KR20120117007A - 선택적인 ngf 경로 억제제로서의 인간 항-ngf 중화 항체 - Google Patents

선택적인 ngf 경로 억제제로서의 인간 항-ngf 중화 항체 Download PDF

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Abstract

본 발명은 인간 신경 성장 인자(NGF)와 상호작용하거나 이에 결합함으로써 NGF의 기능을 중화시키는 항체를 제공한다. 본 발명은 또한 상기 항체의 약제학적 조성물, 및 약제학적 유효량의 항-NGF 항체를 투여함으로써 NGF 기능을 중화시키고, 특히 NGF-관련 장애(예: 만성 통증)를 치료하는 방법을 제공한다. 항-NGF 항체를 사용하여 샘플 중 NGF의 양을 검출하는 방법이 또한 제공된다.

Description

선택적인 NGF 경로 억제제로서의 인간 항-NGF 중화 항체{Human anti-NGF neutralizing antibodies as selective NGF pathway inhibitors}
본 출원은 2004년 7월 15일자로 출원된 미국 특허 출원(U.S.S.N) 제10/891,658호의 계속 출원이며, 2003년 7월 15일자로 출원된 미국 가출원 제60/487,431호에 대한 우선권의 이점을 청구하는, 2008년 11월 25일자로 출원된 미국 특허 출원(U.S.S.N) 제12/277,919호의 일부 계속 출원인, 2009년 10월 9일자로 출원된 미국 특허 출원(U.S.S.N) 제12/576,522호에 대한 우선권을 청구한다. 본 출원은 또한 U.S.S.N. 제10/891,658호의 분할 출원인, 2007년 6월 22일자로 출원된 미국 특허 출원 제11/767,326호에 관련된다. 이들 출원 모두의 기재는 본 명세서에 참조로 포함된다.
서열 목록이 단지 전자 포맷으로 본 출원서와 함께 출원되었고, 본 명세서에 참조로 포함된다. 서열 목록 텍스트 파일 "02-1240-F-CIP.SeqList.txt"는 2008년 11월 25일자로 생성되었고, 크기는 79,116byte이다.
본 발명은 신경 성장 인자(NGF: nerve growth factor)에 결합하는 인간 모노클로날 항체에 관한 것이다. 통증 및 통증-관련 장애를 치료하기 위한 조성물 및 방법이 또한 기재되어 있다.
매일, 미국에서 2백만 명 이상의 사람들이 만성 통증으로 무기력해지고 있다(Jessell and Kelly, 1991, "Pain and Analgesia" in PRINCIPLES OF NEURAL SCIENCE, 3rd Ed., (Kandel, Schwartz, and Jessell, ed.), Elsevier, New York). 불행하게도, 통증을 위한 현재 치료는 단지 부분적으로 효과적이고, 이들 치료법 자체 중 많은 것이 약화시키거나 위험한 부작용을 야기한다. 예를 들면, 비-스테로이드계 소염제("NSAID")(예: 아스피린, 이부프로펜 및 인도메타신)가 염증성 통증에 대해 적절히 효과적임에도 불구하고, 그들은 또한 신장 독소이고, 고용량은 위장 자극, 궤양, 출혈 및 정신적 혼란을 야기하는 경향이 있다. 아편양 제제로 치료받은 환자들은 또한 빈번히 혼란을 경험하며, 장기간 아편양 제제의 사용은 내성 및 의존성과 관련이 된다. 국소 마취제(예: 리도카인 및 멕실레틴)는 동시에 통증을 억제하고, 정상적인 감각의 손실을 야기한다.
통증은 환경으로부터 수용되고, 신경계에 의해 전달되어 해석된 신호를 기준으로 하는 지각이다(검토를 위해, 참조: Millan, 1999, Prog. Neurobiol. 57:1-164). 유해한 자극(예: 열 및 접촉)은 중추신경계("CNS")로 신호를 보내기 위하여 피부에 특별한 감각 수용체를 생성한다. 이 과정은 통각이라 불리우며, 이를 매개하는 말초 감각 뉴런은 통각 수용기이다. 통각 수용기(들)로부터의 신호의 강도 및 CNS에 의한 그 신호의 추상 및 착상에 따라, 사람은 유해한 자극을 통증으로서 경험하거나 하지 않을 수 있다. 사람의 통증 지각이 자극의 세기로 적절히 보정되면, 통증은 이의 의도된 보호 기능으로 작용한다. 그러나, 특정 형태의 조직 손상은 통각과민 또는 프로노시셉션(pronociception)으로서 공지된 현상을 야기하며, 이때 비교적 무해한 자극은 사람의 통증 역치가 낮아지기 때문에 심하게 통증이 있는 것으로 인식된다. 염증과 신경 손상 모두는 통각과민을 유도할 수 있다. 염증성 질환[예: 일광화상, 골관절염, 대장염, 심장염, 피부염, 근염, 신경염, 콜라겐 혈관 질병(류마티스 관절염 및 루푸스를 포함함) 등]로 고생하는 사람들은 종종 통증의 증가된 느낌을 경험한다. 유사하게, 외상, 수술, 절단, 농양, 작열통, 콜라겐 혈관 질병, 탈수초성 질병, 삼차 신경통, 암, 만성 알콜 중독, 뇌졸중, 시상통 증후군, 당뇨병, 포자성 감염, 후천성 면역 결핍증("AIDS"), 독소 및 화학요법은 지나친 통증을 유발하는 신경 손상을 야기한다.
통각 수용기가 정상 및 통각과민 상태하에 외부 신호를 변환하는 메카니즘이 보다 잘 이해되기 때문에, 통각과민에 관련된 과정은 통증 역치의 저하를 억제함으로써, 경험하는 통증의 양을 경감시키는 것이 목적이 될 수 있다.
신경 인자는 생리학적 및 병리학적 통증의 전달시 중요한 역할을 하는 것으로 나타났다. 신경 성장 인자(NGF)가 특히 중요한 것으로 나타났다(검토를 위해, 참조: McMahon, 1996, Phil. Trans. R. Soc. Lond. 351:431-40; and Apfel, 2000, The Clinical Journal of Pain 16:S7-S11). NGF의 국소 및 전신 투여는 모두 통각과민 및 이질통을 유도하는 것으로 나타났다(Lewin et al., 1994, Eur. J. Neurosci. 6:1903-1912). 인간에서 NGF의 정맥내 주입은 전신의 근육통을 유발하는 반면에, 국소 투여는 전신 효과 이외에, 주사 부위 통각과민 및 이질통을 일으킨다(Apfel et al., 1998, Neurology 51:695-702). 통증이 주요 특징인 질환에서 내인성 NGF에 관련된 상당한 몸의 증거가 또한 존재한다. 예를 들면, NGF는 말초 신경 손상에 이어 적어도 2개월 동안 척수후근 신경절(DRG) Schwann 세포에서 상향 조절되고, 증가된 수준은 다양한 관절염 모델로 고생하는 동물의 관절에서 보고되었다(예: Aloe et al., 1993, Growth Factors 9:149-155). 인간에서, NGF 수준은 류마티스 또는 다른 형태의 관절염이 있는 환자로부터의 활액에서 증가된다(예: Aloe et al., 1992, Arthritis and Rheumatism 35:351-355). 더욱이, NGF 기능의 길항작용은 신경병성 및 만성 염증성 통증의 모델에서 통각과민 및 이질통을 방지한다고 설명하였다. 예를 들면, 신경병성 통증(예: 신경원 또는 척수신경 결찰)의 동물 모델에서, NGF에 대한 중화 항체의 전신 주입은 이질통 및 통각과민을 모두 방지한다(Ramer et al., 1999, Eur. J. Neurosci. 11:837-846; and Ro et al., 1999, Pain 79:265-274). 당해 분야에 공지된 항-NGF 항체의 예는, 예를 들면, PCT 공보 제WO01/78698호, 제 WO01/64247호, 제 WO02/096458호 및 제WO 2004/032870호; 미국 특허 제5,844,092호, 제5,877,016호 및 제6,153,189호; Hongo et al., 2000, Hybridoma 19:215-227; Hongo et al., 1993, Cell. Mol. Biol. 13:559-568; 및 GenBank Accession Nos. U39608, U39609, L17078, 또는 L17077을 포함한다.
확실히, 특히 통증의 소분자 매개체 또는 악화 요인(예: NGF)을 표적으로 함으로써, 통증을 위한 신규하고 안전하며 효과적인 치료법에 대한 필요성이 존재한다.
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발명의 요지
본 발명은 통증을 다루는데 치료학적으로 유용한 신규 인간 모노클로날 항체를 제공한다. 특히, 본 발명은 신경 성장 인자(NGF)에 결합하는 모노클로날 항체를 제공한다. 바람직하게는, 모노클로날 항체는 인간의 모노클로날 항체이며, NGF의 생물학적 활성을 중화시키고, NGF-매개된 통증 반응의 효과를 완화시키는데 유용하다. 또한, 본 발명의 모노클로날 항체를 제조하고, 가장 바람직하게는 세포 배양 배지로 분비하는 세포가 본 발명에 의해 제공된다. 통증을 치료 및 조절하기 위한 그들의 용도 이외에, 본 발명의 항체는 신경병성 및 염증성 통증-관련 반응을 치료하는데 유용하다.
본 발명은 또한 항체 Fc 영역의 서열 및 SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, 및 SEQ ID NOs: 79-130으로서 확인된 하나 또는 그 이상의 서열을 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 상기 분자는, 예를 들면, 참조로 인용된 국제 특허출원 공보 제 WO 00/24782 호에 기재된 바와 같은 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 상기 분자는, 예를 들면, 포유동물 세포(예: 차이니즈 햄스터 난소 세포) 또는 세균 세포(예: 대장균 세포)에서 발현될 수 있다.
특정 측면에 있어서, 본 발명은 중쇄 및 경쇄를 포함하는 항체, 바람직하게는 모노클로날 항체, 가장 바람직하게는 인간 항체 및 인간 모노클로날 항체를 제공하며, 여기에서 중쇄는 SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, 또는 SEQ ID NO: 6 에 제시된 아미노산 서열, 또는 이의 항원-결합 단편 또는 면역학적으로 기능적인 면역글로불린 단편을 포함하고, 중쇄의 가변 영역은 SEQ ID NO: 10에 제시된 아미노산 서열, 또는 이의 항원-결합 단편 또는 면역학적으로 기능적인 면역글로불린 단편을 포함한다. 바람직하게는, 중쇄는 SEQ ID NO: 4에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
특정 측면에 있어서, 본 발명은 중쇄 및 경쇄를 포함하는 항체, 바람직하게는 인간 항체 및 보다 바람직하게는 모노클로날 항체, 가장 바람직하게는 인간 모노클로날 항체를 제공하며, 여기에서 중쇄는 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA 및 IgE 중쇄 불변 영역으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 중쇄 불변 영역 또는 이의 임의의 대립형질 변환을 포함하고(본 명세서에 참조로 포함된, Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242에 논의된 바와 같음), 중쇄의 가변 영역은 SEQ ID NO: 10에 제시된 아미노산 서열, 또는 이의 항원-결합 단편 또는 면역학적으로 기능적인 면역글로불린 단편을 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 항체는 SEQ ID NO: 4에 제시된 IgG2 중쇄 불변 영역의 아미노산 서열, 또는 이의 항원-결합 단편 또는 면역학적으로 기능적인 면역글로불린 단편을 포함한다.
특정 측면에 있어서, 본 발명은 중쇄 및 경쇄를 포함하는 항체, 바람직하게는 인간 항체 및 보다 바람직하게는 모노클로날 항체, 가장 바람직하게는 인간 모노클로날 항체를 제공하며, 여기에서 경쇄는 SEQ ID NO: 8에 제시된 아미노산 서열, 또는 이의 항원-결합 단편 또는 면역학적으로 기능적인 면역글로불린 단편을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 12에 제시된 아미노산 서열, 또는 이의 항원-결합 단편 또는 면역학적으로 기능적인 면역글로불린 단편을 포함한다.
특정 측면에 있어서, 본 발명의 항체는 중쇄 및 경쇄를 포함하며, 여기에서 중쇄의 가변 영역은 SEQ ID NO: 10에 제시된 아미노산 서열, 또는 이의 항원-결합 단편 또는 면역학적으로 기능적인 면역글로불린 단편을 포함한다. 다른 측면에 있어서, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 12에 제시된 아미노산 서열, 또는 이의 항원-결합 단편 또는 면역학적으로 기능적인 면역글로불린 단편을 포함한다. 부가의 측면에 있어서, 중쇄는 임의의 SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 18, 또는 SEQ ID NO: 20에 제시된 아미노산 서열, 또는 이의 항원-결합 단편 또는 면역학적으로 기능적인 면역글로불린 단편을 포함한다. 또 다른 측면에 있어서, 경쇄는 임의의 SEQ ID NO: 16, 20, 24에 제시된 아미노산 서열, 또는 이의 항원-결합 단편 또는 면역학적으로 기능적인 면역글로불린 단편을 포함한다.
본 발명은 또한 NGF에 특이적으로 결합하는 항체를 제공하며, 여기에서 중쇄는 SEQ ID NO: 10에 제시된 아미노산 서열, 또는 이의 항원-결합 단편 또는 면역학적으로 기능적인 면역글로불린 단편을 포함하는 가변 영역을 포함하고, 경쇄는 SEQ ID NO: 12에 제시된 아미노산 서열, 또는 이의 항원-결합 단편 또는 면역학적으로 기능적인 면역글로불린 단편을 포함하는 가변 영역을 포함한다.
본 발명은 NGF에 특이적으로 결합하는 분리된 인간 항체를 추가로 제공하며, 이때 항체는 다음을 포함한다:
(a) SEQ ID NO: 79에 제시된 아미노산 서열, 또는 이의 항원-결합 단편 또는 면역학적으로 기능적인 면역글로불린 단편을 포함하는 중쇄 가변 영역을 갖는 중쇄, 및 SEQ ID NO: 80에 제시된 아미노산 서열, 또는 이의 항원-결합 단편 또는 면역학적으로 기능적인 면역글로불린 단편을 포함하는 경쇄 가변 영역을 갖는 경쇄;
(b) SEQ ID NO: 81에 제시된 아미노산 서열, 또는 이의 항원-결합 단편 또는 면역학적으로 기능적인 면역글로불린 단편을 포함하는 중쇄 가변 영역을 갖는 중쇄, 및 SEQ ID NO: 82에 제시된 아미노산 서열, 또는 이의 항원-결합 단편 또는 면역학적으로 기능적인 면역글로불린 단편을 포함하는 경쇄 가변 영역을 갖는 경쇄;
(c) SEQ ID NO: 83에 제시된 아미노산 서열, 또는 이의 항원-결합 단편 또는 면역학적으로 기능적인 면역글로불린 단편을 포함하는 중쇄 가변 영역을 갖는 중쇄, 및 SEQ ID NO: 84에 제시된 아미노산 서열, 또는 이의 항원-결합 단편 또는 면역학적으로 기능적인 면역글로불린 단편을 포함하는 경쇄 가변 영역을 갖는 경쇄; 또는
(d) SEQ ID NO: 86에 제시된 아미노산 서열, 또는 이의 항원-결합 단편 또는 면역학적으로 기능적인 면역글로불린 단편을 포함하는 중쇄 가변 영역을 갖는 중쇄, 및 SEQ ID NO: 87에 제시된 아미노산 서열, 또는 이의 항원-결합 단편 또는 면역학적으로 기능적인 면역글로불린 단편을 포함하는 경쇄 가변 영역을 갖는 경쇄.
특정 측면에 있어서, 본 발명은 또한 중쇄 및 경쇄를 포함하는 항체를 제공하며, 여기에서 중쇄는 중쇄 가변 영역을 포함하고, 이때 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 10에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 75％, 바람직하게는 80％, 보다 바람직하게는 적어도 85％, 보다 더 바람직하게는 적어도 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 및 가장 바람직하게는 약 99％ 동일성을 갖는 서열을 포함하며, 경쇄는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 이때 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 12에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 80％, 바람직하게는 적어도 85％, 보다 바람직하게는 적어도 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 및 가장 바람직하게는 약 99％ 동일성을 갖는 서열을 포함하며, 이때 항체는 NGF에 특이적으로 결합한다.
본 발명은 또한 NGF에 특이적으로 결합하는 항체를 제공하며, 여기에서 중쇄는 SEQ ID NO: 14에 제시된 아미노산 서열, 또는 이의 항원-결합 단편 또는 면역학적으로 기능적인 면역글로불린 단편을 포함하고, 경쇄는 SEQ ID NO: 16에 제시된 아미노산 서열, 또는 이의 항원-결합 단편 또는 면역학적으로 기능적인 면역글로불린 단편을 포함한다.
특정 측면에 있어서, 본 발명은 중쇄 및 경쇄를 포함하는 항체를 제공하며, 여기에서 중쇄는 중쇄 가변 영역을 포함하고, 중쇄 가변 영역은 임의의 SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 18 또는 SEQ ID NO: 22에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 75％, 바람직하게는 80％, 보다 바람직하게는 적어도 85％, 보다 더 바람직하게는 적어도 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 및 가장 바람직하게는 약 99％ 동일성을 갖는 서열을 포함하며, 경쇄는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 이때 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 16에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 80％, 바람직하게는 적어도 85％, 보다 바람직하게는 적어도 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 및 가장 바람직하게는 약 99％ 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 이때 항체는 NGF에 특이적으로 결합한다.
본 발명은 또한 단일쇄 항체, 단일쇄 Fv 항체, F(ab) 항체, F(ab)' 항체 및 (Fab')2 항체를 제공한다.
특별한 측면에 있어서, 본 발명은 SEQ ID NO: 16에 제시된 아미노산 서열, 또는 이의 항원-결합 단편 또는 면역학적으로 기능적인 면역글로불린 단편을 포함하는 경쇄를 제공한다.
또한, 본 발명은 임의의 SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 18 또는 SEQ ID NO: 22에 제시된 아미노산 서열, 또는 이의 항원-결합 단편 또는 면역학적으로 기능적인 면역글로불린 단편을 포함하는 중쇄를 제공한다.
본 발명은 또한 NGF에 특이적으로 결합하는 분리된 인간 항체에 관한 것으로, 이때 항체는 (a) 인간 중쇄 프레임워크 영역, 인간 중쇄 CDR1 영역, 인간 중쇄 CDR2 영역 및 인간 중쇄 CDR3 영역; 및 (b) 인간 경쇄 프레임워크 영역, 인간 경쇄 CDR1 영역, 인간 경쇄 CDR2 영역 및 인간 경쇄 CDR3 영역을 포함한다. 특정 측면에 있어서,인간 중쇄 CDR1 영역은 SEQ ID NO: 22로 제시된 바와 같이 4D4로 표시된 모노클로날 항체(mAb)의 중쇄 CDR1 영역일 수 있고, 인간 경쇄 CDR1 영역은 SEQ ID NO: 24로 제시된 바와 같이 mAb 4D4의 경쇄 CDR1 영역일 수 있다. 다른 측면에 있어서, 인간 중쇄 CDR2 영역은 SEQ ID NO: 18로 제시된 바와 같이 mAb 4D4의 중쇄 CDR2 영역일 수 있고, 인간 경쇄 CDR2 영역은 SEQ ID NO: 20으로 제시된 바와 같이 mAb 4D4의 경쇄 CDR2 영역일 수 있다. 또 다른 측면에 있어서, 인간 중쇄 CDR3 영역은 SEQ ID NO: 14로 제시된 바와 같이 mAb 4D4의 중쇄 CDR3 영역이고, 인간 경쇄 CDR3 영역은 SEQ ID NO: 16으로 제시된 바와 같이 mAb 4D4의 경쇄 CDR3 영역이다.
본 발명은 또한 중쇄 및 경쇄를 포함하는 신경 성장 인자에 특이적으로 결합하는 분리된 인간 항체를 제공하며, 여기에서 중쇄는 SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85 또는 SEQ ID NO: 87에 제시된 아미노산 서열, 또는 이의 항원-결합 단편 또는 면역학적으로 기능적인 면역글로불린 단편을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
본 발명은 또한 중쇄 및 경쇄를 포함하는 NGF에 특이적으로 결합하는 분리된 인간 항체를 제공하며, 여기에서 경쇄는 SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 91 또는 SEQ ID NO: 131에 제시된 아미노산 서열, 또는 이의 항원-결합 단편 또는 면역학적으로 기능적인 면역글로불린 단편을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
본 발명의 항체는 NGF 폴리펩티드와 관련된 적어도 하나의 시험관 내 및/또는 생체 내 활성을 길항하는 능력을 특징으로 한다. 바람직하게는, 본 발명은 NGF 폴리펩티드에 대한 고친화성 결합을 갖는 분리된 항-인간 NGF 인간 항체를 제공하며, 이때 항체는 인간 NGF 폴리펩티드에 결합하고, KinExA를 사용하여 측정된 바와 같이, 약 50 x 10-12M 이하의 해리 상수(KD)를 가지면서 인간 NGF 폴리펩티드로부터 해리되거나, 이는 약 1 x 10-8M 이하인 IC50을 가지면서 시험관 내 중화 검정에서 NGF 유도 생존을 억제한다.
바람직한 양태로, 본 발명은 하기의 특성을 갖는 분리된 항-인간 NGF 인간 항체를 제공한다:
a) 약 1 x 10-8M 이하인 IC50를 가지면서 시험관 내 중화 검정에서 NGF 유도 생존을 억제하고;
b) SEQ ID NO: 14의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3을 가지며; 및
c) SEQ ID NO: 16의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 갖는다.
본 발명은 또한 높은 친화성으로 NGF에 특이적으로 결합하는 분리된 인간 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 면역학적으로 기능적인 면역글로불린 단편을 제공하며, 이때 상기 항체 또는 단편은 약 1 x 10-9 이하의 KD로 인간 NGF 폴리펩티드로부터 해리되고, 약 1 x 10-8M 이하인 IC50을 가지면서 표준 시험관 내 검정에서 인간 NGF 생체활성을 중화시키며, 상기 항체 또는 단편은 다음을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다:
a) 다음 화학식의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 영역:
a1a2a3a4a5
여기에서, a1은 극성 친수성 아미노산 잔기이며; a2는 방향족 아미노산 잔기이고; a3은 지방족, 극성 소수성, 방향족 아미노산 잔기이며; a4는 중성 소수성 또는 지방족 아미노산 잔기이고; 및 a5는 지방족 또는 극성 친수성 아미노산 잔기이다;
b) 다음 화학식의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 영역:
b1b2b3b4b5b6b7b8b9b10b11b12b13b14b15b16b17
여기에서, b1은 지방족, 극성 소수성 또는 방향족 아미노산 잔기이고; b2는 지방족 소수성 아미노산 잔기이며; b3은 극성 친수성 또는 방향족 아미노산 잔기이고; b4는 극성 친수성, 소수성 또는 방향족 아미노산 잔기이며; b5 내지 b9는 독립적으로 극성 친수성 또는 지방족 아미노산 잔기이고; b10은 극성 친수성, 방향족 또는 지방족 아미노산 잔기이며; b11은 방향족 또는 소수성 아미노산 잔기이고; b12는 지방족 소수성 또는 극성 친수성 아미노산 잔기이며; b13은 지방족, 소수성 또는 극성 친수성 아미노산 잔기이고; b14 및 b16은 독립적으로 극성 친수성 아미노산 잔기이며; b15는 지방족 또는 방향족 소수성 아미노산 잔기이고; 및 b17은 지방족 산성 아미노산 잔기이다; 및
c) 다음 화학식의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 영역:
c1c2c3c4c5c6c7c8c9c10c11c12c13c14c15c16c17
여기에서, c1은 부재이거나 지방족 아미노산 잔기이고; c2는 부재이거나 극성 친수성 또는 방향족 소수성 아미노산 잔기이며; c3 및 c4는 독립적으로 부재이거나 극성 친수성, 방향족 소수성 또는 지방족 아미노산 잔기이고; c5는 부재이거나 극성 친수성, 지방족 또는 방향족 아미노산 잔기이며; c6은 부재이거나 극성 친수성 또는 지방족 아미노산 잔기이고; c7은 극성 친수성 또는 지방족 아미노산 잔기이며; c8은 극성 친수성, 소수성 또는 방향족 아미노산 잔기이고; c9는 극성 친수성, 지방족 또는 방향족 소수성 아미노산 잔기이며; c10은 극성 친수성, 방향족 소수성 또는 지방족 소수성 아미노산 잔기이고; c11 내지 c13은 독립적으로 극성 친수성 또는 방향족 소수성 아미노산 잔기이며; c14는 지방족 또는 방향족 소수성 아미노산 잔기이고; c15는 극성 친수성 또는 중성 소수성 아미노산 잔기이며; c16은 부재이거나 극성 친수성 아미노산 잔기이고; 및 c17은 방향족 소수성 또는 지방족 소수성 아미노산 잔기이다.
한 측면에 있어서, a1은 극성 친수성 아미노산 잔기이며; a2는 방향족 소수성 아미노산 잔기이고; a3은 지방족 소수성 아미노산 잔기이며; a4는 중성 소수성이고; a5는 극성 친수성 아미노산 잔기이며; b1은 지방족 또는 방향족 아미노산 잔기이고; b2는 Ile이며; b3은 극성 친수성 아미노산 잔기이고; b4는 극성 친수성 또는 방향족 아미노산 잔기이며; b5 내지 b9는 독립적으로 극성 친수성 또는 지방족 아미노산 잔기이고; b10은 지방족 아미노산 잔기이며; b11은 Tyr이고; b12는 지방족 소수성 아미노산 잔기이며; b13은 지방족 또는 극성 친수성 아미노산 잔기이고; b14 및 b16은 독립적으로 극성 친수성 아미노산 잔기이며; b15는 지방족 소수성 아미노산 잔기이고; b17은 지방족 산성 아미노산 잔기이며; c1은 부재이거나 지방족 아미노산 잔기이고; c2는 부재이거나 극성 친수성 또는 방향족 소수성 아미노산 잔기이며; c3 및 c4는 독립적으로 부재이거나 극성 친수성, 방향족 소수성 또는 지방족 아미노산 잔기이고; c5는 부재이거나 극성 친수성 아미노산 잔기이며; c6은 부재이거나 극성 친수성 또는 지방족 아미노산 잔기이고; c7은 극성 친수성 또는 지방족 아미노산 잔기이며; c8은 극성 친수성, 소수성 또는 방향족 아미노산 잔기이고; c9는 극성 친수성, 지방족 또는 방향족 소수성 아미노산 잔기이며; c10은 극성 친수성, 방향족 소수성 또는 지방족 소수성 아미노산 잔기이고; c11 내지 c13은 독립적으로 극성 친수성 또는 방향족 소수성 아미노산 잔기이며; c14는 지방족 또는 방향족 소수성 아미노산 잔기이고; c15는 극성 친수성 또는 중성 소수성 아미노산 잔기이며; c16은 부재이거나 극성 친수성 아미노산 잔기이고; 및 c17은 방향족 소수성 또는 지방족 소수성 아미노산 잔기이다.
특별한 측면에 있어서, a1은 Ser, Asp 또는 Thr이며; a2는 Tyr이고; a3은 Ala, Ser, Trp 또는 Gly이며; a4는 Met 또는 Ile이고; a5는 His, Gly 또는 Asn이며; b1은 Tyr, Gly, Ile 또는 Asp이고; b2는 Ile이며; b3은 Ser, Thr, Tyr 또는 Asn이고; b4는 Trp, Arg 또는 Pro이며; b5는 Ser, Asn 또는 Gly이고; b6은 Ser, Arg, Asp 또는 Gly이며; b7은 Ser, His 또는 Gly이고; b8은 Ser, Ile, Asp 또는 Thr이며; b9는 Leu, Ile 또는 Thr이고; b10은 Gly, Lys 또는 Phe이며; b11은 Tyr이고; b12는 Ala 또는 Ser이며; b13은 Asp, Gly 또는 Pro이고; b14는 Ser이며; b15는 Val 또는 Phe이고; b16은 Lys 또는 Gln이며; b17은 Gly이고; c1은 부재이거나 지방족 아미노산 잔기이며; c2는 부재이거나, Tyr이고; c3 및 c4는 독립적으로 부재이거나, Tyr, Asn, Val 또는 Glu이며; c5는 부재이거나, Ser, Gly 또는 Trp이고; c6은 부재이거나, Ser, Gly,Glu 또는 Leu이며; c7은 Gly, Arg 또는 Asp이고; c8은 Trp, Pro, Ser 또는 Thr이며; c9는 His, Gly 또는 Tyr이고; c10은 Val, Tyr 또는 Arg이며; c11 내지 c13 은 독립적으로 Ser, Phe, Tyr, Asp 또는 Asn이고; c14는 Phe, Val 또는 Gly이며; c15는 Met 또는 Asp이고; c16은 부재이거나, Asp 또는 Asn이며; 및 c17은 Tyr 또는 Val이다.
다른 특별한 측면에 있어서, a1은 Ser 또는 Asp이고; a2는 Tyr이며; a3은 Ala 또는 Ser이고; a4는 Met 또는 Ile이며; a5는 His 또는 Asn이고; b1은 Tyr 또는 Gly이며; b2는 Ile이고; b3은 Ser, Thr, Tyr 또는 Asn이며; b4는 Trp, Arg 또는 Pro이고; b5는 Ser 또는 Asn이며; b6은 Ser 또는 Arg이고; b7은 His 또는 Gly이며; b8은 Ile 또는 Thr이고; b9는 Leu, Ile 또는 Thr이며; b10은 Gly 또는 Phe이고; b11은 Tyr이며; b12는 Ala 또는 Ser이고; b13은 Asp 또는 Gly이며; b14는 Ser이고; b15는 Val 또는 Phe이며; b16은 Lys 또는 Gln이고; b17은 Gly이며; c1은 부재이거나, Gly이고; c2는 부재이거나, Tyr이며; c3 및 c4는 독립적으로 부재이거나, Tyr, Gly 또는 Val이고; c5는 부재이거나, Ser이며; c6은 Ser 또는 Gly이고; c7은 Gly 또는 Arg이며; c8은 Trp 또는 Pro이고; c9는 His, Gly 또는 Tyr이며; c10은 Val 또는 Tyr이고; c11 내지 c13은 독립적으로 Ser, Tyr, Phe 또는 Asp이며; c14는 Phe 또는 Val이고; c15는 Met 또는 Asp이며; c16은 부재이거나, Asp이고; 및 c17은 Tyr 또는 Val이다.
다른 특별한 측면에 있어서:
a) 중쇄 CDR1은 SEQ ID NO: 22에 제시된 아미노산 서열을 가지며, 중쇄 CDR2는 SEQ ID NO: 18에 제시된 아미노산 서열을 갖고, 중쇄 CDR3은 SEQ ID NO: 14에 제시된 아미노산 서열을 가지며;
b) 중쇄 CDR1은 SEQ ID NO: 92에 제시된 아미노산 서열을 갖고, 중쇄 CDR2는 SEQ ID NO: 93에 제시된 아미노산 서열을 가지며, 중쇄 CDR3은 SEQ ID NO: 94에 제시된 아미노산 서열을 갖고;
c) 중쇄 CDR1은 SEQ ID NO: 98에 제시된 아미노산 서열을 가지며, 중쇄 CDR2는 SEQ ID NO: 99에 제시된 아미노산 서열을 갖고, 중쇄 CDR3은 SEQ ID NO: 100에 제시된 아미노산 서열을 가지며;
d) 중쇄 CDR1은 SEQ ID NO: 104에 제시된 아미노산 서열을 갖고, 중쇄 CDR2는 SEQ ID NO: 105에 제시된 아미노산 서열을 가지고, 중쇄 CDR3은 SEQ ID NO: 106에 제시된 아미노산 서열을 가지며;
e) 중쇄 CDR1은 SEQ ID NO: 110에 제시된 아미노산 서열을 갖고, 중쇄 CDR2는 SEQ ID NO: 111에 제시된 아미노산 서열을 가지며, 중쇄 CDR3은 SEQ ID NO: 112에 제시된 아미노산 서열을 갖고; 및
f) 중쇄 CDR1은 SEQ ID NO: 116에 제시된 아미노산 서열을 가지며, 중쇄 CDR2는 SEQ ID NO: 117에 제시된 아미노산 서열을 갖고, 중쇄 CDR3은 SEQ ID NO: 118에 제시된 아미노산 서열을 갖는다.
본 발명은 또한 NGF에 특이적으로 결합하는 분리된 인간 항체 또는 이의 항원-결합 단편이거나 또는 면역학적으로 기능적인 면역글로불린 단편을 제공하며, 이때 상기 항체 또는 단편은 다음의 a), b) 및 c)를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하며, 상기 항체 또는 단편은 약 1 x 10-9 이하의 KD로 인간 NGF 폴리펩티드로부터 해리되고, 약 1 x 10-8M 이하인 IC50을 가지면서 표준 시험관 내 검정에서 인간 NGF 생체활성을 중화시킨다:
a) 다음 화학식의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 영역:
a1a2a3a4a5a6a7a8a9a10a11a12
여기에서, a1은 극성 친수성 아미노산 잔기이며; a2, a11 및 a12는 독립적으로 지방족 또는 소수성 아미노산 잔기이고; a3, a5, a7 및 a8은 독립적으로 지방족, 극성 친수성, 또는 소수성 아미노산 잔기이며; a4는 극성 친수성 아미노산 잔기이고; a6은 지방족 또는 소수성 아미노산 잔기이며; a9는 부재이거나, 지방족 또는 극성 친수성 아미노산 잔기이고; 및 a10은 지방족, 방향족 또는 소수성 아미노산 잔기이다;
b) 다음 화학식의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 영역:
b1b2b3b4b5b6b7
여기에서, b1은 지방족, 극성 소수성 또는 소수성 아미노산 잔기이고; b2는 지방족 또는 소수성 아미노산 잔기이며; b3 및 b4는 독립적으로 극성 친수성, 지방족 또는 소수성 아미노산 잔기이고; b5는 극성 친수성 또는 지방족 소수성 아미노산 잔기이며; b6은 극성 친수성 또는 지방족 소수성 아미노산 잔기이고; 및 b7은 극성 친수성 아미노산 잔기이다; 및
c) 다음 화학식의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 영역:
c1c2c3c4c5c6c7c8c9c10c11c12c13c14c15c16c17
여기에서, c1 및 c2는 독립적으로 극성 친수성 아미노산 잔기이고; c3은 극성 친수성, 지방족 또는 소수성 아미노산 잔기이며; c4, c5 및 c6은 독립적으로 지방족, 극성 친수성 또는 소수성 아미노산 잔기이고; c7은 부재이거나 극성 친수성 또는 지방족 소수성 아미노산 잔기이며; c8은 극성 친수성 또는 소수성 아미노산 잔기이고; 및 c9는 극성 친수성 아미노산 잔기이다.
한 측면에 있어서, a1, a3, a4, a7 및 a8은 독립적으로 극성 친수성 아미노산 잔기이며; a2, a6, a11 및 a12는 독립적으로 지방족 소수성 아미노산 잔기이고; a5는 극성 친수성 또는 지방족 아미노산 잔기이며; a9는 부재이거나, 지방족 또는 극성 친수성 아미노산 잔기이고; a10은 지방족 또는 방향족 아미노산 잔기이며; b1은 지방족, 극성 소수성 또는 소수성 아미노산 잔기이고; b2는 지방족 소수성 아미노산 잔기이며; b3, b4 및 b7은 독립적으로 극성 친수성 아미노산 잔기이고; b5 및 b6은 독립적으로 극성 친수성 또는 지방족 소수성 아미노산 잔기이며; c1 및 c2는 독립적으로 극성 친수성 아미노산 잔기이고; c3은 극성 친수성, 지방족 또는 소수성 아미노산 잔기이며; c4, c5 및 c6은 독립적으로 지방족, 극성 친수성 또는 소수성 아미노산 잔기이고; c7은 부재이거나, 지방족 소수성 아미노산 잔기이며; c8은 소수성 아미노산 잔기이고; 및 c9는 극성 친수성 아미노산 잔기이다.
특별한 측면에 있어서, a1, a3, a4 및 a7은 각각 Arg, Ser, Gln 및 Ser이고; a2는 Ala이며; a5는 Gly 또는 Ser이고; a8은 Ser 또는 Ile이며; a9는 부재이거나, Ser 또는 Gly이고; a10은 Ala, Tyr, Trp 또는 Phe이며; b1은 Asp, Gly, Ala 또는 Val이고; b2 및 b3은 각각 Ala 및 Ser이며; b4는 Ser 또는 Asn이고; b5는 Leu 또는 Arg이며; b6은 Glu, Ala 또는 Gln이고; b7은 Ser 또는 Thr이며; c1 및 c2는 Gln이고; c3은 Phe, Tyr, Arg 또는 Ala이며; c4는 Asn, Gly 또는 Ser이고; c5는 Ser 또는 Asn이며; c6은 Tyr, Ser, Trp 또는 Phe이고; c7은 부재이거나, Pro 또는 His이며; c8는 Leu, Trp, Tyr 또는 Arg이고; 및 c9는 Thr이다.
다른 특별한 측면에 있어서, a1, a2, a3, a4 및 a7은 각각 Arg, Ala, Ser, Gln 및 Ser이고; a5는 Gly 또는 Ser이며; a8은 Ser 또는 Ile이고; a9는 부재이거나, Ser 또는 Gly이며; a10은 Ala 또는 Tyr이고; b1은 Asp 또는 Gly이며; b2 및 b3은 각각 Ala 및 Ser이고; b4는 Ser 또는 Asn이며; b5는 Leu 또는 Arg이고; b6은 Glu, Ala 또는 Gln이며; b7은 Ser 또는 Thr이고; c1 및 c2는 Gln이며; c3은 Phe, Tyr, Arg 또는 Ala이고; c4는 Asn, Gly 또는 Ser이며; c5는 Ser 또는 Asn이고; c6은 Tyr, Ser, Trp 또는 Phe이며; c7은 부재이거나, Pro 또는 His이고; c8은 Leu, Trp, Tyr 또는 Arg이며; 및 c9는 Thr이다.
다른 특별한 측면에 있어서:
a) 경쇄 CDR1은 SEQ ID NO: 24에 제시된 아미노산 서열을 가지며, 경쇄 CDR2는 SEQ ID NO: 20에 제시된 아미노산 서열을 갖고, 경쇄 CDR3은 SEQ ID NO: 16에 제시된 아미노산 서열을 가지며;
b) 경쇄 CDR1은 SEQ ID NO: 95에 제시된 아미노산 서열을 갖고, 경쇄 CDR2는 SEQ ID NO: 96에 제시된 아미노산 서열을 가지며, 경쇄 CDR3은 SEQ ID NO: 97에 제시된 아미노산 서열을 갖고;
c) 경쇄 CDR1은 SEQ ID NO: 101에 제시된 아미노산 서열을 가지며, 경쇄 CDR2는 SEQ ID NO: 102에 제시된 아미노산 서열을 갖고, 경쇄 CDR3은 SEQ ID NO: 103에 제시된 아미노산 서열을 가지며;
d) 경쇄 CDR1은 SEQ ID NO: 107에 제시된 아미노산 서열을 갖고, 경쇄 CDR2는 SEQ ID NO: 108에 제시된 아미노산 서열을 가지며, 경쇄 CDR3은 SEQ ID NO: 109에 제시된 아미노산 서열을 갖고;
e) 경쇄 CDR1은 SEQ ID NO: 113에 제시된 아미노산 서열을 가지며, 경쇄 CDR2는 SEQ ID NO: 114에 제시된 아미노산 서열을 갖고, 경쇄 CDR3은 SEQ ID NO: 115에 제시된 아미노산 서열을 가지며;
f) 경쇄 CDR1은 SEQ ID NO: 119에 제시된 아미노산 서열을 갖고, 경쇄 CDR2는 SEQ ID NO: 120에 제시된 아미노산 서열을 가지며, 경쇄 CDR3은 SEQ ID NO: 121에 제시된 아미노산 서열을 갖고;
g) 경쇄 CDR1은 SEQ ID NO: 122에 제시된 아미노산 서열을 가지며, 경쇄 CDR2는 SEQ ID NO: 123에 제시된 아미노산 서열을 갖고, 경쇄 CDR3은 SEQ ID NO: 124에 제시된 아미노산 서열을 가지며;
h) 경쇄 CDR1은 SEQ ID NO: 125에 제시된 아미노산 서열을 갖고, 경쇄 CDR2는 SEQ ID NO: 126에 제시된 아미노산 서열을 가지며, 경쇄 CDR3은 SEQ ID NO: 127에 제시된 아미노산 서열을 갖고;
i) 경쇄 CDR1은 SEQ ID NO: 128에 제시된 아미노산 서열을 가지며, 경쇄 CDR2는 SEQ ID NO: 129에 제시된 아미노산 서열을 갖고, 경쇄 CDR3은 SEQ ID NO: 130에 제시된 아미노산 서열을 가지며; 및
j) 경쇄 CDR1은 SEQ ID NO: 132에 제시된 아미노산 서열을 갖고, 경쇄 CDR2는 SEQ ID NO: 133에 제시된 아미노산 서열을 가지며, 경쇄 CDR3은 SEQ ID NO: 134에 제시된 아미노산 서열을 갖는다.
또한, 본 발명의 일부는 신규 항-인간 NGF 인간 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열, 항-인간 NGF 인간 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터, 항-인간 NGF 인간 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 혼입시킨 벡터에 의해 형질전환된 숙주 세포, 항-인간 NGF 인간 항체를 포함하는 제형 및 이의 제조 및 사용 방법이다.
본 발명은 또한 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 샘플을 접촉시키는 단계를 포함하는, 생물학적 샘플에서 NGF 수준의 검출 방법을 제공한다. 본 발명의 항-NGF 항체는 NGF의 검출 및 정량화를 위한 임의의 공지된 검정법, 예를 들면, 경쟁적 결합 검정법, 직접 및 간접 샌드위치 검정법, 면역 침강법 및 효소-결합 면역흡착법(ELISA)에 사용될 수 있다(참조: Sola, 1987, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp. 147-158, CRC Press, Inc.). 항체는 사용되는 검정법에 대해 적절한 친화성을 가지면서 NGF에 결합할 수 있다.
또한, 본 발명은 적어도 하나의 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편이거나 또는 면역학적으로 기능적인 면역글로불린 단편을 포함하는 약제학적 조성물을 약제학적 유효량으로 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, NGF의 증가된 생성 또는 NGF에 대한 증가된 감도와 관련된 질병의 치료 방법을 제공한다.
특정 양태에 있어서, 본 발명은 약제학적 유효량의 NGF 항체를 환자에 경구, 정맥내, 복강내, 뇌내[실질내(intra-parenchymal)], 뇌혈관내 (intracerebroventricular), 근육내, 안구내, 동맥내, 문맥내(intraportal), 병변내(intralesional) 또는 피하 경로에 의한 주사를 통해, 서방성 시스템에 의해 또는 이식 장치에 의해 투여함을 포함하는, 신경 성장 인자(NGF)의 증가된 발현 또는 NGF에 대한 증가된 감도에 의해 야기되는 질환의 치료 방법에 관한 것으로, 이때 상기 질환은 급성 통증, 치통, 외상으로부터의 통증, 수술통, 절단 또는 농양으로부터 생성된 통증, 작열통, 탈수초성 질병, 삼차 신경통, 암, 만성 알콜 중독, 뇌졸중, 시상통 증후군, 당뇨병, 후천성 면역결핍증("AIDS"), 독소, 화학요법, 일반적인 두통, 편두통, 군발성 두통, 혼합된-혈관 또는 비-혈관 증후군, 긴장성 두통, 일반적인 염증, 관절염, 류마티스성 질병, 루푸스, 골관절염, 섬유근통, 염증성 장 질환, 과민성 대장 증후군, 염증성 안 질환, 염증성 또는 불안정한 방광 장애, 건선, 염증성 성분에 의한 피부 통증, 일광화상, 심장염, 피부염, 근염, 신경염, 콜라겐 혈관 질병, 만성 염증성 질환, 염증성 통증 및 관련된 통각과민 및 이질통, 신경병성 통증 및 관련된 통각과민 또는 이질통, 당뇨성 신경병성 통증, 작열통, 교감신경성 지속 통증(sympathetically maintained pain), 구심로차단 증후군, 천식, 상피조직 손상 또는 기능장애, 단순포진, 호흡기, 비뇨생식, 위장 또는 혈관 영역에서의 내장 운동 장애, 상처, 화상, 알레르기성 피부 반응, 가려움(pruritis), 백반증, 일반적인 위장 장애, 대장염, 위궤양, 십이지장궤양, 혈관운동신경성 또는 알레르기 비염, 또는 기관지 장애, 월경곤란증, 소화불량, 위식도역류, 췌장염 또는 장기통(visceralgia)이다.
특정 양태에 있어서, 상기 방법은 약제학적 유효량의 NGF 항체를 포함하며, 골관절염 무릎 통증의 치료 또는 예방에 유용하다. 특정 양태에 있어서, NGF 항체의 약제학적 유효량은 피하 주사시 약 3 내지 약 30㎎이다. 특정 양태에 있어서, 투여는 다중 피하 주사를 포함한다. 양태에 있어서, 투여는 단일 피하 주사를 포함한다. 특정 양태에 있어서, 본 발명의 조성물 및 방법은 SEQ ID NO: 44를 포함하는 경쇄를 포함하는 NGF 항체를 포함한다. 특정 양태에 있어서, NGF 항체는 SEQ ID NO: 40을 포함하는 중쇄를 포함한다. 추가 양태에 있어서, NGF 항체는 SEQ ID NO: 44를 포함하는 경쇄 및 SEQ ID NO: 40을 포함하는 중쇄를 포함한다.
따라서, 본 발명의 상기 기재에 따르면, 다양한 측면에 있어서, 본 발명은 SEQ ID NO: 44를 포함하는 경쇄 및 SEQ ID NO: 40을 포함하는 중쇄를 포함하는 NGF 항체를 포함하는 방법 및 조성물에 관한 것으로, 이때 항체의 중쇄 및 경쇄는 가요성 링커(flexible linker)에 의해 연결되어 단일쇄 항체를 형성한다. 이 측면의 일부 양태에 있어서, NGF 항체는 단일쇄 Fv 항체, Fab' 항체, (Fav')2 항체, 완전 인간 항체 및/또는 인간화 항체를 포함한다. 이 측면의 일부 양태에 있어서, NGF 항체는 NGF 신호화를 억제한다.
이 측면의 특정 양태에 있어서, NGF 항체는 약 1 x 10-9 이하, 약 1 x 10-10 이하 또는 약 1 x 10-11 이하의 KD를 가지면서 인간 NGF 폴리펩티드로부터 해리된다. 이 측면의 특정 양태에 있어서, NGF 항체는 약 1 x 10-8 이하, 약 1 x 10-9 이하 또는 약 0.2 x 10-9 이하의 IC50을 가지면서 표준 시험관 내 검정에서 인간 NGF 생체활성을 중화시킨다. 특정 양태에 있어서, NGF 항체는 상기-언급한 KD 값(들)을 가지면서 인간 NGF 폴리펩티드로부터 해리되고, 상기 언급한 IC50 값을 가지면서 표준 시험관 내 검정에서 인간 NGF 생체활성을 중화시킨다.
본 발명의 특정 바람직한 양태는 하기의 특정 바람직한 양태의 보다 상세한 설명 및 특허청구범위로부터 명백해질 것이다.
도 1은 하이브리도마 조건화 배지로부터 정제된 4D4 모노클로날 항체에 의한 DRG 뉴런 기저 중화 생물학적 검정에서 NGF 활성의 중화를 나타내는 그래프를 도시한 것이다.
도 2는 하이브리도마 조건화 배지로부터 정제된 항-NGF 모노클로날 항체(4D4)에 의한 DRG 뉴런 기저 중화 생물학적 검정에서 인간 NGF 활성에 의해 촉진되는 VR1 발현 및 NGF 활성의 중화를 나타내는 그래프를 도시한 것이다.
도 3은 IgG2 또는 IgG2로서, 그리고 회전병 배양(R) 또는 스피너 플라스크(R)에서 성장시킨 세포에서 발현되는 경우에 일시적으로 발현된 재조합 항-NGF 4D4 모노클로날 항체에 의한 DRG 뉴런 기저 중화 생물학적 검정에서 NGF 활성의 중화를 나타내는 그래프를 도시한 것이다.
도 4는 뉴트로핀의 서열 정렬을 도시한 것이다. 서열 위에 넘버링 및 2차 구조 요소는 성숙 인간 NGF를 의미한다. 보존 잔기는 별표로 표시하였고, 낮은 서열 상동성을 갖는 영역은 그늘져 있다. NGF 인간은 SEQ ID NO: 135이고; NGF 마우스는 SEQ ID NO: 136이며; BDNF는 SEQ ID NO: 137이고; NT3은 SEQ ID NO: 138이다.
도 5는 14D10 (SEQ ID NO: 98), 6H9 (SEQ ID NO: 104), 7H2 (SEQ ID NO: 110), 4G6 (SEQ ID NO: 116), 14D11 (SEQ ID NO: 92), 및 4D4 (SEQ ID NO: 22) 항체에 대한 항-NGF CDR1 중쇄 정렬 및 동일성％를 나타낸다.
도 6은 14D10 (SEQ ID NO: 99), 6H9 (SEQ ID NO: 105), 7H2 (SEQ ID NO: 111), 4G6 (SEQ ID NO: 117), 14D11 (SEQ ID NO: 93), 및 4D4 (SEQ ID NO: 18) 항체에 대한 항-NGF CDR2 중쇄 정렬 및 동일성％를 나타낸다.
도 7은 14D10 (SEQ ID NO: 100), 6H9 (SEQ ID NO: 106), 7H2 (SEQ ID NO: 112), 4G6 (SEQ ID NO: 118), 14D11 (SEQ ID NO: 94), 및 4D4 (SEQ ID NO: 14) 항체에 대한 항-NGF CDR3 중쇄 정렬 및 동일성％를 나타낸다.
도 8은 14D10 (SEQ ID NO: 95), 6H9 (SEQ ID NO: 107), 7H2 (SEQ ID NO: 113), 4G6a (SEQ ID NO: 119), 4G6b (SEQ ID NO: 122), 4G6c (SEQ ID NO: 125), 4G6d (SEQ ID NO: 128), 4G6e (SEQ ID NO: 132), 14D11 (SEQ ID NO: 95), 및 4D4 (SEQ ID NO: 24) 항체에 대한 항-NGF CDR1 경쇄 정렬 및 동일성％를 나타낸다(4G6a는 20031028340으로서 다양한 도면에서 언급되고; 4G6b는 20031028351로서 다양한 도면에서 언급되며; 4G6c는 20031071526으로서 다양한 도면에서 언급되고; 4G6d는 20031028344로서 다양한 도면에서 언급되며; 4G6e는 20031000528로서 다양한 도면에서 언급된다).
도 9는 14D10 (SEQ ID NO: 96), 6H9 (SEQ ID NO: 108), 7H2 (SEQ ID NO: 114), 4G6a (SEQ ID NO: 120), 4G6b (SEQ ID NO: 123), 4G6c (SEQ ID NO: 126), 4G6d (SEQ ID NO: 129), 4G6e (SEQ ID NO: 133), 14D11 (SEQ ID NO: 96), 및 4D4 (SEQ ID NO: 20) 항체에 대한 항-NGF CDR2 경쇄 정렬 및 동일성％를 나타낸다(4G6a는 20031028340으로서 다양한 도면에서 언급되고; 4G6b는 20031028351로서 다양한 도면에서 언급되며; 4G6c는 20031071526으로서 다양한 도면에서 언급되고; 4G6d는 20031028344로서 다양한 도면에서 언급되며; 4G6e는 20031000528로서 다양한 도면에서 언급된다).
도 10은 14D10 (SEQ ID NO: 97), 6H9 (SEQ ID NO: 109), 7H2 (SEQ ID NO: 115), 4G6a (SEQ ID NO: 121), 4G6b (SEQ ID NO: 124), 4G6c (SEQ ID NO: 127), 4G6d (SEQ ID NO: 130), 4G6e (SEQ ID NO: 134), 14D11 (SEQ ID NO: 97), 및 4D4 (SEQ ID NO: 16) 항체에 대한 항-NGF CDR3 경쇄 정렬 및 동일성％를 나타낸다(4G6a는 20031028340으로서 다양한 도면에서 언급되고; 4G6b는 20031028351로서 다양한 도면에서 언급되며; 4G6c는 20031071526으로서 다양한 도면에서 언급되고; 4G6d는 20031028344로서 다양한 도면에서 언급되며; 4G6e는 20031000528로서 다양한 도면에서 언급된다).
도 11은 14D10 (SEQ ID NO: 82), 6H9 (SEQ ID NO: 84), 7H2 (SEQ ID NO: 86), 4G6a (SEQ ID NO: 88), 4G6b (SEQ ID NO: 89), 4G6c (SEQ ID NO: 90), 4G6d (SEQ ID NO: 91), 4G6e (SEQ ID NO: 131), 14D11 (SEQ ID NO: 80), 및 4D4 (SEQ ID NO: 12) 항체에 대한 항-NGF 경쇄 정렬 및 동일성％를 나타낸다(4G6a는 20031028340으로서 다양한 도면에서 언급되고; 4G6b는 20031028351로서 다양한 도면에서 언급되며; 4G6c는 20031071526으로서 다양한 도면에서 언급되고; 4G6d는 20031028344로서 다양한 도면에서 언급되며; 4G6e는 20031000528로서 다양한 도면에서 언급된다).
도 12는 4D4 (SEQ ID NO: 10), 4G6 (SEQ ID NO: 87), 14D10 (SEQ ID NO: 81), 14D11 (SEQ ID NO: 79), 7H2 (SEQ ID NO: 85), 및 6H9 (SEQ ID NO: 83) 항체에 대한 항-NGF 중쇄 정렬 및 동일성％를 나타낸다.
특정 바람직한 양태의 상세한 설명
본 명세서에 사용된 섹션 제목은 단지 조직적 목적을 위한 것이고, 기재된 내용을 제한하는 것으로 해석되지 않는다. 이 출원에 인용된 모든 참조문헌은 확실히 임의의 목적을 위해 참조로 인용된 것이다.
정의
통상적인 기술이 재조합 DNA, 올리고뉴클레오티드 합성 및 조직 배양과 형질전환을 위해 사용될 수 있다(예: 전기천공법, 리포펙션). 효소 반응 및 정제 기술은 제조업자의 사양에 따라 또는 선행 기술분야에서 통상 수반되는 바와 같이, 또는 본 명세서에 기재된 바와 같이 수행할 수 있다. 상기 기술 및 방법들은 일반적으로 당해 분야에 잘 공지된 방법에 따라 및 본 명세서를 통해 인용되고 논의된 다양한 일반적이고 보다 특정한 참조문헌에 기재된 바와 같이 수행할 수 있다(참조예: Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 이는 본 명세서에 임의의 목적을 위해 참조로 인용된다). 특별한 정의가 달리 제공되지 않으면, 본 명세서에 기재된 분석화학, 합성 유기화학과 의학 및 약학 화학과 관련하여 사용된 명명법, 및 이의 실험실 방법과 기술들은 당해 분야에 잘 공지되어 통상 사용되는 것들이다. 유사하게, 통상적인 기술이 화학적 합성, 화학적 분석, 약제학적 제제, 제형 및 전달과, 환자의 치료를 위해 사용될 수 있다.
본 기재에 따라 사용되는 바와 같이, 하기의 용어는 달리 제시되지 않는 한, 다음의 의미를 갖는 것으로 이해해야 할 것이다: 본 발명의 항체과 관련하여 구문 "생물학적 특성(biological property)", "생물학적 특징(biological characteristic)" 및 용어 "활성(activity)"은 본 명세서에서 상호교환적으로 사용되며, 이로써 제한되는 것은 아니지만, 에피토프 친화성 및 특이성(예: 인간 NGF에 대한 항-인간 NGF 인간 항체 결합), 표적 폴리펩티드의 활성(예: NGF 활성)을 길항하는 능력, 항체의 생체 내 안정성 및 항체의 면역 특성을 포함한다. 당해 분야에서 인지된 항체의 다른 확인 가능한 생물학적 특성 또는 특징은, 예를 들면, 교차-반응성(즉, 일반적으로 표적 폴리펩티드의 비-인간 동족체와, 또는 다른 단백질이나 조직과) 및 포유동물 세포에서 단백질의 높은 발현 수준을 보존하는 능력을 포함한다. 상기 언급한 특성 또는 특징은, 이로써 제한되는 것은 아니지만, ELISA, 경쟁적 ELISA, 표면 플라스몬 공명 분석, 시험관 내 및 생체 내 중화 검정법(예: 실시예 2), 및 인간, 영장류 또는 필요에 따를 수 있는 임의의 다른 공급원을 포함한 상이한 공급원으로부터의 조직 절제를 갖는 면역조직화학을 포함한 당해 분야에 인지된 기술을 사용하여 관찰하거나 측정할 수 있다. 항-인간 NGF 인간 항체의 특별한 활성 및 생물학적 특성이 하기의 실시예에 보다 상세히 기재되어 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "분리된 폴리뉴클레오티드"는 게놈, cDNA 또는 합성 기원이나 이들의 조합을 의미하며, 이때 이의 기원의 장점에 의해, 분리된 폴리뉴클레오티드(1)는 분리된 폴리뉴클레오티드가 자연에서 발견되는 폴리뉴클레오티드의 모두 또는 일부와 관련되지 않거나, (2) 자연에서 결합되지 않은 폴리뉴클레오티드에 결합되거나, (3) 보다 큰 서열의 일부로서 자연에서 형성되지 않는다.
본 명세서에서 언급된 용어 "분리된 단백질"은 목적 단백질(1)이 통상 함께 발견되는 적어도 일부 다른 단백질을 포함하지 않거나, (2) 필수적으로 동일한 공급원으로부터, 예를 들면, 동일한 종으로부터의 다른 단백질을 포함하지 않거나, (3) 상이한 종으로부터의 세포에 의해 발현되거나, (4) 폴리뉴클레오티드, 지질, 탄수화물 또는 자연에서 관련되는 다른 물질의 적어도 약 50％로부터 분리되었거나, (5) "분리된 단백질"이 자연에서 관련이 있는 단백질의 일부와 (공유 또는 비공유 상호작용에 의해) 관련되지 않거나, (6) 자연에서 관련되지 않은 폴리펩티드와 작동가능하게(operably) 관련되거나(공유 또는 비공유 상호작용에 의해), (7) 자연에서 형성되지 않음을 의미한다. 상기 분리된 단백질은 합성 기원의 게놈 DNA, cDNA, mRNA 또는 다른 RNA나, 이들의 임의 조합에 의해 암호화될 수 있다. 바람직하게는, 분리된 단백질은 실질적으로 이의 사용(치료학적, 진단학적, 예방학적, 연구 또는 기타)을 방해하는 이의 자연스런 환경에서 발견되는 단백질이나 폴리펩티드 또는 다른 오염물을 포함하지 않는다.
"분리된" 항체는 이의 자연적 환경의 성분으로부터 확인되고, 분리 및/또는 회수된 것이다. 이의 자연적 환경의 오염물 성분은 항체를 위한 진단학적 또는 치료학적 용도를 방해하는 물질이고, 효소, 호르몬 및 다른 단백질성 또는 비-단백질성 용질을 포함할 수 있다. 바람직한 양태로, 항체는 (1) 로우리(Lowry) 방법에 의해 측정된 바와 같이 항체의 95중량％ 초과 및 가장 바람직하게는 99중량％ 초과로, (2) 스피닝 컵 서열 분석기의 사용에 의해 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 적어도 15개 잔기를 수득하기에 충분한 정도로, 또는 (3) 쿠마시 블루 또는 바람직하게는 은 착색을 사용하여 환원 또는 비환원 조건하에 SDS-PAGE에 의한 상동성으로 정제될 것이다. 분리된 항체는 항체 본래 환경의 적어도 한 성분이 존재하지 않을 것이므로, 재조합 세포 내에 동일 반응계내 항체를 포함한다.
용어 "폴리펩티드" 또는 "단백질"은 천연 단백질 서열을 갖는 분자, 즉 자연-발생적인 특이적으로 비-재조합된 세포, 또는 유전자-조작 또는 재조합 세포에 의해 생성된 단백질을 의미하며, 본래 단백질의 아미노산 서열을 갖는 분자, 또는 본래 서열의 하나 이상의 아미노산으로부터의 결실, 이에 대한 부가 및/또는 이의 치환을 갖는 분자를 포함한다. 용어 "폴리펩티드" 및 "단백질"은 특이적으로 항-NGF 항체, 또는 항-NGF 항체의 하나 이상의 아미노산으로부터의 결실, 이에 대한 부가 및/또는 이의 치환을 갖는 서열을 포함한다.
용어 "폴리펩티드 단편"은 아미노-말단 결실, 카복실-말단 결실 및/또는 내부 결실을 갖는 폴리펩티드를 의미한다. 특정 양태에 있어서, 단편은 길이가 적어도 5 내지 약 500개의 아미노산이다. 특정 양태에 있어서, 단편은 길이가 적어도 5, 6, 8, 10, 14, 20, 50, 70, 100, 110, 150, 200, 250, 300, 350, 400 또는 450개의 아미노산이다. 특히 유용한 폴리펩티드 단편은 결합 도메인을 포함한, 기능적 도메인을 포함한다. 항-NGF 항체의 경우에, 유용한 단편은 이로써 제한되는 것은 아니지만, CDR 영역, 중쇄 또는 경쇄의 가변 도메인, 항체 쇄의 일부 또는 2개의 CDR을 포함한 바로 이의 가변 영역 등을 포함한다.
용어 "특이적 결합제"는 표적에 특이적으로 결합하는 천연 또는 비-천연 분자를 의미한다. 특이적 결합제의 예는, 이로써 제한되는 것은 아니지만, 단백질, 펩티드, 핵산, 탄수화물 및 지질을 포함한다. 특정 양태에 있어서, 특이적 결합제는 항체이다.
용어 "NGF에 대한 특이적 결합제"는 NGF의 일부에 특이적으로 결합하는 특이적 결합제를 의미한다. 특정 양태에 있어서, NGF에 대한 특이적 결합제는 NGF에 특이적으로 결합하는 항체이다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "면역학적으로 기능적인 면역글로불린 단편"은 적어도 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 CDR를 함유하는 폴리펩티드 단편을 의미한다. 본 발명의 면역학적으로 기능적인 면역글로불린 단편은 항원에 결합할 수 있다. 바람직한 양태로, 항원은 수용체에 특이적으로 결합하는 리간드이다. 이들 양태에 있어서, 본 발명의 면역학적으로 기능적인 면역글로불린 단편의 결합은 이의 수용체에 대한 리간드의 결합을 방지하여, 수용체에 대한 리간드 결합으로부터 생성되는 생물학적 반응을 차단한다. 바람직하게는, 본 발명의 면역학적으로 기능적인 면역글로불린 단편은 NGF에 특이적으로 결합한다. 가장 바람직하게는, 단편은 인간 NGF에 특이적으로 결합한다.
본 명세서에 사용된 바와 같고 목적물에 적용되는 용어 "자연-발생적인"은 목적물이 자연에서 발견될 수 있다는 사실을 의미한다. 예를 들면, 천연의 공급원으로부터 분리될 수 있고, 사람에 의해 의도적으로 변형되지 않은 유기체(바이러스를 포함)에 존재하는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열은 자연-발생적이다.
용어 "작동가능하게 연결된(operably linked)"은 용어가 적용되는 성분들이 적절한 조건하에 그들을 그들의 고유 기능을 수행하도록 허용하는 관계에 존재함을 의미한다. 예를 들면, 단백질 암호화 서열에 "작동가능하게 연결된" 조절 서열(control sequence)은 단백질 암호화 서열의 발현이 조절 서열의 전사 활성과 양립하는 조건하에 성취되도록 이에 결합된다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "조절 서열(control sequence)"은 그들이 결합된 암호화 서열의 발현, 처리 또는 세포내 편재화에 영향을 줄 수 있는 폴리뉴클레오티드 서열을 의미한다. 상기 조절 서열의 특성은 숙주 유기체에 따라 좌우될 수 있다. 특별한 양태로, 원핵생물에 대한 조절 서열은 프로모터, 리보솜 결합 부위 및 전사 종결 서열을 포함할 수 있다. 다른 특별한 양태로, 진핵생물에 대한 조절 서열은 전사 인자, 전사 인핸서 서열, 전사 종결 서열 및 폴리아데닐화 서열을 위한 하나 또는 다수의 인지 부위를 포함하는 프로모터를 포함할 수 있다. 특정 양태에 있어서, "조절 서열"은 리더 서열 및/또는 융합 파트너 서열을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 언급된 바와 같은 용어 "폴리뉴클레오티드"는 길이가 적어도 10개의 뉴클레오티드인 단일 가닥 또는 이중 가닥 핵산 중합체를 의미한다. 특정 양태에 있어서, 폴리뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드는 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드나, 뉴클레오티드 중 한 형태의 변형된 형태일 수 있다. 상기 변형은 염기성 변형(예: 브로무리딘), 리보스 변형(예: 아라비노시드 및 2',3'-디데옥시리보스) 및 뉴클레오티드간 결합 변형(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포로셀레노에이트, 포스포로디셀레노에이트, 포스포로아닐로티오에이트, 포스포르아닐라데이트 및 포스포로아미데이트)을 포함한다. 용어 "폴리뉴클레오티드"는 특히 DNA의 단일 가닥 및 이중 가닥 형태를 포함한다.
본 명세서에서 언급된 용어 "올리고뉴클레오티드"는 자연발생적인 및/또는 비-자연발생적인 올리고뉴클레오티드 결합에 의해 함께 연결된 자연발생적 및 변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 올리고뉴클레오티드는 일반적으로 단일 가닥이고, 200개의 뉴클레오티드 또는 보다 적은 길이를 갖는 구성원을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서브셋(subset)이다. 특정 양태에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 길이가 10 내지 60개의 뉴클레오티드이다. 특정 양태에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 길이가 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20 내지 40개의 뉴클레오티드이다. 올리고뉴클레오티드는, 예를 들면, 유전적 돌연변이의 구성에 사용하기 위한 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 단백질-암호화 서열과 관련하여 센스 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드일 수 있다.
용어 "자연발생적인 뉴클레오티드"는 데옥시리보뉴클레오티드 및 리보뉴클레오티드를 포함한다. 용어 "변형된 뉴클레오티드"는 변형되거나 치환된 당기(sugar group) 등을 갖는 뉴클레오티드를 포함한다. 용어 "올리고뉴클레오티드 결합"은 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포로셀레노에이트, 포스포로디셀레노에이트, 포스포로아닐로티오에이트, 포스포르아닐라데이트 및 포스포로아미데이트 등과 같은 올리고뉴클레오티드 결합을 포함한다(참조예: LaPlanche et al., 1986, Nucl. Acids Res., 14:9081; Stec et al., 1984, J. Am. Chem. Soc., 106:6077; Stein et al., 1988, Nucl. Acids Res., 16:3209; Zon et al., 1991, Anti-Cancer Drug Design, 6:539; Zon et al., 1991, OLIGONUCLEOTIDES AND ANALOGUES: A PRACTICAL APPROACH, pp. 87-108 (F. Eckstein, Ed.), Oxford University Press, Oxford England; Stec et al., 미국 특허 제5,151,510호; Uhlmann and Peyman, 1990, Chemical Reviews, 90:543, 이의 기재들은 본 명세서에 임의의 목적을 위해 참조로 인용된다). 올리고뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드 또는 이의 하이브리드화의 검출을 가능하게 하는 검출가능한 표지를 포함할 수 있다.
용어 "벡터"는 연결된 다른 핵산을 운반할 수 있는 핵산 분자를 포함한다. 벡터의 한 형태는 "플라스미드"로, 이는 부가의 DNA 절편이 결합될 수 있는 원형 이중 가닥 DNA 루프를 의미한다. 벡터의 다른 형태는 바이러스 벡터로, 여기에서 부가의 DNA 절편은 바이러스 게놈에 결합될 수 있다. 어떤 벡터는 그들이 도입되는 숙주 세포에서 자율 복제될 수 있다(예: 세균 기원 복제를 갖는 세균 벡터 및 에피솜 포유동물 벡터). 다른 벡터(예: 비-에피솜 포유동물 벡터)가 숙주 세포로 도입시 숙주 세포의 게놈으로 통합될 수 있고, 이에 의해 숙주 게놈을 따라 복제된다. 더욱이, 어떤 벡터는 그들이 작동적으로 연결된(operatively linked) 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 상기 벡터는 본 명세서에서 "재조합 발현 벡터(또는 간단히, "발현 벡터")로 언급된다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술에서 유용한 발현 벡터는 종종 플라스미드의 형태로 존재한다. 본 명세서에서, "플라스미드" 및 "벡터"는 플라스미드가 가장 통상적으로 사용되는 벡터의 형태이기 때문에 상호교환적으로 사용될 수 있다. 그러나, 본 발명은 동등한 기능을 하는 다른 형태의 발현 벡터, 예를 들면, 바이러스 벡터(예: 복제 결핍 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-관련 바이러스)를 포함하고자 한다.
구문 "재조합 숙주 세포"(또는 간단히 "숙주 세포")는 재조합 발현 벡터가 도입된 세포를 포함한다. 상기 용어는 특별한 개체 세포뿐만 아니라, 상기 세포의 자손을 의미하고자 함을 당해 분야의 숙련가는 이해할 것이다. 어떤 변형이 돌연변이 또는 환경적 영향으로 인하여 이어지는 세대에서 일어날 수 있기 때문에, 상기 자손은, 실제로 모 세포와 동일하지 않을 수 있지만, 여전히 본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "숙주 세포"의 범위 내에 포함된다. 광범위한 숙주 발현 시스템은 세균, 효모, 바쿨로바이러스 및 포유동물 발현 시스템(및 파아지 디스플레이 발현 시스템)을 포함한 본 발명의 항체를 발현하기 위하여 사용될 수 있다. 적절한 세균 발현 벡터의 한 예는 pUC19이다. 항체를 재조합적으로 발현하기 위하여, 숙주 세포는 경쇄 및 중쇄가 숙주 세포에서 발현되고, 바람직하게는 숙주 세포가 배양되는 배지로 분비되어, 이 배지로부터 항체를 회수할 수 있도록, 항체의 면역글로불린 경쇄 및 중쇄를 암호화하는 DNA 단편을 운반하는 하나 이상의 재조합 발현 벡터에 의해 형질감염시킨다. 표준 재조합 DNA 방법이 항체 중쇄 및 경쇄 유전자를 수득하고, 이들 유전자를 재조합 발현 벡터로 혼입시켜, 문헌(Sambrook et al., 2001, MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratories, Ausubel, F.M. et al. (eds.) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, (1989) 및 Boss et al.에 대한 미국 특허 제4,816,397호)에 기재된 것과 같은 숙주 세포로 벡터를 도입시키기 위하여 사용된다.
용어 "숙주 세포"는 형질전환되거나, 핵산 서열에 의해 형질전환된 다음 선택된 관심 유전자를 발현시킬 수 있는 세포를 의미하기 위하여 사용된다. 상기 용어는 선택된 유전자가 존재하는 한, 자손이 본래 부모와 형태적으로 또는 유전적 구성면에서 동일하든지 간에, 모 세포의 자손을 포함한다.
용어 "형질도입(transduction)"은 대개 파지(phage)에 의해 하나의 세균에서 다른 것으로 유전자의 전달을 의미하기 위하여 사용된다. "형질도입"은 또한 레트로바이러스에 의한 진핵세포 서열의 획득 및 전달을 의미한다.
용어 "형질감염(transfection)"은 세포에 의한 외래 또는 외인성 DNA의 흡수를 의미하기 위하여 사용되고, 세포는 외인성 DNA가 세포막 내로 도입된 경우 "형질감염"된다. 수많은 형질감염 기술은 당해 분야에 잘 공지되어 있고, 본 명세서에 기재되어 있다(참조예: Graham et al., 1973, Virology 52:456; Sambrook et al., 2001, MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratories; Davis et al., 1986, BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Elsevier; and Chu et al., 1981, Gene 13:197). 상기 기술은 하나 이상의 외인성 DNA 잔기를 적절한 숙주 세포로 도입시키기 위하여 사용될 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "형질전환(transformation)"은 세포의 유전적 특성의 변화를 의미하며, 세포는 새로운 DNA를 함유하도록 변형시킨 경우 형질전환된다. 예를 들면, 세포는 이의 천연 상태로부터 유전적으로 변형되는 경우 형질전환된다. 형질감염 또는 형질도입에 이어서, 형질전환 DNA는 세포의 염색체로 물리적으로 통합함으로써 세포의 것과 재조합되거나, 복제 없이 에피솜 요소로서 일시적으로 유지하거나, 플라스미드로서 독립적으로 복제할 수 있다. 세포는 DNA가 세포 분할과 함께 복제되는 경우에 안정하게 형질전환된 것으로 간주한다.
생물학적 물질(예: 핵산 분자, 폴리펩티드, 숙주 세포 등)과 관련하여 사용되는 경우에, 용어 "자연발생적인" 또는 "천연의(native)"는 자연에서 발견되고, 사람에 의해 조작되지 않은 물질을 의미한다. 유사하게, 본 명세서에 사용된 바와 같은 "비-자연발생적인" 또는 "비-천연의"는 자연에서 발견되지 않거나, 사람에 의해 구조적으로 변형 또는 합성된 물질을 의미한다.
용어 "항원"은 선택적 결합제(예: 항체)에 의해 결합될 수 있고, 또한 항원의 에피토프에 결합될 수 있는 항체를 생성하기 위하여 동물에 사용될 수 있는 분자 또는 분자의 일부를 의미한다. 항원은 하나 이상의 에피토프를 가질 수 있다.
당해 분야에 공지된 바와 같이 용어 "동일성(identity)"은 이의 서열을 비교함으로써 측정된 바와 같이, 둘 이상의 폴리펩티드 분자 또는 둘 이상의 핵산 분자 서열 사이의 관계를 의미한다. 당해 분야에서, "동일성"은 또한 둘 이상의 뉴클레오티드 또는 둘 이상의 아미노산 서열 스트링 사이에 매치에 의해 측정된 바와 같이, 각 경우에 해당될 수 있는, 핵산 분자 또는 폴리펩티드 사이에 서열 관련도를 의미한다. "동일성"은 특별한 수학적 모델 또는 컴퓨터 프로그램(즉, "알고리즘")에 의해 어드레스되는 갭 정렬(존재한다면)을 갖는 둘 이상의 보다 작은 서열 사이에 동일한 매치 비율(％)을 측정한다.
용어 "유사성(similarity)"은 관련된 개념에 대해, 단 "동일성"과 대조적으로 당해 분야에서 사용되며, "유사성"은 관련도의 척도를 의미하고, 이는 동일한 매치 및 보존적 치환 매치를 모두 포함한다. 두 폴리펩티드 서열이, 예를 들면, 10/20 동일한 아미노산을 갖고, 나머지는 모두 비-보존적 치환이라면, 동일성 및 유사성 비율은 모두 50％이다. 동일한 샘플에서, 보존적 치환이 존재하는 5개 이상의 위치가 존재한다면, 동일성 비율은 50％로 남지만, 유사성 비율은 75％이다(15/20). 따라서, 보존적 치환이 존재하는 경우에, 두 폴리펩티드 사이의 유사성 비율은 그들 두 폴리펩티드 사이의 동일성 비율보다 더 높을 것이다.
관련 핵산 및 폴리펩티드의 동일성 및 유사성은 공지된 방법에 의해 용이하게 계산할 수 있다. 상기 방법은, 이로써 제한되는 것은 아니지만, 문헌(COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY, (Lesk, A.M., ed.), 1988, Oxford University Press, New York; BIOCOMPUTING: INFORMATICS AND GENOME PROJECTS, (Smith, D.W., ed.), 1993, Academic Press, New York; COMPUTER ANALYSIS OF SEQUENCE DATA, Part 1, (Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds.), 1994, Humana Press, New Jersey; von Heinje, G., SEQUENCE ANALYSIS IN MOLECULAR BIOLOGY, 1987, Academic Press; SEQUENCE ANALYSIS PRIMER, (Gribskov, M. and Devereux, J., eds.), 1991, M. Stockton Press, New York; Carillo et al., 1988, SIAM J. Applied Math., 48:1073; and Durbin et al., 1998, BIOLOGICAL SEQUENCE ANALYSIS, Cambridge University Press)에 기재된 것들을 포함한다.
동일성을 측정하기 위한 바람직한 방법은 시험된 서열 사이에 최대 매치를 제공하도록 고안된다. 동일성을 측정하는 방법은 공개 활용 컴퓨터 프로그램에 기재되어 있다. 두 서열 사이에 동일성을 측정하는 바람직한 컴퓨터 프로그램 방법은, 이로써 제한되는 것은 아니지만, GAP를 포함한, GCG 프로그램 패키지를 포함한다(Devereux et al., 1984, Nucl. Acid. Res., 12:387; Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI), BLASTP, BLASTN, and FASTA (Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol., 215:403-410). BLASTX 프로그램은 the National Center for Biotechnology Information (NCBI) 및 다른 공급처(상기 BLAST Manual, Altschul et al. NCB/NLM/NIH Bethesda, MD 20894; Altschul et al., 1990)로부터 공개적으로 활용되고 있다. 잘-알려진 스미스 워터만(Smith Waterman) 알고리즘이 또한 동일성을 측정하는데 사용될 수 있다.
2개의 아미노산 서열을 정렬하기 위한 특정 정렬도는 두 서열의 단지 짧은 영역의 매칭을 생성할 수 있으며, 이 작은 정렬 영역은 심지어 두 전장 서열 사이에 상당한 관계가 존재하지 않음에도 불구하고, 매우 높은 서열 동일성을 가질 수 있다. 따라서, 특정 양태에 있어서, 선택된 정렬 방법(GAP 프로그램)은 표적 폴리펩티드의 적어도 50개의 인접 아미노산에 걸쳐지는 정렬을 생성한다.
예를 들면, 컴퓨터 알고리즘 GAP(Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI)를 사용하여, 서열 동일성 비율이 측정될 두 폴리펩티드를 그들 각각의 아미노산의 최적 매칭을 위해 정렬한다[알고리즘에 의해 측정된 바와 같은, "매치 스팬(matched span)"]. 특정 양태에 있어서, 갭 오프닝 패널티(gap opening penalty)(이는 평균 대각선의 3배로서 계산되며; 이때 "평균 대각선"은 사용되는 비교 행렬의 대각선의 평균이고; "대각선"은 특별한 비교 행렬에 의해 각각의 완전한 아미노산 매치에 할당된 스코어 또는 숫자이다) 및 갭 확장 패널티(gap extension penalty)(이는 대개 갭 오프닝 패널티의 1/10이다)와, 비교 행렬(예: PAM250 또는 BLOSUM 62)이 알고리즘과 관련하여 사용된다. 특정 양태에 있어서, 표준 비교 행렬(참조: PAM 250 비교 행렬의 경우, Dayhoff et al., 1978, Atlas of Protein Sequence and Structure, 5:345-352; BLOSUM 62 비교 행렬의 경우, Henikoff et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 89:10915-10919)이 또한 알고리즘에 의해 사용된다.
특정 양태에 있어서, 폴리펩티드 서열 비교를 위한 파라미터는 다음을 포함한다:
알고리즘: Needleman et al., 1970, J. Mol. Biol., 48:443-453;
비교 행렬: 상기 Henikoff et al.,1992로부터의 BLOSUM 62;
갭 패널티: 12
갭 길이 패널티: 4
유사성 역치: 0
GAP 프로그램은 상기 파라미터와 함께 유용할 수 있다. 특정 양태에 있어서, 상기 언급한 파라미터는 GAP 알고리즘을 사용하는 폴리펩티드 비교(말단 갭에 대한 패널티 없음과 함께)를 위한 디폴트 파라미터이다.
용어 "상동성(homology)"은 단백질 또는 핵산 서열 사이의 유사성 정도를 의미한다. 상동성 정보는 어떤 단백질 또는 핵산 종의 유전적 관련도를 이해하는데 유용하다. 상동성은 서열을 정렬 및 비교하여 측정할 수 있다. 통상적으로, 아미노산 상동성을 측정하기 위하여, 단백질 서열은 공지된 단백질 서열의 데이터베이스와 비교한다. 상동성인 서열은 그들의 서열을 따라 어떤 곳에서 통상 기능적 동일성을 공유한다. 낮은 정도의 유사성 또는 동일성이 반드시 상동성의 결여를 나타내지 않음에도 불구하고, 높은 정도의 유사성 또는 동일성은 대개 상동성을 나타낸다.
몇몇 접근법이 상동성을 측정하기 위하여 한 서열로부터의 아미노산과 다른 서열의 아미노산을 비교하기 위하여 사용될 수 있다. 일반적으로, 접근법은 두 범주에 속한다: (1) 유사성 행렬을 생성하기 위한 물리적 특성(예: 극성, 전하 및 반 데르 발스 부피)의 비교; 및 (2) PAM(Point Accepted Mutation Matrix)을 생성하기 위한, 공지된 상동 단백질로부터 많은 단백질 서열의 관찰을 기준으로 하는, 임의의 다른 아미노산에 의한 서열 중 아미노산의 유사 치환의 비교.
동일성 비율은 또한 디폴트 파라미터(예: GAP 패널티 5, GAP 오프닝 패널티 15, GAP 확장 패널티 6.6)를 사용하여, 벡터 NTI suite 9.0.0 소프트웨어 패키지의 모듈로서, 프로그램 니들(EMBOSS 패키지) 또는 스트레처(EMBOSS 패키지) 또는 프로그램 정렬 X를 사용하여 계산할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 20개의 통상적인 아미노산 및 그들의 약어는 통상적인 사용을 따른다[참조: IMMUNOLOGY--A SYNTHESIS, 2nd Edition, (E. S. Golub and D. R. Gren, Eds.), Sinauer Associates: Sunderland, MA, 1991, 임의의 목적을 위해 본 명세서에 참조로 인용됨]. 20개의 통상적인 아미노산; 비천연 아미노산(예: α-,α-이치환된 아미노산, N-알킬 아미노산, 락트산 및 다른 비통상적인 아미노산)의 입체이성체(예: D-아미노산)가 또한 본 발명의 폴리펩티드를 위한 적절한 성분일 수 있다. 비통상적인 아미노산의 예는 다음을 포함한다: 4-하이드록시프롤린, γ-카복시글루타메이트, ε-N,N,N-트리메틸리신, ε-N-아세틸리신, O-포스포세린, N-아세틸세린, N-포밀메티오닌, 3-메틸히스티딘, 5-하이드록시리신, σ-N-메틸아르기닌 및 다른 유사한 아미노산과 이미노산(예: 4-하이드록시프롤린). 본 명세서에 사용된 폴리펩티드 표기법에서, 표준 용법 및 관례에 따르면, 좌측 방향은 아미노 말단 방향이고, 우측 방향은 카복실-말단 방향이다.
자연발생적인 잔기는 통상적인 측쇄 특성을 기준으로 하는 클래스들로 나뉠 수 있다:
1) 소수성: 노르류신(Nor), Met, Ala, Val, Leu, Ile, Phe, Trp, Tyr, Pro;
2) 극성 친수성: Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, His, Lys, Ser, Thr;
3) 지방족: Ala, Gly, Ile, Leu, Val, Pro;
4) 지방족 소수성: Ala, Ile, Leu, Val, Pro;
5) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
6) 산성: Asp, Glu;
7) 염기성: His, Lys, Arg;
8) 쇄 배향에 영향을 주는 잔기: Gly, Pro;
9) 방향족: His, Trp, Tyr, Phe; 및
10) 방향족 소수성: Phe, Trp, Tyr.
보존적 아미노산 치환은 동일한 클래스의 다른 멤버에 의한 이들 클래스 중 한 멤버의 교환을 포함할 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 비-자연발생적인 아미노산 잔기를 포함할 수 있으며, 이는 통상 생물학적 시스템에서 합성에 의해서 보다는 오히려 화학적 펩티드 합성에 의해 혼입된다. 이들은 펩티도미메틱(peptidomimetics) 및 아미노산 부분들의 다른 역 또는 반전 형태를 포함한다.
비-보존적 치환은 다른 클래스로부터의 멤버에 의한 이들 클래스 중 한 멤버의 교환을 포함할 수 있다. 상기 치환된 잔기는 비-인간 항체와 상동성인 인간 항체 영역으로, 또는 분자의 비-상동성 영역으로 도입될 수 있다.
상기 변화를 하기 위하여, 특정 양태에 따르면, 아미노산의 수치요법 지수(hydropathic index)가 고려될 수 있다. 각각의 아미노산은 이의 소수성 및 전하 특성을 기준으로 한 수치요법 지수가 부여된다. 그들은 다음과 같다: 이소류신(+4.5); 발린(+4.2); 류신(+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인/시스틴(+2.5); 메티오닌(+1.9); 알라닌(+1.8); 글리신(-0.4); 트레오닌(-0.7); 세린(-0.8); 트립토판(-0.9); 티로신(-1.3); 프롤린(-1.6); 히스티딘(-3.2); 글루타메이트(-3.5); 글루타민(-3.5); 아스파테이트(-3.5); 아스파라긴(-3.5); 리신(-3.9); 및 아르기닌(-4.5).
단백질에 대해 상호적인 생물학적 기능을 부여함에 있어서 수치요법 아미노산 지수의 중요성은 당해 분야에서 이해되고 있다(참조예: Kyte et al., 1982, J. Mol. Biol. 157:105-131). 특정 아미노산이 유사한 수치요법 지수 또는 등급을 갖는 다른 아미노산을 위해 치환되고, 여전히 유사한 생물학적 활성을 유지할 수 있다고 공지되어 있다. 수치요법 지수를 기준으로 하는 변화를 수행함에 있어서, 특정 양태에 있어서, 이의 수치요법 지수가 ±2 이내인 아미노산의 치환이 포함된다. 특정 양태에 있어서, ±1 이내인 것들이 포함되고, 특정 양태에 있어서, ±0.5 이내인 것들이 포함된다.
유사 아미노산의 치환은 특히 이에 의해 생성된 생물학적으로 기능하는 단백질 또는 펩티드를 본 명세서에 기재된 바와 같이, 면역학적 양태에 사용하고자 하는 경우에, 소수성을 기준으로 하여 효과적으로 이루어질 수 있음을 또한 당해 분야에서 알고 있다. 특정 양태에 있어서, 이의 인접한 아미노산의 소수성에 의해 좌우되는 바와 같이, 단백질의 최대 국소 평균 소수성은 이의 면역성 및 항원성과, 즉 단백질의 생물학적 특성과 상관관계가 있다.
하기의 친수성 값이 이들 아미노산 잔기에 부여되었다: 아르기닌(+3.0); 리신(+3.0); 아스파테이트(+3.0 ± 1); 글루타메이트(+3.0 ± 1); 세린(+0.3); 아스파라긴(+0.2); 글루타민(+0.2); 글리신(0); 트레오닌(-0.4); 프롤린(-0.5 ± 1); 알라닌(-0.5); 히스티딘(-0.5); 시스테인(-1.0); 메티오닌(-1.3); 발린(-1.5); 류신(-1.8); 이소류신(-1.8); 티로신(-2.3); 페닐알라닌(-2.5) 및 트립토판(-3.4). 유사한 친수성 값을 기준으로 하여 변화를 수행함에 있어서, 특정 양태에 있어서, 이의 친수성 값이 ±2 이내인 아미노산의 치환이 포함되고, 특정 양태에 있어서, ±1 이내인 것들이 포함되며, 특정 양태에 있어서, ±0.5 이내인 것들이 포함된다. 친수성을 기준으로 하여 1차 아미노산 서열로부터 에피토프를 또한 확인할 수 있다. 이들 영역은 또한 "에피토프 코어 영역"으로서 언급된다.
전형적인 아미노산 치환은 표 1에 제시되어 있다.
Figure pct00001
숙련가는 잘-공지된 기술을 사용하여 본 명세서에 제시된 폴리펩티드의 적절한 변환을 측정할 수 있다. 특정 양태에 있어서, 당해 분야의 숙련가는 활성에 대해 중요한 것으로 믿어지지 않는 표적 영역에 의한 활성의 파괴 없이 변화시킬 수 있는 분자의 적절한 부위를 확인할 수 있다. 다른 양태에 있어서, 숙련가는 유사한 폴리펩티드 중에 보존되는 잔기 및 분자의 부분을 확인할 수 있다. 추가 양태에 있어서, 생물학적 활성의 파괴 없이 또는 폴리펩티드 구조에 역영향을 주지않고, 심지어 생물학적 활성을 위해 또는 구조를 위해 중요할 수 있는 부위를 보존적 아미노산 치환에 적용시킬 수 있다.
또한, 당해 분야의 숙련가는 활성 또는 구조를 위해 중요한 유사한 폴리펩티드에서 잔기를 확인하는 구조-기능 연구를 검토할 수 있다. 상기 비교의 검토시, 숙련가는 유사한 단백질에서 활성 또는 구조를 위해 중요한 아미노산 잔기에 상응하는 단백질의 아미노산 잔기의 중요성을 예상할 수 있다. 당해 분야의 숙련가는 상기 예상되는 중요한 아미노산 잔기에 대한 화학적으로 유사한 아미노산 치환을 선택할 수 있다.
당해 분야의 숙련가는 또한 유사한 폴리펩티드의 그 구조와 관련된 3차원 구조 및 아미노산 서열을 분석할 수 있다. 상기 정보에 비추어, 당해 분야의 숙련가는 이의 3차원 구조에 대해 항체의 아미노산 잔기의 정렬을 예상할 수 있다. 특정 양태에 있어서, 당해 분야의 숙련가는 단백질의 표면 위에 존재하는 것으로 예상되는 아미노산 잔기에 대해 라디칼 변화를 수행하지 않도록 선택할 수 있는데, 이는 상기 라디칼이 다른 분자와의 중요한 상호작용에 관여될 수 있기 때문이다. 더욱이, 당해 분야의 숙련가는 각각의 목적하는 아미노산 잔기에서 단일 아미노산 치환을 함유하는 시험 변환을 생성할 수 있다. 그 다음에, 변환은 당해 분야의 숙련가에게 공지된 활성 검정법을 사용하여 스크린할 수 있다. 상기 변환은 적절한 변환에 대한 정보를 모으기 위해 사용될 수 있다. 예를 들면, 특별한 아미노산 잔기에 대한 변화가 파괴되거나, 바람직하지 못하게 감소되거나 적절치 못한 활성을 일으키는 것으로 발견되었다면, 상기 변화를 갖는 변환은 피할 수 있다. 다시 말해서, 상기 통상적인 실험으로부터 모은 정보를 기준으로 하여, 당해 분야의 숙련가는 추가의 치환이 단독으로 또는 다른 돌연변이와 함께 피해야하는 경우 아미노산을 용이하게 결정할 수 있다.
수많은 과학 문헌이 2차 구조의 예견에 전념하였다(참조: Moult, 1996, Curr. Op. in Biotech. 7:422-427; Chou et al., 1974, Biochemistry 13:222-245; Chou et al., 1974, Biochemistry 113:211-222; Chou et al., 1978, Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol. 47:45-148; Chou et al., 1979, Ann. Rev. Biochem. 47:251-276; 및 Chou et al., 1979, Biophys. J. 26:367-384). 더욱이, 컴퓨터 프로그램이 예상되는 2차 구조를 보조하기 위하여 현재 유용하다. 2차 구조를 예상하는 한 방법은 상동성 모델링을 근거로 한다. 예를 들면, 30％ 초과의 서열 상동 또는 40％ 초과의 유사성을 갖는 2개의 폴리펩티드 또는 단백질은 종종 유사한 구조적 위상을 갖는다. 단백질 구조 데이터베이스(PDB)의 최근 성장은 폴리펩티드 또는 단백질 구조 내에 잠재적인 접힘(fold)의 수를 포함한, 2차 구조의 개선된 예측 가능성을 제공한다(참조: Holm et al., 1999, Nucl. Acid. Res. 27:244-247). 제시된 폴리펩티드 또는 단백질에 제한된 수의 접힘이 존재하고, 임계 수의 구조가 해결된다면, 구조적 예견이 극적으로 보다 정확해질 것임을 제안하였다(Brenner et al., 1997, Curr. Op. Struct. Biol. 7:369-376).
2차 구조를 예견하는 부가의 방법들은 "스레딩(threading)"(Jones, 1997, Curr. Opin. Struct. Biol. 7:377-87; Sippl et al., 1996, Structure 4:15-19), "프로필 분석" (Bowie et al., 1991, Science 253:164-170; Gribskov et al., 1990, Meth. Enzym. 183:146-159; Gribskov et al., 1987, Proc. Nat. Acad. Sci. 84:4355-4358), 및 "진화 결합" (참조: Holm, 1999, 상기; 및 Brenner, 1997, 상기)을 포함한다.
특정 양태에 있어서, 항체 변이체는 글리코실화 변이체를 포함하며, 이때 글리코실화 부위의 수 및/또는 형태는 모 폴리펩티드의 아미노산 서열과 비교하여 변한다. 특정 양태에 있어서, 단백질 변이체는 본래 단백질 보다 더 크거나 적은 수의 N-연결된 글리코실화 부위를 포함한다. N-연결된 글리코실화 부위는 다음의 서열을 특징으로 한다: Asn-X-Ser 또는 Asn-X-Thr(여기에서, X로 표시되는 아미노산 잔기는 프롤린을 제외한, 임의의 아미노산 잔기일 수 있다). 이 서열을 생성하기 위한 아미노산 잔기의 치환은 N-연결된 탄수화물 쇄의 부가를 위한 잠재적인 새로운 부위를 제공한다. 이와 달리, 이 서열을 제거하는 치환은 현존하는 N-연결된 탄수화물 쇄를 제거한다. N-연결된 탄수화물 쇄의 재정렬이 또한 제공되며, 이때 하나 이상의 N-연결된 글리코실화 부위(통상 자연발생적인것)는 제거되고, 하나 이상의 새로운 N-연결된 부위가 생성된다. 부가의 바람직한 항체 변이체는 하나 이상의 시스테인 잔기가 모 아미노산 서열과 비교하여 다른 아미노산(예: 세린)으로부터 결실되거나 이를 위해 치환된 시스테인 변이체를 포함한다. 시스테인 변이체는 항체가 불용성 봉입체의 분리 후와 같이 생물학적 활성 형태로 다시 접혀야 하는 경우에 유용할 수 있다. 시스테인 변이체는 일반적으로 본래 단백질보다 적은 수의 시스테인 잔기를 가지며, 통상적으로 짝이 없는 시스테인으로부터 생성된 상호작용을 최소화하기 위하여 짝수를 갖는다.
부가의 양태에 있어서, 항체 변이체는 변형된 Fc 단편 또는 변형된 중쇄 불변 영역을 포함하는 항체를 포함할 수 있다. "결정화되는 단편"을 나타내는 Fc 단편 또는 중쇄 불변 영역은 항체에 변화된 결합 특성을 부여하기 위하여 돌연변이에 의해 변형시킬 수 있다(참조예: Burton and Woof, 1992, Advances in Immunology 51: 1-84; Ravetch and Bolland, 2001, Annu. Rev. Immunol. 19: 275-90; Shields et al., 2001, Journal of Biol. Chem 276: 6591-6604; Telleman and Junghans, 2000, Immunology 100: 245-251; Medesan et al., 1998, Eur. J. Immunol. 28: 2092-2100; 이들 모두는 본 명세서에 참조로 인용됨). 상기 돌연변이는 치환, 부가, 결실 또는 이의 임의의 조합을 포함할 수 있으며, 통상 당해 분야에 공지된 방법뿐만 아니라, 본 명세서에 기재된 방법에 따라 하나 이상의 돌연변이 유발 올리고뉴클레오티드(들)를 사용하여 위치-지정 돌연변이(site-directed mutagenesis)에 의해 생성된다(참조예: Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 3rd Ed., 2001, Cold Spring Harbor, N.Y. and Berger and Kimmel, METHODS IN ENZYMOLOGY, Volume 152, Guide to Molecular Cloning Techniques, 1987, Academic Press, Inc., San Diego, CA., 이들은 본 명세서에 참조로 인용됨).
특정 양태에 따르면, 아미노산 치환은: (1) 단백질 가수분해에 대한 감수성을 감소시키고; (2) 산화에 대한 감수성을 감소시키고; (3) 단백질 착화합물을 형성하기 위한 결합 친화성을 변화시키고; (4) 결합 친화성을 변화시키고/시키거나, (5) 상기 폴리펩티드에 대해 다른 물리화학적 또는 기능적 특성을 부여하거나 변형시키는 것들이다. 특정 양태에 있어서, 단일 또는 다중 아미노산 치환(특정 양태에 있어서, 보존적 아미노산 치환)은 자연발생적인 서열에서 제조될 수 있다[특정 양태에 있어서, 분자간 접촉을 형성하는 도메인(들) 밖의 폴리펩티드 부분에서 제조될 수 있다]. 바람직한 양태로, 보존적 아미노산 치환은 통상 실질적으로 모 서열의 구조적 특성을 변화시키지 않는다(예: 치환 아미노산은 모 서열에 생성된 나선형을 파괴하거나, 모 서열을 특성화하는 2차 구조의 다른 형태를 방해하고자 해서는 안된다). 당해 분야에-인지된 폴리펩티드 2차 및 3차 구조의 예는 문헌[PROTEINS, STRUCTURES AND MOLECULAR PRINCIPLES, (Creighton, Ed.), 1984, W. H. Freeman and Company, New York; INTRODUCTION TO PROTEIN STRUCTURE (C. Branden and J. Tooze, eds.), 1991, Garland Publishing, New York, N.Y.; 및 Thornton et al., 1991, Nature 354:105, 이들 각각은 본 명세서에 참조로 인용됨]에 기재되어 있다.
펩티드 유사체는 통상 주형 펩티드의 것과 유사한 특성을 갖는 비-펩티드 약제로서 약제 산업에서 사용된다. 비-펩티드 화합물의 이들 형태는 "펩티드 미메틱(peptide mimetic)" 또는 "펩티도미메틱"으로 명명된다(참조: Fauchere, 1986, Adv. Drug Res. 15:29; Veber ＆ Freidinger, 1985, TINS p.392; 및 Evans et al,. 1987, J. Med. Chem. 30:1229, 이들은 임의의 목적을 위해 본 명세서에 참조로 인용됨). 상기 화합물은 종종 컴퓨터화 분자 모델링을 사용하여 개발된다. 치료학적으로 유용한 펩티드와 구조적으로 유사한 펩티드 미메틱은 유사한 치료학적 또는 예방학적 효과를 생성하기 위하여 사용될 수 있다. 일반적으로, 펩티도미메틱은 전형적인 예의 폴리펩티드(즉, 생화학적 특성 또는 약물학적 활성을 갖는 폴리펩티드)(예: 인간 항체)와 구조적으로 유사하지만, 임의로 당해 분야에 잘 공지된 방법에 의해, -CH2-NH-, -CH2-S-, -CH2-CH2-, -CH=CH-(cis 및 trans), -COCH2-, -CH(OH)CH2- 및 -CH2SO-로부터 선택되는 결합에 의해 치환된 하나 이상의 펩티드 결합을 갖는다. 동일한 형태의 D-아미노산(예: L-리신 대신에 D-리신)에 의한 컨센서스 서열의 하나 이상의 아미노산의 조직적 치환은 보다 안정한 펩티드를 생성하기 위한 어떤 양태에서 사용될 수 있다. 또한, 컨센서스 서열 또는 실질적으로 동일한 컨센서스 서열 변환을 포함하는 제한 펩티드는 당해 분야에 공지된 방법에 의해(Rizo ＆ Gierasch, 1992, Ann. Rev. Biochem. 61:387, 임의의 목적을 위해 본 명세서에 참조로 인용됨); 예를 들면, 펩티드를 폐환시키는 분자내 디술파이드 브릿지를 형성할 수 있는 내부 시스테인 잔기를 가함으로써 생성할 수 있다.
"항체" 또는 "항체 펩티드(들)"는 특이적 결합을 위해 완전한 항체와 경쟁하는 완전한 항체 또는 이의 결합 단편을 의미한다. 특정 양태에 있어서, 결합 단편은 재조합 DNA 기술에 의해 제조한다. 부가의 양태에 있어서, 결합 단편은 완전한 항체의 효소 또는 화학적 절단에 의해 제조한다. 결합 단편은, 이로써 제한되는 것은 아니지만, F(ab), F(ab'), F(ab')2, Fv 및 단일쇄 항체를 포함한다.
용어 "중쇄"는 NGF에 특이성을 부여하기에 충분한 가변 영역 서열을 갖는 임의의 면역글로불린 폴리펩티드를 포함한다. 용어 "경쇄"는 NGF에 특이성을 부여하기에 충분한 가변 영역 서열을 갖는 임의의 면역글로불린 폴리펩티드를 포함한다. 전장 중쇄는 1개의 가변 영역 도메인 VH 및 3개의 불변 영역 도메인, CH1, CH2, 및 CH3을 포함한다. VH 도메인은 폴리펩티드의 아미노-말단에 존재하고, CH3 도메인은 카복실-말단에 존재한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이 용어 "중쇄"는 전장 중쇄 및 이의 단편을 포함한다. 전장 경쇄는 1개의 가변 영역 도메인 VL 및 1개의 불변 영역 도메인, CL을 포함한다. 중쇄와 같이, 경쇄의 가변 영역 도메인은 폴리펩티드의 아미노-말단에 존재한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이 용어 "경쇄"는 전장 경쇄 및 이의 단편을 포함한다. F(ab) 단편은 1개의 경쇄 및 CH1과, 1개의 중쇄 가변 영역으로 구성된다. F(ab) 분자의 중쇄는 다른 중쇄 분자와 디술파이드 결합을 형성할 수 없다. F(ab') 단편은 쇄간 디술파이드 결합이 F(ab')2 분자를 형성하기 위하여 두 중쇄 사이에 형성될 수 있도록, CH1과 CH2 도메인 사이에 더 많은 불변 영역을 함유하는 1개의 경쇄 및 1개의 중쇄를 함유한다. Fv 영역은 중쇄 및 경쇄 모두로부터의 가변 영역을 포함하지만, 불변 영역은 결여되어 있다. 단일쇄 항체는 중쇄 및 경쇄 가변 영역이 가요성 링커에 의해 연결되어 항원-결합 영역을 형성하는, 단일 폴리펩티드 쇄를 형성하는 Fv 분자이다. 단일쇄 항체는 국제 특허출원 공보 제WO 88/01649호 및 미국 특허 제4,946,778호와 제5,260,203호에서 상세히 논의된다.
특정 양태에 있어서, "다중 특이적(multispecific)" 또는 "다기능성(multifunctional)" 항체가 아닌 다른 2가 항체는 동일한 항원 특이성을 갖는 결합 부위를 포함하는 것으로 이해한다.
본 발명에 따라 항체 결합 및 특이성을 평가함에 있어서, 과량의 항체가 수용체에 결합된 리간드의 양을 적어도 약 20％, 40％, 60％, 80％, 85％ 또는 그 이상까지 감소시키는 경우에(특히 시험관 내 경쟁적 결합 검정법을 사용하여 측정시), 항체는 실질적으로 수용체에 대한 리간드의 부착을 억제한다.
"중화 항체"는 이것이 결합한 표적 항원의 효과기(effector) 기능을 차단하거나 실질적으로 감소시키는 항체 분자를 의미한다. 따라서, "중화" 항-NGF 항체는 NGF의 효과기 기능, 예를 들면, 수용체 결합 및/또는 세포 반응의 도출을 차단하거나 실질적으로 감소시킬 수 있다. "실질적으로 감소됨"은 표적 항원(예: 인간 NGF)의 효과기 기능의 적어도 60％, 바람직하게는 적어도 약 70％, 보다 바람직하게는 적어도 약 75％, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 80％, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 85％, 가장 바람직하게는 적어도 약 90％ 감소를 의미하고자 한다.
용어 "에피토프(epitope)"는 면역글로불린 또는 T-세포 수용체에 대해 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 결정기, 바람직하게는 폴리펩티드 결정기를 포함한다. 특정 양태에 있어서, 에피토프 결정기는 분자의 화학적으로 활성인 표면 그룹(grouping)(예: 아미노산, 당 측쇄, 포스포릴기 또는 술포닐기)을 포함하며, 특정 양태에 있어서는, 특이적 3차원 구조적 특성 및/또는 특이적 전하 특성을 가질 수 있다. 에피토프는 항체에 의해 결합되는 항원의 영역이다. 특정 양태에 있어서, 항체는 그것이 단백질 및/또는 고분자의 복잡한 혼합물에서 이의 표적 항원을 우선적으로 인지하는 경우에 항원에 특이적으로 결합한다고 말한다. 바람직한 양태로, 항체는 평형 해리상수가 ≤ 10-8M인 경우에, 보다 바람직하게는 평형 해리상수가 ≤ 10-9M인 경우에, 및 가장 바람직하게는 해리상수가 ≤ 10-10M인 경우에, 항원에 특이적으로 결합한다고 말한다.
항체는 두 항체가 동일하거나 입체적으로 중복된 에피토프를 인지하는 경우에, 기준 항체로서 "필수적으로 동일한 에피토프"에 결합한다. 두 항체가 동일하거나 입체적으로 중복된 에피토프에 결합하는지를 결정하기 위한 가장 광범위하게 사용되는 신속한 방법은 경쟁적 검정법으로, 이는 표지된 항원 또는 표지된 항체를 사용하여, 모든 수의 상이한 포맷으로 구성할 수 있다. 대개, 항원은 기질 위에 고정화시키고, 표지된 항체의 결합을 차단하는 비표지된 항체의 능력은 방사성 또는 효소 표지를 사용하여 측정한다.
용어 "제제(agent)"가 화학적 화합물, 화학적 화합물의 혼합물, 생물학적 고분자 또는 생물학적 물질로부터 제조된 추출물을 나타내기 위하여 본 명세서에서 사용된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "표지(label)" 또는 "표지된(labeled)"은, 예를 들면, 표지된 아비딘(예: 바람직하게는 광학 또는 비색법에 의해 검출될 수 있는 형광 마커, 화학발광 마커 또는 효소적 활성과 같은 검출 가능한 마커를 포함하는 스트렙타비딘)에 의해 검출할 수 있는 비오틴 잔기의 폴리펩티드에 방사성 표지된 아미노산 또는 결합의 혼입에 의한, 검출 가능한 마커의 혼입을 의미한다. 특정 양태에 있어서, 표지는 또한 치료학적일 수 있다. 폴리펩티드 및 당단백질을 표지화하는 다양한 방법이 당해 분야에 공지되어 있고, 본 명세서에 기재된 방법에 유용하게 사용할 수 있다. 폴리펩티드에 대한 표지의 예는, 이로써 제한되는 것은 아니지만, 다음을 포함한다: 방사성 동위원소 또는 방사성 핵종(예: 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99mTc, 111In, 125I, 131I), 형광 표지(예: 형광 이소티오시아네이트 또는 FITC, 로다민 또는 란타니드 포스포르), 효소적 표지(예: 서양고추냉이퍼옥시다제, β-갈락토시다제, 루시페라제, 알칼리성 포스파타제), 화학발광 표지, 합텐 표지(예: 비오티닐기) 및 2차 수용체에 의해 인지되는 소정의 폴리펩티드 에피토프(예: 류신 지퍼 쌍 서열, 2차 항체를 위한 결합 부위, 금속 결합 도메인 또는 에피토프 태그). 특정 양태에 있어서, 표지는 잠재적인 입체 장애를 감소시키기 위하여 다양한 길이의 스페이서 암(spacer arm)[예: (CH2)n, 이때 n은 ＜ 약 20임]에 의해 결합시킨다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "생물학적 샘플"은, 이로써 제한되는 것은 아니지만, 생물체 또는 이전에 살았던 것으로부터의 임의 양의 물질을 포함한다. 상기 생물체는, 이로써 제한되는 것은 아니지만, 사람, 마우스, 원숭이, 래트, 토끼 및 다른 동물을 포함한다. 상기 물질은, 이로써 제한되는 것은 아니지만, 혈액, 혈청, 뇨, 세포, 기관, 조직, 뼈, 골수, 림프절 및 피부를 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "약제학적 제제 또는 약제"는 환자에 적절히 투여하는 경우에 목적하는 치료학적 효과를 유도할 수 있는 화학적 화합물 또는 조성물을 의미한다. 본 발명의 항체를 하나 또는 다수 포함하는 약제학적 조성물과 관련하여 표현 "약제학적 유효량"은 본 발명에 따라, 고려되는 환자에서 감도 역치를 건강한 개체에서 관찰되는 것과 견줄만한 수준으로 회복하면서, 외부 자극에 대한 이러한 감도 역치의 감소를 피할 수 있는 상기 약제학적 조성물의 양을 의미하는 것으로 이해한다.
"장애(disorder)"는 본 발명에 따르는 치료로부터 유용해지는 임의의 질환이다. "장애" 및 "질환"은 본 명세서에서 상호교환적으로 사용되며, 포유동물을 문제의 장애에 취약하게 만드는 병리학적 질환을 포함한 만성 및 급성 NGF-매개된 장애 또는 NGF-매개된 질병을 포함한다.
용어 "NGF-매개된 질병" 및 "NGF-매개된 질환"는, 이로써 제한되는 것은 아니지만, 급성 통증, 치통, 외상으로부터의 통증, 수술통, 절단 또는 농양으로부터 생성된 통증, 작열통, 탈수초성 질병, 삼차 신경통, 암, 만성 알콜 중독, 뇌졸중, 시상통 증후군, 당뇨병, 후천성 면역결핍증("AIDS"), 독소 및 화학요법, 일반적인 두통, 편두통, 군발성 두통, 혼합된-혈관 및 비-혈관 증후군, 긴장성 두통, 일반적인 염증, 관절염, 류마티스성 질병, 루푸스, 골관절염, 염증성 장 질환, 과민성 대장 증후군, 염증성 안 질환, 염증성 또는 불안정한 방광 장애, 건선, 염증성 성분에 의한 피부 통증, 일광화상, 심장염, 피부염, 근염, 신경염, 콜라겐 혈관 질병, 만성 염증성 질환, 염증성 통증 및 관련된 통각과민과 이질통, 신경병성 통증 및 관련된 통각과민과 이질통, 당뇨성 신경병성 통증, 작열통, 교감신경성 지속 통증, 구심로차단 증후군, 천식, 상피조직 손상 또는 기능장애, 단순포진, 호흡기, 비뇨생식, 위장 또는 혈관 영역에서의 내장 운동 장애, 상처, 화상, 알레르기성 피부 반응, 가려움, 백반증, 일반적인 위장 장애, 대장염, 위궤양, 십이지장궤양, 혈관운동신경성 또는 알레르기 비염, 또는 기관지 장애, 월경곤란증, 소화불량, 위식도역류, 췌장염 및 장기통을 포함한 NGF의 증가된 수준 또는 NGF에 대한 증가된 감도와 관련된 임의의 의학적 질환 또는 장애를 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, 하나 이상의 항-인간 NGF 인간 항체를 포함하는 비히클- 또는 약제학적 조성물과 관련하여 사용되는 경우에, 용어 "유효량" 및 "치료학적 유효량"은 목적하는 결과(즉, 본 발명의 비히클- 또는 항-인간 NGF 인간 항체에 의한 치료법의 경우, 목적하는 결과는, 예를 들면, 염증 및/또는 통증에서 원하는 감소이다)를 생성하거나, NGF의 하나 이상의 생물학적 활성 수준에 있어서의 주목할 만한 감소를 지지하기에 충분한 양 또는 용량을 의미한다. 보다 특히, 치료학적 유효량은, 예를 들면, 제제에 의해 생체 내 치료된 개체에서 문제가 되는 질환(예: 염증 또는 통증)와 관련된 임상적으로 정의된 하나 이상의 병리학적 과정을 일정 기간 동안 억제하기에 충분한 항-인간 NGF 인간 항체(들)의 양이다. 본 발명에 있어서, 항-NGF 항체의 "유효량"은 고통스런 의학적 질환과 관련된 통증의 인식을 방지, 정지, 조절 또는 감소시킬 수 있다. 본 발명의 방법에 있어서, 용어 "조절" 및 이의 문법적 변환은 원치않는 사건(예: 통증)의 방지, 부분적 또는 완전 억제, 감소, 지연 또는 쇠퇴를 의미하기 위하여 사용된다. 유효량은 선택된 특정 비히클- 또는 항-인간 NGF 인간 항체(들)에 따라 좌우될 수 있으며, 또한 치료할 개체와 관련된 다양한 요인 및 질환과, 장애의 중증정도에 따라 좌우된다. 예를 들면, 비히클- 또는 항-인간 NGF 인간 항체(들)가 생체 내 투여된다면, 예비 임상 동물 작업에서 수득된 용량 반응 곡선 및 독성 데이터뿐만 아니라, 환자의 연령, 체중 및 건강과 같은 요인이 그들 중 고려된다. 제제가 시험관 내에서 세포와 접촉된다면, 흡수율, 반감기, 용량, 독성 등과 같은 파라미터를 평가하기 위하여 다양한 예비-임상 시험관 내 연구를 또한 고안한다. 제시된 제제에 대한 유효량 또는 치료학적 유효량의 결정은 당해 분야의 숙련가의 능력에 잘 속한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "신경 성장 인자" 및 "NGF"는 SEQ ID NO: 30으로 제시된 바와 같이, 재조합 인간 NGF 1-120을 포함한, 모든 포유동물 종의 천연의 서열 NGF로 정의된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "실질적으로 순수한" 또는 "실질적으로 정제된"은 존재하는 압도적인 종(species)인 화합물 또는 종을 의미한다(즉, 몰 기준으로 하여, 조성물 중 다른 개별적인 종보다 더 풍부하다). 특정 양태에 있어서, 실질적으로 정제된 분획은 상기 종이 존재하는 모든 고분자 종의 적어도 약 50％(몰 기준으로)를 포함하는 조성물이다. 특정 양태에 있어서, 실질적으로 순수한 조성물은 조성물에 존재하는 모든 고분자 종의 약 80％, 85％, 90％, 95％ 또는 99％ 이상을 포함한다. 특정 양태에 있어서, 상기 종은 필수적인 동종성으로 정제되며(오염 종은 통상적인 검출 방법에 의해 조성물에서 검출할 수 없다), 이때 조성물은 필수적으로 단일 고분자 종으로 이루어진다.
용어 "환자"는 인간 및 동물 개체를 포함한다.
"치료" 또는 "치료하다"는 치료학적 치료 및 예방학적 또는 예방 조치를 모두 의미한다. 치료가 필요한 것들은 장애를 갖기 쉬운 것들 또는 장애를 방지해야 하는 것들뿐만 아니라, 이미 장애인 것들을 포함한다.
달리 내용으로 요구되지 않는 한, 단수 용어는 복수를 포함하고, 복수 용어는 단수를 포함할 것이다.
본 발명의 특정 양태에 따르면, NGF에 대한 항체는 이로써 제한되는 것은 아니지만, 상기 언급한 것들을 포함한, 신경병성 및 염증성 통증과, NGF-매개된 질병을 치료하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 한 측면에 있어서, 인간 NGF에 대한 결합에 대해 일어나고, 이에 대해 생물학적 및 면역학적 특이성을 갖는 완전 인간 모노클로날 항체가 제공된다. 본 발명의 다른 측면에 있어서, 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 분자에 대한 아미노산 서열, 특히 이의 가변 영역에 상응하는 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한 핵산이 제공된다. 본 발명의 이러한 측면의 특별한 양태는 특히 본 발명에 의해 제공되는 중쇄 및 경쇄의 CDR1 내지 CDR3으로부터의, 상보성 결정 영역(CDR: complementarity determining region)에 상응하는 서열이다. 본 발명의 또 다른 측면에 있어서, 면역글로불린 분자 및 항체, 바람직하게는 본 발명의 모노클로날 항체를 발현하는 하이브리도마 세포 및 세포주가 제공된다. 본 발명은 또한 인간 NGF에 대한 결합에 대해 일어나고, 이에 대해 생물학적 및 면역학적 특이성을 갖는 항체, 바람직하게는 모노클로날 항체의 생물학적 및 면역학적으로 정제된 제제를 제공한다.
효모 인공 염색체(YAC)에서 메가베이스-크기의 인간 위치를 클론화 및 재구성하고, 그들을 마우스 배아주로 도입시키는 능력은 인간 질병의 유용한 모델의 생성뿐만 아니라, 매우 크거나 조잡하게 맵핑된 좌위의 기능적 성분을 유도하는 유용한 접근법을 제공한다. 더욱이, 마우스 좌위를 그들의 인간 등가물로 치환하기 위한 상기 기술의 이용은 발생 도중 인간 유전자 생성물의 발현 및 조절, 다른 시스템과의 그들의 상호작용 및 질병 유도와 진행시 그들의 관여에 독특한 통찰력을 제공한다.
상기 계획의 중요한 실제 적용은 마우스 체액성 면역계의 "인간화(humanization)"이다. 내인성 Ig 유전자가 비활성된 마우스로의 인간 면역글로불린(Ig) 좌위의 도입은 B-세포 발생시 그들의 역할뿐만 아니라, 항체의 프로그램된 발현 및 조합에 기초를 이루는 메카니즘을 연구하는 기회를 제공한다. 더욱이, 상기 계획은 완전 인간 모노클로날 항체(MAbs)의 제조를 위한 원천을 제공한다.
용어 "인간 항체"는 실질적으로 인간의 배아주 면역글로불린 서열에 상응하는 가변 및 불변 영역을 갖는 항체를 포함한다. 특정 양태에 있어서, 인간 항체는 이로써 제한되는 것은 아니지만, 설치류(예: 마우스 및 래트) 및 토끼목 포유류(예: 토끼)를 포함한 비-인간 포유동물에서 제조된다. 특정 양태에 있어서, 인간 항체는 하이브리도마 세포로 제조된다. 특정 양태에 있어서, 인간 항체는 재조합적으로 제조된다.
항체와 관련하여 용어 "재조합"은 재조합 방법에 의해 제조, 발현, 생성 또는 분리되는 항체를 포함한다. 대표적인 예는 숙주 세포에서 형질감염된 재조합 발현 벡터를 사용하여 발현시킨 항체, 재조합, 조합 인간 항체 라이브러리로부터 분리된 항체, 인간 면역글로불린 유전자에 대해 유전자이식된 동물(예: 마우스)로부터 분리된 항체[참조예: Taylor, L.D., et al., Nucl. Acids Res. 20:6287-6295,(1992)]; 또는 다른 DNA 서열에 인간 면역글로불린 유전자 서열의 스플라이싱을 포함하는 임의의 방법에 의해 제조, 발현, 생성 또는 분리된 항체를 포함한다. 상기 재조합 인간 항체는 인간 배아주 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 불변 영역을 갖는다.
인간 항체는 인간 치료법에 사용하기 위한 비-인간 및 키메라 항체에 비해 적어도 3개의 이점을 갖는다:
1) 항체의 효과기 부분이 인간이기 때문에, 이는 인간 면역계의 다른 부분과 더 양호하게 상호작용할 수 있다[예: 보체-의존 세포독성(CDC) 또는 항체-의존 세포의 세포독성(ADCC)에 의해 보다 효율적으로 표적 세포를 파괴함];
2) 인간 면역계는 인간 항체를 외래로서 인지하지 않으므로, 상기 주입된 항체에 대한 항체 반응은 전반적인 외래 비-인간 항체 또는 부분적 외래 키메라 항체에 비해 덜해야 한다;
3) 주입된 비-인간 항체는 인간 항체의 반감기보다 훨씬 더 짧은 인간 순환시 반감기를 갖는 것으로 보고되었다. 주입된 인간 항체는 자연발생적인 인간 항체와 필수적으로 동일한 반감기를 가짐으로써, 보다 적고 덜 빈번한 용량이 제시될 수 있다.
따라서, 완전 인간 항체는 마우스 또는 마우스-유도체화된 MAb에 대해 고유한 면역학적 및 알레르기성 반응을 최소화함으로써, 투여된 항체의 효능 및 안전성을 증가시키리라 예상된다. 따라서, 본 발명의 완전 인간 항체는 만성 및 재발성 통증의 치료, 반복되는 항체 투여가 필요한 이의 치료에 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 항-NGF 항체의 한 특별한 이점은 항체가 완전 인간이고, 인간 항-마우스 항체 또는 다른 이미 기재된 비-인간 종으로부터의 비-완전 인간 항체와 통상 관련된 역반응을 최소화하면서, 비-급성 방식으로 환자에 투여될 수 있다는 것이다.
당해 분야의 숙련가는 인간 Ig 좌위의 큰 단편을 사용하여 마우스 항체 제조가 결핍된 마우스 계통을 조작함으로써, 상기 마우스가 마우스 항체의 부재하에 인간 항체를 제조하도록 할 수 있다. 큰 인간 Ig 단편은 항체 제조 및 발현의 적절한 조절뿐만 아니라, 큰 가변 유전자 다양성을 보존할 수 있다. 항체 다양화 및 선택을 위한 마우스 세포 시스템 및 인간 단백질에 대한 면역학적 내성의 결여를 활용함으로써, 이들 마우스 계통에서 재생된 인간 항체 레퍼토리는 인간 항원을 포함한, 관심있는 임의 항원에 대해 고친화성의 항체가 수득된다. 하이브리도마 기술을 사용하면, 원하는 특이성을 갖는 항원-특이적 인간 MAb가 제조되고 선택될 수 있다.
면역화에 따라, 내인성 면역글로불린 생성의 부재하에 인간 항체의 완전 레퍼토리를 제조할 수 있는 유전자이식된 동물(예: 마우스)이 사용될 수 있다. 상기 배아주 돌연변이 마우스에 인간 배아주 면역글로불린 유전자 어레이의 전달은 항원 도전시 인간 항체의 생성을 유발할 것이다[참조예: Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551-2555, (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258, (1993; Bruggemann et al., Year in Immun., 7:33 (1993); Nature 148:1547-1553 (1994), Nature Biotechnology 14:826 (1996); Gross, J.A., et al., Nature, 404:995-999 (2000); 및 미국 특허 제5,877,397호, 제5,874,299호, 제5,814,318호, 제5,789,650호, 제5,770,429호, 제5,661,016호, 제5,633,425호, 제5,625,126호, 제5,569,825호 및 제5,545,806호(이들 각각은 이의 전문이 모든 목적을 위해 본 명세서에 참조로 인용됨)]. 인간 항체는 또한 파아지 디스플레이 라이브러리로 제조될 수 있다[Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1992); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991)]. Cole 등 및 Boerner 등의 기술은 또한 인간 모노클로날 항체의 제조에 유용하다[Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therap, Alan R. Liss, p. 77 (1985) 및 Boerner et al., J. Immunol., 147(l):86-95 (1991)].
재조합 인간 항체는 또한 시험관 내 돌연변이 유발에 적용시킬 수 있고(또는, 사람 Ig 서열에 대해 유전자이식시킨 동물이 사용되는 경우에, 생체 내 체세포 돌연변이 유발), 이에 따라 재조합 항체의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열은 인간 배아주 VH 및 VL 서열과 관련된 것으로부터 유래되면서, 생체 내에서 인간 항체 배아주 레퍼토리 내에 존재할 수 있는 서열이다.
특정 양태에 있어서, 숙련가는 키메라 항체를 제조하기 위하여 상기 마우스에서 사람 가변 영역(들)과 함께 사람이 아닌 다른 종으로부터의 불변 영역을 사용할 수 있다.
자연발생적인 항체 구조
자연발생적인 항체 구조 단위는 통상 사합체(tetramer)를 포함한다. 상기 사합체는 각각 통상적으로 2개의 동일한 폴리펩티드 쇄의 쌍으로 구성되며, 각 쌍은 1개의 전장 "경"쇄(통상 분자량이 약 15kDa임) 및 1개의 전장 "중"쇄(통상 분자량이 약 50 내지 70kDa임)를 갖는다. 경쇄 및 중쇄 각각의 아미노-말단 부위는 통상적으로 항원 인지에 관여하는 약 100 내지 110 또는 그 이상의 아미노산의 가변 영역을 포함한다. 각 쇄의 카복시-말단 부위는 통상적으로 효과기 기능에 관여하는 불변 영역을 한정한다. 인간 경쇄는 통상적으로 카파 및 람다 경쇄로서 분류된다. 중쇄는 통상적으로 뮤, 델타, 감마, 알파 또는 입실론으로서 분류되며, 각각 IgM, IgD, IgG, IgA 및 IgE로서 항체의 이소타입을 정의한다. IgG는, 이로써 제한되는 것은 아니지만, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함한, 몇 개의 서브클래스를 갖는다. IgM은, 이로써 제한되는 것은 아니지만, IgM1 및 IgM2를 포함한 서브클래스를 갖는다. IgA는 유사하게, 이로써 제한되는 것은 아니지만, IgA1 및 IgA2를 포함한 서브클래스로 세분된다. 전장 경쇄 및 중쇄 내에서, 통상적으로 가변 및 불변 영역은 약 12개 이상 아미노산의 "J" 영역에 의해 결합되고, 중쇄는 또한 약 10개 이상 아미노산의 "D" 영역을 포함한다[참조예: FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY, Ch. 7, 2nd ed., (Paul, W., ed.), 1989, Raven Press, N.Y.(모든 목적을 위해 이의 전문이 참조로 인용됨)]. 각각의 경쇄/중쇄 쌍의 가변 영역은 통상 항원-결합 부위를 형성한다.
가변 영역은 통상적으로 상보성 결정 영역 또는 CDR이라 또한 불리우는, 3개의 초가변 영역에 의해 결합된 비교적 보존된 프레임워크 영역(FR)의 동일한 일반적인 구조를 나타낸다. 각 쌍의 두 쇄로부터의 CDR은 프레임워크 영역에 의해 정렬되고, 이는 특정 에피토프에 결합할 수 있다. N-말단으로부터 C-말단까지, 경쇄 및 중쇄 가변 영역은 모두 통상적으로 도메인 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4를 포함한다. 각 도메인에 대한 아미노산의 정렬은 통상적으로 문헌[Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (1987 and 1991, National Institutes of Health, Bethesda, Md.), 또는 Chothia ＆ Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196:901-917; Chothia et al., 1989, Nature 342:878-883]의 정의에 따른다.
이중특이성 또는 이작용성 항체
이중특이성(bispecific) 또는 이작용성(bifunctional) 항체는 통상적으로 2개의 상이한 중쇄/경쇄 쌍 및 2개의 상이한 결합 부위를 갖는 인공 하이브리드 항체이다. 이중특이성 항체는, 이로써 제한되는 것은 아니지만, 하이브리도마의 융합 또는 F(ab') 단편의 결합을 포함한, 다양한 방법에 의해 제조할 수 있다(참조예: Songsivilai ＆ Lachmann, 1990, Clin. Exp. Immunol. 79: 315-321; Kostelny et al., 1992, J. Immunol. 148:1547-1553).
항체의 제조
본 발명은 인간 NGF에 결합하는 항체를 제공한다. 이들 항체는 전장 NGF 또는 이의 단편에 의한 면역화에 의해 제조될 수 있다. 본 발명의 항체는 폴리클로날 및/또는 모노클로날일 수 있고/있거나, 재조합 항체일 수 있다. 바람직한 양태로, 본 발명의 항체는, 예를 들면, 인간 항체를 제조할 수 있는 유전자이식 동물의 면역화에 의해 제조되는 인간 항체이다(참조예: 국제특허출원 공보 제W0 93/12227호).
본 발명의 항-NGF 항체의 경쇄 및 중쇄 가변 영역의 상보성 결정 영역(CDR)은 동일하거나 다른 종으로부터 프레임워크 영역(FR)으로 이식될 수 있다. 특정 양태에 있어서, 항-NGF 항체의 경쇄 및 중쇄 가변 영역의 CDR은 컨센서스 인간 FR로 이식될 수 있다. 컨센서스 인간 FR을 생성하기 위하여, 몇 개의 인간 중쇄 또는 경쇄 아미노산 서열로부터의 FR은 컨센서스 아미노산 서열을 확인하기 위하여 정렬된다. 항-NGF 항체 중쇄 또는 경쇄의 FR은 상이한 중쇄 또는 경쇄로부터의 FR에 의해 치환될 수 있다. 항-NGF 항체의 중쇄 및 경쇄의 FR에서 드문 아미노산은 통상 치환되지 않는 반면에, FR 아미노산의 나머지는 치환될 수 있다. 드문 아미노산은 그들이 FR에서 대개 발견되지 않는 위치에 존재하는 특정 아미노산이다. 본 발명의 항-NGF 항체로부터 이식된 가변 영역은 항-NGF 항체의 불변 영역과 상이한 불변 영역과 함께 사용될 수 있다. 그렇지 않으면, 이식된 가변 영역은 단일쇄 Fv 항체의 일부이다. CDR 이식법은, 예를 들면, 미국 특허 제6,180,370호, 제5,693,762호, 제5,693,761호, 제5,585,089호 및 제5,530,101호에 기재되어 있으며, 이들은 임의의 목적을 위해 본 명세서에 참조로 인용된다.
본 발명의 항체는 바람직하게는 마우스의 항체-생성 세포로 삽입된 인간 항체 생성 부위의 실질적인 부분을 갖고, 내인성 쥐 항체의 제조가 결핍되도록 추가로 조작되는 유전자이식 마우스를 사용하여 제조한다. 상기 마우스는 인간 면역글로불린 분자 및 항체를 제조할 수 있고, 쥐의 면역글로불린 분자 및 항체의 실질적으로 감소된 양을 제조하지 않거나 제조한다. 이 결과를 성취하는데 이용되는 기술이 본 명세서에 기재된 특허, 특허출원 및 참조문헌에 기재되어 있다. 바람직한 양태로, 숙련가는 임의의 목적을 위해 본 명세서에 참조로 인용된 국제특허출원 공보 제WO 98/24893호에 기재된 바와 같은 방법들을 사용할 수 있다(참조예: Mendez et al., 1997, Nature Genetics 15:146-156, 이는 임의의 목적을 위해 본 명세서에 참조로 인용됨).
본 발명의 모노클로날 항체(mAb)는 통상적인 모노클로날 항체 방법, 예를 들면, Kohler and Milstein (1975, Nature 256:495)의 표준 체세포 하이브리드화 기술을 포함한 다양한 기술에 의해 제조할 수 있다. 체세포 하이브리드화 방법이 대체적으로 바람직함에도 불구하고, 모노클로날 항체를 제조하는 다른 기술, 예를 들면, B-림프구의 바이러스 또는 종양유발 형질전환을 사용할 수 있다.
하이브리도마를 제조하기 위한 바람직한 동물 시스템은 마우스이다. 마우스에서 하이브리도마 제조는 매우 잘 이루어지며, 면역화 방법 및 융합을 위해 면역화된 비장 세포의 분리를 위한 기술이 당해 분야에 잘 공지되어 있다. 융합 파트너(예: 쥐 골수종 세포) 및 융합 방법이 또한 공지되어 있다.
바람직한 양태로, NGF에 대한 인간 모노클로날 항체는 마우스 시스템보다는 오히려 인간 면역계의 일부를 운반하는 유전자이식 마우스를 사용하여 생성할 수 있다. 본 명세서에서 "HuMab" 마우스로서 언급되는, 이들 유전자이식 마우스는 내인성 μ 및 κ 쇄 위치를 비활성화하는 표적 돌연변이와 함께 재배열되지 않은 인간 중쇄(μ 및 γ) 및 κ 경쇄 면역글로불린 서열을 암호화하는 인간 면역글로불린 유전자 소좌위(minilocus)를 함유한다(Lonberg et al., 1994, Nature 368:856-859). 따라서, 마우스는 마우스 IgM 또는 κ의 감소된 발현을 나타내고, 면역화에 대한 반응으로, 도입된 인간 중쇄 및 경쇄 이식 유전자는 클래스 전환 및 염색체 돌연변이를 수행하여 고친화성 인간 IgG κ 모노클로날 항체를 생성한다(상기 Lonberg 등의; Lonberg and Huszar, 1995, Intern. Rev. Immunol. 13:65-93; Harding and Lonberg, 1995, Ann. N.Y. Acad. Sci. 764:536-546). HuMab 마우스의 제조는 문헌(Taylor 등의 1992, Nucleic Acids Res. 20:6287-6295; Chen 등의 1993, International Immunology 5:647-656; Tuaillon et al., 1994, J. Immunol. 152:2912-2920; Lonberg 등의 1994, Nature 368:856-859; Lonberg, 1994, Handbook of Exp. Pharmacology 113:49-101; Taylor 등의 1994, International Immunology 6:579-591; Lonberg ＆ Huszar, 1995, Intern. Rev. Immunol. 13:65-93; Harding ＆ Lonberg, 1995, Ann. N.Y. Acad. Sci 764:536-546; Fishwild 등의 1996, Nature Biotechnology 14:845-851, 이들 모두의 내용은 이의 전문이 본 명세서에 참조로 인용된다)에 상세히 기재되어 있다. 추가로 모두 Lonberg and Kay에 대한 미국 특허 제5,545,806호; 제5,569,825호; 제5,625,126호; 제5,633,425호; 제5,789,650호; 제5,877,397호; 제5,661,016호; 제5,814,318호; 제5,874,299호; 및 제,770,429호와, Surani 등에 대한 미국 특허 제5,545,807호; 1993년 6월 24일자로 공개된 국제특허출원 공보 제WO 93/1227호; 1992년 12월 23일자로 공개된 제WO 92/22646호; 및 1992년 3월 19일자로 공개된 제WO 92/03918호를 참조하라(이들 모두의 기재는 이의 전문이 본 명세서에 참조로 인용됨). 이와 달리, 하기 실시예에 기재된 HCo7, HCo12 및 KM 유전자이식 마우스 계통은 인간 항-NGF 항체를 생성하기 위하여 사용될 수 있다.
본 발명은 생체활성 인간 NGF 폴리펩티드에 특이적이고, 이를 중화시키는 인간 모노클로날 항체를 제공한다. 항체가 NGF 폴리펩티드에 결합하는 경우에, NGF 폴리펩티드에 상당히 특이적이고 이를 중화시키는 항체 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열이 또한 제공된다. 이러한 높은 특이성은 항-인간 NGF 인간 항체, 및 유사 특이성을 갖는 인간 모노클로날 항체가 NGF 관련 질병에 대해 효과적인 면역요법이 될 수 있도록 한다.
한 측면에 있어서, 본 발명은 본 명세서에 제공된 4D4 항체와 동일하거나 필수적으로 동일한 에피토프에 결합하는 분리된 인간 항체를 제공한다.
한 측면에 있어서, 본 발명은 고친화성으로 NGF 폴리펩티드 에피토프에 결합하고, NGF 폴리펩티드 활성을 길항하는 능력을 갖는 SEQ ID NOS: 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 및 79-130에 제시된 아미노산 서열을 적어도 하나 포함하는 분리된 인간 항체를 제공한다. 바람직하게는, 이들 항체는 본 명세서에 제공된 4D4 항체와 동일하거나 필수적으로 동일한 에피토프에 결합한다.
바람직한 양태로, 분리된 인간 항체는 1 x 10-9M 이하의 해리상수(KD)로 NGF 폴리펩티드에 결합하며, 1 x 10-7M 이하인 IC50을 가지면서 시험관 내 중화 검정에서 NGF 유도된 생존을 억제한다. 보다 바람직한 양태로, 분리된 인간 항체는 1 x 10-10M 이하의 해리상수(KD)로 NGF 폴리펩티드에 결합하며, 1 x 10-8M 이하인 IC50을 가지면서 시험관 내 중화 검정에서 NGF 유도된 생존을 억제한다. 보다 더 바람직한 양태로, 분리된 인간 항체는 1 x 10-11M 이하의 해리상수(KD)로 NGF 폴리펩티드에 결합하며, 1 x 10-9M 이하인 IC50을 가지면서 시험관 내 검정에서 NGF 유도된 생존을 억제한다. 상기 언급한 결합 및 중화 범위에 부합되는 항-인간 NGF 인간 항체의 예가 본 명세서에 제공된다.
본 발명의 가장 바람직한 항-인간 NGF 사람 항체는 4D4로서 본 명세서에서 언급되며, 각각 SEQ ID NO: 12 및 SEQ ID NO: 10에 제시된 VL 및 VH 폴리펩티드 서열을 갖는다. 4D4의 VL 및 VH를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 11 및 SEQ ID NO: 9로서 각각 제시되고 있다. 본 발명의 항-인간 NGF 인간 항체의 특성은 실시예에 구체적으로 기재되어 있다. NGF 폴리펩티드에 대한 높은 친화성 및 본 명세서에 제시된 NGF 폴리펩티드 활성을 길항하는 높은 능력이 특히 주목할 만하다.
항-인간 NGF 인간 항체의 해리상수(KD)는 일반적으로 실시예 9에 기재된 바와 같은 표면 플라스몬 공명에 의해 측정할 수 있다. 일반적으로, 표면 플라스몬 공명 분석은 BIAcore 시스템(Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ)을 사용하는 표면 플라스몬 공명(SPR)에 의해 리간드(바이오센서 매트릭스상에 고정화된 재조합 NGF 폴리펩티드) 및 분석물(용액 중 항체) 사이에 실제 결합 상호작용을 측정한다. 표면 플라스몬 분석은 또한 분석물(바이오센서 매트릭스 상에 항체)을 고정화하고, 리간드(용액 중 재조합 V)를 제시함으로써 수행할 수 있다. 항-인간 NGF 인간 항체의 해리상수(KD)는 또한 KinExA 방법론을 사용하여 측정할 수 있다. 본 발명의 특정 양태에 있어서, 항체는 대략 10-8 내지 10-12M의 KD로 NGF에 결합한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "KD"는 특별한 항체-항원 상호작용의 해리상수를 의미하고자 한다. 본 발명의 목적을 위해, KD는 실시예 9에 제시된 바와 같이 측정한다.
바람직한 양태로, 본 발명의 항체는 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 이소타입 중에 있다. 바람직하게는, 항체는 IgG3 이소타입 중에 있다. 보다 바람직하게는, 항체는 IgG1 이소타입 중에 있다. 가장 바람직하게는, 항체는 IgG2 이소타입 중에 있다. 다른 양태로, 본 발명의 항체는 IgM, IgA, IgE 또는 IgD 이소타입 중에 있다. 본 발명의 바람직한 양태로, 항체는 인간 카파 경쇄 및 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 중쇄를 포함한다. IgG1 또는 IgG2 중쇄 불변 영역을 포함하는 본 발명의 항체의 발현이 하기 실시예에 기재되어 있다. 특별한 양태로, 항체의 불변 영역은 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 이소타입을 위한 불변 영역이 아닌 다른 불변 영역에 결합된다. 특정 양태에 있어서, 본 발명의 항체는 포유동물 세포에서 발현을 위해 클론화된다.
특정 양태에 있어서, 항-NGF 항체의 중쇄 및 경쇄에 대한 보존적 변형(및 암호화 뉴클레오티드에 대한 상응하는 변형)은 본 명세서에 기재된 항-NGF 항체의 것과 유사한 기능적 및 화학적 특성을 갖는 항-NGF 항체를 생성할 것이다. 대조적으로, 항-NGF 항체의 기능적 및/또는 화학적 특성에 있어서의 실질적인 변형은 (a) 예를 들면, 시트 또는 나선형 형태와 같은, 치환 영역에서의 분자 골격의 구조, (b) 표적 부위에서 분자의 전하 또는 소수성 또는 (c) 측쇄의 벌크를 유지함에 대한 그들의 효과가 상당히 상이한 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열에서의 치환을 선택함을 수반할 수 있다.
예를 들면, "보존적 아미노산 치환"은 그 위치의 아미노산 잔기의 극성 또는 전하에 영향을 거의 주지 않는 비천연 잔기에 의한 천연 아미노산 잔기의 치환을 포함할 수 있다. 더욱이, 폴리펩티드에서 임의의 천연의 잔기는 "알라닌 스캐닝 돌연변이 유발"에 대해 앞서 기재된 바와 같이, 알라닌에 의해 또한 치환될 수 있다.
목적하는 아미노산 치환(보존적 또는 비보존적이던 간에)은 상기 치환이 바람직하다는 것을 그 당시 당해 분야의 숙련가가 결정할 수 있다. 특정 양태에 있어서, 아미노산 치환은 본 명세서에 기재된 항-NGF 항체의 중요한 잔기를 확인하거나, 항-NGF 항체의 친화성를 증가 또는 감소시키기 위하여 사용될 수 있다.
잘 알려진 바와 같이, 하나, 소수 또는 심지어 몇 개 아미노산의 결실, 부가 또는 치환과 같은 아미노산 서열의 적은 변화는 실질적으로 동일한 특성을 갖는 본래 단백질의 유전체 형태를 유도할 수 있다. 따라서, 본 명세서에 구체적으로 기재된 항체 이외에, 다른 "실질적으로 상동성인" 항체는 당해 분야의 숙련가에게 잘 알려진 다양한 재조합 DNA 기술을 사용하여 용이하게 디자인하고 제조할 수 있다. 일반적으로, 유전자의 변형은 다양한 잘 알려진 기술(예: 위치-지정 돌연변이 유발)에 의해 용이하게 수행할 수 있다. 따라서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 항-NGF 인간 항체에 실질적으로 유사한 특성을 갖는 "변이체" 또는 "돌연변이" 항-NGF 인간 항체를 시도하였다(참조예: WO 00/56772, 이들 모두는 이에 의해 본 명세서에 참조로 인용됨). 따라서, 항-NGF 인간 항체와 관련된 용어 "변이체" 또는 "돌연변이"는 (i) 전체적으로 볼 때, 중쇄의 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3 또는 경쇄의 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3이 각각 SEQ ID NOS: 14, 18 및 22 또는 SEQ ID NOS: 16, 20 및 24에 제시된 초가변 영역과 적어도 80％ 상동성, 바람직하게는 적어도 90％ 상동성, 보다 바람직하게는 적어도 95％ 상동성이고, (ii) 상기 변이체 또는 돌연변이는 분자 X의 것과 동일한 프레임워크 영역을 갖는 기준 항-NGF 인간 항체와 동일한 정도로 인간 NGF의 활성을 억제할 수 있는 임의의 결합 분자(분자 X)를 의미한다.
통상, 항-NGF 인간 항체 변이체는 전체적으로 볼때, SEQ ID NOS: 14, 18 및 22 및/또는 SEQ ID NOS: 16, 20 및 24에 각각 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 80％ 아미노산 서열 동일성, 바람직하게는 적어도 약 85％ 서열 동일성, 보다 더 바람직하게는 적어도 90％ 서열 동일성, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 91％ 서열 동일성, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 92％ 서열 동일성, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 93％ 서열 동일성, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 94％ 서열 동일성, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 95％ 서열 동일성, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 96％ 서열 동일성, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 97％ 서열 동일성, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 98％ 서열 동일성, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 99％ 아미노산 서열 동일성인 경쇄 및/또는 중쇄 CDR을 가질 것이다.
보다 바람직하게는, 항-NGF 인간 항체 변이체는 전체적으로 볼때, SEQ ID NOS: 12, 80, 82, 84, 86, 88, 89, 90 또는 91에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 80％ 아미노산 서열 동일성, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 81％ 서열 동일성, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 82％ 서열 동일성, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 83％ 서열 동일성, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 84％ 서열 동일성, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 85％ 서열 동일성, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 86％ 서열 동일성, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 87％ 서열 동일성, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 88％ 서열 동일성, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 89％ 서열 동일성, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 90％ 서열 동일성, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 91％ 서열 동일성, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 92％ 서열 동일성, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 93％ 서열 동일성, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 94％ 서열 동일성, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 95％ 서열 동일성, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 96％ 서열 동일성, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 97％ 서열 동일성, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 98％ 서열 동일성, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 99％ 아미노산 서열 동일성인 경쇄 가변 영역 및/또는 SEQ ID NOS:10, 81, 83, 85 또는 87에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 70％ 아미노산 서열 동일성, 바람직하게는 적어도 약 75％ 서열 동일성, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 80％ 서열 동일성, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 81％ 서열 동일성, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 82％ 서열 동일성, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 83％ 서열 동일성, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 84％ 서열 동일성, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 85％ 서열 동일성, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 86％ 서열 동일성, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 87％ 서열 동일성, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 88％ 서열 동일성, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 89％ 서열 동일성, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 90％ 서열 동일성, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 91％ 서열 동일성, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 92％ 서열 동일성, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 93％ 서열 동일성, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 94％ 서열 동일성, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 95％ 서열 동일성, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 96％ 서열 동일성, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 97％ 서열 동일성, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 98％ 서열 동일성, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 99％ 아미노산 서열 동일성인 중쇄 가변 영역을 가질 것이다.
폴리뉴클레오티드와 관련된 "변이체"는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 약 75％ 핵산 서열 동일성을 갖는 핵산 분자를 의미하고자 한다. 통상, 폴리뉴클레오티드 변이체는 본 명세서에 기재된 신규 핵산 서열과 적어도 약 75％ 핵산 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 약 80％ 핵산 서열 동일성, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 81％ 핵산 서열 동일성, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 82％ 핵산 서열 동일성, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 83％ 핵산 서열 동일성, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 84％ 핵산 서열 동일성, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 85％ 핵산 서열 동일성, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 86％ 핵산 서열 동일성, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 87％ 핵산 서열 동일성, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 88％ 핵산 서열 동일성, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 89％ 핵산 서열 동일성, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 90％ 핵산 서열 동일성, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 91％ 핵산 서열 동일성, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 92％ 핵산 서열 동일성, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 93％ 핵산 서열 동일성, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 94％ 핵산 서열 동일성, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 95％ 핵산 서열 동일성, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 96％ 핵산 서열 동일성, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 97％ 핵산 서열 동일성, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 98％ 핵산 서열 동일성, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 99％ 핵산 서열 동일성을 가질 것이다.
특별한 양태로, 본 발명은 본 명세서의 실시예 10 및 도 5 내지 10에 제시된 바와 같이, 본 발명의 항체와 동일성의 비율을 갖는 항체, 또는 본 발명의 중쇄 가변 영역, 경쇄 가변 영역, CDR1, CDR2, 또는 CDR3 영역과 동일성의 비율을 갖는 중쇄 가변 영역, 경쇄 가변 영역, CDR1, CDR2, 또는 CDR3 영역을 포함하는 항체를 제공한다.
특정 양태에 있어서, 본 발명은 중쇄 및 경쇄를 포함하는, 신경 성장 인자에 특이적으로 결합하는 분리된 인간 항체를 제공하며, 이때 중쇄는 다음의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다: SEQ ID NO: 10에 제시된 아미노산 서열과 적어도 70％ 또는 75％ 동일한 아미노산 서열, 또는 이의 항원-결합 단편 또는 면역학적으로 기능적인 면역글로불린 단편; SEQ ID NO: 81에 제시된 아미노산 서열과 적어도 70％, 80％, 85％ 또는 95％ 상동성인 아미노산 서열, 또는 이의 항원-결합 단편 또는 면역학적으로 기능적인 면역글로불린 단편; SEQ ID NO: 83에 제시된 아미노산 서열과 적어도 70％, 80％, 85％ 또는 95％ 동일한 아미노산 서열 또는, 이의 항원-결합 단편 또는 면역학적으로 기능적인 면역글로불린 단편; SEQ ID NO: 85에 제시된 아미노산 서열과 적어도 75％, 80％ 또는 85％ 동일한 아미노산 서열, 또는 이의 항원-결합 단편 또는 면역학적으로 기능적인 면역글로불린 단편; 또는 SEQ ID NO: 87에 제시된 아미노산 서열과 적어도 70％, 75％ 또는 80％ 동일한 아미노산 서열, 또는 이의 항원-결합 단편 또는 면역학적으로 기능적인 면역글로불린 단편; SEQ ID NO: 79에 제시된 아미노산 서열과 적어도 56％ 동일한 아미노산 서열, 또는 이의 항원-결합 단편 또는 면역학적으로 기능적인 면역글로불린 단편.
특정 양태에 있어서, 본 발명은 중쇄 및 경쇄를 포함하는, 신경 성장 인자에 특이적으로 결합하는 분리된 인간 항체를 제공하며, 이때 경쇄는 다음의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다: SEQ ID NO: 12에 제시된 아미노산 서열과 적어도 70％, 75％, 80％ 또는 90％ 동일한 아미노산 서열, 또는 이의 항원-결합 단편 또는 면역학적으로 기능적인 면역글로불린 단편; SEQ ID NO: 80에 제시된 아미노산 서열과 적어도 70％, 85％ 또는 90％ 동일한 아미노산 서열 또는 이의 항원-결합 단편 또는 면역학적으로 기능적인 면역글로불린 단편; SEQ ID NOS: 88에 제시된 아미노산 서열과 적어도 70％, 74％, 90％ 또는 94％ 동일한 아미노산 서열, 또는 이의 항원-결합 단편 또는 면역학적으로 기능적인 면역글로불린 단편; SEQ ID NO: 89에 제시된 아미노산 서열과 적어도 70％, 80％, 85％ 또는 87％ 동일한 아미노산 서열, 또는 이의 항원-결합 단편 또는 면역학적으로 기능적인 면역글로불린 단편; SEQ ID NO: 90에 제시된 아미노산 서열과 적어도 70％, 85％, 90％ 또는 94％ 동일한 아미노산 서열, 또는 이의 항원-결합 단편 또는 면역학적으로 기능적인 면역글로불린 단편; SEQ ID NOS: 91에 제시된 아미노산 서열과 적어도 70％, 85％, 90％, 95％ 또는 99％ 동일한 아미노산 서열, 또는 이의 항원-결합 단편 또는 면역학적으로 기능적인 면역글로불린 단편; SEQ ID NO: 82에 제시된 아미노산 서열과 적어도 70％, 80％, 90％, 95％ 또는 96％ 동일한 아미노산 서열, 또는 이의 항원-결합 단편 또는 면역학적으로 기능적인 면역글로불린 단편; SEQ ID NO: 84에 제시된 아미노산 서열과 적어도 70％, 85％, 90％, 95％, 98％ 또는 99％ 동일한 아미노산 서열, 또는 이의 항원-결합 단편 또는 면역학적으로 기능적인 면역글로불린 단편; 또는 SEQ ID NO: 86에 제시된 아미노산 서열과 적어도 70％, 85％, 90％, 95％, 98％ 또는 99％ 동일한 아미노산 서열, 또는 이의 항원-결합 단편 또는 면역학적으로 기능적인 면역글로불린 단편.
특정 양태에 있어서, 본 발명은 인간 중쇄 CDR1을 포함하는, 신경 성장 인자에 특이적으로 결합하는 분리된 인간 항체를 제공하며, 이때 중쇄 CDR1은 SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 110 또는 SEQ ID NO: 22에 제시된 아미노산 서열과 적어도 40％ 또는 60％ 동일한 아미노산 서열, 또는 이의 항원-결합 단편 또는 면역학적으로 기능적인 면역글로불린 단편이다.
다른 양태에 있어서, 본 발명은 인간 중쇄 CDR2를 포함하는, 신경 성장 인자에 특이적으로 결합하는 분리된 인간 항체를 제공하며, 이때 중쇄 CDR2는 SEQ ID NO: 99에 제시된 아미노산 서열과 적어도 70％, 82％ 또는 94％ 동일한 아미노산 서열, 또는 이의 항원-결합 단편 또는 면역학적으로 기능적인 면역글로불린 단편이고; SEQ ID NO: 106에 제시된 아미노산 서열과 적어도 70％ 또는 76％ 동일한 아미노산 서열, 또는 이의 항원-결합 단편 또는 면역학적으로 기능적인 면역글로불린 단편이며; SEQ ID NO: 18에 제시된 아미노산 서열과 적어도 59％ 동일한 아미노산 서열, 또는 이의 항원-결합 단편 또는 면역학적으로 기능적인 면역글로불린 단편이고; SEQ ID NO: 117에 제시된 아미노산 서열과 적어도 70％ 동일한 아미노산 서열, 또는 이의 항원-결합 단편 또는 면역학적으로 기능적인 면역글로불린 단편이며; 또는 SEQ ID NO: 111에 제시된 아미노산 서열과 적어도 70％, 75％ 또는 80％ 동일한 아미노산 서열, 또는 이의 항원-결합 단편 또는 면역학적으로 기능적인 면역글로불린 단편이다.
또 다른 양태로, 본 발명은 인간 경쇄 CDR1을 포함하는, 신경 성장 인자에 특이적으로 결합하는 분리된 인간 항체를 제공하며, 이때 CDR1은 SEQ ID NO: 101에 제시된 아미노산 서열과 적어도 70％ 또는 80％ 동일한 아미노산 서열, 또는 이의 항원-결합 단편 또는 면역학적으로 기능적인 면역글로불린 단편이고; SEQ ID NO: 95에 제시된 아미노산 서열과 적어도 70％, 75％, 80％ 또는 90％ 동일한 아미노산 서열, 또는 이의 항원-결합 단편 또는 면역학적으로 기능적인 면역글로불린 단편이며; SEQ ID NO: 119에 제시된 아미노산 서열과 적어도 75％, 80％ 또는 90％ 동일한 아미노산 서열, 또는 이의 항원-결합 단편 또는 면역학적으로 기능적인 면역글로불린 단편이고; SEQ ID NO: 122에 제시된 아미노산 서열과 적어도 75％, 80％ 또는 90％ 동일한 아미노산 서열, 또는 이의 항원-결합 단편 또는 면역학적으로 기능적인 면역글로불린 단편이며; SEQ ID NO: 125에 제시된 아미노산 서열과 적어도 80％ 동일한 아미노산 서열, 또는 이의 항원-결합 단편 또는 면역학적으로 기능적인 면역글로불린 단편이고; SEQ ID NO: 24에 제시된 아미노산 서열과 적어도 75％, 80％ 또는 90％ 동일한 아미노산 서열, 또는 이의 항원-결합 단편 또는 면역학적으로 기능적인 면역글로불린 단편이며; SEQ ID NO: 107에 제시된 아미노산 서열과 적어도 70％ 또는 80％ 동일한 아미노산 서열 또는 이의 항원-결합 단편 또는 면역학적으로 기능적인 면역글로불린 단편이고; SEQ ID NO: 113에 제시된 아미노산 서열과 적어도 70％ 또는 80％ 동일한 아미노산 서열, 또는 이의 항원-결합 단편 또는 면역학적으로 기능적인 면역글로불린 단편이다.
부가의 양태에 있어서, 본 발명은 인간 경쇄 CDR2를 포함하는, 신경 성장 인자에 특이적으로 결합하는 분리된 인간 항체를 제공하며, 이때 CDR2는 SEQ ID NO: 102에 제시된 아미노산 서열과 적어도 70％ 또는 85％ 동일한 아미노산 서열, 또는 이의 항원-결합 단편 또는 면역학적으로 기능적인 면역글로불린 단편이고; SEQ ID NO: 96에 제시된 아미노산 서열과 적어도 70％ 동일한 아미노산 서열, 또는 이의 항원-결합 단편 또는 면역학적으로 기능적인 면역글로불린 단편이며; SEQ ID NO: 120에 제시된 아미노산 서열과 적어도 70％ 동일한 아미노산 서열, 또는 이의 항원-결합 단편 또는 면역학적으로 기능적인 면역글로불린 단편이고; SEQ ID NO: 123에 제시된 아미노산 서열과 적어도 70％ 동일한 아미노산 서열, 또는 이의 항원-결합 단편 또는 면역학적으로 기능적인 면역글로불린 단편이며; SEQ ID NO: 126에 제시된 아미노산 서열과 적어도 70％ 또는 85％ 동일한 아미노산 서열, 또는 이의 항원-결합 단편 또는 면역학적으로 기능적인 면역글로불린 단편이고; SEQ ID NO: 129에 제시된 아미노산 서열과 적어도 70％ 또는 85％ 동일한 아미노산 서열, 또는 이의 항원-결합 단편 또는 면역학적으로 기능적인 면역글로불린 단편이며; SEQ ID NO: 20에 제시된 아미노산 서열과 적어도 70％ 동일한 아미노산 서열, 또는 이의 항원-결합 단편 또는 면역학적으로 기능적인 면역글로불린 단편이고; SEQ ID NO: 108에 제시된 아미노산 서열과 적어도 70％ 또는 85％ 동일한 아미노산 서열, 또는 이의 항원-결합 단편 또는 면역학적으로 기능적인 면역글로불린 단편이며; SEQ ID NO: 133에 제시된 아미노산 서열과 적어도 70％ 동일한 아미노산 서열, 또는 이의 항원-결합 단편 또는 면역학적으로 기능적인 면역글로불린 단편이고; SEQ ID NO: 114에 제시된 아미노산 서열과 적어도 70％ 또는 85％ 동일한 아미노산 서열, 또는 이의 항원-결합 단편 또는 면역학적으로 기능적인 면역글로불린 단편이다.
다른 양태로, 본 발명은 인간 경쇄 CDR3을 포함하는, 신경 성장 인자에 특이적으로 결합하는 분리된 인간 항체를 제공하며, 이때 CDR3은 SEQ ID NO: 103에 제시된 아미노산 서열과 적어도 70％ 또는 85％ 동일한 아미노산 서열, 또는 이의 항원-결합 단편 또는 면역학적으로 기능적인 면역글로불린 단편이고; SEQ ID NO: 97에 제시된 아미노산 서열과 적어도 70％ 또는 85％ 동일한 아미노산 서열, 또는 이의 항원-결합 단편 또는 면역학적으로 기능적인 면역글로불린 단편이며; SEQ ID NO: 121에 제시된 아미노산 서열과 적어도 70％ 또는 78％ 동일한 아미노산 서열, 또는 이의 항원-결합 단편 또는 면역학적으로 기능적인 면역글로불린 단편이고; SEQ ID NO: 127 제시된 아미노산 서열과 적어도 70％ 또는 78％ 동일한 아미노산 서열, 또는 이의 항원-결합 단편 또는 면역학적으로 기능적인 면역글로불린 단편이며; SEQ ID NO: 130에 제시된 아미노산 서열과 적어도 70％ 또는 78％ 동일한 아미노산 서열, 또는 이의 항원-결합 단편 또는 면역학적으로 기능적인 면역글로불린 단편이고; SEQ ID NO: 16에 제시된 아미노산 서열과 적어도 70％ 또는 78％ 동일한 아미노산 서열, 또는 이의 항원-결합 단편 또는 면역학적으로 기능적인 면역글로불린 단편이며; SEQ ID NO: 109에 제시된 아미노산 서열과 적어도 70％ 또는 85％ 동일한 아미노산 서열, 또는 이의 항원-결합 단편 또는 면역학적으로 기능적인 면역글로불린 단편이고; SEQ ID NO: 134에 제시된 아미노산 서열과 적어도 78％ 동일한 아미노산 서열, 또는 이의 항원-결합 단편 또는 면역학적으로 기능적인 면역글로불린 단편이며; 또는 SEQ ID NO: 115에 제시된 아미노산 서열과 적어도 85％ 동일한 아미노산 서열, 또는 이의 항원-결합 단편 또는 면역학적으로 기능적인 면역글로불린 단편이다.
4D4 항체 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 서열은 각각 SEQ ID NOS: 10 및 12로 제시되고 있다. 그러나, 잠재적인 CDR-접촉 잔기의 많은 것들은 다른 아미노산에 의해 치환될 수 있고, 여전히 항체는 항원에 대해 실질적인 친화성을 유지하도록 허용된다. 마찬가지로, 중쇄 및 경쇄의 CDR과 접촉되지 않은 프레임워크 잔기 중 많은 것들은 인간 항체의 친화성 또는 비-면역성의 상당한 손실 없이, 다른 인간 항체로부터의 상응하는 위치로부터, 인간 컨센서스 아미노산에 의해, 또는 다른 마우스 항체로부터 아미노산의 치환을 수용할 수 있다. 다양한 대체 아미노산의 선택은 친화성, 특이성, 비-면역성, 제조의 용이성 및 다른 원하는 특성의 다양한 조합을 갖는 기재된 항-NGF 항체 및 이의 단편의 형태를 제조하는데 사용될 수 있다.
대안적 양태로, 본 발명의 항체는 하이브리도마 세포주가 아닌 다른 세포주에서 발현될 수 있다. 이들 양태에서, 특별한 항체를 암호화하는 서열은 적절한 포유동물 숙주 세포의 형질전환을 위해 사용될 수 있다. 이들 양태에 따르면, 형질전환은, 예를 들면, 폴리뉴클레오티드를 바이러스(또는 바이러스성 벡터로)로 패키징하고, 바이러스(또는 벡터)에 의해 숙주 세포를 형질도입시킴을 포함하는, 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포로 도입시키기 위한 임의의 공지된 방법을 사용하거나, 미국 특허 제4,399,216호, 제4,912,040호, 제4,740,461호 및 제4,959,455호(이들 모두는 임의의 목적을 위해 본 명세서에 참조로 인용됨)에 예시된 바와 같이, 당해 분야에 공지된 형질감염 방법에 의해 성취할 수 있다. 일반적으로, 사용되는 형질전환 방법은 형질전환되는 숙주에 따라 좌우될 수 있다. 이종성 폴리뉴클레오티드를 포유동물 세포로 도입시키는 방법은 당해 분야에 잘 공지되어 있으며, 이로써 제한되는 것은 아니지만, 덱스트란-매개된 형질감염, 인산칼슘 침전, 폴리브렌 매개된 형질감염, 원형질체 융합, 전기천공법, 리포좀에 폴리뉴클레오티드(들)의 캡슐화(encapsulation) 및 핵으로 DNA의 직접 미량주입법을 포함한다.
본 발명의 NGF 항체의 중쇄 불변 영역, 중쇄 가변 영역, 경쇄 불변 영역 또는 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 분자는 표준 결합 기술을 사용하여 적절한 발현 벡터로 삽입시킨다. 바람직한 양태로, 항-NGF 항체 중쇄 또는 경쇄 불변 영역은 적절한 가변 영역의 C-말단에 붙어있고, 발현 벡터로 결합된다. 벡터는 통상 사용된 특별한 숙주 세포에서 기능성이 되도록 선택된다(즉, 벡터는 유전자의 증폭 및/또는 유전자 발현이 일어날 수 있도록 숙주 세포 시스템과 양립성이다). 발현 벡터의 검토를 위해, 문헌(METH. ENZ. 185 (Goeddel, ed.), 1990, Academic Press)을 참조하라.
통상적으로, 숙주 세포 중 어느 것에 사용된 발현 벡터는 플라스미드 유지를 위해 및 외인성 뉴클레오티드 서열의 클로닝 및 발현을 위한 서열을 함유한다. 특정 양태에서 "플랭킹 서열(flanking sequence)"로서 총괄적으로 언급되는 상기 서열은 통상적으로 하나 이상의 하기 뉴클레오티드 서열을 포함할 것이다: 프로모터, 하나 이상의 인핸서(enhancer) 서열, 복제 기점, 전사 종결 서열, 도너 및 수용체 접합 부위를 함유하는 완전한 인트론 서열, 폴리펩티드 분비를 위한 리더 서열을 암호화하는 서열, 리보솜 결합 부위, 폴리아데닐화 서열, 발현될 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 삽입하기 위한 폴리링커 영역, 및 선택정 마커 원소를 포함할 것이다. 이들 서열은 각각 하기에서 논의된다.
임의로, 벡터는 "태그"-암호화 서열, 즉 항-NGF 항체 폴리펩티드 암호화 서열의 5' 또는 3' 말단에 위치하는 올리고뉴클레오티드 분자를 함유할 수 있으며; 올리고뉴클레오티드 서열은 polyHis(예: hexaHis) 또는 다른 "태그"(예: FLAG, HA(hemaglutinin influenza virus) 또는 이를 위해 시판중인 항체가 존재하는 myc를 암호화한다. 이 태그는 통상적으로 폴리펩티드의 발현시 폴리펩티드에 융합되고, 숙주 세포로부터 NGF 항체의 친화성 정제 또는 검출을 위한 수단으로서 사용될 수 있다. 친화성 정제는, 예를 들면, 친화성 매트릭스로서 태그에 대한 항체를 사용하는 칼럼 크로마토그래피에 의해 수행할 수 있다. 임의로, 태그는 이어서 절단용 특정 펩티다아제를 사용하는 것과 같이 다양한 방법에 의해 정제된 항-NGF 항체 폴리펩티드로부터 제거할 수 있다.
플랭킹 서열은 상동성(즉, 숙주 세포와 동일한 종 및/또는 균주), 이종성(즉, 숙주 세포 종 또는 균주가 아닌 다른 종으로부터), 하이브리드(즉, 하나 이상의 공급원으로부터의 플랭킹 서열의 조합), 합성 또는 천연일 수 있다. 또한, 플랭킹 서열의 공급원은 원핵세포 또는 진핵세포 유기체, 임의의 척추 또는 무척추 생물 또는 임의의 식물일 수 있으나, 단 플랭킹 서열은 기능적이고, 숙주 세포 시스템에 의해 활성화될 수 있다.
본 발명의 벡터에 유용한 플랭킹 서열은 당해 분야에 잘 공지된 몇몇 방법들 중 어느 것에 의해 수득할 수 있다. 통상적으로, 본 발명에 유용한 플랭킹 서열은 이미 맵핑에 의해 및/또는 제한 엔도뉴클레아제 분해에 의해 확인되었고, 이에 따라 적절한 제한 엔도뉴클레아제를 사용하여 적절한 조직 공급원으로부터 분리할 수 있다. 어떤 경우에, 플랭킹 서열의 완전한 뉴클레오티드 서열이 공지될 수 있다. 이때, 플랭킹 서열은 핵산 합성 또는 클로닝을 위해 본 명세서에 기재된 방법을 사용하여 합성할 수 있다.
플랭킹 서열의 모두 또는 단지 일부가 공지되었는지 간에, 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 사용하여 및/또는 동일하거나 다른 종으로부터 올리고뉴클레오티드 및/또는 플랭킹 서열 단편과 같은 적절한 프로브에 의해 게놈 라이브러리를 스크리닝함으로써 수득할 수 있다. 플랭킹 서열이 공지되지 않은 경우에, 플랭킹 서열을 함유하는 DNA 단편은, 예를 들면, 암호화 서열 또는 심지어 다른 유전자나 유전자들을 함유할 수 있는 더 큰 DNA 조각으로부터 분리할 수 있다. 분리는 적절한 DNA 단편을 생성하기 위하여 제한 엔도뉴클레아제 분해에 이어서, 아가로스 겔 정제, Qiagen® 칼럼 크로마토그래피(Chatsworth, CA) 또는 숙련가에게 공지된 다른 방법들을 사용한 분리에 의해 수행할 수 있다. 이 목적을 수행하기 위한 적절한 효소의 선택은 당해 분야의 통상의 숙련가라면 용이하게 알 수 있을 것이다.
복제 기점은 통상 상용 구입한 전핵 발현 벡터의 일부이고, 기점은 숙주 세포에서 벡터의 증폭을 돕는다. 선택된 벡터가 복제 기점 부위를 함유하지 않으면, 공지된 서열을 근거로 하여 화학적으로 합성하고, 벡터로 결합시킬 수 있다. 예를 들면, 플라스미드 pBR322(New England Biolabs, Beverly, MA)로부터의 복제 기점은 대부분의 그램-음성 박테리아에 적합하고, 다양한 바이러스 기점(예: SV40, 폴리오마, 아데노바이러스, 수포성 구내염바이러스(VSV) 또는 유두종 바이러스(예: HPV 또는 BPV))이 포유동물 세포에서 벡터를 클로닝하는데 유용하다. 일반적으로, 복제 기점 성분은 포유동물 발현 벡터를 위해 필요치 않다(예를 들면, SV40 기점이 종종 사용되는데, 이는 단지 이것이 바이러스 초기 프로모터를 함유하기 때문이다).
전사 종결 서열은 통상적으로 폴리펩티드 암호 영역의 말단에 대해 3'에 위치하고, 전사를 종결하는 작용을 한다. 대개, 원핵세포에서 전사 종결 서열은 G-C 풍부 단편에 이어지는 폴리-T 서열이다. 서열은 라이브러리로부터 용이하게 클로닝하거나 벡터의 일부로서 상용 구입하는 반면에, 본 명세서에 기재된 바와 같이 핵산 합성을 위한 방법을 사용하여 또한 용이하게 합성할 수 있다.
선택적 마커 유전자는 선택적 배양 배지에서 성장시킨 숙주 세포의 생존 및 성장에 필요한 단백질을 암호화한다. 통상적인 선택적 마커 유전자는 (a) 전핵 숙주 세포를 위해 항생제 또는 다른 독소(예: 암피실린, 테트라사이클린 또는 카나마이신)에 대한 내성을 부여하거나; (b) 세포의 영양요구성 결핍을 보완하거나; (c) 복잡하거나 한정된 배지로부터 가능하지 못한 중요한 영양소를 공급하는 단백질을 암호화한다. 바람직한 선택적 마커는 카나마이신 내성 유전자, 암피실린 내성 유전자 및 테트라사이클린 내성 유전자이다. 유용하게, 네오마이신 내성 유전자가 또한 원핵 및 진핵 숙주 세포 모두에서 선택을 위해 사용될 수 있다.
다른 선택적 유전자가 발현될 유전자를 증폭시키기 위하여 사용될 수 있다. 증폭은 성장 또는 세포 생존에 중요한 단백질의 제조에 필요한 유전자가 재조합 세포의 이어지는 세대의 염색체 내에 탠덤에서 반복되는 과정이다. 포유동물 세포를 위한 적절한 선택적 마커의 예는 디하이드로폴레이트 환원효소(DHFR) 및 프로모터 없는 티미딘 키나제 유전자를 포함한다. 포유동물 세포 형질전환체는 선택된 압력하에 놓으며, 이때 단지 형질전환체는 벡터에 존재하는 선택적 유전자에 의해 독특하게 생존하도록 적응된다. 선택 압력은 배지에서 선택제의 농도가 연속적으로 증가되는 조건하에 형질전환된 세포를 배양함으로써, 선택적 유전자 및 다른 유전자를 암호화하는 DNA(예: NGF 폴리펩티드에 결합하는 항체) 모두의 증폭을 유도하여 부과된다. 결과적으로, 증가량의 폴리펩티드(예: 항-NGF 항체)는 증폭된 DNA로부터 합성한다.
리보솜-결합 부위는 대개 mRNA의 해독 개시에 필요하고, 샤인-달가르노(Shine-Dalgarno) 서열(원핵생물) 또는 코작(Kozak) 서열(진핵생물)에 의해 특성화된다. 상기 요소는 통상 발현되는 폴리펩티드의 프로모터에 대해 3' 및 암호화 서열에 대해 5'에 위치한다.
어떤 경우에, 글리코실화를 진핵 숙주 세포에서 원하는 경우와 같이, 글리코실화 또는 수율을 개선하기 위하여 다양한 프리-(pre-) 또는 프로서열을 조작할 수 있다. 예를 들면 특별한 신호 펩티드의 펩티다아제 절단 부위를 바꾸거나, 프로-서열을 가할 수 있고, 이는 또한 글리코실화에 영향을 줄 수 있다. 최종 단백질 생성물은 -1번 위치(성숙 단백질의 첫 번째 아미노산에 대해)에, 완전히 제거되어지 않았을지 모르는, 발현되기 쉬운 하나 이상의 아미노산을 가질 수 있다. 예를 들면, 최종 단백질 생성물은 아미노-말단에 결합된, 펩티다아제 절단 부위에서 발견되는 둘 이상의 아미노산 잔기를 가질 수 있다. 그 대신, 일부 효소 절단 부위의 사용은 효소가 성숙 폴리펩티드 내의 그러한 영역에서 절단된다면, 원하는 폴리펩티드의 끝이 다소 절단된 형태(slightly truncated form)를 야기할 수 있다.
본 발명의 발현 및 클로닝은 통상적으로 숙주 유기체에 의해 인지되는 프로모터를 함유하고, 항-NGF 항체를 암호화하는 분자에 작동가능하게 연결된다. 프로모터는 구조 유전자의 전사를 조절하는 구조 유전자의 개시 코돈(일반적으로 약 100 내지 1000bp 내)에 대해 상부 스트림(즉, 5')에 위치하는 비전사 서열이다. 프로모터는 통상 두 클래스 중 하나로 나뉜다: 유도성 프로모터 및 구성 프로모터. 유도성 프로모터는 영양소의 존재 또는 부재 또는 온도 변화와 같은, 배양 조건에서 일부 변화에 대한 반응으로 그들의 조절하에 DNA로부터 증가된 수준의 전사를 개시한다. 한편, 구성 프로모터는 작동가능하게 연결된, 즉 유전자 발현에 대해 거의 조절 없이 유전자를 균일하게 전사한다. 다양한 잠재적 숙주 세포에 의해 인지되는 다수의 프로모터가 잘 공지되어 있다. 적절한 프로모터는 제한 효소 분해 및 원하는 프로모터 서열을 벡터로 삽입함으로써 공급 DNA로부터 프로모터를 제거하여 본 발명의 항-NGF 항체를 포함하는 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 DNA에 작동가능하게 연결된다.
효모 숙주와 함께 사용하기에 적절한 프로모터가 또한 당해 분야에 잘 공지되어 있다. 효모 인핸서는 효모 프로모터와 유용하게 사용된다. 포유동물 숙주 세포와 사용하기에 적절한 프로모터가 잘 공지되어 있고, 이로써 제한되는 것은 아니지만, 폴리오마 바이러스, 계두 바이러스, 아데노바이러스(예: Adenovirus 2), 소 유두종 바이러스, 조류 육종 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 레트로바이러스, 간염-B 바이러스 및 가장 바람직하게는 Simian Virus 40(SV40)와 같은 바이러스의 게놈으로부터 수득되는 것을 포함한다. 다른 적절한 포유동물 프로모터는 이종 포유동물 프로모터, 예를 들면, 열-쇼크 프로모터 및 액틴 프로모터를 포함한다.
관심있을 수 있는 부가의 프로모터는, 이로써 제한되는 것은 아니지만: SV40 초기 프로모터(Bernoist and Chambon, 1981, Nature 290:304-10); CMV 프로모터(Thomsen et al., 1984, Proc. Natl. Acad. USA 81:659-663); 라우스 육종 바이러스의 3' 긴 말단 반복체에 함유된 프로모터(Yamamoto, et al., 1980, Cell 22:787-97); 헤르페스 티미딘 키나제 프로모터 (Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:1444-45); 메탈로티오닌 유전자로부터의 프로모터 및 조절 서열 (Brinster et al., 1982, Nature 296:39-42); 및 전핵성 프로모터(예: 베타-락타마제 프로모터)(Villa-Kamaroff et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 75:3727-31); 또는 태그 프로모터 (DeBoer et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80:21-25)를 포함한다. 조직 특이성을 나타내고, 유전자이식 동물에서 사용되어온 하기의 동물 전사 대조 영역이 또한 관심이 있다: 췌장 샘 세포에서 활성인 엘라스타제 I 유전자 대조 영역(Swift et al., 1984, Cell 38:639-46; Ornitz et al., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409 (1986); MacDonald, 1987, Hepatology 7:425-515); 췌장 베타 세포에서 활성인 인슐린 유전자 대조 영역(Hanahan, 1985, Nature 315:115-22); 임파상 세포에서 활성인 면역글로불린 유전자 대조 영역(Grosschedl et al., 1984, Cell 38:647-58; Adames et al., 1985, Nature 318:533-38; Alexander et al., 1987, Mol. Cell. Biol., 7:1436-44); 고환, 유방, 림프상 및 비만 세포에서 활성인 마우스 유방 종양 바이러스(Leder et al., 1986, Cell 45:485-95); 간에서 활성인 알부민 유전자 대조 영역(Pinkert et al., 1987, Genes and Devel. 1:268-76); 간에서 활성인 알파-페토-단백질 유전자 대조 영역(Krumlauf et al., 1985, Mol. Cell. Biol., 5:1639-48; Hammer et al., 1987, Science 235:53-58); 간에서 활성인 알파 1-항트립신 유전자 대조 영역(Kelsey et al., 1987, Genes and Devel. 1:161-71); 골수 세포에서 활성인 베타-글로빈 유전자 대조 영역(Mogram et al., 1985, Nature 315:338-40; Kollias et al., 1986, Cell 46:89-94); 뇌의 회돌기 세포에서 활성인 수초 염기성 단백질 유전자 대조 영역(Readhead et al., 1987, Cell 48:703-12); 골격근에서 활성인 미오신 경쇄-2 유전자 대조 영역(Sani, 1985, Nature 314:283-86); 및 시상하부에서 활성인 생식선자극 방출 호르몬 유전자 대조 영역(Mason et al., 1986, Science 234:1372-78).
인핸서 서열은 고등 진핵생물에 의한 본 발명의 항-NGF 항체를 포함하는 경쇄 또는 중쇄를 암호화하는 DNA의 전사를 증가시키기 위하여 벡터로 삽입시킬 수 있다. 인핸서는 전사를 증가시키기 위해 프로모터에 대해 작용하는, 대개 길이가 약 10 내지 300bp인 DNA의 시스-작용 요소이다. 인핸서는 전사 단위에 대해 5' 및 3' 위치 모두에서 발견되는, 비교적 배향 및 위치 의존성이다. 포유동물 유전자로부터 가능한 몇몇 인핸서 서열이 공지되어 있다(예: 글로빈, 엘라스타제, 알부민, 알파-페토-단백질 및 인슐린). 그러나, 통상적으로, 바이러스로부터의 인핸서가 사용된다. 당해 분야에 공지된 SV40 인핸서, 사이토메갈로바이러스 초기 프로모터 인핸서, 폴리오마 인핸서 및 아데노바이러스 인핸서가 진핵성 프로모터의 활성화를 위한 예시적 인핸싱 요소이다. 인핸서는 벡터에서 암호화 서열에 대해 5' 또는 3'에 위치하는 반면에, 이는 통상 프로모터로부터 부위 5'에 위치한다.
본 발명의 발현 벡터는 시판중인 벡터와 같은 출발 벡터(starting vector)로 구성될 수 있다. 상기 벡터는 원하는 플랭킹 서열을 모두 함유하거나 함유하지 않을 수 있다. 본 명세서에 기재된 하나 이상의 플랭킹 서열이 벡터에 이미 존재하지 않는 경우, 그들은 개별적으로 수득하여, 벡터로 결합시킬 수 있다. 각각의 플랭킹 서열을 수득하기 위해 사용되는 방법은 당해 분야의 숙련가에게 잘 공지되어 있다.
벡터를 구성하고, 항-NGF 항체를 포함하는 경쇄, 중쇄 또는 경쇄와 중쇄를 암호화하는 핵산 분자를 벡터의 적절한 부위로 삽입시킨 후, 완성된 벡터는 증폭 및/또는 폴리펩티드 발현을 위해 적절한 숙주 세포로 삽입시킬 수 있다. 항-NGF 항체에 대한 발현 벡터의 선택된 숙주 세포에서의 형질전환은 형질감염, 감염, 인산칼슘 공-침전, 전기천공법, 미량 주입법, 리포펙틴, DEAE-덱스트란 매개된 형질감염 또는 다른 공지된 기술을 포함한 잘 알려진 방법에 의해 수행할 수 있다. 선택된 방법은 부분적으로 사용되는 숙주 세포 형태의 기능일 것이다. 이들 방법 및 다른 적절한 방법이 숙련가에게 잘 공지되어 있고, 예를 들면, 상기 Sambrook 등에 제시되어 있다.
적절한 조건하에 배양시, 숙주 세포는 후에 배양 배지로부터(숙주 세포가 배지로 NGF 항체를 분비한다면) 또는 NGF 항체를 생성하는 숙주 세포로부터 직접(분비되지 않는다면) 수거할 수 있는 항-NGF 항체를 합성한다. 적절한 숙주 세포의 선택은 원하는 발현 수준, 활성에 바람직하거나 필요한 폴리펩티드 변형(예: 글리코실화 또는 포스포릴화) 및 생물학적 활성 분자로 접히는 용이성과 같은 다양한 요인에 따라 좌우될 것이다.
발현을 위해 숙주로서 이용가능한 포유동물 세포주는 당해 분야에 잘 공지되어 있으며, 이로써 제한되는 것은 아니지만, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포, HeLa 세포, 아기 햄스터 신장(BHK) 세포, 원숭이 신장 세포(COS), 인간 간세포암 세포(예: Hep G2) 및 수많은 다른 세포주를 포함하는, American Type Culture Collection (ATCC)으로부터 가능한 불멸화 세포주를 이로써 제한되는 것은 아니지만 포함한다. 특정 양태에 있어서, 세포주는 세포주가 높은 발현 수준을 갖고, NGF 결합 특성을 갖는 항체를 구성적으로 제조하는 지를 측정함으로써 선택할 수 있다. 다른 양태로, 그 자신의 항체를 제조하지 않지만, 이종 항체를 제조 및 분비하는 능력을 갖는 B 세포 혈통으로부터의 세포주를 선택할 수 있다.
본 발명의 항체는 생물학적 샘플에서 NGF를 검출하고, NGF 단백질을 제조하는 세포 또는 조직의 확인에 유용하는데 유용하다. NGF에 특이적으로 결합하는 본 발명의 항체는 NGF 매개된 질병의 치료시 유용할 수 있다. 상기 항체는 NGF를 검출하고, NGF 수용체와의 착화합물 형성으로부터 NGF를 억제하기 위해 결합 검정에서 사용될 수 있다. NGF에 결합하여 다른 결합 화합물과의 상호작용을 차단하는 상기 항체는 NGF 매개된 질병의 조절시 치료학적 용도를 가질 수 있다. 바람직한 양태로, NGF에 대한 항체는 이의 수용체에 대한 NGF 결합을 차단할 수 있고, 이는 NGF 유도 단독 형질도입 캐스케이드의 붕괴를 일으킬 수 있다.
본 발명은 또한 본 명세서에 기재된 장애 또는 질환 중의 어느 하나와 같이 환자에서 NGF의 증가된 발현 또는 NGF에 대한 증가된 감도에 의해 야기되는 고통스러운 장애 또는 질환 치료용 약제의 제조에 있어서의 하나 이상의 본 발명의 항체의 용도에 관한 것이다.
바람직한 양태로, 본 발명은 약제학적으로 허용되는 희석제, 담체, 가용화제, 유화제, 보존제 및/또는 보조제와 함께, 하나 또는 다수의 본 발명의 항체를 치료학적 유효량으로 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 바람직하게는, 허용되는 제형 물질은 사용되는 투여 및 농도에서 수용자에게 비독성이다. 바람직한 양태로, 치료학적 유효량의 항-NGF 항체를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다.
특정 양태에 있어서, 허용되는 제형 물질은 바람직하게는 사용되는 투여 및 농도에서 수용자에게 비독성이다.
특정 양태에 있어서, 약제학적 조성물은, 예를 들면, 조성물의 pH, 삼투압 농도, 점도, 투명도, 색상, 등장성, 냄새, 멸균성, 안정성, 용해 또는 방출 속도, 흡착 또는 침투를 변형, 유지 또는 보존하기 위한 제형 물질을 함유할 수 있다. 상기 양태에 있어서, 적절한 제형 물질은, 이로써 제한되는 것은 아니지만, 아미노산(예: 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 리신); 항미생물제; 항산화제(예: 아스코르브산, 아황산나트륨 또는 아황산수소나트륨); 완충제(예: 보레이트, 비카보네이트, Tris-HCl, 시트레이트, 포스페이트 또는 다른 유기산); 증량제(예: 만니톨 또는 글리신); 킬레이트화제(예: 에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA)); 착화합물화제(예: 카페인, 폴리비닐피롤리돈, 베타-사이클로덱스트란 또는 하이드록시프로필-베타-사이클로덱스트란); 충전제; 단당류; 이당류 및 다른 탄수화물(예: 글루코즈, 만노즈 또는 덱스트린); 단백질(예: 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린); 착색, 향미 및 희석제; 유화제; 친수성 중합체(예: 폴리비닐피롤리돈); 저분자량 폴리펩티드; 염-형성 반대이온(예: 나트륨); 보존제(예: 벤즈알코늄 클로라이드, 벤조산, 살리실산, 티메로살, 펜에틸 알콜, 메틸파라벤, 프로필파라벤, 클로르헥시딘, 소르브산 또는 과산화수소); 용매(예: 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜); 당 알콜(예: 만니톨 또는 소르비톨); 현탁제; 계면 활성제 또는 습윤제(예: 플루로닉, PEG, 소르비탄 에스테르, 폴리소르베이트(예: 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80), 트리톤, 트로메타민, 레시틴, 콜레스테롤, 틸록사팔); 안정성 개선제(예: 수크로즈 또는 소르비톨); 장성 개선제(예: 알칼리 금속 할라이드, 바람직하게는 염화나트륨 또는 염화칼륨, 만니톨 소르비톨); 전달 비히클; 희석제; 부형제 및/또는 약제학적 보조제를 포함한다(참조: REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18th Edition, (A.R. Gennaro, ed.), 1990, Mack Publishing Company).
특정 양태에 있어서, 최적의 약제학적 조성물은, 예를 들면, 의도하는 투여 경로, 전달 포맷 및 원하는 용량에 따라 당해 분야의 숙련가가 결정할 것이다(참조예: REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 상기). 특정 양태에 있어서, 상기 조성물은 본 발명의 항체의 물리적 상태, 안정성, 생체 내 방출 속도 및 생체 내 청소율(rate in vivo clearance)에 영향을 줄 수 있다.
특정 양태에 있어서, 약제학적 조성물 중 1차 비히클 또는 담체는 사실상 수성 또는 비수성일 수 있다. 예를 들면, 적절한 비히클 또는 담체는 주사용수, 생리학적 식염수 또는 아마도 비경구 투여용 조성물에서 통상적인 다른 물질로 보충된 인공 뇌척수액일 수 있다. 중성 완충 염수 또는 혈청 알부민과 혼합된 염수는 추가의 예시적 비히클이다. 바람직한 양태로, 본 발명의 약제학적 조성물은 pH 약 7.0-8.5의 트리스 완충제 또는 pH 약 4.0-5.5의 아세테이트 완충제를 포함하며, 소르비톨, 수크로즈, 트윈-20 및/또는 이를 위한 적절한 대체물을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 특정 양태에 있어서, 항-NGF 항체 조성물은 동결건조 케이크 또는 수용액의 형태로 임의의 제형화제(상기 REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES)와 원하는 순도를 갖는 선택된 조성물을 혼합함으로써 저장을 위해 제조할 수 있다. 또한, 특정 양태에 있어서, 항-NGF 항체 생성물은 적절한 부형제(예: 수크로즈)를 사용하여 동결건조물로서 제형화할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 비경구 전달을 위해 선택될 수 있다. 이와 달리, 조성물은 흡입을 위해 또는 소화관을 통한 전달(예: 경구)을 위해 선택될 수 있다. 상기 약제학적으로 허용되는 조성물의 제조는 당해 분야에 속한다.
제형 성분들은 바람직하게는 투여 부위에 허용되는 농도로 존재한다. 특정 양태에 있어서, 완충제는 조성물을 생리학적 pH 또는 다소 낮은 pH에서, 통상적으로 약 5 내지 약 8의 pH 범위 내에서 유지하기 위하여 사용된다.
비경구 투여를 수행하는 경우에, 본 발명에 사용하기 위한 치료학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 비히클에 목적하는 항-NGF 항체를 포함하는 무발열원(pyrogen-free)의 비경구적으로 허용되는 수용액의 형태로 제공될 수 있다. 비경구 주사를 위해 특히 적합한 비히클은 멸균 증류수로, 이때 항-NGF 항체는 적절히 보존되는, 멸균, 등장성 용액으로서 제형화된다. 특정 양태에 있어서, 제제는 데포 주사를 통해 전달될 수 있는 생성물의 조절 방출 또는 서방성(controlled or sustained release)을 제공할 수 있는 주사 가능한 마이크로 구, 생분해성 입자, 중합체성 화합물(예: 폴리락트산 또는 폴리글리콜산), 비드 또는 리포좀과 같은 제제와 목적하는 분자와의 제형을 포함할 수 있다. 특정 양태에 있어서, 순환시 유지 지속기간을 촉진하는 효과를 갖는 히알루론산이 또한 사용될 수 있다. 특정 양태에 있어서, 이식 가능한 약제 전달 장치가 목적하는 항체 분자를 도입시키기 위하여 사용될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 흡입용으로 제형화될 수 있다. 이들 양태에 있어서, 항-NGF 항체는 무수 흡입용 분말로서 유용하게 제형화된다. 바람직한 양태로, 항-NGF 항체 흡입 용액은 또한 에어로졸 전달을 위한 추진제와 함께 제형화될 수 있다. 특정 양태에 있어서, 용액은 분무될 수 있다. 따라서, 폐 투여 및 제형 방법이 국제특허출원 제PCT/US94/001875호에 추가로 기재되어 있으며, 이는 참조로 인용되고, 화학적으로 변형된 단백질의 폐 전달을 기재하고 있다.
또한 제형을 경구 투여할 수 있음을 시도하였다. 이러한 형태로 투여되는 항-NGF 항체는 고체 투여 형태(예: 정제 및 캡슐)의 화합시 통상 사용되는 담체의 존재 또는 부재하에 제형화될 수 있다. 특정 양태에 있어서, 캡슐은 생체이용률이 최대이고 프리-시스템(pre-systemic) 분해가 최소인 경우 위장관의 지점에서 제형의 활성 부분을 방출하도록 고안될 수 있다. 부가제는 항-NGF 항체의 흡수를 용이하게 하기 위하여 포함될 수 있다. 희석제, 향미제, 저융점 왁스, 식물성유, 윤활제, 현탁제, 정제 붕해제 및 결합제가 또한 사용될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 바람직하게는 정제 제조시 적합한 비-독성 부형제와의 혼합물에 하나 또는 다수의 항-NGF 항체를 유효량 포함하도록 제공된다. 멸균수 또는 다른 적절한 비히클에 정제를 용해시킴으로써, 용액은 단위-용량 형태로 제조될 수 있다. 적절한 부형제는, 이로써 제한되는 것은 아니지만, 불활성 희석제(예: 탄산칼슘, 탄산나트륨 또는 비카보네이트, 락토즈 또는 인산칼슘); 또는 결합제(예: 전분, 젤라틴 또는 아카시아); 또는 윤활제(예: 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 또는 탈크)를 포함한다.
지속(sustained)- 또는 조절(controlled)-전달 제형에 항-NGF 항체를 수반하는 제형을 포함한 부가의 약제학적 조성물은 당해 분야의 숙련가에게는 분명할 것이다. 다양한 다른 지속- 또는 조절-전달 수단(예: 리포좀 담체, 생분해성 미세입자 또는 다공성 비드 및 데포 주사)을 제형화하는 기술이 또한 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있다(참조예: 국제특허출원 제PCT/US93/00829호, 이는 참조로 인용되고, 약제학적 조성물의 전달을 위한 다공성 중합체성 미세입자의 조절된 방출을 기재하고 있다). 서방성(sustained-release) 제제는 성형 제품(예: 필름 또는 마이크로캡슐)의 형태로 반투과성 중합체 매트릭스를 포함할 수 있다. 서방성 매트릭스는 폴리에스테르, 하이드로겔, 폴리락트산(각각이 참조로 인용된, 미국 특허 제3,773,919호 및 유럽 특허출원 공보 제EP 058481호에 기재된 바와 같은), L-글루탐산 및 감마 에틸-L-글루타메이트의 공중합체(Sidman 등의 1983, Biopolymers 22:547-556), 폴리(2-하이드록시에틸-메타크릴레이트)(Langer 등의 1981, J. Biomed. Mater. Res. 15:167-277 and Langer, 1982, Chem. Tech. 12:98-105), 에틸렌 비닐 아세테이트(상기 Langer 등의) 또는 폴리-D(-)-3-하이드록시부티르산(유럽 특허출원 공보 제EP 133,988호)을 포함할 수 있다. 서방성 조성물은 또한 당해 분야에 공지된 몇몇 방법 중 어떤 것에 의해 제조될 수 있는 리포좀을 포함할 수 있다(참조예: Eppstein 등의 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688-3692; 참조로 인용된, 유럽 특허출원 공보 제EP 036,676호; 제EP 088,046호 및 제EP 143,949호).
생체 내 투여를 위해 사용되는 약제학적 조성물은 통상 멸균 제제로서 제공된다. 멸균화는 멸균 여과 막을 통한 여과에 의해 수행될 수 있다. 조성물을 동결건조시키면, 이 방법을 사용하는 멸균화는 동결건조 및 재구성 전에 또는 이에 이어서 수행할 수 있다. 비경구 투여용 조성물은 동결건조된 형태로 또는 용액으로 저장할 수 있다. 비경구용 조성물은 일반적으로 멸균 접속구를 갖는 용기, 예를 들면, 피하주사기 주사 바늘에 의해 뚫어질 수 있는 마개를 갖는 정맥내 용액 백(bag) 또는 바이알로 넣는다.
약제학적 조성물이 제형화되면, 이는 용액, 현탁액, 겔, 에멀젼, 고체로서, 또는 탈수 또는 동결건조 분말로서 멸균 바이알에 저장할 수 있다. 상기 제형은 사용할 준비가 된 형태로 또는 투여 전에 재구성되는 형태(예: 동결건조)로 저장될 수 있다.
본 발명은 또한 단일-용량 투여 단위를 제조하기 위한 키트를 제공한다. 본 발명의 키트는 각각 무수 단백질을 함유하는 제1 용기 및 수성 제형을 갖는 제2 용기를 모두 함유할 수 있다. 본 발명의 특정 양태에 있어서, 단일 및 다중-챔버의 미리 충전된 주사기(single and multi-chambered pre-filled syringe)[예: 액체 주사기 및 리오시린지(lyosyringe)]를 함유하는 키트가 제공된다.
치료학적으로 사용되는 항-NGF 항체-함유 약제학적 조성물의 유효량은, 예를 들면, 치료학적 내용 및 목적에 따라 좌우될 것이다. 당해 분야의 숙련가는 치료를 위한 적절한 투여 수준이 부분적으로 전달되는 분자, 항-NGF 항체가 사용되는 지시서, 투여 경로 및 환자의 크기(체중, 체표면 또는 기관 크기) 및/또는 상태(연령 및 일반적인 건강)에 따라 변함을 이해할 것이다. 특정 양태에 있어서, 임상가는 용량의 역가를 정할 수 있고, 최적의 치료학적 효과를 수득하기 위하여 투여 경로를 변경한다. 통상적인 용량은 상기 언급한 요인에 따라, 약 0.1㎍/㎏ 내지 약 30㎎/㎏; 보다 바람직하게는 1㎍/㎏ 내지 약 30㎎/㎏; 보다 더 바람직하게는 5㎍/㎏ 내지 약 30㎎/㎏의 범위일 수 있다.
특정 양태에 있어서, 조성물은 피하 주사로 투여할 수 있다. 그러나, 상기에서 알 수 있는 바와 같이, 투여량은 특정 양태에 있어서, 피하 주사에 의해 투여되는 조성물 중 NGF 항체의 약제학적 유효량이 약 0.1㎍/㎏ 내지 약 30㎎/㎏임을 임상가는 결정할 수 있다. 특정 양태에 있어서, NGF 항체의 약제학적 유효량은 피하 주사시 약 3 내지 약 30㎎이다. 특정 양태에 있어서, 투여는 다중 피하 주사를 포함한다. 또 다른 양태에 있어서, 투여는 단일 피하 주사를 포함한다.
투여 빈도는 사용되는 제형에서 특별한 항-NGF 항체의 약동학적 파라미터에 따라 좌우될 것이다. 통상적으로, 임상가는 원하는 효과가 성취되는 용량에 이를 때 까지 조성물을 투여한다. 따라서, 조성물은 단일 용량으로서, 또는 시간에 따라 2개 이상의 용량(동일한 양의 목적하는 분자를 함유하거나 함유하지 않을 수 있다)으로서, 또는 이식 장치 또는 카테터를 통한 연속 주입으로서 투여될 수 있다. 적절한 용량의 추가 정제는 통상적으로 당해 분야의 통상의 숙련가에 의해 수행되고, 그들에 의해 통상적으로 수행되는 작업의 영역 내에 속한다. 적절한 용량은 적절한 용량-반응 데이터의 사용을 통해 확인할 수 있다. 특정 양태에 있어서, 본 발명의 항체는 연장된 시간에 걸쳐 환자에 투여될 수 있다. 본 발명의 항체의 만성 투여는 비-인간 동물에서 인간 항원에 대해 생겨나는 항체, 예를 들면, 비-인간종에서 제조된 비-완전 인간 항체와 통상 관련된 유해 면역(adverse immune) 또는 알레르기 반응을 최소화한다.
약제학적 조성물의 투여 경로는 공지된 방법, 예를 들면, 경구, 정맥내, 복강내, 뇌내(실질내), 뇌혈관내, 근육내, 안구내, 동맥내, 문맥내 또는 병변내 경로에 의한 주사를 통해, 서방출 시스템에 의해 또는 이식 장치에 의해 따른다. 특정 양태에 있어서, 조성물은 볼루스 주사(bolus injection)에 의해 또는 계속해서 주입에 의해, 또는 이식 장치에 의해 투여될 수 있다.
조성물은 또한 막, 스폰지 또는 목적 분자가 흡수되거나 캡슐화되는 다른 적절한 물질의 이식을 통해 국소 투여할 수 있다. 특정 양태에 있어서, 이식 장치가 사용되는 경우에, 상기 장치는 임의의 적절한 조직 또는 기관으로 이식될 수 있고, 목적 분자의 전달은 확산, 시한 방출 볼루스(timed-release bolus) 또는 연속 투여를 통해 이루어질 수 있다.
특정 양태에 있어서, 본 발명은 약제학적 유효량의 NGF 항체를 환자에 경구, 정맥내, 복강내, 뇌내(실질내), 뇌혈관내, 근육내, 안구내, 동맥내, 문맥내, 병변내 또는 피하 경로에 의한 주사를 통해, 서방성 시스템에 의해 또는 이식 장치에 의해 투여함을 포함하는, 신경 성장 인자(NGF)의 증가된 발현 또는 NGF에 대한 증가된 감도에 의해 야기되는 질환의 치료 방법에 관한 것으로, 이때 상기 질환은 급성 통증, 치통, 외상으로부터의 통증, 수술통, 절단 또는 농양으로부터 생성된 통증, 작열통, 탈수초성 질병, 삼차 신경통, 암, 만성 알콜 중독, 뇌졸중, 시상통 증후군, 당뇨병, 후천성 면역결핍증("AIDS"), 독소, 화학요법, 일반적인 두통, 편두통, 군발성 두통, 혼합된-혈관 또는 비-혈관 증후군, 긴장성 두통, 일반적인 염증, 관절염, 류마티스성 질병, 루푸스, 골관절염, 섬유근통, 염증성 장 질환, 과민성 대장 증후군, 염증성 안 질환, 염증성 또는 불안정한 방광 장애, 건선, 염증성 성분에 의한 피부 통증, 일광화상, 심장염, 피부염, 근염, 신경염, 콜라겐 혈관 질병, 만성 염증성 질환, 염증성 통증 및 관련된 통각과민과 이질통, 신경병성 통증 및 관련된 통각과민 또는 이질통, 당뇨성 신경병성 통증, 작열통, 교감신경성 지속 통증, 구심로차단 증후군, 천식, 상피조직 손상 또는 기능장애, 단순포진, 호흡기, 비뇨생식, 위장 또는 혈관 영역에서의 내장 운동 장애, 상처, 화상, 알레르기성 피부 반응, 가려움, 백반증, 일반적인 위장 장애, 대장염, 위궤양, 십이지장궤양, 혈관운동신경성 또는 알레르기 비염, 또는 기관지 장애, 월경곤란증, 소화불량, 위식도역류, 췌장염 또는 장기통이다.
특정 양태에 있어서, 상기 방법은 약제학적 유효량의 NGF 항체를 포함하며, 골관절염 무릎 통증의 치료 또는 예방에 유용하다. 특정 양태에 있어서, NGF 항체의 약제학적 유효량은 피하 주사당 약 3mg 내지 약 30㎎이다. 특정 양태에 있어서, 투여는 다중 피하 주사를 포함한다. 양태에 있어서, 투여는 단일 피하 주사를 포함한다. 특정 양태에 있어서, 본 발명의 조성물 및 방법은 SEQ ID NO: 44를 포함하는 경쇄를 포함하는 NGF 항체를 포함한다. 특정 양태에 있어서, NGF 항체는 SEQ ID NO: 40을 포함하는 중쇄를 포함한다. 추가 양태에 있어서, NGF 항체는 SEQ ID NO: 44를 포함하는 경쇄 및 SEQ ID NO: 40을 포함하는 중쇄를 포함한다.
따라서, 본 발명의 상기 기재에 따르면, 다양한 측면에 있어서, 본 발명은 SEQ ID NO: 44를 포함하는 경쇄 및 SEQ ID NO: 40을 포함하는 중쇄를 포함하는 NGF 항체를 포함하는 방법 및 조성물에 관한 것으로, 이때 항체의 중쇄 및 경쇄는 가요성 링커에 의해 연결되어 단일쇄 항체를 형성한다. 이 측면의 일부 양태에 있어서, NGF 항체는 단일쇄 Fv 항체, Fab' 항체, (Fav')2 항체, 완전 인간 항체 및/또는 인간화 항체를 포함한다. 이 측면의 일부 양태에 있어서, NGF 항체는 NGF 신호화를 억제한다.
이 측면의 특정 양태에 있어서, NGF 항체는 약 1 x 10-9 이하, 약 1 x 10-10 이하 또는 약 1 x 10-11 이하의 KD를 가지면서 인간 NGF 폴리펩티드로부터 해리된다. 이 측면의 특정 양태에 있어서, NGF 항체는 약 1 x 10-8 이하, 약 1 x 10-9 이하 또는 약 0.2 x 10-9 이하의 IC50을 가지면서 표준 시험관 내 검정에서 인간 NGF 생체활성을 중화시킨다. 특정 양태에 있어서, NGF 항체는 상기-언급한 KD 값(들)을 가지면서 인간 NGF 폴리펩티드로부터 해리되고, 상기 언급한 IC50 값을 가지면서 표준 시험관 내 검정에서 인간 NGF 생체활성을 중화시킨다.
또한, 본 발명에 따르는 항-NGF 항체 약제학적 조성물을 생체 외(ex vivo) 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 상기 경우에, 환자로부터 제거된 세포, 조직 또는 기관은 항-NGF 항체 약제학적 조성물에 노출된 후, 세포, 조직 및/또는 기관이 이어서 환자로 다시 이식된다.
특히, 항-NGF 항체는 폴리펩티드를 발현하고 분비하기 위하여, 본 명세서에 기재된 것과 같은 방법들을 사용하여, 유전적으로 조작된 특정 세포를 이식함으로써 전달할 수 있다. 특정 양태에 있어서, 상기 세포는 동물 또는 인간 세포일 수 있고, 자가유래, 이형성 또는 이종성일 수 있다. 특정 양태에 있어서, 세포는 불멸화될 수 있다. 다른 양태로, 면역학적 반응의 기회를 감소시키기 위하여, 세포는 주변 조직의 침윤을 피하기 위하여 캡슐화할 수 있다. 추가 양태로, 캡슐화 물질은 통상 단백질 생성물(들)의 방출을 허용하지만, 환자의 면역계에 의한 또는 주변 조직으로부터의 다른 유해한 요인에 의한 파괴를 방지하는 생체적합성, 반투과성 중합체성 인클로저(enclosures) 또는 막이다.
실시예
수행된 실험과 성취한 결과를 포함하여, 다음 실시예는 단지 설명을 위한 목적으로 제공되며 본 발명을 제한하는 것으로 해석되지 않는다.
[실시예 1]
대장균 세포로부터 인간 NGF 단백질의 생성
rHu-NGF(1-120)의 클로닝
SEQ ID NO:27 및 SEQ ID NO:28에 제시된 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 프라이머와 표준 PCR 기술을 사용하여 인간 NGF를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 cDNA로부터 증폭시켰다. 5'프라이머는 상기 성숙 서열의 NdeI 제한 부위와 코돈 1(세린) 바로 전에 메티오닌 개시 코돈을 생성시킨다. 3'프라이머는 상기 종결 코돈 바로 다음에 BamHI 제한 부위를 생성시킨다. 상기 생성된 PCR 생성물을 겔 정제하고, 제한 엔도뉴클레아제 NdeI와 BamHI로 분해시킨 다음, NdeI와 BamHI로 분해시킨 벡터 pCFM1656 내로 결합시켰다. 결합된 DNA를 대장균 균주 657의 경쟁 숙주 세포로 형질전환시켰다. 재조합 단백질 생성물의 생산 능력 및 정확한 뉴클레오티드 서열(즉, SEQ IE NO:29)을 갖는 플라스미드 소유 능력에 대해 클론을 스크리닝하였다. 재조합 인간 NGF 1-120의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:30으로 나타낸다.
발현 벡터 pCFM1656 (ATCC #69576)을 미국 특허 제4,710,473호에 기재된 발현 벡터 시스템으로부터 유도하였다. pCFM1656 플라스미드는 (a) 2개의 내인성 NdeI 제한 부위를 T4 폴리머라제 효소로 말단 충전시킨 다음 평활-말단 결합시킴으로써 파괴하고; (b) pCFM636 (특허 번호 제4,710,473호)으로부터 수득한 유사 단편을 갖는 합성 PL 프로모터를 함유하는 특유의 AatII와 ClaI 제한 부위 사이에 상기 DNA 서열을 대체시킨 다음 (c) 상기 특유의 ClaI 및 KpnI 제한 부위 사이의 작은 DNA 서열을, SEQ ID NO:31과 SEQ ID NO:32에 제시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 2개의 프로브를 어닐링하여 수득한 올리고뉴클레오티드로 치환시킴으로써 상기 기재된 pCFM836 플라스미드 (특허 번호 제4,710,473호)로부터 유도될 수 있다.
대장균 K12 숙주 균주 (Amgen strain 657)는 대장균 W1485 (K12 strain)의 유도체이며, E. coli Genetic Stock Center, Yale University, New Haven, CT로부터 수득된다(CGSC strain 6159).
rHu-NGF(1-120)의 발현
NGF 발현 구성물(상기한 바와 같음)을 함유하는 대장균 세포를 공급형-배치 방식(fed-batch mode)으로 풍부한 배지에서 배양시켰다. 세포를 30 ℃에서 49의 600 nm에서의 OD까지 성장시킨 다음, 42 ℃로 온도 전이시켜 유도시켰다. 세포를 유도시킨지 4시간 후에 원심분리시켜 채취하였다. 최종 OD는 75였다. 발현 수율은 대략 0.15 g/L로 측정되었다.
rHu-NGF(1-120)의 재접힘(refolding) 및 정제
세포 페이스트를 마이크로플루이다이저(Microfluidizer)에서 용해시키고(lysed), 10,000 X g에서 30분간 원심분리시켜, 펠릿을 1％ 데옥시콜산으로 세척하고, 상기한 바와 같이 원심분리시킨 다음, 생성된 펠릿을 냉수로 세척하고 다시 원심분리시켰다. 생성된 펠릿[WIBs - 세척된 봉입체(washed inclusion bodies)]을 10 mM DTT를 함유하는, 변성제, 8M 구아니딘 HCl, 50 mM Tris pH 8.5에 재현탁시키고, 실온에서 1시간 동안 용해시킨 다음, 10,000 x g에서 30분간 원심분리시키고, 상등액을 주의하여 기울인 다음 4 ℃에서 5일간 산화환원 쌍(redox couple)을 함유하는 수성 완충액에 25배로 희석시켰다. 이어서 상기 생성된 재접힘물(refold)을 pH 3.0으로 적정하고, 0.45 μM 필터를 통하여 여과하였다. 상기 재접힘물을 표준 NaCl 구배를 사용하는 Sp-Sepharose 빠른 유동 컬럼을 사용하여 정제하였다. 이어서, 상기 양이온 교환 컬럼으로부터의 풀(pool)을 농축시키고 분취량을 -80 ℃로 동결시켰다. 단백질의 순도는 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동법(SDS-PAGE)으로 평가하였으며 쿠마시 블루(Coomassie blue) 염색법으로 분석하였다. 상기 정제된 단백질은 상기 방법에 의해 90％ 이상의 주요 밴드였다.
[실시예 2]
신경 성장 인자(NGF)에 대한 인간 모노클로날 항체의 생산
유전자이식 HuMab 및 KM 마우스
NGF에 대한 완전 인간 모노클로날 항체를 유전자이식 마우스의 HCo7, HCo12, HCo7+HCo12, 및 KM 계통을 사용하여 제조하였으며, 이들 각각의 종은 인간 항체 유전자를 발현시킨다. 이들 각각의 마우스 계통에서, 내인성 마우스 카파 경쇄 유전자는 문헌: Chen 등의 (1993, EMBO J. 12:811-820)에 기재된 바와 같이 균질하게 파괴시켰으며, 상기 내인성 마우스 중쇄 유전자는 국제특허출원 공보 제WO 01/09187호(참고로 포함됨)의 실시예 1에 기재된 바와 같이 균질하게 파괴시켰다. 이들 각각의 마우스 계통은 문헌: Fishwild 등의 (1996, Nature Biotechnology 14:845-851)에 기재된 바와 같이, 인간 카파 경쇄 이식유전자, KCo5를 운반한다. 상기 HCo7 계통은 미국 특허 제5,545,806호, 제5,625,825호, 및 제5,545,807호(참고로 포함됨)에 기재된 바와 같이 HCo7 인간 중쇄 이식유전자를 운반한다. 상기 HCo12 계통은 국제특허출원 공보 제WO 01/09187호 (참고로 포함됨)의 실시예 2에 기재된 바와 같이 HCo12 인간 중쇄 이식유전자를 운반한다. HCo7+HCo12 계통은 HCo7 및 HCo12 중쇄 이식유전자 둘 다를 운반하며 각각의 이식유전자에 대해 반접합성이다. KM 마우스는 문헌: Tomizuka 등의 (1997, Nature Genet. 16, 133-143 및 2000, Proc. Natl. Acad. Sci, 97, 722-727)에 기재된 바와 같이 SC20 중쇄 이식유전자를 포함한다. 상기 이식유전자는 마우스 염색체중으로 통합되는 것이 아니라, 대신 독립적인 염색체 단편으로 번식된다. 상기 단편은 대략 15 MB의 인간 염색체 14를 포함한다. 이는 모든 VH, D 및 JH 유전자 절편과 모든 중쇄 불변 영역 이소-타입을 포함한 전체 인간 중쇄 좌위를 포함한다. 이들 모든 계통은 본 명세서에서 HuMab 마우스로 언급된다.
HuMab 면역화:
NGF에 대한 완전 인간 모노클로날 항체를 만들기 위해, HuMab 마우스를 대장균 세포로부터 항원으로서 유도된 정제된 재조합 NGF (실시예 1)로 면역화시켰다. HuMab 마우스에 대한 일반적인 면역화 방식은 문헌: Lonberg 등의 (1994, Nature 368:856-859; 상기 Fishwild 등의 및 국제특허출원 공보 제WO 98/24884호, 이들 각각의 교시 내용은 참고로 포함된다)에 기재된 바와 같다. 마우스는 1차 항원 주입시 6 내지 16주령이었다. NGF 항원의 정제된 재조합 제제 (25-100 ㎍)를 사용하여 HuMab 마우스는 복강내(IP) 또는 피하(SC) 면역화시켰다.
HuMab 유전자이식 마우스의 면역화는 완전 Freund's 아쥬반트 중의 항원과 2회 주사를 사용하여 수행한 다음, 2 내지 4주 후 불완전 Freund's 아쥬반트 중의 항원을 사용하여 IP 면역화시킨다(총 9회 까지 면역화). 수십 마리의 마우스가 각 항원에 대해 면역화되었다. HCo7, HCo12, HCo7+HCo12, 및 KM 계통 중 총 118마리의 마우스가 NGF 항원으로 면역화되었다. 상기 면역 반응은 안와후방 채혈(retroorbital bleed)로 모니터하였다.
인간 NGF와 결합한 항체를 생산하는 HuMab 마우스를 선택하기 위하여, 면역화된 마우스로부터의 혈청을 상기 Fishwild 등의 문헌에 기재된 바와 같이 ELISA로 시험하였다. 간략하면, 미세역가 플레이트를 대장균으로부터의 정제된 재조합 NGF(실시예 1)로 PBS 중 1-2 ㎍/㎖ 로 하여 50 ㎕/웰로 코팅하고 4 ℃에서 밤새 배양시킨 다음, PBS/Tween (0.05％) 중의 5％ 닭 혈청을 200 ㎕/웰로 하여 차단시켰다. NGF-면역화된 마우스로부터의 혈장 희석액을 각 웰에 가하여 주위 온도에서 1 내지 2시간 동안 배양시켰다. 상기 플레이트를 PBS/Tween으로 세척한 다음 서양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP)에 접합된 염소 항-인간 IgG Fc-특이적 폴리클로날 시약과 함께 1시간 동안 실온에서 배양시켰다. 상기 플레이트를 PBS/Tween으로 세척하고 서양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP)에 접합된 염소 항-인간 IgG Fc-특이적 폴리클로날 시약과 함께 1시간 동안 실온에서 배양시켰다. 세척 후, 상기 플레이트를 ABTS 기질 (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, Catalog No. A-1888, 0.22 ㎎/㎖)로 현상시키고 415 내지 495 nm의 파장에서 광학밀도(OD)를 측정함으로써 분광광도법으로 분석하였다. 충분한 역가의 항-NGF 인간 면역글로불린을 갖는 마우스를 사용하여 하기한 바와 같이 모노클로날 항체를 생산하였다.
NGF에 대한 인간 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마의 생성
희생시키기 2일전 정맥내로 항원을 사용하여 부스팅함으로써 모노클로날 항체 생산용 마우스를 준비하였고, 이후 비장을 제거하였다. 마우스의 비장세포를 HuMab 마우스로부터 단리시켜 표준 프로토콜을 사용하여 마우스 골수종 세포주에 PEG를 사용하여 융합시켰다. 전형적으로, 각 항원에 대해 10 내지 20회의 융합을 수행하였다.
간략하면, 면역화된 마우스로부터 비장 림프구의 단일 세포 현탁액을 1/4 수의 P3X63-Ag8.653 비분비 마우스 골수종 세포(ATCC, Accession No. CRL 1580)에 50％ PEG (Sigma)를 사용하여 융합시켰다. 세포를 평판 바닥 미세역가 플레이트에 대략 1x105/웰로 플레이팅시킨 다음, 10％ 우태아 혈청, 10％ P388D1-(ATCC, Accession No. CRL TIB-63) 조건화 배지, DMEM (Mediatech, Catalog No. CRL 10013, 높은 글루코즈, L-글루타민 및 나트륨 피루베이트 함유) + 5 mM HEPES 중의 3-5％ 오리젠 (IGEN), 0.055 mM 2-머캅토에탄올, 50 ㎎/㎖ 겐타마이신 및 1x HAT (Sigma, Catalog No. CRL P-7185)를 함유하는 선택적 배지에서 약 2주간 배양시켰다. 1 내지 2주 후, HAT가 HT로 대체된 배지중에서 세포를 배양시켰다.
생성된 하이브리도마를 항원-특이적 항체의 생산에 대해 스크리닝하였다. 각 웰을 인간 항-NGF 모노클로날 IgG 항체에 대해 ELISA(상기한 바와 같음)로 스크리닝하였다. 일단 광범위한 하이브리도마 성장을 일으킨 다음, 배지를 통상적으로 10 내지 15일 후 모니터링하였다. 항체 분비 하이브리도마를 다시 플레이팅시키고, 다시 스크리닝하여, 인간 IgG에 대해 여전히 양성이라면, 항-NGF 모노클로날 항체를 적어도 2회 제한 희석법으로 서브클로닝시켰다. 이후 안정한 서브클론을 시험관내에서 배양하여 특성화용 조직 배양 배지중에서 소량의 항체를 생성시켰다.
NGF에 결합하는 인간 모노클로날 항체의 선택
상기한 바와 같은 ELISA 검정법을 사용하여 NGF 면역원과의 양성 반응성을 나타냈던 하이브리도마에 대해 스크리닝하였다. 높은 결합활성으로 NGF에 결합하는 모노클로날 항체를 분비하는 하이브리도마를 서브클로닝하고 추가로 특성화하였다. 모세포의 반응성을 보유하였던(ELISA로 측정된 바와 같이), 각각의 하이브리도마로부터 클론 하나를 액체 질소 중에 보관된 5-10 바이알 세포 은행을 제조하기 위해 선택하였다.
이소타입-특이적 ELISA를 수행하여 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산되는 모노클로날 항체의 이소타입을 결정하였다. 이들 실험에서는, 미세역가 플레이트를 50 ㎕/웰의 PBS 중의 마우스 항-인간 카파 경쇄의 1 ㎍/㎖ 용액으로 코팅시켜 4 ℃에서 밤새 배양시켰다. 5％ 닭 혈청으로 차단시킨 후, 상기 플레이트를 각각의 시험된 모노클로날 항체로부터의 상등액 및 정제된 이소타입 대조군과 반응시켰다. 상기 플레이트를 주위 온도에서 1 내지 2시간 동안 배양시켰다. 이후 웰을 여러가지 인간 IgG-특이적 서양고추냉이 퍼옥시다제-접합된 염소 항-인간 폴리클로날 항혈청과 반응시키고 플레이트를 상기한 바와 같이 현상하여 분석하였다.
ELISA에 의해 검출된 바와 같이 NGF에 대해 유효한 결합을 나타냈던 하이브리도마 상등액으로부터 정제된 모노클로날 항체는 하기한 바와 같은 다양한 생물학적 검정을 사용하여 생물학적 활성에 대해 추가로 시험하였다.
[실시예 3]
강력한 NGF 중화 활성을 갖는 항-NGF 항체의 선택 및 클로닝
NGF 활성의 억제제 (즉, NGF "중화")로서 실시예 2에서 초기에 확인된 항체의 효과를, 바닐로이드 수용체-1 (VR1) 발현의 NGF 유도를 차단하는 각각의 변형된 펩티드의 능력을 측정함으로써 평가하였다.
배근신경절 신경 배양(Dorsal Root Ganglion Neuronal Cultures)
배근신경절(DRG)을 무균 조건하에서 종국에는 마취된 Sprague-Dawley 래트 (Sprague-Dawley rats; Charles River, Wilmington, MA)인, 래트의 시한적-임신한(timed-pregnant) 자궁으로부터 외과적으로 제거한 배아 19일령(E19) 래트의 모든 척수 절편으로부터 하나씩 절제하였다. DRG는 5％ 열 불활성화된 말 혈청(GibcoBRL)을 함유하는 빙냉 L-15 배지 (GibcoBRL, Grand Island, NY)에 수집하여, 느슨한 연결 조직과 혈관을 제거하였다. 상기 DRG를 Ca2+- 및 Mg2+-유리(free) Dulbecco's 인산염 완충된 염수(DPBS), pH 7.4 (GibcoBRL)에서 2회 세정하였다. 이어서 상기 DRG를 파파인 분리 시스템 (Worthington Biochemical Corp., Freehold, NJ)을 사용하여 단일 세포 현탁액으로 분리시켰다. 간략하면, DRG를 Earle's 균형된 염 용액 (EBSS) 중 20 U/㎖의 파파인을 함유하는 분해 용액중에 37 ℃에서 50분간 배양시켰다. 불로 끝마무리한(fire-polished) 파스퇴르 피펫을 통한 적정에 의해 MEM/Ham's F12, 1:1, 1 ㎎/㎖ 오보뮤코이드(ovomucoid) 억제제 및 1 ㎎/㎖ 오브알부민, 및 0.005％ 데옥시리보뉴클레아제 I (DNase)로 이루어진 분리 배지에서 세포를 분리시켰다.
상기 분리된 세포를 200 x g에서 5분간 펠릿화한 다음 1 ㎎/㎖ 오보뮤코이드 억제제, 1 ㎎/㎖ 오브알부민, 및 0.005％ DNase를 함유하는 EBSS에 다시 현탁시켰다. 세포 현탁액을 10 ㎎/㎖ 오보뮤코이드 억제제 및 10 ㎎/㎖ 오브알부민을 함유하는 구배 용액을 통하여 200 x g에서 6분간 원심분리시켜 세포 부스러기를 제거한 다음, 88-㎛ 나일론 메쉬 (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA)를 통하여 여과하여 덩어리(clumps)를 제거하였다. 혈구계수기를 사용하여 세포의 수를 측정하고, 세포를 폴리-오르니틴 100 ㎍/㎖ (Sigma, St. Louis, MO) 및 마우스 라미닌 1 ㎍/㎖ (GibcoBRL)-코팅된 96-웰 플레이트중으로 완전 배지 중에 10x103 세포/웰로 접종(seed)하였다. 상기 완전 배지는 최소 필수 배지(MEM) 및 Ham's F12, 1:1, 페니실린 (100 U/㎖), 스트렙토마이신 (100 ㎍/㎖), 및 10％ 열 불활성화된 말의 혈청(GibcoBRL)으로 이루어져 있었다. 상기 배양액을 37 ℃, 5％ CO2 및 100％ 습도로 유지하였다. 비-신경 세포의 성장을 조절하기 위하여, 5-플루오로-2'-데옥시우리딘 (75 μM) 및 우리딘 (180 μM)을 배지에 포함시켰다.
NGF 및 항-NGF로 처리
플레이팅시킨지 2시간 후, 세포를 재조합 인간 β-NGF (Amgen) 또는 재조합 래트 β-NGF (R＆D Systems, Minneapolis, MN)를 10 ng/㎖의 농도 (0.38 nM)로 처리하였다. 연쇄-희석된 항-NGF 항체 (R＆D Systems)를 포함하는 양성 대조군을 각각의 배양 플레이트에 적용하였다. 시험 항체는 3.16배 연쇄 희석법을 사용하여 10개의 농도로 가하였다. 모든 샘플은 배양물에 가하기 전에 완전 배지에 희석시켰다. 배양 시간은 VR1 발현 측정 전 40시간 이었다.
DRG 뉴런에서 VR1 발현의 측정
배양물을 Hank's 균형된 염 용액 중에 4％ 파라포름알데히드로 15분간 고정시키고, Superblock (Pierce, Rockford, IL)으로 차단시켜, Tris-HCl (Sigma)-완충된 염수(TBS)중에서 0.25％ Nonidet P-40 (Sigma)으로 실온에서 1시간 동안 투과시켰다. 배양물을 0.1％ Tween 20 (Sigma)을 함유하는 TBS로 1회 세정하고 토끼 항-VR1 IgG와 함께 실온에서 1시간 30분간 배양시킨 다음, Eu-표지된 항-토끼 제2 항체 (Wallac Oy, Turku, Finland)와 함께 1시간 동안 실온에서 배양시켰다. 각 항체 배양 후 TBS를 사용한 세척(완만하게 진탕시키면서 5분간 3회)을 적용시켰다. 증강 용액 (150 ㎕/웰, Wallac Oy)을 상기 배양물에 가하였다. 이어서 시간-분해 형광계(Wallac Oy)로 형광 시그날을 측정하였다. 변형된 펩티드로 처리된 샘플중에서의 VR1 발현은 0-1000 ng/㎖로부터의 NGF 적정 표준 곡선과 비교함으로써 측정하였다. DRG 뉴런에서의 VR1 발현에 대한 NGF 효과의 억제율(최대 가능한 억제와 비교하여)은 NGF-처리되지 않은 대조군과 비교함으로써 측정하였다. 결과를 표 2와 5에 제시한다.
상기 세포주를 ＃110-＃129 표지시킨다. 세포주 ＃119, ＃124, 및 ＃125로부터의 항체는 지극히 강력한 NGF 중화 활성이 있는 것으로 증명되었다(도 1). ＃124 세포주는 모세포주였으며, 4D4로도 언급된다. ＃119 및 ＃125 세포주는 4D4 모체의 서브클론이었다. 하이브리도마 ＃124(4D4)를 포함하는 원래의 바이알로부터의 추가 샘플을 성장시켜 ＃167 (4D4)로 표지시켰다.
하이브리도마 ＃167 (4D4)에 의해 생성된 항체를 전술한 샘플에서와 같이 동일한 DRG 뉴런 기저 NGF 중화 검정하였다. 항체 ＃167 (4D4)는 IC50이 0.50 nM인 강력한 항-NGF 활성을 갖는 것으로 증명되었으며 (도 2), 이는 샘플 ＃119, ＃124, 및 ＃125의 활성과 일치하였다. 4개의 샘플의 활성을 표 2에 나타낸다.
Figure pct00002
N-말단 서열화 및 질량 분석(N-Terminal Sequencing and Mass Spectrometry)
정제된 항-NGF 하이브리도마 항체 샘플을 단백질 서열화 및 LC/MS 분석을 위해 준비하였다. Amicon centriprep-30을 사용하여 부피가 15 ㎖ 미만이 될 때까지 배지를 농축시켜 조건화 배지로부터 항체를 정제하였다. rProA (Pharmacia) 수지의 배치를 PBS로 4회 세척하고 마지막 세척후 PBS 중 50％ 슬러리로 제조하였다. 적절한 양의 rProA 수지 (대략 5 ug 항체/수지 ㎕이지만 수지 50 ㎕ 이상을 사용)를 상기 항체 샘플에 가하여 4 ℃에서 밤새 배양시켰다. Ab-수지 혼합물을 원심분리시키고 미결합 분획을 수집하였다. 0.5 ㎖ PBS를 첨가하고 0.45 ㎛ Spin-X (CoStar) 튜브로 옮긴 후 샘플을 10000 rpm에서 3분간 원심분리시켰다. 다음, 상기 수지를 0.5 ㎖ PBS로 적어도 3회 세척하고 이어서 0.1 M 글리신 (pH 2.7)을 수지의 1.5배 부피로 가하여 10분간 실온에서 배양시킨 다음 다시 3분간 10000 rpm으로 원심분리시켜 상등액을 수집하였다. 상기 용출 단계를 2회 이상 반복한 다음 결합된 상등액을 1.0M Tris (pH 9.2) 1/25의 부피을 사용하여 중화시켰다.
새로운 Spin-x 튜브 (0.2 ㎛)를 통한 최종 여과 단계 후, 표준물로서 인간 IgG를 사용한 표준 Bradford 검정법 또는 대안으로 더 큰 샘플의 경우 280에서의 흡광도를 사용하여 항체를 정량화하였다. 2 ㎍의 각 샘플과 함께 2 ㎍의 인간 IgG1,k (Sigma)를 사용하여 겔을 또한 수행하였다. 질량 분석을 위하여, 4 ㎍의 샘플을 탈글리코실화시켜, 환원시키고, Finingan LCQ 질량 분광계에 온-라인 연결되어 있는 HPLC (HP1090)상에 로드하였다. 역상 HPLC에 의해 경쇄를 중쇄와 분리시켰다. 경쇄와 중쇄를 또한 N-말단 단백질 서열화 분석을 위하여 수집하였다.
항-NGF ＃167 (4D4) 항체 샘플의 경쇄 및 중쇄 둘 다의 N-말단 서열은 항-NGF ＃119 (4D4) 항체 샘플의 N-말단 서열 둘 다와 매치되었다. 또한, 상기 항체의 측정된 질량은 ＃167 및 ＃119 하이브리도마로부터 분리된 항체가 동일함을 나타냈다. 상기 측정된, 항-NGF ＃167의 경쇄의 디콘볼루트된(deconvoluted) 질량 (23096)은 항 NGF Ab＃119의 경쇄의 측정된 질량 (23096)과 매치되었다.
항-NGF 항체 중쇄 및 경쇄의 클로닝(Cloning the anti-NGF Antibody Heavy and Light Chains)
가장 강력한 NGF 결합 모노클로날 항체인 4D4.D7을 발현시키는 하이브리도마를 공급원으로 사용하고 TRIzol®시약 (Invitrogen)을 사용하여 전체 RNA를 분리시켰다. 제1 가닥 cDNA는 확장 어댑터 (5'-C CGG ATA GGC CTC CAN NNN NNT-3') (SEQ ID NO: 33)를 갖는 랜덤 프라이머를 사용하여 합성하였고 5' RACE (cDNA 말단의 신속한 증폭) 예비 검정을 제조업자로부터의 지침에 따라서 GeneRacer™ 키트 (Invitrogen)를 사용하여 수행하였다. cDNA를 암호화하는 완전한 경쇄의 제조의 경우, 정방향 프라이머 (forward primer)는 GeneRacer™ 내포(nested) 프라이머였으며, 역방향 프라이머 (reverse primer)는 5'-GGG GTC AGG CTG GAA CTG AGG-3' (SEQ ID NO: 34)였다. 중쇄의 가변 영역을 암호화하는 cDNA 제조의 경우, 정방향 프라이머는 GeneRacer™ 내포 프라이머였으며, 역방향 프라이머는 5'-TGA GGA CGC TGA CCA CAC G-3' (SEQ ID NO 35)였다. RACE 생성물을 pCR4-TOPO (Invitrogen)내로 클로닝시키고 서열을 결정하였다. 컨센서스 서열을 사용하여 전장 항체 쇄 PCR 증폭용 프라이머를 디자인하였다.
항-NGF 4D4.D7 카파 경쇄를 암호화하는 cDNA 제조의 경우, 5' PCR 프라이머는 시그날 서열의 아미노 말단, XbaI 제한 효소 부위, 및 최적화된 코작 서열 (5'-CAG CAG AAG CTT CTA GAC CAC CAT GGA CAT GAG GGT GCC CGC TCA GCT CCT GGG-3'; SEQ ID NO: 36)을 암호화하였다. 3' 프라이머는 카복실 말단과 종결 코돈, 뿐만 아니라 SalI 제한 부위 (5'-CTT GTC GAC TCA ACA CTC TCC CCT GTT GAA GCT C-3'; SEQ ID NO: 37)를 암호화하였다. 상기 생성된 PCR 생성물 단편을 정제하고, XbaI 및 SaII로 분해한 다음, 겔 분리시켜 포유동물의 발현 벡터 pDSRα20 내로 결합시켰다 (국제출원 공보 제WO 90/14363호 참조, 이는 참고 목적으로 본 명세서에 포함된다). pDSRα20은 pDSRα19 에서 뉴클레오티드 2563의 "구아노신"을 "아데노신"으로 위치 지정 돌연변이유발에 의해 변형시켜 생산하였다. 상기 pDSRα19는 하기의 구조를 갖는 pDSRα2를 다음의 방법으로 변형시켜 제조한 것이다: FSH 폴리A 를 NdeI 부위의 말단에서 885 염기쌍까지 대략 1400 염기쌍만큼 짧게 하였으며; 디하이드로폴레이트 환원효소(DHFR) 프로모터는 5' 말단으로부터 대략 1 킬로베이스의 길이만큼 짧게 하여 209 염기쌍을 함유하고; DHFR 폴리A 서열로부터 대략 550 염기쌍 BglⅡ 단편을 결실시켰다.
Figure pct00003
항-NGF 4D4.D7 중쇄를 암호화하는 cDNA의 제조의 경우 5' PCR 프라이머는 시그날 서열의 아미노 말단, XbaI 제한 효소 부위, 및 최적화된 코작 서열 (5'-CAG CAG AAG CTT CTA GAC CAC CAT GGA GTT GGG GCT GTG CTG GGT TTT CCT TGT T-3'; SEQ ID NO: 38)을 암호화하였다. 3' 프라이머는 카복실 말단과 종결 코돈, 뿐만 아니라 SalI 제한 부위 (5'-GCA TGT CGA CTC ATT TAC CCG GAG ACA GGG AGA G-3'; SEQ ID NO: 39)를 암호화하였다. 생성된 생성물을 정제하고, XbaI 및 SaII로 분해시킨 다음, 겔 분리시켜 pDSRα20 벡터 내로 결합시켰다.
뉴클레오티드 서열을 예측된 아미노산으로 해독하고 상기 아미노산의 분자량과 함께 추가하여 측정된 항-NGF Ab 4D4 클론의 경쇄 DNA 서열의 계산된 질량(23099)은 질량 분석에 의해 측정한 바와 같이 측정된 질량(measured mass)과 매치되었다. 상기 측정된, 항-NGF Ab ＃167의 중쇄의 디콘볼루트된 질량(49479)은 항 NGF Ab ＃119의 중쇄의 측정된 질량(49484)과 매치되었으며 또한 기계적 편차내에서 항-NGF Ab 4D4 클론의 중쇄의 DNA 서열(표 3)의 이론적 질량(49484)과 매치되었다.
N-말단 단백질 서열과 LC/MS의 데이타는 상기 하이브리도마 ＃119가 하이브리도마 ＃167과 동일한 항체를 발현시킴을 확인시켜주었다. 또한, 서열을 기초로한 항체의 계산된 질량은 관측 결과를 추가로 확인시켜주었다.
Figure pct00004
[실시예 4]
차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포에서의 항-NGF 항체의 발현
4D4-중쇄/pDSRα19 IgG2 또는 4D4-중쇄/pDSRα19 IgG1과 NGF-카파/pDSRα19 플라스미드를 디하이드로폴레이트 환원효소 결핍 (DHFR-) 혈청-유리 개조된 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포(ATCC 제CRL-9096호) 중으로 인산칼슘법을 사용하여 동시에 형질감염시켜 4D4 항-NGF mAb의 안정한 발현을 성취하였다. DHFR 효소를 발현하는 세포의 성장을 확인하기 위해 형질감염된 세포는 투석된 혈청을 함유하지만 하이포크산틴-티미딘을 함유하지 않는 배지에서 선택되었다. ELISA와 같은 검정법을 사용하여 형질감염된 클론을 스크리닝하여 조건화 배지에서 4D4 항-NGF mAb의 발현을 검출하였다. 최대 발현 클론은 DHFR 증폭을 위하여 메토트렉세이트(MTX)의 농도를 증가시켰다. 조건화 배지에서 4D4 항-NGF mAb의 더 높은 발현을 검출하기 위해 MTX 증폭된 클론을 ELISA와 같은 검정법을 사용하여 스크리닝하였다. 최대 발현 클론은 균질한 집단을 수득하고 세포 은행의 생성하기 위해 서브클로닝시켰다.
본 발명의 재조합 항-NGF 항체는 항-NGF 모노클로날 항체에 대해 상기한 바와 동일한 프로토콜을 사용하여 DHFR이 결핍된 차이니즈 햄스터 난소 세포에서 생성시킬 수 있다. 본 발명의 각각의 항-NGF 항체의 완전한 중쇄 또는 경쇄를 암호화하는 DNA 서열을 발현 벡터 내로 클로닝시킨다. CHOd-세포를 완전한 중쇄를 발현시킬 수 있는 발현 벡터와 적절한 항-NGF 항체의 완전한 경쇄를 발현시키는 발현 벡터로 동시에 형질감염시킨다. 예를 들어, 항-NGF 항체를 생성하기 위해, 세포를 SEQ ID NO:40에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 완전한 중쇄를 발현시킬 수 있는 벡터와 SEQ ID NO:44에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 완전한 경쇄를 발현시킬 수 있는 벡터로 동시에 형질감염시킨다. 표 4에는 다양한 IgG 중쇄 불변 영역을 갖는 4D4 항체에 대한 완전한 중쇄 및 완전 경쇄가 요약되어 있다.
Figure pct00005
[실시예 5]
항-NGF 4D4 항체의 활성 특성화
스피너(S) 또는 롤러(R) 조건 하에서 성장시킨 세포에서 생성된, 일시적으로 발현된 항-NGF 4D4 항체를 시험하여 상기한 (실시예 3) 바와 같이 수행된, DRG 뉴런 기저 NGF 중화 생물학적 검정으로 NGF를 중화시키는 이들의 능력을 확인하였다.
NGF 항체는 혈청-유리 현탁액 개조된 293T 세포(ATCC 제CRL-1573호)에서 일시적으로 발현되었다. 500 mL 또는 1 L 배양액으로 형질감염을 수행하였다. 간략하면, 세포 접종원 (5.0 X 105 세포/mL X 배양액 부피)을 2,500 rpm에서 10분간 4 ℃에서 원심분리시켜 조건화 배지를 제거하였다. 세포를 혈청-유리 DMEM에 재현탁시켜 2,500 rpm에서 10분간 4 ℃에서 다시 원심분리시켰다. 세척액을 흡인시킨 후, 세포를 1L 또는 3L 스피너 플라스크 배양으로 성장 배지 [DMEM/F12 (3:1) + 1X 인슐린-트랜스페린-셀레늄 보충물 + 1X Pen Strep Glut + 2mM L-글루타민 + 20 mM HEPES + 0.01％ Pluronic F68]에 재현탁시켰다. 상기 스피너 플라스크 배양을 자기 교반 플레이트상에서 125 RPM으로 유지시키는데, 이는 37 ℃ 및 5％ CO2에서 유지되는 습화된 배양기에 배치하였다. 플라스미드 DNA를 50 mL 원뿔형 튜브에서 형질감염 시약에 복합체화시켰다. 상기 DNA-형질감염 시약 복합체는 혈청-유리 DMEM에서 최종 배양 부피의 5％로 제조하였다. 1 ㎍ 플라스미드 DNA/mL 배양액을 먼저 혈청-유리 DMEM에 가한 다음, 1 ㎕ X-TremeGene RO-1539/mL 배양액을 가하였다. 상기 복합체를 실온에서 대략 30분간 배양시킨 다음 상기 스피너 플라스크의 세포에 가하였다. 형질감염/발현을 7일간 수행한 후, 조건화 배지를 4,000 RPM에서 60분간 4 ℃에서 원심분리시켜 채취하였다.
회전병 일시적 형질감염의 경우, 본 발명자들은 5％ FBS + 1X 비-필수 아미노산 + 1X Pen Strep Glut + 1X 나트륨 피루베이트가 보충된 DMEM에서 성장시키고 유지시킨 293T 부착 세포(ATCC 제CRL-11268호)를 사용하였다. 대략, 4-5 X 107 293T 세포를 850 ㎠ 회전병에 밤새 접종하였다. 이어서 미리 접종된 세포를 다음날 FuGene6 형질감염 시약을 사용하여 형질감염시켰다. 상기 DNA-형질감염 시약 혼합물은 대략 6.75 mL 혈청-유리 DMEM에서 제조하였다. 675 ㎕의 FuGene6 형질감염 시약을 먼저 가한 다음, 112.5 ㎍의 플라스미드 DNA를 가하였다. 상기 복합체를 실온에서 30분간 배양시켰다. 이어서 전체 혼합물을 회전병에 가하였다. 회전병을 5％ CO2 가스 혼합물로 가스화시키고, 단단하게 캡핑시킨 다음 0.35 RPM으로 회전하는 롤러 랙(roller rack)상의 37 ℃ 배양기에 넣었다. 형질감염을 24시간 동안 수행한 후 배지를 100 mL의 DMEM + 1X 인슐린-트랜스페린-셀레늄 보충물 + 1X Pen Strep Glu + 1X 비-필수 아미노산 + 1X 나트륨 피루베이트로 교체하였다. 전형적으로, 2개의 100 mL 48시간 채취물을 각각의 회전병으로부터 수득하였다. 채취된 혈청-유리 조건화 배지를 함께 모아 4,000 RPM에서 30분간 4 ℃에서 원심분리시켰다.
4D4.IgG1 및 4D4.IgG2 둘 다 인간 NGF에 대해 약 0.14 nM 내지 약 0.2 nM의 IC50 값을 갖는 강력한 활성을 나타냈다 (도 2). 활성 검정 결과가 표 5에 요약되어 있다. 상기 항체는 래트 NGF에 대해서는 활성을 거의 나타내지 않았다 (도 3). 상기 결과는 상기한 바와 같은 하이브리도마로부터 직접 시험한 항체의 활성과 유사하다.
Figure pct00006
[실시예 6]
항-NGF 항체의 생산
CHO 세포(ECACC 제85050302호)의 클로날 세포주에서 발현시켜 항-NGF 항체를 생산한다. 각 생산 공정의 경우, 단일 바이알로부터의 세포를 혈청-유리 세포 배양 배지 내로 해동시킨다. 상기 세포를 초기에는 T-플라스크에서 성장시킨 다음, 이어서 스피너 플라스크로에서 성장시키고 이어서 2000L 생체반응기로 규모를 증가시킨 스테인레스 스틸 반응기에서 성장시킨다. 생산은 공급식 배치 배양액을 사용하여 2000L 생체반응기에서 생산을 수행하는데, 상기 배양액에는 농축된 배지 성분을 함유하는 영양소 공급물이 첨가되어 세포 성장과 배양 생존성을 유지시킨다. 생산은 대략 2주간 지속하는데 이때 항-NGF 항체가 상기 세포에 의해 본질적으로 생산되어 세포 배양 배지 내로 분비된다.
생산 반응기는 설정된 pH, 온도, 및 용해된 산소 농도에서 조절되며; pH는 이산화탄소 가스와 탄산나트륨 첨가에 의해 조절되고; 용해된 산소는 공기, 질소, 및 산소 가스 유동에 의해 조절된다.
생산 말기에, 세포 액체배지(cell broth)를 디스크 스택 원심분리기에 공급하여 배양 상등액을 세포로부터 분리시킨다. 상기 농축물을 심부 필터(depth filter), 이어서 0.2 ㎛ 필터를 통하여 추가로 청정화시킨다. 상기 청정화된 배지를 15 내지 30배 농축시킨다. 이어서 생성된 농축된 조건화 배지를 정제를 통하여 가공하거나 훗날 정제를 위하여 동결시킨다.
[실시예 7]
다른 뉴로트로핀과의 교차-반응성
4D4 항체를 이들의 인간 NT3 또는 인간 BDNF에 대한 교차-반응성에 대해, 인간 NT3에 대한 DRG 뉴런 생존 검정법 및 인간 BDNF에 대한 배양된 DA 뉴런에서의 DA 흡수의 검정법을 포함한, 다른 생물학적 검정으로 시험하였다.
DRG 배양액을 NT3, 항-NT3 및 항-NGF 항체로 처리
플레이팅시킨지 2시간 후, DRG 세포 (상기 실시예 3에서 기재된 분리 방법)를 재조합 hNT-3(제PHC7036호) 100 ng/㎖ (3.8 nM)로 처리하였다. 연쇄-희석된 항-hNT3 항체 (R＆D)를 양성 대조군으로 사용하였다. 미지의 물질 (항-NGF Ab 샘플)을 다양한 농도로 10개의 포인트, 3.16 배 연쇄 희석액으로 가하였다. 모든 샘플은 배양액에 첨가되기 전에 완전 배지에 희석시켰다.
DRG 뉴런에서의 MAP2 발현의 측정
배양물을 Hank's 균형된 염 용역 중에 4％ 파라포름알데히드로 15분간 고정시키고, Superblock (Pierce)으로 1시간 동안 차단시킨 다음 Tris-HCl (Sigma)-완충된 염수 (TBS)중에서 0.25％ Nonidet P-40 (Sigma)으로 1시간 동안 실온(RT)에서 침투시킨다. 배양물을 0.1％ Tween20 (Sigma)을 함유하는 TBS로 1회 세정하고 마우스 항-MAP2 IgG (Chemicon, Temecula, CA)와 함께 1.5시간 동안 실온에서 배양시킨 다음, Eu-표지된 항-마우스 제2 항체 (Wallac Oy, Turku, Finland)와 함께 1시간 동안 실온에서 배양시켰다. TBS를 사용한 세척 (부드럽게 진탕시키며 5분간 3회)을 각각의 항체 배양 후 적용시켰다. 증강 용액 (150 ml/웰, Wallac Oy)을 상기 배양물에 가한 다음 형광 시그날을 시간-분해 형광계 (Wallac Oy)에서 측정하였다.
배아 중뇌 배양(Embryonic Mesencephalic Culture)
19일령의 배아(E19) Sprague-Dawley 래트 (Jackson Labs)를 사용하였다. 도파민작동성 뉴런에 대해 강화시킨 배쪽의 중뇌 조직(ventral midbrain tissue)을 제거하여 Ca++ 및 Mg++가 없는, pH 7.4인 냉각, Dulbecco's 인산염 완충 염수 (DPBS; Gibco)로 옮겼다. 상기 조직 단편을 파파인 분리 시스템 (Worthington Biochemical Corp., Freehold, NJ)을 사용하여 단일 세포 현탁액으로 분리시켰다. 간략하면, 조직 단편을 Earle's 균형된 염 용액 (EBSS) 중의 20 단위/㎖ 파파인을 함유하는 분해액에서 37 ℃로 50분간 배양시켰다. 불로 끝마무리한 파스퇴르 피펫을 통한 적정에 의해 MEM/Ham's F12, 1:1, 1 ㎎/㎖ 오보뮤코이드(ovomucoid) 억제제 및 1 ㎎/㎖ 오브알부민, 및 0.005％ 데옥시리보뉴클레아제 I (DNase)로 이루어진 분리 배지에서 세포를 분리시켰다. 상기 분리된 세포를 200 x g에서 5분간 펠릿화한 다음 1 ㎎/㎖ 오보뮤코이드 억제제, 1 ㎎/㎖ 오브알부민, 및 0.005％ DNase를 함유하는 EBSS에 다시 현탁시켰다. 세포 현탁액을 10 ㎎/㎖ 오보뮤코이드 억제제 및 10 ㎎/㎖ 오브알부민을 함유하는 구배 용액을 통하여 200 x g에서 6분간 원심분리시켜 세포 부스러기를 제거한 다음, 25 ㎍ Nitex 나일론 메쉬 (Tetko, Inc.)를 통하여 여과하여 덩어리를 제거하였다. 분리된 세포를 조직 배양 플레이트에 100,000/㎠의 밀도로 플레이팅시켰다. 상기 플레이트는 폴리-오르니틴 100 ㎍/㎖ (Sigma) 및 마우스 라미닌 1 ㎍/㎖ (Gibco BRL)로 전술한 바와 같이 (Louis JC 등의 J. Pharmacol. Exp. Ther. 1992; 262:1274-1283) 미리-코팅시켰다. 상기 배양 배지는 최소 필수 배지 (MEM)/Ham's F12, 1:1, 12％ 말의 혈청 (Gibco), 100 ㎍/㎖ 트랜스페린 및 2.5 ㎍/㎖ 인슐린(Sigma)으로 이루어져 있다. 상기 배양물은 37 ℃, 5％ CO2 및 100％ 습도에서 6일간 유지하였다.
BDNF 및 항-BDNF 또는 항-NGF로 중뇌 배양물을 처리
플레이팅시킨지 2시간 후 10 ng/㎖의 BDNF(ATCC 제MGC-34632호)를 상기 세포에 가한 다음, 항-NGF Ab 샘플을 연쇄 농축시킨다. 항-BDNF 항체 (Amgen에서 생산한 것)를 양성 대조군으로 사용하였다.
중뇌 뉴런에서 DA 흡수(DA Uptake in Mesencephalic Neurons)
도파민 흡수 검정법을 전술한 바와 같이 수행하였다 (Friedman, L. and Mytilineou, C., Neuroscience Letters 1987; 79:65-72). 6일째에, 배양물을 5.6 mM 글루코즈, 1.3 mM EDTA 및 0.5 mM 파르길린, 모노아민 옥시다제 억제제를 함유하는, 미리-가온시킨 Krebs-Ringer's 인산염 완충액 (pH 7.4)으로 일단 세척하였다. 상기 배양물을 50 nM [3H]DA (NEN)을 함유하는 흡수 완충액중에서 60분간 37 ℃에서 배양하였다. 흡수 완충액을 제거함으로써 흡수를 중단시키고, 배양물을 Krebs-Ringer's 인산염 완충액으로 3회 세척하였다. 액체 섬광 칵테일, 옵틱파제 슈퍼믹스(opticphase supermix) (Wallac)를 상기 배양물에 직접 첨가함으로써 세포를 용해시켜 [3H]DA를 방출시켰다. 이어서 상기 세포 용해물을 마이크로베타-플러스 액체 섬광 계수기 (Wallac, Inc.)에서 방사성에 대해 계수하였다. 친화성이 낮은 DA 흡수는 친화성이 높은 DA 흡수 부위의 특이적 억제제인 0.5 mM GBR12909 (Heikkila RE and Mazino L, European Journal of Pharmacology 1984; 103:241-8)을 상기 흡수 완충액에 가하여 평가하고, 상기 총 흡수량으로부터 수득한 고친화성 DA 흡수치로 뺐다.
Figure pct00007
[실시예 8]
항-NGF 항체에 대한 에피토프의 확인
제한된 단백질분해에 의한 에피토프 맵핑
5 마이크로그램 (㎍)의 NGF를 4D4 (11 ㎍)와 함께 30분간 4 ℃에 0.1M Tris 완충액, pH 7.5중에서 배양시켰다. 이어서 복합체를 프로테아제 (서브틸리신) 1 ㎍으로 37 ℃에서 1 및 2시간 동안 분해시켰다. HPLC 펩티드 맵을 서로 비교하여 4D4 항체에 의해 보호된 펩티드를 찾았다. NGF의 제한된 단백질분해는 수종의 주요 펩티드가 NGF로부터 초기에 방출되는 것으로 나타났다. 특히 흥미로운 것은 펩티드 S18.3, S18.5, 및 S34.4가 생성되었으며 상기 단백질분해로부터 항체에 의해 보호되었다. 다른 피크는 현저하게 형성되거나 보호되지 않았다. 2개의 실험 (1시간 및 2시간 분해)으로부터 보호된 펩티드를 표 7에 나타낸다.
Figure pct00008
보호 비율(％)은 펩티드 피크 높이로부터 계산하였다. S18.5는 2개의 펩티드를 함유하였지만, 280 nm 흡광도에서 검출된 바와 같이, 다른 펩티드 피크 (HWNSY; SEQ ID NO: 47)가 4D4 항체의 첨가에 의해 변화되지 않았기 때문에, 1개의 펩티드 (SSSHPIFHR; SEQ ID NO: 46)만이 4D4 항체로 보호되었다. 펩티드 S18.3은 둘다 동일한 루프 영역으로부터, S34.4의 C-말단 부분이었다. N-말단 및 중앙 루프 영역이 또한 가능한 에피토프였다.
분해된 펩티드의 마이크로콘 분리(Microcon Separation of Digested Peptides)
서브틸리신-분해 물질 (각각 3 ㎍)을 활성 4D4 항체 및 불활성 모노클로날 항체 (＃162)(8 ㎍)와 함께 30분간 4 ℃에 0.1M Tris 완충액, pH 7.5에서 배양시켰다. 결합/비결합 펩티드는 마이크로콘 10 (Millipore Corp., Bedford, Mass)으로 분리시키고 두 분획물 (결합 및 비결합)을 HPLC로 분석하여 항체에 결합된 펩티드를 발견하였다. 4D4 항체 및 ＃162로 처리하고 마이크로콘 분리시킨 후 비결합 분획의 HPLC 비교에 의해 확인된 2개의 열화된 피크가 회수되었는데, 이는 항체 결합된 펩티드를 나타낸다. 4D4 결합된 펩티드는 다음과 같다:
S1 (4.4) ----SRKAVRR (113-119) (SEQ ID NO: 49), C-말단; 및
S2 (28.3) ----EVMVL (35-39) (SEQ ID NO: 50), 루프 영역.
대안으로 NGF 샘플을 Lys-C (K)로 24시간 동안 분해시켰다. 시스테인 잔기를 환원시키고 변성제를 사용하지 않고 카르복시메틸화시켰다. 상기 샘플을 모노클로날 항체 4D4 및 AMG162와 함께 배양시킨 다음, 마이크로콘 100 분리시켰다. 결합 및 비결합 분획물을 역상 HPCL로 분석하였다. 2개의 펩티드만이 하기 나타낸 바와 같이 항체 결합 K-펩티드로서 확인되었다. 서열 분석 및 질량 분석에 의해 측정된 펩티드에 대해 계산된 질량은 일치하였다. 하기 나타낸 바와 같이, 펩티드를 N-말단 및 C-말단 영역으로 맵핑시켰다.
K1(37.6) ----SSSHPIFHRGEFSVCDSVSVWVGDK (SEQ ID NO: 51)
계산된 질량 = 2821; 관측된 질량 = 2828.2; N-말단
K2(39.5) ----QAAWRFIRIDTACVCVLSRK (SEQ ID NO: 52)
계산된 질량 = 2452; 관측된 질량 = 2459.5; C-말단
전술한 에피토프 맵핑 실험은 N-말단 (1-9), 내부 (46-57), 및 C-말단 (96-98) 영역을 포함하여, 적어도 3개의 영역이 4D4 항체에 대해 가능한 에피토프임을 나타냈다. 또한, AspN 분해로 ---SSHPIFHRGEFSVC--- (SEQ ID NO: 53)로 이루어진 펩티드 단편이 4D4 항체에 의해 보호되었음이 밝혀졌으며, 반면, 트립신 분해는 ---SSHPIFHR---- (SEQ ID NO: 54)로 이루어진 펩티드 단편은 D4 항체에 의해 보호되지 않았음을 나타냈다. 따라서, N-말단에서, GEFSVC (SEQ ID NO: 55)의 서열이 4D4 항체로의 결합에 있어서 가장 중요하다.
항-NGF 항체 4D4.IgG1에 대한 에피토프를 더욱 명확하게 정의하기 위하여, 전체 인간 성숙 NGF (hNGF) 서열을 기초로 하는 표준 기술을 사용하여 총 23개의 펩티드를 합성적으로 생성시켰다 (표 8). 상기 펩티드는 15개의 아미노산 길이로, 10개의 아미노산에 의해 중첩되며, C-말단에서 시스테인-마무리(cysteine-tailed)되어 매트릭스에 접합되도록 하였다. 상기한 인간 항-hNGF Ab 4D4.IgG1을 맵핑 실험용으로 사용하였다.
Figure pct00009
인간 NGF 펩티드 단편은 5％ DMSO, 1 mM EDTA, pH 6.23을 갖는 PBS로 희석한다. 최종 펩티드 농도는 55μM(약 100 ㎍/ml)과 동일한 몰 농도로 정규화한다. 펩티드는 실온에서 2시간에 이어서, 교반하에 4oC에서 밤새 Reacti-Bind 말레이미드 활성화된 96개 웰 미세역가 플레이트(Pierce Cat ＃ 15150)(100 ㎕/웰)에서 배양한다. 인간 NGF(100 ㎍/ml)가 양성 대조군로서 사용된다. 플레이트는 완충액(KPL)으로 세척하고, 0.2％ 무-지방 분유(PBS-EDTA 완충액에서, pH 6.23)로 실온에서 2시간 동안 차단한 다음, 1시간 동안 5％ BSA로 추가로 차단한다. 그 다음에, 플레이트는 다양한 농도(0, 3, 10, 30 ㎍/ml)의 인간 항-NGF 항체에 이어서, 염소 항-hFc Ab-HRP(KPL)와 2시간 동안 배양시킨다. 시그널은 TMB 기질로 현상하고, 정지액(KPL)의 부가 후 450 ㎚에서 판독한다.
23개의 인간 NGF 펩티드에서, 4D4 결합을 나타내는 적어도 4개의 주요 피크가 관찰되었다. 이들 피크는 하기의 펩티드에 상응한다: 펩티드 ＃ 1 (SEQ ID NO: 56), SSSHPIFHRGEFSVC (1-15); 펩티드 ＃ 10 (SEQ ID NO: 65), NSVFKQYFFETKARD (46-60); 펩티드 ＃ 16 - 17 (SEQ ID NO: 71-SEQ ID NO: 72), WNSYATTTHTFVKAL--- (76-95); 및 펩티드 ＃ 18 - 21 (SEQ ID NO: 73 - SEQ ID NO: 76), TTTHT--- LSRKC (100-115).
4D4의 4개의 결합 피크는 Weismann 등의 문헌(1999, Nature 401:184-8)에 기재된 바와 같이 NGF에서 루프 L2 및 L4뿐만 아니라, N-말단, C-말단, 내부 도메인으로 맵핑한다. 이들 결과는 표 9에 요약되어 있다.
Figure pct00010
Wiesmann 등은 N-말단(잔기 2 내지 9)이 수용체 결합에 중요함을 나타내는, trkA 수용체에 결합된 huNGF의 결정 구조를 풀었다(Wiesmann 등의 1999, Nature 401:184-8). NGF에서 이 절편의 잔기는 또한 trkB 또는 trkC 수용체에 비하여 trkA에 대한 특이성에 있어서 중요하다. 항체 4D4는 필시 인간 NGF와 다른 뉴로트로핀 사이의 N-말단 차이 때문에, BDNF 및 NT-3뿐만 아니라, 마우스/래트 NGF에 비하여 인간 NGF에 대해 선택적이다.
항체 4D4는 뉴트로핀 사이의 평균 서열 다양성 보다 높은 7개의 뚜렷한 영역 중 2개를 나타내는, 각각 루프 L2 및 L4에 각각 상응하는 펩티드 ＃10 (SEQ ID NO: 65) (NSVFK---, 46-60) 및 펩티드 ＃17 (SEQ ID NO: 72) (TTTHTFVKALTMDGKC, 81-95)에 결합한다. 이들 7개 영역의 NGF 및 BDNF 사이의 스와핑 실험은 L2 및 L4가 NGF의 생물학적 활성에 있어서 중요함을 나타낸다. 더욱이, NGF의 그러한 영역을 갖는 루프 L2 및 L4에서 5개의 NT3 잔기의 치환은 NT3 활성을 유지하면서, NGF-유사 활성을 도입한다. 따라서, L2 및 L4는 항체 4D4가 BDNF 또는 NT-3에 보다는 오히려 NGF에 선택적으로 결합하는 영역일 것이다.
항체 4D4는 또한 NGF 결정 구조의 내부 도메인에 매칭되는, 펩티드 ＃16 (SEQ ID NO: 71) (WNSYATTTHTFVKAL, 76-90)에 결합한다. 이 영역은 인간 NGF 및 마우스 NGF 사이에 100％ 상동성이지만, 다른 뉴로트로핀과는 상이하다. 4D4는 인간 NGF에 대한 이의 활성과 비교시 래트/마우스 NGF에 대해 훨씬 더 약한 활성을 나타낸다. 따라서, NGF의 이 부분에 대한 결합은 대부분 종 특이성에 대해 중요하지 않지만, 뉴로트로핀 사이의 선택성에 있어서는 중요할 것이다.
항체 4D4는 또한 다른 뉴로트로핀(BDNF 및 NT3)과 NGF를 구분하는 인간 NGF의 영역 중 하나인, NGF의 C-말단 영역[펩티드 ＃ 19-21 (SEQ ID NO: 74 - SEQ ID NO: 76) TMDGK---LSRKC, 91-115]에 결합한다. 이 영역에 대한 결합은 4D4가 다른 뉴로트로핀에 대해 비활성인 이유를 설명하는 것을 돕는다. 더욱이, C-말단에서 인간 NGF 및 마우스 NGF 사이에 1개의 아미노산 차이가 존재하여, 이 단일 아미노산은 종의 차이가 관찰된 N-말단과 유사하게, 4D4가 래트/마우스 NGF에 비하여 인간 NGF에 대해 선택적인 이유 중 하나일 수 있음을 제시한다.
마지막으로, 4D4는 또한 인간 NGF의 펩티드 ＃10 (SEQ ID NO: 65) (---KARDC, 50-60)에 의해 기재된 내부 도메인과 상호작용하며, 이 영역은 trkB 또는 trkC 보다 오히려 trkA에 우선적으로 결합하는 NGF에 대한 중요 영역이고, 인간 NGF에 대한 이의 선택적 중화 활성을 추가로 설명한다.
[실시예 9]
KinExA에 의한 모노클로날 항체의 친화성 측정
huNGF(29714-91)에 대한 Ab 4D4(38859-80)의 결합은 KinExA 상에서 시험하였다. 간단히, Reacti-Gel 6x(Pierce)는 huNGF로 예비-코팅시키고, BSA로 차단한다. Ab 4D4 샘플 10 pM 및 30 pM을 huNGF-코팅된 비드를 통해 수행하기 전에 8시간 동안 실온에서 다양한 농도의 huNGF(Amgen)과 배양시킨다. 비드-결합된 항체의 양은 형광(Cy5) 표지된 염소 항-인간-IgG 항체(Jackson Immuno Research)에 의해 정량화한다. 결합 신호는 평형에서 유리 항체의 농도에 비례한다. 평형 해리상수(KD)는 이중-곡선 1-부위 상동성 결합 모델을 사용하여 경쟁 곡선의 비선형 회귀로부터 수득한다(KinExA™ software). KD는 huNGF에 결합하는 Ab 4D4에 대해 약 4 pM이다.
[실시예 10]
부가 항-NGF 항체의 확인
상기 실시예 2 및 3에 기재된 바와 같이 생성되고 확인된, 부가의 항-NGF 항체(14D10, 6G9, 7H2, 14F11 및 4G6으로 표시되는)가 추가 연구를 위해 선택되었다. 간단히, 조건화 배지가 결합 활성을 위해 시험된다. 배지로부터 항체를 정제하고 서열화한다. 예상되는 질량은 조건화 배지로부터의 항체의 질량 분석법 데이터와 비교한다. 항체를 클로닝한다. 클론 중 2개를 CHO 세포에서 발현시키고, 상기 기재된 바와 같이 활성에 대해 시험한다. 결과는 표 10에 제시되어 있다.
Figure pct00011
이어서, 이들 항체의 경쇄 및 중쇄 가변 영역의 서열은 서로에 대해뿐만 아니라, 4D4 항체 서열과 비교한다(도 5 및 6). 이들 비교로부터 확인된 중쇄 가변 영역의 상동성 비율은 표 11에 제시되어 있다. 경쇄 가변 영역의 상동성 비율은 표 12에 제시되어 있다. 또한, 다양한 항체의 CDR 영역의 상동성 비율은 도 5 내지 10에 제시되어 있다.
Figure pct00012
Figure pct00013
[실시예 11]
인간에서 피하 NGF 항체의 안전성 및 내성
이 연구의 목적은 골관절염(OA) 무릎 통증이 있는 개체에서 신경 성장 인자에 대한 항체(NGF 항체)의 다중 피하(SC) 투여량의 안전성 및 내성을 평가하고, OA 무릎 통증이 있는 개체에 대한 NGF 항체의 다중 SC 투여량의 투여 후 NGF 항체의 혈청 약물동태학(PK)을 검사하는 것이다. 다중 SC 투여량의 임상적 이점은 Western Ontario and McMaster Universities Arthritis Index [WOMACTM3.1]에 의해 평가한다.
OA 무릎 통증이 있는 개체에서 임상 I(phase I)의, 순차적 랜덤화된, 이중-블라인드 위약-조절된, 다중 투여량, 고선량 연구를 수행한다. 연구 디자인은 각 코호트(cohort)에 8명의 개체를 갖는 4개의 개체 코호트를 포함한다(n=32). NGF 항체의 3개의 투여량 수준(3㎎, 10㎎, 20㎎)을 사용한다. 이 연구에 사용된 NGF 항체는 제시된 방법과 유사하게 제조된 완전 인간 모노클로날 항체이다(완전 인간 모노클로날 항체는 상기 실시예 2 및 3 에 기재된 프로토콜을 사용하여 제조하였다).
효능 데이터의 가변성이 크고, 연구를 효능 측정의 통계학적 유의성을 평가하기 위해 작동시키지 않았음에도 불구하고, 통증-관련 치료 효과는 분명한 것으로 보여졌다. 평균 총 WOMAC 스코어, 평균 WOMAC 서브범주 스코어, 평균 환자 총괄 질병 평가 및 평균 의사 총괄 질병 평가는 투여 기간에 걸쳐 유지되는 효과를 갖는 치료 그룹에서 처음 투여 후 첫 시점에서 일반적인 개선 경향을 나타낸다. 이들 경향은 위약 그룹에서 명확한 것과 같지 않다. NGF 항체의 최종 투여량 후, 치료 효과는 시간에 따라 기준선으로 기운다.
OA 무릎 통증이 있는 개체에 단일 또는 다중 SC 투여량의 투여 후, NGF 항체 노출은 3 내지 20 ㎎의 투여량 범위에서 투여량에 대략 비례해서 증가되는 것으로 나타났다. 중간값 Tmax는 7.5 내지 11.5일의 범위이다. 이상 반응(AEs; Adverse events)은 치료 그룹에서는 10명의 개체(56％)에 대해 그리고 위약 그룹에서는 2명의 개체(33％)에 대해 치료-관련으로서 보고되었다. 어떠한 개체도 AEs로 인해 연구를 일찍 중단하지 않았다. 그러나, 등급 2 감각신경 AEs로 인하여, 프로토콜-특이적 중단 규칙은 코호트에서 5명의 개체(2명 위약, 3명 치료)가 연구중인 생성물의 네 번째 및 최종 용량을 투여받지 않도록 적용되었다. 감각신경 AEs은 용량-의존성인 것으로 나타났다.
36세와 63세 사이의 남성 및 여성 OA 개체에서, 항체 20 ㎎을 투여받은 6명의 개체 중 4명에 대해 보고된 있을 수 있는 투여량-의존성 감각신경 반응(경미 또는 보통의 중증정도)인 이상 반응(treatment-emergent)을 제외하고, 다중 SC 투여는 이 연구에서 투여되는 용량에서 잘 견디는 것으로 나타났다. NGF 항체 노출은 3 내지 20 ㎎의 투여량 범위에서 투여량에 대략 비례해서 증가되는 것으로 나타났다. 말기 상 반감기(t1/2, z)는 20.3 내지 26.4일의 범위이다.
상기 기재는 본 발명의 특정 양태를 강조하는 것이고, 이에 대등한 모든 변형 또는 대안은 특허청구범위에 제시된 바와 같이 본 발명의 취지 및 범위 내에 속함을 이해해야 한다.

Claims (25)

  1. 약제학적 유효량의 NGF 항체를 경구, 정맥내, 복강내, 뇌내[실질내(intra-parenchymal)], 뇌혈관내(intracerebroventricular), 근육내, 안구내, 동맥내, 문맥내(intraportal), 병변내(intralesional) 또는 피하 경로에 의한 주사를 통해, 서방성 시스템에 의해, 또는 이식 장치에 의해 환자에게 투여함을 포함하는, 신경 성장 인자(NGF)의 증가된 발현 또는 NGF에 대한 증가된 감도에 의해 야기되는 질환을 치료하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 주사가 피하 주사임을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 2 항에 있어서, NGF 항체의 약제학적 유효량이 피하 주사 당 약 3 mg 내지 약 30㎎ 임을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 2 항에 있어서, 피하 주사가 다중 피하 주사를 포함함을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1 항에 있어서, 질환은 급성 통증, 치통, 외상으로부터의 통증, 수술통(surgical pain), 절단 또는 농양으로부터 생성된 통증, 작열통, 탈수초성 질병, 삼차 신경통, 암, 만성 알콜 중독, 뇌졸중, 시상통 증후군, 당뇨병, 후천성 면역결핍증("AIDS"), 독소, 화학요법, 일반적인 두통, 편두통, 군발성 두통, 혼합된-혈관 또는 비-혈관 증후군, 긴장성 두통, 일반적인 염증, 관절염, 류마티스성 질병, 루푸스, 골관절염, 섬유근통, 염증성 장 질환, 과민성 대장 증후군, 염증성 안 질환, 염증성 또는 불안정한 방광 장애, 건선, 염증성 성분에 의한 피부 통증, 일광화상, 심장염, 피부염, 근염, 신경염, 콜라겐 혈관 질병, 만성 염증성 질환, 염증성 통증 및 관련된 통각과민과 이질통, 신경병성 통증 및 관련된 통각과민 또는 이질통, 당뇨성 신경병성 통증, 교감신경성 지속 통증(sympathetically maintained pain), 구심로차단 증후군, 천식, 상피조직 손상 또는 기능장애, 단순포진, 호흡기, 비뇨생식, 위장 또는 혈관 영역에서의 내장 운동 장애, 상처, 화상, 알레르기성 피부 반응, 가려움(pruritis), 백반증, 일반적인 위장 장애, 대장염, 위궤양, 십이지장궤양, 혈관운동신경성 또는 알레르기 비염, 또는 기관지 장애, 월경곤란증, 소화불량, 위식도역류, 췌장염 또는 장기통(visceralgia)임을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 5 항에 있어서, 골관절염이 골관절염 무릎 통증임을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 6 항에 있어서, 주사가 피하 주사임을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 7 항에 있어서, NGF 항체의 약제학적 유효량이 피하 주사 당 약 3 mg 내지 약 30㎎임을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 1 항에 있어서, 약제학적으로 허용되는 담체, 및 SEQ ID NO: 44를 포함하는 경쇄와 SEQ ID NO: 40을 포함하는 중쇄를 포함하는 분리된 항체를 포함하는 약제학적 조성물을 투여함을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 9 항에 있어서, 항체의 중쇄 및 경쇄가 가요성 링커(flexible linker)에 의해 연결되어 단일쇄 항체를 형성함을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 1 항에 있어서, NGF 항체가 Fab' 항체임을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 1 항에 있어서, NGF 항체가 (Fab')2 항체임을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 1 항에 있어서, NGF 항체가 완전 인간임을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 1 항에 있어서, NGF 항체가 인간화됨을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 1 항에 있어서, NGF 항체가 NGF 신호화(signaling)를 억제함을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 1 항에 있어서, NGF 항체가 SEQ ID NO: 44를 포함하는 경쇄 및 SEQ ID NO: 40을 포함하는 중쇄를 포함하고, 항체의 중쇄 및 경쇄는 가요성 링커(flexible linker)에 의해 연결되어 단일쇄 항체를 형성함을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 16 항에 있어서, NGF 항체가 단일쇄 Fv 항체임을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 16 항에 있어서, NGF 항체가 Fab' 항체임을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 16 항에 있어서, NGF 항체가 (Fab')2 항체임을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 16 항에 있어서, NGF 항체가 완전 인간임을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 16 항에 있어서, NGF 항체가 인간화됨을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 16 항에 있어서, NGF 항체가 NGF 신호화(signaling)를 억제함을 특징으로 하는 방법.
  23. 제 16 항에 있어서, NGF 항체가 약 1 x 10-9 이하의 KD를 가지면서 인간 NGF 폴리펩티드로부터 해리되고, 약 1 x 10-8 이하의 IC50을 가지면서 표준 시험관 내 검정에서 인간 NGF 생체활성을 중화시킴을 특징으로 하는 방법.
  24. 제 16 항에 있어서, NGF 항체가 약 1 x 10-10 이하의 KD를 가지면서 인간 NGF 폴리펩티드로부터 해리되고, 약 1 x 10-9 이하의 IC50을 가지면서 표준 시험관 내 검정에서 인간 NGF 생체활성을 중화시킴을 특징으로 하는 방법.
  25. 제 16 항에 있어서, NGF 항체가 약 1 x 10-11 이하의 KD를 가지면서 인간 NGF 폴리펩티드로부터 해리되고, 약 0.2 x 10-9 이하의 IC50을 가지면서 표준 시험관 내 검정에서 인간 NGF 생체활성을 중화시킴을 특징으로 하는 방법.
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