KR101551878B1 - 항-ｍｎ 항체 및 그의 사용 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 MN 단백질에 대해 특이적인 항원 결합 부위를 가진 항체, 및 상기 항체를 이용하여 MN-관련 장애를 치료 및 진단하는 방법을 제공한다.
MN 단백질, 항원 결합 부위, 항체, 암

Description

항-ＭＮ 항체 및 그의 사용 방법{ANTI-MN ANTIBODIES AND METHODS OF USING SAME}
참고문헌의 도입
본 출원은 2005년 12월 12일자로 출원된 미국 가출원 제60/749,716호의 이익을 청구한다.
상기 출원, 및 그 출원에서 언급하는 모든 문헌 및 그 출원에서 언급하거나 참고하는 모든 문헌, 및 본원에서 언급하거나 참고하는 모든 문헌 ("본원에서 언급하는 문헌"), 본원에서 언급하는 문헌에서 언급하거나 참고하는 모든 문헌은, 본원에서 언급하거나 본원에서 참고문헌으로 도입되는 임의의 문헌 내의 임의의 제품에 대한 임의의 제조업체의 지침, 설명서, 제품 상세설명, 및 제품 기록과 함께, 본원에 참고문헌으로 도입되며, 본 발명을 수행하는데 채택할 수 있다.
본 발명은 MN 단백질에 대해 특이성을 갖는 항체 및/또는 그의 단편에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 항체 및/또는 면역접합체 조성물, 및 MN-관련 장애, 예를 들어 암을 치료, 예방, 및/또는 진단하는데 있어서 그들의 용도에 관한 것이다.
암의 발생은 노화와 관련된 것이 가장 일반적이며, 모든 신규한 케이스의 암 중 65％가 65세 이상의 환자에게서 보고되었다. 암은 미국에서 심장 질환 바로 다 음을 잇는 2번째 사망 원인이다. 실제, 미국 암 학회(American Cancer Society)는 현재 사망률이 정적인 상태를 유지한다고 보고, 미국에서 4명 중 1명이 암으로 사망할 것이라고 추산하고 있다. 미국에서만, 2006년 신규한 케이스가 1,399,790건 및 암 사망자가 564,830건으로 추정된다. 이들 신규한 케이스의 대부분은 결장암 (106,680건), 폐암 (172,570건) 및 유방암 (214,640건)인 것으로 추정된다. 게다가, 암 발병률 및 유병률이 모두, 평균 1.4％의 증가률을 반영하여, 다음 10년간 대략 15％ 증가할 것으로 예상된다 (미국 암 학회, 2006).
최근에 동정된 항원, MN, 세포 표면 단백질 관련 종양 중 하나가 다수의 임상 암종에서 발현되는 것으로 밝혀졌다. 예를 들면, MN은 신장 세포 암종의 100％ (문헌 [Liao, SY, Cancer Res., 1997, 57:2827-2831]), 식도 암종의 100％ (문헌 [Turner JR, Hum. Pathol., 199, 28:740-744]), 자궁경부 암종의 90％ 초과 (문헌 [Liao, SY, Cancer Res., 1997, 57:2827-2831]), 악성 결장 암종의 76％ (문헌 [Saarnio, J. et al., Am. J. Path., 1997, 153:279-285]), 비-소세포 폐 암종의 80％ (문헌 [Vermylen P. et al., Eur. Respir. J., 1999, 14:806-811]), 및 유방 암의 48％ (문헌 [Chia SK et al., J. Clin. Oncol., 2001, 19:3660-3668])에서 이소 발현되는 것으로 밝혀졌다. 항원과 관련된 다른 종양과 마찬가지로, MN 단백질 또한, 예를 들면 위, 담관 점막을 포함해서 정상 조직의 제한된 수의 세포 상에 존재하고, 소장 내에 위치한 정상 세포를 고도로 증식시킨다 (문헌 [Saarnio J. et al., J. Histochem. Cytochem., 1998, 46:497-504]).
인간 MN cDNA는 클로닝 및 서열분석 되었다 (문헌 [Pastorek, et al., Oncogene, 1994, 9:2877-2888]). 예상되는 단백질은 신호 펩티드, 프로테오글리칸-관련 서열, 탄산 탈수효소 도메인 (탄산 탈수효소 IX 또는 CA IX), 막통과 세그먼트, 및 짧은 세포내 부분으로 이루어진 것이다. 탄산 탈수효소 IX 도메인은 이산화탄소의 탄산으로의 가역적인 수화를 촉매한다. 이러한 활성은 종양 환경의 세포외 부분의 국소적인 산성화를 조절하는 역할을 하여, 결과적으로 프로테아제의 활성, 및 최종적으로 전이를 야기할 수 있다.
MN 발현의 조절이 또한 연구되고 있다. 일 측면에서, 예를 들면, MN 발현은 저산소증에 의해 상향조절된다. 저산소증-유도가능 인자-1 (HIF-1)로 알려진 전사 복합체는 MN 발현 조절자이다. 따라서, MN은 저산소증에 대한 종양 반응을 이해하는데 연관성이 있는 HIF-1 반응 유전자로 알려져 있다 (문헌 [Wykoff CC et al., Cancer Res., 2000, 60:7075-7083]). 또한, MN 발현은 종양 저산소증 수준과 관련이 있으며, 자궁경부암에서의 전체적인 생존 및 전이가 없는 생존의 예후 지표이다 (문헌 [Loncaster, JA et al., Cancer Res., 2000, 60:7075-7083]). MN 발현은 또한 높은 평균 혈관 밀도, 진행암 단계, 두경부 암종에서의 괴사 정도 (문헌 [Beasley NJP et al., Cancer Res., 2001, 61:5262-5267]), 비인두 암종에서의 불량한 생존률 (문헌 [Hui EP et al., Clin. Cancer Res., 2002, 8:2595-2604]), 종양 괴사, 높은 등급의 음성 에스트로겐 수용체 상태, 높은 재발률, 및 침윤성 유방 암종에 대한 불량한 생존률 (문헌 [Chia SK et al., J. Clin. Oncol., 2001, 19:3660-3668])과 관련이 있다. 따라서, MN 항원의 발현은 불량한 생존 예후, 및 높은 등급의 암과 관련이 있다.
이들 공격적인 암, 특히 MN 발현을 표적으로 하는 암에 대한 신규하고 개선된 치료법이 매우 소망되며, 당업계에 두각을 나타낼 것이다. 이에, 본 발명은 MN-관련 암의 치료, 예방 및/또는 진단에 유용한 신규한 항체 조성물 및 그의 면역 접합체를 개시한다.
본 발명의 요약
본 발명은 세포-표면 단백질 MN에 결합하고, 암의 치료, 예방 및/또는 진단에 사용할 수 있는 항체, 예를 들어 모노클로날 항체, 또는 항체 단편에 관한 것이다. 본 발명의 항체는 추가로 세포독성제, 예를 들어 모노메틸라우리스타틴-E에 접합될 수 있으며/거나, 하나 이상의 부가적인 항암제와 함께 투여되거나 제형화될 수 있다. 본 발명의 항-MN 항체 및 면역접합체는 암, 예를 들어 고형 종양을 치료 및/또는 진단 및/또는 모니터링하기 위한 본 발명의 방법에 사용할 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 MN 단백질에 대해 특이적인 항원 결합 부위를 갖는 항체 또는 항체 단편, 또는 상기 항체 또는 항체 단편을 포함하는 조성물을 제공한다. 상기 항원 결합 부위는 적어도 하나의 CDR1, CDR2, 또는 CDR3, 또는 CDR2 또는 CDR3과 조합된 CDR1, 또는 CDR1 또는 CDR3과 조합된 CDR2, 또는 CDR1 또는 CDR2와 조합된 CDR3, 또는 그의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 상기 CDR1은 서열 57, 58, 59, 60, 61, 62, 77, 80, 81, 86, 87, 88, 89, 98, 99, 104, 107, 및 108로 이루어진 군에서 선택할 수 있다. 상기 CDR2는 서열 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 78, 82, 83, 90, 91, 92, 93, 100, 101, 105, 109, 및 110으로 이루어진 군에서 선택할 수 있다. 상기 CDR3는 서열 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 79, 84, 85, 94, 95, 96, 97, 102, 103, 106, 111, 및 112로 이루어진 군에서 선택할 수 있다. 본 발명의 이러한 측면의 CDR 서열은 또한 아미노산 서열을 포함할 수도 있고, 그것은 각각의 CDR1, CDR2 또는 CDR3을 가르키는 상기 서열 중 임의의 것에 대해 바람직하게는 약 80％보다 높은 서열 동일성을 갖고, 보다 바람직하게는 약 85％보다 높은 서열 동일성, 보다 더 바람직하게는 약 90％보다 높은 서열 동일성, 더욱 보다 더 바람직하게는 약 95％ 또는 약 99％보다 높은 서열 동일성, 및 약 100％까지의 서열 동일성을 갖는다.
또다른 측면에서, 상기 항원 결합 부위는 서열 57 내지 85, 및 서열 57 내지 85에 대해 약 80％보다 높은 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택된 중쇄 가변 영역 CDR을 가질 수 있다.
상기 항원 결합 부위는 또한 서열 86 내지 112, 및 서열 86 내지 112에 대해 약 80％보다 높은 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택된 경쇄 가변 영역 CDR을 가질 수도 있다.
상기 항원 결합 부위는 또한 하기 6개의 CDR 세트를 포함하는 특이적인 CDR 서열 세트로부터 선택할 수 있다:
(a) [3ee9] 서열 57, 63, 70, 89, 93, 및 97;
(b) [3ef2] 서열 58, 64, 71, 107, 109, 및 111;
(c) [1e4] 서열 59, 65, 72, 107, 109, 및 111;
(d) [3a4] 서열 60, 66, 73, 108, 110, 및 112;
(e) [3ab4] 서열 61, 67, 74, 87, 91, 및 95;
(f) [3ah10] 서열 61, 68, 75, 88, 92, 및 96;
(g) [3bb2] 서열 62, 69, 76, 98, 100, 및 102;
(h) [1aa1] 서열 77, 78, 79, 86, 90, 및 94;
(i) [5a6] 서열 80, 82, 84, 99, 101, 및 103; 및
(j) [5aa3] 서열 81, 83, 85, 104, 105, 및 106.
상기 항원 결합 부위는 또한
(a) [3ee9] 서열 57, 63, 및 70;
(b) [3ef2] 서열 58, 64, 및 71;
(c) [1e4] 서열 59, 65, 및 72;
(d) [3a4] 서열 60, 66, 및 73;
(e) [3ab4] 서열 61, 67, 및 74;
(f) [3ah10] 서열 61, 68, 및 75;
(g) [3bb2] 서열 62, 69, 및 76;
(h) [1aa1] 서열 77, 78, 및 79;
(i) [5a6] 서열 80, 82, 및 84; 및
(j) [5aa3] 서열 81, 83, 및 85
로 이루어진 군에서 선택된 중쇄 CDR 서열의 세트를 포함할 수 있다.
상기 항원 결합 부위는 또한
(a) [3ee9] 서열 89, 93, 및 97;
(b) [3ef2] 서열 107, 109, 및 111;
(c) [1e4] 서열 107, 109, 및 111;
(d) [3a4] 서열 108, 110, 및 112;
(e) [3ab4] 서열 87, 91, 및 95;
(f) [3ah10] 서열 88, 92, 및 96;
(g) [3bb2] 서열 98, 100, 및 102;
(h) [1aa1] 서열 86, 90, 및 94;
(i) [5a6] 서열 99, 101, 및 103; 및
(j) [5aa3] 서열 104, 105, 및 106
로 이루어진 군에서 선택된 경쇄 CDR 서열의 세트를 포함할 수 있다.
또다른 측면에서, 본 발명은
(a) 서열 133의 중쇄 가변 영역 및 서열 134의 경쇄 가변 영역;
(b) 서열 135의 중쇄 가변 영역 및 서열 136의 경쇄 가변 영역;
(c) 서열 137의 중쇄 가변 영역 및 서열 138의 경쇄 가변 영역;
(d) 서열 139의 중쇄 가변 영역 및 서열 140의 경쇄 가변 영역;
(e) 서열 141의 중쇄 가변 영역 및 서열 142의 경쇄 가변 영역;
(f) 서열 143의 중쇄 가변 영역 및 서열 144의 경쇄 가변 영역;
(g) 서열 145의 중쇄 가변 영역 및 서열 146의 경쇄 가변 영역;
(h) 서열 147의 중쇄 가변 영역 및 서열 148의 경쇄 가변 영역;
(i) 서열 149의 중쇄 가변 영역 및 서열 150의 경쇄 가변 영역; 및
(j) 서열 151의 중쇄 가변 영역 및 서열 152의 경쇄 가변 영역
으로 이루어진 군에서 선택된 한 쌍의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 함유하는 항원 결합 부위를 갖는 항체 또는 항체 단편을 제공한다.
본 발명의 항체 또는 항체 단편은 바람직하게는 약 0.15 nM 내지 약 50 nM의 해리 상수로 MN 단백질에 결합할 수 있다.
또다른 측면에서, 본 발명의 항체 또는 단편은 IgG 항체 또는 IgG 단편이다. 상기 항체 또는 단편은 또한 IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgM, IgD, IgE, IgA, 또는 IgM 항체, Fab 단편, F(ab')2 단편, scFv 단편, Fv 단편, 이중항체(diabody), 선형 항체, 단일-쇄 항체, 생물특이적 항체, 다중특이적 항체, 또는 키메라 항체 (예를 들어, 인간 또는 비-인간 항체 결합 영역에 이식된 인간 항체 골격, 또는 인간 또는 비-인간 항체 결합 영역에 이식된 비-인간 항체 골격을 포함)일 수 있다. 상기 키메라 항체는, 예를 들면 비-인간원, 예컨대 젖소, 마우스, 라마, 낙타, 또는 토끼 유래의 항체 골격 영역을 포함할 수 있다. 항체 공학에 대한 추가의 정보는, 예를 들면 문헌 [Holliger and Hudson, Nature Biotechnology, (Sep, 2005) 23:1126-1136]에서 찾아볼 수 있으며, 이것은 본원에 참고문헌으로 도입된다. 상기에서 언급한 단편들은 이뮤노글로불린 또는 적합한 방법, 예를 들어 재조합 발현에 의해 단편 형태로 생산된 것으로부터 수득할 수 있다.
본 발명의 항체 또는 항체 단편은 또한 인간화된 것일 수 있고, 상기 CDR 서열 또는 영역 (예를 들어 CDR1, CDR2, CDR3)은 인간 이외의 것, 예를 들어 뮤린(murine)의 것일 수 있다.
본 발명의 항체 또는 항체 단편, 또는 상기 항체 또는 단편을 포함하는 조성물은 상기 항체 또는 단편에 접합된 세포독성제를 포함할 수 있다. 일 측면에서, 상기 세포독성제는 모노메틸라우리스타틴-E (MMAE)이나, 다른 세포독성제도 또한 제공되며, 그러한 것에는 예를 들면 MMAE의 기능적 유사체 (예를 들어, 모노메틸라우리스타틴-F), 및 그 밖의 세포독성제, 예를 들어, 아플리딘, 아자리빈, 아나스트로졸, 아자시티딘, 블레오마이신, 볼테조미브, 브리오스타틴-1, 부술판, 칼리키마이신, 캄프토테신, 10-히드록시캄프토테신, 카무스틴, 셀레브렉스, 클로람부실, 시스플라틴, 이리노테칸 (CPT-1 1), SN-38, 카보플라틴, 클라드리빈, 시클로포스파미드, 사이타라빈, 다카르바진, 도세탁셀, 닥티노마이신, 다우노마이신 글루쿠로니드, 다우노루비신, 덱사메타손, 디에틸스틸베스트롤, 독소루비신, 독소루비신 글루쿠로니드, 에피루비신 글루쿠로니드, 에티닐 에스트라디올, 에스트라무스틴, 에토포시드, 에토포시드 글루쿠로니드, 인산 에토포시드, 플록수리딘 (FUdR), 3',5'-O-디올레오일-FudR (FUdR-dO), 플루다라빈, 플루타미드, 플루오로우라실, 플루옥시메스테론, 겜시타빈, 카프론산 히드록시프로게스테론, 히드록시우레아, 이다루비신, 이포스파마이드, L-아스파라기나제, 류코보린, 로무스틴, 메클로레타민, 아세트산 메드로프로게스테론, 아세트산 메게스트롤, 멜팔란, 메르캅토푸린, 6-메르캅토푸린, 메토트렉세이트, 미토산트론, 미트라마이신, 미토마이신, 미토탄, 페닐 부티레이트, 프레드니손, 프로카바진, 파클리탁셀, 펜토스타틴, PSI-341, 세무스틴 스트렙토조신, 타목시펜, 탁산, 탁솔, 테스토스테론 프로피오네이트, 탈리도미드, 티오구아닌, 티오테파, 테니포사이드, 토포테칸, 우라실 머스타드, 벨케이드, 빈블라스 틴, 비노렐빈, 빈크리스틴, 리신, 아브린, 리보누클레아제, 옹코나제, rapLR1, DNase I, 스타필로코커스 내독소-A, 포크위드(pokeweed) 항바이러스 단백질, 젤로닌, 디프테리아 독소, 슈도모나스 외독소, 및 슈도모나스 내독소, 또는 그의 조합물이 포함될 수 있다. 임의의 세포독성제에는 또한 그의 기능적 유사체가 포함될 수 있다.
본 발명의 조성물은 (상기에서 언급한 접합된 세포독성제가 있거나 없는) 항체 및 단편에 더하여 다양한 항암제를 포함할 수 있고, 그러한 것에는 예를 들면 블레오마이신, 도세탁셀 (탁소테레(Taxotere)), 독소루비신, 에다트렉세이트, 에를로티닙 (타세바(Tarceva)), 에토포시드, 피나스테라이드 (프로스카(Proscar)), 플루타미드 (유렉신(Eulexin)), 겜시타빈 (겜자르(Gemzar)), 게니티닙 (이레사(Irresa)), 아세트산 고세렐린 (졸라덱스(Zoladex)), 그라니세트론 (카이트릴(Kytril)), 이마티닙 (글리벡(Gleevec)), 이리노테칸 (캠프토/캠프토사르(Campto/Camptosar)), 온단세트론 (조프란(Zofran)), 파클리탁셀 (탁솔(Taxol)), 페가스파가제 (온카스파(Oncaspar)), 염산 필로카핀 (살라겐(Salagen)), 포르피머 나트륨 (포토프린(Photofrin)), 인터류킨-2 (프로류킨(Proleukin)), 리툭시맙 (리툭산(Rituxan)), 토포테칸 (하이캄틴(Hycamtin)), 트라스투주맙 (헤르셉틴(Herceptin)), 트리아핀, 빈크리스틴, 및 타르타르산 비노렐빈 (나벨빈(Navelbine)), 또는 치료적 항체 또는 그의 단편이 포함될 수 있으며, 또는 항-혈관형성제, 예컨대, 안지오스타틴, 베바시주맙 (아바스틴(Avastin)®), 소라페닙 (넥사바르(Nexavar)®), 바쿨로스타틴, 칸스타틴, 마스핀, 항-VEGF 항체 또는 펩티드, 항-태반 성장 인자 항체 또는 펩티드, 항-Flk-1 항체, 항-Flt-1 항체 또는 펩티드, 라미닌 펩티드, 피브로넥틴 펩티드, 플라스미노겐 활성화제 억제제, 조직 메탈로프로테이나제 억제제, 인터페론, 인터류킨 12, IP-10, Gro-β, 트롬보스폰딘, 2-메톡시오에스트라디올, 프롤리페린-관련 단백질, 카르복시아미도트리아졸, CM101, 마리마스타트(Marimastat), 다황화 펜토산, 안지오포이에틴 2, 인터페론-알파, 헤르비마이신 A, PNU145156E, 16K 프로락틴 단편, 리노미드(Linomide), 탈리도미드, 펜톡시필린, 게니스테인, TNP-470, 엔도스타틴, 파클리탁셀, 악쿠틴, 시도포비르, 빈크리스틴, 블레오마이신, AGM-1470, 혈소판 인자 4 또는 미노사이클린을 포함할 수 있다.
본 발명은 추가로 또다른 측면에서, 본 발명의 항체 및/또는 단편, 또는 본 발명의 항체 및/또는 단편을 포함하는 본 발명의 조성물을 치료상 유효량 투여하는 것에 의한 MN-관련 장애의 치료 방법을 제공한다. 상기 MN-관련 장애에는, 예를 들면 암, 예컨대 고형 종양 암이 포함될 수 있다. 상기 고형 종양은 유방, 호흡기관, 폐, 뇌, 생식기관, 소화기관, 결장, 비뇨기관, 신장, 식도, 자궁경부, 눈, 간, 피부, 머리, 목, 갑상선, 및 부갑상선 내에 있거나, 그로부터 기원된 것일 수 있다.
또다른 측면에서, 본 발명은 발병이 의심되는 조직 또는 세포에서의 MN 수준을 상응하는 건강한 조직 또는 세포에서의 MN 수준과 비교하는 단계를 포함하고, 상기 발병이 의심되는 조직 또는 세포에서의 비정상적인 MN 수준은 MN-관련 장애의 지표이며, 상기 비교 단계는 본 발명의 항체 또는 항체 단편을 이용하여 발병 조직 및 건강한 조직에서의 MN 수준을 면역검정에 의해 검출하는 단계를 추가로 포함하는, 비정상적인 MN 수준을 특징으로 하는 MN-관련 장애의 진단 방법을 제공한다.
특정 측면에서, 본 발명은 MN-관련 장애의 진단 방법을 제공하며, 면역검정은 (a) 건강한 조직에서의 MN 단백질 수준을 검출하는 단계; (b) 발병이 의심되는 조직에서의 MN 단백질 수준을 검출하는 단계; 및 (c) (a) 및 (b)로부터의 MN 단백질 수준을 비교하는 단계를 포함한다. 건강한 조직에서의 MN 단백질 수준에 비해 발병이 의심되는 조직에서의 MN 단백질 수준의 상승은 MN-관련 장애의 존재를 나타낸다.
본 발명은 또한 본 발명의 항체 또는 항체 단편, 또는 대안으로 본 발명의 조성물, 및 MN-관련 장애의 치료 또는 진단 방법에 키트를 사용한다는 것에 대한 지침서 세트를 포함하는 키트를 제공한다.
이들 실시양태 및 그 밖의 실시양태를 개시하며, 이는 이하의 상세한 설명으로부터 분명해지고, 그에 포함된다.
이하의 상세한 설명은 일예로 제시되는 것일 뿐, 기재한 특이적 실시양태로만 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니고, 첨부한 도면으로 가장 잘 이해할 수 있다.
도 1은 항체 상보성 결정 영역 (CDR)의 DNA 서열을 도시한다;
도 2는 항체 상보성 결정 영역 (CDR)의 단백질 서열을 도시한다;
도 3은 특이적 항체 경쇄 및 중쇄 가변 영역의 DNA 서열을 도시하며, 이들 각각은 CDR 및 프레임워크(framework) 영역을 모두 함유한다;
도 4는 특이적 항체 경쇄 (VL) 및 중쇄 (VH) 가변 영역의 단백질 서열을 도시하며, 이들 각각은 CDR 및 프레임워크 영역을 모두 함유한다;
도 5는 본 발명의 MN 항체에 대한 MN-결합 특성을 도시한다;
도 6은 항-MN 항체와의 인큐베이션에 의해 생산된 MN 코팅 플레이트에 대한 종양 세포 부착의 저해를 도시한다;
도 7은 항-MN 모노클로날 항체 1e4를 포함하는 면역접합체로 처리하여 유발한 MaTu 종양을 포함하는 이종이식 모델에서의 생체내 항-종양 활성을 도시한다;
도 8은 표면 상에 MN 단백질을 발현하는 PC3mm2 세포주에 대한 항-MN 항체의 결합의 FACS 측정치를 도시한다.
도 9는 항체 접합 (MMAE에 접합된 항-MN 항체)을 개략적으로 도시한다;
도 10a는 3ee9/MMAE가 MN+ (MaTu) 세포에는 결합하지만, MN- (DLD) 세포에는 결합하지 않음을 도시한 FACS 플롯을 나타낸다;
도 10b는 1E4 면역접합체가 MN+ (PC3mm2) 세포에는 결합하지만, MN- (DLD) 세포에는 결합하지 않음을 도시한 FACS 플롯을 나타낸다;
도 10c는 1aa1 면역접합체가 MN+ (PC3mm2) 세포에는 결합하지만, MN- (DLD) 세포에는 결합하지 않음을 도시한 FACS 플롯을 나타낸다;
도 11a는 3ee9/MMAE가 MN+ 세포에 의해서는 내재화되지만, MN- 세포에 의해 서는 내재화되지 않음을 도시한 면역형광 화상을 나타낸다. 내재화된 3ee9/MMAE는 형광으로 표시된다;
도 11b는 1E4 면역접합체가 MN+ 세포에 의해서는 내재화되지만, MN- 세포에 의해서는 내재화되지 않음을 도시한 면역형광 화상을 나타낸다. 내재화된 1E4 면역접합체는 형광으로 표시된다;
도 12는 바이오틴화된 세포 표면 단백질의 MN 항체에 의한 특이적 면역침강을 도시한 면역 블롯을 나타낸다;
도 13a는 3ee9/MMAE가 MN+ 세포에 대해서는 세포독성이지만, MN- 세포에 대해서는 그러하지 않음을 그래프적으로 도시한다;
도 13b는 1E4 면역접합체가 MN+ 세포에 대해서는 세포독성이지만, MN- 세포에 대해서는 그러하지 않음을 그래프적으로 도시한다;
도 13c는 1aa1 면역접합체가 MN+ 세포에 대해서는 세포독성이지만, MN- 세포에 대해서는 그러하지 않음을 그래프적으로 도시한다;
도 14는 튜불린 억제에 의한 3ee9/MMAE의 정상적인 방추 형성의 저해를 도시한 면역형광 화상을 나타낸다;
도 15는 MaTu 이종이식물에 대한 3ee9/MMAE의 항-종양 효능을 그래프적으로 도시한다;
도 16은 발생한 MaTu 유방 종양에 대한 1E4 면역접합체의 항-종양 효능을 그래프적으로 도시한다;
도 17은 MaTu 이종이식물에 대한 1aa1 면역접합체의 항-종양 효능을 그래프 적으로 도시한다;
도 18은 MaTu 이종이식물에 대한 3ee9/MMAE의 치료 지수 (TI)를 그래프적으로 도시한다;
도 19는 HT-29 이종이식물에 대한 3ee9/MMAE 및 유리 MMAE의 항-종양 효능을 그래프적으로 도시한다;
도 20은 HT-29 이종이식물에 대한 Q7D×2 스케쥴에 따른 3ee9/MMAE의 항-종양 효능을 그래프적으로 도시한다;
도 21은 HT-29 이종이식물에 대한 Q1D×1 스케쥴에 따른 3ee9/MMAE의 항-종양 효능을 그래프적으로 도시한다;
도 22는 PC3mm2 이종이식물에 대한 3ee9/MMAE의 항-종양 효능을 그래프적으로 도시한다;
도 23은 Colo-205 이종이식물에 대한 3ee9/MMAE의 항-종양 효능을 그래프적으로 도시한다;
도 24는 HCT-15 이종이식물에 대한 3ee9/MMAE의 항-종양 효능을 그래프적으로 도시한다;
도 25는 MN- (위쪽 그래프) 및 MN+ (아래쪽 그래프) MIAPaca2 이종이식물에 대한 3ee9/MMAE의 항-종양 효능을 그래프적으로 도시한다;
도 26a 및 26b는 Colo-205 CRC 이종이식물에 대한 3ee9/MMAE 및 크셀로다(Xeloda)® 조합물의 항-종양 효능을 다양한 투여량에서 그래프적으로 도시한다;
도 27은 huMN-MIAPaca2 및 MIAPaca2 종양 내의 3ee9의 생체내 국소화를 도시한 면역형광 화상을 나타낸다; 그리고
도 28은 HT-29 CRC 이종이식물에 두 번 투여한 경우의 3ee9/MMAE의 튜불린 중합 억제를 도시한 (조직학적 샘플의) 면역형광 화상을 나타낸다.
도 29는 포유동물 발현 벡터 3ee9H+LpCMVUCOE8 (실시예 21 참고)의 삽입 영역의 완전한 뉴클레오티드 서열을 나타내고 (서열 153), 이는 벡터 3ee9pMORPHx9 (실시예 1 내지 3 참고)로부터 수득한, 각각 서열 126 및 125의 카파 및 중쇄 CDR 가변 영역을 포함하는 인간 IgG 항-MN 항체를 코딩한다.
본원에서 기재하는 본 발명은, 기재한 항-MN 항체, 면역접합체, 치료 방법, 프로토콜, 세포주, 동물 종 또는 속, 구축물, 및 시약을 포함해서 본 발명의 임의의 측면에 관해 본원에서 언급하는 특정 사항으로 제한되는 것이 아니고, 다양할 수 있음을 이해하여야 한다. 또한, 본원에서 사용하는 용어는 단지 특정 실시양태를 기재하기 위한 목적일 뿐이고, 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것은 아님을 이해하여야 한다.
정의
달리 정의한 바 없으면, 본원에서 사용하는 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 분야의 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 의미를 가진다. 그러나, 이하의 참고 문헌들은 당업자에게 본 발명에서 사용되는 많은 용어의 일반적인 정의가 적합하다는 것을 제공할 수 있고, 그러한 정의는 당업계에서 통상적으로 이해되는 의미와 일치하는 것으로 언급되고 사용될 수 있다. 그러한 참고문헌에는 문헌 [Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2d ed. 1994)]; [The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988)]; [Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991)]; [Lackie et al., The Dictionary of Cell & Molecular Biology (3d ed. 1999)]; 및 [Cellular and Molecular Immunology, Eds. Abbas, Lichtman and Pober, 2nd Edition, W.B. Saunders Company]이 포함되지만, 이것으로 제한되는 것은 아니다. 본원에서 사용하는 용어의 정의를 제공하고, 당업계에서 통상적으로 이해되는 의미를 갖는, 당업자가 이용할 수 있는 임의의 부가적인 기술 자료를 참고할 수 있다. 본 발명의 목적상 다음과 같은 용어들을 추가로 정의한다. 부가적인 용어들은 명세서의 다른 부분에서 정의한다.
본원 및 첨부된 청구항에서 사용하는 단수의 표현형은, 내용 중 달리 명시하지 않는 한, 복수형의 언급도 포함한다. 따라서, 예를 들면, "유전자"라는 언급은 하나 이상의 유전자에 대한 언급이고, 당업자에게 공지인 그의 등가물 등도 포함된다.
본원에서 사용하는 용어 "항체"에는 천연에서 단리되거나 재조합 방법에 의해 제조된 이뮤노글로불린 분자 (예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY를 포함하는 임의의 유형, 및/또는 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2를 포함하는 임의의 계열)가 포함된다. 항체는 또한 항원-결합 항체 단편, 예컨대 Fab, F(ab')2, scFv (단일 쇄 Fvs), Fv, 단일 쇄 항체, 이중항체, 디술피드-결합 Fvs (sdFv), 및 VL 또는 VH 도메인을 포함하는 단편을 포함하는 의미이고, 이들은 무손상 이뮤노글로불린으로부터 제조되거나, 재조합 방법에 의해 제조된다.
본 발명의 항체 및/또는 항원-결합 항체 단편은 단일특이적 (예를 들어, 모노클로날), 이중특이적, 삼중특이적 또는 보다 다중특이적일 수 있다. 다중특이적 항체는 항원의 서로 다른 에피토프에 대해 특이적일 수 있거나, 하나 이상의 항원의 에피토프에 대해 특이적일 수 있다. 예를 들어, PCT 공개공보 WO 93/17715; WO 92/08802; WO 91/00360; WO 92/05793; 문헌 [Tutt, et al., 1991, J. Immunol. 147:60 69]; 미국 특허 제4,474,893호; 제4,714,681호; 제4,925,648호; 제5,573,920호; 제5,601,819호; 문헌 [Kostelny et al., 1992, J. Immunol. 148:1547 1553]을 참고하고, 이들 각각은 본원에 참고문헌으로 도입된다.
항원-결합 항체 단편은 가변 영역(들) 만을 포함할 수 있거나, 또는 힌지 영역, CH1, CH2, CH3 및 CL 도메인의 전체 또는 부분과 조합된 것을 포함할 수 있다. 또한 본 발명에는 가변 영역(들)과 힌지 영역, CH1, CH2, CH3 및 CL 도메인과의 임의의 조합을 포함하는 항원-결합 항체 단편도 포함된다.
바람직하게는, 상기 항체 또는 항원-결합 항체 단편은 인간의 것, 인간화된 것, 뮤린 (예를 들어, 마우스 및 래트), 당나귀, 양, 토끼, 염소, 기니아 피그, 낙타, 말, 또는 닭의 것이다. 본원에서 사용하는 "인간" 항체에는 이하에 기재하는, 예를 들면 Kucherlapati 등의 미국 특허 제5,939,598호에서와 같이, 인간 이뮤노글로불린의 아미노산 서열을 갖는 항체가 포함되며, 인간 이뮤노글로불린 라이브러리로부터, 인간 B 세포로부터, 또는 하나 이상의 인간 이뮤노글로불린에 대한 트랜스제닉 동물로부터 단리된 항체가 포함된다. 또한, 용어 항체는, 항체 CDR 삽입물을 천연 항체에서 발견되는 것과 동일한 활성 결합 배열로 배향하여 이들 키메라 단백질에 의해 관찰되는 표적 항원의 결합이 CDR이 유래된 천연 항체의 결합 활성과 비례하여 유지될 수 있게 한 다른 단백질 골격으로도 확장된다.
본원에서 사용하는 용어 비-인간 (예를 들어, 뮤린) 항체의 "인간화된" 형태란 비-인간 이뮤노글로불린 유래의 최소한의 서열을 함유하는 키메라 항체를 말한다. 대부분의 경우, 인간화된 항체는 수혜자의 초가변 영역 잔기 (예를 들어, 상보성 결정 영역 "CDR")가 비-인간 종 (공여자 항체), 예컨대 마우스, 래트, 토끼 또는 목적으로 하는 특이성, 친화도 및 능력을 갖는 비인간 영장류의 초가변 영역 잔기 (CDR)로 대체된 인간 이뮤노글로불린이다. 일부 예에서, 인간 이뮤노글로불린의 프레임워크 영역 (FR) 잔기를 상응하는 비-인간 잔기로 대체할 수 있다. 또한, 인간화된 항체는 수혜자 항체 또는 공여자 항체에서는 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 그러한 개조는 항체 수행능을 더욱 개량한다. 일반적으로, 인간화된 항체는 적어도 하나 또는 전형적으로 두 개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 수 있고, 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 영역은 비-인간 이뮤노글로불린의 초가변 영역에 상응하며, 모든 또는 실질적으로 모든 FR은 인간 이뮤노글로불린 서열의 FR이다. 또한, 인간화된 항체는 임의로, 전형적으로는 인간 이뮤노글로불린의 것인, 이뮤노글로불린 불변 영역 (Fc)의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 검토를 위해, 문헌 [Jones, et al., (Nature 321:522-525, 1986)]; [Reichmann, et al., (Nature 332:323-329, 1988)]; 및 [Presta, (Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596, 1992)]을 참고한다. 인간화된 항체의 제조예는 미국 특허 제7,049,135호, 제6,828,422호, 제6,753,136호, 제6,706,484호, 제6,696,248호, 제6,692,935호, 제6,667,150호, 제6,653,068호, 제6,300,064호, 제6,294,353호, 및 제5,514,548호에서 찾아볼 수 있고, 이들 각각은 그 전체가 본원에 도입된다.
본원에서 사용하는 용어 "단일-쇄 Fv" 또는 "sFv" 항체 단편은 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하고, 이들 도메인은 단일 폴리펩티드 쇄 내에 존재한다. 일반적으로, Fv 폴리펩티드는 추가로 VH 및 VL 도메인 사이에 폴리펩티드 링커를 포함하고, 이는 sFv가 항원 결합을 위한 목적으로 하는 구조를 형성하게 한다. 검토를 위해, 문헌 [Pluckthun (The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp. 269-315, 1994)]를 참고하고, 이것은 그 전체가 본원에 도입된다.
용어 "이중항체"란 두 개의 항원-결합 부위를 갖는 작은 항체 단편을 말하며, 상기 단편은 동일한 폴리펩티드 쇄 (VH-VL) 내의 경쇄 가변 도메인 (VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (VH)을 포함한다. 동일한 쇄 상의 두 개의 도메인 사이에 쌍을 이루지 못하도록 짧은 링커를 사용함으로써, 상기 도메인은 또다른 쇄의 상보적인 도메인과 쌍을 이루게 되고, 두 개의 항원-결합 부위가 형성된다. 이중항체는, 예를 들면 EP 404,097; WO 93/11161; 및 문헌 [Hollinger, et al., (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448, 1993)]에 보다 상세하게 기재되어 있으며, 이들 각각은 참고문헌으로 도입된다.
"선형 항체"라는 표현은 당업계, 예를 들면 문헌 [Zapata, et al., (Protein Eng. 8(10):1057-1062, 1995)]) (참고문헌으로 도입됨)에 기재된 항체를 말한다. 간략히 말하면, 상기 항체는 한 쌍의 항원 결합 영역을 형성하는 한 쌍의 직렬 Fd 세그먼트 (VH-CH1-VH-CH1)를 포함한다. 선형 항체는 이중특이적 또는 단일특이적일 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "모노클로날 항체"란 실질적으로 균질한 항체의 군집으로부터 수득한 항체, 즉 소량으로 존재할 수 있는 자연 발생 돌연변이를 제외하고, 동일한 군집을 포함하는 개개의 항체를 말한다. 모노클로날 항체는 고도로 특이적인, 즉 단일 항원 부위에 대한 것이다. 또한, 전형적으로 상이한 결정기 (에피토프)에 대한 상이한 항체를 포함하는 종래의 (폴리클로날) 항체 제제와 대조적으로, 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정기에 대한 것이다. 수식어 "모노클로날"이란 실질적으로 균질한 항체의 군집으로부터 수득한 항체의 특성을 나타내는 것으로, 임의의 특정 방법에 의한 항체의 생산을 요구하는 것으로 해석되어서는 안된다. 예를 들면, 본 발명에서 사용되는 모노클로날 항체는 문헌 [Kohler, et al., (Nature 256:495, 1975)]에 첫번째로 기재된 하이브리도마 방법으로 제조할 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법으로 제조할 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 제4,816,567호 참고). 모노클로날 항체는 또한, 예를 들면 문헌 [Clackson, et al., (Nature 352:624-628,1991)] 및 [Marks, et al., (J. Mol. Biol. 222:581-597, 1991)]에 기재되어 있는 기술을 이용하여 파지 항체 라이브러리로부터 단리할 수도 있다.
본원의 모노클로날 항체에는 또한 "키메라" 항체가 포함되며, 그것은 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 종 유래의 항체 또는 특정 항체 계열 또는 하위계열에 속하는 항체에 상응하는 서열과 동일하거나 상동성인 반면, 상기 쇄(들)의 나머지는 다른 종 유래의 항체 또는 다른 항체 계열 또는 하위계열에 속하는 항체, 및 그러한 항체의 단편에 상응하는 서열과 동일하거나 상동성이어서, 목적으로 하는 생물학적 활성을 나타낸다 (예를 들어, 미국 특허 제4,816,567호; 및 문헌 [Morrison, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855, 1984]을 참고하고, 이들 각각은 참고문헌으로 도입됨).
본원에서 사용되는 용어 "생물학적 샘플" 또는 "환자 샘플"이란, 유기체로부터, 또는 유기체의 성분 (예를 들어, 세포)으로부터 수득한 샘플을 말한다. 상기 샘플은 임의의 생물학적 조직 또는 체액일 수 있다. 상기 샘플은 환자 유래의 샘플인 "임상 샘플"일 수 있다. 그러한 샘플에는 체액 샘플들 중에서, 객담, 혈액, 혈청, 혈장, 혈액 세포 (예를 들어, 백혈구), 조직 샘플, 생검 샘플, 소변, 복막강액, 흉막액, 타액, 정액, 유방 삼출물, 뇌척수액, 눈물, 점액, 림프액, 시토졸, 복수, 양수, 방광 세척액, 및 기관지폐포 세척액 또는 그 유래의 세포가 포함되지만, 이것으로 제한되는 것은 아니다. 환자 샘플은 신선한 것이거나, 동결된 것일 수 있고, 헤파린, 구연산염 또는 EDTA로 처리된 것일 수 있다. 생물학적 샘플에는 또한, 조직학적 목적을 위해 채취한 동결 절편과 같은, 조직의 절편이 포함될 수 있다.
용어 "암"에는, 고형 종양, 예컨대 유방암, 호흡기관암, 뇌암, 생식기관암, 소화기관암, 비뇨기관암, 눈암, 간암, 피부암, 두경부암, 갑상선암, 부갑상선암, 및 그들의 원격 전이암이 포함될 수 있지만, 이것으로 제한되는 것은 아니다. 상기 용어에는 또한, 육종, 림프종, 백혈병, 및 혈장 세포 골수종이 포함된다.
유방암의 예에는, 침윤성 유관암, 침윤성 소엽암, 동일계내 유관암, 및 동일계내 소엽암이 포함되지만, 이것으로 제한되는 것은 아니다. 호흡기관암의 예에는, 소세포 폐암 및 비-소세포 폐암 외에도, 기관지 선종 및 흉막폐 아세포종이 포함되지만, 이것으로 제한되는 것은 아니다. 뇌암의 예에는 뇌 줄기 및 눈아래 신경교종, 소뇌 및 대뇌의 성세포종, 수모세포종, 상의세포종, 및 외배엽성 및 송과체성 종양이 포함되지만, 이것으로 제한되는 것은 아니다. 남성 생식기관의 종양에는 전립선암 및 고환암이 포함되지만, 이것으로 제한되는 것은 아니다. 여성 생식기관의 종양에는 자궁내막암, 자궁경부암, 난소암, 질암, 외음부암 및 자궁육종이 포함되지만, 이것으로 제한되는 것은 아니다. 소화기관의 종양에는 항문암, 결장암, 결장직장암, 식도암, 담낭암, 위장암, 췌장암, 직장암, 소장암 및 침샘암이 포함되지만, 이것으로 제한되는 것은 아니다. 비뇨기관의 종양에는 방광암, 음경암, 신장암, 신우암, 요관암 및 요도암이 포함되지만, 이것으로 제한되는 것은 아니다. 눈암에는 안구내 흑색종 및 망막모세포종이 포함되지만, 이것으로 제한되는 것은 아니다. 간암의 예에는 간세포암종 (섬유층판 변이형을 동반하거나 하지 않는 간 세포 암종), 담관암종 (간내 담도 암종) 및 혼합 간세포 담관상피암종이 포함되지만, 이것으로 제한되는 것은 아니다. 피부암에는 편평세포암, 카포시 육종, 악성 흑색종, 메르켈(Merkel) 세포 피부암, 및 비-흑색종 피부암이 포함되지만, 이것으로 제한되는 것은 아니다. 두경부암에는 후두암/하인두암/비인후암/구인두암, 및 입술암 및 구강암이 포함되지만, 이것으로 제한되는 것은 아니다. 림프종에는 AIDS-관련 림프종, 비-호지킨 림프종, 피부 T-세포 림프종, 호지킨 질환, 및 중추신경계의 림프종이 포함되지만, 이것으로 제한되는 것은 아니다. 육종에는 연질 조직 육종, 골육종, 악성 섬유성 조직구종, 림프육종, 및 횡문근육종이 포함되지만, 이것으로 제한되는 것은 아니다. 백혈병에는 급성 골수성 백혈병, 급성 림프성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 및 모발상세포 백혈병이 포함되지만, 이것으로 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용하는 용어 "에피토프"는 항체가 항원 결합 부위를 통해 결합하는 항원, 예를 들어 MN 단백질 상의 임의의 항원 결정기를 의미한다. 결정기 또는 항원 결정기는 통상적으로 아미노산 또는 당의 측쇄와 같이 분자의 화학적으로 활성인 표면 분류로 이루어지고, 통상적으로 특이적인 3차원적 구조 특성 뿐만 아니라, 특이적인 전하 특성을 가진다.
용어 "특이적으로 면역반응성인"이란, 항체와 항체의 항원 결합 부위에 의해 인식되는 에피토프를 가진 단백질, 화합물 또는 항원 사이의 결합 반응을 말한다. 이러한 결합 반응은 존재하는 단백질 및 다른 생물제제의 불균질한 군집 사이에서, 인식되는 에피토프를 가진 단백질, 항원 또는 에피토프의 존재를 결정한다. 면역검정의 내용 중에서, 특이적으로 면역반응성인 항체는 인식되는 에피토프를 가진 단백질에 결합할 수 있고, 그렇다 하더라도, 샘플 중에 존재하는 에피토프가 결핍된 다른 단백질에도 검출가능하게 낮은 정도로 결합할 수 있다. 생체내 내용 중에서, "특이적으로 면역반응성인"이란 동물 내에서 백신 또는 항원에 대한 면역 반응, 예를 들면 항원에 대한 체액성 반응 (면역적으로 반응성인 조건 하에서 존재하는 백신, 단백질, 화합물 또는 항원에 대한 항체의 생산) 또는 세포-매개 반응 (또한, 본원에서 "세포성 면역 반응," 즉 존재하는 백신, 단백질, 화합물 또는 항원에 대한 T 림프구 매개 반응이라고도 함)이 형성되는 조건을 말하는 것일 수 있다.
본원에서 사용하는 용어 "면역적으로 반응성인 조건"은 면역검정 또는 시험관내 반응의 내용 중에 사용되고, 여기서 예를 들면 온도, 염 농도, pH, 시약 및 그의 농도, 및 항원 및 상기 항원에 대해 특이적으로 면역반응성인 동일 기원의 항체의 농도를 포함한 반응의 물리적 조건은, 동일 기원의 항체가 항원에 결합가능하도록 제공되거나 조정된다. 면역적으로 반응성인 조건은 항체 결합 반응의 포맷에 의존적이고, 전형적으로 면역검정 프로토콜에 사용되는 조건이다. 문헌 [Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New York, for a description of immunoassay formats and conditions]를 참고한다.
본원에서 사용되는 용어 "환자" 또는 "대상체"에는 포유동물 (예를 들어, 인간 및 동물)이 포함된다.
항체
본 발명은 MN에 결합하는 항체에 관한 것이다. 이들 항체는 다양한 치료상 및 진단상 목적에 유용할 수 있다.
항체 선택성 및 결합 친화도에 있어서 가장 중요한 결정기는 상보성 영역 (CDR)의 서열 및 생성된 배열이라는 것이 당업자에게 일반적으로 인식될 것이다. 대부분의 항체는 6개의 CDR을 함유하고, 그 중 3개는 중쇄 가변 영역 (VH)이며 나머지 3개는 경쇄 가변 영역 (VL)이다. VH 및 VL 내 CDR 사이의 개재 서열은 CDR을 배향하는 프레임워크 영역이다. 상기 CDR은 함께 항체 내에 항원 결합 부위를 형성한다. 항체의 기능적 특성을 결정하는데 중요한 이들 CDR의 역할이 항체 인간화 및 항체 최적화 방법에서 오랫동안 연구되어 왔다. 전자의 방법에서, 모노클로날 항체, 예를 들면 마우스 항체 유래의 CDR이 유사한 프레임워크 디자인의 인간 항체로 전달되어, 인간에게서 동일한 기능적 특성 및 감소된 면역원성을 가진 항체의 생성을 야기한다.
이러한 방법의 성공은 다수의 인간화된 항체가 인간 치료 요법으로서 성공적으로 상업화된 것으로부터 명백하며, 그러한 것으로 헤르셉틴(Herceptin)® (트라스투주맙, 미국 캘리포니아주 사우스 샌프란시스코 소재의 제넨테크 사 제), 시나지스(Synagis)® (팔리비주맙, 미국 메릴랜드주 게이더스버그 소재의 메디뮨 사 제), 캄패스(Campath)® (알렘투주맙, 미국 메사추세츠주 캠브리지 소재의 젠자임 옹콜로지 사 제), 제나팍스(Zenapax)® (다클리주맙, 미국 뉴저지주 너틀리 소재의 로쉐 파마슈티컬 사 제), 졸레어(Xolair)® (오말리주맙, 미국 캘리포니아주 사우스 샌프란시스코 소재의 제넨테크 사 제), 랍티바(Raptiva)® (에팔리주맙, 미국 캘리포니아주 사우스 샌프란시스코 소재의 제넨테크 사 제), 아바스틴® (베바시주맙, 미국 캘리포니아주 사우스 샌프란시스코 소재의 제넨테크 사 제), 및 마일로타그(Mylotarg)® (젬투주맙 오조가마이신, 미국 뉴저지주 메디슨 소재의 와이어스-에이어스트 사 제)가 포함된다. 다른 예는 문헌 [Singer, et al., (J. Immunol, 150:2844-2857, 1993)]; [Luo, et al., (J. Immunol Meth., 275:31-40, 2002)]; 및 [Kostelny, et al., (Int. J. Cancer 93;556-565, 2001)]에 기재되어 있다.
항체 최적화 방법은 CDR 서열 내의 특이적 변경을 통한 항체 선택성 또는 결합 친화도의 개선에 초점을 맞춘다. 이는 CDR이 치료상 및 진단상 용도에 요구되는 결합 친화도 및 선택 특성을 코딩하는 항체 개발 분야에서 잘 받아들여지고, 이들 CDR 서열은 당업자에게 공지된 표준 절차를 이용하여, 매우 다양한 택일적 항체 프레임워크에 목적으로 하는 기능적 특성을 부여하는데 사용될 수 있다. 또한, 항체 CDR을 이뮤노글로불린-유사 접힘을 보유하는 다른 단백질, 예컨대 이뮤노글로불린 상과인 다른 단백질 및 이뮤노글로불린과 유사한 접힘을 갖는 비-이뮤노글로불린에 이식시킴으로써 항체 결합 활성을 전달하는 것이 가능하다 (문헌 [Nicaise, et al., Protein Science 13:1882-1891, 2004]).
본 발명은 본 발명의 항체 및 항원 결합 항체 단편을 제조하기 위한 임의의 공지된, 또는 적합한 기술을 의도한다.
예를 들면, MN-관련 장애, 예컨대 MN-관련 암의 진단 및/또는 치료에 사용하기 위하여, 본 발명의 고친화도 항-MN 항체 또는 항원 결합 항체 단편을 수득하는 데에는 파지 디스플레이 기술이 유용하다. 친화도 성숙이라고 불리는 이 기술은 초기의 또는 어버이 항체와 비교하여 항원에 대해 보다 높은 친화도를 가지고 결합하는 항체를 동정하기 위해, 돌연변이 유발 또는 CDR 워킹 및 MN 항원을 이용한 재-선별을 채택한다 (예를 들어, 문헌 [Glaser et al., 1992, J. Immunology 149:3903] 참고). 단일 뉴클레오티드가 아닌 전체 코돈의 돌연변이화는 반-무작위적인 아미노산 돌연변이 레퍼토리를 야기한다. 단일 CDR 내의 단일 아미노산 변경에 의해 서로 상이하고, 각각의 CDR 잔기에 대해 각각 가능한 아미노산 치환을 나타내는 변형체들을 함유하는, 변형체 클론의 집합으로 이루어진 라이브러리를 구축할 수 있다. 항원에 대해 증가된 결합 친화도를 갖는 돌연변이체는 표지된 항원을 함유하는 고정화된 돌연변이체와 접촉시켜 스크리닝할 수 있다. 항원에 대해 증가된 접착력을 갖는 돌연변이 항체를 동정하기 위해 당업계 공지의 임의의 스크리닝 방법을 이용할 수 있다 (예를 들어, ELISA) (문헌 [Wu et al., 1998, Proc Natl. Acad. Sci. USA 95:6037]; [Yelton et al., 1995, J. Immunology 155:1994] 참고, 참고문헌으로서 도입됨). CDR 워킹은 또한 경쇄를 무작위적으로 선별하는데 사용할 수 있다 (문헌 [Schier et al., 1996, J. Mol. Bio. 263:551] 참고, 참고문헌으로서 도입됨).
특정한 일예에서, 모르포시스 아게(MorphoSys AG) (독일)는 완전한 인간 항체를 생성하는데 사용할 수 있는 파지-항체 기술을 제공한다. 모르포시스 HuCAL GOLD 라이브러리는 문헌 [Rauchenberger, et al., (J. Biol. Chem. 278:38194-38205, 2003, 참고문헌으로서 도입됨)]에 기재된 HuCAL-Fab 1 라이브러리를 포함해서 초기의 기술 버전에 비해 다수의 개선점을 제공한다 (문헌 [Knappik, et al., J. Mol. Biol. 296:57-86, 2000], 참고문헌으로서 도입됨). 초기 버전과 같이, HuCAL GOLD에는 인간 항체 디자인이 도입되어 있고, 그것은 인간 콘센서스 프레임워크 서열 및 자연적 인간 서열의 다양성과 유사한 CDR 변이성 패턴을 특징으로 한다. 그러나, HuCAL GOLD에서 다양성은 모든 6개의 항체 CDR을 포함하도록 확장된다. 또한, Cys디스플레이(CysDisplayTM) 특성으로 인해 고친화도 항체의 회수가 증가된다 (문헌 [Kretzschmar and von Ruden, Curr. Opin. Biotechnol. 13:598-602, 2002]). 이러한 기술에 의해 유래된 항체는 매우 감소된 면역원 가능성을 나타낸다.
파지-디스플레이 기술, 예컨대 모르포시스 사의 기술은 당업계에 공지되어 있고, 추가로 문헌 [Boehncke WH et al., Br J Dermatol. (2005), Nov;153(5): 1092]; [Simon Moroney et al., Modern BioPharmaceuticals]; [J. Knaeblein, Wiley-VCH Verlag (2005)]; [Ralf Ostendorp et al., Antibodies, Volume 2: Novel technologies and therapeutic use, p.13-52, (2004), Kluwer Academic/Plenum Publishers, New York]; [R. Rauchenberger et al., J Biol Chem., (2003), Oct 3, 278(40): 38194-38205]; [T. Kretzschmar et al., Curr Opin Biotechnol., (2002), Dec, 13(6):598-602]; [Krebs B et al, J Immunol Methods, (2001), Aug 1, 254(1-2)]; [M. Marget et al., Tissue Antigens (2000), 56: 1-9]; [A. Knappik et al., J. Mol Biol., (2000), Feb 11, 296 (1): 57-86]; 및 [A. Pluckthun et al., Immunotechnology, (1997), Jun; 3(2): 83-105]를 참고할 수 있고, 이들 각각은 그 전체가 본원에 참고문헌으로 도입된다.
일예로서, 모르포시스 기술을 이용하여 MN 결합 및 세포 부착-중화 활성을 갖는 항체를 동정할 수 있다. MN 단백질을 미세역가 플레이트 또는 자석 비드 상에 코팅하여, 모르포시스 HuCAL-GOLD Fab 파지 라이브러리와 인큐베이션할 수 있다. MN에 결합하지 않는 파지-결합 Fab를 상기 플레이트로부터 세척해 내면, MN에 결합된 파지만이 잔류한다. 티올 환원제, 예컨대 디티오트레이톨(DTT)을 부가하여 결합된 파지를 용출해내어, 파지에 결합된 항체의 디술피드 결합을 절단할 수 있다. 회수한 파지의 군집을 MN 결합 항체 단편을 발현하는 파지로 보강할 수 있고, 이. 콜라이(E. coli) 숙주에 감염시켜 증식시킬 수 있다. MN에 결합하는 파지-결합 항체의 군집을 더욱 보강하기 위해 보강된 파지의 군집을 이용하여 이러한 패닝(panning) 방법을 반복할 수 있다. 이어서, 표준 클로닝 기술을 이용하여 Fab를 코딩하는 유전자 서열을 잘라내고, 숙주 세포주, 예컨대 CHO 또는 이. 콜라이 발현 세포주를 형질전환하는데 사용되는 발현 벡터, 예컨대 박테리아 (예를 들어, 이. 콜라이) 발현 벡터, 또는 포유동물 발현 벡터에 전달할 수 있다. 이어서, 보강된 집합으로부터 Fab가 발현되어 정제될 수 있다.
별법으로, 항원으로서 MN 발현 세포를 이용하여 패닝을 수행할 수 있다. 예를 들어, MN 항원에 의해 형질감염된 세포를 바이오틴으로 표지화할 수 있다. 이어서, 이들 형질감염된 세포를 표지되지 않은 비-MN 형질감염된 세포와, 표지화된 것 대 표지화되지 않은 것의 1:10 비율로 혼합할 수 있다. 상기 파지 라이브러리를 상기 세포에 첨가하고, 바이오틴화하고, MN-보유 세포를 자석에 부착된 스트렙타비딘-결합 자석 비드로 포획한다. 비-특이적 파지를 세척해내고, 자기장을 제거하여 MN-보유 세포를 특이적으로 용출한다. 세포 패닝을 추가로 되풀이하여 이들 특이적으로 결합된 파지를 증식시킬 수 있거나, 펩티드 및/또는 단백질 패닝을 번갈아할 수 있다.
항체는 이하에 기재하는 바와 같이, 다양한 다른 기술로 생산할 수 있다. 예를 들면, 항체를 수득하기 위한 또다른 접근법은 Dower 등 (WO 91/17271, 참고문헌으로 도입됨) 및 McCafferty 등 (WO 92/01047) (이들 각각은 그 전체가 참고문헌으로 도입됨)이 기재한 바와 같이 B 세포로부터 DNA 라이브러리를 스크리닝하는 것이다. 이들 방법에서, 파지의 라이브러리는 그 구성원이 그들의 외부 표면 상에 상이한 항체를 디스플레이한 상태로 생산된다. 항체는 통상적으로 Fv 또는 Fab 단편으로서 디스플레이된다. 항체를 디스플레이한 파지는 선별된 단백질에 대한 결합의 친화도 보강에 의해 선별된다.
파지-디스플레이 방법의 변형에서, 선별된 뮤린 항체에 대한 결합 특이성을 갖는 인간 항체를 생산할 수 있다 (예를 들어, WO 92/20791, 참고문헌으로 도입됨). 이 방법에서, 선별된 뮤린 항체의 중쇄 또는 경쇄 가변 영역 (예를 들어, 5C7.29)을 출발 재료로서 사용할 수 있다. 예를 들어, 경쇄 가변 영역을 출발 재료로 선택한 경우, 동일한 경쇄 가변 영역 (즉, 뮤린 출발 재료) 및 상이한 중쇄 가변 영역을 디스플레이하는 구성원으로 파지 라이브러리를 구축할 수 있다. 중쇄 가변 영역은 재정렬된 인간 중쇄 가변 영역의 라이브러리로부터 수득할 수 있다. 단백질에 대해 강한 특이적 결합을 나타내는 파지 (예를 들어, 10 nM 이상 또는 1 nM 이상)를 선별한다. 이어서, 이 파지로부터의 인간 중쇄 가변 영역을 추가의 파지 라이브러리를 구축하기 위한 출발 재료로서 제공한다. 이 라이브러리에서, 각각의 파지는 동일한 중쇄 가변 영역 (즉, 첫 번째 디스플레이 라이브러리에서 동정된 영역) 및 상이한 경쇄 가변 영역을 디스플레이한다. 경쇄 가변 영역은 재정렬된 인간 가변 경쇄 영역의 라이브러리로부터 수득할 수 있다. 다시, 강한 특이적 결합을 나타내는 파지를 선별한다.
또다른 예로서, 트리오마 계통 분류법(trioma methodology)을 이용하여 항체를 또한 생산할 수 있다. 이러한 접근법에 사용하기 위한, 기본적인 접근법 및 예시가 되는 세포 융합 파트너, SPAZ-4가 Oestberg 등 (문헌 [Hybridoma 2:361-367, 1983]; 미국 특허 제4,634,664호, 이들 각각은 참고문헌으로 도입됨); 및 Engleman 등 (미국 특허 제4,634,666호, 참고문헌으로 도입됨)]에 의해 기재되어 있다. 이 방법에 의해 수득되는 항체-생산 세포주를 트리오마라 부르는데, 이는 이들이 3개의 세포 (2개는 인간 및 1개는 마우스)로부터 유래되었기 때문이다. 먼저, 마우스 골수종 주를 인간 B-림프구와 융합시켜 비-항체-생산 이종이식 하이브리드 세포, 예컨대 SPAZ-4 세포주를 수득한다. 이어서, 상기 이종이식 세포를 면역화된 인간 B-림프구와 융합시켜 항체-생산 트리오마 세포주를 수득한다. 트리오마는 인간 세포로 제조된 통상적인 하이브리도마에 비해 보다 안정적으로 항체를 생산하는 것이 확인되었다.
B-림프구는 인간 공여자의 혈액, 비장, 림프절 또는 골수로부터 수득된다. 단백질에 의한 살아있는 인간의 생체내 면역화는 유해한 반응을 일으킬 위험이 있기 때문에 통상적으로 바람직하지 않다. 따라서, B-림프구는 통상적으로 단백질 (예를 들어, MN) 또는 그의 항원 단편, 또는 상기 단백질 (예를 들어, MN)을 보유하는 세포에 의해 시험관내에서 면역화된다. 시험관내 면역화를 위해, 예시가 되는 뮤린 항체 중 하나에 결합하는 아미노산 세그먼트로 본질적으로 이루어진 특이적 에피토프 단편을 이용할 수 있다. B-림프구는 전형적으로 10％ 인간 혈청으로 보충된 RPMI-1640 (예를 들어, 미국 특허 제4,634,666호 참고)와 같은 배지 중에서 7 내지 14일의 기간 동안 항원에 노출된다.
면역화된 B-림프구는 당업계 공지의 방법으로 SPAZ-4와 같은 이종이식 하이브리드 세포에 융합시킬 수 있다. 예를 들면, 상기 세포를 MW 1,000 내지 4,000인 40 내지 50％ 폴리에틸렌 글리콜로 약 37℃에서 약 5 내지 10분 동안 처리할 수 있다. 세포를 융합 혼합물로부터 분리하고, 목적으로 하는 하이브리드 (예를 들어, HAT 또는 AH)를 선별하기 위해 배지 중에서 증식시킬 수 있다. 상기에서 비-인간 항체에 대해 논의한 것과 동일한 방법을 이용하여 단백질 (예를 들어, MN)에 결합하는 능력에 대해 트리오마 배양 배지를 검정함으로써, 요구되는 결합 특이성을 갖는 항체를 분비하는 클론을 동정할 수 있다. 목적으로 하는 특이성을 갖는 인간 항체를 생산하는 트리오마를, 예를 들면 제한 희석 기술로 서브클로닝하고, 배양 배지 중의 시험관내에서 성장시킬 수 있다.
트리오마가 유전적으로 안정하다 하더라도, 매우 높은 수준으로 항체를 생산하지 않을 수 있다. 트리오마로부터의 항체 유전자를 하나 이상의 발현 벡터로 클로닝하고, 상기 벡터로 세포주, 예컨대 재조합 또는 인간화된 이뮤노글로불린의 발현을 위한 세포주를 형질전환시킴으로써 발현 수준을 증가시킬 수 있다.
적어도 인간 이뮤노글로불린 유전자좌의 세그먼트를 코딩하는 이식 유전자를 가진 비-인간 트랜스제닉 포유동물로부터 단백질 (예를 들어, MN)과 교차-반응하는 인간 항체를 또한 생산할 수 있다. 통상적으로, 그러한 트랜스제닉 포유동물의 내생적 이뮤노글로불린 유전자좌는 기능적으로 불활성이다. 인간 이뮤노글로불린 유전자좌의 세그먼트에는 재정렬되지 않은 중쇄 및 경쇄 성분의 서열이 포함될 수 있다. 내생적 이뮤노글로불린 유전자의 불활성화 및 외생적 이뮤노글로불린 유전자의 도입 둘 다는 표적화된 상동 재조합, 또는 YAC 염색체의 도입으로 달성할 수 있다. 이러한 방법으로 생산된 트랜스제닉 포유동물은 이뮤노글로불린 성분 서열을 기능적으로 재정렬할 수 있고, 내생적 이뮤노글로불린 유전자의 발현 없이, 인간 이뮤노글로불린 유전자에 의해 코딩된 다양한 이소타입의 항체 레퍼토리를 발현할 수 있다. 이러한 특성을 갖는 포유동물의 생산 및 특성은, 예를 들면 Lonberg 등 (WO 93/12227); 및 Kucherlapati (WO 91/10741) (이들 각각은 그 전체가 참고문헌으로 도입됨)가 상세하게 기재한다. 교차-반응성 MN 인간 항체는 상기에서 언급한 바와 같이 트랜스제닉 비-인간 포유동물을 면역화함으로써 수득할 수 있다. 모노클로날 항체는, 예를 들면 종래의 쾰러-밀스테인 기술 (Kohler and Milstein, 문헌 [Nature 256:495-497, 1975], 참고문헌으로 도입됨)을 이용하여 그러한 포유동물의 B-세포를 적합한 골수종 세포주에 융합시킴으로써 제조할 수 있다.
다양한 면역화 전략을 이용하여 단백질 (예를 들어, MN)과 교차-반응하는 마우스 또는 다른 비-인간 항체를 수득할 수 있다. 일부 전략에서, 비-인간 동물 (통상적으로 비-인간 포유동물, 예컨대 마우스)을 MN 항원으로 면역화할 수 있다. 면역원에는 MN에 의해 안정하게 형질감염되어 그의 세포 표면에 MN을 발현하는 세포, 및 예시가 되는 교차-반응성 항체에 결합하는 분자의 세그먼트를 함유하는 MN 단백질 또는 에피토프 단편이 포함될 수 있다. MN에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하기 위해, 면역화된 동물로부터 수득한 항체-생산 세포를 불멸화시키고 선별할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, C.S.H.P., N.Y., 1988], 참고문헌으로 도입됨). 결합은, 예를 들면 두 번째 표지를 보유한 적절한 2차 항체를 이용하여 검출할 수 있다. 이어서, 교차-반응성 항체에 대해 MN 발현 세포에 대한 선택적인 세포성 세포독성을 감독하는 그들의 능력을 추가로 스크리닝할 수 있다.
본 발명은 또한 선별된 마우스 또는 다른 비-인간 항체에 대해 유사한 결합 특이성 및 친화도를 갖는 인간화된 항체에 관한 것이다. 재조합 DNA 기술 (예를 들어, 문헌 [Queen, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:10029-10033,1989]; WO 90/07861; 이들 각각은 그 전체가 참고문헌으로 도입됨), 즉 CDR 이식법에 의해 비-인간 항체의 CDR 영역 (예를 들어, CDR1, CDR2, 및 CDR3)을 인간 프레임워크 및 불변 영역에 결합시킴으로써 인간화된 항체를 형성할 수 있다. 이들 인간화된 이뮤노글로불린은 실질적으로 인간 이뮤노글로불린 유래의 가변 영역 프레임워크 잔기 (수혜자 이뮤노글로불린이라고 함) 및 실질적으로 마우스 이뮤노글로불린 유래의 상보성 결정 영역 (CDR) (공여자 이뮤노글로불린이라고 함)을 가진다. 불변 영역(들)이 존재하는 경우, 이 또한 실질적으로 인간 이뮤노글로불린 유래의 것일 수 있다.
원칙적으로, 임의의 인간 항체 유래의 프레임워크 서열은 CDR 이식법을 위한 주형으로 제공될 수 있다. 그러나, 그러한 프레임워크에의 직접적인 CDR 교체는 종종 항원에 대한 결합 친화도의 유의한 손실을 야기함이 입증되었다 (문헌 [Glaser, et al., J. Immunol. 149:2606, 1992]; [Tempest, et al., Biotechnology 9:266, 1992]; [Shalaby, et al., J. Exp. Med. 17: 217, 1992]). 인간 항체가 본래의 뮤린 항체와 보다 상동성일수록, 뮤린 CDR과 인간 프레임워크의 결합에 의해 친화도를 감소시킬 수 있는 왜곡이 CDR에 덜 도입될 것이다. 따라서, 인간화된 항체 가변 영역 프레임워크와 공여자 항체 가변 영역 프레임워크 사이의 상동성 (즉, 백분율 서열 동일성)은 바람직하게는 적어도 약 65％, 보다 바람직하게는 적어도 약 75％, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 85％, 및 더욱 보다 더 바람직하게는 약 95％ 또는 약 99％일 것이 제안된다.
중쇄 및 경쇄 가변 영역 프레임워크 잔기는 동일한 또는 상이한 인간 항체 서열로부터 유래될 수 있다. 그러나, 동일한 인간 항체로부터 선택된 중쇄 및 경쇄 프레임워크 서열은 2 쇄의 조립에 있어서 불화합 가능성을 감소시킨다. 인간 항체 서열은 자연 발생 인간 항체의 서열일 수 있거나, 또는 몇몇 인간 항체의 콘센서스 서열일 수 있다 (예를 들어, WO 92/22653, 참고문헌으로 도입됨). CDR 배열 및/또는 항원에의 결합에 그들이 미칠 수 있는 영향을 기초로 하여, 치환을 위해 인간 가변 영역 프레임워크 잔기로부터 특정 아미노산을 선별할 수 있다. 그러한 영향의 분석은 특정 위치의 아미노산의 특징의 조사, 또는 특정 아미노산의 치환 또는 돌연변이 유발 효과의 실험적 관찰을 설계함으로써 수행할 수 있다.
예를 들면, 뮤린 가변 영역 프레임워크 잔기와 선별된 인간 가변 영역 프레임워크 잔기 사이의 아미노산이 서로 상이할 경우, 인간 프레임워크 아미노산을 마우스 항체 유래의 등가의 프레임워크 아미노산으로 치환할 수 있고, 이때 상기 아미노산은
(1) 항원에 직접 접촉하거나,
(2) 서열 중 CDR 영역에 인접하거나,
(3) 다른 방법으로 CDR 영역과 상호작용하는 것 (예를 들어, CDR 영역의 약 4 내지 6Å 이내)으로 합리적으로 기대되는 것이다.
치환을 위한 다른 후보자는, 예를 들면 그 위치의 인간 이뮤노글로불린이 통상적인 것이 아닌 수혜자 인간 프레임워크 아미노산이다. 이들 아미노산은 공여자 항체의 동등한 위치 또는 보다 전형적인 인간 이뮤노글로불린의 동등한 위치 유래의 아미노산으로 치환될 수 있다. 인간화된 이뮤노글로불린의 가변 영역 프레임워크는 인간 가변 영역 프레임워크 서열 또는 그러한 서열의 콘센서스에 대해, 예를 들면 바람직하게 적어도 약 85％ 서열 동일성, 보다 바람직하게 적어도 약 90％ 서열 동일성, 보다 더 바람직하게 적어도 약 95％ 서열 동일성, 및 더욱 보다 더 바람직하게 적어도 약 99％ 서열 동일성을 나타낼 수 있다.
본 발명은 또한 단백질 (예를 들면, MN)에 특이적으로 결합하는 첫 번째 결합 부위 및 두 번째 잔기에 특이적으로 결합하는 두 번째 결합 부위를 가지는 이중특이적 또는 이중기능적 항체에 관한 것이다. 이중특이적 항체에서, 하나의 중쇄 및 경쇄 쌍은 통상적으로, 예를 들면 MN 결합 항체 유래의 것이고, 다른 쌍은 또다른 에피토프에 대해 생성된 항체 유래의 것이다. 이것은 다중-기능적 결합가, 즉 적어도 두 개의 상이한 에피토프에 동시에 결합할 수 있는 능력을 야기한다.
결합 검정
본 발명의 항체 또는 항체 단편과 본 발명의 항원 (MN 단백질) 사이의 결합 (또는 친화도)의 강도를 기재하기 위해 임의의 유용한 방법을 이용할 수 있다. 예를 들면, 당업계 공지인 표준 반응 속도 분석에 의해 해리 상수, Kd (Kd = k2/k1 = [항체][항원]/[항체-항원 복합체])를 판단할 수 있다. 해리 상수는 복합체를 분리시키는 것이 얼마나 용이한지에 관하여 항체 및 항원 사이의 결합 강도를 나타내는 것이라고 당업자에게 인식될 것이다. 복합체를 형성하는데 고 농도의 항체 및 항원이 필요할 경우, 결합의 강도 또는 친화도는 낮고, 그 결과 Kd는 보다 높다. Kd (농도 단위로 표현됨, 예를 들어 몰 또는 나노몰)가 작을수록 결합은 보다 강하다.
예를 들면, 효소-결합 면역특이적 검정 (ELISA), 2분자 상호작용 분석 (BIA) (예를 들어, 문헌 [Sjolander and Urbaniczky, Anal. Chem. 63:2338 2345, 1991]; [Szabo, et al., Curr. Opin. Struct. Biol. 5:699 705, 1995], 이들 각각은 본원에 참고문헌으로 도입됨), 및 MN을 발현하는 세포에 결합하는 항체의 정량을 위한 형광-활성 세포 분류 (FACS)를 포함하여, 다양한 공지의 기술 및 면역검정법으로 친화도를 평가하고/거나 측정할 수 있다. BIA는 임의의 반응물을 표지하지 않고, 실시간으로 생물특이적 상호작용을 분석하는 기술이다 (예를 들어, BIAcoreTM). BIAcore는 생물학적 분자, 예컨대 본 발명의 항체와 MN 단백질 항원 사이의 실시간 상호작용에 있어서, 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 광학 현상의 변화를 판단하는 것을 기초로 한다. BIAcore 기술과 관련된 참고문헌은 미국 공개공보 제: 2006/0223113, 2006/0134800, 2006/0094060, 2006/0072115, 2006/0019313, 2006/0014232, 및 2005/0199076호에서 추가로 찾아볼 수 있고, 이들 각각은 참고문헌으로 그 전체가 본원에 도입된다.
단백질 (예를 들어, MN)에 특이적으로 결합하는 본 발명의 항체 또는 항원 결합 항체 단편은, 다른 단백질을 면역화학적 검정에 사용할 경우에 제공되는 검출 신호에 비해, 예를 들면 바람직하게는 적어도 약 5배, 보다 바람직하게는 적어도 약 10배, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 20배 높은 검출 신호를 제공한다. 따라서, 이들 항체는 용액으로부터 단백질 (예를 들어, MN)을 면역침강시키는데 사용할 수 있다.
당업계 공지의 임의의 적합한 방법으로 본 발명의 항체 및 단편의 면역특이적 결합 (또는, 본원에서 정의하는 "특이적으로 면역반응성인" 결합)을 검정할 수 있다. 항체 및 항원을 포함하는 검정은 "면역검정"으로 공지되어 있고, 본 발명의 항체 및 항원 모두의 특성을 결정하기 위해 본 발명에서 채택할 수 있다. 사용가능한 면역검정에는 웨스턴 블롯, 방사성면역검정, ELISA (효소 결합 면역흡수 검정), "샌드위치" 면역검정, 면역침강 검정, 침전 반응, 겔 확산 침전 반응, 면역확산 검정, 응집 검정, 보체-결합 검정, 면역방사계수 검정, 형광 면역검정, 단백질 A 면역검정 등과 같은 기술을 이용한 경쟁적 및 비-경쟁적 검정 시스템이 포함되지만, 이것으로 제한되는 것은 아니다. 상기 검정은 일상적이며 당업계에 널리 공지되어 있고 (예를 들어, 문헌 [Ausubel et al., eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York] 참고, 이것은 그 전체가 본원에 참고문헌으로 도입됨), 과도한 실험을 하지 않고도 수행할 수 있다. 예시가 되는 면역검정을 아래에 간략하게 기재한다 (그러나 제한하고자 하는 의도는 아님).
면역침강 프로토콜은 일반적으로, 단백질 포스파타제 및/또는 프로테아제 억제제 (예를 들어, EDTA, PMSF, 아프로티닌, 바나드산 나트륨)가 보충된 용해 완충제, 예컨대 RIPA 완충제 (1％ NP-40 또는 트리톤 X-100, 1％ 데옥시콜린산 나트륨, 0.1％ SDS, 0.15 M NaCl, 0.01 M 인산 나트륨 pH 7.2, 1％ 트라시롤) 중에서 세포의 군집을 용해하고, 상기 세포 용해물에 관심 항체를 첨가하고, 4℃에서 시간 (예를 들어, 14시간) 동안 인큐베이션하고, 상기 세포 용해물에 단백질 A 및/또는 단백질 G 세파로스 비드를 첨가하고, 약 1시간 이상 4℃에서 인큐베이션하고, 용해 완충제 중에서 비드를 세척하고, 상기 비드를 SDS/샘플 완충제에 재현탁시키는 것을 포함한다. 관심 항체가 특정 항원을 면역침강시키는 능력은, 예를 들면 웨스턴 블롯 분석으로 평가할 수 있다. 당업자는 항원에 대한 항체의 결합을 증가시키고, 백그라운드를 감소시키기 위해 개조할 수 있는 파라미터를 알고 있을 것이다 (예를 들면, 세파로스 비드로 세포 용해물을 사전 보증하는 것). 면역침강 프로토콜에 관한 추가의 논의는, 예를 들면 문헌 [Ausubel et al., eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York at 10.16.1]을 참고하고, 이것은 본원에 참고문헌으로 도입된다.
웨스턴 블롯 분석은 일반적으로 단백질 샘플을 준비하고, 상기 단백질 샘플을 폴리아크릴아미드 겔에서 전기영동하고 (예를 들어, 항원의 분자량에 의존하여 8％ 내지 20％ SDS-PAGE), 상기 폴리아크릴아미드 겔로부터 단백질 샘플을 니트로셀룰로스, PVDF 또는 나일론과 같은 막으로 옮기고, 상기 막을 저지 용액 (예를 들어, 3％ BSA 함유 PBS 또는 무지방 유액) 중에서 저지시키고, 상기 막을 세척 완충제 (예를 들어, PBS-Tween 20) 중에서 세척하고, 상기 막을 저지 완충제 중에 희석된 1차 항체 (관심 항체)로 저지시키고, 상기 막을 세척 완충제 중에서 세척하고; 상기 막을 저지 완충제 중에 희석된 효소적 기질 (예를 들면, 양고추냉이 퍼옥시다제 또는 알칼리성 포스파타제) 또는 방사성 분자 (예를 들면, 32P 또는 125I)에 접합된 2차 항체 (1차 항체를 인식함, 예를 들어, 항-인간 항체)로 저지시키고, 상기 막을 세척 완충제 중에서 세척하고, 항원의 존재를 검출하는 것을 포함한다. 당업자는 검출되는 신호를 증가시키고, 백그라운드 노이즈를 감소시키기 위해 개조할 수 있는 파라미터를 알고 있을 것이다. 웨스턴 블롯 프로토콜에 관한 추가의 논의는, 예를 들어 문헌 [Ausubel et al., eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York at 10.8.1]을 참고하고, 이것은 본원에 참고문헌으로 도입된다.
ELISA는 전형적으로 항원을 준비하고, 96 웰 미세역가 플레이트의 웰을 상기 항원으로 코팅하고, 검출가능한 화합물, 예컨대 효소적 기질 (예를 들면, 양고추냉이 퍼옥시다제 또는 알칼리성 포스파타제)에 접합된 관심 항체를 상기 웰에 첨가하고, 소정 시간동안 인큐베이션하고, 항원의 존재를 검출하는 것을 포함한다. ELISA에서 관심 항체는 검출가능한 화합물에 접합되는 것이어서는 안되고, 대신, 검출가능한 화합물에 접합된 2차 항체 (관심 항체를 인식함)를 상기 웰에 첨가할 수 있다. 추가로, 상기 웰을 항원으로 코팅하는 대신, 항체를 상기 웰에 코팅할 수 있다. 이 경우, 코팅된 웰에 관심 항원을 첨가하는 것에 이어, 검출가능한 화합물에 접합된 2차 항체를 첨가할 수 있다. 당업자는 검출되는 신호를 증가시키기 위해 개조할 수 있는 파라미터 뿐만 아니라, 당업계 공지의 ELISA의 다른 변형예에 대해 알고 있을 것이다. ELISA에 관한 추가의 논의는, 예를 들어 문헌 [Ausubel et al., eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York at 11.2.1]을 참고하고, 이것은 본원에 참고문헌으로 도입된다.
일 측면에서, 본 발명은 모르포시스 HuCAL GOLD Fab 라이브러리를 스크리닝하는 것에 의해 동정된 MN 결합 특징을 가진 다수의 상이한 항체를 포함한다. 본 발명의 일 측면에서, 인간 항체의 VH 영역의 3개의 CDR 아미노산 서열이 동정되었다 (서열 57 내지 85; 도 2). 본 발명의 또다른 실시양태에서는, 인간 MN 항체의 VL 영역의 3개의 CDR 아미노산 서열이 동정되었다 (서열 86 내지 112; 도 2). 본 발명은 또한 CDR, 프레임워크, 및 VH/VL 쌍의 조합에 관한 것이다. 그러한 조합의 일례를 도 3 (뉴클레오티드 서열을 코딩하는 것으로 서열 113 내지 132) 및 도 4 (단백질 서열로서 서열 133 내지 152)에 도시한다. MN에 결합하는 항체를 또한 도 4에 도시한다. 스크리닝 방법의 상세한 사항은 본원에서 기재하는 실시예에 기재되어 있다. 당업자는 고도로 활성인 특이적 항체 또는 항체 단편에 대한 다른 선별 방법을 의도할 수 있고, 인간 MN 항체를 동정하는데 사용할 수 있다.
본 발명의 항체 및/또는 항원 결합 항체 단편은 또한 항체-코딩 발현 구축물로 형질감염시킨 숙주 세포를 포함해서, 항체를 발현하는 임의의 세포로부터 정제할 수 있다. 상기 숙주 세포는 항체가 발현되는 조건 하에서 배양할 수 있다. 당업계에 널리 공지된 방법을 이용하여 정제된 항체 및/또는 항원 결합 항체 단편을, 세포 내에서 항체와 회합되어 있을 수 있는 다른 세포 성분, 예컨대 특정 단백질, 탄수화물, 또는 지질로부터 분리할 수 있다. 그러한 방법에는 크기 배제 크로마토그래피, 황산 암모늄 유안분획, 이온 교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피, 및 예비 겔 전기영동이 포함되지만, 이것으로 제한되는 것은 아니다. 제제의 순도는 당업계 공지의 임의의 방법, 예컨대 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 평가할 수 있다. 정제된 항체 제제는 하나의 유형 이상의 항체 (예를 들어, MN 결합 및 중화 특징을 가진 항체)를 함유할 수 있다.
별법으로, 항체의 아미노산 서열 또는 항체 서열 (예를 들어 CDR 서열)의 일부를 합성하기 위해, 화학적 방법, 예컨대 고상 기술을 이용한 직접 펩티드 합성법을 이용하여 항체를 생산할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149 2154, 1963]; [Roberge, et al., Science 269:202 204, 1995], 이들 각각은 본원에 참고문헌으로 도입됨). 단백질 합성은 수동 기술을 이용하거나 또는 자동조작에 의해 수행할 수 있다. 자동 합성은, 예를 들면 어플라이드 바이오시스템스 431A 펩티드 신테사이저 (Applied Biosystems 431A Peptide Synthesizer, 퍼킨 엘머 사 제)를 이용하여 달성할 수 있다. 임의로, 항체의 단편을 개별적으로 합성하고, 화학적 방법으로 조합하여, 전장 분자를 생산할 수 있다.
예를 들면, 종래의 항체 생산법 (예를 들어, 동물 면역화 방법), 모노클로날 생산법, 또는 재조합 DNA 방법에 의한 것을 포함해서, 본원에 기재된 임의의 방법으로 본 발명에 따른 항체 또는 단편을 동정하거나 수득한 경우, 상기 항체를 특징화 및/또는 정제 및/또는 개조하기 위한 추가의 단계를 수행하는 것이 바람직할 것이다. 예를 들면, 면역반응성 항체 단편을 제조하거나, 동정된 목적으로 하는 항체의 정제된 고-역가의 조성물을 제조하거나, 또는 동정된 항체 또는 그의 단편에 대해 면역반응성을 테스트하는 것이 바람직할 수 있다. 본 발명은 본 발명의 항체를 특징화, 정제 또는 검정하기 위한 임의의 공지의 적합한 방법을 의도하고 있으며, 본 발명이 속하는 분야의 당업자가 과도한 실험을 하지 않고 본 발명의 항체를 임의로 추가로 특징화, 정제 및/또는 검정하는데 필요한 수준의 기술적 노-하우 및 자원, 예를 들면 기술 매뉴얼 또는 전문 서적을 가지고 있을 것이라 기대한다.
특정 측면에서, 본 발명의 항체 및/또는 항체 단편을 널리 공지된 방법으로 재조합 세포 배양물로부터 회수 및 정제할 수 있고, 그러한 방법에는 단백질 A 정제, 황산 암모늄 또는 에탄올 침강법, 산 추출법, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포셀룰로스 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피, 수산화아파타이트 크로마토그래피 및 렉틴 크로마토그래피가 포함되지만, 이것으로 제한되는 것은 아니다. 정제를 위해 고성능 액체 크로마토그래피 ("HPLC")를 또한 채택할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Colligan, Current Protocols in Immunology], 또는 [Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, N.Y., (1997 2001)]의, 예를 들어, 챕터 1, 4, 6, 8, 9, 10을 참고하고, 이들 각각은 그 전체가 본원에 참고문헌으로 도입된다.
항체에 관한 내용 중 용어 "단리"란 항체를 정제하기 위한 당업계 공지의 임의의 방법을 말한다. 항체를 정제하기 위한 방법은 당업계에 널리 공지되어 있고, 본 발명은 당업자에게 공지이며 과도한 실험을 요구하지 않는 임의의 적합한 방법을 의도한다. 예를 들면, 크로마토그래피적 방법, 예컨대 면역-친화도 크로마토그래피 (관심 항체를 결합 및 포획하기 위한 고정화된 리간드), 친화도 크로마토그래피, 단백질 침강법, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 크기-배제 크로마토그래피 외에도 전기 영동을 기술 문헌, 예를 들면 문헌 [Methods in Enzymology, Volume 182, Guide to Protein Purification, Eds. J. Abelson, M. Simon, Academic Press, 1st Edition, 1990]에 기재된 것으로부터 찾아볼 수 있고, 이것은 본원에 참고문헌으로 도입된다. 따라서, 정제 단계, 예컨대 크로마토그래피적 단계를 수행하는데 적합한 재료는 당업자에게 알려져 있다. 상기 방법들은 본원에 기재한 바와 같은 본 발명에 따른 임의의 항체, 항원 또는 그의 임의의 단편을 정제하는데 적합하다.
특정 실시양태는 숙주 세포 또는 그의 일부로부터 발현된 단백질 또는 항체 또는 그의 단편을 정제 또는 단리하는 것을 요구할 수 있다. 본 발명은 형질전환된 숙주 세포로부터 재조합 단백질을 단리하는 종래의 절차를 의도한다. 그러한 방법에는, 예를 들면, 먼저 세포 펠렛 또는 세포 배양 배지로부터 추출한 후, 염석하는 것에 의한 관심 단백질 또는 단편의 단리가 포함되고, 재조합 단백질 또는 단편을 단리하기 위해 수성 이온 교환 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피 단계, 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC), 및 친화도 크로마토그래피를 포함한 하나 이상의 크로마토그래피 단계를 이용할 수 있다. 단백질 정제를 위한 절차에 있어서의 가이던스를, 예를 들면 문헌 [Methods in Enzymology, Volume 182, Guide to Protein Purification, Eds. J. Abelson, M. Simon, Academic Press, 1st Edition, 1990]을 포함한 기술 문헌에서 찾아볼 수 있고, 이것은 이미 참고문헌으로 도입되었다.
화학적으로-합성된 분자는 예비적인 고성능 액체 크로마토그래피로 실질적으로 정제할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Creighton, Proteins: Structures and Molecular Principles, WH Freeman and Co., New York, N.Y., 1983]을 참고하고, 본원에 참고문헌으로 도입됨). 합성 폴리펩티드 조성물은 아미노산 분석 또는 서열 분석에 의해 확인할 수 있다 (예를 들어, 에드만(Edman) 분해를 이용).
폴리뉴클레오티드
또다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 항체 (예를 들어, MN에 대한 항체) 또는 항원 결합 항체 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 이들 폴리뉴클레오티드는, 예를 들면 치료 또는 진단 용도를 위한 양의 항체를 생성하거나 또는 본 발명의 면역검정에 사용하기 위한 항체 또는 단편의 샘플을 생성하는데 사용될 수 있다.
예를 들면, 항체 VH 영역 내의 3 가지 CDR을 각각 코딩하는데 사용될 수 있는 폴리뉴클레오티드는 서열 1 내지 29로 기재되어 있다. 예를 들면, 항체 VL 영역 내의 3 가지 CDR을 각각 코딩하는데 사용될 수 있는 폴리뉴클레오티드는 서열 30 내지 56으로 기재되어 있다. 예를 들면, 항체의 완전한 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열 113 내지 132로 기재되어 있다 (도 3).
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 또한 당업계에 공지된 임의의 방법 또는 적합한 방법에 따라 막 성분, 단백질 및 지질과 같은 다른 세포 성분 없이 숙주 세포로부터 단리될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 표준 핵산 정제 기술을 이용하여 단리될 수 있거나 또는 중합효소 연쇄 반응 (PCR)과 같은 증폭 기술 또는 자동 합성 장치를 이용하여 합성될 수 있다. 폴리뉴클레오티드의 단리 방법은 통상적인 것으로, 당업계에 공지되어 있다. 이와 같은 임의의 폴리뉴클레오티드 수득 기술은 본 발명의 항체를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 수득하는데 이용될 수 있다. 예를 들어, 제한 효소 및 프로브는 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 단리하는데 사용될 수 있다.
항체-코딩 cDNA 분자는 주형으로 mRNA를 사용하고, 표준 분자 생물학 기술을 이용하여 제조할 수 있다. 그 후에, cDNA 분자는 당업계에 공지되어 있으며 삼브룩(Sambrook) 등의 문헌 [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Cold Spring Harbor, N.Y.; 1989, Vol. 1-3] (본원에 참고로 포함됨)의 것과 같은 메뉴얼에 개시된 분자 생물학 기술을 이용하여 복제할 수 있다. PCR과 같은 증폭 기술을 이용하여 추가의 폴리뉴클레오티드 카피를 수득할 수 있다.
별법으로, 합성 화학 기술을 이용하여 본 발명의 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 합성할 수 있다. 유전자 코드의 동의성은, 예를 들면 VH-CDR1, VH-CDR2, VH-CDR3, VL-CDR1, VL-CDR2, VL-CDR3, 완전한 VH 또는 완전한 VL 아미노산 서열 (예를 들어, 서열 57 내지 112 및 133 내지 152) 중 하나를 갖는 항체를 코딩하는 다른 뉴클레오티드 서열이 합성되도록 한다.
항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현을 위해, 폴리뉴클레오티드는 삽입된 코딩 서열의 전사 및 번역에 필요한 요소를 함유하는 발현 벡터에 삽입될 수 있다. 당업자에게 잘 알려진 방법을 이용하여 항체를 코딩하는 서열 및 적절한 전사 및 번역 제어 요소를 함유하는 발현 벡터를 구축할 수 있다. 이들 방법은 시험관내 재조합 DNA 기술, 합성 기술 및 생체내 유전자 재조합을 포함한다. 이러한 기술은, 예를 들면 문헌 [Sambrook, et al. (1989)] 및 [Ausubel, et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley ＆ Sons, New York, N.Y., 1995] (본원에 참고로 포함됨)에 기재되어 있다.
다양한 발현 벡터/숙주 시스템이 항체를 코딩하는 서열의 함유 및 발현에 이용될 수 있다. 이들은 미생물, 예컨대 재조합 박테리오파지, 플라스미드 또는 코스미드 DNA 발현 벡터로 형질전환된 박테리아; 효모 발현 벡터로 형질전환된 효모; 바이러스 발현 벡터 (예를 들어, 바쿨로바이러스)로 감염된 곤충 세포 시스템; 바이러스 발현 벡터 (예를 들어, 꽃양배추 모자이크 바이러스, CaMV; 담배 모자이크 바이러스, TMV)로 형질전환된 식물 세포 시스템; 또는 박테리아 발현 벡터 (예를 들어, Ti 또는 pBR322 플라스미드), 또는 동물 세포 시스템을 포함하나, 이들로 한정되지는 않는다.
제어 요소 또는 조절 서열은 전사 및 번역을 수행하는 숙주 세포 단백질과 상호작용하는 벡터의 비-번역 영역 (인핸서, 프로모터, 5' 및 3' 비번역 영역)에 있다. 이러한 요소는 강점 및 특이성이 다양할 수 있다. 사용되는 벡터 시스템 및 숙주에 따라, 구성적 및 유도가능한 프로모터를 비롯한 임의의 수의 적합한 전사 및 번역 요소가 사용될 수 있다. 예를 들어, 박테리아 시스템에서 클로닝하는 경우, BLUESCRIPT 파지미드 (스트라타진(Stratagene), 미국 캘리포니아주 라졸라 소재), pSPORT1 플라스미드 (라이프 테크놀로지스(Life Technologies)) 등의 하이브리드 lacZ 프로모터와 같은 유도가능한 프로모터가 사용될 수 있다. 바쿨로바이러스 폴리헤드린 프로모터는 곤충 세포에 사용될 수 있다. 식물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터 또는 인핸서 (예를 들어, 열 충격, RUBISCO 및 보관 단백질 유전자) 또는 식물 바이러스로부터 유래된 프로모터 또는 인핸서 (예를 들어, 바이러스 프로모터 또는 리더 서열)는 벡터에 클로닝될 수 있다. 포유동물 세포 시스템에서, 포유동물 유전자 또는 포유동물 바이러스로부터의 프로모터, 예를 들어 CMV 프로모터가 사용될 수 있다. 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 다수의 카피를 함유하는 세포주의 생성이 필요한 경우, SV40 또는 EBV 기재의 벡터가 적절한 선별가능한 마커와 함께 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명은 또한 본 발명의 단리된 핵산 분자 (예를 들어, 서열 113 내지 132의 중쇄 및 경쇄 가변 영역)를 포함하는 재조합 벡터, 재조합 벡터로 유전자 조작된 숙주 세포, 및 본 발명의 재조합 항체 또는 이들의 단편의 생성 및/또는 발현에 관한 것이다.
발현 구축물은 전사 개시, 종결 부위, 및 전사 영역에서 전사를 위한 리보솜 결합 부위를 더 함유할 수 있다. 구축물에 의해 발현되는 성숙한 전사체의 코딩 부분은 전사될 mRNA의 말단에 적절하게 위치한 전사 개시 (시작 부분) 및 종결 코돈 (예를 들어, UAA, UGA 또는 UAG)을 더 포함할 수 있으며, 포유동물 또는 진핵 세포 발현에는 UAA 및 UAG가 바람직하다.
발현 벡터는 또한 하나 이상의 선별가능한 마커를 포함할 수 있다. 이러한 마커는 포유동물 세포 마커, 예컨대 메토트렉세이트 (MTX), 디히드로폴레이트 리덕타제 (DHFR) (예를 들어, 미국 특허 제4,399,216호; 동 제4,634,665호; 동 제4,656,134호; 동 제4,956,288호; 동 제5,149,636호; 및 동 제5,179,017호 (이들은 각각 본원에 참고로 포함됨) 참조), 암피실린, 네오마이신 (G418), 미코페놀산, 또는 글루타민 신테타제 (GS) (예를 들어, 미국 특허 제5,122,464호; 동 제5,770,359호; 동 제5,827,739호 (이들은 각각 본원에 참고로 포함됨) 참조), 및 박테리아 세포 마커, 예컨대 테트라사이클린 또는 암피실린 내성 유전자를 포함하나, 이들로 한정되지는 않는다. 상기 기재된 숙주 세포에 적절한 배양 배지 및 조건은 당업계에 공지되어 있다. 적합한 벡터는 당업자에게 용이하게 명백해질 것이다.
본 발명의 DNA, 예를 들어 서열 113 내지 132의 하나 이상의 항체-코딩 서열을 함유하는 DNA 발현 벡터를 숙주 세포에 도입하기에 적합한 임의의 공지된 방법이 이용될 수 있다. 일부 공지된 방법은 인산칼슘 형질감염, DEAE-덱스트란 매개성 형질감염, 양이온성 지질-매개성 형질감염, 전기천공, 형질도입, 감염 또는 다른 공지된 방법을 포함한다. 이러한 방법은 당업계에 기재되어 있으며, 예컨대 문헌 [Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Cold Spring Harbor, N.Y.; 1989) Vol. 1-3, Chapters 14, 16 and 18]에 기재되어 있다.
당업자는 본 발명의 항체 또는 이들의 일부를 코딩하는 핵산의 발현에 이용가능한 다수의 발현 시스템에 대한 지식을 가지고 있을 수 있다.
본 발명의 항체 또는 항체 단편의 생성에 유용한 세포 배양물의 예는 포유동물 세포이다. 포유동물 세포 시스템은 단일층 세포 형태일 수도 있으나, 포유동물 세포 현탁액 또는 생물반응기도 사용될 수 있다. 온전한 글리코실화 단백질을 발현시킬 수 있는 다수의 적합한 숙주 세포주가 당업계에 개발되어 있으며, CHO, CHO-S, COS-1 (예를 들어, ATCC CRL 1650), COS-7 (예를 들어, ATCC CRL-1651), HEK293, BHK21 (예를 들어, ATCC CRL-10), CHO (예를 들어, ATCC CRL 1610) 및 BSC-1 (예를 들어, ATCC CRL-26) 세포주, Cos-7 세포, CHO 세포, hep G2 세포, P3X63Ag8.653, SP2/0-Ag14, 293 세포, HeLa 세포 등을 포함하고, 이들은 예를 들면 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (American Type Culture Collection)으로부터 용이하게 입수가능하다.
이들 세포에 대한 발현 벡터는 복제 원점; 프로모터 (예를 들어, 후기 또는 초기 SV40 프로모터, CMV 프로모터 (예를 들어, 미국 특허 제5,168,062호; 동 제5,385,839호), HSV tk 프로모터, pgk (포스포글리세레이트 키나제) 프로모터, EF-1 α 프로모터 (미국 특허 제5,266,491호), 이뮤노글로불린 프로모터; 인핸서, 및/또는 프로세싱 정보 부위, 예컨대 리보솜 결합 부위, RNA 스플라이스 부위, 폴리아데닐화 부위 (예를 들어, SV40 거대 T Ag 폴리 A 첨가 부위), 및 전사 터미네이터 서열 등과 같은 발현 제어 서열을 하나 이상 포함할 수 있다. 본 발명의 핵산 또는 단백질의 생성에 유용한 다른 세포는 공지되어 있고/거나, 예를 들면 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션의 세포주 및 하이브리도마 카달로그 또는 공지되어 있거나 또는 상업적인 다른 공급원으로부터 입수가능하다.
진핵 숙주 세포가 사용되는 경우, 폴리아데닐화 또는 전사 터미네이터 서열이 벡터에 혼입될 수 있다. 터미네이터 서열의 예는 소 성장 호르몬 유전자로부터의 폴리아데닐화 서열이다. 전사체의 정확한 스플라이싱을 위한 서열이 또한 포함될 수 있다. 스플라이싱 서열의 예는 SV40으로부터의 VP1 인트론이다 (문헌 [Sprague, et al., J. Virol. 45:773 781 (1983)]). 추가로, 숙주 세포에서 복제를 제어하는 유전자 서열은 당업계에 공지된 바와 같이 벡터에 혼입될 수 있다.
항체 제조를 비롯한 본원에 유용한 추가의 분자 생물학 기술을 기재하고 있는 일반적 문헌은 [Berger and Kimmel (Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, Vol. 152, Academic Press, Inc.)]; [Sambrook, et al., (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Cold Spring Harbor, N.Y.; 1989) Vol. 1-3)]; [Current Protocols in Molecular Biology, (F. M. Ausabel et al. [Eds.], Current Protocols, a joint venture between Green Publishing Associates, Inc. and John Wiley ＆ Sons, Inc. (supplemented through 2000))]; [Harlow et al., (Monoclonal Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988), Paul [Ed.])]; [Fundamental Immunology, (Lippincott Williams ＆ Wilkins (1998))]; 및 [Harlow, et al., (Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1998))] (이들은 모두 본원에 참고로 포함됨)을 포함한다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 또한 환자 샘플에서 MN 단백질의 수준을 측정하기 위한 정량적인 면역검정의 용도에 관한 것이다. 다수의 포맷이 본 발명의 방법을 이용하기에 적합할 수 있다. 예를 들면, 환자 샘플에서의 MN 단백질의 검출 및 정량화는 당업계에 통상적으로 공지된 다른 검정법 중에서 효소-연결 면역흡착 검정, 방사성면역검정, 이중 항체 샌드위치 검정, 응집 검정, 형광 면역검정, 면역전자 및 스캐닝 현미경에 의해 수행될 수 있다. 이러한 검정에서 MN 단백질의 정량화는 당업계에 공지된 통상적인 방법에 의해 적합해질 수 있다. 한 실시양태에서, 순환 MN 단백질 수준의 일련의 변화는 캡쳐 항체가 통상적인 기술을 이용하여 지지체의 표면 상에 고정되는 샌드위치 검정에 의해 검출 및 정량화될 수 있다.
적합한 지지체는, 예를 들면 합성 중합체 지지체, 예컨대 폴리프로필렌, 폴리스티렌, 치환된 폴리스티렌, 폴리아크릴아미드 (예컨대, 폴리아미드 및 폴리비닐 클로라이드), 유리 비드, 아가로스 및 니트로셀룰로스를 포함한다.
본 발명의 방법에 사용될 수 있는 ELISA 샌드위치 면역검정의 예는 캡쳐 항체로 마우스 항-인간 MNN 모노클로날 항체를 사용하고, 디텍터 항체로 바이오티닐화된 염소 항-인간 MN 폴리클로날 항체를 사용한다. 캡쳐 모노클로날 항체는 미세역가 플레이트 웰에 고정된다. 희석된 인간 혈청/혈장 샘플 또는 MN 표준 (재조합 야생형 MN 단백질)을 웰에서 인큐베이션하여, 캡쳐 모노클로날 항체에 의한 MN 항원의 결합을 허용한다. 웰을 세척한 후에, 고정된 MN 항원을 바이오티닐화된 디텍터 항체에 노출시키고, 이어서 웰을 다시 세척한다. 이어서, 스트렙타비딘-양고추냉이 퍼옥시다제 접합체를 첨가한다. 최종 세척 후에, TMB 블루 기질을 웨에 첨가하여 결합된 퍼옥시다제 활성을 검출한다. 2.5 N 황산을 첨가하여 반응을 중단시키고, 흡광도를 450 nm에서 측정한다. 샘플의 흡광도 값과 MN 표준의 관계로 혈청 또는 혈장의 MN의 정량적인 값 (pg/mL)을 결정한다.
MN 단백질을 확인하는데 유용한 항체는 임의의 통상적인 방식으로 표지될 수 있다. 표지의 한 예는 양고추냉이 퍼옥시다제이고, 항체 표지 방법의 한 예는 바이오틴-스트렙타비딘 복합체를 사용하는 방법이다.
적절하게는, 본 발명의 면역검정에서 트레이서로서 사용되는 항체는 임의의 방식으로 직접 또는 간접적으로 표지되어 가시화되거나 또는 가시화될 수 있는 신호를 생성할 수 있다. 검출가능한 마커 물질은 방사성 핵종, 예컨대 3H, 125I 및 131I; 형광 물질, 예컨대 플루오레세인 이소티오시아네이트 및 다른 형광 색소, 피코빌린 단백질, 피코에리틴, 희토류 킬레이트, 텍사스(Texas) 레드, 단실 및 로다민; 색도계 시약 (크로모겐); 전자 오페이크 물질, 예컨대 콜로이드성 금; 생물발광물질; 화학발광물질; 염료; 효소, 예컨대 양고추냉이 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제, 글루코스 옥시다제, 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제, 아세틸콜린에스테라제, α-, β-갈락토시다제, 기타; 조효소; 효소 기질; 효소 보조인자; 효소 억제제; 효소 서브유닛; 금속 이온; 유리 라디칼; 또는 형성된 면역복합체의 존재 또는 양을 검출 또는 측정하는 수단을 제공하는 임의의 다른 면역학적 활성 또는 비활성 물질을 포함한다. 효소 기질 조합의 예는 양고추냉이 퍼옥시다제 및 테트라메틸 벤지딘 (TMB), 및 알칼리성 포스파타제 및 파라니트로페닐 포스페이트 (pNPP)이다.
본 발명에 따른 또다른 검출 및 정량화 시스템은 발광 신호, 생물발광 (BL) 또는 화학발광 (CL)을 생성한다. 화학발광 (CL) 또는 생물발광 (BL) 검정에서, 강도 또는 전체 광 방출을 측정하며, 이는 알려지지 않은 분석물의 농도와 관련이 있다. 빛은 루미노미터 (디텍터로서의 광전자 배증관 튜브) 또는 전하-커플링된 장치를 이용하여 정량적으로 측정되거나, 또는 사진 또는 X-선 필름 수단에 의해 정성적으로 측정될 수 있다. 이러한 검정을 이용하는데 있어 주요 이점은 이들의 간편성, 및 매우 적은 양의 분석물의 검출 및/또는 정량화를 가능하게 하는 분석 민감성이다.
발광 표지의 예는 아크리디늄 에스테르, 아크리디늄 술포닐 카르복스아미드, 루미놀, 움벨리페론, 이소루미놀 유도체, 광단백질, 예컨대 에쿼린, 및 반딧불로부터의 루시퍼라제, 해양 박테리아, 바굴라(Vargulla) 및 레닐라(Renilla)이다. 루미놀은 임의로는 4-요오도페놀 또는 4-히드록시-신남산과 같은 인핸서 분자와 함께 사용될 수 있다. 전형적으로, CL 신호는 염기성 조건하에 산화제로 처리하여 생성된다.
추가의 발광 검출 시스템은 신호 (검출가능한 마커)가 기질 상에서의 효소 반응에 의해 생성되는 것이다. CL 및 BL 검출 계획은 알칼리성 포스파타제 (AP), 글루코스 옥시다제, 글루코스 6-포스페이트 데히드로게나제, 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP) 및 크산틴 옥시다제 표지 등의 검정을 위해 개발되었다. AP 및 HRP는 CL 및 BL 반응의 범위에서 정량화될 수 있는 2 가지 효소 표지이다. 예를 들면, AP는 1-(트리옥틸포스포늄 메틸)-4-(트리부틸포스포늄 메틸)벤젠 디오클로라이드와 같은 인핸서 분자의 존재 또는 부재하에 아다만틸 1,2-디옥세탄 아릴 포스페이트 기질 (예를 들어, AMPPD 또는 CSPD; 문헌 [Kricka, L.J., "Chemiluminescence and Bioluminescence, Analysis by," Molecular Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference (ed. R.A. Meyers) (VCH Publishers; N.Y., N.Y.; 1995)]); 예를 들어 4-메톡시-4-(3-포스페이트페닐)스피로[1,2-디옥세탄-3,2'-아다만탄]의 2나트륨 염과 같은 기질과 함께 사용될 수 있다. HRP는 2',3',6'-트리플루오로페닐-메톡시-10-메틸아크리단-9-카르복실레이트와 같은 기질과 함께 사용될 수 있다.
CL 및 BL 반응은 효소 뿐만 아니라 다른 기질, 보조인자, 억제제, 금속 이온 등의 분석에 적합할 수 있다. 예를 들어, 루미놀, 반딧불 루시퍼라제 및 해양 박테리아 루시퍼라제 반응은 각각 과산화물, ATP 및 NADPH의 생성 또는 소비에 대한 지표 반응이다. 이들은 옥시다제, 키나제 및 데히드로게나제가 관여하는 다른 반응과 커플링될 수 있고, 커플링된 반응의 임의의 성분 (효소, 기질, 보조인자)을 측정하는데 사용될 수 있다.
검출가능한 마커는 본 발명의 검정에 사용되는 항체에 직접 또는 간접적으로 연결될 수 있다. 검출가능한 표지의 간접 연결의 예는 항체와 마커 사이의 결합 쌍을 사용한 것이나 또는 신호 증폭 시스템을 사용한 것이다.
검출가능한 마커에 항체를 연결시키는데 사용될 수 있는 결합 쌍의 예는 바이오틴/아비딘, 스트렙타비딘, 또는 항-바이오틴; 아비딘/항-아비딘; 티록신/티록신-결합 글로불린; 항원/항체; 항체/항-항체; 탄수화물/렉틴; 합텐/항-합텐 항체; 염료 및 소수성 분자/소수성 단백질 결합 부위; 효소 억제제, 조효소 또는 보조인자/효소; 다중핵산/상동성 다중핵산 서열; 플루오레세인/항-플루오레세인; 디니트로페놀/항-디니트로페놀; 비타민 B12/내재성 인자; 코르티손, 코르티솔/코르티솔 결합 단백질; 및 특이적 수용체 단백질/막-연관된 특이적 수용체 단백질에 대한 리간드이다.
표지를 항체에 직접 또는 간접적으로 연결시키는데 사용되는 다양한 수단은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 표지는 공유결합에 의해 또는 비-공유결합적으로 결합될 수 있다. 항체 접합 방법의 예는 문헌 [Avarmeas, et al., Scan. J. Immunol. 8(Suppl. 7): 7, 1978]; [Bayer, et al., Meth. Enzymol. 62:308, 1979]; [Chandler, et al., J. Immunol. Meth. 53:187, 1982]; [Ekeke and Abuknesha, J. Steroid Biochem. 11:1579, 1979]; [Engvall and Perlmann, J. Immunol. 109:129, 1972]; [Geoghegan, et al., Immunol. Comm. 7:1, 1978]; 및 [Wilson and Nakane, Immunofluorescence and Related Techniques, Elsevier/North Holland Biomedical Press; Amsterdam (1978)] (이들은 각각 본원에 참고로 포함됨)에 기재되어 있다.
표지의 특성에 따라, 표지의 검출 및 정량화에 다양한 기술이 이용될 수 있다. 형광 물질의 경우, 다수의 형광 강도 측정기가 이용될 수 있다. 화학발광물질의 경우, 루미노미터 또는 필름이 이용될 수 있다. 효소와 함께, 형광, 화학발광 또는 착색 생성물이 형광 강도 측정기, 루미노미터, 분광광도 측정기에 의해 또는 육안으로 결정 또는 측정될 수 있다.
아크리디늄, 벤즈아크리디늄 또는 아크리단 유형의 헤테로시클릭 고리계를 갖는 다양한 유형의 화학발광 화합물이 다른 표지의 예이다. 아크리디늄 에스테르의 예로는 아크리디늄, 벤즈[a]아크리디늄, 벤즈[b]아크리디늄, 벤즈[c]아크리디늄, 벤즈이미다졸 양이온, 퀴놀리늄, 이소퀴놀리늄, 퀴놀리지늄, 시클릭 치환된 퀴놀리늄, 페난트리디늄 및 퀴녹살리늄과 같은 고리계를 비롯하여, 포지티브 산화 상태에서 헤테로원자를 함유하는 헤테로시클릭 고리 또는 고리계를 갖는 화합물이 있다.
트레이서는 당업자에게 공지된 바와 같이 아크리디늄 또는 벤즈아크리디늄 에스테르 상에 존재하는 반응성 관능기를 선별된 항체에 직접 또는 간접적으로 부착시켜 제조할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Weeks, et al., Clin. Chem. 29(8):1474-1479, 1983]). 화합물의 예는 아릴 고리 이탈기 및 아릴 고리의 파라 또는 메타 위치에 존재하는 반응성 관능기를 갖는 아크리디늄 및 벤즈아크리디늄 에스테르이다 (예를 들어, 미국 특허 제4,745,181호 및 WO 94/21823, 본원에 참고로 포함됨).
사용 방법
용어 "치료"는 인간을 비롯한 대상체 (또는 환자)에게 대상체의 상태를 직접 또는 간접적으로 개선시키거나, 대상체의 상태 또는 장애의 진행을 지연시키거나, 또는 치료하에 질환 또는 장애의 하나 이상의 징후를 개선시키기 위한 목적으로 의학적 도움을 제공하는 임의의 과정, 활동, 적용, 요법 등을 포함한다.
용어 "조합 요법" 또는 "공동-요법"은 질환, 상태 및/또는 장애를 치료하기 위해 2 가지 이상의 치료제를 투여하는 것을 의미한다. 이러한 투여는 실질적으로 동시 방식, 예컨대 고정된 비율의 활성 성분을 갖는 단일 캡슐, 또는 각각의 억제제에 대한 별도의 다중 캡슐로 2 가지 이상의 치료제를 공동-투여하는 것을 포함한다. 추가로, 이러한 투여는 각각의 유형의 치료제를 순차적인 방식으로 사용하는 것을 포함한다. 순차적으로 공동-투여되는 2 가지 이상의 치료제의 투여 순서는 제한되지 않는다.
어구 "치료상 유효량"은 주어진 치료적 처치와 연관된 부작용을 피하거나 최소화시키면서 질환, 상태 및/또는 장애 중증도, 및/또는 이들의 징후를 개선시키는 목적을 달성하는, 투여되는 각각의 제제의 양을 의미한다.
용어 "제약상 허용되는"은 대상 항목이 제약 생성물에 사용하기에 적절하다는 것을 의미한다.
본 발명의 항체는 치료제로서의 가치가 있을 것으로 기대된다. 따라서, 본 발명의 실시양태는 목적하는 상태를 치료하는데 효과적인 양의 본 발명의 항체를 함유하는 조성물을 환자 (포유동물 포함)에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 환자에서 다양한 상태를 치료하는 방법을 포함한다.
본 발명의 항체는 MN 단백질과 연관된 질환 및/또는 거동의 치료 또는 예방에 사용될 수 있다. 이들 질환 및/또는 거동은 예를 들면 신장, 식도, 유방, 자궁경부, 결장 및 폐의 암종과 같은 암을 포함한다. 본 발명은 또한 MN이 상승되거나 또는 달리 비정상적으로 발현되는 장애의 징후를 개선시키는 방법에 관한 것이다. 이들 장애는 신장, 식도, 유방, 자궁경부, 결장 및 폐의 암종 등을 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Liao, Cancer Res. 57:2827-2831, 1997]; [Turner, Hum. Pathol. 28:740-744, 1997]; [Liao, et al., Am. J. Pathol. 145:598-609, 1994]; [Saarnio, et al., Am. J. Pathol. 153:279-285, 1998]; [Vermylen, et al., Eur. Respir. J. 14:806-811, 1999] 참조). 본 발명의 한 실시양태에서, 본 발명의 항체의 치료상 유효 투여량은 MN이 상승되는 장애를 앓고 있는 환자에게 투여한다.
본 발명의 항체는 단독으로 또는 하나 이상의 추가의 치료제와 함께 투여될 수 있다. 조합 요법은 본 발명의 항체 및 하나 이상의 추가의 치료제를 함유하는 단일 제약 투여 제제를 투여하는 것 뿐만 아니라, 본 발명의 항체 및 추가의 치료제를 각각 자신의 별도의 제약 투여 제제로 투여하는 것을 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 항체 및 치료제는 환자에게 단일 경구 투여 조성물로 함께 투여될 수 있거나 또는 각각의 제제가 별도의 경구 투여 제제로 투여될 수 있다.
별도의 투여 제제가 사용되는 경우, 본 발명의 항체 및 하나 이상의 추가의 치료제는 본질적으로 같은 시점에 (예를 들어, 동시에) 또는 별도의 교대 시점에 (예를 들어, 순차적으로) 투여될 수 있다. 제제의 투여 순서는 제한되지 않는다.
예를 들어, 한 측면에서, 항체/단편 또는 항암제(들) 또는 이 둘 모두의 효과를 강화시키기 위한 본 발명의 항-MN 항체 또는 항체 단편과 하나 이상의 항암제의 공동-투여는 암과 같은 MN-관련 장애의 치료에 사용될 것으로 고려된다.
이러한 조합 요법은 또한 암 예방, 암의 재발 예방, 암의 확산 또는 전이 예방, 또는 암과 연관된 징후의 감소 또는 개선에 이용될 수 있다.
하나 이상의 항암제는 당업계에 공지되어 있고 적합한 임의의 화합물, 예를 들면 화학 제제, 다른 면역요법제, 암 백신, 항-혈관형성제, 사이토킨, 호르몬 요법제, 유전자 요법제 및 방사선 요법제를 포함할 수 있다. 화학 제제 (또는 "항암제" 또는 "항-종양제" 또는 "암 요법제")는 암 치료를 돕는 임의의 분자 또는 화합물을 나타낸다. 본 발명에서 고려되는 화학 제제의 예로는 시토신 아라비노시드, 탁소이드 (예를 들어, 파클리탁셀, 도세탁셀), 항-튜불린제 (예를 들어, 파클리탁셀, 도세탁셀, 에포틸론 B, 또는 그의 유사체), 마크롤리드 (예를 들어, 리족신), 시스플라틴, 카르보플라틴, 아드리아마이신, 테노포시드, 미토잔트론, 디스코데르몰리드, 엘레우테로빈, 2-클로로데옥시아데노신, 알킬화제 (예를 들어, 시클로포스파미드, 메클로르에타민, 티오에파, 클로르암부실, 멜팔란, 카르무스틴 (BSNU), 로무스틴 (CCNU), 시클로토스파미드, 부술판, 디브로모만니톨, 스트렙토조토신, 미토마이신 C, 및 시스-디클로로디아민 백금 (II) (DDP) 시스플라틴, 티오-테파), 항생제 (예를 들어, 닥티노마이신 (이전에는, 악티노마이신), 블레오마이신, 미트라마이신, 안트라마이신), 항대사물질 (예를 들어, 메토트렉세이트, 6-머캅토퓨린, 6-티오구아닌, 시타라빈, 플라보피리돌, 5-플루오로우라실, 플루다라빈, 겜시타빈, 다카르바진, 테모졸라미드), 아스파라기나제, 바실러스 칼메트(Bacillus Calmette) 및 게린(Guerin), 디프테리아 독소, 헥사메틸멜라민, 히드록시우레아, LYSODREN.RTM., 뉴클레오시드 유사체, 식물 알칼로이드 (예를 들어, 탁솔, 파클리탁셀, 캄프토테신, 토포테칸, 이리노테칸 (CAMPTOSAR, CPT-11), 빈크리스틴, 빈카 알칼로이드, 예컨대 빈블라스틴), 포도필로톡신 (유도체, 예컨대 에피포도필로톡신, VP-16 (에토포시드), VM-26 (테니포시드) 포함), 시토칼라신 B, 콜친, 그라미시딘 D, 에티듐 브로마이드, 에메틴, 미토마이신, 프로카르바진, 메클로르에타민, 안트라사이클린 (예를 들어, 다우노루비신 (이전에는, 다우노마이신), 독소루비신, 독소루비신 리포솜), 디히드록시안트라신디온, 미톡산트론, 미트라마이신, 악티노마이신 D, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀롤, 퓨로마이신, 항-유사분열제, 아브린, 리신 A, 슈도모나스 외독소, 신경 성장 인자, 혈소판-유래 성장 인자, 조직 플라스미노겐 활성화제, 알데스류킨, 알루타민, 아나스트로졸, 비칼루타미드, 비아오마이신, 부술판, 카페시타빈, 카르보플레인, 클로르아부실, 클라드리빈, 실라라빈, 다클리노마이신, 에스트라무신, 플록스우리딘, 감시타빈, 고세레인, 이다루비신, 이토스파미드, 라우프롤리드 아세테이트, 레바미졸, 로무슬린, 메클로르에타민, 마게스트롤, 아세테이트, 머캅토퓨리노, 메스나, 미톨란크, 페가스페르가제, 펜토슬라틴, 피카마이신, 리욱슬맙, 캄파쓰-1, 스트라플로조신, 티오구아닌, 트레티노인, 비노렐빈, 또는 이들의 임의의 단편, 부류 구성원 또는 유도체 (이들의 제약상 허용되는 염 포함)가 있으나 이들로 한정되지는 않는다. 하나 이상의 화학 제제 (예를 들어, FLAG, CHOP)를 포함하는 조성물이 또한 본 발명에서 고려된다. FLAG는 플루다라빈, 시토신 아라비노시드 (Ara-C) 및 G-CSF를 포함한다. CHOP는 시클로포스파미드, 빈크리스틴, 독소루비신 및 프레드니손을 포함한다.
화학 제제는 항-혈관형성제, 예를 들면 안지오스타틴, 베바시주맙 (아바스틴(Avastin®)), 소라페닙 (넥사바르(Nexavar®)), 바쿨로스타틴, 칸스타틴, 마스핀, 항-VEGF 항체 또는 펩티드, 항-태반 성장 인자 항체 또는 펩티드, 항-Flk-1 항체, 항-Flt-1 항체 또는 펩티드, 라미닌 펩티드, 피브로넥틴 펩티드, 플라스미노겐 활성화제 억제제, 조직 메탈로프로테이나제 억제제, 인터페론, 인터류킨 12, IP-10, Gro-β, 트롬보스폰딘, 2-메톡시오에스트라디올, 프롤리페린-관련 단백질, 카르복시아미도트리아졸, CM101, 마리마스타트, 다황화 펜토산, 안지오포이에틴 2, 인터페론-α, 헤르비마이신 A, PNU145156E, 16K 프로락틴 단편, 리노미드, 탈리도미드, 펜톡시필린, 게니스테인, TNP-470, 엔도스타틴, 파클리탁셀, 악쿠틴, 시도포비르, 빈크리스틴, 블레오마이신, AGM-1470, 혈소판 인자 4 또는 미노사이클린일 수 있다. 이론에 국한되지 않고, 항-혈관형성제의 공동-투여는 유리하게는 종양에서 MN 발현의 증가를 유도하여 종양이 본 발명의 항체 및 항체 접합체에 보다 민감해지도록 할 수 있다.
한 측면에서, 상기 화학 제제는 100 내지 1000 mg/m2/주기의 투여량 범위의 겜시타빈이다. 한 실시양태에서, 상기 화학 제제는 200 내지 4000 mg/m2/주기의 투여량 범위의 다카르바진이다. 또다른 측면에서, 상기 투여량 범위는 700 내지 1000 mg/m2/주기이다. 또 다른 측면에서, 상기 화학 제제는 25 내지 50 mg/m2/주기의 투여량 범위의 플루다라빈이다. 또다른 측면에서, 상기 화학 제제는 200 내지 2000 mg/m2/주기의 투여량 범위의 시토신 아라비노시드 (Ara-C)이다. 또 다른 측면에서, 상기 화학 제제는 1.5 내지 7.5 mg/kg/주기의 투여량 범위의 도세탁셀이다. 또 다른 측면에서, 상기 화학 제제는 5 내지 15 mg/kg/주기의 투여량 범위의 파클리탁셀이다. 추가의 측면에서, 상기 화학 제제는 5 내지 20 mg/kg/주기의 투여량 범위의 시스플라틴이다. 다른 추가의 측면에서, 상기 화학 제제는 5 내지 20 mg/kg/주기의 투여량 범위의 5-플루오로우라실이다. 또다른 측면에서, 상기 화학 제제는 2 내지 8 mg/kg/주기의 투여량 범위의 독소루비신이다. 다른 추가의 측면에서, 상기 화학 제제는 40 내지 160 mg/kg/주기의 투여량 범위의 에피포도필로톡신이다. 또 다른 측면에서, 상기 화학 제제는 50 내지 200 mg/kg/주기의 투여량 범위의 시클로포스파미드이다. 추가의 측면에서, 상기 화학 제제는 50 내지 150 mg/m2/주기의 투여량 범위의 이리노테칸이다. 다른 추가의 측면에서, 상기 화학 제제는 3.7 내지 18.5 mg/m2/주기의 투여량 범위의 빈블라스틴이다. 또다른 측면에서, 상기 화학 제제는 0.7 내지 2 mg/m2/주기의 투여량 범위의 빈크리스틴이다. 한 측면에서, 상기 화학 제제는 3.3 내지 1000 mg/m2/주기의 투여량 범위의 메토트렉세이트이다.
또다른 측면에서, 본 발명의 항-MN 항체 및/또는 항체 단편은, 헤르셉틴(Herceptin®), 레툭산(Retuxan®), 오바렉스(OvaRex), 파노렉스(Panorex), BEC2, IMC-C225, 비탁신(Vitaxin), 캄파쓰(Campath) I/H, 스마트(Smart) MI95, 림포시드(LymphoCide), 스마트 I D10, 및 온콜림(Oncolym), 리툭산, 리툭시맙, 겜투주맙 또는 트라스투주맙 등을 비롯한 면역조절제 또는 항체와 같은 하나 이상의 면역요법제와 함께 투여된다.
본 발명은 또한 본 발명의 항-MN 항체 및/또는 항체 단편을, 안지오스타틴, 탈리도미드, 크링글(kringle) 5, 엔도스타틴, 세르핀(Serpin) (세린 프로테아제 억제제) 항-트롬빈, 피브로넥틴의 29 kDa N-말단 및 40 kDa C-말단 단백질 가수분해 단편, 프로락틴의 16 kDa 단백질 가수분해 단편, 혈소판 인자-4의 7.8 kDa 단백질 가수분해 단편, 혈소판 인자-4의 단편에 상응하는 β-아미노산 펩티드 (문헌 [Maione et al., 1990, Cancer Res. 51:2077]), 콜라겐 I의 단편에 상응하는 14-아미노산 펩티드 (문헌 [Tolma et al., 1993, J. Cell Biol. 122:497]), 트롬보스폰딘(Thrombospondin) I의 단편에 상응하는 19-아미노산 펩티드 (문헌 [Tolsma et al., 1993, J. Cell Biol. 122:497]), SPARC의 단편에 상응하는 20-아미노산 펩티드 (문헌 [Sage et al., 1995, J. Cell. Biochem. 57:1329]), 또는 이들의 임의의 단편, 부류 구성원 또는 유도체 (이들의 제약상 허용되는 염 포함) 등을 비롯한 하나 이상의 항-혈관형성제와 함께 투여하는 것을 고려한다.
혈관신생을 억제하고 라미닌, 피브로넥틴, 프로콜라겐 및 EGF의 단편에 상응하는 다른 펩티드가 또한 기재되어 있다 (검토를 위해, 문헌 [Cao, 1998, Prog. Mol. Subcell. Biol. 20:161] 참조). 모노클로날 항체 및 시클릭 펜타펩티드 (RGD 단백질에 결합하는 특정 인테그린을 차단함) (즉, 펩티드 모티프 Arg-Gly-Asp를 보유함)는 항-혈관신생 활성을 갖는 것으로 입증되었다 (문헌 [Brooks et al., 1994, Science 264:569]; [Hammes et al., 1996, Nature Medicine 2:529]). 또한, 길항제에 의한 유로키나제 플라스미노겐 활성화제 수용체의 억제는 혈관신생, 종양 성장 및 전이를 억제한다 (문헌 [Min et al., 1996, Cancer Res. 56:2428-33]; [Crowley et al., 1993, Proc Natl Acad. Sci. USA 90:5021]). 이러한 항-혈관형성제의 사용도 또한 본 발명에서 고려된다.
또다른 측면에서, 본 발명의 항-MN 항체 및/또는 항체 단편은 방사선 조사 처방과 함께 투여된다.
본 발명의 항-MN 항체 및/또는 항체 단편은 또한, 림포카인, 종양 괴사 인자, 종양 괴사 인자-유사 사이토킨, 림포톡신-α, 림포톡신-β, 인터페론-β, 마크로파지 염증성 단백질, 과립구 단핵세포 콜로니 자극 인자, 인터류킨 (인터류킨-1, 인터류킨-2, 인터류킨-6, 인터류킨-12, 인터류킨-15, 인터류킨-18 등 포함), OX40, CD27, CD30, CD40 또는 CD137 리간드, Fas-Pas 리간드, 4-1BBL, 내피 단핵세포 활성화 단백질, 또는 이들의 임의의 단편, 부류 구성원 또는 유도체 (이들의 제약상 허용되는 염 포함) 등을 비롯한 하나 이상의 사이토킨과 함께 투여될 수 있다.
본 발명의 항-MN 항체 및/또는 항체 단편은 또한, 예를 들면 자가 유래 세포 또는 조직, 비-자가 유래 세포 또는 조직, 암배 항원, α-태아 단백질, 인간 융모성 고나도트로핀, BCG 생균 백신, 멜라닌형성 세포 계통 단백질 (예를 들어, gp100, MART-1/MelanA, TRP-1 (gp75), 티로시나제, 널리 공유된 종양-관련 (종양-특이적 포함) 항원 (예를 들어, BAGE, GAGE-1, GAGE-2, MAGE-1, MAGE-3, N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제-V, p15), 종양-관련된 돌연변이 항원 (β-카테닌, MUM-1, CDK4), 비-흑색종 항원 (예를 들어, HER-2/neu (유방 및 난소 암종), 인간 유두종 바이러스-E6, E7 (자궁경부 암종), MUC-1 (유방, 난소 및 췌장 암종) 등을 비롯한 암 백신과 함께 투여될 수 있다. T-세포에 의해 인식되는 인간 종양 항원의 경우, 일반적으로 문헌 [Robbins and Kawakami, 1996, Curr. Opin. Immunol. 8:628]을 참조한다. 암 백신은 정제된 제제이거나 정제되지 않은 제제일 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 항-MN 항체 및/또는 항체 단편은 호르몬 치료와 함께 사용된다. 호르몬 요법 처치는 호르몬 효능제, 호르몬 길항제 (예를 들면, 플루타미드, 타목시펜, 류프롤리드 아세테이트 (LUPRON), LH-RH 길항제), 호르몬 생합성 및 처리 억제제, 및 스테로이드 (예를 들어, 덱사메타존, 레티노이드, 베타메타존, 코르티솔, 코르티손, 프레드니손, 데히드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 미네랄로코르티코이드, 에스트로겐, 테스토스테론, 프로게스틴), 항-게스타겐 (예를 들면, 미페프리스톤, 오나프리스톤) 및 항-안드로겐 (예를 들면, 시프로테론 아세테이트)을 포함한다.
본 발명의 항-MN 항체 및/또는 단편은 항-MDR (다중약물 내성) 표현형 제제와 함께 사용될 수 있으며, 예를 들면 공동-투여될 수 있다.
다수의 인간 암은 각각의 약물 클래스가 상이한 구조 및 작용 메카니즘을 가졌음에도 불구하고 동시에 여러 클래스의 항암 약물에 대한 내성을 내재적으로 표현하거나 또는 자발적으로 발생시킨다. 이러한 현상은 배양된 포유동물 세포에서 모방될 수 있는 것으로, 일반적으로는 다중약물 내성 ("MDR") 또는 다중약물 내성 표현형으로 지칭된다. MDR 표현형은 인간 환자의 암에 대해 성공적인 화학요법 처치에 대한 유의한 장애로 나타난다. 다중 화학요법제에 대한 악성 종양의 내성이 치료 실패의 주된 요인이다 (문헌 [Wittes et al., Cancer Treat. Rep. 70:105 (1986)]; [Bradley, G. et al., Biochim. Biophys. Acta 948:87 (1988)]; [Griswald, D. P. et al., Cancer Treat. Rep. 65(S2):51 (1981)]; [Osteen, R. T. (ed.), Cancer Manual, (1990)]). 처음에 세포독성제에 민감성이었던 종양은 재발하거나 또는 다중 화학요법 약물에 불응성이 되기도 한다 (문헌 [Riordan et al., Pharmacol. Ther. 28:51 (1985)]; [Gottesman et al., Trends Pharmacol. Sci. 9:54 (1988)]; [Moscow et al., J. Natl. Cancer Inst. 80:14 (1988)]; [Croop, J. M. et al., J. Clin. Invest. 81:1303 (1988)]). 종양으로부터 수득하여 세포독성 약물 선별의 존재하에 성장시킨 세포 또는 조직은 상기 클래스의 다른 약물 뿐만 아니라 안트라사이클린, 빈카 알칼로이드 및 에피포도필로톡신 등을 비롯한 다른 클래스의 약물에 대해 교차-내성을 나타낼 수 있다 (문헌 [Riordan et al., Pharmacol. Ther. 28:51 (1985)]; [Gottesman et al., J. Biol. Chem. 263:12163 (1988)]). 따라서, 단일 약물에 대해 획득한 내성은 동시에 구조적 및 기능적으로 관련이 없는 약물의 다양한 군에 대한 내성을 나타낸다. 이러한 내성은 고형-형태 및 액상-형태의 종양 (예를 들어, 혈액 또는 림프-기재의 암) 둘 모두에 문제가 될 수 있다.
포유동물 세포에서의 다중약물 내성의 한 가지 주요 메카니즘은 170 kDa 원형질 막 당단백질 펌프 시스템의 증가된 발현과 관련된다 (문헌 [Juranka et al., FASEB J 3:2583 (1989)]; [Bradley, G. et al., Blochem. Biophys. Acta 948:87 (1988)]). 이러한 펌프 시스템 (다중약물 수송자로 지칭되기도 함)을 코딩하는 유전자는 배양된 인간 세포로부터 클로닝되었으며, 일반적으로 mdr1로 지칭된다. 이 유전자는 여러 클래스의 정상적인 조직에서 발현되지만, 이들 조직에서 mdr1 유전자 생성물로 수송되는 생리학적 기질은 확인되지 않았다. MDR1 생성물은 에너지-의존성 방출 기능을 갖는 단백질 군인 ABC 수송자 단백질 거대족의 구성원이다.
mdr1 유전자의 단백질 생성물 (일반적으로, P-당단백질 ("P-170", "P-gp")로 공지되어 있음)은 상기 언급된 에너지-의존성 유출 펌프를 구성하는 170 kDa의 원형질 막횡단 단백질이다. 세포 표면 상에서의 P-gp의 발현은 다수의 항암제를 비롯한 다중 세포독성 약물에 대해 세포가 내성을 나타내도록 하기에 충분하다. P-gp-매개성 MDR은 상이한 유형의 종양에서 종양 내성의 중요한 임상적 성분인 것으로 나타났으며, mdr1 유전자 발현은 상이한 유형의 암에서 화학요법에 대한 내성과 관련이 있다.
mdr1 유전자의 뉴클레오티드 서열 (문헌 [Gros, P. et al., Cell 47:371 (1986)]; [Chen, C. et al., Cell 47:381 (1986)])은 mdr1 유전자가 P-당단백질과 유사하거나 동일한 폴리펩티드를 코딩하며, 이들은 박테리아 수송자와 유사한 막 단백질의 고도로 보존된 클래스의 구성원으로, 정상적인 생리학적 수송 과정에 관여함을 나타낸다. mdr1 유전자의 서열 분석 결과는 Pgp가 2개의 상동성 (43％ 동일성) 절반 사이에 분포된 1280개 아미노산으로 구성되어 있음을 나타낸다. 분자의 절반은 각각 6개의 소수성 막횡단 도메인을 갖고, 이들은 각각 거대 세포질 루프 내에 ATP 결합 부위를 갖는다. 약 8％의 분자 만이 세포외에 존재하고, 탄수화물 잔기 (대략 30 kDa)는 상기 영역 내의 부위에 결합한다.
따라서, "다중약물-내성" 또는 "다중약물-내성" 표현형을 갖는 포유동물 세포가 세포내 환경으로부터 다수의 세포독성 물질 (예를 들어, 화학요법 약물)을 격리, 방출 또는 배출하는 능력을 특징으로 한다는 것이 이해될 것이다. 세포는 단일 화학요법 약물 (선별 독소)에 대한 노출에 의해 부가된 선별 압력의 결과로 상기 표현형을 획득할 수 있다. 다르게는, 세포독성 물질의 방출이 세포 분비 생성물, 대사물질 등의 정상적인 방출과 공통적인 메카니즘과 관련이 있을 수 있으므로, 세포는 독소 노출 이전에 표현형을 나타낼 수 있다. 다중약물 내성은 세포가 사전에 노출되지 않은 추가의 세포독소 (다른 화학요법 약물)를 방출하는 능력을 세포가 획득하였다는 점에서 선별 독소에 대해 획득한 단일 내성과는 상이하다. 예를 들면, 문헌 [Mirski et al. (1987), 47 Cancer Res. 2594-2598]은 선별 독소로서의 아드리아마이신 (독소루비신)의 존재하에 인간 소세포 폐 암종으로부터 유래된 H69 세포주를 배양하여 다중약물-내성 세포 집단을 단리하는 것에 대해 기재하고 있다. 살아있는 세포는 안트라사이클린 유사체 (예를 들어, 다우노마이신, 에피루비신, 메노가릴 및 미톡산트론), 아시비신, 에토포시드, 그라미시딘 D, 콜치신 및 빈카-유래의 알칼로이드 (빈크리스틴 및 빈블라스틴) 뿐만 아니라 아드리아마이신의 세포독성 효과에 대해 내성을 갖는 것으로 밝혀졌다. 유사한 선별 배양 기술이 추가의 다중약물-내성 세포 집단을 생성하는데 적용될 수 있다.
따라서, 본 발명의 제약 조성물은 MDR 표현형 및/또는 MDR 표현형과 연관된 상태를 억제하는 작용을 하는 화합물을 더 포함할 수 있다. 이러한 화합물은 당업계에 공지된 임의의 MDR 억제제 화합물, 예컨대 MDR 성분에 특이적인 항체 (예를 들어, 항-MDR 수송자 항체) 또는 MDR 수송자의 소분자 억제제 (다중약물 내성을 반대로 역전시키거나 또는 억제하는 것으로 알려진 제제들로, 특히 타목시펜, 베라파밀 및 시클로스포린 A를 포함함)를 포함할 수 있다 (문헌 [Lavie et al. J. Biol. Chem. 271: 19530-10536, 1996], 본원에 참고로 포함됨). 이러한 화합물은 미국 특허 제5,773,280호, 동 제6,225,325호 및 동 제5,403,574호 (이들은 각각 본원에 참고로 포함됨)에서 찾아볼 수 있다. 이러한 MDR 억제제 화합물은 화학요법 처치를 보조 또는 향상시키기 위해 MDR 표현형의 검출 후에 MDR 표현형을 반대로 역전시키는 것을 비롯하여, 다양한 목적을 위해 본 발명의 항-MN 항체 및/또는 단편과 공동-투여될 수 있다. 예를 들면 타목시펜, 베라파밀 또는 시클로스포린 A와 같은 MDR 억제제가 MDR 표현형의 검출을 돕기 위해 본 발명의 화합물과 함께 사용될 수 있다. 상기 측면에 따라, MDR 억제제는 기질 도메인을 마주 향하고 있는 화상형성 화합물을 수송 또는 "펌핑-아웃(pumping-out)"하는데 있어서의 MDR 수송 시스템의 능력이 MDR 억제제의 존재하에 감소되므로 MDR 암 세포에서의 본 발명의 화합물의 흡수 및 축적을 향상시킬 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 항-MN 항체 및/또는 항체 단편은 암 치료에 유전자 요법 프로그램과 함께 사용된다. 인터류킨-2를 분비하는 재조합 세포를 사용하는 유전자 요법은 암, 특히 유방암을 예방 또는 치료하기 위해 본 발명의 항체와 함께 투여될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Deshmukh et al., 2001, J. Neurosurg. 94:287] 참조).
하나의 예로 암을 치료하는데 치료상 유용한 특정 항체의 능력을 평가하기 위해, 항체를 마우스 이종이식 종양 모델의 생체내에서 시험할 수 있다. 경우에 따라, MN 항체는 치료 평가 이전에 IgG1 항체로 전환될 수 있다. 이러한 전환은 실시예 5에 기재되어 있고, 치료 모델의 한 가지 예가 실시예 9에 상세하게 기재되어 있다. 항체 활성은 또한 실시예 12에 기재된 바와 같이 항체 의존적 세포-매개성 세포독성 검정을 이용하여 시험할 수 있다.
본 발명은 또한 MN이 환자 샘플 또는 생물학적 샘플에서 검출될 수 있는 진단 방법을 제공한다. 이러한 진단 방법은, 예를 들면 MN이 상승하는 장애를 진단하기 위해 이용될 수 있다. 이러한 장애는 신장, 식도, 유방, 자궁경부, 결장 및 폐의 암종을 포함하나 이들로 한정되지는 않는다. 진단을 위해 사용되는 경우, 환자로부터 수득한 샘플에서의 항체-MN 복합체의 양이 정상적인 샘플에서의 복합체의 양보다 훨씬 많은 것으로 검출되면 환자는 장애를 가질 가능성이 있는 것으로 확인된다. 암 조직에서 MN을 검출하는 면역조직화학 방법은 실시예 11에 기재되어 있다.
본 발명의 또다른 측면에서, 비정상적인 양의 발현된 MN 단백질을 갖는 MN-관련 암의 검출 및/또는 가시화 방법이 제공된다. 이러한 방법은 MN-관련 암 세포를 본 발명의 항-MN 항체 또는 단편과 접촉시키는 단계, 및 의학적 화상형성 방식을 이용하여 화상을 제작하는 단계를 포함할 수 있으며, 이 때 항-MN 항체 또는 단편은 의학적 화상형성 방식에 의해 검출될 수 있는 표지 도메인을 포함한다.
본 발명의 검출 방법은 시험관내에서 수행할 수 있다. 암 세포 또는 조직은 예를 들면 생검체 또는 세포 또는 조직 배양물과 같은 임의의 적합한 공급원으로부터 수득할 수 있다. 생검체를 수득하는 방법 및 분리된 조직 및/또는 세포를 유지 및/또는 증식시키는 방법은 당업자에게 공지될 것이다. 다중약물 내성의 시험관내 검출은, 예를 들면 특정 대상체의 암이 치료 이전, 치료 도중 또는 치료 이후에 다중약물 표현형을 나타내는지 여부를 결정하는 것과 같이 다양하게 적용될 수 있다.
본 발명의 화합물을 검출하는데 이용되는 화상형성 방식의 유형은 본 발명의 화합물에 사용된 특정 표지 도메인에 의존할 것이다. 예를 들어, 표지 도메인이 가돌리늄 킬레이트를 포함하는 경우, MRI는 전형적으로 본 발명의 화상형성 제제를 검출하는데 사용될 수 있다. 방사성 핵종 킬레이트가 표지 도메인으로 사용된 경우, 핵 화상형성 방법 (예를 들어, PET)이 이용될 수 있다. 형광-기재의 표지 도메인이 사용되는 경우, 예를 들면 FACS 시스템 또는 형광 현미경 또는 형광 자동화 플레이트 판독기와 같은 광학 화상형성 시스템이 사용될 수 있다. 본 발명의 시험관내 검출 방법에 사용하기에 적절한 화상형성 방식을 선택하는 것은 완전하게 당업자의 지식의 범위 내에 속하는 것이다.
추가로, 본 발명의 시험관내 검출 방법에 사용되는 화상형성 제제의 양은 당업자에 의해 결정될 것이며, MDR 표현형이 나타나는 정도, 예를 들어 MDR 수송 시스템 (예를 들어, P-당단백질)의 발현 수준에 의존할 수 있다. 당업자는 과도한 실험없이 MDR 표현형을 검출하기에 충분한 신규 화상형성 화합물의 양, 즉 검출가능하게 충분한 양이 어느 정도인지 결정할 수 있다.
이용되는 화상형성 방식의 유형은 임의의 특정한 유형으로 제한되지 않으며, 예를 들면 MRI, 핵 화상형성 (예를 들어, PET 또는 SPECT), 광학 화상형성, 음파발광 화상형성 또는 광음향 화상형성 (초음파)을 포함할 수 있다. 당업자는 본 발명의 화상형성 화합물의 특정 표지 도메인이 이용되는 특정 화상형성 방식과 상용성이어야 함을 이해할 것이다.
바람직한 실시양태에서, 검출 방법은 항-MN 항체 또는 이들의 단편, 및 MRI에 의해 검출될 수 있는 적절한 표지를 사용한다. 예를 들면, 본 발명의 항체 또는 단편은 표지 도메인을 포함할 수 있으며, 이는 예를 들어 상자성 금속 킬레이트(들) 또는 본원에 기재된 임의의 것과 같은 MR 조영제이다. 화상형성 제제는 또한 양전자 방출 단층촬영 (PET) 또는 단일 광자 방출 컴퓨터 단층촬영 (SPECT)과 같은 핵 화상형성 방식에 의한 화상형성 또는 검출에 사용되는 방사성 핵종 표지 도메인을 포함할 수 있으며, 예를 들면 방사성 핵종으로는 예컨대 199Au, 72As, 141Ce, 67Cu, 60Cu, 52Fe, 67Ga, 68Ga, 51Gr, 111In, 177Lu, 51Mn, 203Pb, 188Re, 97Ru, 47Sc, 177mSn, 94mTc, 167Tm 및 90Y 등이 있다. 방사성 핵종은 적합한 킬레이터 또는 다중 킬레이터, 예를 들면 HYNIC, DRPA, EDTA, DOTA, TETA, DTPA 및 BAT에 의해 킬레이팅될 수 있다. 킬레이터가 금속과 배위결합하는 조건은 예를 들면 강소우(Gansow) 등의 미국 특허 제4,831,175호, 동 제4,454,106호 및 동 제4,472,509호 (이들은 각각 본원에 참고로 포함됨)에 기재되어 있다. 99mTc (테크네튬-99m)는 일반적으로 핵의학 분야에 이용가능하므로 치료 및 진단적 적용에 특히 관심있는 방사성 동위원소이고, 비용이 저렴하고, 최소의 환자 방사선 투여량을 제공하며, 이상적인 핵 화상형성 특성을 갖는다.
환자 샘플은 본 발명의 항체와 접촉시킬 수 있으며, 이어서 환자 샘플을 항체-MN 복합체의 존재에 대해 검정할 수 있다. 상기 기재된 바와 같이, 항체는 검출가능한 표지, 예컨대 형광, 방사성 동위원소, 화학발광, 또는 효소 표지, 예컨대 양고추냉이 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제 또는 루시퍼라제를 포함할 수 있다.
임의로는, 항체는 고체 지지체에 결합될 수 있으며, 이는 검정의 자동화를 수반할 수 있다. 적합한 고체 지지체로는 유리 또는 플라스틱 슬라이드, 조직 배양 플레이트, 미세역가 웰, 튜브, 규소 칩, 또는 입자, 예컨대 비드 (라텍스, 폴리스티렌 또는 유리 비드 등 포함)가 있으나 이들로 한정되지는 않는다. 공유 및 비-공유 연결, 수동적 흡수, 또는 항체 및 고체 지지체에 부착된 결합 잔기 쌍을 사용하는 것을 비롯한 당업계에 공지된 임의의 방법은 항체를 고체 지지체에 부착시키는데 사용될 수 있다. MN 및 항체의 결합은 반응물질을 함유하기에 적합한 임의의 용기에서 수행할 수 있다. 이러한 용기의 예로는 미세역가 플레이트, 시험 튜브 및 미세원심분리 튜브가 있다.
제약 조성물 및 투여
본원에 기재된 항체는 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물에 제공될 수 있다. 제약상 허용되는 담체는 비-발열성일 수 있다. 조성물은 단독으로 투여되거나 또는 안정화 화합물과 같은 하나 이상의 다른 제제와 함께 투여될 수 있으며, 이는 염수, 완충 염수, 덱스트로스 및 물을 비롯하여 임의의 멸균된 생물학적 상용성 제약 담체로 투여될 수 있다. 염수, 글리신 등을 비롯한 다양한 수성 담체가 사용될 수 있다. 이들 용액은 멸균 상태이며, 일반적으로 미립자 물질은 함유되어 있지 않다. 이들 용액은 통상적인 공지의 멸균 기술 (예를 들면, 여과)에 의해 멸균될 수 있다.
일반적으로, 어구 "제약상 허용되는 담체"는 당업계에 인식되어 있는 것으로, 본 발명의 화합물을 포유동물에게 투여하기에 적합한 제약상 허용되는 물질, 조성물 또는 비히클을 포함한다. 담체는 대상 제제를 하나의 기관 또는 신체의 일부로부터 다른 기관 또는 신체의 일부로 운반 또는 수송하는데 관여하는 액체 또는 고체 충전재, 희석제, 부형제, 용매 또는 캡슐화 물질을 포함한다. 각각의 담체는 제제의 다른 성분과 상용성이고 환자에게 유해하지 않다는 의미에서 "허용되는" 것이어야 한다. 제약상 허용되는 담체로 사용될 수 있는 물질의 몇몇 예로는 당, 예컨대 락토스, 글루코스 및 수크로스; 전분, 예컨대 옥수수 전분 및 감자 전분; 셀룰로스 및 그의 유도체, 예컨대 나트륨 카르복시메틸 셀룰로스, 에틸 셀룰로스 및 셀룰로스 아세테이트; 분말 트라가칸트; 맥아; 젤라틴; 활석; 부형제, 예컨대 코코아 버터 및 좌약 왁스; 오일, 예컨대 낙화생유, 면실유, 홍화유, 참깨유, 올리브유, 옥수수유 및 대두유; 글리콜, 예컨대 프로필렌 글리콜; 다가알코올, 예컨대 글리세린, 소르비톨, 만니톨 및 폴리에틸렌 글리콜; 에스테르, 예컨대 에틸 올레에이트 및 에틸 라우레이트; 아가; 완충제, 예컨대 수산화마그네슘 및 수산화알루미늄; 알긴산; 발열인자-무함유 물; 등장성 염수; 링거액(Ringer's solution); 에틸 알코올; 포스페이트 완충제 용액; 및 제약 제제에 사용되는 다른 비-독성 상용성 물질이 있다.
습윤제, 유화제 및 윤활제, 예컨대 나트륨 라우릴 술페이트 및 마그네슘 스테아레이트 뿐만 아니라, 착색제, 방출제, 코팅제, 감미제, 향미제 및 방향제, 보존제 및 항산화제가 또한 본 발명의 항체 조성물에 존재할 수 있다.
제약상 허용되는 항산화제의 예로는 수용성 항산화제, 예컨대 아스코르브산, 시스테인 히드로클로라이드, 나트륨 바이술페이트, 나트륨 메타바이술피트, 나트륨 술피트 등; 지용성 항산화제, 예컨대 아스코르빌 팔미테이트, 부틸화된 히드록시아니솔 (BHA), 부틸화된 히드록시톨루엔 (BHT), 레시틴, 프로필 갈레이트, α-토코페롤 등; 및 금속 킬레이팅제, 예컨대 시트르산, 에틸렌디아민 테트라아세트산 (EDTA), 소르비톨, 타르타르산, 인산 등이 있다.
조성물은 생리학적 조건에 가까워지도록 하기 위해 필요한 제약상 허용되는 보조 물질, 예컨대 pH 조정제 및 완충제 등을 함유할 수 있다. 이러한 제약 제제에서 본 발명의 항체의 농도는 광범위하게 달라질 수 있으며, 선별된 특정 투여 방식에 따라 주로 유체 부피, 점도 등에 기초하여 선별될 수 있다. 경우에 따라, 한 가지를 초과하는 유형의 항체가 제약 조성물에 포함될 수 있다 (예를 들어, MN 결합에 대해 상이한 Kd를 갖는 항체).
조성물은 환자에게 단독으로 또는 다른 제제, 약물 또는 호르몬과 함께 투여될 수 있다. 활성 성분 이외에도, 이들 제약 조성물은 제약상 사용될 수 있는 제제로의 활성 화합물의 가공을 용이하게 하는 부형제 및 보조제를 포함하는 적합한 제약상 허용되는 담체를 함유할 수 있다. 본 발명의 제약 조성물은 경구, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수강내, 수막강내, 뇌실내, 경피, 피하, 복막내, 비강내, 비경구, 국소, 설하 또는 직장 수단 등을 비롯한 임의의 다수의 경로에 의해 투여될 수 있다.
본 발명의 조성물은 추가로 적합한 면역담체, 예컨대 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드, 예컨대 알부민, 헤모시아닌, 티로글로불린 및 이들의 유도체, 특히 소 혈청 알부민 (BSA) 및 키홀 림펫 헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanin; KLH), 다당류, 탄수화물, 중합체 및 고체-상을 고려한다. 다른 단백질-유래 또는 비-단백질 유래 물질이 당업자에게 공지되어 있다.
백신 관련 측면, 예를 들면 암 백신과 본 발명의 항체 관련 측면에서, 본 발명의 조성물은 아주반트와 함께 또는 아주반트 없이 투여될 수 있다. 임의의 아주반트-유도된 독성을 피하기 위해 아주반트의 부재하에 투여를 수행할 수 있다. 본 발명이 속하는 분야의 당업자, 예를 들어 암 전문의는 아주반트가 사용되어야 하는지 사용되지 말아야 하는지 여부를 확인하는 방법, 및 이것이 대상체의 병력, 가족 데이타, 독성 데이타, 알레르기-관련 시험 결과 등에 의존할 수 있음을 인식 및 이해하고 있을 것이다. 아주반트가 사용되는 실시양태에서, 아주반트는 보호 항체, 예컨대 보호 IgG 항체의 형성을 촉진하는 것이 유리하다. 당업자에게 공지된 임의의 적합한 아주반트가 본 발명에서 고려되며, 본 발명에 용이하게 적합하다. 동물에게 백신을 접종하는데 사용하기 적합한 아주반트로는 수산화알루미늄, 수산화알루미늄, 사포닌 및 그의 정제된 성분 Quit A, 완전 프로인트(Freund) 아주반트 (CFA) 및 불완전 프로인트 아주반트 (IFA)가 있을 수 있으나 이들로 한정되지는 않는다. 덱스트란 술페이트는 스타필로코쿠스 세포 표면 항원에 대한 IgG2 항체의 강력한 자극제인 것으로 밝혀졌으며, 또한 아주반트로 적합하다. 당업자라면 일부 아주반트는 수의학적 적용에 보다 바람직할 수 있는 반면, 다른 아주반트는 인간에서 사용하기 바람직할 것이며, 아주반트 독성이 화합물을 인간에게 투여하기 전에 당업자가 고려해야 할 사항임을 인식하고 있을 것이다.
비경구, 피하, 정맥내, 근육내 투여 등에 적합한 제제; 적합한 제약 담체; 및 제제화 및 투여를 위한 기술은 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 준비할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 20th edition, 2000] 참조). 본 발명의 화합물의 경구 투여용 액체 투여 형태는 제약상 허용되는 에멀젼, 마이크로에멀젼, 용액, 현탁액, 시럽 및 엘릭시르를 포함한다. 활성 성분 이외에도, 액체 투여 형태는, 예를 들면 물 또는 다른 용매, 가용화제 및 유화제, 예컨대 에틸 알코올, 이소프로필 알코올, 에틸 카르보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸렌 글리콜, 오일 (특히, 면실, 땅콩, 옥수수, 배, 올리브, 피마자 및 참깨 오일), 글리세롤, 테트라히드로푸릴 알코올, 폴리에틸렌 글리콜 및 소르비탄의 지방산 에스테르, 및 이들의 혼합물과 같은, 당업계에 통상적으로 사용되는 비활성 희석제를 함유할 수 있다.
본원에 사용된 어구 "비경구 투여" 및 "비경구적으로 투여된"은 장 및 국소 투여 이외의 투여 방식, 일반적으로는 주사에 의한 투여 방식을 의미하며, 정맥내, 근육내, 동맥내, 수막강내, 낭내, 안와내, 심장내, 피내, 복막내, 경기관, 피하, 피하내, 관절내, 낭하, 지주막하, 척수내 및 흉골내 주사 및 주입 등을 포함한다.
치료상 유효 투여량을 결정하는 것은 당업자의 능력의 범위 내에 속한다. 치료상 유효 투여량은 치료상 유효 투여량의 부재하에 나타난 효능과 비교하여 질환 (예를 들면, 암)을 효과적으로 치료하는데 사용될 수 있는 항체의 양을 나타낸다.
치료상 유효 투여량은 처음에 동물 모델 (예를 들면, 래트, 마우스, 토끼, 개 또는 돼지)에서 추정할 수 있다. 동물 모델은 또한 적절한 투여 농도 범위 및 경로를 결정하는데 사용될 수 있다. 이어서, 이러한 정보를 인간으로의 투여에 유용한 투여량 및 경로를 결정하는데 사용할 수 있다.
항체의 치료 효능 및 독성 (예를 들어, ED50 - 50％ 집단에서 치료상 효과적인 투여량 및 LD50 - 50％ 집단에 대해 치사량인 투여량)은 세포 배양물 또는 실험용 동물에서 표준 제약 절차에 의해 결정될 수 있다. 치료 효과에 대한 독성의 투여량 비율이 치료 지수이며, 이는 LD50/ED50 비율로 나타낼 수 있다. 동물 연구로부터 수득한 데이타는 인간에 사용되는 투여량 범위로 제제화하는데 사용될 수 있다. 이러한 조성물에 함유되는 투여량은 독성이 거의 나타나지 않거나 전혀 나타나지 않는, ED50을 포함하는 순환 농도 범위에 포함될 수 있다. 투여량은 사용되는 투여 형태, 환자의 민감성 및 투여 경로에 따라 상기 범위 내에서 달라진다.
정확한 투여량은 치료를 필요로 하는 환자와 관련된 요인을 고려하여 실시자에 의해 결정될 수 있다. 투여량 및 투여는 충분한 수준의 항체를 제공하거나 또는 원하는 효과를 유지하도록 조정될 수 있다. 고려될 수 있는 요인으로는 질환 상태의 중증도, 대상체의 일반적인 건강 상태, 대상체의 연령, 체중 및 성별, 식습관, 투여 시간 및 횟수, 약물 조합(들), 반응 민감성 및 요법에 대한 허용성/반응이 있다.
본 발명의 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 구축하여, 트랜스페린-다중양이온-매개성 DNA 전달, 네이키드(naked) 또는 캡슐화된(encapsulated) 핵산으로의 형질감염, 리포솜-매개성 세포 융합, DNA-코팅된 라텍스 비드의 세포내 수송, 원형질체 융합, 바이러스 감염, 전기천공, "유전자 총(gene gun)" 및 DEAE- 또는 칼슘 포스페이트-매개성 형질감염 등을 비롯한 잘-수립된 기술을 이용하여 생체외 또는 생체내에서 세포에 도입할 수 있다.
항체의 생체내 유효 투여량은 환자 체중 1 kg 당 약 5 ㎍ 내지 약 500 ㎍의 범위이다. 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 투여하는 경우, 생체내 유효 투여량은 DNA 약 100 ng 내지 약 500 ㎍ 범위이다.
본 발명의 항체-함유 제약 조성물의 투여 방식은 항체를 숙주에 전달하는 임의의 적합한 경로일 수 있다. 하나의 예로, 본 발명의 제약 조성물은 비경구 투여 (예를 들어, 피하, 근육내, 정맥내 또는 비강내 투여)에 유용할 수 있다.
본 개시문에 인용된 모든 특허 및 특허 출원은 그 거명을 통해 본원에 참고로 포함된다. 상기 개시문은 일반적으로 본 발명을 설명한다. 하기 구체적 실시예를 참고하여 본 발명을 보다 상세하게 이해할 수 있으며, 단 하기 실시예는 단지 설명 목적을 위해 제공된 것일 뿐, 본 발명의 범위를 한정하지는 않는다.
본원에 기재한 구조물, 재료, 조성물 및 방법은 본 발명의 대표적인 예를 나타낸 것이며, 본 발명의 범위가 이러한 예의 범위로 제한되지 않는다는 것을 이해해야 한다. 당업자는 본 발명이 본원에 개시된 구조물, 재료, 조성물 및 방법에 변형을 가하여 실시될 수 있으며 이러한 변형은 본 발명의 범위 내에 속하는 것으로 간주된다는 것을 인지할 것이다.
실시예 1: 인간 조합 Fab 라이브러리 (HuCAL GOLD)의 구축
HuCAL® GOLD는 HuCAL® 기술 (인간 조합 항체 라이브러리(Human Combinatorial Antibody Library), 독일 마르틴스리드/플라네그 소재의 모르포시스 아게)을 기초로 하는 항체 라이브러리이다. 상기 라이브러리는 6개의 다양화된 CDR 영역을 특징으로 하는 Fab 포맷의 완전 인간 항체 합성 라이브러리를 고친화도 항체를 선별하는 디스플레이 기술, Cys디스플레이TM (독일 마르틴스리드/플라네그 소재의 모르포시스 아게)와 조합한다. Cys디스플레이TM는 디술피드 결합을 통한 표현형-유전자형 연결을 기초로 하는 1가 파지 디스플레이 기술로서, 고친화도의 특이적 항체의 회수를 허용한다.
파지 디스플레이 벡터 pMORPH®23은 Fab 단편의 1가 Cys디스플레이TM를 허용하는 파지미드 벡터이다. 이것은 전장 gIIIp, Fd 쇄 (VH-CH1) 및 경쇄 (VL-CL)를 코딩하며, 이것들 모두가 상응하는 단백질 쇄를 이. 콜라이의 주변세포질로 보내는 상이한 분비 신호 서열을 수반한다. ompA 및 phoA 신호 서열 모두가 중쇄 및 경쇄를 주변세포질로 수송하는데 이용되며, 상기 쇄들은 주변세포질에서 비-공유 상호작용을 통해 조립된다. 이러한 디스플레이 벡터는 유도가능한 lac 프로모터/오퍼레이터 영역을 보유한다. 발현 억제를 위한 laqIq 유전자 생성물은 이. 콜라이 숙주 균주 TG1에 의해 공급되었다. Cys-gIIIp 및 Fab 발현의 유도는 IPTG (이소프로필-β-D-티오-갈락토-피라노시드) 첨가로 달성되었다. 풍부해진 Fab 집합을 pMORPH®23으로부터 Fab 발현 벡터 pMORPH®x9에 제한 효소 XbaI 및 EcoRI을 사용하여 서브클로닝하였다. 이 단계까지, Fd 쇄 C-말단의 시스테인 및 링커-His6 부분 이 제거되었고, gIIIp가 절단되었다. 발현 벡터 pMORPH®x9_Fab_FH는 2개의 C-말단 태그 FLAG 및 6xHis를 제공하기 때문에 Fab 단백질의 검출 및 정제를 용이하게 한다.
파지미드 구제 및 파지 증식
TG1 세포 중의 HuCAL GOLD Fab 파지미드를 34 ㎍/mL 클로르암페니콜 및 1％ 글루코스가 보충된 2×TY 배지 중에서 증식시켰다. 37℃에서 30분 동안의 헬퍼 파지 감염 (VCSM13 약 2×1011 내지 6×1011 pfu/mL) 후에, TG1 세포를 원심분리로 농축시켰다. 상기 감염된 TG1 세포를 34 ㎍/mL 클로르암페니콜, 50 ㎍/mL 카나마이신 및 0.25 mM IPTG를 함유하는 2×TY 배지 중에서 22℃에서 밤새 인큐베이션시켜서 상기 파지를 증식시켰다. 파지를 함유하는 상등액을 상 패닝에 사용하였다.
실시예 2: 고상 패닝
맥시소르프(MaxiSorp)TM 플레이트 (미국 뉴욕주 로체스터 소재의 날젠 넌크 인터내셔널(Nalgene Nunc International)) 또는 디나비즈(Dynabeads)TM (미국 캘리포니아주 칼스배드 소재의 인비트로젠(Invitrogen))를 PBS 중 인간 MN 단백질 (웰 1개 당 1 ㎍씩 또는 비드 1 mg 당 1 ㎍씩)로 코팅하여 고상 패닝을 수행하였다. MN 단백질은 정제를 위한 C-말단 his태그를 갖는 상기 단백질의 전체 세포외 도메인을 나타낸다. MN 단백질을 포유동물 세포주 HKB-11에서 발현시키고, 당업자에게 공지된 표준 방법을 이용한 Ni-NTA 크로마토그래피로 정제하였다. 결합된 MN 단백 질을 함유하는 웰을 PBS 중 5％ 유액으로 차단하고 PBS 중에서 세척한 후에 1×1012개 HuCAL GOLD Fab 파지를 함유하는 사전-차단(pre-block)된 HuCAL GOLD 파지 라이브러리의 분취액과 함께 2시간 동안 실온에서 인큐베이션시켰다. 결합된 파지를 세척한 후에 10 mM Tris 완충제 (pH 8.0) 중 20 mM DTT로 용출시켰다. 3회의 패닝을 수행하면서, 상기한 바와 같이 각 회 사이마다 파지 증식을 수행하였다. 각 회의 패닝 사이에서 세척 엄격도를 증가시켜서 비-특이적 결합을 감소시켰다.
실시예 3: 이. 콜라이에서의 발현을 위한, 선별된 Fab 단편의 서브클로닝
선별된 Fab를 pMORPH®23 디스플레이 벡터로부터 pMORPH®x9_Fab_FH 발현 벡터로 클로닝하여, ELISA 스크리닝을 하기 위해 가용성 Fab가 신속하게 발현되는 것을 용이하게 하였다. pMORPH®23 벡터의 DNA 제제를 EcoRI 및 XbaI으로 소화시켜서, 전체 Fab-코딩 단편 (ompA-VL-VL 및 phoA-Fd)을 절단해 냈다. 이후의 정제 후에, 상기 단편을 상기 제조된 pMORPHx9_Fab_FH 벡터 (역시, EcoRI/XbaI으로 소화시켜 정제함)에 라이게이션시켰다. Fab 삽입물을 함유하는 벡터로 감응성 이. 콜라이 TG1 F- 세포를 전기천공으로 형질감염시켰다. 형질전환된 이. 콜라이 세포를 34 ㎍/mL 클로르암페니콜 및 1％ 글루코스를 함유하는 LB 플레이트에서 37℃에서 밤새 성장시켰다. 콜로니를 골라내어 34 ㎍/mL 클로르암페니콜 및 1％ 글루코스를 함유하는 배양 배지에 넣었다. 글리세롤을 20％로 첨가하고, 이 스톡(stock) 출발 배양물들을 ELISA에 필요할 때까지 -80℃에 저장하였다. 정제된 Fab를 얻기 위해서, 상기 벡터를 보유하는 이. 콜라이 형질전환체를 전형적으로 여러개의 1 L 진탕 플라스크 배양으로 성장시켜 수거하고, 당업자에게 공지된 방법을 이용한 Ni-NTA 친화도 크로마토그래피로 정제하였다.
실시예 4: ELISA에 의한, MN-결합 Fab 단편의 동정
맥시소르프 96웰 ELISA 플레이트를, PBS 중 5 ㎍/mL 농도의 정제된 인간 MN 단백질 용액 100 ㎕/웰로 코팅하였다. 출발 스톡 배양물로부터 34 ㎍/mL 클로르암페니콜을 함유하는 2×TY 배지 중에서 성장한 이. 콜라이 형질전환체를 이용하여 Fab를 발현시켰다. Fab 발현물을 수거하기 열두 (12)시간 전에 IPTG (최종 농도 0.5 mM)를 첨가하여 유도하였다. 세포를 용해시키고, 용해물 100 ㎕를 MN으로 사전 코팅되고 유액으로 차단된 맥시소르프 플레이트의 웰 내에서 2시간 동안 실온에서 인큐베이션시켰다. 이어서, 상기 플레이트를 TBS 및 Tween-함유 TBS 중에서 세척하여 비-특이적 결합을 제거하였다. 알칼리성 포스파타제에 접합된 염소 항-인간 (Fab')2 항체 (미국 일리노이주 록크포드 소재의 피어스 케미칼(Pierce Chemical))를 사용하여, 결합된 Fab를 검출하였다. 기질 AttoPhos (미국 캘리포니아주 알라메다 소재의 로쉐 다이아그노스틱스(Roche Diagnostics))를 제조업체의 지침서에서의 지시에 따라 사용하여, 430 nm에서 여기시키고 535 nm에서의 방출을 판독하였다.
많은 수의 이. 콜라이 형질전환체가 Fab를 발현하였고, ELISA에서 잡음(noise ration)에 대한 신호를 10 초과로 나타냈다. VH 영역과 VL 영역의 DNA 서열분석은 50개 초과의 독특한 MN-결합 Fab를 찾아내었다. 10종 항체의 전체 VH 및 VL의 DNA 및 단백질 서열을 이들의 기능적 성질을 기초로 하여 도 3 및 도 4에 각각 나타내었다. 이들 10종의 개시된 항체 각각은 포유동물 발현 세포주 HKB-11에서 단리한 정제된 MN 단백질에 ELISA에 의해 결합하였다 (도 5). 또한, 조사한 항체들은 MN의 세포외 도메인을 코딩하는 바쿨로바이러스로 감염된 sf9 곤충 세포에서 단리한 정제된 MN와 반응하였고 (도 5), 이것은 ELISA 상호작용이 MN 단백질에는 특이적이지만 단백질 제제 중의 임의의 미량 오염물질에는 특이적이지 않음을 입증하였다. BIAcoreTM 검정에서, 본 발명의 항체는 1 nM (1×10-9 M) 내지 약 50 nM (5.0×10-8 nM) 범위의 Kd로 인간 MN에 특이적으로 결합하였다 (도 5).
실시예 5: MN-결합 Fab 및 IgG의 동정
MN 단백질과 본 발명의 항체 사이의 결합 상호작용을 BIAcore 3000 기기 (스웨덴 웁살라 소재의 비아코어(BIAcore))에서의 표면 플라즈몬 공명 기술로 분석하였다. 전장 IgG (1e4, 1aa1 및 3ee9)의 결합을 위해서, 표준 아민 커플링 키트 (스웨덴 웁살라 소재의 비아코어)를 사용하여 염소 항-인간 IgG Fc를 CM5 바이오센서 칩에 고밀도로 공유결합 커플링시켰다. 이어서, 포획 검정을 이용하여 300 반응 단위의 BIAcore 신호를 목표로 하여 이들 IgG가 항-인간 IgG Fc-고정화 표면에 결합되도록 하였다. PBS/0.05％ Tween 20을 함유하거나 10 mM Na-HEPES (pH 7.5)/150 mM NaCl/3 mM EDTA/0.005％ Tween 20을 함유하는 운행 완충제를 10 ㎕/분의 유속으로 사용하여 25℃에서 BIAcore를 작동시켰다. 리간드 결합 후에는 유속을 25 ㎕/분으로 증가시키고, 여러가지 농도의 MN 분석물 (예를 들어, 50 nM 내지 1 nM의 범위)을 상기 표면에 10분 동안 흘려주어 결합 상을 모니터링할 수 있게 하였다. 이후, 35분 동안 해리를 진행시킨 후에 10 mM 인산 100 ㎕를 100 ㎕/분으로 사용하여 항-인간 IgG Fc-고정화 표면을 재생시켰다. 1:1 랭뮈르(Langmuir) 결합 모델로 센서그램(sensorgram)을 핏팅하여 속도 상수를 계산하였다. MN에 대한 Fab의 결합을 유사하게 결정하였으나, 여기서는 항-인간-Fab IgG를 칩에 고정화시키고 MN 결합의 평가 전에 Fab를 포획하는데 사용하였다. 도 5는 개시한 항체가 정제된 MN 단백질에 결합하는 것에 대한 결합 상수를 보여준다. 각각의 항체는 MN에 결합하였고, 이때 0.15 nM 내지 50 nM 범위의 Kd 값을 나타내었다.
실시예 6: 293F 세포에서의 일시적 항체 발현을 위한 HuCAL 이뮤노글로불린 발현 벡터의 구축
중쇄 발현 벡터: pcDNA3.1+ (미국 캘리포니아주 칼스배드 소재의 인비트로젠)의 다중 클로닝 부위를 제거하고 (NheI/ApaI), 리더 서열 (NheI/EcoRI), VH-도메인 (EcoRI/BlpI) 및 이뮤노글로불린 불변 영역 (BlpI/ApaI)의 라이게이션을 위해서 HuCAL에 사용되는 제한 부위와 상용성인 부위를 삽입하였다. 리더 서열 (EMBL M83133)은 코자크(Kozak) 서열 [Kozak, Nucleic Acid Res. 15:8125-8148, 1987]을 갖고 있었다. 인간 IgG1 (PIR J00228), IgG4 (EMBL K01316) 및 혈청 IgA1 (EMBL J00220)의 불변 영역을 약 70개 염기 길이의 중첩 올리고뉴클레오티드로 절단해 냈다. 침묵(silent) 돌연변이를 도입하여, HuCAL 디자인과 비-상용성인 제한 부위를 제거하였다. 올리고뉴클레오티드를 중첩 연장-PCR로 스플라이싱하였다.
경쇄 발현 벡터: pcDNA3.1/Zeo+ (미국 캘리포니아주 칼스배드 소재의 인비트로젠)의 다중 클로닝 부위를 2개의 상이한 부위로 대체하였다. κ-부위는, κ-리더 (NheI/EcoRV), HuCAL-scFv Vk-도메인 (EcoRV/BsiWI) 및 κ-쇄 불변 영역 (BsiWI/ApaI)의 삽입을 위한 제한 부위를 제공하였다. λ-부위에서 상응하는 제한 부위는 NheI/EcoRV (l-리더), EcoRV/HpaI (Vl-도메인) 및 HpaI/ApaI (λ-쇄 불변 영역)이었다. κ-리더 (EMBL Z00022) 뿐만이 아니라 λ-리더 (EMBL L27692) 역시 둘다 코자크 서열을 갖고 있었다. 인간 κ-쇄 (EMBL J00241) 및 λ-쇄 (EMBL M18645)의 불변 영역은 상기한 바와 같은 중첩 연장-PCR로 조립하였다.
Fab로부터 전장 IgG의 생성: 이. 콜라이 발현 벡터 pMORPHx9_Fab_FH 내에 함유된 Fab 중쇄 서열은, pMORPHx9_Fab_FH를 MfeI/BlpI으로 절단하고, EcoRI/BlpI으로 절단해 둔 상기 중쇄 발현 벡터로 라이게이션시켰다. pMORPHx9_Fab_FH 내에 함유된 Fab 카파 경쇄 서열은, pMORPHx9_Fab_FH를 EcoRV/BsiWI로 절단하고, 역시 EcoRV/BsiWI으로 절단해 둔 상기 카파 경쇄 발현 벡터로 라이게이션시켰다. pMORPHx9_Fab_FH 내에 함유된 Fab 람다 경쇄 서열은, pMORPHx9_Fab_FH를 EcoRV/HpaI으로 절단하고, 상기한 람다 발현 벡터로 라이게이션시켰다.
전장 IgG의 일시적인 대규모 발현: Cellbag 20L/0 (미국 뉴저지주 소머르세트 소재의 웨이브 바이오테크 엘엘씨(Wave Biotech LLC))에 프리스타일(Freestyle) 293 발현 배지 (인비트로젠) 9.3 L 중 0.25×106개 293F 세포/mL (인비트로젠)를 접종하였다. 세포를 1×106개/mL의 밀도로 성장시키고, 293fectin 시약 (인비트로젠) 을 함유하는 옵티멤(Optimem) (인비트로젠) 350 mL 중 전장 항체를 코딩하는 경쇄 발현 벡터 및 중쇄 발현 벡터 각각 5 mg씩을 첨가하여 형질감염시켰다. 96시간 동안 37℃에서 발효시킨 후에, 세포 배양 상등액을 원심분리로 수거하여 멸균 여과하고, pH 7.6으로 조정한 접면 유동(tangential flow) 여과로 농축시킨 후에 표준 단백질 A 컬럼 크로마토그래피 (미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재의 아머샴 파르마샤 바이오테크(Amersham Pharmacia Biotech))를 실시하였다.
실시예 7: 세포 부착 검정
PBS 중 1 ㎍/mL의 정제된 MN 용액 오십 (50) ㎕를 미처리 96웰 플레이트에 밤새 4℃에서 흡착시켰다. 상기 용액을 제거하고, PBS로 3회 헹궜다. 웰들을 RPMI1640 배지 중 50％ FBS 200 ㎕로 1시간 동안 차단시켰다. 이어서, 상기 웰에 PBS 중 1％ BSA 중의 1e4 항-MN 항체 100 ㎍, PBS 중 1％ BSA 중의 대조군 IgG 또는 PBS 중 1％ BSA를 처리하였다. PBS로 세척한 후에 5000개의 MaTu 세포 (MN+ 세포)를 상기 웰에 첨가하고, 플레이트를 밤새 37℃에서 5％ CO2하에 인큐베이션시켰다. MaTu 세포가 MN-코팅된 웰에 부착하는 것을 차단하는 항-MN 항체의 능력은, PBS로 세척한 후에 평가하였다. 본 실험의 예를 도 6에 나타내었고, 여기서 항-MN 항체 1e4 100 ㎍은 세포 부착을 억제한 반면에 대조군 IgG 또는 완충제 비히클은 그렇지 않았다.
실시예 8: 면역접합체를 사용한, 피하 이종이식 암 모델
항-MN 항체를 당업계에 공지된 프로토콜 (예를 들어, [Liu, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 93:8618-8623, 1996])을 이용하여 세포독성 소분자에 접합시켰다. 인간 유방 이종이식물인 MaTu 세포를 10％ FBS가 보충된 RPMI 중에서의 접착성 배양물로서 유지시켰다. Ncr 누드 마우스 (8주 내지 12주령)에게 80％ 매트리겔/20％ HBSS 0.1 mL 중 5×106개 세포를 오른쪽 옆구리에 피하 접종하였다. 종양이 평균 크기 약 180 mg에 도달했을 때 (6일) 처치를 개시하였다. 세포독성 소분자에 접합된 모노클로날 항체를 매 4일마다 1회씩 (Q4D×3) 10 mg/kg의 투여량으로 i.v. 투여하였다. 대조군 마우스에게는 PBS 또는 미접합 모노클로날 항체를 처치하였다. 각 동물의 건강 상태를 매일 검사하였다. 각 실험군은 10마리 마우스로 구성되었고, 투여 부피는 체중 10 g 당 0.1 mL이었다. 각 종양의 길이 및 폭은 전자 캘리퍼로 1주 당 2회 내지 3회 측정하였고, 종양의 중량 (mg)은 [길이 (mm)×폭 (mm)2]/2의 식을 기초로 계산하였다. 1일 관찰결과를 포함하는, 연구 기간 내내 수집한 모든 데이타를 분석하였다. 종양 성장 억제율 (TGI)은 (1-T/C)×100 (여기서, T = 처치군의 최종 종양 중량, C = 대조군의 최종 종양 중량)으로 계산하였다. 도 7은 모노클로날 IgG1 1e4가 세포독성 약물에 접합된 경우에 30 mg/kg의 면역접합체에서는 유의한 항-종양 효과가 발생하지만, 미접합 항체는 효과가 없다는 것을 보여준다. 이러한 데이타는 MN 단백질에 대한 항체가 종양으로 세포독성 약물을 전달하기 위한 비히클로서 치료 유용성을 갖는다는 것을 입증한다.
실시예 9: 형광-활성화 세포 분류 검정 (FACS 검정)
세포를 진단 도구로서의 MN 발현에 대하여 검정할 수 있다. 접착성의, MN을 발현하는 PC-3 mm2 세포 및 MN을 발현하지 않는 DLD1 세포를 PBS 용액 중 1:10 트립신/베르센(Versene)을 5분 내지 10분 동안 사용하여 이들 세포의 플라스크에서 떼어냈다. 세포를 회전시켜 가라앉히고 (1000 rpm, 5분), 빙냉 RPMI 10％ FBS로 1회 세척하여 빙냉 염색 완충제 (Ca+ Mg+ -무함유 PBS, 2％ BSA, 및 0.05％ 아지드화나트륨) 중에 6×106개 세포/mL로 재현탁시켰다. 1차 항체인 인간 항-MN IgG1 또는 대조군 인간 IgG1 항체를 25 ㎍/mL로 사용하여 6×105개 세포와 함께 빙상에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 미결합 항체는 빙냉 염색 완충제로 세포로부터 세척해 냈다. 상기 세포를 PBS 중 2％ 포름알데히드로 10분 동안 고정시킨 후에 염색 완충제로 2회 세척하였다. 세포 펠렛을 항-인간 알렉사 플로어(Alexa Fluor) 488 2차 항체 (최종 농도는 1:200, 몰레큘라 프로브즈(Molecular Probes)/인비트로젠, 미국 캘리포니아주 칼스배드 소재)를 함유하는 빙냉 염색 완충제 100 ㎕ 중에 재현탁시키고, 빙상에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 미결합 항체는 유동 완충제 (2％ BSA를 함유하는 PBS)를 2회 사용하여 세포로부터 세척해 내고, 세포를 유동 완충제 1 mL 중에 재현탁시켰다. 재현탁시킨 세포의 FACS 분석은 벡크만 FACS 칼리버(Beckman FACS Caliber) 기기에서 수행하였다. 도 8은, PC-3 mm2 인간 전립선암 세포는 FACS로 검정시에 MN을 발현하였지만, DLD-1 세포는 그렇지 않았음을 보여준다.
실시예 10: 항체-의존적 세포 매개 세포독성 검정 (ADCC 검정)
항-MN IgG의 항-종양 활성은 ADCC 활성에 의해 매개될 수 있다. MN을 발현 하는 PC-3 mm2 세포 및 MN을 발현하지 않는 HCT-116 세포를 250 ng/mL, 1000 ng/mL 또는 2000 ng/mL의 인간 항-MN IgG1 또는 대조군 인간 IgG1 항-디곡신 항체와 함께 인큐베이션시켰다. 인간 PBMC를 이들 세포에 50:1, 25:1 및 5:1 비율의 이펙터(effector):표적 비율로 가하였다. 크롬-51 방출 검정을 수행하여 표적 세포 용해 수준을 결정하였다. DLD 및 PC-3 mm2 세포의 존재하에 대조군 항체와 인큐베이션하거나 항체 없이 인큐베이션했을 때 소량의 용해가 관찰되었다. 이러한 자발적인 용해 수준은 50:1, 25:1 및 5:1의 표적:이펙터 비율 각각에 대하여 10％ 내지 15％, 5％ 내지 10％ 또는 2％ 내지 3％였다. 유사하게, MN을 발현하지 않는 DLD 세포의 용해는 항-MN 항체와 인큐베이션시킨 경우에 0 내지 10％ 범위였다. 그러나, 인간 항-MN IgG와 인큐베이션시킨 경우의 PC-3 mm2 세포 용해는 대조군보다 유의하게 더 높았다. 50:1의 표적:이펙터 비율로 250 ng/mL, 1000 ng/mL 및 2000 ng/mL를 사용한 경우에는 40％, 50％ 및 60％의 용해가 관찰되었다. 유사하게, 25:1의 비율에서는 30％, 33％ 및 38％의 용해가 관찰되었고, 마지막으로 5:1의 표적:이펙터 비율에서는 8％, 10％ 및 15％의 용해가 관찰되었다. 이러한 실험은 인간 항-MN 항체가 항-종양 ADCC 활성을 매개하며, 암의 치유적 치료에 사용될 수 있음을 보여준다.
실시예 11: 면역접합체
제조
다양한 인간 Fab를 코딩하는 파지 디스플레이 라이브러리 (모르포시스)를 사용하여, MN 세포 표면 항원에 대한 인간 항체를 생성하였다. 이 항체를 모노메틸 라우리스타틴 E (MMAE) [Fransisco et al., Blood, 2003, 102:1458-1465]에 접합시켰다 (도 9).
시험관내 활성 및 선택성
3ee9/MMAE의 항체 부분 (3ee9)은, 1010개의 인간 Fab 단편 (Fab는 항체의 항원 결합 부분임)으로 이루어진 모르포시스 파지 라이브러리에 대한 정제된 인간 MN 세포외 도메인을 시험관내 "패닝"하여 동정하였다. 활성 Fab를, 이것들이 MN 양성 세포에 첨가될 때 그와 선택적으로 결합하고 내재화되는 능력에 대하여 추가로 조사하였다. 이어서, 생성된 활성 Fab를 전장 인간 IgG1 항체로 전환시켜서 CHO 세포에서 발현시키고 정제한 후에 독성단인 MMAE [Liu et al, Proc Natl Acad Sci, 1996, 93:8618-8623]에 접합시켰다. 이어서, 상기 접합된 항체를, 이것들이 MN-발현 세포를 사멸시키는 능력에 대하여 시험하였다. 시험한 7종의 전장 항체 패널 중에서, 시험관내 및 생체내 검정 둘다에서의 결합 성질, 선택성 및 역가를 기초로 하여 3ee9/MMAE가 선별되었다.
표면 플라즈몬 공명 (Biacore) 재료 및 방법
HKB11에서 발현된 인간 MN 단백질과 인간 전장 항-MN MAb 사이의 결합 상호작용을 BIAcore 3000 기기 (스웨덴 웁살라 소재의 비아코어)에서의 표면 플라즈몬 공명 기술로 분석하였다. 칩 제조를 위해서, 표준 아민 커플링 키트 (스웨덴 웁살라 소재의 비아코어)를 사용하여 염소 항-인간 IgG Fc를 CM5 바이오센서 칩에 공유결합 커플링시켰다. 이어서, 포획 검정을 이용하여 300 반응 단위의 BIAcore 신호 를 목표로 하여 상기 관심 항체가 항-인간 IgG Fc-고정화 표면에 결합되도록 하였다. 10 mM Na-HEPES (pH 7.5)/150 mM NaCl/3 mM EDTA/0.005％ Tween 20을 함유하는 운행 완충제를 10 ㎕/분의 유속으로 사용하여 25℃에서 BIAcore를 작동시켰다. 리간드 결합 후에는 유속을 25 ㎕/분으로 증가시키고, MN 분석물 (50 nM 내지 1 nM)을 상기 표면에 10분 동안 흘려주어 결합 상을 모니터링할 수 있게 하였다. 이후, 35분 동안 해리를 진행시킨 후에 10 mM 인산을 100 ㎕/분으로 사용하여 항-인간 IgG Fc-고정화 표면을 재생시켰다. 1:1 랭뮈르 결합 모델을 이용하여 센서그램을 핏팅하여 속도 상수를 계산하였다 (하기 표 1).
가용성 MN에 대한 패닝-유도된 항체의 친화도
(표면 플라즈몬 공명 (Biacore)으로 측정함)
1E4 3EE9 1AA1 3A4 5AA3 3EF2
친화도
(K d , nM) 		5 4 27 1 1 6
항체 결합
3ee9/MMAE는 Biacore 기술을 사용할 때 정제된 MN 단백질에 대하여 3.6 nM의 Kd를 갖는 것으로 나타났고, 이것은 미접합 항체 3ee9의 친화도와 동일한 정도였다. MN (CA IX)에 대한 결합은 특이적이라고 여겨지는데, 13종의 다른 탄산 탈수효소에 대하여는 검출가능하게 결합하지 않기 때문이다. 미토콘드리아-결합 CA5에 대한 결합이 관찰되었지만, 상기 동위효소는 생체내에서는 항체에 접근할 수 없다.
FACS 분석을 통해 3ee9/MMAE는 MN-발현 MaTu 세포에는 결합하지만 MN-음성 DLD 세포에는 결합하지 않는 것으로 나타났다 (도 10a). MN 항체 G250, 인간화 IgG1 항체 (윌렉스(Wilex))를 시험관내 연구 내내 기준물로서 사용하였다. 이것은 5.3 nM의 Kd로 MN에 결합하였고, MN+ 및 MN- 세포주에 대하여 3ee9/MMAE와 유사한 결합 프로파일을 나타내었다.
항체 1E4 및 1aa1 면역접합체에 대하여도 유사한 결과가 얻어져서 (각각 도 10b 및 도 10c), MN+ 세포에는 결합하지만 MN- 세포에는 결합하지 않는 것으로 나타났다.
항체 내재화
3ee9/MMAE는 셀로믹스(Cellomics)로 측정했을 때 MN-발현 세포 (PC3mm2)에 의해서는 선택적으로 내재화되지만 MN-음성 세포 (DLD1)에 의해서는 그렇지 않았다 (도 11a). 유사하게, 1E4 면역접합체는 MN+ 세포 (PC3mm2)에 의해서는 내재화되지만 MN- (DLD1) 세포에 의해서는 그렇지 않는다는 것도 밝혀졌다 (도 11b).
면역침전
특이성을 추가로 연구하기 위해서, 3ee9/MMAE의 항체 부분 (3ee9)을 비롯한 각종 후보 항체 및 기준 항체 G250을, 바이오틴으로 선택적으로 표지해 둔 MN+ (Pc3mm2) 및 MN- (DLD-1) 세포주의 세포 용해물과 함께 인큐베이션시켰다. 항체와 세포 단백질 사이의 복합체는 면역침전되었고, 동시침전된 항원은 효소-결합된 스트렙타비딘으로 발색시킨 면역블롯을 이용하여 가시화하였다. G250과 3ee9/MMAE의 3ee9 항체 모두가 MN+ 세포의 MN과 동일 크기의 단일 밴드에 선택적으로 결합하고 동시 면역침전되었다 (도 12). 3ef2, 5aa3 및 5A6과 같은 덜 특이적인 항체는 MN 뿐만이 아니라 여러가지 다른 단백질과도 동시 면역침전되었다.
세포독성
시험관내 세포독성 검정을 수행하였다. 3ee9/MMAE는 MN-발현 PC3mm2 세포에는 고도로 세포독성이지만 (EC50 = 50 nM), MN-음성 MIAPaca2 세포에는 그렇지 않은 것으로 밝혀졌다 (도 13a). 1μM이나 되는 높은 투여량에서도 MN-음성 세포는 10％ 미만으로 사멸하는 것으로 나타났다. 또한, 시험관내 세포독성 검정에서 1A4 면역접합체는 MN+ 세포 (PC3mm2 및 MaTu)에게는 선택적으로 세포독성이지만 MN- 세포 (MIAPaca2 및 DLD1)에게는 그렇지 않은 것으로 나타났다 (도 13b). 추가로, 시험관내 세포독성 검정에서 1aa1 면역접합체는 MN+ 세포 (PC3mm2)에게는 선택적으로 세포독성이지만 MN- 세포 (MIAPaca2)에게는 그렇지 않은 것으로 나타났다 (도 13c).
3ee9/MMAE에 의해 전달되는 세포독성 약물 MMAE는 세포의 체세포분열 동안의 방추 형성을 저해하여 G2/M 정지를 초래하는 튜불린 억제제이다. 3ee9/MMAE를 MN-발현 세포 (Pc3mm2) 및 MN을 발현하지 않는 세포 (H460)에게 처치한 효과는 도 14에 나타내었다. 튜불린을 형광-표지된 항체로 염색하였다. 미처치 세포는 정상적인 방추 형성을 나타내었지만, 처치한 MN-발현 세포는 MMAE와 튜불린의 결합 및 정상적인 방추 형성 저해로 인해 단편화된 섬유를 나타내었다. MN을 발현하지 않는 세포에서는 활성이 나타나지 않았다. 이러한 연구는 항체 약물 접합체 3ee9/MMAE가 표적화된 튜불린 파괴를 통해 세포를 파괴시킨다는 것을 확인시켜 준다.
실시예 12: 면역접합체의 생체내 활성
피하 이식된 인간 이종이식 암 모델에 대한, 3ee9/MMAE의 생체내 약리
3ee9/MMAE는 정맥내 경로를 통해 간헐적인 스케쥴로 투여할 때 무흉선 마우스 중 다중 인간 이종이식 종양 모델의 성장에 대하여 유의하고 일관적인 항-종양 효과를 나타낸다. 3ee9/MMAE의 생체내 항-종양 효과를 6종의 상이한 인간 이종이식 종양 모델에서 조사하였다. 이들 모델은 인간 종양 세포를 암컷 무흉선 NCr (nu/nu) 마우스 (미국 뉴욕주 소재의 타코닉(Taconic))에게 피하 이식하여 수립되었다. 평가한 인간 종양 이종이식 모델은 MaTu 인간 유방 암종 모델, HT-29 및 Colo-205 인간 결장직장 암종 (CRC) 모델, PC3MM2 전립선 암종 모델, HCT-15 다중-약물 내성 (P-gp) CRC 모델 및 MiaPaCa2 인간 췌장 모델을 포함하였다. PBS를 비히클로 사용하였고, 투여 용액은 매일 새로 제조하였다. 투여 부피는 10 g 당 0.1 mL (1 kg 당 10 mL)이었다.
각 종양의 길이와 폭을 전자 캘리퍼로 1주 당 2회 내지 3회 측정하였고, 종양 중량 (mg)은 [길이 (mm)×폭 (mm)2]/2의 식을 기초로 계산하였다. 1일 관찰결과를 포함하는, 연구 기간 내내 수집한 모든 데이타를 항-종양 데이타 획득 시스템 (Anti-tumor Data Acquisition System, ADAS)에서 분석하였다. 최대 허용 투여량 (MTD)은 20％ 치사율 및/또는 20％ 알짜 체중 손실률을 넘지 않는 최고 투여량으로 정의된다. 종양 성장 억제율 (TGI)은 (1-T/C)×100 (여기서, T = 마지막 투여 후 처치군의 최종 종양 중량, C = 마지막 투여 후 대조군의 최종 종양 중량)으로 계산하였다. 또한, 항-종양 효능은 초기 크기의 50％ 이하인 크기를 갖는 종양으로 정의되는 반응 (또는 반응자 또는 퇴행)의 발생으로 측정하였다. 지속적이라고 여겨지는 반응에는 최소 7일의 기간이 필요하다.
MaTu 이종이식 모델 중 3ee9/MMAE의 효능
인간 유방 이종이식물인 MaTu 세포를 10％ FBS가 보충된 RPMI 중에서의 접착성 배양물로서 유지시켰다. NCr 누드 마우스 (8주 내지 12주령)에게 80％ 매트리겔/20％ HBSS 0.1 mL 중 5×106개 세포를 오른쪽 옆구리에 피하 접종하였다. 종양이 평균 크기 약 180 mg에 도달했을 때 (7일) 처치를 개시하였다. BAY 79-4620 (3ee9-IC)을 매 4일마다 1회씩 (Q4D×3) 1 mg/kg, 3 mg/kg 및 10 mg/kg의 투여량으로 i.v. 투여하였다. 대조군 마우스에게는 PBS 또는 미접합 모노클로날 항체를 10 mg/kg의 투여량으로 처치하였다.
각 동물의 건강 상태를 매일 검사하였다. 각 실험군은 10마리 마우스로 구성되었고, 투여 부피는 체중 10 g 당 0.1 mL이었다. 각 종양의 길이와 폭을 전자 캘리퍼로 1주 당 2회 내지 3회 측정하였고, 종양 중량 (mg)은 [길이 (mm)×폭 (mm)2]/2의 식을 기초로 계산하였다. 1일 관찰결과를 포함하는, 연구 기간 내내 수집한 모든 데이타를 분석하였다. 종양 성장 억제율 (TGI)은 (1-T/C)×100 (여기서, T = 처치군의 최종 종양 중량, C = 대조군의 최종 종양 중량)으로 계산하였다.
3ee9/MMAE는 조사한 모든 투여량에서 잘 허용되어, 모든 처치 동물은 유의한 중량 손실을 나타내지 않았다. MaTu 종양 모델에서 3ee9/MMAE의 대표적인 효능을 도 15에 예시하였다. 미처치 및 비히클-처치된 대조군 둘다의 종양은 모든 동물에서 점진적으로 성장하였다. 대조군 및 비히클군 중의 동물에 대한 평균 2배 증식 시간은 11.2일이었다. 투여가 끝났을 때, 3ee9/MMAE는 조사한 모든 투여량에서 강한 항-종양 효능을 나타냈다. 더욱 구체적으로, BAY 79-4620 (3ee9-IC)은 1 mg/kg, 3 mg/kg 및 10 mg/kg 각각에서 67％, 72％ 및 78％의 TGI를 생성하였다. 이와 비교하여, 미접합 3ee9 mAb는 상기 유방 이종이식 종양의 성장 억제에 있어서 유의한 효과를 갖지 않았다.
미리 결정해 둔 투여 방식 (Q4D×3)을 완료한 후, 종양 성장 지연 및 퇴행에 대한 3ee9/MMAE의 효과를 결정하였다. 도 15에 나타낸 바와 같이, 3ee9/MMAE 처치에 의해 유의한 종양 성장 지연 및 퇴행이 야기되었다. 조사한 최저 투여량 (1 mg/kg)에서는 처치 중단 후에 약 2주 동안은 종양이 안정적으로 유지되었고, 이후에는 다시 성장하기 시작하였다. 전체적으로, 30％의 종양이 1 mg/kg의 이러한 처치에 반응성이었다. 이와 비교하여, 3 mg/kg 및 10 mg/kg으로 처치한 경우에는 100％의 동물이 반응하였다. 처치 중단 후 약 3개월이 지난 후일지라도 3 mg/kg 및 10 mg/kg 군에서는 각각 오직 3개 및 1개의 종양만이 재성장의 신호를 나타내었으며, 70％ 및 90％의 동물들은 처치 중단 후 약 90일이 지난 후일지라도 종양이 없는 상태로 유지되었다는 점을 주목해야 한다.
모노클로날 IgG1 1E4가 세포독성 약물과 접합된 경우, 이것은 30 mg/kg의 면역접합체로 투여될 때 인간 유방 이종이식물인 MaTu에 대하여 유의한 항-종양 효과를 나타내었지만, 미접합 항체는 효과가 없었다 (도 16). 동일한 프로토콜을 사용하지만 접합된 형태의 항체 1aa1 (도 17), 3ee9 및 5aa3으로 대체한 추가의 실험은 유사한 결과를 제공하였다. 추가로, HT-29 및 Colo-205 인간 결장직장 암 이종이식 모델 및 PC3-mm2, 인간 전립선 이종이식 모델을 비롯한 여러가지 조직학적 유형에서 유래된 다른 인간 이종이식 모델에서도 접합된 형태의 3ee9 사용시에는 항-종양 효과가 나타났다. 이러한 데이타는 MN 단백질에 대한 항체가 종양으로 세포독성 약물을 전달하기 위한 비히클로서 치료 유용성을 갖는다는 것을 나타낸다.
실시예 13: MaTu 이종이식 모델에서 3ee9/MMAE의 치료 지수 결정
3ee9/MMAE의 최대 허용 투여량 (MTD), 최소 효능 투여량 (MED) 및 치료 지수 (TI)를 MaTu 이종이식 종양-보유 마우스를 사용하여 결정하였다. TI는 MTD를 MED로 나눈 비율로 정의된다. 3ee9/MMAE를 매 4일마다 1회씩 총 3회 주사 (Q4D×3)로 하여 정맥내 투여하였다. 3ee9/MMAE를 0.625 mg/kg, 1.25 mg/kg, 2.5 mg/kg, 5.0 mg/kg, 10 mg/kg, 30 mg/kg 및 60 mg/kg의 투여량 수준으로 투여하였다. 대조군 마우스에게는 PBS 또는 미접합 모노클로날 항체를 60 mg/kg의 투여량으로 처치하였다. 60 mg/kg으로 투여된 3ee9/MMAE가 MTD인 것으로 나타났고, 이러한 처치에 대한 반응으로 10％ 치사율 및 약 20％ 체중 손실률이 있었다. 모든 다른 처치군은 잘 허용되었다.
3ee9/MMAE의 항-종양 활성을 도 18에 나타내었다. 투여 종료시, 0.625 mg/kg 및 1.25 mg/kg 투여량의 3ee9/MMAE는 각각 62％ 및 81％ 억제를 야기했다. 2.5 mg/kg, 5 mg/kg, 10 mg/kg, 30 mg/kg 및 60 mg/kg의 투여량에서는 종양 성장이 더 많이 억제되었고 (약 90％), 대다수의 종양이 퇴행을 나타내기 시작했다. 관찰된 데이타를 기초로 할 때, 3ee9/MMAE의 MED는 0.625 mg/kg이었다. 미리 결정해 둔 투여 방식 (Q4D×3)을 완료한 후, 종양 성장 지연 및 퇴행에 대한 3ee9/MMAE의 효과를 결정하였다. 0.625 mg/kg의 투여량에 대하여는 종양 퇴행이 나타나지 않았다. 반대로, 80％의 동물은 1.25 mg/kg에 대한 반응으로 종양 퇴행을 나타내었다. 또한, 2.5 mg/kg 및 그 이상의 투여량에서는 100％의 동물이 처치에 반응하였다. 3ee9/MMAE의 치료 지수는 약 96인 것으로 결정되었다.
실시예 14: HT-29 이종이식 모델 중 3ee9/MMAE의 효능
인간 CRC 이종이식물인 HT-29 세포를 HBSS 0.1 mL 중 5×106개 세포로 오른쪽 옆구리에 피하 접종하였다. 종양이 평균 크기 약 120 mg에 도달했을 때 (5일) 처치를 개시하였다. 3ee9/MMAE를 매 4일마다 1회씩 (Q4D×3) 0.625 mg/kg, 1.25 mg/kg, 2.5 mg/kg, 5.0 mg/kg, 10 mg/kg의 투여량으로 i.v. 투여하였다. 대조군 마우스에게는 PBS 또는 미접합 모노클로날 항체를 10 mg/kg의 투여량으로 처치하였다. 추가로, MMAE를 0.1 mg/kg, 0.2 mg/kg 및 1 mg/kg 투여량의 유리 약물로서도 평가하였다. MMAE의 투여량 0.1 mg/kg 및 0.2 mg/kg은, 상기 약물이 각각 5 mg/kg 및 10 mg/kg의 3ee9/MMAE에 존재하는 것과 동등한 양이다.
3ee9/MMAE는 조사한 모든 투여량에서 잘 허용되어, 모든 처치 동물은 유의한 중량 손실을 나타내지 않았다. 유사하게, 더 낮은 투여량의 MMAE, 즉 0.1 mg/kg 및 0.2 mg/kg 투여량의 MMAE 역시 잘 허용되어 유의하지 않은 최소의 중량 손실을 나타내었다. 그러나, 1 mg/kg의 최고 투여량에서는 나머지 동물에서 50％ 치사율이 관찰되었고, 심각한 중량 손실이 나타나서 독성인 것으로 간주되었다.
HT-29 종양 모델에서 3ee9/MMAE 및 유리 MMAE의 대표적인 효능을 도 19에 예시하였다. 미처치 및 비히클-처치된 대조군의 종양은 모든 동물에서 점진적으로 성장하였다. 대조군 및 비히클군 중의 동물에 대한 평균 2배 증식 시간은 6.4일이었다. 투여 종료시, 3ee9/MMAE는 조사한 모든 투여량에서 강한 항-종양 효능을 나타냈다. 더욱 구체적으로, 3ee9/MMAE는 0.625 mg/kg, 1.25 mg/kg, 2.5 mg/kg, 5 mg/kg 및 10 mg/kg의 투여량 각각에서 54％, 72％, 97％, 100％ 및 100％의 TGI를 생성하였다. 이와 비교하여, 유리 MMAE는 0.2 mg/kg에서 60％의 유의한 TGI를 나타낸 반면에 0.1 mg/kg에서는 상기 이종이식 모델의 성장 억제에 있어서 유의한 효과를 갖지 않았다. 종양 반응의 측면에서, 3ee9/MMAE를 1.25 mg/kg으로 투여한 경우에는 20％의 동물에서 퇴행이 나타났다. 더 높은 투여량에서는 종양 반응이 훨씬 더 높아서, 2.5 mg/kg에서는 90％ 퇴행이 나타났고 5 mg/kg 및 10 mg/kg에서는 100％ 반응이 유도되었다. 반대로, 유리 MMAE는 앞서 정의한 바와 같은 어떠한 종양 반응도 유도하지 않았다.
또한, 3ee9/MMAE의 항-종양 효과도 스케쥴을 변화시키면서, 즉 1주 당 1회 씩 총 2회 투여 (Q7D×2, 도 20) 및 병기분류(staging)시의 단일 투여 (Q1D×1, 도 21)로 평가하였다. 2가지 스케쥴 모두에서 3ee9/MMAE는 0.625 mg/kg, 1.25 mg/kg, 2.5 mg/kg, 5 mg/kg 및 10 mg/kg으로 투여되었다. 스케쥴과는 무관하게, 3ee9/MMAE는 상기 CRC 이종이식 모델에서 성장을 억제하는데 있어서 고도로 효과적이었다.
하기 표 2는 3ee9/MMAE의 항-종양 효능을 요약한다. 항-종양 효능은 Q4D×3 스케쥴에서 3ee9/MMAE에 대하여 관찰된 것과 매우 유사하였고, 이는 조사한 스케쥴에서는 3ee9/MMAE의 항-종양 효능이 스케쥴과는 무관하다고 여겨짐을 나타낸다.
Figure 112008050165144-pct00001
실시예 15: PC3mm2 및 Colo-205 이종이식 모델 중 3ee9/MMAE의 효능
다음으로, 3ee9/MMAE의 항-종양 활성을 인간 전립선 (PC-3mm2) 및 CRC (Colo-205) 종양 이종이식물에 대하여 평가하였다. 암컷 NCr nu/nu 마우스에게 5×106개 PC3mm2 또는 Colo-205 세포를 피하 (s.c.) 이식하였다. 종양이 평균 크기 대략 125 mg 내지 150 mg에 도달했을 때 처치를 개시하였다. 마우스의 일반적인 건강을 매일 모니터링하고 기록하였다. 종양 치수 및 체중을 처치 제1일부터 시작하여 1주에 2회씩 기록하였다.
PC3mm2 및 Colo-205 연구에서는 3ee9/MMAE를 매 4일마다 1회씩 총 3회 주사 (Q4D×3)로 하여 각각 1 mg/kg, 3 mg/kg, 10 mg/kg 및 30 mg/kg의 투여량 및 1.25 mg/kg, 2.5 mg/kg, 5 mg/kg 및 10 mg/kg의 투여량으로 정맥내 (i.v.) 투여하였다. 다른 연구에서와 같이, 3ee9/MMAE는 평가한 모든 투여량에서 잘 허용되었다. 3ee9/MMAE는 10 mg/kg 및 30 mg/kg의 투여량 수준으로 투여되었을 때 수립된 PC3MM2 전립선 종양의 성장을 억제하여, 100％의 동물이 반응을 나타내었다 (도 22). 1 mg/kg 및 3 mg/kg의 더 낮은 투여량에서는 투여 종료시에 45％ 내지 50％의 TGI를 나타내어 중간 정도의 효과만이 관찰되었다. 그러나, 20％의 동물은 3 mg/kg 군에서 반응을 나타냈다.
유사하게, Colo-205 CRC 이종이식 모델에서 3ee9/MMAE는 종양 성장을 억제하는데 있어서 고도로 효과적이었다 (도 23). 투여 종료시, 5 mg/kg 및 10 mg/kg의 투여량에서는 > 90％의 TGI가 관찰되었고, 2.5 mg/kg의 투여량에 대한 반응에서는 > 70％의 TGI가 관찰되었다. 최저 투여량인 1 mg/kg의 3ee9/MMAE는 이러한 CRC 모델에서 비교적 효과가 없었다. 퇴행의 측면에서, 5 mg/kg 및 10 mg/kg으로 투여된 3ee9/MMAE는 각각 40％ 및 80％ 반응을 나타내었다.
실시예 16: HCT-15 이종이식 모델 중 3ee9/MMAE의 효능
다중-약물 내성 모델에서 3ee9/MMAE의 효과를 조사하기 위해서, 암컷 NCr nu/nu 마우스에게 5×106개의 HCT-15 세포를 피하 (s.c.) 이식하였다. HCT-15는 P-당단백질 (P-gp)을 과다발현하는 다중-약물 내성 (MDR) 세포주이다. 따라서, 상기 세포주는 다중-약물 내성 표현형을 나타내며, 탁솔®, 독소루비신 및 에토포시드에 내성이 있다. 마우스가 평균 중량 약 150 mg의 수립된 종양을 가진 경우에 3ee9/MMAE, 탁솔 및 겜시타빈을 투여하였다. P-gp 기질이 아닌 피리미딘 유사체인 겜시타빈은 양성 대조군으로 사용되었다. 예상한 바와 같이, 겜시타빈 (120 mg/kg, i.p., QD×10)은 상기 MDR 모델에서 고도로 활성이었다 (도 24). 반대로, 3ee9/MMAE (MMAE는 P-gp의 공지된 기질임) 및 탁솔®은 어떠한 유의한 항-종양 효과도 나타내지 못했다.
실시예 17: huMN-MIAPaca2 및 MIAPaca2 이종이식 모델 중 3ee9/MMAE의 효능
MN 발현과 항-종양 효능 사이의 관계를 보다 잘 이해하기 위해서, MN을 낮은 수준으로 발현하는 췌장 모델인 MIAPaCa2 및 MN을 높은 수준으로 발현하는 huMN-MIAPaCa2 모델을 사용한 이종이식 효능 연구를 수행하였다. 후자의 세포주는 MIAPaCa2 세포주를 MN의 안정적인 발현이 일어나도록 조작하여 유도된 것이다. 3ee9/MMAE는 이와 같이 MN을 낮은 수준으로 발현하는 MIAPaCa2 세포주의 성장을 억제하는데 있어서는 최소의 효과를 나타냈다 (도 25). 10 mg/kg으로 투여된 3ee9/MMAE만이 50％의 TGI를 나타냈다. 반대로, huMN-MIAPaCa2 모델에 대하여는 3ee9/MMAE가 유의한 항-종양 활성을 갖는 것으로 나타났으며, 투여 종료시에 2.5 mg/kg, 5 mg/kg 및 10 mg/kg의 투여량에서는 각각 63％, 82％ 및 94％의 TGI가 나타났다. 추가로, 10 mg/kg의 투여량은 100％ 반응을 유도하였고, 이는 종양에서 과다발현된 MN 수준에 의한 민감도 변화가 크다는 것을 나타낸다.
실시예 18: Colo-205 이종이식 모델에서 크셀로다 ® 와의 조합
3ee9/MMAE를 다른 암 화학요법제와 병용하는 것에 대한 가능성을 조사하였다. 크셀로다®는 전이성 결장직장 암종이 있는 환자의 첫번째 치료제로 사용된다. 3ee9/MMAE 및 크셀로다®를 사용한 조합 요법의 활성 및 허용성을 평가하였다. 3ee9/MMAE는 Q4D×3 스케쥴로 1.25 mg/kg, 2.5 mg/kg 및 10 mg/kg의 투여량 수준으로 i.v. 투여되었다. 크셀로다®는 1일 1회씩 9일 동안 250 mg/kg 및 500 mg/kg의 투여량 수준으로 경구 투여되었다. 2.5 mg/kg 및 10 mg/kg으로 단독 투여된 3ee9/MMAE는 강한 종양 성장 억제를 나타냈다 (각각 73％ 및 96％의 TGI) (도 26a). 그러나, 1.25 mg/kg 군의 3ee9/MMAE는 비교적 효과가 없어서 겨우 31％의 TGI를 나타내는 것에 불과하였다. 또한, 250 mg/kg 및 500 mg/kg의 투여량 수준으로 단독 투여된 크셀로다®는 각각 78％ 및 86％의 강한 TGI를 나타냈다.
반응의 측면에서, 10 mg/kg 군의 3ee9/MMAE는 80％ 반응률을 유도한 반면에 크셀로다의 2가지 투여량 군 동물은 모두가 어떠한 퇴행도 나타내지 않았다. 모든 조합 처치군은 잘 허용되었고, 종양 성장 뿐만이 아니라 반응률에서도 유의한 억제가 나타났다. 이들 2가지 작용제를 조합한 경우의 TGI 및 종양 반응에 관한 상세한 정량적 데이타를 도 26a 및 도 26b 뿐만이 아니라 하기 표 3에도 나타냈다. 조사한 투여량에서, 크셀로다®와 병용한 3ee9/MMAE의 항-종양 활성은 3ee9/MMAE 또는 크셀로다®를 단일 작용제로 투여한 경우보다 훨씬 우수하였다. 마지막으로, 허용성과 관련하여, 이들 치료제의 투여는 유해 반응 없이 잘 허용되었다.
Figure 112008050165144-pct00002
실시예 19: 양쪽 옆구리에 이식된 인간 이종이식 암 모델에 대한 3ee9 mAb의 생체내 분포/종양으로의 국소화
3ee9/MMAE 중 mAb 성분의 생체내 분포 및 종양으로의 국소화를 결정하기 위해서, 양쪽 옆구리에 MN 발현 수준이 높은 것과 낮은 것 둘다의 종양을 이식한 마우스에서 CRI 마에스트로(Maestro)™를 사용하여 비-침윤성 생체내 화상형성 연구를 수행하였다. 다중-스펙트럼 획득 기능 및 분석 기능을 갖춘 마에스트로™ 생체내 화상형성 시스템 (CRI, 미국 매사추세츠주 워번 소재)을 자가-형광 백그라운드를 제거하도록 디자인하였다. 알렉사 플로어 750 (인비트로젠, 카탈로그 번호: A20011)을 제조업체의 지침에 따라 사용하여 BAY 79-4620의 Mab 3ee9, M75 (MN을 인식하는 마우스 모노클로날) 및 대조군 인간 IgG를 이것과 접합시켰다. 단백질/AF750(mol/mol)의 비율은 3ee9의 경우에는 1/5.9였고 인간 IgG의 경우에는 8.9였으며 M75의 경우에는 6.0였다.
각각의 형광-표지된 항체를 주사하기 12일 전에 하를란(Harlan) Balb/C 누드 마우스에게 MIAPaCa-2 (MN을 낮은 수준으로 발현함. 50％ 매트리겔 중 7.5×106개 세포)를 오른쪽 옆구리에 피하 이식하고, huMN-MIAPaCa2 (MN으로 형질감염시킨 안정적인 세포주. 50％ 매트리겔 중 5×106개 세포)를 왼쪽 옆구리에 피하 이식하였다. 접합된 항체 4 ㎍을 제0일 (이식한 지 12일 후)에 각 동물에게 주사하였다. 화상형성은 제4일, 제5일 및 제10일에 수행하였다. 마취시켜서 (100 mg/kg 케타민/10 mg/kg 크실라진, i.p.) 화상형성 시스템에 넣은 동물을 이용하여 데이타를 수집하였다. 다중-스펙트럼 화상 큐브 (일련의 화상)를, 근적외선 (NIR) 범위를 포함하는 680 nm 내지 950 nm의 스펙트럼 범위에 걸쳐 매 10 nm마다 이격된 화상으로 획득하였다.
각각의 화상을 5초 동안 노출시켰다. 마에스트로 소프트웨어를 사용한 스펙트럼 큐브로부터 위색(false-colored) 화상을 합성하고 이미지프로 플러스(ImagePro Plus) 6.0을 이용하여 가시 밝기로 스케일화하였다. 스케일화는 모든 화상에 동일하였고, 가장 밝은 화상이 포화 수준보다 약간 낮게 하였다. 가장 강한 형광으로 표지된 항체는 간과 방광에 국소화하는 경향이 있었다. 이어서, 4일 내지 5일 후에는 대부분의 신호가 간과 방광에서 줄어들어 종양에서 안정화되었다. 제5일에 촬영한 화상이 백그라운드에 대한 신호의 비율이 가장 높았다 (도 27). 5일 후에, hIgG를 주사한 동물로부터는 신호가 거의 생성되지 않았는데, 이는 hIgG가 종양 조직에 국소화되지 못했다는 것을 나타낸다. 반대로, M75와 3ee9는 둘다 MN을 높은 수준으로 발현하는 (huMN-MIAPaCa2) 종양에 특이적으로 국소화하였다. 동일 동물에서 MN을 낮은 수준으로 발현하는 MIAPaCa2 종양에서는 국소화가 관찰되지 않았다.
실시예 20: 생체내 작용 메카니즘
3ee9/MMAE의 생체내 작용 메카니즘을 알아내기 위해서, 종양을 마우스의 오른쪽 옆구리에 5×106개 HT-29 세포로 피하 이식하였다. 8일 후에, HT-29 종양을 보유한 무흉선 마우스에게 비히클 또는 1.25 mg/kg 및 5 mg/kg의 3ee9/MMAE (Q1D×1)를 처치하였다. 3ee9/MMAE의 투여후 4시간 및 1일, 3일 및 5일이 지난 후에 종양을 수집하여 포르말린 중에 고정시켰다. 이어서, 샘플을 파라핀에 묻고 5 ㎛로 절편화시켜서 파라핀을 제거하고 인간 조직의 형광 면역조직화학에 대한 표준 프로토콜에 따라 마우스 항체로 염색하였다: 항-α/β-튜불린, 항-포스포-히스톤 H3 및 DNA. 이어서, 형광 현미경하에서 슬라이드를 관찰하고, 3개의 별개의 색상 채널을 통해 대표적인 화상을 촬영하였다.
3ee9/MMAE는 4시간 샘플에서 세포 메카니즘에 영향을 미치는 효과가 거의 없었다. 그러나, 제1일이 지난 후에는 G2/M 정지기에 있는 세포의 수가 증가하였고, 다극성 방추가 명백하게 관찰되었다. 추가로, 튜불린 염색의 수준이 감소한 것을 관찰할 수 있었다. 이후, 이러한 효과는 제3일 및 제5일 샘플에서 크게 증폭되었다. 사실, 제5일에는 3ee9/MMAE의 5 mg/kg 투여량 군의 거의 모든 세포가 처치의 영향을 크게 받았다 (도 28). 이러한 데이타는 3ee9/MMAE가 튜불린 억제를 통해 암 세포의 성장에 영향을 주어 G2/M 정지 및 세포자멸(apoptosis)을 야기하였음을 명백하게 나타낸다.
하기 표 4는 3ee9/MMAE의 거동 프로파일을 요약한다.
3ee9/MMAE 프로파일
검정 3ee9/MMAE에 대한 결과
친화도 (Kd) 3.6 nM
세포 결합 (FACS): MN+/MN- +++/-
내재화: MN+/MN- +++/-
세포독성: MN+/MN- (ec50) 50 nM/> 1 μM
면역침전 특이적
IHC 특이적
생체내 분포 정상
생체내 활성: MED 1 mg/kg
생체내 활성: MTD 60 mg/kg
실시예 21: 3ee9 경쇄 및 중쇄 CDR 가변 영역을 기초로 하고 안정적인 CHO 세포 발현 시스템을 사용한, 항-MN IgG의 발현 벡터 구축, 형질감염, 발현 및 정제
발현 벡터 3ee9 H+L pCMV UCOE 8의 구축
벡터 3ee9pMORPHx9 (실시예 1 내지 실시예 3에 따라 수득함)로부터의 카파 및 중쇄 CDR 가변 영역 (각각 서열 126 및 서열 125)을 다음과 같이 벡터 H+LpattB (ML 래버러토리즈(ML Laboratories))에 삽입하였다. 3ee9pMORPHx9 (이전의 실시예, 예를 들어 실시예 1 내지 실시예 3에 따라 제조함)의 대략 350개 염기쌍의 EcoRV - BsiWI 제한 효소 단편을 H+LpattB의 EcoRV - BsiWI 제한 효소 부위에 삽입하여 벡터 3ee9카파pAttB를 생성하였다. 다음으로, 3ee9pMORPHx9의 대략 350개 염기쌍의 MfeI-BllpI 제한 효소 단편을 3ee9카파pAttB의 EcoRI - BlpI 제한 효소 부위에 삽입하여 3ee9H+LpattB를 생성하였다. 이어서, 3ee9 중쇄 및 경쇄 코딩 서열 (각각 서열 126 및 서열 125)을 게이트웨이 BP 클로나제(Gateway BP Clonase) II 효소 혼합물 (인비트로젠, 카탈로그 번호: 11789-100)을 사용하여 pDONR221 (인비트로젠, 카탈로그 번호: 12536-017)와 재조합하여, 벡터 3ee9H+LpENTR을 생성하였다. 벡터 3ee9H+LpCMVUCOE8은 게이트웨이 LR 클로나제 II 효소 혼합물 (인비트로젠, 카탈로그 번호: 11791-100)를 사용한 3ee9H+LpENTR과 pCMV_UCOE8_DEST 사이의 재조합으로 생성되었다.
이어서, pCMV_UCOE8_DEST를 구축하였다. 게이트웨이 벡터 전환 카세트 (인비트로젠, 카탈로그 번호: 11828-029)를 pCET906의 SmaI 부위에 삽입하여 벡터 pCET906_gw를 생성하였다. 벡터 pCET906은 ML 래버러토리즈에서 구하였고, 문헌 [Williams et. al., BMC Biotechnology, (2005), 5:17]에 상세하게 기재되어 있으며 상기 문헌은 본원에 참고로 포함된다. 이어서, pCET906_gw의 대략 2900개 염기쌍의 AgeI 제한 효소 단편을 pCET1015의 AgeI 부위로 클로닝하여 pCMV_UCOE8_DEST를 생성하였다. 벡터 pCET1015 역시 ML 래버러토리즈에서 구하였고, 문헌 [Williams et al., 상기 문헌]에 상세하게 기재되어 있다. 벡터 pCMV_UCOE8_DEST를 ccdB 독소 유전자에 내성이 있는 이. 콜라이 균주 (예를 들어, 인비트로젠이 "원샷 ccdB 생존 T1 세포(One Shot ccdB Survival T1 cells)"로 시판하는 것 (카탈로그 번호: C7510-03))에서 증식시켰다. 3ee9H+LpCMVUCOE8 삽입물의 완전 뉴클레오티드 서열, 즉 벡터 3ee9pMORPHx9로부터 수득한, 서열 126 및 서열 125 각각의 카파 및 중쇄 CDR 가변 영역을 포함하는 인간 IgG 항-MN 항체를 코딩하는 완전 뉴클레오티드 서열을 도 29에 나타내었다.
세포 클론 3ee9.25의 단리
CHO-S 세포를 벡터 3ee9H+LpCMVUCOE8로 형질감염시키기 위해서, DNA 60 ㎍을 8 mM L-글루타민 및 HT (인비트로젠)을 함유하고 PenStrep이 없는 CD CHO (인비트로젠 #10743-029) 완전 배지 2 mL 중에 희석시켰다. 이어서, CD CHO 완전 배지 2 mL를 250 mL 엘렌마이어(erlenmeyer) 플라스크에 첨가하였다. 이어서, DMRIE-C (인비트로젠, 카탈로그 번호: 10459-014) 150 ㎕를 상기 플라스크에 첨가하고, RT에서 10분 동안 인큐베이션시켰다. 이어서, 희석된 DNA를 희석된 DMRIE-C와 혼합하여 5％ CO2로 세정하고, RT에서 30분 동안 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 동안에, 5×106 c/mL (총 세포 2×107개)의 CHO-S 세포 4 mL를 CD CHO 완전 배지 (P/S 없음) 중에 제조하였다. 인큐베이션 후, 세포를 상기 플라스크에 DNA-DMRIE-C 복합체와 함께 첨가한 후에 완만하게 흔들어서 혼합시켰다. 이어서, 플라스크를 5％ CO2로 세정하고, 37℃에서 4시간 동안 125 rpm으로 진탕시켰다. 다음으로, Pen Strep을 함유하지 않는 CD CHO 완전 배지 32 mL를 상기 플라스크에 첨가하여 5％ CO2로 세정한 후에 다시 진탕기 (37℃)에 밤새 넣어 두었다. 24시간 후, 세포를 계수하여 회전시켜 가라앉히고, 플레이팅시키기에 적절한 세포 밀도로 5.5 mL/L PenStrep 및 20％ 조건화 배지 및 항생제 (12.5 ㎍/mL 퓨로마이신)를 함유하는 CD CHO 완전 배지 중에 재현탁시켰다. 세포를 96웰 플레이트에 100개, 300개, 900개 및 2700개 세포/웰로 플레이팅하였다. 이어서, 상기 플레이트를 5％ CO2 인큐베이터에서 대략 3주 동안 인큐베이션시켰다. 플레이트들이 섞이지 않도록 주의를 기울였다.
플레이트의 웰 중 20％ 미만에서 단일 콜로니를 함유하는 웰을 갖는 플레이트에서 개개의 클론을 증식시켰다. 세포를, 웰 1개 당 선별 배지 1 mL를 함유하는 비-조직 처리된 24웰 플레이트로 옮겼다. 세포를 약 1주 동안 인큐베이션시켰고, 이 동안에 필요에 따라 신선한 배지를 500 ㎕ 첨가하였다. 항체 발현은, 발현하지 않는 클론을 제거하기 위해서 단일 희석물로 시험하였다. 클론은, 1:5 희석물 (TBS/tween 95 ㎕ 중 상등액 5 ㎕)을 2벌로 사용하여 ELISA로 시험하였다. OD (광학 밀도)가 0.1 미만인 클론은 제거하였다. 양성 클론을 비-조직 처리된 6웰 플레이트로 옮겼다. 다음으로, 세포 5 mL를 4×104개 세포/mL로 접종하였다. 4일 동안 인큐베이션한 후에 단백질 발현을 ELISA로 측정하였다. 1:50, 1:100, 1:200 및 1:400 희석물을 사용하여 클론을 시험하였다. 클론 3ee9.25는 가장 높은 분비된 항체 농도를 나타내었다. 3ee9.25 세포를 125 mL 엘렌마이어 진탕기 플라스크에 2×105개 세포/mL로 접종하여 옮겨서, 세포가 현탁 성장하도록 하였다.
항-MN IgG의 발현
형질감염된 CHO-S 세포를 웨이브(Wave) 10 리터 바이오리액터(Bioreactor) (미국 08873 뉴저지주 소머세트 플랭클린 스퀘어 드라이브 300 소재의 웨이브 바이오테크(Wave Biotech)에 500,000개 세포/mL로 접종하였다. 세포를 5％ CO2 대기하에 37℃에서 25 rpm으로 흔들리는 생물반응기를 사용하여 50％ CD-CHO 배지 (인비트로젠 10743), 50％ 시그마(Sigma) CHO 배지 제5호 (시그마 0363), 1％ FCS, 1× HT 보충물 (인비트로젠 11067-030), 페니실린/스트렙토마이신 (인비트로젠 15140-122), 8 mM L-글루타민 (인비트로젠 25030-081) 및 12.5 ㎍/mL 퓨로마이신 (BD 631305) 중에서 7일 동안 배양하였다. 발효 기간의 종료시에 사용된 배양 배지를 원심분리로 수거하여 멸균 여과 (0.2 μM)시킨 후에 IgG 정제를 실시하였다.
항-MN IgG의 정제
전형적으로, IgG-함유 세포 배양 배지 10 L 내지 20 L를 프렙-스케일(Prep-Scale) TFF-2 30 kD 카트리지 (밀리포어(Millipore))를 사용하여 2배 내지 5배 농축시켰다. 농축된 배지에 1 M Tris-Cl 완충제 (pH 7.5)를 최종 농도 50 mM로 첨가하였다. 이어서, 5.0 M NaCl을 최종 농도 150 mM로 첨가하였다. 전형적으로, 상기 농축된 배지를 PBS (pH 7.4)로 평형화시킨 30 mL 단백질 세파로스 컬럼에 로딩하였다. 상기 컬럼을 0.1％ Tween 20 및 1 mM EDTA를 함유하는 PBS (pH 7.4)로 세척하였다. 이어서, 상기 컬럼을 PBS로 세척하고 100 mM 글리신 완충제 (pH 3.0)로 용출시켰다. 분획물 수집후에는 1 M Tris-Cl (pH 7.8)을 사용하여 pH 7.5로 중화시켰다. 정제된 IgG를 투석에 의해 PBS로 이동시키고, 여과 (0.2 μM)를 통해 멸균시켰다. 최종 정제된 항체 제제를 1 mg/mL 내지 5 mg/mL로 조정하였고, 쿠마시 블루(coomassie blue)로 염색한 SDS-PAGE 겔로 결정할 때 이것은 95％ 이상의 순도를 나타내었는데 여기서 Mr = 50 kDa의 중쇄 및 Mr = 25 kDa의 경쇄에 상응하는 2개의 밴드로 이동한 단백질은 단백질 1 mg 당 1 EU 미만의 내독소 수준을 가졌고, SEC HPLC로 결정할 때 단백질 응집률이 10％ 미만이었다. 또한, 상기 제제에 대하여, 표면 플라즈몬 공명에 의한 MN 항원 결합, FACS에 의한 MN-발현 세포와의 결합, 및 자동화 화상형성 (셀로믹스)으로 결정한 MN-발현 세포로의 내재화에 관한 기능적 Q.C.를 실시하였다. 20 L의 조합 발효는 전형적으로 정제된 단백질 1 g을 생성하였고, 이때 전체 회수율은 50％ 내지 75％였다. 255 pmol의 정제된 전장 3ee9 항체 최종 제제의 N-말단 서열분석을 ABI 프로사이즈(Procise) 494 HT 서열분석기로 수행하여, 성숙 카파 경쇄의 예상 서열
Figure 112008050165144-pct00003
을 368 pmol로 수득하였다. 이것은 mAb 3ee9의 성숙 V카파1 경쇄에 상응하는 N-말단 서열 (서열 146)과 동일하였다. 중쇄는 에드만 서열분석으로 검출되지 않았는데, 이는 이 서열이 차단되었음을 보여준다.
***
이와 같이, 본 발명의 바람직한 실시양태를 상세하게 기재하였지만, 본 발명의 사상 또는 범위에서 벗어나지 않고도 본 발명에 대한 여러가지 명백한 변형이 가능하기 때문에, 상기 단락에서 한정된 본 발명이 상기한 명세서 기재의 특정 세부사항으로 한정되는 것이 아님을 이해해야 한다.
SEQUENCE LISTING <110> BAYER PHARMACEUTICALS CORPORATION <120> ANTI-MN ANTIBODIES AND METHODS OF USING SAME <130> 54716-66475 <140> <141> <150> 60/749,716 <151> 2005-12-12 <160> 153 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 30 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 ggatttacct tttcttctta tggtatgtct 30 <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 ggatttacct tttcttctta tggtatgcat 30 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 ggatttacct tttctaataa tgctatgaat 30 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 ggatttacct tttctgatta ttctattaat 30 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 ggatttacct tttcttctta tggtatttct 30 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 ggatttacct tttctaatta tggtatttct 30 <210> 7 <211> 51 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 ggtatctctt ctcttggtag cactacctat tatgcggata gcgtgaaagg c 51 <210> 8 <211> 51 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 8 gctatctctt attcttctag ctctacctct tatgcggata gcgtgaaagg c 51 <210> 9 <211> 51 <212> 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gtgtattatt gcgcgcgtgg tcgttatttt 300 cttatggatg tttggggcca aggcaccctg gtgacggtta gctcagc 347 <210> 114 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 114 gatatccaga tgacccagag cccgtctagc ctgagcgcga gcgtgggtga tcgtgtgacc 60 attacctgca gagcgagcca gaatattctt tcttatctga attggtacca gcagaaacca 120 ggtaaagcac cgaaactatt aatttatgct gcttcttctt tgcaaagcgg ggtcccgtcc 180 cgttttagcg gctctggatc cggcactgat tttaccctga ccattagcag cctgcaacct 240 gaagactttg cggtttatta ttgccagcag tatggttctg ttcctacctt tggccagggt 300 acgaaagttg aaattaaacg tacg 324 <210> 115 <211> 347 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 115 gaattggtgg aaagcggcgg cggcctggtg caaccgggcg gcagcctgcg tctgagctgc 60 gcggcctccg gatttacctt ttctaataat gctatgaatt gggtgcgcca agcccctggg 120 aagggtctcg agtgggtgag cggtatctct tatgattcta gcaagaccta ttatgcggat 180 agcgtgaaag gccgttttac catttcacgt gataattcga aaaacaccct gtatctgcaa 240 atgaacagcc tgcgtgcgga agatacggcc gtgtattatt gcgcgcgtct tacttatact 300 ggtgcttatc gttggggcca aggcaccctg gtgacggtta gctcagc 347 <210> 116 <211> 311 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 116 gatatcgaac tgacccagcc gccttcagtg agcgttgcac caggtcagac cgcgcgtatc 60 tcgtgtagcg gcgataatct tggttcttat tatgttcatt ggtaccagca gaaacccggg 120 caggcgccag ttcttgtgat ttatgatgat aataatcgtc cctcaggcat cccggaacgc 180 tttagcggat ccaacagcgg caacaccgcg accctgacca ttagcggcac tcaggcggaa 240 gacgaagcgg attattattg ccagtcttat gattttggta aggttgtgtt tggcggcggc 300 acgaagttaa c 311 <210> 117 <211> 350 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 117 gaattggtgg aaagcggcgg cggcctggtg caaccgggcg gcagcctgcg tctgagctgc 60 gcggcctccg gatttacctt ttctgattat tctattaatt gggtgcgcca agcccctggg 120 aagggtctcg agtatgtgag caatatctct tattctggta gctctaccta ttatgcggat 180 agcgtgaaag gccgttttac catttcacgt gataattcga aaaacaccct gtatctgcaa 240 atgaacagcc tgcgtgcgga agatacggcc gtgtattatt gcgcgcgttt taagtattct 300 ggtggttctg attcttgggg ccaaggcacc ctggtgacgg ttagctcagc 350 <210> 118 <211> 317 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 118 gatatcgaac tgacccagcc gccttcagtg agcgttgcac caggtcagac cgcgcgtatc 60 tcgtgtagcg gcgataatct tcctgatttt tatgttcatt ggtaccagca gaaacccggg 120 caggcgccag ttcttgtgat ttctgaggat aataagcgtc cctcaggcat cccggaacgc 180 tttagcggat ccaacagcgg caacaccgcg accctgacca ttagcggcac tcaggcggaa 240 gacgaagcgg attattattg ctctacttat ggttatactt attcttattc tgtgtttggc 300 ggcggcacga agttaac 317 <210> 119 <211> 362 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 119 gaattggtgg aaagcggcgg cggcctggtg caaccgggcg gcagcctgcg tctgagctgc 60 gcggcctccg gatttacctt ttcttcttat ggtatttctt gggtgcgcca agcccctggg 120 aagggtctcg agtgggtgag cggtatctct tattctggta gctctaccta ttatgcggat 180 agcgtgaaag gccgttttac catttcacgt gataattcga aaaacaccct gtatctgcaa 240 atgaacagcc tgcgtgcgga agatacggcc gtgtattatt gcgcgcgtct taagccttat 300 cgtcataaga atggttggtt tgattattgg ggccaaggca ccctggtgac ggttagctca 360 gc 362 <210> 120 <211> 327 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 120 gatatccaga tgacccagag cccgtctagc ctgagcgcga gcgtgggtga tcgtgtgacc 60 attacctgca gagcgagcca gaatatttct aattatctga attggtacca gcagaaacca 120 ggtaaagcac cgaaactatt aattcataag gtttctaatt tgcaaagcgg ggtcccgtcc 180 cgttttagcg gctctggatc cggcactgat tttaccctga ccattagcag cctgcaacct 240 gaagactttg cggtttatta ttgccttcag tatgatgatt ttcctcgtac ctttggccag 300 ggtacgaaag ttgaaattaa acgtacg 327 <210> 121 <211> 356 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 121 gaattggtgg aaagcggcgg cggcctggtg caaccgggcg gcagcctgcg tctgagctgc 60 gcggcctccg gatttacctt ttcttcttat ggtatttctt gggtgcgcca agcccctggg 120 aagggtctcg agtgggtgag ctctatctct tattctggta gcaataccta ttatgcggat 180 agcgtgaaag gccgttttac catttcacgt gataattcga aaaacaccct gtatctgcaa 240 atgaacagcc tgcgtgcgga agatacggcc gtgtattatt gcgcgcgtat gaagcctatg 300 cgtggttatt ctggtgctgt ttggggccaa ggcaccctgg tgacggttag ctcagc 356 <210> 122 <211> 321 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 122 gatatccaga tgacccagag cccgtctagc ctgagcgcga gcgtgggtga tcgtgtgacc 60 attacctgca gagcgagcca ggatatttct aatcgtctgg cttggtacca gcagaaacca 120 ggtaaagcac cgaaactatt aatttatgat gctaattctt tgcaaagcgg ggtcccgtcc 180 cgttttagcg gctctggatc cggcactgat tttaccctga ccattagcag cctgcaacct 240 gaagactttg cgacttatta ttgctttcag tattctggtc ctacctttgg ccagggtacg 300 aaagttgaaa ttaaacgtac g 321 <210> 123 <211> 347 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 123 gaattggtgg aaagcggcgg cggcctggtg caaccgggcg gcagcctgcg tctgagctgc 60 gcggcctccg gatttacctt ttctaattat ggtatttctt gggtgcgcca agcccctggg 120 aagggtctcg agtgggtgag cgctatctct tattatggta gcaataccta ttatgcggat 180 agcgtgaaag gccgttttac catttcacgt gataattcga aaaacaccct gtatctgcaa 240 atgaacagcc tgcgtgcgga agatacggcc gtgtattatt gcgcgcgtct taagggtggt 300 tctggttttg tttggggcca aggcaccctg gtgacggtta gctcagc 347 <210> 124 <211> 342 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 124 gatatcgtga tgacccagag cccactgagc ctgccagtga ctccgggcga gcctgcgagc 60 attagctgca gaagcagcca aagcctggtt tattctaatg gcaatactac tctgtcttgg 120 taccttcaaa aaccaggtca aagcccgcag ctattaattt atggtgtttc taatcgtgcc 180 agtggggtcc cggatcgttt tagcggctct ggatccggca ccgattttac cctgaaaatt 240 agccgtgtgg aagctgaaga cgtgggcgtg tattattgcc agcagtataa ttcttttcct 300 cgtacctttg gccagggtac gaaagttgaa attaaacgta cg 342 <210> 125 <211> 359 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 125 gaattggtgg aaagcggcgg cggcctggtg caaccgggcg gcagcctgcg tctgagctgc 60 gcggcctccg gatttacctt ttcttcttat ggtatgtctt gggtgcgcca agcccctggg 120 aagggtctcg agtgggtgag cggtatctct tctcttggta gcactaccta ttatgcggat 180 agcgtgaaag gccgttttac catttcacgt gataattcga aaaacaccct gtatctgcaa 240 atgaacagcc tgcgtgcgga agatacggcc gtgtattatt gcgcgcgtac tggttctcct 300 ggtactttta tgcatggtga tcattggggc caaggcaccc tggtgacggt tagctcagc 359 <210> 126 <211> 327 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 126 gatatccaga tgacccagag cccgtctagc ctgagcgcga gcgtgggtga tcgtgtgacc 60 attacctgca gagcgagcca ggatattaat aattatctgt cttggtacca gcagaaacca 120 ggtaaagcac cgaaactatt aatttatggt gcttctaatt tgcaaagcgg ggtcccgtcc 180 cgttttagcg gctctggatc cggcactgat tttaccctga ccattagcag cctgcaacct 240 gaagactttg cggtttatta ttgccagcag tattatggtc gtcctactac ctttggccag 300 ggtacgaaag ttgaaattaa acgtacg 327 <210> 127 <211> 359 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 127 gaattggttc agagcggcgc ggaagtgaaa aaaccgggcg aaagcctgaa aattagctgc 60 aaaggttccg gatattcctt ttctaagtat tggattggtt gggtgcgcca gatgcctggg 120 aagggtctcg agtggatggg cattatctat ccgactgata gctatacccg ttattctccg 180 agctttcagg gccaggtgac cattagcgcg gataaaagca ttagcaccgc gtatcttcaa 240 tggagcagcc tgaaagcgag cgatacggcc atgtattatt gcgcgcgtac tcatggttat 300 tataagaatg gtcgtatgga tgtttggggc caaggcaccc tggtgacggt tagctcagc 359 <210> 128 <211> 342 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 128 gatatcgtga tgacccagag cccactgagc ctgccagtga ctccgggcga gcctgcgagc 60 attagctgca gaagcagcca aagcctggtt cattctaatg gctataatta tctgtcttgg 120 taccttcaaa aaccaggtca aagcccgcag ctattaattt atcttggttc taatcgtgcc 180 agtggggtcc cggatcgttt tagcggctct ggatccggca ccgattttac cctgaaaatt 240 agccgtgtgg aagctgaaga cgtgggcgtg tattattgcc atcagtatgg tgatttttct 300 gatacctttg gccagggtac gaaagttgaa attaaacgta cg 342 <210> 129 <211> 353 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 129 gaattggttc agagcggcgc ggaagtgaaa aaaccgggcg aaagcctgaa aattagctgc 60 aaaggttccg gatattcctt tactggttat atttcttggg tgcgccaagc ccctgggaag 120 ggtctcgagt ggatgggcat tatctatccg ggtgatagct ataccaatta ttctccgagc 180 tttcagggcc aggtgaccat tagcgcggat aaaagcatta gcaccgcgta tcttcaatgg 240 agcagcctga aagcgagcga tacggccatg tattattgcg cgcgttattc tggtcctaat 300 tgggatgtta tggattcttg gggccaaggc accctggtga cggttagctc agc 353 <210> 130 <211> 323 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 130 gatatcgtgc tgacccagcc gccttcagtg agtggcgcac caggtcagcg tgtgaccatc 60 tcgtgtagcg gcagcagcag caacattggt tcttattatg tgaattggta ccagcagttg 120 cccgggacgg cgccgaaact tctgatttat gctgatgata agcgtccctc aggcgtgccg 180 gatcgtttta gcggatccaa aagcggcacc agcgcgagcc ttgcgattac gggcctgcaa 240 agcgaagacg aagcggatta ttattgccag tcttatgatt ctactaagga tgattctgtg 300 tttggcggcg gcacgaagtt aac 323 <210> 131 <211> 347 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 131 gaattggtgg aaagcggcgg cggcctggtg caaccgggcg gcagcctgcg tctgagctgc 60 gcggcctccg gatttacctt ttcttcttat ggtatgcatt gggtgcgcca agcccctggg 120 aagggtctcg agtatgtgag cgctatctct tattcttcta gctctacctc ttatgcggat 180 agcgtgaaag gccgttttac catttcacgt gataattcga aaaacaccct gtatctgcaa 240 atgaacagcc tgcgtgcgga agatacggcc gtgtattatt gcgcgcgtct ttcttatact 300 ggttttgctg tttggggcca aggcaccctg gtgacggtta gctcagc 347 <210> 132 <211> 311 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 132 gatatcgaac tgacccagcc gccttcagtg agcgttgcac caggtcagac cgcgcgtatc 60 tcgtgtagcg gcgataatct tggttcttat tatgttcatt ggtaccagca gaaacccggg 120 caggcgccag ttcttgtgat ttatgatgat aataatcgtc cctcaggcat cccggaacgc 180 tttagcggat ccaacagcgg caacaccgcg accctgacca ttagcggcac tcaggcggaa 240 gacgaagcgg attattattg ccagtcttat gattttggta aggttgtgtt tggcggcggc 300 acgaagttaa c 311 <210> 133 <211> 115 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 133 Glu Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val 1 5 10 15 Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Asn Tyr Met 20 25 30 His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Ile 35 40 45 Ile Asn Pro His Asn Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly 50 55 60 Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Met Glu 65 70 75 80 Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 85 90 95 Gly Arg Tyr Phe Leu Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 134 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 134 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile Leu Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Val Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr 100 105 <210> 135 <211> 115 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 135 Glu Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu 1 5 10 15 Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Asn Ala Met 20 25 30 Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Gly 35 40 45 Ile Ser Tyr Asp Ser Ser Lys Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly 50 55 60 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln 65 70 75 80 Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 85 90 95 Leu Thr Tyr Thr Gly Ala Tyr Arg Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 136 <211> 106 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 136 Asp Ile Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Arg Ile Ser Cys Ser Gly Asp Asn Leu Gly Ser Tyr Tyr Val 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr 35 40 45 Asp Asp Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Glu 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Phe Gly Lys Val Val 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 137 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 137 Glu Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu 1 5 10 15 Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Ser Ile 20 25 30 Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Val Ser Asn 35 40 45 Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly 50 55 60 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln 65 70 75 80 Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 85 90 95 Phe Lys Tyr Ser Gly Gly Ser Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 138 <211> 105 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 138 Asp Ile Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Arg Ile Ser Cys Ser Gly Asp Asn Leu Pro Asp Phe Tyr Val 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Ser 35 40 45 Glu Asp Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Glu 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Thr Tyr Gly Tyr Thr Tyr Ser Tyr 85 90 95 Ser Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu 100 105 <210> 139 <211> 120 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 139 Glu Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu 1 5 10 15 Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Ile 20 25 30 Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Gly 35 40 45 Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly 50 55 60 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln 65 70 75 80 Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 85 90 95 Leu Lys Pro Tyr Arg His Lys Asn Gly Trp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 140 <211> 109 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 140 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile 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<212> PRT <213> Homo sapiens <400> 142 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Arg 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Asn Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gln Tyr Ser Gly Pro Thr Phe 85 90 95 Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr 100 105 <210> 143 <211> 115 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 143 Glu Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu 1 5 10 15 Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Gly Ile 20 25 30 Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ala 35 40 45 Ile Ser Tyr Tyr Gly Ser Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly 50 55 60 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln 65 70 75 80 Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala 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Leu 1 5 10 15 Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Ser Lys Tyr Trp Ile 20 25 30 Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly Ile 35 40 45 Ile Tyr Pro Thr Asp Ser Tyr Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gln Gly 50 55 60 Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Leu Gln 65 70 75 80 Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg 85 90 95 Thr His Gly Tyr Tyr Lys Asn Gly Arg Met Asp Val Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 148 <211> 114 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 148 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Ser Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys His Gln Tyr 85 90 95 Gly Asp Phe Ser Asp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 Arg Thr <210> 149 <211> 117 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 149 Glu Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu Ser Leu 1 5 10 15 Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Ile Ser 20 25 30 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly Ile Ile 35 40 45 Tyr Pro Gly Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Phe Gln Gly Gln 50 55 60 Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Trp 65 70 75 80 Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr 85 90 95 Ser Gly Pro Asn Trp Asp Val Met Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 150 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 150 Asp Ile Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Tyr 20 25 30 Tyr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Ala Asp Asp Lys Arg Pro Ser Gly Val 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Gly Ser Tyr Tyr Val 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr 35 40 45 Asp Asp Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Glu 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Phe Gly Lys Val Val 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu 100 <210> 153 <211> 6675 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic nucleotide construct <400> 153 aattggaggc tacagtcagt ggagaggact ttcactgact gactgactgc gtctcaacct 60 ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctc tgtctagagg gcaccatggt gttgcagacc 120 caggtcttca tttctctgtt gctctggatc tctggtgcct acggggatat ccagatgacc 180 cagagcccgt ctagcctgag cgcgagcgtg ggtgatcgtg tgaccattac ctgcagagcg 240 agccaggata ttaataatta tctgtcttgg taccagcaga aaccaggtaa agcaccgaaa 300 ctattaattt atggtgcttc taatttgcaa agcggggtcc cgtcccgttt tagcggctct 360 ggatccggca ctgattttac cctgaccatt agcagcctgc aacctgaaga ctttgcggtt 420 tattattgcc agcagtatta tggtcgtcct actacctttg gccagggtac gaaagttgaa 480 attaaacgta cggtggctgc accatctgtc ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg 540 aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg ctgaataact tctatcccag agaggccaaa 600 gtacagtgga aggtggataa cgccctccaa tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag 660 caggacagca aggacagcac ctacagcctc agcagcaccc tgacgctgtc taaagcagac 720 tacgagaaac acaaagtcta cgcctgcgaa gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc 780 acaaagagct tcaacagggg agagtgttag gcggccgcgc ctcgactgtg ccttctagtt 840 gccagccatc tgttgtttgc ccctcccccg tgccttcctt gaccctggaa ggtgccactc 900 ccactgtcct ttcctaataa aatgaggaaa ttgcatcgca ttgtctgagt aggtgtcatt 960 ctattctggg gggtggggtg gggcaggaca gcaaggggga ggattgggaa gacaatagca 1020 ggcatgctgg ggatgcggtg ggctctatgg gatgcttatc gccacgttcg gcgcgccgtc 1080 gacgatgtac gggccagata tacgcgttga cattgattat tgactagtta ttaatagtaa 1140 tcaattacgg ggtcattagt tcatagccca tatatggagt tccgcgttac ataacttacg 1200 gtaaatggcc cgcctggctg accgcccaac gacccccgcc cattgacgtc aataatgacg 1260 tatgttccca tagtaacgcc aatagggact ttccattgac gtcaatgggt ggactattta 1320 cggtaaactg cccacttggc agtacatcaa gtgtatcata tgccaagtac gccccctatt 1380 gacgtcaatg acggtaaatg gcccgcctgg cattatgccc agtacatgac cttatgggac 1440 tttcctactt ggcagtacat ctacgtatta gtcatcgcta ttaccatggt gatgcggttt 1500 tggcagtaca tcaatgggcg tggatagcgg tttgactcac ggggatttcc aagtctccac 1560 cccattgacg tcaatgggag tttgttttgg caccaaaatc aacgggactt tccaaaatgt 1620 cgtaacaact ccgccccatt gacgcaaatg ggcggtaggc gtgtacggtg ggaggtctat 1680 ataagcagag ctctctggct aactagagaa cccactgctt actggcttat cgaaattaat 1740 acgactcact atagggagac ccaagctggc tagcgccacc atgaaacacc tgtggttctt 1800 cctcctgctg gtggcagctc ccagatgggt cctgtcccag gtggaattgg tggaaagcgg 1860 cggcggcctg gtgcaaccgg gcggcagcct gcgtctgagc tgcgcggcct ccggatttac 1920 cttttcttct tatggtatgt cttgggtgcg ccaagcccct gggaagggtc tcgagtgggt 1980 gagcggtatc tcttctcttg gtagcactac ctattatgcg gatagcgtga aaggccgttt 2040 taccatttca cgtgataatt cgaaaaacac cctgtatctg caaatgaaca gcctgcgtgc 2100 ggaagatacg gccgtgtatt attgcgcgcg tactggttct cctggtactt ttatgcatgg 2160 tgatcattgg ggccaaggca ccctggtgac ggttagctca gcctccacca agggtccatc 2220 ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg ggcacagcgg ccctgggctg 2280 cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg tggaactcag gcgccctgac 2340 cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca ggactctact ccctcagcag 2400 cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc tacatctgca acgtgaatca 2460 caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc aaatcttgtg acaaaactca 2520 cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga ccgtcagtct tcctcttccc 2580 cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct gaggtcacat gcgtggtggt 2640 ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg tacgtggacg gcgtggaggt 2700 gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac agcacgtacc gggtggtcag 2760 cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag gagtacaagt gcaaggtctc 2820 caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc aaagccaaag ggcagccccg 2880 agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag ctgaccaaga accaggtcag 2940 cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc gccgtggagt gggagagcaa 3000 tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg ctggactccg acggctcctt 3060 cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg cagcagggga acgtcttctc 3120 atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg cagaagagcc tctccctgtc 3180 tccgggtaaa tgagggcccg tttaaacccg ctgatcagcc tcgactgtgc cttctagttg 3240 ccagccatct gttgtttgcc cctcccccgt gccttccttg accctggaag gtgccactcc 3300 cactgtcctt tcctaataaa atgaggaaat tgcatcgcat tgtctgagta ggtgtcattc 3360 tattctgggg ggtggggtgg ggcaggacag caagggggag gattgggaag acaatagcag 3420 gcatgctggg gatgcggtgg gctctatggc ttctgaggcg gaaagaacca gcctcacgtg 3480 gacccagctt tcttgtacaa agtggtcccc ctacagagac gactgactga ctgactggaa 3540 agaggaaggg ctggaagagg aaggagcttg gcgtaatcat ggtcatagct gtttcctgtg 3600 tgaaattgtt atccgctcac aattccacac aacatacgag ccggaagcat aaagtgtaaa 3660 gcctggggtg cctaatgagt gagctaactc acattaattg cgttgcgctc actgcccgct 3720 ttccagtcgg gaaacctgtc gtgccagctg cattaatgaa tcggccaacg cgcggggaga 3780 ggcggtttgc gtattgggcg ctcttccgct tcctcgctca ctgactcgct gcgctcggtc 3840 gttcggctgc ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa 3900 tcaggggata acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt 3960 aaaaaggccg cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa 4020 aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt 4080 ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg 4140 tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcata gctcacgctg taggtatctc 4200 agttcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc 4260 gaccgctgcg ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca acccggtaag acacgactta 4320 tcgccactgg cagcagccac tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct 4380 acagagttct tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta gaaggacagt atttggtatc 4440 tgcgctctgc tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa 4500 caaaccaccg ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa 4560 aaaggatctc aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa 4620 aactcacgtt aagggatttt ggtcatgaga ttatcaaaaa ggatcttcac ctagatcctt 4680 ttaaattaaa aatgaagttt taaatcaatc taaagtatat atgagtaaac ttggtctgac 4740 agttaccaat gcttaatcag tgaggcacct atctcagcga tctgtctatt tcgttcatcc 4800 atagttgcct gactccccgt cgtgtagata actacgatac gggagggctt accatctggc 4860 cccagtgctg caatgatacc gcgagaccca cgctcaccgg ctccagattt atcagcaata 4920 aaccagccag ccggaagggc cgagcgcaga agtggtcctg caactttatc cgcctccatc 4980 cagtctatta attgttgccg ggaagctaga gtaagtagtt cgccagttaa tagtttgcgc 5040 aacgttgttg ccattgctac aggcatcgtg gtgtcacgct cgtcgtttgg tatggcttca 5100 ttcagctccg gttcccaacg atcaaggcga gttacatgat cccccatgtt gtgcaaaaaa 5160 gcggttagct ccttcggtcc tccgatcgtt gtcagaagta agttggccgc agtgttatca 5220 ctcatggtta tggcagcact gcataattct cttactgtca tgccatccgt aagatgcttt 5280 tctgtgactg gtgagtactc aaccaagtca ttctgagaat agtgtatgcg gcgaccgagt 5340 tgctcttgcc cggcgtcaat acgggataat accgcgccac atagcagaac tttaaaagtg 5400 ctcatcattg gaaaacgttc ttcggggcga aaactctcaa ggatcttacc gctgttgaga 5460 tccagttcga tgtaacccac tcgtgcaccc aactgatctt cagcatcttt tactttcacc 5520 agcgtttctg ggtgagcaaa aacaggaagg caaaatgccg caaaaaaggg aataagggcg 5580 acacggaaat gttgaatact catactcttc ctttttcaat attattgaag catttatcag 5640 ggttattgtc tcatgagcgg atacatattt gaatgtattt agaaaaataa acaaataggg 5700 gttccgcgca catttccccg aaaagtgcca cctgacgtct aagaaaccat tattatcatg 5760 acattaacct ataaaaatag gcgtatcacg aggccctttc gtctcgcgcg tttcggtgat 5820 gacggtgaaa acctctgaca catgcagctc ccggagacgg tcacagcttg tctgtaagcg 5880 gatgccggga gcagacaagc ccgtcagggc gcgtcagcgg gtgttggcgg gtgtcggggc 5940 tggcttaact atgcggcatc agagcagatt gtactgagag tgcaccataa aattgtaaac 6000 gttaatattt tgttaaaatt cgcgttaaat ttttgttaaa tcagctcatt ttttaaccaa 6060 taggccgaaa tcggcaaaat cccttataaa tcaaaagaat agcccgagat agggttgagt 6120 gttgttccag tttggaacaa gagtccacta ttaaagaacg tggactccaa cgtcaaaggg 6180 cgaaaaaccg tctatcaggg cgatggccca ctacgtgaac catcacccaa atcaagtttt 6240 ttggggtcga ggtgccgtaa agcactaaat cggaacccta aagggagccc ccgatttaga 6300 gcttgacggg gaaagccggc gaacgtggcg agaaaggaag ggaagaaagc gaaaggagcg 6360 ggcgctaggg cgctggcaag tgtagcggtc acgctgcgcg taaccaccac acccgccgcg 6420 cttaatgcgc cgctacaggg cgcgtactat ggttgctttg acgtatgcgg tgtgaaatac 6480 cgcacagatg cgtaaggaga aaataccgca tcaggcgcca ttcgccattc aggctgcgca 6540 actgttggga agggcgatcg gtgcgggcct cttcgctatt acgccagctg gcgaaagggg 6600 gatgtgctgc aaggcgatta agttgggtaa cgccagggtt ttcccagtca cgacgttgta 6660 aaacgacggc cagtg 6675

Claims (91)

  1. MN 단백질에 대해 특이적인 항원 결합 부위를 가지고, 상기 항원 결합 부위는
    [3ee9] 서열 57, 63, 70, 89, 93, 및 97
    의 아미노산 서열들을 갖는 6개의 상보성 결정 영역(complementarity determining region; CDR) 세트를 포함하는, 항체 또는 항체 단편.
  2. 제1항에 있어서, 0.15 nM 내지 50 nM의 해리 상수로 MN 단백질과 결합하는 것인 항체 또는 항체 단편.
  3. 제1항에 있어서, 상기 항체가 IgG인 항체 또는 항체 단편.
  4. 제1항에 있어서, 상기 항체가 IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgM, IgD, IgE, IgA, IgM Fab 단편, F(ab')2 단편, scFv 단편, Fv 단편, 이중항체(diabody), 선형 항체, 단일-쇄 항체, 이중특이적 항체, 키메라 항체, 또는 다중특이적 항체인 항체 또는 항체 단편.
  5. 제1항에 있어서, 인간화된 것인 항체 또는 항체 단편.
  6. 제1항에 따른 항체 또는 항체 단편, 및 하나 이상의 제약상 보조 물질을 포함하는, 암의 치료를 위한 제약 조성물.
  7. 모노메틸라우리스타틴-E에 접합된 MN 단백질에 대해 특이적인 항원 결합 부위를 갖는 항체 또는 항체 단편을 포함하고, 상기 항원 결합 부위는
    [3ee9] 서열 57, 63, 70, 89, 93, 및 97
    의 아미노산 서열들을 갖는 6개의 상보성 결정 영역(complementarity determining region; CDR) 세트를 포함하는, 암의 치료를 위한 제약 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편이 0.15 nM 내지 50 nM의 해리 상수로 MN 단백질과 결합하는 조성물.
  9. 제7항에 있어서, 상기 항체가 IgG인 조성물.
  10. 제7항에 있어서, 상기 항체가 IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgM, IgD, IgE, IgA, IgM Fab 단편, F(ab')2 단편, scFv 단편, Fv 단편, 이중항체(diabody), 선형 항체, 단일-쇄 항체, 이중특이적 항체, 키메라 항체, 또는 다중특이적 항체인 조성물.
  11. 제7항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편이 인간화된 조성물.
  12. 모노메틸라우리스타틴-E에 접합된 MN 단백질에 대해 특이적인 항원 결합 부위를 갖는 항체 또는 그의 항체 단편을 포함하고, 상기 항원 결합 부위는
    [3ee9] 서열 57, 63, 70, 89, 93, 및 97
    의 아미노산 서열들을 갖는 6개의 상보성 결정 영역(complementarity determining region; CDR) 세트를 포함하는, MN-발현 유방암, 결장암, 전립선암, 또는 췌장암을 가진 대상체를 치료하기 위한 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편이 0.15 nM 내지 50 nM의 해리 상수로 MN 단백질과 결합하는 조성물.
  14. 제12항에 있어서, 상기 항체가 IgG인 조성물.
  15. 제12항에 있어서, 상기 항체가 IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgM, IgD, IgE, IgA, IgM Fab 단편, F(ab')2 단편, scFv 단편, Fv 단편, 이중항체(diabody), 선형 항체, 단일-쇄 항체, 이중특이적 항체, 키메라 항체, 또는 다중특이적 항체인 조성물.
  16. 제12항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편이 인간화된 조성물.
  17. MN 단백질에 대해 특이적인 항원 결합 부위를 가지고, 상기 항원 결합 부위는
    [3ee9] 서열 145 및 146
    의 아미노산 서열들을 갖는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역 쌍을 포함하는, 항체 또는 항체 단편.
  18. 서열 153의 뉴클레오티드 서열로 코딩된 항-MN IgG 항체.
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