CN112175087A

CN112175087A - 一种抗CD4和TGFβ的双特异性抗体、其药物组合及其用途

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Publication number: CN112175087A
Application number: CN201910588823.3A
Authority: CN
Inventors: 程汉兵
Original assignee: Shenzhen Maijiarui Biotechnology Co ltd
Current assignee: Shenzhen Maijiarui Biotechnology Co ltd
Priority date: 2019-07-02
Filing date: 2019-07-02
Publication date: 2021-01-05
Anticipated expiration: 2039-07-02
Also published as: CN112175087B

Abstract

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种双特异性抗体，至少包括：第一蛋白功能区，所述第一蛋白功能区靶向CD4，所述第一蛋白功能区为抗CD4的抗体或其抗原结合片段；第二蛋白功能区，所述第二蛋白功能区靶向TGFβ1，所述第二蛋白功能区为抗TGFβ1的抗体或其抗原结合片段。本发明的双特异性抗体CT101能够很好地特异性与CD4结合，特异性地结合到辅助性T细胞上；与此同时，CT101也能与TGFβ1结合，并且能够十分有效地阻断TGFβ1与TGFβRII的结合，从而特异地解除TGFβ对辅助性T细胞的免疫抑制。具有用于制备防治肝癌、肺癌、乳腺癌、肾癌、宫颈癌、卵巢癌、淋巴瘤、结肠癌、直肠癌等恶性肿瘤的药物的作用。

Description

一种抗CD4和TGFβ的双特异性抗体、其药物组合及其用途

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种抗CD4和TGFβ的双特异性抗体、其药物组合及其用途。

背景技术

肿瘤尤其是恶性肿瘤是当今世界严重危害人类健康的疾病，在各种疾病所导致的死亡中高居第二位。随着近年来环境污染，人们生活压力增大，恶性肿瘤发病率呈逐年上升趋势。而且，恶性肿瘤治疗效果差，尤其是晚期转移率高，预后多不佳。目前临床上采用的常规疗法如放疗、化疗、靶向治疗或手术治疗虽一定程度上缓解了病情，延长了生存时间，但这些方法仍然存在很大的局限性，不仅仅是体现在治疗效果上，而且很多恶性肿瘤病人仍然没有有效的治疗方案，例如胰腺癌等。

TGFβ于1981年首次被鉴别(Robert等人，PNAS，78：5339-5343.(1981))。转化生长因子β，因最初其将正常成纤维细胞转化为不依赖锚定生长的细胞的能力，而命名的多功能细胞因子。

TGFβ家族成员一般有TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3。其中，人TGFβ与小鼠TGFβ保守性非常高：人TGFβ1与小鼠TGFβ1只有一个氨基酸的差异，人TGFβ2与小鼠TGFβ2只有三个氨基酸的差异，人TGFβ3与小鼠TGFβ3相同。

具有生物学活性的TGFβ一般以二聚体的形式错在，当其与细胞表面的TGFβTypeII受体(TGFβRII)结合后，就会与临近的TGFβtype I受体(TGFβRI)结合，共同形成六聚体。随后，由于TGFβ的结合，TGFβRII丝氨酸/苏氨酸激酶的活性被激活。此时，TGFβRII使TGFβRI上一些关键的丝氨酸被磷酸化，激活了其丝氨酸/苏氨酸激酶的活性。这个磷酸化过程会持续向下游进行，使临近的regulatory SMAD(R-SMAD)被磷酸化，主要包括SMAD2，3，9等等(通常R-SMAD会被SARA蛋白固定在细胞膜内部)。被磷酸化的R-SMAD对于细胞质游离的Co-SMAD(如SMAD4)有着极高的亲和力，于是形成了R-SAMD-Co-SMAD聚合物。它将进入细胞核，与转录因子共同结合到DNA上，启动下游基因的表达(Sporn等，Science，233：532(1986))。

然而，TGFβ并不能直接作用于细胞表面的受体。在正常情况下，只有少量的游离态TGFβ可以与受体结合，而大多数TGFβ都是与latency-associated peptide(LAP)结合，不具有活性。TGFβ共有四种形态，只有当TGFβ-LAP聚体被肿瘤微环境中的蛋白酶(由肿瘤细胞分泌)剪切，形成游离态，才能激活TGFβ。关于TGFβ及其作用的一般性综述可参见相应的文献(Joan Massague，TGFβin Cancer.Cell，134(2):215-230(2008))。

TGFβ是一类重要的细胞因子。TGFβ信号通路能够调控细胞的生长，分化以及细胞凋亡，是细胞维持正常功能不可或缺的重要部分。然而，TGFβ却能操控肿瘤微环境，具有致癌作用。恶性肿瘤细胞会大量分泌TGFβ蛋白，一方面让癌细胞加速成长和扩散，另一方面令癌细胞绕过免疫系统的攻击。

TGFβ在肿瘤发生、发展中具有双重作用。最初的研究发现,TGFβ抑制造血细胞上皮细胞和的增殖，促进细胞凋亡。随后的实验又证明TGFβ对多种上皮性肿瘤细胞(如胃癌、肺癌、结肠癌、肝癌、肾癌及前列腺癌)的体外增殖起负调控作用，其信号传导通路中任何蛋白发生突变都将使肿瘤细胞具有选择性生长优势，导致肿瘤的发生。由于这种增殖抑制特性，TGFβ一度被认为是最有潜力的癌症治疗药物靶点。但随着研究的深入，人们又发现TGFβ在肿瘤进展期能够促进肿瘤侵袭和转移。因此有学者提出TGFβ在肿瘤的发生、发展中是一把“双刃剑”(俞清翔，转化生长因子β与肿瘤转移的研究进展，世界华人消化杂志，14(25):2538-2541(2016))。

TGFβ对肿瘤生长的影响不仅体现在对肿瘤细胞的直接作用上，TGFβ还能够抑制免疫系统对于癌细胞的杀伤。TGFβ能够诱导调控性T细胞(Treg)，使之对效应性T细胞(effector T cell)产生抑制作用。另外，TGFβ能够直接作用于辅助性T细胞(helper Tcell)，B细胞，NK细胞，巨噬细胞以及树突状细胞(dendritic cell,，DC)，抑制它们的免疫活性(Eduard Battle&Joan Massague，Transformating Growth Factor-βSignaling inImmunity and Cancer.Immunity，50(4):924-940(2019))。

根据TGFβ在肿瘤生长中的作用，人们开发出了很多抑制TGFβ信号通路的抗体或者小分子化合物，但近二十多年过去了，没有一个靶向TGFβ的药物取得临床上的成功。靶向TGFβ通路的化学小分子抑制剂本身有很大的毒性，比如一些TGFβRI化学小分子抑制剂具有很强的心脏毒性。而中和TGFβ活性的抗体分子，相对化学小分子来说，不容易渗透进细胞内，因此其安全性有很大的优势，但并没有显示出临床有效性。

CAT192是一个人IgG4单克隆抗体，主要中和TGFβ1的活性，对TGFβ2和TGFβ3没有中和能力。该抗体最初由美国剑桥抗体公司(Cambridge Antibody Technology，CAT)通过噬菌体展示技术分离得到。2000年，CAT公司与美国Genzyme公司签署合作协议共同开发TGFβ抗体。2004年，CAT和Genzyme公司共同宣布CAT192在治疗硬皮症(scleroderma)的I/II期临床实验中，在各种剂量使用上都是安全的，但并没有显示出有效性。临床有效性实验的失败导致CAT192被Genzyme公司放弃，转而以开发另外一种TGFβ中和抗体fresolimumab来替代。目前，fresolimumab在治疗恶性肿瘤的临床有效性方面仍然进展缓慢。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种抗CD4和TGFβ的双特异性抗体、其药物组合及其用途，用于解决现有技术中的问题。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一种双特异性抗体，所述双特异性抗体至少包括：

第一蛋白功能区，所述第一蛋白功能区靶向CD4，所述第一蛋白功能区为抗CD4的抗体或其抗原结合片段；

第二蛋白功能区，所述第二蛋白功能区靶向TGFβ1，所述第二蛋白功能区为抗TGFβ1的抗体或其抗原结合片段。

本发明第二方面提供一种分离的核酸分子，其编码前述双特异性抗体。

本发明第三方面提供一种构建体，其包含本发明的分离的核酸分子。

本发明第四方面提供一种宿主细胞，所述宿主细胞含有前述分离的核酸分子，或者包含前述构建体。

本发明第五方面提供前述双特异性抗体的制备方法，包括如下步骤：在适合表达所述双特异性抗体的条件下，培养如前述的宿主细胞，以及从细胞培养物中回收所述双特异性抗体的步骤。

本发明第六方面提供一种偶联物，其包含双特异性抗体以及偶联部分，所述双特异性抗体为前述双特异性抗体，所述偶联部分为可检测的标记；优选地，所述偶联部分为化学小分子、荧光物质、发光物质、有色物质或酶。

本发明第七方面提供前述双特异性抗体、核酸分子、构建体、宿主细胞、偶联物在制备或筛选：预防和/或治疗恶性肿瘤的药物中的用途；优选地，所述恶性肿瘤选自结肠癌、直肠癌、肺癌、肾癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、膀胱癌、胃肠道癌、脑癌、肝癌、黑色素瘤或白血病中的一种或多种。

本发明第八方面提供一种药物组合物，包括治疗有效量的前述双特异性抗体、宿主细胞或偶联物；可选地，所述药物组合物还包含药学上可接受的辅料。

本发明第九方面提供25、抗CD4抗体和抗TGFβ1抗体联合用于制备预防和/或治疗恶性肿瘤的药物中的用途；优选地，所述恶性肿瘤选自结肠癌、直肠癌、肺癌、肾癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、膀胱癌、胃肠道癌、脑癌、肝癌、黑色素瘤或白血病中的一种或多种。

如上所述，本发明构建抗CD4和TGFβ的双特异性抗体，具有以下有益效果：

本发明的双特异性抗体CT101能够很好地特异性与CD4结合，特异性地结合到辅助性T细胞上；与此同时，CT101也能与TGFβ1结合，并且能够十分有效地阻断TGFβ1与TGFβRII的结合，从而特异地解除TGFβ对辅助性T细胞的免疫抑制。具有用于制备防治肝癌、肺癌、乳腺癌、肾癌、宫颈癌、卵巢癌、淋巴瘤、结肠癌、直肠癌等恶性肿瘤的药物的作用。

附图说明

图1：不同的抗体治疗对EMT-6乳腺癌移植肿瘤的抑制效果。治疗抗体有对照IgG、抗TGFβ抗体、抗CD8/抗TGFβ双功能抗体、抗CD64/抗TGFβ双功能抗体以及抗CD4/抗TGFβ双功能抗体。

图2：双功能抗体CT101的IgG-ScFv形式(Morrison模式)结构示意图。

图3：双功能抗体CT101的IgG-ScFv形式(Morrison模式)氨基酸序列,其中下划线部分的氨基酸为抗体的重链或轻链CDR区域。

图4：双功能抗体CT101(IgG-ScFv形式)的SDS-PAGE检测结果。左图为还原型蛋白电泳结果，右图为非还原型蛋白电泳结果。

图5：双功能抗体CT101(IgG-ScFv形式)流经分子筛的高效液相色谱图。

图6：双功能抗体CT101与CD4结合的动力学特征参数检测结果。

图7：双功能抗体CT101与TGFβ1结合的动力学特征参数检测结果。

图8：间接ELISA法检测双功能抗体CT101、抗TGFβ1抗体CAT192与TGFβ1蛋白的结合常数EC50。

图9：间接ELISA法检测双功能抗体CT101、抗CD4抗体Ibalizumab与CD4蛋白的结合常数EC50。

图10：竞争ELISA方法检测双功能抗体CT101、抗TGFβ1抗体CAT192与TGFβRII竞争结合TGFβ1的活性。

图11：FACS流式细胞术检测双功能抗体CT101、抗CD4抗体Ibalizumab与HEK293-CD4细胞表面CD4蛋白的结合常数EC50。

图12：双功能抗体CT101和抗TGFβ1抗体CAT192对HEK293细胞TGFβ信号通路的抑制作用。

图13：双功能抗体CT101和抗TGFβ1抗体CAT192对稳定表达人CD4分子的HEK293细胞TGFβ信号通路的抑制作用。

图14：不同的抗体治疗对MC38结肠癌移植肿瘤的抑制效果。治疗抗体有对照IgG、抗TGFβ1抗体CAT192、抗PD-L1抗体atezolizumab、atezolizumab联合CAT192以及双功能抗体CT01。

具体实施方式

通过基因工程的方法改造TGFβ抗体，使其特异性地抑制免疫细胞上的TGFβ信号通路，如辅助性T细胞(CD4阳性T细胞)、杀伤性T细胞(CD8阳性T细胞)或巨噬细胞等，从而解除TGFβ对免疫细胞的抑制，使其发挥抗肿瘤作用。

双功能抗体也称作双特异性抗体(Bispecific Antibody)，是同时靶向两种不同抗原的特异性抗体，其可以通过免疫分选纯化产生。另外，也可以通过基因工程获得。基因工程在结合位点处优化，合成形式的考量以及产量等方面均有相应的灵活性及优势。目前，其存在形式已经被证明有超过45种。目前已开发的多种双特异性抗体为IgG-ScFv形式即Morrison模式，由于这种类似于天然存在的IgG形式，其在抗体工程、表达和纯化上所具有的优势，已被证明是双功能抗体的一种理想存在形式。

通过基因工程技术，将中和TGFβ抗体和靶向免疫细胞抗体整合成一个双功能抗体，从而特异性中和免疫细胞上的TGFβ信号。这种类型的双功能抗体能够充分解除TGFβ对免疫细胞的功能抑制，从而更大程度上实现其抗癌功能。

本发明人总结以往TGFβ抗体临床失败的教训，通过设计双功能抗体，将中和TGFβ抗体特异性靶向到主要免疫细胞上，如辅助性T细胞(CD4阳性T细胞)、杀伤性T细胞(CD8阳性T细胞)或巨噬细胞(CD64阳性)，来验证其是否相对于TGFβ抗体具有更强的抗肿瘤功能。这些特异性靶向主要免疫细胞的双功能抗体分别为抗CD4/抗TGFβ、抗CD8/抗TGFβ以及抗CD64/抗TGFβ。

通过EMT-6乳腺癌移植肿瘤模型，本发明人发现靶向辅助性T细胞的双功能抗体抗CD4/抗TGFβ具有最强的抗肿瘤效果，而抗CD64/抗TGFβ效果次之。抗CD8/抗TGFβ相对于对照抗体IgG和抗TGFβ则没有显著效果。

本发明人经过深入的实验研究和创造性的劳动，获得了能够同时结合CD4和TGFβ1，并阻断辅助性T细胞上TGFβ信号通路的人双功能抗体，命名为CT101。

本发明人发现，CT101能够：

有效地结合人辅助性T细胞表面的CD4分子，解除TGFβ对辅助性T细胞的免疫抑制；

有效地激活辅助性T细胞，从而激活一系列免疫细胞，抑制肿瘤的生长。

具有用于制备防治肝癌、肺癌、乳腺癌、肾癌、宫颈癌、卵巢癌、淋巴瘤、结肠癌、直肠癌等恶性肿瘤的药物的潜力。

由此提供了下述发明：

本发明的双特异性抗体，至少包括：

优选的，所述第一蛋白功能区的重链可变区包含氨基酸序列分别为SEQ ID NO:17—SEQ ID NO:19所示的HCDR1-HCDR3，其轻链可变区包含氨基酸序列分别为SEQ ID NO:20—SEQ ID NO:22所示的LCDR1-LCDR3；和，

所述第二蛋白功能区的重链可变区包含氨基酸序列分别为SEQ ID NO:23—SEQID NO:25所示的HCDR1-HCDR3，其轻链可变区包含氨基酸序列分别为SEQ ID NO:26—SEQID NO:28所示的LCDR1-LCDR3。

在本发明的一些实施方式中，所述第一蛋白功能区的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，所述第一蛋白功能区的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示；和，

所述第二蛋白功能区的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示；所述第二蛋白功能区的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示。

在本发明的一些实施方式中，所述第一蛋白功能区选自Fab、Fab’、F(ab’)2、Fd、Fv、dAb、互补决定区片段、单链抗体、人源化抗体、嵌合抗体或双抗体；和/或

所述第二蛋白功能区选自Fab、Fab’、F(ab’)2、Fd、Fv、dAb、互补决定区片段、单链抗体、人源化抗体、嵌合抗体或双抗体。

在本发明的一些实施方式中，所述第一蛋白功能区为免疫球蛋白或单链抗体；和

所述第二蛋白功能区为免疫球蛋白或单链抗体。

在本发明的一些实施方式中，所述的双特异性抗体为IgG-ScFv模式。

在本发明的一些实施方式中，所述的双特异性抗体也可为其他双特异性抗体存在形式。

在本发明的一些实施方式中，所述第一蛋白功能区为免疫球蛋白，和所述第二蛋白功能区为单链抗体；或者

所述第一蛋白功能区为单链抗体，和所述第二蛋白功能区为免疫球蛋白。

在本发明的一些实施方式中，所述的双特异性抗体中，所述的免疫球蛋白包括非—CDR区，且所述非—CDR区来自非鼠类的物种，例如来自灵长类抗体，如人抗体。

在本发明的一些实施方式中，所述的双特异性抗体中，所述的免疫球蛋白，其恒定区来自于人抗体。

优选地，所述免疫球蛋白的恒定区选自人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的恒定区。

在本发明的一些实施方式中，所述的双特异性抗体中，所述的免疫球蛋白，其重链恒定区为人IgG1chain C region或人IgG4chain C region,并且其轻链恒定区为人Igkappa chain C region。

在本发明的一些实施方式中，所述免疫球蛋白的恒定区是人源化的，例如，重链恒定区均采用IgG4chain C region，ACCESSION:P01861；轻链恒定区均采用Ig kappa chainC region，ACCESSION:P01834。

在本发明的一些实施方式中，所述的双特异性抗体中，所述免疫球蛋白为1个；所述单链抗体为2个，并且优选为两个相同的单链抗体。

在本发明的一些实施方式中，所述的双特异性抗体中，所述免疫球蛋白为IgG、IgA、IgD、IgE或IgM；优选为IgG，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。

在本发明的一些实施方式中，所述的双特异性抗体中，所述单链抗体为两条，每条单链抗体的一端分别连接在免疫球蛋白的两条重链的C末端或N末端。

在本发明的一些实施方式中，所述的双特异性抗体中，所述单链抗体连接在免疫球蛋白的重链的C末端。由于免疫球蛋白有两条重链，因此，一个免疫球蛋白分子连接有两个单链抗体分子。优选地，两个单链单体分子相同。

在本发明的一些实施方式中，所述单链抗体的VH与VL之间存在二硫键。在抗体的VH和VL之间引入二硫键的方法是本领域熟知的，例如可参见美国专利申请US5747654；Rajagopal等人，Prot.Engin.10(1997)1453-1459；Reiter等人，Nature Biotechnology14(1996)1239-1245；Webber等人，Molecular Immunology 32(1995)249-258；Reiter等人，Immunity 2(1995)281-287；Reiter等人，JBC 269(1994)18327-18331；Reiter等人，Inter.J.of Cancer 58(1994)142-149；或,Reiter等人，Cancer Res.54(1994)2714-2718；其通过引用并入本文。

在本发明的一些实施方式中，所述的双特异性抗体中，所述第一蛋白功能区和第二蛋白功能区直接连接或者通过连接片段连接。

优选地，所述连接片段为(GGGGS)m,m为正整数，例如1、2、3、4、5或6。其中，GGGGS(SEQ ID NO:16)为Linker的构成单元。例如，可以为GGGGS GGGGS GGGGS GGGGS(SEQ IDNO:15)。

在本发明的一些实施方式中，所述的双特异性抗体中，所述第一蛋白功能区和第二蛋白功能区独立地为1个、2个或者2个以上。

在本发明的一些实施方式中，所述的双特异性抗体，其中，所述的双特异性抗体以小于10^-9M或更小的Kd结合CD4蛋白和/或TGFβ1蛋白；优选地，所述Kd通过Biacore分子相互作用仪测得。

本发明的另一方面涉及一种分离的核酸分子，其编码本发明中任一所述的双特异性抗体。

本发明还涉及一种构建体，其包含本发明的分离的核酸分子。

优选的，所述构建体由如前述核酸分子插入到表达载体的多克隆位点构建而成。

本发明还涉及一种宿主细胞，其包含本发明的分离的核酸分子，或者包含本发明的构建体。

在本发明的一些实施方式中，所述宿主细胞含有所述的构建体、或者染色体中整合有所述的核酸分子。

优选的，所述重组的宿主细胞由所述构建体转染到宿主细胞构建而成。

本发明的再一方面涉及本发明中任一项所述的双特异性抗体的方法，其包括在合适的条件下培养本发明的宿主细胞，以及从细胞培养物中回收所述双特异性抗体的步骤。

本发明的再一方面涉及一种偶联物，其包含双特异性抗体以及偶联部分，其中，所述双特异性抗体为本发明中任一项所述的双特异性抗体，所述偶联部分为可检测的标记；优选地，所述偶联部分为小分子化合物、荧光物质、发光物质、有色物质或酶。

本发明的再一方面涉及一种药物组合物，其包含本发明中任一项所述的双特异性抗体或者包含本发明的偶联物；可选地，其还包含药学上可接受的辅料。

本发明的双特异性抗体或者本发明的药物组合物可以配制成药学领域已知的任何剂型，例如，片剂、丸剂、混悬剂、乳剂、溶液、凝胶剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、酏剂、锭剂、栓剂、注射剂(包括注射液、注射用无菌粉末与注射用浓溶液)、吸入剂、喷雾剂等。优选剂型取决于预期的给药方式和治疗用途。本发明的药物组合物应当是无菌的并在生产和储存条件下稳定。一种优选的剂型是注射剂。此类注射剂可以是无菌注射溶液。例如，可通过下述方法来制备无菌注射溶液：在适当的溶剂中掺入必需剂量的本发明的双特异性抗体，以及任选地，同时掺入其他期望的成分(包括但不限于，pH调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂，等渗剂、防腐剂、稀释剂，或其任何组合)，随后过滤除菌。此外，可以将无菌注射溶液制备为无菌冻干粉剂(例如，通过真空干燥或冷冻干燥)以便于储存和使用。此类无菌冻干粉剂可在使用前分散于合适的载体中，例如无菌无热原水。此外，本发明的双特异性抗体可以以单位剂量形式存在于药物组合物中，以便于施用。在某些实施方案中，所述单位剂量为至少1mg，至少5mg，至少10mg，至少15mg，至少20mg，至少25mg，至少30mg，至少45mg，至少50mg，至少75mg，或至少100mg。在所述药物组合物为液体(例如，注射剂)剂型的情况下，其可以包含浓度至少为0.1mg/ml，如至少0.25mg/ml，至少0.5mg/ml，至少1mg/ml，至少2.5mg/ml，至少5mg/ml，至少8mg/ml，至少10mg/ml，至少15mg/ml，至少25mg/ml，至少50mg/ml，至少75mg/ml，或至少100mg/ml的本发明的双特异性抗体。

本发明的双特异性抗体或药物组合物可以通过本领域已知的任何合适的方法来施用，包括但不限于，口服、口腔、舌下、眼球、局部、肠胃外、直肠、叶鞘内、内胞浆网槽内、腹股沟、膀胱内、局部(如，粉剂、药膏或滴剂)，或鼻腔途径。但是，对于许多治疗用途而言，优选的给药途径/方式是胃肠外给药(例如静脉注射，皮下注射，腹膜内注射，肌内注射)。技术人员应理解，给药途径和/或方式将根据预期目的而发生变化。在一个优选的实施方案中，本发明的双特异性抗体或药物组合物通过静脉输注或注射给予。

本发明所提供的双特异性抗体或药物组合物可以单独使用或联合使用，也可以与另外的药学活性剂(例如肿瘤化疗药物)联合使用。这种另外的药学活性剂可以在施用本发明的双特异性抗体或本发明的药物组合物之前、同时或之后施用。

在本发明中，可调整给药方案以获得最佳目的反应(例如治疗或预防反应)。例如，可以单次给药，可以在一段时间内多次给药，或者可以随治疗情况的紧急程度按比例减少或增加剂量。

本发明的再一方面涉及本发明中任一项所述的双特异性抗体、核酸分子、构建体、宿主细胞或偶联物在制备或筛选：预防和/或治疗恶性肿瘤的药物中的用途；优选地，所述恶性肿瘤选自结肠癌、直肠癌、肺癌、肾癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、膀胱癌、胃肠道癌、脑癌、肝癌、黑色素瘤或白血病中的一种或多种。

本发明的体外实验中，抗TGFβ1抗体CAT192以及双功能抗体CT101均能抑制HEK293细胞中的TGFβ信号通路，其IC50约等于250pM。但在稳定表达人CD4分子的HEK293细胞中，抗CD4-抗TGFβ1双功能抗体抑制TGFβ信号通路的能力是抗TGFβ抗体的16倍，其IC50分别是15pM和250pM。

本发明的再一方面涉及一种预防和/或治疗恶性肿瘤的方法，包括给予受试者有效量的本发明中任一项所述的双特异性抗体或者本发明的偶联物的步骤；优选地，所述肿瘤选自结肠癌、直肠癌、肺癌、肝癌、卵巢癌、皮肤癌、胶质瘤、黑色素瘤、肾癌、前列腺癌、膀胱癌、胃肠道癌、乳腺癌、脑癌或白血病中的一种或多种。

本发明的双特异性抗体的治疗或预防有效量的典型非极限范围是0.02－50mg/kg，例如0.1－50mg/kg，0.1－25mg/kg，或1－10mg/kg。应注意的是，剂量可随需要治疗的症状的类型和严重性不同而发生变化。此外，本领域技术人员理解，对于任一特定患者，特定的给药方案应根据患者需要和医生的专业评价而随时间调整；此处给出的剂量范围只用于举例说明目的，而不限定本发明药物组合物的使用或范围。

在本发明中，所述受试者可以为啮齿类动物，如小鼠，或灵长类动物，例如人，食蟹猴。

根据本发明中任一项所述的双特异性抗体或者偶联物，其用于预防和/或治疗恶性肿瘤；优选地，所述肿瘤选自结肠癌、直肠癌、肺癌、肝癌、卵巢癌、黑色素瘤、肾癌、胰腺癌、皮肤癌、胶质瘤、前列腺癌、膀胱癌、胃肠道癌、乳腺癌、脑癌或白血病中的一种或多种。

抗体治疗药物，特别是单克隆抗体(Monoclonal Antibody,mAb)已在多种疾病的治疗中取得了良好的疗效。获取这些治疗性抗体的传统实验方法是采用抗原免疫动物，在免疫动物体内获取靶向抗原的抗体，或通过亲和力成熟的方法来改进那些与抗原的亲和力较低的抗体。然而，这些方法需要大量时间和精力，大多数时候也并不能针对抗原上的特定表位。

轻链和重链的可变区决定抗原的结合；每条链的可变区均含有三个高变区，称互补决定区(CDR)(重链(H)的CDR包含HCDR1、HCDR2、HCDR3，轻链(L)的CDR包含LCDR1、LCDR2、LCDR3；其由Kabat等人命名，见Sequences of Proteins of Immunological Interest,Fifth Edition(1991),第1-3卷,NIH Publication 91-3242,Bethesda Md)。

通过本领域技术人员所熟知的技术手段，例如通过VBASE2数据库分析下面的(1)-(13)项中的单克隆抗体序列的CDR区的氨基酸序列，结果如下：

(1)Ibalizumab

重链可变区的氨基酸序如SEQ ID NO:7所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO:9所示。

其重链可变区的3个CDR区的氨基酸序列如下：

HCDR1:GYTFTSYVIH(SEQ ID NO:17)

HCDR2:YINPYNDGTDYDEKFKG(SEQ ID NO:18)

HCDR3:EKDNYATGAWFA(SEQ ID NO:19)

其轻链可变区的3个CDR区的氨基酸序列如下：

LCDR1:KSSQSLLYSTNQKNYLA(SEQ ID NO:20)

LCDR2:WASTRES(SEQ ID NO:21)

LCDR3:QQYYSYRT(SEQ ID NO:22)

(2)CAT192

重链可变区的氨基酸序如SEQ ID NO:11所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO:13所示。

其重链可变区的3个CDR区的氨基酸序列如下：

HCDR1:SYGMH(SEQ ID NO:23)

HCDR2:VISYDGSIKYYADSVKG(SEQ ID NO:24)

HCDR3:TGEYSGYDTDPQYS(SEQ ID NO:25)

其轻链可变区的3个CDR区的氨基酸序列如下：

LCDR1:RSSQGIGDDLG(SEQ ID NO:26)

LCDR2:GTSTLQS(SEQ ID NO:27)

LCDR3:LQDSNYPLT(SEQ ID NO:28)

(3)CT101

其重链可变区的9个CDR区的氨基酸序列如下：

HCDR1:GYTFTSYVIH(SEQ ID NO:17)

HCDR2:YINPYNDGTDYDEKFKG(SEQ ID NO:18)

HCDR3:EKDNYATGAWFA(SEQ ID NO:19)

HCDR4:SYGMH(SEQ ID NO:23)

HCDR5:VISYDGSIKYYADSVKG(SEQ ID NO:24)

HCDR6:TGEYSGYDTDPQYS(SEQ ID NO:25)

HCDR7:RSSQGIGDDLG(SEQ ID NO:26)

HCDR8:GTSTLQS(SEQ ID NO:27)

HCDR9:LQDSNYPLT(SEQ ID NO:28)

其轻链可变区的3个CDR区的氨基酸序列如下：

LCDR1:KSSQSLLYSTNQKNYLA(SEQ ID NO:20)

LCDR2:WASTRES(SEQ ID NO:21)

LCDR3:QQYYSYRT(SEQ ID NO:22)

在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的细胞培养、分子遗传学、核酸化学、免疫学实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。

如本文中所使用的，当提及TGFβ1蛋白(GenBank ID：NP_000651.3)的氨基酸序列时，其包括TGFβ1蛋白的全长。然而，本领域技术人员理解，在TGFβ1蛋白的氨基酸序列中，可天然产生或人工引入突变或变异(包括但不限于置换，缺失和/或添加)，而不影响其生物学功能。因此，在本发明中，术语“TGFβ1蛋白”应包括所有此类序列，包括其天然或人工的变体。在本发明的一个实施方案中，TGFβ1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1的下划线部分所示(不含末尾的6个His，共112个氨基酸)。

如本文中所使用的，当提及CD4蛋白(cluster differentiation 4,NCBIGenBank:NP_000607.1)的氨基酸序列时，其包括CD4蛋白的全长，还包括CD4的胞外片段,可溶性CD4分子(soluble CD4，sCD4)。然而，本领域技术人员理解，在CD4蛋白的氨基酸序列中，可天然产生或人工引入突变或变异(包括但不限于置换，缺失和/或添加)，而不影响其生物学功能。因此，在本发明中，术语“CD4蛋白”应包括所有此类序列，包括其天然或人工的变体。在本发明的一个实施方案中，CD4的胞外片段sCD4的氨基酸序列如SEQ ID NO:3的下划线部分所示(不含末尾的6个His，共365个氨基酸)。

如本文中所使用的，当提及TGFβRII蛋白(transforming growth factor betareceptor II,NCBIGenBank:NP_001020018.1)的氨基酸序列时，其包括TGFβRII蛋白的全长，还包括TGFβRII的胞外片段,即TGFβRII-ECD，还包括TGFβRII-ECD的融合蛋白，例如与人IgG的Fc蛋白片段进行融合的片段。然而，本领域技术人员理解，在TGFβRII蛋白的氨基酸序列中，可天然产生或人工引入突变或变异(包括但不限于置换，缺失和/或添加)，而不影响其生物学功能。因此，在本发明中，术语“TGFβRII蛋白”应包括所有此类序列，包括其天然或人工的变体。在本发明的一个实施方案中，TGFβRII的胞外片段TGFβRII-ECD的氨基酸序列如SEQ ID NO:5的双下划线部分所示(不含C端的hFc以及Thrombin剪切序列，共137个氨基酸)。

如本文中所使用的，术语EC₅₀是指半最大效应浓度(concentration for 50％ofmaximal effect)，是指能引起50％最大效应的浓度。

如本文中所使用的，术语IC₅₀是指半最大抑制浓度(concentration for 50％ofmaximal inhibition)，是指能引起50％最大抑制的浓度。

如本文中所使用的，术语“抗体”是指，是指通常由两对多肽链(每对具有一条“轻”(L)链和一条“重”(H)链)组成的免疫球蛋白分子。从一般意义上，重链可以理解为抗体中分子量较大的多肽链，轻链是指抗体中分子量较小的多肽链。轻链可分类为κ和λ轻链。重链通常可分类为μ、δ、γ、α或ε，并且分别将抗体的同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和重链内，可变区和恒定区通过大约12或更多个氨基酸的“J”区连接，重链还包含大约3个或更多个氨基酸的“D”区。各重链由重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)组成。重链恒定区由3个结构域(CH1、CH2和CH3)组成。各轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子，包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)的结合。VH和VL区还可被细分为具有高变性的区域(称为互补决定区(CDR))，其间散布有较保守的称为构架区(FR)的区域。各VH和VL由按下列顺序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4从氨基末端至羧基末端排列的3个CDR和4个FR组成。各重链/轻链对的可变区(VH和VL)分别形成抗体结合部位。氨基酸至各区域或结构域的分配遵循Kabat Sequences of Proteins ofImmunologicalInterest(National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1987and1991))，或Chothia&Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917；Chothia等人(1989)Nature342:878-883的定义。特别地，重链还可以包含3个以上CDR，例如6、9、或12个。例如在本发明的双功能抗体中，重链可以是IgG抗体的重链的C端连接另一个抗体的ScFv，这种情况下重链含有9个CDR。术语“抗体”不受任何特定的产生抗体的方法限制。例如，其包括，特别地，重组抗体、单克隆抗体和多克隆抗体。抗体可以是不同同种型的抗体，例如，IgG(例如，IgG1，IgG2，IgG3或IgG4亚型)，IgA1，IgA2，IgD，IgE或IgM抗体。

如本文中所使用的，术语抗体的“抗原结合片段”是指包含全长抗体的片段的多肽，其保持特异性结合全长抗体所结合的相同抗原的能力，和/或与全长抗体竞争对抗原的特异性结合，其也被称为“抗原结合部分”。通常参见，Fundamental Immunology,Ch.7(Paul,W.,ed.,第2版，Raven Press,N.Y.(1989)，其以其全文通过引用合并入本文，用于所有目的。可通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶促或化学断裂产生抗体的抗原结合片段。在一些情况下，抗原结合片段包括Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fv、dAb和互补决定区(CDR)片段、单链抗体(例如，scFv)、嵌合抗体、双抗体(diabody)和这样的多肽，其包含足以赋予多肽特异性抗原结合能力的抗体的至少一部分。

如本文中所使用的，术语“Fd片段”意指由VH和CH1结构域组成的抗体片段；术语“Fv片段”意指由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的抗体片段；术语“dAb片段”意指由VH结构域组成的抗体片段(Ward等人,Nature 341:544-546(1989))；术语“Fab片段”意指由VL、VH、CL和CH1结构域组成的抗体片段；术语“F(ab')2片段”意指包含通过铰链区上的二硫桥连接的两个Fab片段的抗体片段。

在一些情况下，抗体的抗原结合片段是单链抗体(例如,scFv)，其中VL和VH结构域通过使其能够产生为单个多肽链的连接体配对形成单价分子(参见，例如,Bird等人,Science242:423-426(1988)和Huston等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883(1988))。此类scFv分子可具有一般结构：NH2-VL-接头-VH-COOH或NH2-VH-接头-VL-COOH。合适的现有技术接头由重复的GGGGS氨基酸序列或其变体组成。例如，可使用具有氨基酸序列(GGGGS)4的接头，但也可使用其变体(Holliger等人(1993)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448)。可用于本发明的其他接头由Alfthan等人(1995)，Protein Eng.8:725-731，Choi等人(2001)，Eur.J.Immunol.31:94-106，Hu等人(1996)，Cancer Res.56:3055-3061，Kipriyanov等人(1999)，J.Mol.Biol.293:41-56和Roovers等人(2001)，CancerImmunol.描述。

在一些情况下，抗体的抗原结合片段是双抗体，即，双价抗体，其中VH和VL结构域在单个多肽链上表达，但使用太短的连接体以致不允许在相同链的两个结构域之间配对，从而迫使结构域与另一条链的互补结构域配对并且产生两个抗原结合部位(参见，例如,Holliger P.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)，和Poljak R.J.等人,Structure2:1121-1123(1994))。

可使用本领域技术人员已知的常规技术(例如，重组DNA技术或酶促或化学断裂法)从给定的抗体获得抗体的抗原结合片段(例如，上述抗体片段)，并且以与用于完整抗体的方式相同的方式就特异性筛选抗体的抗原结合片段。

在本文中，除非上下文明确指出，否则当提及术语“抗体”时，其不仅包括完整抗体，而且包括抗体的抗原结合片段。

如本文中所使用的，术语“单抗”和“单克隆抗体”是指，来自一群高度同源的抗体分子中的一个抗体或抗体的一个片断，也即除可能自发出现的自然突变外，一群完全相同的抗体分子。单抗对抗原上的单一表位具有高特异性。多克隆抗体是相对于单克隆抗体而言的，其通常包含至少2种或更多种的不同抗体，这些不同的抗体通常识别抗原上的不同表位。单克隆抗体通常可采用Kohler等首次报道的杂交瘤技术获得(Nature,256:495,1975)，但也可采用重组DNA技术获得(如参见U.S.P 4,816,567)。

如本文中所使用的，术语“嵌合抗体”是指这样的抗体，其轻链或/和重链的一部分源自一个抗体(其可以源自某一特定物种或属于某一特定抗体类或亚类)，而轻链或/和重链的另一部分源自另一个抗体(其可以源自相同或不同的物种或属于相同或不同的抗体类或亚类)，但无论如何，其仍保留对目标抗原的结合活性(U.S.P 4,816,567to Cabillyetal.；Morrison et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851 6855(1984))。

如本文中所使用的，术语“人源化抗体”是指，人源免疫球蛋白(受体抗体)的全部或部分CDR区被一非人源抗体(供体抗体)的CDR区替换后得到的抗体或抗体片段，其中的供体抗体可以是具有预期特异性、亲和性或反应性的非人源(例如，小鼠、大鼠或兔)抗体。此外，受体抗体的构架区(FR)的一些氨基酸残基也可被相应的非人源抗体的氨基酸残基替换，或被其他抗体的氨基酸残基替换，以进一步完善或优化抗体的性能。关于人源化抗体的更多详细内容，可参见例如，Jones et al.,Nature,321:522 525(1986)；Reichmannetal.,Nature,332:323329(1988)；Presta,Curr.Op.Struct.Biol.,2:593 596(1992)；和Clark,Immunol.Today 21:397402(2000)。

如本文中所使用的，术语“表位”是指，抗原上被免疫球蛋白或抗体特异性结合的部位。“表位”在本领域内也称为“抗原决定簇”。表位或抗原决定簇通常由分子的化学活性表面基团例如氨基酸或碳水化合物或糖侧链组成并且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。例如，表位通常以独特的空间构象包括至少3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14或15个连续或非连续的氨基酸，其可以是“线性的”或“构象的”。参见，例如，EpitopeMapping Protocols in Methods in Molecular Biology，第66卷，G.E.Morris，Ed.(1996)。在线性表位中，蛋白质与相互作用分子(例如抗体)之间的所有相互作用的点沿着蛋白质的一级氨基酸序列线性存在。在构象表位中，相互作用的点跨越彼此分开的蛋白质氨基酸残基而存在。

如本文中所使用的，术语“分离的”或“被分离的”指的是，从天然状态下经人工手段获得的。如果自然界中出现某一种“分离”的物质或成分，那么可能是其所处的天然环境发生了改变，或从天然环境下分离出该物质，或二者情况均有发生。例如，某一活体动物体内天然存在某种未被分离的多聚核苷酸或多肽，而从这种天然状态下分离出来的高纯度的相同的多聚核苷酸或多肽即称之为分离的。术语“分离的”或“被分离的”不排除混有人工或合成的物质，也不排除存在不影响物质活性的其它不纯物质。

如本文中所使用的，术语“载体(vector)”是指，可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。一种载体可以含有多种控制表达的元件，包括但不限于，启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。

如本文中所使用的，术语“宿主细胞”是指，可用于导入载体的细胞，其包括但不限于，如大肠杆菌或枯草菌等的原核细胞，如酵母细胞或曲霉菌等的真菌细胞，如S2果蝇细胞或Sf9等的昆虫细胞，或者如纤维原细胞，CHO细胞，COS细胞，NSO细胞，HeLa细胞，BHK细胞，HEK 293细胞或人细胞等的动物细胞。

如本文中使用的，术语“特异性结合”是指，两分子间的非随机的结合反应，如抗体和其所针对的抗原之间的反应。在某些实施方式中，特异性结合某抗原的抗体(或对某抗原具有特异性的抗体)是指，抗体以小于大约10^-5M，例如小于大约10^-6M、10^-7M、10^-8M、10^-9M或10^-10M或更小的亲和力(Kd)结合该抗原。在本发明的一些实施方案中，术语“靶向”是指特异性结合。

如本文中所使用的，术语“Kd”是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数，其用于描述抗体与抗原之间的结合亲和力。平衡解离常数越小，抗体-抗原结合越紧密，抗体与抗原之间的亲和力越高。通常，抗体以小于大约10^-5M，例如小于大约10^-6M、10^-7M、10^-8M、10^- ⁹M或10^-10M或更小的解离平衡常数(Kd)结合抗原，例如，如使用表面等离子体共振术(SPR)在Biacore仪中测定的。

如本文中所使用的，术语“单克隆抗体”和“单抗”具有相同的含义且可互换使用；术语“多克隆抗体”和“多抗”具有相同的含义且可互换使用；术语“多肽”和“蛋白质”具有相同的含义且可互换使用。并且在本发明中，氨基酸通常用本领域公知的单字母和三字母缩写来表示。例如，甘氨酸可用G或Gly表示，丙氨酸可用A或Ala表示。

如本文中所使用的，术语“药学上可接受的辅料”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体和/或赋形剂，其是本领域公知的(参见例如Remington'sPharmaceutical Sciences.Edited by Gennaro AR,19th ed.Pennsylvania:MackPublishing Company,1995)，并且包括但不限于：pH调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂。例如，pH调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液；表面活性剂包括但不限于阳离子，阴离子或者非离子型表面活性剂，例如Tween-80；离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。

如本文中所使用的，术语“佐剂”是指非特异性免疫增强剂，当其与抗原一起或预先递送入机体时，其可增强机体对抗原的免疫应答或改变免疫应答类型。佐剂有很多种，包括但不限于铝佐剂(例如氢氧化铝)、弗氏佐剂(例如完全弗氏佐剂和不完全弗氏佐剂)、短小棒状杆菌、脂多糖、细胞因子等。弗氏佐剂是目前动物试验中最常用的佐剂。氢氧化铝佐剂则在临床实验中使用较多。

如本文中所使用的，术语“有效量”是指足以获得或至少部分获得期望的效果的量。治疗疾病有效量是指，足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其并发症的量。测定这样的有效量完全在本领域技术人员的能力范围之内。例如，对于治疗用途有效的量将取决于待治疗的疾病的严重度、患者自己的免疫系统的总体状态、患者的一般情况例如年龄，体重和性别，药物的施用方式，以及同时施用的其他治疗等等。

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

制备例1：重组TGFβ1的制备

1.构建pCMV-TGFβ1-His质粒

以TGFβ1human cDNA(Genewiz公司合成)为模板进行PCR扩增并用普通DNA产物纯化试剂盒纯化回收TGFβ1-His片段。将回收后的TGFβ1-His片段与表达载体pCMV使用NheI和XbaI酶切，胶回收目的基因片段和线性表达载体，通过T4连接酶连接，并将全部连接产物转化DH5α化学感受态细胞，涂布带有Amp的Agar平板，挑选分离良好的单菌落进行菌落PCR鉴定，将PCR鉴定结果为阳性的克隆子接种到LB培养基培养，并取菌液送广州英俊公司测序验证。测序结果比对显示，阳性重组子插入序列完全正确。

2.融合蛋白TGFβ1-His的表达和纯化

按照lipofectamin转染试剂盒(购自Invitrogen公司)方法将重组质粒pCMV-TGFβ1-his转染HEK293F细胞(购自Invitrogen公司)5天后，将培养液通过高速离心、上清浓缩并换液至Binding Buffer A(20mM HEPES,150mM NaCl,pH 7.4)后上样至HisTrap柱，用Elution Buffer(20mM HEPES,150mM NaCl,0.5M Immidazole,pH 7.4)线性洗脱蛋白，初纯样品用HiTrap Desalting柱换液至Binding Buffer B(20mM Tris-HCl,pH 9.0)并上样至HiTrap Q柱，用Elution Buffer B(50mM Tris-HCl,1M NaCl,pH 9.0)线性洗脱蛋白、回收目标样品并换液至PBS。取纯化后样品加入还原型蛋白电泳上样缓冲液，进行SDS-PAGE电泳检测。

制得了融合蛋白TGFβ1-His。

TGFβ1-His的氨基酸序列如下(118aa)：

ALDTNYCFSSTEKNCCVRQLYIDFRKDLGWKWIHEPKGYHANFCLGPCPYIWSLDTQYSKVLALYNQH NPGASAAPCCVPQALEPLPIVYYVGRKPKVEQLSNMIVRSCKCSHHHHHH(SEQ ID NO:1)

其中，下划线部分为TGFβ1的氨基酸序列。

编码TGFβ1-His的核酸序列

GCCCTGGATACCAACTATTGCTTCAGCTCCACAGAGAAGAACTGCTGTGTGCGGCAGCTGTACATTGACTTTAGGAAGGACCTGGGTTGGAAGTGGATCCACGAGCCCAAGGGCTACCATGCCAACTTCTGCCTCGGGCCCTGCCCCTACATTTGGAGCCTGGACACGCAGTACAGCAAGGTCCTGGCCCTGTACAACCAGCATAACCCGGGCGCCTCGGCGGCGCCGTGCTGCGTGCCGCAGGCGCTGGAGCCGCTGCCCATCGTGTACTACGTGGGCCGCAAGCCCAAGGTGGAGCAGCTGTCCAACATGATCGTGCGCTCCTGCAAGTGCAGCCATCATCATCATCATCAT(SEQ ID NO:2)

制备例2：重组蛋白CD4-His的表达和纯化

1.构建pCMV-CD4-His质粒

以CD4 human cDNA(Genewiz公司合成)为模板进行PCR扩增并用普通DNA产物纯化试剂盒纯化回收CD4-His片段。将回收后的CD4-His片段与表达载体pCMV使用NheI和XbaI酶切，胶回收目的基因片段和线性表达载体，通过T4连接酶连接，并将全部连接产物转化DH5α化学感受态细胞，涂布带有Amp的Agar平板，挑选分离良好的单菌落进行菌落PCR鉴定，将PCR鉴定结果为阳性的克隆子接种到LB培养基培养，并取菌液送广州英俊公司测序验证。测序结果比对显示，阳性重组子插入序列完全正确。

2.重组蛋白CD4-His的表达和纯化

按照lipofectamin转染试剂盒(购自Invitrogen公司)方法将重组质粒pCMV-CD4-his转染HEK293F细胞(购自Invitrogen公司)5天后，将培养液通过高速离心、上清浓缩并换液至Binding Buffer A(20mM HEPES,150mM NaCl,pH 7.4)后上样至HisTrap柱，用ElutionBuffer(20mM HEPES,150mM NaCl,0.5M Immidazole,pH 7.4)线性洗脱蛋白，初纯样品用HiTrap Desalting柱换液至Binding Buffer B(20mM Tris-HCl,pH 9.0)并上样至HiTrapQ柱，用Elution Buffer B(50mM Tris-HCl,1M NaCl,pH 9.0)线性洗脱蛋白、回收目标样品并换液至PBS。取纯化后样品加入还原型蛋白电泳上样缓冲液，进行SDS-PAGE电泳检测。

制得了融合蛋白CD4-His。

CD4-His的氨基酸序列如下(371aa)：

KKVVLGKKGDTVELTCTASQKKSIQFHWKNSNQIKILGNQGSFLTKGPSKLNDRADSRRSLWDQGNFP LIIKNLKIEDSDTYICEVEDQKEEVQLLVFGLTANSDTHLLQGQSLTLTLESPPGSSPSVQCRSPRGKNIQGGKTL SVSQLELQDSGTWTCTVLQNQKKVEFKIDIVVLAFQKASSIVYKKEGEQVEFSFPLAFTVEKLTGSGELWWQAERA SSSKSWITFDLKNKEVSVKRVTQDPKLQMGKKLPLHLTLPQALPQYAGSGNLTLALEAKTGKLHQEVNLVVMRATQ LQKNLTCEVWGPTSPKLMLSLKLENKEAKVSKREKAVWVLNPEAGMWQCLLSDSGQVLLESNIKVLPTWHHHHHH(SEQ ID NO:3)

其中，下划线部分为CD4的氨基酸序列。

编码CD4-His的核酸序列

AAGAAAGTGGTGCTGGGCAAAAAAGGGGATACAGTGGAACTGACCTGTACAGCTTCCCAGAAGAAGAGCATACAATTCCACTGGAAAAACTCCAACCAGATAAAGATTCTGGGAAATCAGGGCTCCTTCTTAACTAAAGGTCCATCCAAGCTGAATGATCGCGCTGACTCAAGAAGAAGCCTTTGGGACCAAGGAAACTTTCCCCTGATCATCAAGAATCTTAAGATAGAAGACTCAGATACTTACATCTGTGAAGTGGAGGACCAGAAGGAGGAGGTGCAATTGCTAGTGTTCGGATTGACTGCCAACTCTGACACCCACCTGCTTCAGGGGCAGAGCCTGACCCTGACCTTGGAGAGCCCCCCTGGTAGTAGCCCCTCAGTGCAATGTAGGAGTCCAAGGGGTAAAAACATACAGGGGGGGAAGACCCTCTCCGTGTCTCAGCTGGAGCTCCAGGATAGTGGCACCTGGACATGCACTGTCTTGCAGAACCAGAAGAAGGTGGAGTTCAAAATAGACATCGTGGTGCTAGCTTTCCAGAAGGCCTCCAGCATAGTCTATAAGAAAGAGGGGGAACAGGTGGAGTTCTCCTTCCCACTCGCCTTTACAGTTGAAAAGCTGACGGGCAGTGGCGAGCTGTGGTGGCAGGCGGAGAGGGCTTCCTCCTCCAAGTCTTGGATCACCTTTGACCTGAAGAACAAGGAAGTGTCTGTAAAACGGGTTACCCAGGACCCTAAGCTCCAGATGGGCAAGAAGCTCCCGCTCCACCTCACCCTGCCCCAGGCCTTGCCTCAGTATGCTGGCTCTGGAAACCTCACCCTGGCCCTTGAAGCGAAAACAGGAAAGTTGCATCAGGAAGTGAACCTGGTGGTGATGAGAGCCACTCAGCTCCAGAAAAATTTGACCTGTGAGGTGTGGGGACCCACCTCCCCTAAGCTGATGCTGAGTTTGAAACTGGAGAACAAGGAGGCAAAGGTCTCGAAGCGGGAGAAGGCGGTGTGGGTGCTGAACCCTGAGGCGGGGATGTGGCAGTGTCTGCTGAGTGACTCGGGACAGGTCCTGCTGGAATCCAACATCAAGGTTCTGCCCACATGGCATCATCATCATCATCAT(SEQ ID NO:4)

制备例3：融合蛋白TGFβRII-hFc的表达和纯化

1.基因TGFβRII-hFc的合成：

对基因TGFβRII(Transforming Growth Factor Beta Receptor II,NCBIGenBank:NP_001020018.1)的胞外片段TGFβRII-ECD所对应的氨基酸分别与Thrombin酶切位点及人IgG的Fc蛋白片段(hFc)进行融合设计(SEQ ID NO:5)。委托金唯智公司合成相应的编码核酸序列(SEQ ID NO:6)。

TGFβRII:Transforming Growth Factor Beta Receptor II,NCBIGenBank:NP_001020018.1；

hFc:Ig gamma-1chain C region，ACCESSION：P01857，106-330；

融合蛋白TGFβRII-hFc的氨基酸序列：(370aa)

其中，带双下划线的为TGFβRII的ECD部分，带波浪线的为Thrombin酶切位点，带单下划线的为hFc部分。

编码融合蛋白TGFβRII-hFc的核酸序列：(1110bp).

ACGATCCCACCGCACGTTCAGAAGTCGGTTAATAACGACATGATAGTCACTGACAACAACGGTGCAGTCAAGTTTCCACAACTGTGTAAATTTTGTGATGTGAGATTTTCCACCTGTGACAACCAGAAATCCTGCATGAGCAACTGCAGCATCACCTCCATCTGTGAGAAGCCACAGGAAGTCTGTGTGGCTGTATGGAGAAAGAATGACGAGAACATAACACTAGAGACAGTTTGCCATGACCCCAAGCTCCCCTACCATGACTTTATTCTGGAAGATGCTGCTTCTCCAAAGTGCATTATGAAGGAAAAAAAAAAGCCTGGTGAGACTTTCTTCATGTGTTCCTGTAGCTCTGATGAGTGCAATGACAACATCATCTTCTCAGAAGAATATAACACCAGCAATCCTGACCTGGTGCCGAGGGGAAGCGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA(SEQID NO:6)

2.pCMV-TGFβRII-hFc质粒的构建；

将金唯智公司合成的TGFβRII-hFc编码基因克隆到pCMV(本公司拥有)表达载体中，获得pCMV-TGFβRII-hFc质粒。

3.重组质粒pCMV-TGFβRII-hFc转染HEK293F细胞

按照lipofectamin转染试剂盒(购自Invitrogen公司)方法将重组质粒pCMV-TGFβRII-hFc转染HEK293F细胞(购自ThermoFisher Scientific公司)。

4.TGFβRII-hFc蛋白的SDS-PAGE电泳检测

将重组质粒pCMV-TGFβRII-hFc转染HEK293F细胞5天后，将培养液通过高速离心、微孔滤膜抽真空过滤以及ProteinA/G柱进行纯化得到TGFβRII-hFc融合蛋白样品，并取部分样品加入还原型蛋白电泳上样缓冲液，进行SDS-PAGE电泳检测。

制得了融合蛋白TGFβRII-hFc。

制备例4：抗CD4的抗体Ibalizumab的制备

上市的CD4单抗Trogarzo(Ibalizumab)的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列参照美国专利公开US005871732。编码重链可变区和轻链可变区的核酸序列委托金斯瑞公司合成。

Ibalizumab重链可变区的氨基酸序列：(122aa)

QVQLQQSGPEVVKPGASVKMSCKASGYTFTSYVIHWVRQKPGQGLDWIGYINPYNDGTDYDEKFKGKATLTSDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREKDNYATGAWFAYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:7)

编码Bevacizumab重链可变区的核酸序列：(366bp)

CAGGTGCAACTGCAACAGTCCGGACCCGAAGTCGTGAAACCAGGAGCTTCCGTGAAGATGAGCTGCAAAGCATCCGGATACACCTTCACCAGCTACGTGATCCACTGGGTGAGGCAGAAACCTGGCCAGGGCCTGGACTGGATCGGCTACATCAACCCTTACAACGACGGAACCGACTACGACGAGAAATTCAAAGGCAAAGCTACCCTGACCAGCGACACCAGCACCTCCACTGCTTACATGGAGCTGTCCAGCCTGAGGTCCGAAGACACCGCTGTGTACTACTGCGCTAGGGAGAAGGACAACTACGCTACCGGCGCTTGGTTCGCCTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTGACCGTGTCCAGC(SEQ IDNO:8)

Ibalizumab轻链可变区的氨基酸序列：(112aa)

DIVMTQSPDSLAVSLGERVTMNCKSSQSLLYSTNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSVQAEDVAVYYCQQYYSYRTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:9)编码Ibalizumab轻链可变区的核酸序列：(336bp)

GACATCGTGATGACCCAGTCCCCTGACTCCCTGGCTGTGTCCCTGGGCGAACGGGTCACCATGAACTGCAAATCTTCCCAGTCCCTGCTGTACTCCACCAACCAGAAGAACTACCTGGCTTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGTCCCCCAAACTGCTCATCTACTGGGCTTCCACCAGGGAAAGCGGCGTGCCTGACAGATTCTCCGGAAGCGGCAGCGGAACCGACTTCACCCTGACCATCTCCAGCGTGCAGGCTGAAGACGTGGCTGTCTACTACTGCCAGCAGTACTACAGCTACAGGACCTTCGGCGGAGGCACCAAGCTGGAGATCAAG(SEQ ID NO:10)

重链恒定区均采用Ig gamma-4chain C region，ACCESSION:P01861；轻链恒定区均采用Ig kappa chain C region，ACCESSION:P01834。

将Ibalizumab的重链cDNA和轻链的cDNA分别克隆到pCMV载体中，获得抗体Ibalizumab的重组表达质粒。

将重组质粒转染HEK293F细胞。将HEK293F细胞培养液纯化后进行检测。

制得了抗CD4单抗Trogarzo(Ibalizumab)。

制备例5：抗TGFβ1的抗体CAT192的制备和检测

抗体CAT192重链可变区的氨基酸序列：(123aa)

EVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKELEWVAVISYDGSIKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARTGEYSGYDTDPQYSWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:11)

抗体CAT192重链可变区的核酸序列：(369bp)

GAGGTCCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGAGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATCATATGATGGAAGTATTAAATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGCGAACTGGTGAATATAGTGGCTACGATACGGACCCCCAGTACTCCTGGGGGCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA(SEQID NO:12)

抗体CAT192轻链可变区的氨基酸序列：(107aa)

EIVLTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQGIGDDLGWYQQKPGKAPILLIYGTSTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTINSLQPEDFATYYCLQDSNYPLTFGGGTRLEIK(SEQ ID NO:13)

抗体CAT192轻链可变区的核酸序列：(321bp)

GAAATTGTGCTGACTCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGTCAAGTCAGGGCATTGGAGATGATTTGGGCTGGTATCAGCAGAAGCCAGGGAAAGCCCCTATCCTCCTGATCTATGGTACATCCACTTTACAAAGTGGGGTCCCGTCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGCACAGATTTCACTCTCACCATCAACAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAACTTATTACTGTCTACAAGATTCCAATTACCCGCTCACTTTCGGCGGAGGGACACGACTGGAGATTAAA(SEQ ID NO:14)

制得了抗TGFβ1的抗体CAT192。

实施例1：不同双功能抗体体内抑制肿瘤生长实验

为检测不同双功能抗体的体内抑瘤活性，首先用EMT-6乳腺癌细胞，接种于到6－8周龄的雌性BALB/c小鼠皮下。然后每5天给药一次，每次尾静脉注射50μg，一共给药5次。给药后测量各组肿瘤的长宽，计算肿瘤体积。

结果图1所示。结果表明：与对照抗体IgG以及抗TGFβ(克隆1D11)抗体对比，抗CD4/抗TGFβ对小鼠肿瘤具有最强的抑制效果，抗CD64/抗TGFβ效果次之，抗CD8/抗TGFβ则相交于抗TGFβ抗体没有明显效果。

实施例2：双功能抗体CT101的重链和轻链的序列设计、制备和检测

1.序列设计

本发明中的双功能抗体CT101的结构模式属于Morrison模式(IgG-scFv)，即在一个IgG抗体的两条重链的C端均连接另一个抗体的scFv片段，其重链和轻链的主要组成设计以及序列信息如图2和图3。

2.抗体CT101的表达和纯化

分别将CT101的重链cDNA序列和轻链的cDNA序列克隆到pCMV载体中，提取重组质粒共转染HEK293F细胞。细胞培养5天后，将培养液通过高速离心、上清浓缩后上样至ProteinA/G柱，用Elution Buffer一步洗脱蛋白并回收目标样品抗体CT101，并换液至PBS。

2.抗体CT101的检测

将纯化后的抗体CT101分别加入还原型蛋白电泳上样缓冲液和非还原型蛋白电泳上样缓冲液，煮沸后进行SDS-PAGE电泳检测。CT101的电泳图如图4所示，还原型蛋白样品目标蛋白在75kD和25kD处，非还原型蛋白样品(单个抗体)目标蛋白在200kD处。

3.抗体CT101的高效液相色谱分析

将纯化后的抗体CT101流经AKTA纯化仪上的Superdex S200 10/300GL柱子(通用公司)，使用PBS溶液以0.5mL/分钟流经系统。抗体CT101的高效液相色谱图如图5所示，CT101主要以单体形式存在(90％)，另外，还有10％以多聚体的形式存在。

以下的实验中用到的人源化抗体CT101，如果没有特别说明，均为参照本实施例的方法制得。

实施例2：抗体CT101的动力学参数测定

1.双功能抗体CT101与CD4结合的动力学参数测定

采用Biacore分子相互作用仪检测抗体CT101与人CD4的亲和力常数。以HBS-EP作为缓冲液，采用Bicaore标准氨基偶联方式将人CD4固定于CM5芯片表面。抗体CT101与人CD4结合，抗体CT101浓度为8-250nM(两倍稀释)，流速为30μl/min，结合时间为120s，解离时间为880s。芯片使用10mM甘氨酸，pH2.7再生，流速为30μl/min，时间为120s。数据以1:1模型拟合分析，得到亲和力常数。使用Biacore Control 2.0软件进行数据采集，Biacore T200Evaluation 2.0软件进行数据分析。抗体CT101、Ibalizumab与人CD4结合的动力学参数见表1，抗体CT101与人CD4结合的动力学特征参数检测结果分别如图6所示。

表1：人源化抗体CT101、Ibalizumab与人CD4分子结合的动力学参数

Kd为亲和力常数；Kon为抗原抗体结合速率；Koff为抗原抗体解离速率；Kd＝Koff/Kon。结果表明，抗体CT101与抗原有较好的亲和力，且亲和力稍优于对照抗体Ibalizumab。

2.双功能抗体CT101与TGFβ1结合的动力学参数测定

采用Biacore分子相互作用仪检测抗体CT101与人TGFβ1的亲和力常数。以HBS-EP作为缓冲液，采用Bicaore标准氨基偶联方式将人TGFβ1固定于CM5芯片表面。抗体CT101与人TGFβ1结合，抗体CT101浓度为8-250nM(两倍稀释)，流速为30μl/min，结合时间为120s，解离时间为880s。芯片使用10mM甘氨酸，pH2.7再生，流速为30μl/min，时间为120s。数据以1:1模型拟合分析，得到亲和力常数。使用Biacore Control 2.0软件进行数据采集，BiacoreT200Evaluation 2.0软件进行数据分析。抗体CT101、CAT192与人TGFβ1结合的动力学参数见表2，抗体CT101与人TGFβ1结合的动力学特征参数检测结果分别如图7所示。表2：抗体CT101和CAT192与TGFβ1结合的动力学参数

抗体名称	Kon(10<sup>4</sup>/Ms)	Koff(10<sup>-5</sup>/s)	Kd(Koff/Kon,nM)
				CT101	2.8	2.1	0.75
CAT192	3.0	2.4	0.80

结果表明，抗体CT101、CAT192与抗原TGFβ1均有较好的亲和力。

实施例3：ELISA方法检测抗体CT101与抗原的结合活性

1.间接ELISA方法分别测定抗体CT101、CAT192与抗原TGFβ1-Ηis的结合活性

方法具体如下：

用TGFβ1-His包被酶标板，37℃孵育3小时。洗板后，1％BSA封闭1小时。洗板后加入梯度稀释的抗体，37℃孵育60分钟。洗板后加入酶标记的驴抗人IgG二抗工作液，37℃孵育30分钟。洗板后加入TMB显色液避光显色5min，加入终止液终止显色反应。立即把酶标板放入酶标仪中，选择450nm光波长读取酶标板各孔的OD数值。用SoftMax Pro软件对数据进行分析处理。

检测抗体CT101与抗原TGFβ1-Ηis结合的结果如图8所示。以抗体浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标进行曲线拟合，计算抗体的结合EC₅₀，结果如下表3所示。

表3：抗体CT101和CAT192分别与TGFβ1-his的结合(间接ELISA)

	CT101	CAT192
			EC<sub>50</sub>	85.2pM	84.5pM

结果显示，抗体CT101与CAT192均能有效地结合TGFβ1蛋白，且其结合效率呈剂量依赖关系。

2.间接ELISA方法分别测定抗体CT101、ibalizumab与CD4的结合活性

方法具体如下：

用CD4-His包被酶标板，37℃孵育3小时。洗板后，1％BSA封闭1小时。洗板后加入梯度稀释的抗体，37℃孵育60分钟。洗板后加入酶标记的驴抗人IgG二抗工作液，37℃孵育30分钟。洗板后加入TMB显色液避光显色5min，加入终止液终止显色反应。立即把酶标板放入酶标仪中，选择450nm光波长读取酶标板各孔的OD数值。用SoftMax Pro软件对数据进行分析处理。

检测抗体CT101与抗原CD4结合结果如图9所示。以抗体浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标进行曲线拟合，计算抗体的结合EC₅₀，结果如下表4所示。

表4：抗体CT101和Ibalizumab分别与CD4-his的结合(间接ELISA)

	CT101	Ibalizumab
			EC<sub>50</sub>	255.5pM	250.4pM

结果显示，抗体CT101与ibalizumab均能有效地结合CD4蛋白，并且其结合效率呈剂量依赖关系。

3.竞争ELISA方法分别测定抗体CT101、CAT192与TGFβRII竞争结合抗原TGFβ1的活性。具体方法如下：

用TGFβ1-His包被酶标板，37℃孵育3小时。洗板后，1％BSA于37℃封闭1小时。洗板后加入梯度稀释的抗体和人TGFβRII-ECD-Fc-biotin(终浓度为0.1μg/ml)，室温孵育2小时。洗板后加入HRP标记链霉亲和素SA-HRP(1:2000)工作液，37℃孵育30分钟。洗板后加入TMB显色液避光显色5min，加入终止液终止显色反应。立即把酶标板放入酶标仪中，选择450nm光波长读取酶标板各孔的OD数值。用SoftMax Pro软件对数据进行分析处理。

检测结果如图10所示。通过对结合的抗体CT101进行吸光强度定量分析，曲线模拟抗体的结合效率获得结合EC₅₀(表5)。

表5：竞争ELISA检测抗体与TGFβRII-Fc竞争结合抗原TGFβ1-His。

	CT101	CAT192
			IC<sub>50</sub>	105.2pM	105.5pM

结果显示，抗体CT101和CAT192均能有效地结合抗原TGFβ1，抑制TGFβRII结合TGFβ1，并且抗体抑制TGFβRII结合TGFβ1的效率呈剂量依赖关系。

实施例4：抗体CT101对细胞膜表面抗原CD4的结合

首先构建表达人CD4抗原的HEK293，然后采用流式细胞术分析验证抗体对细胞膜表面抗原CD4的特异性结合能力。

1.构建表达CD4抗原的HEK293细胞

慢病毒载体pHAGE-CD4-IRES-EGFP以及辅助质粒psPAX2、pMD2.G转染HEK293细胞，48小时后，收集上清，用0.45μm的滤膜过滤后感染新的HEK293细胞。感染48小时后，用流式细胞仪检测EGFP，从而分选出稳定表达CD4的克隆群体HEK293-CD4细胞。

2.检测抗体CT101对细胞表面抗原的结合

采用常规胰酶消化方法消化上述步骤获得的表达CD4抗原的HEK293-CD4细胞，并使每个收集管内细胞数为2×10⁵，用PBS(含1％BSA)配制抗体浓度梯度稀释液，冰上与HEK293-CD4细胞孵育半小时，每管加入100μL FITC偶联羊抗人IgG(1：200)冰上孵育半小时，用PBS洗涤，加入200μL PBS重悬细胞，在流式细胞仪上用FITC通道检测荧光信号(MFI,mean fluorescent intensity)。

结果如图11所示，通过对结合的CT101抗体和Ibalizumab进行荧光定量分析和曲线拟合，计算出CT101抗体和ibalizumab结合EC₅₀如表6所示。

表6：FACS检测CT101结合HEK293T-CD4表面抗原的荧光强度分析

	CT101	CAT192
			EC<sub>50</sub>	310.5pM	312.5pM

结果显示，CT101抗体能有效地结合HEK293-CD4细胞表面CD4抗原，其结合效率呈剂量依赖关系，Ibalizumab对HEK293-CD4细胞表面CD4抗原的结合活性与CT101相似，表明双功能抗体CT101的抗CD4功能没有因为抗体改造而受到影响。

实施例5：CT101抗体抑制TGFβ1诱导HEK93细胞中TGFβ/Smad信号通路激活

HEK293细胞以1x 10⁵/ml的浓度接种于24孔板，500μL/孔，于37℃、5％CO₂孵箱中培养24h后，转染TGFβ/Smad启动子活性荧光素酶报告质粒pSMAD-Luc以及海参荧光素酶内参质粒pRL-TK。转染后24小时，加入不同浓度的CT101抗体和CAT192抗体继续培养12小时。12小时后，弃培养基，每孔细胞用100μL 1x Passive Lysis Buffer(购自Promega公司)裂解。取70μL裂解液置于酶标板中，加30μL底物1溶液，立即把酶标板放入酶标仪中，选择Luminescence读取酶标板各孔的数值为An。再加入30μL底物2溶液，立即把酶标板放入酶标仪中，选择Luminescence读取酶标板各孔的数值为Bn。用SoftMax Pro软件对数据进行分析处理。An/Bn的比值即为TGFβ/Smad信号通路的激活倍数。

结果如图12所示。结果显示，抗体CT101、CAT192均可有效抑制TGFβ1诱导的TGFβ/Smad信号通路激活，且呈剂量依赖关系；并且在相同的剂量下，CT101有效抑制TGFβ1诱导的TGFβ/Smad信号通路激活的药理学活性与CAT192类似，其IC₅₀均为250pM左右。

实施例6：CT101抗体抑制TGFβ1诱导HEK293-CD4细胞中TGFβ/Smad信号通路激活

HEK293-CD4细胞以1x 10⁵/ml的浓度接种于24孔板，500μL/孔，于37℃、5％CO₂孵箱中培养24h后，转染TGFβ/Smad启动子活性荧光素酶报告质粒pSMAD-Luc以及海参荧光素酶内参质粒pRL-TK。转染后24小时，加入不同浓度的CT101抗体和CAT192抗体继续培养12小时。12小时后，弃培养基，每孔细胞用100μL 1x Passive Lysis Buffer(购自Promega公司)裂解。取70μL裂解液置于酶标板中，加30μL底物1溶液，立即把酶标板放入酶标仪中，选择Luminescence读取酶标板各孔的数值为An。再加入30μL底物2溶液，立即把酶标板放入酶标仪中，选择Luminescence读取酶标板各孔的数值为Bn。用SoftMax Pro软件对数据进行分析处理。An/Bn的比值即为TGFβ/Smad信号通路的激活倍数。

结果如图13所示。结果显示，抗体CT101、CAT192均可有效抑制TGFβ1诱导的TGFβ/Smad信号通路激活，且呈剂量依赖关系；并且在相同的剂量下，CT101有效抑制TGFβ1诱导HEK93-CD4细胞中TGFβ/Smad信号通路激活的药理学活性远高于CAT192，其IC₅₀值分别为15pM和250pM。

实施例7：CT101体内抑制肿瘤生长实验

为检测CT101的体内抑瘤活性，首先用MC38结肠癌细胞，接种于到6－8周龄的雌性人CD4转基因小鼠皮下。然后每5天给药依次，每次尾静脉注射50μg，一共给药4次。给药后测量各组肿瘤的长宽，计算肿瘤体积。

结果图14所示。结果表明：相比同型对照抗体IgG，CAT92，atezolizumab(抗PDL1抗体)，抑或是atezolizumab联合CAT92，CT101对小鼠肿瘤具有更强的抑制效果。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

序列表

<110> 深圳市迈加瑞生物技术有限公司

<120> 一种抗CD4和TGFβ的双特异性抗体、其药物组合及其用途

<160> 28

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Ala Leu Asp Thr Asn Tyr Cys Phe Ser Ser Thr Glu Lys Asn Cys Cys

1 5 10 15

Val Arg Gln Leu Tyr Ile Asp Phe Arg Lys Asp Leu Gly Trp Lys Trp

20 25 30

Ile His Glu Pro Lys Gly Tyr His Ala Asn Phe Cys Leu Gly Pro Cys

35 40 45

Pro Tyr Ile Trp Ser Leu Asp Thr Gln Tyr Ser Lys Val Leu Ala Leu

50 55 60

Tyr Asn Gln His Asn Pro Gly Ala Ser Ala Ala Pro Cys Cys Val Pro

65 70 75 80

Gln Ala Leu Glu Pro Leu Pro Ile Val Tyr Tyr Val Gly Arg Lys Pro

85 90 95

Lys Val Glu Gln Leu Ser Asn Met Ile Val Arg Ser Cys Lys Cys Ser

100 105 110

His His His His His His

115

<210> 2

<211> 354

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gccctggata ccaactattg cttcagctcc acagagaaga actgctgtgt gcggcagctg 60

tacattgact ttaggaagga cctgggttgg aagtggatcc acgagcccaa gggctaccat 120

gccaacttct gcctcgggcc ctgcccctac atttggagcc tggacacgca gtacagcaag 180

gtcctggccc tgtacaacca gcataacccg ggcgcctcgg cggcgccgtg ctgcgtgccg 240

caggcgctgg agccgctgcc catcgtgtac tacgtgggcc gcaagcccaa ggtggagcag 300

ctgtccaaca tgatcgtgcg ctcctgcaag tgcagccatc atcatcatca tcat 354

<210> 3

<211> 371

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Lys Lys Val Val Leu Gly Lys Lys Gly Asp Thr Val Glu Leu Thr Cys

1 5 10 15

Thr Ala Ser Gln Lys Lys Ser Ile Gln Phe His Trp Lys Asn Ser Asn

20 25 30

Gln Ile Lys Ile Leu Gly Asn Gln Gly Ser Phe Leu Thr Lys Gly Pro

35 40 45

Ser Lys Leu Asn Asp Arg Ala Asp Ser Arg Arg Ser Leu Trp Asp Gln

50 55 60

Gly Asn Phe Pro Leu Ile Ile Lys Asn Leu Lys Ile Glu Asp Ser Asp

65 70 75 80

Thr Tyr Ile Cys Glu Val Glu Asp Gln Lys Glu Glu Val Gln Leu Leu

85 90 95

Val Phe Gly Leu Thr Ala Asn Ser Asp Thr His Leu Leu Gln Gly Gln

100 105 110

Ser Leu Thr Leu Thr Leu Glu Ser Pro Pro Gly Ser Ser Pro Ser Val

115 120 125

Gln Cys Arg Ser Pro Arg Gly Lys Asn Ile Gln Gly Gly Lys Thr Leu

130 135 140

Ser Val Ser Gln Leu Glu Leu Gln Asp Ser Gly Thr Trp Thr Cys Thr

145 150 155 160

Val Leu Gln Asn Gln Lys Lys Val Glu Phe Lys Ile Asp Ile Val Val

165 170 175

Leu Ala Phe Gln Lys Ala Ser Ser Ile Val Tyr Lys Lys Glu Gly Glu

180 185 190

Gln Val Glu Phe Ser Phe Pro Leu Ala Phe Thr Val Glu Lys Leu Thr

195 200 205

Gly Ser Gly Glu Leu Trp Trp Gln Ala Glu Arg Ala Ser Ser Ser Lys

210 215 220

Ser Trp Ile Thr Phe Asp Leu Lys Asn Lys Glu Val Ser Val Lys Arg

225 230 235 240

Val Thr Gln Asp Pro Lys Leu Gln Met Gly Lys Lys Leu Pro Leu His

245 250 255

Leu Thr Leu Pro Gln Ala Leu Pro Gln Tyr Ala Gly Ser Gly Asn Leu

260 265 270

Thr Leu Ala Leu Glu Ala Lys Thr Gly Lys Leu His Gln Glu Val Asn

275 280 285

Leu Val Val Met Arg Ala Thr Gln Leu Gln Lys Asn Leu Thr Cys Glu

290 295 300

Val Trp Gly Pro Thr Ser Pro Lys Leu Met Leu Ser Leu Lys Leu Glu

305 310 315 320

Asn Lys Glu Ala Lys Val Ser Lys Arg Glu Lys Ala Val Trp Val Leu

325 330 335

Asn Pro Glu Ala Gly Met Trp Gln Cys Leu Leu Ser Asp Ser Gly Gln

340 345 350

Val Leu Leu Glu Ser Asn Ile Lys Val Leu Pro Thr Trp His His His

355 360 365

His His His

370

<210> 4

<211> 1113

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aagaaagtgg tgctgggcaa aaaaggggat acagtggaac tgacctgtac agcttcccag 60

aagaagagca tacaattcca ctggaaaaac tccaaccaga taaagattct gggaaatcag 120

ggctccttct taactaaagg tccatccaag ctgaatgatc gcgctgactc aagaagaagc 180

ctttgggacc aaggaaactt tcccctgatc atcaagaatc ttaagataga agactcagat 240

acttacatct gtgaagtgga ggaccagaag gaggaggtgc aattgctagt gttcggattg 300

actgccaact ctgacaccca cctgcttcag gggcagagcc tgaccctgac cttggagagc 360

ccccctggta gtagcccctc agtgcaatgt aggagtccaa ggggtaaaaa catacagggg 420

gggaagaccc tctccgtgtc tcagctggag ctccaggata gtggcacctg gacatgcact 480

gtcttgcaga accagaagaa ggtggagttc aaaatagaca tcgtggtgct agctttccag 540

aaggcctcca gcatagtcta taagaaagag ggggaacagg tggagttctc cttcccactc 600

gcctttacag ttgaaaagct gacgggcagt ggcgagctgt ggtggcaggc ggagagggct 660

tcctcctcca agtcttggat cacctttgac ctgaagaaca aggaagtgtc tgtaaaacgg 720

gttacccagg accctaagct ccagatgggc aagaagctcc cgctccacct caccctgccc 780

caggccttgc ctcagtatgc tggctctgga aacctcaccc tggcccttga agcgaaaaca 840

ggaaagttgc atcaggaagt gaacctggtg gtgatgagag ccactcagct ccagaaaaat 900

ttgacctgtg aggtgtgggg acccacctcc cctaagctga tgctgagttt gaaactggag 960

aacaaggagg caaaggtctc gaagcgggag aaggcggtgt gggtgctgaa ccctgaggcg 1020

gggatgtggc agtgtctgct gagtgactcg ggacaggtcc tgctggaatc caacatcaag 1080

gttctgccca catggcatca tcatcatcat cat 1113

<210> 5

<211> 370

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Thr Ile Pro Pro His Val Gln Lys Ser Val Asn Asn Asp Met Ile Val

1 5 10 15

Thr Asp Asn Asn Gly Ala Val Lys Phe Pro Gln Leu Cys Lys Phe Cys

20 25 30

Asp Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp Asn Gln Lys Ser Cys Met Ser Asn

35 40 45

Cys Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu Lys Pro Gln Glu Val Cys Val Ala

50 55 60

Val Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn Ile Thr Leu Glu Thr Val Cys His

65 70 75 80

Asp Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp Phe Ile Leu Glu Asp Ala Ala Ser

85 90 95

Pro Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Lys Pro Gly Glu Thr Phe Phe

100 105 110

Met Cys Ser Cys Ser Ser Asp Glu Cys Asn Asp Asn Ile Ile Phe Ser

115 120 125

Glu Glu Tyr Asn Thr Ser Asn Pro Asp Leu Val Pro Arg Gly Ser Asp

130 135 140

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

145 150 155 160

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

165 170 175

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

180 185 190

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

195 200 205

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

210 215 220

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

225 230 235 240

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

245 250 255

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

260 265 270

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

275 280 285

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

290 295 300

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

305 310 315 320

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

325 330 335

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

340 345 350

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

355 360 365

Gly Lys

370

<210> 6

<211> 1110

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

acgatcccac cgcacgttca gaagtcggtt aataacgaca tgatagtcac tgacaacaac 60

ggtgcagtca agtttccaca actgtgtaaa ttttgtgatg tgagattttc cacctgtgac 120

aaccagaaat cctgcatgag caactgcagc atcacctcca tctgtgagaa gccacaggaa 180

gtctgtgtgg ctgtatggag aaagaatgac gagaacataa cactagagac agtttgccat 240

gaccccaagc tcccctacca tgactttatt ctggaagatg ctgcttctcc aaagtgcatt 300

atgaaggaaa aaaaaaagcc tggtgagact ttcttcatgt gttcctgtag ctctgatgag 360

tgcaatgaca acatcatctt ctcagaagaa tataacacca gcaatcctga cctggtgccg 420

aggggaagcg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 480

ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 540

gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 600

tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 660

agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 720

gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 780

aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggaggag 840

atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 900

gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 960

ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 1020

cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 1080

cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa 1110

<210> 7

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Val Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Val Ile His Trp Val Arg Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Asp Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Asp Tyr Asp Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Lys Asp Asn Tyr Ala Thr Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 8

<211> 366

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

caggtgcaac tgcaacagtc cggacccgaa gtcgtgaaac caggagcttc cgtgaagatg 60

agctgcaaag catccggata caccttcacc agctacgtga tccactgggt gaggcagaaa 120

cctggccagg gcctggactg gatcggctac atcaaccctt acaacgacgg aaccgactac 180

gacgagaaat tcaaaggcaa agctaccctg accagcgaca ccagcacctc cactgcttac 240

atggagctgt ccagcctgag gtccgaagac accgctgtgt actactgcgc tagggagaag 300

gacaactacg ctaccggcgc ttggttcgcc tactggggcc agggaaccct ggtgaccgtg 360

tccagc 366

<210> 9

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Val Thr Met Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser

20 25 30

Thr Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln

85 90 95

Tyr Tyr Ser Tyr Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 10

<211> 336

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gacatcgtga tgacccagtc ccctgactcc ctggctgtgt ccctgggcga acgggtcacc 60

atgaactgca aatcttccca gtccctgctg tactccacca accagaagaa ctacctggct 120

tggtaccagc agaaacctgg ccagtccccc aaactgctca tctactgggc ttccaccagg 180

gaaagcggcg tgcctgacag attctccgga agcggcagcg gaaccgactt caccctgacc 240

atctccagcg tgcaggctga agacgtggct gtctactact gccagcagta ctacagctac 300

aggaccttcg gcggaggcac caagctggag atcaag 336

<210> 11

<211> 123

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Ile Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Thr Gly Glu Tyr Ser Gly Tyr Asp Thr Asp Pro Gln Tyr Ser

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 12

<211> 369

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gaggtccagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt agctatggca tgcactgggt ccgccaggct 120

ccaggcaagg agctggagtg ggtggcagtt atatcatatg atggaagtat taaatactat 180

gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240

ctgcaaatga acagcctgag agctgaggac acggctgtgt attactgtgc gcgaactggt 300

gaatatagtg gctacgatac ggacccccag tactcctggg ggcaagggac cacggtcacc 360

gtctcctca 369

<210> 13

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Gly Ile Gly Asp Asp

20 25 30

Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Ile Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Gly Thr Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Asp Ser Asn Tyr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 14

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gaaattgtgc tgactcagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60

atcacttgcc ggtcaagtca gggcattgga gatgatttgg gctggtatca gcagaagcca 120

gggaaagccc ctatcctcct gatctatggt acatccactt tacaaagtgg ggtcccgtca 180

aggttcagcg gcagtggatc tggcacagat ttcactctca ccatcaacag cctgcagcct 240

gaagattttg caacttatta ctgtctacaa gattccaatt acccgctcac tttcggcgga 300

gggacacgac tggagattaa a 321

<210> 15

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

1 5 10 15

Gly Gly Gly Ser

20

<210> 16

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

Gly Gly Gly Gly Ser

1 5

<210> 17

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Val Ile His

1 5 10

<210> 18

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Asp Tyr Asp Glu Lys Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 19

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

Glu Lys Asp Asn Tyr Ala Thr Gly Ala Trp Phe Ala

1 5 10

<210> 20

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Thr Asn Gln Lys Asn Tyr Leu

1 5 10 15

Ala

<210> 21

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser

1 5

<210> 22

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

Gln Gln Tyr Tyr Ser Tyr Arg Thr

1 5

<210> 23

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

Ser Tyr Gly Met His

1 5

<210> 24

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Ile Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 25

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

Thr Gly Glu Tyr Ser Gly Tyr Asp Thr Asp Pro Gln Tyr Ser

1 5 10

<210> 26

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

Arg Ser Ser Gln Gly Ile Gly Asp Asp Leu Gly

1 5 10

<210> 27

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

Gly Thr Ser Thr Leu Gln Ser

1 5

<210> 28

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

Leu Gln Asp Ser Asn Tyr Pro Leu Thr

1 5

Claims

1.一种双特异性抗体，至少包括：

2.如权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于，

所述第一蛋白功能区的重链可变区包含氨基酸序列分别为SEQ ID NO:17—SEQ IDNO:19所示的HCDR1-HCDR3，其轻链可变区包含氨基酸序列分别为SEQ ID NO:20—SEQ IDNO:22所示的LCDR1-LCDR3；

和，

所述第二蛋白功能区的重链可变区包含氨基酸序列分别为SEQ ID NO:23—SEQ IDNO:25所示的HCDR1-HCDR3，其轻链可变区包含氨基酸序列分别为SEQ ID NO:26—SEQ IDNO:28所示的LCDR1-LCDR3。

3.如权利要求2所述的双特异性抗体，其特征在于，

所述第一蛋白功能区的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，所述第一蛋白功能区的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示；

和，

4.如权利要求1-3任一所述的双特异性抗体，其特征在于，

所述第一蛋白功能区选自Fab、Fab’、F(ab’)2、Fd、Fv、dAb、互补决定区片段、单链抗体、人源化抗体、嵌合抗体或双抗体；

和/或

5.如权利要求1-3任一所述的双特异性抗体，其特征在于，所述第一蛋白功能区为免疫球蛋白或单链抗体；

和

所述第二蛋白功能区为免疫球蛋白或单链抗体。

6.如权利要求5所述的双特异性抗体，其特征在于，所述双特异性抗体存在形式为IgG-ScFv形式，或其他双特异性抗体存在形式。

7.如权利要求5所述的双特异性抗体，其特征在于，所述第一蛋白功能区为免疫球蛋白，和所述第二蛋白功能区为单链抗体；

或者

8.如权利要求5所述的双特异性抗体，其特征在于，所述的免疫球蛋白包括非-CDR区，且所述非-CDR区来自非鼠类的物种，优选灵长类，更优选人。

9.如权利要求5所述的双特异性抗体，其特征在于，所述的免疫球蛋白的恒定区来自人抗体；

10.如权利要求5所述的双特异性抗体，其特征在于，所述的免疫球蛋白的重链恒定区为人IgG1 chain C region或人IgG4 chain C region,并且其轻链恒定区为人Ig kappachain C region。

11.如权利要求5所述的双特异性抗体，其特征在于，所述免疫球蛋白选自IgG、IgA、IgD、IgE或IgM；优选为IgG。

12.如权利要求5所述的双特异性抗体，其特征在于，所述单链抗体为两条，每条单链抗体的一端分别连接在免疫球蛋白的两条重链的N末端或者C末端。

13.如权利要求1-3任一所述的双特异性抗体，其特征在于，所述第一蛋白功能区和第二蛋白功能区直接连接或者通过连接片段连接；

优选地，所述连接片段为(GGGGS)m，m为正整数，优选为1、2、3、4、5或6。

14.如权利要求1-3任一所述的双特异性抗体，其特征在于，所述第一蛋白功能区和第二蛋白功能区独立地为1个、2个或者2个以上。

15.如权利要求1-3任一所述的双特异性抗体，其特征在于，所述的双特异性抗体以小于10^-9M或更小的Kd结合CD4蛋白和/或TGFβ1蛋白；优选地，所述Kd通过Biacore分子相互作用仪测得。

16.一种分离的核酸分子，其编码权利要求1至15中任一权利要求所述的双特异性抗体。

17.一种构建体，其包含本发明的分离的核酸分子。

18.一种宿主细胞，所述重组的宿主细胞含有如权利要求16所述的核酸分子、或者如权利要求17所述的构建体。

19.如权利要求1-15任一权利要求所述的双特异性抗体的制备方法，包括如下步骤：在适合表达所述双特异性抗体的条件下，培养如权利要求18所述的宿主细胞，以及从细胞培养物中回收所述双特异性抗体的步骤。

20.一种偶联物，其包含双特异性抗体以及偶联部分，其特征在于，所述双特异性抗体为权利要求1至15中任一权利要求所述的双特异性抗体，所述偶联部分为可检测的标记；优选地，所述偶联部分为化学小分子、荧光物质、发光物质、有色物质或酶。

21.一种药物组合物，包括治疗有效量的如权利要求1-15任一权利要求所述的双特异性抗体、如权利要求18所述的宿主细胞或如权利要求20所述的偶联物；可选地，所述药物组合物还包含药学上可接受的辅料。

22.如权利要求1-15任一所述的双特异性抗体、如权利要求16所述的核酸分子、如权利要求17所述的构建体、如权利要求18所述的宿主细胞、如权利要求20所述的偶联物在制备或筛选：预防和/或治疗恶性肿瘤的药物中的用途；优选地，所述恶性肿瘤选自结肠癌、直肠癌、肺癌、肾癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、膀胱癌、胃肠道癌、脑癌、肝癌、黑色素瘤或白血病中的一种或多种。

23.抗CD4抗体和抗TGFβ1抗体联合用于制备预防和/或治疗恶性肿瘤的药物中的用途；优选地，所述恶性肿瘤选自结肠癌、直肠癌、肺癌、肾癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、膀胱癌、胃肠道癌、脑癌、肝癌、黑色素瘤或白血病中的一种或多种。