TW201125581A - Human anti-NGF neutralizing antibodies as selective NGF pathway inhibitors - Google Patents

Human anti-NGF neutralizing antibodies as selective NGF pathway inhibitors Download PDF

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TW201125581A TW099134471A TW99134471A TW201125581A TW 201125581 A TW201125581 A TW 201125581A TW 099134471 A TW099134471 A TW 099134471A TW 99134471 A TW99134471 A TW 99134471A TW 201125581 A TW201125581 A TW 201125581A
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James J S Treanor
Haichun Huang
Heather Inoue
Tie J Zhang
Frank Martin
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Description

201125581 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於結合神經生長因子（NGF)之人類單株抗 體。亦描述用於治療疼痛及疼痛相關病症之組合物及方 法。 本申請案主張2009年10月9曰申請之美國專利申請案第 (U.S.S.N.)12/576,522號之優先權，其為2008年11月25曰申 請之美國專利申請案第（匕8.8.：^.)12/277,919號的部分接續 申請案，其為2004年7月15曰申請之美國專利申請案第 (U.S.S.N.)10/891,658號的接續申請案且主張2003年7月15 曰申請之美國臨時.申請案第60/487,43 1號之優先權利。本 申請案亦係關於2007年6月22日申請之美國專利申請案第 1 1/767,326號，該專利申請案為U.S.S.N. 10/891,658之分案 申請案。所有此等申請案之揭示内容以引用的方式併入本 文中。 序列表僅以電子格式與本申請案一起呈送，且以引用的方 式併入本文中。序列表正文檔案「02-1240-F-CIP.SeqList.txt」 於2008年11月25日形成，且大小為79,116位元組。 【先前技術】 每天，美國有超過2,000,000人因慢性疼痛而失能 (Jessell 及 Kelly，1991，「Pain and Analgesia」，PRINCIPLES OF NEURAL SCIENCE，第 3 版，（Kandel，Schwartz及 Jessell 編），Elsevier, New York)。不幸地，當前之疼痛治療僅部分 有效，且許多此等治療本身引起衰弱或危險副作用。舉例 151365.doc 201125581 而言，儘管諸如阿司匹靈（aspirin)、布洛芬（ibuprofen)及 吲哚美辛（indomethacin)之非類固醇消炎藥（「NSAID」）對 炎性痛適度有效，但其亦具有腎臟毒性，且高劑量傾向於 引起腸胃刺激、潰瘍、出血及精神錯亂。以類鴉片 (opioid)治療之患者通常亦經歷精神混亂，且長期使用類 鴉片與耐受性及依賴性聯繫在一起。諸如利多卡因 (lidocaine)及美西律（mexiietine)之局部麻醉劑抑制疼痛但 同時失去正常感覺。 疼痛為基於自環境接收且由神經系統傳輸及解繹之信號 的感覺（評論參看 Millan，1999，Prog. TVewroWo/. 57:1-164)。 諸如熱及觸碰之有害刺激使皮膚中之專門感覺受體向中樞 神經系統（「CNS」）發送信號。此過程稱為傷痛刺激，且 介導其之周邊感覺神經元為疼痛感受器。視來自疼痛感受 器之彳§號強度及CNS對彼信號之提取及加工而定，個體可 經受或可不經受如疼痛之有害刺激。當疼痛感覺根據刺激 強度適當校準時，疼痛發揮其預期保護功能。然而，特定 類型之組織損傷引起稱為痛覺過敏或痛覺亢進之現象，其 中相對無害之刺激因個體疼痛臨限值降低而感覺為劇 痛。發炎及神經損傷皆可誘發痛覺過敏。受諸如曬傷、骨 關節炎、結腸炎、心臟炎、皮炎、肌炎、神經炎、膠原血^ 管病（包括類風濕性關節炎及狼瘡）及其類似病況之發炎病 況折磨的個體通常疼痛感覺增強。同樣，外傷 '手術、切 除術、膿腫 ' 灼痛、膠原血管病、髓鞘脫失病、三又神經 痛、癌症、慢性酒精中毒、中風、丘腦痛症候群、糖尿 151365.doc 201125581 病、疱疹性感染、後天性免疫缺陷症候群（「AIDS」）、毒 素及化學療法引起神經損傷，導致過度疼痛。 隨著更進一步理解疼痛感受器在正常及痛覺過敏條件下 轉換外部信號之機制，可靶向痛覺過敏中牽涉之過程以抑 制疼痛臨限值降低，藉此減少所經歷之疼痛量。 已顯示神經營養因子在生理性及病理性疼痛之傳輸中起 重要作用。神經生長因子（NGF)看似尤其重要（評論參看
McMahon, 1996, JVawUoc. Loi 351:431-40 ;及 Apfel, 2000, 77ze C/im'ca/ «/owrwa/ ο/Ραίπ 16:S7-S11)。已 顯示局部及全身性投與NGF會引起痛覺過敏及異常疼痛 (Lewin等人 ’ 1994，6:1903-1912)。在人 體内靜脈内輸注NGF會產生全身性肌痛，而局部投與除了 全身性作用外還會引起注射部位痛覺過敏及異常疼痛 (Apfel等人，1998, 幻；51:695_702)。在疼痛為顯著 特徵之病況中亦存在牵涉内源NGF之明顯身體跡象。舉例 而5，NGF在周邊神經損傷後在背根神經節（DRG)神經鞘 細胞（Schwann cell)中上調持續至少2個月，且在罹患多種 關節炎模型之動物關節中報導含量升高（例如A丨〇 e等人， 1993, 9:149-155)。在人類中，NGF於患有 類風濕性或其他類型關節炎之患者滑液中之含量升高（例 如 Aloe荨人，1992，/及心"加 35:351-355)。 此外，已證明拮抗NGF功能會防止神經疼痛及慢性炎性痛 之模型中的痛覺過敏及異常疼痛。舉例而言，在神經痛 (例如神經幹或脊神經結紮）之動物模型中’全身注射中和 151365.doc 201125581 NGF之抗體可預防異常疼痛及痛覺過敏（Ramer等人，1999, 五狀·/· 11:837-846 ;及Ro等人，1999，79:265- 274)。此項技術中已知之抗NGF抗體之實例包括例如PCT 公開案第WO 01/78698號、第WO 01/64247號、第WO 02/096458號及第WO 2004/032870號；美國專利第 5,844,092 號、第 5,877,016 號及第 6，153，189號；Hongo 等 人，2000，19:215-227 ; Hongo 等人，1993，Ce//. Mo/· 5z_o/· 13:559-568 ;及 GenBank 寄存編號 U39608、 U39609 、 L17078或L17077 。 明顯，需要針對疼痛之新穎安全且有效之治療，尤其藉 由靶向疼痛之小分子介體或惡化因子（諸如NGF)進行的治 療。 【發明内容】 本發明提供治療學上適於控制疼痛之新穎人類單株抗 體。特定言之，本發明提供結合至神經生長因子（NGF)之 單株抗體。單株抗體較佳為人類單株抗體，且中和NGF之 生物活性，且適於改善NGF介導之疼痛反應的作用。本發 明亦提供向細胞培養基中產生且最佳分泌本發明單株抗體 之細胞。除了治療及控制疼痛之用途外，本發明抗體適於 治療神經痛及炎性痛相關之反應。 本發明另外提供包含抗體Fc區序列及一或多個識別為 SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 22及SEQ ID NO: 79-130之序列的融合蛋白。該等分 151365.doc 201125581 子可使用例如以引用方式併入本文中之國際專利申請公開 案第WO 00/24782號中所述之方法製備。該等分子可例如 表現於哺礼動物細胞（例如中國倉鼠卵巢細胞）或細菌細跑 (例如大腸桿菌細胞）中。 在某些態樣中’本發明提供包含重鏈及輕鏈之抗體較 佳單株抗體，最佳人類抗體及人類單株抗體，其中重鏈包 含如 SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 4或 SEQ ID NO: 6所闡述 之胺基酸序列，或其抗原結合或免疫功能性免疫球蛋白片 段’且重鏈之可變區包含如SEq ID no: 1〇所闡述之胺基 I序列’或其抗原結合或免疫功能性免疫球蛋白片段。重 鏈較佳包含如SEQ ID NO: 4所闡述之胺基酸序列。 在某些態樣中’本發明提供包含重鏈及輕鏈之抗體，較 佳人類抗體，及更佳單株抗體，最佳人類單株抗體，其中 重鏈包含選自由 IgGl、igG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA及 IgE重鏈恆定區或其任何對偶基因變異體組成之群的重鏈 惶疋區（如 Kabat 等人 ’ 1991，Sequences of Proteins of Immunological lnterest，第 5 版，u s Depanment 〇f
Health and Human Services，NIH Publication第 91-3242號中 所SWJ述，以引用的方式納入本文中），且重鏈之可變區包 , 含如SEQ ID NO: 10所闡述之胺基酸序列，或其抗原結合 或免疫功能性免疫球蛋白片段。本發明抗體較佳包含如 SEQ ID NO: 4所闡述之igG2重鏈恆定區的胺基酸序列，或 其抗原結合或免疫功能性免疫球蛋白片段。 在某些態樣中，本發明提供包含重鏈及輕鏈之抗體，較 151365.doc 201125581 佳人類抗體，及更佳單株抗體，最佳人類單株抗體，其中 輕鏈包含如SEQ ID NO: 8所闡述之胺基酸序列，或其抗原 結合或免疫功能性免疫球蛋白片段，且輕鏈可變區包含如 SEQ ID NO: 12所闡述之胺基酸序列，或其抗原結合或免 疫功能性免疫球蛋白片段。 在某些態樣中，本發明抗體包含重鏈及輕鏈，其中重鏈 之可變區包含如SEQ ID NO: 1〇所闡述之胺基酸序列，或 其抗原結合或免疫功能性免疫球蛋白片段。在其他態樣 中，輕鏈可變區包含如SEQ ID N〇: 12所闡述之胺基酸序 列，或其抗原結合或免疫功能性免疫球蛋白片段。在其他 態樣中，重鏈包含如SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 18或 SEQ ID NO: 20中任一者所闡述之胺基酸序列，或其抗原 結合或免疫功能性免疫球蛋白片段。在其他態樣中，輕鏈 包含如SEQ ID NO: 16、20、24中任一者所闡述之胺基酸 序列’或其抗原結合或免疫功能性免疫球蛋白片段。 本發明亦提供特異性結合至NGF之抗體，其中重鏈包含 含有如SEQ ID NO: 10所闡述之胺基酸序列之可變區，或 其抗原結合或免疫功能性免疫球蛋白片段，且輕鏈包含含 有如SEQ ID NO: 12所闡述之胺基酸序列之可變區，或其 抗原結合或免疫功能性免疫球蛋白片段。 本發明進步長:供特異性結合至NGF之經分離人類抗 體’其中抗體包含： (a)具有包含如SEQ ID NO: 79所闡述之胺基酸序列之重 鏈可變區，或其抗原結合或免疫功能性免疫球蛋白片段之 151365.doc 201125581 重鍵’及具有包含如SEq ID NO: 80所闡述之胺基酸序列 之輕鏈可變區’或其抗原結合或免疫功能性免疫球蛋白片 段之輕鏈； (b) 具有包含如SEQ Π) NO: 81所闡述之胺基酸序列之重 鍵可變區’或其抗原結合或免疫功能性免疫球蛋白片段之 重鏈’及有包含如SEQ id NO: 82所闡述之胺基酸序列之 輕鏈可變區’或其抗原結合或免疫功能性免疫球蛋白片段 之輕鏈； (c) 具有包含如SEQ ID NO: 83所闡述之胺基酸序列之重 鍵可變區’或其抗原結合或免疫功能性免疫球蛋白片段之 重鏈，及具有包含如SEQ ID N〇: 84所闡述之胺基酸序列 之輕鏈可變區，或其抗原結合或免疫功能性免疫球蛋白片 段之輕鏈；或 (d) 具有包含如SEQ ID NO: 86所闡述之胺基酸序列之重 鏈可變區’或其抗原結合或免疫功能性免疫球蛋白片段之 重鏈’及具有包含如SEQ ID NO: 87所闡述之胺基酸序列 之輕鏈可變區，或其抗原結合或免疫功能性免疫球蛋白片 段之輕鏈。 在某些態樣中’本發明亦提供包含重鍵及輕鏈之抗體， 其中重鏈包含重鏈可變區，且其中重鏈可變區包含與如 SEQ ID NO: 1 〇所闡述之胺基酸序列具有至少75%、較佳 80¾、更佳至少85%、甚至更佳至少90%、91%、92%、 93%、94%、95%、96%、97°/。、98%及最佳約 99%—致性 的序列’且其中輕鏈包含輕鏈可變區，且其中輕鏈可變區 151365.doc 201125581 包含與如SEQ ID NO: 12所闡述之胺基酸序列具有至少 80%、較佳至少85% '更佳至少90%、91%、92%、93%、 94%、95%、96%、97%、98°/。及最佳約 99%—致性的序 列，其中抗體特異性結合至NGF。 本發明亦提供特異性結合至NGF之抗體，其中重鏈包含 如SEQ ID NO: 14所闡述之胺基酸序列，或其抗原結合或 免疫功能性免疫球蛋白片段，且輕鏈包含如SEQ ID NO: 1 6所闡述之胺基酸序列，或其抗原結合或免疫功能性免疫 球蛋白片段。 在某些態樣中，本發明提供包含重鏈及輕鏈之抗體，其 中重鏈包含重鏈可變區，且其中重鏈可變區包含與如SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 18或 SEQ ID NO: 22 中任一者所闡 述之胺基酸序列具有至少75%、較佳80%、更佳至少 8 5%、甚至更佳至少 90%、91%、92%、93%、94%、 95%、96°/。、97%、98%及最佳約99%—致性的序列，且其 中輕鍵包含輕鏈可變區，且其中輕鏈可變區包含與如SEQ ID NO: 16所闡述之胺基酸序列具有至少80%，較佳至少 85%，更佳至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、 96%、97%、98%及最佳約99°/〇—致性的胺基酸序歹ij，其中 抗體特異性結合至NGF。 本發明亦提供單鏈抗體、單鏈Fv抗體、F(ab)抗體、 F(ab)·抗體及（Fab')2抗體。 在特定態樣中，本發明提供包含如SEQ ID NO: 16所闡 述之胺基酸序列，或其抗原結合或免疫功能性免疫球蛋白 151365.doc 10 201125581 片段的輕鏈。 此外，本發明提供包含如SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 18或SEQ ID NO: 22中任一者所闡述之胺基酸序列，或其 抗原結合或免疫功能性免疫球蛋白片段的重鏈。 本發明亦係關於特異性結合NGF之經分離人類抗體，其 中抗體包含：（a)人類重鏈構架區、人類重鏈CDR1區、人 類重鏈CDR2區及人類重鏈CDR3區；及⑻人類輕鏈構架 區、人類輕鏈CDR1區、人類輕鏈CDR2區及人類輕鏈 CDR3區。在某些態樣中，人類重鏈CDR1區可為命名為 4D4之單株抗體（mAb)之如SEQ ID NO:22所示的重鏈CDR1 區，且人類輕鏈CDR1區可為mAb 4D4之如SEQ ID NO:24 所示的輕鏈CDR1區。在其他態樣中，人類重鏈CDR2區可 為mAb 4D4之如SEQ ID NO:18所示的重鏈CDR2區，且人 類輕鏈CDR2區可為mAb 4D4之如SEQ ID NO:20所示的輕 鏈CDR2區。在其他態樣中，人類重鏈CDR3區為mAb 4D4 之如SEQ ID N0:14所示的重鏈CDR3區，且人類輕鏈CDR3 區為111八5 404之如8£()1〇>10:16所示的輕鏈〇0113區。 本發明亦提供特異性結合神經生長因子之包含重鏈及輕 鏈之經分離人類抗體，其中重鏈包含含有*SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 79、SEQ ID NO: 81、SEQ ID NO: 83、 SEQ ID NO: 85或SEQ ID NO: 87所闡述之胺基酸序列的重 鏈可變區’或其抗原結合或免疫功能性免疫球蛋白片段。 本發明進一步提供特異性結之包含重鏈及輕鏈之 經分離人類抗體’其中輕鏈包含含有如SEq ID NO: 12、 151365.doc -11 - 201125581 SEQ ID NO: 80、SEQ ID NO: 82、SEQ ID NO: 84、SEQ ID NO: 86、SEQ ID NO: 88、SEQ ID NO: 89、SEQ ID NO: 90、SEQ ID NO: 91 或 SEQ ID NO: 131所闡述之胺基 酸序列的輕鏈可變區’或其抗原結合或免疫功能性免疫球 蛋白片段》 本發明抗體特徵在於拮抗至少一種與NGF多肽相關之活 體外及/或活體内活性的能力。本發明較佳提供以高親和力 結合至NGF多肽之經分離抗人類NGF人類抗體，其中抗體 結合至人類NGF多肽且如使用KinExA所測定以約5〇χ 1 Ο·12 Μ 或50χ10·12 Μ以下之解離常數（KD)自人類NGF多肽解離， 或在活體外中和分析中以約1 X 1 Ο·8 Μ或1 X 1 Ο·8 Μ以下之 IC5G抑制NGF誘導之存活。 在一較佳實施例中，本發明提供具有以下特徵之經分離 抗人類NGF人類抗體： a) 在活體外中和分析中以約1x1 〇·9 Μ或1x1 〇_9 Μ以下之 ICw抑制NGF誘導之存活； b) 具有包含SEQ ID NO:14之胺基酸序列的重鏈CDR3 ;及 e)具有包含SEQ ID NO:16之胺基酸序列的輕鏈CDR3。 本發明亦提供以高親和力特異性結合至NGF之經分離人 類抗體或其抗原結合或免疫功能性免疫球蛋白片段，其中 該等抗體或片段以約1 X 1 〇·9或1 X1 〇_9以下之Kd自人類Ngf 多肽解離’且在標準活體外分析中以約lxlO·8 Μ或1χΐ〇-8 μ 以下之IC5〇中和人類NGF生物活性’且其中抗體或片段包 含重鏈可變區，該重鏈可變區包含： 151365.doc 12 201125581 a) 包含下式之胺基酸序列的cdri區： a丨a2a3a4a5 其中： a1為極性親水性胺基酸殘基；a2為芳族胺基酸殘基； 為脂族、極性疏水性、芳族胺基酸殘基；〆為中性疏水性 或脂族胺基酸殘基；且a5為脂族或極性親水性胺基酸殘 基； b) 包含下式之胺基酸序列的CDR2區： b1b2b3b4b5b6b7b8b9b10b,1b12b13b,4b15b16b17 其中： b1為脂族、極性疏水性或芳族胺基酸殘基；y為脂族疏 水性胺基酸殘基；b3為極性親水性或芳族胺基酸殘基；y 為極性親水性、疏水性或芳族胺基酸殘基；b5_b9獨立為極 性親水性或脂族胺基酸殘基；b1Q為極性親水性、芳族或脂 族胺基酸殘基；b11為芳族或疏水性胺基酸殘基；b12為脂 族疏水性或極性親水性胺基酸殘基；為脂族、疏水性或 極性親水性胺基酸殘基；b14與b16獨立為極性親水性胺基 酸殘基，b15為脂族或芳族疏水性胺基酸殘基；且b 17為脂 族酸性胺基酸殘基；及 c) 包含下式之胺基酸序列的CDR3區： c1c2c3c4c5c6c7c8c9c10c1,c,2c13c14c,5c16c17 其中： C 1不存在或為脂族胺基酸殘基；C2不存在或為極性親水 性或芳族疏水性胺基酸殘基；C3與C4獨立地不存在或為極 151365.doc -13· 201125581 性親水性、芳族疏水性、或脂族胺基酸殘基；c5不存在或 為極性親水性、脂族或芳族胺基酸殘基；c6不存在或為極 性親水性或脂族胺基酸殘基；c7為極性親水性或脂族胺基 酸殘基；C8為極性親水性、疏水性或芳族胺基蛟殘基；c9 為極性親水性、脂族或芳族疏水性胺基酸殘基；為極性 親水性、芳族疏水性、或脂族疏水性胺基酸殘基；c 11 _c 13 獨立地為極性親水性或芳族疏水性胺基酸殘基；C! 4為脂族 或芳族疏水性胺基酸殘基；C15為極性親水性或中性疏水性 胺基酸殘基；C16不存在或為極性親水性胺基酸殘基；且 C17為芳族疏水性或脂族疏水性胺基酸殘基。 在一態樣中，a1為極性親水性胺基酸殘基；a2為芳族疏 水性胺基酸殘基；a3為脂族疏水性胺基酸殘基；a4為中性 疏水性；a5為極性親水性胺基酸殘基；bi為脂族或芳族胺 基酸殘基；b2為IIe ; b3為極性親水性胺基酸殘基；b4為極 性親水性或芳族胺基酸殘基；b5-b9獨立為極性親水性或脂 族胺基酸殘基；b1G為脂族胺基酸殘基；b"為Tyr ; b12為脂 族疏水性胺基酸殘基；b13為脂族或極性親水性胺基酸殘 基’· b14與b16獨立為極性親水性胺基酸殘基；且為脂族 疏水性胺基酸殘基；b17為脂族酸性胺基酸殘基；c〗不存在 或為脂族胺基酸殘基；c2不存在或為極性親水性或芳族疏 水性胺基酸殘基；c3與c4獨立地不存在或為極性親水性、 芳族疏水性、或脂族胺基酸殘基；c5不存在或為極性親水 性胺基酸殘基；C6不存在或為極性親水性或脂族胺基酸殘 基；C7為極性親水性或脂族胺基酸殘基；c8為極性親水 151365.doc •14- 201125581 性、疏水性或芳族胺基酸殘基；C9為極性親水性、脂族或 芳族疏水性胺基酸殘基；c1Q為極性親水性、芳族疏水性或 脂族疏水性胺基酸殘基；cn-c13獨立地為極性親水性或芳 知疏水性胺基酸殘基；C 14為脂族或芳族疏水性胺基酸殘 基；c15為極性親水性或中性疏水性胺基酸殘基；c 16不存 在或為極性親水性胺基酸殘基；且C1 7為芳族疏水性或脂族 疏水性胺基酸殘基。 在特定態樣中，a1為Ser、Asp或Thr ; a2為Tyr ; a3為
Ala、Ser、Trp 或 Gly ; a4 為 Met 或 lie ; a5 為 His、Gly 或 Asn ; b1 為 Tyr、Gly、lie 或 Asp ; b2 為 lie ; b3 為 Ser、Thr、 Tyr 或 Asn ; b4 為 Trp、Arg 或 Pro ; b5 為 Ser、Asn 或 Gly ; b6 為 Ser、Arg、Asp 或 Gly ; b7 為 Ser、His 或 Gly ; b8 為 Ser、 lie、Asp 或 Thr ; b9 為 Leu、lie 或 Thr ; b1。為 Gly、Lys 或 Phe，t^^Tyr ; b12為 Ala或 Ser ; b13為 Asp ' Gly或 Pro ; b14 為 Ser ; b15 為 Val 或 Phe ; b^6 為 Lys 或 Gin ; b17 為 Gly ; c1 不存 在或為脂族胺基酸殘基；c2不存在或為Tyr ; c3與c4獨立地 不存在、為Tyr、Asn、Val或Glu ; c5不存在、為Ser、Gly 或 Trp，c6 不存在、為 Ser、Gly、Glu 或 Leu; c7 為 Gly、Arg 或 Asp ; c8 為 Trp、Pro、Ser 或 Thr ; c9 為 His、Gly 或 Tyr ; c10為 Va卜 Tyr 或 Arg ; cn-c13獨立為 Ser、Phe、Tyr、Asp 或 Asn ; c14 為 Phe、Val 或 Gly ; c]5 為 Met 或 Asp ; 不存在' 為 Asp 或 Asn;且 c17 為 Tyr 或 Val。 在另一特定態樣中，a1為Ser或Asp ; a2為Tyr ; a3為Ala 或 Ser ; a4 為 Met 或 lie ; a5 為 His 或 Asn ; b1 為 Tyr 或 Gly ; b2 151365.doc -15· 201125581 為 lie ; b3 為 Ser、Thr、Tyr 或 Asn ; b4為 Trp、Arg或 Pro ; b5 為 Ser 或 Asn ; b6 為 Ser 或 Arg ; b7 為 His 或 Gly ; b8 為 lie 或 Thr ; b9 為 Leu、lie 或 Thr ; b丨0為 Gly 或 Phe ; b丨丨為 Tyr ; b12 為 Ala 或 Ser ; b13 為 Asp 或 Gly ; b14 為 Ser ; b15 為 Val 或 Phe ; b16為Lys或Gin ; b17為Gly ; c1不存在或為Gly ; c2不存在或 為Tyr ; c3與c4獨立地不存在、為Tyr、Gly或Val ; c5不存在 或為 Ser ; c6 為 Ser 或 Gly ; c7 為 Gly 或 Arg ; c8 為 Trp 或 Pro ; c9 為 His、Gly 或 Tyr ; c〗0 為 Val 或 Tyr ; c"V3獨立為 Ser、 Tyr、Phe 或 Asp ; c14 為 Phe 或 Val ; c15 為 Met 或 Asp ; c16不存 在或為Asp ;且c17為Tyr或Val。 在其他特定態樣中： a) 重鏈CDR1具有如SEQ ID NO: 22所闡述之胺基酸序 列，重鏈CDR2具有如SEQ ID NO: 18所闡述之胺基酸序 歹1J，且重鏈CDR 3具有如SEQ ID NO: 14所闡述之胺基酸 序列； b) 重鏈CDR1具有如SEQ ID NO: 92所闡述之胺基酸序 列，重鏈CDR2具有如SEQ ID NO: 93所闡述之胺基酸序 列，且重鏈CDR 3具有如SEQ ID NO: 94所闡述之胺基酸 序列； c) 重鏈CDR1具有如SEQ ID NO: 98所闡述之胺基酸序 列，重鏈CDR2具有如SEQ ID NO: 99所闡述之胺基酸序 列，且重鏈CDR 3具有如SEQ ID NO: 1〇〇所闡述之胺基 酸序列； d) 重鏈CDR1具有如SEQ ID NO: 104所闡述之胺基酸序 151365.doc -16· 201125581 列，重鏈CDR2具有如SEQ ID NO: 105所闡述之胺基酸 序列，且重鏈CDR 3具有如SEQ ID NO: 106所闡述之胺 基酸序列； e) 重鏈CDR1具有如SEQ ID NO: 110所闡述之胺基酸序 歹|J，重鏈CDR2具有如SEQ ID NO: 111所闡述之胺基酸 序列，且重鏈CDR 3具有如SEQ ID NO: 112所闡述之胺 基酸序列；且 f) 重鏈CDR1具有如SEQ ID NO: 116所闡述之胺基酸序 列’重鏈CDR2具有如SEQ ID NO: 117所闡述之胺基酸 序列，且重鏈CDR 3具有如SEQ ID NO: 11 8所闡述之胺 基酸序列。 本發明亦提供特異性結合至NGF之經分離人類抗體或其 抗原結合或免疫功能性免疫球蛋白片段，其中抗體或片段 包含如下輕鏈可變區，輕鏈可變區包含： a) 包含下式之胺基酸序列的CDR 1區： a 丨 a2a3a4a5a6a7a8a9a 丨 〇a】V2 其中： a為極性親水性胺基酸殘基；a2、α 11與a 12獨立為脂族或 疏水性胺基酸殘基；a3、a5 ' a7與a8獨立為脂族、極性親水 性或疏水性胺基酸殘基，a4為極性親水性胺基酸殘基；a6 為脂族或疏水性胺基酸殘基；a9不存在或為脂族或極性親 水性胺基酸殘基；且a1G為脂族、芳族或疏水性胺基酸殘 基； b) 包含下式之胺基酸序列的CDR2區： 151365.doc 17 201125581 bVbVbVb7 其中： b1為脂族、極性疏水性或疏水性胺基酸殘基；b2為脂族 或疏水性胺基酸殘基；b3與b4獨立為極性親水性、脂族咬 疏水性胺基酸殘基；b5為極性親水性或脂族疏水性胺基酸 殘基；b6為極性親水性或脂族疏水性胺基酸殘基；且y為 極性親水性胺基酸殘基；且 c)包含下式之胺基酸序列的CDR3區： c1c2c3c4c5c6c7c8c9c,0c1,c,2c,3c14c,5c16c17 其中： c與c2獨立為極性親水性胺基酸殘基；c3為極性親水 性、脂族或疏水性胺基酸殘基；C4、C5與C6獨立為脂族、 極性親水性或疏水性胺基酸殘基；C7不存在或為極性親水 性或脂族疏水性胺基酸殘基；C8為極性親水性或疏水性胺 基酸殘基；且C9為極性親水性胺基酸殘基，且其中該抗體 或片段以約lxio·9或lxl〇-9以下之KD自人類NGF多肽解 離，且在標準活體外分析中以約lxl〇·8 IV[或lxlO·8 Μ以下 之IC50中和人類NGF生物活性。 在一態樣中’ a1、a3、a4、a7與a8獨立為極性親水性胺基 酸殘基s ; a2、a6、a11與a12獨立為脂族疏水性胺基酸殘 基；a5為極性親水性或脂族胺基酸殘基；a9不存在、或為 脂族或極性親水性胺基酸殘基；a1Q為脂族或芳族胺基酸殘 基；b1為脂族、極性疏水性、或疏水性胺基酸殘基；b2為 脂族疏水性胺基酸殘基；b3、b4與b7獨立為極性親水性胺 151365.doc • 18 - 201125581 基酸殘基；b5與b6獨立為極性親水性或脂族疏水性胺基酸 殘基；c1與c2獨立為極性親水性胺基酸殘基；c3為極性親 水性、脂族或疏水性胺基酸殘基；c4、c5、與c6獨立為脂 族、極性親水性或疏水性胺基酸殘基；c7不存在或為脂族 疏水性胺基酸殘基；C8為疏水性胺基酸殘基；且C9為極性 親水性胺基酸殘基。 在一特定態樣中，a1、a3、a4與a7分別為Arg、Ser、Gin 及 Ser，a2 為 Ala ·’ a5 為 Gly 或 Ser ; a8 為 Ser 或 lie ; a9 不存 在、為 Ser 或 Gly ; a10 為 Ala、Tyr、Trp 或 Phe ; b1 為 Asp、 Gly、Ala或 Val ; b2與 b3 分別為 Ala及 Ser ; b4為 Ser 或 Asn ; b5 為 Leu 或 Arg ; b6 為 Glu、Ala 或 Gin ; b7 為 Ser 或 Thr ; c1 與 c 為 Gin，c3 為 Phe、Tyr、Arg 或 Ala ; c4 為 Asn ' Gly 或 Ser ; c5 為 Ser 或 Asn ; c6 為 Tyr、Ser、Trp 或 Phe ; c7 不存 在、為 Pro 或 His ; c8 為 Leu、Trp、Tyr 或 Arg ;且 c9 為 Thr。 在另一特定態樣中，a1、a2、a3、a4與a7分別為Arg、 Ala、Ser、Gin及 Ser ; a5 為 Gly 或 Ser ; a8 為 Ser 或 lie ; a9 不 存在、為Ser或Gly ; a丨0為Ala或Tyr ; b1為Asp或Gly ; b2與 b3 分別為 Ala及 Ser ; b4 為 Ser 或 Asn ; b5 為 Leu 或 Arg ; b6 為 Glu、Ala 或 Gin ; b7 為 Ser 或 Thr ; c1 及 c2 為 Gin ; c3 為 Phe、 Tyr、Arg或 Ala ; c4為 Asn、Gly 或 Ser ; c5為 Ser或 Asn ; c6為 Tyr、Ser、Trp 或 Phe ; c7 不存在、為 pro 或 His ; c8 為 Leu、 TrP、Tyr 或 Arg ;且 c9為 Thr。 在其他特定態樣中： 151365.doc -19- 201125581 a) 輕鏈CDR1具有如SEQ ID NO: 24所闡述之胺基酸序 列，輕鏈CDR2具有如SEQ ID NO: 20所闡述之胺基酸序 列，且輕鏈CDR 3具有如SEQ ID NO: 16所闡述之胺基酸 序列； b) 輕鏈CDR1具有如SEQ ID NO: 95所闡述之胺基酸序 列，輕鏈CDR2具有如SEQ ID NO: 96所闡述之胺基酸序 列，且輕鏈CDR 3具有如SEQ ID NO·· 97所闡述之胺基酸 序列； c) 輕鏈CDR1具有如SEQ ID NO: 101所闡述之胺基酸序 列，輕鏈CDR2具有如SEQ ID NO: 102所闡述之胺基酸 序列，且輕鏈CDR 3具有如SEQ ID NO: 103所闡述之胺 基酸序列； d) 輕鏈CDR1具有如SEQ ID NO: 107所闡述之胺基酸序 列，輕鏈CDR2具有如SEQ ID NO: 108所闡述之胺基酸 序列，且輕鏈CDR 3具有如SEQ ID NO: 109所闡述之胺 基酸序列； e) 輕鏈CDR1具有如SEQ ID NO: 113所闡述之胺基酸序 列，輕鏈CDR2具有如SEQ ID NO: 114所闡述之胺基酸 序列，且輕鏈CDR 3具有如SEQ ID NO: 115所闡述之胺 基酸序列； f) 輕鏈CDR1具有如SEQ ID NO: 119所闡述之胺基酸序 列，輕鏈CDR2具有如SEQ ID NO: 120所闡述之胺基酸 序列，且輕鏈CDR 3具有如SEQ ID NO: 121所闡述之胺 基酸序列； 151365.doc -20- 201125581 g) 輕鏈CDR1具有如SEQ ID NO: 122所闡述之胺基酸序 歹>J，輕鏈CDR2具有如SEQ ID NO: 123所闡述之胺基酸 序列，且輕鏈CDR 3具有如SEQ ID NO: 124所闡述之胺 基酸序列； h) 輕鏈CDR1具有如SEQ ID NO: 125所闡述之胺基酸序 歹>]，輕鏈CDR2具有如SEQ ID NO: 126所闡述之胺基酸 序列，且輕鏈CDR 3具有如SEQ ID NO: 127所闡述之胺 基酸序列； i) 輕鏈CDR1具有如SEQ ID NO: 128所闡述之胺基酸序 列，輕鏈CDR2具有如SEQ ID NO: 129所闡述之胺基酸 序列，且輕鏈CDR 3具有如SEQ ID NO: 130所闡述之胺 基酸序列；且 j) 輕鏈CDR1具有如SEQ ID NO: 132所闡述之胺基酸序 列，輕鏈CDR2具有如SEQ ID NO: 133所闡述之胺基酸 序列，且輕鏈CDR 3具有如SEQ ID NO: 134所闡述之胺 基酸序列。 編碼新穎抗人類NGF人類抗體之聚核苷酸序列、包含編 碼抗人類NGF人類抗體之聚核苷酸序列的載體、以併入編 碼抗人類NGF人類抗體之聚核苷酸的載體轉型之宿主細 胞、包含抗人類NGF人類抗體之調配物及其製備及使用方 法亦為本發明之部分。 本發明亦提供偵測生物樣品中之NGF含量的方法，其包 含使樣品與本發明抗體或其抗原結合片段接觸之步驟。本 發明之抗NGF抗體可用於任何已知分析方法_以供偵測及 151365.doc -21 - 201125581 定量NGF，分析方法諸如競爭性結合分析、直接及間接夾 心分析、免疫沈澱分析及酶聯免疫吸附分析（ELisA)(參看 Sola, 1987, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, 第147-158頁，CRC Press，Inc.)。抗體可以對所採用之分析方 法適當的親和力結合NGF。 此外，本發明提供治療與NGF產量增加或對NGF敏感性 增加相關之疾病的方法，其包含向有需要之個體投與醫藥 學上有效量之醫藥組合物的步驟，其中醫藥組合物包含至 少一種本發明抗體或其抗原結合或免疫功能性免疫球蛋白 片段。 在某些實施例中，本發明係關於治療由神經生長因子 (NGF)表現增加或對NGF敏感性增加引起之病況的方法， 其包含向患者經口、藉由靜脈内、腹膜内、大腦内（腦實 質内）、腦室内、肌肉内、眼内、動脈内、門靜脈内、病 灶内或皮下途徑注射、藉由持續釋放系統或藉由植入裝置 投與醫藥學上有效量之刪抗體’其中該錢為急性湾 痛、牙痛、外傷疼痛、外科疼痛、切除術或膿腫引起之湾 痛、灼痛、趙鞘脫失病、三叉神經痛、癌症、慢性酒精中 毒、中風、丘腦痛症候群、糖尿病、後天性免疫缺陷症候 群（「MDS」）、毒素、化學療法、一般性頭痛、偏頭痛、 叢集性頭痛、混合性血管或非血管症候群、緊張性頭痛 全身性發炎、關節炎、風濕病、狼瘡、骨關節炎、肌肉_ 維疼痛、發炎性腸病、大腸急躁症、發炎性眼病、發炎括 或不穩定膀胱功能障礙、牛皮癬、具有發炎組分之皮膚病 151365.doc •22· 201125581 症、嘴傷、心臟姿、由六 慢性發炎性病、兄 广肌炎、神經炎、耀原血管病、 神經痛及^ X及相關之痛覺過敏及異常疼痛、 疼痛、灼錢過敏或異常疼痛、糖尿錢神經病變 雜b 轉性疼痛 '傳人神經阻滯症候 砰、孝。而' 上皮組織損傷或功能障礙、單純疱療呼吸、 泌尿生殖、腸胃或血管區内臟蠕動紊亂'創傷、燒傷、過 :丨生=反應、搔癢、白斑病、一般性腸胃障礙、結腸 尺月》貝瘍、十二指腸潰瘍、血管舒縮性或過敏性鼻炎' 或支氣管病症、痛經、消化不良、胃食道逆流、胰臟炎、 或内臟疼痛。 在某些貫鈀例中，該等方法包含醫藥學上有效量之NGF 抗體且適用於治療或預防骨關節炎膝痛。在某些實施例 中，NGF杬體之醫藥學上有效量為每次皮下注射約3 至 約30 mg。在某些實施例中，投與包含多次皮下注射。在 實施例中’投與包含單次皮下注射。在某些實施例中，本 發明之組合物及方法包含NGF抗體，該抗體包含含有SEQ ID NO. 44之輕鏈。在某些實施例中，NGF抗體包含含有 SEQ ID. NO. 40之重鏈。在其他實施例中，NGF抗體包含 含有SEQ ID NO. 44之輕鏈及含有SEQ ID. NO. 40之重鏈。 因此，根據以上本發明描述’本發明之各種態樣係關於 包含NGF抗體之方法及組合物，該抗體包含含有SEQ ID NO: 44之輕鏈及含有SEQ ID NO: 40之重鏈，其中抗體之 重鏈與輕鏈由可撓性連接子連接形成單鏈抗體。在此態樣 之一些實施例中，NGF抗體包含單鏈Fv抗體、Fab'抗體、 151365.doc •23- 201125581 (Fab')2抗體、完全人類抗體及/或人類化抗體。在此態樣之 一些實施例中，NGF抗體抑制NGF信號傳導。 在此態樣之某些實施例中，NGF抗體以約ix10-9或lxl〇-9 以下、約1x10-丨％戈lxl0-、下、或約1χ1〇.丨丨或1χ1〇·"以下 之KD自人類NGF多肽解離。在此態樣之某些實施例中， NGF抗體在標準活體外分析中以約丨χ〗〇·8或1 X 1 以下、 約 1Χ10-9 或 1X10.9 以下、或約 〇2χ1〇·9 或 〇2χ1〇.9 以下之 iC5〇 中和人類NGF生物活性。在某些實施例中，NGF抗體以上 述KD值自人類NGF多肽解離且在標準活體外分析中以上述 ICso值中和人類NGF生物活性。 本發明之特定較佳實施例將自以下特定較佳實施例之更 詳細描述及申請專利範圍顯而易知。 【實施方式】 本文所用之段標題僅出於組織目的且不應解釋為限制所 述之主旨。本申請案中引用之所有參考案出於任何目的以 引用的方式明確併入本文中。 定義 重·.且DNA、寡核苷酸合成及組織培養及轉型可使用習知 技術進行（例如電穿孔、脂質體轉染）。酶促反應及純化技 Μ根據製造商說明書或如此項技術中通常所實現或如本 文所述執仃。上述技術及程序一般可根據此項技術中熟知 之方法及如本說明書全文所引用及論述之各種—般參考文獻 及更具體之參考文獻中所述執行。參看例如〜蠢。。k等人， 01, MOLECULAR cloning： a laboratory MANUAL. » % 3 151365.doc -24· 201125581 版 ’ Cold Spring Harbor Laboratory press，c〇ld Spring
Harbor·，N.Y. ’為了任何目的，其以引用的方式併入本文 中。除非提供特定定義，否則與本文所述之分析化學、合 成有機化學以及醫學及醫藥化學結合利用之命名法、及本 文所述之分析化學、合成有機化學以及醫學及醫藥化學之 實驗室程序及技術為此項技術中熟知且通常所用者。同 樣，可使用習知技術來進行化學合成、化學分析、醫藥製 備、調配及傳遞，以及患者之治療。 如根據本發明所用，除非另外指出’否則以下術語應理 解為具有以下含義：關於本發明抗體之片語「生物特 性」、「生物特徵」及術語「活性」在本文互換使用且包括 (但不限於）抗原決定基親和力及特異性（例如結合至人類 NGF之抗人類NGF人類抗體）、拮抗所靶向多肽之活性（例 如NGF活性）的能力、抗體之活體内穩定性、及抗體之免 疫原性特性。此項技術中公認之抗體之其他可識別生物特 性或特徵包括例如交又反應性（亦即一般與所靶向多肽之 非人類同系物或與其他蛋白質或組織之交又反應性）及保 持蛋白質於哺乳動物細胞中之高表現量的能力。上述特性 或特徵可使用此項技術中公認之技術觀測或測量，包括 (但不限於）ELISA、競爭性ELISA、表面電聚子共振分 析、活體外及活體内中和分析（例如實例2)、及使用不同來 源（包括人類、靈長類動物或視需要之任何其他來源）之組 織切片進行的免疫組織化學。以下實例中進—步詳細福述 抗人類NGF人類抗體之特定活性及生物特性。 J51365.doc •25- 201125581 如本文所用之術語「經分離聚核苦酸」將意謂例如基因 .’·且cDNA或合成來源或其某種組合之聚核苷酸，赛於其 來源，該經分離聚核苷酸⑴不與在自然界中可發現經分離 聚核苦酸之整個聚核皆酸或其一部分締合；⑺連接至在自 二界中不與其連接之聚核m ;或（3)實質上不作為較大序 列之一部分而存在。 本文中提及之術語「經分離蛋白質」意謂本發明蛋白質 ο)不含至少一些通常與其一起存在之其他蛋白質，（2)基 本上不含來自相同來源（例如來自相同物種）之其他蛋白 質，（3)藉由來自不同物種之細胞表現，（4)至少已與約 之自然界中與其締合之聚核發酸、脂質、碳水化合物或其 他物質分離，（5)不與自然界中與「經分離蛋白質」締合之 一部分蛋白質締合（藉由共價或非共價相互作用），與自 然界中不與其締合之多肽操作性締合（藉由共價或非共價 相互作用），或（7)自然界中不存在。該經分離蛋白質可藉 由合成來源之基因組1)>^、cDNA、mRNA或其他rna或其 任何組合來編碼。較佳地，經分離蛋白質實質上不含會干 擾其用途（治療性、診斷性、防治性、研究或其他用途）之 其天然環境中發現之蛋白質或多肽或其他污染物。 經分離」杬體為自其天然環境之組分識別及分離及/ 或回收之抗體。其天然環境之污染組分為可干擾抗體之診 斷或治療用途之物質，且可包括酶、激素及其他蛋白質或 非蛋白質溶質。在較佳實施例中，該抗體⑴如藉由 方法所測定，為純度大於95重量％，且最佳大於99重量％ 15I365.doc -26 · 201125581 之抗體；（2)其純度足以藉由使用旋杯式序列測定儀獲得至 少15個殘基之N末端或内部胺基酸序列；或（3)藉由s〇s_ PAGE ’在還原條件或非還原條件下，使用庫馬斯藍 (Coomassie blue)或較佳銀染色法，測得其達均質純度。由 於抗體之天然環境不會出現至少一種組分，因此經分離抗 體會包括處於重組細胞内原位之抗體。 術語「多肽」或「蛋白質」意謂具有天然蛋白質序列的 分子’亦即由天然存在及特定言之非重組細胞、或遺傳工 程改造細胞或重組細胞產生之蛋白質，及包含具有天然蛋 白質胺基酸序列的分子或天然序列缺失、添加及/或取代 一或多個胺基酸的分子。特定言之，術語「多肽」及「蛋 白質」涵蓋抗NGF抗體’或抗NGF抗體缺失、添加及/或取 代一或多個胺基酸之序列。 術語「多肽片段」係指具有胺基末端缺失、羧基末端缺 失及/或内部缺失之多肽。在某些實施例中，片段為至少5 至約500個胺基酸長。應瞭解，在某些實施例中，片段為 至少 5、6、8、10、14、20、50、70、100、110、150、 200 ' 250 ' 3 00、3 50、400或450個胺基酸長。特定適用之 多肽片段包括功能性結構域，包括結合域。在抗NGF抗體 之情形中，適用片段包括（但不限於）CDr區、重鏈或輕鏈 之可變域、抗體鏈之一部分或僅其包括兩個CDR之可變 區、及其類似物。 術語「特異性結合劑」係指特異性結合至標靶之天然或 非天然分子。特異性結合劑之實例包括（但不限於）蛋白 151365.doc •27· 201125581 質、肽、核酸、碳水化合物及脂質。在某些實施例中，特 異性結合劑為抗體。 術語「NGF之特異性結合劑」係指特異性結合1^〇17之任 何部分的特異性結合劑。在某些實施例中，NGF2特異性 結合劑為特異性結合至NGF的抗體。 如本文所用之術語「免疫功能性免疫球蛋白片段」係指 至少含有免疫球蛋白重鏈及輕鏈之CDR的多肽片段。本發 明之免疫功能性免疫球蛋白片段能夠結合至抗原。在較佳 實施例_，抗原為特異性結合至受體之配位體。在此等實 施例中，、结合本發明之免疫功能性免疫球蛋白片段可防止 配位體與其受體結合、中斷由受體結合至配位體產生的生 物反應。本發明之免疫功能性免疫球蛋白片段較佳特異性 結合至NGF。片段最佳特異性結合至人類NGF。 如本文所用且應用於物體之術語「天然存在」係指物體 可在自然界令發現。舉例而言，存在於可從自然界中之來 源分離之生物體（包括病毒）中且未經人類有意修飾的多肽 或聚核苷酸序列為天然存在的。 術§吾「可操作地連接」意謂應用該術語之組分處於允許 其在適合條件下執行其固有功能的關係中。舉例而言， 「可操作地連接」至蛋白質編碼序列之控制序列與蛋白質 編碼序列接合使得在與控制序列之轉錄活性相容的條件下 表現蛋白質編碼序列。 如本文所用之術「控制序列」係指可實現其所接合之 編碼序列的表現、處理或胞内定位之聚核普酸序列。該等 15I365.doc -28- 201125581 控制序列之種類可視宿主生物體而定。在特定實施例中， 原核生物之控制序列可包括啟動子、核糖體結合位點及轉 錄終止序列。在其他特定實施例中，真核生物之控制序列 可包括啟動子（包含_種或複數種針對轉錄因子之辨識位 點）、轉錄強化子序列、轉錄終止序列及聚腺苷酸化序 列。在某些實施例中，「控制序列」可包括前導序列及/或 融合搭配序列。 本文k及之術語「聚核苷酸」意謂長度為至少丨〇個核苷 酸之單股或雙股核酸聚合物。在某些實施例中，包含聚核 皆酸之核苷酸可為核糖核苷酸或去氧核糖核苷酸或任一型 式核苷酸的經修飾形式。該等修飾包括鹼基修飾，諸如溴 尿苷（bromuridine);核糖修飾，諸如阿拉伯糖（arabin〇side) 及2·，3二去氧核糖；及核苷酸間的鍵修飾，諸如硫代鱗酸 酯、二硫代鱗酸酯、砸代構酸酯、二确代峨酸酯、苯胺硫 代磷酸酯、苯胺麟酸酯及鱗醯胺酸。術語「聚核苷酸」特 定包括DNA之單股及雙股形式。 本文提及之術語「寡核苷酸」包括天然存在之核苷酸及 藉由天然存在及/或非天然存在之寡核苷酸鍵連接在一起 的經修飾核苷酸。寡核苷酸為包含一般為單股且長度為 200個或200個以下核苷酸之成員的聚核苷酸子集。在某些 實施例中，寡核苷酸長度為10至60個核苷酸。在某些實施 例中，寡核苷酸長度為12、13、14、15、16、17、18、19 或20至40個核苷酸。寡核苷酸可為單股或雙股的，例如用 於建構基因突變體。本發明之寡核苷酸可為關於蛋白質編 151365.doc -29- 201125581 碼序列的有義或反義寡核苷酸。 術語「天然存在之核苷酸」包括去氧核糖核苷酸及核糖 核苷酸。術語「經修飾核苷酸」包括具有經修飾或經取代 糖基及其類似物之核苷酸。術語「寡核苷酸鍵」包括諸如 硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸 酯、苯胺硫代磷酸酯、苯胺磷酸酯、磷醯胺酸及其類似物 之寡核苦酸鍵。參看例如LaPlanche等人，1986，TVmc/. Acids Res., 14:9081 ; Stec 等人，1984, J. Am. Chem. Soc., 106:6077 ; Stein 等人，1988, Nucl. Acids Res., 16:3209 ; Zon等人，1991, Drwg Dehgw，6:539 ; Zon等 人，1991，OLIGONUCLEOTIDES AND ANALOGUES: A PRACTICAL APPROACH,第 87-1 08 頁（F. Eckstein編）， Oxford University Press, Oxford England ; Stec等人，美國 專利第 5,1 5 1，5 10 號；Uhlmann 及 Peyman，1990, Chemical 及90:543，為了任何目的，其揭示内容以引用的方 式併入本文中。募核苷酸可包括可偵測標記使能夠偵測寡 核苷酸或其雜交。 術語「載體」包括一種核酸分子，其能夠轉運另一已與 其連接之核酸。一種類型之載體為「質體」，其係指可接 合其他DNA區段之環狀雙股DNA環。另一類型之載體為病 毒載體，其十可將其他DNA區段接合至病毒基因組中。某 些載體能夠在引入該等載體之宿主細胞中自主複製（例如 具有細菌複製起點之細菌載體及游離型哺乳動物載體）。 其他載體（例如非游離型哺乳動物載體）可在引入宿主細胞 151365.doc •30· 201125581 中之後整合至宿主細胞之基因組中，藉此與宿主基因組一 起複製。此外，某些載體能夠指導與其可操作地連接之基 因的表現。該等載體在本文中稱為「重組表現載體」（或 簡稱為「表現載體」）。一般而言，適用於重.DNA技術 中之表現載體通常呈質體形式。在本說明書中，因為質體 為載體之最常用形式，所以「質體」與「載體」可互換使 用。然而，本發明意欲包括表現載體之該等其他形式，諸 如病毒載體（例如複製缺陷反轉錄病毒、腺病毒及腺相關 病毒），其提供等效功能。
片語「重組宿主細胞」（或簡稱為「宿主細胞」）包括已 引入重組表現載體之細胞。熟習此項技術者應理解，該等 術語不僅欲指特定個體細胞，而且亦指該細胞之子代。因 為可能因突變或環境影響而在繼代中發生某些修飾，所以 該子代實際上可能與親本細胞不同，但其仍包括在如本文 所用之術S吾「宿主細胞」之範_内。多種宿主表現系統可 用於表現本發明抗體，包括細菌、酵母、桿狀病毒及哺乳 動物表現系統（以及嗟菌體呈現表現系統）。適合細菌表現 載體之實例為puc 1 9。為重組表現抗體，以攜有編碼抗體 免疫球蛋白輕鏈及重鏈之DNA片段的一或多個重組表現載 體轉染宿主細胞’使得輕鏈及重鏈在宿主細胞中表現且較 佳使其分泌至培養宿主細胞之培養基中，自該培養基中可 回收該等抗體*使用標準重組DNA方法獲得抗體重鏈及輕 鏈基因’將此等基因併入重組表現載體中且將該等載體引 入侣主細胞中，諸如Sambrook等人，2001，MOLECULAR 151365.doc 201125581 CLONING, A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratories，Ausubel，F.M.等人（編）Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing Associates，(1989)及 Boss等人之美國專利第4,816,397號中所述者》 術語「宿主細胞」係用於指已用核酸序列轉型或能夠用 核酸序列轉型且接著能夠表現所關注之所選基因的細胞。 該術語包括親本細胞之子代，不管子代在形態學或遺傳構 成上與原始親本細胞相同與否，只要所選基因存在即可。 術語「轉導」係用於指一般藉由噬菌體將基因自一細菌 轉移至另一細菌。「轉導」亦係指藉由反轉錄病毒獲得及 轉移真核細胞序列。 術語「轉染」係用於指細胞吸收外來或外源性DNA，且 當外源性DNA引入至細胞膜内部時，細胞經「轉染」。多 種轉染技術在此項技術中熟知且揭示於本文申。參看例如 Graham等人，1973，Virology 52:456 ; Sambrook等人，2001, MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratories ; Davis等人，1986，BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Elsevier ;及Chu等人，1981，Gene 13:197。該等技術可用於向適合宿主細胞中引入一或多個 外源性DNA部分。 如本文所用之術語「轉型」係指細胞遺傳特徵之改變， 且當細胞經修飾以含有新DNA時，細胞經轉型。舉例而 言，當細胞自其天然態經遺傳修飾時，細胞經轉型。在轉 染或轉導後，轉型DNA可藉由實體整合至細胞染色體中與 15I365.doc -32- 201125581 細胞之DNA重組，或可短暫保持為未經複製之游離型元 件’或可以質體形式獨立複製。當DNA隨細胞分裂而複製 時’認為細胞已穩定轉型。 術語「天然存在」或「天然」當與諸如核酸分子、多 狀、宿主細胞及其類似物之生物物質結合使用時係指在自 然界中可發現且未經人類操縱之物質。同樣，如本文所用 之「非天然存在」或「非天然」係指在自然界中未發現或 已由人類在結構上修飾或合成之物質。 術語「抗原」係指能夠經選擇性結合劑（諸如抗體）結 合’且另外能夠在動物中使用以產生能夠結合至彼抗原之 抗原決定基之抗體的分子或分子部分。抗原可具有一或多 個抗原決定基。 如此項技術中已知，術語「一致性」係指兩個或兩個以 上多肽分子或兩個或兩個以上核酸分子之序列之間藉由比 較其序列所測定的關係。在此項技術中，「一致性」亦意 明如兩個或兩個以上核苷酸或兩個或兩個以上胺基酸序列 的鏈之間的匹配所測定，核酸分子或多肽之間視情況而定 的序列關聯程度。「一致性」測量兩個或兩個以上序列之 間的一致匹配百分比，其中藉由特定數學模型或電腦程式 (亦即「演算法」）處理間隙比對（若存在）。 術相似性」在此項技術中關於相.關概念使用，但與 一致性」形成對比，「相似性」係指關聯性之量度，包 括一致匹配及保守取代匹配。若兩個多肽序列具有例如 10/20個相同胺基酸，且其餘均為非保守取代，則一致性 151365.doc -33- 201125581 及相似性百分比將皆為50%。若在同一實例中，另外有5 個位置存在保守取代，則一致性百分比仍為50%，但相似 性百分比將為75%(1 5/20)。因此，在存在保守取代之情形 中，兩個多肽之間的相似性百分比將高於該兩個多肽之間 的一致性百分比。 相關核酸及多肽之一致性及相似性可藉由已知方法容易 地計算。該等方法包括（但不限於）COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY, (Lesk，A.M.編），1988，Oxford University Press, New York ； BIOCOMPUTING: INFORMATICS AND GENOME PROJECTS，（Smith, D.W.編），1993, Academic Press, New York ； COMPUTER ANALYSIS OF SEQUENCE DATA,第 1部分，（Griffin，A.M.及 Griffin，H.G_ 編），1994, Humana Press, New Jersey ； von Heinje, G., SEQUENCE ANALYSIS IN MOLECULAR BIOLOGY, 1987, Academic Press ; SEQUENCE ANALYSIS PRIMER，（Gribskov, M.及 Devereux, J·編），1991，M. Stockton Press，New York ; Carillo 等 人，1988，J. MW/z.，48:1073 ;及Durbin等人， 1998， BIOLOGICAL SEQUENCE ANALYSIS, Cambridge University Press 中所述者 e 測定一致性之較佳方法經設計以得到所測試序列之間的 最大匹配。測定一致性之方法描述於可公開獲得之電腦程 式中。測定兩個序列之間的一致性之較佳電腦程式方法包 括（但不限於）GCG程式封裝，包括GAP(Devereux等人， 1984, Nucl. Acid. Res., 12:387 ； Genetics Computer Group, 151365.doc •34- 201125581
University of Wisconsin, Madison, WI) 、BLASTP 、 BLASTN 及 FASTA(Altschul 等人，1990，·/· Mo/_ 5io/·， 215:403-410)。BLASTX程式可自美國國家生物技術資訊 中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI)及 其他來源（BLAST Manual, Altschul 等人 NCB/NLM/NIH Bethesda，MD 20894 ; Altschul等人，1990，上文）公開獲 得。熟知的Smith Waterman演算法亦可用於測定一致性β 某些比對兩個胺基酸序列之比對流程可導致僅匹配兩個 序列之短區域，且此小的比對區可具有極高序列一致性， 即使兩個全長序列之間無顯著關係。因此，在某些實施例 中，所選比對法（GAP程式）將導致跨越標靶多肽之至少50 個相鄰胺基酸的比對。
舉例而言，使用電腦演算法GAP(Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI) » 比對待要 測定序列一致性百分比之兩個多肽以最佳匹配其各別胺基 酸（如演算法所測定，「匹配跨距」）。在某些實施例中，與 演算法一起結合使用間隙開放罰分（其計算為平均對角線 的3倍；其中「平均對角線」為所用比較矩陣之對角線平 均值；「對角線」為特定比較矩陣分配給各完全胺基酸匹 配之評分或數值）及間隙延伸罰分（其一般為間隙開放罰分 的1/10)、以及諸如PAM250或BLOSUM 62之比較矩陣。在 某些實施例中，演算法亦使用標準比較矩陣（參看針對 PAM 250 比較矩陣的 Dayhoff等人，1978，Α/α·? o/iWek Sequence and Structure, 5:345-352 ； BLOSUM 62it^L 151365.doc -35- 201125581 矩陣的 Henikoff等人 ’ 1992，7V〇c. w".上如.USA， 89:10915-10919)。 在某些實施例中’多肽序列比較之參數包括.以下： 演算法：Needleman等人，1970，/ Μο/ϋ/·, 48:443-453 ; 比較矩陣：來自上文Henikoff等人，1992之BLOSUM 62 ; 間隙罰分：12 間隙長度罰分：4 相似性臨限值：0 GAP程式可能適用於上述參數。在某些實施例中，上述 參數為使用GAP演算法進行多肽比較（連同對於末端間隙 無罰分）的預設參數。 術s吾「同源性」係指蛋白質或核酸序列之間的相似性程 度。同源性資訊適用於理解特定蛋白質或核酸種類之遺傳 學關聯。可藉由比對及比較序列來測定同源性。通常，將 蛋白質序列與已知蛋白質序列的資料庫比較來測定胺基酸 同源性《同源序列在其序列某處具有共同功能一致性。高 度相似性或一致性為同源性之一般指示，儘管低程度相似 性或一致性並非必然指示缺乏同源性。 可使用若干方法比較一序列之胺基酸與另一序列之胺基 酸以測定同源性。一般而言，該等方法分為兩類·· 〇)比較 諸如極性、電荷及凡得瓦爾體積（Van der Waals volume)之 物理特徵以產生相似性矩陣；及（2)比較序列中之胺基酸經 任一其他胺基酸的可能取代，此基於對許多來自已知同源 蛋白質之蛋白質序列的觀測，且產生可接受點突變矩陣 151365.doc -36- 201125581 (PAM)。 亦可藉由使用程式針（program needle)(EMBOSS封裝）或 延伸子（stretcher)(EMBOSS封裝）或載體NTI套件9.0.0軟體 封裝模組形式之程式比對（program align)X，使用預設參數 (例如GAP罰分5、GAP開放罰分15、GAP延伸罰分6.6)計算 一致性百分比。 如本文所使用’二十種習知胺基酸及其縮寫沿用習知用 法。參看 IMMUNOLOGY--A SYNTHESIS，第 2版，（E_ S. Golub 及D. R. Gren編），Sinauer Associates: Sunderland，ΜΑ, 1991，為 了任何目的’其以引用的方式併入本文中。二十種習知胺 基酸之立體異構體（例如D-胺基酸）、非天然胺基酸（諸如 α'α"一取代之胺基酸）、Ν-院基胺基酸、乳酸及其他非習知 胺基酸亦可為本發明多肽之適合組分。非習知胺基酸之實 例包括：4-羥基脯胺酸、γ_羧基麩胺酸、ε·Ν，Ν,Ν_三甲基 離胺酸、ε-Ν-乙醯基離胺酸、〇_磷酸絲胺酸、Ν_乙醯基絲 胺酸、Ν-甲醯基曱硫胺酸、3-甲基組胺酸、5-羥基離胺 酸、σ-Ν-曱基精胺酸及其他類似胺基酸及亞胺基酸（例如4_ 羥基脯胺酸）。在本文所用之多肽記法中，根據標準用法 及慣例’左手方向為胺基末端方向而右手方向為羧基末端 方向。 天然存在之殘基可基於共同側鍵特性分類： 1) 疏水性：正白胺酸（N〇r)、Met、Ala、Val、Leu、 lie、Phe、Trp、Tyr、Pro ; 2) 極性親水性：Arg、Asn、Asp、Gin、Glu、His、 151365.doc -37- 201125581
Lys、Ser、Thr ; 3) 月日族.Ala、Gly、lie、Leu、Val、Pro ; 4) 月曰族疏水性：Ala、lie、Leu、Val、Pro ; 5) 中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gin ; 6) 酸性：Asp、Glu ; 7) 驗性：jjis、Lys、Arg ; 8) 影響鍵定向之殘基：Gly、Pro ; 9) 族：His、Trp、Tyr、Phe ;及 l〇)芳族疏水性：Phe、Trp、Tyr。 保守性胺基酸取代可涉及將一個此等種類中之— 战員換 成同一種類之另一成員。保守性胺基酸取代可涵蓋通常藉 由化學肽合成而非藉由生物系統中之合成併入的非天然存 在之胺基酸殘基。此等包括肽模擬物，及胺基酸部分之其 他反向或反相形式。 非保守性取代可涉及將一個此等種類中之一成員換成另 一種類中之一成員。該等經取代殘基可引入至與非人類抗 體同源之人類抗體區域中，或引入至分子的非同源區^ 中〇 根據某些實施例，在作出該等改變時，可考慮胺基酸之 親水指數。已基於各胺基酸之疏水性及電荷特徵向其分配 親水指數。其為：異白胺酸（+4·5);纈胺酸（+42);白胺酸 (+3.8);苯丙胺酸（+2.8);半胱胺酸/胱胺酸（+25);甲硫胺 酸（+1.9);丙胺酸（+1.8);甘胺酸（_〇·4);蘇胺酸（_〇 7);絲 胺酸（-0.8);色胺酸（-0.9);酪胺酸（-Μ);脯胺酸（·16); 151365.doc •38· 201125581 組胺酸（-3.2)，麵胺酸（-3.5);楚醯胺酸（_3 5);天冬胺酸 (-3.5) ’天冬醒胺（-3.5);離胺酸（_3 9);及精胺酸（_4 5)。 此項技術中應理解胺基酸親水指數在賦予蛋白質以相互 作用生物功能中之重要性（參看例如Kyte等人，1982，乂 Mo/. 157:105-131)。已知某些胺基酸可取代為具有類 似親水指數或評分且仍保持類似生物活性之其他胺基酸。 在某些貫施例中，在基於親水指數進行改變時，親水指數 在±2内之胺基酸取代包括在内。在某些實施例中，在土 之胺基酸取代包括在内，且在某些實施例中，在±〇5内之 胺基酸取代包括在内。 此項技術中亦應理解’如本文所揭示，可基於親水性有 效進行類似胺基酸之取代，當藉此形成之生物功能蛋白質 或肽欲用於免疫學實施例中時尤其如此。在某些實施例 中’蛋白質的最大局部平均親水性取決於其相鄰胺基酸之 親水性’且與其免疫原性及抗原性相關，亦即與蛋白質之 生物特性相關。 此等胺基酸殘基已分配以下親水性值：精胺酸（+3 〇); 離胺酸（+3.0);天冬胺酸（+3.0 ± 1);麵胺酸（+3.0 ± 1);絲 胺酸（+0.3);天冬醯胺（+〇·2);麩醯胺酸（+0.2);甘胺酸 (〇);蘇胺酸（-0.4);脯胺酸（-0.5 ± 1);丙胺酸（-0.5);組胺 酸（-0.5);半胱胺酸（-ΐ·〇);曱硫胺酸;纈胺酸（4.5); 白胺酸（-1.8);異白胺酸（-1.8);酪胺酸（·2.3);苯丙胺酸 (-2.5)及色胺酸（-3.4)。在某些實施例中，在基於類似親水 性值進行改變時，親水性值在±2内的胺基酸之取代包括在 151365.doc •39· 201125581 内，在某些實施例中，在±ι内的胺基酸之取代包括在内， 且在某些實施例中，在±0.5内的胺基酸之取代包括在内。 亦可基於親水性識別來自一級胺基酸序列之抗原決定基。 此等區域亦稱為「抗原決定基核心區域」。 例示性胺基酸取代闡述於表1中。 表1 胺基酸取代 初始殘基 例示性取代 較佳取代 Ala Val、Leu、lie Val Arg Lys、Gin、Asn Lys Asn Gin Gin Asp Glu Glu Cys Ser、Ala Ser Gin Asn Asn Glu Asp Asp Gly Pro 、 Ala Ala His Asn、Gin、Lys、Arg Arg lie Leu、Val、Met、Ala、 Phe、正白胺酸 Leu Leu 正白胺酸、lie、Val、Met、 Ala、Phe lie Lys Arg、1，4 二胺基-丁酸 Acid、Gin、Asn Arg Met Leu、Phe、lie Leu Phe Leu、Val ' lie、Ala、Tyr Leu Pro Ala Gly Ser Thr、Ala、Cys Thr Thr Ser Ser Trp Tyr、Phe Tyr Tyr Trp、Phe、Thr、Ser Phe Val lie、Met、Leu、Phe、Ala、 正白胺酸 Leu 習此相關技藝之人士將能夠使用熟知技術確定如本文所 述之多肽的適合變異體。在某些實施例中，熟習此項技術 者可藉由靶向並非認為對活性重要之區域來識別可改變但 •40· 151365.doc 201125581 不會破壞活性之分子適合區域。在其它實施例中，習此相 關技藝之人士可識別在類似多肽中保守之分子殘基及部 分。在其他實施例中，甚至對生物活性或對結構重要之區 域可經受保守胺基酸取代而不破壞生物活性或不會不利影 響多肽結構。 另外，熟習此項技術者可回顧識別類似多肽中對活性或 結構重要之殘基的結構-功能研究β雲於該比較，習此相 關技藝之人士可預測在一蛋白質中與類似蛋白質中對活性 或結構重要之胺基酸殘基對應之胺基酸殘基的重要性。 習此項技術者可針對該等預測之重要胺基酸殘基選擇化學 上類似之胺基酸取代。 熟習此項技術者亦可分析與類似多肽中之三維結構相關 的三維結構及胺基酸序列。鑒於該資訊，熟習此項技術者 可關於其三維結構預測抗體之胺基酸殘基的比對。在某些 實施例中，熟習此項技術者可選擇不對經預測位於蛋白質 表面上之胺基酸殘基作出根本改變，因為該等殘基可能涉 及與其它分子之重要相互作用。此外，熟習此項技術者可 產生在每一所要胺基酸殘基處含有單一胺基酸取代之測試 變異體。該等變異體接著可使用熟習此項技術者已知之活 性分析進行篩選。該等變異體可用於搜集關於適合變異體 之資訊。舉例而言，若發現對特定胺基酸殘基之改變導致 受損的、非所要減少的或不當活性，則可避免具有該改變 之變異體。換言之，基於自該等常規實驗搜集之資訊，熟 習此項技術者可容易地判定應避免單獨或與其它突變組合 151365.doc •41 · 201125581 之其他取代的胺基酸。 許多科學出版物已致力於二級結構之預測。參看Moult, 1996, Curr. ζ·«价oiec/z· 7:422-427 ; Chou 等人，1974, 13:222-245 ; Chou 等人，1974，少 113:211-222 ; Chou等人，1978，•EwzjvTwo/.ee/ai.dreosMo/· 价ο/. 47:45-148 ; Chou等人，1979, /^v. 47:25卜 276 ;及Chou等人，1979,所·/· 26:367-384。此外，目前 可使用電腦程式輔助預測二級結構。一種預測二級結構之 方法係基於同源模擬法。舉例而言，具有大於30%序列一 致性或大於40%相似性之兩個多肽或蛋白質通常具有類似 結構佈局。蛋白質結構資料庫（PDB)之近期發展提高了對 二級結構（包括多肽或蛋白質結構内潛在的摺疊數）之可預 測性。參看Holm等人，1999, iVMc/· JciW. /?打· 27:244-247。已 提出（Brenner等人，1997，Cwrr. Sirwci.价〇/· 7:369-376)， 在既定多肽或蛋白質中存在有限數量的摺疊，且一旦解析 出臨界數目個結構，則結構預測將顯著地變得更加精確。 預測二級結構之其他方法包括「穿線（threading)」 (Jones, 1997，Cwrr. iSirwci. 5ζ·σ/· 7:377-87 ; Sippl等人， 1996，4:15-19)、「型態分析（profile analysis)」 (Bowie等人，1991，》Scie«ce 253:164-170 ; Gribskov等人，1990, Mei/z.五183:146-159 ; Gribskov等人，1987, iVoc. iVai. 84:4355-4358)及「進化連接（evolutionary linkage)」 (參看Holm, 1999，上文；及Brenner，1997，上文）。 在某些實施例中，抗體變異體包括糖基化變異體，其中 151365.doc • 42- 201125581 糖基化位點之數目及/或類型相較於親本多肽之胺基酸序 列有所改變。在某些實施例中’蛋白質變異體包含數目比 天然蛋白質多或少的N連接糖基化位點。n連接糖基化位 點特徵在於以下序列：Asn-X-Ser或Asn-X-Thr，其中指定 為X之胺基酸殘基可為除脯胺酸之外的任何胺基酸殘基。 形成此序列之胺基酸殘基取代提供潛在新位點以供添加N 連接碳水化合物鏈。或者’消除此序列之取代將移除現有 N連接碳水化合物鏈。亦提供N連接碳水化合物鏈之重 排，其中消除一或多個N連接糖基化位點（通常為天然存在 之位點）且形成一或多個新的N連接位點。其他較佳抗體變 異體包括半胱胺酸變異體，其中與親本胺基酸序列相比， 缺失一或多個半胱胺酸殘基或一或多個半胱胺酸殘基取代 為另一胺基酸（例如絲胺酸）。當抗體在諸如分離不溶性包 涵體後必需再指疊為生物活性構形時，半胱胺酸變異體可 能適用。半胱胺酸變異體一般具有比天然蛋白質少的半胱 殘基’且通常具有偶數以使由未成對半耽胺酸產生的 相互作用降至最低。 在其他實施例中’抗體變異體可包括包含經修飾Fc片段 或經修飾重鏈恆定區之抗體。可藉由突變修飾代表「結晶 之片段」的F c片段或重鏈恆定區從而賦予抗體以改變之結 合特徵。參看例如 Burton 及 Woof, 1992, Advances in 51: 1-84 ; Ravetch&Βο11αη(1,2001，^«Μ.πβν· 19: 275_90 ; Shields等人，2001，o/扪o/.
Chew 276: 6591-6604 ; Telleman 及 Junghans, 2000, 151365.doc •43· 201125581
Immunology 100: 245-251 ; Medesan 等人，1998, Eur. J. /mww加厂28: 2092-2100 ;其均以引用的方式併入本文 中）。該等突變可包括取代、添加、缺失或其任何組合， 且通常藉由根據本文所述之方法以及根據此項技術中已知 之方法使用一或多個誘突變寡核苷酸進行的定點突變誘發 產生（參看例如 Sambrook等人，MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL,第 3版，2001，Cold Spring Harbor， N.Y.以及 Berger及Kimmel，METHODS IN ENZYMOLOGY，第 152卷，Guide to Molecular Cloning Techniques, 1987，Academic Press, Inc.，San Diego, CA·，其以引用的方式併入本文中）。 根據某些實施例，胺基酸取代為以下取代：（1)減少對 蛋白水解之易感性，（2)減少對氧化之易感性，（3)改變形 成蛋白質複合物之結合親和力，（4)改變結合親和力及/或 (5)賦予或修飾該等多肽的其它物理化學或功能特性。根據 某些實施例，單個或多個胺基酸取代（在某些實施例中為 保守胺基酸取代）可於天然存在之序列中進行（在某些實施 例中，在形成分子間接觸之結構域之外的多肽部分中）。 在較佳實施例中，保守胺基酸取代通常不會實質上改變親 本序列之結構特徵（例如置換胺基酸不應趨向於損壞親本 序列中存在的螺旋或破壞表徵親本序列之其它類型的二級 結構）。此項技術中公認之多肽二級及三級結構之實例描 述於 PROTEINS，STRUCTURES AND MOLECULAR PRINCIPLES， (Creighton編），1984，W. H. Freeman and Company，New York ; INTRODUCTION TO PROTEIN STRUCTURE (C. Branden及J. 151365.doc -44- 201125581
Tooze 編），1991，Garland Publishing, New York, Ν.Υ ;及 Thornton等人，1991，354:105中，其各以引用的方气 併入本文中。 在醫藥行業中，肽類似物通常用作特性與模板肽類似的 非肽藥物。此等類型之非肽化合物稱為「肽模擬物」。參 看 Fauchere，1986，Adv_ Drug Res. 15:29 ; Veber & Freidinger, 1985，7ms第 392 頁；及 Evans 等人。1987，J. Med. Chem. 30:1229，為了任何目的，其以引用的方式併入本文中。 該等化合物通常藉助於電腦化分子模型開發。結構上類似 於治療學上適用之肽的肽模擬物可用以產生類似治療或防 治效果。一般而言，肽模擬物結構上類似於範例多肽（亦 即具有生物化學特性或藥理學活性之多肽），諸如人類抗 體’但一或多個肽鍵視情況藉由此項技術中熟知之方法經 選自以下之鍵置換：-CH2-NH-、-CH2-S-、、 -CH = CH-(順式及反式）' _c〇CH2_、_CH(〇H)CH2 及 -CH2SO-。在某些實施例中’可使用相同類型之D_胺基酸 系統性取代共同序列之一或多個胺基酸（例如D—離胺酸代 替L-離胺酸）產生更穩定之肽。此外，包含共同序列或實 質上相同之共同序列變化的限制性肽可由此項技術中已知 之方法產生（Rizo & Gierasch，1992, Bioc/zew. 61:3 87 ,為了任何目的，其以引用的方式併入本文中），例 如藉由添加能夠形成使肽環化之分子内二硫橋鍵的内部半 胱胺酸殘基。 「抗體」或「抗體肽」係指完整抗體或與完整抗體競爭 151365.doc •45- 201125581 特異性結合之其結合片段。在某些實施例中，結合片段係 藉由重組難技術產生。在其他實施例中，結合片段传藉 由酶促裂解或化學裂解完整抗體產生。結合片段包括(； 不限於）F(ab)、F(ab，）、F(ab，)2、Fv 及單鍵抗體。 術語「重鍵」包括具有足夠可變區序列以賦予對廳之 特異性的任何免疫球蛋白多肽。術語「輕鏈」包括具有足 夠可變區序列以賦予對NGF之特異性的任何免疫球蛋白多 肽。全長重鏈包括可變區結構域％及三個恒定區結構域 CH1、Ch2及Ch3。νΗ結構域處於多肽之胺基末端，且 結構域處於羧基末端。如本文所用之術語「重鏈」涵蓋全 長重鏈及其片段。全長輕鏈包括可變區結構域乂及恆定區 結構域CL。與重鏈一樣，輕鏈之可變區結構域處於多肽之 胺基末端。如本文所用之術語「輕鏈」涵蓋全長輕鏈及其 片段。F(ab)片段包含一個輕鏈、及一個重鏈之Ch1與可變 區。F(ab)分子之重鏈不能與另一重鏈分子形成二硫鍵。 F(ab')片段含有一個輕鏈及一個含有Ch丨與Ch2結構域之間 的大部分值定區之重鏈，使得可在兩個重鏈之間形成鍵間 二硫鍵，從而形成F(ab’）2分子。Fv區包含來自重鏈及輕鏈 之可變區’但缺乏恆定區。單鏈抗體為重鏈及輕鏈可變區 經可撓性連接子連接形成單個多肽鏈的Fv分子，該單個多 狀鏈可形成抗原結合區。單键抗體詳細論述於國際專利申 請公開案第|〇 88/01649號以及美國專利第4 946,778號及 第 5,260,203號中。 在某些實施例中’除「多特異性」或「多功能」抗體之 I51365.doc -46- 201125581 外的二價抗體應理解為包含之結合位點具有相同抗原特異 性。 在根據本發明評定抗體結合及特異性時，當過量之抗體 使得與受體結合之配位體的量減少至少約2〇β/。、4〇%、 60%、80%、85%或85。/。以上時（尤其如使用活體外競爭性 結合分析所測得），抗體實質上抑制配位體與受體黏著。 「中和抗體」意謂能夠阻斷或實質上降低其所結合之標 乾抗原之效應功能的抗體分子。因此，「中和」抗Ngf抗 體能夠阻斷或實質上降低NGF之效應功能，諸如受體結合 及/或引起細胞反應。「實質上降低」欲意謂降低標靶抗原 (例如人類NGF)的至少約60%、較佳至少約70%、更佳至少 約75%、甚至更佳至少約80%、仍更佳至少約85%、最佳 至少約90%效應功能。 術語「抗原決定基」包括能夠特異性結合至免疫球蛋白 或Τ細胞受體之任何決定子，較佳多肽決定子。在某些實 施例中’抗原決疋基決定子包括分子之化學活性表面基 團，諸如胺基酸、糖側鏈 '磷醯基或磺醯基；且在某些實 施例中，其可具有特定三維結構特徵及/或特定電荷特 徵。抗原決定基為抗體所結合之抗原區。在某些實施例 中，當抗體在蛋白質及/或大分子之複雜混合物中優先識 別其標靶抗原時，則稱抗體特異性結合抗原。在較佳實施 例中，當平衡解離常數U0-8 ；^時，更佳當平衡解離常數 <10.9 Μ時，且最佳當平衡解離常數^1〇-1〇厘時，則稱抗體 特異性結合抗原。 151365.doc -47- 201125581 田抗體與參考抗體辨識相同或空間上重疊之抗原決定基 時兩個抗體結合「基本上相同之抗原決定基」。判定兩 個抗體是否結合相同或空間上重疊之抗原決定基的最廣泛 使用且最快速之方法為競爭分析，其可使用經標記抗原或 ，標記㈣以所有不同型式經組態。-般而言，將抗原固 定於受質上’且使用放射性標記或酶標記測量未經標記之 抗體阻斷經標記抗體之結合的能力。 本文所用之術3吾「藥劑」表示化合物、化合物之混合 物、生物大分子或由生物材料製備之提取物。 如本文所用，術語「標記」或「經標記」係指例如藉由 併入經放射性標記之胺基酸或連接至可被經標記抗生物素 蛋白(例如抗生蛋白鏈菌素，其較佳包含可偵測標記物， 諸如螢光標記物、化學發光標記物或光學方法或比色法可 偵測之酶活性）偵測到的生物素部分之多肽，從而併入可 偵測標記物。在某些實施例中，標記亦可為治療性的。此 項技術中已知標記多肽及醣蛋白之多種方法，且該等方法 可有利地用於本文揭示之方法中。用於多肽之標記的實例 包括（但不限於）以下··放射性同位素或放射性核素（例如 3H、14C、15N、35S、90Y、"mTc、111ΐη、125ι、131】广螢光 標記（例如異硫氰酸螢光素或FITC、若丹明（rh〇damine)或 鑭系金屬磷光體）、酶促標記（例如辣根過氧化酶、p_半乳 糖苷酶、螢光素酶、鹼性磷酸酶）；化學發光標記；半抗 原標記，諸如生物素基團；及由二級報導體辨識之預定多 肽抗原決定基（例如白胺酸拉鏈對序列、二級抗體之結合 151365.doc -48· 201125581 位點、金屬結合域或抗原決定基標籤）。在某些實施例 中’標記可經各種長度之間隔臂（諸如（CH2)n，其十〇<約 2〇)連接以降低可能之位阻。 i抬（但不限於）任何量 如本文所用之術語「生物樣 的來自活物（living thing)或先前為活物之物質。該等活物 包括（但不限於）人類、小鼠、猴、大鼠、兔及其他動物。 該等物質包括（但不限於）血液、血清、尿液、細胞、器 官、組織、骨骼、骨髓、淋巴結及皮膚。 如本文所用之術語「醫藥劑或藥物」係指當向患者適當 投與時能夠誘發所要治療效果的化合物或組合物。根據本 發明，關☆包含一種或複數種本發明抗體之醫藥組合物的 表述「醫藥學上有效量」應理解為意謂能夠在相關患者體 内消除對外部刺激之靈敏度臨限值降低，使此靈敏度臨限 值回到與健康«中冑測到的程度相冑之程度的該醫藥組 合物之量。 「病症」為將受益於本發明治療之任何病況。「病症」 與「病況」在本文中互換使用且包括慢性及急性ngf介導 之病症或NGF介導之疾病，包括使哺乳動物易患所論述病 症之彼等病理狀況。 術語「NGF介導之疾病」及「卿介導之病況」涵蓋與 NGF含量增加或對NGF敏感性增加相_之任何醫學病況或 病症，包括（但不限於）急,时痛、牙痛、外傷疼痛、外科 疼痛、切除術或膿腫引起之疼痛、灼痛、髓勒脫失病、三 叉神經痛、癌纟、慢性酒精中毒、甲風、丘腦痛症候群、 151365.doc -49. 201125581 糖尿病後天性免疫缺陷症候群（「aids」）、毒素及化學 療法 般性頭痛、偏頭痛、叢集性頭痛、混合性血管及 非血管症候群、緊張性頭痛、全身性發炎、關節炎、風濕 病狼瘡、骨關節炎、發炎性腸病、大腸急躁症、發炎性 眼病發炎性或不穩定膀胱功能障礙、牛皮癖、具有發炎 組为之皮膚病症、曬傷、心臟炎、皮炎、肌炎、神經炎、 膠原血管病、慢性發炎性病況、炎性痛及相關之痛覺過敏 及異常疼痛、神經痛及相關之痛覺過敏及異常疼痛、糖尿 病性神經病變疼痛、灼痛、交感神經維持性疼痛、傳入神 經阻滯症候群、哮喘、上皮組織損傷或功能障礙、單純疱 疹、呼吸、泌尿生殖、腸胃或血管區内臟蠕動紊亂、創 傷、燒傷、過敏性皮膚反應、搔癢、白斑病、一般性腸胃 障礙、結腸炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、血管舒縮性或過 敏性鼻炎或支氣管病症、痛經、消化不良、胃食道逆流、 胰臟炎、及内臟疼痛。 如本文所用，術語「有效量」及「治療有效量」當關於 媒劑或包含一或多種抗N G F人類抗體之醫藥組合物使用時 係指足以產生所要結果（亦即’對於使用媒劑或本發明之 抗人類NGF人類抗體的療法，所要結果為例如發炎及/或疼 痛的所要降低）或支持NGF之一或多種生物活性程度可觀 測降低的量或劑量。更特定言之’治療有效量為在以抗人 類NGF人類抗體活體内治療之個體體内足以抑制一或多種 與組織病況相關的臨床定義之病理學過程（例如發炎或疼 痛）達一段時間的該藥劑之量。在本發明中，「有效量」之 151365.doc -50- 201125581 抗NGF抗體可預防、停止、批制+、少± ^ 识w ut控制或減輕與任何疼痛醫學病 況有關的疼痛感覺。在本發明方法中，術語「控制」及其 語法變體用於指預防、部分或完全抑制、減輕、延遲或減 緩非所要事件’例如疼痛。有效量可視所選特定媒劑或抗 人類驗人類抗體而改變，且亦視與待治療之個體及病症 嚴重程度相關的多種因素及條件而改變。舉例而言，若欲 活體内投與媒劑或抗人類NGF人類抗體，則將考慮諸如患 者之年齡、體重及健康狀況、以及臨床前動物研究中獲得 之劑量反應曲線及毒性㈣之因素。若欲使藥劑與細胞活 體外接觸’則亦將設計多種臨床前活體外研究來評定諸如 吸收、半衰期、劑量、毒性等參數。既定藥劑之有效量或 治療有效量之判定亦在熟習此項技術者能力範圍内。 如本文所用’術語「神經生長因子」及「贿」定義為 所有哺乳動物物種之天料列NGF，包括重組人類卜 120 ’ 如 SEQ ID NO:30 中所示。 如本文所使用，「實質上純」《「實質上經純化」意謂 所存在之主要物質化合物或物質（亦即以莫耳計其比組 合物中之任何其他個別物質均更充足）。在某些實施例 中’實質上經純化之部分為物質佔所存在之所有大分子物 質的至少約50%(以莫耳計)的組合物。在某些實施例中， 實質上純組合物將佔組合物中存在之所有大分子物質的約 80。/。、跳、9G%、95%或99%以上。在某些實施例中將 物質純化至基本上均f (無法藉由f知伯測方法在組合物 中伯測到污染物f)，其中組合物基本上由單—大分子物 151365.doc -51 - 201125581 質組成" 術語「患者」包括人類個體及動物個體。 「治療」係指治療性處理及防治或預防措施。需要治療 者包括已羅患病症者以及傾向於羅患病症者或待要預防病 症者。 除非上下文另外要求’否則單數術語應包括複數且複數 術語應包括單數。 根據本發明之某些實施例’針對NGF之抗體可用於治療 神經疼痛及炎性痛及NGF介導之疾病，包括（但不限於）上 文所述之病症。 在本發明之一態樣中，提供針對人類NGF產生且具有結 合至人類NGF之生物學及免疫學特異性的完全人類單株抗 體。在另一態樣中’本發明提供包含編碼重鏈及輕鏈免疫 球蛋白分子之胺基酸序列之核苷酸序列的核酸，尤其包含 對應於其可變區之序列的核酸。本發明之此態樣的特定實 施例為對應於本發明提供之重鏈及輕鏈的互補決定區 (CDR)之序列，特定言之對應於CDR1至CDR3的序列《在 另一態樣中’本發明提供表現免疫球蛋白分子及抗體、較 佳本發明之單株抗體的融合瘤細胞及細胞株。本發明亦提 供針對人類NGF產生且具有結合至人類NGF之生物學及免 疫學特異性之抗體、較佳單株抗體的生物學及免疫學純化 製劑。 在酵母人工染色體（YAC)中選殖及重建百萬鹼基對尺寸 之人類基因座且將其引入至小鼠生殖系令之能力提供說明 15I365.doc •52· 201125581 極大或未經加工之定位基因座（mapped 1〇ci)的功能性組分 以及產生人類疾病之適用模型的有利方法。此外，利用該 技術以人類等效物取代小鼠基因座提供對在產生、與其他 系統通信、及涉及於疾病誘發及進展的期間表現及調節人 類基因產物的獨特瞭解。 該策略之重要實際應用為使小鼠體液免疫系統「人類 化」。將人類免疫球蛋白（Ig)基因座引入至内源性Ig基因已 滅活之小鼠中提供機會研究構成抗體之程式化表現及總成 以及其於B細胞產生中之作用基礎的機制。此外，該策略 提供產生完全人類單株抗體（MAb)之來源。 術浯「人類抗體」包括具有實質上對應於人類生殖系免 疫球蛋白序列之可變區及恆定區的抗體。在某些實施例 中，人類抗體產生於非人類哺乳動物中，包括（但不限於） 齧齒動物，諸如小鼠及大鼠；以及兔類動物，諸如家兔。 在某些實施例中，人類抗體產生於融合瘤細胞中。在某些 實施例中’人類抗體係重組產生。 關於抗體之術語「重組」包括抗體藉由重組方式製備、 表現、形成或分離。代表性實例包括使用轉染至宿主細胞 中之重組表現載體表現之抗體、自重組、組合人類抗體庫 分離之抗體、自人類免疫球蛋白基因的轉殖基因動物（例 如小鼠）分離之抗體（參看例如Taylor, L.D.等人，7\^/· Λα. 20:6287-6295，（1992));或藉由涉及將人類免疫 球蛋白基因序列拼接至其他DNA序列的任何方式製備、表 現、形成或分離之抗體。該等重組人類抗體具有來源於人 151365.doc •53· 201125581 類生殖系免疫球蛋白序列之可變區及恆定區。 人類抗體具有至少三個優於用於人類療法中之非人類及 嵌合抗體的優勢： 1) 因為抗體之效應部分為人類的，所以其可與人類免 疫系統之其他部分更好的相互作用(例如藉由補體依賴性 細胞’性（CDC)或抗體依賴性細胞毒性（adcc)更有效破壞 標靶細胞）； 2) 人類免疫系統不會將人類抗體辨識為外來抗體，因 此對該注射抗體之抗體反應小於對完全外來非人類抗體或 部分外來嵌合抗體的細胞反應； 3) 已報導注射之非人類抗體在人類循環中之半衰期比 人類抗體之半衰期短的多。注射之人類抗體的半衰期將基 本上與天然存在之人類抗體相同，因而允許給予較小且較 短頻率之劑量。 因此，預期完全人類抗體使小鼠或源自小鼠iMAb固有 之免疫原性及過敏性反應最小化，藉此提高所投與抗體之 功效及安全性。因此，本發明之完全人類抗體可用於治療 慢性及復發性疼痛，其治療需要重複投與抗體。因此，本 發明之抗NGF抗體的一個特定優勢為該等抗體為完全人類 的，且可以非急性方式向患者投與，同時使通常與人類抗 小鼠抗體或其他先前所述之來自非人類物種的不完全人類 抗體相關的不良反應最小化。 熟習此項技術者可以人類][g基因座之大片段對小鼠抗體 產生不足之小鼠品系進行工程改造，使得該小鼠在無小鼠 15J365.doc -54- 201125581 抗體存在下產生人類抗體。人類ig大片段可保持大可變基 因多樣性以及對抗體產生及表現之適當調節。藉由開發用 於抗體多樣化及選擇之小鼠細胞機器且對人類蛋白質缺乏 免疫耐受性，此等小鼠品系中再生之人類抗體譜產生針對 任何所關注抗原（包括人類抗原）之高親和力抗體。使用融 合瘤技術，可產生及選擇具有所要特異性之抗原特異性人 類 MAb。 可採用在無内源性免疫球蛋白產生之情形下，在免疫後 能夠產生人類抗體之完全譜之轉殖基因動物（例如小鼠）。 在該生殖系突變小鼠中轉移人類生殖系免疫球蛋白基因陣 列將導致在抗原攻擊後產生人類抗體（參看例如Jakobovits 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551-2555，（1993); Jakobovits等人，Nature, 362:255-258，（1993) ; Bruggemann等 人，Year in Immun·，7:33 (1993) ; Nature 148:1547-1553 (1994)， Nature Biotechnology 14:826 (1996) ; Gross, J.A·等人，Nature， 404:995-999 (2000);及美國專利第 5,877,397號、第 5,874,299 號、第 5,814,318 號、第 5,789,650 號、第 5,770,429 號、第 5,661,016號、第 5,633,425號、第 5,625，126號、第 5,569,825號 及第5,545,806號（為了所有目的，其各自以全文引用的方 式併入本文中））。人類抗體亦可在噬菌體呈現庫中產生 (Hoogenboom 及 Winter, J. Mol. Biol., 227:3 81 (1992)； Marks等人，J. Mol. Biol·，222:581 (1991))。Cole等人及 Boerner等人之技術亦適用於製備人類單株抗體（Cole等 人，Monoclonal Antibodies and Cancer Therap, Alan R. Liss > 151365.doc -55- 201125581 第 77 頁（1985)及 Boerner 等人，J. Immunol.，147(1).86-95 (1991))。 重組人類抗體亦可經受活體外突變誘發（或當使用人類 Ig序列轉殖基因動物時，經受活體内體細胞突變誘發），因 此重組抗體之VH及VL區胺基酸序列為儘管來源與人類生 殖系VH及VL序列有關但可能在活體内不天然存在於人類 抗體生殖系譜内的序列。 在某些實施例中，習此相關技藝之人士可在該小鼠中使 用來自除人類以外之物種的恆定區以及人類可變區來產生 嵌合抗體。 天然存在之抗體結構
天然存在之抗體結構單元通常包含四聚體。各該四聚體 通常由兩個相同多肽鏈對構成，各對具有一個完全長度 輕」鏈（通常具有約25 kDa之分子量）及一個完全長度 「重」鏈（通常具有約50 — 70 kDa之分子量卜各輕鏈及重鏈 之胺基末端部分通常包括具有約1〇〇至u〇個或u〇個以上 胺基酸之可變區’該可變區通常負責抗原識別。各鏈之羧 基末端部分通常界定負責效應功能之恆定區。人類輕鏈通 常分類為κ輕鏈及λ輕鏈。重鏈通常分類為μ、δ、γ、α或 ε，且將抗體同型分別定義為IgM、IgD、IgG、IgA及IgE。 IgG具有若干子類，包括（但不限於）IgGl、IgG2、IgG3及 IgG4。IgM具有包括（但不限於）IgM1及IgM2之子類。IgA 類似地再分為包括（但不限於）1§八丨及1§八2之子類。在全長 輕鍵及重鏈内’可變區與恆定區通常由具有約12個或12個 151365.doc -56- 201125581 以上胺基酸之「j」區連接，其中重鏈亦包括約10個以上 胺基酸之「D」區。參看例如FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY， 第 7章，第 2版，（Paul, W.編），1989, Raven Press，N.Y.(為 了所有目的，以全文引用的方式併入）。各輕鏈/重鏈對之 可變區通常形成抗原結合位點。 可變區通常展現相對保守構架區（FR)由三個高變區（亦 稱為互補決定區或CDR)連接之相同一般結構。來自各對 之兩條鏈的CDR通常由可使能夠結合至特異性抗原決定基 之構架區對準。自N末端至C末端，輕鏈及重鏈可變區通 常包含結構域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3 及 FR4。通常根據Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest 之定義（1987 及 1991，National Institutes of Health, Bethesda，Md.)或Chothia & Lesk，1987, «/. Μσ/. 5ίο/· ΜόΑΟΙ-ρΠ ; Chothia等人， 1989, iVaiwre 342:878-883將胺基 酸分配 至各結構域。 雙特異性或雙功能抗體 雙特異性或雙功能抗體通常為具有兩個不同重鏈/輕鏈 對及兩個不同結合位點之人工雜交抗體。雙特異性抗體可 藉由多種方法製造，包括（但不限於）融合瘤之融合或連接 F(ab')片段。參看例如 Songsivilai & Lachmann, 1990，C7i«. £jc/7· 79: 315-321 ; Kostelny等人，1992，*/. 148:1547-1553 。 製備抗體 本發明提供結合至人類NGF之抗體。此等抗體可藉由以 151365.doc •57· 201125581 全長NGF或其片段免疫來製造。本發明抗體可為多株或單 株抗體’及/或可為重組抗體》在較佳實施例中，本發明 抗體為例如藉由使能夠產生人類抗體之轉殖基因動物免疫 而製備之人類抗體（參看例如國際專利申請公開案w〇 93/12227)。 本發明抗NGF抗體之輕鏈及重鏈可變區的互補決定區 (CDR)可移植至來自同一物種或另一物種的構架區（FR)。 在某些實施例中，抗NGF抗體之輕鍵及重鏈可變區的cdr 可移植至共同人類FR。為了產生共同人類FR，比對來自 若干人類重鏈或輕鍵胺基酸序列的FR以識別共同胺基酸序 列。抗NGF抗體重鏈或輕鍵之FR可以來自不同重鏈或輕鏈 之FR置換。抗\0?抗體之重鏈及輕鏈的FR中之稀有胺基 酸通常未經置換’而其餘FR胺基酸可置換^稀有胺基酸為 處於在FR中一般不會發現該等胺基酸之位置中的特異性胺 基酸。來自本發明之抗NGF抗體的移植可變區可與不同於 抗NGF抗體之恆定區的恆定區一起使用。或者，移植可變 區為單鏈Fv抗體之一部分。CDR移植描述於例如美國專利 第 6，180,370 號、第 5,693,762 號、第 5,693,761 號、第 5,585,089號及第5,530，101號，為了任何目的，其以引用的 方式併入本文中。 本發明抗體較佳使用將人類抗體產生之基因座的實質部 分插入至產生抗體之小鼠細胞中且經進一步工程改造以致 内源性鼠類抗體產生不足之轉殖基因小鼠製備。該等小鼠 能夠產生人類免疫球蛋白分子及抗體，且不會產生鼠類免 151365.doc -58 - 201125581 疫球蛋白分子及抗體或實質上產生減少量之鼠類免疫球蛋 白分子及抗體。用於實現此結果之技術揭示於本說明書中 揭示之專利、申請案及參考文獻中。在較佳實施例中，習 ： 此相關技藝之人士可採用國際專利申請公開案第wo 98/24893中所揭示之方法’為了任何目的，其以引用的方 式併入本文中。亦參看Mendez等人，1997, G⑼沾以 15:146-156,為了任何目的，其以引用的方式併入本文中。 本發明之單株抗體（mAb)可藉由多種技術製造，包括習 知單株抗體法，例如K〇hler& Milstein〇975， 256:495)之標準體細胞雜交技術。儘管體細胞雜交程序較 佳，但原則上亦可採用其他產生單株抗體之技術，例如Β 淋巴細胞之病毒或致癌性轉型。 用於製備融合瘤之較佳動物系統為小鼠。已充分確認小 鼠中之融合瘤產生，且用於融合之經免疫脾細胞的免疫方 案及分離技術為此項技術所熟知。 在一較佳實施例中，可使用具有部分人類免疫系統而非 小鼠系統的轉殖基因小鼠產生針對NGF之人類單株抗體。 此等轉殖基因小鼠在本文中稱為「HuMab」小鼠，其含有 · 編碼未重排人類重鏈（μ及γ)及κ輕鏈免疫球蛋白序列之人類 免疫球蛋白基因微小基因座以及使内源性^及κ鏈基因座失 '舌的乾向突變（Lonberg等人，1994，368:856-859)。 因此’小鼠展現降低之小鼠IgM或κ表現，且引入之人類重 鍵及輕鏈轉殖基因回應於免疫反應發生類別轉換及體細胞 突變以產生高親和力人類IgG κ單株抗體（Lonberg等人，上 151365,doc -59· 201125581 文；Lonberg及 Huszar，1995，13:65-93 ; Harding 及 Lonberg，1995, Ann. N.Y. Acad. Sci. 764:53 6-546)。HuMab小鼠之製備詳細描述於Taylor等人， 1992, Nucleic Acids Res. 20:6287-6295 ; Chen等人，1993, International Immunology 5:647-656 ； Tuaillon^ A » 1994, J. Immunol. 152:2912-2920 ; Lonberg 等人，1994，Nature 368:856-859 ； Lonberg, 1994, Handbook of Exp. Pharmacology 113:49-101 ; Taylor等人，1994, /«ieniaiz’owa/ /mmwwo/ogy 6:579-591 ; Lonberg及Huszar，1995，/wwwwo/. 13:65-93 ; Harding 及 Lonberg，1995，TV. Z dcac/· «SW 764:536-546 ; Fishwild等人，1996, 14:845-851 中’其内 容均以全文引用的方式併入本文中。另外參看均頒予 Lonberg及Kay之美國專利第5,545,806號；第5,569,825號； 第 5,625，126 號；第 5,633,425 號；第 5,789,650 號；第 5,877,397 號；第 5,661，016 號；第 5,814,318 號；第 5,874,299號及第5,770,429號；以及Surani等人之美國專利 第5,545,807號；1993年6月24曰公開之國際專利申請公開 案第 WO 93/1227號；1992年 12 月 23 日公開之 WO 92/22646 ; 及1992年3月19日公開之WO 92/03918 ’其揭示内容均以全 文引用的方式併入本文中。或者’下文實例中描述之 HCo7、HCol2及KM轉殖基因小鼠品系可用於產生人類抗 NGF抗體。 本發明提供對生物活性人類NGF多肽具有特異性且中和 生物活性人類NGF多肽之人類單株抗體。亦提供抗體重鏈 151365.doc -60- 201125581 及輕鏈胺基酸序列，該等序列對NGF多肽具有高度特異性 且與其結合時對其進行中和。此高度特異性使抗人
類NGF 人類抗體及具有類似特異性之人類單株抗體成為NGF相關 疾病之有效免疫療法。 在一態樣中’本發明提供與本文提供之4d4抗體結合相 同或基本上相同之抗原決定基的經分離人類抗體。 在一態樣中’本發明提供包含SEq ID NO: 10、12、 14、16、18、20、22、24及79-130中所示之至少一種胺基 酸序列的經分離人類抗體，其以高親和力結合NGF多肽抗 原決定基且具有拮抗NGF多肽活性之能力。此等抗體較佳 與本文提供之4D4抗體結合相同或基本上相同之抗原決定 基。 在較佳實施例中’經分離人類抗體以lxl〇-9 Μ或1χ1〇·9 Μ 以下之解離常數（Kd)結合至Ngf多肽，且在活體外中和分 析中以1χ1(Γ7 Μ或ΙχΙΟ·7 μ以下之IC5〇抑制NGF誘發之存 活°在更佳實施例中，經分離人類抗體以1 χ丨〇-1 ο Μ或 lxl〇-1Q Μ以下之解離常數（Kd)結合至NGF多肽，且在活體 外中和分析中以lxl〇_8 Μ或lxl〇-8 Μ以下之IC50抑制NGF誘 發之存活。在一甚至更佳實施例中，經分離抗NGF人類抗 體以lxlO·11 Μ或ΙχΙΟ·11 Μ以下之解離常數（KD)結合至人類 NGF多肽’且在活體外中和分析中以1 χ ι〇_9 μ或1 X 1 〇·9 μ 以下之ICw抑制NGF誘發之存活。本文提供滿足上述結合 及中和準則之抗人類NGF人類抗體之實例。 本發明最佳之抗人類NGF人類抗體在本文中稱為4D4， 151365.doc • 61 · 201125581
且具有分別如SEQ ID NO: 12及SEQ ID NO: 10中所示之VL 及VH多肽序列。編碼4d4之vl及VH的聚核苷酸序列分別 顯示於SEQ ID NO: 11及SEQ ID NO: 9中。實例中特定揭 示本發明抗人類NGF人類抗體之特性。本文論證的對NGF 多肽之高親和力及拮抗NGF多肽活性之高能力尤其值得注 意。 可藉由如實例9中一般描述之表面電漿子共振測定抗人 類NGF人類抗體之解離常數（κ〇)β 一般而言，表面電漿子 共振分析藉由表面電漿子共振（SPR)使用BIAcore系統 (Pharmacia Biosensor，Piscataway，NJ)測量配位體（固定於 生物感測器基質上之重組NGF多肽）與分析物（抗體溶液）之 間的即時結合相互作用。亦可藉由固定分析物（生物感測 器基質上之抗體）及提供配位體（溶解狀態之重組V)進行表 面電漿子分析。亦可藉由使用KinExA方法測定抗人類NGF 人類抗體之解離常數（KD)。在本發明之某些實施例中，抗 體以約1〇-8 Μ至1〇·12 Μ之KD結合至NGF。如本文所用之術 語「Kd」意欲指特定抗體-抗原相互作用之解離常數。出 於本發明之目的’如實例9中所示測定kd。 在較佳實施例中’本發明抗體為IgG1、IgG2、IgG3或 IgG4同型。抗體較佳為lgG3同型。抗體更佳為IgG〗同型。 抗體最佳為IgG2同型。在其他實施例中，本發明抗體為 IgM、IgA、IgE或IgD同型。在本發明之較佳實施例中，抗 體包含人類κ輕鏈及人類IgGl、igG2、IgG3或IgG4重鏈。 下文實例中描述包含IgGl或IgG2重鏈恆定區之本發明抗體 151365.doc •62- 201125581 的表現。在特定實施例中，抗體之可變區接合至除夏、 IgG2、IgG3或IgG4同型之恆定區以外的恆定區。在特定實 施例中，本發明之抗體已經選殖以供在哺乳動物細胞中表 現。 在特定實施例中，抗NGF抗體之重鏈及輕鏈的保守修飾 (及編碼核苷酸之對應修飾）將產生功能及化學特徵類似於 本文揭示之抗NGF抗體的抗NGF抗體。相比之下，可藉由 在重鏈及輕鏈之胺基酸序列中選擇性取代來實質上修飾抗 NGF抗體之功能及/或化學特徵，使其（a)將分子主鏈之取 代區域的結構保持為片或螺旋構形，（b)保持分子在標靶位 點處之電荷或疏水性，或（〇保持側鏈之體積的作用方面顯 著不同。 舉例而言，「保守胺基酸取代」可涉及以非天然殘基取 代天然胺基酸殘基，使得對彼位置之胺基酸殘基的極性或 電荷幾乎無影響或無影響。此外，如先前針對「丙胺酸掃 描突變誘發」戶斤述，多肽中之任何天然殘基亦可經丙胺酸 取代。 在/要取代時可由熟習此項技術者決定所要胺基酸取代 (保寸或非保寸）。在某些實施例中，胺基酸取代可用於識 別抗卿抗體之重要殘基，或用於增加或降低本文所述抗 NGF抗體之親和力。 如已熟知，胺基酸序列之諸如缺[添力〇或取代一個、 乂數或甚至若干個胺基酸的微小改變可產生初始蛋白質之 對偶基因形式，其具有實質上相同之特性。因&，除本文 15I365.doc •63- 201125581 特定描述之抗體外，可利用熟習此項技術者熟知的各種重 組DNA技術容易地設計及製造其他「實質上同源」抗體。 一般而言，可藉由諸如定點突變誘發之多種熟知技術容易 地修飾基因。因此，本發明涵蓋與本文揭示之抗NGF人類 抗體具有實質上類似之特徵的「變異」或「突變」抗NGF 人類抗體（參看例如WO 00/56772，其均以引用的方式併入 本文中）。因此，關於抗NGF人類抗體之術語「變異體」 或「突變體」意謂任何結合分子（分子X)(i)其中重鏈之高 變區CDR1、CDR2及CDR3或輕鏈之高變區CDR1、CDR2及 CDR3 整體上與 SEQ ID NO: 14、1 8 及 22 或 SEQ ID NO: 16、20及24所示之高變區分別至少80%同源，較佳至少 90%同源，更佳至少95%同源，及（ii)其中變異體或突變體 能夠將人類NGF之活性抑制到與參考抗NGF人類抗體（其構 架區與分子X之構架區相同）相同的程度。 通常，抗NGF人類抗體變異體將具有整體上與SEQ ID NO: 14、18及22及/或SEQ ID NO: 16、20及24所示之胺基 酸序列分別具有至少約80%胺基酸序列一致性、較佳至少 約85%序列一致性、更佳至少約90%序列一致性、更佳至 少約91%序列一致性、更佳至少約92%序列一致性、更佳 至少約93%序列一致性、更佳至少約94%序列一致性、更 佳至少約95%序列一致性、更佳至少約96%序列一致性、 更佳至少約97%序列一致性、更佳至少約98%序列一致 性、更佳至少約99%胺基酸序列一致性的輕鏈及/或重鏈 CDR。 151365.doc -64- 201125581 抗NGF人類抗體變異體更佳將具有整體上與SEQ ID NO: 12、80、82、84、86、88、89、90或91所示之胺基酸序列 具有至少約80%胺基酸序列一致性、更佳至少約81%序列 一致性、更佳至少約82%序列一致性、更佳至少約83°/〇序 列一致性、更佳至少約84%序列一致性、更佳至少約85% 序列一致性、更佳至少約86%序列一致性、更佳至少約 87%序列一致性、更佳至少約88%序列一致性、更佳至少 約89°/。序列一致性、更佳至少約90%序列一致性、更佳至 少約91%序列一致性、更佳至少約92°/。序列一致性、更佳 至少約93%序列一致性、更佳至少約94%序列一致性、更 佳至少約95%序列一致性、更佳至少約96%序列一致性、 更佳至少約97%序列一致性、更佳至少約98%序列一致 性、更佳至少約99%胺基酸序列一致性的輕鏈可變區，及/ 或整體上與SEQ ID NO: 10、81、83、85或87所示之胺基酸 序列具有至少約70%胺基酸序列一致性、較佳至少約75% 序列一致性、更佳至少約80%序列一致性、更佳至少約 81 %序列一致性、更佳至少約82°/。序列一致性、更佳至少 約83°/。序列一致性、更佳至少約84%序列一致性、更佳至 少約85%序列一致性、更佳至少約86%序列一致性、更佳 至少約87%序列一致性、更佳至少約88%序列一致性、更 佳至少約89%序列一致性、更佳至少約90°/。序列一致性、 更佳至少約91 %序列一致性、更佳至少約92°/。序列一致 性、更佳至少約93%序列一致性、更佳至少約94%序列一 致性、更佳至少約95%序列一致性、更佳至少約96%序列 151365.doc -65- 201125581 一致性、更佳至少約97°/◦序列一致性、更佳至少約98%序 列一致性、更佳至少約99%胺基酸序列一致性的重鏈可變 區。 關於聚核苷酸之「變異體」意欲指與本發明聚核苷酸序 列具有至少約75%核酸序列一致性的核酸分子。通常，聚 核苷酸變異體將與本文揭示之新穎核酸序列具有至少約 75%核酸序列一致性、更佳至少約80%核酸序列一致性、 更佳至少約81%核酸序列一致性、更佳至少約82%核酸序 列一致性、更佳至少約83%核酸序列一致性、更佳至少約 84%核酸序列一致性、更佳至少約85%核酸序列一致性、 更佳至少約86%核酸序列一致性、更佳至少約87%核酸序 列一致性、更佳至少約88%核酸序列一致性、更佳至少約 89%核酸序列一致性、更佳至少約90%核酸序列一致性、 更佳至少約91%核酸序列一致性、更佳至少約92%核酸序 列一致性、更佳至少約93%核酸序列一致性、更佳至少約 94%核酸序列一致性、更佳至少約95%核酸序列一致性、 更佳至少約96%核酸序列一致性、更佳至少約97°/。核酸序 列一致性、更佳至少約9 8 %核酸序列一致性、更佳至少約 99%核酸序列一致性。 在特定實施例中’本發明提供與本發明抗體具有一定百 分比一致性之抗體，或重鏈可變區、輕鍵可變區、 CDR1、CDR2或CDR3區與本發明抗體之重鏈可變區、輕 鏈可變區、CDR1、CDR2或CDR3區具有一定百分比一致 性的抗體，如本文實例及圖5-10中所示。 151365.doc •66· 201125581 在某些實施例中，本發明提供特異性結合神經生長因子 且包含重鏈及輕鏈之經分離人類抗體，其中重鏈包含如下 重鏈可變區，該重鏈可變區包含：與SEQ ID NO: 10所闡 述之胺基酸序列至少70%或75% —致之胺基酸序列，或其 抗原結合或免疫功能性免疫球蛋白片段；與SEQ ID NO: 8 1所闡述之胺基酸序列至少70%、80%、85°/。或95%同源之 胺基酸序列，或其抗原結合或免疫功能性免疫球蛋白片 段；與SEQ ID NO: 83所闡述之胺基酸序列至少70%、 80%、85%或95% —致之胺基酸序列，或其抗原結合或免 疫功能性免疫球蛋白片段；與SEQ ID NO: 85所闡述之胺 基酸序列至少75%、80%或85% —致之胺基酸序列，或其 抗原結合或免疫功能性免疫球蛋白片段；與SEQ ID NO: 87所闡述之胺基酸序列至少70%、75%或80%—致之胺基 酸序列，或其抗原結合或免疫功能性免疫球蛋白片段；與 SEQ ID NO: 79所闡述之胺基酸序列至少56%—致之胺基酸 序列，或其抗原結合或免疫功能性免疫球蛋白片段。 在某些實施例中，本發明提供特異性結合神經生長因子 且包含重鏈及輕鏈之經分離人類抗體，其中輕鏈包含如下 輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：與SEQ ID NO: 12所闡 述之胺基酸序列至少70%、75%、80%或90%—致之胺基酸 序列，或其抗原結合或免疫功能性免疫球蛋白片段；與 SEQ ID NO: 80所闡述之胺基酸序列至少70%、85%或90% 一致之胺基酸序列，或其抗原結合或免疫功能性免疫球蛋 白片段；與SEQ ID NO: 88所闡述之胺基酸序列至少70%、 151365.doc -67- 201125581 74%、90%或94% —致之胺基酸序列，或其抗原結合或免 疫功能性免疫球蛋白片段；與SEQ ID NO: 89所闡述之胺 基酸序列至少70°/。、80%、85%或87% —致之胺基酸序列’ 或其抗原結合或免疫功能性免疫球蛋白片段；與SEQ瓜 NO: 90所闡述之胺基酸序列至少70%、85%、90%或94。/〇一 致之胺基酸序列，或其抗原結合或免疫功能性免疫球蛋白 片段；與SEQ ID NO: 91所闡述之胺基酸序列至少70%、 85%、90%、95°/。或99%—致之胺基酸序列，或其抗原結合 或免疫功能性免疫球蛋白片段；與SEQ ID NO: 82所闡述 之胺基酸序列至少70%、80%、90%、95%或96%—致之胺 基S曼序列’或其抗原結合或免疫功能性免疫球蛋白片段； 與SEQ ID NO·· 84所闡述之胺基酸序列至少70%、85%、 90%、95%、98%或99%一致之胺基酸序列，或其抗原結合 或免疫功能性免疫球蛋白片段；與SEQ ID NO: 86所闡述 之胺基酸序列至少7〇%、85%、9〇%、95%、98%或99% — & t @基酸序列’或其抗原結合或免疫功能性免疫球蛋白 片段。 在某些其他實施例中，本發明提供特異性結合神經生長 因子且包含人類重鏈CDR1之經分離人類抗體，其中重鏈 CDR1 為與如 SEQ ID NO: 98、SEQ ID NO: 105、SEQ ID N0: 110或SEQ ID NO·· 22所闡述之胺基酸序列至少40%或 60 /〇 —致的胺基酸序列，或其抗原結合或免疫功能性免疫 球蛋白片段。 在其他實施例中，本發明提供特異性結合神經生長因子 151365.doc -68 · 201125581 且包含人類重鏈CDR2之經分離人類抗體，其中重鏈CDR2 為與SEQ ID NO: 99所闡述之胺基酸序列至少70°/。、82%或 94%—致之胺基酸序列，或其抗原結合或免疫功能性免疫 球蛋白片段；與SEQ ID NO: 106所闡述之胺基酸序列至少 70%或76% —致之胺基酸序列，或其抗原結合或免疫功能 性免疫球蛋白片段；與SEQ ID NO: 18所闡述之胺基酸序 列至少59°/。一致之胺基酸序列，或其抗原結合或免疫功能 性免疫球蛋白片段；與SEQ ID NO: 11 7所闡述之胺基酸序 列至少70%—致之胺基酸序列，或其抗原結合或免疫功能 性免疫球蛋白片段；與SEQ ID NO: 111所闡述之胺基酸序 列至少70%、75%或80% —致之胺基酸序列，或其抗原結 合或免疫功能性免疫球蛋白片段。 在其他實施例中，本發明提供特異性結合神經生長因子 且包含人類輕鏈CDR1之經分離人類抗體，其中該CDR1為 與SEQ ID NO: 101所闡述之胺基酸序列至少70%或80% — 致之胺基酸序列，或其抗原結合或免疫功能性免疫球蛋白 片段；與SEQ ID NO: 95所闡述之胺基酸序列至少70%、 75%、80%或90% —致之胺基酸序列，或其抗原結合或免 疫功能性免疫球蛋白片段；與SEQ ID NO: 119所闡述之胺 基酸序列至少75%、80%或90% —致之胺基酸序列，或其 抗原結合或免疫功能性免疫球蛋白片段；與SEQ ID NO: 122所闡述之胺基酸序列至少75%、80%或90%—致之胺基 酸序列，或其抗原結合或免疫功能性免疫球蛋白片段；與 SEQ ID NO: 125所闡述之胺基酸序列至少80%—致之胺基 151365.doc -69- 201125581 酸序列，或其抗原結合或免疫功能性免疫球蛋白片段；與 SEQ ID NO: 24所闡述之胺基酸序列至少75%、80%或90% 一致之胺基酸序列，或其抗原結合或免疫功能性免疫球蛋 白片段；與SEQ ID NO: 107所闡述之胺基酸序列至少70% 或80% —致之胺基酸序列，或其抗原結合或免疫功能性免 疫球蛋白片段·，與SEQ ID NO: 113所闡述之胺基酸序列至 少70%或80% —致之胺基酸序列，或其抗原結合或免疫功 能性免疫球蛋白片段。 在其他實施例中，本發明提供特異性結合神經生長因子 且包含人類輕鏈CDR2之經分離人類抗體，其中該CDR2為 與SEQ ID NO: 102所闡述之胺基酸序列至少70%或85°/〇 — 致之胺基酸序列，或其抗原結合或免疫功能性免疫球蛋白 片段；與SEQ ID NO: 96所闡述之胺基酸序列至少70%—致 之胺基酸序列，或其抗原結合或免疫功能性免疫球蛋白片 段；與SEQ ID NO: 120所闡述之胺基酸序列至少70%—致 之胺基酸序列，或其抗原結合或免疫功能性免疫球蛋白片 段；與SEQ ID NO: 123所闡述之胺基酸序列至少70%—致 之胺基酸序列，或其抗原結合或免疫功能性免疫球蛋白片 段；與SEQ ID NO: 126所闡述之胺基酸序列至少70%或 8 5 % —致之胺基酸序列，或其抗原結合或免疫功能性免疫 球蛋白片段；與SEQ ID NO: 129所闡述之胺基酸序列至少 70%或85% —致之胺基酸序列，或其抗原結合或免疫功能 性免疫球蛋白片段；與SEQ ID NO: 20所闡述之胺基酸序 列至少70% —致之胺基酸序列，或其抗原結合或免疫功能 151365.doc -70- 201125581 性免疫球蛋白片段；與SEQ ID NO: 108所闡述之胺基酸序 列至少70%或85% —致之胺基酸序列，或其抗原結合或免 疫功能性免疫球蛋白片段；與SEQ ID NO: 133所闡述之胺 基酸序列至少70°/。一致之胺基酸序列，或其抗原結合或免 疫功能性免疫球蛋白片段；與SEQ ID NO: 114所闡述之胺 基酸序列至少70%或85% —致之胺基酸序列，或其抗原結 合或免疫功能性免疫球蛋白片段。
在其他實施例中，本發明提供特異性結合神經生長因子 且包含人類輕鏈CDR3之經分離人類抗體，其中該CDR3為 與SEQ ID NO: 103所闡述之胺基酸序列至少70%或85% — 致之胺基酸序列，或其抗原結合或免疫功能性免疫球蛋白 片段；與SEQ ID NO: 97所闡述之胺基酸序列至少70%或 85%—致之胺基酸序列，或其抗原結合或免疫功能性免疫 球蛋白片段；與SEQ ID NO: 121所闡述之胺基酸序列至少 70%或78% —致之胺基酸序列，或其抗原結合或免疫功能 性免疫球蛋白片段；與SEQ ID NO: 127所闡述之胺基酸序 列至少70%或78% —致之胺基酸序列，或其抗原結合或免 疫功能性免疫球蛋白片段；與SEQ ID NO: 130所闡述之胺 基酸序列至少70%或78% —致之胺基酸序列，或其抗原結 合或免疫功能性免疫球蛋白片段；與SEQ ID NO: 16所闡 述之胺基酸序列至少70%或78% —致之胺基酸序列，或其 抗原結合或免疫功能性免疫球蛋白片段；與SEQ ID NO: 109所闡述之胺基酸序列至少70%或85%—致之胺基酸序 列，或其抗原結合或免疫功能性免疫球蛋白片段；與SEQ 151365.doc •71 - 201125581 ID NO: 134所闡述之胺基酸序列至少78% 一致之胺基酸序 列，或其抗原結合或免疫功能性免疫球蛋白片段；與SEQ ID NO: 115所闡述之胺基酸序列至少85%—致之胺基酸序 列’或其抗原結合或免疫功能性免疫球蛋白片段。 4D4抗體重鏈及輕鏈可變區之序列分別顯示於seq m NO: 10及12中。然而，許多潛在CDR接觸殘基可經其他胺 基酸取代且仍使抗體保持對抗原之實質親和力。同樣，不 與重鏈及輕鏈中之CDR接觸的許多構架殘基可經來自其他 人類抗體之相應位置的胺基酸、人類共同胺基酸、或來自 其他小鼠抗體之相應位置的胺基酸取代，而不顯著損失人 類抗體之親和力或非免疫原性》可選擇各種替代胺基酸產 生所揭示抗NGF抗體或其片段具有親和力、特異性、非免 疫原性、製造容易程度、及其他所要特性之不同組合的型 式。 在替代實施例中，本發明抗體可在除融合瘤細胞株以外 的細胞株中表現。在此等實施例中，編碼特定抗體之序列 可用於轉型適合哺乳動物宿主細胞。根據此等實施例，可 使用將聚核苷酸引入宿主細胞中之任何已知方法（包括例 如將聚核苷酸封裝於病毒（或病毒載體）中，且以病毒（或載 體）轉導宿主細胞）或藉由此項技術中已知之轉染程序實現 轉型’如美國專利第4,399,216號、第4,912,040號、第 4,740,461號及第4,959,455號（為了任何目的，其均以引用 的方式併入本文中）所例示。一般而言，所用之轉型程序 可視待要轉型之宿主而定。將異源聚核苷酸引入哺乳動物 151365.doc -72- 201125581 細胞中之方法為此項技術中已知且包括（但不限於）聚葡萄 糖介導之轉染、磷酸鈣沈澱、凝聚胺介導之轉染、原生體 融合、電穿孔、將聚核苷酸囊封於脂質體中、及將DN A直 接微注射至核中。 使用標準接合技術將編碼本發明NGF抗體之重鏈值定 區、重鏈可變區、輕鏈恆定區或輕鏈可變區之胺基酸序列 的核酸分子插入至適當表現載體中。在一較佳實施例中， 抗NGF抗體重鏈或輕鏈恆定區附接至適當可變區之c末端 且接合至表現載體中。載體通常經選擇以在所採用之特定 宿主細胞中起作用（亦即載體與宿主細胞機制相容使得可 擴增基因及/或表現基因）。表現載體之評論參看meth ENZ. 185 (Goeddel編）’ 1990，Academic Press。 通常，任何宿主細胞中所用之表現載體將含有用於質體 維持以及選殖及表現外源性核苷酸序列的序列。在某些實 施例中，該等統稱為「側接序列」之序列通常將包括一或 多個以下核苷酸序列：啟動子、一或多種強化子序列、複 製起源、轉錄終止序列、含有供者及受者拼接位點之完全 内含子序列、編碼用於多肽分泌之前導序列的序列、核糖 體結合位點、聚腺苷酸化序列、用於插入編碼待要表現之 多肽之核酸的多連接區域（p〇lyHnker regi〇n)、及可選標記 元件。下文討論此等序列中之每一者。
視情況而言，載體可含有編碼「標籤」之序列，亦即位 於抗NGF抗體多肽編碼序列之5,或3·端的寡核苷酸分子； 該寡核苷酸序列編碼聚His(諸如6His)、或另—r垆M I51365.doc •73· 201125581 諸如存在市售抗體之FLAG、HA(血球凝集素流感病毒）或 。此標籤通常在表現多肽後與多肽融合，且可用作供 自宿主細胞親和力純化或偵測NGF抗體之手段。可例如藉 由使用針對標籤之抗體作為親和力基質的管柱層析完成親 和力純化。視情況而言，隨後可藉由各種方式（諸如使用 針對裂解之特定肽酶）自經純化抗NGF抗體多肽移除標 籤。 側接序列可同源（亦即來自與宿主細胞相同之物種及/或 品系）、異源（亦即來自除宿主細胞物種或品系之外的物 種）、雜交（亦即來自一種以上來源之側接序列的組合）、合 成或天然。因此，側接序列之來源可為任何原核生物體或 真核生物體、任何脊椎或無脊椎生物體、或任何植物，只 要側接序列在宿主細胞機射起作用且可被宿主細胞機制 活化。 適用於本發明載It中之側接彳列可藉由此項㈣中熟知 之若干方法巾之任-者獲得。通f，本文適用之側接序列 已預先藉由定位及/或限制性核酸内切酶消化識別，因此 可使用適當限制性核酸内切酶自適當組織源分離。在一些 情形中’可能已知側接序列之完全核苦酸序列。此處，側 接序列可使用本文針對核酸合成或選殖所述之方法合成。 無論已知所有抑或僅一部分側接序歹，其均可使用聚入 酶鏈反應(PCR)及/或以適合探針(諸如來自相同或另一二 之寡核普酸及/或側接序列片段）筛選基因組庫獲得。若側 接序列未知，則可自可能含有例如編碼序列或甚至另—基 151365.doc •74- 201125581 因或其他基因的較大片DNA分離含有側接序列之dna的片 段。可藉由限制性核酸内切酶消化產生適當DNA片段，隨 後使用遣脂糖凝膠純化、Qiagen®管柱層析（Chatsw〇rth， C A)或熟習此項技術者已知之其他方法來完成分離。一般 熟習此項技術者將咸了解如何針對此目的選擇合適酶。 複製起源通常為彼等市售原核生物表現載體的一部分， 且該起源幫助在宿主細胞中擴增載體。若所選載體不含複 製位點之起源，則可基於已知序列化學合成，且接合至載 體中。舉例而言，來自質體pBR322(New England则士, Beverly，ΜΑ)之複製起源適於多數格蘭氏陰性細菌 gative bacteria) ’且多種病毒起源（例如SV4〇、多瘤病毒 、腺病毒、水泡性口炎病毒（vsv)或乳突狀瘤病 毒，諸如HPV或BPV)適於在哺乳動物細胞中選殖载體。一 般而言’哺乳動物表現載體無需複製組分之起源(例如通 常僅使用SV40起源，因為其亦含有病毒早期啟動子)。 轉錄終止序列通常位於多肽編碼區之3,端，且用於終止 轉錄。-般而言，原核生物細胞中之轉錄終止序列為富含 G-C之片段，繼之為聚τ序列。儘管該序列很容易於自集 合庫令選殖或甚至作為載體之-部分自市售商品講得但 其亦很容易使㈣酸合成法（諸如本文所述之方法）合成。 可選標記基因編媽在選擇性培養基中生長之宿主細胞生 存及生長所必需的蛋白質。典型選擇標記基因編竭⑷賦予 原核生㈣主細胞對抗生素或其他毒素（例如安比西林 ㈣piciliin)、四環素（tetraeyeline)或康黴素（kan卿之 151365.doc •75· 201125581 抗性；（b)補充細胞之營養缺陷，·或（c)供應不可自複合培 養基或成分明確培養基獲得之關鍵養分的蛋白質。較佳可 選標記為康黴素抗性基因、安比西林抗性基因及四環素抗 性基因。有利地，新黴素（neomycin)抗性基因亦可用於^ 原核生物及真核生物宿主細胞兩者中選擇。 可使用其他可選基因擴增表現之基因。擴增過程為製造 對生長或細胞存活至關重要之蛋白質所需之基因在連續產 生重組細胞之染色體内串聯重複。用於哺乳動物細胞之適 合可選標記物的實例包括二氫葉酸還原酶（DHFR)及無啟 動子胸苷激酶基因將哺乳動物細胞轉型體置於惟獨轉型 體因載體中存在之可選基因而適於存活的選擇壓力下。藉 由在選擇劑於培養基中之濃度連續增加的條件下培養經轉 型細胞來強加選擇壓力，藉此擴增可選基因及編碼另一基 因之DNA ’諸如結合至NGF多肽之抗體。因此，自擴增之 DNA合成增加量之多肽（諸如抗ngf抗體）。 核糖體結合位點一般為mRNA之轉譯起始所必需，且由 夏因-達爾加諾序列（Shine-Dalgarno sequence)(原核生物） 或可紮克序列（Kozak sequence)(真核生物）表徵。該元件通 常位於啟動子之3,端及待要表現之多肽編碼序列的5，端。 在一些情形中，諸如真核生物宿主細胞表現系統需要糖 基化的情形，可操作各種前序列（presequence)或前導序列 (ptosequence)來改良糖基化或產量。舉例而言，可改變特 定信號狀之肽酶裂解位點，或添加前導序列，此亦可影響 糖基化。最終蛋白質產物在-1位置（相對於成熟蛋白質的第 151365.doc -76· 201125581 一個胺基酸）可具有一或多個易發生表現之額外胺基酸， 此可能未完全移除。舉例而言，最终蛋白質產物的胺基末 端可連接有一個或兩個在肽酶裂解位點中發現之胺基酸殘 基。或者，使用一些酶裂解位點可導致所要多肽的略微截 斷开> 式’只要酶在成熟多肽内的酶裂解位點區域切斷。 本發明之表現及選殖載體通常將含有由宿主生物體識別 且可操作地連接至編碼抗NGF抗體之分子的啟動子。啟動 子為位於結構基因之起始密碼子上游（亦即5，）（ 一般在約 100至1000 bp内）的非轉錄序列，其控制結構基因之轉錄。 啟動子習知地分為兩類中之一類：誘導性啟動子及組成性 啟動子。誘導性啟動子使自DNA轉錄之程度在其控制下回 應於培養條件的一些改變（諸如有或無養分存在或溫度改 變）開始增加。另一方面，組成性啟動子均勻轉錄與其可 操作地連接之基因，亦即對基因表現幾乎無控制或無控 制。熟知由多種潛在宿主細胞鑑別之大量啟動子。適合啟 動子藉由限制性酶消化自源DNA移除啟動子且將所要啟動 子序列插入至載體中來可操作地連接至編碼構成本發明抗 NGF抗體之重鏈或輕鏈的dna。 此項技術中亦熟知與酵母宿主一起使用之適合啟動子。 酵母強化子適宜與酵母啟動子—起使^與哺乳動物宿主 細胞一起使用之適合啟動子為熟知的且包括（但不限於）自 病毒基因組獲得之啟動子，料病毒諸如多瘤病毒、禽殖 病毒、腺病毒（諸如2型腺病毒）、牛乳頭狀瘤病毒、禽類肉 瘤病毒、細胞巨大病毒、反轉錄病毒、B型肝炎病毒及最 151365.doc -77· 201125581 佳猴病毒40(SV40)。其他適合哺乳動物啟動子包括異源"甫 乳動物啟動子’例如熱休克啟動子及肌動蛋白啟動子° 可能關注之其他啟動子包括（但不限於）：SV40早期啟動 子（Bernoist及 Chambon，1981，290:304-10) ; CMV啟 動子（Thomsen等人 ’ 1984，Proc. iVai/. Jcai/. 81:659- 663);勞氏肉瘤病毒（Rous sarcoma virus)之3'長末端重複 中含有之啟動子（Yamamoto等人 ’ 1980，Ce// 22:787-97); 范修胸苷激酶啟動子（Wagner等人，i981，iVoc. #如/· AW. Scz. U.S.A. 78:1444-45);來自金屬硫蛋白基因之啟 動子及調節序列（Brinster等人’ 1982，296:39-42); 及原核生物啟動子，諸如β-内酿胺酶啟動子（Villa-Kamaroff等人，1978，Proc. _ΛΓαί/· Scz·. C/U·，75:3727- 31);或 tac啟動子（DeBoer 等人，1983，Proc. *Scz·. t/.S.丄，80:2卜25)。亦關注展現組織特異性且已用於轉 殖基因動物中之以下動物轉錄控制區：在胰腺腺泡細胞中 具有活性之I型彈性蛋白酶基因控制區（Swift等人，1984, Ce// 38:639-46 ; Ornitz等人，1986，Co/c/
Symp. Quant. Biol. 50:399-409 (1986) ； MacDonald, 1987, //epaio/o发少7:425-515);在騰腺β細胞中具有活性之膜島素 基因控制區（Hanahan, 1985, iWuwre 315:115-22);在淋巴樣 細胞中具有活性之免疫球蛋白基因控制區（Grosschedl等 人，1984, CW/ 38:647-58; Adames等人，1985, 318:533- 38 ; Alexander等人，1987, Μο/. Ο//.价〇/.，7:1436-44);在睾 丸細胞、乳房細胞、淋巴樣細胞及肥大細胞中具有活性之 151365.doc -78- 201125581 小鼠乳房腫瘤病毒控制區（Leder等人，1986，CV// 45:485-95);在肝臟中具有活性之白蛋白基因控制區（Pinkert等 人，1987, 1:268-76);在肝臟中具有活性 之α-胎蛋白基因控制區（Krumlauf等人，1985, Mo/. Ce//. 5ίο/·，5:1639-48 ; Hammer等人，1987, iSWewce 235:53-58); 在肝臟中具有活性之al-抗胰蛋白酶基因控制區（Kelsey等 人，1987，Gewes Deve/· 1:161-71);在骨髓細胞中具有 活性之β-血球蛋白基因控制區（Mogram等人，1985，TVaiwre 315:338-40 ; Kollias等人，1986，CW/ 46:89-94);在腦中 之少樹突神經膠細胞中具有活性之髓鞘鹼性蛋白基因控制 區（Readhead等人，1987，CW/ 48:703-12);在骨骼肌中具 有活性之肌凝蛋白輕鏈_2基因控制區（Sani, 1985, 314:283-86);及在下丘腦中具有活性之促性腺釋放激素基 因控制區（Mason等人，1986, 234:1372-78)。 強化子序列可插入至載體中以提高高等真核生物之編碼 構成本發明抗NGF抗體之輕鏈或重鏈之DNA的轉錄。強化 子為DNA之順式作用元件，一般約為1〇_3〇〇冲長其對啟 動子起作用從而提高轉錄。在轉錄單元之5，及3,位置發 見強化子相對疋向且位置獨立。已知自哺乳動物基因獲 得之右干強化子序列（例如血球蛋白、彈性蛋白酶、白蛋 月°蛋白及騰島素）。然而，通常使用來自病毒之強 化子。此項技術中已知之SV40強化子、細胞巨大病毒早期 啟動子強化子、多瘤病毒強化子及腺病毒強化子為用於活 化真核錢啟動子之例示性增強元件。儘管強化子可位於 151365.doc •79· 201125581 載體中編碼序列的5’或3’ ’但其通常位於啟動子之5,位點。 可自諸如市售載體之起始載體建構本發明之表現載體。 該等載體可含有或不含有所有所要側接序列。若載體中不 存在一或多個本文所述之侧接序列，則該等序列可個別地 獲得且接合至載體中β熟習此項技術者熟知用於獲得各側 接序列之方法。 在已建構載體且編碼構成抗NGF抗體之輕鍵、重鏈、或 輕鍵及重鏈之核酸分子已插入至載體中之適當位點後，可 將完整載體插入至適合宿主細胞中以供擴增及/或多肽表 現。可藉由熟知方法將抗NGF抗體之表現載體轉型至所選 宿主細胞中，該等方法包括轉染、感染、磷酸鈣共沈澱、 電穿孔、顯微注射、脂質體轉染、DEAE_聚葡萄糖介導之 轉染或其他已知技術。所選方法將部分隨待使用之宿主細 胞類型而變化。此等方法及其他適合方法為習此相關技藝 之人士所熟知且闡述於例如上文8&1111?1>〇〇1^等人中。 田在適當條件下培養宿主細胞時，其合成抗ngf抗體， 該抗體隨後可自培養基收集（若宿主細胞將其分泌至培養 基中）或直接自產生其之宿主細胞收集（若未分泌）。適當宿 主細胞之選擇將視多種因素而定，諸如所要表現量、達到 活性所要或必需之多肽修飾（諸如糖基化或磷酸化）及摺疊 成生物活性分子之容易程度。 可用作宿主以供表現之哺乳動物細胞株為此項技術所熟 知且包括（但不限於）可自美國菌種保存中心（八聊七抓 Type Culture C〇necti〇n，ATCC)獲得之永生化細胞株，包 151365.doc 201125581 括（但不限於）中國倉鼠卵巢（CHO)細胞、海拉（HeLa)細 胞、幼倉鼠腎（BHK)細胞、猴腎臟細胞（COS)、人類肝癌 細胞（例如Hep G2)及多種其他細胞株。在某些實施例中， 可藉由測定哪些細胞株具有高表現量且組成性產生具有 NGF結合特性之抗體來選擇細胞株。在另一實施例中，可 選擇來自不產生自己的抗體但具有產生且分泌異源抗體之 能力之B細胞系的細胞株。 本發明抗體適用於偵測生物樣品中之NGF及辨識產生 NGF蛋白之細胞或組織。特異性結合至ngf之本發明抗體 可用於治療NGF介導之疾病。該等抗體可用於在結合分析 中倩測NGF及抑制NGF使其不與NGF受體形成複合物。該 等結合至NGF且阻斷與其他結合化合物之相互作用的抗體 具有調節NGF介導之疾病的治療用途。在較佳實施例中， NGF之抗體可阻斷NGF與其受體之結合，此可中斷誘 導之信號轉導級聯。 本發明亦係關於一或多種本發明抗體之用途，其係用於 製造用以治療患者中由NGF表現增加或對ngf之敏感性增 加引起的特定病症或病況（諸如本文所揭示之任一種病症 或病況）之藥物。 在車乂佳m施例中，本發明提供醫藥組合物，其包含治療 有效里之一種或複數種本發明抗體以及醫藥學上可 :釋劑1劑、增溶劑、乳化劑、防腐劑及/或佐齊^可 7之調配材料較佳在所採用之劑量及濃度 毒。在較祛杳# y ,丄 叹又4… 歹1中，提供包含治療有效量之抗NC}F抗體 151365.doc • 81 - 201125581 的醫藥組合物。 在某些實施例中，可接受之調配材料較佳在所採用之劑 量及濃度下對接受者無毒。 在某些實施例中，醫藥組合物可含有調配材料供修飾、 保持或維持例如組合物之pH值、容積滲透濃度、黏度、澄 清度、顏色、等張性、氣味、無菌度、穩定性、溶解或釋 放速率、吸附或穿透。在該等實施例中，適合調配材料包 括（但不限於）胺基酸（諸如甘胺酸、楚醯胺酸、天冬醯胺、 精胺酸或雖胺酸）；抗菌劑；抗氧化劑（諸如抗壞血酸、亞 硫酸鈉或亞硫酸氫鈉）；緩衝劑（諸如硼酸鹽、碳酸氫鹽、
Tris-HCl、檸檬酸鹽、磷酸鹽或其他有機酸）；膨化劑（諸 如甘露糖醇或甘胺酸）、螯合劑（諸如乙二胺四乙酸 (EDTA)),錯合劑（諸如咖啡驗、聚乙烯n比哈咬酮、卜環糊 精或羥丙基-β-環糊精）；填充劑；單醣，雙醣及其他碳水 化合物（諸如葡萄糖、甘露糖及糊精）；蛋白質（諸如血清白 蛋白、明膠或免疫球蛋白）；著色劑、調味劑及稀釋劑； 乳化劑；親水性聚合物（諸如聚乙烯吡咯啶酮）；低分子量 多狀；成鹽相對離子（諸如納）；防腐劑（諸如氣化苯甲烴 銨、以酸、水楊酸、硫柳汞、苯乙醇、對經基苯 s曰、對經基苯甲酸丙西旨、沙威隆（chl〇rhexidine)、山梨酸 或過氧化氫)；溶劑(諸如甘油、丙二醇或聚乙二醇)；糖醇 (諸如甘露糖醇或山梨糖醇)；懸浮劑；界面活性劑或渴淵 劑（諸如普流尼克（pluronie)類、職、脫水山梨糖醇醋、 諸如聚山梨醇醋20、聚山梨醇醋8〇之聚山梨醇醋、氣核、 151365.doc -82· 201125581 缓血酸胺（tromethamine)、卵填S旨、膽固醇、替洛沙旅 (tyloxapal));穩定性增強劑（諸如蔗糖或山梨糖醇）；張力 增強劑（諸如鹼金屬鹵化物（較佳為氣化鈉或氯化鉀）、甘露 糖醇、山梨糖醇）；傳遞媒劑；稀釋劑；賦形劑及/或醫藥 佐劑。參看 REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 第 18版，（A.R_ Gennaro編），1990, Mack Publishing Company。 在某些實施例中，最佳醫藥組合物將由熟習此項技術者 視例如預期投與途徑、傳遞型式及所要劑量確定。參看例 如 REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES，上 文。在某些實施例中，該等組合物可影響本發明抗體之物 理狀態、穩定性、活體内釋放速率及活體内清除速率。 在某些實施例中，醫藥組合物中之主要媒劑或載劑可為 水性或非水性的。舉例而言，適合媒劑或載劑可為注射用 水、生理食鹽水溶液或人工腦脊髓液，可能補充有非經腸 投與之組合物中共有之其他材料。中性緩衝鹽水或與血清 白蛋白混合之鹽水為另外的例示性媒劑》在較佳實施例 中，本發明之醫藥組合物包含約pH 7.0-8.5之Tris缓衝劑、 或約pH 4.0-5.5之乙酸鹽缓衝劑，且可另外包括山梨糖 醇、蔗糖、Tween-20及/或其適合替代物。在本發明之某 些實施例中，可藉由使具有所需純度之所選組合物與視情 況任選之調配劑（REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES ’上文）混合來製備呈凍乾餅或水溶液形式之抗 NGF抗體組合物以供儲存。此外，在某些實施例中，抗 NGF抗體產物可使用諸如蔗糖之適當賦形劑調配成凍乾產 151365.doc -83- 201125581 物0 可選擇本發明之醫藥組合物用於非經腸傳遞。或者，組 口物可經選擇用以吸人或經由消化道（諸如經口）傳遞。該 等醫藥學上可接受之組合物之製備在此項技術範圍内。 調配組份較佳呈投與部位可接受之濃度。在某些實施例 中，緩衝劑係用以將組合物維持於生理ρΗ值或略微較低之 pH值，通常在約5至約8ipH值範圍内。 當預期非經腸投與時，用於本發明之治療組合物可以於 醤藥學上可接受之媒劑中包含所要抗NGF抗體之無熱原 質、非經腸可接受之水溶液形式提供。用於非經腸注射之 尤其適合之媒劑為無菌蒸餾水，其可將抗NGF抗體調配成 無菌等張溶液適當保藏。在某些實施例中，製備可涉及用 諸如可注射微球體、生物可侵蝕性粒子、聚合化合物（諸 如聚乳酸或聚乙醇酸）、珠粒或脂質體之試劑調配所要分 子，此可提供可經由積存注射傳遞之產物的控制或持續釋 放。在某些實施例中，亦可使用作用在於增加循環中之持 續時間的玻尿酸。在某些實施例中，可使用可植入藥物傳 遞裝置引入所要抗體分子。 本發明醫藥組合物可經調配以供吸入。在此等實施例 中，抗NGF抗體宜調配為乾燥可吸入粉末。在較佳實施例 中，抗NGF抗體吸入溶液亦可與推進劑一起調配以供霧劑 傳遞。在某些實施例中，溶液可霧化。肺部投與及調配方 法因此進一步描述於國際專利申請案第PCT/US94/〇〇i875 號中，其以引用的方式併入且描述經化學修飾蛋白質的肺 151365.doc -84 - 201125581 部傳遞。 亦預期調配物可經口投與 以此方式投與之抗NGF抗體 可與混合配製m體㈣（諸如錠劑及膠囊）時慣常使用之載 劑一起調酉己或不與該等載劑一起調配。纟$些實施例中， 膠囊可經設計以在胃腸道中生物可用性最大且體循環前降 解最小之時釋放調配物之活性部分。可納入其他藥劑以促 進抗NGF抗體吸收。亦可採用稀釋劑、調味劑、低熔點 蠟、植物油、潤滑劑、懸浮劑、錠劑崩解劑及黏合劑。 較佳提供包含有效量之一種或複數種抗NGF抗體與適於 製造錠劑之無毒賦形劑混合的本發明醫藥組合物。藉由將 錠劑溶解於無菌水或另一適當媒劑中，可製備呈單位劑型 之溶液。適合賦形劑包括（但不限於广惰性稀釋劑，諸如 碳酸鈣、碳酸鈉或碳酸氫鈉、乳糖或磷酸鈣；或黏合劑， 諸如澱粉、明膠或阿拉伯膠（acacia);或潤滑劑，諸如硬 脂酸鎂、硬脂酸或滑石。 其他醫藥組合物對於熟習此項技術者將顯而易知，包括 於持續或控制傳遞調配物中包含抗NGF抗體之調配物。用 於調配多種其它持續或控制傳遞手段（諸如脂質體載劑、 生物可侵钱微粒或多孔珠粒及積存注射劑）之技術亦為熟 習此項技術者所已知。參看例如國際專利申請案第 PCT/US93/00829號，其以引用的方式併入且描述用於傳遞 醫藥組合物之多孔聚合微粒的控制釋放。持續釋放製劑可 包括成形物品（例如膜）或微囊形式之半透聚合物基質。持 續釋放基質可包括聚酯、水凝膠、聚乳酸交酯（如美國專 151365.doc -85 · 201125581 利第3,773,919號及歐洲專利申請公開案第EP 058481號中 所揭示’其各自以引用的方式併入）、L-麩胺酸與γ L-麩胺 酸乙醋之共聚物（Sidman等人，1983, Biopolymers 22:547-556)、聚（甲基丙烯酸2-羥乙酯）(Langer等人，1981，·/. Biomed. Mater. Res. 15:167-277 及 Langer，1982，C/iem. rec/2. 12:98-105)、乙烯乙酸乙烯酯（Langer等人，上文）或 聚-D(-)-3-羥基丁酸（歐洲專利申請公開案第ep 133,988 號）。持續釋放組合物亦可包括可藉由此項技術中已知之 若干方法中之任一種製備的脂質體。參看例如Eppstein等 人，1985, τν^/. sc/· 82:3688-3692 ;歐洲 專利申請公開案第EP 036,676號；第EP 088,046號及第EP 143,949號，其以引用的方式併入本文中。 用於活體内投與之醫藥組合物通常以無菌製劑形式提 供。可藉由經無菌過濾膜過濾來滅菌。當組合物經凍乾 時’使用此方法之滅菌操作可於凍乾及復水之前或之後執 行。用於非經腸投與之組合物可以凍乾形式或以溶液形式 儲存一般將非經腸組合物置於具有無菌進入孔（access P〇rt)之谷器中’例如具有皮下注射針可穿透之塞子的靜脈 溶液袋或小瓶。 醫藥組合物—經調配，即可以溶液、懸浮液、凝膠、乳 ' 固體形式或脫水或凍乾粉末形式儲存於無菌小瓶中。 此等調配物可以即用形式或需要在投與前復原之形式（例 如凍乾形式）儲存。 本發月亦提供用於製造單次劑量投與單元之套組。本發 151365.doc • 86 · 201125581 明之套組可各自含有一具有脫水蛋白質之第一容器及一具 有含水調配物之第二容器。在本發明之某些實施例中，提 有單至及多至預填充注射器（例如液體注射器及溶解 注射器（lyosyringe))之套組。 治療上待使用之含抗NGF抗體之醫藥組合物的有效量將 視例如治療情形及目標而定。熟習此項技術者將瞭解用 於治療之適當劑量濃度將部分視所傳遞之分子、使用抗 NGF抗體之適應症、投與途徑及患者之體型（體重、體表 或器官尺寸）及/或狀況（年齡及一般健康狀況）而定。在某 些實把例t ’臨$醫師可滴定劑量及改變投藥途徑以得到 最優治療效果。典型劑量可在約〇1 pg/kg多達約3〇 mg/kg 或30 mg/kg以上之範圍内，此視上文所述因素而定。在較 佳實施例中，劑量可在〇 i pg/kg多達約3〇 mg/kg範圍内； 更佳1 Pg/kg多達約30 mg/kg範圍内；或甚至更佳5 gg/kg多 達約30 mg/kg範圍内。 在某些實施例中，組合物可藉由皮下注射投與。如上文 所述，劑量可由臨床醫師判定，然而在某些實施例中，待 藉由皮下注射投與之組合物中之NGF抗體的醫藥學上有效 里為約0.1 pg/kg至約30 mg/kg。在某些實施例中，NGF抗 體之醫藥學上有效量為每次皮下注射約3 mg至約30 mg。 在某些實施例中，投與包含多次皮下注射。在其他實施例 中’投與包含單次皮下注射。 劑量頻率將視所用調配物中特定抗NGF抗體之藥物動力 學參數而定。通常，臨床投與組合物直至達到實現所要作 151365.doc •87· 201125581 用之劑量。因此，可以單次劑量、或隨時間以兩次或兩次 以上劑量（其可含有或可不含有相同量之所要分子）、或經 由植入裝置或導管連續輸注來投與組合物。適當劑量之進 一步改進由一般技術者按常規進行且在其常規進行之工作 範圍内。適當劑量可經由使用適當劑量-反應資料來確 定。在某些實施例中，本發明抗體可長時期向患者投與。 長期投與本發明抗體使通常與針對非人類動物中之人類抗 原產生的抗體（例如非人類物種中產生之不完全人類抗體） 相關之不良免疫或過敏反應最小。 醫藥組合物之投與途徑與已知方法一致，例如經口；藉 由靜脈内、腹膜内、大腦内（腦實質内）、腦室内、肌肉 内、眼内、動脈内、門靜脈内或病灶内途徑注射；藉由持 續釋放系統或藉由植入裝置。在某些實施例中，可藉由快 速注射或藉由連續輸注或藉由植入裝置投與該等組a物。 可經由植入已吸收或囊封所要分子之膜、海綿或另一適 當材料來局部投與組合物《在某些實施例中，若使用植入 裝置’則可將該裝置植入任何適合組織或器官中，且可^ 由擴散、定時釋放藥團或連續投與來傳遞該所要分子。 在某些實施例中，本發明係關於治療由神經生長因 表對NGF敏感性增力σ引起之病況的方法 其包含向患者經口、藉由靜脈内、腹臈内、大腦内（腦 質内）、腦室内、肌肉内、眼内、動脈内、門靜脈内、 灶内或皮下途徑注射、藉由持續釋放系統或藉由植入裝 投與醫藥學上有效量之NGF抗體’其中該病況為急性\ I51365.doc -88 - 201125581 痛、牙痛、外傷疼痛'外科疼 痛 '灼痛、髓鞘脫央广 除術或膿腫引起之疼 毒、中風、= 又神經痛'癌症、慢性酒精中 中几 自痛症候群、糖尿病、後夭&&^ 群（「aids」）、毒素、仆風底土 性免疫缺陷症候 紫 ’、 予療法、-般性頭痛、偏頭痛、 叢集性頭痛、混合性血管 入ή 飞非f症候群、緊張性頭痛、 王身性發炎、關節炎、風濕病 地由十 々 思月關即炎、肌肉纖 ，准疼痛、發炎性腸病、大腸急躁症、發炎性 或不穩定膀胱功能障礙、牛/ 發炎' 症、曬傷、心臟炎、皮炎、：：t有發炎組分之皮膚病 皮x肌炎、砷經炎、膠原血管病、 慢性發炎性病況、炎性痛及相eg 廣 人汪厲及相關之痛覺過敏及異常疼痛、 神經痛及相關之痛覺過敏或異常疼痛、糖尿病性神經病變 疼痛'灼痛、交感神經維持性疼痛、傳入神經阻滞症候 群、哮喘、上皮組織損傷或功能障礙、單m呼吸、 必尿生殖、腸胃或血管區内臟螺動奈IL、創傷、燒傷、過 敏性5膚反應、搔癢、白斑病、—般性腸胃障礙、結腸 炎月潰瘍、十二指腸潰瘍、血管舒縮性或過敏性鼻炎、 或支氣管病症、痛經、消化不良、胃食道逆流、胰臟炎、 或内臟疼痛。 在某些實施例中，該等方法包含醫藥學上有效量之NGF 抗體且適用於治療或預防骨關節炎膝痛。在某些實施例 中NGF杬體之醫藥學上有效量為每次皮下注射約3 mg至 約30 mg。在某些實施例中，投與包含多次皮下注射。在 實施例中，投與包含單次皮下注射。在某些實施例中，本 發明之組合物及方法包含NGF抗體，該抗體包含含有seq 151365.doc -89- 201125581 ID NO. 44之輕鏈。在某些實施例中，nGF抗體包含含有 SEQ ID. NO. 40之重鏈。在其他實施例中，NGF抗體包含 含有SEQ ID NO. 44之輕鏈及含有SEq id· NO. 40之重鏈。 因此’根據以上本發明描述，本發明之各種態樣係關於 包含NGF抗體之方法及組合物，該抗體包含含有SEq id NO: 44之輕鏈及含有SEq id NO: 40之重鏈，其中抗體之 重鏈與輕鏈由可撓性連接子連接形成單鏈抗體。在此態樣 之一些實施例中’ NGF抗體包含單鏈Fv抗體、Fab1抗體、 (Fab’）2抗體、完全人類抗體及/或人類化抗體。在此態樣之 一些實施例中，NGF抗體抑制NGF信號傳導。 在此態樣之某些實施例中，NGF抗體以約lxl0·9或1χ1 (T9 以下、約1x10·丨。或1x10·丨G以下、或約&1〇」丨或1><1〇-1丨以下 之KD自人類NGF多肽解離。在此態樣之某些實施例中， NGF抗體在標準活體外分析中以約lxl0·8或lxl0-8以下、 約 lxlO-9 或 lxlO·9 以下、或約 〇.2χ1〇-9 或 0.2X10.9 以下之 IC50 中和人類NGF生物活性。在某些實施例中，NGF抗體以上 述1<：〇值自人類NGF多肽解離且在標準活體外分析中以上述 IC50值中和人類NGF生物活性。 亦可能需要根據本發明離體使用抗NGF抗體醫藥組合 物。在該等情形中，將已自患者移除之細胞、組織或器官 暴露於抗NGF抗體醫藥組合物，隨後將細胞 '組織及/或器 官植回患者體内。 詳言之，可藉由植入已使用諸如本文所述之方法遺傳工 程改造之特定細胞來表現及分泌多肽，從而傳遞抗NGF抗 151365.doc -90- 201125581 體。在某些實施例中，該等細胞可為動物或人類細胞，且 可為自體、異源或異種細胞。在某些實施例中，細胞可永 生化。在其他實施例中，為減少免疫學反應之可能性，可 囊封該等細胞以避免浸潤周圍組織。在其他實施例中，囊 封材料通常為生物相容、半透聚合殼或膜，其容許該（等） 蛋白質產物之釋放但防止患者免疫系統或來自周圍組織之 其他有害因子破壞細胞。 實例 包括所進行實驗及所達成結果之以下實例僅為說明目的 提供，且不欲解釋為限制本發明。 實例1 自大腸桿菌細胞產生人類NGF蛋白 選殖 rHu-NGF(l-120) 使用序列如SEQ ID NO:27及SEQ ID NO:28所示之寡核 苷酸引子及標準PCR技術自cDNA擴增編碼人類NGF之核苦 酸序列。5'引子在緊接成熟序列之密碼子1(絲胺酸）之前形 成iW/el限制位點及甲硫胺酸起始密碼子。3，引子在緊接終 止密碼子之後形成限制位點。所得pcr產物經凝膠 純化，以限制性核酸内切酶及5amHI消化，接著接合 至亦以而el及β_ΗΙ消化之載體pCFM1656中。將經接合 DNA轉型至大腸桿菌菌株657之勝任宿主細胞中。針對產 生重組蛋白質產物及質體具有正確核苷酸序列（亦即SEq ID NO:29)的能力篩選純系。重組人類ngf 1-120之胺基酸 序列如SEQ ID NO:30所示。 151365.doc •91- 201125581 表現載體pCFM1656(ATCC #69576)源自美國專利第 4,710,473號中所述之表現載體系統。pCFM1656質體可藉 由以下步驟由所述PCFM836質體（專利第4,710,473號）獲 得：（a)藉由末端填充T4聚合酶隨後鈍端接合來破壞兩個 内源性限制位點；（b)以獲自pCFM636之含有PL啟動子 的類似片段（專利第4,710,473號）置換獨特與C7a/限制 位點之間含有合成PL啟動子的DNA序列；接著（c)以使具有 如SEQ ID NO: 31及SEQ ID NO:32所示之核苷酸序列的兩 個探針黏接產生之寡核苷酸取代獨特C/d與尺限制位點 之間的小DNA序列。 大腸桿菌K12宿主菌株（Amgen菌株65 7)為自美國大腸桿 菌遺傳菌種中心（E. coli Genetic Stock Center)，Yale University，New Haven，CT(CGSC 菌株 6159)獲得之大腸桿 菌W1485(K12菌株）的衍生物。 表現 rHu-NGF(l-120) 含有NGF表現構築體之大腸桿菌細胞（如上文所述）在豐 富培養基中以饋料批次模式（fed-batch mode)酿酵。細胞在 30°C下生長至在600 nm下OD為49，接著藉由使溫度轉換 至42°C誘導。在誘導後4小時，藉由離心採集細胞。最終 OD為75。測得表現量為約0.15 g/L。 再摺疊及純化rHu-NGF(l-120) 將細胞漿料溶解於Microfluidizer中，在l〇,〇〇〇xg下離心 3 0分鐘，離心塊以1 %去氧膽酸洗滌，如上文所述離心， 所得離心塊接著以冷水洗滌且再離心。將所得離心塊 151365.doc •92- 201125581 (WIB-經洗滌包涵體）再懸浮於含有1〇 mM DTT之變性劑、8 M 脈鹽酸鹽' 50 mM Tris pH 8.5中，且在室溫下溶解！小 時，在10,000xg下離心30分鐘，且小心傾析上清液，接著 在4 C下在含有氧化還原對之水性緩衝液中稀釋2 5倍，持 續5天。接著滴定所得再摺疊物直至pH 3.0，經0.45 μΜ過 濾器過濾。使用具有標準NaCl梯度之Sp-瓊脂糖凝膠快速 流動管柱純化再摺疊物。隨後濃縮來自陽離子交換管柱之 池且等分試樣在-8(TC下冷凍。蛋白質之純度藉由sdS-聚 丙烯醯胺凝膠電泳（SDS-PAGE)評定且藉由庫馬斯藍染色 (Coomassie blue stain)分析。此方法之經純化蛋白質大於 9 0 %主頻帶。 實例2 產生針對神經生長因子（NGF)之人類單株抗體 轉殖基因HuMab及KM小鼠 使用各自表現人類抗體基因的HCo7、HCol2、 HCo7+HCol2 '及轉殖基因小鼠之KM菌株製備NGF之完全 人類早株抗體。在每一種此等小鼠菌株中，内源小鼠κ輕 鏈基因已如Chen等人（1993, 乂 12:811-820)中所述以 同型接合方式中斷，且内源小鼠重鏈基因已如國際專利申 請公開案第WO 01/09 187號（以引用的方式併入）之實例1中 所述以同型接合方式中斷。如Fishwild等人（1996, 14:845-851)中所述，此等小鼠菌株各具有 人類κ輕鏈轉殖基因KCo5。HCo7菌株具有如美國專利第 5,545,806號、第5,625,825號及第5,545,807號（以引用的方 151365.doc •93· 201125581 式併入）中所述之HCo7人類重鏈轉殖基因。HCol2菌株具 有如國際專利申請公開案第WO 01/09187號（以引用的方式 併入）之實例2中所述的HCol2人類重鏈轉殖基因。 HCo7+HCol2菌株具有HCo7及HCol2重鏈轉殖基因兩者且 各轉殖基因為半合子。KM小鼠包含如Tomizuka等人（1997, Ge加ί· 16，133-143及 2000, /Voc. #ai/· dead. Sci， 97，722-727)中所述之SC20重鏈轉殖基因《此轉殖基因未 整合至小鼠染色體中，但另外以獨立染色體片段形式增 殖。片段包括約15 MB之人類染色體14。其含有完整人類 重鏈基因座’包括所有VH、D及JH基因區段及所有重鏈恆 定區同型。所有此等菌株在本文中均稱為HuMab小鼠。 HuMab免疫： 為了產生NGF之完全人類單株抗體，以源自大腸桿菌細 胞之經純化重組NGF作為抗原（實例1)免疫HuMab小鼠。 HuMab小鼠之一般免疫流程描述於L〇nberg等人（1994, Waiwre 368:856-859 ; Fishwild等人，上文；及國際專利申 請公開案第WO 98/24884號，其教示各自以引用的方式併 入）中。小鼠在第一次輸注抗原時為6-16週大。使用NGF抗 原之經純化重組製劑（25-100 μβ)腹膜内（IP)或皮下（SC)免 疫HuMab小鼠。 使用元全弗氏佐劑（complete Freund’s adjuvant)中之抗原 及兩次注射’繼之以不完全弗氏佐劑中之抗原ιρ免疫2·4 週（總共多達9次免疫）來實現HuMab轉殖基因小鼠之免疫。 數十個小鼠以各抗原免疫。總共118隻HCo7、HCol2、 151365.doc -94- 201125581 HCo7+HCol2及KM菌株之小鼠以NGF抗原免疫。藉由眼窩 後放血監測免疫反應。 為了選擇產生結合人類NGF之抗體的HuMab小鼠，藉由 如上文Fishwild等人所述之ELISA測試經免疫小鼠之血 清。簡言之，微量滴定盤塗有PBS中1-2 pg/mL來自大腸桿 菌之經純化重組NGF(實例1)，且在4°C下每孔50 pL培育隔 夜，接著以每孔200 μί於PBS/Tween(0.05%)中之5%雞灰清 阻斷。向各孔中添加來自經NGF免疫之小鼠的血漿稀釋 液，且在環境溫度下培育1-2小時。滴定盤以PBS/Tween洗 滌’接著與結合至辣根過氧化酶（HRP)的山羊抗人類IgG Fc特異性多株試劑一起在室溫下培育1小時。滴定盤以 PBS/Tween洗滌’且與結合至辣根過氧化酶（HRp)之山羊 抗人類IgG Fc特異性多株試劑一起在室溫下培育i小時。 洗務後’滴定盤以ABTS受質（Sigma Chemical Co.，St. Louis，MO，目錄號 a-1888, 0.22 mg/mL)顯色且藉由在 415-495 nm波長下測定光學密度（〇D)進行分光光度分析。如下 文所述使用具有充分抗NGF人類免疫球蛋白效價之小鼠產 生單株抗體。 製造NGF之人類單株抗體的融合瘤之產生 以抗原靜脈内加打2天使小鼠產生單株抗體，隨後處 死，且此後移除脾臟。自HuMab小鼠分離小鼠脾細胞且使 用標準方案與PEG—起融合至小鼠骨髓瘤細胞株。通常， 各抗原進行10 - 2 〇次融合。 簡S之’使來自經免疫小鼠之脾淋巴細胞的單細胞懸浮 151365.doc -95- 201125581 液與 50% PEG(Sigma)—起融合至 1/4數目之P3X63-Ag8.653 非分泌型小鼠骨髓瘤細胞（ATCC，寄存編號CRL 1580) » 細胞以每孔約1 X 105個塗於平底微量滴定盤中，隨後在選 擇性培養基（含有10%胎牛血清、10% P388D1-(ATCC，寄 存編號CRL TIB-63)條件培養基、含3-5% 〇rigen(IGEN)之 DMEM(Mediatech，目錄號CRL 10013，具有高糖、L·麩醯 胺酸及丙酮酸鈉）加5 HEPES、0.〇55 mM 2-巯塞乙醇、 50 mg/mL·僅大黴素（gentamyCin)&1XHAT(Sigma，目錄號 CRL P-7185))中培育約2週。1_2週後，在以HT置換HAT的 培養基中培養細胞》 篩選所得融合瘤以產生抗原特異性抗體。藉由Elis A(上 文所述）篩選個別孔之人類抗NGF單株IgG抗體。一旦出現 大規模融合瘤生長，則一般在1 〇_ 1 4天後監測培養基。再 塗分泌抗體之融合瘤，再次篩選，若對人類IgG仍呈陽 性，則藉由限制稀釋法次選殖抗NGF單株抗體至少2次。 接著在組織培養基中活體外培養穩定次純系產生少量抗體 以供表徵。 選擇結合至NGF之人類單株抗體 使用如上文所述之ELISA分析篩選顯示對NGF免疫原具 有陽性反應性的融合瘤。對分泌以高親合力結合至NGF之 單株抗體的融合瘤進行次選殖且進一步表徵。選擇各融合 瘤之保留親本細胞之反應性（如ELISA所測定）之一個純系 來製備儲存於液氮中之5-10小瓶細胞庫（cell bank)。 進行同型特異性ELISA，測定如本文所揭示產生之單株 151365.doc 96· 201125581 抗體的同型。在此等實驗中，微量滴定盤孔每孔塗有50 gL 1 pg/mL小鼠抗人類κ輕鏈於PBS中之溶液且在4°C下培育隔 夜。在以5%雞血清阻斷後，使滴定盤與來自各測試單株 抗體及純化同型對照組之上清液反應。各滴定盤在環境温 度下培育1-2小時。各孔接著與各種人類IgG特異性辣根過 氧化酶結合之山羊抗人類多株抗血清反應，且如上文所述 對各滴定盤進行顯色及分析。 使用如下文所述之多種生物分析進一步測試如ELISA所 偵測顯示與NGF大量結合之自融合瘤上清液純化之單株抗 體的生物活性。 實例3 選擇及選殖具有有效NGF中和活性之抗NGF抗體 藉由測量各經修飾肽阻斷對香草素受體-1 (VR1)表現之 NGF誘導的能力評估最初在實例2中識別為NGF活性抑制 劑（亦即NGF「中和」）之抗體的效用。 背根神經節神經元培養物 在無菌狀態下，自定時懷孕，最終麻醉之Sprague-Dawley大鼠（Charles River, Wilmington, ΜΑ)的子宮手術移 出之第19天胚胎（El9)大鼠的所有脊髓區段逐個剝離背根 神經節（DRG)。將DRG收集於含有5%熱滅活馬血清 (GibcoBRL)之冰冷 L-15 培養基（GibcoBRL，Grand Island, NY)中，且移除任何鬆散結締組織及血管。DGR在無Ca2 + 及Mg2+之杜爾貝科氏構酸鹽緩衝鹽水（Dulbecco's phosphate buffered saline，DPBS)，pH 7.4(GibcoBRL)中沖洗兩次。接著 151365.doc -97- 201125581 使用木瓜酶解離系統（Worthington Biochemical Corp.，
Freehold，NJ)將DRG解離成單細胞懸浮液。簡言之，在 37°C下，DRG在含有20 U/ml木瓜酶於厄爾平衡鹽溶液 (Earle's Balanced Salt Solution，EBSS)中之消化溶液中培 育50分鐘。藉由經火焰磨光巴氏滴管（Pasteur pipette)在由 MEM/Ham's F 12(1:1)、1 mg/ml類卵黏蛋白抑制劑及 1 mg/ml 卵白蛋白、及0.005%去氧核糖核酸酶I(DNase)組成之解離 培養基中滴定來解離細胞。 解離之細胞在200xg下成塊5分鐘，且再懸浮於含有i mg/ml 類卵黏蛋白抑制劑、1 mg/ml卵白蛋白及0.005% DNase之 EBSS中。在20〇xg下經含有1〇 mg/ml類卵黏蛋白抑制劑、 10 mg/ml卵白蛋白之梯度溶液離心細胞懸浮液持續6分鐘 以移除細胞碎片，接著經88-μιη耐綸篩（Fisher Scientific， Pittsburgh，PA)過濾移除任何凝塊。以血球計測定細胞數 目’且將細胞以每孔ΙΟχΙΟ3個細胞在完全培養基中接種至 聚鳥胺酸100 kg/ml(Sigma，St. Louis, MO)及小鼠層黏連蛋 白1 pg/ml(GibcoBRL)塗覆之96孔盤中。完全培養基由i:i 之最小必需培養基（MEM)及Ham's F12、青黴素（penicillin) (100 U/ml)、鍵黴素（streptomycin)(100 pg/ml)及 10% 熱滅 活馬血清（GibcoBRL)組成。培養物保持於37°C、5% C02 及100%濕度下。為了控制非神經元細胞的生長，培養基 中包括5-氟-2·-脫氧尿苷（75 μΜ)及尿苷（180 μΜ)。 以NGF及抗NGF處理 塗佈2小時後，細胞以10 ng/ml(0.38 ηΜ)濃度之重組人 151365.doc 98- 201125581 類(3-NGF(Amgen)或重組大鼠P-NGF(R&D Systems, Minneapolis, MN)處理。向各培養盤施用包含連續稀釋之抗ngF抗體 (R&D Systems)的陽性對照組。使用3.16倍連續稀釋以1〇倍 濃度添加測試抗體。將所有樣品稀釋於完全培養基中，隨 後添加至培養物中。培育時間為測量VR1表現前40小時。 測量DRG神經元中之VR1表現 培養物以4。/〇三聚甲醛固定於漢克氏平衡鹽溶液（Hanks， balanced salt solution)中持續 15分鐘，以 Superblock (Pierce， Rockford，IL)阻斷，且在室溫下以含〇25% N〇nidet p_ 40(Sigma)之 Tris-HCl(Sigma)緩衝鹽水（TBS)打洞 (permeabiliZe)l小時。培養物以含有 〇 1% Tween 20(Sigma) 之TBS沖洗一次，且與家兔抗VRi IgG—起在室溫下培育 1.5小時’隨後在室溫下培育以標記之抗家兔二次抗體
(Wallac Oy，Turku, Finland)l小時。各抗體培育後，以TBS 洗蘇（3 χ5分鐘’緩慢振盪）❶向培養物中添加增強溶液（每 孔15〇 μ卜Wallac Oy)。接著用時差式螢光計（WaUac 〇y) 測量螢光信號。藉由與0-1000 ng/ml之NGF滴定標準曲線 比較測定以經修飾肽處理之樣品中的VRi表現。藉由與未 經NGF處理之對照組比較測定ngf對DRG神經元中之VR1 表現的抑制作用百分比（與最大可能抑制比較）^表2及表5 中給出結果。 細胞株標記為# 11 〇_#丨29。來自細胞株# 119、# 124及 #125之抗體表明極有效NGF中和活性（圖〇。#124細胞株為 親本細胞株’亦稱為4D4。#119及#125細胞株為4D4親本 151365.doc •99· 201125581 之次純系。使來自包含融合瘤# 124(4D4)之初始小瓶的額 外樣品生長且標記為#167(4D4)。 對融合瘤#167(4D4)產生之抗體進行與先前樣品相同的 基於DRG神經元之NGF中和分析。抗體#167(4D4)以0.50 nM之IC50表明強抗NGF活性（圖2)，此與樣品#119、#124及 # 125的活性一致。4個樣品之活性顯示於表2中。 表2
DRG細胞中使用0.38 nM hNGF之抗hNGF活性 編碼 IC50 119(來自 124) < 1.2 nM 124(親本） < 0.57 nM 125(來自 124) < 0.3 nM 167(來自與124相同之樣品)* 0.50 nM 末端定序及質譜分析 製備經純化抗NGF融合瘤抗體樣品用於蛋白質定序及 LC/MS分析。藉由使用Amicon centriprep-30濃縮培養基直 至體積小於15 ml，從而自條件培養基純化抗體。 rProA(Pharmacia)樹脂批料以PBS洗務4次，且最後一次洗 滌後在PBS中製成50%漿料。向抗體樣品中添加適當量之 rProA樹脂（約5 pg抗體/μΐ樹脂，但使用不少於50 μΐ樹脂） 且在4°C下培育隔夜。將Ab-樹脂混合物離心且收集未結合 之部分。添加0.5 ml PBS且轉移至 0.45 μπι Spin-X(CoStar) 試管後，將樣品在10000 rpm下離心3分鐘。接著將樹脂以 0.5 ml PBS洗滌至少3次，接著添加1.5倍樹脂體積之0.1 Μ 甘胺酸（pH 2.7)，且在室溫下培育10分鐘，隨後於10000 rpm下再離心3分鐘，收集上清液。此溶離步驟再重複兩 151365.doc -100- 201125581 次，接著將合併之上清液以1/25體積1.0 M tris(pH 9.2)中 和° 在經新的Spin-x管（0.2 μιη)之最終過濾步驟後，抗體使 用人類IgG作為標準物之標準Bradford分析或較大樣品在 2 80下之吸光度定量。亦使用2 pg各樣品以及2 pg人類 1呂01，1<;(8丨811^)跑膠。對於質譜分析’將44§樣品去糖、還 原及裝載至線上連接至Finingan LCQ質譜儀之HPLC(HP 1090) 上。藉由逆相HPLC分離輕鏈與重鏈。亦收集輕鏈及重鏈 進行N末端蛋白質定序分析。 抗NGF #167(4D4)抗體樣品之輕鏈及重鏈的兩個N末端 序列匹配抗NGF #119(4D4)抗體樣品之兩個N末端序列。 此外，所測量之抗體質量指示自#167及#119融合瘤分離之 抗體相同。抗NGF #167之輕鏈的測量解迴旋質量（23096) 與抗NGF Ab #119之輕鏈測量質量（23096)匹配。 選殖抗NGF抗體重鏈及輕鏈 使用表現最有效NGF結合單株抗體4D4.D7之融合瘤作為 使用TRIzol®試劑（Invitrogen)分離總RNA的來源。使用具 有延伸接附子（5'-GGC CGG ATA GGC CTC CAN NNN NNT-3')(SEQ ID NO: 33)之隨機引子合成第一股cDNA，且 根據製造商說明書使用GeneRacer™套組（Invitrogen)進行5' RACE(cDNA端快速擴增）製備型分析。為了製備編碼完全 輕鏈之cDNA，前置引子為GeneRacer™巢式引子，且反置 引子為5'-GGG GTC AGG CTG GAA CTG AGG-3'(SEQ ID NO: 34)。為了製備編碼重鏈可變區的cDNA，前置引子為 151365.doc -101 - 201125581
GeneRacerTM巢式引子，且反置引子為5’-TGA GGA CGC TGA CCA CAC G-3’（SEQ ID NO 35) » 將 RACE 產物選殖至 pCR4-TOPO(Invitrogen)中且測定序歹ij 。使用共同序歹ij設計 用於全長抗體鏈PCR擴增的引子。 為了製備編碼抗NGF 4D4.D7 κ輕鏈之cDNA ’ 5，PCR引 子編碼信號序列之胺基末端、Xbal限制性酶位點及最佳 Kozak序列（5，-CAG CAG AAG CTT CTA GAC CAC CAT GGA CAT GAG GGT GCC CGC TCA GCT CCT GGG-3'； SEQ ID NO: 36)。3’引子編碼羧基末端及終止密碼子、以 及心/1限制性位點（5，-CTT GTC GAC TCA ACA CTC TCC CCT GTT GAA GCT C-3· ; SEQ ID NO: 37)。將所得PCR產 物片段純化，以沿及Sdl消化，接著凝膠分離且接合至 哺乳動物表現載體pDSRa20(參看國際申請公開案第WO 90/143 63號，為了任何目的，其以引用的方式併入本文 中。藉由定點突變誘發將pDSRal9中之核苷酸2563由「鳥 苷」變為「腺苷」產生pDSRot20)。 為了製備編碼抗NGF 4D4.D7重鏈之cDNA，5' PCR引子 編碼信號序列之胺基末端、限制性酶位點及最佳 Kozak序歹|J(5'-CAG CAG AAG CTT CTA GAC CAC CAT GGA GTT GGG GCT GTG CTG GGT TTT CCT TGT T-3'； SEQ ID NO: 38) » 3'引子編碼羧基末端及終止密碼子、以 及*Sa/I限制性位點（5'-GCA TGT CGA CTC ATT TAC CCG GAG ACA GGG AGA G-3, ； SEQ ID NO: 39)。將所得產物 純化，以Xbal及Sail消化，凝膠分離且接合至pDSRa20載 151365.doc -102- 201125581 體中。 如將核苷酸序列轉譯成預測之胺基酸且將胺基酸之分子 量相加所測定，抗NGF Ab 4D4純系輕鏈DNA序列的計算 質量（23099)與如質譜分析測定之測量質量匹配。在儀器偏 差内，抗NGF Ab #167重鏈的測量解迴旋質量（49479)與抗 NGF Ab #119重鏈的測量質量（49484)匹配’且亦與抗NGF Ab 4D4純系重鏈DNA序列之理論質量（49484)匹配（表3)。 N末端蛋白質序列資料及LC/MS確認融合瘤#119與融合 瘤# 167表現相同之抗體。此外，抗體基於序列之計算質量 進一步確認觀測結果。 表3-質諸分析結果之概述 抗NGF Ab Ab #167之測量質量 Ab #119之測量質量 源自Ab 4D4之DNA 序列的理論質量 輕鏈 23096 23096 23099 重鏈 49479 49484 49484 實例4 在中國倉鼠卵巢（CHO)細胞中表現抗NGF抗體
藉由使用磷酸鈣法將4D4-重鏈/pDSRal9 IgG2或4D4-重 鏈/pDSRal9 IgGl及NGF-K/pDSRal9質體共轉染至缺乏二 氫葉酸還原酶（DHFR·)之無丘清適應中國倉鼠卵巢（CHO) 細胞中穩定表現4D4抗NGF mAb。在含有透析血清但不含 次黃嘌呤-胸苷之培養基中選擇轉染之細胞以確保表現 DHFR酶之細胞的生長。使用諸如ELISA之分析篩選經轉 染之純系，以偵測條件培養基中4D4抗NGF mAb之表現。 最高表現純系經受增加濃度之甲胺喋呤（MTX)以供DHFR 151365.doc -103· 201125581 擴增。使用諸如ELISA之分析篩選MTX擴增之純系，以偵 測條件培養基中4D4抗NGF mAb之較高表現。對最高表現 純系進行次選殖以獲得同質群體且形成細胞庫。 可使用與上文針對抗NGF單株抗體所述相同之方案在缺 乏DHFR之中國倉鼠卵巢細胞中產生本發明之重組抗nGF 抗體。將編碼各本發明抗NGF抗體之完全重鍵或輕鏈的 DNA序列選殖至表現載體中。CHOd細胞以能夠表現完全 重鏈之表現載體及表現適當抗NGF抗體之完全輕鍵的表現 載體共轉染。舉例而言，為了產生抗NGF抗體，使細胞以 能夠表現包含如SEQ ID NO: 40所闡述之胺基酸序列之完 全重鏈的載體及能夠表現包含如SEQ ID NO: 44所闡述之 胺基酸序列之完全輕鏈的載體共轉染。表4概述具有多個 IgG重鏈恆定區之4D4抗體之完全重鏈及完全輕鏈。 表4 抗體 重鏈可變區 + 重鏈恆定區 完全重鏈 4D4(IgG2) SEQIDNO: 10 + SE〇 ID NO: 4 SEQ ID NO: 40 4D4(IgGl) SEQ ID NO: 10 + SE〇 ID NO: 2 SEO ID NO: 41 4D4(IgG4) SEQ ID NO: 10 + SEQ ID NO: 6 SE〇 ID NO: 42 4D4(IgG3) SE〇 ID NO: 10 + SEO ID NO: 26 SEO ID NO: 43 輕鏈可變區 抗體 + 完全輕鏈 輕鏈恆定區 4D4 SEQ ID NO: 12 + SE〇 ID NO: 8 SEO ID NO: 44 實例5 表徵抗NGF 4D4抗體之活性 測試經短暫表現之在旋轉（S)或轉瓶（R)條件下生長之細 151365.doc -104· 201125581 胞中產生的抗NGF 4D4抗體，以在如上文（實例3)所述進行 之基於DRG神經元之NGF中和生物分析中確認其中和NGF 的能力。 在無血清懸浮液適應之293T細胞中短暫表現NGF抗體。 轉染500 mL或1 L培養物。簡言之，將細胞接種液（5.0xlO5 個細胞/毫升X培養物體積）在4°C下在2,500 RPM下離心10 分鐘以移除條件培養基。將細胞再懸浮於無血清DMEM 中，且在2,500 RPM下在4°C下再離心10分鐘。將洗滌溶液 抽氣後：將細胞再懸浮於1 L或3 L旋轉燒瓶培養物中之生 長培養基[DMEM/F 12(3 :1)+1 X胰島素-轉鐵蛋白-硒補充液 + 1χ青黴素鍵黴素麵酿胺酸（Pen Strep Glut)+2 mM L-楚醯 胺酸+20 mM HEPES + 0.01% Pluronic F68]中。將旋轉燒瓶 培養物保持於125 RPM下之磁力攪拌板上，將其置於保持 於3 7°C及5% C02中之含濕氣培育箱中。使質體DNA與轉 染試劑在50 mL錐形管中複合。在無血清DMEM中在5%最 終培養物體積中製備DNA-轉染試劑複合物。首先向無血 清DMEM中每毫升培養物添加1 pg質體DNA，隨後每毫升 培養物添加1 μΐ X-TremeGene RO-1 539。複合物在室溫下 培育約30分鐘，接著添加至旋轉燒瓶中之細胞中。轉染/ 表現7天，此後藉由在4°C下在4,000 RPM下離心60分鐘採 集條件培養基。 對於轉瓶短暫轉染，使用生長且保持於補充有5% FBS+1X非必需胺基酸+ 1χ Pen Strep Glut+1 X丙酮酸鈉之 DMEM中的 293T黏著細胞。將約4-5xl07個 293T細胞接種 151365.doc -105- 201125581 於850 cm2轉瓶中隔夜。接著在第2天使用FuGene6轉染試 劑轉染先前接種之細胞。在約6·75 mL無血清DMEM中製 備DNA-轉染試劑混合物。首先添加675 μΐ FuGene6轉染試 劑，隨後添加112.5 pg質體DNA。複合物在室溫下培育30 分鐘。接著將全部混合物添加至轉瓶中。轉瓶充以5°/。C02 氣體混合物，蓋緊蓋子且置於在0.35 RPM下旋轉之輥筒架 上的37°C培育箱中。轉染24小時，此後將培養基換為100 mL DMEM+1 X膜島素-轉鐵蛋白-石西補充液+ lxPen Strep Glu+1 X 非必需胺基酸+ 1χ丙酮酸鈉。通常，自各轉瓶獲得兩份100 ml 48小時採集物。彙聚採集之無血清條件培養基且在4°C下 在4,000 RPM下離心30分鐘。 4D4.IgGl與4D4.IgG2皆顯示針對人類NGF之IC50值為約 0.14 nM至約0.2 nM的有效活性（圖2)。活性分析之結果概 述於表5中。抗體顯示對大鼠NGF幾乎無活性（圖3)。結果 類似於自上文所述之融合瘤直接測試之抗體活性。 表5
Ab hNGF之IC50 (nM> rNGF之IC50 (nM) 4D4.IgGl.R 0.1488 >34nM 4D4.IgGl.S 0.1587 >45nM 4D4.IgG2.R 0.2047 >59nM 4D4.IgG2.S 0.2063 >37nM hNGF=人類NGF，rNGF=大鼠NGF，R=轉瓶培養，S=旋轉培養 實例6 產生抗NGF抗體 藉由在CHO細胞之純系中表現產生抗NGF抗體。對於每 次生產運行，將來自單個小瓶之細胞解束至無血清細胞培 151365.doc -106- 201125581 養基中。細胞最初在τ燒瓶中生長，隨後在旋轉燒瓶中生 長，接著在按比例放大至2000 L生物反應器之不鏽鋼反應 器中生長。使用饋料批次培養物在2000 L生物反應器中進 行生產，其中添加含有濃縮培養基組分之養分饋料以保持 細胞生長及培養物存活力。生產持續約2週，其間細胞組 成性產生抗NGF抗體且分泌至細胞培養基中。 生產反應器控制於預定pH值、溫度、及溶氧含量下：藉 由添加二氧化碳氣體及碳酸鈉控制pH值；藉由空氣、氮氣 及氧氣流控制溶氧。 生產結束時，將細胞培養液饋入至磁碟組式離心機且自 細胞分離培養物上清液。經深度型過渡器，繼之以0.2 μιη 過濾器使濃縮物進一步澄清。接著藉由切向流超濾作用濃 縮已澄清條件培養基。將條件培養基濃縮1 5至30倍。接著 藉由純化處理所得濃縮條件培養基或冷凍所得濃縮條件培 養基以供在晚些時候純化。 實例7 與其他神經營養素之交叉反應性 在不同生物分析中測試4D4抗體對人類ΝΤ3或人類BDNF 的交叉反應性，包括針對人類ΝΤ3之DRG神經元存活分析 及針對人類BDNF之培養DΑ神經元中之D Α吸收分析。 以NT3、抗NT3及抗NGF抗體處理DRG培養物 塗佈2小時後，以重組hNT-3 100 ng/ml(3.8 nM)處理DRG 細胞（如上文實例3中所述之分離程序）。連續稀釋之抗 hNT3抗體（R&D)用作陽性對照。以1 0個點、3.1 6倍連續稀 151365.doc -107- 201125581 釋在各種濃度下添加未知物（抗NGF Ab樣品）。將所有樣品 稀釋於完全培養基中，隨後添加至培養物中。 測量DRG神經元中之MAP2表現 培養物以4%三聚甲醛固定於漢克氏平衡鹽溶液中持續 15分鐘，以Superblock(Pierce)阻斷1小時，且在室溫（RT)下 以含 0.25% Nonidet P-40(Sigma)之 Tris-HCl(Sigma)緩衝鹽 水（TBS)打洞1小時。培養物以含有0.1% Tween20(Sigma) 之TBS沖洗一次，且與小鼠抗MAP2 IgG(Chemicon， Temecula，CA)—起在室溫下培育1.5小時，隨後在室溫下 培育Eu標記之抗小鼠二次抗體（Wallac Oy, Turku，Finland) 持續1小時。各抗體培育後，以TBS洗滌（3x5分鐘，溫和振 盪）。向培養物中添加增強溶液（每孔150 ml，Wallac Oy)， 且接著用時差式螢光計（Wallac Oy)測量螢光信號。 胚胎中腦培養物 使用第 19天胚胎（E19)Sprague-Dawley 大鼠（Jackson Labs)。 移除富含多巴胺激導性神經元之中腦腹部組織且轉移至不 含Ca++及Mg++之冷杜爾貝科氏磷酸鹽緩衝鹽水（DPBS)，pH 7.4(Gibco)中。使用木瓜酶解離系統（Worthington Biochemical Corp.，Freehold，NJ)將組織片段解離成單細胞懸浮液。簡言 之，在37°C下，組織片段在含有20 U/ml木瓜酶於厄爾平 衡鹽溶液（EBSS)中之消化溶液中培育50分鐘。藉由經火焰 磨光巴氏滴管在由MEM/Ham’s F12(l:l)、1 mg/ml類卵黏 蛋白抑制劑及1 mg/ml卵白蛋白、及0.005%去氧核糖核酸 酶I(DNase)組成之解離培養基中滴定來解離細胞。解離之 151365.doc -108 * 201125581 細胞在20〇xg下成塊5分鐘，且再懸浮於含有1 mg/ml類卵 黏蛋白抑制劑' 1 mg/ml卵白蛋白及0.005% DNase之EBSS 中。在200xg下經含有1〇 mg/mi類印黏蛋白抑制劑、1〇 mg/ml 卵白蛋白之梯度溶液離心細胞懸浮液持續6分鐘以移除細 胞碎片’且經25 Nitex耐綸篩（Tetko，Inc.)過濾移除凝 塊。將解離之細胞以100,〇〇〇個/cm2之密度塗佈於組織培養 盤中。如先前所述將各培養盤以聚鳥胺酸100 pg/ml(Sigma) 及小鼠層黏連蛋白1 pg/ml(Gibco BRL)預塗覆（Louis JC等 人，J. P/mrwaco/•五Μα」992; 262:1274-1283.)。培養 基由最小必需培養基（MEM)/Ham's F12(1:1)、12%馬血清 (Gibco)、100 Mg/ml 轉鐵蛋白及 2.5 pg/ml胰島素（Sigma)組 成。培養物保持於3 7°C，5% C02及100%濕度下持續6天。 以BDNF及抗BDNF或抗NGF處理中腦培養物 塗佈後2小時’向細胞中添加1 〇 ng/ml之BDNF，隨後連 續濃縮抗NGF Ab樣品。抗BDNF抗體（在Amgen產生）用作 陽性對照。 中腦神經元之DA吸收 如先前所述進行多巴胺吸收分析（Friedman, L.及 Mytilineou，C., 1987; 79:65-72)。在第 6 天，培養物以含有5.6 mM葡萄糖、1.3 mM EDTA及〇·5 mM 巴吉林（pargylin)(—種單胺氧化酶抑制劑）的預升溫之 1(^&5-11丨11§61>破酸鹽缓衝液^117.4)洗務一次。在37。(3下’ 將培養物在含有50 nM [3H]DA(NEN)之吸收緩衝液中培育 60分鐘。藉由移除吸收緩衝液停止吸收，且培養物以 151365.doc •109- 201125581
Krebs-Ringer填酸鹽緩衝液洗蘇3次。藉由向混合物中直接 添加液體閃爍混合液’即opticphase supermix(Wallac)溶解 細胞，從而釋放[3H]DA。接著在microbeta-plus液體閃燦 計數器（Wallac，Inc.)中計數細胞溶解產物之放射性。藉由 向吸收缓衝液中添加0.5 mM GBR12909(—種高親和力DA 吸收位點之特異性抑制劑）（Heikkila RE及Mazino L， 五wropeow 1984; 103:241-8)來評定 低親和力DA吸收，且自總吸收量減去以獲得高親和力DA 吸收值。 表6 抗體 hNT-3之IC50 (nM) hBDNF之IC50 (nM) 4D4 (IgG2) > 13.75 > 13.75 實例8 識別抗NGF抗體之抗原決定基 藉由有限蛋白水解之抗原決定基定位 在4°C 下，將5 pg NGF 與 4D4(11 μβ)—起在 〇.1 M Tris 緩 衝液，pH 7·5中培育30分鐘。接著在37°C下，將複合物以 蛋白酶（枯草菌蛋白（subtilisin))l pg消化1小時及2小時。將 HPLC肽圖譜彼此比較以發現經4D4抗體保護之肽。NGF之 有限蛋白水解表明若干主要肽最初自NGF釋放。尤其關注 的是，產生肽S18.3、S 18.5及S34.4且以蛋白水解產生之抗 體保護。其他峰未顯著形成或經保護。兩個實驗（1小時及 2小時消化）產生之經保護肽顯示於表7中。 151365.doc • 110· 201125581 表7 保護％ 1小時消化 2小時消化 S16.1 QAA(96-98) C末端 — 57 S18.3 FFETK(53-57) (SEQ ID NO: 45) 環區 40 45 S18.5 SSSHPIFHR(l-9) (SEQ ID NO: 46) (HWNSY)* (SEQ ID NO: 47) N末端 40 50 S34.4 NSVEKQYFFETK(46-57) (SEQ ID NO: 48) 環區 69 38 自肽峰高度計算保護百分比。SI 8.5含有兩個肽，但僅 一個肽（SSSHPIFHR; SEQ ID NO: 46)經4D4抗體保護，因 為如280 nm吸光度下所偵測，另一肽峰（HWNSY ; SEQ ID NO: 47)在添加4D4抗體時未改變。肽S18.3為S34.4之C末 端部分，其皆來自同一環區。N末端及中心環區亦為可能 之抗原決定基。 經消化肽之Microcon分離 在4°C下，枯草菌蛋白消化之材料（各3 pg)與活性4D4抗 體及滅活單株抗體（#162)(8 pg)—起在0.1 M Tris缓衝液， pH 7.5 中培育30分鐘。藉由Microcon 10(Millipore Corp.， Bedford, Mass)分離經結合/未結合肽，藉由HPLC分析兩部 分（經結合及未結合）以發現結合至抗體之肽。回收藉由以 4D4抗體及# 1 62處理後HPLC比較未結合部分及Microcon分 離識別出的兩個廢棄峰，指示抗體結合肽。4D4結合肽 為·
Sl(4·4)…-SRKAVRR(113-119)(SEQIDNO:49)，C末端；及 S2(28.3)----EVMVL(35-39)(SEQIDNO:50)，環區。 151365.doc 201125581 或者以Lys-C (K)消化NGF樣品持續24小時。將半胱胺酸 殘基還原且在無變性劑之情形下羧曱基化。樣品與單株抗 體4D4及AMG162 —起培育，隨後Microcon 100分離。藉由 逆相HPLC分析經結合及未結合部分。如下文所指示，僅 兩種肽識別為抗體結合K肽。藉由序列分析測定肽之計算 質量，且肽的質譜分析一致。如下文所指示，肽定位於N 末端及C末端區。 Κ1(37·6)…-SSSHPIFHRGEFSVCDSVSVWVGDK(SEQ IDNO: 51) 計算質量=2821 ;觀測質量=2828.2 ; N末端 K2(39.5)…-QAAWRFIRIDTACVCVLSRK(SEQ ID NO: 52) 計算質量=2452 ;觀測質量=2459.5 ; C末端 前述抗原決定基定位實驗指示至少三個區為4D4抗體的 可能抗原決定基，包括N末端區（1-9)、内部區（46-57)及C 末端區（96-98)。此外，AspN消化揭示由…SSHPIFHRGEFSVC---組成之肽片段（SEQ ID NO: 53)經4D4抗體保護，而胰蛋白 酶消化顯示由---SSHPIFHR----組成之肽片段（SEQ ID NO: 54)未經4D4抗體保護。因此，在N末端，GEFSVC序列 (SEQ ID NQ: 55)對結合至4D4抗體最重要。 為了更明碟界定抗NGF抗體4D4.IgGl之抗原決定基，使 用標準技術基於完整人類成熟NGF(hNGF)序列合成產生總 共23個肽（表8)。肽為15個胺基酸長，10個胺基酸重疊，且 在C末端加尾半胱胺酸以允許與基質結合。使用上文所述 之人類抗hNGF Ab 4D4.IgGl進行定位實驗。 151365.doc • 112* 201125581 表8 狀編號 序列 SEQ ID NO 33582-27-01 SSSHPIFHRGEFSVC(1-15) 56 33582-27-02 IFHRGEFSVADSVSVC(6-20) 57 33582-27-03 EFSVADSVSVWVGDKC(11 -25) 58 33582-27-04 DSVSVWVGDKTTATDC(16-30) 59 33582-27-05 WVGDKTTATDIKGKEC(21-35) 60 33582-27-06 TTATDIKGKEVMVLGC(26-40) 61 33582-27-07 IKGKEVMVLGEVNIN(31 -45) 62 33582-27-08 VMVLGEVNINNSVFKC(36-50) 63 33582-27-09 EVNINNS VFKQ YFFEC(41-55) 64 33582-27-10 NSVFKQYFFETKARDC(46-60) 65 33582-27-11 QYFFETKARDPNPVDC(51 -65) 66 33582-27-12 TKARDPNPVDSGARDC(56-70) 67 33582-27-13 PNPVDSGARDIDSKHC(61-75) 68 33582-27-14 SGARDIDSKHWNSYC(66-80) 69 33582-27-15 IDSKHWNSYATTTHTC(71-85) 70 33582-27-16 WNSYATTTHTFVKALC(76-90) 71 33582-27-17 TTTHTFVKALTMDGKC(81 -95) 72 33582-27-18 FVKALTMDGKQAAWRC(86-100) 73 33582-27-19 TMDGKQAAWRFIRIDC(91-105) 74 33582-27-20 QAAWRFIRIDTAAVC(96-110) 75 33582-27-21 FIRIDTA AVAVLSRKC( 101-115) 76 33582-27-22 TAAVAVLSRKAVRRAC( 106-120) 77 33582-27-23 C AAVAVLSRKAVRRA(107-120) 78 將人類NGF肽片段稀釋於含有5% DMSO、1 mM EDTA，pH 6.23之PBS中。最終肽濃度校正至55 μΜ下之相 同莫耳濃度（約1〇〇 pg/ml)。在室溫下，將肽以每孔100 μΐ 在Reacti-Bind順丁烯二醯亞胺活化之96孔微量滴定盤 (Pierce目錄號15 150)中培育2小時，接著在4°C下在攪拌下 培育隔夜。人類NGF(100 pg/ml)用作陽性對照。滴定盤以 洗滌緩衝液（KPL)洗滌，且在室溫下以0.2%脫脂乳粉（在 PBS-EDTA緩衝液中，pH6·23)阻斷2小時，接著以5%BSA 進一步阻斷1小時。滴定盤接著與各種濃度（0、3、10、30 pg/ml)之人類抗NGF抗體一起培育，隨後與山羊抗hFc Ab- 151365.doc -113 - 201125581 HRP(KPL)—起培育2小時》信號以TMB受質顯現且在添加 停止溶液（KPL)後在450 nm下讀取。 23個人類NGF肽觀測到至少4個指示4D4結合之主峰。此 等峰對應於以下肽：肽# 1(SEQ ID NO: 56)、 SSSHPIFHRGEFSVC(1-15)、肽 # l〇(SEQ ID NO: 65)、 NSVFKQYFFETKARD(46-60)、肽# 16-17(SEQ ID NO: 71-SEQ ID NO·· 72)、WNSYATTTHTFVKAL---(76-95);及肽# 18-21(SEQ IDNO: 73-SEQIDNO: 76)、TTTHT---LSRKC(100-115)。 如 Weismann 等人（1999，iVaiwre 401:184-8)所述，4D4 的 四個結合峰定位於NGF中之N末端、C末端、内部結構域以 及環L2及L4。此等結果概述於表9中。 表9 hNGF 抗原決定基 N末端 L2 内部 L4 内部 c末端 肽# 肽# 1 (SEQ ID NO: 56)， SSSHPI— · 1-15 肽# 10 (SEQ ID NO: 65)， NSVFKQ-- · 46-60 肽# 16 (SEQ ID NO: 71)， WNSYA …， 76-90 肽# 17 (SEQ ID NO: 72)， TMDGKQ--， 81-95 肽#19 (SEQ ID NO: 74), TMDGK— * 91-105 肽 # 20·21 (SEQ ID NO: 75-SEQ ID NO:76) · QAAWR—. 96-115 Ab結合信號 +++ + ++ ++ +-H- -H-
Wiesmann等人解決結合至trkA受體之hNGF的晶體結 構，顯示N末端（殘基2-9)對於報導體結合重要（Wiesmann 等人，1999，401:184-8)。NGF中此區段之殘基對 trkA優於trkB或trkC受體之特異性而言亦重要。抗體4D4對 人類NGF具有優於小鼠/大鼠NGF以及BDNF及NT-3之選擇 性，此最可能係因為人類NGF與其他神經營養素之間的N 末端差異。 抗體 4D4 結合至肽 #l〇(SEQ ID NO: 65)(NSVFK---，46- 151365.doc -114- 201125581 60)及肽 #17(SEQ ID NO: 72)(TTTHTFVKALTMDGKC，81-95)，分別對應於環L2及L4，此表示7個不同區中之兩個的 序列多樣性高於神經營養素之平均序列多樣性。此等7個 區之NGF與BDNF之間的交換實驗（swapping 示L2及L4對於NGF之生物活性而言重要。此外，以NGF殘 基取代環L2及L4中之5個NT3殘基引入NGF樣活性，同時 保持NT3活性。因此，L2與L4為抗體4D4選擇性結合至 NGF而非BDNF或NT-3的可能區域。 抗體 4D4 亦結合至肽 #16(SEQ ID NO: 71)(WNSYATTTHTFVKAL， 76-90)，匹配NGF晶體結構之内部結構域。人類NGF與小鼠 NGF之間的此區域100%同源，但與其他神經營養素不同。 與4D4對人類NGF之活性相比，其對大鼠/小鼠NGF之活性 弱得多。因此，與NGF之此部分結合最可能對物種特異性 不關鍵，但對神經營養素之選擇而言重要。 抗體4D4亦結合至NGF之C末端區（肽# 19-21(SEQ ID NO: 74-SEQ ID NO: 76)TMDGK--_LSRKC，91-115)，此為 人類NGF使NGF不同於其他神經營養素（BDNF及NT3)的一 個區域。與此區域結合幫助解釋為什麼4D4對其他神經營 養素不具有活性。此外，人類NGF之C末端與小鼠NGF之C 末端之間存在單個胺基酸差異，表明此單個胺基酸可為 4D4對人類NGF之選擇性優於大鼠/小鼠NGF的一個原因， 類似於觀測到物種差異之N末端。 最終，4D4亦與肽#10(SEQ ID NO: 65)(---KARDC，50-60)描述之人類NGF内部結構域相互作用，此為NGF優先結 151365.doc -115 - 201125581 合至trkA而非trkB或trkC之重要區域，進一步解釋其對人 類NGF之選擇性中和活性。 實例9 藉由KinExA之單株抗體之親和力測量 在 KinExA上測試 Ab 4D4(38859-80)與 huNGF(29714-91) 之結合。簡言之，Reacti-Gel 6x(Pierce)以huNGF預塗覆且 以BSA阻斷。10 pM及30 pM Ab 4D4樣品與各種濃度之 huNGF(Amgen)在室溫下一起培育8小時，隨後穿過huNGF 塗覆之珠粒。藉由螢光（Cy5)標記之山羊抗人類lgG抗體 (Jackson Immuno Research)定量珠粒結合之抗體量。結合 信號與平衡時的游離抗體濃度成比例。解離平衡常數（KD) 獲自使用雙曲線一位點均勻結合模型之競爭曲線的非線性 回歸（KinExTM軟體）。Ab 4D4結合至huNGF之KD為約4 pM 〇 實例10 識別其他抗NGF抗體 選擇如上文實例2及3所述產生及識別之其他抗NGF抗體 (命名為14D10、6G9、7H2、14F11及4G6)用於進一步研 究。簡言之，測試條件培養基之結合活性。純化且定序來 自培養基之抗體。比較來自條件培養基之抗體的預測質量 與質譜分析資料。選殖抗體。將純系中之兩者表現於CH〇 細胞中且如上文所述測試其活性。結果顯示於表1〇中。 151365.doc •116· 201125581 表ίο 純系 hNGF 之 IC50 ίηΜ) rNGF 之 IC50 (nM) 註釋 分子純系 hNGF 之 IC50 (nM) rNGF 之 IC50 (nM) 7H2 3.294 1.748 選殖 7H2-rFc 0.963 0.792 6H9 3.172 1.699 選殖 6H9-rFc 13.93 0.653 14D10 0.3918 >13 選殖 14D11 0.2803 >20 選殖 4G6 0.414 >10 選殖 接著將此等抗體之輕鏈及重鏈可變區的序列與4D4抗體 序列比較，以及將其彼此比較（圖5及圖6)。如自此等比較 識別出之重鏈可變區之同源性百分比顯示於表11中。輕鏈 可變區之同源性百分比顯示於表1 2中。此外，各種抗體之 CDR區之同源性百分比顯示於圖5-10中。 表11 4D4VH 14D10VH 6H9VH 7H2 VH 14D11 VH 4G6VH 4D4 VH 100% 70.9% 70.1% 75.6% 47.2.% 73.4% 14D10VH 100% 95.3% 85% 54.3% 81.1% 6H9VH 100% 86.6% 54.3% 81.1% 7H2VH 100% 51.2% 79.8% 14D11 VH 100% 56.8% 4G6VH 100% 表12 V4D4 VK 14D11 LC 4G6a LC 4G6b LC 4G6c LC 14D10 LC 6H9 LC 4G6d LC 7H2 LC 4G6e V4D4 VK 100% 89% 91% 72% 74% 69% 71% 71% 70% 73% 14D11 LC 100% 94% 68% 71% 67% 68% 68% 68% 70% 4G6a LC 100% 69% 74% 68% 70% 70% 69% 71% 4G6b LC 100% 87% 83% 86% 86% 86% 96% 4G6c LC 100% 91% 94% 94% 94% 91% 14D10 LC 100% 91% 94% 94% 86% 6H9 LC 100% 99% 98% 89% 4G6d LC 100% 99% 89% 7H2 LC 100% 4G6e 100% -117- 151365.doc 201125581 實例11 皮下NGF抗體於人類中之安全性及耐受性 此研究之目標為評估針對神經生長因子之抗體（NGF抗 體）之多次皮下（SC)劑量在患有骨關節炎（OA)膝痛之個體 中的安全性及耐受性，且檢驗在向患有OA膝痛之個體投 與多次SC劑量之NGF抗體後的NGF抗體血清藥物動力學 (PK)。藉由 Western Ontario and McMaster Universities Arthritis Index [WOMACtm3.1]評定多次SC給藥之臨床益 處。 在患有OA膝痛之個體中進行I期、依序隨機、雙盲安慰 劑對照、多劑量、劑量遞增研究。研究設計包括4組個 體，每組8名個體（n=32)。使用三種NGF抗體劑量（3 mg、 10 mg、20 mg)。此研究中所用之NGF抗體為類似於所述 (本文？-吾人是否希望確認/闡明此等I期mAb之製造方法？) 程序製備之完全人類單株抗體。 儘管功效資料變化性大且研究不能評估功效測量之統計 顯著性，但疼痛相關處理作用看似顯然。平均總WOMAC 評分、平均WOMAC子類評分、平均患者整體疾病評定及 平均醫師整體疾病評定顯示治療組第一次給藥後第一時間 點的總改良趨勢，該等作用在整個給藥期間得以保持。安 慰劑組未出現此等趨勢。在NGF抗體最後一次給藥後，治 療作用隨時間趨向於基線。 向患有OA膝痛之個體投與單次或多次SC劑量後，NGF 抗體暴露看似與3 mg至20 mg劑量範圍中之劑量大致成比 151365.doc -118· 201125581 例增加。平均Tmax在7.5至11.5天範圍内。不良事件（ae)報 導為治療組中10名個體（56%)及安慰劑組中2名個體（33%) 的治療相關事件。未有個體因為AE而提前中斷研究。然 而，由於2級神經感覺AE，各方案之規定停止規則變得適 用，使得一組中5名個體（2名安慰劑，3名治療）未接受研究 產品的第四次及最後一次給藥。神經感覺AE看似為劑量 依賴性的。 在年齡為36歲至63歲的男性及女性OA個體中，此研究 中除緊急治療之外的所投劑量下的多次S c給藥看似良好耐 受，接受20 mg抗體之6名個體中有4名報導可能之劑量依 賴性神經感覺事件（嚴重程度為輕度或中等）。NGf抗體暴 露看似隨3 mg至20 mg之劑量範圍中的劑量大致成比例增 長。末期半衰期（t1/2，z)在20.3天至26.4天範圍内。 應理解’前述揭示内容強調本發明之特定實施例，且其 所有修改或替代等效物在如隨附申請專利範圍中所闡述之 本發明精神及範疇内。 【圖式簡單說明】 圖1(a)及1(b)描繪表明在基於DRG神經元之中和生物分 析中自融合瘤條件培養基純化之4D4單株抗體對NGF活性 之中和作用的曲線圖； 圖2描繪表明人類NGF活性刺激VR1表現及在基於drg神 經元之中和生物分析中自融合瘤條件培養基純化之抗NGf 單株抗體（4D4)對NGF活性之中和作用的曲線圖； 圖3描繪表明在基於drg神經元之中和生物分析中，短 151365.doc -119- 201125581 暫表現之重組抗NGF 4D4單株抗體當表現為IgG丨或IgG2且 在生長於培養轉瓶（R)或旋轉燒瓶（S)中之細胞中表現時對 NGF活性之中和作用的曲線圖； 圖4描繪神經營養素之序列比對。序列上方之編號及二 級結構元件係關於成熟人類NGF ^保守殘基以星號標記， 且將序列同源性低之區域劃陰影。NGF人類為SEQ ID NO: 135 ; NGF小鼠為 SEQ ID NO: 136 ; BDNF為 SEQ ID NO: 137 ; NT3為 SEQ ID NO: 138 ; 圖 5 顯示 14D10(SEQ ID NO: 98)、6H9(SEQ ID NO: 104) 、7H2(SEQ ID NO: 110)、4G6(SEQ ID NO: 116)、 14D11(SEQ ID NO: 92)及 4D4(SEQ ID NO: 22)抗體的抗 NGF CDR1重鏈比對及一致性百分比； 圖 6 顯示 14D10(SEQ ID NO: 99)、6H9(SEQ ID NO: 105) 、7H2(SEQ ID NO: 111)、4G6(SEQ ID NO: 117)、 14D11(SEQ ID NO: 93)及 4D4(SEQ ID NO: 18)抗體的抗 NGF CDR2重鏈比對及一致性百分比； 圖 7 顯示 14D10(SEQ ID NO: 100)、6H9(SEQ ID NO: 106) 、7H2(SEQ ID NO: 112)、4G6(SEQ ID NO: 118)、 14D11(SEQ ID NO: 94)及 4D4(SEQ ID NO: 14)抗體的抗 NGF CDR3重鏈比對及一致性百分比；
圖 8顯示 14D10(SEQ ID NO: 95)、6H9(SEQ ID NO: 107)、 7H2(SEQ ID NO: 113)、4G6a(SEQ ID NO: 119)、4G6b(SEQ ID NO: 122)、4G6c(SEQ ID NO: 125)、4G6d(SEQ ID NO: 128)、 4G6e(SEQ ID NO: 132)、14D11(SEQ ID NO: 95)及4D4(SEQ ID 151365.doc -120- 201125581 NO: 24)抗體的抗NGF CDR1輕鏈比對及一致性百分比 (4G6a在各圖中稱為20031028340 ; 4G6b在各圖中稱為 2003 102835 1 ; 4G6c在各圖中稱為 20031071526 ; 4G6d在各 圖中稱為20031028344 ; 4G6e在各圖中稱為2003 1000528); 圖 9顯示 14D10(SEQ ID NO: 96)、6H9(SEQ ID NO: 108)、 7H2(SEQ ID NO: 114)、4G6a(SEQ ID NO: 120)、4G6b(SEQ ID NO: 123)、4G6c(SEQ ID NO: 126)、4G6d(SEQ ID NO: 129)、 4G6e(SEQ ID NO: 133)、14D11(SEQ ID NO: 96)及4D4(SEQ ID NO·· 20)抗體的抗NGF CDR2輕鏈比對及一致性百分比（4G6a 在各圖中稱為20031028340 ; 4G6b在多個圖中稱為 20031028351 ; 4G6c在各圖中稱為 20031071526 ; 4G6d在各圖 中稱為 2003 1028344 ; 4G6e在各圖中稱為 20031000528); 圖 10顯示 14D10(SEQ ID NO: 97)、6H9(SEQ ID NO: 109)、 7H2(SEQ ID NO: 115)、4G6a(SEQ ID NO: 121)、4G6b(SEQ ID NO: 124)、4G6c(SEQ ID NO: 127)、4G6d(SEQ ID NO: 130)、 4G6e(SEQ ID NO: 134)、14D11(SEQ ID NO: 97)及4D4(SEQ ID NO: 16)抗體的抗NGF CDR3輕鏈比對及一致性百分比（4G6a 在各圖中稱為20031028340 ; 4G6b在多個圖中稱為 20031028351 ; 4G6c在各圖中稱為 20031071526 ; 4G6d在各圖 中稱為 20031028344 ; 4G6e在各圖中稱為 20031000528); 圖 11顯示 14D10(SEQ ID NO: 82)、6H9(SEQ ID NO: 84)、 7H2(SEQ ID NO: 86)、4G6a(SEQ ID NO: 88)、4G6b(SEQ ID NO: 89)、4G6c(SEQ ID NO: 90)、4G6d(SEQ ID NO: 91)、4G6e(SEQ ID NO: 131)、14D11(SEQ ID NO: 80)及4D4(SEQ ID NO: 12) 151365.doc -121 - 201125581 抗體的抗NGF輕鏈比對及一致性百分比（4G6a在各圖中稱 為 20031028340 ; 4G6b在各圖中稱為 20031028351 ; 4G6c在 各圖中稱為20031071526 ; 4G6d在各圖中稱為20031028344 ; 4G6e在各圖中稱為2003 1000528);及 圖 12 顯示 4D4(SEQ ID NO: 10)、4G6(SEQ ID NO: 87)、 14D10(SEQ ID NO: 81)、14D11(SEQ ID NO: 79)、7H2(SEQ ID NO: 85)及6H9(SEQ ID NO: 83)抗體的抗NGF重鏈比對及一 致性百分比。 151365.doc -122- 201125581 序 列 表 <110>作為選擇性NGF途徑抑制劑之人類抗-NGF中和性抗體 <120>美商安美基公司
<130> 02-1240-F-CIP <140> 099134471 <141> 2010-10-08 <150> 12/576,522 <151> 2009-10-09 <160〉 141 <170> Prtentln version 3.0 <210〉 1 151365-序列表.doc 201125581 <211〉 990 <212> DNA <213〉智人 <400〉 1 gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60 ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120 tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180 ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240 tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 300 aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 360 ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420 gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 480 tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 540 agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600 gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 660 aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 720 ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780 gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840 ctggactccg acggctcctt cttcctctat agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900 cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 960 cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa 990 • 2- 151365-序列表.doc 201125581 <210〉 2 <211〉 330 <212〉 PRT <213〉智人 <400〉 2
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 15 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr 65 70 75 80
Tyr He Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met He Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 3- 151365-序列表.doc 201125581 165 170 175
Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190
His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro He Glu Lys Thr He Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220
Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255
Pro Ser Asp He Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn 260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn 290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320
Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210〉 3 <211〉 978 <212〉 DNA <213〉智人 <400〉 3 gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcgccct gctccaggag cacctccgag -4- 151365-序列表.doc 201125581 agcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120 tggaactcag gcgctctgac cagcggcgtg cacaccttcc cagctgtcct acagtcctca 180 ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcaacttcgg cacccagacc 240 tacacctgca acgtagatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagac agttgagcgc 300 aaatgttgtg tcgagtgccc accgtgccca gcaccacctg tggcaggacc gtcagtcttc 360 ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacgtgc 420 gtggtggtgg acgtgagcca cgaagacccc gaggtccagt tcaactggta cgtggacggc 480 gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagcca cgggaggagc agttcaacag cacgttccgt 540 gtggtcagcg tcctcaccgt tgtgcaccag gactggctga acggcaagga gtacaagtgc 600 aaggtctcca acaaaggcct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa aaccaaaggg 660 cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc gggaggagat gaccaagaac 720 caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctacccca gcgacatcgc cgtggagtgg 780 gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacac ctcccatgct ggactccgac 840 ggctccttct tcctctacag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac 900 gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc 960 tccctgtctc cgggtaaa 978 <210〉 4 <211〉 326 〈212〉 PRT <213〉智人 151365-序列表,doc 201125581 <400> 4
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 15 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gin Thr 65 70 75 · 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95
Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 100 105 110
Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 115 120 125
Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 130 135 140
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gin Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 145 150 155 160
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Phe Asn 165 170 175
Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gin Asp Trp 180 185 190
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro 195 200 205
Ala Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Thr Lys Gly Gin Pro Arg Glu 210 215 220 •6· 151365-序列表.doc 201125581
Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn 225 230 235 240
Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie 245 250 255
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 260 265 270
Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 275 280 285
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys 290 295 300
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu 305 310 315 320
Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 <210〉 5 <211〉 981 <212〉 DNA <213〉智人 <400〉 5 gccagcacca aggggccatc cgtcttcccc ctggcgccct gctccaggag cacctccgag 60 agcacagccg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120 tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180 ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacgaagacc 240 tacacctgca acgtagatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agttgagtcc 300 aaatatggtc ccccatgccc atcatgccca gcacctgagt tcctgggggg accatcagtc 360 151365-序列表.doc 201125581 ttcctgttcc ccccaaaacc csiaggacact ctcatgatct cccggacccc tgaggtcacg 420 tgcgtggtgg tggacgtgag ccaggaagac cccgaggtcc agttcaactg gtacgtggat 480 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagttcaa cagcacgtac 540 cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaacggcaa ggagtacaag 600 tgcaaggtct ccaacaaagg cctcccgtcc tccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 660 gggcagcccc gagagccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccaggagga gatgaccaag 720 aaccaggtca gcctgacctg cctggtceiaa ggcttctacc ccagcgacat cgccgtggag 780 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 840 gacggctcct tcttcctcta cagcaggcta accgtgraca agagcaggtg gcaggagggg 900 aatgtcttct catgctccgt gakgcatgag gctctgcaca accactacac acagaagagc 960 ctctccctgt ctctgggtaa a 981 <210〉 6 〈211〉 327 <212〉 PRT <213〉智人 <400〉 6
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 15 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 151365-序列表.doc 201125581
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr 65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro 100 105 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 115 120 125
Asp Thr Leu Met He Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 130 135 140
Asp Val Ser Gin Glu Asp Pro Glu Val Gin Phe Asn Trp Tyr Val Asp 145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Phe 165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp 180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu 195 200 205
Pro Ser Ser lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg 210 215 220
Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gin Glu Glu Met Thr Lys 225 230 235 240
Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 245 250 255 lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser •9· 151365-序列表.doc 201125581 275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Glu Gly Asn Val Phe Ser 290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser 305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 325 <210〉 7 <211〉 321 <212〉 DNA <213〉智人 <400〉 7 cgaactgtgg ctgcaccatc tgtcttcatc ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat aacttctatc ccagagaggc caaagtacag tggaaggtgg ataacgccct; ccaatcgggt aacicccagg agagtgicac agagcaggac agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc accctgacgc tgagcaaagc agactacgag aaacacaaag tctacgcctg cgaagtcacc catcagggcc tgagctcgcc cgtcaceiaag agcttcaaca ggggagagtg t <210〉 8 〈211〉 107 〈212〉 PRT <213〉智人 • 10· 60 120 180 240 300 321 151365-序列表.doc 201125581 <400〉 8
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu 15 10 15
Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin 35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser 85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210〉 9 <211> 369 <212〉 DNA <213〉智人 <400〉 9 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc tcctgtgcag cctctggctt cacctteiaga agttatagca tgaactgggt tcgccaggct ccagggaagg ggctggagtg ggtttcatac attagtcgta gtagtcatac catattctac gcagactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa ttcactgtat ctgcaaatgg acagcctgag agacgaggac acggctatgt attactgtgc gagagtatat -11 - 151365-序列表.doc 201125581 agcagtggct ggcacgtctc tgattatttt gactactggg gccagggaat cctggtcacc gtttcctca 360 369 <210〉 10 <211〉 123 <212〉 PRT 〈213> 智人 <400〉 10
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Arg Ser Tyr 20 25 30
Ser Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Tyr lie Ser Arg Ser Ser His Thr lie Phe Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asp Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Val Tyr Ser Ser Gly Trp His Val Ser Asp Tyr Phe Asp Tyr 100 105 110
Trp Gly Gin Gly lie Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210〉 11 151365·序列表.doc -12- 201125581 <211〉 321 <212〉 DNA <213〉智人 <400〉 11 gccatccagt tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gggcattagc agtgctttag cctggtatca gcagaaacca 120 gggaaagctc ctaagctcct gatctatgat gcctccagtt tggaaagtgg ggtcccatca 180 aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240 gaagattttg caacttatta ctgtcaacag tttaatagtt acccgctcac tttcggcgga 300 gggaccaagg tggagatcaa a 321 <210〉 12 <211> 107 <212〉 PRT <213〉智人 <400〉 12
Ala lie Gin Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Gly lie Ser Ser Ala 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly -13- 151365·序列表doc 201125581 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Phe Asn Ser Tyr Pro Leu 85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 100 105 <210〉 13 <211> 42 <212〉 DNA <213〉智人 〈400〉 13 gtatatagca gtggctggca cgtctctgat tattttgact ac <210〉 14 <211〉 14 <212〉 PRT 〈213〉智人 <400〉 14
Val Tyr Ser Ser Gly Trp His Val Ser Asp Tyr Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 15 <211〉 27 -14- 151365·序列表.doc 201125581 <212〉 DNA <213〉智人 <400> 15 caacagttta atagttaccc gctcact 〈210〉 16 <211〉 9 <212〉 PRT <213> 智人 <400〉 16 Gin Gin Phe Asn 1 Ser Tyr Pro Leu Thr 5 〈210〉 17 <211> 51 <212〉 DNA <213〉 智人 <400〉 17 tacattagtc gtagtagtca taccatattc tacgcagact ctgtgaaggg c <210> 18 <211〉 17
<212> PRT •15· 151365-序列表.doc 201125581 <213〉智人 <400> 18
Tyr lie Ser Arg Ser Ser His Thr lie Phe Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15
Gly <210> 19 <211〉 21 <212〉 DNA <213〉智人 <400〉 19 gatgcctcca gtttggaaag t <210〉 20 <211> 7 <212〉 PRT <213〉智人 <400〉 20
Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser 1 5 <210〉 21 •16· 151365-序列表.doc 201125581 <211> 15 <212> DNA <213〉智人 <400> 21 agttatagca tgaac <210〉 22 <211> 5 <212〉 PRT <213〉智人 <400〉 22
Ser Tyr Ser Met Asn 1 5 <210> 23 <211〉 33
<212〉 DNA <213〉智人 <400〉 23 cgggcaagtc agggcattag cagtgcttta gcc 〈210〉 24 〈211〉 11 -17- 151365-序列表.doc 201125581 <212〉 PRT <213〉智人 <400> 24
Arg Ala Ser Gin Gly lie Ser Ser Ala Leu Ala 1 5 10 <210〉 25 〈211〉 1131
<212〉 DNA <213〉智人 <400〉 25 gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcgccct gctccaggag cacctctggg 60 ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120 tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180 ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240 tacacctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agttgagctc 300 aaaaccccac ttggtgacac Eiactcacaca tgcccacggt gcccagagcc caaatcttgt 360 gacacacctc ccccgtgccc acggtgccca gagcccaaat cttgtgacac acctcccccg 420 tgcccacggt gcccagagcc caaatcttgt gacacacctc ccccatgccc acggtgccca 480 gcacctgaac tcctgggagg accgtcagtc ttcctcttcc ccccaaaacc caaggatacc 540 cttatgattt cccggacccc tgaggtcacg tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac 600 cccgaggtcc agttcaagtg gtacgtggac ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag 660 -18· J5】365-序列表.doc 201125581 ccgcgggagg agcagttcaa cagcacgttc cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac 720 caggactggc tgaacggcaa ggagtacaag tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc 780 cccatcgaga aaaccatctc caaaaccaaa ggacagcccc gagaaccaca ggtgtacacc 840 ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaeia 900 ggcttctacc ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca gcgggcagcc ggagaacaac 960 tacaacacca cgcctcccat gctggactcc gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc 1020 accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg aacatcttct catgctccgt gatgcatgag 1080 gctctgcaca accgcttcac gcagaagagc ctctccctgt ctccgggtaa a 1131 <210〉 26 〈211〉 376 <212〉 PRT <213〉智人 <400〉 26
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 15 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr 65 70 75 80 -19· 15Π65-序列表.doc 201125581
Tyr Thr Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95
Arg Val Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro 100 105 110
Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg 115 120 125
Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys 130 135 140
Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro 145 150 155 160
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 165 170 175
Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 180 185 190
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gin Phe Lys Trp Tyr 195 200 205
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 210 215 220
Gin Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 225 230 235 240
Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 245 250 255
Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Thr Lys Gly Gin 260 265 270
Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met 275 280 285
Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 290 295 300
Ser Asp He Ala Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gin Pro Glu Asn Asn 20- 151365-序列表d〇c 201125581 305 310 315 320
Tyr Asn Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 325 330 335
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn lie 340 345 350
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gin 355 360 365
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 370 375 〈210〉 27 〈211〉 29
〈212〉 DNA <213〉 人工 <220〉 <223〉人類NGF之PCR引子 <400> 27 acaccacata tgtcatcatc ccatcccat <210〉 28 <211> 40 <212〉 DNA <213〉人工 <220〉 -21 · 151365·序列表.doc 201125581 <223〉人類NGF之PCR引子 <400> 28 accacaggat cctccttatg cacgacgcac agctttacgg 40 〈210〉 29 〈211〉 375 〈212〉 DNA <213〉人工 〈220〉 <223〉編碼重組人類met-NGF之核苷酸序列 <400〉 29 catatgtcat catcccatcc catcttccac aggggcgaat tctcggtgtg tgacagtgtc 60 agcgtgtggg ttggggataa gaccaccgcc acagacatca agggcaagga ggtgatggtg 120 ttgggagagg tgaacattaa caacagtgta ttcaaacagt acttttttga gaccaagtgc 180 cgggacccaa atcccgttga cagcgggtgc cggggcattg actcaaagca ctggaactca 240 tattgtacca cgactcacac ctttgtcaag gcgctgacca tggatggcaa gcaggctgcc 300 tggcggttta tccggataga tacggcctgt gtgtgtgtgc tcagccgtaa agctgtgcgt 360 cgtgcataag gatcc 375 <210〉 30 <211〉 121 <212〉 PRT 〈213> 人工 -22· 151365·序列表.doc 201125581 <220〉 <223〉重組人類met-NGF之胺基酸序列Ο120) <400〉 30 ； Met Ser Ser Ser His Pro lie Phe His Arg Gly Glu Phe Ser Val Cys 15 10 15
Asp Ser Val Ser Val Trp Val Gly Asp Lys Thr Thr Ala Thr Asp lie 20 25 30
Lys Gly Lys Glu Val Met Val Leu Gly Glu Val Asn lie Asn Asn Ser 35 40 45
Val Phe Lys Gin Tyr Phe Phe Glu Thr Lys Cys Arg Asp Pro Asn Pro 50 55 60
Val Asp Ser Gly Cys Arg Gly He Asp Ser Lys His Trp Asn Ser Tyr 65 70 75 80
Cys Thr Thr Thr His Thr Phe Val Lys Ala Leu Thr Met Asp Gly Lys 85 90 95
Gin Ala Ala Trp Arg Phe lie Arg He Asp Thr Ala Cys Val Cys Val loo 105 no
Leu Ser Arg Lys Ala Val Arg Arg Ala 115 120 <210> 31 <211〉 55
<212〉 DNA <213〉人工 <220〉 151365-序列表_此〇 ·23- 201125581 <223〉產生表現載體pCFM1656之5·引子序列（ATCC# 69576 <400〉 31 cgatttgatt ctagaaggag gaataacata tggttaacgc gttggaattc ggtac 55 <210> 32 <211> 49 <212〉 DNA <213〉人工 〈220〉 <223〉產生表現載體pCFM1656之3·引子序列（ATCC# 69576 <400〉 32 taaactaaga tcttcctcct tattgtatac caattgcgca accttaagc 49 <210〉 33 <211〉 24 <212> DNA <213〉人工 <220〉 <223〉PCR 引子 〈220〉 <221〉 Unsure -24- 151365·序列表.doc 201125581 <222〉 (18)..(23) 〈223〉η 為 a、c、t 或 g <400〉 33 ggccggatag gcctccannn nnnt <210> 34 <211〉 21 <212> DNA <213〉人工 〈220〉 〈223〉PCR 引子 <400> 34 ggggtcaggc tggaactgag g <210〉 35 <211> 19 <212> DNA <213〉人工 <220〉 <223〉PCR 引子 <400〉 35 tgaggacgct gaccacacg 151365-序列表.doc 201125581 <210〉 36 <211> 54 <212〉 DNA <213〉人工 <220〉 〈223> PCR 引子 <400〉 36 cagcagaagc ttctagacca ccatggacat gagggtgccc gctcagctcc tggg 54 <210〉 37 <211> 34 <212〉 DNA <213〉人工 <220〉 <223〉PCR 引子 <400> 37 cttgtcgact caacactctc ccctgttgaa gctc 34
<210> 38 〈211〉 55 〈212〉 DNA -26- 151365-序列表.doc 201125581 〈213> 人工 <220〉 <223〉PCR 引子 <400> 38 cagcagaagc ttctagacca ccatggagtt ggggctgtgc tgggttttcc ttgtt 55 <210〉 39 <211> 34 <212〉 DNA <213〉人工 <220〉 <223〉PCR 引子 <400> 39 gcatgtcgac tcatttaccc ggagacaggg agag 34 <210〉 40 <211〉 449 <212〉 PRT <213〉智人 〈400〉 40
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15 •27· 151365-序列表.doc 201125581
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Arg Ser Tyr 20 25 30
Ser Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Tyr He Ser Arg Ser Ser His Thr lie Phe Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asp Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Val Tyr Ser Ser Gly Trp His Val Ser Asp Tyr Phe Asp Tyr 100 105 110
Trp Gly Gin Gly lie Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly 115 120 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser 130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val 145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe 165 170 175
Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val 180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gin Thr Tyr Thr Cys Asn Val 195 200 205
Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys 210 215 220
Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro 225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met He Ser 28- 151365·序列表.doc 201125581 245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 260 265 270
Pro Glu Val Gin Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val 290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys 325 330 335
Thr lie Ser Lys Thr Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr 340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr 355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu 370 375 380
Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu 385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 405 410 415
Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 445
Lys <210> 41 <211> 453 •29· 151365·序列表.doc 201125581 <212> PRT <213〉智人 <400〉 41
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg. Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Arg Ser Tyr 20 25 30
Ser Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Tyr lie Ser Arg Ser Ser His Thr lie Phe Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asp Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Val Tyr Ser Ser Gly Trp His Val Ser Asp Tyr Phe Asp Tyr 100 105 110
Trp Gly Gin Gly lie Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly 115 120 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly 130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val 145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe 165 170 175
Pro Ala Val Lea Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val 180 185 190 30· 151365·序列表.doc 201125581
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr He Cys Asn Val 195 200 205
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys 210 215 220
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu 225 230 235 240
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 245 250 255
Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 260 265 270
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 275 280 285
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser 290 295 300
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu 305 310 315 320
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala 325 330 335
Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro 340 345 350
Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin 355 360 365
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp He Ala 370 375 380
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 385 390 395 400
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu 405 410 415
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser -31 - 151365-序列表.doc 201125581 420 425 430
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser 435 440 445
Leu Ser Pro Gly Lys 450 <210> 42 <211> 450 <212〉 PRT 〈213> 智人 <400〉 42
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Arg Ser Tyr 20 25 30
Ser Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Tyr lie Ser Arg Ser Ser His Thr lie Phe Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asp Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Val Tyr Ser Ser Gly Trp His Val Ser Asp Tyr Phe Asp Tyr 100 105 110
Trp Gly Gin Gly lie Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly 115 120 125 •32 151365-序列表.doc 201125581
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser 130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val 145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe 165 170 175
Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val 180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val 195 200 205
Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys 210 215 220
Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly 225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie 245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gin Glu 260 265 270
Asp Pro Glu Val Gin Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Phe Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser He Glu 325 330 335
Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr 340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Gin Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu 355 360 365 -33 151365·序列表.doc 201125581
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp He Ala Val Glu Trp 370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp 405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gin Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu 435 440 445
Gly Lys 450 <210〉 43 <211〉 499 <212〉 PRT <213〉智人 <400> 43
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Arg Ser Tyr 20 25 30
Ser Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Tyr lie Ser Arg Ser Ser His Thr lie Phe Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr • 34· 151365·序列表.doc 201125581 65 70 75 80
Leu Gin Met Asp Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Val Tyr Ser Ser Gly Trp His Val Ser Asp Tyr Phe Asp Tyr 100 105 110
Trp Gly Gin Gly He Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly 115 120 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Gly Gly 130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val 145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe 165 170 175
Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val 180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr Thr Cys Asn Val 195 200 205
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Leu Lys 210 215 220
Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro 225 230 235 240
Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys 245 250 255
Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser 260 265 270
Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu 275 280 285
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 290 295 300 -35· 151365-序列表.d〇c 201125581
Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 305 310 315 320
His Glu Asp Pro Glu Val Gin Phe Lys Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 325 330 335
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Phe Asn Ser Thr 340 345 350
Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn 355 360 365
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro 370 375 380 lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Thr Lys Gly Gin Pro Arg Glu Fro Gin 385 390 395 400
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Val 405 410 415
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val 420 425 430
Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Asn Thr Thr Pro 435 440 445
Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 450 455 460
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn lie Phe Ser Cys Ser Val 465 470 475 480
Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu 485 490 495
Ser Pro Gly
<210〉 44 <211〉 214 <212〉 PRT 36· 151365·序列表.doc 201125581 〈213> 智人 <400〉 44
Ala lie Gin Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Gly lie Ser Ser Ala 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Phe Asn Ser Tyr Pro Leu 85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110
Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly 115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140
Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin 145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser -37- 151365-序列表.doc 201125581 195 200
Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 〈210〉 45 <211〉 5 <212〉 PRT <213〉智人 <400> 45
Phe Phe Glu Thr Lys 1 5 <210〉 46 <211> 9
<212〉 PRT <213〉智人 <400> 46
Ser Ser Ser His Pro lie Phe His Arg 1 <210> 47 <211> 5 <212〉 PRT <213〉 智人 •38· 205 151365·序列表.doc 201125581 <400> 47
His Trp Asn Ser Tyr 1 5 〈210〉 48 <211〉 12
<212> PRT <213〉智人 <400〉 48
Asn Ser Val Glu Lys Gin Tyr Phe Phe Glu Thr Lys 1 <210〉 49 <211〉 7 <212〉 PRT 〈213〉 智人 <400〉 49
Ser Arg Lys Ala Val Arg Arg 1 5 <210> 50 <211〉 5
<212〉 PRT <213〉智人 -39- 151365·序列表.doc 201125581 <400〉 50
Glu Val Met Val Leu 1 5 <210> 51 <211> 25
<212〉 PRT <213〉智人 <400〉 51
Ser Ser Ser His Pro lie Phe His Arg Gly Glu Phe Ser Val Cys Asp 15 10 15
Ser Val Ser Val Trp Val Gly Asp Lys 20 25 〈210〉 52 <211〉 20 〈212〉 PRT <213〉智人 <400〉 52
Gin Ala Ala Trp Arg Phe lie Arg lie Asp Thr Ala Cys Val Cys Val 15 10 15
Leu Ser Arg Lys 20 〈210〉 53 40- 151365-序列表.doc 201125581 <211> 14 <212〉 PRT <213〉智人 <400> 53
Ser Ser His Pro lie Phe His Arg Gly Glu Phe Ser Val Cys 1 5 10 <210> 54 <211〉 8
<212> PRT <213〉智人 <400〉 54
Ser Ser His Pro lie Phe His Arg 1 <210> 55 <211> 6 <212〉 PRT <213〉 智人 <400〉 55
Gly Glu Phe Ser Val Cys •41 · 151365-序列表.doc 201125581 <210> 56 <211> 15 <212〉 PRT <213〉智人 <400> 56
Ser Ser Ser His Pro lie Phe His Arg Gly Glu Phe Ser Val Cys 15 10 15 <210〉 57 <211> 16
<212〉 PRT <213〉智人 〈400〉 57 lie Phe His Arg Gly Glu Phe Ser Val Ala Asp Ser Val Ser Val Cys 15 10 15 〈210〉 58 <211〉 16
<212〉 PRT <213〉智人 <400〉 58
Glu Phe Ser Val Ala Asp Ser Val Ser Val Trp Val Gly Asp Lys Cys 15 10 15 -42- 151365-序列表.doc 201125581 <210> 59 <211〉 16 <212> PRT <213〉智人 <400> 59
Asp Ser Val Ser Val Trp Val Gly Asp Lys Thr Thr Ala Thr Asp Cys 15 10 15 <210〉 60 〈211〉 16
<212> PRT <213〉智人 <400〉 60
Trp Val Gly Asp Lys Thr Thr Ala Thr Asp lie Lys Gly Lys Glu Cys 15 10 15 <210〉 61 <211〉 16
<212〉 PRT <213〉智人 <400> 61
Thr Thr Ala Thr Asp lie Lys Gly Lys Glu Val Met Val Leu Gly Cys •43· 151365-序列表.doc 201125581 15 10 15 <210> 62 <211> 15 <212〉 PRT 〈213> 智人 <400〉 62 lie Lys Gly Lys Glu Val Met Val Leu Gly Glu Val Asn lie Asn 15 10 15 <210〉 63 <211〉 16 <212〉 PRT <213〉智人 <400>
Val Met 1 <210〉 <211〉 <212> <213〉 63 Val Leu Gly Glu Val Asn lie Asn Asn Ser Val Phe Lys Cys 5 10 15 64 16 PRT 智人 <400> 64 151365-序列表.doc • 44· 201125581
Glu Val Asn lie Asn Asn Ser Val Phe Lys Gin Tyr Phe Phe Glu Cys 15 10 15 <210> 65 <211〉 16
<212〉 PRT <213〉智人 <400> 65
Asn Ser Val Phe Lys Gin Tyr Phe Phe Glu Thr Lys Ala Arg Asp Cys 15 10 15 <210〉 66 <211> 16
<212〉 PRT <213〉智人 <400〉 66
Gin Tyr Phe Phe Glu Thr Lys Ala Arg Asp Pro Asn Pro Val Asp Cys 15 10 15 <210> 67 <211〉 16
<212> PRT 〈213〉智人 <400> 67 -45- 151365·序列表.doc 201125581
Thr Lys Ala Arg Asp Pro Asn Pro Val Asp Ser Gly Ala Arg Asp Cys 15 10 15 <210〉 68 <211〉 16
<212> PRT <213〉智人 <400〉 68
Pro Asn Pro Val Asp Ser Gly Ala Arg Asp He Asp Ser Lys His Cys 15 10 15 <210> 69 〈211〉 15
<212> PRT <213〉智人 〈400〉 69
Ser Gly Ala Arg Asp He Asp Ser Lys His Trp Asn Ser Tyr Cys 15 10 15 <210〉 70 <211〉 16
<212> PRT <213〉智人 -46 · 151365-序列表.doc 201125581 <400> 70 lie Asp Ser Lys His Trp Asn Ser Tyr Ala Thr Thr Thr His Thr Cys 15 10 15 〈210〉 71 <211〉 16
<212〉 PRT 〈213〉智人 <400> 71
Trp Asn Ser Tyr Ala Thr Thr Thr His Thr Phe Val Lys Ala Leu Cys 15 10 15 〈210〉 72 <211〉 16
<212〉 PRT 〈213〉智人 <400〉 72
Thr Thr Thr His Thr Phe Val Lys Ala Leu Thr Met Asp Gly Lys Cys 15 10 15 <210〉 73 <211〉 16
<212〉 PRT <213〉智人 • 47· 151365·序列表.doc 201125581 <400> 73
Phe Val Lys Ala Leu Thr Met Asp Gly Lys Gin Ala Ala Trp Arg Cys 15 10 15 <210〉 74 <211〉 16
<212> PRT <213〉智人 <400〉 74
Thr Met Asp Gly Lys Gin Ala Ala Trp Arg Phe lie Arg lie Asp Cys 15 10 15 <210> 75 <211〉 15 〈212〉 PRT <213〉智人 <400〉 75
Gin Ala Ala Trp Arg Phe lie Arg lie Asp Thr Ala Ala Val Cys 15 10 15 <210〉 76 <211〉 16 <212〉 PRT <213〉智人 -48· 151365·序列表.doc 201125581 <400> 76
Phe lie Arg lie Asp Thr Ala Ala Val Ala Val Leu Ser Arg Lys Cys 15 10 15 <210〉 77 <211〉 16
〈212〉 PRT <213〉智人 <400> 77
Thr Ala Ala Val Ala Val Leu Ser Arg Lys Ala Val Arg Arg Ala Cys 15 10 15 <210〉 78 <211〉 15
〈212〉 PRT <213〉智人 <400〉 78
Cys Ala Ala Val Ala Val Leu Ser Arg Lys Ala Val Arg Arg Ala 15 10 15 <210〉 79 <211〉 125
<212> PRT <213〉智人 • 49- 151365·序列表.doc 201125581 <400> 79
Glu Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 15 10 15
Ser Leu Lys lie Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Asn Phe Thr Thr Tyr 20 25 30
Trp lie Gly Trp Val Arg Gin Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly lie lie Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Lys Tyr Ser Pro Ser Phe 50 55 60
Gin Gly Gin Val Thr lie Ser Ala Asp Lys Ser lie Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Asn Tyr Tyr Gly Ser Gly Thr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met 100 105 110
Asn Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210〉 80 <211〉 107
<212> PRT <213〉智人 <400〉 80
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15 50- 151365·序列表.doc 201125581
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Gly lie Ser He Trp 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin His Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Ala Asn Ser Phe Pro Trp 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 100 105 <210〉 81 <211〉 127 <212〉 PRT <213〉智人 <400> 81
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Arg 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Glu Asp Tyr 20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Gly lie Ser Trp Asn Arg Gly He lie Gly Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 •51 · 151365·序列表.doc 201125581
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Lys Glu Gly Tyr Tyr Gly Ser Gly Arg Pro Gly Tyr Phe Tyr Tyr 100 105 110
Val Met Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 82 <211〉 108
<212> PRT <213〉智人 <400〉 82
Glu lie Val Leu Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 15 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Val Ser Ser Gly 20 25 30
Phe Leu Ala Trp Phe Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 lie Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Ala lie Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Gly Ser Ser Pro 85 90 95
Tyr Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105 <210> 83 52- 151365-序列表.doc 201125581 <211> 127 <212〉 PRT <213〉智人 <400〉 83
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Arg 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe lie Phe Asp Asp Tyr 20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Gly lie Ser Trp Asn Arg Gly lie lie Gly Tyr Ala Gly Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95
Val Lys Glu Gly Tyr Tyr Gly Ser Gly Arg Pro Gly Tyr Phe Tyr Tyr 100 105 110
Val Met Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210〉 84 〈211〉 108
<212〉 PRT <213〉智人 •53· 151365-序列表.doc 201125581 <400> 84
Glu He Val Leu Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 15 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 lie Tyr Val Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Gly Ser Ser Pro 85 90 95
Tyr Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105 <210> 85 <211〉 121 <212〉 PRT <213〉智人 <400〉 85
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Arg 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe lie Phe Asp Asp Tyr 20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 •54 151365-序列表.doc 201125581
Ser Gly He Thr Trp Asn Ser Gly lie Leu Gly Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asp Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Lys Glu Glu Gly Ser Gly Arg Tyr Tyr Asn Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110
Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210〉 86 <211〉 107
<212〉 PRT <213〉智人 〈400〉 86
Glu lie Val Leu Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 15 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 lie Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Gly Ser Ser Tyr •55· 151365-序列表.doc 201125581 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105 <210〉 87 <211〉 124 <212〉 PRT <213〉智人 〈400〉 87
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Arg Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr 20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Asp lie Asn Trp Asn Gly Gly Ser Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Glu Gin Trp Leu Asp Pro Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp 100 105 110
Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210〉 88 <211〉 107 151365·序列表.doc -56- 201125581 <212〉 PRT <213〉智人 <400> 88
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Gly lie Ser Ser Trp 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu lie 35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Asn Ser Tyr Pro Trp 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 100 105 <210〉 89 <211〉 107 〈212〉 PRT <213〉智人 <400> 89
Glu lie Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 15 10 15 •57· 151365·序列表.doc 201125581
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Gly Val Ser Ser Tyr 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly lie Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Pro Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Arg Ser Asn Trp His Arg 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 100 105 <210〉 90 〈211〉 108 〈212〉 PRT <213〉智人 <400〉 90
Glu lie Val Leu Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 15 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 lie Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gly Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Glu -58- 151365-序列表.doc 201125581 65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Asn Ser Tyr Pro 85 90 95
Trp Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 100 105 <210〉 91 〈211〉 107 <212> PRT <213〉智人 <400> 91
Glu lie Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 15 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly lie Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Arg Ser Asn Trp Pro Trp 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu He Lys 100 105 <210〉 92 <211〉 5 59· 151365·序列表.doc 201125581 <212> PRT <213〉智人 <400〉 92
Thr Tyr Trp lie Gly 1 5 〈210〉 93 <211〉 17
<212〉 PRT <213〉智人 〈400〉 93 lie lie Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Lys Tyr Ser Pro Ser Phe Gin 15 10 15
Gly <210〉 94 <211〉 16 〈212〉 PRT <213〉智人 <400> 94
Asn Tyr Tyr Gly Ser Gly Thr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asn Val 15 10 15 -60· 151365-序列表.doc 201125581 <210〉 95 <211> 11 <212〉 PRT <213〉智人 <400> 95
Arg Ala Ser Gin Gly lie Ser lie Trp Leu Ala 1 <210〉 96 <211〉 7 〈212〉 PRT 〈213〉 智人 <400〉 96
Ala Ala Ser Ser Leu Gin Ser 1 5 <210〉 97 <211〉 9 <212〉 PRT <213〉 智人 〈400〉 97
Gin Gin Ala Asn Ser Phe Pro Trp Thr •61 · 151365·序列表.doc 201125581 1 5 <210〉 98 <211〉 5 <212〉 PRT 〈213〉 智人 <400> 98
Asp Tyr Ala Met His 1 5 <210〉 99 <211> 17 <212〉 PRT <213> 智人 <400〉 99
Gly lie Ser Trp Asn Arg Gly lie lie Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15
Gly 〈210〉 100 <211> 17 <212> PRT <213〉 智人 151365-序列表.doc ·62· 201125581 <400〉 100
Gly Tyr Tyr Gly Ser Gly Arg Pro Gly Tyr Phe Tyr Tyr Val Met Asp 15 10 15
Val <210〉 101 <211〉 12 <212〉 PRT <213〉智人 <400〉 101
Arg Ala Ser Gin Ser Val Ser Ser Gly Phe Leu Ala 1 5 10 <210〉 102 〈211〉 7 〈212〉 PRT 〈213〉智人 <400〉 102
Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr 1 5 <210〉 103
<211〉 9 <212> PRT -63- 151365-序列表.doc 201125581 <213〉智人 <400> 103
Gin Gin Tyr Gly Ser Ser Pro Tyr Thr 1 5 <210> 104 〈211〉 5
<212〉 PRT <213〉智人 <400> 104
Asp Tyr Ala Met His 1 5 <210> 105 <211〉 17
〈212〉 PRT <213〉智人 <400〉 105
Gly lie Ser Trp Asn Arg Gly lie lie Gly Tyr Ala Gly Ser Val Lys 15 10 15
Gly <210> 106 -64- 151365-序列表.doc 201125581 <211> 17 <212〉 PRT <213〉智人 <400〉 106
Gly Tyr Tyr Gly Ser Gly Arg Pro Gly Tyr Phe Tyr Tyr Val Met Asp 15 10 15
Val 〈210〉 107 <211> 12 <212> PRT <213〉智人 <400〉 107 Arg Ala Ser Gin Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala 1 5 10 <210〉 108 <211〉 7 <212〉 PRT 〈213〉 智人 <400> 108 • 65- 151365-序列表.doc 201125581
Val Ala Ser Ser Arg Ala Thr 1 5 <210〉 109 <211〉 9
<212〉 PRT <213〉智人 <400> 109
Gin Gin Tyr Gly Ser Ser Pro Tyr Thr 1 5 <210〉 110 〈211〉 5
<212> PRT <213〉智人 <400〉 110
Asp Tyr Ala Met His 1 <210〉 111 <211〉 17 <212〉 PRT <213〉 智人 <400> 111 -66- 151365-序列表.doc 201125581
Gly lie Thr Trp Asn Ser Gly lie Leu Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15
Gly <210〉 112 <211> 11 <212〉 PRT <213〉智人 <400〉 112
Glu Gly Ser Gly Arg Tyr Tyr Asn Phe Asp Tyr 1 5 10 <210〉 113 <211> 12
<212〉 PRT 〈213〉智人 <400> 113
Arg Ala Ser Gin Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala 1 5 10 <210〉 114 <211〉 7
<212> PRT <213〉智人 •67· 151365-序列表 _doc 201125581 <400> 114
Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr
1 5 〈210〉 115 <211〉 8 <212〉 PRT <213〉 智人 <400〉 115 Gin Gin Tyr Gly Ser Ser Tyr Thr 1 5 〈210〉 116 〈211〉 5 <212〉 PRT 〈213〉 智人 <400〉 116 Asp Tyr Gly Met Asn 1 5 <210〉 117 <211〉 17 <212> PRT •68 151365-序列表.doc 201125581 <213〉智人 <400〉 117
Asp lie Asn Trp Asn Gly Gly Ser Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15
Gly <210〉 118 <211> 15 <212〉 PRT <213〉智人 <400> 118
Glu Gin Trp Leu Asp Pro Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val 15 10 15 <210〉 119 <211〉 11
<212〉 PRT 〈213〉智人 〈400〉 119
Arg Ala Ser Gin Gly lie Ser Ser Trp Leu Ala 1 5 10 <210〉 120 •69· 151365-序列表.doc 201125581 <211〉 7 <212> PRT <213〉智人 <400〉 120
Ala Ala Ser Ser Leu Gin Ser 1 5 <210〉 121 <211〉 9
<212> PRT <213〉智人 <400> 121
Gin Gin Tyr Asn Ser Tyr Pro Trp Thr 1 <210〉 122 <211〉 11 <212〉 PRT <213〉 智人 <400> 122
Arg Ala Ser Gin Gly Val Ser Ser Tyr Leu Ala 1 5 10 〈210〉 123 70- 151365-序列表.doc 201125581 <211〉 7 <212> PRT <213〉智人 <400〉 123
Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr 1 5 <210〉 124 〈211〉 9
<212〉 PRT 〈213> 智人 <400〉 124
Gin Gin Arg Ser Asa Trp His Arg Thr 1 5 〈210〉 125 〈211〉 12
<212> PRT <213〉智人 〈400〉 125
Arg Ala Ser Gin Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala 1 5 10 -71 - 151365-序列表.doc 201125581 <210〉 126 <211> 7 <212〉 PRT <213〉智人 <400> 126
Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr 1 5 <210〉 127 <211〉 9
<212〉 PRT <213〉智人 <400〉 127
Gin Gin Tyr Asn Ser Tyr Pro Trp Thr 1 5 〈210〉 128 <211〉 11
<212〉 PRT <213〉智人 〈400〉 128
Arg Ala Ser Gin Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala 1 5 10 -72· 151365-序列表.doc 201125581 <210> 129 <211> 7 <212〉 PRT <213〉智人 <400> 129
Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr 1 5 <210〉 130 〈211〉 9
<212> PRT <213〉智人 <400> 130
Gin Gin Arg Ser Asn Trp Pro Trp Thr 1 5 <210〉 131 <211〉 108
<212〉 PRT <213〉智人 <400〉 131
Glu lie Val Leu Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly -73- 151365-序列表.doc 201125581 15 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 lie Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Gly Ser Ser Pro 85 90 95
Tyr Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105 <210〉 132 <211> 11 <212> PRT 〈213>智人 <400〉 132
Arg Ala Ser Gin Gly Val Ser Ser Tyr Leu Ala 1 5 l〇 〈210〉 133 <211> 7
<212〉 PRT <213〉智人 • 74- 151365·序列表.doc 201125581 <400> 133
Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr 1 5 <210> 134 <211〉 9
〈212〉 PRT <213〉智人 <400〉 134
Gin Gin Tyr Gly Ser Ser Pro Tyr Thr 1 5 <210〉 135 <211> 120
<212〉 PRT 〈213〉智人 <400〉 135
Ser Ser Ser His Pro lie Phe His Arg Gly Glu Phe Ser Val Cys Asp 15 10 15
Ser Val Ser Val Trp Val Gly Asp Lys Thr Thr Ala Thr Asp lie Lys 20 25 30
Gly Lys Glu Val Met Val Leu Gly Glu Val Asn lie Asn Asn Ser Val 35 40 45
Phe Lys Gin Tyr Phe Phe Glu Thr Lys Cys Arg Asp Pro Asn Pro Val 50 55 60 -75- 151365-序列表.doc 201125581
Asp Ser Gly Cys Arg Gly lie Asp Ser Lys His Trp Asn Ser Tyr Cys 65 70 75 80
Thr Thr Thr His Thr Phe Val Lys Ala Leu Thr Met Asp Gly Lys Gin 85 90 95
Ala Ala Trp Arg Phe He Arg He Asp Thr Ala Cys Val Cys Val Leu 100 105 110
Ser Arg Lys Ala Val Arg Arg Ala 115 120 <210〉 136 <211〉 120
<212〉 PRT <213〉小家鼠 <400〉 136
Ser Ser Thr His Pro Val Phe His Met Gly Glu Phe Ser Val Cys Asp 15 10 15
Ser Val Ser Val Trp Val Gly Asp Lys Thr Thr Ala Thr Asp lie Lys 20 25 30
Gly Lys Glu Val Thr Val Leu Ala Glu Val Asn lie Asn Asn Ser Val 35 40 45
Phe Arg Gin Tyr Phe Phe Glu Thr Lys Cys Arg Ala Ser Asn Pro Val 50 55 60
Glu Ser Gly Cys Arg Gly He Asp Ser Lys His Trp Asn Ser Tyr Cys 65 70 75 80
Thr Thr Thr His Thr Phe Val Lys Ala Leu Thr Thr Asp Glu Lys Gin 85 90 95
Ala Ala Trp Arg Phe lie Arg lie Asp Thr Ala Cys Val Cys Val Leu • 76- 151365-序列表.doc 201125581 100 105 110
Ser Arg Lys Ala Thr Arg Arg Ala 115 120 <210〉 137 <211> 126
<212> PRT <213〉智人 <400〉 137
His Ser Asp Pro Ala Arg Arg His Ser Asp Pro Ala Arg Arg Gly Glu 15 10 15
Leu Ser Val Cys Asp Ser lie Ser Glu Trp Val Thr Ala Ala Asp Lys 20 25 30
Lys Thr Ala Val Asp Met Ser Gly Gly Thr Val Thr Val Leu Glu Lys 35 40 45
Val Pro Val Ser Lys Gly Gin Leu Lys Gin Tyr Phe Tyr Glu Thr Lys 50 55 60
Cys Asn Pro Met Gly Tyr Thr Lys Glu Gly Cys Arg Gly lie Asp Lys 65 70 75 80
Arg His Trp Asn Ser Gin Cys Arg Thr Thr Gin Ser Tyr Val Arg Ala 85 90 95
Leu Thr Met Asp Ser Lys Lys Arg lie Gly Trp Arg Phe lie Arg He 100 105 110
Asp Thr Ser Cys Val Cys Thr Leu Thr lie Lys Arg Gly Arg 115 120 125 <210〉 138 <211〉 119 -77· 151365-序列表.doc 201125581 <212〉 PRT <213〉智人 <400> 138
Tyr Ala Glu His Lys Ser His Arg Gly Glu Tyr Ser Val Cys Asp Ser 15 10 15
Glu Ser Leu Trp Val Thr Asp Lys Ser Ser Ala lie Asp lie Arg Gly 20 25 30
His Gin Val Thr Val Leu Gly Glu lie Lys Thr Gly Asn Ser Pro Val 35 40 45
Lys Gin Tyr Phe Tyr Glu Thr Arg Cys Lys Glu Ala Arg Pro Val Lys 50 55 60
Asn Gly Cys Arg Gly lie Asp Asp Lys His Trp Asn Ser Gin Cys Lys 65 70 75 80
Thr Ser Gin Thr Tyr Val Arg Ala Leu Thr Ser Glu Asn Asn Lys Leu 85 90 95
Val Gly Trp Arg Trp He Arg He Asp Thr Ser Cys Val Cys Ala Leu 100 105 110
Ser Arg Lys lie Gly Arg Thr 115 <210> 139 <211〉 104 <212> PRT <213〉智人 <400〉 139
Val Asn Val Ser Phe Pro Ala Ser Val Gin Leu His Thr Ala Val Glu 15 10 15 78 - 15】365·序列表.doc 201125581
Met His His Trp Cys lie Pro Phe Ser Val Asp Gly Gin Pro Ala Pro 20 25 30
Ser Leu Arg Trp Leu Phe Asn Gly Ser Val Leu Asn Glu Thr Ser Phe 35 40 45 lie Phe Thr Glu Phe Leu Glu Pro Ala Ala Asn Glu Thr Val Arg His 50 55 60
Gly Cys Leu Arg Leu Asn Gin Pro Thr His Val Asn Asn Gly Asn Tyr 65 70 75 80
Thr Leu Leu Ala Ala Asn Pro Phe Gly Gin Ala Ser Ala Ser lie Met 85 90 95
Ala Ala Phe Met Asp Asn Pro Phe 100 <210> 140 <211〉 103 <212> PRT <213〉智人 <400〉 140
Leu Thr Val His Phe Ala Pro Thr lie Thr Phe Leu Glu Ser Pro Thr 15 10 15
Ser Asp His His Trp Cys lie Pro Phe Thr Val Lys Gly Asn Pro Lys 20 25 30
Pro Ala Leu Gin Trp Phe Tyr Asn Gly Ala lie Leu Asn Glu Ser Lys 35 40 45
Tyr lie Cys Thr Lys lie His Val Thr Asn His Thr Glu Tyr His Gly 50 55 60 •79- 151365·序列表.doc 201125581
Cys Leu Gin Leu Asp Asn Pro Thr His Met Asn Asn Gly Asp Tyr Thr 65 70 75 80
Leu lie Ala Lys Asn Glu Tyr Gly Lys Asp Glu Lys Gin lie Ser Ala 85 90 95
His Phe Met Gly Trp Pro Gly 100 <210〉 141 <211〉 102 <212〉 PRT <213〉智人 <400〉 141
Leu Thr Val Tyr Tyr Pro Arg Val Val Ser Leu Glu Glu Pro Glu 15 10 15
Leu Arg Leu Glu His Cys He Glu Phe Val Val Arg Gly Asn Pro Pro 20 25 30
Pro Thr Leu His Trp Leu His Asn Gly Gin Pro Leu Arg Glu Ser Lys 35 40 45 lie lie His Val Glu Tyr Tyr Gin Glu Gly Glu He Ser Glu Gly Cys 50 55 60
Leu Leu Phe Asn Lys Pro Thr His Tyr Asn Asn Gly Asn Tyr Thr Leu 65 70 75 80
He Ala Lys Asn Pro Leu Gly Thr Ala Asn Gin Thr lie Asn Gly His 85 90 95
Phe Leu Lys Trp Pro Phe 100 -80· 151365·序列表.doc

Claims (1)

  1. 201125581 七、申請專利範圍： 1. 一種NGF抗體之用途，其係用於製造用以治療由神經生 長因子（NGF)表現增加或對NGF敏感性增加引起之病況 的藥物，其中該藥物經口；藉由靜脈内、腹膜内、大腦 内（腦實質内）、腦室内、肌肉内、眼内、動脈内、門靜 脈内、病灶内或皮下途徑注射；藉由持續釋放系統或藉 由植入裝置投與。 2. 如請求項〗之用途，其中該注射為皮下注射。 3·如請求項2之用途，其中該藥物包含醫藥學上有效量之 NGF抗體，每次皮下注射約3 mg至約3〇 mg。 4.如請求項2之用途，其中該皮下注射包含多次皮下注 射。 ’ °月求項1之用途，其中該病況為急性疼痛、牙痛、外 傷疼痛、外科疼痛、切除術或膿腫引起之疼痛、灼痛、 髓鞘脫失病、三又神經痛、癌症、慢性酒精中毒中 風、丘腦痛症候群、糖展病、後天性免疫缺陷症候群 (IDS」）' 毒素、化學療法、一般性頭痛、偏頭痛、 叢集！生頭痛、混合性血管或非血管症候群、緊張性頭 痛全身性發炎、關節炎、風濕病、狼瘡、骨關節炎、 :肉裁維疼痛、發炎性腸病、大腸急躁症、發炎性眼 :、發炎性或不穩定膀胱功能障礙、牛皮癬、具有發炎 分之皮膚病症、曬傷、心臟炎、皮炎、肌炎、神經 人膠原i管病、慢性發炎性病況、炎性痛及相關之痛 覺過敏及異常疼痛、神經痛及相關之痛覺過敏或異常疼 151365.doc 201125581 痛、糖尿病性神經病變疼痛、交感神經維持性疼痛、傳 入神經阻滯症候群、哮喘、上皮組織損傷或功能障礙、 單純疱疹、呼吸、泌尿生殖、$胃或血管區之内臟蠕動 紊亂、創傷、燒傷、過敏性皮膚反應、搔癢、白斑病、 -般性腸胃障礙、結腸炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、血 管舒縮性或過敏性鼻炎或支氣管病症、痛經、消化不 良、月食道逆流、騰臟炎、或内臟疼痛。 6.如請求項5之用途，其中該骨關節炎為骨關節炎膝痛。 7·如請求項6之用途’其中該注射為皮下注射。 8. 如請求項7之用途，其中該藥物包含醫藥學上有效量之 NGF抗體’每次皮下注射約3 mg至約30 mg。 9. 如請求項1之用途，其中該藥物包含醫藥組合物，該醫 藥組合物包含醫藥學上可接受之載劑及經分離抗體，其 中該抗體包含含有SEQ ID NO. 44之輕鏈及含SEQ ID. NO. 40之重鏈。 10·如6青求項9之用途，其中該抗體之該重鏈及該輕鏈由可 挽性連接子連接形成單鏈抗體。 U.如清求項1之用途’其中該NGF抗體為FAb，抗體。 12.如清求項1之用途，其中該NGF抗體為（Fab，)2抗體。 13·如§青求項1之用途’其中該NGF抗體為完全人類抗體。 14. 如睛求項1之用途，其中該NGF抗體為人類化抗體。 15. 如請求項1之用途，其中該NGF抗體抑制NGF信號傳導。 16. 如5青求項1之用途，其中該NGF抗體包含含有SEQ ID N0_ 44之輕鏈及含SEQ ID NO: 40之重鏈，且該抗體之該 151365.doc 201125581 重鍵及該輕鏈由可撓性連接子連接形成單鏈抗體。 17. 如請求項16之用途’其中該ngf抗體為單鏈Fv抗體。 18. 如請求項16之用途’其中該ngf抗體為FAb'抗體。 • 19·如請求項16之用途，其中該NGF抗體為（Fab')j^體。 . 20·如請求項16之用途，其中該NGF抗體為完全人類抗體。 21. 如請求項16之用途，其中該ngf抗體為人類化抗體。 22. 如請求項16之用途，其中該NGF抗體抑制NGF信號傳 導。 23·如請求項16之用途，其中該NGF抗體以約lxl〇-9或lxi0-9 以下之KD自人類NGF多肽解離，且在標準活體外分析中 以約1χ1〇_8或lxlO·8以下之IC5❹中和人類NGF生物活性。 24. 如請求項16之用途，其中該NGF抗體以約lxlO·10或1χ1〇-ιο 以下之KD自人類NGF多肽解離，且在標準活體外分析中 以約lxlO·9或ΙχίΟ·9以下之IC5〇中和人類NGF生物活性。 25. 如請求項16之用途’其中該NGF抗體以約1χΐ〇-Η或1χ1〇·ιι 以下之KD自人類NGF多肽解離，且在標準活體外分析中 以約0.2xlO·9或〇·2χ1 〇_9以下之IC50中和人類NGF生物活 性0 151365.doc
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