EA012872B1 - АНТИТЕЛА ПРОТИВ MAdCAM - Google Patents

АНТИТЕЛА ПРОТИВ MAdCAM Download PDF

Info

Publication number
EA012872B1
EA012872B1 EA200601297A EA200601297A EA012872B1 EA 012872 B1 EA012872 B1 EA 012872B1 EA 200601297 A EA200601297 A EA 200601297A EA 200601297 A EA200601297 A EA 200601297A EA 012872 B1 EA012872 B1 EA 012872B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
antibody
antibodies
amino acid
mabsam
tob
Prior art date
Application number
EA200601297A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200601297A1 (ru
Inventor
Николас Пуллен
Элизабет Моллой
Зирид-Аймее Келлерманн
Ларри Л. ГРИН
Мэри Хаак-Френдшо
Original Assignee
Пфайзер Инк.
Эмджен Фримонт Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=34794356&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=EA012872(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Пфайзер Инк., Эмджен Фримонт Инк. filed Critical Пфайзер Инк.
Publication of EA200601297A1 publication Critical patent/EA200601297A1/ru
Publication of EA012872B1 publication Critical patent/EA012872B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/463—Cellular immunotherapy characterised by recombinant expression
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/02—Stomatological preparations, e.g. drugs for caries, aphtae, periodontitis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/12—Antidiarrhoeals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/18—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for pancreatic disorders, e.g. pancreatic enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/10—Drugs for disorders of the urinary system of the bladder
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/04—Antipruritics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/04—Drugs for skeletal disorders for non-specific disorders of the connective tissue
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/16—Otologicals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/02—Nutrients, e.g. vitamins, minerals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P39/00—General protective or antinoxious agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/14—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/14—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4
    • A61P5/16—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4 for decreasing, blocking or antagonising the activity of the thyroid hormones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/14—Vasoprotectives; Antihaemorrhoidals; Drugs for varicose therapy; Capillary stabilisers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56966—Animal cells
    • G01N33/56972—White blood cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/51—Complete heavy chain or Fd fragment, i.e. VH + CH1
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/515—Complete light chain, i.e. VL + CL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70503—Immunoglobulin superfamily, e.g. VCAMs, PECAM, LFA-3
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70546—Integrin superfamily, e.g. VLAs, leuCAM, GPIIb/GPIIIa, LPAM

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Dermatology (AREA)

Abstract

Настоящее изобретение относится к антителам, включая человеческие антитела и их антигенсвязывающие части, которые специфически связываются с MAdCAM, а предпочтительно с человеческим MAdCAM, и которые ингибируют MAdCAM. Изобретение также относится к человеческим анти-MAdCAM антителам и к их антигенсвязывающим частям, а также относится к антителам, которые представляют собой химерные, биспецифические, дериватизированные, одноцепочечные антитела или части гибридных белков. Настоящее изобретение также относится к выделенным тяжелым и легким цепям иммуноглобулинов, происходящих от человеческих анти-MAdCAM антител, и к молекулам нуклеиновой кислоты, кодирующим такие иммуноглобулины. Настоящее изобретение также относится к способам получения человеческих анти-MAdCAM антител, композиций, содержащих эти антитела, и к способам использования этих антител и композиций в методах диагностики и лечения. Настоящее изобретение также относится к способам генотерапии, проводимой с использованием молекул нуклеиновой кислоты, кодирующих молекулы тяжелой и/или легкой цепей иммуноглобулина, составляющих человеческие анти-MAdCAM антитела. Настоящее изобретение также относится к трансгенным животным или растениям, содержащим молекулы нуклеиновой кислоты согласно изобретению.

Description

Настоящее изобретение относится к выделенному антителу, которое специфически связывается с МАбСАМ, где по меньшей мере последовательности СЭК. указанного антитела представляют собой человеческие последовательности СЭК или к антигенсвязывающей части указанного антитела. В некоторых вариантах изобретения указанным антителом является человеческое антитело, а предпочтительно антитело, которое действует как антагонист МАбСАМ. Настоящее изобретение также относится к композициям, содержащим указанные антитела или их части.
Настоящее изобретение также относится к композиции, содержащей тяжелую и/или легкую цепь указанного антитела-антагониста против МАбСАМ или его вариабельную область или другую антигенсвязывающую часть, или молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие любой из вышеуказанных компонентов, и фармацевтически приемлемый носитель. Композиции согласно изобретению могут дополнительно включать и другой компонент, такой как терапевтический агент или диагностический агент. На
- 1 012872 стоящее изобретение также относится к диагностическим и терапевтическим способам.
Настоящее изобретение также относится к выделенной клеточной линии, продуцирующей указанное антитело против МЛбСЛМ или его антигенсвязывающую часть.
Настоящее изобретение также относится к молекулам нуклеиновой кислоты, кодирующим тяжелую и/или легкую цепь указанного анти-МЛбСЛМ антитела или его вариабельной области или антигенсвязывающей части.
Настоящее изобретение относится к векторам и к клеткам-хозяевам, содержащим указанные молекулы нуклеиновой кислоты, а также к способам рекомбинантного продуцирования полипептидов, кодируемых указанными молекулами нуклеиновой кислоты.
Настоящее изобретение также относится к трансгенным животным, не являющимся человеком, или к трансгенным растениям, которые экспрессируют тяжелую и/или легкую цепь указанного антиМЛбСЛМ антитела или его антигенсвязывающую часть.
Краткое описание чертежей
На фиг. 1 проиллюстрировано выравнивание последовательностей для сравнения предсказанных аминокислотных последовательностей вариабельных областей тяжелой цепи и легкой каппа-цепи двенадцати человеческих моноклональных антител против МЛбСЛМ с аминокислотными последовательностями, кодируемыми соответствующими человеческими генами зародышевой линии.
На фиг. 1А проиллюстрировано выравнивание последовательностей для сравнения предсказанной аминокислотной последовательности тяжелой цепи антител 1.7.2 и 1.8.2 с последовательностью генного продукта УН3-15 человеческой зародышевой линии.
На фиг. 1В проиллюстрировано выравнивание последовательностей для сравнения предсказанной аминокислотной последовательности тяжелой цепи антитела 6.14.2 с последовательностью генного продукта УН3-23 человеческой зародышевой линии.
На фиг. 1С проиллюстрировано выравнивание последовательностей для сравнения предсказанной аминокислотной последовательности тяжелой цепи антитела 6.22.2 с последовательностью генного продукта УН3-33 человеческой зародышевой линии.
На фиг. 1Ό проиллюстрировано выравнивание последовательностей для сравнения предсказанной аминокислотной последовательности тяжелой цепи антитела 6.34.2 с последовательностью генного продукта УН3-30 человеческой зародышевой линии.
На фиг. 1Е проиллюстрировано выравнивание последовательностей для сравнения предсказанной аминокислотной последовательности тяжелой цепи антитела 6.67.1 с последовательностью генного продукта УН4-4 человеческой зародышевой линии.
На фиг. 1Е проиллюстрировано выравнивание последовательностей для сравнения предсказанной аминокислотной последовательности тяжелой цепи антитела 6.73.2 с последовательностью генного продукта УН3-23 человеческой зародышевой линии.
На фиг. 1С проиллюстрировано выравнивание последовательностей для сравнения предсказанной аминокислотной последовательности тяжелой цепи антитела 6.77.1 с последовательностью генного продукта УН3-21 человеческой зародышевой линии.
На фиг. 1Н проиллюстрировано выравнивание последовательностей для сравнения предсказанной аминокислотной последовательности тяжелой цепи антител 7.16.6 и 7.26.4 с последовательностью генного продукта УН1-18 человеческой зародышевой линии.
На фиг. 11 проиллюстрировано выравнивание последовательностей для сравнения предсказанной аминокислотной последовательности тяжелой цепи антитела 7.2 0.5 с последовательностью генного продукта УН4-4 человеческой зародышевой линии.
На фиг. 11 проиллюстрировано выравнивание последовательностей для сравнения предсказанной аминокислотной последовательности тяжелой цепи антитела 9.8.2 с последовательностью генного продукта УН3-33 человеческой зародышевой линии.
На фиг. 1К проиллюстрировано выравнивание последовательностей для сравнения предсказанной аминокислотной последовательности легкой каппа-цепи антител 1.7.2 и 1.8.2 с последовательностью генного продукта А3 человеческой зародышевой линии.
На фиг. 1Ь проиллюстрировано выравнивание последовательностей для сравнения предсказанной аминокислотной последовательности легкой каппа-цепи антитела 6.14.2 с последовательностью генного продукта 012 человеческой зародышевой линии.
На фиг. 1М проиллюстрировано выравнивание последовательностей для сравнения предсказанной аминокислотной последовательности легкой каппа-цепи антитела 6.22.2 с последовательностью генного продукта А26 человеческой зародышевой линии.
На фиг. 1Ν проиллюстрировано выравнивание последовательностей для сравнения предсказанной аминокислотной последовательности легкой каппа-цепи антитела 6.34.2 с последовательностью генного продукта 012 человеческой зародышевой линии.
На фиг. 10 проиллюстрировано выравнивание последовательностей для сравнения предсказанной аминокислотной последовательности легкой каппа-цепи антитела 6.67.1 с последовательностью генного продукта В3 человеческой зародышевой линии.
- 2 012872
На фиг. 1Р проиллюстрировано выравнивание последовательностей для сравнения предсказанной аминокислотной последовательности легкой каппа-цепи антитела 6.73.2 с последовательностью генного продукта 012 человеческой зародышевой линии.
На фиг. 10 проиллюстрировано выравнивание последовательностей для сравнения предсказанной аминокислотной последовательности легкой каппа-цепи антитела 6.77.1 с последовательностью генного продукта А2 человеческой зародышевой линии.
На фиг. 1К проиллюстрировано выравнивание последовательностей для сравнения предсказанной аминокислотной последовательности легкой каппа-цепи антител 7.16.6 и 7.26.4 с последовательностью генного продукта А2 человеческой зародышевой линии.
На фиг. 18 проиллюстрировано выравнивание последовательностей для сравнения предсказанной аминокислотной последовательности легкой каппа-цепи антитела 7.20.5 с последовательностью генного продукта А3 человеческой зародышевой линии.
На фиг. 1Т проиллюстрировано выравнивание последовательностей для сравнения предсказанной аминокислотной последовательности легкой каппа-цепи антитела 9.8.2 с последовательностью генного продукта 018 человеческой зародышевой линии.
На фиг. 2 проиллюстрировано выравнивание последовательностей с помощью программы СЬи§ТАЬ для сравнения предсказанных аминокислотных последовательностей тяжелой цепи и легкой каппа-цепи человеческих анти-МА6САМ антител.
На фиг. 2А проиллюстрировано выравнивание последовательностей с помощью программы СЬИЗТАЬ для сравнения предсказанных аминокислотных последовательностей легкой каппа-цепи, и радиальное дерево этих последовательностей, указывающие на степень сходства между последовательностями легких каппа-цепей анти-МА6САМ антитела.
На фиг. 2В проиллюстрировано выравнивание последовательностей с помощью программы СЬИЗТАЬ для сравнения предсказанных аминокислотных последовательностей тяжелой цепи, и радиальное дерево этих последовательностей, указывающие на степень сходства между последовательностями тяжелых цепей анти-МА6САМ антитела.
На фиг. 3 проиллюстрировано выравнивание аминокислотных последовательностей с помощью программы СЬИЗТАЬ для сравнения 2 Ν-концевых доменов МА6САМ собакоподобных обезьян и человека, которые образуют а4в7-связывающий домен, β-нити выравнивали, как описано в работе Тап е1 а1., 81гисШге (1998) 6:793-801.
На фиг. 4 приводится график дозозависимого влияния очищенных биотинилированных антител 1.7.2 и 7.16.6 на адгезию лимфоцитов человеческой периферической крови в срезах МА6САМэкспрессирующего замороженного эндотелия печени человека.
На фиг. 5 приводится двумерное графическое представление, полученное по данным, взятым из табл. 7 для различных эпитопов МА6САМ, с которыми связываются анти-МА6САМ антитела 1.7.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2. Анти-МА6САМ антитела в одном и том же кружке имеют одинаковые типы реактивности, связываются с одним и тем же участком эпитопа, и, вероятно, распознают один и тот же эпитоп на МА6САМ. Клоны анти-МА6САМ антитела в перекрывающихся кружках не способны к одновременному связыванию, а поэтому, они, вероятно, распознают перекрывающийся эпитоп на МА6САМ. Обособленные кружки представляют клоны анти-МА6САМ антител, имеющие различные эпитопы, пространственно отделенные друг от друга.
На фиг. 6 представлены данные сэндвич-ЕЫ8А-анализа для анти-МА6САМ антитела 1.7.2 и анти-МА6САМ антитела 7.16.6, меченного А1еха 488, указывающие на то, что два антитела, способные распознавать различные эпитопы на МА6САМ, могут быть использованы для детекции растворимого МА6САМ в диагностических целях.
На фиг. 7 проиллюстрировано действие ингибирующего анти-МА6САМ антитела (1 мг/кг), а именно, анти-МА6САМ шАЬ 7.16.6, в модели собакоподобных обезьян, на ряд циркулирующих периферических α4β7 +-лимфоцитов, выраженное как кратное увеличение по сравнению с контрольным тАЬ 1дС2а или носителем.
Подробное описание изобретения Определения и общие методы
Если это не оговорено особо, то все научные и технические термины, используемые в описании настоящего изобретения, имеют значения, хорошо известные специалистам. Кроме того, если это не очевидно из контекста изобретения, то под термином, употребляемом в единственном числе, могут подразумеваться также термины во множественном числе, и наоборот, под термином, употребляемым во множественном числе, могут подразумеваться также термины в единственном числе. В общих чертах, номенклатура, используемая в описании методов молекулярной биологии, иммунологии, микробиологии, генетики, химии белков и нуклеиновых кислот и гибридизации, относящихся к клеточным и тканевым культурам, хорошо известна и широко применяется специалистами. Упомянутые выше способы и процедуры согласно изобретению, если это не оговорено особо, обычно осуществляют в соответствии со стандартной хорошо известной методикой, которая описана в различных общих и более конкретных цити
- 3 012872 руемых руководствах и обсуждается в описании настоящего изобретения. См. например, руководство 8атЬтоок с1 а1., Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬотаФгу Мапиа1 (2б еб., Со1б 8рппд НагЬог ЬаЬота1оту Ргекк, Со1б 8рппд НагЬог, Ν.Υ. 1989) и Аи8иЬе1 е1 а1., СштеШ Рто1осо1к ίη Мо1еси1аг Вю1оду, Огеепе РиЬЬксЬшд АккоС1а1е5 (1992) и Наботе & Ьапе, АпЬЬоФек: А ЬаЬота1оту Мапиа1, Со1б 8рппд НагЬог ЬаЬота1оту Ргекк, Со1б 8рппд НагЬог, Ν.Υ. (1990), которые вводятся в настоящее описание посредством ссылки. Ферментативные реакции и процедуры очистки проводят в соответствии с инструкциями производителей, как описано в литературе или в настоящей заявке. Для проведения химического синтеза и химических анализов, для получения фармацевтических препаратов и композиций, а также для их доставки пациентам и лечения пациентов, применяются стандартные методы.
Используемые здесь термины, если это не оговорено особо, имеют нижеследующие значения.
Термин полипептид включает природные или искусственные белки, фрагменты белков и полипептидные аналоги последовательностей белков. Полипептид может быть мономерным или полимерным.
Используемый здесь термин выделенный белок или выделенный полипептид означает белок или полипептид, который, по своей природе или по своему происхождению (1) не ассоциируется с природными компонентами, с которыми он обычно ассоциируется в природе, (2) не содержит других белков от того же самого источника, (3) экспрессируется клеткой другого вида, или (4) не существует в природе. Таким образом, полипептид, полученный методом химического синтеза или синтезированный в клеточной системе, отличающейся от клеточной системы, от которой он обычно происходит, будет изолированным от его природных компонентов. Белок также может быть, по существу, отделен от ассоциированных с ним природных компонентов методами очистки белков, хорошо известными специалистам.
Белок или полипептид является по существу, чистым, по существу, гомогенным, или по существу, очищенным, если по меньшей мере примерно 60-75% образца содержит полипептид одного вида. Такой полипептид или белок может быть мономерным или мультимерным. По существу, чистый полипептид или белок обычно составляет примерно 50, 60, 70, 80 или 90% мас./мас. в образце белка, а в основном, примерно 95%, а предпочтительно более 99%. Чистота или гомогенность белка может быть определена различными хорошо известными методами, такими как электрофорез образца белка в полиакриламидном геле, с последующей визуализацией одной полипептидной полосы после окрашивания геля красителем, хорошо известным специалистам. В некоторых целях, для очистки с более высоким разрешением может быть использована ВЭЖХ или другие хорошо известные методы.
Используемый здесь термин полипептидный фрагмент означает полипептид, который имеет амино-концевую и/или карбокси-концевую делецию, но в котором остальная аминокислотная последовательность в соответствующих положениях аминокислот идентична природной аминокислотной последовательности. В некоторых вариантах изобретения, фрагменты имеют длину по меньшей мере 5, 6, 8 или 10 аминокислот. В других вариантах, фрагменты имеют длину по меньшей мере 14 аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 20 аминокислот, обычно по меньшей мере 50 аминокислот, а еще более предпочтительно по меньшей мере 70, 80, 90, 100, 150 или 200 аминокислот.
Используемый здесь термин полипептидный аналог означает полипептид, который содержит сегмент, имеющий по меньшей мере 25 аминокислот, в основном, идентичных части аминокислотной последовательности, и который обладает по меньшей мере одним из нижеследующих свойств, а именно, он (1) специфически связывается с МАбСАМ в подходящих условиях связывания; (2) он может ингибировать связывание интегрина α4β7- и/или Ь-селектина с МАбСАМ или (3) он способен ингибировать экспрессию МАбСАМ на клеточной поверхности ш νίΙΐΌ или ш у1уо. Обычно, полипептидные аналоги, по сравнению с природной последовательностью, содержат консервативную аминокислотную замену (добавление или делецию). Эти аналоги обычно имеют длину по меньшей мере 20 аминокислот, предпочтительно, по меньшей мере 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150 или 200 аминокислот или более, а в большинстве случаев, они имеют такую же длину, как и полноразмерный природный полипептид.
Предпочтительными аминокислотными заменами являются замены, которые приводят: (1) к снижению чувствительности к протеолизу, (2) к снижению чувствительности к окислению, (3) к изменению аффинности связывания для образования белковых комплексов, (4) к изменению аффинности связывания или (5) к сообщению или модификации других физико-химических или функциональных свойств таких аналогов. Такими аналогами могут быть различные мутеины с последовательностью, отличающейся от природной пептидной последовательности. Так, например, в природную последовательность (предпочтительно, в ту часть полипептида, которая расположена за пределами доменобразующих межмолекулярных контактов) могут быть внесены одна или множество аминокислотных замен (предпочтительно, консервативных аминокислотных замен). Консервативная аминокислотная замена не должна значительно влиять на структурные свойства родительской последовательности (например, аминокислотная замена не должна приводить к разрушению спирали, присутствующей в родительской последовательности, или к нарушению вторичной структуры других типов, которая характеризует родительскую последовательность). Примеры известных вторичных и третичных структур полипептида описаны в публикациях Рго1еш, 81шс1иге8 апб Мо1еси1аг Рппс1р1е8 (СгещЫоп еб., \У.Н. Бгеетап апб Сотрапу, №те Υо^к 1984); !п!гобисЬоп 1о Рго1еш 81гис1иге (Вгапбеп С. & Тоохе 1. ебк., Оаг1апб РиЬНкЫпд, №те Υо^к, Ν,Υ. 1991) и у ТЬотп
- 4 012872 ΐοη е! а1., Ыа1иге 354:105 (1991), которые вводятся в настоящее описание посредством ссылки.
Непептидные аналоги обычно используются в фармацевтической промышленности в качестве лекарственных средств со свойствами, аналогичными свойствам матричного пептида. Непептидные соединения этого типа называются пептидными миметиками или пептидомиметиками. См. публикации Еаисйеге, 1. Αάν. Эгид. Ке8. 15:29 (1986); УеЬег & Ете1бтдет, ΤΙΝ8 р.392 (1985) и Еуапк е! а1., 1. Меб. Сйет. 30:1229 (1987), которые вводятся в настоящее описание посредством ссылки. Такие соединения часто разрабатывают с помощью компьютерных программ молекулярного моделирования. Пептидные миметики, структурно сходные с терапевтически ценными пептидами, могут быть использованы для достижения эквивалентного терапевтического или профилактического эффекта. В общих чертах, пептидомиметики являются структурно сходными с репрезентативным полипептидом (то есть, с полипептидом, который обладает биохимическими свойствами или фармакологической активностью), таким как человеческое антитело, и обычно они имеют одну или несколько пептидных связей, необязательно замененных связью, такой как -0Ή2ΝΗ-. -СН2З-, -СН2-СН2-, -СН=СН- (цис и транс), -СОСН2-, -СН(ОН)СН2- и -СН2ЗО-, в соответствии с хорошо известной методикой. Системная замена одной или нескольких аминокислот консенсусной последовательности Ό-аминокислотой того же типа (например, замена Ь-лизина на Ό-лизин) может быть использована для генерирования более стабильных пептидов. Кроме того, пептиды с конформационными ограничениями, содержащие консенсусную последовательность или вариант последовательности, в основном, идентичный консенсусной последовательности, могут быть генерированы известными методами (см. публикацию Κίζο & С1егаксй, Лпп.Кеу. Вюсйет. 61:387 (1992), которая вводится в настоящее описание посредством ссылки), например, путем присоединения внутренних цистеиновых остатков, способных образовывать внутримолекулярные дисульфидные мостики, которые циклизуют данный пептид.
Иммуноглобулин представляет собой тетрамерную молекулу. В природном иммуноглобулине, каждый тетрамер состоит из двух идентичных пар полипептидных цепей, каждая из которых имеет одну легкую цепь (примерно 25 кДа) и одну тяжелую цепь (примерно 50-70 кДа). Аминоконцевая часть каждой цепи включает вариабельную область, состоящую примерно из 100-110 или более аминокислот, ответственных, главным образом, за распознавание антигена. Карбоксиконцевая часть каждой цепи определяет константную область, ответственную, главным образом, за эффекторную функцию. Человеческие легкие цепи классифицированы как легкие цепи к и λ. Тяжелые цепи классифицированы как μ, δ, γ, α или ε, и определяют изотип антитела, такой как 1дМ, 1дИ, 1дС, 1дА и 1дЕ, соответственно. В легкой и тяжелой цепях, вариабельные и константные области связаны посредством 'Τ'-области, состоящей примерно из 12 или более аминокислот, при этом, тяжелая цепь также включает Ό''-область, состоящую примерно из 10 или более аминокислот. См. в общих чертах публикацию Еипбатеп!а1 1ттипо1оду, Сй. 7 (Раи1, еб., 2пб еб. Κаνеη Ргекк, Ν.Υ. (1989), которая для всех целей осуществления изобретения вводится в настоящее описание посредством ссылки). Вариабельные области каждой пары легкая цепь/тяжелая цепь образуют связывающий сайт антитела, в результате чего интактный иммуноглобулин имеет два связывающих сайта.
Иммуноглобулиновые цепи имеют идентичную общую структуру, состоящую из относительно консервативных каркасных областей (ЕК), связанных тремя гипервариабельными областями, также называемыми комплементарность-определяющими областями или СЭК. СЭК двух цепей каждой пары выравнивают по каркасным областям с получением эпитоп-специфического сайта связывания. Легкие и тяжелые цепи, в направлении от Ν-конца к С-концу, содержат домены ЕК1, СЭК1, ЕК2, СЭК2, ЕК3, СЭК3 и ЕК4. Присвоение аминокислот для каждого домена осуществляют в соответствии с нумерацией Кэбата, описанной в публикациях Зесщепсек о£ Рто!етк о£ 1ттипо1од1са1 1п!егек! (№1бопа1 1пкй!и!ек о£ Неа1!й, Ве!йекба, Мб. 1991)(1987) или С1о1Ыа апб Ьекк, б. Мо1. Вю1. 196:901-17 ((1987) и (1987)); С1о1Ыа е! а1., №11иге 342:878-883 (1989), каждая из которых во всей своей полноте вводится в настоящее описание посредством ссылки.
Термин антитело означает интактный иммуноглобулин или его антигенсвязывающую часть, которая конкурирует с интактным антителом за специфическое связывание. В некоторых вариантах изобретения, антителом является его антигенсвязывающая часть. Антигенсвязывающие части могут быть получены методами рекомбинантных ДНК или путем ферментативного или химического гидролиза интактных антител. Антигенсвязывающими фрагментами являются т!ет айа ЕаЬ, ЕаЬ', Е(аЬ')2, Εν, бАЬ и фрагменты гипервариабельной области (СЭК), одноцепочечные антитела (ксЕу), химерные антитела, диантитела и полипептиды, которые содержат по меньшей мере часть иммуноглобулина, достаточную для специфического связывания антигена с полипептидом. ЕаЬ-фрагментом является одновалентный фрагмент, состоящий из доменов УЪ, УН, СЬ и СН1; Е(аЬ)2-фрагментом является двухвалентный фрагмент, содержащий два ЕаЬ-фрагмента, связанных дисульфидным мостиком в шарнирной области; Ебфрагмент состоит из доменов УН и СН1; Εν-фрагмент состоит из доменов УЪ и УН одной цепи антитела; а бАЬ-фрагмент (\Уагб е! а1., №1ите, 341:544-546 (1989)) состоит из домена УН.
Используемый здесь термин антитело, которое обозначается, например, 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.77.2, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4 или 9.8.2, представляет собой моноклональное антитело, которое про
- 5 012872 дуцируется гибридомой с таким же обозначением. Так, например, антитело 1.7.2 продуцируется гибридомой 1.7.2. Антитело, обозначаемое 6.22.2-тоб, 6.34.2-тоб, 6.67.1-тоб, 6.77.1-тоб или 7.26.4-тоб, представляет собой моноклональное антитело, последовательность которого была модифицирована путем сайт-направленного мутагенеза соответствующей родительской последовательности.
Одноцепочечное антитело (ксРу) представляет собой антитело, в котором области УЪ и УН являются спаренными и образуют одновалентную молекулу посредством синтетического линкера, который способствует образованию молекул в виде одной цепи белка. (В1гб е! а1., 8с1епсе, 242:423-426 (1988) и Ни81ои е! а1., Ргос. №111. Асаб. 8ск, И8А, 85:5879-5883 (1988)). Диантитела представляют собой двухвалентные биспецифические антитела, в которых домены УН и УЪ экспрессируются на одной полипептидной цепи, но с использованием линкера, который является слишком коротким для того, чтобы происходило спаривание между двумя доменами на одной и той же цепи, что вынуждает эти домены спариваться с комплементарными доменами другой цепи и образовывать два антигенсвязывающих сайта, (см. например, НоШдет Р. е! а1., Ргос. №111. Асаб. 8ск, И8А, 90:6444-6448 (1993) и РоЩак КН. е! а1., 8!тис!иге, 2:11211123 (1994)). Одна или несколько областей СЭВ антитела согласно изобретению могут быть включены в молекулу путем ковалентного или нековалентного связывания с образованием иммуноадгезина, который специфически связывается с МАбСАМ. Иммуноадгезин может вводить СОВ как часть более крупной полипептидной цепи; может ковалентно связывать СОВ с другой полипептидной цепью; или может вводить СОВ путем нековалентного связывания. СОВ позволяют иммуноадгезину специфически связываться с конкретным представляющим интерес антигеном.
Антитело может иметь один или несколько связывающих сайтов. Если присутствует более, чем один связывающий сайт, то такие связывающие сайты могут быть идентичны друг другу, либо они могут быть различными. Так, например, природный иммуноглобулин имеет два идентичных связывающих сайта; одноцепочечное антитело или РаЬ-фрагмент имеет один связывающий сайт, а биспецическое или бифункциональное антитело (диантитело) имеет два различных связывающих сайта.
Термин выделенное антитело представляет собой антитело, которое (1) не ассоциируется с природными компонентами, включая другие нативные антитела, с которыми оно ассоциируется в природе, (2) не содержит других белков от того же самого источника, (3) экспрессируется клеткой другого вида, или (4) не существует в природе. Примерами выделенных антител являются анти-МАбСАМ антитело, которое было аффинно очищено с использованием МАбСАМ; анти-МАбСАМ антитело, которое было продуцировано гибридомой или другой клеточной линией ίη νίΙΐΌ; и человеческое анти-МАбСАМ антитело, полученное от трансгенного млекопитающего или растения.
Используемый здесь термин человеческое антитело означает антитело, в котором последовательностями вариабельной и константной областей являются последовательности человеческого антитела. Этот термин также охватывает антитела, последовательности которых происходят от человеческих генов, но которые были модифицированы, например, в целях снижения возможной иммуногенности, повышения аффинности и удаления цистенов или сайтов гликозилирования, которые могут приводить к образованию нежелательной укладки и т. п. Этот термин охватывает такие антитела, которые рекомбинантно продуцируются в нечеловеческих клетках, и которые могут вызывать гликозилирование, не являющееся типичным для человеческих клеток. Этот термин также охватывает антитела, которые вырабатываются у трансгенных мышей, имеющих несколько или все локусы тяжелой и легкой цепей человеческого иммуноглобулина.
В одном из своих аспектов, настоящее изобретение относится к гуманизированному антителу. В некоторых вариантах изобретения, гуманизированным антителом является антитело, которое происходит от видов животных, не являющихся человеком, и в котором некоторые аминокислоты каркасных и константных доменов тяжелой и легкой цепей были мутированы во избежание или для элиминации иммунного ответа у человека. В некоторых вариантах изобретения, гуманизированное антитело может быть продуцировано путем присоединения константных доменов человеческого антитела к вариабельным доменам антитела животного, не являющегося человеком. Примеры получения гуманизированных антител можно найти в патентах США №№ 6054297, 5886152 и 5977293. В некоторых вариантах изобретения, гуманизированное анти-МАбСАМ антитело согласно изобретению содержит аминокислотную последовательность одной или нескольких каркасных областей одного или нескольких человеческих антиМАбСАМ антител согласно изобретению.
В другом своем аспекте настоящее изобретение включает химерное антитело. В некоторых вариантах изобретения, химерное антитело означает антитело, которое содержит одну или несколько областей одного антитела и одной или нескольких областей одного или нескольких других антител. В предпочтительном варианте изобретения, одна или несколько СЭВ происходят от человеческого антиМАбСАМ антитела согласно изобретению. В более предпочтительном варианте изобретения, все СЭВ происходят от человеческого анти-МАбСАМ антитела согласно изобретению. В другом предпочтительном варианте, СЭВ, происходящие от более, чем одного человеческого анти-МАбСАМ антитела согласно изобретению, являются смешанными и совместимыми в химерном антителе. Так, например, химерное антитело может содержать область СЭВ1 от легкой цепи первого человеческого анти-МАбСАМ антитела, которая может быть объединена с СЭВ2 и СЭВ3 легкой цепи второго человеческого анти-МАбСАМ
- 6 012872 антитела, и область СЭР тяжелой цепи, которая может происходить от третьего анти-МАйСАМ антитела. Кроме того, каркасные области могут происходить от одного из одинаковых анти-МАйСАМ антител, от одного или нескольких различных антител, таких как человеческое антитело, или от гуманизированного антитела.
Нейтрализующее антитело, ингибирующее антитело или антитело-антагонист представляет собой антитело, которое ингибирует связывание лиганда α4β7 или а4в7-экспрессирующих клеток или любого другого когнатного лиганда или клеток, экспрессирующих когнатный лиганд, с МАйСАМ по меньшей мере примерно на 20%. В предпочтительном варианте изобретения указанное антитело ингибирует связывание интегрина α4β7 или а4в7-экспрессирующих клеток с МАйСАМ по меньшей мере примерно на 40%, более предпочтительно на 60%, а еще более предпочтительно на 80, 85, 90, 95 или 100%. Ингибирование связывания может быть определено любым методом, известным среднему специалисту в данной области, например, оно может определено ίη νίΐτο с помощью анализа на конкурентное связывание. Пример такого определения ингибирования связывания а4в7-экспрессирующих клеток с МАйСАМ представлен в примере 1.
Фрагменты или аналоги антител могут быть легко получены средним специалистом в данной области, исходя из описания настоящего изобретения. Предпочтительно, чтобы амино- и карбокси-концы этих фрагментов или аналогов находились вблизи границ функциональных доменов. Структурные и функциональные домены могут быть идентифицированы путем сравнения данных нуклеотидных или аминокислотных последовательностей с последовательностями, имеющимися в известных общедоступных базах данных или в базах данных, находящихся в частной собственности. Предпочтительно, для идентификации мотивов последовательностей или конформационных доменов предсказанных белков, которые встречаются в других белках с известной структурой и/или функцией, используются методы компьютерного сравнения. Методы идентификации последовательностей белка, которые образуют известную трехмерную структуру, известны специалистам и описаны в работе Βο\νίο е! а1., 8с1епсе 253:164 (1991) .
Используемый здесь термин поверхностный плазмонный резонанс означает оптическое явление, который позволяет анализировать в режиме реального времени биоспецифические взаимодействия путем детекции изменений концентрации белка в биосенсорной матрице, например, с использованием системы В1Асоге (Рйатшаша Вюкепкот АВ, Ирр8а1а, 8\тейеп апй РЬсаКцуау. N1). Более подробное описание можно найти у Ιοηδδοη и. е! а1., Апп.Вю1. С11п. 51:19-26 (1993); Ιοηβδοη и. е! а1., Вю!есБшдие8, 11:620-627 (1991); 1ойп88оп В. е! а1., 1. Мο1. Κ^ο^ηίΐ. 8:125-131 (1995) и у ίοΐιηδοη В. е! а1., Апа1. Вюсйеш., 198:268-277 (1991).
Термин Κο[| означает константу скорости обратной реакции, т.е., константу диссоциации антитела из комплекса антитело/антиген.
Термин Кй означает константу диссоциации конкретной реакции взаимодействия антителоантиген. Считается, что антитело связывается с антигеном, если константа диссоциации составляет < 1 мкМ, предпочтительно < 100 нМ, а наиболее предпочтительно < 10 нМ.
Термин эпитоп означает любую детерминанту белка, способную специфически связываться с иммуноглобулином или Т-клеточным рецептором или как-либо иначе взаимодействовать с молекулой. Эпитопные детерминантаты обычно состоят из химически активных поверхностных групп молекул, таких как аминокислоты или углеводные боковые цепи, и, в основном, имеют специфическую трехмерную структуру, а также специфические зарядовые характеристики. Эпитоп может быть линейным или конформационным. В линейном эпитопе все сайты взаимодействия между белком и взаимодействующей молекулой (такой как антитело) располагаются вдоль первичной аминокислотной последовательности белка. В конформационном эпитопе, сайты взаимодействия расположены по всей длине первичной аминокислотной последовательности белка. В конформационном эпитопе, сайты взаимодействия находятся в аминокислотных остатках, которые расположены на белке друг против друга и отделены друг от друга.
Используемые здесь двадцать главных аминокислот имеют общепринятые аббревиатуры. См. монографию Ιιηιηιιηο1οβ\· - А §уп!йе818 (2й ей., Οο1ιιό Е.8. & Степ Ό.Κ.. ейз., 8таиет А88οс^а!е8, 8ипйет1апй, Ма88. (1991)), которая вводится в настоящее описание посредством ссылки. Стереоизомеры (например, Ό-аминокислоты) двадцати главных аминокислот, неприродных аминокислот, таких как α,αдизамещенные аминокислоты, Ν-алкилзамещенных аминокислот, молочной кислоты и других редких аминокислот могут также служить подходящими компонентами для описанных здесь полипептидов согласно изобретению. Примерами редких аминокислот являются 4-гидроксипролин, γ-карбоксиглутамат, ε-Ν,Ν,Ν-триметиллизин, ε-Ν-ацетиллизин, О-фосфосерин, Ν-ацетилсерин, Ν-формилметионин, 3метилгистидин, 5-гидроксилизин, ε-Ν-метиларгинин и другие аналогичные аминокислоты и иминокислоты (например, 4-гидроксипролин). В используемой здесь системе обозначения полипептидов, в соответствии с общепринятой практикой и принятым соглашением о терминологии, левый конец аминокислоты называется аминоконцом, а правый конец аминокислоты называется карбоксиконцом.
Используемый здесь термин полинуклеотид означает полимерную форму нуклеотидов длиной по
- 7 012872 меньшей мере в 10 нуклеотидов, либо рибонуклеотидов или дезоксинуклеотидов, либо модифицированную форму, состоящую из нуклеотидов любого типа. Этот термин также включает одноцепочечные и двухцепочечные формы ДНК.
Используемый здесь термин выделенный полинуклеотид означает полинуклеотид геномной ДНК, кДНК или синтетический полинуклеотид или некоторые их комбинации; причем, по своей природе, выделенный полинуклеотид (1) не ассоциируется со всем полинуклеотидом или с частью полинуклеотида, с которым указанный выделенный полинуклеотид ассоциируется в природе; (2) функционально присоединен к полинуклеотиду, который не связан с ним в природе, или (3) не существует в природе как часть более крупной последовательности.
Используемый здесь термин олигонуклеотид означает природные и модифицированные нуклеотиды, связанные друг с другом природными или неприродными олигонуклеотидными связями. Олигонуклеотиды представляют собой полинуклеотидную подпоследовательность, обычно содержащую 200 или менее нуклеотидов. Олигонуклеотиды, предпочтительно, имеют длину 10-60 нуклеотидов, а наиболее предпочтительно 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20-40 нуклеотидов. Обычно олигонуклеотиды являются одноцепочечными, например олигонуклеотиды, используемые для зондов, однако они могут быть и двухцепочечными, например, олигонуклеотиды, используемые для конструирования генного мутанта. Олигонуклеотиды согласно изобретению могут быть смысловыми или антисмысловыми.
Используемый здесь термин природные нуклеотиды означает дезоксирибонуклеотиды и рибонуклеотиды. Используемый здесь термин модифицированные нуклеотиды означает нуклеотиды с модифицированными или с замещенными сахарными группами и т.п.
Используемый здесь термин олигонуклеотидные связи включает такие олигонуклеотидные связи, как фосфортиоат, фосфордитиоат, фосфорселеноат, фосфордиселеноат, фосфоранилотиоат, фосфоранилидат, фосфорамидат и т.п. См., например, публикации ЬаР1апсйе е! а1., Νιιοϊ. АсЛк. Кек. 14:9081 (1986); §!ес е! а1., 1. Ат. Сйет. 8ос. 106:6077 (1984); §!еш е! а1., Νυο1. Ас1бк. Кек. 16:3209 (1988); Ζοη е! а1., Αη!ίСапсег Эгид Эекщп 6:539 (1991); Ζοη е! а1., О11допис1еойбек апб Апа1одиек: А Ргасйса1 Арргоасй, рр.87-108 (Е.Ескк!еш Еб., ОхГогб Ишуегкйу Ргекк, ОхГогб Епд1апб (1991)); §!ес е! а1., патент США № 5151510; ИЫтапп & Реутап Сйетюа1 Кеу1е^к, 90:543 (1990), которые вводятся в настоящее описание посредством ссылки. Если необходимо, олигонуклеотид может включать метку для детекции.
Функционально присоединенные последовательности включают последовательности регуляции экспрессии, которые являются смежными с представляющими интерес генами, и последовательности регуляции экспрессии, которые осуществляют регуляцию представляющего интерес гена, действуя ίη !гапк или на расстоянии от него. Используемый здесь термин последовательность регуляции экспрессии означает полинуклеотидные последовательности, которые необходимы для эффективной экспрессии и процессинга кодирующих последовательностей, к которым они присоединены.
Последовательностями регуляции экспрессии являются соответствующие последовательности инициации и терминации транскрипции, промоторные и энхансерные последовательности; сигналы эффективного процессинга РНК, такие как сигналы сплайсинга и полиаденилирования; последовательности, стабилизирующие цитоплазматическую мРНК; последовательности, повышающие эффективность трансляции (то есть, консенсусная последовательность Козака); последовательности, повышающие стабильность белка, и если это необходимо, то последовательности, усиливающие секрецию белка. Природа таких регуляторных последовательностей варьируется в зависимости от типа организма-хозяина, например у прокариотов такие регуляторные последовательности обычно включают промотор, сайт связывания с рибосомой и последовательность терминации транскрипции, а у эукариотов такие регуляторные последовательности обычно включают промоторы и последовательность терминации транскрипции. Термин регуляторные последовательности включает, как минимум, все компоненты, присутствие которых необходимо для экспрессии и процессинга, и может также включать дополнительные компоненты, присутствие которых является желательным, например лидерные последовательности и последовательности партнеров по связыванию.
Используемый здесь термин вектор означает молекулу нуклеиновой кислоты, способную переносить другую нуклеиновую кислоту, к которой она присоединена. Одним из типов векторов является плазмида, представляющая собой кольцевую двухцепочечную ДНК-петлю, к которой могут быть присоединены дополнительные ДНК-сегменты. Другим типом вектора является вирусный вектор, в котором дополнительные ДНК-сегменты могут быть лигированы в вирусный геном. Некоторые векторы способны автономно реплицироваться в клетке-хозяине, в которую они вводятся (например, бактериальные векторы, имеющие ориджин репликации в бактерии, и эписомные векторы млекопитающих). Другие векторы (например, не-эписомные векторы млекопитающих) могут быть интегрированы в геном клеткихозяина после их введения в указанную клетку-хозяина, а поэтому, они могут реплицироваться вместе с геномом хозяина. Кроме того, некоторые векторы способны регулировать экспрессию генов, к которым они функционально присоединены. Такие векторы называются здесь рекомбинантными экспрессионными векторами (или просто экспрессионными векторами). В общих чертах, в методах рекомбинантных ДНК, экспрессионные векторы часто используются в форме плазмид. В настоящем описании термины плазмида и вектор могут быть взаимозаменяемыми, поскольку плазмида чаще всего используется
- 8 012872 в качестве вектора. Однако настоящее изобретение включает и другие формы экспрессионных векторов, такие как вирусные векторы (например, дефектные по репликации ретровирусы, аденовирусы и аденоассоциированные вирусы), которые имеют эквивалентные функции.
Используемый здесь термин рекомбинантная клетка-хозяин (или просто клетка-хозяин) означает клетку, в которую был введен рекомбинантный экспрессионный вектор. Следует отметить, что такие термины могут означать не только конкретную клетку индивидуума, но также и потомство таких клеток. Поскольку в последующих генерациях могут возникать некоторые модификации, обусловленные либо мутацией, либо влиянием окружающей среды, то такое потомство, фактически, не может быть идентичным родительской клетке, однако оно все же входит в объем используемого здесь термина клеткахозяин.
Используемый здесь термин селективная гибридизация относится к детектируемому и специфическому связыванию. Полинуклеотиды, олигонуклеотиды и их фрагменты согласно изобретению селективно гибридизуются с цепями нуклеиновой кислоты в таких условиях гибридизации и промывки, которые значительно минимизируют уровень детектируемого связывания с неспецифическими нуклеиновыми кислотами. Для достижения селективной гибридизации, известной специалистам и обсуждаемой в настоящей заявке, могут быть использованы условия высокой жесткости или в высокой степени жесткие условия. Одним из примеров условий высокой жесткости или в высокой степени жестких условий является инкубирование полинуклеотида с другим полинуклеотидом, где один полинуклеотид может быть фиксирован на твердой поверхности, такой как мембрана, в буфере для гибридизации, содержащем 6 х 88РЕ или 88С, 50% формамид, 5 х реагент Денхардта, 0,5% ДСН, 100 мкг/мл денатурированной фрагментированной ДНК спермы лосося, при температуре гибридизации 42°С в течение 12-16 ч, с последующей двухкратной промывкой при 55°С в промывочном буфере, содержащем 1 х 88С, 0,5% ДСН. См. также 8атЬтоок е! а1., см. выше, рр. 9,50-9,55.
Термин процент идентичности последовательностей, относящийся к нуклеотидным последовательностям, означает процент остатков двух последовательностей, которые являются одинаковыми при их сравнении путем выравнивания на максимальное соответствие. Длина сравниваемой последовательности, используемой для определения идентичности, может составлять по меньшей мере примерно более девяти нуклеотидов, а обычно по меньшей мере примерно 18 нуклеотидов, или по меньшей мере примерно 24 нуклеотида, а обычно по меньшей мере примерно 28 нуклеотидов, чаще всего по меньшей мере примерно 32 нуклеотида, а предпочтительно по меньшей мере примерно 36, 48 или более нуклеотидов. Для определения идентичности нуклеотидных последовательностей могут быть применены различные алгоритмы, известные специалистам. Так, например, полинуклеотидные последовательности можно сравнивать с помощью программ ЕА8ТА, Оар или Век(ПЕ которые входят в пакет программ Χνίδοοηδίη Раскаде Уеткюи 10.3, Ассе1гук, 8аи И1едо, СА. Программа ЕА8ТА, в которую входят, например, программы ЕА8ТА2 и ЕА8ТА3, позволяет проводить выравнивание последовательностей и определять процент идентичности последовательностей для областей с наилучшим перекрыванием между запрашиваемыми последовательностями и исследуемыми последовательностями (публикации Реагкои, Ме!1обк Еихуто1. 183:63-98 (1990); Реагкои, МеШобк Мо1. Вю1. 132:185-219 (2000); Реагкои, МеШобк Епхуто1. 266:227-258 (1996); Реагкои, 1. Мо1. Вю1. 276:71-84 (1998), которые вводятся в настоящее изобретение посредством ссылки). Если это не оговорено особо, то используются параметры по умолчанию, установленные для данной программы или алгоритма. Так, например, процент идентичности нуклеотидных последовательностей может быть определен с помощью программы ЕА8ТА с соответствующими параметрами по умолчанию (размер слова 6 и фактор ЙОРАМ для оценочной матрицы) или с помощью программы Оар с ее параметрами по умолчанию, которая поставляется в νίκ^^ω Раскаде Уеткюи, и которая вводится в настоящее описание посредством ссылки.
Если это не оговорено особо, то термин нуклеотидная последовательность охватывает и комплементарную ей последовательность. Таким образом, подразумевается, что термин молекула нуклеиновой кислоты, имеющая конкретную последовательность, должен охватывать ее комплементарную цепь вместе с ее комплементарной последовательностью.
В молекулярной биологии, исследователи используют термины процент идентичности последовательностей, процент сходства последовательностей и процент гомологии последовательностей, которые являются взаимозаменяемыми. В настоящей заявке, эти термины имеют одно и то же значение только, если они относятся к нуклеотидным последовательностям.
Термин по существу, аналогичный, или по существу, аналогичные последовательности, если он относится к нуклеиновой кислоте или к ее фрагменту, означает, что при оптимальном выравнивания, с соответствующими нуклеотидными инсерциями или делециями, для сравнения этой последовательности с другой нуклеиновой кислотой (или ее комплементарной цепью), идентичность нуклеотидных оснований в этих нуклеотидных последовательностях составляет по меньшей мере примерно 85%, предпочтительно по меньшей мере примерно 90%, а еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 95, 96, 97, 98 или 99%, как может быть определено с помощью любого хорошо известного алгоритма для определения идентичности последовательностей, такого как ЕА8ТА, ВЬА8Т или ОАР, и как обсуждается
- 9 012872 выше.
Термин в основном, идентичный, относящийся к полипептидам, означает, что две пептидных последовательности, при их оптимальном выравнивании, например, с помощью программ САР или ВЕ8ТЕ1Т с использованием весов пробелов по умолчанию, имеют по меньшей мере 75- или 80%-ную идентичность последовательностей, предпочтительно по меньшей мере 90- или 95%-ную идентичность последовательностей, а более предпочтительно по меньшей мере 98- или 99%-ную идентичность последовательностей. При этом предпочтительно чтобы положения остатков, которые не являются идентичными, отличались по своим консервативным аминокислотным заменам. Термин консервативная аминокислотная замена означает аминокислотный остаток, замененный другим аминокислотным остатком, имеющим боковую цепь (группу Я) и аналогичные химические свойства (например, заряд или гидрофобность). В общих чертах, консервативная аминокислотная замена не будет оказывать значительного влияния на функциональные свойства белка. В тех случаях, когда две или более аминокислотных последовательности отличаются друг от друга консервативными заменами, то процент идентичности последовательностей или степень их сходства могут быть скорректированы с учетом консервативной природы такой замены. Способы осуществления такой коррекции хорошо известны специалистам. См., например, публикацию Реагаои, МеШобк Μοί. ΒίοΙ., 24:307-31 (1994), которая вводится в настоящее описание посредством ссылки. Примерами групп аминокислот, которые имеют боковые цепи с аналогичными химическими свойствами, являются 1) аминокислоты, имеющие алифатические боковые цепи: глицин, аланин, валин, лейцин и изолейцин; 2) аминокислоты, имеющие алифатические гидроксильные боковые цепи: серин и треонин; 3) аминокислоты, имеющие амидсодержащие боковые цепи: аспарагин и глутамин; 4) аминокислоты, имеющие ароматические боковые цепи: фенилаланин, тирозин и триптофан; 5) аминокислоты, имеющие основные боковые цепи: лизин, аргинин и гистидин; и 6) аминокислоты, имеющие серусодержащие боковые цепи: цистеин и метионин. Предпочтительными консервативными аминокислотными заменами являются замены в пределах таких групп, как валин-лейцин-изолейцин, фенилаланин-тирозин, лизин-аргинин, аланин-валин, глутамат-аспартат и аспарагин-глутамин.
Альтернативно, консервативной заменой является любая замена, имеющая положительное значение в матрице логарифмического правдоподобия РАМ250, описанной в публикации Соиие! е! а1., Зсбеисе 256: 1443-45 (1992), которая вводится в настоящее описание посредством ссылки. Термин умеренно консервативная замена означает любую замену, имеющую неотрицательное значение в матрице логарифмического правдоподобия РАМ250.
Сходство полипептидных последовательностей обычно определяют с помощью компьютерной программы для анализа последовательностей. Компьютерный анализ белков проводят для установления соответствия последовательностей с использованием цены сходства, приписываемой различным заменам, делециям и другим модификациям, включая консервативные аминокислотные замены. Так, например, ССС включает программы, такие как Сар и ВеЧПГ. которые могут быть использованы с параметрами по умолчанию, установленными в этих программах, для определения гомологии последовательностей или идентичности последовательностей между близкородственными полипептидами, такими как гомологичные полипептиды, происходящие от организмов различных видов, или между белком дикого типа и его мутеином. См., например, ХУ^сощш раскаде Уегаюи 10.3. Полипептидные последовательности могут быть также подвергнуты сравнению с помощью программы ЕА8ТА с использованием параметров по умолчанию или рекомендованных параметров, а именно, программы, входящей в пакет программ \У15соп5ш раскаде Уегаюи 10.3. Программа ЕА8ТА (например, ЕА8ТА2 и ЕА8ТА3) позволяет проводить сопоставление последовательностей и определять процент идентичности последовательностей для областей с наилучшим перекрыванием между запрашиваемыми последовательностями и исследуемыми последовательностями (Реатаои (1990); Реатаои (2000)). Другим предпочтительным алгоритмом для сравнения последовательности согласно изобретению с последовательностью базы данных, содержащей большое число последовательностей, происходящих от различных организмов, является компьютерная программа ВЬАЗТ, а в частности, Ыайр или 1Ыа81и, с параметрами по умолчанию, установленными в таких программах. См. например, руководство Л115с1и.11 е! а1., 1. Мо1. Вю1. 215:403-410 (1990); А11ьсПи1 е! а1., М.1с1е1с Асббк Яе§. 25:3389-402 (1997), которое вводится в настоящее описание посредством ссылки.
Длина полипептидных последовательностей, сравниваемых для определения их гомологии, обычно составляет по меньшей мере примерно 16 аминокислотных остатков, обычно по меньшей мере примерно 20 остатков, чаще всего по меньшей мере примерно 24 остатка или примерно 28 остатков, а предпочтительно более, чем примерно 35 остатков. При поиске содержащихся в базе данных последовательностей, происходящих от большого числа различных организмов, предпочтительно, сравнивать аминокислотные последовательности.
Используемые здесь термины метка или меченный относятся к включению другой молекулы в антитело. В одном варианте изобретения, указанной меткой является детектируемый маркер, например радиоактивно меченная аминокислота, включение которой в полипептид биотинильной молекулы или ее присоединение к полипептиду биотинильной молекулы может быть детектировано по меченному авидину (например, стрептавидину, содержащему флуоресцентный маркер или ферментативную активность, которые могут быть детектированы оптическими или колориметрическими методами). В другом вариан
- 10 012872 те указанная метка или маркер могут также обладать терапевтическими свойствами, например они могут быть конъюгированы с лекарственным средством или токсином. При этом могут быть использованы различные методы мечения полипептидов и гликопротеинов, хорошо известные специалистам. Примерами меток, используемых для полипептидов, являются, но не ограничиваются ими, радиоизотопы или радио родамин, комплекс лантанид-фосфор), ферментные метки (например, пероксидаза хрена, βгалактозидаза, люцифераза, щелочная фосфатаза), хемилюминесцентные маркеры, биотинильные группы, предварительно определенные полипептидные эпитопы, распознаваемые вторичной репортерной молекулой (например, двухкомпонентные последовательности лейциновой молнии, сайты связывания для вторых антител, металлосвязывающие домены, эпитопные метки), магнитные вещества, такие как гадолиниевые хелатные комплексы; токсины, такие как коклюшный токсин; таксол; цитохалазин В; грамицидин Ό; этидийбромид; эметин; митомицин; этопозид; тенопозид; винкристин; винбластин; колхицин; доксорубицин; даунорубицин; дигидроксиантрациндион; митоксантрон; митрамицин; актиномицин Ό; 1-дегидротестостерон; глюкокортикоиды; прокаин; тетракаин; лидокаин; пропранолол; пуромицин и их аналоги или гомологи. В некоторых вариантах осуществления изобретения, метки присоединяют посредством спейсерных групп различной длины для уменьшения возможного стерического затруднения.
Используемый здесь термин агент означает химическое соединение, смесь химических соединений, биологическую макромолекулу или экстракт, полученный из биологических материалов. Используемый здесь термин фармацевтический агент или лекарственное средство означает химическое соединение или композицию, способные индуцировать нужный терапевтический эффект при их соответствующем введении пациенту. Другие используемые здесь химические термины имеют общепринятые значения, описанные в публикации ТНе МеСга\\-НШ П1сйоиагу о£ ΟΊιαηίοαΙ Тегпъ (Рагкег, 8. Ей., МеСга\\-НШ. 8ап Егаиаксо (1985)), которая вводится в настоящее описание посредством ссылки.
Используемый здесь термин противовоспалительное или иммуномодулирующее средство означает средства, которые обладают функциональным свойством, заключающимся в снижении степени воспаления, включая снижение тяжести воспалительного заболевания у индивидуума, включая человека. В различных вариантах изобретения, указанными воспалительными заболеваниями могут быть, но не ограничиваются ими, воспалительные заболевания желудочно-кишечного тракта, включая болезнь Крона, язвенный колит, дивертикулез, гастрит, заболевание печени, первичный билиарный склероз, склерозирующий холангит.
Воспалительными заболеваниями также являются, но не ограничиваются ими, заболевание брюшной полости (включая перитонит, аппендицит, заболевание желчных путей), острый поперечный миелит, аллергический дерматит (включая кожную аллергию, аллергическую экзему, кожную атопию, атопическую экзему, кожное воспаление, воспалительную экзему, атопический дерматит, воспалительный дерматит, блошиную кожу, милиарный дерматит, милиарную экзему, дерматит, вызываемый клещом домашней пыли), анкилозирующий спондилит (синдром Рейтера), астма, воспаление дыхательных путей, атеросклероз, артериосклероз, билиарная атрезия, воспаление мочевого пузыря, рак молочной железы, панкардит (включая васкулиты, ревматоидное поражения эпонихия, язвы на ногах, полимиозит, хронические сосудистые воспаления, перикардит, хроническую обструктивную болезнь легких), хронический панкреатит, периневрит, колиты (включая амебный колит, инфекционный колит, бактериальный колит, болезнь Крона, ишемический колит, язвенный колит, идиопатический проктоколит, воспалительное заболевание кишечника, псевдомембранозный колит), колагенозы (васкулиты) (ревматоидный артрит, СКВ, прогрессирующий системный склероз, смешанное заболевание соединенительной ткани, сахарный диабет), болезнь Крона (регионарный энтерит, грануломатозный илеит, илеоколит, воспаление пищеварительной системы), демиелинизирующее заболевание (включая миелит, рассеянный склероз, диссеминированный склероз, острый диссеминированный энцефаломиелит, перивенозную демиелинизацию, дефицит витамина В12, синдром Гийена-Барре, ассоциированный с ретровирусом рассеянный склероз (РС), дерматомиозит, дивертикулит, экссудативная диарея, гастрит, грануломатозный гепатит, грануломатозное воспаление, холецистит, инсулинзависимый сахарный диабет, воспалительное заболевание печени (фиброз печени, первичный билиарный цирроз печени, гепатит, склерозирующий холангит), воспаление легких (идиопатический фиброз легких, эозинофильная гранулема легких, легочный гистиоцитоз X, перибронхиолярное воспаление, острый бронхит), венерическая лимфогранулема, злокачественная меланома, болезни полости рта/зубов (включая гингивит, периодонтоз), мукозит, воспаление скелетномышечной системы (миозит), неалкогольный стеатогепатит (неалкогольное жировое перерождение печени), воспаление глаз и глазниц (включая увеит, неврит зрительного нерва, периферическое ревматоидное изъязвление, периферическое воспаление роговицы), остеоартрит, остеомиелит, фарингит, полиартрит, проктит, псориаз, лучевое поражение, саркоидоз, серповидно-клеточная невропатия, поверхностный тромбофлебит, синдром системной воспалительной реакции, тиреоидит, системная красная волчанка, реакция трансплантат против хозяина, острые поражения, вызванные ожогами, синдром Бехчета и синдром Сьегрена.
Термины пациент и индивидуум включают человека и других животных.
- 11 012872
Человеческие антитела против МАйСАМ и их характеризация
В одном из своих вариантов настоящее изобретение относится к анти-МАйСАМ антителам, содержащим человеческие последовательности СПЯ. В своем предпочтительном варианте настоящее изобретение относится к человеческим антителам против МАйСАМ. В некоторых вариантах изобретения человеческие антитела против МАйСАМ продуцируют путем иммунизации трансгенного животного, не являющегося человеком, например грызуна, геном которого содержит гены человеческого иммуноглобулина, так, чтобы у этого трансгенного животного продуцировались человеческие антитела. В некоторых своих вариантах, настоящее изобретение относится к анти-МАйСАМ антителу, которое не связывается с комплементом.
В предпочтительном варианте изобретения анти-МАйСАМ антителом является антитело 1.7.2,
1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-той, 6.34.2-той, 6.67.1той, 6.77.1-той или 7.26.4-той. В другом предпочтительном варианте изобретения анти-МАйСАМ антитело включает легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из 8ЕО ΙΌ N0: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 54, 58, 62, 66 или 68 (с сигнальной последовательностью или без нее), или вариабельную область любой из указанных аминокислотных последовательностей, либо один или несколько СЭЯ, происходящих от этих аминокислотных последовательностей. В другом предпочтительном варианте изобретения, анти-МАйСАМ антитело включает тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из 8Е0 ΙΌ N0: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42, 46, 52, 56, 60 или 64 (с сигнальной последовательностью или без нее), или аминокислотную последовательность указанной вариабельной области, либо одну или несколько СЭЯ, происходящих от этих аминокислотных последовательностей. Настоящее изобретение также включает человеческие анти-МАйСАМ антитела, включающие аминокислотную последовательность, простирающуюся от области СЭЯ1 до области СЭЯ3, включительно, и происходящую от любой одной из вышеупомянутых последовательностей. Настоящее изобретение также относится к анти-МАйСАМ антителу, включающему одну или несколько каркасных областей (РЯ) любой из вышеупомянутых последовательностей.
Настоящее изобретение также относится к анти-МАйСАМ антителу, включающему одну из вышеупомянутых аминокислотных последовательностей, в которые были внесены одна или несколько модификаций. В некоторых вариантах изобретения, цистеины антитела которые могут быть химически реактивными, заменены другими остатками, таким как, но не ограничивающимися ими, аланин или серин. В одном из вариантов изобретения присутствует замена не канонического цистеина. Такая замена может быть сделана в СЭЯ или в каркасной области вариабельного домена или в константной области антитела. В некоторых вариантах изобретения такой цистеин является каноническим.
В некоторых вариантах изобретения аминокислотную замену вносят для удаления возможных протеолитических сайтов, присутствующих в данном антителе. Такие сайты могут присутствовать в СЭЯ или в каркасной области вариабельного домена или в константной области данного антитела. Замена цистеиновых остатков и удаление протеолитических сайтов может снижать степень гетерогенности продукта антитела. В некоторых вариантах изобретения, пары аспарагин-глицин, которые могут образовывать сайты деамидирования, удаляют путем замены одного или обоих этих остатков. В некоторых вариантах изобретения, аминокислотную замену делают в целях добавления или удаления потенциальных сайтов гликозилирования в вариабельной области антитела согласно изобретению.
В некоторых вариантах изобретения отщепляют С-концевой лизин тяжелой цепи анти-МАйСАМ антитела согласно изобретению. В различных вариантах настоящего изобретения тяжелая и легкая цепи анти-МАйСАМ антител могут, но необязательно, включать сигнальную последовательность.
В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к двенадцати ингибирующим человеческим моноклональным антителам против МАйСАМ и к гибридомным клеточным линиям, продуцирующим эти антитела. В табл. 1 перечислены идентификаторы последовательностей (8Е0 ΙΌ N0:) нуклеиновых кислот, которые кодируют полноразмерную тяжелую и легкую цепи (включая сигнальную последовательность) и соответствующие полноразмерные выведенные аминокислотные последовательности.
- 12 012872
Таблица 1
Человеческие анти-МАсЗСАМ антитела
Идентификатор последовательностей (ЗЕО 10 N0:}
Моноклональное Полноразмерная последовательность
антитело
Тяжелая цепь Легкая цепь
ДНК Белок ДНК Белок
1.7.2 1 2 3 4
1.8.2 5 6 7 8
6.14.2 9 10 11 12
6.22.2 13 14 15 16
6.34.2 17 18 19 20
6.67.1 21 22 23 24
6.73.2 25 26 27 28
6.77.1 29 30 31 32
7.16.6 33 34 35 36
7.20.5 37 33 39 40
7.26.4 41 42 43 44
9.8.2 45 46 47 48
В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к модифицированному варианту некоторых идентифицированных выше человеческих моноклональных антител против МАбСАМ. В табл. 2 перечислены идентификаторы последовательностей ДНК и последовательностей белков модифицированных антител.
Таблица 2
Человеческие анти-МАсЮАМ антитела -
Идентификатор последовательностей (ЗЕО Ю ΝΟ;)
Модифицированное Полноразмерная последовательность
моноклональное
антитело
Тяжелая цепь Легкая цепь
ДНК Белок ДНК Белок
6.22.2-тос1 51 52 53 54
6.34.2-тоб 55 56 57 56
6.67.1-πιοά 59 60 61 62
6.77.1-тоб 63 64 65 66
7.26.4-тос1 41 42 67 68
Классы и подклассы анти-МАбСАМ антител
Указанное антитело может представлять собой молекулу 1дС. 1дМ. 1дЕ. 1дА или Ι§Ό. В предпочтительном варианте изобретения указанное антитело относится к классу 1дС и к подклассу Ι§61. 1дС2. 1дС3 или Ιβ&-|. В более предпочтительном варианте анти-МАбСАМ антитело принадлежит к подклассу 1дС2 или 1дС4. В другом предпочтительном варианте изобретения. анти-МАбСАМ антитело принадлежит к такому же классу и подклассу. как антитела 1.7.2. 1.8.2. 7.16.6. 7.20.5. 7.26.4. 6.22.2-тоб. 6.34.2-тоб.
6.67.1-тоб. 6.77.1-тоб или 7.26.4-тоб. которые принадлежат к подклассу 1дС2. или антитела 6.14.2.
6.22.2. 6.34.2. 6.67.1. 6.73.2. 6.77.1 или 9.8.2. которые принадлежат к подклассу 1дС4.
Класс и подкласс анти-МАбСАМ антител могут быть определены любым методом. известным специалистам. В общих чертах. класс и подкласс данного антитела могут быть определены с использованием антител. которые являются специфичными к антителу конкретного класса и подкласса. Такие антитела являются коммерчески доступными. Класс и подкласс антитела может быть определен с помощью ЕЫ8А или Вестерн-блот-анализа. а также другими методами. Альтернативно. класс и подкласс антитела может быть определен путем секвенирования всех или части константных доменов тяжелой и/или легкой цепей антител. сравнения их аминокислотных последовательностей с известными аминокислотными последовательностями различных классов и подклассов иммуноглобулинов. и определения класса и подкласса этих антител как класса. указывающего на наибольшую идентичность последовательностей.
- 13 012872
Видовая и молекулярная селективность
В другом аспекте настоящего изобретения анти-МАбСАМ антитело обладает как видовой, так и молекулярной селективностью. В одном из вариантов изобретения анти-МАбСАМ антитело связывается с МАбСАМ человека, собакоподобных обезьян или собак. В некоторых вариантах изобретения антиМАбСАМ антитело не связывается с МАбСАМ цепкохвостых обезьян, таких как мартышки. В соответствии с описанием настоящего изобретения можно определить видовую селективность анти-МАбСАМ антитела хорошо известными методами. Так, например, видовую селективность можно определить с помощью Вестерн-блот-анализа, ЕАС8, ЕЫ8А или иммуногистохимического анализа. В предпочтительном варианте изобретения видовую селективность можно определить с помощью иммуногистохимического анализа.
В некоторых вариантах изобретения, анти-МАбСАМ антитело которое специфически связывается с МАбСАМ, обладает селективностью к МАбСАМ, которая по меньшей мере в 10, предпочтительно по меньшей мере в 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 или 90 раз, а более предпочтительно в 100 раз превышает селективность к УСАМ, фибронектину или к любому другому антигену. В предпочтительном варианте изобретения анти-МАбСАМ антитело не обнаруживает какого-либо заметного связывания с УСАМ, фибронектином или с любым другим антигеном, не являющимся МАбСАМ. Селективность анти-МАбСАМ антитела по отношению к МАбСАМ может быть определена методами, хорошо известными специалистам, в соответствии с описанием настоящего изобретения. Так, например, такая селективность может быть определена с помощью Вестерн-блот-анализа, ЕАС8, ЕЬ18А или иммуногистохимического анализа.
Аффинность связывания анти-МАбСАМ антител с МАбСАМ
В другом аспекте настоящего изобретения анти-МАбСАМ антитела специфически связываются с МАбСАМ с высокой аффинностью. В одном из вариантов изобретения анти-МАбСАМ антитело специфически связывается с МАбСАМ с Кб 3 х 10-8 М или менее, как было определено с помощью поверхностного плазмонного резонанса, такого как В1Асоге. В более предпочтительных вариантах изобретения указанное антитело специфически связывается с МАбСАМ с Кб 1 х 10-8 М или менее, или 1 х 10-9 М, или менее. В еще более предпочтительном варианте изобретения указанное антитело специфически связывается с МАбСАМ с Кб 1 х 10-10 М или менее. В других предпочтительных вариантах изобретения указанное антитело специфически связывается с МАбСАМ с Кб, равным 2,66 х 10-10 М или менее, 2,35 х 10-11 М или менее или 9 х 10-12 М или менее. В другом предпочтительном варианте изобретения, указанное антитело специфически связывается с МАбСАМ с Кб 1 х 10-11 М или менее. В другом предпочтительном варианте изобретения указанное антитело специфически связывается с МАбСАМ, в основном, с таким же Кб, как и антитело, выбранное из 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5,
7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-тоб, 6.34.2-тоб, 6.67.1-тоб, 6.77.1-тоб или 7.26.4-тоб. Антитело в основном, с таким же Кб, как и эталонное антитело, имеет Кб, которое составляет ±100 пМ, предпочтительно ±50 пМ, более предпочтительно ±20 пМ, еще более предпочтительно ±10 пМ, ±5 пМ или ±2 пМ по сравнению с Кб эталонного антитела в том же самом эксперименте. В другом предпочтительном варианте изобретения, указанное антитело связывается с МАбСАМ, в основном, с таким же Кб, как и антитело, которое содержит один или несколько вариабельных доменов или одну или несколько областей СБК. антитела, выбранного из 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2тоб, 6.34.2-тоб, 6.67.1-тоб, 6.77.1-тоб или 7.2 6.4-тоб. В еще одном предпочтительном варианте изобретения, указанное антитело связывается с МАбСАМ, в основном, с таким же Кб, как и антитело, которое содержит одну из аминокислотных последовательностей, выбранных из 8ЕЦ ΙΌ N0: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 52, 54, 56, 58, 62, 64, 66 или 68 (с сигнальной последовательностью или без нее) или ее вариабельный домен. В другом предпочтительном варианте антитело связывается с МАбСАМ, в основном, с таким же Кб, как и антитело, которое содержит одну или несколько областей СЭР антитела, содержащего аминокислотную последовательность, выбранную из 8ЕС ΙΌ N0: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 52, 54, 56, 58, 62, 64, 66 или 68.
Аффинность связывания анти-МАбСАМ антитела с МАбСАМ может быть определена любым методом, известным специалистам. В одном из вариантов изобретения, аффинность связывания может быть определена с помощью конкурентных анализов ЕЬ18А, РИА или поверхностного плазмонного резонанса, такого как В1Асоге. В более предпочтительном варианте изобретения, аффинность связывания измеряют с помощью поверхностного плазмонного резонанса. В еще более предпочтительном варианте изобретения, аффинность связывания и скорость диссоциации измеряют с применением В1Асоге. Пример определения аффинности связывания описан ниже в примере ΙΙ.
Время полужизни анти-МАбСАМ антител
В соответствии с другим аспектом изобретения анти-МАбСАМ антитело имеет время полужизни ίη νίΙΐΌ или ίη у1уо по меньшей мере один день. В предпочтительном варианте изобретения указанное антитело или его часть имеет время полужизни по меньшей мере три дня. В более предпочтительном варианте изобретения указанное антитело или его часть имеет время полужизни четыре дня или более. В другом варианте изобретения указанное антитело или его часть имеет время полужизни восемь дней или
- 14 012872 более. В другом варианте изобретения, указанное антитело или его антигенсвязывающая часть дериватизированы или модифицированы так, что они имеют более длительное время полужизни, как обсуждается ниже. В другом предпочтительном варианте изобретения антитело может содержать точковые мутации для увеличения его времени полужизни в сыворотке, описанные в заявке \¥0 00/09560, опубликованной 24 февраля 2000.
Время полужизни антитела может быть измерено любыми методами, известными среднему специалисту в данной области. Так, например, время полужизни антитела может быть измерено с помощью Вестерн-блот-анализа, ЕЫ8А или РИА в течение соответствующего периода времени. Время полужизни антитела может быть измерено у любого подходящего животного, такого как примат, например собакоподобная обезьяна или человек.
Идентификация эпитопов МАйСАМ, распознаваемых анти-МАйСАМ антителом
Настоящее изобретение также относится к человеческому моноклональному анти-МАйСАМ антителу, которое связывается с таким же антигеном или эпитопом, как и описанное здесь человеческое антиМАйСАМ антитело. Кроме того, настоящее изобретение относится к человеческому анти-МАйСАМ антителу, которое конкурирует или перекрестно конкурирует за связывание с человеческим антиМАйСАМ антителом. В предпочтительном варианте изобретения, человеческим анти-МАйСАМ антителом является 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-той,
6.34.2-той, 6.67.1-той, 6.77.1-той или 7.26.4-той. В другом предпочтительном варианте изобретения, человеческое анти-МАйСАМ антитело содержит один или несколько вариабельных доменов или одну или несколько областей СИВ антитела, выбранного из 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-той, 6.34.2-той, 6.67.1-той, 6.77.1-той или 7.26.4-той. В еще одном предпочтительном варианте изобретения человеческое анти-МАйСАМ антитело содержит одну из аминокислотных последовательностей, выбранных из 8ЕО ΙΌ N0: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 52, 54, 56, 58, 62, 64, 66 или 68 (с сигнальной последовательностью или без нее), или ее вариабельный домен. В другом предпочтительном варианте изобретения человеческое анти-МАйСАМ антитело включает одну или несколько областей СИВ антитела, содержащего одну из аминокислотных последовательностей, выбранную из 8ЕО ΙΌ N0: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 52, 54, 56, 58, 62, 64, 66 или 68. В особенно предпочтительном варианте изобретения анти-МАйСАМ антителом является другое человеческое антитело.
Для того чтобы определить, может ли анти-МАйСАМ антитело связываться с таким же антигеном, как другое анти-МАйСАМ антитело, применяются различные методы, известные специалистам. Так, например, может быть использовано известное анти-МАйСАМ антитело для захвата антигена, элюирования антигена из анти-МАйСАМ антитела и последующего определения связывания тестируемого антитела с элюированным антигеном. Можно определить, конкурирует ли данное антитело с антиМАйСАМ антителом за связывание с МАйСАМ в условиях насыщения, а затем определить способность тестируемого антитела связываться с МАйСАМ. Если тестируемое антитело способно связываться с МАйСАМ одновременно с анти-МАйСАМ антителом, то тестируемое антитело связывается с другим эпитопом, чем тот эпитоп, с которым связывается анти-МАйСАМ антитело. Однако, если тестируемое антитело неспособно связываться с МАйСАМ одновременно с анти-МАйСАМ антителом, то тестируемое антитело конкурирует с человеческим анти-МАйСАМ антителом. Этот эксперимент может быть проведен с помощью ЕЫ8А, поверхностного плазмонного резонанса, или, предпочтительно, В1Асоге. Для того, чтобы определить, имеет ли место перекрестное конкурирование анти-МАйСАМ антитела с другим анти-МАйСАМ антителом, может быть использован вышеописанный конкурентный метод, осуществляемый в двух направлениях, то есть метод, в котором определяют, блокирует ли известное антитело тестируемое антитело и наоборот.
Гены, кодирующие легкую и тяжелую цепи
Настоящее изобретение также относится к анти-МАйСАМ антителу, содержащему вариабельную область легкой цепи, кодируемую геном каппа-цепи человеческого антитела. В предпочтительном варианте изобретения, вариабельная область легкой цепи кодируется генами семейства Ук А2, А3, А26, В3, О12 или О18. В различных вариантах изобретения, легкая цепь содержит не более, чем одиннадцать, не более, чем шесть или не более, чем три аминокислотных замены по сравнению с последовательностью генов Ук А2, А3, А26, В3, 012 или 018 человеческой зародышевой линии. В предпочтительном варианте изобретения, такими аминокислотными заменами являются консервативные замены.
Последовательности 8Е0 ΙΌ N0: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44 и 48 представляют собой аминокислотные последовательности полноразмерных легких каппа-цепей двенадцати анти-МАйСАМ антител 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4 и 9.8.2. На фиг. 1К-1Т проиллюстрировано сравнение путем выравнивания аминокислотных последовательностей вариабельных доменов легкой цепи двенадцати анти-МАйСАМ антител с последовательностями зародышевой линии, от которой они происходят. На фиг. 2А проиллюстрировано сравнение путем выравнивания аминокислотных последовательностей вариабельных доменов легких каппа-цепей двенадцати анти-МАйСАМ антител друг с другом. В соответствии с описанием настоящего изобретения любой средний специалист в данной области может определить различия между последовательностями антител зародышевой линии и
- 15 012872 последовательностями других анти-МАбСАМ антител.
Последовательности 8ЕО ΙΌ N0: 54, 58, 62, 66 или 68 представляют собой аминокислотные последовательности полноразмерных легких каппа-цепей пяти дополнительных анти-МАбСАМ антител:
6.22.2-тоб, 6.34.2-тоб, 6.67.1-тоб, 6.77.1-тоб или 7.26.4-тоб, модифицированных путем внесения аминокислотных замен в родительские анти-МАбСАМ антитела 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.77.1 или 7.26.4, соответственно.
В предпочтительном варианте изобретения область УЪ анти-МАбСАМ антител, по сравнению с аминокислотной последовательностью зародышевой линии, содержит такие же мутации, как любая одна или несколько областей УЪ антител 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5,
7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-тоб, 6.34.2-тоб, 6.67.1-тоб, 6.77.1-тоб или 7.2 6.4-тоб. Настоящее изобретение включает анти-МАбСАМ антитело, в котором присутствуют области, кодируемые такими же человеческими генами Ук и !к, как в репрезентативном антителе. В некоторых вариантах изобретения данное антитело по сравнению с антителом зародышевой линии содержит такие же одну или несколько мутаций, как и репрезентативные антитела. В некоторых вариантах изобретения данное антитело содержит различные замены в таких же одном или нескольких положениях, как в репрезентативных антителах. Так, например, УЪ анти-МАбСАМ антител может содержать одно или несколько аминокислотных замен, которые являются аналогичными заменам, присутствующим в антителе 7.16.6, и другую аминокислотную замену, которая является аналогичной замене в антителе 7.26.4. Таким образом, можно смешивать и подбирать по соответствию различные признаки связывающего антитела в целях, например, изменения аффинности данного антитела против МАбСАМ или скорости диссоциации этого антитела от антигена. В другом варианте изобретения, эти мутации присутствуют в таком же положении, как и мутации, имеющиеся в любой одной или нескольких областях УЪ антител 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1,
6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-тоб, 6.34.2-тоб, 6.67.1-тоб, 6.77.1-тоб или 7.2 6.4-тоб, но, при этом, консервативные аминокислотные замены сделаны в других аминокислотных положениях. Так, например, если аминокислотной заменой, по сравнению с зародышевой линией, в одном из антител
1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-тоб, 6.34.2-тоб,
6.67.1- тоб, 6.77.1-тоб или 7.26.4-тоб, является глутамин, то консервативной заменой может быть аспартат. Аналогичным образом, если аминокислотной заменой является серин, то консервативной заменой может быть треонин.
В другом предпочтительном варианте изобретения легкая цепь содержит аминокислотную последовательность, аналогичную аминокислотной последовательности области УЪ 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2,
6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-тоб, 6.34.2-тоб, 6.67.1-тоб, 6.77.1-тоб или
7.26.4-тоб. В другом особенно предпочтительном варианте изобретения легкая цепь содержит аминокислотные I последовательности, аналогичные аминокислотным последовательностям СПК-областей легкой цепи антитела 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2,
6.22.2- тоб, 6.34.2-тоб, 6.67.1-тоб, 6.77.1-тоб или 7.26.4-тоб. В другом предпочтительном варианте изобретения легкая цепь содержит аминокислотную последовательность по меньшей мере с одной СЪКобластью легкой цепи антитела 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5,
7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-тоб, 6.34.2-тоб, 6.67.1-тоб, 6.77.1-тоб или 7.26.4-тоб. В другом предпочтительном варианте изобретения легкая цепь содержит аминокислотную последовательность с СОК-областями, происходящими от различных легких цепей, в которых Ук и 1к кодируются одними и теми же генами. В более предпочтительном варианте изобретения СОК из различных легких цепей были получены от антител 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-тоб, 6.34.2тоб, 6.67.1-тоб, 6.77.1-тоб или 7.26.4-тоб. В другом предпочтительном варианте изобретения легкая цепь содержит аминокислотную последовательность, выбранную из 8Е0 ΙΌ N0: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 54, 58, 62, 64, 66 или 68 с сигнальной последовательностью или без нее. В другом варианте изобретения легкая цепь содержит аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью, выбранной из 8Е0 ΙΌ N0: 3, 7, 11, 15, 19, 23, 27, 31, 35, 39, 43, 47, 53, 57, 61, 65 или 67 (с сигнальной последовательностью или без нее), или нуклеотидной последовательностью, кодирующей аминокислотную последовательность, имеющую 1-11 аминокислотных инсерций, делеций или замен. При этом предпочтительно, чтобы аминокислотные замены были консервативными. В другом варианте изобретения антитело или его часть содержит легкую цепь лямбда.
Настоящее изобретение также относится к анти-МАбСАМ антителу или его части, содержащим человеческую генную последовательность УН или последовательность, происходящую от человеческого гена УН. В одном из вариантов изобретения аминокислотная последовательность тяжелой цепи происходит от семейства человеческих генов УН 1-18, 3-15, 3-21, 3-23, 3-30, 3-33 или 4-4. В различных вариантах изобретения тяжелая цепь содержит не более, чем пятнадцать, не более, чем шесть или не более, чем три аминокислотных замены по сравнению с последовательностью генов УН 1-18, 3-15, 3-21, 3-23, 3-30, 3-33 или 4-4 человеческой зародышевой линии.
Последовательности 8Е0 ΙΌ N0: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42 и 46 представляют собой аминокислотные последовательности полноразмерных тяжелых цепей двенадцати анти-МАбСАМ антител. На фиг. 1А-П проиллюстрировано сравнение путем выравнивания аминокислотных последовательно
- 16 012872 стей вариабельных областей тяжелой цепи двенадцати анти-МАйСАМ антител с последовательностями зародышевой линии, от которой они происходят. На фиг. 2В проиллюстрировано сравнение путем выравнивания аминокислотных последовательностей вариабельных доменов тяжелой цепи двенадцати анти-МАйСАМ антител друг с другом. Исходя из настоящего описания и исходя из нуклеотидных последовательностей согласно изобретению, любой средний специалист в данной области может определить кодируемую аминокислотную последовательность для тяжелых цепей двенадцати анти-МАйСАМ антител и тяжелых цепей зародышевой линии, а также может определить различия между последовательностями антител зародышевой линии и последовательностями других антител. 8Е0 ΙΌ N0: 52, 56, 60 и 64 представляют собой аминокислотные последовательности полноразмерных тяжелых цепей антиМАйСАМ антител: 6.22.2-той, 6.34.2-той и 6.77.1-той, модифицированных путем внесения аминокислотных замен в родительские анти-МАйСАМ антитела 6.22.2, 6.34.2 и 6.67.1, соответственно. Одно дополнительно модифицированное анти-МАйСАМ антитело, 7.26.4-той, имеет аминокислотную последовательность полноразмерной тяжелой цепи, которая представляет собой 8ЕО ΙΌ N0:42.
В предпочтительном варианте изобретения область УН анти-МАйСАМ антител, по сравнению с аминокислотной последовательностью зародышевой линии, содержит такие же мутации, как любая одна или несколько УН антител 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4,
9.8.2, 6.22.2-той, 6.34.2-той, 6.67.1-той, 6.77.1-той или 7.26.4-той. Как обсуждается выше, указанное антитело, по сравнению с антителом зародышевой линии, содержит такие же одну или несколько мутаций, как и репрезентативные антитела. В некоторых вариантах изобретения данное антитело содержит различные замены в таких же одном или нескольких положениях, как в репрезентативных антителах. Так, например, УН анти-МАйСАМ антител может содержать одно или несколько аминокислотных замен, которые являются аналогичными заменам, присутствующим в антителе 7.16.6, и другую аминокислотную замену, которая является аналогичной замене в антителе 7.26.4. Таким образом, можно смешивать и подбирать по соответствию различные признаки связывающего антитела в целях, например, изменения аффинности данного антитела против МАйСАМ или его скорости диссоциации от антигена. В другом варианте изобретения аминокислотная замена по сравнению с зародышевой линией присутствует в таком же положении, как и замена, имеющаяся в любой одной или нескольких областей УН сравниваемого антитела 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2той, 6.34.2-той, 6.67.1-той, 6.77.1-той или 7.26.4-той, но при этом положение, в котором сделана замена другим остатком, является консервативной заменой по сравнению с со сравниваемым антителом.
В другом предпочтительном варианте изобретения тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность, аналогичную аминокислотной последовательности УН антитела 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2,
6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-той, 6.34.2-той, 6.67.1-той, 6.77.1-той или
7.26.4-той. В другом особенно предпочтительном варианте изобретения тяжелая цепь содержит аминокислотные последовательности, аналогичные аминокислотным последовательностям СИЯ-областей тяжелой цепи антитела 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2,
6.22.2-той, 6.34.2-той, 6.67.1-той, 6.77.1-той или 7.26.4-той. В другом предпочтительном варианте тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность по меньшей мере из одной СИЯ-области тяжелой цепи антитела 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2,
6.22.2-той, 6.34.2-той, 6.67.1-той, 6.77.1-той или 7.26.4-той. В другом предпочтительном варианте изобретения тяжелая цепь содержит аминокислотные последовательности с СИЯ-областями, происходящими от различных тяжелых цепей. В более предпочтительном варианте изобретения СИЯ из различных тяжелых цепей были получены от антител 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-той, 6.34.2-той, 6.67.1-той, 6.77.1-той или 7.26.4-той. В другом предпочтительном варианте изобретения тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность, выбранную из 8Е0 ΙΌ N0: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42, 46, 52, 56, 60 или 64 с сигнальной последовательностью или без нее. В другом варианте изобретения тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью, выбранной из 8Е0 ΙΌ N0: 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 29, 33, 37, 41, 45, 51, 55, 59 или 63, или нуклеотидной последовательностью, кодирующей аминокислотную последовательность, имеющую 1-15 аминокислотных инсерций, делеций или замен. В другом варианте изобретения указанной заменой является консервативная аминокислотная замена.
Способы получения антител и антителопродуцирующих клеточных линий Иммунизация
В одном из вариантов изобретения человеческие антитела продуцируют путем иммунизации антигеном МАйСАМ животного, не являющегося человеком и содержащего в своем геноме некоторые или все локусы тяжелой и легкой цепей человеческого иммуноглобулина, антигеном МАйСАМ. В предпочтительном варианте изобретения указанным животным, не являющимся человеком, является животное XЕN0М0υ8Е™, которое представляет собой сконструированный мышиный штамм, содержащий крупные фрагменты локусов человеческого иммуноглобулина, и является дефицитным по продуцированию мышиного антитела. См., например, Отееи с1 а1., №11игс СспсЕех 7:13-21 (1994) и патенты США 5916771, 5939598, 5985615, 5998209, 6075181, 6091001, 6114598 и 6130364. См. также \\'0 91/10741, \\'0 94/02602, \\'0 96/34096, \\'0 96/33735, \\'0 98/16654, \\'0 98/24893, \\'0 98/50433, \\'0 99/45031, \\'0 99/53049, \\'0
- 17 012872
00/09560 и АО 00/037504. У животных XЕNΟМΟυ8Е™ продуцируется репертуар полноразмерных человеческих антител, подобный тому, который обычно продуцируется у взрослого человека, и генерируются антигенспецифические человеческие тАЬ§. Второе поколение животных XЕNОМОυ8Е™ содержат примерно 80% генов V, кодирующих репертуар человеческих антител, благодаря введению этим мышам фрагментов дрожжевой искусственной хромосомы (УАС), имеющих мегаоснования определенной длины и конфигурацию зародышевой линии, и находящихся в локусах тяжелой цепи и легкой каппа-цепи человеческих антител. В другом варианте изобретения мыши XЕNОМОυ8Е™, кроме того, содержат почти весь человеческий локус тяжелой цепи и легкой λ-цепи. См. публикации Мейбе/ е1 а1., №11иге Сепебсх 16:146-156 (1997), Огееп & 1акоЬоуЙ8, 1. Ехр. Меб. 188:483-495 (1998), которые вводятся в настоящее описание посредством ссылки.
Настоящее изобретение также относится к способу получения анти-МАбСАМ антител от животных, не являющихся человеком и не являющихся мышью, путем иммунизации трансгенных животных, не являющихся человеком, которые имеют локус человеческого иммуноглобулина. Такие животные могут быть созданы методами, непосредственно описанными выше. Методы, описанные в этих документах, могут быть модифицированы как описано в патенте США 5994619 (патент 619), который вводится в настоящее описание посредством ссылки. В патенте 619 описаны методы продуцирования новых клеток и клеточных линий культуральной внутренней клеточной массы (С1СМ), полученных от свиней и коров, и трансгенных клеток С1СМ, в которые была введена гетерологичная ДНК. Трансгенные клетки С1СМ могут быть использованы для продуцирования клонированных трансгенных эмбрионов, плода и потомства. В патенте 619 также описаны методы создания трансгенных животных, которые способны передавать потомству гетерологичную ДНК. В предпочтительных вариантах изобретения животными, не являющимися человеком, являются крысы, овцы, свиньи, козы, крупный рогатый скот или лошади.
В другом варианте изобретения животными, не являющимися человеком и содержащими локус человеческого иммуноглобулина, являются животные, которые имеют минилокусы человеческих иммуноглобулинов. В методе, основанном на минилокусах, экзогенный локус 1д имитируется посредством включения отдельных генов локуса 1д. Таким образом, конструкция для введения животному образуется из одного или нескольких генов νΗ, одного или нескольких генов ΌΗ, одного или нескольких генов ДН константного домена μ и второго константного домена (предпочтительно, константного домена гаммацепи). Этот метод описан, пйег аба, в патентах США 5545807, 5545806, 5625126, 5633425, 5661016, 5770429, 5789650, 5814318, 5591669, 5612205, 5721367, 5789215 и 5643763, которые вводятся в настоящее описание посредством ссылки.
Преимуществом метода с использованием минилокуса является быстрота, с которой конструкции, включающие части локуса ДО. могут генерироваться и встраиваться в геном животного. Однако возможным недостатком метода с использованием минилокуса, является то, что разнообразия иммуноглобулинов может оказаться недостаточным для поддержания полного формирования В-клеток, так, чтобы можно было снижать уровень продуцирования антител.
Для продуцирования анти-МАбСАМ антитела животное, не являющееся человеком и содержащее несколько или все локусы человеческого иммуноглобулина, иммунизируют антигеном МАбСАМ, а затем у этого животного выделяют антитело или антитело-продуцирующие клетки. Антиген МАбСАМ может представлять собой выделенный и/или очищенный МАбСАМ, а предпочтительным антигеном является человеческий МАбСАМ. В другом варианте изобретения антигеном МАбСАМ является фрагмент МАбСАМ, а предпочтительно внеклеточный домен МАбСАМ. В другом варианте изобретения антигеном МАбСАМ является фрагмент, содержащий по меньшей мере один эпитоп МАбСАМ. В другом варианте изобретения, антигеном МАбСАМ является клетка, которая экспрессирует МАбСАМ на своей поверхности, а предпочтительно, клетка, которая сверхэкспрессирует МАбСАМ на своей поверхности.
Иммунизация животных может быть проведена любым методом, известным специалистам. См., например, Наг1оте & Ьапе, АпбЬоб1е8: А ЬаЬога!огу Мапиа1, Νο\ν Уогк: Со1б 8рппд НагЬог Рге§8, 1990. Методы иммунизации животных, не являющихся человеком, таких как крысы, овцы, козы, свиньи, крупный рогатый скот и лошади, хорошо известны специалистам. См., например, Наг1о\у & Ьапе, и патент США № 5994619. В предпочтительном варианте изобретения антиген МАбСАМ вводят вместе с адъювантом для стимуляции иммунного ответа. Такими адъювантами являются полный или неполный адъювант Фрейнда, ШВ1 (мурамилдипептиды) или 18СОМ (иммуностимулирующие комплексы). Такие адъюванты могут защищать полипептид от быстрого диспергирования путем его изолирования в локальном участке, либо они могут содержать вещества, стимулирующие секрецию факторов, которые являются хемотаксическими для макрофагов и других компонентов иммунной системы, из организма-хозяина. При введении полипептида схема иммунизации предпочтительно включает два или более введения данного полипептида за период времени в несколько недель.
В примере I проиллюстрирован протокол иммунизации животного XЕNОМОυ8Е™ полноразмерным человеческим МАбСАМ в забуференом фосфатом физиологическом растворе.
Продуцирование антител и антителопродуцирующих клеточных линий
После иммунизации животного антигеном МАбСАМ у этого животного могут продуцироваться ан
- 18 012872 титела и/или антителопродуцирующие клетки. Сыворотку, содержащую анти-МАбСАМ антитело, получают от животного путем взятия у него крови или после его умерщвления. Эта сыворотка может быть использована в том виде, в каком она была получена от животного, или из этой сыворотки может быть получена иммуноглобулиновая фракция, либо из нее могут быть выделены анти-МАбСАМ антитела.
В другом варианте изобретения антителопродуцирующие иммортализованные клеточные линии получают от иммунизованного животного. После иммунизации животное умерщвляют и В-клетки подвергают иммортализации хорошо известными методами. Методы иммортализации клеток включают, но не ограничиваются ими, трансфекцию клеток онкогенами, инфицирование клеток онкогенным вирусом, культивирование в условиях отбора на иммортализованные клетки, обработку этих клеток канцерогенными или мутирующими соединениями, слияние этих клеток с иммортализованной клеткой, например, с миеломной клеткой, и инактивацию клеток геном-супрессором опухоли. См. выше, например, Наг1оте & Ьапе. В тех вариантах, в которых используются миеломные клетки, эти миеломные клетки не секретируют полипептиды иммуноглобулина (не-секреторные клеточные линии). После иммортализации и отбора с использованием антибиотиков иммортализованные клетки или супернатанты их культур скринируют с использованием МАбСАМ или его части, либо МАбСАМ-экспрессирующей клетки. В предпочтительном варианте изобретения предварительный скрининг осуществляют с помощью иммуноферментного анализа (ЕЫ8А) или радиоиммуноанализа (РИА), а предпочтительно ЕЫ8А. Пример ЕБ18Аскрининга приводится в заявке \¥О 00/37504, которая вводится в настоящее описание посредством ссылки.
В другом варианте изобретения антителопродуцирующие клетки могут быть получены от человека, который страдает аутоиммунным расстройством, или у которого экспрессируются анти-МАбСАМ антитела. Клетки, экспрессирующие анти-МАбСАМ антитела, могут быть выделены путем забора лейкоцитов и их обработки посредством клеточного сортинга с активацией флуоресценции (РАС8) или путем пэннинга на планшетах, сенсибилизированных антигеном МАбСАМ или его частью. Эти клетки могут быть подвергнуты слиянию с человеческими не-секреторными миеломными клетками с получением человеческих гибридом, экспрессирующих человеческие анти-МАбСАМ антитела. Вообще говоря, этот вариант является менее предпочтительным, поскольку есть вероятность, что анти-МАбСАМ антитела будут обладать низкой аффинностью по отношению к МАбСАМ.
Клетки, продуцирующие анти-МАбСАМ антитело, например гибридомы, отбирают, клонируют, а затем скринируют на нужные свойства, включая устойчивый рост, продуцирование антител на высоком уровне и другие желаемые свойства, как подробно обсуждается ниже. Гибридомы могут быть культивированы и размножены ίη у1уо у сингенных животных, у животных с отсутствием иммунной системы, например, у бестимусных (голых) мышей или в клеточной культуре ίη У1!го. Методы отбора, клонирования и размножения гибридом хорошо известны среднему специалисту в данной области.
Предпочтительным иммунизированным животным, не являющимся человеком, является животное, у которого экспрессируются гены человеческих иммуноглобулинов; и В-клетки селезенки этого животного подвергают слиянию с миеломной клеточной линией, взятой у животного того же самого вида, не являющегося человеком. Более предпочтительным иммунизированным животным является животное ХЕЫОМОИЗЕ™, а миеломной клеточной линией является несекреторная мышиная миелома, такая как миеломная клеточная линия Р3-Х63-АС8-653 (АТСС). См., например, пример I.
Таким образом, в одном из своих вариантов, настоящее изобретение относится к способам получения клеточной линии, которая продуцирует человеческое моноклональное антитело или его фрагмент против МАбСАМ, где указанные способы включают: (а) иммунизацию описанного здесь трансгенного животного, не являющегося человеком, антигеном МАбСАМ, частью МАбСАМ или клеткой или тканью, экспрессирующей МАбСАМ; (Ь) стимуляцию вырабатывания у данного трансгенного животного иммунного ответа против МАбСАМ; (с) выделение антитело-продуцирующих клеток из трансгенного животного; (б) иммортализацию этих антитело-продуцирующих клеток; (е) создание отдельных моноклональных популяций иммортализованных антитело-продуцирующих клеток; и (ί) скрининг иммортализованных антитело-продуцирующих клеток или супернатантов их культур для идентификации антитела против МАбСАМ.
В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к гибридомам, которые продуцируют человеческие анти-МАбСАМ антитела. В предпочтительном варианте изобретения указанными гибридомами являются мышиные гибридомы, описанные выше. В другом варианте изобретения указанные гибридомы продуцируются животными, не являющимися человеком и мышью, такими как крысы, овцы, свиньи, козы, крупный рогатый скот или лошади. В другом варианте осуществления изобретения указанными гибридомами являются человеческие гибридомы, в которых человеческие несекреторные миеломные клетки слиты с человеческими клетками, экспрессирующими анти-МАбСАМ антитело.
- 19 012872
Нуклеиновые кислоты, векторы, клетки-хозяева и рекомбинантные методы получения антител Нуклеиновые кислоты
Настоящее изобретение также относится к молекулам нуклеиновых кислот, кодирующих антиМАйСАМ антитела. В одном из вариантов изобретения, указанная молекула нуклеиновой кислоты кодирует тяжелую и/или легкую цепи иммуноглобулина против МАйСАМ. В предпочтительном варианте изобретения одна молекула нуклеиновой кислоты кодирует тяжелую цепь иммуноглобулина против МАйСАМ, а другая молекула нуклеиновой кислоты кодирует легкую цепь иммуноглобулина против МАйСАМ. В более предпочтительном варианте изобретения кодируемым иммуноглобулином является человеческий иммуноглобулин, предпочтительно человеческий 1дС. Указанная кодируемая легкая цепь может быть λ-цепью или к-цепью, а предпочтительно к-цепью.
В предпочтительном варианте изобретения молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая вариабельную область легкой цепи, содержит последовательность генов человеческой Ук А2, А3, А26, В3, 012 или 018 зародышевой линии или вариант указанной последовательности. В предпочтительном варианте изобретения молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая легкую цепь, содержит последовательность, происходящую от человеческих генов 1к1, 1к2, 1к3, 1к4 или 1к5. В предпочтительном варианте изобретения молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая легкую цепь, кодирует не более, чем одиннадцать, а предпочтительно не более, чем шесть, а еще более предпочтительно, не более, чем три аминокислотных замены по сравнению с аминокислотной последовательностью, кодируемой генами Ук А2, А3, А26, В3, 012 или 018 зародышевой линии. В более предпочтительном варианте изобретения указанной нуклеиновой кислотой, кодирующей легкую цепь, является последовательность зародышевой линии.
Настоящее изобретение относится к молекуле нуклеиновой кислоты, которая кодирует вариабельную область легкой цепи (УЪ), содержащую от одной до одиннадцати аминокислотных замен по сравнению с последовательностью зародышевой линии, где эти аминокислотные замены идентичны, по сравнению с зародышевой линией, аминокислотным заменам, присутствующим в последовательности УЪ одного из антител 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2той, 6.34.2-той, 6.67.1-той, 6.77.1-той или 7.26.4-той. Настоящее изобретение также относится к молекуле нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи антител 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2,
6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-той, 6.34.2-той, 6.67.1-той, 6.77.1-той или 7.26.4той. Настоящее изобретение также относится к молекуле нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность одной или нескольких областей СОК любой одной из легких цепей антител 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2,
6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-той, 6.34.2-той, 6.67.1-той, 6.77.1-той или 7.26.4-той. В предпочтительном варианте изобретения указанная молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность всех областей СОК любой одной из легких цепей антител 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4,
9.8.2, 6.22.2-той, 6.34.2-той, 6.67.1-той, 6.77.1-той или 7.26.4-той. В другом варианте изобретения молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность одной из 8Е0 ΙΌ N0: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 54, 58, 62, 66 или 68 или содержит нуклеотидную последовательность одной из 8Е0 ΙΌ N0: 3, 7, 11, 15, 19, 23, 27, 31, 35, 39, 43, 47, 53, 57, 61, 65 или 67. В другом предпочтительном варианте изобретения молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность одной или нескольких СОК любой из 8Е0 ΙΌ N0: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 54, 58, 62, 66 или 68, или содержит нуклеотидную последовательность одной или нескольких СОК любой из 8Е0 ΙΌ N0: 3, 7, 11, 15, 19, 23, 27, 31, 35, 39, 43, 47, 53, 57, 61, 65 или 67. В более предпочтительном варианте изобретения молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность всех областей СОК любой из 8Е0 ΙΌ N0: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 54, 58, 62, 66 или 68 или содержит нуклеотидную последовательность всех областей СОК любой из 8ЕО ΙΌ N0: 3, 7, 11, 15, 19, 23, 27, 31, 35, 39, 43, 47, 53, 57, 61, 65 или 67.
Настоящее изобретение также относится к молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей аминокислотную последовательность УЪ, содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична последовательности УЪ, описанной выше, а в частности, УЪ, содержащей аминокислотную последовательность одной из 8Е0 ΙΌ N0: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 54, 58, 62, 66 или 68. Настоящее изобретение также относится к нуклеотидной последовательности, которая по меньшей мере на 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична нуклеотидной последовательности одной из 8Е0 ΙΌ N0: 3, 7, 11, 15, 19, 23, 27, 31, 35, 39, 43, 47, 53, 57, 61, 65 или 67.
В другом своем варианте настоящее изобретение относится к молекуле нуклеиновой кислоты, которая гибридизуется в условиях высокой жесткости с молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей УЪ, как описано выше, а в частности, с молекулой нуклеиновой кислоты, которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 54, 58, 62, 66 или 68. Настоящее изобретение также относится к молекуле нуклеино
- 20 012872 вой кислоты, которая гибридизуется в условиях высокой жесткости с молекулой нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность одной из 8Е0 ГО N0: 3, 7, 11, 15, 19, 23, 27, 31, 35, 39, 43, 47, 53, 57, 61, 65 или 67.
Настоящее изобретение также относится к молекуле нуклеиновой кислоты, в которой вариабельную область тяжелой цепи (УН) кодируют гены человеческой УН 1-18, 3-15, 3-21, 3-23, 3-30, 3-33 или 44. В некоторых вариантах изобретения молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая УН, также содержит семейство генов Ш4 или ДН6. В некоторых вариантах изобретения, молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая УН, также содержит гены человеческой Ш4Ь или Ш6Ь. В другом варианте изобретения молекула нуклеиновой кислоты содержит последовательность, происходящую от человеческого гена Ό 3-10, 4-23, 5-5, 6-6 или 9-19. В еще более предпочтительном варианте изобретения молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая УН, содержит не более, чем пятнадцать, не более, чем шесть или не более, чем три аминокислотных замены по сравнению с последовательностью генов УН 1-18, 3-15, 3-21, 3-23, 3-30, 3-33 или 4-4 человеческой зародышевой линии. В особенно предпочтительном варианте изобретения молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая УН, содержит по меньшей мере одну аминокислотную замену, по сравнению с последовательностью зародышевой линии, где эта аминокислотная замена идентична аминокислотной замене зародышевой линии, присутствующей в последовательности тяжелой цепи одного из антител 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2,
6.22.2-тоб, 6.34.2-тоб, 6.67.1-тоб, 6.77.1-тоб или 7.26.4-тоб. В еще более предпочтительном варианте изобретения УН содержит не более чем пятнадцать аминокислотных замен, по сравнению с последовательностью зародышевой линии, где указанные замены идентичны заменам зародышевой линии, присутствующим в последовательности УН одного из антител 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2,
6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-тоб, 6.34.2-тоб, 6.67.1-тоб, 6.77.1-тоб или 7.26.4-тоб.
В одном из вариантов изобретения молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность УН антител 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2,
6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-тоб, 6.34.2-тоб, 6.67.1-тоб, 6.77.1-тоб или
7.26.4-тоб. В другом варианте изобретения молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность одной или нескольких областей СОК тяжелой цепи антител 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4,
9.8.2, 6.22.2-тоб, 6.34.2-тоб, 6.67.1-тоб, 6.77.1-тоб или 7.26.4-тоб. В предпочтительном варианте изобретения молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотные последовательности всех областей СОК тяжелой цепи антител 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2,
6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-тоб, 6.34.2-тоб, 6.67.1-тоб, 6.77.1-тоб или
7.26.4-тоб. В другом предпочтительном варианте изобретения, молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотные последовательности одной из последовательностей 8Е0 ГО N0: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42, 46, 52, 54, 56, 60 или 64 или содержит нуклеотидную последовательность одной из последовательностей 8Е0 ГО N0: 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 29, 33, 37, 41, 45, 51, 55, 59 или 63. В другом предпочтительном варианте изобретения молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотные последовательности одной или нескольких областей СОК любой из последовательностей 8Е0 ГО N0: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42, 46, 52, 54, 56, 60 или 64 или содержит нуклеотидную последовательность одной или нескольких областей СОК любой из последовательностей 8Е0 ГО N0: 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 29, 33, 37, 41, 45, 51, 55, 59 или 63.
В предпочтительном варианте изобретения молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидные последовательности, кодирующие аминокислотные последовательности всех областей СОК любой из последовательностей 8Е0 ГО N0: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42, 46, 52, 54, 56, 60 или 64 или содержит нуклеотидную последовательность всех областей СОК любой из последовательностей 8Е0 ГО N0: 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 29, 33, 37, 41, 45, 51, 55, 59 или 63. В некоторых вариантах изобретения молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую непрерывную область от СГОЕ1 и до СЭЕ3 (включительно) тяжелой или легкой цепи любого из вышеупомянутых антиМАбСАМ антител.
В другом варианте изобретения молекула нуклеиновой кислоты кодирует аминокислотную последовательность УН, которая по меньшей мере на 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична одной из нуклеотидных последовательностей, кодирующих аминокислотные последовательности УН, описанные непосредственно выше, а в частности, УН, содержащей аминокислотную последовательность одной из 8Е0 ГО N0: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42, 46, 52, 54, 56, 60 или 64. Настоящее изобретение также относится к нуклеотидной последовательности, которая по меньшей мере на 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична нуклеотидной последовательности одной из 8Е0 ГО N0: 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 29, 33, 37, 41, 45, 51, 55, 59 или 63.
В другом своем варианте молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей УН, является молекула, которая гибридизуется в условиях высокой жесткости с нуклеотидной последовательностью, кодирующей область УН, описанную выше, а в частности, область УН, содержащую аминокислотную последовательность одной из 8Е0 ГО N0: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42, 46, 52, 54, 56, 60 или 64. Настоящее
- 21 012872 изобретение также относится к нуклеотидной последовательности, кодирующей область УН, которая гибридизуется в условиях высокой жесткости с молекулой нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность одной из ЗЕО ГО N0: 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 29, 33, 37, 41, 45, 51, 55, 59 или 63.
Нуклеотидная последовательность, кодирующая полноразмерную тяжелую цепь или легкую цепь, либо ту и другую цепи анти-МАбСАМ антитела или его вариабельной области, может быть выделена из любого источника, продуцирующего анти-МАбСАМ антитело. Методы выделения мРНК, кодирующей антитело, хорошо известны специалистам. См., например, ЗатЬгоок е! а1., Мо1еси1аг С1ошпд: А ЪаЬога!огу Мапиа1, 2б еб., Со1б Зрппд НагЬог ЪаЬога!огу Ргекк, Со1б Зрппд НагЬог, ΝΥ, (1989) . Указанная мРНК может быть использована в целях продуцирования кДНК для проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР) или для кДНК-клонирования генов антитела. В одном из вариантов изобретения молекулы нуклеиновой кислоты могут быть получены из гибридомы, экспрессирующей анти-МАбСАМ антитело, описанное выше, а предпочтительно, из гибридомы которая имеет, в качестве одного из партнеров по слиянию, клетку трансгенного животного, экспрессирующую гены человеческого иммуноглобулина, такого как животное ХЕХЮМОиЗЕ™, трансгенная мышь или трансгенное животное, не являющееся человеком и мышью. В другом варианте изобретения, гибридому получают из не-трансгенного животного, не являющегося человеком, которое может быть использовано, например, для продуцирования гуманизированных антител.
Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая полноразмерную тяжелую цепь анти-МАбСАМ антитела, может быть сконструирована путем присоединения молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полноразмерный вариабельный домен тяжелой цепи или ее антигенсвязывающий домен, к константному домену тяжелой цепи. Аналогичным образом, молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая легкую цепь анти-МАбСАМ антитела, может быть сконструирована путем присоединения молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полноразмерный вариабельный домен легкой цепи или ее антигенсвязывающий домен, к константному домену легкой цепи. Молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие области УН и УЪ, могут быть превращены в полноразмерные гены антитела путем их встраивания в экспрессионные векторы, которые уже кодируют константную область тяжелой цепи или константную область легкой цепи, соответственно, так, чтобы в данном векторе, сегмент УН был функционально присоединен к сегменту(ам) константной области тяжелой цепи (СН), а сегмент УЪ был функционально присоединен к сегменту константной области легкой цепи (СЬ). Альтернативно, молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие цепи УН или УЪ, превращают в полноразмерные гены антитела путем объединения, например, путем лигирования молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей цепь УН с молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей цепь СН, в соответствии со стандартными методами молекулярной биологии. Аналогичный результат может быть достигнут с использованием молекул нуклеиновой кислоты, кодирующих цепи УЪ и СЪ. Последовательности генов константной области тяжелой и легкой цепей человеческого антитела известны специалистам. См., например, КаЬа! е! а1., Зециепсех о£ Рго!еш8 о£ 1ттипо1ощса1 1п!еге8!, 5 111 Еб., МН РиЬ1. №. 91-3242 (1991). Молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие полноразмерные тяжелые цепи и/или легкие цепи, могут быть затем экспрессированы в клетке, в которую они были введены, с последующим выделением анти-МАбСАМ антитела.
В предпочтительном варианте изобретения нуклеиновая кислота, кодирующая вариабельную область тяжелой цепи, кодирует вариабельную область, состоящую из аминокислотных последовательностей ЗЕО ГО N0: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42, 46, 52, 54, 56, 60 или 64, а молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая вариабельную область легких цепей, кодирует вариабельную область, состоящую из аминокислотных последовательностей ЗЕО ГО N0: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 54, 58, 62, 66 или 68.
В одном из вариантов изобретения молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая либо тяжелую цепь анти-МАбСАМ антитела, либо ее антигенсвязывающую часть, или легкую цепь анти-МАбСАМ антитела либо ее антигенсвязывающую часть, может быть выделена у животного, не являющегося человеком и мышью, у которого экспрессируются гены человеческого иммуноглобулина, и которое было иммунизовано антигеном МАбСАМ. В другом варианте изобретения, молекула нуклеиновой кислоты может быть выделена из клетки, продуцирующей анти-МАбСАМ антитело и происходящей от нетрансгенного животного или взятой у человека, у которого продуцируются анти-МАбСАМ антитела. мРНК от клеток, продуцирующих анти-МАбСАМ антитело, может быть выделена стандартными методами, клонирована и/или амплифицирована с помощью ПЦР и методами конструирования библиотек, а также скринирована в соответствии со стандартными протоколами с получением молекул нуклеиновой кислоты, кодирующих тяжелые и легкие цепи анти-МАбСАМ антитела.
Молекулы нуклеиновой кислоты могут быть использованы для рекомбинантной экспрессии больших количеств анти-МАбСАМ антител, описанных ниже. Молекулы нуклеиновой кислоты могут быть также использованы для продуцирования химерных антител, одноцепочечных антител, иммуноадгезинов, диантител, мутированных антител и производных антител, подробно описанных ниже. Если молекулы нуклеиновой кислоты происходят от нетрансгенного животного, не являющегося человеком, то такие молекулы нуклеиновой кислоты могут быть использованы для гуманизации антитела, как описано ниже.
- 22 012872
В другом варианте изобретения молекулы нуклеиновой кислоты согласно изобретению могут быть использованы в качестве зондов или ПЦР-праймеров для специфических последовательностей антител. Так, например, молекула нуклеиновой кислоты в качестве зонда, может быть использована в диагностических методах, а молекула нуклеиновой кислоты в качестве ПЦР-праймера может быть использована для амплификации областей ДНК, которые могут применяться т!ег айа для выделения нуклеотидных последовательностей в целях продуцирования вариабельных доменов анти-МАбСАМ антител. В предпочтительном варианте изобретения молекулами композиции настоящего изобретения являются олигонуклеотиды. В более предпочтительном варианте изобретения такие олигонуклеотиды происходят от высоковариабельных областей тяжелой и легкой цепей представляющего интерес антитела. В еще более предпочтительном варианте изобретения эти олигонуклеотиды кодируют все или часть одной или нескольких СОК.
Векторы
Настоящее изобретение относится к векторам, содержащим молекулы нуклеиновой кислоты согласно изобретению, кодирующие тяжелую цепь или ее антигенсвязывающую часть. Настоящее изобретение также относится к векторам, содержащим молекулы нуклеиновой кислоты согласно изобретению, кодирующие легкую цепь или ее антигенсвязывающую часть. Настоящее изобретение также относится к векторам, содержащим молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие гибридные белки, модифицированные антитела, фрагменты антител и их зонды.
Для экспрессии антител или фрагментов антител согласно изобретению ДНК, кодирующие неполные или полноразмерные легкие и тяжелые цепи и полученные как описано выше, встраивают в экспрессионные векторы так, чтобы эти гены были функционально присоединены к последовательностям регуляции транскрипции и трансляции. Экспрессионными векторами являются плазмиды, ретровирусы, аденовирусы, аденоассоциированные вирусы (ААУ), вирусы растений, такие как вирус мозаики цветной капусты, вирус мозаики табака, космиды, УАС, эписомы, происходящие от ЕВУ и т.п. Ген антитела лигируют в вектор так, чтобы в данном векторе последовательности регуляции транскрипции и трансляции выполняли присущую им функцию регуляции транскрипции и трансляции гена антитела. Экспрессионный вектор и последовательности регуляции экспрессии выбирают так, чтобы они были совместимы с клеткой-хозяином, используемой для экспрессии. Ген легкой цепи антитела и ген тяжелой цепи антитела могут быть встроены в отдельные векторы. В предпочтительном варианте изобретения оба гена встраивают в один и тот же экспрессионный вектор. Эти гены антитела встраивают в экспрессионный вектор стандартными методами (например, путем лигирования комплементарных рестрикционных сайтов с фрагментом гена антитела и с вектором, либо путем лигирования с затуплением концов, если рестрикционные сайты отсутствуют).
Подходящим вектором является вектор, кодирующий функционально полноразмерную последовательность СН или СЬ человеческого иммуноглобулина с соответствующими рестрикционными сайтами, сконструированными так, что любая УН или УЪ-последовательность может быть легко встроена и экспрессирована как описано выше. В таких векторах сплайсинг обычно происходит между сайтом донорного сплайсинга во встроенной 1-области и сайтом акцепторного сплайсинга, находящимся перед человеческим С-доменом, а также в областях сплайсинга, которые находятся в человеческих СН-экзонах. Последовательности полиаденилирования и терминации транскрипции расположены в нативных хромосомных сайтах, находящихся ниже кодирующих областей. Рекомбинантный экспрессионный вектор может также кодировать сигнальный пептид, который облегчает секрецию цепи антитела, происходящего от клетки-хозяина. Ген цепи антитела может быть клонирован в вектор так, чтобы сигнальный пептид был присоединен, с сохранением рамки считывания, к амино-концу гена цепи антитела. Таким сигнальным пептидом может быть иммуноглобулиновый сигнальный пептид или гетерологичный сигнальный пептид (то есть, сигнальный пептид, происходящий от белка, не являющегося иммуноглобулином).
Помимо генов цепи антитела, рекомбинантные экспрессионные векторы согласно изобретению несут регуляторные последовательности, которые регулируют экспрессию генов цепи антитела в клеткехозяине. Для специалиста в этой области очевидно, что конструирование экспрессионного вектора, включая выбор регуляторных последовательностей, может быть осуществлено в зависимости от таких факторов, как выбор трансформируемой клетки-хозяина, уровень экспрессии нужного белка и т.п. Предпочтительными регуляторными последовательностями для экспрессии в клетке-хозяине млекопитающего являются вирусные элементы, которые регулируют высокие уровни экспрессии белка в клетках млекопитающего, такие как промоторы и/или энхансеры, происходящие от ретровирусных ЬТК, цитомегаловируса (СМУ) (такие, как промотор/энхансер СМУ), обезьяньего вируса 40 (8У40) (такие, как промотор/энхансер 8У40), аденовируса (например, главный поздний промотор аденовируса (АбМЬР), промоторы полиомы и сильные промоторы млекопитающих, такие как промоторы нативного иммуноглобулина и актина. Более подробное описание вирусных регуляторных элементов и их последовательностей можно найти, например, в патентах США № 5168062, 4510245 и 4968615, каждый из которых вводится в настоящее описание посредством ссылки. Методы экспрессии антител в растениях, включая описание промоторов и векторов, а также трансформация растений, известны специалистам. См., например, патент США 6517529. Методы экспрессии полипептидов в бактериальных клетках или в клетках грибов, на
- 23 012872 пример. в дрожжевых клетках. также хорошо известны специалистам.
Помимо генов цепи антитела и регуляторных последовательностей рекомбинантные экспрессионные векторы согласно изобретению могут содержать дополнительные последовательности. такие как последовательности. которые регулируют репликацию вектора в клетках-хозяевах (например. ориджин репликации). и селективные маркерные гены. Селективный маркерный ген облегчает отбор клетокхозяев. в которые был встроен данный вектор (см.. например. патенты США №№ 4399216. 4634665 и 5179017). Так. например. обычно. селективный маркерный ген сообщает клетке-хозяину. в которую был введен данный вектор. резистентность к лекарственным средствам. таким как С418. гигромицин или метотрексат. Предпочтительными селективными маркерными генами являются ген дигидрофолатредуктазы (ΌΗΕΚ) (используемый в бЫг--клетках-хозяевах для отбора на метотрексат/амплификации). ген пео (для отбора на С418) и ген глутамат-синтетазы.
Не-гибридомные клетки-хозяева и методы рекомбинантного продуцирования белка
Молекулы нуклеиновой кислоты. кодирующие тяжелую цепь или ее антигенсвязывающую часть и/или легкую цепь или ее антигенсвязывающую часть анти-МАбСАМ антитела. и векторы. содержащие эти молекулы нуклеиновой кислоты. могут быть использованы для трансформации подходящих клетокхозяев млекопитающих. растений. бактерий или дрожжей. Такая трансформация может быть осуществлена путем введения полинуклеотидов в клетку-хозяина любым подходящим методом.
Методы введения гетерологичных полинуклеотидов в клетки млекопитающих хорошо известны специалистам. и такими методами являются опосредуемая декстраном трансфекция; преципитация фосфатом кальция; опосредуемая полибреном трансфекция. слияние протопластов; электропорация; инкапсуляция полинуклеотида(ов) в липосомы; биобаллистическая инжекция. и прямая микроинжекция ДНК в ядро. Кроме того. молекулы нуклеиновой кислоты могут быть введены в клетки млекопитающих с помощью вирусных векторов. Методы трансформации клеток хорошо известны специалистам. См.. например. патенты США №№ 4399216. 4912040. 4740461 и 4959455 (которые вводятся в настоящее описание посредством ссылки). Методы трансформации клеток растений хорошо известны специалистам. и такими методами являются. например. трансформация. опосредуемая АдтоЬас!етшт. биобаллистическая трансформация. прямая инжекция. электропорация и трансформация вирусом. Методы трансформации бактериальных и дрожжевых клеток также хорошо известны специалистам.
Клеточные линии млекопитающих. подходящие для экспрессии в качестве хозяев. хорошо известны специалистам. и такими линиями являются многие иммортализованные клеточные линии. имеющиеся в Американской коллекции типовых культур (АТСС). Эти линии включают. 1п1ег аба. клетки яичника китайского хомячка (СНО). клетки N80. клетки 8Р2. клетки НЕК 293Т. клетки ΝΙΗ-3Τ3. клетки НеЬа. клетки почек детеныша хомячка (ВНК). клетки почек обезьяны (СО8). клетки человеческой гепатоцеллюлярной карциномы (например. Нер С2). клетки А549. клетки 3Т3 и различные другие клеточные линии. Клетками-хозяевами млекопитающих являются клетки человека. мыши. крысы. собаки. обезьяны. свиньи. козы. коровы. лошади и хомячка. При этом особенно предпочтительно выбирать клеточные линии. которые обеспечивают высокие уровни экспрессии. Другими клеточными линиями. которые могут быть использованы. являются клеточные линии насекомых. такие как клетки 8£9. клетки амфибий. бактериальные клетки. клетки растений и клетки грибов. После введения в клетки-хозяева млекопитающих рекомбинантных экспрессионных векторов. кодирующих тяжелую цепь или ее антигенсвязывающую часть и легкую цепь и/или ее антигенсвязывающую часть. эти антитела продуцируют путем культивирования указанных клеток-хозяев в течение периода времени. достаточного для экспрессии такого антитела в клетках-хозяевах. или. более предпочтительно. секреции указанного антитела в культуральную среду. в которой были культивированы эти клетки-хозяева. Антитела могут быть выделены из культуральной среды стандартными методами очистки белков. Растительными клетками-хозяевами являются. например. клетки Мсобаиа (табака). АтаЬ1бор818 (резушки Таля). ряски. кукурузы. пшеницы. картофеля и т.п. Бактериальными клетками-хозяевами являются Е.соб и виды 8!тер!отусеб. Дрожжевыми клеткамихозяевами являются 8с1пхо5асс11аготусе5 ротЬе. Бассйатотусез сегеу181ае и РюЫа раЦогЬ.
Кроме того. экспрессия антител согласно изобретению (или других происходящих от них молекул) в клеточных линиях-продуцентах может усилена различными известными методами. Так. например. система экспрессии гена глутамин-синтетазы (система 08) наиболее часто используется для повышения уровня экспрессии в определенных условиях. Полное или частичное обсуждение системы ОС можно найти в Европейских патентах №№ 0216846. 0256055. 0338841 и 0323997.
По всей вероятности. антитела. экспрессируемые различными клеточными линиями или экспрессируемые в трансгенных животных. могут иметь различный характер гликозилирования. Однако. все антитела. кодируемые описанными здесь молекулами нуклеиновой кислоты или содержащие описанные здесь аминокислотные последовательности. являются частью настоящего изобретения. независимо от характера гликозилирования антител.
Трансгенные животные и растения
Настоящее изобретение также относится к трансгенным животным. не являющимся человеком. и к трансгенным растениям. содержащим одну или несколько молекул нуклеиновой кислоты согласно изобретению. которые могут быть использованы для продуцирования антител согласно изобретению. Анти
- 24 012872 тела могут быть продуцированы в тканях или физиологических жидкостях и выделены из таких тканей или физиологических жидкостей, как молоко, кровь или моча коз, коров, лошадей, свиней, крыс, мышей, кроликов, хомячков или других млекопитающих. См., например, патенты США №№ 5827690, 5756687, 5750172 и 5741957. Как описано выше, трансгенные животные, не являющиеся человеком, и содержащие локусы человеческого иммуноглобулина, могут быть иммунизованы МАбСАМ или его частью. Методы получения антител в растениях описаны, например, в патентах США №№ 6046037 и 5959177, которые вводятся в настоящее описание посредством ссылки.
В другом варианте изобретения трансгенные животные, не являющиеся человеком, и трансгенные растения продуцируют путем введения указанному животному или растению одной или нескольких молекул нуклеиновой кислоты согласно изобретению стандартными методами генной инженерии. См. выше, Нодап. Трансгенными клетками, используемыми для создания трансгенного животного, могут быть стволовые эмбриональные клетки, соматические клетки или оплодотворенные яйцеклетки. Трансгенными организмами, не являющимися человеком, могут быть химерные и не-химерные гетерозиготы и нехимерные гомозиготы. См. например, Нодап е! а1., Матри1абпд 1йе Мойке ЕтЬгуо: А ЬаЬота!оту Мапиа1 2еб., Со1б Зрппд НагЬог Ргекк (1999); 1асккоп е! а1., Мойке Сепебск апб Ттапкдешск: А Ртасбса1 Арргоасй, ОхГогб ишхегкйу Ргекк (2000); и Рюкеб, Тгапкдешс Ашта1 Тесйпо1оду: А ЬаЬога!огу НапбЬоок, Асабетк Ргекк (1999). В другом варианте изобретения трансгенные животные, не являющиеся человеком, могут иметь дизрупцию и замену, которая нацелена на соответствующую мишень, и которая кодирует представляющую интерес тяжелую и/или легкую цепь. В предпочтительном варианте изобретения трансгенные животные или растения содержат и экспрессируют молекулы нуклеиновой кислоты, которые кодируют тяжелые и легкие цепи, и которые, при их объединении, специфически связываются с МАбСАМ, а предпочтительно, с человеческим МАбСАМ. В другом варианте изобретения трансгенные животные или растения содержат молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие модифицированное антитело, такое как одноцепочечное антитело, химерное антитело или гуманизированное антитело. Анти-МАбСАМ антитела могут быть продуцированы у любого трансгенного животного. В предпочтительном варианте изобретения указанными животными, не являющимися человеком, являются мыши, крысы, овцы, свиньи, козы, крупный рогатый скот или лошади. У трансгенных животных, не являющихся человеком, указанные кодируемые полипептиды экспрессируются в крови, молоке, моче, слюне, слезах, слизи и в других физиологических жидкостях.
Библиотеки фагового представления
Настоящее изобретение относится к способу продуцирования анти-МАбСАМ антитела или его антигенсвязывающей части, включающему стадии синтеза библиотеки человеческих антител на фаге; скрининга библиотеки с помощью МАбСАМ или его части; выделения фага, который связывается с МАбСАМ; и получения антитела из этого фага. Один из методов получения библиотеки антител включает стадии иммунизации животного-хозяина, не являющегося человеком и содержащего локусы человеческого иммуноглобулина, антигеном МАбСАМ или его антигенной частью для вырабатывания иммунного ответа; экстрагирования из указанного животного-хозяина клеток, ответственных за продуцирование антител; выделения РНК из экстрагированных клеток; обратной транскрипции РНК с получением кДНК; амплификации кДНК с использованием праймера; и встраивания кДНК в вектор фагового представления так, чтобы в этом фаге экспрессировались данные антитела. Таким образом могут быть получены рекомбинантные анти-МАбСАМ антитела согласно изобретению.
Рекомбинантные человеческие антитела против МАбСАМ согласно изобретению, помимо описанных здесь анти-МАбСАМ антител, могут быть выделены путем скрининга рекомбинантной комбинаторной библиотеки антител, а предпочтительно, библиотеки фагового представления ксЕу, полученной с использованием кДНК человеческих УБ и УН, продуцированных из мРНК, выделенной из человеческих лимфоцитов. Методика получения и скрининга таких библиотек известна специалистам. Существуют коммерчески доступные наборы для генерирования библиотек фагового представления (например, система для фагового представления рекомбинантных антител Рбаттас1а КесотЫпап! Рйаде АпбЬобу Зук!ет, са!а1од по.27-9400-01; и набор для фагового представления З!га!адепе ЗитЕА™, са!а1од по. 240612). Для генерирования и скрининга библиотек представления антител могут быть также применены и другие методы и реагенты (см. например, патент США № 5223409; публикации РСТ №№ XVО 92/18619, XVО 91/17271, АО 92/20791, АО 92/15679, АО 93/01288, АО 92/01047, АО 92/09690; Еисйк е! а1. (1991), Вю!есйпо1оду 9:1370-1372; Нау е! а1., Нит. АпбЬоб. НуЬбботак 3:81-85 (1992); Нике е! а1., Заепсе 246:12751281 (1989); МсСаГГебу е! а1., \а1иге 348:552-554 (1990); СбГГйбк е! а1., ЕМВО б. 12:725-734 (1993); Намктк е! а1., 1. Мо1. Вю1. 226:889-896 (1992); С1асккоп е! а1., №11иге 352:624-628 (1991); Сгат е! а1., Ргос.№11Е Асаб. Зск, ИЗА, 89:3576-3580 (1992); Саггаб е! а1., Вю!есбпо1оду 9:1373-1377 (1991); НоодепЬоот е! а1., Мс. Ас1б Кек. 19:4133-4137 (1991) и ВагЬак е! а1., Ргос.№!1. Асаб. Зск, ИЗА, 88:7978-7982 (1991).
В предпочтительном варианте изобретения для выделения человеческих анти-МАбСАМ антител с нужными свойствами, сначала используют описанное здесь человеческое анти-МАбСАМ антитело для отбора последовательностей человеческих тяжелых и легких цепей, обладающих аналогичной активностью связывания с МАбСАМ, где такой отбор осуществляют методами эпитопного импринтинга, описанными НоодепЬоот е! а1., в публикации заявки РСТ № АО 93/06213. Библиотеками антител, исполь
- 25 012872 зуемыми в этих методах, являются, предпочтительно, библиотеки 5сРу, полученные и скринированные как описано МсСаГГеПу е! а1. в публикации РСТ № АО 92/01047, и в работах МсСаГГеПу е! а1., Ыа!иге 348:552-554 (1990); и СгбГГййк е! а1., ЕМВО 1. 12:725-734 (1993). Библиотеки 5сРу антител, предпочтительно, скринируют с использованием человеческого МАбСАМ в качестве антигена.
После предварительного отбора человеческих УЬ- и УН-сегментов проводят эксперименты по смешиванию и совместимости, в которых различные пары предварительно отобранных УЬ- и УНсегментов скринируют на связывание с МАбСАМ для отбора предпочтительных комбинаций пар УЬ/УН. Кроме того, для улучшения качества антитела, УЬ- и УН-сегменты предпочтительных пар УЬ/УН могут быть неспецифически мутированы, предпочтительно» в области СЭЯ3 УН и/или УЬ способом, аналогичным соматическому процессу мутации би убуо, ответственному за созревание аффинности антител во время вырабатывания природного иммунного ответа. Такое би уббто созревание аффинности антител может быть осуществлено путем амплификации областей УН и УЬ с использованием ПЦРпраймеров, комплементарных СЭЯ3 УН или СЭЯ3 УЬ, соответственно, где указанные праймеры были пронизаны произвольной смесью четырех нуклеотидных оснований в определенных положениях, так, чтобы полученные ПЦР-продукты кодировали УЬ- и УН-сегменты с введенными в них, а именно в их СЭЯ3-области, УН и/или УЬ, случайными мутациями. Эти произвольно мутированные УЬ- и УНсегменты могут быть снова скринированы на связывание с МАбСАМ.
После скрининга и выделения анти-МАбСАМ антитела согласно изобретению из библиотеки представления рекомбинантных иммуноглобулинов, нуклеиновая кислота, кодирующая отобранное антитело, может быть выделена из упаковочного вектора представления (например, из фагового генома) и субклонирована в другие экспрессионные векторы стандартными методами рекомбинантных ДНК. Если это необходимо, то нуклеиновая кислота может быть дополнительно модифицирована для создания других форм антител согласно изобретению, как описано ниже. Для экспрессии рекомбинантного человеческого антитела, выделенного путем скрининга комбинаторной библиотеки, ДНК, кодирующую антитело, клонируют в рекомбинантный экспрессионный вектор и вводят в клетки-хозяева млекопитающих, как описано выше.
Переключение классов
В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к механизму, благодаря которому класс анти-МАбСАМ антитела может быть переключен на другой класс. В одном из аспектов изобретения УЬили УН-кодирующую молекулу нуклеиновой кислоты выделяют хорошо известными методами, так, чтобы она не включала каких-либо нуклеотидных последовательностей, кодирующих СЬ или СН. Затем эту молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую УЬ или УН, функционально присоединяют к нуклеотидной последовательности, кодирующей СЬ или СН молекулы иммуноглобулина другого класса. Это может быть достигнуто с использованием вектора или молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей СЬили СН-кодирующие последовательности, описанные выше. Так, например, исходное анти-МАбСАМ антитело, которое первоначально имело класс 1дМ, может быть переключено на класс 1дС. Кроме того, переключение классов может применяться для превращения 1дС одного подкласса в 1дС другого подкласса, например 1дС4 в 1дС2. Предпочтительный способ продуцирования антитела согласно изобретению, имеющего нужный изотип или подкласс, включает стадии выделения нуклеиновой кислоты, кодирующей тяжелую цепь анти-МАбСАМ антитела, и нуклеиновой кислоты, кодирующей легкую цепь анти-МАбСАМ антитела; получения вариабельной области тяжелой цепи; лигирования вариабельной области тяжелой цепи с константным доменом тяжелой цепи нужного изотипа; экспрессии легкой цепи и лигированной тяжелой цепи в клетке; и сбора анти-МАбСАМ антитела, имеющего нужный изотип.
Производные антитела
Описанные выше молекулы нуклеиновой кислоты могут быть использованы для генерирования производных антител способами и методами, известными среднему специалисту в данной области.
Гуманизированные антитела
Иммуногенность не-человеческих антител может быть, до некоторой степени, снижена путем применения методов гуманизации, возможно, с использованием соответствующих библиотек представления. Следует отметить, что мышиные антитела или антитела животных других видов могут быть гуманизированы или примитизированы хорошо известными методами. См., например, Аби!ег & Наггбк, 1ттиио1. Тобау, 14:43-46 (1993) и Агбдй! е! а1., Сгб!. Яеубетек би 1ттиио1., 12125-168 (1992). Представляющее интерес антитело может быть сконструировано методами рекомбинантных ДНК для замены СН1, СН2, СН3, шарнирных доменов и/или каркасного домена соответствующей человеческой последовательностью (см. АО 92/02190 и патенты США №№ 5530101, 5585089, 5693761, 5693792, 5714350 и 5777085). В другом варианте изобретения, не-человеческое анти-МАбСАМ антитело может быть гуманизировано путем замены СН1, шарнирного домена, СН2, СН3, и/или каркасных доменов соответствующей человеческой последовательностью анти-МАбСАМ антитела согласно изобретению.
Мутированные антитела
В другом варианте изобретения молекулы нуклеиновой кислоты, векторы и клетки-хозяева могут быть использованы для получения мутированных анти-МАбСАМ антител. Эти антитела могут быть мутированы в вариабельных доменах тяжелой и/или легкой цепей для изменения связывающих свойств
- 26 012872 антитела. Так, например, такая мутация может быть сделана в одной или в нескольких СГОЯ-областях для увеличения или снижения Кй антитела против МАйСАМ. Методы сайт-направленного мутагенеза хорошо известны специалистам. См. выше, например, ΞηιηόΐΌοΚ е! а1., и Аи8иЬе1 е! а1. В предпочтительном варианте изобретения, мутации могут быть введены в вариабельную область анти-МАйСАМ антитела в известный аминокислотный остаток, который, по сравнению с остатком в зародышевой линии, необходимо модифицировать. В более предпочтительном варианте изобретения в известные аминокислотные остатки, которые, по сравнению с остатком в зародышевой линии, необходимо модифицировать, вводят одну или несколько мутаций в вариабельную область или область СОЯ одного из анти-МАйСАМ антител 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2^οφ 6.34.2тοй, 6.67.1^οά, 6.77.1-тοй или 7.26.4^οά. В другом варианте изобретения в известные аминокислотные остатки, которые, по сравнению с остатком в зародышевой линии, необходимо модифицировать, вводят одну или несколько мутаций в вариабельную область или область СОЯ, аминокислотная последовательность которой представлена в 8ЕО ГО ΝΟ: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 52, 54, 56, 58, 62, 64, 66 или 68, либо нуклеотидная последовательность которой представлена в 8ЕО ГО ΝΟ: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 51, 53, 55, 57, 61, 63, 65 или 67. В другом варианте изобретения молекулы нуклеиновой кислоты имеют мутации в одной или нескольких каркасных областях. Мутация может быть сделана в каркасной области или в константном домене в целях увеличения времени полужизни анти-МАйСАМ антитела. См., например, заявку \УО 00/09560, опубликованную 24 февраля, 2000, которая вводится в настоящее описание посредством ссылки. В одном из вариантов изобретения может присутствовать одна, три, пять или десять точковых мутаций, но не более, чем пятнадцать точковых мутаций. Мутация в каркасной области или в константном домене может быть также сделана в целях изменения иммуногенности антитела, в целях введения сайта для ковалентного или нековалентного связывания с другой молекулой, или в целях изменения таких свойств, как фиксация комплемента. Мутации могут быть сделаны в каждой из таких участков, как каркасные области, константный домен и вариабельные области одного мутированного антитела.
Альтернативно, мутации могут быть сделаны либо в каркасной области, либо в вариабельных областях, либо в константном домене одного мутированного антитела.
В одном из вариантов изобретения мутированное анти-МАйСАМ антитело, по сравнению с антиМАйСАМ антителом до его мутации, имеет не более, чем пятнадцать аминокислотных замен в любой из областей УН или УЬ. В более предпочтительном варианте изобретения мутированное анти-МАйСАМ антитело, в областях УН или УЬ имеет не более, чем десять аминокислотных замен, более предпочтительно, не более, чем пять аминокислотных замен, а еще более предпочтительно, не более, чем три аминокислотных замены. В другом варианте изобретения в константных областях присутствует не более, чем пятнадцать аминокислотных замен, более предпочтительно не более, чем десять аминокислотных замен, а еще более предпочтительно не более, чем пять аминокислотных замен.
Модифицированные антитела
В другом варианте изобретения гибридное антитело или иммуноадгезин могут быть сконструированы так, чтобы они содержали целое анти-МАйСАМ антитело или его часть, присоединенные к другому полипептиду. В предпочтительном варианте изобретения к указанному полипептиду присоединены только вариабельные области анти-МАйСАМ антитела. В другом предпочтительном варианте изобретения, УН-домен анти-МАйСАМ антитела присоединен к первому полипептиду, а УЪ-домен антиМАйСАМ антитела присоединен ко второму полипептиду, который связан с первым полипептидом так, что УН- и УЪ-домены могут взаимодействовать друг с другом с образованием связывающего сайта антитела. В другом предпочтительном варианте изобретения УН-домен отделен от УЪ-домена линкером, в результате чего УН- и УЪ-домены могут взаимодействовать друг с другом (см. ниже раздел Одноцепочечные антитела). Затем антитело УН-линкер-УЪ присоединяют к представляющему интерес полипептиду. Такое гибридное антитело может быть использовано для прямой доставки полипептида в клетку или в ткань, экспрессирующую МАйСАМ. Указанным полипептидом может быть терапевтическое средство, такое как токсин, фактор роста или другой регуляторный белок, либо указанным полипептидом может быть диагностическое средство, такое как фермент, который может быть легко визуализирован, например, пероксидаза хрена. Кроме того, могут быть сконструированы гибридные антитела, в которых два (или более) одноцепочечных антитела присоединены друг к другу. Это может оказаться полезным, если необходимо создать двухвалентное или поливалентное антитело на одной полипептидной цепи, или если необходимо создать биспецифическое антитело.
Для создания одноцепочечного антитела (^Ρν), УН- и УЪ-кодирущие фрагменты ДНК функционально присоединяют к другому фрагменту, кодирующему гибкий линкер, например, кодирующему аминокислотную последовательность (С1у4-8ет)3, так, чтобы последовательности УН и УЪ могли экспрессироваться как непрерывный одноцепочечный белок, имеющий УЪ- и УН-области, соединенные гибким линкером (см., например, В1гй е! а1., 8с1епсе 242:423-426 (1988); Ни^Юп е! а1., Ртос. №!1. Асай. 8сЕ, И8А, 85:5879-5883 (1988); МсСайейу е! а1., №11иге 348:552-554 (1990). Одноцепочечное антитело может быть одновалентным, если используется только одна область УН или УЪ; двухвалентным, если
- 27 012872 используются обе области УН и УБ; или поливалентным, если используются более двух областей УН и УБ.
В другом варианте изобретения другие модифицированные антитела могут быть получены с использованием молекул нуклеиновой кислоты, кодирующих анти-МАбСАМ антитело. Так, например, каппа-антитела (III е! а1., Рго!еш Епд. 10:94 9-57 (1997)), миниантитела (Магйп е! а1., ЕМВО 1. 13:5303-9 (1994)), диантитела (НоШдег е! а1., Ргос. Ναΐ1. Асаб. 8ск, И8А, 90:6444-6448 (1993)) или янусины (1апи81п8) (Тгаипескег е! а1., ЕМВО 1. 10:3655-3659 (1991) & Тгаипескег е! а1., 1апи8Ш8:пете то1еси1аг беыдп Гог ЫкресШс геадепй, 1п!. 1. Сапсег 8ирр1, 7:51-52 (1992)) могут быть получены стандартными методами молекулярной биологии, описанными в настоящей заявке.
В другом аспекте изобретения могут быть генерированы химерные и биспецифические антитела. Может быть получено химерное антитело, содержащее СБК и каркасные области от различных антител. В предпочтительном варианте изобретения СБК химерного антитела содержат все СБК вариабельной области легкой цепи или тяжелой цепи человеческого анти-МАбСАМ антитела, а каркасные области происходят от одного или нескольких различных антител. В более предпочтительном варианте изобретения, СБК химерного антитела содержат все СБК вариабельных областей легкой цепи и тяжелой цепи человеческого анти-МАбСАМ антитела. Каркасные области могут происходить от антител животных других видов, а в предпочтительном варианте могут быть гуманизированными. Альтернативно, каркасные области могут происходить от другого человеческого антитела.
Может быть генерировано биспецифическое антитело, которое специфически связывается с МАбСАМ посредством одного связывающего домена и с другой молекулой посредством второго связывающего домена. Биспецифическое антитело может быть продуцировано методами рекомбинантных ДНК, применяемыми в молекулярной биологии, либо оно может быть физически конъюгировано. Кроме того, может быть генерировано одноцепочечное антитело, содержащее более, чем одну область УН и УБ, и специфически связывающееся с МАбСАМ и с другой молекулой. Такие биспецифические антитела могут быть получены методами, хорошо известными специалистам, например, в соответствии с пунктами (ί) и (ίί), см., например, Рапдег е! а1., 1ттипо1. МеШобк 4:72-81 (1994) и \Упд111 & НаггБ. см. выше, и в соответствии с пунктом (ίίί), см. например, Тгаипескег е! а1., 1п!. ί. Сапсег (8ирр1.) 7:51-52 (1992). В предпочтительном варианте изобретения, биспецифическое антитело связывается с МАбСАМ и с другой молекулой, экспрессируемыми на высоком уровне в эндотелиальных клетках. В более предпочтительном варианте изобретения, такой другой молекулой является УСАМ, 1САМ или Б-селектин.
В различных вариантах изобретения описанные выше модифицированные антитела получают с использованием одной или нескольких вариабельных областей или одной или нескольких областей СБК, происходящих от одного из антител, выбранных из 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-тоб, 6.34.2-тоб, 6.67.1-тоб, 6.77.1-тоб или 7.26.4-тоб. В другом варианте изобретения модифицированные антитела получают с использованием одной или нескольких вариабельных областей или одной или нескольких областей СБК, аминокислотные последовательности которых представлены в 8ЕЦ 1Б N0: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 52, 54, 56, 58, 62, 64, 66 или 68, или нуклеотидные последовательности которых представлены в 8ЕС II) N0: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 51, 53, 55, 57, 61, 63, 65 или 67.
Дериватизированные и меченные антитела
Антитело или его часть согласно изобретению могут быть дериватизированы или присоединены к другой молекуле (например, к другому пептиду или белку). В общих чертах, антитела или их части дериватизируют так, чтобы такая дериватизация или мечение не оказывали негативного влияния на связывание с МАбСАМ. В соответствии с этим, антитела или их части согласно изобретению конструируют так, чтобы они включали как интактные, так и модифицированные формы описанных здесь человеческих анти-МАбСАМ антител. Так, например, антитело или его часть согласно изобретению могут быть функционально присоединены (путем химического связывания, генетического сцепления, нековалентного связывания или как-либо иначе) к одной или нескольким другим молекулам, таким как другое антитело (например, биспецифическое антитело или диантитело), детектирующий агент, цитотоксический агент, фармацевтическое средство и/или белок или пептид, которые могут опосредовать связывание антитела или его части с другой молекулой (такой как стрептавидиновая коровая область или полигистидиновая метка).
Дериватизированное антитело одного типа продуцируют путем перекрестного сшивания двух или более антител (того же самого типа или различных типов, например, для получения биспецифических антител). Подходящими перекрестносшивающими агентами являются агенты, которые представляют собой гетеробифункциональные агенты, имеющие две различных реакционноспособных группы, разделенные соответствующим спейсером (например, м-малеимидобензоил-№гидроксисукцинимидоэфиром), или гомобифункциональные агенты (например, дисукцинимидилсуберат). Такие линкеры поставляются фирмой Р1егсе С11еппса1 Сотрапу, КоскГогб, III.
Дериватизированным антителом другого типа является меченное антитело. Подходящими детектирующими агентами, с помощью которых может быть дериватизировано антитело или его часть согласно
- 28 012872 изобретению, являются флуоресцентные соединения, включая флуоресцеин, флуоресцеинизотиоцианат, родамин, 5-диметиламин-1-нафталинсульфонилхлорид, фикоэритрин, лантанид-фосфор и т.п. Антитело может быть также помечено ферментами, которые используют для детекции, например, такие как пероксидаза хрена, β-галактозидаза, люцифераза, щелочная фосфатаза, глюкозооксидаза и т.п. Если антитело метят детектируемым ферментом, то его детектируют путем добавления дополнительных реагентов, в присутствии которых данный фермент продуцирует реакционный продукт, который может быть идентифицирован. Так, например, в присутствии фермента пероксидазы хрена добавление пероксида водорода и диаминобензидина приводит к окрашиванию реакционного детектируемого продукта. Антитело может быть также помечено биотином и детектировано путем непрямого измерения уровня связывания с авидином или стрептавидином. Антитело может быть помечено агентом, обладающим магнитными свойствами, таким как гадолиний. Антитело может быть также помечено предварительно определенным полипептидным эпитопом, распознаваемым вторичным репортером (например, двухкомпонентными последовательностями лейциновой молнии, сайтами связывания для вторых антител, металл-связывающими доменами, эпитопными метками). В некоторых вариантах изобретения, метки присоединяют посредством спейсерных групп различной длины для уменьшения возможного стерического затруднения.
Анти-МАйСАМ антитело может быть также помечено радиоактивно меченной аминокислотой. Радиоактивно меченное антитело может быть использовано как в диагностических, так и в терапевтических целях. Так, например, радиоактивно меченное анти-МАйСАМ антитело может быть использовано для детекции МАйСАМ-экспрессирующих тканей с помощью рентгеновской или другой диагностической аппаратуры. Кроме того, радиоактивно меченное анти-МАйСАМ антитело может быть использовано в терапевтических целях в качестве токсина для патологических тканей или МАйСАМ-экспрессирующих опухолей. Примерами меток, используемых для полипептидов, являются, но не ограничиваются ими, нижеследующие радиоизотопы или радионуклиды 3Н, 14С, 15Ν, 35δ, 90Υ, 94Тс, 'ίη. 125Ι, 131Ι.
Анти-МАйСАМ антитело может быть также дериватизировано химической группой, такой как полиэтиленгликоль (ПЭГ), метильная или этильная группа, или углеводная группа. Эти группы могут быть использованы для улучшения биологических свойств антитела, например, для увеличения его времени полужизни в сыворотке или для повышения уровня связывания с тканью. Эта методика может также применяться к любым антигенсвязывающим фрагментам или к вариантам анти-МАйСАМ антител.
Фармацевтические композиции и наборы
В другом своем аспекте настоящее изобретение также относится к композициям, содержащим ингибирующее человеческое анти-МАйСАМ антитело и к способам лечения индивидуумов такими композициями. В некоторых вариантах изобретения указанным индивидуумом, подвергаемым лечению, является человек. В других вариантах изобретения таким индивидуумом является животное. В некоторых вариантах изобретения таким животным является собака или примат, но не человек.
Лечение может предусматривать введение одного или нескольких ингибирующих моноклональных антител против МАйСАМ согласно изобретению или их антигенсвязывающих фрагментов, отдельно или вместе с фармацевтически приемлемым носителем. Ингибирующие анти-МАйСАМ антитела согласно изобретению и композиции, содержащие эти антитела, могут быть введены в комбинации с одним или несколькими другими терапевтическими, диагностическими или профилактическими средствами. Такими другими терапевтическими средствами являются противовоспалительные или иммуномодулирующие средства. Такими средствами являются, но не ограничиваются ими, кортикостероиды для местного и перорального введения, такие как преднизолон, метилпрендизолон, NСX-1015 или будезонид; аминосалицилаты, такие как мезалазин, олсалазин, балсалазид или NСX-456; иммуномодуляторы такого класса, как азатиоприн, 6-меркаптопурин, метотрексат, циклоспорин, ГК506, ГЬ-10 (илодекакин), ГЬ-11 (опрелевкин), ΙΕ-12, антагонисты М ^/6^074, антагонисты СЭ40, такие как ΤΝΧ-100/5-012, антагонисты 0Х40Ь, СМ-С8Р, пимекролимус или рапамицин; средства против ΤΝΡα такого класса, как инфликсимаб, адалимумаб, СЭР-870, онерцепт, этанерцепт; противовоспалительные средства такого класса, как ингибиторы РЭЕ-4 (рофлумиласт и т.п.), ингибиторы ТАСЕ (ЭРС-333, ВОР-58 и т.п.) и ингибиторы Ιί,Έ (УХ740 и т.п.), а также антагонисты рецептора ΙΕ-2, такие как даклизумаб; антагонисты селективных адгезивных молекул такого класса, как натализумаб, МЬ№02 или аликафорсен, аналгетики такого класса, как, но не ограничивающиеся ими, ингибиторы СОХ-2, такие как рофекоксиб, вальдекоксиб, целекоксиб, модуляторы потенциал-зависимых каналов типа Р/р (α2δ), такие как габапентин и прегабалин, антагонисты рецептора ΝΚ-1, модуляторы каннабиноидных рецепторов и агонисты дельта-опиоидных рецепторов, а также антинеопластические, противоопухолевые, антиангиогенные или химиотерапевтические средства. Такие дополнительные средства могут быть включены в одну и ту же композицию, либо они могут быть введены отдельно. В некоторых вариантах изобретения, одно или несколько ингибирующих анти-МАйСАМ антител согласно изобретению могут быть использованы в качестве вакцины или в качестве адъювантов для вакцины. В частности, поскольку МАйСАМ экспрессируется в лимфоидной ткани, то вакцинные антигены могут быть преимущественно доставлены в лимфоидную ткань путем их конъюгирования с анти-МАйСАМ антителом согласно изобретению.
Используемый здесь термин фармацевтически приемлемый носитель означает любой и все рас
- 29 012872 творители, дисперсионные среды, покрытия, антибактериальные и противогрибковые агенты, изотонические агенты, агенты, усиливающие или замедляющие абсорбцию и т.п., которые являются физиологически совместимыми. Некоторыми примерами фармацевтически приемлемых носителей являются вода, физиологический раствор, забуференный фосфатом физиологический раствор, ацетатный буфер с хлоридом натрия, декстроза, глицерин, полиэтиленгликоль, этанол и т.п., а также их комбинации. Во многих случаях, в композицию предпочтительно включать изотонические агенты, например сахара, полиспирты, такие как маннит и сорбит, или хлорид натрия. Другими примерами физиологически приемлемых веществ являются поверхностно-активные вещества, смачивающие агенты или небольшие количества добавок, таких как смачивающие или эмульгирующие агенты, консерванты или буферы, которые увеличивают срок хранения или повышают эффективность данного антитела.
Композиции согласно изобретению могут быть приготовлены в различных формах, например, в жидкой, полутвердой или в твердой лекарственных формах, таких как жидкие растворы (например, растворы для инъекций и инфузий), дисперсии или суспензии, таблетки, драже, лиофилизованный осадок, сухие порошки, липосомы и суппозитории. Предпочтительная форма зависит от способа введения и от терапевтического применения. Типичные предпочтительные композиции приготавливают в форме растворов для инъекций или вливаний, таких как композиции, аналогичные композициям, используемым для пассивной иммунизации человека. Предпочтительным способом введения является парентеральное (например, внутривенное, подкожное, внутрибрюшинное, внутримышечное, внутрикожное) введение. В предпочтительном варианте изобретения, указанное антитело вводят путем внутривенной инфузии или инъекции. В другом предпочтительном варианте изобретения, указанное антитело вводят путем внутримышечной, внутрикожной или подкожной инъекции.
Терапевтические композиции должны быть стерильными и стабильными в условиях их получения и хранения. Такая композиция может быть приготовлена в виде раствора, лиофилизованного осадка, сухого порошка, микроэмульсии, дисперсии, липосомы или другой упорядоченной структуры, подходящей для приготовления лекарственного средства высокой концентрации. Стерильные растворы для инъекций могут быть получены путем включения анти-МАбСАМ антитела в требуемом количестве в соответствующий растворитель вместе с одним из перечисленных выше ингредиентов или с их комбинацией, если это необходимо, и с последующей стерилизацией. В случае стерильных порошков, используемых для приготовления стерильных растворов для инъекций, предпочтительными методами такого приготовления является вакуумная сушка и лиофилизация с получением порошка, содержащего активный ингредиент и любой другой нужный ингредиент, из предварительно стерилизованного раствора. В общих чертах, дисперсии получают путем включения активного соединения в стерильный носитель, содержащий основную дисперсионную среду и другие необходимые ингредиенты из числа вышеперечисленных ингредиентов. Нужные свойства раствора можно поддерживать, например с использованием поверхностноактивных веществ и получением частиц нужного размера в случае дисперсии, и с использованием поверхностно-активных веществ, фосфолипидов и полимеров. Пролонгированная абсорбция инъецируемых композиций может быть достигнута путем включения в данную композицию агента, замедляющего абсорбцию, например, моностеаратных солей, полимерных материалов, масел и желатина.
Антитела согласно изобретению могут быть введены различными известными способами, хотя для многих терапевтических применений, предпочтительным путем/способом введения является подкожная, внутримышечная, внутрикожная или внутривенная инфузия. Как очевидно для специалистов в данной области, такой путь и/или способ введения варьируется в зависимости от желаемых результатов.
В некоторых вариантах изобретения, композиции антител могут быть приготовлены в комбинации с носителем, который будет защищать антитело от быстрого высвобождения, и такими композициями являются препараты с регулируемым высвобождением, включая имплантаты, чрезкожные пластыри и микроинкапсулированные системы для доставки. При этом могут быть использованы биологически разлагаемые биосовместимые полимеры, такие как этиленвинилацетат, полиангидриды, полигликолевая кислота, коллаген, полиортоэфиры и полимолочная кислота. Многие методы получения таких композиций запатентованы или, по существу, известны специалистам. См., например, 8ик1атеб апб Соп1го11еб Ке1еаке Эгид ОеНуегу 8у81етк (1.К. КоЬткоп, еб., Магсе1 Эеккег, 1пс., №\ν Уогк 1978).
В некоторых вариантах изобретения анти-МАбСАМ антитело согласно изобретению может быть введено перорально, например, вместе с инертным разбавителем или с хорошо усваиваемым пищевым наполнителем. Соединение (и другие ингредиенты, если это необходимо) может быть также заключено в твердую или мягкую желатиновую капсулу, спрессовано в таблетки или введено непосредственно в пищу индивидуума. Для перорального терапевтического применения, анти-МАбСАМ антитела могут быть введены вместе с наполнителями, и могут быть использованы в форме таблеток для проглатывания, таблеток для растворения в щечном кармане, пастилок, капсул, эликсиров, суспензий, сиропов, облаток и т.п. Для введения соединения согласно изобретению не-парентеральным способом, может оказаться необходимым покрытие данного соединения материалом, предупреждающим его инактивацию, или введение данного соединения вместе с указанным материалом.
Композиции согласно изобретению могут включать терапевтически эффективное количество или профилактически эффективное количество антитела или его антигенсвязывающей части согласно изо
- 30 012872 бретению. Термин терапевтически эффективное количество означает количество, которое, при определенных дозах, и в течение необходимого периода времени является эффективным для достижения нужного терапевтического результата. Терапевтически эффективное количество антитела или его части может варьироваться в зависимости от таких факторов, как патологическое состояние, возраст, пол и масса индивидуума, а также от способности данного антитела или его части вырабатывать нужный ответ у данного индивидуума. Терапевтически эффективное количество также означает количество, при котором терапевтически полезное действие антитела или части антитела значительно превосходит его токсическое или нежелательное действие. Профилактически эффективное количество означает количество, которое при определенных дозах и в течение необходимого периода времени является эффективным для достижения нужного профилактического результата. Поскольку профилактическую дозу обычно вводят индивидууму до развития заболевания или на ранней стадии его развития, то такое профилактически эффективное количество обычно меньше, чем терапевтически эффективное количество.
Схемы введения доз могут быть скорректированы для достижения оптимального нужного ответа (например, терапевтического или профилактического ответа). Так, например, может быть введена одна ударная доза, либо может быть введено несколько дробных доз в течение определенного периода времени, либо дозу можно пропорционально снижать или увеличивать в зависимости от сложности данной терапевтической ситуации. Для облегчения введения дозы и равномерности такого введения, особенно предпочтительными являются парентеральные композиции, полученные в виде унифицированной лекарственной формы. Используемый здесь термин унифицированная лекарственная форма означает физически дискретные единицы, приготовленные в виде доз на один прием для лечения млекопитающих, при этом каждая из этих унифицированных доз содержит предварительно рассчитанное количество активного соединения, эффективное для достижения нужного терапевтического эффекта, в сочетании с нужным фармацевтическим носителем. Технические требования для получения унифицированных лекарственных форм согласно изобретению определяются, или непосредственно зависят от них, (а) уникальными свойствами анти-МАбСАМ антитела или его части и конкретно достигаемым терапевтическим или профилактическим эффектом и (Ь) ограничениями, с которыми сталкиваются специалисты при приготовлении такого антитела для устранения повышенной чувствительности у индивидуумов.
В качестве примера, неорграничивающие интервалы терапевтически или профилактически эффективных количеств антитела или частей антитела согласно изобретению составляют от 0,025 до 50 мг/кг, предпочтительно, от 0,1 до 50 мг/кг, а более предпочтительно, 0,1-25; 0,1-10 или 0,1-3 мг/кг. В некоторых вариантах изобретения, указанная композиция содержит 5 мг/мл антитела в буфере, содержащем 20 мМ ацетата натрия, рН 5,5, 140 мМ №-1С1 и 0,2 мг/мл полисорбата 80. Следует отметить, что эти величины доз могут варьироваться в зависимости от типа и тяжести состояния, подвергаемого лечению. Кроме того, следует отметить, что для любого индивидуума конкретные схемы введения доз должны быть скорректированы в зависимости от времени и индивидуальных потребностей индивидуума, и в соответствии с назначением врача, проводящего лечение или наблюдение за введением композиций, а поэтому указанные здесь интервалы доз приводятся лишь для иллюстрации и не ограничивают объема практического применения заявленной композиции.
В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к наборам, содержащим анти-МАбСАМ антитело или часть антитела согласно изобретению, или композицию, включающую такое антитело. Указанный набор, помимо антитела или композиции, может включать диагностические или терапевтические средства. Этот набор может также включать инструкции по осуществлению метода диагностики или терапии. В предпочтительном варианте этот набор включает антитело или содержащую его композицию и диагностическое средство, которые могут быть использованы в описанном ниже методе. В другом предпочтительном варианте изобретения указанный набор включает антитело или содержащую его композицию и один или несколько терапевтических средств, которые могут быть использованы в описанном ниже методе.
Генная терапия
Молекулы нуклеиновой кислоты согласно изобретению могут быть введены пациенту, нуждающемуся в этом, путем проведения генной терапии. Такая терапия может быть осуществлена ίη у1уо или ех У1уо. В предпочтительном варианте изобретения пациенту вводят молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие тяжелую цепь и легкую цепь. В более предпочтительном варианте изобретения молекулы нуклеиновой кислоты вводят так, чтобы они стабильно интегрировались в хромосомы В-клеток, поскольку эти клетки специализируются на продуцировании антител. В предпочтительном варианте изобретения В-клетки-предшественники трансфецируют или инфицируют ех у1уо и снова трансплантируют пациенту, нуждающемуся в этом. В другом варианте изобретения В-клетки-предшественники или другие клетки инфицируют ίη у1уо рекомбинантным вирусом, который, как известно, инфицирует клетки представляющего интерес типа. Типичными векторами, используемыми для генотерапии, являются липосомы, плазмиды и вирусные векторы. Примерами вирусных векторов являются ретровирусы, аденовирусы и аденоассоциированные вирусы. После инфицирования либо ίη у1уо, либо ех у1уо, может быть проведен мониторинг уровней экспрессии антитела путем взятия образца у пациента, подвергаемого лечению, и путем проведения любого иммуноанализа, известного специалистам или обсуждаемого в настоящей за
- 31 012872 явке.
В предпочтительном варианте изобретения способ генотерапии включает стадии введения выделенной молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей тяжелую цепь анти-МАбСАМ антитела или его антигенсвязывающую часть, и экспрессии этой молекулы нуклеиновой кислоты. В другом варианте изобретения, способ генотерапии включает стадии введения выделенной молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей легкую цепь анти-МАбСАМ антитела или его антигенсвязывающую часть, и экспрессии этой молекулы нуклеиновой кислоты. В более предпочтительном варианте изобретения способ генотерапии включает стадии введения выделенной молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей тяжелую цепь анти-МАбСАМ антитела согласно изобретению или его антигенсвязывающую часть, и выделенной молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей легкую цепь анти-МАбСАМ антитела согласно изобретению или его антигенсвязывающую часть, и экспрессии этих молекул нуклеиновой кислоты. Указанный способ генотерапии может также включать стадию введения другого противовоспалительного или иммуномодулирующего средства.
Диагностические способы
Анти-МАбСАМ антитела могут быть использованы для детекции МАбСАМ в биологическом образце ίη У1!то или ίη у1уо. Анти-МАбСАМ антитела могут быть использованы в стандартном иммуноанализе, включая, но не ограничиваясь ими, ЕЫ8А, РИА, РАС8, иммуногистохимический анализ ткани, Вестерн-блот-анализ или иммунопреципитацию. Анти-МАбСАМ антитела согласно изобретению могут быть использованы для детекции МАбСАМ у человека. В другом варианте изобретения анти-МАбСАМ антитела могут быть использованы для детекции МАбСАМ у приматов-мартышек, таких как собакоподобные обезьяны, макак-резус, шимпанзе и человекообразные обезьяны. Настоящее изобретение относится к способу детекции МАбСАМ в биологическом образце, включающему контактирование биологического образца с анти-МАбСАМ антителом согласно изобретению и детекцию антитела, связанного с МАбСАМ. В одном из вариантов изобретения анти-МАбСАМ антитело непосредственно дериватизируют детектируемой меткой. В другом варианте изобретения анти-МАбСАМ антитело (первое антитело) является немеченным, а второе антитело или другая молекула, которые могут связываться с указанным анти-МАбСАМ антителом, являются меченными. Как хорошо известно специалисту, второе антитело выбирают так, чтобы оно обладало способностью специфически связываться с первым антителом конкретного вида и класса. Так, например, если анти-МАбСАМ антителом является человеческий 1дС, то вторым антителом может быть антитело против человеческого 1дС. Другими молекулами, которые могут связываться с антителами, являются, но не ограничиваются ими, белок А и белок С, которые оба являются коммерчески доступными и поставляются, например, фирмой Р1егсе СНет1са1 Со.
Подходящие метки для антитела или второго антитела описаны выше, и такими метками являются различные ферменты, простетические группы, флуоресцентные вещества, люминесцентные вещества, магнитные вещества и радиоактивные вещества. Примерами подходящих ферментов являются пероксидаза хрена, щелочная фосфатаза, β-галактозидаза или ацетилхолинэстераза; примерами подходящих комплексов, содержащих простетические группы, являются стрептавидин/биотин и авидин/биотин; примерами подходящих флуоресцентных веществ являются умбеллиферон, флуоресцеин, флуоресцеинизотиоцианат, родамин, дихлортриазиниламин-флуоресцеин, данзилхлорид или фикоэритрин; примером люминесцентных веществ является люминол; примером магнитного вещества является гадолиний, а 125 131 35 3 примерами подходящих радиоактивных веществ являются I, I, 8 или Н.
В альтернативном варианте изобретения МАбСАМ может быть проанализирован в биологическом образце путем проведения конкурентного иммуноанализа с использованием МАбСАМ-стандартов, меченных детектируемым веществом, и немеченного анти-МАбСАМ антитела. В этом анализе биологический образец, меченные МАбСАМ-стандарты и анти-МАбСАМ антитело объединяют и определяют количество меченного МАбСАМ-стандарта, связанного с немеченным антителом. Количество МАбСАМ в биологическом образце обратно пропорционально количеству меченного МАбСАМ-стандарта, связанного с анти-МАбСАМ антителом.
Описанные выше иммуноанализы могут быть также применены в различных целях. В одном из вариантов изобретения анти-МАбСАМ антитела могут быть использованы для детекции МАбСАМ, присутствующего в клетках или в клеточной культуре. В предпочтительном варианте изобретения антиМАбСАМ антитела могут быть использованы для определения уровня экспрессии МАбСАМ на поверхности клеток после обработки этих клеток различными соединениями. Этот метод может быть применен для тестирования соединений, которые могут быть использованы для активации или ингибирования МАбСАМ. В этом методе один из образцов клеток обрабатывают тестируемым соединением в течение определенного периода времени, а другой образец оставляют необработанным, а затем определяют уровень экспрессии на поверхности клеток с помощью проточной цитометрии, иммугистохимического анализа, Вестерн-блот-анализа, ЕЬ18А или РИА. Кроме того, иммуноанализы могут быть масштабированы в целях проведения более высокоэффективного скрининга для тестирования большого числа соединений на активацию или ингибирование МАбСАМ.
Анти-МАбСАМ антитела согласно изобретению могут быть также использованы для определения уровней МАбСАМ в тканях или в клетках, происходящих от этой ткани. В предпочтительном варианте
- 32 012872 изобретения указанной тканью является патологическая ткань. В более предпочтительном варианте изобретения такой тканью является воспаленная ткань желудочно-кишечного тракта или ее биоптат. В предпочтительном варианте указанного способа ткань или ее биоптат могут быть взяты у пациента. Затем ткань или биоптат могут быть подвергнуты иммуноанализу для определения, например, уровней МАйСАМ, уровней МАйСАМ на клеточной поверхности или локализации МАйСАМ методами, обсуждаемыми выше. Этот метод может быть использован для того, чтобы определить, экспрессируется ли МАйСАМ в воспаленной ткани на высоком уровне.
Вышеописанный диагностический метод может быть использован для того, чтобы определить, экспрессируются ли в ткани высокие уровни МАйСАМ, что может служить показателем того, что такая ткань будет давать хороший ответ на лечение анти-МАйСАМ антителом. Кроме того, такой диагностический метод может быть также применен для того, чтобы определить, приводит ли лечение антиМАйСАМ антителом (см. ниже) к уменьшению уровней экспрессии МАйСАМ в ткани, и тем самым, установить, является ли такое лечение успешным.
Антитела согласно изобретению могут быть также использованы ίη у1уо для определения местоположения тканей и органов, в которых экспрессируется МАйСАМ. В предпочтительном варианте изобретения анти-МАйСАМ антитела могут быть использованы для определения местоположения воспаленной ткани. Преимущество анти-МАйСАМ антител согласно изобретению заключается в том, что они не приводят к вырабатыванию иммунного ответа после их введения. Такой метод включает стадии введения анти-МАйСАМ антитела или фармацевтической композиции, содержащей это антитело, пациенту, нуждающемуся в проведении такого диагностического теста, и проведения у пациента визуализирующего анализа, позволяющего определить местоположение МАйСАМ-экспрессирующих тканей. Визуализирующие анализы хорошо известны специалистам-медикам, и такими анализами являются, но не ограничиваются ими, рентгеновский анализ, гамма-сцинтиграфия, визуализация методом магнитного резонанса (МК1), позитронно-эмиссионная томография или компьютерная томография (КТ). В другом варианте этого способа у пациента берут биопсию для того, чтобы можно было без проведения визуализирующего анализа определить, экспрессируется ли МАйСАМ в представляющей интерес ткани, или нет. В предпочтительном варианте изобретения, анти-МАйСАМ антитела могут быть помечены детектируемым агентом, который может быть визуализирован у пациента. Так, например, антитело может быть помечено контрастирующим агентом, таким как барий, который может применяться в рентгеновском анализе, или магнитным контрастирующим агентом, таким как гадолиниевый хелатный комплекс, который может быть использован для МК! или КТ. Другими агентами для мечения являются, но не ограничиваются ими, радиоизотопы, такие как 99Тс. В другом варианте изобретения анти-МАйСАМ антитело может быть немеченным и может быть визуализировано путем введения второго антитела или другой молекулы, которые являются детектируемыми, и которые могут связываться с анти-МАйСАМ антителом.
Анти-МАйСАМ антитела согласно изобретению могут быть также использованы для определения уровней растворимого МАйСАМ, присутствующего в донорной крови, сыворотке, плазме или другой физиологической жидкости, включая, но не ограничиваясь ими, образцы кала, мочи, мокроты или биоптат. В предпочтительном варианте изобретения указанной физиологической жидкостью является плазма. Затем эту физиологическую жидкость используют в иммуноанализе для определения, например, уровней растворимого МАйСАМ. Растворимый МАйСАМ может служить маркером-заменителем, указывающим на развитие воспаления желудочно-кишечного тракта, и метод детекции такого маркера может быть применен в диагностическом анализе для оценки тяжести заболевания.
Вышеописанный диагностический метод может быть применен для того, чтобы определить, экспрессируются ли в ткани индивидуума высокие уровни растворимого МАйСАМ, что может служить показателем того, что такая ткань индивидуума будет давать хороший ответ на лечение заболевания антиМАйСАМ антителом. Кроме того, такой диагностический метод может быть также применен для того, чтобы определить, приводит ли лечение анти-МАйСАМ антителом (см. ниже) или другим фармацевтическим средством к уменьшению уровней экспрессии МАйСАМ у индивидуума, и тем самым установить, является ли такое лечение успешным.
Ингибирование а4р7/МАйСАМ-зависимой адгезии анти-МАйСАМ антителом
В другом варианте изобретения настоящее изобретение относится к анти-МАйСАМ антителу, которое связывается с МАйСАМ и ингибирует связывание и адгезию клеток, несущих а4в7-интегрин, с МАйСАМ и/или с другими когнатными лигандами, такими как Ь-селектин, с МАйСАМ. В предпочтительном варианте изобретения МАйСАМ представляет собой человеческий МАйСАМ и имеет растворимую форму или экспрессируется на поверхности клетки. В другом предпочтительном варианте изобретения указанным анти-МАйСАМ антителом является человеческое антитело. В другом варианте изобретения указанное антитело или его часть ингибирует связывание α4β7 с МАйСАМ с концентрацией ТС50, составляющей не более чем 50 нМ. В предпочтительном варианте изобретения, величина Ιί.'50 составляет не более, чем 5 нМ. В более предпочтительном варианте изобретения величина Ιί.'50 составляет менее, чем 5 нМ. В еще более предпочтительном варианте изобретения, величина Ιί.'50 составляет менее, чем 0,05 мкг/мл, 0,04 мкг/мл или 0,03 мкг/мл. В другом предпочтительном варианте изобретения величина
- 33 012872
1С50 составляет менее, чем 0,5 мкг/мл, 0,4 мкг/мл или 0,3 мкг/мл. Величина 1С50 может быть определена любым известным методом. Обычно величину 1С50 измеряют с помощью ЕЫ8А или анализа на адгезию. В предпочтительном варианте изобретения величину 1С50 измеряют в анализе на адгезию с использованием клеток или тканей, которые обычно экспрессируют МАбСАМ, или клеток или тканей, которые были сконструированы так, что они экспрессируют МАбСАМ.
Ингибирование рекрутинга лимфоцитов в лимфоидную ткань кишечника анти-МАйСАМ антителами
В другом варианте изобретения настоящее изобретение относится к анти-МАбСАМ антителу, которое связывается с нативно экспрессируемым МАбСАМ и ингибирует связывание лимфоцитов со специализированной лимфоидной тканью желудочно-кишечного тракта. В предпочтительном варианте изобретения нативно экспрессируемым МАбСАМ является МАбСАМ человека или приматов и имеет растворимую форму или экспрессируется на поверхности клетки. В другом предпочтительном варианте изобретения указанным анти-МАбСАМ антителом является человеческое антитело. В другом варианте изобретения, указанное антитело или его часть ингибирует рекрутинг α4β7 +-лимфоцитов, вызывающих трофические поражения кишечника, в ткани, экспрессирующие МАбСАМ, при концентрации 1С50, составляющей не более, чем 5 мг/кг. В предпочтительном варианте изобретения, величина 1С50 составляет не более, чем 1 мг/кг. В более предпочтительном варианте изобретения величина 1С50 составляет менее, чем 0,1 мг/кг. В одном из предпочтительных вариантов изобретения величина 1С50 может быть определена путем измерения отношения доза:эффект для рекрутинга меченных технецием лимфоцитов периферической крови в желудочно-кишечный тракт с помощью гамма-сцинтиграфии или однофотонной эмиссионной компьютерной томографии. В другом варианте изобретения величина 1С50 может быть определена путем измерения увеличения уровней α4β7 +-лимфоцитов, вызывающих трофические поражения кишечника, таких как, но не ограничивающихся ими, СЭ4', α,ιβ-'-Т-клетки памяти, в периферической крови, где такое измерение проводят с помощью проточной цитометрии в зависимости от дозы анти-МАбСАМ антитела.
Для лучшего понимания настоящего изобретения ниже представлены примеры его осуществления. Эти примеры приводятся лишь в иллюстративных целях и не рассматриваются как ограничение объема изобретения.
Пример 1. Генерирование гибридом, продуцирующих анти-МАбСАМ антитело
Антитела согласно изобретению получали, анализировали и отбирали, как описано в нижеследующем примере.
Получение первичного иммуногена
Для иммунизации мышей ХепоМоике™ были получены два иммуногена: (ί) гибридный белок МАбСАМ-Ес 1дС1 и (ίί) клеточные мембраны, полученные из клеток, стабильно трансфецированных антигеном МАбСАМ.
(ί) Гибридный белок МАбСАМ-Ес 1дО1
Конструирование экспрессионного вектора
ЕсоШ/ВдШ-фрагмент кДНК, кодирующий зрелый внеклеточный иммуноглобулин-подобный домен МАбСАМ, вырезали из клона ρΙΝΕΥ Шсу!^ (3279276) и клонировали в ЕсоК1/ВатН1-сайты вектора р1О1 (81ттоп5, Э.Ь. (1993), Се11и1аг Iиΐе^асΐ^ои8 ш Оеуе1ортеп1: А Ргасбса1 Арргоасб, еб. НагНеу Э.А. (ОхЕогб Ищу. Ргекк, ОхЕогб), рр.93-127)), в результате чего генерировали гибрид Ес 1дО1 в той же рамке считывания. Полученную вставку вырезали ферментами ЕсоКЛАоЙ и клонировали в рС^NА3.1+(Iиν^ΐ^одеи).
Затем подтверждали последовательность кДНК МАбСАМ-Ес 1дС1 в данном векторе. Аминокислотная последовательность гибридного белка МАбСАМ-Ес 1дС1 представлена ниже: Гибридный белок МАбСАМ-Ес 1§С1:
мррсьАъьгАаьъаьььаодБаукрьоУЕРРВРУУАУАЬвазЕоьтскхдсаркв АЗУоиквьптэьеАУозптекеуьтУвкАЯьеААОТйуаувзаавктронтуоьь УУАРРРОЬТУ8РААЬУРОО₽ЕУАСТАНКУТ₽УЕРИАЬ8ЕБЬЬУаООЕЬЕОА<2АЬ!3 РЕУОЕЕЕБЕРОетЖОУЬЕКУТЕКИЕЬРРХ.еТРУРРАЬТСОАТМКЬРОЬЕЬЗНКОА ΙΡνΧιΗ3ΡΤ3ΡΕΡΡϋΤΤ3ΡΕ8₽ϋΤΤ3ΡΕ8ΡΟΤΤ80ΕΡΡΙ>ΤΤ80Β₽₽Ι)ΤΤ30ΕΡΡϋΤ Т5РЕРРОКТ8РЕ₽АРОдВ8ТНТРКЗР<38ТКТККРЕ10РКЗСОКТНТСРРСРАРЕЬ ЬЗСРЗУРЕРР РКРКБТЬМ! ВКТРЕТТСУУТОУЗНЕОРЕУКРЫИУУОСЗУЕУНЫАКГ КРНЕЕС'ПТ5ТтаУУ8УЬТУЬНОВИШ<ЭКЕУКСКУЗЫКАЬРАР1ЕКТ1ВКАКОСРЕ ЕР0УУТЪРР81ШЕЬТКК0У8ЬТСЬУКОРУР8В1АУЕИЕ8Ш0РЕЫНУКАТРРУШ
5ПЗЗРРЬУ8КЬТУПК5КИ0дСЙП7РЗС8УМНЕАЬНКНУТ0КЗЬЗЬ8РаК (ЗЕО ГО N0: 107) .
Подчеркнуто: сигнальный пептид
Выделено жирным шрифтом: внеклеточный домен МАбСАМ
Экспрессия/очистка рекомбинантного белка
Клетки СНО-ЭНЕК трансфецировали вектором рС^NА3.1+, содержащим кДНК гибридного белка МАбСАМ-Ес Ι§6ι, и стабильные клоны, экспрессирующие гибридный белок МАбСАМ-Ес Ι§61, отбирали в среде Исков, содержащей 600 мкг/мл С418 и 100 нг/мл метотрексата. Для экспрессии белка в биоре
- 34 012872 актор из полого волокна высевали клетки СНО, стабильно экспрессирующие МАбСАМ-Ес 1цС|, в среду Исков, содержащую 10% фетальную бычью сыворотку с низким содержанием 1дС (01Ьсо), заменимые аминокислоты (01Ьсо), 2 мМ глутамина (01Ьсо), пируват натрия (01Ьсо), 100 мкг/мл 0418 и 100 нг/мл метотрексата, и использовали для получения концентрированного супернатанта среды. Гибридный белок МАбСАМ-Ес 1дО1 выделяли из собранного супернатанта с помощью аффинной хроматографии. Вкратце, супернатант наносили на колонку с белком 0-сефарозой Н1Тгар (5 мл, Рйатташа) (2 мл/мин) , промывали 25 мМ трис рН 8, 150 мМ №1С1 (5 колоночными объемами) и элюировали 100 мМ глицином, рН 2,5 (1 мл/мин), и полученные фракции сразу нейтрализовали добавлением 1М трис, рН 8, до достижения рН 7,5. Фракции, содержащие гибридный белок МАбСАМ-Ес 1дО1, идентифицировали с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ, объединяли и наносили на колонку с сефакрилом 8100 (РйаттаОа), предварительно, уравновешенную 35 мМ бис-трис, рН 6,5, 150 мМ №С1. Затем проводили гель-фильтрацию при 0,35 мл/мин, и собирали пик гибридного белка МАбСАМ-Ес 1дб примерно в 3 х 5 мл-фракциях. Эти образцы объединяли и наносили на колонку Кекоигсе О (6 мл, Рйаттааа), предварительно уравновешенную 35 мМ бис-трис, рН 6,5. Затем колонку промывали 5 колоночными объемами 35 мМ бис-трис, рН 6,5, 150 мМ №С1 (6 мл/мин), и гибридный белок МАбСАМ-Ес 1дО1 элюировали 35 мМ бис-трисом, рН 6,5, 400 мМ №С1, с получением 4-6 млфракции. На этой стадии, белок имел чистоту 90% и мигрировал в виде одной полосы приблизительно 68 кД, при электрофорезе в ДСН-ПААГ. В полученном материале для его использования в качестве иммуногена и во всех последующих анализах буфер заменяли на 25 мМ НЕРЕ8, рН 7,5, 1 мМ ЕЭТА. 1 мМ ДТТ, 100 мМ №С1, 50% глицерин и хранили в виде аликвот при -80°С.
(ίί) Клеточные мембраны, стабильно экспрессирующие МАбСАМ 8ас1^о!1-фрагмент, содержащий нуклеотиды 645-1222 опубликованной последовательности МАбСАМ (8йу)ап А.М. е! а1., I. 1ттипо1., 156, 2851-7 (1996)) подвергали ПЦР-амплификации из библиотеки кДНК толстой кишки и клонировали в 8асЖо!1-сайты вектора ρΙΝΏ-Нудго (1пуйтодеп). 8ас1-фрагмент, содержащий дополнительную 5'кодирующую последовательность, субклонировали в эту конструкцию, происходящую от плазмиды ρС^NΑ3.1, содержащей МАбСАМ-Ес 1дО1, и получали полноразмерную кДНК МАбСАМ. Затем Крп1/№П-фрагмент, содержащий кДНК МАбСАМ, клонировали в соответствующие сайты в векторе рЕЕ5ЕКТУ50АСАТ (1пуйтодеп) и удаляли САТ-кодирующую последовательность. Последовательность кДНК-вставки подтверждали и использовали в процедурах трансфекции в целях генерирования одиночных стабильно экспрессирующихся клонов в клетках Е1р1п ΝΙΗ 3Т3 (1пуйтодеп) с использованием рекомбиназы Е1р в соответствии с инструкциями производителя. Стабильно экспрессирующиеся клоны отбирали по их способности поддерживать уровень связывания с человеческой лимфобластоидной α4β7 +В-клеточной линией ΓΥ (Сйап В.М. е! а1., I. Вю1. Сйет., 267:8366-70 (1992)), как показано ниже. Стабильные клоны клеток СНО, экспрессирующих МАбСАМ, получали аналогичным образом с использованием Е1р1п-клеток СНО (1пуйтодеп).
МАбСАМ-экспрессирующие клетки Е1р1п ΝΙΗ 3Т3 культивировали в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла (01Ьсо), содержащей 2 мМ Ь-глутамина, 10% донорной телячьей сыворотки (01Ьсо) и 200 мкг/мл гигромицина В (1пуйтодеп), и размножали в роллер-флаконах. МАбСАМэкспрессирующие клетки Е1р1п СНО культивировали в среде Хэмса Е12/модифицированной по способу Дульбекко среде Игла (01Ьсо), содержащей 2 мМ Ь-глутамина, 10% донорной телячьей сыворотки (01Ьсо) и 350 мкг/мл гигромицина В (1пуйтодеп), и размножали в роллер-флаконах. Клетки собирали с использованием не-ферментного раствора для разделения клеток (81дта) и соскабливали со стенок путем промывки в забуференном фосфатом физиологическом растворе посредством центрифугирования. Клеточные мембраны получали из клеточного осадка в два раунда: политронной гомогенизации в 25 мМ бис-трис, рН 8, 10мМ МдС12, 0,015% (мас./об.) апротонина, 100 ед./мл бацитрацина и центрифугирования. Конечный клеточный осадок ресуспендировали в том же самом буфере, и 50 х 106 клеточных эквивалентов разделяли на аликвоты в пробирках Эппендорфа с толстыми стенками и центрифугировали при >100000 х д с получением осадка клеточных мембран для иммунизации мышей ХепоМоике. Супернатант отбрасывали, а мембраны хранили в пробирках Эппендорфа при -80°С вплоть до их использования. Подтверждение экспрессии белка в клеточных мембранах проводили с помощью электрофореза в ДСНПААГ и Вестерн-блот-анализа с использованием кроличьего антипептидного антитела, вырабатываемого против Ν-концевых остатков МАбСАМ ([С]-КРЬрУЕРРЕР).
Иммунизация и получение гибридомы
8-10-недельных мышей XЕNОМОυ8Е™ внутрибрюшинно или в подушечки задних лап иммунизировали очищенным рекомбинантным гибридным белком МАбСАМ-Ес 1дО1 (10 мкг/дозу/мышь) или клеточными мембранами, полученными из клеток СНО или №Н-3Т3, стабильно экспрессирующих МАбСАМ (10 х 106 клеток/дозу/мышь). Эту дозу повторно вводили от пяти до семи раз в течение 3-8 недель. За четыре дня до слияния клеток, мышам вводили последнюю инъекцию внеклеточного домена человеческого МАбСАМ в РВ8. Лимфоциты селезенки и лимфоузлов, взятые у иммунизованных мышей, подвергали слиянию с несекреторной клеточной линией миеломы Р3-Х63-Ад8.653, и клетки подвергали отбору на ГАТ-среде, как описано в литературе (Сайте & М11к!еш, Ме!йобк Епхуто1. 73:3-46 (1981). Была выделена и субклонирована панель гибридом, каждая из которых секретировала МАбСАМ
- 35 012872 специфические человеческие антитела 1дС2к и 1дС4к. Двенадцать субклонов гибридом, 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4 и 9.8.2, продуцирующих моноклональные антитела против МАбСАМ выделяли и детектировали с помощью описанных ниже анализов. Все родительские линии 1.7, 1.8, 6.14, 6.22, 6.34, 6.67, 6.73, 6.77, 7.16, 7.20, 7.26 и 9.8, из которых были субклонированы гибридомные линии 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4 или 9.8.2, обладали активностью против МАбСАМ.
Анализы ЕЫ8А
Детекцию антигенспецифических антител в мышиной сыворотке и в супернатанте гибридомы осуществляли с помощью ЕЫЗА, как описано в литературе (СоПдап е! а1., Иш! 2.1 Епхуте-Ппкеб 1ттипокогЬеп! аккаук, Сиггеп! Рго!осо1к ш 1ттипо1оду (1994)) с использованием гибридного белка МАбСАМЕс 1дС1 для захвата антител. Для животных, которые были иммунизованы гибридным белком МАбСАМЕс 1дС1, антитела скринировали на неспецифическую реактивность против человеческого 1дС1, и анализировали на способность связываться с Е1р1п-МАбСАМ-клетками СНО с помощью проточной цитометрии.
В предпочтительном анализе ЕЕ1ЗА, проводились нижеследующие процедуры.
ЕЕ1ЗА-планшеты сенсибилизировали в течение ночи при 4°С путем добавления в планшеты 100 мкл/лунку гибрида МАбСАМ-Ес 1дС1 (4,5 мкг/мл), содержащего буфер (100 мМ натрийкарбонатный/бикарбонатный буфер, рН 9,6). После инкубирования сенсибилизирующий буфер удаляли и планшет блокировали 200 мкл/лунку блокирующего буфера (5% ВЗА, 0,1% Твин-20 в забуференном фосфатом физиологическом растворе), а затем инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч. После этого блокирующий буфер удаляли и в течение 2 ч при комнатной температуре добавляли 50 мкл/лунку супернатанта гибридомы или другую сыворотку или супернатант (например, позитивный контроль). После инкубирования, планшет промывали РВЗ (3 х 100 мкл/лунку) и связывание тАЬ, продуцируемого гибридомой, детектировали с использованием ПХ-конъюгированных вторых антител (то есть, ПХконъюгированных мышиных антител против человеческого 1дС2, 1:1000 (ЗВ са!. № 9060-05), для антител 1дС2, или ПХ-конъюгированных мышиных антител против человеческого 1дС4, 1:1000 (2утеб Са!. № 3840) для антител 1дС4), разведенных в РВЗ. Планшеты инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч, промывали в РВЗ (3 х 100 мкл/лунку) и, наконец, проявляли 100 мкл ОРЭ (о-фенилендиамина (ЭЛКО З2405) + 5 мкл 30% Н2О2/12 мл). Планшеты оставляли для проявления на 10-20 мин, а затем реакцию прекращали добавлением 100 мкл 2М Н2ЗО4. Планшеты считывали при 490 нм.
Анализ на адгезию
Антитела, которые продемонстрировали связывание с гибридным белком МАбСАМ-Ес 1дС1, на что указывал ЕЕ1ЗА-анализ, оценивали на антагонистическую активность в анализах на адгезию с α4β7 +клетками ΕΥ, и с клетками СНО, экспрессирующими либо (ί) гибридный белок МАбСАМ-Ес 1§С1, либо (ίί) МАбСАМ.
(ί) Анализ гибрида МАбСАМ-Ес 1дС1
100 мкл 4,5 мкг/мл раствора очищенного гибридного белка МАбСАМ-Ес 1дС1 в РВЗ Дульбекко адсорбировали в 96-луночных черных планшетах с И-образным дном М1сгоГ1иог В (Эупех #7805) в течение ночи при 4°С. Планшеты, сенсибилизированные МАбСАМ, переворачивали и избыток жидкости удаляли, а затем блокировали при 37°С в течение по меньшей мере 1 ч в 10% ВЗА/РВЗ. В течение этого времени культивируемые клетки подсчитывали путем исключения трипановым синим (должно быть приблизительно 8 х 105 клеток/мл), и 20 х 106 клеток на аналитический планшет пипетировали в 50миллилитровую центрифужную пробирку. Клетки ΕΥ культивировали в среде КРМ1 1640 (С1Ьсо), содержащей 2 мМ Б-глутамина и 100% термоинактивированной фетальной бычьей сыворотки (МГе Тес1по1од1ек #10108-165), и высевали при 1-2 х 105/мл через каждые 2-3 дня для предотвращения дифференцировки культуры. Клетки два раза промывали средой КРМ1 1640 (С1Ьсо), содержащей 2 мМ Б-глутамина (С1Ьсо), путем центрифугирования (240 г), и конечный клеточный осадок ресуспендировали при 2 х 106 клеток/мл в КРМ1 1640 для загрузки кальцеина АМ. Кальцеин АМ (Мо1еси1аг ргоЬек #С-3099) добавляли к клеткам при разведении 1:200 в ДМСО (в конечной концентрации примерно 5 мкМ), и во время инкубирования (37°С в течение 30 мин) клетки защищали от прямого воздействия света. При проведении этой стадии инкубирования клеток тестируемые антитела разводили следующим образом: для тестирования разовой дозы антитела разводили до 3 мкг/мл (конечная концентрация 1 мкг/мл) в 0,1 мг/мл ВЗА (З1дта #А3059) в РВЗ; а для построения кривых 1С50, антитела разводили в 0,1 мг/мл ВЗА/РВЗ при наибольшей концентрации 3 мкг/мл (конечная концентрация 1 мкг/мл), после чего для всего планшета делали двойные разведения (в отношении 1:2). Последнюю лунку ряда использовали для определения общего связывания и при этом использовали 0,1 мг/мл ВЗА в РВЗ.
После блокирования содержимое из планшетов удаляли и в каждую лунку добавляли 50 мкл антител/контроля, а затем планшет инкубировали при 37°С в течение 20 мин. В это время, клетки ^Υ, нагруженные кальцеином, один раз промывали средой КРМ1 1640, содержащей 10% фетальную бычью сыворотку, и один раз промывали 1 мг/мл ВЗА/РВЗ путем центрифугирования, а затем конечный клеточный осадок ресуспендировали до 1 х 106/мл в 1 мг/мл ВЗА/РВЗ. В каждую лунку планшета с И-образным
- 36 012872 дном добавляли 100 мкл клеток, а затем этот планшет герметично закрывали, быстро центрифугировали (1000 об./мин, в течение 2 мин) и инкубировали при 37°С в течение 45 мин. По истечении этого времени планшеты промывали в аппарате для мойки планшетов 8ка1гоп и интенсивность флуоресценции измеряли на планшет-ридере \Уа11ас УШог2 1420 Ми1Е-1аЬе1 Кеабег (длина волны возбуждения λ485 нм, длина волны излучения λ535 нм, подсчет проводили с верхнего ряда на расстоянии 8 мм от дна планшета, в течение 0,1 с с нормальной апертурой излучения). Для каждой концентрации антитела, определяли процент адгезии, который выражали как процент максимальной флуоресцентной реакции в отсутствии любого антитела минус интенсивность флуоресценции, ассоциированной со неспецифическим связыванием. Величину 1С50 определяли как концентрацию анти-МАбСАМ антитела, при которой адгезивная реакция снижалась на 50% по сравнению с реакцией в отсутствии анти-МАбСАМ антитела. Антитела, которые способны ингибировать связывание клеток ΊΥ с гибридом МАбСАМ-Ес 1дС1 с величиной 1С50<0,1 мкг/мл, рассматривались как антитела, обладающие сильной антагонистической активностью, и были использованы в последующем анализе на адгезию клеток МАбСАМ-СНО. Все двенадцать тестируемых АЬ обнаруживали сильную антагонистическую активность (табл. 3). Моноклональные антитела 1.7.2, 1.8.2, 7.16.6, 7.20.5 и 7.26.4 были получены от линий дифференцировки 1дС2к, а моноклональные антитела 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1 и 9.8.2 были получены от линий дифференцировки 1дО4к.
(ίί) Анализ на адгезию клеток МАбСАМ-СН0
Клетки ΊΥ культивировали как описано выше. МАбСАМ-экспрессирующие клетки СНО генерировали с использованием конструкции кДНК МАбСАМ рЕЕ5ЕКТ и с использованием рекомбиназы Е1р (1пу11годеп), как описано выше. Одиночные стабильные клоны МАбСАМ-экспрессирующих клеток СНО отбирали по их способности поддерживать уровень адгезии и связывания кроличьего антипетидного антитела, вырабатываемого против №конца МАбСАМ, с клетками ΊΥ посредством проточной цитометрии, как описано выше. МАбСАМ-экспрессирующие клетки СНО культивировали через каждые 2-3 дня в среде ИМЕМ/Е12 (61Ьсо # 21331-020), содержащей 2 мМ Ь-глутамин, 10% фетальную бычью сыворотку (С1Ьсо) и 350 мкл/мл гигромицина В (1пуйгодеп) в отношении 1:5. Для проведения анализа на адгезию, МАбСАМ-экспрессирующие клетки СНО высевали при 4 х 104 клеток/лунку в 96-луночные черные планшеты с прозрачным дном (Соз!аг # 3904) в 200 мкл культуральной среды и культивировали в течение ночи при 37°С/5% С02.
На следующий день супернатант гибридомы или очищенное моноклональное антитело разводили в концентрации, начиная с 30 мкг/мл (эквивалентной конечной концентрации 10 мкг/мл), в 1 мг/мл В8А/РВ8, как описано выше. Содержимое планшетов с МАбСАМ-клетками СНО удаляли и в каждую лунку добавляли 50 мкл антител/контроля, а затем планшет инкубировали при 37°С в течение 20 мин. Последнюю лунку этого ряда использовали для определения общего связывания и при этом добавляли 0,1 мг/мл В8А в РВ8. Клетки ΊΥ, нагруженные кальцеином АМ, с конечной концентрацией 1 х 106/мл в 1 мг/мл В8А/РВ8, получали, как описано выше, и после 20-минутного инкубирования с антителом, в планшет добавляли 100 мкл клеток. Затем планшеты инкубировали при 37°С в течение 45 мин, а затем промывали в аппарате для мойки планшетов Тесап (Р\У 384) и интенсивность флуоресценции измеряли на планшет-ридере ^а11ас, как описано выше. Для каждой концентрации антитела определяли процент адгезии, который выражали как процент максимальной флуоресцентной реакции в отсутствии любого антитела минус степень флуоресценции, ассоциированной с неспецифическим связыванием. Антитела, которые были способны ингибировать связывание клеток 1Υ с МАбСАМ-экспрессирующими клетками СНО с величиной 1С50<0,1 мкг/мл, рассматривались как антитела, обладающие сильной антагонистической активностью. Как показано выше, величину 1С50 определяют как концентрацию анти-МАбСАМ антитела, при которой адгезивная реакция снижалась на 50% по сравнению с реакцией в отсутствии антиМАбСАМ антитела. Значения 1С50 для антител 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4 или 9.8.2 в этом анализе представлены ниже в табл. 3.
- 37 012872
Таблица 3. Величины 1С50 репрезентативных анти-МАбСАМ антител
Клон Среднее значение 1С.П для гибрида МАЗСАМ-Гс 1дС1 (мкг/мл) η Среднее значение 1С5о в анализе МАйСАМ-Г1р1п-клеток СНО (мкг/мл) η
1.7.2 1.8.2 7.16.6 7.20.5 7.26.4 6.7^.2* 5.77.г ? 0,030 + 0,011 6 0,027 + 0,011 4 0,019 + 0,009 7 0,025 + 0,027 7 0,021 + 0,040 4 0,011 + 0,005 ' 4 0,018 + 0,011 4 0,013 + 0,008 4 0,013 + 0,070 4 0,020 + 0,010 4 0,022 + 0,004 4 0,020 + 0,050 4 0,502 + 0,280 9 0,424 + 0,107 8 0,389 + 0,093 16 0,387 + 0,202 9 0,574 + 0,099 15 0,291 + 0,096 6 0,573 + 0,168 7 0,285 + 0,073 7 0,298 + 0,115 8 0,369 + 0,103 8 0,520 + 0,100 4 0,440 + 0,342 8
1дС2
Ж':
Для измерения антагонистической активности анти-МАбСАМ тАЬ в проточных анализах в условиях сдвигового напряжения созданные для имитации микроваскулярного окружения в верхнем эндотелии венул, которые служили в качестве лимфоидной ткани кишечника, клетки СНО, экспрессирующие МАбСАМ, высевали на стеклянные предметные стекла микроскопа (50 х 4 мм) и оставляли для слипания до образования конфлюентного монослоя (прибл. 2,5 х 105 клеток). Затем клетки инкубировали с аффинно-очищенным тАЬ в пределах концентраций (0,1-10 мкг/мл) в течение 20 мин при 37°С, а затем к планшету с клетками подсоединяли систему для проточного анализа. тАЬ, соответствующее изотипу 1дО2 или 1дО4, (10 мкг/мл) использовали в качестве негативного контроля. Лимфоциты периферической крови, взятые от нормального донора (ЛПК), подвергали перфузии на клеточном монослое в условиях постоянного сдвигового напряжения 0,05 Па. Эксперименты были визуализированы и была вычислена полная адгезия лимфоцитов (встряхивание + прочная адгезия). Все из тестируемых моноклональных антител обнаруживали сильную антагонистическую активность в описанных условиях.
(ΐϊϊ) Анализы Стэмпера-Вудрафа
Для визуализации МАбСАМ+-сосудов биотинилированные анти-МАбСАМ тАЬ генерировали исходя из 1-2 мг аффиноочищенного белка с использованием 20-молярного избытка биотин-N48 (Р1егсе) в забуференном фосфатом физиологическом растворе в соответствии с инструкциями производителя. Реакцию проводили при комнатной температуре (30 мин), реакционную смесь обессоливали на колонке с РЭ (РЬагтас1а) и определяли концентрацию белка.
Нормальные печеночные лимфоузлы удаляли из донорного органа, быстро замороженного в жидком азоте, и хранили при -70°С вплоть до использования. Затем приготавливали 10 мкм криосрезы, осушали воздухом на предметных стеклах, покрытых поли-Ь-лизином, и до проведения анализа фиксировали в ацетоне. Срезы блокировали с использованием блокирующей системы авидин-биотин (ПАКО), а затем инкубировали с биотинилированным анти-МАбСАМ тАЬ в пределах концентраций 1-50 мкг/мл при комнатной температуре (2 ч). тАЬ, соответствующее изотипу 1дО2 или 1дО4, (50 мкг/мл) использовали в качестве негативного контроля, а блокирующее анти-β- антитело (50 мкг/мл) использовали в качестве позитивного контроля.
Лимфоциты периферической крови, взятые от нормальных доноров (ЛПК), метили мышиным антителом против человеческих тАЬ (ПАКО) с последующей визуализацией прилипающих клеток. 5 х 105 ЛПК добавляли к каждому из срезов лимфоузлов и инкубировали в течение 30 мин, а затем слегка промывали во избежание отделения прилипших клеток. Затем срезы снова фиксировали в ацетоне, снова инкубировали с биотинилированным анти-МАбСАМ тАЬ (10 мкг/мл), а затем с биотинилированным козьим антимышиным тАЬ (для распознавания СП2-меченных ЛПК и неокрашенных МАбСАМ+сосудов), и наконец с комплексом стрептавидина и ПХ 81герАВсотр1ех/НКР (ПАКО). И наконец МабСАМ'-сосуды и СП2-меченные ЛПК визуализировали путем добавления к срезам субстрата ПАВ (ПАКО), при этом реакционный коричневый продукт указывал на участки позитивного окрашивания. Адгезию лимфоцитов количественно оценивали путем подсчета числа лимфоцитов, прилипших к 50 МАбСАМ+-сосудам портальных трактов, вен или синусоидов. Данные, выражаемые как средние величины, затем нормализовали на процент адгезии; при этом величины адгезии ЛПК в отсутствии антитела
- 38 012872 принимали за 100%. Эти данные были получены с использованием различных доноров, п=3, и различных доноров печеночных лимфоузлов. Репрезентативные данные для биотинилированных очищенных моноклональных антител 1.7.2 и 7.16.6 по сравнению с блокирующим анти-в7-антителом, используемым в качестве контроля, представлены на фиг. 4.
Анализ на селективность
УСАМ и фибронектин являются структурно родственными молекуле МАйСАМ и имеют последовательность, гомологичную последовательности МАйСАМ. Аффинно-очищенные анти-МАйСАМ тАЬ оценивали на МАйСАМ-специфичность путем определения их способности блокировать связывание а4в1+/а5в1+-Т-клеток 1игка1 (АТСС) с их когнатной клеточно-адгезивной молекулой. 100 мкл 4,5 мкг/мл раствора фрагмента, связывающегося с клетками, содержащими фибронектин (110 кД, Еигора ВюргойисЪ Ый, Са1. № ИВР4215-18) или УСАМ (Рапуега) в РВ8 Дульбекко, адсорбировали в 96-луночных черных планшетах с И-образным дном Мюгойиог В (Эупех #7805) в течение ночи при 4°С. Затем сенсибилизированные планшеты переворачивали и избыток жидкости удаляли, после чего их блокировали при 37°С в течение по меньшей мере 1 ч в 10% В8А/РВ8. В течение этого времени, культивируемые Тклетки 1игка1 подсчитывали путем исключения трипановым синим и к ним добавляли краситель кальцеин АМ, как описано выше для клеток ΊΥ. Тестируемые антитела разводили, начиная с наибольшей концентрации 10 мкг/мл, в 0,1 мг/мл В8А в РВ8. Последнюю лунку ряда использовали для определения общего связывания, и для этого использовали 0,1 мг/мл В8А в РВ8. Для блокирования взаимодействия а5в1/фибронектина использовали эхистатин, полученный в РВ8, при наибольшей концентрации 100 нМ (ВасЕет, Са1. № Н-9010). Для блокирования взаимодействия а4в1/УСАМ-1 использовали анти-СЭ106 тАЬ (клон 51-10С9, ВЭ РЕагттдеп Са1. № 555645), при наибольшей концентрации 1 мкг/мл.
После блокирования содержимое из планшетов удаляли, и в каждую лунку добавляли 50 мкл антител/контроля, а затем планшет инкубировали при 37°С в течение 20 мин. Затем клетки Т 1игка1, нагруженные кальцеином, один раз промывали, как описано ранее, и клеточный осадок ресуспендировали в 1 мг/мл В8А/РВ8 с получением конечной концентрации клеток 1 х 106/мл. В каждую лунку планшета с Иобразным дном добавляли 100 мкл клеток, после чего планшет герметично закрывали, быстро центрифугировали (1000 об./мин в течение 2 мин) и инкубировали при 37°С в течение 45 мин. По истечении этого времени планшеты промывали в аппарате для мойки планшетов 8ка1гоп и интенсивность флуоресценции измеряли на планшет-ридере Аа11ас УкЮг2 1420 Мц1й1аЬе1 Кеайег (длина волны возбуждения λ485 нм, длина волны излучения λ535 нм, подсчет проводили с верхнего ряда, на расстоянии 8 мм от дна планшета, в течение 0,1 с с нормальной апертурой излучения). Для каждой концентрации антитела степень ингибирования выражали, как проиллюстрировано ниже, в табл. 4 (незначительное ингибирование адгезии, *** полное ингибирование адгезии). Все репрезентативные тАЬ были сильными и селективными антагонистами МАйСАМ и обладали селективностью к МАйСАМ, которая значительно, более чем в 100 раз, превышала селективность к УСАМ-1 и фибронектину.
- 39 012872
Таблица 4. Сравнительная селективность анти-МАбСАМ антитела и других адгезивных молекул, таких как фибронектин и УСАМ-1, по отношению к МАбСАМ
Клон Анализ на ингибирование азР1/фибронектина (10 мкг/мл) Анализ на ингибирование α4βι/νθΑΜ (10 мкг/мл) Анализ на ингибирование α4β7/МАбСАМ (0,1 мкг/мл)
1.7.2 - . - 9г + Ά1
1.8.2 - + ★ ★
7.16.6 - ' - +· ★ ★
7.20.5 - - ***
7.26.4 ' - - * *
6. .14.2 - ***
НИ - - ★ Ά· +
М 2 - - * + *
Л 7.1* - - ★ +
6-23Л - - чк к к
РУ1· - * -к ★
0'2 Ч:; , * Мг к
1дС2
Гибридомы были депонированы в Европейской коллекции клеточных культур (ЕСАСС), Н.Р.А, САМК, Ройои Оо\уп, 8а11кЬигу, νί11κ1ίΐΐ 8Р4 016, 9 сентября 2003 со следующими регистрационными номерами:
Гибридома № депозита
1.7.2 03090901
1.8.2 03090902
6.14.2 03090903
6.22.2 03090904
6.34.2 03090905
6.67.1 03090906
6.73.2 03090907
6.77.1 03090908
7.16.6 03090909
7.20.5 03090910
7.26.4 03090911
9.8.2 03090912
Пример 2. Определение констант аффинности (Кб) полноразмерных человеческих моноклональных анти-МАбСАМ антител с помощью В1Асоге
Авторами настоящего изобретения были проведены измерения аффинности очищенных антител с помощью поверхностного плазмонного резонанса на устройстве В1Асоге™ 3000 в соответствии с протоколами производителей.
Протокол 1.
Для проведения кинетических анализов получали сенсорный чип СМ5 В1Асоге с нанесенными на его поверхность мышиными антителами против человеческого иммуноглобулина (1д62 и 1д64) рутинным методом присоединения аминов. Супернатанты гибридом 10-, 5- и 2-кратно разводили в буфере для электрофореза НВ8-Р (10 мМ НЕРЕ8, рН 7,4, 150 мМ №С1, 0,005% поверхностно-активного вещества Р20), содержащем 100 мкг/мл В8А и 10 мг/мл карбоксиметилдекстран, или использовали в чистом виде. Каждое тАЬ иммобилизовали на отдельной поверхности при контакте в течение 1 мин, и при 5минутной промывке для стабилизации базового уровня тАЬ. Затем на все поверхности в течение 1 мин инъецировали гибридный белок МАбСАМ-Рс 1д61 (141 нМ) с последующей 3-минутной диссоциацией. Полученные данные были нормализованы на количество антитела, иммобилизованного на каждой по
- 40 012872 верхности, и оценивали с помощью общего лэнгмюровского соответствия 1:1 с использованием простых моделей отклонения, имеющихся в компьютерной программе В^еуаШайоп, поставляемой ВМсоге.
Протокол 2.
Аффинно-очищенные тАЬ были иммобилизованы на декстрановом слое биосенсорного чипа СМ5 путем связывания с амином. Чипы получали с использованием ацетатного буфера, рН 4,5, в качестве иммобилизирующего буфера, при этом достигаемая плотность белка составляла 2,5-5,5 кВИ. Образцы гибридного белка МАйСАМ-Рс Ι§6; в буфере для электрофореза получали при концентрациях 0,2-55 нМ (раствор с концентрацией 0 нМ, содержащий лишь один буфер для электрофореза был включен как нулевой стандарт). Образцы рандомизировали и инъецировали в дубликатах в течение 3 мин каждый через 4 проточные кюветы с использованием НВ8-ЕР (10 мМ НЕРЕ8, рН 7,4, 150 мМ №С1, 3 мМ ЕЭТА, 0,005% поверхностно-активного вещества Р20) в качестве буфера для электрофореза. Для минимизации ограничений массового переноса использовали скорость потока 100 мкл/мин. Мониторинг диссоциации гибридного белка МАйСАМ-Рс Ι§6ι проводили в течение 180 мин, при этом поверхность регенерировали путем 6-секундных инъекций 25 мМ Н3РО4 (50 мкл/мин) или 10 мМ (6.22.2), 20 мМ (6.67.1, 6.73.2, 6.77.1) до 25 мМ (6.34.2) и 45 мМ (6.14.2) Να0Η и данные анализировали с использованием компьютерной программы ВМетакшПоп (ν3.1).
В табл. 5 представлены данные измерения аффинности для репрезентативных анти-МАйСАМ антител согласно изобретению.
Таблица 5. Определение констант аффинности, Кй, с помощью поверхностного плазмонного резонанса ВМсоге
1дС2
Протокол 1 Протокол 2
коп (1/мс) коГ1 (1/с) Κ0(ρΜ) (1/мс) ^οί£ (1/с) К0(рМ)
2,4 х 105 1 х КГ5 42 5,5 х 103 1,3 х 10 '7 23,6
2,9 х 105 1 х 105 35 1,8 х 105 2,3 х 10'5 128
1,5 х 106 2,2 х 10*6 1,5 2,9 х Ю5 1,4 х 1СГ6 4,8
4,5 х 105 1,9 х 10‘5 42,2 1, 6 х 105 1,2 х Ю5 75
9,6 х 105 2,6 х 10’1 271 1,5 х 105 1,2 х 1СГ5 80
1,3 х 105 1 х 10'5 7,7 5 х 105 <5 х 10’6 <10
1,5 х 10е 1,4 х 10~5 9,3 2,3 х 105 8,7 х 10’7 3,8
1,2 х 106 1,9 х 1О'Ь 15,8 3,3 х 105 <5 х 10’6 <15
5,9 х 106 1 х 10~5 17 2,4 х 105 <5 х 10'6 <20
1,4 х 105 1,3 х 10'4 93
1,5 х 106 1 х 10~5 6,7
2,3 х 106 2,3 х 10~4 100 4,4 х 105 1,4 х 10“5 32,5
Кинетические анализы показали, что антитела, полученные способами согласно изобретению, обладают высокой аффинностью и имеют высокие константы связывания с внеклеточным доменом МАйСАМ.
Пример 3. Идентификация селективности по отношению к эпитопу и видовая перекрестная реактивность анти-МАйСАМ антител
Антитела распознают поверхностные эпитопы на антигенах как области линейной (первичной) последовательности или структурной (вторичной) последовательности. Для того чтобы определить ландшафт функционального эпитопа для анти-МАйСАМ антител, проводили картирование эпитопа с помощью программы Ьиштех, картирование эпитопа с помощью программы Высоте и видовой иммуногистохимический анализ.
Картирование эпитопа с помощью программы Ьиштех
МхЫдб 2.3.4-конъюгированные сферы (Са1Ьюсйет М1 1427) присоединяли к первому неизвестному анти-МАйСАМ антителу. Авторы настоящего изобретения добавляли в лунки 96-луночного планшета для культивирования тканей 150 мкл первого неизвестного антитела при соответствующем разведении (0,1 мкг/мл, разведенного в гибридомной среде). Маточный раствор сфер осторожно встряхивали и разводили в супернатанте до концентрации 0,5 х 105 сфер/мл. Затем сферы инкубировали в супернатанте на шейкере в течение ночи в темноте при 4°С.
Каждую лунку 96-луночного микротитрационного фильтровального планшета (М1Шроге #
- 41 012872
МАВУШ250) предварительно смачивали добавлением 200 мкл промывочного буфера (РВ8. содержащего 0.05% твина-20) и содержимое удаляли путем отсасывания. Затем в фильтровальный планшет добавляли 50 мкл/лунку 0.5 χ 105 сфер/мл маточного раствора. и лунки промывали промывочным буфером (2 х 100 мкл/лунку). После этого добавляли 60 мкл/лунку антигена МАбСАМ-Ес ΙβΟ1. разведенного в гибридомной среде (0.1 мкг/мл). Затем планшеты сенсибилизировали и инкубировали при комнатной температуре при легком помешивании в течение одного часа. Лунки два раза промывали путем добавления 100 мкл/лунку промывочного буфера. а затем их содержимое отсасывали. После этого добавляли 60 мкл/лунку второго неизвестного анти-МАбСАМ антитела. разведенного в гибридомной среде (0.1 мкг/мл). Планшеты встряхивали при комнатной температуре в темноте в течение двух часов. Затем лунки два раза промывали путем добавления 100 мкл/лунку промывочного буфера. после чего содержимое лунок отсасывали. После этого добавляли 60 мкл/лунку биотинилированного МхЫдС 2.3.4 (0.5 мкг/мл). Планшеты встряхивали при комнатной температуре в темноте в течение 20 мин. Затем лунки два раза промывали путем добавления 100 мкл/лунку промывочного буфера. после чего содержимое лунок отсасывали. В каждую лунку добавляли 60 мкл 1 мкг/мл МхЫдС 2. 3. 4. конъюгированных со стрептавидином-ФЭ (Рйагтас1а # 554061) и разведенных в гибридомной среде. Планшеты встряхивали при комнатной температуре в темноте в течение одного часа. Затем лунки два раза промывали путем добавления 100 мкл/лунку промывочного буфера. после чего содержимое лунок отсасывали. Затем каждую лунку ресуспендировали в 80 мкл блокирующего буфера (РВ8. содержащего 0.5% альбумин бычьей сыворотки. 0.1% твина и 0.01% тимерозала). посредством осторожного пипетирования путем всасывания и выпуска среды в целях ресуспендирования сфер.
С использованием программы Ьиттех 100 и сопутствующих программ (Ьиттех® Согрогайои). планшеты считывали для определения интенсивности люминесценции. Исходя из полученных данных люминесценции для различных тестируемых анти-МАбСАМ антител. эти анти-МАбСАМ антитела классифицировали по их специфичности связывания. Анти-МАбСАМ антитела. которые были протестированы. соответствуют группе идентифицированных участков на эпитопе. представленных в табл. 8.
Картирование с помощью В1Асоге:
В методе. аналогичном методу. описанному выше. программа В1Асоге может быть также использована для определения уникальности данного эпитопа для анти-МАбСАМ антител. проиллюстрированных в настоящем изобретении. Девять клонов анти-МАбСАМ антител 6.22.2. 6.34.2. 6.67.1. 6.77.1. 7.20.5.
9.8.2. 1.7.2. 7.26.4 и 7.16.6 были иммобилизованы на декстрановом слое в отдельных проточных кюветах биосенсорного чипа СМ5 путем присоединения амина. В качестве буфера для иммобилизации использовали 10 мМ ацетатный буфер рН 4.5 (клоны 6.22.2. 6.34.2. 7.20.5. 9.8.2. 1.7.2. 7.26.4 и 7.16.6) или 10 мМ ацетатный буфер. рН 5.5 (клоны 6.67.1 и 6.77.1). Во всех случаях была достигнута плотность белка. составляющая примерно 3750 КИ. Дезактивацию непрореагировавших Ν-гидроксисукцинимидозфиров осуществляли с использованием 1 М гидрохлорида этаноламина. рН 8.5.
Гибридный белок МАбСАМ-Ес 1дС1 разводили до концентрации 1.5 мкг/мл (приблизительно 25 мМ) в буфере для электрофореза НВ8-ЕР (0.01 М НЕРЕ8. рН 7.4. 0.15М №С1. 3 мМ ЕИТА. 0.005% полисорбата 20). Затем это разведение инъецировали через первую проточную кювету в объеме 50 мкл со скоростью потока 5 мкл/мин. После завершения инъекции в ту же самую проточную кювету добавляли первое антитело в качестве зонда. Все тестируемые антитела разводили до концентрации примерно 20 мкг/мл в НВ8-ЕР. и также инъецировали в объеме 50 мкл со скоростью потока 5 мкл/мин. Если связывания тестируемого антитела не наблюдалось. то сразу инъецировали следующий тестируемый клон. Если связывание происходило. то сенсорную поверхность регенерировали для удаления гибридного белка МАбСАМ-Ес 1дС1 и тестируемого антитела. При этом были использованы различные растворы для регенерации в зависимости от иммобилизованного антитела и тестируемого антитела. Систематизированное описание условий регенерации приводится в табл. 6.
- 42 012872
Таблица 6. Систематизированные условия регенерации для картирования эпитопов с помощью ВТА^те
Иммобилированное антитело Удаляемые антитела-зонды Раствор для регенерации Объем инъекции
7.16.6 6.22.2 40 мМ фосфорная кислота 20 мкл
6.34.2 40 мМ фосфорная кислота 40 мкл
7.20.5 40 мМ фосфорная кислота 20 мкл
6.77.1 9.8.2 40 ММ фосфорная кислота 10 мкл
1.7.2 40 мМ фосфорная кислота 5 мкл
7.16.6 40 мМ фосфорная кислота 10 мкл
1.7.2 6.77.1 25 мМ фосфорная кислота 5 мкл
9.8.2 25 мМ фосфорная кислота 5 мкл
7.20.5 25 ММ фосфорная кислота 5 мкл
6.22.2 25 мМ фосфорная кислота 5 мкл
6.34.2 25 мМ гидроксида натрия 5 мкл
6.67.1 25 мМ гидроксида натрия 5 мкл
6.22.2 9.8.2 25 мМ гидроксида натрия 20 мкл
7.26.4 25 мМ гидроксида натрия 5 мкл
6.34.2 9.8.2 25 мМ гидроксида натрия 70 мкл
1.7.2 40 мМ гидроксида натрия 5 мкл
7.26.4 40 мМ гидроксида натрия 5 мкл
6.67.1 9.8.2 40 мМ гидроксида натрия 5 мкл
1.7.2 40 мМ гидроксида натрия 5 мкл
7.20.5 9.8.2 25 мМ фосфорная кислота 5 мкл
1.7.2 25 мМ фосфорная кислота 5 мкл
7.26.4 25 мМ фосфорная кислота 5 мкл
7.26.4 9.8.2 40 мМ гидроксида натрия 20 мкл
6.22.2 75 мМ фосфорная кислота 20 мкл
7.20.5 75 мМ фосфорная кислота 20 мкл
7.16.6 75 мМ фосфорная кислота 20 мкл
9.8.2 9.8.2 25 мМ фосфорная кислота 15 мкл
6.22.2 25 мМ фосфорная кислота 10 мкл
7.20.5 25 мМ фосфорная кислота 20 мкл
7.16.6 25 мМ фосфорная кислота 10 мкл
Во всех процедурах регенерации скорость потока составляла 50 мкл/мин
После регенерации гибридный белок МАйСАМ-Рс 1дС1 снова связывали, а затем инъецировали тестируемые антитела. Эти процедуры проводили до тех пор, пока вся панель клонов не была инъецирована на поверхность иммобилизованного антитела со связанным с гибридным белком МАйСАМ-Рс 1дС1. Для зондирования девятью тестируемыми клонами использовали новую проточную кювету с другим иммобилизованным антителом и связанным МАйСАМ. Анти-МАйСАМ антитела 1.7.2 и 1.8.2 распознавали один и тот же эпитоп для МАйСАМ, как и предполагалось, исходя из высокой гомологии первичных аминокислотных последовательностей их тяжелой цепи и легкой цепи каппа, 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 2, 4, 6, 8, соответственно. А поэтому, с помощью матрицы отклика ВТА^те оценивали только 1.7.2. В этом анализе, антитела 6.14.2 и 6.73.2 не использовались, а все остальные комбинации пар анти-МАйСАМ антител тестировали аналогичным способом. В качестве порогового значения между связыванием и отсутствием связывания был произвольно выбран уровень 100 ЯИ, а матрицу отклика (табл. 7) создавали на основе данных, полученных из наблюдений связывания.
- 43 012872
Таблица 7. Матрица отклика для картирования эпитопов В1Асоге
Иммобилизованное антитело.,. „ Второе антитело ’
6.22.2 | 6.34.2 6.67.1 6.77.1 7.20.5 9.8.2 1.73 736.4 7.16.6
6.22.2 ЖЖ - - - X X X X
=.· 6.34.2 ; - - X X X X
: ^6.67.11% - - X X - -
:-/6:77:1-/% - - X X - X
' .730.5/ΐ - - - сХх'ЛхОхк X X X X
- 9,8.2; X X X X X - X
‘ · 1.73: .. X X X X X X X
7.26.4 .' · X X - - X X й X
7Д&6 у X X - - X - - | 1
Матрица отклика для всех комбинаций пар антител; указывает на отсутствие связывания антитела-зонда; х указывает на наблюдаемое связывание (выше выбранного порогового уровня 100 ВИ).
Диагональ матрицы, представленной в табл. 7 (заштрихованной серым), соответствует данным связывания для идентичных пар зондов. Во всех случаях, за исключением двух клонов 7.16.6 и 9.8.2, антитела были самоблокирующимися. Антитела 7.16.6 и 9.8.2 не обнаруживали перекрестного конкурирования. Отсутствие самоблокирования может быть обусловлено тАЬ-индуцированным конформационным изменением в гибридном белке, которое допускает дополнительное связывание тАЬ со вторым сайтом на МАбСАМ-1дРе.
Классификация клонов, которые обладают аналогичной картиной реактивности, была проведена в соответствии по меньшей мере с шестью различными участками эпитопов, как показано на графике, представленном на фиг. 5.
Более точная идентификация последовательностей эпитопов, с которыми реагируют антиМАбСАМ антитело, может быть осуществлена любым из ряда методов, включая, но не ограничиваясь ими, Вестерн-блот-анализ массивов нанесенных пятнами пептидных библиотек (Вешеке е! а1., Сигг. Торхек ίη М1егоЬ1о1. амб Iттиηо1. 243:23-36 (1999), М. Рати1ок, Е.Ь. ХУтпаекег. С.Н. \Уоп§ ебк., 8ргтдегУег1ад, Вег1т), фаговое или бактериальное отображения экспрессионной библиотеки флагелина/ШС, или простого анализа МЛЬИРТОР фрагментов связанного белка после ограниченного протеолиза.
Иммуногистохимические анализы
ОСТ или залитые в сахарозу замороженные образцы ткани подвздошной кишки (пейеровы бляшки), мезентриальных лимфоузлов, селезенки, желудка, двенадцатиперстной кишки, тощей кишки и толстой кишки использовали в качестве позитивного контроля окрашивания на анти-МАбСЛМ тАЬк. Для окрашивания срезов человеческих тканей человеческими тАЬ 1дС2, генерировали биотинированные производные анти-МАбСАМ тАЬ. 10 мкм замороженных срезов тканей разрезали и наносили на предметные стекла, покрытые поли-Ь-лизином, после этого помещали непосредственно в 100% ацетон при 4°С (10 мин), а затем в метанол с 3% пероксидом водорода (10 мин), и между стадиями промывали РВ8. Эти предметные стекла блокировали биотиновой системой для блокирования (ИАКО еа!. № Х0590), затем инкубировали с первичным антителом (1:100-1:1000) в РВ8 (1 ч), промывали РВ8-твином 20 (0,05%), и связывание выявляли с помощью ПХ-стрептавидина (ВИ Β^оκс^еηсе еа!. № 550946, 30 мин) и субстрата ЭАВ (81дта еа!. № Ό5905). Для тАЬ 1дС4, использовали ПХ-конъюгированные вторые мышиные антитела против человеческого 1дС4 (2утеб Са!. № 3840). Предметные стекла подвергали контрастному окрашиванию реагентом гемалумом Мейера (1 мин), промывали, а затем помещали в ИРХ.
Аффинность связывания сравнивали в тканях животных различных видов (тканях мышей, крыс, кроликов, собак, свиней, собакоподобных обезьян и человека). Иммуногистохимичекий анализ не выявил какой-либо реактивности в тканях крыс, кроликов и свиней, а анализ, проводимый с помощью ЕЫ8А, не обнаруживал какой-либо перекрестной реактивности анти-МАбСАМ антител с рекомбинантным мышиным МАбСАМ. Данные, полученные для тканей человека, собакоподобной обезьяны и собаки, представлены ниже в табл. 8:
- 44 012872
Таблица 8. Характер перекрестной реактивности анти-МАбСАМ антител с ортологами МАбСАМ разных видов
Перекрестная реактивность
Связывание анти-МАбСАМ антитела со специализированными эндотелиальными структурами и лимфоидной тканью показано в заштрихованных участках, в соответствии с пояснением к таблице.
Идентификацию эпитета осуществляли на основе анализа эпитопов с помощью программы Ьитбиех, и для каждого антитела показан характер перекрестной реактивности с МАбСАМ. Данные картирования эпитопов в анализе Ьитбиех для анти-МАбСАМ антител 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2 и 6.77.1 (курсив) были получены из отдельных экспериментов, в отличие от экспериментов, проводимых для 1.7.2, 1.8.2, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4 и 9.8.2 (жирный шрифт), как показано различными шрифтами.
Все тестируемые анти-МАбСАМ антитела обладали способностью распознавать человеческий эпитоп МАбСАМ, экспрессируемый на участках сосудистого эндотелия желудочно-кишечного тракта. Кроме антител 1.7.2 и 1.8.2, все остальные тестируемые анти-МАбСАМ антитела обладали способностью специфически связываться с участками сосудистого эндотелия желудочно-кишечного тракта собакоподобных обезьян. Некоторые другие анти-МАбСАМ антитела, а именно 6.14.2 и 6.67.1, обладали способностью к специфическому распознаванию ортолога МАбСАМ собак, а также МАбСАМ собакоподобных обезьян.
Генерирование клеточных линий СНО, экспрессирующих функционально активный химерный МАйСАМ собакоподобных обезьян/человека
Различия в аффинности связывания некоторых анти-МАбСАМ антител против МАбСАМ человека и собакоподобных обезьян позволяют определить, может ли такое наблюдение быть сделано на основе структуры антитела.
Исходя из опубликованной аминокислотной последовательности для МАбСАМ макака. (8йу_)аи А.М. е! а1., 1. 1ттиио1., 156, 2851-7 (1996)) конструировали праймеры для ПЦР-амплификации последовательности а4в7-связывающего домена МАбСАМсобакоподобных обезьян. Общую РНК получали из замороженных срезов мезентриальных лимфоузлов (прибл. 200 мг) с использованием Тризола (биуббтодеи) в соответствии с инструкциями производителей. 1-2 мкг о1бдо-бТ подвергали праймированию и обратной транскрипции с использованием обратной транскриптазы АМУ (Рготеда). Часть продукта обратной транскрипции подвергали ПЦР с использованием прямого праймера 5'-АСС АТС САТ ССС ССС СТС ССС-3' (8ЕО ΙΌ N0:67) и обратного праймера 5'-СТС САС САС ССС САТ ССС СТС-3' (8ЕО ΙΌ N0:68) и с использованием СС-2-полимеразы в 1М растворе СС (С1ои!ес1) при температуре отжига 62°С. ОТ-ПЦР-продукт соответствующего размера вырезали и выделяли из 1% агарозного геля после электрофореза, а затем клонировали в ТОРО-ТА (биуббтодеи) между ЕсоЯб-сайтами рСЯ2.1. После этого подтверждали последовательность вставки. Нуклеотидная последовательность и предсказанная транслированная аминокислотная последовательности представлены в 8Е0 ΙΌ N0:49 и 50, соответственно.
При выравнивании предсказанных аминокислотных последовательностей а4в7-связывающих доменов МАбСАМ человека и собакоподобной обезьяны была выявлена высокая степень идентичности этих последовательностей (90,8%)(на фиг. 3 представлено выравнивание этих последовательностей). Для генерирования функционально активной МАбСАМ-экспрессирующей клеточной линии собакоподобной обезьяны, которая имитирует картину связывания анти-МАбСАМ антитела, представленную в таблице 8, 8асб-фрагмент, соответствующий последовательности а4в7-связывающего домена в рСЯ2.1, субклониро- 45 012872 вали непосредственно в конструкцию рШЭ-Нудго с С-концевым человеческим МАйСАМ, содержащую карбоксиконцевой муциновый ствол и трансмембранный домен, описанный выше. Затем подтверждали последовательность и ориентацию, после чего КрПЖоб-фрагмент клонировали в вектор рЕР5РЯТУ56\САТ ЦпуЦтодсп), удаляли САТ-кодирующую последовательность, и эту конструкцию использовали в процедурах трансфекции для генерирования отдельных стабильно экспрессирующихся клонов в клетках Ρ1ρΙη-0Η0 (ЧпуЦгодсп) в соответствии с инструкциями производителя.
Связывание клонов анти-МАйСАМ антитела с клетками СНО, экспрессирующими химерный МАйСАМ собакоподобных обезьян/человека, оценивали с помощью проточной цитометрии и функциональную активность анти-МАйСАМ антител определяли с помощью анализа на адгезию, почти аналогичного анализу, который был проведен для клеток ΣΥ, как описано выше. Связывание и функциональная активность анти-МАйСАМ антител представлены в табл. 9.
Таблица 9. Корреляция между функциональной активностью в анализе на адгезию МАйСАМэкспрессирующих клеток СН0/1У собакоподобных обезьян/человека и связыванием МАйСАМэкспрессирующих клеток СНО собакоподобных обезьян/человека, определенная с помощью РАС8 для ряда анти-МАйСАМ антител клон
ТлТ
1.8.2
7.16.6
7.26.5
7.26.4
Функциональная
1СМ (МКГ/МЛ) неактивный неактивный
0.72
0.62
0.96
0.53
0.83
0.47
0.75 неактивный
0.64
0.83 человек
Связываний, определяемое о помощью РАСЗ собакоподобная обезьяна/чеповек
В целом, эти данные указывают на хорошую корреляцию между способностью данного антиМАйСАМ антитела связываться с человеческим МАйСАМ или МАйСАМ собакоподобных обезьян, как было установлено с помощью иммуногистохимического анализа (табл. 8) на связывание с рекомбинантными клетками, и функциональной активностью (табл. 9). Так, например, анти-МАйСАМ антитела 1.7.2,
1.8.2, 6.73.2 продемонстрировали стабильное отсутствие связывания с тканями и клетками, экспрессирующими химерный белок МАйСАМ собакоподобных обезьян/человека. Анти-МАйСАМ антитела 1.7.2,
1.8.2, 6.73.2 также не обнаруживали функциональную блокирующую активность в анализе на адгезию МАйСАМ-экспрессирующих ΣΥ собакоподобных обезьян/человека.
Аналогичные методы могут быть использованы для определения эпитопа для анти-МАйСАМ антител 6.14.2 и 6.67.1, которые распознают собачий МАйСАМ.
Пример 4. Применение анти-МАйСАМ тАЬ для детекции циркулирующего растворимого МАйСАМ как метода диагностики заболевания
Анти-МАйСАМ антитела могут быть использованы для детекции циркулирующего растворимого МАйСАМ (^МАйСАМ). Присутствие ^МАйСАМ в клинической плазме, в пробах сыворотки или в другой биологической жидкости, такой как, но не ограничивающейся ими, кал, моча и мокрота, вероятно, может служить подходящей заменой биологическому маркеру, как показателю наличия ассоциированного с ним заболевания, включая, но не ограничиваясь им, воспалительного заболевания кишечника.
Исходя из данных картирования эпитопов (табл. 7 и 8), очевидно, что анти-МАйСАМ антитела 1.7.2 и 7.16.6, распознают различные эпитопы на человеческом МАйСАМ. ЕЫЗА-планшеты сенсибилизировали в течение ночи при 4°С 100 мкл/лунку 50 мкг/мл раствора антитела 1.7.2 в забуференном фосфатом физиологическом растворе (РВ8). После инкубирования планшет блокировали в течение 1,5 ч блокирующим буфером РВ8, содержащим 10% молоко (200 мкл/лунку). После инкубирования, планшет промывали РВ8 (2 х 100 мкл/лунку), и в этот планшет добавляли серийные разведения гибридного белка МАйСАМЧдСВРс, начиная с наибольшей концентрации 50 мкг/мл до примерно 5 нг/мл в РВ8 с получением конечного объема 100 мкл, и инкубировали в течение 2 ч при комнатной температуре. В аналогичном методе белок МАйСАМЧдСВРс может быть разведен в плазме или в сыворотке, либо в какой-либо
- 46 012872 другой соответствующей биологической жидкости, а затем использован для определения уровня экспрессии растворимого МАбСАМ в клиническом образце, как описано ниже. В качестве негативного контроля, в лунки, содержащие первое анти-МАбСАМ антитело, добавляли только буфер. После этого, планшет промывали РВЗ (3 х 100 мкл/лунку), а затем инкубировали в темноте с антителом 7.16.6, меченным А1еха-488 (100 мкл, 5 мкг/мл). Антитело 7.16.6, меченное А1еха-488, получали с использованием коммерчески доступного набора (Мо1еси1аг РгоЬек, А-20181) в соответствии с протоколами производителей.
Планшет промывали РВЗ, содержащим 0,05% Твина-20, и уровень связывания меченного 7.16.6 с захваченным растворимым МАбСАМ определяли путем измерения интенсивности флуоресценции (на планшет-ридере Аа11ас У1с!ог2 1420 Ми1б1аЬе1 Кеабег, длина волны возбуждения λ485 нм, длина волны излучения λ535 нм, подсчет проводили с верхнего ряда, на расстоянии 3 мм от дна планшета, в течение 0,1 с с нормальной апертурой излучения). Если флуоресценция представляет собой зависимость от концентрации гибридного белка МАбСАМ-1дС1-Ес, показанную на фиг. 6, то это означает, что антитело
1.7.2 и меченное антитело 7.16.6 могут быть использованы для диагностики заболевания в целях определения уровня циркулирующего растворимого МАбСАМ, экспрессируемого в биологической жидкости или в клиническом образце. Этот сэндвич-ЕЫЗА-анализ не ограничивается использованием антител
1.7.2 и 7.16.6, и может быть использована любая комбинация анти-МАбСАМ антител, которые распознают различные эпитопы на МАбСАМ, на что указывают данные и интерпретация табл. 7 и фиг. 5. Аналогичные стратегии могут применяться для разработки аналогичных анализов, таких как иммуногистохимический анализ и Вестерн-блот-анализ, с использованием других описанных анти-МАбСАМ антител и различных партнеров, вариантов, меток и т. п.
Пример 5. Аминокислотная структура анти-МАбСАМ тАЬ, полученных в соответствии с настоящим изобретением
Ниже обсуждаются структурные данные, относящиеся к анти-МАбСАМ тАЬ, полученным способами согласно изобретению.
Для анализа структур тАЬ, продуцированных в соответствии с настоящим изобретением, авторами настоящего изобретения были клонированы гены, кодирующие фрагменты тяжелой и легкой цепей, из специфического гибридомного клона. Клонирование и секвестрование генов проводили следующим образом:
Ро1у(А)+мРНК выделяли приблизительно из 2 х 105 гибридомных клеток, происходящих от иммунизованных мышей ХепоМоике с использованием набора Еак!-Тгаск (бкЦгодеп). Генерирование произвольно праймированной кДНК осуществляли с помощью ПЦР. Праймеры, специфические для семейства человечесих УН или Ук (Магкк е! а1., Ойдопис1еоббе рбтегк Гог ро1утегаке сйат геасбоп атрййсабоп оГ йитап 1ттипод1оЬи1ш уапаЫе депеке апб бебдп оГ Гатйу-кресШс ойдопис1еоббе ргоЬек, Еиг. 1. 1ттипо1., 21, 985-991 (1991)) или универсальный праймер человеческой области УН, МС-30 (5'-САС СТС САС СТС САС САС ТС1 СС-3 (ЗЕС ΙΌ NО:108), были использованы в комбинации с праймерами, специфичными к человеческой С/2, МС40-б (5'-ССТ САС ССА СТА САС ТСС ТСА ССА-3 (ЗЕО ΙΌ N0:109), константной области Сγ4, МС-40б (5'-ССТ САС ССА СТА САС ТСС ТСА ССА СТС Т-3 (ЗЕО Ш N0:110) или константной области Ск (йкР2; как описано ранее у Сгееп е! а1., 1994). Последовательности транскриптов тяжелой цепи и каппа-цепи, происходящих от человеческого тАЬ и выделенных из гибридом, получали путем прямого секвенирования ПЦР-продуктов, продуцированных из поли(А+)-РНК с использованием праймеров, описанных выше. ПЦР-продукты клонировали в рСК2.1 с использованием набора для клонирования ТОРО-ТА (^йгодеп) и обе цепи секвенировали с использованием наборов для секвенирования с обрывом цепи красителем Рбкт, и с помощью устройства для секвенирования АВ1 377. Все последовательности анализировали путем выравнивания с последовательностями каталога У ВАЗЕ (Тотйпкоп е! а1., б. Мо1. Вю1. 227, 776-798 (1992); Нит. Мо1. Сепе!. 3, 853-860 (1994); ЕМВОЭ., 14, 4628-4638 (1995)).
Затем каждое из антител, а именно, 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-тоб, 6.34.2-тоб, 6.67.1-тоб, 6.77.1-тоб и 7.26.4-тоб, подвергали секвенированию на его полноразмерную ДНК. Для этого, всю РНК выделяли приблизительно из 3-6 х 106 гибридомных клеток с использованием набора К№аку кй (О|адеп). мРНК подвергали обратной транскрипции с использованием ойдо-бТ и системы обратной транскриптазы на основе АМУ (Рготеда). Для конструирования 5'-специфических праймеров для амплификации, содержащих оптимальную последовательность Козака и инициирующий кодон АТС (подчеркнут), и 3'-обратных праймеров для специфической тяжелой цепи и легкой каппа-цепи использовали У ВАЗЕ, как показано в табл. 10.
- 47 012872
Таблица 10. Пары ПЦР-праймеров для амплификации кДНК из гибридом, экспрессирующих антиМАбСАМ тАЬ и праймеры, используемые для конструирования модифицированных вариантов антиМАбСАМ антител ^ Л ^Олигонуклеотидная последовательность , *ΐ?· т ·.· ·’· *· .Г' ν •,'-’.νξ/.Τ·». ί νΗ1-1Β
УНЗ-15
УНЗ-21
УНЗ-23
ΥΗ3-30
ΥΗ3-33
ΥΗ4-4
АЗ/ЛЗ
Α26
012
013
5' ТАТСТААОСТТСТАЗАСТСа^ОТССАССАТООАС^^
70)
71) - ' ТАТСТАА(ЮТГСТА0АСТСвАаСаССАССАТВСААСТСаа5СТССвСГСССТТ
72)
6' 7АТСТААССТТСТАВА<ЛХ20АаССССАС(ЛтеОАХЛТТТЭЕ<ЗСТОАаСГгаетГГГ
73)
5' ТАТСТААаСГТТСТАСАСТС<ЗАЙС6ССАССАТС(ЗАаТТТ<ЗеаСТСАССТСССТТ
74)
5* ТАТСТААЗСТТСТА<ЗАСТСОА<ЗСОССАССАТ<ЗаА<ЗТТТ<ЗОССТЕАОСТ{За(УГГ
75)
5' ТАТСТААЛСТТС1АаАСТОЗА<ЗОТССАССАТОАААСАССтаТС5ТТСТТССТС
75)________________________________________________________________
5' ТАТСТААССТТ^АОАССС<ХЮООССАССАТСАааСТССеГОСТСАвСТССТО
77)
5* ТАТС7АА0СТТСтааАСС«ЮасеСТЖСаАТВТТСССЛТСАСЛАСТСАТТВСа 7В)
5' ТАТСТААаСТТСТАСАСССЭСОСОССАССАТВОТаТТССЗЮАССаАееТСТТС
73)
5* ТАТСТААОСГГСТА0АССаЗвСаЗССАССЛ1Х№САТаАСОСТССССаСТСА<3
80)
5' ТАТСТАА0СТТСТЛОАССС®ЮССССАССАТ®ЗАСАТСАО®ЗТСССТОСТСАО
3'
3'
3'
3'
3'
3'
3'
3'
3·
3’
3’ [380 (8ВД
18ВЧ (3Ε0 (8Ε0 (3Ε0 (3Ε5
ΟΕΟ (5Ε® <8Β0 (3ΒΟ (8Β0
ΙΟ
ГО
ΙΟ
ГО
ГО
ГО
ГО
НО:
ΗΟι но»
ΗΟι
ΗΟι
ΝΟ:
ΗΟι
ГО ΗΟι
ΙΟ ΗΟι
ΙΟ-ΗΟι
ГО ΗΟι
ΙΟ НО:
- 48 012872
λ 7 ’ л &/· -золигонуклвотидная ПОСЛеДОва|^Л|ЬНрСТОД;;>7 ; · \
81) '
Кег1д32 Еву1д34 ЕеуКарра 5' ТТСГСТОАТСАВААТТССТАТСАТГТАСССОДАСАСАОааАСАВ 3’ (2Κ0 10 ΝΟι ВЗ) 5* ТТСГГТСАТСАСААТТСТСАСТААСАСТСТССССТеТТОААСС 3' (330 ТО N01 83) 5' ТТСТСтаЛТСАеААТДХСТЛТСАТТТАСССАС^ 3' (ЗВД ТО ΝΟι 84}
6.22.2УК_Р1 б, 22.2УК_К1 в. 22.2УН_У1 6.22.2УН_К1 6.32.2УНСВ* 5* -ОДА ТСТ ВОД АСА ВАТ ТТС ЯСС СТС АСС АТС ЯХТ АЗС СИ) САА ОС-31 (830 ТО ΝΟι 85) 5' -ЗСТ ТСС ЛСД СТА ТТС АТС ОТО АВВ СТС АЛА ТСТ СТС ССА ВАТ СС-3* (8®2 ТО ΝΟι 66) 5'-ССА ССС ТСТ ОДА ТТС АСС ТТС АВТ АОС-3* (880 ТО N01 87) 5'-ССТ АСТ ВАЛ СОТ САЛ ТСС АСА СТС Т6С-3' (380 ТО ΝΟι 88) 5'-СОД АСС ТСС ТТС ТАВ АЗС ЛСД СОД-3' (880 ТО ΝΟι 89}
6.34.2УК_Р1 6.34.2УХ_Е1 6.3«.2УХ_Е2 6.34.2УХ_ПЭ 6.34. 2УН_Р16.34 . 2УН К1 5' -ССА АСТ САС АОТ АТТ АСТ АСС ТАТ ТТА ААТ ТСС ТАТ САЗ САС ААА СС3* (980 ТО N01 90} 5* -СОТ ТТС ТСС ТВА ТАС САА ТТТ ААА ТАВ СТА СТА АТА СТС ТВА СТТ СС3'(580 ТО N01 91) 5'-ССА ТСА ОТТ СТС ТСС ААС СМ АОД АТТ ТТС САА СТТ АСТ АСТ ВТС АСС3' (980 ТО ΝΟι 92) 5' -ЗСТ САС АОТ АОТ ААС ТТС САА ААТ ССТ САС СТТ ССА САС ААС ТСА ТСО3' (ЗЕО ТО МО: 93) ’ 5'-ССА ААТ САА САС ССТ СОД С6С ТСА ОСА САС С-3' (ЕВД ΙΟ ΝΟι 94) 5*-СОТ СТС СТС АВС ССТ САВ ССТ СТТ САТ ТТС С-3' (ЭВО ТО НО: 95)
6.67.1УК_Р1 6.67.ΐνΧ_Η1 6.«7.1УН_Р1 6.«7.1УН_К1 6,«7,ΐνΗ Св* 5' -САА ТАА САА СТА СТТ АСС ТТО ОТА ССА АСА ОАА АСС АОД АСА ОСС3'(880 ТО N0: 96) з'-аас тот ест зет ттс тот тод тас саа ост аас тле ттс тта ттс-э· (зео ТО НО» 97) 5'-ССС ТСА ЗСС СТС ОАО ТСА ССА ТОТ САС ТАС АСА ССТ ССА АСА АСС-3* (ЗЕО ΙΟ ΝΟι ЭВ) 5'-СОТ ТСТ ТОД АСТ ТОТ СТА ста АСА ТОД ТСА СТС ВАС ССС ТВА ВОД-3' (ЗЕО ТО »01 99) 5'-АТТ СТА ВАС САС ССС вСС АОД-3' (ЗВО 10 N0: 100)
6.77. ΐνΚ_Ρ1 6.77. ΐνΚ_Κ1 6.77. ΐνΚ_Ρ2 6.77. ΐνΚ_Κ3 5’-ССА ТСТ ССТ ССА АОТ СТА СТС АСА ОСС ТСС-3* (ЗЕО ТО ΝΟι 101) 5'-В0А вас ТСТ ВАС ТАС АСТ ТСС АОД АЗА ТЗС-З' (880 ТО N01 102) 5'-ОСТ ТТЛ ТТА СТС САТ 6СА ЛАЯ ТАТ АСА ЗСТ ТАТ СТС САС ТТТ ТОО СС 3' (ЗЕО ТО N0; 103} 5' -ОСС САА ААС ТОД АСА ТАА ССТ ОТА ТАС ТТТ ОСА ТСС АВТ ААТ ААА СС 3' (980 ТО ΝΟι 104) *
7.26.4Κ 81 5'-ССТ ОСА АОТ СТА СТС АЗА ССС ТСС-3' (8В0 ТО НО( 103)
7.26.4Κ Κ1 9'-ОДА ОДС ТСТ ВАС ТАЗ АСТ ТСС АОД-3* (ЗЕО ΙΟ »0: 106)
Указанные пары праймеров использовали для амплификации кДНК с применением полимеразы Тад (Ехрапб Ηί§1 Е1бе1йу Тад ро1утегаэе. Косйе). и ПЦР-продукты клонировали в вектор рСК2.1 ТОРО-ТА (1пуйгодеп) для последующего секвенирования. Затем клоны с подтвержденными последовательностями тяжелой цепи и легкой цепи каппа клонировали в векторы рЕЕ6.1 и рЕЕ12.1 (ΕΟΝΖΛ) с использованием ХЬа.1/ЕсоК1 и НтбШ/ЕсоШ-сайтов. соответственно.
Анализ на использование генов
В табл. 11 проиллюстрировано использование генов тяжелой цепи и легкой цепи каппа для каждой гибридомы. описанной в настоящем изобретении.
- 49 012872
Таблица 11. Использование генов тяжелой цепи и легкой цепи каппа
КЛОН ТЯЖЕЛАЯ ЦЕПЬ Легкая цепь каппа
νΗ I 0 Ι 4Η Ук
1.7.2 УНЗ-15 06-19 Ж4Ь АЗ Ж5
1.8.2 УНЗ-15 06-19 4Н4Ь АЗ Ж5
7.16.6 УН1-18 06-6 Л46Ь А2 Ж1
7.20.5 УН4-4 03-10 ^6Ь АЗ Ж4
7.26.4 УН1-18 06-6 Л6Ь А2 Ж1
УНЗ-23 05-5 ΰΗ4Ρ 012 Ж5
УНЗ-ЗЗ 05-12 ЛВЬ А26 Ж4
УНЗ-ЗО 04-23 Л6Ь 012 ЖЗ
УН4-4 03-10 ЛН4Ь ВЗ Ж4
УНЗ-23 05-19 2Н6Ь 012 ΛΚ2
УНЗ-21 06-19 Л46Ь А2 Ж2
5Γ/9;8δΐ.-·’ УНЗ-ЗЗ 03-10 0Г 03-16 л-мь 016 Ж5
1д(32
Анализ последовательностей
Для дополнительной оценки структуры антитела предсказанные аминокислотные последовательности антител получали из кДНК, выделенных из клонов.
Последовательности с идентификационными номерами (8Е0 ΙΌ N0:) 1-48 и 51-68 представляют нуклеотидные и аминокислотные последовательности тяжелой цепи и легкой цепи каппа анти-МАйСАМ антител 1.7.2 (8ЕО ΙΌ N0:1-4), 1.8.2 (8ЕО ΙΌ N0:5-8), 6.14.2 (8ЕО ΙΌ N0:9-12), 6.22.2 (8ЕО ΙΌ N0:1316), 6.34.2 (8 НО ΙΌ N0:17-20), 6.67.1 (8 НО ΙΌ N0:21-24), 6.73.2 (8 НО ΙΌ N0:25-28), 6.77.1 (8 НО ΙΌ N0:29-32), 7.16.6 (8ЕО ΙΌ N0:33-36), 7.20.5 (8ЕО ΙΌ N0:37-40), 7.26.4 (8ЕО ΙΌ N0:41-44), 9.8.2 (8ЕО ΙΌ N0:45-48), и модифицированных анти-МАйСАМ антител 6.22.2-той (8Е0 ΙΌ N0:51-54), 6.34.2-той (8ЕО ΙΌ N0:55-58), 6.67.1-той (8ЕО ΙΌ N0:59-62), 6.77.1-той (8ЕО ΙΌ N0:63-66) и 7.26.4-той (8ЕО ΙΌ N0:41-42, 67-68). Для каждой клонированной последовательности анти-МАйСАМ антитела, последовательности сигнальных пептидов (или их кодирующие нуклеотиды) указаны строчными буквами и подчеркнуты.
На фиг. 1А-11 проиллюстрировано выравнивание последовательностей для сравнения предсказанных аминокислотных последовательностей тяжелой цепи антител 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1,
6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4 и 9.8.2 с аминокислотной последовательностью соответствующих генных продуктов зародышевой линии. Положения последовательностей СЭКЕ СЭ2 и СЭЕ3 антител подчеркнуты, различия между экспрессируемой последовательностью и соответствующей последовательностью зародышевой линии показаны жирным шрифтом, и если в экспрессируемой последовательности, по сравнению с зародышевой линией, имеются добавления, то они показаны символом (-) в последовательности зародышевой линии.
На фиг. 1К-1Т проиллюстрировано выравнивание последовательностей для сравнения предсказанных аминокислотных последовательностей легкой цепи каппа антител 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2,
6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4 и 9.8.2 с аминокислотной последовательностью соответствующих генных продуктов зародышевой линии. Положения последовательностей СЭКЕ СЭ2 и СЭЕ3 антител подчеркнуты, различия между экспрессируемой последовательностью и соответствующей последовательностью зародышевой линии показаны жирным шрифтом, и если в экспрессируемой последовательности, по сравнению с зародышевой линией, имеются добавления, то они показаны символом (-) в последовательности зародышевой линии.
Присутствие посттрансляционных модификаций: гликозилирование и деамидирование
Результатом некоторых изменений в экспрессированной последовательности анти-МАйСАМ антитела, по сравнению с установленной последовательностью зародышевой линии, является включение остатков, которые, потенциально, могут подвергаться ^связанному гликозилированию. (А5п-Х-8ег/Тйг) и/или деамидированию (А§п-01у) (см. табл. 12). Последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей аминокислотные последовательности вариабельного домена легкой цепи каппа анти-МАйСАМ антител
6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.26.4 и 9.8.2 (8ЕО ΙΌ N0:16, 20, 24, 28, 32, 44 и 48) и вариабельного домена тяжелой цепи антитела 6.14.2 (8Е0 ΙΌ N0:10), позволяют предсказать наличие ^связанного гликозилирования. Присутствие такой пост-трансляционной модификации было исследовано с применением комбинации методов электрофореза в ДСН-ПААГ и окрашивания антителами (тАЬ) 6.22.2, 6.34.2,
6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.26.4 и 9.8.2 с использованием набора для окрашивания Рго-Ο® Етега1й 488 01усорго1ет (Мо1еси1аг РгоЬек).
Вкратце, приблизительно 2 мкг восстановленного анти-МАйСАМ антитела загружали на 4-12% ДСН-полиакриламидный гель с использованием буфера М0Р8. После электрофореза гель фиксировали в 50% МеОН, 5% уксусной кислоте и промывали в 3% уксусной кислоте. Затем все углеводы на геле окисляли периодной кислотой и окрашивали с использованием набора для окрашивания Рго-О® Етега1й 488
- 50 012872
61усоргоГеш δΐηίπ Κίΐ (Мо1еси1аг РгоЬез). После проведения последней стадии промывки, окрашивание гликопротеином визуализировали с использованием флуоресцентного сканера, излучающего на длине волны 473 нм.
После окрашивания гликопротеином гель окрашивали на общий белок с использованием набора для окрашивания геля белком КиЬу 8ΥΡΡΌ и анализировали с использованием флуоресцентного сканера, излучающего на длине волны 473 нм. Все легкие цепи каппа анти-МАбСАМ антител, 6.22.2, 6.34.2,
6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.26.4 и 9.8.2 позитивно окрашивались на наличие гликозилирования. Для дополнительного подтверждения, анти-МАбСАМ антитело 7.26.4 подвергали гидролизу трипсином/химотрипсином, и анализ ЖХ-МС/МС подтверждал присутствие модифицированного триптического пептида и давал дополнительное подтверждение наличия гликозилирования легкой цепи каппа.
Специфические последовательности Азп-С1у в областях СИК1 анти-МАбСАМ антител 1.7.2, 1.8.2,
6.22.2 и 7.20.5, сообщали этим областям восприимчивость к деамидированию. Деамидирование при нейтральном рН дает отрицательный заряд и может также приводить к β-изомеризации, которая может негативно влиять на свойства антитела. Для анти-МАбСАМ антител 1.7.2, 1.8.2 и 7.20.5, присутствие деамидированных Азп-изоаспартатных остатков оценивали с помощью масс-спектроскопии после захвата боковой цепи изоаспартата молекулой МеОН.
Вкратце, для анти-МАбСАМ антитела 1.7.2 проводили мониторинг статуса триптического/Азр-№ пептида 88^8^^^8N6ΥNΥ^ (8ЕО ΙΌ N0:69X1573,7 Да) с помощью ЖХ-МС/МС. Анти-МАбСАМ антитело 1.7.2 восстанавливали в 10 мМ ДТТ, алкилировали в 5 мМ №-иодацетата, после чего буфер заменяли на буфер для гидролиза трипсином (50 мМ Трис-НС1, 1 мМ СаС12, рН 7,6). Затем это антитело смешивали с секвенирующим модифицированным трипсином высокой чистоты (Рготеда) в отношении протеаза:белок = 1:20. Белок гидролизовали трипсином в течение 15 ч при 30°С, и полученные пептиды разделяли с помощью ВЭЖХ с использованием С-18 КРС на системе ЕНап ЬС. 33Азп-содержащий пептид (4032 Да) собирали из колонки и разводили в буфере для гидролиза Азр^ (50 мМ натрий-фосфатный буфер, рН 8,0). Затем добавляли Азр-№эндопротеиназу (КосЕе) в отношении пептид: фермент, составляющем приблизительно 10:1.
К образцу метанола (1 мл, -20°С) добавляли ацетилхлорид (100 мкл) и смесь нагревали до комнатной температуры. Триптический + Азр-№гидролизат сушили в центрифуге 8рееб-Уас, а затем добавляли 5 мкл метанола/ацетилхлорида (45 мин, комнатная температура), и снова сушили в 8рееб-Уас. Полученный остаток разводили в 0,1% ТЕА и пептиды сначала анализировали на масс-спектрометре Уоуадег-ЭЕ 8ТК МЛЪ0[-Т0Е с применением либо метода приготовления тонкослойного образца на нитроцеллюлозе, либо обращенно-фазовой очистки с использованием С18 21р Т1рз (М1Шроге) с последующим капельным смешиванием с α-цианоматрицей. Метилированную пептидную смесь также анализировали с помощью ЖХ-МС/МС на масс-спектрометре с ионной ловушкой (Леса ХР Р1из йп Тгар), как описано выше. Элюирование проводили из вертикальной колонки непосредственно в ионную МС-ловушку, после чего пептиды анализировали с помощью МС и МС/МС. МС представляет собой прибор для анализа всех ионов с массой в пределах от 300 до 2000 Да. При любом конкретном сканировании, наиболее активный ион затем анализировали с помощью МС/МС.
Таблица 12. Посттрансляционная модификация анти-МАбСАМ антител
клон Тяжелая цепь Легкая цель каппа
Гликозилирование (ΝΧ3/Τ) Подтвержденный Гликозилирование (ΝΧ8ΓΓ) Подтвержденный Деамидирование (N6) Подтвержденный
1.7.2 ЬОБНЙУН М3
1.8,2 ЬОБНЗУЦ из
7.18.6 7.20.6 7.26.4 скгнозььу мб/расе Η3Ν3ΥΝΥ из
Жя ΤΡΝΝ3ΆΜΤ Ν.ϋ ЗСЮТТЬТ! абошззуц РАЗЕ РАЗЕ ьтшзцка Н.Р
<8.6Ϋ.1· ББЫМКТУЪА РАЗЕ
ΚΑ50ΝΙΤΝ РАЗЕ
зсвззсзь РАЗЕ
ГлГЛгЛ нзоньзтт РАЗЕ
1дО2 а64 .
Исследование путем мутагенеза
Первичная аминокислотная последовательность анти-МАбСАМ антител, проиллюстрированных в настоящем изобретении, может быть модифицирована с помощью сайт-направленного мутагенеза для
- 51 012872 удаления возможных сайтов посттрансляционной модификации (например, гликозилирования, деамидирования), для изменения исходного изотипа или для создания новых модификаций, которые могут повышать терапевтическую эффективность. Например, для создания замен в анти-МАйСАМ антителах
6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.77.1 и 7.26.4 в целях возврата некоторых каркасных последовательностей к исходным последовательностям зародышевой линии, применяли ПЦР для удаления потенциальных сайтов гликозилирования и/или для замены фонового изотипа на изотип человеческого 1дС2. Клонированные кДНК рСЯ2.1 ТОРО-ТА (100 нг), соответствующие нуклеотидам тяжелой цепи 8ЕО ΙΌ ΝΟ:13, 17, 21 и 29 и нуклеотидам легкой цепи каппа 8ЕО ΙΌ ΝΟ:15, 19, 23, 31 и 43, использовали в качестве матрицы в реакциях ПЦР с перекрывающимся удлинением и с применением набора праймеров, описанных в табл. 10.
Тяжелая цепь 6.22.2.
Наборы ПЦР-праймеров 6.22.2_УН_Р1 и 6.22.2_УН_СЗ* (1) и УН3-33 и 6.22.2_УН_Я1 (2) использовали для генерирования отдельных ПЦР-продуктов (1) и (2) с применением полимеразы Тад Ехрапй и кДНК-матрицы рСЯ2.1 ТОРО-ТА (100 нг) , представленной нуклеотидной последовательностью 8ЕО ΙΌ ΝΟ:13. Продукты (1) и (2) очищали и объединяли в третьей стадии ПЦР (примерно 50 нг каждого) вместе с праймерами УН3-33 и УК6.22.2_СЗ* для генерирования модифицированного У-домена тяжелой цепи 6.22.2. Этот модифицированный вариант содержит мутацию НЪ/РНе в РЯ1 и вводит рестрикционный ХЬа1-сайт, гарантирующий сохранение рамки считывания при клонировании в вектор, происходящий от рЕЕ6.1 и обозначенный рЕЕ6.1СН, который содержит соответствующий константный домен человеческого 1§С2. Конечный ПЦР-фрагмент клонировали в ХЬа1-сайт рЕЕ6.1СН, анализировали на ориентацию и подтверждали полноразмерную последовательность вставки. Нуклеотидная последовательность для модифицированной тяжелой цепи 6.22.2 представлена в 8ЕО ΙΌ ΝΟ:51, а соответствующая аминокислотная последовательность представлена в 8ЕО ΙΌ ΝΟ:52. Показаны изменения в нуклеотидных и аминокислотных последовательностях, по сравнению с исходными последовательностями.
Легкая цепь каппа 6.22.2.
Наборы ПЦР-праймеров 6.22.2_УК_Р1 и гетКарра (1) и А26 и 6.22.2_УК_Я1 (2) использовали для генерирования отдельных ПЦР-продуктов (1) и (2) с применением полимеразы Тад Ехрапй и кДНКматрицы рСЯ2.1 ТОРО-ТА (100 нг), представленной нуклеотидной последовательностью 8ЕО ΙΌ ΝΟ:15. Продукты (1) и (2) очищали и объединяли в третьей стадии ПЦР (примерно 50 нг каждого) вместе с праймерами А26 и ге\Карра для генерирования модифицированного У-домена легкой цепи каппа 6.22.2. Этот модифицированный вариант содержит мутации Акп/Акр и С1у/8ег в последовательности РЯ3. Полученный ПЦР-продукт клонировали в рЕЕ12.1 с использованием Н^ηйIII/ЕсοЯI-сайтов и подтверждали полноразмерную последовательность. Нуклеотидная последовательность для модифицированной легкой цепи каппа 6.22.2 представлена в 8ЕО ΙΌ ΝΟ:53, а соответствующая аминокислотная последовательность представлена в 8ЕО ΙΌ ΝΟ:54. Показаны изменения в нуклеотидных и аминокислотных последовательностях, по сравнению с исходными последовательностями.
Тяжелая цепь 6.34.2.
Наборы ПЦР-праймеров 6.34.2_УН_Р1 и 6.22.2_УН_С8* (1) и УН3-30 и 6.34.2_УН_Я1 (2) использовали для генерирования отдельных ПЦР-продуктов (1) и (2) с применением полимеразы Тад Ехрапй и кДНК-матрицы рСЯ2.1 ТОРО-ТА (100 нг), представленной нуклеотидной последовательностью 8ЕО ΙΌ ΝΟ:17. Продукты (1) и (2) очищали и объединяли в третьей стадии ПЦР (примерно 50 нг каждого) вместе с праймерами УН3-30 и УК6.22.2_СЗ* для генерирования модифицированного У-домена тяжелой цепи 6.34.2. Этот модифицированный вариант содержит мутацию 8ег/Агд в РЯ3 и вводит рестрикционный ХЬаЕсайт, гарантирующий сохранение рамки считывания при клонировании в вектор, происходящий от рЕЕ6.1, и обозначенный рЕЕ6.1СН, который содержит соответствующий константный домен человеческого [дС2. Конечный ПЦР-фрагмент клонировали в ХЬаЕсайт рЕЕ6.1СН, анализировали на ориентацию и подтверждали полноразмерную последовательность вставки. Нуклеотидная последовательность для модифицированной тяжелой цепи 6.34.2 представлена в 8ЕО ΙΌ ΝΟ:55, а соответствующая аминокислотная последовательность представлена в 8ЕО ΙΌ ΝΟ:56. Показаны изменения в нуклеотидных и аминокислотных последовательностях, по сравнению с исходными последовательностями.
Легкая цепь каппа 6.34.2.
Наборы ПЦР-праймеров 012 и 6.34.2_УК_Я1 (1), 6.34.2_УК_Р1 и 6.34.2_УК_Я2 (2), а также 6.34.2_УК_Р2 и гетКарра (3) использовали для генерирования отдельных ПЦР-продуктов (1), (2) и (3) с применением полимеразы Тад Ехрапй и кДНК-матрицы рСЯ2.1 ТОРО-ТА (100 нг), представленной нуклеотидной последовательностью 8ЕО ΙΌ ΝΟ:19.
Продукты (1), (2) и (3) очищали, а продукты (1) и (2) объединяли в третьей стадии ПЦР (примерно 50 нг каждого) вместе с праймерами 012 и 6.34.2_УК_Я2 для генерирования ПЦР-продукта (4). ПЦРпродукты (2) и (3) объединяли в четвертой стадии ПЦР (примерно 50 нг каждого) вместе с праймерами 6.34.2_УК_Р1 и гетКарра для генерирования ПЦР-продукта (5). ПЦР-продукты (4) и (5) очищали и объединяли (примерно 50 нг каждого) вместе с праймерами 012 и ге\'Карра для генерирования модифицированного У-домена легкой цепи каппа 6.34.2. Этот модифицированный вариант содержит мутацию Акп/8ег в СОЯ1, мутацию РНе/Туг в РЯ2 и мутации Агд-ТЬг/8ег-8ег, Акр/С1и и 8ег/Туг в последовательности РЯ3. Полученный ПЦР-продукт клонировали в рЕЕ12.1 с использованием Н^ηйIII/ЕсοЯ1-сайтов и
- 52 012872 подтверждали полноразмерную последовательность. Нуклеотидная последовательность для модифицированной легкой цепи каппа 6.34.2 представлена в 8Е0 ΙΌ N0:57, а соответствующая аминокислотная последовательность представлена в 8Е0 ΙΌ N0:58. Показаны изменения в нуклеотидных и аминокислотных последовательностях, по сравнению с исходными последовательностями.
Тяжелая цепь 6.67.1.
Наборы ПЦР-праймеров 6.67.1_УН_Р1 и 6.67.1_УН_С8* (1) и УН4-4 и 6.67.1_УН_Я1 (2) использовали для генерирования отдельных ПЦР-продуктов (1) и (2) с применением полимеразы Тас.| Ехраиб и кДНК-матрицы рСЯ2.1 ТОРО-ТА (100 нг) , представленной нуклеотидной последовательностью 8Е0 ΙΌ N0:21. Продукты (1) и (2) очищали и объединяли в третьей стадии ПЦР (примерно 50 нг каждого) вместе с праймерами УН4-4 и УК6.67.1_С8* для генерирования модифицированного У-домена тяжелой цепи 6.67.1. Этот модифицированный вариант содержит мутацию Пе-Ееи-А1а/Ме!-8ег-Уа1 в РЯ3 и вводит рестрикционный ХЬа[-сайт, гарантирующий сохранение рамки считывания при клонировании в вектор, происходящий от рЕЕ6.1 и обозначенный рЕЕ6.1СН, который содержит соответствующий константный домен человеческого Ι§02. Конечный ПЦР-фрагмент клонировали в ХЬаТ-сайт рЕЕ6.1СН, анализировали на ориентацию и подтверждали полноразмерную последовательность вставки. Нуклеотидная последовательность для модифицированной тяжелой цепи 6.67.1 представлена в 8Е0 ΙΌ N0:59, а соответствующая аминокислотная последовательность представлена в 8Е0 ΙΌ N0:60. Показаны изменения в нуклеотидных и аминокислотных последовательностях, по сравнению с исходными последовательностями.
Легкая цепь каппа 6.67.1.
Наборы ПЦР-праймеров 6.67.1_УК_Р1 и геуКарра (1) и В3 и 6.67.1_УК_Я1 (2) использовали для генерирования отдельных ПЦР-продуктов (1) и (2) с применением полимеразы Тас.| Ехраиб и кДНКматрицы рСЯ2.1 ТОРО-ТА (100 нг), представленной нуклеотидной последовательностью 8Е0 ΙΌ N0:23. Продукты (1) и (2) очищали и объединяли в третьей стадии ПЦР (примерно 50 нг каждого) вместе с праймерами В3 и геуКарра для генерирования модифицированного У-домена легкой цепи каппа 6.67.1. Этот модифицированный вариант содержит мутацию Тйг/Аки в СЭЯ1 и мутацию Агд/С1у в РЯ2. Полученный ПЦР-продукт клонировали в рЕЕ12.1 с использованием НтбШ/ЕсоЯ1-сайтов и подтверждали полноразмерную последовательность. Нуклеотидная последовательность для модифицированной легкой цепи каппа 6.67.1 представлена в 8Е0 ΙΌ N0:61, а соответствующая аминокислотная последовательность представлена в 8Е0 ΙΌ N0:62. Показаны изменения в нуклеотидных и аминокислотных последовательностях, по сравнению с исходными последовательностями.
Тяжелая цепь 6.77.1.
Наборы ПЦР-праймеров УН3-21 и 6.22.2_УН_С8* использовали для генерирования отдельных ПЦР-продуктов с применением полимеразы Тас.| Ехраиб и кДНК-матрицы рСЯ2.1 ТОРО-ТА (100 нг), представленной нуклеотидной последовательностью 8Е0 ΙΌ N0:21. ПЦР-продукты гидролизовали ферментом ХЬаЕ подвергали гель-очистке, клонировали в ХЬаЬсайт рЕЕ6.1СН, и анализировали на ориентацию. Затем подтверждали полноразмерную последовательность вставки. Нуклеотидная последовательность для модифицированной тяжелой цепи 6.77.1 представлена в 8Е0 ΙΌ N0:63, а соответствующая аминокислотная последовательность представлена в 8Е0 ΙΌ N0:64. Показаны изменения в нуклеотидных и аминокислотных последовательностях, по сравнению с исходными последовательностями.
Легкая цепь каппа 6.77.1.
Наборы ПЦР-праймеров А2 и 6.77.1_УК_Я1 (Ι), 6.77.1_УК_УК_Р1 и 6.77.1_Я2 (2), а также 6.77.1__УК_Р2 и геуКарра (3) использовали для генерирования отдельных ПЦР-продуктов (1), (2) и (3) с применением полимеразы Тас.| Ехраиб и кДНК-матрицы рСЯ2.1 ТОРО-ТА (100 нг), представленной нуклеотидной последовательностью 8Е0 ΙΌ N0:31. Продукты (1), (2) и (3) очищали, и продукты (1) и (2) объединяли в третьей стадии ПЦР (примерно 50 нг каждого) вместе с праймерами А2 и 6.77.1_УК_Я2 для генерирования ПЦР-продукта.
(4). ПЦР-продукты (2) и (3) объединяли в четвертой стадии ПЦР (примерно 50 нг каждого) вместе с праймерами 6.77.1_УК_Р1 и геуКарра для генерирования ПЦР-продукта (5). ПЦР-продукты (4) и (5) очищали и объединяли (примерно 50 нг каждого) вместе с праймерами А2 и 1К2 для генерирования модифицированного У-домена легкой цепи каппа 6.77.1. Этот модифицированный вариант содержит мутацию Аки/Еук в СОЯ1, мутацию 8ег/Туг в РЯ3 и мутацию Су§/8ег в последовательности СЭЯ3. Полученный ПЦР-продукт клонировали в рЕЕ12.1 с использованием НтбШ/ЕсоЯ1-сайтов и подтверждали полноразмерную последовательность. Нуклеотидная последовательность для модифицированной легкой цепи каппа 6.77.1 представлена в 8Е0 ΙΌ N0:65, а соответствующая аминокислотная последовательность представлена в 8Е0 ΙΌ N0:66. Показаны изменения в нуклеотидных и аминокислотных последовательностях, по сравнению с исходными последовательностями.
Легкая цепь каппа 7.26.4.
Наборы ПЦР-праймеров 7.2 6.4_УК_Р1 и геуКарра (1) и А2 и 7.26.4_УК_Я1 (2) использовали для генерирования отдельных ПЦР-продуктов (1) и (2) с применением полимеразы Тас.| Ехраиб и кДНКматрицы рСЯ2.1 ТОРО-ТА (100 нг), представленной нуклеотидной последовательностью 8Е0 ΙΌ N0:43. Продукты (1) и (2) очищали и объединяли в третьей стадии ПЦР (примерно 50 нг каждого) вместе с праймерами А2 и геуКарра для генерирования модифицированного У-домена легкой цепи каппа 7.26.4.
- 53 012872
Этот модифицированный вариант содержит мутацию Акп/Зег в СЭК1. Полученный ПЦР-продукт клонировали в рЕЕ12.1 с использованием НтбШ/ЕсоЯ1-сайтов и подтверждали полноразмерную последовательность. Нуклеотидная последовательность для модифицированной легкой цепи каппа 7.2 6.4 представлена в ЗЕО ГО NО:67, а соответствующая аминокислотная последовательность представлена в ЗЕО ГО NО:68. Показаны изменения в нуклеотидных и аминокислотных последовательностях, по сравнению с исходными последовательностями.
Функциональный эукариотический экспрессионный вектор для каждого из модифицированных вариантов 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.77.1 и 7.26.4, обозначаемых 6.22.2-тоб, 6.34.2-тоб, 6.67.1-тоб, 6.77.1тоб или 7.26.4-тоб и представляющих собой, соответственно, нуклеотидные последовательности тяжелой цепи ЗЕО ГО NО: 51, 55, 59, 63 и 41, и соответствующие аминокислотные последовательности ЗЕО ГО NО:52, 56, 60, 64 и 42, а также нуклеотидные последовательности легкой цепи каппа ЗЕО ГО NО:53, 57, 61, 65 и 67, и соответствующие аминокислотные последовательности ЗЕО ГО NО:54, 58, 62, 66 и 68, конструировали следующим образом. кДНК-вставки тяжелой цепи, соответствующие 6.22.2-тоб, 6.34.2тоб, 6.67.1-тоб и 6.77.1-тоб, вырезали из вектора рЕЕ6.1СН ферментами №!1/За11, а родительский вариант тяжелых цепей 7.26.4 вырезали из вектора рЕЕ6.1 ферментами №!1/За11, и очищенные фрагменты клонировали в идентичные сайты соответствующего вектора рЕЕ12.1, содержащего модифицированные варианты последовательностей легкой цепи каппа 6.22.2-тоб, 6.34.2-тоб, 6.67.1-тоб, 6.77.1-тоб и 7.26.4-тоб. Последовательности этих векторов подтверждали и выделенные количества. использовали для временной трансфекции клеток НЕК 293Т. Вкратце, 9 х 106 клеток НЕК 293Т, которые были засеяны в колбу Т165 за один день до трансфекции и промыты в Ор!1тет, подвергали временной трансфекции кДНК-векторами, соответствующими 6.22.2-тоб, 6.34.2-тоб, 6.67.1-тоб, 6.77.1-тоб и 7.26.4-тоб (40 мкг) с использованием липофектамина РЬИЗ (1пуйгодеп) в соответствии с инструкциями производителя. Эти клетки инкубировали в течение 3 ч, а затем среду для трансфекции заменяли средой ЭМЕМ (1пуйгодеп 21969-035), содержащей 10%-ную фетальную телячью сыворотку со сверхнизким содержанием 1дС (1пуйгодеп 16250-078) и Б-глутамин (50 мл) . Через 5 дней собирали супернатант среды, фильтровали в стерильных условиях и анти-МАбСАМ антитело очищали с помощью аффинной хроматографии на белке С-сефарозе способом, аналогичным способу, описанному выше. Количество выделенного антитела (20-100 мкг) оценивали с помощью анализа Брэдфорда.
Анти-МАбСЛМ-активность аффинно-очищенного антитела, соответствующего 6.22.2-тоб, 6.34.2тоб, 6.67.1-тоб, 6.77.1-тоб и 7.26.4-тоб, оценивали в анализе гибрида МАбСЛМ-IдС1-Ес, описанном выше. Сравнение величин 1С50 для этих анти-МАбСЛМ антител с величинами 1С50 для родительских анти-МАбСАМ антител, от которых они происходят, приводится в табл. 13. Влияние описанных выше аминокислотных замен на активность модифицированных анти-МАбСАМ антител, по сравнению с их родительскими последовательностями, было минимальным. Данные антитела также сохраняли свою способность связываться с клетками СНО, экспрессирующими рекомбинантный человеческий МАбСАМ или химерный МАбСАМ собакоподобных обезьян/человека.
Таблица 13. Активность модифицированных вариантов анти-МАбСАМ антител 6.22.2-тоб, 6.34.2-тоб, 6.67.1-тоб, 6.77.1-тоб и 7.26.4-тоб по сравнению с их родительскими последовательностями
Клон Среднее значение 1С5о, полученное в анализе гибрида МАдСАМ-1дС1-Рс (мкг/мл)
Исходный Модифицированный
6.22.2 0,018 0,058
6.34.2 0,013 0, 049
6.67.1 0,013 0,037
6.77.1 0,022 0,077
7.26.4 0,021 0,033
Пример 6. Увеличение числа β7 +-лимфоцитов в периферической крови путем блокирования антиМАбСАМ антител
Был разработан анализ для идентификации и корреляции механического эффекта анти-МАбСАМ антитела и его уровня в крови. Ингибирующее анти-МАбСАМ антитело должно обладать ингибирующим действием на рекрутинг лейкоцитов, экспрессирующих интегрин α4β7, в желудочно-кишечный тракт. Поэтому, классы лейкоцитов, несущих интегрин α4β7, должны ограничиваться лейкоцитами периферической крови.
Это было продемонстрировано на полноразмерном тАЬ 7.16.6 против человеческого МАбСАМ у собакоподобных обезьян.
Очищенное тАЬ 7.16.6 против человеческого МАбСАМ (1 мг/кг) или носитель (20 мМ ацетата натрия, 0,2 мг/мл полисорбата 80, 45 мг/мл маннита и 0,02 мг/мл ЕЭТА при рН 5,5) оценивали аналогичным образом путем их внутривенного введения двум группам собакоподобных обезьян (п = 4/группу)
- 54 012872 через подкожную вену ноги. Через 3 дня после введения дозы, брали пробы крови путем пункции в бедренную вену и кровь собирали в пробирки с ЕЭТА. ЬРАМ-специфические антитела, которые перекрестно реагируют с интегрином α4β7 собакоподобных обезьян, не являются коммерчески доступными, а поэтому вместо них использовали анти-β- антитело (распознающее интегрин α4β7 и </.|.β-). Антитела (30 мкл), указанные в нижеследующей табл. 15, добавляли в пробирки, содержащие 100 мкл крови собакоподобных обезьян, слегка перемешивали путем встряхивания и инкубировали в течение 20-30 мин при 4°С.
Таблица 15. Антитела (ВО Рйаттшдеп), используемые для иммунофенотипирования крови собакоподобных обезьян
Каталожный номер Антитело или изотип
555748 ш1д61, к-Е1ТС
555844 т!д(32а, к-РЕ
559425 т!дС1 - РегСР
555751 ш1дБ1, к-АРС
555728 СО 28-Г1ТС
555945 β7-ΡΕ
558814 СО 95-АРС
550631 СО 4-РегСР
В каждую пробирку добавляли 1 мл раствора ЕАС81уке 1:10 (ВО # 349202), размешивали путем легкого встряхивания и содержимое инкубировали при комнатной температуре в течение примерно 12 мин в темноте до тех пор, пока не происходил полный лизис эритроцитов. Затем в каждую пробирку добавляли 2 мл буфера для окрашивания ВО (# 554656), после чего содержимое размешивали и центрифугировали при 250 х д в течение 6-7 мин при комнатной температуре. Супернатант отбрасывали и осадок ресуспендировали в 3 мл буфера для окрашивания, а затем снова размешивали и центрифугировали при 250 х д в течение 6-7 мин при комнатной температуре. После этого к клеточному осадку периферической крови обезьян добавляли буфер Су!ойх (ВО # 554655), содержащий параформальдегид (100 мкл) (мас./об.), и смесь тщательно размешивали при центрифугировании с низкой/умеренной скоростью. Образцы выдерживали при 4°С в темноте до тех пор, пока они не потребуются для анализа на ЕАС8Са11Ьиг. Непосредственно перед сбором, во все пробирки добавляли РВ8 (100 мкл). Абсолютный ряд клеток, а именно, СЭ4'в-'СО951оСО28' (необученные клетки), ί.Ό4'β ί.Ό951ιίί.Ό28' (центральные клетки памяти), ί.Ό4'β ί.Ό951ιίί.Ό28' (центральные клетки памяти), ί.Ό4'β ί.Ό951ιίί.Ό28- (эффекторные клетки памяти) были идентифицированы в соответствующих анализах с применением клеточного сортинга и квадрантных анализах. Другие субпопуляции Т-клеток, например, центральные СЭ8'-Т-клетки памяти (β ί.Ό8'ί.Ό28'ί.Ό95') и любые другие лейкоциты, несущие лиганд МАбСАМ, могут быть также проанализированы этим методом с использованием соответствующих антител, Анти-МАбСАМ тАЬ 7.16.6, по сравнению с носителем-контролем, давало приблизительно 3-кратное увеличение уровней центральных С^4+β-+С^95й^С^28+-Т-клеток памяти в кровотоке, как показано на фиг. 7. Какого-либо влияния на популяцию циркулирующих центральных С^4+β--С^95й^С^28+-Т-клеток памяти не наблюдалось, что указывало на то, что действие анти-МАбСАМ тАЬ 7.16.6 является специфическим по отношению к хомингу Т-клеток в кишечник. У собакоподобных обезьян, влияние анти-МАбСАМ тАЬ 7.16.6 на популяцию циркулирующих (/..ιβ-'-лимфоцитов указывало на то, что это антитело является хорошим заменителем биомаркера, подтверждающего соответствующий механизм, особенно при его практическом применении в клинических условиях.
Последовательности
8ЕЦ ΙΌ N0:1-48 и 51-68 представляют собой нуклеотидные и аминокислотные последовательности тяжелой цепи и легкой каппа-цепи для двенадцати человеческих анти-МАбСАМ антител, нуклеотидные и аминокислотные последовательности (/..^-связывающих доменов МАбСАМ собакоподобных обезьян и нуклеотидные и аминокислотные последовательности пяти модифицированных человеческих антиМАбСАМ антител.
8ЕЦ ΙΌ N0:1-48 представляют собой нуклеотидные и аминокислотные последовательности тяжелой цепи и легкой каппа-цепи для двенадцати человеческих моноклональных анти-МАбСАМ антител
1.7.2 (8ЕО ΙΌ N0:1-4), 1.8.2 (8ЕО ΙΌ N0:5-8), 6.14.2 (8ЕО ΙΌ N0:9-12), 6.22.2 (8ЕО ΙΌ N0:13-16), 6.34.2 (8 ЕС) ΙΌ N0:17-20), 6.67.1 (8 ЕС) ΙΌ N0:21-24), 6.73.2 (8 ЕС) ΙΌ N0:25-28), 6.77.1 (8 ЕС) ΙΌ N0:29-32), 7.16.6 (8ЕС) ΙΌ N0:33-36), 7.20.5 (8ЕС) ΙΌ N0:37-40), 7.26.4 (8ЕС) ΙΌ N0:41-44) и 9.8.2 (8 ЕС) ΙΌ N0:4548).
8ЕЦ ΙΌ N0:49-50 представляют собой нуклеотидные и аминокислотные последовательности α4β7
- 55 012872 связывающих доменов МАйСАМ собакоподобных обезьян.
8Е0 ΙΌ N0:51-68 представляют собой нуклеотидные и аминокислотные последовательности тяжелой цепи и легкой каппа-цепи модифицированных моноклональных анти-МАйСАМ антител: модифицированного антитела 6.22.2 (8Е0 ΙΌ N0:51-54), модифицированного антитела 6.34.2 (8Е0 ΙΌ N0:55-58), модифицированного антитела 6.67.1 (8Е0 ΙΌ N0:59-62), модифицированного антитела 6.77.1 (8Е0 ΙΌ N0:63-66) и нуклеотидные и аминокислотные последовательности и легкой каппа-цепи модифицированного моноклонального анти-МАйСАМ антитела 7.26.4 (8Е0 ΙΌ N0: 67-68). 8Е0 ΙΌ N0:70-106 и 108-110 представляют собой различные праймерные последовательности.
- 56 012872
Список последовательностей <110> ΡΓΙΖΕΚ 1ЫС.
АВЕЕЫ1Х, НДС.
ΡΕΙΖΕΚ ЫМ1ТЕ0 <120> АНТИТЕЛА ПРОТИВ МАССАМ <130> АВХ-РЕб РСТ <14О> РСТ/0205/000370 <141> 2005-01-07 <150> 60/535,490 <151> 2004-01-09 <160> 147 <17О> Ра£епТ1п νετ. 3.3 <210> 1 <211> 1392 <212> ДНК <213> Ното зархепз <400> 1 а’Ьддад'е^д ддс!:дадс1:д даЪЪЪСсс'ЬС дсБдсХат. £ааааддРд1: ссад1:дрдад60 дСдсадсРдд СддадСсРдд дддаддсСРд дСдаадссЬд дддддРсссЬ 1:адас(:сбсс120 £д1дЪадсс£ сТддаББсас ^БсасИаас дссЪдда1:да 1:с5ддд5ссд ссаддсБсса180 дддааддддс 5ддадЪдддБ 5ддссдЪаС1: ааааддаааа сБда'ЬддСдд дасаасадас240
1асдсбдсас ссдрдааадд садаРГсасс аРсЪсаадад абдаМсааа ааасасдсЪд300
1а5с5дсааа БдаасадссЪ даааассдад дасасадссд ^дТаТГасБд 1ассасаддд360 ддадТддсТд аддас£ас5д дддссаддда асссТдд1:са ссдТсбсс^с адссЪссасс420 аадддсссаР сдд£с55ссс ссЬддсдссс 5дс5ссадда дсассБссда дадсасадсд480 дсссОдддсО дссТддбсаа ддасЬасЪРс сссдаассдд БдасддСдСс дТддаасТса540 ддсдсРсЬда ссадсддсдб дсасассЬ^с ссадсЪдЬсс ЪасадЪссЬс аддас1:с{:ас600
5сссТсадса дсд!дд1:дас сдБдсссБсс адсаасбСсд дсасссадас сТасассТдс660 аасдбадаОс асаадсссад саасассаад дрддасаада садСРдадсд еаааГдНдх720 дТ:сдад5дсс сассдБдссс адсассасс± дрддсаддас сд5сад5с51 сс5сЪ1:сссс780 ссаааассса аддасасссГ саБдабсбсс сддассссЬд аддТсасдОд сдТддБддТд840 дасдЬдадсс асдаадассс сдаддБссад ЪРсаасЬддЪ асдЪддасдд сдБддаддЪд900 саЬаа£дсса адасааадсс асдддаддад садТЬсааса дсасдЫесд 5д5дд5садс960 дЬссбсассд Ь'ЬдТдсасса ддасРддсРд аасддсаадд ад^асаадЬд саадд5сЬсс1020 аасаааддсс Бсссадсссс саЬсдадааа ассабс^сса ааассааадд дсадссссда1080 даассасадд ОдСасасссТ дсссссаТсс сдддаддада Бдассаадаа ссаддбсадс1140 сЬдассСдсс СддТсааадд с!:Рс±асссс адсдасаСсд ссдБддадТд ддададсааб1200 дддсадссдд адаасаас±а саадассаса сс£ссса£дс бддасЬссда сддсйссЬ'Ьс1260
ГЬссбсЪаса дсаадс^сас сдрддасаад адсаддБддс адсаддддаа сдТсБЪсБса1320
ЪдсбссдТда СдсаБдаддс 5с5дсасаас сасБасасдс адаададссЪ сТссс1;д5с51380 ссдддТаааБ да1392 <210> 2 <211> 463 <212> БЕЛОК <213> Ното зархепз <400> 2
Мех С1и РНе С1у Ьеи Зег Тгр Не РЬе Ьеи А1а А1а 11е Ьеи Туз 31у 15 10 15
Уа1 С1п Суз 61и Уа1 С1п Ьеи 1 С1и Зег 61у С1у С1у Беи Уа1 Ьуз
25 30
- 57 012872
Рго 01 у СЬу 35 Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз 40 УаЬ А1а Зег СЬу 45 РЬе ТЬг РЬе
ТЬг Азп АЬа Тгр МеЬ 1Ье Тгр УаЬ Агд СЬп АЬа Рго СЬу Ьуз СЬу Ьеи
50 55 60
СЬи Тгр УаЬ 01 у Агд 1Ье Ьуз Агд Ьуз ТЬг Азр СЬу СЬу ТЬг ТЬг Азр
65 70 75 80
Туг АЬа АЬа Рго УаЬ Ьуз СЬу Агд РЬе ТЬг Не Зег Агд Азр Азр Зег
85 90 95
Ьуз Азп ТЬг Ьеи Туг Ьеи СЬп МеС Азп Зег Ьеи Ьуз ТЬг СЬи Азр ТЬг
100 105 110
АЬа УаЬ Туг Туг Суз ТЬг ТНг СЬу СЬу УаЬ АЬа СЬи Азр Тух Тгр СЬу
115 120 Ь25
СЬп СЬу ТЬг Ьеи УаЬ ТЬг УаЬ Зех Зег АЬа Зег ТЬг Ьуз СЬу Рго Зег
130 135 140
УаЬ РЬе Рго Ьеи АЬа Рго Суз Зег Агд Зег ТЬг Зег СЬи Зег ТЫ АЬа
145 150 155 160
АЬа Ьеи 01 у Суз Ьеи УаЬ Ьуз Азр Туг РЬе Рго СЬи Рго УаЬ ТЬг УаЬ
165 170 175
Зег Тгр Азп Зег С1 у АЬа Ьеи ТЬг Зег СЬу УаЬ НЬз ТНг РЬе Рго АЬа
130 185 190
УаЬ Ьеи СЬп Зег Зег СЬу Ьеи Туг Зег Ьеи Зег Зег УаЬ УаЬ ТНг УаЬ
195 200 205
Рго Зег Зег Азп РЬе СЬу ТЬг СЬп ТЬг Туг ТЬг Суз Азп УаЬ Авр НЬз
210 215 220
Ьуз Рго Зег Азп ТЬг Ьуз УаЬ Азр Ьуз ТНг УаЬ СЬи Агд Ьуз Суз Суз
225 230 235 240
УаЬ СЬи Суз Рго Рго Суз Рго АЬа Рго Рго УаЬ АЬа СЬу Рго Зег УаЬ
245 250 255
РНе Ьеи РЬе Рго Рго Ьуз Рго Ьуз Азр ТЬг Ьеи Μβΐ Ые Зег Агд ТЬг
260 265 270
Рго СЬи УаЬ ТЬг Суз УаЬ УаЬ УаЬ Азр УаЬ Зег НЬз С1и Азр Рго СЬи
275 280 285
УаЬ СЬп РЬе Азп Тгр Туг УаЬ Азр СЬу УаЬ СЬи УаЬ Н1з Азп АЬа Ьуз
290 295 300
ТЬг Ьуз Рго Агд СЬи СЬи СЬп РЬе Азп Зег ТНг РЬе Агд УаЬ УаЬ Зех
305 310 315 320
УаЬ Ьеи ТЬг УаЬ УаЬ НЬз СЬп Азр Тгр Ьеи Азп СЬу Ьуз СЬи Туг Ьуз
325 330 335
Суз Ьуз УаЬ Зег Азп Ьуз 61у Ьеи Рго АЬа Рго 1Ье СЬи Ьуз ТЬг 1Ье
340 345 350
Зег Ьуз ТЬг Ьуз СЬу СЬп Рго Агд СЬи Рхо СЬп УаЬ Туг ТЬг Ьеи Рхо
355 360 365
Рго Зег Агд СЬи СЬи МеЬ ТЬг Ьуз Азп СЬп УаЬ Зег Ьеи ТЬг Суз Ьеи
- 58 012872
370 375 380
Уа1 Ьуз 61 у РЬе Туг Рго Зег Азр Не А1а Уа1 61и Тгр 01и Зег Азп
385 390 395 400
е1у С1п Рго С1и Азп Азп Туг Ьуз ТЬг ТЬг Рго Рго Ме£ Ьеи Азр Зег
405 410 415
Азр <31у Зег РЬе РЬе Ьеи Туг Зег Ьуз Ьеи ТЬг Уа1 Азр Ьуз Зег Агд
420 425 430
Тгр С1п 61п О1у Азп Уа1 РЕе Зег Суз Зег Уа1 МеГ ΗΪ3 С1и АЬа Ьеи
435 440 445
Н1з Азп Н1з Туг ТЬг С1п Ьуз Зег Ьеи Зег Ьеи Зег Рго С1у Ьуз
450
455
460 <210>
<211> <212?
<213>
720
ДНК
Ното заргепз <400>
аЬдаддсЬсс дабаЬЬдЬда аЬсЬссЬдса ЬассЬдсада 5ссдддд£сс адсададЬдд ассЬЬсддсс аСс^Ьсссдс ааГаасЬЬсЬ ддСаасЬссс адсасссЬда асссаЬсадд сЬдсЬсадсЬ ЬдасЬсадЬс ддЬсЬадЬса адссадддса сЬдасаддЬЬ аддсбдадда аадддасасд саЬсЬдаЬда аЬсссадада аддададЬдр сдсСдадсаа дссЬдадсЬс ссЬддддсЬд Ъссас5с£сс дадсс^ссьд дЬсЬссасад садЬддсадЬ ЪдЬЬддддР!: асьддадаьь дсадЬСдааа ддссааадГа сасададсад адсадасЬас дсссдЬсаса сЬаа4дс6сЬ сСдсссдЬоа сааадбааЬд сСссЬдаЬсЬ ддаЬсаддса ЬайСасЬдса ааасдаасЬд ЬсЬддаасЬд садЬддаадд дасадсаадд дадааасаса аададсЬЬса дддЬсЬсЬдд ссссъддада даГасаасЪа аЬЬЬдддЬЬс садаЪГЪЪас ЬдсаадсЬсЬ ЬддсЪдсасс ссЬсЬдЬЬдС ЬддаЬаасдс асадсассЬа аадЬсЬасдс асаддддада аЬссадбддд досддссЬсс Ы+ддаЬЬдд Ьаа5сдддсс ас-ЬдааааЪс асааасбаЬс аЬсЬдк с±Ьс дЬдссЬдс+д ссГссааЬсд садсс1садс сЬдсдаадЬс дСдЬГадЬда
120
180
240
300
360
420
480
540
600
660
720 <210> 4 <211> 238 <212> БЕЛОК <213> Нолю заргепз <400> 4
МеЬ Агд Ьеи Рго А1а С1п Ьеи Ьеи С1у Ьеи Ьеи МеЬ Ьеи Тгр Уа1 15 Зег
1 5 10
61у Зег Зег Б1у Азр Не Уа1 МеЬ ТЬг С1п Зег Рго Ьеи Зег Ьеи Рго
20 25 30
Уа1 ТЬг Рго 51у С1и Рго АЬа Зег Не Зег Суз Агд Зег Зег С1п Зег
35 40 45
Ьеи Ьеи 61п Зег Азп С1у Туг Азп Туг Ьеи Азр Тгр Туг Ьеи 61п Ьуз
50 55 60
Рго С1у С1п Зег Рго СЬп Ьеи Ьеи Не Туг Ьеи С1у Зег Азп Агд АЬа
65 70 75 80
Зег С1у Уа1 Рго Азр Агд РЬе Зег С1у Зег 61у Зег С1у ТЬг Азр РЬе
85 90 95
ТЬг Ьеи Ьуз 11е Зег Агд Уа1 С1и А1а СЬи Азр Уа1 С1у νβΐ Туг Туг
100 105 но
Суз МеЕ СЬп 115 АЬа Ьеи (ЗЬп ТЫ Ые ТЬг РЬе СЬу 61п 61у ТЬг Агд Ьеи
120 125
С1ц Ые Ьуз Агд ТЬг УаЬ АЬа АЬа Рго Зег УаЬ РЬе ЬЬе РЬе Рго Рго
130 135 140
Зег Азр 61и С1п Ьеи Ьуз Зег СЬу ТЬг АЬа Зег УаЬ УаЬ Суз Ьеи Ьеи
145 150 155 160
Азп Азп РЬе Туг Рго Агд СЬи АЬа Ьуз УаЬ 61п Тгр Ьуз УаЬ Азр Азп
165 170 175
АЬа Ьеи СЬп Зег Б1у Азп Зег СЬп СЬи Зег УаЬ ТЬг СЬи СЬп Азр Зег
180 185 ЬЭО
Ьуз Азр Зег ТЬг Туг Зег Ьеи Зег Зег ТЬг Ьеи ТЬг Ьеи Зег Ьуз АЬа
195 200 205
Азр Туг СЬи Ьуз Н1з Ьуз УаЬ Туг АЬа Суз СЬи УаЬ ТЬг Н1з 61п С1у
210 215 220
Ьеи Зег Зег Рго УаЬ ТЫ Ьуз Зег РЬе Азп Агд СЬу СЬи Суз
225 230 235
<210> 5 <2Ы> 1392 <212> ДНК <213> Ното зарЬепз <400> 5 агддадгггд ддсЕдадсЕд даЕгЕЕссЕЕ дсЕдсЕаЕЁЕ ЁааааддЕдЕ ссадЕдЕдад60 дЕдсадсЕдд ЕддадЕсЕдд дддаддсЕЕд дЕдаадссЕд дддддЕсссЕ ЕадасЕсЕсс120
ЕдЕдЕадЕсЕ сЕддаЕЕсас ЕЁЕсасЕаас дссЕддаЕда ЁсЕдддЕссд ссаддсЕсса180 дддааддддс ЕддадЕдддЕ ЕддссдЕаЕЕ ааааддаааа сЕдаЕддЕдд дасаасадас240
ЕасдсЕдсас ссдЕдааадд садаЕЕсасс аЕсЕсаадад аЕдаЕЕсааа ааасасдсЕд300
ЕаЕсЕдсааа ЕдаасадосЕ даааассдад дасасадссд ЕдЁаЕЕасЕд Еассасаддд360 ддадЕддсЕд аддааЕасЕд дддссаддда асссЕддЕса ссдЕеЕссЕс адссЕссасс420 аадддсссаЕ сддЕсЕЕссс ссЕддсдссс ЕдсЕссадда дсассЕссда дадсасадсд480 дсссЕдддсЕ дссЕддЕсаа ддасЕасЕЕс сссдаассдд ЕдасддЕдЕс дЕддаасЕса540 ддсдсЕсЕда ссадсддсдЕ дсасассЕЕс ссадсЕдЕсс ЕасадЕссЕс аддасЕсЕас600
ЕсссЕсадса дсдЕддЕдас сдЕдсссЕсс адсаасЕЕсд дсасссадас сЕасассЕдс660 аасдЕадаЕс асаадсссад саасассаад дЕддасаада садЕЕдадсд саааЕдЕЕдЕ720 дЕсдадЕдсс сассдЕдссс адсассассЕ дЕддсаддас сдЕсадЕсЕЕ ссЕсЕЕсссс780 ссаааассса аддасасссЕ саЕдаЕсЕсс сддассссЕд аддЕсасдЕд сдЕддЕддЕд840 дасдЕдадсс асдаадассс сдаддЕссад ЕЕсаасЕддЕ асдЕддасдд сдЕддаддЕд900 саЕааЕдсса адасааадсс асдддаддад садЕЕсааса дсасдЕЕссд ЕдЕддСсадс960 дЕссЕсассд ЕЕдЕдсасса ддасЕддсЕд аасддсаадд адЕасаадЕд сааддЕсЕсс1020 аасаааддсс Ессоадсссс саЕсдадааа ассаЕсЕсса ааассааадд дсадссссда1080 даассасадд ЕдЕасасссЕ дсссссаЕсс сдддаддада Едассаадаа ссаддЕсадс1140 сЕдассЕдсс ЕддЕсааадд сЕЕсЕасссс адсдасаЕсд ссдЕддадЕд ддададсааЕ1200 дддсадссдд адаасаасЕа саадассаса ссЕсссаЕдс ЕддасЕссда сддсЕссЕЕс1260
ЕЕссЕсЕаса дсаадсЕсас сдЕддасаад адсаддЕддс адсаддддаа сдЕсЕЕсЕса1320
ЕдсЕссдЕда ЕдсаЕдаддс ЕсЕдсасаас сасЕасасдс адаададссЕ сЕсссЕдЕсЕ 1380 ссдддЕаааЕ да1392 <210> 6 <211> 463 <212> БЕЛОК <21Э> Ното зариепз <400> 6
- 60 012872
МеЬ (31и 1 РЬе 61у Ьеи Зег Тгр Не РЪе Ъеи А1а А1а Не Ьеи Ьуз 15 61у
5 10
Уа1 <31п Суз 61и Уа1 С1п Ьеи Уа1 С1и Зег 61у С1у С1у Ьеи Уа1 Ъуз
20 25 30
Рго 61у 61у Зег Ъеи Агд Ъеи Зег Суз Уа1 Уа1 Зег 01у РЬе ТЪг РЬе
35 40 45
ТЬг Азп А1а Тгр Мер 11е Тгр Уа1 Агд е1п А1а Рго 01у Ъуз С1у Ъеи
50 55 60
С1и Тгр Уа1 С1у Агд 11е Ъуз Агд Ьуз ТЬг Азр С1у С1у ТЪг ТЬг Азр
65 70 75 80
Туг А1а А1а Рго Уа1 Ъуз С1у Агд РЬе ТЬг 11е Зег Агд Азр Азр Зег
85 90 95
Ъуз Азп ТЬг Ъеи Туг Ъеи 61п МеЬ Азп Зег Ъеи Ьуз ТЬг В1и Азр ТЬг
100 105 но
А1а Уа1 Туг Туг Суз ТЪг ТЪг С1у С1у Уа1 А1а 01и Азр Туг Тгр б1у
115 120 125
<31п б1у ТЬг Ъеи Уа1 ТЪг Уа1 Зег Зег А1а Зег ТЬг Ьуз (31у Рго Зег
130 135 140
Уа1 РЬе Рго Ъеи А1а Рго Суз Зег Агд Зег ТЬг Зег б1и Зег ТЬг А1а
145 150 155 160
А1а Ъеи С1у Суз Ъеи Уа1 Ъуз Азр Туг РЬе Рго СэЪи Рго Уа1 ТЬг Уа1
165 170 175
Зег Тгр Азп Зег С1У А1а Ьеи ТЬг Зег С1у Уа1 НЪз ТЪг РЬе Рго А1а
180 185 190
Уа1 Ъеи С1п Зег Зег С1у Ьеи Туг Зег Ъеи Зег Зег Уа1 Уа1 ТЬг Уа1
195 200 205
Рго Зег Зег Азп РЬе С1у ТЬг С1п ТЬг Туг ТЬг Суз Азп Уа1 Азр Нхз
210 215 220
Ъуз Рго Зег Азп ТЬг Ъуз Уа1 Азр Ъуз ТЬг Уа1 <31и Агд Ъуз Суз Суз
225 230 235 240
Уа1 б1и Суз Рго Рго Суз Рго А1а Рго Рго Уа1 А1а С1у Рго Зег Уа1
245 250 255
РЬе Ъеи РЬе Рго Рго Ъуз Рго Ьуз Азр ТЬг Ьеи Мер 11е Зег Агд ТЬг
260 265 270
Рго С1и Уа1 ТЬг Суз Уа1 Уа1 Уа1 Азр Уа1 Зег Н1з С1и Азр Рго С1и
275 280 285
Уа1 С1п РЬе Азп Тгр Туг Уа1 Азр С1у Уа1 С1и Уа1 Н13 Азп А1а Ъуз
290 295 300
ТЬг Ъуз Рго Агд С1и Б1и С1п РЬе Азп Зег ТЬг РЬе Агд Уа1 Уа1 Зег
305 310 315 320
Уа1 Ъеи ТЬг Уа1 Уа1 Н1з С1п Азр Тгр Ъеи Азп С1у Ьуз С1и Туг Ъуз
325 330 335
Суз Ъуз Уа1 Зег Азп Ъуз е1у Ъеи Рго А1а Рго 11е С1и Ъуз ТЬг Не
- 61 012872
340 345 350
Бег Ьуз ТНг Ьуз С1у БЬп Рго Агд СЬи Рго СЬп УаЬ Туг ТНг Ьеи Рго
355 360 365
Рго Зег Агд СЬи СЬи Мер ТНг Ьуз Азп СЬп УаЬ Зег Ьеи ТНг Суз Ьеи
370 375 380
УаЬ Ьуз С1у РЬе Туг Рго Зег Азр Не АЗ. а УаЬ СЬи Тгр СЬи Зег Азп
385 390 395 400
С1у СЬп Рго СЬи Азп Азп Туг ьуз ТЬг ТНг Рго Рго Мер Ьеи Азр Зег
405 410 415
Азр 61у Зег РЬе РЬе Ьеи Туг Зег Ьуз Ьеи ТНг УаЬ Азр Ьуз Зег Агд
420 425 430
Тгр С1п СЬп СЬу Азп Уа1 РЬе Зег Суз Зег Уа1 Мер Нхз СЬи АЬа Ьеи
435 440 445
Н15 АЗП ΗΪ3 Туг ТЬг СЬп Ьуз Зег Ьеи Зег Ьеи Зег Рго СЬу Ьуз
450 455 460
<210> 7 <211> 720 <212> ДНК <213> Ното зархепз <400> 7 аРдаддсРсс даРаРРдРда аРсРссРдса РассРдсада РссддддРсс адсададРдд ассРРсддсс аРсЬРсссдс ааРаасРрср ддРаасРссс адсасссРда асссаРсадд сРдсРсадсР РдасРсадРс ддРсРадРса адссадддса сРдасаддРР аддсРдадда аадддасасд саРсЬдаРда аРсссадада аддададрдр сдсРдадсаа дссРдадсРс ссРддддсРд РссасРсРсс дадссРссРд дрсРосасад садрддсадр ЪдРРддддРР асРддадаРР дсадРРдааа ддссааадРа сасададсад адсадасРас дсссдРсаса сРааРдсРсР сРдсссдРса сааадраард сРссРдаРсР дддрсаддса РаРРасРдса ааасдаасРд РсРддаасЬд садрддаадд дасадсаадд дадааасаса аададсРРса дддРсРсРдд ссссРддада даРЬсааоРа аРРРдддРРс садаРРРРас РдсаадсРсР РддсРдсасс ссРсРдРРдР РддаРаасдс асадсассРа аадРсРасдс асаддддада арссадрддд 60 дссддссРсс 120 РРРддаРРдд 180 раарсдддсс 240 асРдааааРс 300 асааасРаРс 360 аРсРдРсРРс 420 дрдссрдсрд 480 ссРссааРсд 540 садссРсадс 600 сРдсдаадРс 660 дрдррадрда 720 <2Ь0> 8 <211> 238 <212> БЕЛОК <213> Ното зархепз <400> 8
Мер 1 Агд Ьеи Рго АЬа 5 СЬп Ьеи Ьеи СЬу Ьеи ЬО Ьеи Мер Ьеи Тгр УаЬ 15 Зег
СЬу Зег Зег СЬу Азр 1Ье УаЬ Мер ТНг СЬп Зег Рго Ьеи Зег Ьеи Рго
20 25 30
УаЬ ТНг Рго С1у СЬи Рго АЬа Зег 1Ье Зег Суз Агд Зег Зег СЬп Зег
35 40 45
Ьеи Ьеи СЬп Зег Азп С1у РЬе Азп Туг Ьеи Азр Тгр Туг Ьеи СЬп Ьуз
50 55 60
Рго С1у СЬп Зег Рго СЬп Ьеи Ьеи Ые Туг Ьеи СЬу Зег Азп Агд АЬа
65 70 75 80
- 62 012872
Зег СЬу УаЬ Рго Азр 85 Агд РЬе Зег СЬу Зег С1у Зег 90 СЬу ТЬг Азр 95 РЬе
Т11г Ьеи Ьуз Не Зег Агд УаЬ СЬи АЬа СЬи Азр УаЬ СЬу УаЬ Туг Туг
100 105 но
Суз МеЬ СЬп АЬа Ьеи СЬп ТЪг Не ТЪг РЬе .СЬу СЬп СЬу ТЬг Агд Ьеи
115 120 125
С1и Не Ьуз Агд ТЬг УаЬ АЬа А1а Рго Зег УаЬ РЬе Не РЬе Рго Рго
130 135 140
Зег Азр СЬи СЬп Ьеи Ьуз Зег СЬу ТЬг АЬа Зег УаЬ УаЬ Суз Ьеи Ьеи
145 150 155 160
Азп Азп РЬе Туг Рго Агд СЬи. АЬа Ьуз УаЬ СЬп Тгр Ьуз УаЬ Азр Азп
165 170 175
АЬа Ьеи СЬп Зег СЬу Азп Зег СЬп СЬи Зег Уа1 ТЬг СЬи СЬп Азр Зег
180 185 190
Ьуз Азр Зег ТЬг Туг Зег Ьеи Зег Зег ТЬг Ьеи ТЬг Ьеи Зег Ьуз АЬа
195 200 205
Азр Тут СЬи Ьуз НЬз Ьуз УаЬ Туг АЬа Суз СЬи УаЬ ТЬг НЬз СЬп СЬу
210 215 220
Ьеи Зег Зег Рго УаЬ ТЬг Ьуз Зег РЬе Азп Агд СЬу СЬи Суз
225 230 235
<210> 9 <2Η> 1404 ' <212> ДНК <213> Ното зарЬепз <400> 9 аЬддадЬЬЬд ддсЬдадсЬд дсЬЬНЛс!:!: дЪддсоаЬЬЬ ЬааааддЬдЬ ссадЬдЬдад 60 дЬдсадсЬдЬ ЬддадЬсЬдд дддаддсЬЬд д-ЬасадссЬд ς9ςςςϊοαοΐ дадасЬсЬсс 120 ЬдЬдсадссЬ.сЬддасЬсас сЬТХаасааХ ЬсЬдссаЬда ссЬдддТссд ссаддсЬсса 180 дддааддддс ЬддадЬдддб сЪсаасЬасЬ адЬддаадЬд дЪддЬассас аЬасЬасдса 24 0 дасЬссдЬда адддссддЬЬ сассаьсьсс ададасЬсЬс ссаадаасас дсЬсТаЬсЬд300 сааа-Сдааса дссЬдададс сдаддасасд дссдЬа'Ьа'Ы: ас+дЬдсддс ссдЬддабас360 адсЬаЬддЬа сдасссссСа ЬдадЬасСдд ддссадддаа сссЬддЬсас сдЬсСссЬса420 дс+Ьссасса адддсссаЬс сдЬсЬТсссс сЬддсдсссЬ д-ЬЬссаддад сассЬссдад480 адсасадссд сссЬдддсЬд ссЬддЬсаад дасЪасЬЬсс ссдаассддЬ дасддЬдЬсд540
ЬддаасЬсад дсдсссЬдас садсддсдЬд сасассЬ+сс сддсТдЬссЬ асадЪссЬса600 ддасЬсЬас-Ь сссЬсадсад сдЬддЬдасс дЬдсссЬсса дсадсНддд сасдаадасс660
ЬасассЬдса асдЬадаРса саадсссадс аасассаадд Ьддасаадад адЬЬдадЬсс720 аааЬаЬддЬс ссссаЬдссс аЬсаЬдссса дсассЬдадЬ ьссЬдддддд ассаЬсадЬс730
ЬЬссЬдЫзсс ссссаааасс сааддасасЬ сЬсаЪдаЬсЬ сссддаоссс ЬдаддЬсасд840
ЬдсдЬддЬдд ЪддасдЪдад ссаддаадас сесдаддЬсс адН.саас1:д дЬасдбддаЬ900 ддсдЬддадд ЬдсаЬааЬдс саадасааад ссдсдддадд адсадЬЬсаа садсасдЪас960 сдЬдЬддСса дсдкссЬсас сдЬссЬдсас саддасЬддс Ьдаасддсаа ддад+асаад1020
ЬдсааддЬсЬ ссаасааадд ссЬсссдЬсс ^ссаЬсдада ааассаЬсТс сааадссааа1080 дддсадсссс дададссаса ддрдбасасс сЬдсссссаЬ сссаддадда даЬдассаад1140 аассаддЬса дссЬдассЬд ссЬддГсааа ддсЬЬсЬасс ссадсдасаЬ сдссдЬддад1200
Ьдддададса аЬдддсадсс ддадаасаас Ьасаадасса сдссЬсссдЬ дсЬддасЬсс1260 дасддсЬссЬ ссСХссЬсГа садсаддсГа ассд+ддаса ададсаддЬд дсаддадддд1320 ааЬдЬсНсЬ саЬдсЬссд1: даЬдоаЬдад дсЬсЬдсаса ассасЬасас асадаададс 1380 сЬсЬсссЬдЬ с1_с..ддд1аа аЬда1404
- 63 012872 <210 10 <211> 467 <212> БЕЛОК <213> Нотс зархепз <400> 10
Μβΐ 1 С1и РЬе СЬу Ьеи 5 Зег Тгр Ьеи РЬе Ьеи ЬО УаЬ АЬа Ι1Ε Ьеи Ьуз 15 СЬу
УаЬ СЬп Суз СЬи Уа1 СЬп Ьеи Ьеи С1и Зег СЬу С1у СЬу Ьеи УаЬ СЬп
20 25 . 30
Рго СЬу СЬу Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз АЬа А1а Зег СЬу Ьеи ТЬг РЬе
35 40 45
Авп Азп Зех АЬа МеХ ТЬг Тгр УаЬ Агд СЬп АЬа Рго СЬу Ьуз СЬу Ьеи
50 55 60
С1и Тгр Уа1 Зег ТЬг ТЬг Зег СЬу Зег СЬу СЬу ТЬг ТЬг Туг Тух АЬа
65 70 75 80
Азр Зег Уа1 Ьуз СЬу Агд РЬе ТЬг ГЬе Зег Агд Азр Зег Рго Ьуз Азп
85 90 95
ТЬг Ьеи Туг Ьеи СЬп Мер Азп Зег Ьеи Агд АЬа СЬи Азр. ТЬг АЬа УаЬ
100 105 110
Туг Туг Суз АЬа А1а Агд СЬу Туг Зег Туг СЬу ТЬг ТЬг Рго Туг СЬи
115 120 125
Туг Тгр СЬу СЬп СЬу ТЬг Ьеи УаЬ ТЬг УаЬ Зег Зег АЬа Зег ТЬг Ьуз
130 135 140
51у Рго Зег УаЬ РЬе Рго Ьеи А1а Рго Суз Зег Агд Зег ТЬх Зег СЬи
145 150 155 160
Зег ТЬг А1а А1а Ьеи СЬу Суз Ьеи УаЬ Ьуз Азр Туг РЬе Рхо СЬи Рго
165 170 175
Уа1 ТЬг УаЬ Зег Тгр Азп Зег СЬу АЬа Ьеи ТЬх Вех СЬу УаЬ НЬз ТЬх
180 185 190
РЬе Рго АЬа УаЬ Ьеи СЬп Зег Зег СЬу Ьеи Туг Зег Ьеи Зех Зех УаЬ
195 200 205
УаЬ ТЬг УаЬ Рго Зег Зег Зег Ьеи С1у ТЬг Ьуз ТЬх Тух ТЬх Суз Азп
210 215 220
УаЬ Азр ΗΪΞ Ьуз Рго Зег Азп ТЬг Ьуз УаЬ Азр Ьуз Ахд УаЬ СЬи Зех
225 230 235 240
Ьуз Туг СЬу Рго Рго Суз Рго Зег Суз Рго АЬа Рго СЬи РЬе Ьеи СЬу
245 250 255
С1у Рго Зег УаЬ РЬе Ьеи РЬе Рго Рго Ьуз Рго Ьуз Азр ТЬг Ьеи Мех
260 265 270
Ые Зех Агд ТЬг Рго СЬи Уа1 ТЬг Суз УаЬ УаЬ УаЬ Азр УаЬ Зег СЬп
275 280 285
С1и Азр Рго СЬи УаЬ СЬп РЬе Азп Тгр Туг УаЬ Азр СЬу УаЬ СЬи УаЬ
290 295 300
НЬз Азп АЬа Ьуз ТЬг Ьуз Рго Агд СЬи СЬи СЬп РЬе Азп Зех ТЬг Тух
- 64 012872
305 310
Агд Уа1 Уа1 Зег Уа1 325 Деи ТЬг Уа1
Дуз С1и Туг Дуз 340 Суз Дуз Уа1 Зег
61и Дуз ТЬг 355 Не Зег Дуз А1а Дуз 360
Туг ТЬг 370 Деи Рго Рго Зег С1п 375 С1и
Деи 385 ТЬг Суз Деи Уа1 Дуз 390 С1у РЬе
Тгр С1и Зег Азп В1у 405 В1п Рго С1и
Уа1 Деи Азр Зег 420 Азр В1у Зег РЬе
Азр Дуз Зег 435 Агд Тгр С1п С1и <31у 440
Н1з С1и 450 А1а Деи Нхз Аз η Н1з 455 Туг
315 320
Деи Нхз 330 С1П Азр Тгр Деи Азп 335 С1у
Аз η 345 Дуз С1у Деи Рго Зег 350 Зег 11е
61у С1п Рго Агд <31и 365 Рго С1п Уа1
С1и Меб ТЬг Дуз 380 Азп С1п Уа1 Зег
Туг Рго Зег 395 Азр Не А1а Уа1 61и 400
Азп Азп 410 Туг Дуз ТЬг ТЬг Рго 415 Рго
РЬе 425 Деи Туг Зег Агд Деи 430 ТЬг Уа1
Аз η Уа1 РЬе Зег Суз 445 Зег νβΐ Меб
ТЬг С1п Дуз Зег 4 60 Деи Зег Деи Зег
Деи С1у Дуз
465 <210> 11 <211> 711 <212> ДНК <213> Ното зархепз <400> 11 абддасабда адабдбдаса дбсассабса ааассаддда ссабсааддб саассбдаад ддссадддда ссдссаДсбд ббсбабссса бсссаддада сЪдасдсТда садддссбда дддбссссдс Ьссадабдас сбЪдссдддс аадссссбаа Дсадбддсад абЬббдсаас сасдасбдда абдадсадбЪ дададдссаа дбдбсасада дсааадсада дсбсдсссдб
Дсадсбссбд ссадТсТсса аадбсддадс адбссбдабс Ьддс’Ьскддд 66асбасТдб дабсадасда дааабсбдда адбасадбдд дсаддасадс сбасдадааа сасааададс дддсбссбдс басбсбддсб ссдаддддсс 60 бссбсссбдб сбдсабсбдб аддадасада 120 аббадсадсб абббаааббд дбабсадсад 180
66666Сд6д6 ссадбббдса аадбддддбс 24 0 асадабббса сбсбсассаб садсадбсбд 300 033089381:1: асаббссссс баббассббс 360 асбдбддсбд сассабсбдб сббсабсббс 420 асбдссбсбд 66дбдбдссб дсбдаабаас 480 ааддбддаба асдсссбсса абсдддбаас 540 ааддасадса ссбасадссб садсадсасс 600 сасааадбсб асдссбдсда адбсасссаб 660 ббсаасаддд дададбдбба д 711 <210> 12 <211> 236 <212> БЕЛОК <213> Ното зархепз <400> 12
Неб Азр Меб Агд Уа1 Рго А1а 61п Деи Деи С1у Деи Деи Деи Деи Тгр
1 5 10 15
Деи Агд Е1у А1а Агд Суз Азр 11е С1п Меб ТЬг С1п Зег Рго Зег Зег
20 25 30
- 65 012872
Ьеи Зег А1а 35 Зег Уа1 61у Азр Агд 40 Уа1 ТЪг Не ТЬг Суз Агд 45 А1а Зег
Агд Зег Не Зег Зег Туг Ьеи Азп Тгр Туг С1п 61п Ьуз Рго С1у Ьуз
50 55 60
А1а Рго Ьуз Уа1 Ьеи 11е РЬе РЪе Уа1 Зег Зег Ьеи С1п Зег Й1у Уа1
65 70 75 80
Рго Зег Агд РЬе Зег С1у Зег С1у Зег 61у ТЬг Азр РЪе ТЫ Ьеи ТЫ
85 90 95
Не Зег Зег Ьеи 61п Рго Б1и Азр РЪе А1а ТЪг Туг Туг Суз 61П С1П
100 105 110
Азп Туг 11е Рго Рго Не ТЬг РЪе Е1у С1п С1у ТЫ Агд Ьеи 61и Не
115 120 125
Агд Агд ТЪг Уа1 А1а А1а Рго Зег Уа1 РЬе Не РЪе Рго Рго Зег Азр
130 135 140
61и С1п Ьеи Ьуз Зег С1у ТЪг А1а Зег Уа1 Уа1 Суз Ьеи Ьеи Азп Азп
145 150 155 160
РЪе Туг Рго Агд 61и А1а Ьуз Уа1 61п Тгр Ьуз Уа1 Азр Азп А1а Ьеи
165 170 175
61п Зег 61у Азп Зег б1п С1и Зег Уа1 ТЪг 61и 61П Азр Зег Ьуз Азр
180 185 190
Зег ТЪг Туг Зег Ьеи Зег Зег ТЪг Ьеи ТЪг Ьеи Зег Ьуз А1а Азр Туг
195 200 205
61и Ьуз Н1з Ьуз Уа1 Туг А1а Суз С1и Уа1 ТЪг Н1з С1п С1у Ьеи Зег
210 215 220
Зег Рго Уа1 ТЫ Ьуз Зег РЬе Азп Агд С1у С1и Суз
225 230 235
<210> 13 <211> 1398 <212> ДНК <213> Ното зарЬепз <400> 13 аРддадЬСРд дЬдсадсЬдд Ьд1:дсадсд1: ддсааддддс дасЪссдЬда саааЬдааса ЬасЬаЬЬасд ассаадддсс дссдсссЪдд Ьсаддсдссс СасРсссРса ЬдсаасдЪад ддЬсссссаЪ ЬРссссссаа д1:дд1:ддасд дадд£дса£а д1:садсд1:сс ддсЬдадсТд 5ддадЬс0дд сСддасасас ЬддадЬдддЬ адддссда^Ь дссЬдададс дЬаЬддасдЬ са'ЬссдЬсЬЬ дсЬдссЬддЬ 1:дассадсдд дсадсдрддр аЬсасаадсс дсссаЬсаЪд аасссаадда Ьдадссадда аЬдссаадас ^сассдЪсс1:
ддГЫЬссЬс дддаддсдЬд сНсадЬадс ддсааЫаЬа сассаЫЬсс сдаддасасд сЬддддссаа сссссрддсд сааддасЬас сдЬдсасасс дассдрдссс садсаасасс сссадсасс! сасРсЬса-Ьд адассссдад ааадссдсдд· дсассаддас дЫдсЬЫЫ дСссадссСд да£ддса1:дс ЬддЬаЪдаСд ададасааЫ: дс£дЪа£а££ дддассасдд ссыдысса 5Ьссссдаас ЬЬсссддЫд ЬссадсадсС ааддЬддаса дадЫссЪдд аРсЪсссдда дтссадПса даддадсадр ЪддсЪдаасд
ЪаададдСдР ддаддЬсссЬ асЬдддЪссд даадЬааЬаа ссаадаасас асЬдЬдсдад ЬсассдЬсЬс ддадсассЬс сддЪдасддЬ ЪссЬасадЪс Сдддсасдаа адададЬЬда ддддассаЪс ссссЬдаддЬ асЬддЬасдЬ 1саасадсас дсааддадРа ссадСдСсад 60 дадасбЫсс 120 ссаддсСсса 180 аЬаЬСаРдса 240 дсОдЬабсЪд 300 адаГсссддс 360 сЬсадсЫсс 420 сдададсаса 480 дЬсдЬддаас 540 сЪсаддасЬс 600 дассЬасасс 660 дЬссаааЪаЬ 720 адЬсЬЪссЬд 780 сасд1:дсдЬд 840 ддаЬддсдЬд 900 дЪассдЬдЬд 960 саад^дсаад 1020
- 66 012872 д1:с1:ссааса ааддсс^ссс дЬссЬссаЬс дадаааасса £с1:ссааадс ссссдададс сасадд^дЬа сасссбдссс сса^сссадд аддада5дас дПсадссЬда ссЬдссЬддЬ саааддсЬСс Ьассссадсд асаЬсдссдЬ адсааСдддс адссддадаа саасЪасаад ассдсдссЬс ссдЬдсЬдда ЬссЬЬсЬЬсс ЬсЬасадсад дсЬаассдЬд дасаададса ддгддсадда ЬЬсбсаЬдсТ ссдГдаИдса ГдаддсЬсЬд сасаассасЬ асасасадаа сЬд!с1:сЬдд дЬаааЪда сааадддсад 1080 саадаассад 1140 ддад£дддад 1200 сЬссдасддс 1260 ддддааЬдЬс 1320 дадссЬсксс 1380 1398 <210> 14 <211> 465 <212> БЕЛОК <213> Ното заргепз <400> 14
МеЪ 1 Б1и РЬе С1у Ьеи 5 Зег Тгр Уа1 РЬе Ьеи 10 Уа1 А1а Ьеи Ьеи Агд 15 61у
Уа1 С1п Суз С1п Уа1 С1п Ьеи Уа1 Б1и Зег 61 у С1у 61у Уа1 Уа1 С1п
20 25 30
Рго 61у Агд Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег 61у Нхз ТЬг РЬе
35 40 45
Зег Зег АЗр Б1у МеЬ Н1з Тгр Уа1 Агд Б1п А1а Рго Б1у Ьуз 61у Ьеи
50 55 60
Б1и Тгр νβΐ А1а Не Не Тгр Туг Азр Б1у Зег Азп Ьуз Туг Туг А1а
65 70 75 80
Азр Зег Уа1 Ьуз 61у Агд РЬе ТЬг Ые Зег Агд Азр Азп Зег Ьуз АЗП
85 90 95
ТЬг Ьеи Туг Ьеи С1п МеЬ Азп Зег Ьеи Агд А1а Б1и Азр ТЬг А1а Уа1
100 105 110
Туг Туг Суз А1а Агд Азр Рго С1у Туг Туг Туг Б1у МеЬ Азр Уа1 Тгр
115 120 125
С1у 61п 61 у ТЬг ТЬг Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег А1а Зег ТЬг Ьуз С1у рго
130 135 140
Зег Уа1 РЬе Рго Ьеи А1а Рго Суз Зег Агд Зег ТЬг Зег С1и Зег ТЬг
145 150 155 160
А1а А1а Ьеи С1у Суз Ьеи Уа1 Ьуз Азр Туг РЬе Рго 61и Рго Уа1 ТЬг
165 170 175
1/а1 Зег Тгр Азп Зег Б1у А1а Ьеи ТЬг Зег Б1у Уа1 Шз ТЬг РЬе Рго
180 185 190
А1а Уа1 Ьеи С1 п Зег Зег Б1у Ьеи Туг Зег Ьеи Зег Зег Уа1 Уа1 ТЬг
195 200 205
Уа1 Рго Зег Зег Зег Ьеи С1у ТЬг Ьуз ТЬг Туг ТЬг Суз Азп Уа1 Азр
210 215 220
Η1Ξ Ьуз Рго Зег Азп ТЬг Ьуз Уа1 Азр Ьуз Агд Уа1 61и Зег Ьуз Туг
225 230 235 240
61у Рго Рго Суз Рго Зег Суз Рго А1а Рго 61и РЬе Ьеи Б1у Б1у Рго
245 250 255
Зег Уа1 РЬе Ьеи РЬе Рго Рго Ьуз Рго Ьуз Азр ТЬг Ьеи НеЬ Не Зег
- 67 012872
260 265 270
Агд ТЬг Рго СЬи УаЬ ТЬг Суэ УаЬ УаЬ УаЬ Азр УаЬ Зег СЬп СЬи Азр
275 280 285
Рго СЬи УаЬ СЬп РЬе Азп Тгр Туг УаЬ Азр СЬу УаЬ СЬи УаЬ НЬз Азп
290 295 300
АЬа Ьуз ТЬг Ьуз Рго Агд СЬи СЬи СЬп РЬе Азп Зег ТЫ Туг Агд УаЬ
305 310 345 320
УаЬ Зег УаЬ Ьеи ТЬг УаЬ Ьеи НЬз СЬп Азр Тгр Ьеи Азп 64 у Ьуз СЬи
325 330 335
Туг Ьуз Суз Ьуз УаЬ Зег Азп Ьуз СЬу Ьеи Рго Зег Зег Ые СЬи Ьуз
340 345 350
ТЬг Ые Зег Ьуз АЬа Ьуз СЬу СЬп Рго Агд СЬи Рго СЬп УаЬ Туг ТЬг
355 360 365
Ьеи Рго Рго Зег СЬп СЬи СЬи МеЬ ТЬг Ьуз Азп СЬп УаЬ Зег Ьеи ТНг
370 375 380
Суз Ьеи УаЬ Ьуз С1у РЬе Туг Рго Зег Азр Ые АЬа УаЬ СЬи Тгр СЬи
365 390 395 400
Зег Азп СЬу СЬп Рго СЬи Азп Азп Туг Ьуз ТНг АЬа Рго Рго УаЬ Ьеи
405 440 415
Азр Зег Азр С1у Зег РЬе РЬе Ьеи Туг Зег Агд Ьеи ТЬг УаЬ Азр Ьуз
420 425 430
Зег Агд тгр СЬп СЬи СЬу Азп УаЬ РЬе Зег Суз Зег Уа1 МеЬ НЬз СЬи
435 440 445
АЬа Ьеи НЬз Азп НЬз Туг ТЬг СЬп Ьуз Зег Ьеи Зег Ьеи Зег Ьеи С1у
450 455 4 60
Ьуз
465 <210> 15 <211> 705 <212> ДНК <213> Ното зарЬепз <400> 15 аЬдЫдссаЬ сасаасЬсаЬ ЬдддЫЬсЬд ЫдсЬсЬддд ЫссадсЫс саддддЬдаа60 аЫдЬдсЬда сЬсадЬсЬсс адасЫЬсад ЬсЬдЬдасЬс саааададаа адЬсассаЬс120 ассЬдссддд ссадЬсадад ааЫддЬадт адсЫасасЬ ддЬассадса дааассадаЬ160 садЬсЬссаа аасЬссЬсаЬ саадЬаЬдсЬ ЬсссадЬссЬ ЬсЬсаддддЬ ссссЬсдадд240
ЫсадЪддса дТддаЬЫдд дасаааЫЬс асссЬсасса ЬсааЬддссЬ ддаадсЬдаа300 даОдсТдсаа сЫаЫаЫд ЬсаЬсададЬ ддЬсдЬЫас сдсЬсасЫЬ сддсддаддд360 ассааддЬдд адаОсааасд аасЬдЬддсЬ дсассаЬсЬд ЬсЫсаЬсЫ сссдссаТсЬ420 даЬдадсадЬ ЬдаааЬсЬдд аасЬдссЬЫ дЫдНдНдсс ЬдсЬдааЬаа сЫсЬаЬсса460 адададдсса аадЬасадЬд даадд^ддаТ. аасдсссЬсс ааЬсдддЬаа сЬсссаддад540 адЬдЬсасад адсаддасад сааддасадс асЫасадсс Ьсадсадсас ссЬдасдсЬд600 адсааадсад асЬасдадаа асасааадЬс ЬасдссЬдсд аадЬсассса Ьсадддсс1:д660 адсЬсдсссд Ьсасааадад сЫсаасадд ддададьд ы адЬда705 <210> 16 <211> 233
- 68 012872 <212> БЕЛОК <213> Ното зарЬепз <400> 16
Ме£ 1 Ьеи Рго Бег СЬп 5 Ьеи Не СЬу РЬе Ьеи 10 Ьеи Ьеи Тгр УаЬ Рго 15 АЬа
Бег Агд СЬу СЬи Не УаЬ Ьеи ТЬг СЬп Бег Рго Азр РЬе СЬп Зег УаЬ
20 25 30
ТЬг Рго Ьуз СЬи Ьуз УаЬ ТЬг Не ТЬг Суз Агд АЬа Бег СЬп Агд ЬЬе
35 40 45
СЬу Бег Зег Ьеи НЬз Тгр Туг СЬп СЬп Ьуз Рхо Азр С1п Зег Рго Ьуз
50 55 60
Ьеи Ьеи Не Ьуз Туг АЬа Бег СЬп Зег РЬе Зег СЬу УаЬ Рго Зег Агд
65 70 75 80
РЬе Зег С1у Зег 01 у Зег СЬу ТЬг Азп РЬе ТЬг Ьеи ТЬг Не Азп СЬу
85 90 95
Ьеи СЬи АЬа СЬи Авр АЬа АЬа ТЬг Туг Туг Суз НЬз СЬп Зег СЬу Агд
100 105 110
Ьеи Рго Ьеи ТЬг РЬе СЬу СЬу СЬу ТЬг Ьуз УаЬ СЬи ЬЬе Ьуз Агд ТЬг
115 120 125
УаЬ А1а АЬа Рго Зег УаЬ РЬе 11е РЬе Рго Рго Зег Азр СЬи СЬп Ьеи
130 135 140
Ьуз Зег СЬу ТЬг АЬа Зег УаЬ УаЬ Суз Ьеи Ьеи Азп Азп РЬе Туг Рго
145 150 155 160
Агд СЬи АЬа Ьуз УаЬ СЬп Тгр Ьуз УаЬ Азр Азп А1а Ьеи СЬп Зег СЬу
165 170 175
Азп Зег СЬп СЬи Бег УаЬ ТЬг СЬи СЬп Азр Зег Ьуз Азр Зег ТЬг Туг
180 185 190
Бег Ьеи Бег Бег ТЬг Ьеи ТЬг Ьеи Зег Ьуз АЬа Азр Туг СЬи Ьуз НЬз
195 200 205
Ьуз УаЬ Туг А1а Суз С1и УаЬ ТЬг НЬз СЬп СЬу Ьеи Зег Зег Рго УаЬ
210 215 220
ТЬг Ьуз Бег РЬе Азп Агд С1у СЬи Суз
225 230
<210> 17 <211> 1410 <212> ДНК <213> Ното зарЬепз <400> 17 аЪддадЬЬЬд дЬдсадсЬдд ЬдЬдсадссЬ ддсааддддс дасЬссдЬда саааЬдааса дсдаЬаассЬ 1:ссЪсадсЪЪ ддсЬдадсЬд ЬддадЬсЬдд сЬдда1:Ьсас ЬддадЬдддЬ адддссдаЫ: дссЬдадсдс асЬаСЬасЬа ссассааддд ддЬЬЬЬссЬс дддаддсдЬд сНсадЪадс ддсадНаЪа сассаЬсЬсс Ьдаддасасд сддааЬддас сссаЬссдЬс дЬЬдсЬсЫЬ дЬссадссЬд ЬаЬддсаЬдс Ьсааа^даЬд ададасааЪЬ дсЬдЬдЬаП дЪсЬддддсс ЬЬсссссЬдд
Ъаададдрд! ддаддЁсссЬ асЬдддЬссд даааЬааЬаа ссааааасас асЬдЬдсдад аадддассас сдсссЬдсЪс ссадСдЬсад дадасТсЪсс ссаддсЬсса аЬасЬаЬдса дсЬдЬаЪсЬд адаЬадЬасд ддЬсассдЬс саддадсасс
120
180
240
300
360
420
480
- 69 012872
Ьссдададса садссдсссЬ дддсХдссХд дСсааддасЬ асХХссссда ассддХдасд540 дЪдХсдЬдда асХсаддсдс ссХдассадс ддсдбдсаса ссХХсссддс ХдХссХасад600
ЬссХсаддас 5сХасХсссХ садсадсдгд дЬдассдХдс ссгссадсад сгХдддсасд660 аадассХаса ссХдсаасдХ адабсасаад сссадсааса ссааддХдда саадададХХ720 дадХссаааХ аХддбссссс аХдсссаХса Хдсссадсас сХдадбХссХ ддддддасса780
ХсадХсХгсс гдЬХсссссс аааасссаад дасасЕсХса ХдаХсЕсссд дасссс^дад840 дгсасдЬдсд ХддХддХдда сдЬдадссад даадассссд аддХссад^Х саасЪддЪас900 дЬддаХддсд ХддаддХдса ХааХдссаад асааадссдс дддаддадса дХХсаасадс960 асдХассдХд ХддЬсадсдХ ссЬсассдЮ сХдсассадд асгддсХдаа сддсааддад1020 гасаадгдса аддХсХссаа саааддссХс ссдЬссЬсса Хсдадаааас саХсХссааа1080 дссааадддс адссссдада дссасаддЬд ХасасссХдс ссссаЬссса ддаддадаХд1140 ассаадаасс аддХсадссС дассЬдссгд дХсаааддсЬ Хс5ассссад сдасаХсдсс1200 д^ддадХддд ададсааХдд асадссддад аасаасбаса адассасдсс ХсссдХдсХд1260 дасХссдасд дсХссХХсХХ ссХсХасадс аддсХаассд гддасаадад саддХддсад1320 даддддаагд 1сХХсЬсаХд сЬссдХдагд саЬдаддсХс Хдсасаасса сЬасасасад 1380 аададссХсЬ сссХдХсХсХ дддХаааХда1410 <210> 18 <211> 469 <212> БЕЛОК <213> Ното зарЬепз <400> 18
Мер С1и 1 РЬе СЬу Ьеи 5 Зег Тгр УаЬ РЬе Ьеи Уа1 10 АЬа Ьеи Ьеи Ахд 15 СЬу
УаЬ СЬп Суз СЬп УаЬ СЬп Ьеи УаЬ СЬи Зег СЬу СЬу СЬу УаЬ УаЬ СЬп
20 25 30
Рго б1у Агд Зех Ьеи Агд Ьеи Зег Суз АЬа АЬа Зег СЬу РЬе ТЬг РЬе
35 40 45
Зех Зег Туг СЬу МеХ Нхз Тгр УаЬ Ахд СЬп АЬа Рго СЬу Ьуз СЬу Ьеи
50 55 60
СЬи Тгр УаЬ АЬа УаЬ 11е Зег Азп Азр сьу Азп Азп Ьуз Туг Туг АЬа
65 70 75 80
Азр Зег УаЬ Ьуз СЬу Ахд РЬе ТЬх 1Ье Зег Агд Азр Азп Зех Ьуз Азп
85 90 95
ТЬг Ьеи Туг Ьеи СЬп Мех Азп Зег Ьеи Зех АЬа СЬи Азр ТЬх АЬа УаЬ
ьоо 105 110
Туг Туг Суз АЬа Ахд Азр Зех ТЬг АЬа 1Ье ТЬх Туг Туг Тух Тух СЬу
115 120 125
МеХ Азр УаЬ Тгр СЬу СЬп СЬу ТЬх ТЬг УаЬ ТЬх Уа1 Зег Зех АЬа Зех
130 Ь35 140
ТЬг Ьуз СЬу Рхо Зег УаЬ РЬе Рхо Ьеи АЬа Рго Суз Зег Агд Зег ТЬх
145 Ь50 155 Ь60
Зех СЬи Зех ТЬг АЬа АЬа Ьеи СЬу Суз Ьеи УаЬ Ьуз Азр Туг РЬе Рхо
165 170 175
61и Рго Уа1 ТЬх УаЬ Зех Тхр Азп Зег СЬу АЬа Ьеи ТЬх Зех СЬу УаЬ
180 185 190
Н1з ТЬх РЬе Рхо АЬа УаЬ Ьеи СЬп Зег Зег СЬу Ьеи Туг Зех Ьеи Зех
195 200 205
Зег УаЬ Уа1 ТЬг УаЬ Рго Зег Зех Зег Ьеи СЬу ТЬг Ьуз ТЬг Туг ТЬх
210 215 220
Суз 225 Азп Уа1 Азр Низ Ьуз 230 Рго Зег Азп ТЬг Ьуз 235 Уа1 Азр Ьуз Агд Уа1 240
С1<1 Зег Ьуз Туг СХу Рго Рго Суз Рго Зег Суз Рго А1а Рго С1и РЬе
245 250 255
Ьеи С1у С1у Рго Зег УаХ РЬе Ьеи РЬе Рго Рго Ьуз Рго Ьуз Азр ТЬг
260 265 270
Ьеи МеЬ Не Зег Агд ТЬг Рго СХи Уа1 ТЬх Суз Уа1 УаЬ УаХ Азр УаХ
275 280 285
8ег 61п С1и Азр Рго С1и УаХ СХп РЬе Азп Тгр Туг УаХ Азр С1у Уа1
290 295 300
(31и Уа1 ΗΪ3 Азп А1а Ьуз ТЬг Ьуз Рго Ахд СХи СХи С1п РЬе Азп Зег
305 310 315 320
ТЫ Туг Агд Уа1 УаХ Зег Уа1 Ьеи ТЬг УаХ Ьеи Η1Ξ <ЗХп Азр Тгр Ьеи
325 330 335
Азп С1у Ьуз СХи Туг Ьуз Суз Ьуз УаХ Зег Азп Ьуз С1у Ьеи Рго Зег
340 345 350
Зег Не 61и Ьуз ТЬг Не Зег Ьуз АХ а Ьуз С1у СХп Рго Агд СХи Рго
355 360 365
(31п Уа1 Туг ТЬг Ьеи Рго Рго Зег СХп СХи С1и Мее ТЫ Ьуз Азп схп
370 375 380
Уа1 Зег Ьеи ТЬг Суз Ьеи Уа1 Ьуз СХу РЬе Туг Рго Зег Авр Не АХ а
385 390 395 400
Уа1 б1и Тгр 61и Зег Азп <31у Θ1Π Рго СХи Азп Азп Туг Ьуз ТЬг ТЬг
405 410 415
Рго Рго УаХ Ьеи Азр Зег Азр СХу Зег РЬе РЬе Ьеи Туг Зег Агд Ьеи
420 425 430
ТЬг Уа1 Азр Ьуз Зег Агд Тгр С1п С1и С1у Азп Уа1 РЬе Зег Суз Зег
435 440 445
Уа1 Мее ΗΪ3 <31и А1а Ьеи ΗΪ3 Азп Н1з Туг ТЬг СХп Ьуз Зег Ьеи Зег
450 455 460
Ьеи Зег Ьеи С1у Ьуз
65 <210> 19 <211> 714 <212> ДНК <213> Ното зархепз <400> 19 аеддасаеда дддессссдс есадсессед дддсесседс еасеседдсе ссдаддедсс60 адаедедаса ессадаЬдас ссадЬсесса ессессседе сДдсаЬсТдЬ сддадасада120 дДсассаСса сеедссдддс аадТсадааЬ аееадеадсе аеееаааЬед дееесадсад180 ааассаддда аадссссТаа дсДссТдаЬс ТаТдсТдсаТ соддееедаа дсдЬддддРс240 ссаТсасдде Ъсадеддеад еддаеседдд асадаеееса сесесассае саддасес7д300 саасседаед аеееедсаас ееасесседе сассададее асадесессс аеесасееЬс360 ддсссЬддда ссааадТдда еаесааасда асЪдТддсТд сассаДскдТ сеесаЬсеес420
- 71 012872 ссдссаГсбд ЬВсЬаБссса Бсссаддада ЫдасдсЬда садддссБда аЬдадсадГЬ дададдссаа дЬдРсасада дсааадсада дсВсдсссдр даааЬсГдда адЬасадБдд дсаддасадс сБасдадааа сасааададс асГдссБЫд ааддВддаТа ааддасадса сасааадБсБ Ыааасаддд
ЬГдРдЬдссЬ асдсссБсса ссЬасадссЬ асдссВдсда дададЬдЫа дсЬдааЬаас 480 аБсдддЬаас 540 садсадсасс 600 адБсасссаЬ 660 дЪда 714 <210> 20 <211> 236 <212> БЕЛОК <213> Ното зарБепе <400> 20
МеЬ 1 Азр МеЬ Агд νβΐ 5 Рго А1а С1п Беи Беи С1у 10 Беи Беи Беи Беи 15 Тгр
Беи Агд Е1у А1а Агд Суз Азр Не Е1п Μβΐ ТЬг 61п Зег Рго Зег Зег
20 25 30
Беи Зег А1а Зег Уа1 С1у Азр Агд Уа1 ТЫ 11е ТЬг Суз Агд А1а Зег
35 40 45
(31п Азп 11е Зег Зег Туг Беи Азп Тгр РЬе Е1п С1п Вуз Рго 61у Буз
50 55 60
А1а Рго Буз Беи Беи Не Туг А1а А1а Зег <31у Беи Буз Агд Е1у Уа1
65 70 75 80
Рго Зег Агд РЬе Зег С1у Зег 61у Зег Е1у ТЬг Азр РЬе ТЬг Беи ТЫ
85 90 95
Не Агд ТЬг Беи Е1п Рго Азр Азр РЬе А1а ТЫ Туг Зег Суз ΗΪ5 61п
100 105 но
Зег Туг Зег Беи Рго РЬе ТЫ РЬе 61 у Рго С1у ТЬг Буз Уа1 Азр 11е
115 120 125
Вуз Агд ТЬг Уа1 А1а А1а Рго Зег Уа1 РЬе Не РЬе Рго Рго Зег Азр
130 135 140
С1и С1п Беи Вуз Зег С1у ТЫ А1а Зег Уа1 Уа1 Суз Беи Беи Азп Азп
145 150 155 160
РЬе Туг Рго Агд <31и А1а Вуз Уа1 61п Тгр Буз Уа1 Азр Азп А1а Беи
165 170 175
С1п Зег С1у Азп Зег С1п С1и Зег Уа1 ТЬг С1и С1п Азр Зег Вуз Азр
180 185 190
Зег ТЬг Туг Зег Беи Зег Зег ТЬг Беи ТЬг Беи Зег Вуз А1а Азр Туг
195 200 205
<31и Буз Н13 Вуз Уа1 Туг А1а Суз С1и Уа1 ТЬг Н1з С1п С1у Беи Зег
210 215 220
Зег Рго Уа1 ТЬг Буз Зег РЬе Азп Агд С1у Е1и Суз
225 230 235
<210> 21 <211> 1413 <212> ДНК <213> Ното заргепз
- 72 012872 <400> 21 аЕдааасасс ЕдЕддЕСсЕЕ ссЕссЕдсЕд дЕддсадсЕс ссадаЕдддЕ ссЕдЕсссад60 дЕдсадсЕдс аддадЕсддд сссаддасЕд дЕдаадссЕЕ сддадасссЕ дЕсссЕсасс120
ЕдсасЕдЕсЕ сЕддЕдасЕс саЕсадЕадЕ аасЕаЕЕдда дсЕддаЕссд дсадсссдсс180 дддаадддас ЕддадЕддаЕ ЕдддсдЕаЕс ЕаЕассадЕд ддддсассаа сЕссаасссс240
ЕсссЕсаддд дЕсдадЕсас саЕЕЕЕадса дасасдЕсса адаассадЕЕ сЕсЕсЕдааа300 сЕдадЕЕсЕд Едассдссдс ддасасддсс дЕдЕаЕЕасЕ дЕдсдадада.ЕсдЕаЕЁасЕ 360 аЕааЕЕсддд дасЕЕаЕЕсс аЕссЕЕсЕЕЕ дасЕасЕддд дссадддаас ссЕддЕсасс420 дЕсЕссЕсад сЕЕссассаа дддсссаЕсс дЕсЕЕссссс ЕддсдсссЕд сЕссаддадс480 ассЕссдада дсасадссдс ссЕдддсЕдс сЕддЕсаадд асЕасЕЕссс сдаассддЕд540 асддЕдЕсдЕ ддаасЕсадд сдсссЕдасс адсддсдЕдс асассЕЕссс ддсЕдЕссЕа600.
садЕссЕсад дасЕсЕасЕс ссЕсадсадс дЕддЕдассд ЕдсссЕссад садсЕЕдддс660 асдаадассЕ асассЕдсаа сдЕадаЕсас аадсссадса асассааддЕ ддасаадада720 дЕЕдадЕсса ааЕаЕддЕсс сссаЕдссса ЕсаЕдсссад сассЕдадЕЕ ссЕдддддда780 ссаЕсадЕсЕ ЕссЕдЕЕссс сссаааассс ааддасасЕс ЕсаЕдаЕсЕс ссддассссЕ840 даддЕсаадЕ дсдЕддЕддЕ ддасдЕдадс саддаадасс ссдаддЕсса дЕЕсаасЕдд900
ЕасдЕддаЕд дсдЕддаддЕ дсаЕааЕдсс аадасааадс сдсдддадда дсадЕЕсаас960 адсасдЕасс дЕдЕддЕсад сдЕссЕсасс дЕссЕдсасс аддасЕддсЕ даасддсаад1020 дадЕасаадЕ дсааддЕсЕс саасаааддс сЕсссдЕссЕ ссаЕсдадаа аассаЕсЕсс1080 ааадссааад ддсадссссд ададссасад дЕдЕасассс ЕдсссссаЕс ссаддаддад1140 аЕдассаада ассаддЕсад ссЕдассЕдс сЕддЕсааад дсЕЕсЕассс садсдасаЕс1200 дссдЕддадЕ дддададсаа Едддсадссд дадаасаасЕ асаадассас дссЕсссдЕд1260 сЕддасЕссд асддсЕссЕЕ сЕЕссЕсЕас адсаддсЕаа ссдЕддасаа дадсаддЕдд1320 саддадддда аЕдЕсЕЕсЕс аЕдсЕссдЕд аЕдсаЕдадд сЕсЕдсасаа ссасЕасаса1380 садаададсс ЕсЕсссЕдЕс ЕсЕдддЕааа Еда .1413 <210> 22 <211> 470 <212> БЕЛОК <213> Ното заргепв <400> 22 . .
МеЕ 1 Ьуз ΗΪ3 Ьеи Тгр РЬе РЬе Ьеи Ьеи Ьеи Уа1 А1а А1а Рго Агд 15 Тгр
5 10
Уа1 Ьеи Зег С1п Уа1 С1п Ьеи С1п С1и Зег С1у Рго С1у Ьеи Уа1 Ьуз
20 25 30
Рго Зег С1и ТЬг Ьеи Зег Ьеи ТЬг Суз ТЬг Уа1 Зег С1у Азр Зег Не
35 40 45
Зег Зег Азп Туг Тгр Зег Тгр Не Агд С1п Рго А1а С1у Ьуз С1у Ьеи
50 55 60
С1и Тгр Не 01 у Агд Не Туг ТЬг Зег С1у С1у ТЬг Азп Зег Азп Рго
65 70 75 80
Зег Ьеи Агд СХу Агд Уа1 ТЬг Не Ьеи А1а Азр ТЬг Зег Ьуз Азп С1п
85 90 95
РЬе Зег Ьеи Ьуз Ьеи Зег Зег Уа1 ТЬг А1а А1а Азр ТЬг А1а Уа1 Туг
100 105 но
Туг Сув А1а Агд Азр Агд Не ТЬг Не Не Агд <31у Ьеи Не Рго Зег
115 120 125
РЬе РЬе Азр Туг Тгр С1у С1п 61у ТЬг Ьеи Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег А1а
130 135 140
Зег ТЬг Ьуз е1у Рго Зег Уа1 РЬе Рго Ьеи А1а Рго Суз Зег Агд Зег
145 150 155 160
ТЪг Зег 61и Зег ТЬг А1а А1а Ьеи б!у Суз Ьеи Уа1 Ьуз Азр Туг РЬе
- 73 012872
165 170 175
Рго СЬи Рго УаЬ ТЬг УаЬ Зег Тгр Азп Зег СЬу АЬа Ьеи ТЬг Зег 61у
180 185 190
УаЬ НЬз ТЬг РЬе Рго АЬа УаЬ Ьеи СЬп Зег Зег СЬу Ьеи Туг Зег Ьеи
195 200 205
Зег Зег УаЬ УаЬ ТЬг УаЬ Рго Зег Зег Зег Ьеи С1у ТЬг Ьуз ТЬг Туг
210 215 220
ТЬг Суз Азп УаЬ Азр НЬз Ьуз Рго Зег Азп ТЬг ьуз УаЬ Азр Ьуз Агд
225 230 235 240
УаЬ СЬи Зег Ьуз Туг СЬу Рго Рго Суз Рго Зег Суз Рго АЬа Рго СЬи
245 250 255
РЬе Ьеи С1у С1у Рго Зег УаЬ РЬе Ьеи РЬе Рго Рго Ьуз Рго Ьуз Азр
260 2 65 270
ТЬг Ьеи МеЬ ЬЬе Зег Агд ТЬг Рго СЬи УаЬ ТЬг Суз УаЬ УаЬ УаЬ Азр
275 280 285
УаЬ Зег СЬп СЬи Азр Рго СЬи УаЬ СЬп РЬе Азп Тгр Туг УаЬ Азр СЬу
290 295 300
УаЬ СЬи УаЬ НЬз Азп АЬа Ьуз ТЬг Ьуз Рго Агд СЬи СЬи СЬп РЬе Азп
305 310 315 320
Зег ТЬг Туг Агд УаЬ Уа1 Зег УаЬ Ьеи ТЬг УаЬ Ьеи НЬз СЬп Азр Тгр
325 330 335
Ьеи Азп С1у Ьуз СЬи Туг Ьуз Суз Ьуз УаЬ Зёг Азп ьуз С1у Ьеи Рго
340 345 350
Зег Зег Ые СЬи Ьуз ТЬг ЬЬе Зег Ьуз АЬа Ьуз СЬу СЬп Рго Агд СЬи
355 360 365
Рго СЬп УаЬ Туг ТЬг Ьеи Рго Рго Зег СЬп СЬи СЬи Меб ТЬг Ьуз Азп
37 0 375 380
СЬп УаЬ Зег Ьеи ТЬг Суз Ьеи УаЬ Ьуз СЬу РЬе Туг Рго Зег Азр Не
385 390 395 400
АЬа УаЬ СЬи Тгр СЬи Зег Азп СЬу СЬп Рго' СЬи Азп Азп Туг Ьуз ТЬг
405 410 415
ТЬг Рго Рго УаЬ Ьеи Азр Зег Азр СЬу Зег РЬе РЬе Ьеи Туг Зег Агд
420 425 430
Ьеи ТЬг Уа1 Азр Ьуз Зег Агд Тгр СЬп СЬи СЬу Азп УаЬ РЬе Зег Суз
435 440 445
Зег УаЬ МеЬ НЬз СЬи АЬа Ьеи НЬз Азп НЬз Туг ТЬг СЬп Ьуз Зег Ьеи
450 455 4 60
Зег Ьеи 8ег Ьеи С1у Ьуз
465 470 <210> 23 <211> 729 <212> ДНК <213> Ното зарЬепз
- 74 012872 <400> 23 аРддРдРРдс дасаРсдРда аРсаасРдса РддЬассаас дааРаРдддд аРсадсадсс ссРссссРса
РсРдРсРРса РсРРсссдсс
РдссРдсРда сРссааРсдд адссРсадса РдсдаадРса РдрРадРда адасссаддр РдасссадРс адРссадсса адааассаад РсссРдассд РдсаддсРда сРРЬсддсдд аРаасЬРсРа дРаасРссса дсасссРдас сссаРсаддд сРРсаРРРсР РссадасРсс дадрдрррра асадссрсср аррсадрддс адаРдРддса адддассаад аРсРдаРдад Ьессададад ддададрдрс дсРдадсааа ссрдадсРсд срдррдсрср срддсрдрдр РасадсРсса аааРРдсРса адсдддРсРд дРРРаРРРсР дРддадаРса садРРдаааР дссааадРас асададсадд дсадасРасд сссдРсасаа
РдссРасддд дадддссасс сРасРРадсЬ аРсРаРасдд ддаРсРсРдд сРсРдддсда асааРаадас РРРасРдддс ддасадаРРР сасрсрсасс дРсаасааЬа аасдаасрдр сРддаасРдс адРддааддр асадсаадда адааасасаа ададсегсаа
РЬаРадРаЬР ддсрдсасса сРсРдРРдРд ддаРаасдсс садсассРас адРсРасдсс саддддадад <210> 24 <211> 241 <212> БЕЛОК <213> Ното зарЬепз <400> 24
МеР 1 УаЬ Ьеи СЬп ТНг 5 СЬп УаЬ РНе Не Зег 10 Ьеи Ьеи Ьеи Тгр Пе 15 Зег
С1у А1а Туг СЬу Азр Не УаЬ Мер ТНг СЬп Зег Рго Азр Зег Ьеи АЬа
20 25 30
УаЬ Зег Ьеи С1у С1и Агд АЬа ТНг 11е Азп Суз Ьуз Зег Зег СЬп Зег
35 40 45
УаЬ Ьеи Туг Зег Зег Азп Азп Ьуз ТНг Туг Ьеи АЬа Тгр Туг СЬп СЬп
50 55 60
Ьуз Рго Агд 61п Рго Рго Ьуз Ьеи Ьеи Не Туг Тгр АЬа Зег Не Агд
. 65 70 7.5 30
СЬи Туг бЬу УаЬ Рго Азр Агд РНе Зег Б1у Зег СЬу Зег СЬу ТНг Азр
85 90 95
РНе ТНг Ьеи ТНг Не Зег Зег Ьеи СЬп АЬа СЬи Авр УаЬ АЬа Уа1 Туг
100 105 110
РНе Суз Θΐη 61п Туг туг Зег 1Ье Рго Рго Ьеи ТНг РНе СЬу СЬу СЬу
115 120 125
ТНг Ьуз УаЬ СЬи Пе Ьуз Агд ТНг УаЬ АЬа АЬа Рго Зег УаЬ РНе 1Ье
130 135 140
РНе Рго' Рго Зег Азр СЬи СЬп Ьеи Ьуз Зег СЬу ТНг АЬа Зег УаЬ УаЬ
145 150 155 160
Суз Ьеи Ьеи Азп Азп РНе Туг Рго Агд СЬи АЬа Ьуз УаЬ СЬп Тгр Ьуз
165 170 175
УаЬ Азр Азп АЬа Ьеи бЬп Зег С1у Азп Зег СЬп СЬи Зег УаЬ ТНг СЬи
180 185 ЬЭО
61п Азр Зег Ьуз Азр Зег ТНг Туг Зег Ьеи Зег Зег ТНг Ьеи ТНг Ьеи
195 200 205
Зег Ьуз АЬа Азр Туг СЬи Ьуз НЬз Ьуз УаЬ Туг АЬа Суз СЬи УаЬ ТЫ
210 215 220
- 75 012872
Ηί3 61п 01у Ъеи Зег Зег Рго Уа1 ТЬг Ъуз Зег РЬе Азп Агд С1у 01 и
225 230 235 240
Суз <210> 25 <211> 1419 <212> ДНК <213> Ното зарЪепз <400> 25 аЬддадЬЬЬд дЬдсадсЬдЬ ЬдЬдсадссЪ дддааддддс дасЬссдЬда саааЬдааса дсЪддададд ассдЬсЬссЬ адсассьссд дЬдасддЬдЬ сЬасадЬссЬ ддсасдаада ададЬЬдадЬ ддассаЪсад ссЪдаддЬса ЬддЪасдЪдд аасадсасдЪ ааддадЬаса Ьссааадсса дадаЪдасса аЬсдссдЬдд дЪдсЬддасЬ Ьддсаддадд асасадаада ддсЬдадсЬд ЬддадЬсЪдд сЪддаЬЬсас ЬддадЪдддЬ адддссддьь дссЬдададс ддсЬсЬасЪа садсЬЬссас адаасасадс одЬддаасЪс саддасЬсЬа ссЬасассЬд ссаааЬаЪдд ЪсЬЬссЪдЪЪ сдЬдсдЬддЬ аЬддсдЬдда ассдЬдЬддЬ адЬдсааддЪ аадддсадсс адаассаддЪ адЬдддадад ссдасддсЬс ддааЬдЬсЪЬ дасЬсЪсссЬ дсЬЬЬЬЬсЫ: дддадасЬЬд сЬЬЬадаадЬ сЬсадЬЬаЬЬ сассаЬсЪсс сдаддасдсд сЪасЬасддЬ саадддссса сдсссьдддс аддсдсссЪд сЬсссЬсадс саасдЬадаЬ ЬсссссаЬдс ссссссаааа ддЬддасдЪд ддЬдсаЬааЬ садсдьссЪс сЬссаасааа ссдададсса садссЪдасс сааЬдддоад сЬЬсЬЬссЬс сЬсаЪдсЪсс дЬсЬсЬдддЬ дЬддсЬаЬЬЬ дЬссадссЬд ЬаЬдссаЬда адЪддЪсдЬд ададасааН дссдЬаЬаЬЬ аЬддасдЬсЬ ЬссдЬсЬЬсс ьдссЬддЪса ассадсддсд адсдЬддЬда сасаадссса ссаЪсаЪдсс сссааддаса адссаддаад дссаадасаа ассдЬссЬдс ддссЬсссдЬ саддЬдЬаса ЬдссЪддЪса ссддадааса Ьасадсаддс дЬдаЬдсаЬд аааЬдаЬад
ЬааааддЪдЬ дддддЪсссЪ асЬдддЪссд дЬддЪасЬас ссаадаасас асЬдЬдсдаа ддддссаадд сссЬддсдсс аддасЬасЪЪ ЪдсасассЬЪ ссдЬдсссЬс дсаасассаа садсассЪда сЪсЬсаЬдаЬ ассссдаддЬ адссдсддда ассаддасЬд ссЬссаЬсда сссЬдссссс ааддсЬЪсБа асЬасаадас ЬаассдЪдда аддсЬсЬдса ссадьдьдад дадасЬсЪсс асаддсЪсса аЬасЬасдса дсЪдЬаЬсЪд даЬадсадЬд дассасддЬс сЬдсЪссадд ссссдаассд сссддсЬдЬс ЬадсадсЪЬд ддЬддасаад дЬЬссЬдддд сЪсссддасс ссадЫсаас ддадсадЬЪс дсЬдаасддс даааассаЬс аЪсссаддад ссссадсдас сасдссЬссс саададсадд саассасЬас
120
180
240
300
360
420
480
540
600
660
720
780
840
900
960
1020
1090
1140
1200
1260
1320
1380
1419 <210> 26 <211> 471 <212> БЕЛОК <213> Ното зарЪепз <400> 26
Меь 1 61и РЬе С1у Ъеи Зег Тгр Ъеи РЬе Ъеи Уа1 А1а 11е Ъеи Ъуз 15 С1у
5 10
Уа1 С1п Суз 61и Уа1 61п Ъеи Ъеи С1и Зег <31у 51у Азр Ъеи Уа1 С1п
20 25 30
Рго 61у 61 у Зег Ъеи Агд Ъеи Зег Суз А1а А1а Зег 61у РЬе ТЬг РЬе
35 40 45
Агд Зег Туг А1а МеЬ Азп Тгр Уа1 Агд С1п А1а Рго 61у Ъуз С1у Ьеи
50 55 60
Е1и Тгр Уа1 Зег Уа1 11е Зег С1у Агд 61у С1у ТЬг ТЬг Туг Туг А1а
65 70 75 80
Азр Зег Уа1 Ъуз 01 у Агд РЬе ТЬг Не Зег Агд Азр Азп Зег Ьуз Азп
85 90 95
- 76 012872
ТЬг Ьеи Туг Ьеи 100 61п МеЬ Азп Зег Ьеи Агд 105 А1а 61и Азр АЬа НО А1а УаЬ
Туг Туг Суз АЬа Ьуз Не АЬа Уа1 АЬа 61у 61и 61у Ьеи Туг Туг Туг
115 120 125
Туг 61у МеЬ Азр УаЬ Тгр С1у 61п С1у ТЬг ТЬг Уа1 ТЬг УаЬ Зег Зег
130 135 140
А1а Зег ТЬг Ьуз 61 у Рго Зег Уа1 РЬе Рго Ьеи А1а Рго Суз Зег Агд
145 150 155 160
Зег ТЬг Зег СЬи Азп ТЬг А1а А1а Ьеи 61у Суз Ьеи Уа1 Ьуз Азр Туг
165 170 175
РЬе Рго 61и Рго Уа1 ТЬг Уа1 Зег Тгр АЗП Зег 61у АЬа Ьеи ТЬг Зег
180 185 190
С1у Уа1 НЬз ТЬг РЬе Рго А1а Уа1 Ьеи 61п Зег Зег □1у Ьеи Туг Зег
195 200 205
Ьеи Зег Зег УаЬ Уа1 ТЬг Уа! Рго Зег Зег Зег Ьеи 61у ТЬг Ьуз ТЬг
210 215 220
Туг ТЬг Суз Азп Уа1 Азр ΗΪ3 Ьуз Рго Зег Азп ТЬг Ьуз Уа1 Азр Ьуз
225 230 235 240
Агд Уа1 61и Зег Ьуз Туг 61у Рго Рго Суз Рго Зег Суз Рго АЬа Рго
245 250 255
61и РЬе Ьеи 61 у 61 у Рго Зег Уа1 РЬе Ьеи РЬе Рго Рго ьуз Рго Ьуз
260 265 270
Азр ТЬг Ьеи Мер 11е Зег Агд ТЬг Рго 61и Уа1 ТЬг Суз Уа1 Уа1 УаЬ
275 230 235
Азр Уа1 Зег 61 п 61и Азр Рго 61и УаЬ 61 п РЬе Азп Тгр Туг Уа1 Азр
290 295 300
С1у Уа1 61и УаЬ НЬз Азп АЬа Ьуз ТЬг Ьуз Рго Агд СЬи БЬи 61 п РЬе
305 ЗЮ 315 320
Азп Зег ТЬг Туг Агд Уа1 Уа1 Зег Уа1 Ьеи ТЬг УаЬ Ьеи НЬз СЬп Азр
325 330 335
Тгр Ьеи Азп 61у Ьуз 61и Туг Ьуз Суз Ьуз Уа1 Зег Азп Ьуз 61 у Ьеи
340 345 350
Рго Зег Зег Не 61 и Ьуз ТЬг Не Зег Ьуз А1а Ьуз 61у СЬп Рго Агд
355 360 365
61и Рго С1п Уа1 Туг ТЬг Ьеи Рго Рго Зег 61п 61и 6Ьи МеЬ ТЬг Ьуз
370 375 380
Азп 61п УаЬ Зег Ьеи ТЬг Суз Ьеи УаЬ Ьуз 61у РЬе Туг Рго Зег Азр
385 390 395 400
Не А1а Уа1 61 и Тгр 61и Зег Азп 61у 61 п Рго 61и АЗП Азп Туг Ьуз
405 410 415
ТЬг ТЬг Рго Рго Уа1 Ьеи Азр Зег Азр 61 у Зег РЬе РЬе Ьеи Туг Зег
420 425 430
Агд Ьеи ТЬг Уа1 Азр Ьуз Зег Агд Тгр 61п 61и 61у Азп Уа1 РЬе Зег
- 77 012872
435
445
Суз Зег Уа1 Меб 450 ΗΪ3 С1и А1а Леи Н1з Азп Н1з Туг ТЬг С1п Луз Зег
455 460
Леи Зег Леи Зег Леи 61у Луз
465 470
<210> 27 <211> 720 <212> ДНК <213> Ното зархепз <400> 27 абддасабда адабдбдаса дбсассббса ааассаддда ссабсааддб саассбдаад ддббббддсс абсббсссдс аабаасббсб ддбаасбссс адсасссбда асссабсадд дддбссссдс бссадабдас сббдссдддс аддссссбаа бссдбддсад аббббдсаас аддддассас сабсбдабда абсссадада аддададбдб сдсбдадсаа дссбдадсбс бсадсбссбд ссадбсбсса аадбсадаас дсбссбдабс бддабсбддд ббасбасбдб дсбддабабс дсадббдааа ддссааадба сасададсад адсадасбас дсссдбсаса дддсбссбдс бссбсссбдб аббассаасб бабдсбдсдб асадабббса саасададбб ааасдаасбд бсбддаасбд садбддаадд дасадсаадд дадааасаса аададсббса басбсбддсб сбдсабсбдб абббаааббд ссадбббдсс сбсбсассаб асадбаабсс бддсбдсасс ссбсбдббдб бддабаасдс асадсассба аадбсбасдс асаддддада ссдаддбдсс аддбдасада дбабсадсад аададдддбс садсадбсбд бссддадбдс абсбдбсббс дбдссбдсбд ссбссаабсд садссбсадс сбдсдаадбс дбдббадбда
120
180
240
300
360
420
480
540
600
660
720 <210> 28 <211> 238 <212> БЕЛОК <213> Ното зарДепз <400> 28
Меб Азр 1 Меб Агд Уа1 5 Рго А1а С1п Леи Леи 10 01 у Леи Леи Леи Леи 15 Тгр
Леи Агд С1у А1а Агд Суз Азр Не С1п Меб ТЬг Б1п Зег Рго Зег Зег
20 25 30
Леи Зег А1а Зег Уа1 С1у Азр Агд Уа1 ТЬг РЬе ТЬг Суз Агд А1а Зег
35 40 45
61п Азп 11е ТЬг Азп Туг Леи Азп Тгр Туг Б1п С1п Луз Рго Б1у Луз
50 55 60
А1а Рго Луз Леи Леи Не Туг А1а А1а Зег Зег Леи Рго Агд С1у Уа1
65 70 75 80
Рго Зег Агд РЬе Агд Б1у Зег 61у Зег С1у ТЬг Азр РЬе ТЬг Леи ТЬг
85 90 95
11е Зег Зег Леи 61п Рго С1и Азр РЬе А1а ТЬг Туг Туг Суз С1п С1п
100 105 но
Зег Туг Зег Азп Рго Рго С1и Суз С1у РЬе С1у Б1П С1у ты ТЬг Леи
115 120 125
Азр 11е Луз Агд ТЬг Уа1 А1а А1а Рго Зег Уа1 РЬе Не РЬе Рго Рго
130 135 140
Зег Азр С1и Б1п Леи Луз Зег <31у ТЬг А1а Зег Уа1 Уа1 Суз Леи Леи
145 150 155 160
- 78 012872
Азп Азп РЬе Туг Рго Агд СЬи 165 АЬа Ьуз УаЬ 170 СЬп Тгр Ьуз УаЬ Азр 175 Азп
А1а Ьеи СЬп Зег СЬу Азп Зег 61П СЬи Зег УаЬ ТЬг СЬи СЬп Азр Зег
180 185 190
Ьуз Азр Зег ТЬг Туг Зег Ьеи Зег Зег ТЬг Ьеи ТЬг Ьеи Зег Ьуз АЬа
195 200 205
Азр Туг СЬи Ьуз НЬз Ьуз УаЬ Туг А1а Суз СЬи УаЬ ТЬг НЬз СЬп С1у
210 215 220
Ьеи Зег Зег Рго Уа1 ТЬг Ьуз Зег РЬе Азп Агд СЬу СЬи Суз
225 230 235
<210> 29 <211> 1434 <212> ДНК <213> Ното зарЬепз <400> 29 абддаасбдд дбдсадсбдд ЬдбдсадссЬ дддааддддс дасбсадбда сааабдааса адсадбддсб дбсассдбсб аддадсассб ссддбдасдд дбссЬасадб ббдддсасда аадададббд дддддассаб ассссьдадд аасбддбасд ббсаасадса ддсааддадб абс+ссааад даддадабда дасабсдссд сссдЬдсбдд аддбддсадд Ьасасасада ддсбссдсбд ЬддадбсЬдд сЬддаббсас ГддадбдддЬ адддссдаЬб дссбдададс ддбссбасба ссбсадсббс ссдададсас бдбсдбддаа ссбсаддасЬ адассбасас адЬссааа1:а садЬсббссЬ ЬсасдсдсдЬ Ьддабддад1: сдбассдбдЬ асаадбдсаа ссааадддса ссаадаасса бддадбддда асбссдасдд аддддаабдб ададссбсЬс ддЧ.иссО: дддаддсс+д сЫсадбадс сЬсзЪсса!:!: сассаЮТсс сдаддасасд сбасЬасбас сассаадддс адссдсссбд сбсаддсдсс сбасЬсссбс сбдсаасдба Ьддбссссса дббсссссса ддбддбддас ддаддбдсаб ддбсадсдбс ддбсЬссааа дссссдадад ддбсадссбд дадсаабддд сбссббсЫс сЬЬЬЬсасдс ссЬдбсбсЬд дЫдсбаббЬ дбсаадссбд ЬаЬадсабда адбадбадба ададасаасд дсЬдбдбаЫ: ддбабддасд ссабссдбсб ддсбдссбдд сбдассадсд адсадсдбдд дабсасаадс Ьдсссабсаб ааасссаадд дбдадссадд аабдссаада сбсассдбсс аааддссбсс ссасаддЬд!; ассбдссбдд садссддада сбсбасадса ЬссдЬдаЬдс ддбааабдас
Ьадааддбдб дддддбсссб асбдддьссд дбадЬбасаб ссаадаасбс асбдбдсдад ЬсЬддддсса Ьсссссбддс бсааддасба дсдЬдсасас бдассдбдсс ссадсаасас дсссадсасс асасЬсбсаб аадассссда сааадссдсд бдсассадда сдЬссЬссак асасссбдсс бсаааддсбб асаасЬасаа ддсбаассдб абдаддсбсЬ аддааббсЬд ссадбдбдад дадасбсбсс ссаддсЬсса абасбасдса асЬдбабсЬд адабдддбаб адддассасд дсссбдсбсс сбЬссссдаа сббсссддсб сбссадсадс сааддЬддас Ь.дадЫгсс’Ьд даЬсбсссдд ддбссадЬЬс ддаддадсад сЬддсбдаас сдадаааасс сссабсссад сбассссадс дассасдссЬ ддасаададс дсасаассас абда
120
180
240
300
360
420
480
540
600
660
720
780
840
900
960
1020
1080
1140
1200
1260
1320
1380
1434 <210> 30 <211> 472 <212> БЕЛОК <213> Ното зарЬепз <400> 30
Меб 1 СЬи Ьеи С1у Ьеи 5 Агд Тгр УаЬ РЬе Ьеи УаЬ 10 АЬа 11е Ьеи СЬи 15 С1у
УаЬ СЬп Суз СЬи УаЬ СЬп Ьеи УаЬ СЬи Зег СЬу СЬу С1у Ьеи Уа1 Ьуз
20 25 30
Рго 01у 61у Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз АЬа АЬа Зег СЬу РЬе ТЬг РЬе
35 40 45
- 79 012872
Зег Зег 50 Туг Зег МеЬ Азп Тгр УаЬ Агд СЬп АЬа Рго СЬу Ьуз СЬу Ьеи
55 60
СЬи Тгр УаЬ Зег Зег 1Ье Зег Зег Зег Зег Зег Туг Не Туг Туг АЬа
65 70 75 80
Азр Зег УаЬ Ьуз СЬу Агд РЬе ТЬг Не Зег Агд Азр Азп АЬа Ьуз Азп
85 90 95
Зег Ьеи Туг Ьеи СЬп МеЬ Азп Зег Ьеи Агд АЬа СЬи Азр ТЬг АЬа УаЬ
100 105 110
Туг Туг Суз АЬа Агд Азр СЬу Туг Зег Зег СЬу Тгр Зег Туг Туг Туг
115 120 125
Туг Туг СЬу МеЬ Азр УаЬ Тгр СЬу СЬп СЬу ТЬг ТЬг УаЬ ТЬг УаЬ Зег
130 135 140
Зег А1а Зег ТЬг Ьуз СЬу Рго Зег УаЬ РЬе Рго Ьеи АЬа Рго Суз Зег
145 150 155 160
Агд Зег ТЬг Зег СЬи Зег ТЬг АЬа АЬа Ьеи СЬу Суз Ьеи УаЬ Ьуз Азр
165 170 175
Туг РЬе Рго СЬи Рго УаЬ ТЬг УаЬ Зег Тгр Азп Зег СЬу АЬа Ьеи ТЬг
180 185 190
Зег СЬу УаЬ ΗΪΞ ТЬг РЬе Рго АЬа УаЬ Ьеи СЬп Зег Зег СЬу Ьеи Туг
195 200 205
Зег Ьеи Зег Зег УаЬ УаЬ ТЬг УаЬ Рго Зег Зег Зег Ьеи СЬу ТЬг Ьуз
210 215 220
ТЪг Туг ТЬг Суз Азп УаЬ Азр НЬз Ьуз Рго Зег Азп ТЬг Ьуз УаЬ Азр
225 230 235 240
Ьуз Агд УаЬ СЬи Зег Ьуз Туг СЬу Рго Рго Суз Рго Зег Суз Рго АЬа
245 250 255
Рго СЬи РЬе Ьеи СЬу СЬу Рго Зег УаЬ РЬе Ьеи РЬе Рго Рго Ьуз Рго
260 265 270
Ьуз Азр ТЬг Ьеи МеЬ ЬЬе Зег Агд ТЬг Рго СЬи УаЬ ТЬг Суз УаЬ УаЬ
275 280 285
УаЬ Азр УаЬ Зег СЬп СЬи Азр Рго СЬи УаЬ СЬп РЬе Азп Тгр Туг УаЬ
290 295 300
Азр СЬу УаЬ СЬи УаЬ НЬз Азп АЬа Ьуз ТЬг Ьуз Рго Агд СЬи СЬи СЬп
305 310 315 320
РЬе Азп Зег ТЬг Туг Агд УаЬ УаЬ Зег УаЬ Ьеи ТЬг УаЬ Ьеи НЬз еьп
325 330 335
Азр Тгр Ьеи Азп СЬу Ьуз СЬи Туг Ьуз Суз Ьуз УаЬ Зег Азп Ьуз СЬу
340 345 350
Ьеи Рго Зег Зег Не СЬи Ьуз ТЬг Не Зег Ьуз АЬа Ьуз СЬу СЬп Рго
355 360 365
Агд СЬи Рго СЬп УаЬ Туг ТЬг Ьеи Рго Рго Зег СЬп СЬи СЬи МеЪ ТЬг
370 375 380
Ьув Азп СЬп УаЬ Зег Ьеи ТЬг Суз Ьеи УаЬ Ьуз СЬу РЬе Туг Рго Зег
- 80 012872
385 390 395 400
Азр 1Ье АЬа УаЬ СЬи Тгр СЬи Зег Азп СЬу СЬп Рго СЬи Азп Азп Туг
405 410 415
Ьуз ТЬг ТЬг Рго Рго УаЬ Ьеи Азр Зег Азр СЬу Зег РЬе РЬе Ьеи Туг
420 425 430
Зег Агд Ьеи ТЬг УаЬ Азр Ьуз Зег Агд Тгр СЬп 61и С1у Азп УаЬ РЬе
435 440 445
Зег Агд Зег УаЬ Ме! НЬз СЬи АЬа Ьеи Н13 Азп НЬз Туг ТЫ СЬп Ьуз
450 455 460
Зег Ьеи Зег Ьеи Зег Ьеи СЬу Ьуз
465 470 <210> 31 <211> 723 <212> ДНК <213> Ното зархепз <400> 31 аЬдаддсЬсс да1а11д1да а!с!сс1дса 1асс!дсада 1с1ддад!дс адссдддЬдд 1дсад!111д ЫсаРсЫсс с1даа!аас1 1сдддЬаас! адсадсассс д!сассса!с 1да сЬдсЬсадс! Ьдасссадас ас!с1ад1са адсссддсса садасаддЫ аддсЬдадда дасаддддас сдсса!с1да 1с!а1сссад сссаддадад 1дасдс!дад адддссЬдад сс1ддддс!д 1ссас!с!с1 дадсс1сс1д дссЬссасад сад!ддсадс ГдЫддддЫ саадсЬддад 1дадсад!1д ададдссааа 1д1сасадад сааадсадас с1сдссод1с с1аа!дс1с! с!д!ссд!са с!1ад!да1д О1сс1да1с1 дддЬсаддда 1а11сс1дса аЮааасдаа ааа!с1ддаа д!асад!дда саддасадса 1асдадааас асааададс!
дда!асс1дд с!сс1ддаса дааадасс!а а!даад111с садаШсас 1дсааад1а1 с1д1ддс1дс с!дсс1с1д1 адд!дда!аа аддасадсас асааад!с1а 1саасадддд а!ссад!дса дссддссЬсс 111дааЫ дд саассддЫ с асЬдааааЬс асадс11а!д асса1с1д1с 1д1д1дсс1д адсссЬссаа с1асадсс1с сдссЬдсдаа ададьдыад
120
180
240
300
360
420
480
540
600
660
720
723 <210> 32 <211> 239 <212> БЕЛОК <213> Ното зарЬепз <400> 32
Ме! 1 Агд Ьеи Рго АЬа 5 СЬп Ьеи Ьеи СЬу Ьеи ЬО Ьеи Ме! Ьеи Тгр Ые 15 Рго
СЬу Зег Зег А1а Азр Ые УаЬ Ме! ТЬг СЬп ТЬг Рго Ьеи Зег Ьеи Зег
20 25 30
УаЬ ТЫ Рго СЬу СЬп Рго АЬа Зег ЬЬе Зег Суз Азп Зег Зег СЬп Зег
35 40 45
Ьеи Ьеи Ьеи Зег Азр СЬу Ьуз ТЬг Туг Ьеи Азп Тгр Туг Ьеи СЬп Ьуз
50 55 60
Рго СЬу СЬп Рго Рго СЬп Ьеи Ьеи Ые Туг СЬи УаЬ Зег Азп Агд РЬе
65 70 75 80
Зег СЬу УаЬ Рго Азр Агд РЬе Зег СЬу Зег СЬу Зег СЬу ТЬг Азр РЬе
85 90 95
ТЫ Ьеи Ьуз Ые Зег Агд УаЬ СЬи АЬа СЬи Азр УаЬ СЬу УаЬ Туг Зег
- 81 012872
100 105 110
Суз Меб Б1п Зег Не С1п Ьеи меб Суз Зег РЬе С1у Б1П С1у ТЬг Ьуз
115 120 125
Ьеи 01и 11е Ьуз Агд ТЬг Уа1 А1а А1а Рго Зег Уа1 РЬе 11е РЬе Рго
130 135 140
Рго Зег Азр С1и ст Ьеи Ьуз Зег С1у ТЬг А1а Зег Уа1 Уа1 Суз Ьеи
145 150 155 160
Ьеи Азп Азп РЬе Туг Рго Агд С1и А1а Ьуз Уа1 С1п Тгр Ьуз Уа1 Азр
165 170 175
Азп А1а Ьеи Б1п Зег С1у Азп Зег С1п С1и Зег Уа1 ТЬг С1и С1п Азр
180 185 190
Зег Ьуз Азр Зег ТЬг Туг Зег Ьеи Зег Зег ТЫ Ьеи ТЬг Ьеи Зег Ьуз
195 200 205
А1а Азр Туг 51и Ьуз Н1з Ьуз Уа1 Туг А1а Суз С1и Уа1 ТЬг Н1з С1п
210 215 220
С1у Ьеи Зег Зег Рго Уа1 ТЬг Ьуз Зег РЬе Азп Агд С1у С1и Суз
225 230 235
<210> 33 <211> 1410 <212> ДНК <213> Нолю зархепз <400> 33 абддасбдда д5бсадс5дд Ьдсааддсбб ддасаадддс садааддбсс дассбдадда адсбсдбссд д5сбссбсад ассбссдада асддбдбсдб садбссбсад асссадассб дббдадсдса бсадбсббсс дбсасдбдсд дбддасддсд асдббссдЬд басаадбдса ассааадддс ассаадаасс дбддадбддд дасбссдасд саддддаасд аададссбсб ссбддадсаб бдсадбсбдд сбддббасас 5693959931 адддсададб дссбдадабс дадасбасба ссбссассаа дсасадсддс ддаас5садд дасбсбас5с асассбдсаа аабдббдбдб бсббсссссс бддбддбдда 5ддаддбдса бддбсадсдб аддбсбссаа адссссдада аддбсадссб ададсаабдд дс6сс55сП: 5с55с5са5д ссс6д5с6сс ссббббсббд дбддсадсад саасаддбдс ссасЬсссад 60 адсбдаддОд аадаадссбд дддссбсадб дааддбсбсс 120 сЬОбассадс 5а6дд5а6са асбдддбдсд асаддссссб 180 дддабддабо адсдбббаса дбддбаасас ааасбабдса 240 сассабдасс дсадасасаб ссасдадсас адссбасабд 300 бдасдасасд дссдбдбабб асбдбдсдад ададддбадс 360 ббасддбабд дасдбсбддд дссаадддас сасддбсасс 420 дддсссабсд дбсббссссс бддсдсссбд сбссаддадс 480 ссбдддсбдс сбддбсаадд асбасббссс сдаассддбд 540 сдсбсбдасс адсддсдбдс асассббссс адсбдбссба 600 ссбсадсадс дбддбдассд бдсссбссад саасббсддс 660 сдбадабсас аадсссадса асассааддб ддасаадаса 720 сдадбдссса ссдбдсссад сассассбдб ддсаддассд 780 аааасссаад дасасссбса бдабсбсссд дассссбдад 840 сдбдадссас даадассссд аддбссадбб саасбддбас 900 баабдссаад асааадссас дддаддадса дббсаасадс 960 ссбсассдбб дбдсассадд асбддсбдаа сддсааддад 1020 саааддссбс ссадссссса бсдадаааас сабсбссааа 1080 ассасаддбд басасссбдс ссссабсссд ддаддадабд 1140 дассбдссбд дбсаааддсб бсбассссад сдасабсдсс 1200 дсадссддад аасаасбаса адассасасс бсссабдсбд 1260 ссбсбасадс аадсбсассд бддасаадад саддбддсад 1320 сбссдбдаЪд сабдаддсбс бдсасаасса сбасасдсад 1380 дддбааабда 1410 <210> 34 <211> 469 <212> БЕЛОК <213> Ното зархепз
- 82 012872
<400> 34 Тгр 5 Зег Ые Ьеи РЬе Ьеи УаЬ АЬа 10 АЬа АЬа ТЬг 15 СЬу
Ме£ Азр 1 Тгр ТЬг
АЬа НЬз Зег СЬп УаЬ С1п Ьеи УаЬ СЬп Зех СЬу АЬа СЬи УаЬ Ьуз Ьуз
20 25 30
Рго СЬу АЬа Зег УаЬ Ьуз УаЬ Зег Суз Ьуз АЬа Зег СЬу Туг ТЬг РЬе
35 40 45
ТЬг Зег Туг СЬу 11е Азп Тгр УаЬ Агд СЬп АЬа Рго СЬу СЬп СЬу Ьеи
50 55 60
СЬи Тгр МеЬ СЬу Тгр Ые Зег УаЬ Туг Зег СЬу Азп ТЬг Азп Туг АЬа
65 70 75 80
СЬп Ьуз Уа1 СЬп 61у Ахд УаЬ ТЬг Ме£ ТЬг АЬа Азр ТЬх Бег ТЬг Зег
85 90 95
ТЬг АЬа Туг МеХ Азр Ьеи Агд Зег Ьеи Агд Зег Азр Азр ТЬг АЬа УаЬ
100 105 110
Туг Туг Суз А1а Агд СЬи СЬу Зег Зег Зех Зег СЬу Азр Тух Тух Туг
115 120 125
С1у Меб Азр УаЬ Тгр СЬу СЬп СЬу ТЬг ТЬг УаЬ ТЬх УаЬ Зег Зег АЬа
130 135 140
Зег ТЬг Ьуз СЬу Рго Зег УаЬ РЬе Рго Ьеи АЬа Рго Суз Зег Агд Зег
145 150 155 160
ТЬг Зег 61и Зег ТЬх А1а АЬа Ьеи СЬу Суз Ьеи УаЬ Ьуз Азр Туг РЬе
165 170 175
Рго СЬи Рхо УаЬ ТЬг УаЬ Зег Тгр Азп Зех СЬу АЬа Ьеи ТЬг Зег СЬу
18 0 185 190
Уа1 НЬз ТЬг РЬе РГО АЬа УаЬ Ьеи СЬп Зег Зег СЬу Ьеи Туг Бег Ьеи
195 200 205
Зег Зег УаЬ УаЬ ТЬх УаЬ Рго Зег Зег Азп РЬе СЬу ТЬг СЬп ТЬг Туг
210 215 220
ТЬг Суз Азп УаЬ Азр НЬз Ьуз Рго Зег Азп ТЬг Ьуз УаЬ Азр Ьуз ТЬх
225 230 235 240
Уа1 СЬи Агд ьуз Суз Суз УаЬ СЬи Суз Рго Рго Суз Рго АЬа Рго Рго
245 250 255
УаЬ АЬа СЬу Рго Зег УаЬ РЬе Ьеи РЬе Рго Рго Ьуз Рго Ьуз Азр ТЬг
260 265 270
Ьеи МеЪ Ые Зег Агд ТЬг Рго СЬи Уа1 ТЬг Суз УаЬ УаЬ УаЬ Азр УаЬ
275 280 285
Зег НЬз СЬи Азр Рго С1и УаЬ СЬп РЬе Азп Тхр Туг УаЬ Азр СЬу УаЬ
290 295 300
СЬи УаЬ НЬз Азп А1а Ьуз ТЬг Ьуз Рго Агд СЬи СЬи СЬп РЬе Азп Зег
305 310 315 320
ТЬг РЬе Агд Уа1 УаЬ Зег УаЬ Ьеи ТЬг УаЬ УаЬ НЬз СЬп Азр Тхр Ьеи
325 330 335
- 83 012872
Азп СЬу Ьуз СЬи 340 Туг Ьуз Суз Ьуз УаЬ Зег 345 Азп Ьуз БЬу Ьеи 350 Рго АЬа
Рго 11е СЬи Ьуз ТНг 1Ье Зег Ьуз ТНг Ьуз С1у БЬп Рго Агд СЬи Рго
355 360 365
СЬп УаЬ Туг ТНг Ьеи Рго Рго Зег Агд СЬи СЬи Мер ТНг Ьуз Азп БЬп
370 375 380
УаЬ Зег Ьеи ТНг Суз Ьеи УаЬ Ьуз СЬу РНе Туг Рго Зег Азр 11е АЬа
385 390 395 400
УаЬ СЬи Тгр СЬи Зег Азп БЬу СЬп Рго СЬи Азп Азп Туг Ьуз ТНг ТНг
405 4Ь0 4Ь5
Рго Рго Мер Ьеи Азр Зег Азр БЬу Зег РНе РНе Ьеи Туг Зег Ьуз Ьеи
420 425 430
ТНг УаЬ Азр Ьуз Зег Агд Тгр СЬп БЬп БЬу Азп УаЬ РНе Зег Суз Зег
435 440 445
УаЬ Мер Н13 СЬи АЬа Ьеи НЬз Азп НЬз Туг ТНг СЬп Ьуз Зег Ьеи Зег
450 455 460
Ьеи Зег Рго СЬу Ьуз
465 <210> 35 <21Ь> 723 <212> ДНК <213> Ното зархепз <400> 35 аРдаддсРсс даРаЬЬдРда аРсРссРдса РассРдсада РсРддадРдс адссдддрдд ЬддасдРРсд РРсаРсРРсс сРдааРаасР РсдддРаасР адсадсассс дРсасссаРс Рда сРдсРсадсР Рдасссадас адРсРадРса адссаддсса садаРаддРР аддсРдадда дссаадддас сдссаРсРда РсРаРсссад сссаддадад ЬдасдсРдад адддссгдад ссРддддсРд ЬссасРсРсР дадссРссРд дссРссасад садрддсадс РдРРдддаРР сааддрддаа РдадсадРРд ададдссааа РдРсасадад сааадсадас срсдсссдрс сРааРдоРср сРдРссдРса саРасРдаРд сРссРдаРсР дддрсаддда РаРРасРдса аРсааасдаа ааарсрддаа драсадрдда саддасадса Расдадааас асааададсС ддаРассРдд ссссРддаса даасдассра аРдаадРРРс садаРРРсас РдсааааРаР сРдРддсРдс срдссЬсРдр аддРддаРаа аддасадсас асааадРсРа Рсаасадддд арссадРдса дссддссРсс РРРдРаРРдд саассддРРс асРдааааРс асадсРРсад ассарсрдрс РдРдРдссЬд сдсссРссаа сРасадссРс сдссРдсдаа ададРдРРад
120
180
240
300
360
420
480
540
600
660
720
723 <210> 36 <211> 239 <212> БЕЛОК <213> Ното зархепз <400> 36
Мер 1 Агд Ьеи Рго АЬа 5 СЬп Ьеи Ьеи СЬу Ьеи 10 Ьеи Мер Ьеи Тгр Не 15 РГО
БЬу Зег Зег АЬа 20 Азр 11е УаЬ Мер ТНг 25 СЬп ТНг Рго Ьеи Зех 30 Ьеи Зег
УаЬ ТНг Рхо СЬу БЬп Рго АЬа Зех 1Ье Зег Суз Ьуз Зег Зег СЬп Зег
40 45
- 84 012872
Ьеи Ьеи 50 НЬз ТЬг Азр СЬу ТЬг ТЪг Туг 55 Ьеи Туг Тгр 60 Туг Ьеи СЬп Ьуз
Рго СЬу СЬп Рго Рго СЬп Ьеи Ьеи Ые Туг СЬи УаЬ Зег Азп Агд РЬе
65 70 75 80
Зег СЬу УаЬ Рго Азр Агд РЪе Зег СЬу Зег СЬу Зег СЬу ТЬг Азр РЬе
85 90 95
ТЬг Ьеи Ьуз Ые Зег Агд УаЬ СЬи АЬа СЬи Азр УаЬ СЬу Ые Туг Туг
100 105 110
Суз МеЕ С1п Азп Ые СЬп Ьеи Рго Тгр ТЬг РЬе СЬу СЬп СЬу ТЬг Ьуз
115 120 125
УаЬ 01 и Ые Ьуз Агд ТЬг УаЬ АЬа АЬа Рго Зег УаЬ РЬе 11е РЬе Рго
130 135 140
Рго Зег Азр О1и СЬп Ьеи Ьуз Зег СЬу ТЬг АЬа Зег УаЬ УаЬ Суз Ьеи
145 150 155 160
Ьеи Азп Азп РЬе Туг Рго Агд СЬи АЬа Ьуз УаЬ СЬп Тгр Ьуз УаЬ Азр
165 170 175
Азп АЬа Ьеи СЬп Зег СЬу Азп Зег СЬп СЬи Зег УаЬ ТЬг СЬи СЬп Азр
180 185 190
Зег Ьуз Азр Зег ТЪг Туг Зег Ьеи Зег Зег ТЬг Ьеи ТЬг Ьеи Зег Ьуз
195 200 205
АЬа Азр Туг СЬи Ьуз НЬз Ьуз УаЬ Туг АЬа Суз СЬи УаЬ ТЬг НЬз СЬп
210 215 220
СЬу Ьеи Зег Зег Рго УаЬ ТЬг Ьуз Зег РЪе Азп Агд СЬу СЬи Суз
225 230 235
<210> 37 <211> 1416 <212> ДНК <213> Ното зарЬепз <400> 37 аЕдааасаса дйдсадсЕдс ЕдсасЕдЕсЕ дддаадддас ЕсссЕсаада сЕдадсЕсЕд ЕаЕЕасЕаЕд дЕсассдЕсЕ аддадсассЕ ссддЕдасдд дЕссЕасадЕ ЕЕсддсассс аадасадЕЕ.д ддассдЕсад ссЕдаддЕса ЕддЕасдЕдд аасадсасдЕ ааддадЕаса Ессаааасса дадаЕдасса аЕсдссдЕдд
ЕдЕддЕЕсЕЕ аддадЕсддд сЕддЕадсЕс ЕддадЕддаЕ дЕсдадЕсас Едассдссдс сЕЕсддддад ссЕсадссЕс ссдададсас ЕдЕсдЕддаа ссЕсаддасЕ адассЕасас адсдсаааЕд ЕсЕЕссЕсЕЕ сдЕдсдЕддЕ асддсдЕдда ЕссдЕдЕддЕ адЕдсааддЕ аадддсадсс адаассаддЕ адЕдддадад ссЕасЕдсЕд сссаддасЕд саЕсадЕадЕ ЕдддсдЕаЕс саЕдЕсасЕа ддасасддсс ЕЕаЕЕасЕас сассаадддс адсддсссЕд сЕсаддсдсЕ сЕасЕсссЕс сЕдсаасдЕа ЕЕдЕдЕсдад ссссссаааа ддЕддасдЕд ддЕдсаЕааЕ садсдЕссЕс сЕссаасааа ссдадаасса садссЕдасс сааЕдддсад дЕддсадсЕс дЕдаадссЕЕ ЕассасЕдда ЕаЕассадЕд дасасдЕсса дЕдЕаЕЕасЕ ддЕсЕддасд ссаЕсддЕсЕ ддсЕдссЕдд сЕдассадсд адсадсдЕдд даЕсасаадс ЕдсссассдЕ сссааддаса адссасдаад дссаадасаа ассдЕЕдЕдс ддссЕсссад саддЕдЕаса ЕдссЕддЕса ссддадааса ссадаЕдддЕ сддадасссЕ асЕддаЕссд ддадсассаа адаассадЕЕ дЕдсдадада ЕсЕддддсса ЕсссссЕддс ЕсааддасЕа дсдЕдсасас ЕдассдЕдсс ссадсаасас дсссадсасс сссЕсаЕдаЕ ассссдаддЕ адссасддда ассаддасЕд сссссаЕсда сссЕдссссс ааддсЕЕсЕа асЕасаадас ссЕдЕсссад дЕсссЕсасс дсадсссдсс сЕасааассс сЕсссЕдаад дддддЕсадд адддассасд дсссЕдсЕсс сЕЕссссдаа сЕЕсссадсЕ сЕссадсаас сааддЕддас ассЕдЕддса сЕсссддасс ссадЕЕсаас ддадсадЕЕс дсЕдаасддс даааассаЕс аЕсссдддад ссссадсдас сасассЕссс
120
130
240
300
360
420
480
540
600
660
720
780
840
900
960
1020
1080
1140
1200
1260
- 85 012872 аЛдсЬддасЬ ссдасддоЬс Еддсадсадд ддаасдЬсЬЬ асдсадаада дссТсЬсссЬ съЬсЬЬссЬс Ьасадсаадс сЬсаЬдсьсс дьдаьдсаСд дЬсГссдддЬ аааЪда
ЁсассдЁдда саададсадд аддсЬсЕдса саассасеас
1320
1380
1416 <210 38 <211> 471 <212> БЕЛОК <213> Ното зарЬепз
<400> 38 Ьеи Ьеи УаЬ 10 А1а АЬа Рго Агд 15 Тгр
МеХ 1 Ьуз НЬз Ьеи Тгр РЬе 5 РЬе Ьеи
УаЬ Ьеи Зег СЬп УаЬ СЬп Ьеи СЬп СЬи Зег 61 у Рго СЬу Ьеи УаЬ Ьуз
20 25 30
Рго Зег СЬи ТЬг Ьеи Зег Ьеи ТЬг Суз ТЬг УаЬ Зег 61у Зег Зег Ые
35 40 45
Зег Зег Туг Н13 Тгр Азп Тгр Не Агд 61п Рго А1а 61у Ьуз 61у Ьеи
50 55 60
СЬи Тгр Не СЬу Агд Не Туг ТЬг Зег СЬу Зег ТЬг Азп Туг Азп Рго
65 70 75 80
Зег Ьеи Ьуз Зег Агд УаЬ ТЬг Мее Зег Ьеи Азр ТЬг Зег Ьуз Азп СЬп
85 90 95
РЬе Зег Ьеи Ьуз Ьеи Зег Зег УаЬ ТЬг АЬа АЬа Азр ТЫ АЬа УаЬ Туг
100 105 но
Туг Суз АЬа Агд СЬи 61 у УаЬ Агд Туг Туг Туг АЬа Зег 61у Зег Туг
115 120 125
Туг Туг СЬу Ьеи Азр УаЬ Тгр СЬу СЬп СЬу ТЬг ТЬг Уа1 ТЬг УаЬ Зег
130 135 140
Зег А1а Зег ТЬг Ьуз СЬу Рго Зег УаЬ РЬе Рго Ьеи АЬа Рго Суз Зег
145 150 155 160
Агд Зег ТЬг Зег СЬи Зег ТЬг АЬа АЬа Ьеи СЬу Суз Ьеи УаЬ Ьуз Азр
165 170 175
Туг РЬе Рго СЬи Рго УаЬ ТЬг УаЬ Зег Тгр Азп Зег СЬу АЬа Ьеи ТЬг
180 185 190
Зег СЬу Уа1 НЬз ТЬг РЬе Рго АЬа УаЬ Ьеи СЬп Зег Зег СЬу Ьеи Туг
195 200 205
Зег Ьеи Зег Зег УаЬ УаЬ ТЬг УаЬ Рго Зег Зег Азп РЬе СЬу ТЬг СЬп
210 215 220
ТЬг Туг ТЬг Суз Азп УаЬ Азр НЬз Ьуз Рго Зег Азп ТЬг Ьуз УаЬ Азр
225 230 235 240
Ьуз ТЬг УаЬ СЬи Агд Ьуз Суз Суз УаЬ СЬи Суз Рго Рго Суз Рго АЬа
245 250 255
Рго Рго УаЬ АЬа СЬу Рго Зег УаЬ РЬе Ьеи РЬе Рго Рго Ьуз Рго Ьуз
260 265 270
Азр ТЬг Ьеи Мее Не Зег Агд ТЬг Рго СЬи УаЬ ТЬг Суз УаЬ УаЬ УаЬ
275 280 285
- 86 012872
Аар Уа1 Зег НБз 61и Азр Рго С1и Уа1 295 61п РЬе Азп 300 Тгр Туг Уа1 Азр
290
61у Уа1 С1и Уа1 НБз Азп А1а Буз ТЬг Вуз Рго Агд 61и 61и 61п РЬе
305 310 315 320
Азп Зег ТЬг РЬе Агд Уа1 Уа1 Зег Уа1 Беи ТЬг Уа1 Уа1 НБз 61п Азр
325 330 335
Тгр Беи Азп 61у Буе С1и Туг Вуз Суз Вуз Уа1 Зег Азп Вуз Е1у Беи
340 345 350
Рго А1а Рго Не 61и Буз ТЬг Не Зег Буз ТЬг Вуз С1у С1п Рго Агд
355 360 365
61ц Рго 61п Уа1 Туг ТЬг Беи Рго Рго Зег Агд 61и 61и Мер ТЬг Буз
370 375 380
Азп 61П Уа1 Зег Беи ТЬг Суз Беи Уа1 Буз 61у РЬе Туг Рго Зег Азр
385 390 395 400
11е А1а Уа1 С1и Тгр С1и Зег Азп С1у 61п Рго 61и Азп Азп Туг Буз
405 410 415
ТЬг ТЬг Рго Рго Мес Беи Азр Зег Азр С1у Зег РЬе РЬе Беи Туг Зег
420 425 430
Вуз Беи ТЬг Уа1 Азр Вуз Зег Агд Тгр 61п 61п 61у Азп Уа1 РЬе Зег
435 440 445
Суз Зег Уа1 МеБ НБз 61и А1а Беи НБз Азп НБз Туг ТЬг 61п Вуз Зег
450 455 460
Беи Зег Беи Зег Рго 61 у Буз
465 470
<210> 39 <211> 720 <212> ДНК <213> Ното зарБепз <400> 39 аБдаддсЬсс даБаЫдБда аЬсвссБдса ЬассЬдсада ЬссддддЬсс адсададЪдд асЫЬсддсд аТсЪЬсссдс ааВаасЬЬсЬ ддбаасРссс адсасссБда асссаБсадд сЬдсЬсадсВ РдасБсадВс ддСсСадЬса адссадддса сБдасаддЬЬ аддсБдадда дадддассаа са^сЬдаΐда аРсссадада аддададбдБ сдсЬдадсаа дссБдадсВс ссБддддсьд БссасЬсЬсс дадсЫссЬд дЬсБссасад садЬддсадВ БдББддддБЬ ддрддадаЬс дсадЬЬдааа ддссааадба сасададсад адсадасБас дсссдбсаса сЬааЬдсЪс!: сЬдсссдЬса саЬддЬааЬд сЬссБдаЪсЬ ддаБсаддса ЬаЫасЬдса ааасдаасЪд ЬсРддаасЬд садБддаадд дасадсаадд дадааасаса аададсББса дддЬсБсЬдд соссЬддада даЬасаасба аЫЬдддЫс садаЬБЫас БдсаадсЬсЬ РддсРдсасс ссЬсЬдЫдБ РддаЬаасдс асадсассБа аадБсБасдс асаддддада аРссадЪддд 60 дссддссЬсс 120 ЬЫддаЫздд 180 ЬааЬсдддсс 240 асЬдааааБс 300 асааасЬсВс 360 аЬсРдЬсЬЬс 420 дЬдссЬдсрд 480 ссЬссааЬсд 540 садссОсадс 600 сЬдсдаадЬс 660 дЬдБ-ЬадЬда 720
<210> <211> <212> <213> 40 233 БЕЛОК Нотс зарБепз
<400> 40
- 87 012872
МеЬ 1 Агд Ьеи Рго А1а С1п 5 Ьеи Ьеи 61у Ьеи 10 Ьеи Мер Ьеи Тгр Уа1 15 Зег
С1у Зег Зег 61у Азр Не Уа1 МеЪ ТЪг С1п Зег Рго Ьеи Зег Ьеи Рго
20 25 30
Уа1 ТЪг Рго С1у 61и Рго А1а Зег 11е Бег Суз Агд Зег Бег 61п Бег
35 40 45
Ьеи Ьеи Нхз С1у Азп С1у Туг Азп Туг Ьеи Азр Тгр Туг Ьеи С1п Ьуз
50 55 60
Рго 61у С1п Зег Рго С1п Ьеи Ьеи 11е Туг Ьеи С1у Зег Азп Агд А1а
65 70 75 .80
Зег 31у Уа1 Рго Азр Агд РЪе Зег 31у Зег <31у Зег 61у ТЪг Азр РЬе
85 90 95
ТНг Ьеи Ьуз 11е Зег Агд Уа1 С1и А1а С1и Азр Уа1 С1у Уа1 Туг Туг
100 105 110
Суз МеЬ 61п А1а Ьеи 61п ТЪг Ьеи ТЪг РЪе <31у С1.у С1у ТЪг Ьуз Уа1
115 120 125
С1и 11е Ьуз Агд ТЪг Уа1 А1а А1а Рго Зег Уа1 РЬе 11е РЪе Рго Рго
130 135 140
Зег Азр 61и 31п Ьеи Ьуз Зег С1у ТНг А1а Зег Уа1 Уа1 Суз Ьеи Ьеи
145 150 155 160
Азп Азп РЪе Туг Рго Агд <31и А1а Ьуз Уа1 θΐη Тгр Ьуз Уа1 Азр Азп
165 170 175
А1а Ьеи 61п Зег 01у Аеп Зег 61п 01и Зег Уа1 ТЪг 51и 61п Азр Бег
180 185 190
Ьуз Азр Зег ТЪг Туг Зег Ьеи Зег Бег ТЪг Ьеи ТЪг Ьеи Бег Ьуз А1а
195 200 205
Азр Туг С1и Ьуз Нхз Ьуз Уа1 Туг А1а Суз 61и Уа1 ТЪг Нхз С1п С1у
210 215 220
Ьеи Зег Зег Рго Уа1 ТЪг Ьуз Зег РЬе Азп Агд 61у 61и Суз
225 230 235
<210> 41 <211> 1410 <212> ДНК <213> Ното зархепз <400> 41 аЬддасЬдда дЬЬсадсЬдд ЬдсдаддсЬЪ ддасаадддс садаадсЬсс дадсйдадда адсЬсдЪссд дЬсЪссЬсад ассЪссдада асддЪдЬсдЬ садЬссЬсад асссадассЪ ссЪддадсаЪ ЪдсадЬсЪдд сЬддЪЪасас Ыдад’ЬддаЬ адддсададЬ дссЪдадаЪс дадасЪасЪа ссЪссассаа дсасадсддс ддаасТсадд дасЬсЬасЪс асассИдсаа ссЬЪЪЬсЬЬд адсЬдаддЬд сЬЬЪассадс дддаЬддаЪс сасса1:д1:сс Ъдасдасасд сЬасддЪаЬд дддсссаЪсд ссЪдддсЬдс сдсЪсЪдасс ссЪсадсадс сдЬадаЪсас дьддсадсад аадаадссРд ЬаЪ.дд1;аЪсд адсдЬЬЪаса асадасасаЪ дссд'Ьд'Ьа'Ы дасдЬсЬддд дЬсЬЪссссс сЪддЬсаадд адсддсдЪдс дЪддЪдассд аадсссадса саасаддЪдс дддссЬсадЬ асЬдддЬдсд дЪддЪаасас ссасдадсас асЬдЪдсдад дссаадддас ЬддсдсссЪд асЬасЫссс асассЬЪссс ЪдсссЬссад асассааддЬ ссасЪсссад 60 дааддЫЬсс 120 асаддссссЬ 180 ааасЪаЬдса 240 адссЬасаЬд 300 ададддрадс 360 сасддЬсасс 420 сЬссаддадс 480 сдаассддйд 540 адсЬдЬссЪа 600 саасЫсддс 660 ддасаадаса 720
- 88 012872 дббдадсдса бсадбсббсс дбсасдбдсд дбддасддсд асдббссдбд басаадбдса асдааадддс ассаадаасс дбддадбддд дасбссдасд саддддаасд аададссбсб аабдббдбдб бсббсссссс бддбддбдда бддаддбдса бддбсадсдб аддбсбссаа адссссдада аддбсадссб ададсаабдд дсбссббсбб бсббсбсабд сссбдбсбсс сдадбдссса аааасссаад сдбдадссас баабдссаад ссбсассдбб саааддссбс ассасаддбд дассбдссбд дсадссддад ссбсбасадс сбссдбдабд дддбааабда ссдбдсссад дасасссбса даадассссд асааадссас дбдсассадд ссадссссса басасссбдс дбсаааддсб аасаасбаса аадсбсассд сабдаддсбс сассассбдб бдабсбсссд аддбссадбб дддаддадса асбддсбдаа ббдадаааас ссссабсссд бсбассссад адассасасс бддасаадад бдсасаасса ддсаддассд дассссбдад саасбддбас дббсаасадс сддсааддад сабсбссааа ддаддадабд сдасабсдсс бсссабдсбд саддбддсад сбасасдсад
780
840
900
960
1020
1080
1140
1200
1260
1320
1380
1410 <210> 42 <211> 469 <212> БЕЛОК <213> Ното зархепа <40О> 42
Меб 1 Азр Тгр ТЬг Тгр 5 Зег 11е Леи РЬе Леи 10 Уа1 А1а А1а А1а ТЫ 15 61у
А1а Нхз Зег С1п Уа1 С1п Леи Уа1 61п Зег 61у А1 а 61и Уа1 Луз Луз
20 25 30
Рго 61у А1а Зег Уа1 Луз Уа1 Зег Суз 61и А1а Зег С1у Туг ТЫ РЬе
35 40 45
ТЬг Зег Туг 61у 11е Азр тгр νβΐ Агд 61п А1а Рго 61у (31п Б1у Леи
50 55 60
61и Тгр Меб <31у Тгр 11е Зег Уа1 Туг Зег 61у Азп ТЬг Азп Туг А1а
65 70 75 80
61ь Луз Леи <31п 61 у Агд Уа1 ТЬг Меб Зег ТЬг Азр ТЬг Зег ТЬг Зег
85 90 95
ТЬг А1а Туг Меб С1и Леи Агд Зег Леи Агд Зег Азр Азр ТЬг А1а Уа1
100 105 но
Туг Туг Суз А1а Агд 61и С1у Зег Зег Зег Зег 61у Азр Туг Туг Туг
115 120 125
61 у Меб Азр Уа1 Тгр <31у С1п 61у ТЬг ТЬг Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег А1а.
130 135 140
Зег ТЬг Луз 61у РГО Зег Уа1 РЬе Рго Леи А1а Рго Суз Зег Агд Зег
145 1.50 155 160
ТЬг Зег 61и Зег ТЬг А1а А1а Леи 61у Суз Леи Уа1 Луз Азр Туг РЬе
165 170 175
Рго С1и Рго Уа1 ТЬг Уа1 Зег Тгр Азп Зег 61у А1а Леи ТЬг Зег 61у
180 185 190
Уа1 НХЗ ТЬг РЬе Рго А1а Уа1 Леи 61п Зег Зег С1у Леи Туг Зег Леи
195 200 205
Зег Зег Уа1 Уа1 ТЬг Уа1 Рго Зег Зег Азп РЬе 61у. ТЬг 61п ТЬг Туг
210 215 220
ТЬг Суз Азп Уа1 Азр ΗΪ3 Луз Рго Зег Азп ТЬг Луз Уа1 Азр Луз ТЬг
225 230 235 240
- 89 012872
УаЬ СЬи Агд Ьуз Суз 245 Суз УаЬ СЬи Суз Рго 250 Рго Суз Рго АЬа Рго 255 Рго
УаЬ АЬа СЬу Рго Зег УаЬ РЬе Ьеи РЬе Рго Рхо ЬуЗ Рго Ьуз Азр ТЬг
260 265 270
Ьеи Мех Ые Зег Агд ТЬг Рхо СЬи УаЬ ТЬг Суз УаЬ УаЬ УаЬ Азр УаЬ
275 280 285
Зег НЬз СЬи Азр Рго СЬи УаЬ СЬп РЬе Азп Тхр Тух УаЬ Азр СЬу УаЬ
290 295 300
СЬи УаЬ НЬз Азп АЬа Ьуз ТЬг Ьуз Рхо Ахд СЬи СЬи СЬп РЬе Азп Зех
305 310 315 320
ТЬг РЬе Агд УаЬ УаЬ Зег УаЬ Ьеи ТЬг УаЬ УаЬ НЬз СЬп Азр Тхр Ьеи
325 330 335
Азп СЬу Ьуз СЬи Тух Ьуз Суз Ьуз УаЬ Зех Азп Ьуз СЬу Ьеи Рго АЬа
340 345 350
Рго Ые СЬи Ьуз ТЬг Ые Зег Ьуз ТЬх .Ьуз СЬу СЬп Рго Агд СЬи Рго
355 360 365
СЬп УаЬ Туг ТЬг Ьеи Рхо Рхо Зех Ахд СЬи СЬи Мег ТЬг Ьуз Азп СЬп
370 375 380
УаЬ Зег Ьеи ТЬх Суз Ьеи УаЬ Ьуз СЬу РЬе Туг Рго Зег Азр 11е АЬа
385 390 395 400
УаЬ СЬи Тгр СЬи Зег Азп СЬу СЬп Рго СЬи Азп Азп Туг Ьуз ТЬг ТЬг
405 410 415
Рго Рго Ме£ Ьеи Азр Зег Азр СЬу Зег РЬе РЬе Ьеи Тух 5ег Ьуз Ьеи
420 425 430
ТЬг УаЬ Азр Ьуз Зег Ахд Тгр СЬп СЬп СЬу Азп УаЬ РЬе Зех Суз Зег
435 440 445
УаЬ Мег НЬз СЬи АЬа Ьеи НЬз Азп НЬз Туг ТЬг СЬп Ьуз Зег Ъёц Зег
450 455 4 60
Ьеи Зег Рго СЬу Ьуз
465 <210> 43' <211> 723.
<212> ДНК' <213> Ното зархепз <400> 43 аЬдаддсХсс сЬдсРсадсЬ ссЬддддсгд сХааЬдсЬсХ ддаЬассЬдд аХссадЬдсд60 дагаЬХдХда Ьдасссадас гссасгсгсг сЬдХссдЬса ссссЬддаса дссддссХсс120 аХсЬссЬдса адЬсЬааХса дадссХссЬд ХаХадгдаХд дааадассХа хгхдьгьгдд180 гассЬдсада адссаддсса дссЬссасад сгссгдагсг агдаадгьгс саассдагХс240
ЬсгддадЬдс садагаддьг садЪддсадс дддХсаддда садаРЬЬсас асгдааааХс300 адссдддЬдд аддсгдадда ЬдгХддддгг гаьгасгдса гдсааадХаХ асадсхгссд360
ЬддасдЬХсд дссаадддас сааддХддаа аЬсааасдаа сЬдЬддсгдс ассаЬсЬдРс420 гхсагсЬХсс сдссаЪсЬда гдадсадггд ааабсСддаа сгдссгсХдХ ХдХдгдссЬд480 сЬдааЬаасЬ ХсЬагсссад ададдссааа д5асадХдда аддХддаГаа сдсссЬссаа540 исдддХаасХ сссаддадад ЬдЬсасадад саддасадса аддасадсас сХасадссХс600 адсадсассс ЬдасдсХдад сааадсадас Хасдадааас асааадЬсЬа сдссХдсдаа660
- 90 012872 дЬсасссаЬс адддссХдад сЬсдсссд'Ьс асааададсЬ Ьсаасадддд ададЬдЬЬад 720
Ьда 723 <210> 44 <211> 239 <212> БЕЛОК <213> Ногао зарЬепз <400> 44
МеЬ Агд 1 Ьеи Рго АЬа 5 СЬп Ьеи Ьеи СЬу Ьеи Ьеи МеЬ Ьеи Тгр Не Рхо
10 15
СЬу Зег Зег А1а Азр Не УаЬ МеЬ ТЬх С1п ТЬх Рго Ьеи Зех Ьеи Зег
20 25 30
УаЬ ТЬг Рго СЬу СЬп Рхо АЬа Зех Не Зег Суз Ьуз Зег Азп СЬп Зег
35 40 45
Ьеи Ьеи Туг Зег Азр СЬу Ьуз ТЬх туг- Ьеи РЬе Тгр Туг Ьеи СЬп Ьуз
50 55 60
Рго СЬу СЬп Рго Рго СЬп Ьеи Ьеи ие Туг СЬи УаЬ Зег Азп Агд РЬе
65 70 75 80
Зег СЬу УаЬ Рго Азр Агд РЬе Зег СЬу Зег СЬу Зех СЬу ТЬг Азр РЬе
85 90 95
ТЬг Ьеи Ьуз Не Зег Агд УаЬ СЬи АЬа СЬи Азр УаЬ СЬу УаЬ Туг Туг
100 105 110
Суз Мер СЬп Зег ЬЬе СЬп Ьеи Рхо Тгр ТЬг РЬе СЬу СЬп СЬу ТЬг Ьуз
115 120 125
УаЬ СЬи 11е Ьуз Агд ТЬг УаЬ АЬа А1а Рго Зег УаЬ РЬе Не РЬе Рго
130 135 140
Рго Зег Азр СЬи СЬп Ьеи Ьуз Зег СЬу ТЬг А1а Зег УаЬ УаЬ Суз Ьеи
145 150 155 160
Ьеи Азп Азп РЬе Туг Рго Ахд СЬи АЬа Ьуз УаЬ СЬп Тгр Ьуз УаЬ Азр
165 170 175
Азп АЬа Ьеи СЬп Зег СЬу Азп Зег СЬп СЬи Зех УаЬ ТЬг СЬи СЬп Азр
180 185 190
Зег Ьуз Азр Зех ТЬг Туг Зег Ьеи Зег Зег ТЬг Ьеи ТЬг Ьеи Зег Ьуз
195 200 205
АЬа Азр Туг СЬи Ьуз НЬз Ьуз УаЬ Туг АЬа Суз СЬи Уа1 ТЬх НЬз СЬп
210 215 220
СЬу Ьеи. Зег Зег Рго УаЬ ТЬг Ьуз Зег РЬе Азп Агд СЬу СЬи Суз
225 230 235
<210> 45 <211> 1389 <212> ДНК <213> Ното зарЬепз <400> 45 . .
аЬддадЬЬЬд ддсЬдадоЬд ддЬЬЬЬссЬс дЬЬдсЬсЫЬ ЪаададдЬдЬ ссадЬдЬсад 60 дРдсадсЬдд ЬддадЬсЪдд дддаддсд!д дЬссадссЬд ддаддЬссс!: дадасЬсЬсс 120
- 91 012872
СдСдсадсдС ддсааддддс дасСссдСда саааСдааса сасСССдссС ссаСссдСсС ддсСдссСдд сСдассадсд адсадсдСдд даСаасаадс СдсссаСсаС ааасссаадд дСдадссадд ааСдссаада сссассдСсс аааддссСсс ссасаддСдС ассСдссСдд садссддада сСсСасадса СссдСдаСдс ддСаааСда сСддаССсас СддадСдддС адддссдаСС дссСдададс асСддддсса СсссссСддс СсааддасСа дсдСдсасас СдассдСдсс ссадсаасас дсссадсасс асасСсСсаС аадассссда сааадссдсд Сдсассадда сдСссСссаС асасссСдсс СсаааддсСС асаасСасаа ддсСаассдС аСдаддсСсС сССсадСадс ддсадССаСа сассаСсСсс сдаддасаод дддаасссСд дсссСдсСсс сССссссдаа сССсссддсС сСссадсадс сааддСддас СдадССссСд даСсСсссдд ддСссадССс ддаддадсад сСддсСдаас сдадаааасс сссаСсссад сСассссадс дассасдссС ддасаададс дсасаассас
СаСддсаСдс СддСаСдаСд ададасааСС дсСдЪдСаСС дСсассдСсС аддадсассС ссддсдасдд дСссСасадС ССдддсасда аадададССд дддддассаС асссссдадд аасСддСасд ССсаасадса ддсааддадС аСсСссааад даддадасда дасаСсдссд сссдСдсСдд аддСддсадд Сасасасада асСдддСссд даадСааСда ссаадаасас асСдСдсдад ссСсадсССс ссдададсас СдСсдСддаа ссСсаддасС адассСасас адсссаааса садСсССссС СсасдСдсдС СддаСддсдС сдСассдСдС асаадСдсаа ссааадддса ссаадаасса СддадСддда асСссдасдд аддддааСдС ададссСсСс ссаддсСсса аСасСаСдса дсСдСаСсСд дддддсдСас сассаадддс адссдсссСд сСсаддсдсс сСасСсасСс сСдсаасдСа СддСссссса дССассссса ддСддСддас ддаддСдсаС ддСсадсдСс ддСсСссаас дссссдадад ддСсадссСд дадсааСддд сСοοΐΐϋΐΐο СССсСсаСде ссСдСсСсСд
180
240
300
360
420
480
540
600
660
720
780
840
900
960
1020
1080
1140
1200
1260
1320
1380
1389 <210> 46 <211> 462 <212> БЕЛОК <213> Ното зархепз <400> 46
МеС 1 СЬи РЬе СЬу Ьеи 5 Зег Тгр УаЬ РЬе Ьеи 10 УаЬ АЬа Ьеи Ьеи Агд 15 СЬу
УаЬ СЬп Суз СЬп УаЬ СЬп Ьеи УаЬ СЬи Зег СЬу СЬу СЬу УаЬ УаЬ СЬп
20 25 30
Рго СЬу Агд Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз АЬа АЬа Зег СЬу РЬе ТЬг РЬе
35 40 45
Зег Зег Туг СЬу МеС НЬз Тгр УаЬ Агд СЬп АЬа Рго СЬу Ьуз СЬу Ьеи
50 55 60
СЬи Тгр УаЬ АЬа УаЬ Не Тгр Туг Азр СЬу Зег Азп СЬи Туг Туг АЬа
65 70 75 80
Азр Зег УаЬ Ьуз СЬу Агд РЬе ТЬг Т1е Зег Агд Азр Азп Зег Ьуз Азп
85 90 95
ТЬг Ьеи Туг Ьеи СЬп МеС Азп Зег Ьеи Агд АЬа СЬи Азр ТЬг АЬа УаЬ
100 105 ЬЬО
Туг Туг Суз АЬа Агд СЬу АЬа Туг Н1з РЬе АЬа Туг Тгр СЬу СЬп СЬу
115 120 125
ТЬг Ьеи УаЬ ТЬг УаЬ Зег Зег АЬа Зег ТЬг Ьуз СЬу Рго Зег УаЬ РЬе
130 135 140
Рго Ьеи АЬа Рго Суз Зег Агд Зег ТЬг Зег СЬи Зег ТЬг АЬа АЬа Ьеи
145 150 155 160
СЬу Суз Ьеи УаЬ Ьуз Азр Туг РЬе Рго СЬи Рго УаЬ ТЬг УаЬ Зег Тгр
165 170 175
Азп Зег СЬу АЬа Ьеи ТЬг Зег СЬу УаЬ НЬз ТЬг РЬе Рго АЬа УаЬ Ьеи
- 92 012872
180 185 190
СЬп Зег Зег С1у Ьеи Туг Зег Ьеи Зег Зег УаЬ УаЬ ТЬг УаЬ Рхо Зег
195 200 205
Зег Зег Ьеи СЬу ТЬг Ьуз ТЫ Туг ТЬг Суз Азп УаЬ Авр НЬз Ьуз Рго
210 215 220
Зег Азп ТЬг Ьуз Уа! Азр Ьуз Агд УаЬ СЬи Зег Ьуз Туг СЬу Рго Рго
225 230 235 240
Суз Рго Зег Суз Рго АЬа Рго СЬи РЬе Ьеи СЬу СЬу Рго Зег УаЬ РЬе
245 250 255
Ьеи РЬе Рго Рго Ьуз Рго Ьуз Азр ТЫ Ьеи МеЬ ЬЬе Зег Ахд ТЬг Рго
260 265 270
СЬи УаЬ ТЬг Суз УаЬ УаЬ УаЬ Азр УаЬ Зег СЬп СЬи Азр Рго СЬи УаЬ
275 280 285
СЬп РЬе Азп Тгр Туг УаЬ Азр С1у УаЬ СЬи УаЬ НЬз Азп АЬа Ьуз ТЬг
290 295 300
Ьуз Рго Агд СЬи БЬи СЬп РЬе Азп Зег ТЬг Туг Агд УаЬ УаЬ Зег УаЬ
305 310 315 320
Ьеи ТЬг УаЬ Ьеи НЬз СЬп Азр Тгр Ьеи Аап ОЬу Ьуз СЬи Туг Ьуз Суз
325 330 335
Ьуз УаЬ Зег Азп Ьуз С1у Ьеи Рго Зег Зег ЬЬе СЬи Ьуз ТЫ Ые Зег
340 345 350
Ьуз АЬа Ьуз СЬу СЬп Рго Агд СЬи Рго СЬп УаЬ Туг ТЬг Ьеи Рго Рго
355 360 365
Зег СЬп СЬи СЬи МеЬ ТЬг Ьуз Азп СЬп УаЬ Зег Ьеи ТЬг Суз Ьеи УаЬ
370 375 380
Ьуз С1у РЬе Туг Рго Зег Азр ЬЬе АЬа УаЬ СЬи Тгр СЬи Зег Азп СЬу
385 390 395 400
СЬп Рго СЬи Азп Азп Туг Ьуз ТЬг ТЬг Рго Рго УаЬ Ьеи Азр Зег Азр
405 410 415
СЬу Зег РЬе РЬе Ьеи Туг Зег Ахд Ьеи ТЬг УаЬ Азр Ьуз Зег Агд Тгр
420 425 430
СЬп СЬи СЬу Азп УаЬ РЬе Зег Суз Зег УаЬ МеЬ НЬз СЬи АЬа Ьеи НЬз
435 440 445
Азп НЬз Туг ТЬг СЬп Ьуз Зег Ьеи Зег Ьеи Зег Ьеи СЬу Ьуз
450 455 460
<210> 47 <211> 720 <212> ДНК <213> Ното эарЬепз <400> 47 аЬддасаЬда дддЬсссЬдс ЬсадсЬссЬд дддсЬссЬдс ЬдсЬсЬддсЬ сЬсадЬсдса 60 ддЬдссадаЬ дЬдасаЬсса даЬдасссад ЬсЬссаЬссЬ сссЬдЬсЬдс аЬсЬдЬадда 120 дасададСса ссабсасЬЬд осаддсдадЬ саддасаЬЬа дсаасЬаЬЬЬ аааЪЬддЬаЬ 130 садсадааас садддааадс сссЬаадсЬс сЬдаЬсЬасд абдсаЬссаа ЬЬСддаааса 240
- 93 012872
300
360
420
480
540
600
660
720 ддддРсссаР адссьдсадс ассРРсддсс аРсРРсссдс ааРаасРРсР ддРаасРссс адсасссРда асссаРсадд сааддРРсад сРдаадаРаЬ аддддасасд саРсРдаРда ассссадада аддададрдр сдсРдадсаа дссРдадсРс
РддаадРдда рдсаасаРаР асРддадаРР дсадръдааа ддссааадРа сасададсад адсадасРас дсссдРсаса
РсРдддасад РссРдРсаас ааасдаасРд РсРддаасРд садЬддаадд дасадсаадд дадааасаса аададсРРса аРРРРасЪРР асРсРдаРаа РддсРдсасс ссрсрдррдр ЪддаРаасдс асадсассРа аадРсРасдс асаддддада сассаРсадс РсРсРсдаРс аРсРдРсРРс дРдссРдсРд ссРссааРсд садссРсадс сРдсдаадРс дрдррадрда <210> 48 <211> 238 <212> БЕЛОК <213> Ното вархепз <400> 48
Мер 1 Азр МеР Агд Уа1 5 Рго А1а ст Ьеи Ьеи С1у Ьеи Ъеи 10 Ьеи Ьеи 15 Тгр
Ьеи Зег Уа1 А1а С1у А1а Агд Суз Азр 11е С1п Мер ТЬг С1п Зег Рго
20 25 30
Зег Зег Ъеи Зег А1а 5ег Уа1 С1у Азр Агд Уа1 ТЬг Не ТЬг Суз ст
35 40 45
А1а Зег 61п Азр Не Зег Азп Туг Ьеи Азп Тгр Туг 51п 61п Ьуз Рго
50 55 60
С1у Ъуз А1а Рго Ьуз Ьеи Ьеи 11е Туг Азр А1а Зег Азп Ьеи С1и ТЬг
65 70 75 80
С1у Уа1 Рго Зег Агд РЪе Зег С1у Зег С1у Зег С1у ТЬг Азр РЬе ТЬг
85 90 95
Рке ТЬг Т1е Зег Зег Ьеи С1п Рго С1и Азр 11е А1а ТЬг Туг Зег Суз
100 105 110
б1п Н1з Зег Азр Азп Ьеи Зег Не ТЬг РЬе С1у С1п С1у ТЬг Агд Ьеи
115 120 125
С1и Не Ьуз Агд ТЬг Уа1 А1а А1а Рго Зег Уа1 РЬе Не РЬе Рго Рго
130 135 140
Зег Азр С1и С1п Ьеи Ьув Зег 61у ТЬг А1а Зег Уа1 Уа1 Суз Ьеи Ьеи
145 150 155 160
Азп Азп РЬе Туг Рго Агд 61и А1а Ъуз Уа1 61п Тгр Ьуз Уа1 Азр Азп
165 170 175
А1а Ьеи С1п Зег С1у Азп Зег 61п С1и Зег Уа1 ТЬг С1и ст Азр Зег
180 185 190
Ъуз Азр Зег ТЬг Туг Зег Ъеи Зег Зег ТЬг Ьеи ТЪг Ьеи Зег Ъуз А1а
195 200 205
Азр Туг С1и Ьуз Н15 Ьуз Уа1 Туг А1а Суз С1и Уа1 ТЪг Н1з С1п С1у
210 215 220
Ьеи Зег Зег Рго Уа1 ТЪг Ъуз Зег РЬе Азп Агд С1 у С1и Суз
225 230 235
<210> 49 <211> 681
- 94 012872 <212> ДНК <213> Масаса £азс1си1аг1з <400> 49 аЕддаЪсддд ддссадЁссс дсссЕдддсд д£дсад£ддс дЕссЕсассд Едсдддддсс сХдассаЕсЕ ааадЕсасдс сХддаддддд даддасдЕдс сЕдсссдсдс саддссаХсс дссЁддсссЕ ЁссаддЕдаа ссЕсЁсдсса ддддссЕдда Едсдсаасдс дсассЕЕсса ссссддсадс сЁдЕддассс сссаддсЬсЕ ЕдЫсадддЕ ЕсЕасЕдсса сддЬсс£дса ссЕдсЕддсд дссссЕдсад дсЁсассЕдс сассадссЕд сЕсдсЕдЕсд дсасассдХд ссЬддЕдссЬ сааЕдсдсЕс дддсссддад дасададсдс ддссасдаЕд с дддсЕЕсЕдд д£ддадсссс сдссЁддасЁ ддсдсддЕдс дсддссддда сддсЁссЕЕд ддЕдасссдд ЁССЫСЁССС дьддаддадд ЕддсддсЕдс аддсЁдссЕд ддсЕссЕсса сддадссддЕ дсдсддасдд адЬсддасдс сссдЕдЕдЕд ЕдЕасдссЁЁ аддЕддссЁд ЕдсЕссЕддд аддаддадсс сдасссЕддс дсЕЕддадсЕ дссдддсЕдс ддЕддссд-Ьд сддддссасд дддссдсадс сдЕдддсЁсс сссддассад ЁасддсЕсас ддассаддаа ссаддаддад аассссЬдЕс садссассдс
120
1Θ0
240
300
360
420
480
540
600
660
681 <210> 50 <211> 227 <212> БЕЛОК <213> Масаса £азсЬсиЬаг1з <40О> 50
Ме£ 1 Азр Агд 61у Ьеи 5 АХа Ьеи Ьеи Ьеи А1а С1у Ъеи Ьеи 10 61у Ьеи 15 Ьеи
С1п Рго СЬу Суз СЬу С1п Зег Ьеи СЬп Уа1 Ьуз Рго Ьеи С1п Уа1 С1и
20 25 30
Рго Рго 61и Рго Уа1 Уа1 А1а УаЬ АЬа Ьеи С1у А1а Зег Агд С1п Ьеи
35 40 45
ТЬг Суз Агд Ьеи Азр Суз АЬа Азр С1у С1у А1а ТЬг Уа1 С1п Тгр Агд
50 55 60
С1у Ьеи Азр ТЪг Зег Ьеи СЬу АЬа Уа1 С1п Зег Азр АЬа б1у Агд Зег
65 70 75 80
Уа1 Ьеи ТЬг УаЬ Агд Азп АЬа Зег Ьеи Зег АЬа АЬа С1у ТЬг Агд Уа1
85 90 95
Суз Уа1 С1у Зег Суз СЬу 01 у Агд ТЬг РЬе С1п Н1з ТЪг Уа1 Агд Ьеи
100 105 110
Ьеи Уа1 Туг А1а РЬе Рго Азр С1п Ьеи ТЬг 11е Зег Рго А1а А1а Ьеи
115 120 125
Уа1 Рго 61у Азр Рго (Ли Уа1 АЬа Суз ТЬг АЬа Н1з Ьуз Уа1 ТЬг Рго
130 135 140
УаЬ Азр Рго Азп АЬа Ьеи Зег РЬе Зег Ьеи Ьеи Ьеи С1у Азр С1п (Ли
145 150 155 160
Ьеи 61и СЬу А1а С1п А1а Ьеи СЬу Рго С1и УаЬ СЬи С1и С1и С1и С1и
165 170 175
Рго С1п СЬи С1и (Ли Азр Уа1 Ьеи РЬе Агд УаЬ ТЫ С1и Агд Тгр Агд
180 185 190
Ьеи Рго ТЬг Ьеи АЬа ТЬг Рго Уа1 Ьеи Рго А1а Ьеи Туг Суз αΐη АЬа
195 200 205
ТЬг Ме£ Агд Ьеи Рго С1у Ьеи (Ли Ьеи Зег НЬз Агд С1п А1а Не Рго
- 95 012872
210 215 220
Уа1 Ьеи Н1з
225 <210> 51 <211> 1398 <212> ДНК <213> Ното зарЬепз <400> 51 аЬддад! Ыд д!дсадс!дд 1д!дсадсд! ддсааддддс дас1ссд!да саааЬдааса 1ас!аЫасд ассаадддсс дсддсссЬдд 1саддсдс1с 1ас!ссс1са !дсаасд!ад 1д!д!сдад! сссссаааас дЬддасдЬда д!дса!аа!д адсд!сс!са 1ссаасааад сдадаассас адсс1дасс! ааЬдддсадс ЫсЫСС1С1 1са1дсЬссд 1с1ссддд1а ддс1дадс!д 1ддад1с!дд сЬддаЫсас 1ддад!ддд! адддссдаЫ дссЬдададс д!а!ддасд! са!ссд!сЫ дс!дсс1дд! 1дассадсдд дсадсдЬдд! аЬсасаадсс дсссассдЬд ссааддасас дссасдаада ссаадасааа ссдЫд! дса дссьсссадс адд!д!асас дсс!дд!саа сддадаасаа асадсаадс! 1да!дса!да аа!да!ад ддЫЫссЬс дддаддсдТд сЫсадЬадс ддсааЫаЬа сасса!с!сс сдаддасасд сЬддддссаа сссссЬддсд сааддас1ас сдЬдсасасс дассдЬдссс садсаасасс сссадсасса сс!са!да1с ссссдаддЬс дссасдддад ссаддас!дд ссссаЬсдад ссЬдссссса аддсЫс1ас сЬасаадасс сассд1ддас ддс1с!дсас дЫдсЬсЫ! д!ссадсс!д да!ддса!дс 1дд1а!да!д ададасааЫ 9019181311 дддассасдд ссс!дс1с1а Ыссссдаас 11сссадс!д 1ссадсаас1 ааддЬддаса сс1д!ддсад Ьсссддассс садЫ саас! дадсадЫ са сЬдаасддса аааассаЬс! 1сссдддадд сссадсдаса асасс!ссса аададсадд! аасеас!аса
1аададд1д1 ддаддЬссс! ас!ддд!ссд даад!аа!аа ссаадаасас ас!д!дсдад 1сассд!с1с даадсасЫс сддЬдасдд! 1сс!асад1с 1сддсассса адасадЫда дассд!сад1 с!дадд!сас ддЬасдЬдда асадсасдЫ аддадЬасаа ссаааассаа адаЬдассаа 1сдссд!дда 1дс!ддас1с ддсадсаддд сдсадаадад ссад!д!сад дадас!с!сс ссаддсЫса а!аЫа!дса дс!д!а1с1д ада!сссддс с!садс11сс сдададсаса д!сд!ддаас с!саддас1с дассЬасасс дсдсааа!д! сЫсс! сЫс д!дсд1дд!д сддсдЬддад ссд!д!дд1с д!дсаадд!с адддсадссс даассаддЬс дЬдддададс сдасддсЬсс даасд! сЫс сс1с1ссс1д
120
180
240
300
360
420
480
540
600
660
720
780
840
900
960
1020
1080
1140
1200
1260
1320
1380
1398 <210> 52 <211> 464 <212> БЕЛОК <213> Ното зарЬепз <400> 52
Ме! 1 ЕЬи РЬе СЬу Ьеи 5 Зег Тгр УаЬ РЬе Ьеи Уа1 10 АЬа Ьеи Ьеи Агд 15 СЬу
УаЬ СЬп Суз С1п УаЬ СЬп Ьеи УаЬ СЬи Зег СЬу СЬу С1у УаЬ УаЬ СЬп
20 25 30
Рго СЬу Агд Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз АЬа АЬа Зег СЬу РЬе ТЬг РЬе
35 40 45
Зег Зег Азр СЬу Ме! Ηίε Тгр УаЬ Агд СЬп АЬа Рго СЬу Ьуз СЬу Ьеи
50 55 60
СЬи Тгр УаЬ АЬа Ые Ые Тгр Туг Азр СЬу Зег Азп Ьуз Туг Туг АЬа
65 70 75 80
Азр Зег УаЬ Ьуз СЬу Агд РЬе ТЬг 11е Зег Агд Азр Азп Зег Ьуз Азп
85 90 95
ТЬг Ьеи Туг Ьеи СЬп Ме! Азп Зег Ьеи Агд АЬа СЬи Азр ТЬг АЬа Уа1
100 105 110
- 96 012872
Туг Туг Суз 115 АЬа Агд Азр Рго СЬу 120 Туг Туг Туг СЬу Меб 125 Азр УаЬ Тгр
СЬу СЬп С1 у ТЬг ТЬг УаЬ ТЬг УаЬ Зег Зег АЬа Зег ТЬг Ьуз БЬу Рго
130 135 140
Зег УаЬ РЬе Рго Ьеи АЬа Рго Суз Зег Агд Зег ТЬг Зег СЬи Зех ТЬг
145 150 155 160
АЬа АЬа Ьеи СЬу Суз Ьеи УаЬ Ьуз Азр Туг РЬе Рхо СЬи Рго УаЬ ТЬг
165 170 175
Уа1 Зег Тгр Азп Зег СЬу АЬа Ьеи ТЬг Зег 61 у УаЬ НЬз ТЬг РЬе Рго
18 0 185 190
АЬа УаЬ Ьеи СЬп Зех Зег БЬу Ьеи Туг Зег Ьеи Зег Зег УаЬ УаЬ ТЫ
195 200 205
УаЬ Рго Зег Зег Азп РЬе БЬу ТЬг СЬп ТЬх Тух ТЬх Суз Азп УаЬ Азр
210 215 220
ΗΪ5 Ьуз Рго Зег Азп ТЬх Ьуз УаЬ Азр Ьуз ТЬг УаЬ СЬи Агд Ьуз Суз
225 230 235 240
Суз УаЬ СЬи Суз Рхо Рго Суз Рго АЬа Рго Рго УаЬ АЬа СЬу Рго Зег
245 250 255
УаЬ РЬе Ьеи РЬе Рго Рго Ьуз Рго Ьуз Азр ТЬг Ьеи Меб Не Зех Ахд
260 265 270
ТЬг Рго СЬи УаЬ ТЬг Суз УаЬ УаЬ УаЬ Азр УаЬ Зег НЬз СЬи Азр Рго
275 280 285
СЬи УаЬ СЬп РЬе Азп Тгр Туг УаЬ Азр С1у УаЬ СЬи УаЬ НЬз Азп А1а
290 295 300
Ьуз ТЬг Ьуз Рго Ахд СЬи СЬи СЬп РЬе Азп Зег ТЬг РЬе Агд УаЬ УаЬ
305 310 315 320
Зег УаЬ Ьеи ТЬг УаЬ УаЬ Н1з СЬп Азр Тхр Ьеи Азп СЬу Ьуз СЬи Туг
325 330 335
Ьуз Суз Ьуз УаЬ Зег Азп Ьуз СЬу Ьеи Рхо АЬа Рго ЬЬе СЬи Ьуз ТЬх
340 345 350
ЬЬе Зег Ьуз ТЬг Ьуз СЬу СЬп Рго Агд СЬи Рго СЬп УаЬ Туг ТЬг Ьеи
355 360 365
Рго Рго Зег Агд СЬи СЬи Мес ТЫ Ьуз Азп СЬп УаЬ Зег Ьеи ТЬг Суз
370 375 380
Ьеи УаЬ Ьуз СЬу РЬе Туг Рго Зег Азр Не АЬа УаЬ СЬи Тгр СЬи Зег
385 390 395 400
Азп СЬу СЬп Рго СЬи Азп Азп Туг Ьуз ТЬг ТЬг Рго Рго Меб Ьеи Азр
405 410 415
Зег Азр 61у Зег РЬе РЬе Ьеи Тух Зех Ьуз Ьеи ТЬх УаЬ Азр Ьуз Зег
420 425 430
Агд Тгр СЬп СЬп СЬу Азп УаЬ РЬе Зег Суз Зег УаЬ Меб НЬз СЬи АЬа
435 440 445
- 97 012872
Ьеи Зег Рго С1у Ьуз
60 <210> 53 <211> 705 <212> ДНК <213> Ното зарЬепз <400> 53 аЬдЬЬдссаЬ аЫдЬдсбда ассЬдссддд садРсЬссаа РЬсадбддса даСдсИдсаа ассааддЬдд даЬдадсадД адададдсса адЬдЬсасад адсааадсад адсРсдсссд сасаасЬсар сбсадДсЬсс ссадбсадад аасбссРсаб дбддаЬсЬдд сЫаЬЬасбд адабсааасд РдаааРсЬдд аадЬасадЬд адсаддасад асЬасдадаа Рсааааадад
ЬдддЫЫсЬд адасШсад ааЬЬддЬадЬ саадРаРдсб дасадаЫЫс ЬсаЬсададЬ аасЬдЬддсЬ аасДдссЬсЬ дааддЬддаб сааддасадс асасааадЬс сЬЪсаасадд сьдсЫЬддд 1:сЬд1:дас1:с адсЬРасасЬ РсссадЬссР асссЬсасса ддСсдШас дсассабсЬд дРРдДдбдсс аасдсссЬсс ассРасадсс Расдссбдсд ддададЬдТЬ
ЬДссадсЫс саааададаа ддЬассадса РсРсаддддР РсааЬадссР сдсЬсасЬОР ДсЬЬсаЬсЬЬ ЬдсЬдааЬаа ааЬсдддЬаа Ьсадсадсас аадЬсассса адТда саддддЬдаа 60 адДсассаРс 120 дааассадаЬ 180 ссссЬсдадд 240 ддаадсрдаа 300 сддсддаддд 360 сссдссаЬсД 420 сДДсДаРссс 480 сДсссаддад 540 ссЬдасдсЬд 600 Ьсадддссбд 660
705 <210> 54 <211> 233 <212> БЕЛОК <213> Ното зарЬепз <400> 54
Мех 1 Ьеи Рго Зег СЬп 5 Ьеи Не СЬу РЬе Ьеи Ьеи 10 Ьеи Тгр Уа1 Рго 15 АЬа
Зег Агд СЬу СЬи Не Уа1 Ьеи ТЬг СЬп Зег Рго Азр РЬе С1п Зег Уа1
20 25 30
ТЬг Рго Ьуз СЬи Ьуз УаЬ ТЬг 11е ТЬг Суз Агд АЬа Зег СЬп Агд Не
35 40 45
СЬу Зег Зег Ьеи НЬз Тгр Туг С1п С1п Ьуз Рго Азр СЬп Зег Рго Ьуз
50 55 60
Ьеи Ьеи Не Ьуз Туг АЬа Зег С1п Зег РЬе Зег СЬу УаЬ Рго Зег Агд
65 70 75 80
РЬе Зег СЬу Зег СЬу Зег С1у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг 1Ье Азп Зег
85 90 95
Ьеи СЬи АЬа СЬи Азр АЬа АЬа ТЬг Туг Туг Суз НЬз СЬп Зег СЬу Агд
100 105 НО
Ьеи Рго Ьеи ТЬг РЬе СЬу С1у С1у ТЬг Ьуз Уа1 СЬи Не Ьуз Агд ТЬг
115 120 125
УаЬ АЬа АЬа Рго Зег Уа1 РЬе 11е РЬе Рго Рго Зег Азр СЬи СЬп Ьеи
130 135 140
Ьуз Зег СЬу ТЬг АЬа Зег УаЬ УаЬ Суз Ьеи Ьеи Азп Азп РЬе Туг Рго
145 150 155 160
Агд С1и АЬа Ьуз Уа1 СЬп Тгр Ьуз УаЬ Азр Азп АЬа Ьеи СЬп Зег 61 у
- 98 012872
165 170
Азп Зег е1п СЬи Зег УаЬ ТНг СЬи СЬп Азр Зех Ьуз Азр
180 185
Зег Ьеи Зег Зег ТНг Ьеи ТНг Ьеи Зех Ьуз АЬа Азр Туг
195 200 205
Ьуз УаЬ Туг АЬа Суз С1и УаЬ ТНг НЬз СЬп СЬу Ьеи Зег
210 215 220
ТНг Ьуз Зег РНе Азп Агд СЬу СЬи Суз
225 230
175
Зег ТЬх Туг
190
СЬи Ьуз Нхз
Зег Рго УаЬ
<210> 55 <211> 1410 <212> ДНК <213> Ното зархепз <400> 55 арддадрррд дрдсадсрдд рдрдсадсср ддсааддддс дасРссдРда саааРдааса дсдаРаассР РссРсадсРР Рссдададса дРдРсдРдда рссрсаддас садассРаса дадсдсаааР дРсРРссРсР асдрдсдрдд дасддсдрдд РРссдрдрдд аадрдсаадд ааадддсадс аадаассадд дадрдддада РссдасддсР дддаасдРсР адссрсРссс ддсрдадсрд РддадРсРдд сРддаРРсас РддадРдддР адддссдаРР дссРдсдсдс асРасРасРа ссассааддд садсддсссР асРсаддсдс РсРасРсссР ссрдсаасдр дррдрдрсда Рссссссааа РддРддасдР аддрдсаРаа РсадсдРссР РсРссаасаа сссдадаасс РсадссРдас дсаардддоа ссРРсРРссР РсРсаРдсРс РдРсРссддд ддРРРРссРс дддаддсдрд СРРсадрадс ддсадРРаРа сассаРсРсс Рдаддасасд сддаарддас сссаРссдРс дддсРдссРд РсРдассадс садсадсдрд адаРсасаад дрдсссассд асссааддас дадссасдаа Рдссаадаса сассдРРдРд аддссРссса асаддрдрас сРдссРддРс дссддадаас сбасадсаад сдРдаРдсас РаааРдаРад дРРдсРсРРР дЪссадссРд РаРддсаРдс РсаааРдаРд ададасааРР дсрдрдрарр дРсРддддсс РРсссссРдд дрсааддаср ддсдРдсаса дрдассдрдо сссадсааса Рдсссадсас асссРсаРда дассссдадд аадссасддд сассаддасР дсссссаРсд асссрдсссс аааддсРРсР аасРасаада срсассдрдд даддсРсРдс
РаададдРдР ддаддРсссР асРдддРссд даааРааРаа ссааааасао асрдрдсдад аадддассас сдсссРдсРс асррссссда ссРРсссадс ссРссадсаа ссааддрдда сассрдрддс РсРсссддас РссадРРсаа аддадсадРР ддсрдаасдд адаааассаР саРсссддда ассссадсда ссасассРсс асаададсад асаассасРа ссадрдрсад 60 дадасРсРсс 120 ссаддсрсса 180 аРасРаРдса 240 дсрдрарсрд 300 адаРадРасд 360 ддРсассдРс 420 Радаадсасс 480 ассддрдасд 540 РдРссРасад 600 сРРсддсасс 660 саадасадРР 720 аддассдрса 780 сссРдаддРс 840 срддрасдрд 900 саасадсасд 960 сааддадРас 1020 сРссаааасс 1080 ддадардасс 1140 саРсдссдРд 1200 саРдсРддас 1260 дрддсадсад 1320 сасдсадаад 1380 1410 <210> 56 <211> 468 <212> БЕЛОК <213> Ното зархепз
<400> 56
Мер 1 СЬи РЬе БЬу Ьеи Зег Тгр УаЬ 5
УаЬ СЬп Суз БЬп 20 УаЬ БЬп Ьеи УаЬ
Рхо СЬу Агд 35 5ег Ьеи Агд Ьеи Зех 40
Зег Зег 50 Туг БЬу Мер Нхз Тгр 55 УаЬ
РНе Ьеи 10 УаЬ АЬа Ьеи Ьеи Агд 15 01 у
СЬи 25 Зег БЬу СЬу БЬу УаЬ 30 УаЬ СЬп
Суз АЬа АЬа Зег БЬу 45 РЬе ТЬг РЬе
Агд СЬп АЬа Рго 60 БЬу Ьуз БЬу Ьеи
С1и 65 Тгр Уа1 А1а Уа! 11е Зег Азп Азр С1у Азп Азп Ьуз Туг Туг Ά1 а 30
70 75
Азр Бет Уа! Ьуз С1у Агд РЬе ТЬг Не Зег Агд Азр Азп Зег Ьуз Азп
85 90 95
ТЬг Ьеи Туг Ьеи С1п Меб АЗП Зег Ьеи Агд А1а С1и Азр ТЬг А! а Уа!
100 105 НО
Туг Туг Суз А1а Агд Азр Зег ТЬг А1а Не ТЬг Туг Туг Туг Туг С1у
115 120 125
Меб Азр Уа! Тгр С1у С1П (Ну ТЬг ТЬг Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег А1а Зег
130 135 140
ТЬг Ьуз Иу Рго Зег Уа1 РЬе Рго Ьеи А1а Рго Суз Зег Агд Зег ТЬг
145 150 155 160
Зег С1и Зег ТЬг А1а А! а Ьеи С1у Суз Ьеи Уа1 Ьуз Азр Туг РЬе Рго
165 170 175
С1и Рго Уа1 ТЬг Уа1 Зег Тгр Азп Зег Е1у А1а Ьеи ТЬг Зег С1у Уа!
180 185 190
Нхз ТЬг РЬе Рго А1а Уа1 Ьеи Б1п Зег Зег С1у Ьеи Туг Зег Ьеи Зег
195 200 205
Зег Уа1 Уа1 ТЬг Уа1 Рго Зег Зег Азп РЬе С1у ТЬг С1п ТЬг Туг ТЬг
210 215 220
Суз Азп Уа1 Азр Н13 Ьуз Рго Зег Азп ТЬг Ьуз Уа! Азр Ьуз ТЬг Уа1
225 230 235 240
(Ии Агд Ьуз Суз Суз Уа1 (Ни Суз Рго Рго Суз Рго А1а Рго Рго Уа1
245 250 255
А1а СИу Рго Зег Уа1 РЬе Ьеи РЬе Рго Рго Ьуз Рго Ьуз Азр ТЬг Ьеи
260 265 270
Меб Ые Зег Агд ТЬг Рго С1и Уа1 ТЬг Суз Уа1 Уа1 Уа1 Азр Уа1 Зег
275 280 285
Н13 С1и Азр Рго С1и Уа1 С1п РЬе Азп Тгр Туг Уа! Азр <Иу Уа1 (Ии
290 295 300
Уа1 Н15 Азп А1а Ьуз ТЬг Ьуз Рго Агд С1и СИи СИп РЬе Азп Зег ТЬг
305 310 315 320
РЬе Агд Уа! Уа1 Зег Уа1 Ьеи ТЬг Уа1 Уа1 Н1з СИп Азр Тгр Ьеи Азп
325 330 335
С1у Ьуз С1и Туг Ьуз Суз Ьуз Уа1 Зег Азп Ьуз (Ну Ьеи Рго А1а Рго
340 345 350
Не С1и Ьуз ТЬг Не Зег Ьуз ТЬг Ьуз (Ну 61п Рго Агд СИи Рго С1п
355 360 365
Уа1 Туг ТЬг Ьеи Рго Рго Зег Агд 61и 01 и Меб ТЬг Ьуз Азп 61п Уа1
370 375 380
Бег Ьеи ТЬг Суз Ьеи Уа1 Ьуз С1у РЬе Туг Рго Зег Азр Не А1а Уа1
385 390 395 400
- 100 012872
С1и Тгр СЬи Зег АзП 405 С1у СЬп Рго 01и Азп 410 АзП Туг Ьуз ТЬг ТЬг 415 Рго
Рго МеЬ Ьеи Азр 420 Зег Азр СЬу Зег РЬе 425 РЬе Ьеи Туг Зег Ьуз 430 Ьеи ТЬг
Уа1 А ер Ьуз 435 Зег Агд Тгр 61п С1п 4 40 СЬу Азп Уа1 РЬе Зег 445 Суз Зег Уа1
Мер Н1з С1и А1а Ьеи НЬз Азп НЬз Туг ТЬг С1п Ьуз Зег Ьеи Зег Ьеи
450 455 460
Зег Рго 01у Ьуз
465 <210> 57 <211> 714 <212> ДНК <213> Ното аар!епз <400> 57 а’Ьддаса^да ддд'Сссосдс £садс£сс1д дддс^сс^дс ^асЪс^ддсЬ содаддЬдсс60 ада^.д'Ьдаса ^ссадаЪдао ссад^с^оса Ьсо^ссс^д!: с^дсаЪсЪдЪ сддадасада120 д^сассаЪса с^дссдддс аад£садад11 аЪЪадЪадсЪ ат^Ьааа^Ъд дЪаЪсадсад180 ааассаддда аадссссЪаа дсЪсс^даЪс ЪаЪдсЪдсаЪ соддЫ^даа дсд1:дддд1:с240 сса£сасдд1: Ъсад^ддЬад £дда£с£ддд асада^^^са сЬс^сассай садЬЬсЬс^д300 саассЪдадд а£Ъ1:1дсаас 1:1ас1:ас1:д1: сассадад1:£ асад^сЪссс аЪЪсасЪ^с360 ддссс^ддда ссааад^дда 1:а1:сааасда ас^дИддс^д сасса^с^д!: сЪЪсаЪсЪЪс420 ссдссаЬсЪд аЪдадсад!:^ даааЬсЪдда асЬдссЬсЬд ЬЬдЬд^дссЬ дсЬдааЪаас480 ££с£а£ссса дададдссаа ад!:аоад1:дд ааддЪдда^а асдссс1:сса аЪсдддЪаас540
Ъсссаддада д^дСсасада дсаддасадс ааддасадса ссЪасадссЪ садсадсасс600 с1:дасдс1да дсааадсада с1:асдадааа сасааад£с£ асдссЪдсда адЪсассса!660 садддсс^да дсЪсдссад^. сасааададс ЪЪсаасаддд дадад£.д!Ла д^да714 <210> 58 <211> 236 <212> БЕШОК <213> Ното зар1епз <400> 58
Мег 1 Азр Ме£ Агд УаЬ 5 Рго А1а С1п Ьеи Ьеи С1у 10 Ьеи Ьеи Ьеи Ьеи 15 Тгр
Ьеи Агд С1у А1а Агд Суз Азр Не СЬп Ме1: ТЬг СЬп Зег Рго Зег Зег
20 25 30
Ьеи Зег АЬа Зег УаЬ СЬу Азр Агд УаЬ ТЬг Не ТЬг Суз Агд АЬа Зег
35 .40 45
С1п Зег Не Зег Зег Туг Ьеи Азп Тгр Туг СЬп СЬп Ьуз Рго СЬу Ьуз
50 55 60
А1а Рго Ьуз Ьеи Ьеи Не Туг А1а АЬа Зег С1у Ьеи Ьуз Агд СЬу Уа1
65 70 75 80
Рго Зех Ахд РЬе Зег СЬу Зег СЬу Зег СЬу ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг
85 90 95
Не Зег Зег Ьеи С1п Рго СЬи Азр РЬе АЬа ТЬг Туг Туг Суз Н1з СЬп
100 105 110
Зег Туг Зег Ьеи Рго РЬе ТЬг РЬе 61у Рго СЬу ТЬг Ьуз УаЬ Азр ЬЬе
- 101 012872
115 120 125
Ьуз Агд ТЬг УаЬ АЬа АЬа Рго Зег Уа1 РЬе 11е РЬе Рхо Рхо Зег Азр
130 135 140
СЬи 61л Ьеи Ьуз Зег СЬу ТЬг АЬа Зех УаЬ УаЬ Суз Ьеи Ьеи Азп Азп
145 150 155 160
РЬе Туг Рго Агд СЬи АЬа Ьуз Уа1 СЬп Тхр Ьу8 Уа1 Азр Азп АЬа Ьеи
165 170 175
61п Зег 61у Азп Зег СЬп СЬи Зег Уа1 ТЬг 61и 61п Азр Зег ьуз Азр
180 185 190
Зег ТЬг Туг Зег Ьеи Зег Зех ТЬх Ьеи ТЬг Ьеи Зех Ьуз АЬа Азр Туг
195 200 205
6111 Ьуз НЬз Ьуз УаЬ Туг АЬа Суз СЬи УаЬ ТЬх НЬз С1п СЬу Ьеи Зех
210 215 220
Зег Рго УаЬ ТЬг Ьуз Зег РЬе Азп Агд С1у 61и Суз
225 230 235
<210 59 <211> 1413 <212> ДНК <213> Ното зарЬепз <400 59 аЬдааасасс дгдсадсХдс ЬдсасРдЬсС дддаадддас Ьсссгсаддд сбдадЫсХд агааЬЬсддд дХсЬссЬсад ассЬссдада асддЬдЬсдЬ садЬссХсад асссадассХ дЬЬдадсдса ЬсадЬсгХсс дХсасдХдсд дрддасддсд асдХЬссдСд ЬасаадЬдса ассааадддс ассаадаасс дЬддадЬддд дасХссдасд саддддаасд аададссХсь гдЪддгЪсгг аддадгсддд сХддХдасЬс ЬддадХддаЬ дЬсдадЬсас Хдассдссдс дасЬгаЬгсс сЫссассаа дсасадсддс ддаасбсадд дасЬсХасЬс асассЬдсаа ааЬдЬЬдЬдб ЬсЬЬсссссс ЬддЬддбдда ХддаддХдса ЬддЬсадсдЬ аддЬсбссаа адссссдада аддЬсадссб ададсааЬдд дсХссЫсП ХсХЬсЬсагд сссгдьсьсс ссЬссьдсХд сссаддасбд сахсадхад! ХдддсдХаХс саЬдЬсадга ддасасддсс аЬссгЬсЬгЬ дддсссабсс ссгдддсХдс сдсЬсбдасс ссХсадсадс сдХадаЬсас сдадЬдссса аааасссаад сдХдадссас ХааЪдссаад ссХсассдЫ: саааддссЪс ассасаддЬд дассХдссЬд дсадссддад ссЬсЬасадс сЬссдХдаЬд дддЬаааЬда дХддсадсХс дРдаадссСЬ аасЬаЬЬдда ХабассадЬд дасасдЬсса дгдЪаЬгасб дасбасЬддд дЬсЬЬссссс сЬддгсаадд адсддсдЬдс дХддЬдассд аадсссадса ссдЬдсссад дасасссЬса даадассссд асааадссас дХдсассадд ссадссссса ЬасасссЬдс дхсаааддсх аасаасгаса аадсбсассд саЬдаддсЬс Тад ссадаЬдддХ сддадасссЬ дсЬддаЬссд ддддсассаа адаассадХЬ дгдсдадада дссадддаас ХддсдсссЬд асСасМссс аеассЬЬссс ЬдсссЬссад асассаадд! сассассЬдХ ЬдаЬсЬсссд аддХссадХЬ дддаддадса асЬддсЬдаа Ьсдадаааас ссссаЬсссд ЬсХассссад адассасасс Ьддасаадад бдсасаасоа ссХдбсссад дХсссХсасс дсадсссдсс сЬссаасссс сЬсХсЬдааа гсдСаХХасХ ссЬддЪсасс сРсРадаадс сдаассддЬд адсСдХссХа саасЬЬсддс ддасаадаса ддсаддассд дассссХдад саасЬддгас дХХсаасадс сддсааддад саЬсЬссааа ддаддадабд сдасагсдсс ЪсссаЬдсХд саддСддсад сХасасдсад
120
180
240
300
360
420
480
540
600
660
720
780
840
900
960
1020
1080
1140
1200
1260
1320
1330
1413 <210> 60 <211> 469 <212> БЕЛОК <213> Ното зарЬепз <400> 60
МеЬ Ьуз НЬз Ьеи Тгр РЬе РЬе Ьеи Ьеи Ьеи УаЬ А1а А1а Рго Агд Тгр
10 15
- 102 012872
УаЬ Ьеи Зег СЬп УаЬ 20 СЬп Ьеи СЬп СЬи Зег СЬу 25 Рго СЬу Ьеи 30 УаЬ Ьуз
Рго Зег СЬи ТЬг Ьеи Зег Ьеи ТЬг Суз ТЬг УаЬ Зег С1у Азр Зег . Не
35 40 45
Зег Зег Азп Туг Тгр Зег Тгр Ые Агд СЬп Рго АЬа 61у Ьуз 61у Ьеи
50 55 60
СЬи Тгр Ые 61 у Агд Ые Туг ТЬг Зег. СЬу 61у ТЬг Азп Зег Азп Рго
65 70 75 30
Зег Ьеи Агд СЬу Агд УаЬ ТЬг МеЬ Зег УаЬ Азр ТЬг Зег Ьуз Азп 61п
85 90 95
РЬе Зег Ьеи Ьуз Ьеи Зег Зег УаЬ ТЬг АЬа АЬа Азр ТЬг АЬа УаЬ Туг
100 105 110
Туг Суз АЬа Агд Азр Агд Ые ТЬг 11е Ые Агд ОЬу Ьеи Ые Рго Зег
115 120 125
РЬе РЬе Азр Туг Тгр ОЬу 61п 61у ТЬг Ьеи УаЬ ТЬг УаЬ Зег Зег АЬа
130 135 140
Зег ТЬг Ьуз СЬу Рго Зег УаЬ РЬе Рго Ьеи АЬа Рго Суз Зег Агд Зег
145 150 155 160
ТЬг Зег СЬи Зег ТЬг АЬа АЬа Ьеи СЬу Суз Ьеи УаЬ Ьуз Азр Туг РЬе
165 170 175
Рго СЬи Рго УаЬ ТЬг УаЬ Зег Тгр Азп Зег ОЬу АЬа Ьеи ТЬг Зег 61у
180 185 190
УаЬ Н1з ТЬг РЬе Рго АЬа УаЬ Ьеи СЬп Зег Зег СЬу Ьеи Туг Зег Ьеи
195 200 205
Зег Зег УаЬ УаЬ ТЬг УаЬ Рго Зег Зег Азп РЬе СЬу ТЬг С1п ТЬг Туг
210 215 220
ТЬг Суз Азп УаЬ Азр НЬз Ьуз Рго Зег Азп ТЬг Ьуз УаЬ Азр Ьуз ТЬг
225 230 235 240
УаЬ СЬи Агд Ьуз Суз Суз УаЬ СЬи Суз Рго Рго Суз Рго АЬа Рго Рго
245 250 255
УаЬ АЬа С1у Рго Зег УаЬ РЬе Ьеи РЬе Рхо Рго Ьуз Рго Ьуз Азр ТЬг
260 265 27.0
Ьеи МеЬ ЬЬе Зег Агд ТЬг Рго СЬи УаЬ ТЬг Суз УаЬ УаЬ УаЬ Азр УаЬ
275 280 285
Зег НЬз СЬи Азр Рго СЬи УаЬ СЬп РЬе Азп Тхр Туг УаЬ Азр ОЬу УаЬ
290 295 300
СЬи УаЬ НЬз Азп АЬа Ьуз ТЬг Ьуз Рго Агд СЬи СЬи СЬп РЬе Азп Зег
305 310 315 320
ТЬг РЬе Агд УаЬ УаЬ Зег УаЬ Ьеи ТЬг Уа1 УаЬ НЬз СЬп Азр Тгр Ьеи
325 330 335
Азп Б1у Ьуз СЬи Туг Ьуз Суз Ьуз УаЬ Зег Азп Ьув 61у Ьеи Рго АЬа
340 345 350'
- 103 012872
Рго Ые СЬи 355 Ьуз ТЬг Ые Зег Ьуз 360 ТЬг Ьуз СЬу СЬп Рго 365 Агд СЬи Рго
611). УаЬ Туг ТЬг Ьеи Рго Рго Зег Агд СЬи СЬи МеЕ ТЬг Ьуз Азп СЬп
370 375 380
УаЬ Зег Ьеи ТЬг Суз Ьеи УаЬ Ьуз СЬу РЬе Туг Рго Зег Азр Ые АЬа
385 390 395 400
УаЬ СЬи Тгр С1и Зег Азп СЬу СЬп Рго СЬи Азп Азп Туг Ьуз ТЬг ТЬг
405 410 415
Рго Рго МеЕ Ьеи Азр Зег Азр СЬу Зег РЪе РЬе Ьеи Туг Зег Ьуз Ьеи
420 425 430
ТЬг УаЬ Азр Ьуз Зег Агд Тгр СЬп СЬп СЬу Азп УаЬ РЬе Зег Суз Зег
435 440 445
УаЬ МеЕ НЬз СЬи АЬа Ьеи НЬз Азп НЬз Туг ТЬг СЬп Ьуз Зег Ьеи Зег
450 455 460
Ьеи Зег Рго СЬу Ьуз
465 <210> 61 <211> 729 <212> ДНК <213> Ното зарЬепз <400> 61 аЕддЕдЕЕдс дасаЕсдЕда аЕсаасЕдса ЕддЕассаас дааЕаЕдддд аЕсадсадсс ссЕссссЕса ЕсЕдЕсЕЕса ЕдссЕдсЕда сЕссааЕсдд адссЕсадса ЕдсдаадЕса ЕдЕЕадЕда адасссаддЕ ЕдасссадЕс адЕссадсса адааассадд ЕсссЕда.ссд ЕдсаддсЕда сЕЕЕсддсдд ЕсЕЕССсдсс аЕаасЕЕсЕа дЕаасЕссса дсасссЕдас сссаЕсаддд сЕЕсаЕЕЕсЕ ЕссадасЕсс дадЕдЕЕЕЕа асадссЕссЕ аЕЕсадЕддс адаЕдЕддса адддассаад аЕсЕдаЕдад Есссададад ддададЕдЕс дсЕдадсааа ссЕдадсЕсд сЕдЕЕдсЕсЕ сЕддсЕдЕдЕ ЕасадсЕсса аааЕЕдсЕса адсдддЕсЕд дЕЕЕаЕЕЕсЕ дЕддадаЕса садЕЕдаааЕ дссааадЕас асададсадд дсадасЕасд сссдЕсасаа ддаЕсЕсЕдд сЕсЕдддсда асааЕаадаа ЕЕЕасЕдддс ддасадаЕЕЕ дЕсаасааЕа аасдаасЕдЕ сЕддаасЕдс адЕддааддЕ асадсаадда адааасасаа ададсЕЕсаа
ЕдссЕасддд дадддссасс сЕасЕЕадсЕ аЕсЕаЕасдд сасЕсЕсасс ЕЕаЕадЕаЕЕ ддсЕдоасса сЕсЕдЕЕдЕд ддаЕаЭсдсс садсассЕас адЕсЕасдсс ааддддадад
120
180
240
300
360
420
480
540
600
660
720
729
<210> 62 <211> 241 <212> БЕЛОК <213> Ното зарЬепз
<400> 62
МеЕ 1 УаЬ Ьеи СЬп ТЬг 5 СЬп УаЬ РЬе Ые Зег Ьеи 10 Ьеи Ьеи Тгр Ые 15 Зег
СЬу АЬа Туг СЬу Азр Не УаЬ МеЕ ТЬг СЬп Зег Рго Азр Зег Ьеи АЬа
20 25 30
УаЬ Зег Ьеи СЬу.СЬи Агд АЬа ТЬх Ые Азп Суз Ьуз Зег Зег СЬп Зег
35 40 45
УаЬ Ьеи Туг Зег Зег Азп Азп Ьуз Азп Туг Ьеи АЬа Тгр Туг СЬп СЬп
50 55 60
- 104 012872
Ьуз 65 Рго БЬу СЬп Рго Рго 70 Ьуз Ьеи Ьеи 1Ье Туг 75 Тгр АЬа Зег ЬЬе Агд 60
СЬи Туг БЬу УаЬ Рго Азр Ахд РЬе Зег СЬу Зех СЬу Бег БЬу ТЬх Азр
65 90 95
рне ТЬг Ьеи ТЬг Не Бег Зег Ьеи СЬп АЬа СЬи Азр УаЬ АЬа УаЬ Туг
100 105 И0
РЬе Суз БЬп Б1П Туг Туг Зег Ые Рго Рхо Ьеи ТЬг РЬе БЬу БЬу БЬу
115 120 125
ТЬг Ьуз УаЬ СЬи Не Ьуз Агд ТЬг УаЬ АЬа АЬа Рго Зег УаЬ РЬе Не
130 135 140
РЬе Рго Рго Бег Азр СЬи СЬп Ьеи Ьуз Зег БЬу ТЬг АЬа Зех УаЬ УаЬ
145 150 155 160
Суз Ьеи Ьеи Азп Азп РЬе Туг Рго Агд СЬи АЬа Ьуз УаЬ СЬп Тгр Ьуз
165 170 175
УаЬ Азр Азп АЬа Ьеи СЬп Бег СЬу Азп Зег СЬп СЬи Зег УаЬ ТЬг СЬи
180 185 190
СЬп Азр Зег Ьуз Азр Зег ТЬг Туг Бег Ьеи Зег Зег тьг Ьеи ТЬг Ьеи
195 200 205
Бег Ьуз АЬа Азр Туг СЬи Ьуз НЬз Ьуз УаЬ тух АЬа Суз СЬи УаЬ ТЬг
210 215 220
НЬз СЬп СЬу Ьеи Зег Зег Рхо УаЬ ТЬг Ьуз Зег РЬе Азп Агд БЬу СЬи
225 230 235 240
Суз <2ΐο> ез <21Ь> 1419 <212> ДНК <213> Ното зарЬепз <400> 63 абддаасбдд ддсбссдсбд ддббббссбб дббдсбаббб бадааддбдб ссадбдбдад60 дбдсадсбдд бддадбсбдд дддаддссбд дбсаадссбд дддддбсссб дадасбсбсс120 бдбдсадссб сбддаббсас сббсадбадс бабадсабда асбдддбссд ссаддсбсса160 дддааддддс бддадбдддб сбсабссабб адбадбадба дбадббасаб абасбасдса240 дасбсадбда адддссдабб сассабсбсс ададасаасд ссаадаасбс асбдбабсбд300 сааабдааса дссбдададс сдаддасасд дсбдбдбабб асбдбдсдад адабдддбаб360 адсадбддсб ддбссбасба сбасбасбас ддбабддасд бсбддддсса адддассасд420 дбсассдбсб ссбсадсббс сассаадддс ссабссдбсб бсссссбддс дсссбдсбсб430 адаадсассб ссдададсас адсддсасбд ддабдссбдд бсааддасба сббссссдаа540 ссддбдасдд бдбсдбддаа сбсаддсдсб сбдассадсд дсдбдсасас сббсссадсб600 дбссбасадб ссбсаддасб сбаобсссбс адсадсдбдд бдассдбдсс сбссадсаас660 ббсддсассс адассбасас сбдсаасдба дабсасаадс ссадсаасас сааддбддас720 аадасадббд адсдсааабд ббдбдбсдад бдсссассдб дсссадсасс ассбдбддса780 ддассдбсад бсббссбсбб ссссссаааа сссааддаса сссбсабдаб сбсссддасс840 ссбдаддбса сдбдсдбддб ддбддасдбд адссасдаад ассссдаддб ссадббсаас900 бддбасдбдд асддсдбдда ддбдсабааб дссаадасаа адссасддда ддадсадббс960 аасадсасдб бссдбдбддб садсдбссбс ассдббдбдс ассаддасбд дсбдаасддс1020 ааддадбаса адбдсааддб сбссаасааа ддссбсссад сссссабсда даааассабс1060 бссаааасса аадддсадсс ссдадаасса саддбдбаса сссбдссссс абсссдддад1140 дадабдасса адаасоаддб садосбдасс бдссбддбса ааддаббсба ссссадсдас1200 абсдссдбдд адбдддадад саабдддсад ссддадааса асбасаадас сасассбссс1260
- 105 012872 ардсЬддасЬ ссдасддсЪс Бддсадсадд ддаасд'ЬсСЬ асдсадаада дссЬсБсссЬ
Ш.ШосТс Ьасадсаадс сЬсаЬдсЬсс дЬдабдсаЬд дБсБссдддЬ аааБдаЬад
БсассдБдда саададсадд аддсБсБдса саассасБас
1320
1380
1419 <210> 64 <211> 471 <212> БЕЛОК <213> Ното зарБепз <400> 64
МеБ 1 61и Беи 51у Беи Агд Тгр Уа1 5 РЬе Беи Уа1 10 А1а 11е Беи 51и 15 СБу
Уа1 61п Суз 5111 Уа1 51п Беи Уа1 61и Зег 51 у С1у СБу Беи Уа1 .Буз
20 25 30
РгО 61у С1у Зег Беи Агд Беи Зег Суз А1а А1а Зег С1у РЬе ТЬг РЬе
35 40 45
Зег Зег туг Зег МеВ Азп Тгр Уа1 Агд 61п А1а Рго 51у Буз СБу Беи
50 55 60
С1и Тгр Уа1 Зег Зег Не Зег Зег Зег Зег Зег Туг Не Туг Туг А1а
65 70 75 80
Азр Зег Уа1 Буз 61у Агд РЬе ТЬг 11е Зег Агд Азр Азп А1а Буз Азп
85 90 95
Зег Беи Туг Беи С1п Мер Азп Зег Беи Агд А1а С1и Азр ТЬг А1а Уа1
100 105 110
Туг Туг Суз А1а Агд Азр С1у Туг Зег Зег С1у Тгр Зег Туг Туг Туг
115 120 125
Туг Туг 61у Мер Азр Уа1 Тгр 51 у С1п 51 у ТЬг ТЬг Уа1 ТЬг Уа1 Зег
130 135 140
Зег А1а Зег ТЬг Буз 51 у Рго Зег Уа1 РЬе Рго Беи А1а Рго Суз Зег
.145 150 155 160
Агд Зег ТЬг Зег 51и Зег ТЫ А1а А1а Беи С1у Суз Беи Уа1 Вуз Азр
165 170 175
Туг РЬе Рго С1и Рго 7а1 ТЬг Уа1 Зег Тгр Азп Зег С1у А1а Беи ТЬг
180 185 190
Зег 61у Уа1 НБз ТЬг РЬе Рго. А1а Уа1 Беи Θ1Π Зег Зег СБу Беи Туг
195 200 205
Зег Беи Зег Зег Уа1 Уа1 ТЬг Уа1 Рго Зег Зег Азп РЬе 51у ТЬг С1п
210 215 220
ТЬг Туг ТЬг Суз Азп Уа1 Азр НБз Буз Рго Зег Азп ТЬг Буз Уа1 Азр
225 230 235 240
Буз ТЬг Уа1 С1и Агд Вуз Суз Суз Уа1 51и Суз Рго Рго Суз Рго А1а
245 250 255
Рго Рго Уа1 А1а 51у Рго Зег Уа1 РЬе Беи РЬе Рго Рго Вуз Рго Вуз
260 265 270
Азр ТЬг Беи МеЬ Не Зег Агд ТЬг Рго 61и Уа1 ТЬг Суз Уа1 Уа1 Уа1
275 280 285
- 106 012872
Азр Уа1 290 Зег Н1з Е1и Азр Рго С1и Уа1 295 61п РЬе Азп 300 Тгр Туг Уа1 Азр
С1у Уа1 С1и Уа1 Ηί3 Азп А1а Ьуз ТЬг Ьуз Рго Агд В1и 61и Е1п РЬе
305 310 315 320
Азп Зег ТЬг РЬе Агд Уа1 Уа1 Зег Уа1 Ьеи ТЬг Уа1 Уа1 ΗίΞ <31п Азр
325 330 335
Тгр Ьеи Азп Е1у Ьуз В1и Туг Ьуз Суз Ьуз Уа1 Зег Азп Ьуз 61у Ьеи
340 345 350
Рго А1а Рго Не 61и Ьуз ТЬг Не Зег Ьуз ТЬг Ьуз 61у С1п Рго Агд
355 360 365
Е1и Рго С1п Уа1 Туг ТЬг Ьеи Рго Рго Зег Агд В1и С1и Меб ТЬг Ьуз
370 375 380
Азп 61П Уа1 Зег Ьеи ТЬг Суз Ьеи Уа1 Ьуз С1у РЬе Туг Рго Зег Азр
385 390 3 95 400
Не А1а Уа1 С1и Тгр С1и Зег Азп С1у Е1п Рго <31и Азп Азп Туг Ьуз
405 410 415
ТЬг ТЬг Рго Рго Меб Ьеи Азр Зег Азр Е1у Зег РЬе РЬе Ьеи Туг Зег
420 425 430
Ьуз Ьеи ТЬг Уа1 Азр Ьуз Зег Агд Тгр В1п С1п С1у Азп Уа1 РЬе Зег
435 440 445
Суз Зег Уа1 Меб Н13 Е1и А1а Ьеи Н1з Азп Н1з Туг ТЬг (31 п Ьуз Зег
450 455 460
Ьеи Зег Ьеи Зег Рго В1у Ьуз
4 65 470
<210> 65 <211> 723 <212> ДНК <213> Ното зархепз <400> 65 абдаддсбсс дабаббдбда абсбссбдса бассбдсада бсбддадбдс адссдддбдд бдсадббббд ббсабсббсс сбдаабаасб бсдддбаасб адсадсассс дбсасссабе бда сбдсбсадсб бдасссадас адбсбадбса адсссддсса садасаддбб аддсбдадда дссаддддас сдссабсбда бсбабсссад сасаддадад Тдасдсбдад адддссбдад ссбддддсбд бссасбсбсб дадссбссбд дссбссасад садбддсадс бдббддддбб саадсбддад бдадсадббд ададдссааа бдбсасадад сааадсадас сбсдсссдбс сбаабдсбсб ддабассбдд абссадбдса 60 сбдбссдбса сбссбддаса дссддссбсс 120 сббадбдабд дааадассба бббдааббдд 180 сбссбдабсб абдаадбббс саассддббс 240 дддбсаддда садабббсас асбдаааабс 300 баббасбдса бдсааадбаб асадсббабд 360 абсааасдаа сбдбддсбдс ассабсбдбс 420 ааабсбддаа сбдссбсбдб бдбдбдссбд 480 дбасадбдда аддбддабаа сдсссбссаа 540 саддасадса аддасадсас сб^садссбс 600 басдадааас асааадбсба сдссбдсдаа 660 асааададсб бсаасадддд ададбдббад 720 723 <210> 66 <211> 239 <212> БЕЛОК <213> Ното зарбепз
- 107 012872
<400> 66 С1п Ьеи Ьеи. 61у Ьеи 10 Ьеи Мер Ьеи Тгр Не 15 Рго
Мер 1 Агд Ьеи Рго А1а 5
61у Зег Зег А1а Азр Не Уа1 МеР ТЬг 61п ТЬг Рго Ьеи Зег Ьеи Зег
20 25 30
Уа1 ТЬг Рго 61у 61п Рго А1а Эе г Не Зег Суз Ьуз Зег Зег 61п Зег
35 40 45
Ьеи Ьеи Ьеи Зег Азр 61 у Ьуз ТЬг Туг Ьеи Азп Тгр Туг Ьеи 61п Ьуз
50 55 60
Рго 61у 61п Рго Рго С1п Ьеи Ьеи Не Туг 61и Уа1 Зег Азп Агд РЬе
65 70 75 80
Зег С1у Уа1 Рго Азр Агд РЬе Зег 61у Зег С1у Зег 61у ТЬг Азр РЬе
85 90 95
ТЬг Ьеи Ьуз Не Зег Ахд Уа1 61и А1а 61и Азр Уа1 61у Уа1 Туг Зег
100 105 110
Суз МеР С1п Зег 11е 61п Ьеи Мер Зег Зег РЬе 61у 61п 61у ТЬг Ьуз
115 120 125
Ьеи С1и Не Ьуз Агд ТЬг Уа1 А1а А1а Рго Зег Уа1 РЬе 11е РЬе Рго
130 135 140
Рго Зег Азр С1и 61п Ьеи Ьуз Зег (31у ТЬг А1а Зег Уа1 Уа1 Суз Ьеи
145 150 155 160
Ьеи Азп Азп РЬе Туг Рго Агд 61и А1а Ьуз Уа1 61п Тгр Ьуз Уа1 Азр
165 170 175
Азп А1а Ьеи С1п Зег С1у Азп Зег 61п 51и Зег Уа1 ТЬг 61и 61п Азр
180 185 190
Зег Ьуз Азр Зег ТЬг Туг Зег Ьеи Зег Зег ТЬг Ьеи ТЫ Ьеи Зег Ьуз
195 200 205
А1а Азр Туг С1и Ьуз Н13 Ьуз Уа1 Туг А1а Суз 61и Уа1 ТЪг Н1з 61п
210 215 220
61 у Ьеи Зег Зег Рго Уа! ТЬг Ьуз Зег РЪе Азп Агд 61у 61и Суз
225 230 235
<210> 67 <211> 723 <212> ДНК <213> Ното зархепз <400> 67 аРдаддсРсс даРаРРдРда аРсРссРдса РассРдсада РсРддадРдс адссдддрдд РддасдРРсд РРсаРсРРсс сРдааРаасР РсдддРаасР адсадсассс сРдоРсадср Рдасссадас адРсРадРса адссаддсса садаРаддРР аддсРдадда дссаадддас сдссаРсРда РсРаРсссад сссаддадад РдасдсРдад ссРддддсРд РссасРсРсР дадссрссрд дссРссасад садРддсадс РдРРддддРР сааддрддаа рдадсадррд ададдссааа РдРсасадад сааадсадас сРааРдсРсР сРдРссдРса РарадрдаРд сРссРдаРсР дддрсаддда РаРРасРдса аРсааасдаа аааРсРддаа драсадрдда саддасадса Расдадааас ддаРассРдд ссссРддаса дааадассРа аРдаадРРРс садаРРРсас РдсааадРаР срдрддсрдс ОРдссРсРдР аддРддаРаа аддасадсас асааадРсРа аРссадРдсд дссддссРсс РРРдРРРРдд саассдаРРс асРдааааРа асадсррссд ассарсрдрс РдРдРдссРд сдсссРссаа сРасадссРс сдссРдсдаа
120
180
240
300
360
420
480
540
600
660
- 108 012872 дЕсасссаЕс адддссЕдад сЕсдсссдйс асааададсЕ Есаасадддд ададЕдЕЕад 720
Еда . 723 <210> 68 <211> 239 <212> БЕЛОК <213> Ното зархепз <400> 68
МеЕ Агд Ьеи Рго А1а С1п Ьеи Ьеи С1у Ьеи Ьеи 10 МеЕ Ьеи Тгр Не 15 Рго
1 5
61у Зег Зег А1а Авр Не Уа1 МеЕ ТЪг <31п Тйг Рго Ьеи Зег Ьеи Зег
20 25 30
Уа1 ТЪг Рго 31у 61п Рго А1а Зег Не Зег Суз Ьуз Зег Зег 61п Зег
35 40 4 5
Ьеи Ьеи Туг Зег Азр 61у Ьуз ТИг Туг Ьеи РЬе Тгр Туг Ьеи С1п Ьуз
50 55 60
Рго 61у С1п Рго Рго 61П Ьеи Ьеи Не Туг 31 и Уа1 Зег Азп Агд РЪе
65 . 70 75 80
Зег С1у Уа1 Рго Авр Агд РЬе Зег С1у Зег Б1у Зег 61у Тйг Азр РЪе
85 90 95
Тйг Ьеи Ьуз Не Зег Агд Уа1 61и А1а С1и Азр Уа1 61у Уа1 Туг Туг
100 105 110
Суз МеЕ 61п Зег Не С1п Ьеи Рго Тгр Тйг Рйе 61 у 61п С1у Тйг Ьуз
115 120 125
Уа1. 61и Не Ьуз Агд ТЪг Уа1 А1а А1а Рго Зег Уа1 РЬе Не РЬе Рго
130 135 140
Рго Зег Азр С1и С1п Ьеи Ьуз Зег 61у ТИг А1а Зег Уа1 Уа1 Суз Ьеи
145 150 155 160
Ьеи Азп Азп РЪе Туг Рго Агд С1и А1а Ьуз Уа1 С1П Тгр Ьуз. Уа1 Азр
165 170 175
Азп А1а Ьеи 51п Зег 61у Азп Зег С1п О1и Зег Уа1 ТЙГ 61и <31п Азр
180 185 190
Зег Ьуз Азр Зег ТЪг Туг Зег Ьеи Зег Зег Тйг Ьеи Тйг Ьеи Зег Ьуз
195 200 205
А1а Азр Туг 61и Ьуз Нхз Ьуз Уа1 Туг А1а Суз 61и Уа1 ТНг Нхз 61п
210 215 220
С1у Ьеи Зег Зег Рго Уа1 Тйг Ьуз Зег Рйе Азп Агд 61у 61и Суз
225 230 235
<210> 69 <211> 14 <212> БЕЛОК .
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид
- 109 012872 <400> 69
Зег Зег 01п Зег Ьеи Ьеи С1п 8ег Азп С1у Туг Азп Туг Ьеи 15 10 <210> 70 <211> 53 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический прайыер <400> 70
ЕаЕсЕаадсЕ ЕсЕадасЕсд адсдссасса ЕддасЕддас сЕддадсаЕс сЕЕ 53 <210> 71 <211> 53 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический праймер <400> 71
ЕаЕсЕаадсЕ ЕсЕадасЕсд адсдссасса ЕддадЕЕЕдд дсЕдадсЕдд аЕЕ 53 <210> 72 <211> 53 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический праймер <400> 72
ЕаЕсЕаадсЕ ЕсЕадасЕсд адсдссасса ЕддаасЕддд дсЕссдсЕдд дЕЕ 53 <210> 73 <211> 53 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический прайыер <400> 73
ЕаЕсЕаадсЕ ЕсЕадасЕсд адсдссасса ЕддадЕЕЕдд дсЕдадсЕдд сЕЕ 53 <210> 74 <211> 53 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
- 110 012872 <223> Описание искусственной последовательности: синтетический праймер <400> 74
ЬаЬЫаадс! ЬсЬадасбсд адсдссасса 1ддадЫ1дд дс1дадс1дд 'Д: 53 <210> 75 <211> 53 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический праймер <400> 75
1а1с1аадс1 ЬсбадасЬсд адсдссасса ЪддадШдд дс1дадс!дд дЫ53 <210> 76 <211> 53 <212> ДНК.
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический праймер.
<400> .76.
баЬсЬаадс! ГЫадасДсд адсдссасса бдааасасс! дбддЫсЫс с!с53 <210> 77 <211> 53 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220> .
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический праймер .
<400> 77
ЬаЬсЬаадс! ЪсЬадасссд ддсдссасса Ьдаддсбссс 1дс1садс1с с!д 53 <210> 78 <211> 53 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический праймер <400> 78
ЬаДсЬаадс! ЬсЬадасссд ддсдссасса ЬдЫдсса! с асаасбсаЫ ддд 53 <210> 79 <211> 53 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность
- 111 012872 <22О>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический праймер <400> 79'
ЬаДсДаадсД ДсДадасссд ддсдссасса ДддДдДДдса дасссаддЬс 7:с53 <210> 80 <211> 53.
<212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220 <223> Описание искусственной последовательности: синтетический праймер <300 80
ДаДсДаадсД ДсДадасссд ддсдссасса ДддасаДдад ддДссссдсД сад53 <210 81 <211> 53 <212> ДНК.
<213> Искусственная последовательность.
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический праймер <400> 81
ДаДсДаадсД ДсДадасссд ддсдссасса ДддасаДдад ддДсссДдсД сад53 <210> 82 .
<211> 44 ' <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220 .
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический праймер ,.
<400> 82
ДДсДсДдаДс адааДДссДа ДсаДД1ассс ддадасаддд адад44 <210 83.
<211> 43 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический праймер <400> 83
ДДсДДДдаДс адааДДсДса сЬаасасДсД ссссДдДДда аде43 <210 84 <211> 44 <212> ДНК.
<213> Искусственная последовательность.
- 112 012872 <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический праймер <400> 84
ЫсЬсЬдабс адааЫссДа ЬсаЫбассс ададасаддд адад 44 <210> 85 <211> 44 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<22 3> Описание искусственной последовательности: синтетический праймер <400> 85 ддаГсЬддда садаШсас ссЬсассаЬс ааЬадссЬдд аадс 44 <210> 86 <211> 44 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический праймер <400> 86 дсьиссаддс ьаЫдасууи дадддЬуааа еСьдЬсссад аРсс 44 <210> 37 <211> 27 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности; синтетический праймер <400> 87 дсадсдОсЬд даЫсассЫ садЬадс 27 <210> 88 <211> 27 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический праймер <400> 68 дсЬасДдаад дЬдааЬссад асдсДдс 27 <210> 89 <211> 24 <212> ДНК
- 113 012872 <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический праймер <400> 89 сддаддЕдсЕ ЕсЕададсад ддсд .24 <210> 90 <211> 47 <212> ДНК.
<213> Искусственная последовательность ' <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический праймер <400> 90.
дсаадЕсада дЕаЕЕадЕад сЕаЕЕЕаааЕ ЕддЕаЕсадс адйаасс47 <210> 91 <211> 47 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <22О>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический праймер <400> 91 ддЕЕЕсЕдсЕ даЕассааЕЕ ЕаааЕадсЕа сЕааЕасЕсЕ дасЕЕдс47 <210> 92 <211> 48 <212> ДНК ..
<213> Искусственная последовательность.
<220> . ' <223> Описание искусственной последовательности: синтетический праймер <400> 92 ссаЕсадЕЕс ЕсЕдсаассЕ даддаЕЕЕЕд саасЕЕасЕа сЕдЕсасс .48 <210> 93 <211> 48 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность.
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический праймер <400> 93 ддЕдасадЕа дЕаадЕЕдса аааЕссЕсад дЕЕдсадада асЕдаЕдд 48 <210> 94 <211> 31
- 114 012872 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический праймер <400> 94 дсаааРдаас адссРдсдсд сРдаддасас д 31 <210> 95 <211> 31 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический праймер <400> 95 сдРдРссРса дсдсдсаддс РдРРсаРРРд с <210> 96 <211> 45 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический праймер <400> 96 сааЬаадаас РасРЪадсРР ддЬассааса дааассадда садсс 45 <210> 97 <211> 45 <212> ДНК ..
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический праймер <400 97 ддссдРссРд дРРРсРдРРд дРассаадсР аадрадррср -ЬзЫсд 45 <210 98 <211> 45 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический праймер <40 0 98 сссРсадддд РсдадРсасс аРдРсадРад асасдРссаа даасс 45 <210> 99
- 115 012872 <211> 45 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический праймер <400> 99 .
ддССсЬСдда сдЬдСсСасЪ дасаЬддЬда сСсдассссС даддд 45 <210> 100 <211> 21 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220> .
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический праймер.
<400> 100.
аЬЮТададс адддсдссад д21 <210> 101 <211> 30 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический праймер <400> 101 ссаЪсЬссЬд саадЪс^адЬ сададссОсс <210> 102 <211> 30 <212> ДНК ' <213> Искусственная последовательность <220> .
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический праймер .
<400> 102 ддаддс^сЬд асЬадасЪЬд саддадаЪдд <210> 103 <211> 47 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический праймер <400> 103 ддЬЬЪа^Лас 5дса1:дсааа д1:а!:асадсР ЬаЬдЬссадС ЪРЕддсс 4 7
- 116 012872 <210> 104 <211> 47 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический праймер <400 104 ддссаааасЕ ддасаЕаадс ЕдЕаЕасЕЕЕ дсаЕдсадЕа аЕааасс 47 <210> 105 <211> 24 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический праймер <400 105 ссЕдсаадЕс ЕадЕсададс сЕсс 24 <210 106 <211> 24 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220 <223> Описание искусственной последовательности: синтетический праймер <400 106 ддаддсЕсЕд асЕадасЕЕд садд 24 <210> 107 <211> 543 <212> БЕЛОК <213> Ното зарЬепз
<400> 107
МеЕ 1 Азр РЬе С1у Ьеи А1а Ьеи Ьеи Ьеи А1а С1у Ьеи Ьеи (31у Ьеи 15 Ьеи
5 10
Ьеи (31у <31п Зег Ьеи 51л Уа1 Ьуз Рго Ьеи С1Л Уа1 61и Рго Рго (31и
20 25 30
Рго Уа1 Уа1 А1а Уа1 А1а Ьеи С1у А1а Зег Агд (31л Ьеи ТЬг Суз Агд
35 40 45
Ьеи А1а Суз А1а Азр Агд <31у А1а Зег Уа1 С1П Тгр Агд С1у Ьеи Азр
50 55 60
ТЬг Зег Ьеи С1у А1а Уа1 С1п Зег Азр ТЬг (31у Агд Зег Уа1 Ьеи ТЬг
65 70 75 80
Уа1 Агд Азп А1а Зег Ьеи Зет А1а А1а С1у ТЬг Агд Уа1 Суз Уа1 С1у
85 90 95
Зег Суз 61у е1у Агд ТЬг РЬе С1П Н1з ТЬг Уа1 (31л Ьеи Ьеи Уа! Туг
- 117 012872
100 105 110
А1а РЬе Рго Азр 61П Ьеи ТЬг Уа1 Зег Рго А1а А1а Ьеи Уа1 Рго 61у
115 120 125
Азр Рго 61и Уа1 А1а Суз ТЬг А1а Η13 Ьуз Уа1 ТЬг Рго Уа1 Азр Рго
130 135 140
Азп А1а Ьеи Зег РЬе Зег Ьеи Ьеи Уа1 61 у 61у 61п 61и Ьеи 61и 61у
145 150 155 160
А1а С1п А1а Ьеи 61у Рго С1и Уа1 С1П 61 и 61и 61и 61и 61и Рго 61п
165 170 175
е1у Азр С1и Азр Уа1 Ьеи РЬе Агд Уа1 ТЬг 61и Агд Тгр Агд Ьеи Рго
180 185 190
Рго Ьеи 61у ТЬг Рго Уа1 Рго Рго А1а Ьеи Туг Суз 61п А1а ТЬг Меб
195 200 205
Агд Ьеи Рго С1у Ьеи С1и Ьеи Зег ΗΪ3 Агд 61п А1а Не Рго Уа1 Ьеи
210 215 220
Н1з Зег Рго ТЬг Зег Рго С1и Рго Рго Азр ТЬг ТЬг Зег Рго 61и Зег
225 230 235 240
Рго Азр ТЬг ТЬг Зег Рго С1и Зег Рго Азр ТЬг ТЬг Зег 61п 61и Рго
245 250 255
Рго Азр ТЫ ТЬг Зег С1п 61и Рго Рго Азр ТЬг ТЬг Зег 61п 61и Рго
260 265 270
Рго Азр ТЬг ТЬг Зег Рго 61и Рго Рго Азр Ьуз ТЬг Зег Рго 61и Рго
275 280 285
А1а Рго С1п 61п 61у Зег ТЬг НЬз ТЬг Рго Агд Зег Рго 61у Зег ТЬг
290 295 300
Агд ТЬг Агд Агд Рго 61и Не 61п Рго Ьуз Зег Суз АЗр Ьуз ТЫ ΗΪ3
305 310 315 320
ТЫ Суз Рго Рго Суз Рго А1а Рго Б1и Ьеи Ьеи 61у 61у Рго Зех Уа1
325 330 335
РЬе Ьеи РЬе Рго Рго Ьуз Рго Ьуз Азр ТЬг Ьеи Меб 11е Зег Агд ТЬг
340 345 350
Рго С1и Уа1 ТЬг Суз Уа1 Уа1 Уа1 Азр Уа1 Зег Нхз 61и Азр Рго 61и
355 360 365
Уа1 Ьуз РЬе Азп Тгр Туг Уа1 Азр С1у Уа1 С1и Уа1 Н1з Азп А1а Ьуз
370 375 380
ТЬг Ьуз Рго Агд С1и С1и 61п Туг Азп Зег ТЬг Туг Агд Уа1 Уа1 Зег
385 390 395 400
Уа1 Ьеи ТЬг Уа1 Ьеи Н13 61п Азр Тгр Ьеи Азп 61у Ьуз 61и Туг Ьуз
405 410 415
Суз Ьуз Уа1 Зег Азп Ьуз А1а Ьеи Рго А1а Рго 11е 61и Ьуз ТЬг Пе
420 425 430
Зег Ьуз А1а Ьуз 61у С1п Рго Агд С1и Рго 61п Уа1 Туг ТЬг Ьеи Рго
435 440 445
- 118 012872
Рго Зег 450 Агд Азр 61и Ьеи ТЫ 455 Ьуз Азп БЬп УаЬ Зег 460 Ьеи ТЫ Суз Ьеи
УаЬ Ьуз БЬу РЬе Туг Рго Зег Азр Не АЬа Уа1 СЬи Тгр СЬи Зег Азп
4 65 470 475 480
БЬу 61п Рго 61и Азп Азп Туг Ьуз АЬа ТЫ Рго Рго УаЬ Ьеи Азр Зег
485 4 90 495
Авр БЬу Зег РЬе РЬе Ьеи Туг Зег Ьуз Ьеи ТЫ УаЬ Азр Ьуз Зег Агд
500 505 510
Тгр СЬп БЬп БЬу Азп УаЬ РЬе Зег Суз Зег УаЬ Меб ΗΪ8 БЬи АЬа Ьеи
515 520 525
НЬз Азп НЬз Туг ТЬг БЬп Ьуз Зег Ьеи Зег Ьеи Зег Рго БЬу Ьуз
530 535 540
<210> 108 <211> 23 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический праймер <400> 108 саддбдсадс бддадсадбс бдд 23 <210> 109 <211> 24 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический праймер <400> 109 дсбдадддад бададбссбд адда <210> 110 <211> 28 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический праймер <400> 110 дсбдадддад бададбссбд аддасбдб 28 <210> 111 <211> 21 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность
- 119 012872 <220>
<223> Описание искусственной последовательности; синтетический праймер <400> 111 адсабддабс ддддссбддс с 21 <210> 112 <211> 21 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности; синтетический праймер <400> 112 дбдсаддасс дддабддссб д 21 <210> 113 <211> 116 <212> БЕЛОК <213> Ното зархепз <400> 113
С1и 1 7а1 С1п Ьеи Уа1 С1и Зег С1у 61у С1у Ьеи Уа1 Ьуз Рго С1у 15 С1у
5 10
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег 61у РЬе ТЬг РЬе Зег Азп А1а
20 25 30
Тгр Меб Зег Тгр Уа1 Агд С1п А1а Рго С1у Ьуз С1у Ьеи С1и Тгр Уа1
35 40 45
В1у Агд Не Ьуз Зег Ьуз ТЬг Азр Е1у 61у ТЬг ТЬг Азр Туг А1а А1а
50 55 60
Рго Уа1 Ьуз 61у Агд РЬе ТЬг Не Зег Агд Азр Азр Зег Ьуз Азп ТЬг
65 70 75 80
Ьеи Туг Ьеи 61п Меб Азп Зег Ьеи Ьуз ТЬг С1и Азр ТЬг А1а Уа1 Туг
85 90 95
Туг Суз ТЬг ТЬг Уа1 А1а Азр Туг Тгр С1у С1п С1у ТЬг Ьеи Уа1 ТЬг
100 105 но
Уа1 Зег Зег А1а
115 <210> 114 <211> 116 <212> БЕЛОК <213> Ното зархепз <400> 114
С1и 1 Уа1 Й1п Ьеи Ьеи 5 О1и Зег 51у Е1у 01у 10 Ьеи Уа1 61п Рго 61у 15 61у
Зег Ьеи Агд Ьеи 20 Зег Суз А1а А1а Зег 25 51у РЬе ТЬг РЬе Зег 30 Зег Туг
- 120 012872
А1а МеЕ Зег Тгр 35 Уа1 Агд С1п А1а 40 Рго СЬу Ьуз 61у Ьеи 45 С1и Тгр Уа1
Зег А1а Ые Зег СЬу Зег С1у СЬу Зег ТЬг Туг Туг АЬа Азр Зег УаЬ
50 55 60
Ьуз С1у Агд РЬе ТЬг Ые Зег Агд Азр Азп Зег Ьуз Азп ТЬг Ьеи Туг
65 70 75 80
Ьеи С1п МеЕ Азп Зег Ьеи Агд АЬа СЬи Азр ТЬг АЬа Уа1 Туг Туг Суз
65 90 95
А1а А1а С1у Туг Зег Туг СЬу Туг Тгр С1у С1п СЬу ТЬг Ьеи УаЬ ТЬг
100 105 110
УаЬ Зег Зег АЬа
115 <210> 115 <211> 117 <212> БЕЛОК <213> Ното зархепз
<400> 115 Зег С1у СЬу СЬу УаЬ 10 Уа1 С1п Рго СЬу 15 Агд
СЬп 1 Уа1 СЬп Ьеи УаЬ СЬи 5
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а АЬа Зег С1у РЬе ТЪг РЬе Зег Зег Туг
20 25 30
СЬу МеЕ Н18 Тгр Уа1 Агд СЬп АЬа Рго СЬу Ьуз СЬу Ьеи СЬи Тгр УаЬ
35 40 45
АЬа УаЬ Ые Тгр Туг Азр С1у Зег Азп Ьуз Туг Туг АЬа Азр Бег УаЬ
50 55 60
Ьуз СЬу Агд РЬе ТЬг Ые Зег Агд Аар Азп Зег Ьуз Азп ТЪг Ьеи Туг
65 70 75 80
Ьеи С1п МеЕ Азп Зег Ьеи Агд А1а СЬи Азр ТЪг АЬа Уа1 Туг Туг Суз
65 90 95
АЬа Агд Туг Туг Туг СЬу МеЕ Азр УаЬ Тгр СЬу СЬп СЬу ТЪг ТЬг Уа1
100 Ь05 110
ТЬг УаЬ Зег Зег АЬа
115 <210> 116 <211> 122 <212> БЕЛОК <213> Ното зарЬепз
<400> 116 Уа1 УаЬ СЬп Рго СЬу 15 Агд
С1п 1 УаЬ СЬп Ьеи УаЬ 5 СЬи Зег С1у СЬу СЬу ЬО
Бег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз АЬа АЬа Зег СЬу РНе ТЬг РЬе Зег Бег Туг
20 25 30
СЬу МеЕ НЬз Тгр УаЬ Агд СЬп АЬа Рго СЬу Ъуз СЬу Ьеи СЬи Тгр УаЬ
40 45
- 121 012872
А1а УаБ 50 11е Зег Туг Азр СБу 55 Зег Азп Буз Туг Туг АБа 60 Азр Зег УаБ
Вуз СБу Агд РЬе ТЬг 11е Бег Агд Азр Азп Зег Вуз Азп ТЬг Беи Туг
65 70 75 80
Беи είπ МеБ Азп Бег Беи Агд АБа С1и Азр ТЬг АБа УаБ Туг Туг Суз
85 90 95
АБа Агд ТЬг УаБ УаБ ТЬг Туг Туг Туг Туг СБу МеБ Азр Уа1 Тгр СБу
100 105 110
СБп СБу ТЬг ТЬг Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег АБа
115 120 <210> 117 <211> 120 <212> БЕЛОК <213> Ното зарБепз <400> 117
С1П 1 УаБ от Беи С1п 5 С1и Зег СБу Рго СБу 10 Беи УаБ Буз Рго Зег 15 С1и
ТЬг Беи Зег Беи ТЬг Суз ТЬг УаБ Зег СБу СБу Зег 11е Зег Зег Туг
20 25 30
Туг Тгр Зег Тгр 11е Агд С1п Рго АБа СБу Буз СБу Беи СБи Тгр Не
35 40 45
гл „ Ь ч-гг Не Тчг*' Ткг тъг Азп Т Ϊ7Τ* Азп Рго Зег Т. А 1Д Т .17«
У * -Г *- “Л -
50 55 60
Зег Агд Уа1 ТЬг МеБ Зег Уа1 Азр ТЬг Зег Буз Азп С1п РЬе Зег Беи
65 70 75 Θ0
Ьуз Беи Зег Зег УаБ ТЬг АБа АБа Азр ТЬг АБа УаБ Туг Туг Суз АБа
85 90 95
Агд 11е ТЬг МеЬ Уа1 Агд СБу УаБ Не РЬе Азр Туг Тгр СБу С1п СБу
100 105 110
ТЬг Беи УаБ ТЬг Уа1 Зег Зег АБа
115 120 <2ю> не <211> 121 <212> БЕЛОК <213> Ното зарБепз <400> 118
С1и УаБ 1 С1п Беи Беи С1и 5 Зег СБу СБу С1у Беи 10 УаБ С1п Рго СБу 15 СБу
Зег Беи Агд Беи Зег Суз АБа А1а Зег СБу РЬе ТЬг РЬе Зег Зег Туг
20 25 30
АБа Ме-Ь Зег Тгр УаБ Агд С1п АБа Рго СБу Буз СБу Беи С1и Тгр Уа1
35 40 45
Зег АБа 1Бе Зег СБу Зег СБу СБу Зег ТЬг Туг Туг АБа Азр Зег Уа1
- 122 012872
50 55 60
Ьуз еьу Агд РНе ТНг Ые Зег Агд Азр Азп Зег Ьуз Азп ТНг Ьеи Туг
65 70 75 80
Ьеи БЬп Мер Азп Зег Ьеи Ахд АЬа СЬи Азр ТНг АЬа УаЬ Туг Туг Суз
85 90 95
АЬа Ые АЬа УаЬ АЬа Туг Туг Туг Туг СЬу Мер Азр УаЬ Тгр БЬу СЬп
ЬОО 105 110
БЬу ТНг ТНг УаЬ ТНг УаЬ Зег Зег АЬа
115 120 <210> 119 <2Ы> 125 <212> БЕЛОК <213> Ното зархепз
<400> 119 БЬу БЬу БЬу Ьеи УаЬ 10 Ьуз Рго БЬу 15 БЬу
СЬи 1 УаЬ СЬп Ьеи УаЬ БЬи Зег 5
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз АЬа АЬа Зег БЬу РНе ТНг РЬе Зег Зег Туг
20 25 30
Зег Мер Азп Тгр УаЬ Агд БЬп АЬа Рго БЬу Ьуз БЬу Ьеи БЬи Тгр УаЬ
35 40 45
Зег Зег Ые Зег Зег Зег Зег Зег Туг Ые Туг Туг АЬа Азр Зег УаЬ
50 55 80
Ьуз БЬу Агд РНе ТНг Ые Зег Агд Азр Азп АЬа Ьуз Азп Зег Ьеи Туг
65 70 75 80
Ьеи БЬп Мер Азп Зег Ьеи Агд АЬа БЬи Азр ТНг АЬа УаЬ Туг Туг Суз
85 90 95
АЬа Агд БЬу Туг Зег Зег БЬу Тгр Туг Туг Туг Туг Туг БЬу Мер Азр
100 105 ыо
УаЬ Тгр БЬу БЬп БЬу ТНг ТНг УаЬ ТНг УаЬ Зег Зег АЬа
115 120 125 <210> 120 <211> 121 <212> БЕЛОК <213> Ното зархепз <400> 120
БЬп 1 УаЬ СЬп Ьеи УаЬ 5 СЬп Зег БЬу АЬа БЬи УаЬ Ьуз Ьуз 10 Рго БЬу 15 АЬа
Зег УаЬ Ьуз УаЬ Зег Суз Ьуз АЬа Зег БЬу Туг ТНг РНе ТНг Зег Туг
20 25 30
БЬу Ые Зег Тгр УаЬ Агд БЬп АЬа Рго БЬу БЬп БЬу Ьеи 61и Тгр Мер
35 40 45
БЬу Тгр Ые Зег АЬа Туг Азп СЬу Азп ТНг Азп Туг АЬа СЬп Ьуз Ьеи
50 55 60
- 123 012872
СЬп С1у Агд УаЬ ТЬг МеЬ. ТЬх ТЬг Азр ТЬг Зег ТЬг Зег ТЬг АЬа Туг
65 70 75 80
МеЁ СЬи Ьеи Агд Зег Ьеи Агд Зег Азр Азр ТЬг АЬа УаЬ Туг Туг Суз
35 90 95
АЬа Агд Зег Зет Зег Зег Туг Туг Туг С1у ΜβΈ Азр УаЬ Тгр СЬу СЬп
100 105 110
СЬу ТЬг ТЬг УаЬ ТЬг УаЬ Зег Зег АЬа
115 120 <210> 121 <211> 122 <212> БЕЛОК <213> Ното зарЬепз <400> 121
СЬп 1 УаЬ СЬп Ьеи СЬп СЬи Зег СЬу Рго СЬу Ьеи УаЬ Ьуз Рго Зег 15 СЬи
5 10
ТЬг Ьеи Зег Ьеи ТЬг Суз ТЬг УаЬ Зег СЬу СЬу Зег Ые Зег Зег Туг
20 25 30
Туг Тгр Зег Тгр Ые Агд СЬп Рго АЬа СЬу Ьуз СЬу Ьеи СЬи Тгр Ые
35 40 45
СЬу Агд 11е Туг ТЬг Зег СЬу Зег ТЬг Азп Туг Азп Рго Зег Ьеи Ьуз
50 55 60
Зег Ахд УаЬ ТЬг МеЬ Зег УаЬ Азр ТЬг Зег Ьуз Азп СЬп РЬе Зег Ьеи
65 70 75 80
Ьуз Ьеи Зег Зег УаЬ ТЬг АЬа АЬа Азр ТЬг АЬа УаЬ Туг Туг Суз АЬа
85 90 95
Агд Туг Туг Туг СЬу Зег СЬу Зег Туг Туг СЬу Меь Азр.УаЬ Тгр СЬу
100 105 110
СЬп СЬу ТЬг ТЬг УаЬ ТЬг УаЬ Зег Зег АЬа
115 120 <210> 122 <211> 112 <212> БЕЛОК <213> Ното зарЬепз
<40О> 122 СЬу СЬу СЬу УаЬ 10 УаЬ СЬп Рго СЬу 15 Ахд
СЬп 1 УаЬ СЬп Ьеи УаЬ . 5 СЬи Зег
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз АЬа АЬа Зег СЬу РЬе ТИг РЬе Зег Зег Туг
20 25 30
СЬу МеЬ Ηίε Тгр УаЬ Агд СЬп АЬа Рго СЬу Ьуз СЬу Ьеи СЬи Тгр УаЬ
35- 40 45
АЬа УаЬ Ые Тгр Туг Азр СЬу Зег Азп Ьуз Туг Туг АЬа Азр Зег УаЬ
50 55 60
Ьуз СЬу Агд РЬе ТЬг Ые Зег Агд Азр Азп Зег Ьуз Азп ТЬг Ьеи Туг
65 70 75 80
- 124 012872
Ьеи СЬп Меб Азп Зег 85 Ьеи Агд А1а СЬи Азр ТЬг 90 УаЬ Туг Туг 95 Суз
АЬа РЬе Азр Туг Тгр СЬу С1п СЬу ТЬг Ьеи УаЬ ТЬг УаЬ Зег Зег АЬа
100 105 110
<210> 123 <211> 112 <212> БЕЛОК <213> Ното зарЬепз <400> 123
Азр 1 Не УаЬ Меб ТЬг 5 СЬп Зег Рго Ьеи Зег 10 Ьеи Рго УаЬ ТЬг Рго 15 СЬу
СЬи Рго АЬа Зег Пе Зег Суз Агд Зег Зег СЬп Зег Ьеи Ьеи СЬп Зег
20 25 30
Азп СЬу Туг Азп Туг Ьеи Азр Тгр Туг Ьеи СЬп Ьуз Рго СЬу СЬп Зег
35 40 45
Рго СЬп Ьеи Ьеи Не Туг Ьеи СЬу Зег Азп Агд АЬа Зег СЬу УаЬ Рго
50 55 60
Азр Агд РЬе Зег СЬу Зег СЬу Зег СЬу ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи Ьуз 11е
65 70 75 80
Зег Агд УаЬ СЬи АЬа СЬи Азр УаЬ СЬу УаЬ Туг Туг Суз Меь С1п АЬа
65 90 95
Ьеи СЬп ТЬг Не ТЬг РЬе СЬу СЬп СЬу ТЬг Агд Ьеи СЬи Не Ьуз Агд
100 . 105 110 <210> 124 <211> 107 <212> БЕЛОК <213> Ното зарЬепз
<400> 124 Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег 10 АЬа Зег УаЬ 15 С1у
Азр 1 11е С1п Меб ТЬг 5 СЬп
Азр Агд УаЬ ТЬг Не ТЬг Суз Агд АЬа Зег С1п Зег Пе Зег Зег Туг
20 25 30
Ьеи Азп Тгр Туг СЬп СЬп Ьуз Рго СЬу Ьуз АЬа Рго Ьуз. УаЬ Ьеи ЬЬе
35 40 45
РЬе АЬа АЬа Зег Зег Ьеи СЬп Зег СЬу УаЬ Рго Зег Агд РЬе Зег СЬу
50 55 60
Зег С1у Зег СЬу ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг Не Зег Зег Ьеи СЬп Рго
65 70 75 80
СЬи Азр РЬе АЬа ТЬг Туг Туг Суз СЬп СЬп Зег Туг Зег ТЬг Рго ТЬг
- 125 012872
85 90 95
РЬе С1у 61п б!у ТЬг Агд Ьеи <31и Не Ьуз Агд
ίσο 105
<210> 125 <211> 106 <212> БЕЛОК <213> Ното зарЬепз
<400> 125 ТЬг 5 (31п Зег Рго Азр РЬе 10 Θΐη Зег Уа1 ТЬг Рго 15 Ьуз
61и Не 1 νβΐ Ьеи
С1и Ьуз νβΐ ТЬг Не ТЬг Суз Агд А1а Зег С1п Зег Не С1у Зег Зег
20 25 30
Ьеи Н1з Тгр Туг С1п 51П Ьуз Рго Азр Й1п Зег Рго Ьуз Ьеи Ьеи 11е
35 40 45
Ьуз Туг А1а Зег С1п Зег РЪе ТЬг е1у Уа1 Рго Зег Агд РЬе Зег С1у
50 55 60
Зег С1у Зег С1у ТЪг Азр РЪе ТЬг Ьеи ТЬг Не Азп Зег Ьеи Й1и А1а
65 70 75 80
С1и Азр А1а А1а ТЬг Туг Туг Суз ΗΪ3 61п Зег Зег Зег Ьеи ТЬг РЪе
85 90 95
С1у С1у Й1у ТЬг Ьуз Уа1 С1и Не Ьуз Агд
100 105
<210> 126 <211> 10В <212> БЕЛОК <213> Ното зартепз
<400> 126
Азр 1 Не 61п МеР ТЬг <31п Зег 5 Рго Зег Зег 10 Ьеи Зег А1а Зег Уа1 15 С1у
Азр Ахд νβι ТЬг Не ТЬг Суз Агд А1а Зег С1п Зег 11е Зег Зег Туг
20 25 30
Ьеи Азп Тгр Туг 61п εΐη Ьуз Рго Й1у Ьуз А1а Рхо Ьуз Ьеи Ьеи 11е
35 40 45
Туг А1а А1а Зех Зег Ьеи Зег 51п С1у νβΐ Рго Зег Агд РЪе Зех С1у
50 55 60
Зег С1у Зег С1у ТЬх Азр РЬе ТЬх Ьеи ТЬг Не Зех Зег Ьеи С1п Рго
65 70 75 80
С1и Азр РЬе А1а ТЬг Туг Туг Суз 61п б1п Зег Тух Зег ТЪг Рго РЪе
85 90 95
ТЬг РЬе С1у Рго С1у ТЬг Ьуз Уа1 Азр Пе Ьуз Агд
100 105 <210> 127 <211> 114
- 126 012872 <212> БЕЛОК <213> Ното зарЬепз
<400> 127 МеЬ ТЬг С1п Зег Рго Азр Зег Ьеи АЬа УаЬ Зег Ьеи С1у 15
Азр 1 11е УаЬ
5 10
61и Агд АЬа ТЬг Не Азп Суз Ьуз Зег Зег СЬп Зег Уа! Ьеи Тух Зех
20 25 30
Зег Азп Азп Ьуз Азп Туг Ьеи АЬа Тгр Туг С1п СЬп Ьуз Рхо С1у С1п
35 40 45
Рго Рго Ьуз Ьеи Ьеи Не Туг Тгр АЬа Зег ТЬг Агд СЬи Зег С1у УаЬ
50 55 60
Рго Азр Агд РЬе Зег СЬу Зег 61у Зег 61у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг
65 70 75 80
Не Зег Зег Ьеи СЬп АЬа СЬи Азр УаЬ АЬа УаЬ Туг Туг Суз СЬп С1п
85 90 95
Туг Туг Зег ТЬг Рго Ьеи ТЬг РЬе С1у СЬу СЬу ТЬг Ьуз УаЬ 61и Не
100 105 но
Ьуз Агд <210> 128 <211> 106 <212> БЕЛОК <213> Ното зархепз <400> 128
Азр 1 Не СЬп МеЬ ТЬг СЬп Зег Рго 5 Зег Зег Ьеи Зег АЬа Зег УаЬ СЬу
10 15
Азр Агд Уа1 ТЬх Не ТЬг Суз Ахд АЬа Зех 61п Зег 11е Зех Зех Тух
20 25 30
Ьеи Азп Тгр Туг <31п СЬп Ьуз Рго С1у Ьуз АЬа Рго Ьуз Ьеи Ьеи Не
35 40 45
Туг АЬа АЬа Зег Зег Ьеи С1п Зег СЬу УаЬ Рго Зег Агд РЬе Зег 01у
50 55 60
Зег С1у Зег 61у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг Не Зег Зег Ьеи СЬп Рго
65 70 75 ео
61и Азр РЬе АЬа ТЬг Туг Туг Суз СЬп СЬп Зег Туг Зег ТЬг Рго РЬе
85 90 95
61у СЬп 61у ТЬг ТЬг Ьеи Азр 11е Ьуз Агд
100 105 <210> 129 <211> 110 <212> БЕЛОК <213> Ното зархепз <400> 129
Азр 11е Уа! МеЬ ТЬг 61п ТЬг Рго Ьеи Зег Ьеи Зег Уа! ТЬг Рго 31у
- 127 012872
1 5 10 15
СЬп Рго А1а Зег Не Зех Суз Ьуз Зег Зег С1п Зег Ьеи Ьеи Нхз Зег
20 25 30
Азр В1у Ьуз ТНг Туг Ьеи Туг Тгр Туг Ьеи 61п Ьуз Рго СЬу СЬп Рго
35 40 45
Рго С1п Ьеи Ьеи Не Туг СЬи Уа1 Зег Азп Агд РЬе Зег С1у Уа1 Рго
50 55 60
Азр Агд РЬе Зег 31у Зег С1у Зег СЬу ТЫ Азр РЬе ТЬг Ьеи Ьуз 11е
65 70 75 30
Зег Агд УаЬ СЬи АЬа 51и Азр Уа! С1у УаЬ Туг Туг Суз Ме! СЬп Зег
85 90 95
11е СЬп Ьеи РЬе 51у С1п С1у ТНг Ьуз Ьеи СЬи 11е Ьуз Агд
100 105 110 <210> 130 <211> 113 <212> БЕЛОК <213> Ното зарЬепз <400> 130
Азр 1 11е Уа1 Ме! ТЬг 5 С1п ТЬг Рго Ьеи Зег 10 Ьеи Зег Уа1 ТНг Рго 15 С1у
С1п Рго А1а Зег Ые Зег Суз Ьуз Зег Зег СЬп Зег Ьеи Ьеи Η1Ξ Зег
20 25 30
Азр 51у Ьуз ТЬг Туг Ьеи Туг Тгр Туг Ьеи СЬп Ьуз Рго Е1у С1п Рго
35 40 45
Рго С1п Ьеи Ьеи 11е Туг <3111 Уа1 Зег Азп Агд РНе Зег 61у УаЬ Рго
50 55 60
Азр Агд РЬе Зег С1у Зег С1у Зег С1у ТЬг Азр РНе ТНг Ьеи Ьуз ΪΚ
65 70 75 80
Зег Агд Уа1 31 и А1а СЬи Азр Уа1 С1у Уа1 Туг Туг Суз Ме! С1п Зег
85 90 95
11е С1П Ьеи Рго Тгр ТЬг РЬе С1у б1п СЬу ТЬг Ьуз Уа1 С1и Не Ьуз
100 105 110
Агд
<210> 131 <211> 112 <212> БЕЛОК <213> Ното зарЬепз
<400> 131 Азр 11е УаЬ Ме! ТНг (31п Зег Рго Ьеи Зег Ьеи Рго Уа1 ТЬг Рго С1у
1 5 10 15
Е1и Рго А1а Зег Не Зег Суз Агд Зег Зег СЬп 5ег Ьеи Ьеи НЬз С1у
25 30- 128 012872
Азп СЬу Туг 35 Азп Туг Ьеи Азр Тгр Туг Ьеи СЬп 40 Ьуз Рго 45 СЬу СЬп Зег
Рго СЬп Ьеи Ьеи Не Туг Ьеи СЬу Зег Азп Агд АЬа Зег СЬу УаЬ Рго
50 55 60
Азр Агд РЬе Зег СЬу Зег СЬу Зег СЬу Ткг Азр РЬе Ткг Ьеи Ьуз Не
65 70 75 80
Зег Агд УаЬ СЬи АЬа СЬи Азр УаЬ СЬу УаЬ Туг Туг Суз МеЬ СЬп А1а
85 90 95
Ьеи СЬп Ткг Ьеи Ткг Рке СЬу СЬу СЬу Ткг Ьуз УаЬ СЬи Не Ьув Агд
100 105 110
<210> 132 <211> 107 <212> БЕЛОК <213> Ното зарЬепз <400> 132
Азр 1 Не СЬп МеЬ Ткг СЬп 5 Зег Рго Зег Зег 10 Ьеи Зег АЬа Зег УаЬ 15 СЬу
Азр Агд УаЬ Ткг Не ТЬг Суз СЬп АЬа Зег СЬп Азр Не Зег Азп Туг
20 25 30
Ьеи Азп Тгр Туг СЬп СЬп Ьуз Рго СЬу Ьуз АЬа Рго Ьуз Ьеи Ьеи Не
35 40 45
Туг Азр АЬа Зег Азп Ьеи СЬи Ткг СЬу УаЬ Рго Зег Агд РЬе Зег СЬу
50 55 60'
Зег СЬу Зег СЬу Ткг Азр Рке Ткг Рке Ткг Не Зег Зег Ьеи СЬп Рго
65 70 75 80
СЬи Азр Не АЬа Ткг Туг Туг Суз СЬп СЬп Туг Азр Азп Ьеи Не Ткг
85 90 95
Рке СЬу СЬп СЬу Ткг Агд Ьеи СЬи Не Ьуз Агд
100 . 105 <210> 133 <21Ь> 125 .
<212> БЕЛОК <213> Ното зарЬепз
<400> 133 УаЬ сьп 5 Зег СЬу АЬа СЬи УаЬ Ьуз Ьуз Рго СЬу АЬа 15
СЬп 1 УаЬ СЬп Ьеи
Зег УаЬ Ьуз УаЬ Зег Суз СЬи АЬа Зег СЬу Туг Ткг РЬе ТЬг Зег Туг
20 25 30
СЬу ЬЬе Азр Тгр УаЬ Агд СЬп АЬа Рго СЬу СЬп СЬу Ьеи СЬи Тгр Мек
35 40 45
СЬу Тгр Не Зег УаЬ Туг Зег СЬу Азп Ткг Азп Туг АЬа СЬп Ьуз Ьеи
50 55 60
129 012872
С1л 65 С1у Агд Уа1 ТЬг Меб 70 Зег ТЬг
РЬе Ьеи Ьеи Агд Зег 85 Ьеи Агд Зег
А1а Агд 61и С1у 100 Зег Зег Зег Зег
Уа1 Тгр С1у 115 С1ь С1у ТЬг ТЬг Уа1 120
Азр ТЬг Зег 75 ТЬх Зег ТЬг А1а РЬе 30
Азр Азр 90 ТЬг А1а Уа1 Туг Тух 95 Суз
С1у 105 Азр Туг Туг Туг 61у НО Меб Азр
ТЬг Уа1 Бег Зег А1а 125
<210> 134 <211> 10 <212> БЕЛОК <213> Масаса £азс1си1агбз
<400> 134 Ьуз Рго Ьеи Б1п Уа1 С1и Рго Рго
1 5
<210> 135
<211> 8
<212> БЕЛОК
<213> Ното зархепз
<400> 135
ТЬг РЬе Азп Азп Зег А1а Меб ТЬг
1 5
<210> 136
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Ното яархепз
<.400> 136
Суз Ьуз Зег Азп С1п Зег Ьеи Ьеи
1 5
<210> 137
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Ното зархепз
<400> 137
Зег С1у ТЬг Азп РЬе ТЬг Ьеи ТЬг
1 5
<210> 138
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Ното зархепз
<400> 138
А1а Зег С1п Азп Не Зег Бег Тух
1 5
61и Рго
Туг
Не
Ьеи
- 130 012872 <210> 139 <211> 9 <212> БЕЛОК .
<213> Ното зарЬепз <400> 139
Зех Зег Азп Азп Ьуз ТЪг Туг Ьеи А1а
5 <210> 140 <211> 8 <212> БЕЛОК <213> Ното зарЬепз <400> 140
Агд А1а Зег С1п Азп 11е ТЬг Азп
5 <210> 141 <211> 8 <212> БЕЛОК <213> Ното зарЬепз <400> 141
Зег Суз Азп Зег Зег 51п Зех Ьеи
5
<210> 142
<211> 8
<212> БЕЛОК
<213> Ното зарЬепз
<400> 142
НЬз Зег Азр Азп Ьеи Зег Не ТЬг
5 <210> 143 <211> 7 <212> БЕЛОК <213> Ното зарЬепз <400> 143
Ьеи Е1п Зег Азп С1у Туг Азп ' 5 <210> 144 <211> 7 <212> БЕЛОК <213> Ното зарЬепз <400> 144 .
Ьеи Е1п Зег Азп С1у Туг Азп
5 <210> 145 <211> 7 <212> БЕЛОК <213> Ното зарЬепз
- 131 012872
<400> 145
ΗΪ3 С1у Азп <31у Туг Азп Туг
1 5
<210> 146
<211> 8
<212> БЕЛОК
<213> Ηοπιο зархепз
<400> 146
Ьеи Тйг Не Азп 61у Ьеи <31и А1а
1 5
<210 147
<211> 15
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический линкерный пептид
<400 147
61у С1у Б1у Б1у Бег 01 у С1у С1у 61у Зег С1у С1у С1у 31у Зег 15 10 15

Claims (34)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Моноклональное антитело человека или его антигенсвязывающая часть, которая специфически связывается с молекулой клеточной адгезии адрессина слизистой (МАбСАМ), причем указанное антитело или его часть связывается с МАбСАМ человека с Кб, равным 3х10-10 М или менее, и ингибирует связывание α4β7 с МАбСАМ человека.
  2. 2. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающая часть, которая специфически связывается с МАбСАМ и ингибирует связывание МАбСАМ с α4β7, где (a) тяжелая цепь содержит аминокислотные последовательности СОЯ1, СЭВ2 и СЭВ3 тяжелой цепи первого моноклонального антитела, выбранного из группы, состоящей из моноклональных антител
    1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-тоб, 6.34.2-тоб, 6.67.1-тоб, 6.77.1-тоб и 7.26.4-тоб;
    (b) легкая цепь содержит аминокислотные последовательности СОЯ1, СЭВ2 и СЭВ3 легкой цепи второго моноклонального антитела, выбранного из группы, состоящей из моноклональных антител 1.7.2,
    1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-тоб, 6.34.2-тоб, 6.67.1тоб, 6.77.1-тоб и 7.26.4-тоб;
    (c) антитело содержит тяжелую цепь (а) и легкую цепь (Ь) или (б) антитело представляет собой антитело (с), где первое моноклональное антитело такое же, как второе антитело.
  3. 3. Моноклональное антитело человека или его антигенсвязывающая часть по п.1, где указанное антитело или его часть обладает по меньшей мере одним из следующих свойств:
    (a) конкурирует с эталонным антителом за перекрестное связывание с МАбСАМ;
    (b) конкурирует с эталонным антителом за связывание с МАбСАМ;
    (c) связывается тем же эпитопом МАбСАМ, что и эталонное антитело;
    (б) связывается с МАбСАМ, по существу, с таким же Кб, что и эталонное антитело;
    (е) связывается с МАбСАМ, по существу, с такой же константой диссоциации, что и эталонное антитело;
    где указанное эталонное антитело выбрано из группы, состоящей из моноклональных антител 1.7.2,
    1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-тоб, 6.34.2-тоб, 6.67.1тоб, 6.77.1-тоб и 7.26.4-тоб.
  4. 4. Моноклональное антитело человека или его антигенсвязывающая часть по п.1, где указанное антитело или его часть обладает по меньшей мере одним из следующих свойств:
    (a) связывается с клетками человека;
    (b) обладает селективностью в отношении МАбСАМ человека, которая по меньшей мере в 100 раз выше селективности в отношении УСАМ или к фибронектину;
    (c) ингибирует связывание а4в7-экспрессирующих клеток с МАбСАМ человека или (б) ингибирует рекрутинг лимфоцитов в лимфоидную ткань желудочно-кишечного тракта.
  5. 5. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающая часть по п.2, в котором тяжелая цепь содержит аминокислотные последовательности СОЯ1, СЭВ2 и СЭВ3 тяжелой цепи моноклонального ан
    - 132 012872 титела 7.16.6, а легкая цепь содержит аминокислотные последовательности СЭКЕ СЭЯ2 и СЭЯ3 легкой цепи моноклонального антитела 7.16.6.
  6. 6. Линия гибридомных клеток, продуцирующая моноклональное антитело по п.2, где указанная гибридома выбрана из группы, состоящей из 1.7.2 (ЕСАСС регистрационный номер 03090901), 1.8.2 (ЕСАСС регистрационный номер 03090902), 6.14.2 (ЕСАСС регистрационный номер 03090903), 6.22.2 (ЕСАСС регистрационный номер 03090904), 6.34.2 (ЕСАСС регистрационный номер 03090905), 6.67.1 (ЕСАСС регистрационный номер 03090906), 6.73.2 (ЕСАСС регистрационный номер 03090907), 6.77.1 (ЕСАСС регистрационный номер 03090908), 7.16.6 (ЕСАСС регистрационный номер 03090909), 7.20.5 (ЕСАСС регистрационный номер 03090910), 7.26.4 (ЕСАСС регистрационный номер 03090911) и 9.8.2 (ЕСАСС регистрационный номер 03090912).
  7. 7. Моноклональное антитело человека, продуцируемое линией гибридомных клеток по п.6, или антигенсвязывающая часть указанного моноклонального антитела.
  8. 8. Моноклональное антитело человека или его антигенсвязывающая часть по п.2, где указанное антитело выбрано из группы, состоящей из моноклональных антител 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-той, 6.34.2-той, 6.67.1-той, 6.77.1-той и 7.26.4той.
  9. 9. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающая часть по п.3, где антитело выбрано из группы, состоящей из:
    (a) антитела, содержащего аминокислотные последовательности, представленные в 8ЕО ΙΌ ΝΟ:2 без сигнальной последовательности и 8ЕО ΙΌ ΝΟ:4 без сигнальной последовательности;
    (b) антитела, содержащего аминокислотные последовательности, представленные в 8ЕО ΙΌ ΝΟ:6 без сигнальной последовательности и 8ЕО ΙΌ ΝΟ:8 без сигнальной последовательности;
    (c) антитела, содержащего аминокислотные последовательности, представленные в 8ЕО ΙΌ ΝΟ:10 без сигнальной последовательности и 8ЕО ΙΌ ΝΟ:12 без сигнальной последовательности;
    (й) антитела, содержащего аминокислотные последовательности, представленные в 8ЕО ΙΌ ΝΟ:14 без сигнальной последовательности и 8ЕО ΙΌ ΝΟ:16 без сигнальной последовательности;
    (е) антитела, содержащего аминокислотные последовательности, представленные в 8ЕО ΙΌ ΝΟ:18 без сигнальной последовательности и 8ЕО ΙΌ ΝΟ:20 без сигнальной последовательности;
    (!) антитела, содержащего аминокислотные последовательности, представленные в 8ЕО ΙΌ ΝΟ:22 без сигнальной последовательности и 8ЕО ΙΌ ΝΟ:24 без сигнальной последовательности;
    (д) антитела, содержащего аминокислотные последовательности, представленные в 8ЕО ΙΌ ΝΟ:26 без сигнальной последовательности и 8ЕО ΙΌ ΝΟ:28 без сигнальной последовательности;
    (H) антитела, содержащего аминокислотные последовательности, представленные в 8ЕО ΙΌ ΝΟ:30 без сигнальной последовательности и 8ЕО ΙΌ ΝΟ:32 без сигнальной последовательности;
    (ί) антитела, содержащего аминокислотные последовательности, представленные в 8ЕО ΙΌ ΝΟ:34 без сигнальной последовательности и 8ЕО ΙΌ ΝΟ:36 без сигнальной последовательности;
    (ί) антитела, содержащего аминокислотные последовательности, представленные в 8ЕО ΙΌ ΝΟ:38 без сигнальной последовательности и 8ЕО ΙΌ ΝΟ:40 без сигнальной последовательности;
    (к) антитела, содержащего аминокислотные последовательности, представленные в 8ЕО ΙΌ ΝΟ:42 без сигнальной последовательности и 8ЕО ΙΌ ΝΟ:44 без сигнальной последовательности;
    (I) антитела, содержащего аминокислотные последовательности, представленные в 8ЕО ΙΌ ΝΟ:46 без сигнальной последовательности и 8ЕО ΙΌ ΝΟ:48 без сигнальной последовательности;
    (т) антитела, содержащего аминокислотные последовательности, представленные в 8ЕО ΙΌ ΝΟ:52 без сигнальной последовательности и 8ЕО ΙΌ ΝΟ:54 без сигнальной последовательности;
    (п) антитела, содержащего аминокислотные последовательности, представленные в 8ЕО ΙΌ ΝΟ:56 без сигнальной последовательности и 8ЕО ΙΌ ΝΟ:58 без сигнальной последовательности;
    (о) антитела, содержащего аминокислотные последовательности, представленные в 8ЕО ΙΌ ΝΟ:60 без сигнальной последовательности и 8ЕО ΙΌ ΝΟ:62 без сигнальной последовательности;
    (р) антитела, содержащего аминокислотные последовательности, представленные в 8ЕО ΙΌ ΝΟ:64 без сигнальной последовательности и 8ЕО ΙΌ ΝΟ:66 без сигнальной последовательности;
    (с.|) антитела, содержащего аминокислотные последовательности, представленные в 8ЕО ΙΌ ΝΟ:42 без сигнальной последовательности и 8ЕО ΙΌ ΝΟ:68 без сигнальной последовательности.
  10. 10. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающая часть по п.3, причем антитело представляет собой антитело, содержащее аминокислотные последовательности 8ЕО ΙΌ ΝΟ:34 без сигнальной последовательности и 8ЕО ΙΌ ΝΟ:36 без сигнальной последовательности.
  11. 11. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающая часть по п.2, где указанное антитело содержит:
    (а) тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность вариабельной области (УН) тяжелой цепи антитела, выбранного из группы, состоящей из моноклональных антител 1.7.2 (8ЕО ΙΌ ΝΟ:2), 1.8.2 (8ЕО ΙΌ ΝΟ:6), 6.14.2 (8ЕО ΙΌ ΝΟ:10), 6.22.2 (8ЕО ΙΌ ΝΟ:14), 6.34.2 (8ЕО ΙΌ ΝΟ:18), 6.67.1 (8ЕО ΙΌ ΝΟ:22), 6.73.2 (8ЕО ΙΌ ΝΟ:26), 6.77.1 (8ЕО ΙΌ ΝΟ:30), 7.16.6 (8ЕО ΙΌ ΝΟ:34), 7.20.5 (8ЕО ΙΌ ΝΟ:38), 7.26.4 (8ЕО ΙΌ ΝΟ:42), 9.8.2 (8ЕО ΙΌ ΝΟ:46), 6.22.2-той (8ЕО ΙΌ ΝΟ:52), 6.34.2-той (8ЕО ΙΌ
    - 133 012872
    ЫО:56), 6.67.1-тоб (81%) ГО ЫО:60), 6.77.1-тоб (81%) ГО \О:64) и 7.26.4-тоб (81%) ГО \О:42);
    (b) легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность вариабельной области (Уь) легкой цепи антитела, выбранного из группы, состоящей из моноклональных антител 1.7.2 (8ЕО ГО ΝΌ:4), 1.8.2 (81%) ГО ЫО:8), 6.14.2 (81%) ГО ЫО:12), 6.22.2 (81%) ГО ЫО:16), 6.34.2 (81%) ГО ЫО:20), 6.67.1 (81%) ГО ЫО:24), 6.73.2 (81%) ГО ЫО:28), 6.77.1 (81%) ГО ЫО:32), 7.16.6 (81%) ГО ЫО:36), 7.20.5 (81%) ГО ЫО:40), 7.26.4 (81%) ГО ЫО:44), 9.8.2 (81%) ГО ЫО:48), 6.22.2-тоб (81%) ГО ЫО:54), 6.34.2-тоб (81%) ГО ЫО:58), 6.67.1-тоб (81%) ГО ЫО:62), 6.77.1-тоб (81%) ГО ЫО:66) и 7.26.4-тоб (81%) ГО ЫО:68); или (c) тяжелую цепь (а) и легкую цепь (Ь); или (б) тяжелую цепь (а) и легкую цепь (Ь), где (а) и (Ь) принадлежат одному антителу.
  12. 12. Моноклональное антитело человека по п.2, где указанное антитело содержит:
    (a) аминокислотную последовательность тяжелой цепи, которая по меньшей мере на 90% идентична аминокислотной последовательности тяжелой цепи моноклонального антитела, выбранного из группы, состоящей из моноклональных антител 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-тоб, 6.34.2-тоб, 6.67.1-тоб, 6.77.1-тоб и 7.26.4-тоб;
    (b) аминокислотную последовательность легкой цепи, которая по меньшей мере на 90% идентична аминокислотной последовательности легкой цепи моноклонального антитела, выбранного из группы, состоящей из моноклональных антител 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-тоб, 6.34.2-тоб, 6.67.1-тоб, 6.77.1-тоб и 7.26.4-тоб; или (c) обе последовательности (а) и (Ь).
  13. 13. Моноклональное антитело по п.3, содержащее аминокислотные последовательности тяжелой и легкой цепи моноклонального антитела 7.16.6.
  14. 14. Моноклональное антитело по любому из пп.1-5 и 11, которое представляет собой молекулу иммуноглобулина 6 (1д6), 1дМ, 1дЕ, 1дА или Ι§Ό.
  15. 15. Антигенсвязывающая часть по любому из пп.1-5 и 7-11, которая представляет собой РаЬфрагмент, Р(аЬ')2-фрагмент, Ру-фрагмент или одноцепочечное антитело.
  16. 16. Фармацевтическая композиция, содержащая эффективное количество моноклонального антитела или его антигенсвязывающей части по любому из пп.1-5 и 7-14 и фармацевтически приемлемый носитель.
  17. 17. Способ лечения воспалительного заболевания у индивидуума, включающий стадии введения указанному индивидууму моноклонального антитела или его антигенсвязывающей части по любому из пп.1-5 и 7-14.
  18. 18. Способ по п.17, где указанным воспалительным заболеванием является воспалительное заболевание желудочно-кишечного тракта.
  19. 19. Способ по п.18, где указанным воспалительным заболеванием желудочно-кишечного тракта является болезнь Крона, язвенный колит или оба этих заболевания.
  20. 20. Выделенная клеточная линия, продуцирующая моноклональное антитело или его антигенсвязывающую часть по любому из пп.1-5, 7-14, или тяжелую или легкую цепи указанного антитела, или его части.
  21. 21. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую тяжелую цепь антитела, или его антигенсвязывающую часть, или легкую цепь антитела, или его антигенсвязывающую часть по любому из пп.1-5, 7-14.
  22. 22. Вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по п.21, где указанный вектор необязательно содержит последовательность регуляции экспрессии, функционально связанную с молекулой нуклеиновой кислоты.
  23. 23. Клетка-хозяин, содержащая вектор по п.22 или молекулу нуклеиновой кислоты по п.21.
  24. 24. Способ получения моноклонального антитела человека или его антигенсвязывающей части по любому из пп.1-5 и 7-14, где указанный способ включает культивирование клетки-хозяина по п.23 или клеточной линии по любому из пп.6 и 20 в подходящих условиях и выделение указанного антитела или его антигенсвязывающей части.
  25. 25. Трансгенное животное, не являющееся человеком, содержащее: (а) молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую тяжелую цепь антитела или ее антигенсвязывающую часть; (Ь) молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую легкую цепь антитела или ее антигенсвязывающую часть; или (с) обе молекулы (а) и (Ь), кодирующие антитело по любому из пп.1-5 и 7-14, причем экспрессируется указанная тяжелая цепь и/или легкая цепь полипептида, кодируемого молекулами нуклеиновых кислот.
  26. 26. Трансгенное растение, содержащее: (а) молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую тяжелую цепь антитела или ее антигенсвязывающую часть; (Ь) молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую легкую цепь антитела или ее антигенсвязывающую часть; или (с) обе молекулы (а) и (Ь), кодирующие антитело по любому из пп.1-5 и 7-14, причем экспрессируется указанная тяжелая цепь и/или легкая цепь полипептида, кодируемого молекулами нуклеиновых кислот.
  27. 27. Способ ингибирования лейкоцитарной адгезии, миграции и инфильтрации в ткани, где указанный способ включает стадию контактирования эндотелиальных клеток с моноклональным антителом или антигенсвязывающей частью по любому из пп.1-5, 7-14.
    - 134 012872
  28. 28. Способ диагностики расстройства, характеризующегося наличием в кровотоке растворимой молекулы МАйСАМ человека, где указанный способ включает стадии: (1) контактирования биологического образца с моноклональным антителом или его антигенсвязывающей частью по любому из пп.1-5, 7-14 и (2) детектирование связывания указанного антитела или антигенсвязывающей части с МАйСАМ в указанном биологическом образце.
  29. 29. Диагностический набор для детекции МАйСАМ, содержащий моноклональное антитело или его антигенсвязывающую часть по любому из пп.1-5 и 7-14.
  30. 30. Вакцина для ингибирования а4р7/МАйСАМ-зависимого связывания, содержащая эффективное количество моноклонального антитела или антигенсвязывающей части по любому из пп.1-5 и 7-14 и фармацевтически приемлемый носитель.
  31. 31. Вакцина по п.30, где указанная вакцина является вакциной для введения в слизистую.
  32. 32. Способ определения эффективности ингибирования связывания МАйСАМ с а4р7 при введении моноклонального антитела или его антигенсвязывающей части по любому из пп.1-5 и 7-14 у индивидуума, где указанный способ включает стадии определения увеличения уровня циркулирующих а4р7экспрессирующих лейкоцитов у указанного индивидуума после введения указанного антитела, где повышение уровня указанных циркулирующих лимфоцитов указывает на ингибирование указанного связывания.
  33. 33. Способ по п.32, где указанными а4р7-экспрессирующими лейкоцитами являются лимфоциты.
  34. 34. Способ по п.32, где указанное увеличение уровней циркулирующих а4р7-экспрессирующих лейкоцитов определяют с помощью ВАС8-анализа.
EA200601297A 2004-01-09 2005-01-07 АНТИТЕЛА ПРОТИВ MAdCAM EA012872B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US53549004P 2004-01-09 2004-01-09
PCT/US2005/000370 WO2005067620A2 (en) 2004-01-09 2005-01-07 ANTIBODIES TO MAdCAM

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200601297A1 EA200601297A1 (ru) 2007-02-27
EA012872B1 true EA012872B1 (ru) 2009-12-30

Family

ID=34794356

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200601297A EA012872B1 (ru) 2004-01-09 2005-01-07 АНТИТЕЛА ПРОТИВ MAdCAM

Country Status (38)

Country Link
US (6) US9328169B2 (ru)
EP (2) EP2177537B1 (ru)
JP (7) JP4315982B2 (ru)
KR (2) KR20120048644A (ru)
CN (1) CN1956738B (ru)
AP (1) AP2006003689A0 (ru)
AR (1) AR047372A1 (ru)
AT (2) ATE522547T1 (ru)
AU (1) AU2005204678B2 (ru)
BR (2) BRPI0506768B1 (ru)
CA (1) CA2552523C (ru)
CR (1) CR8485A (ru)
DE (1) DE602005026779D1 (ru)
DK (1) DK2177537T3 (ru)
DO (1) DOP2005000002A (ru)
EA (1) EA012872B1 (ru)
EC (1) ECSP066741A (ru)
ES (2) ES2362667T3 (ru)
HK (1) HK1099695A1 (ru)
IL (1) IL176749A0 (ru)
MA (1) MA28430B1 (ru)
MX (4) MX350383B (ru)
MY (1) MY140862A (ru)
NL (1) NL1027975C2 (ru)
NO (1) NO342054B1 (ru)
NZ (1) NZ548702A (ru)
OA (1) OA13358A (ru)
PA (1) PA8621301A1 (ru)
PE (1) PE20051053A1 (ru)
PL (1) PL2177537T3 (ru)
PT (1) PT2177537E (ru)
SI (1) SI2177537T1 (ru)
SV (1) SV2006001990A (ru)
TN (1) TNSN06216A1 (ru)
TW (2) TWI363762B (ru)
UY (1) UY28716A1 (ru)
WO (1) WO2005067620A2 (ru)
ZA (1) ZA200605825B (ru)

Families Citing this family (120)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
OA12589A (en) 2001-01-05 2006-06-08 Abgenix Inc Antibodies to insulin-like growth factor i receptor.
US7658924B2 (en) * 2001-10-11 2010-02-09 Amgen Inc. Angiopoietin-2 specific binding agents
AR039067A1 (es) 2001-11-09 2005-02-09 Pfizer Prod Inc Anticuerpos para cd40
EP1596885A2 (en) * 2003-02-13 2005-11-23 Pfizer Products Inc. Uses of anti-insulin-like growth factor i receptor antibodies
BRPI0410562B8 (pt) 2003-05-22 2021-05-25 Fralunhofer Usa Inc proteína de veículo e seu método de produção em uma planta, ácido nucleico isolado, vetor de expressão e célula hospedeira
AP2006003689A0 (en) * 2004-01-09 2006-08-31 Pfizer Antibodies to MAdCAM
HUE058817T2 (hu) 2004-09-03 2022-09-28 Genentech Inc Humanizált anti-béta7 antagonisták és alkalmazásaik
WO2006096490A2 (en) * 2005-03-08 2006-09-14 Pharmacia & Upjohn Company Llc ANTI-MAdCAM ANTIBODY COMPOSITIONS
EP3623473A1 (en) 2005-03-31 2020-03-18 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Process for production of polypeptide by regulation of assembly
JP2009500390A (ja) * 2005-07-08 2009-01-08 ファイザー・リミテッド 新規ＭＡｄＣＡＭ抗体
WO2007007151A2 (en) * 2005-07-11 2007-01-18 Pfizer Limited Use of anti-mad-cam antibody for the treatment of emphysema
WO2007007160A2 (en) * 2005-07-11 2007-01-18 Pfizer Limited Anti-madcam antibodies to treat fever
KR20080017094A (ko) * 2005-07-11 2008-02-25 화이자 리미티드 간 섬유증을 치료하기 위한 항-ＭＡｄＣＡＭ 항체 및항섬유성 캐스파아제 억제제의 신규한 조합물
BRPI0614475B8 (pt) 2005-08-03 2021-05-25 Fraunhofer Usa Inc polipeptídeo, anticorpo, ácido nucleico, vetores, célula hospedeira, composição e processos de produção de anticorpo
US9670269B2 (en) 2006-03-31 2017-06-06 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods of modifying antibodies for purification of bispecific antibodies
JP5624276B2 (ja) 2006-03-31 2014-11-12 中外製薬株式会社 抗体の血中動態を制御する方法
US7745584B2 (en) * 2006-05-22 2010-06-29 California Institute Of Technology Antibodies to sulfated carbohydrates
EP1878747A1 (en) * 2006-07-11 2008-01-16 greenovation Biotech GmbH Glyco-engineered antibodies
WO2008033159A1 (en) * 2006-09-15 2008-03-20 Fraunhofer Usa, Inc. Influenza antibodies, compositions, and related methods
CA2687141C (en) 2007-05-22 2014-04-01 Amgen Inc. Compositions and methods for producing bioactive fusion proteins
WO2009009759A2 (en) 2007-07-11 2009-01-15 Fraunhofer Usa, Inc. Yersinia pestis antigens, vaccine compositions, and related methods
ES2566957T3 (es) 2007-09-26 2016-04-18 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Región constante de anticuerpo modificado
EP3689912A1 (en) 2007-09-26 2020-08-05 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method of modifying isoelectric point of antibody via amino acid substitution in cdr
US8912149B1 (en) 2007-11-28 2014-12-16 California Institute Of Technology Glycosaminoglycan mimetics
EP2236604B1 (en) 2007-12-05 2016-07-06 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-nr10 antibody and use thereof
JO2913B1 (en) 2008-02-20 2015-09-15 امجين إنك, Antibodies directed towards angiopoietin-1 and angiopoietin-2 proteins and their uses
EP2279004B1 (en) * 2008-05-16 2015-01-14 F. Hoffmann-La Roche AG Use of biomarkers for assessing treatment of gastrointestinal inflammatory disorders with beta7integrin antagonists
TWI440469B (zh) 2008-09-26 2014-06-11 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Improved antibody molecules
US8734803B2 (en) 2008-09-28 2014-05-27 Ibio Inc. Humanized neuraminidase antibody and methods of use thereof
JP5717624B2 (ja) 2009-03-19 2015-05-13 中外製薬株式会社 抗体定常領域改変体
TWI682995B (zh) 2009-03-19 2020-01-21 日商中外製藥股份有限公司 抗體恆定區域改變體
EP3385279B1 (en) 2009-03-20 2020-02-26 Amgen Inc. Carrier immunoglobulins and uses thereof
ES2751946T3 (es) 2009-03-20 2020-04-02 Amgen Inc Anticuerpo antagonista específico del heterodímero alfa-4-beta-7
MX2011012136A (es) 2009-05-15 2012-04-10 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anticuerpo anti-axl.
JP5837821B2 (ja) 2009-09-24 2015-12-24 中外製薬株式会社 抗体定常領域改変体
EP2483307A1 (en) 2009-09-29 2012-08-08 Fraunhofer USA, Inc. Influenza hemagglutinin antibodies, compositions, and related methods
US20110158982A1 (en) * 2009-10-05 2011-06-30 The Regents Of The University Of Michigan COMPOSITIONS AND METHODS FOR INHIBITING MAdCAM
JP5889181B2 (ja) 2010-03-04 2016-03-22 中外製薬株式会社 抗体定常領域改変体
WO2011119948A1 (en) * 2010-03-26 2011-09-29 Kolltan Pharmaceuticals, Inc. Anti-kit antibodies and uses thereof
JP6159660B2 (ja) 2010-09-22 2017-07-05 アムジエン・インコーポレーテツド 担体としての免疫グロブリンおよびその使用
MX355060B (es) 2010-11-17 2018-04-03 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Molecula multiespecifica de union a antigeno que tiene funcion alternativa a la funcion del factor viii de coagulacion sanguinea.
CN102603649B (zh) * 2011-01-20 2016-05-25 赣南师范学院 一种以地巴唑为先导分子的荧光探针化合物及其制备方法
WO2012103165A2 (en) 2011-01-26 2012-08-02 Kolltan Pharmaceuticals, Inc. Anti-kit antibodies and uses thereof
US20140093496A1 (en) 2011-02-25 2014-04-03 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Fc-gamma-RIIb-SPECIFIC Fc ANTIBODY
EP3070104B1 (en) 2011-04-19 2017-12-27 The United States of America, as represented by The Secretary, Department of Health and Human Services Human monoclonal antibodies specific for glypican-3 and use thereof
WO2012154987A1 (en) 2011-05-10 2012-11-15 Nestec Sa Methods of disease activity profiling for personalized therapy management
TW201817745A (zh) 2011-09-30 2018-05-16 日商中外製藥股份有限公司 具有促進抗原清除之ＦｃＲｎ結合域的治療性抗原結合分子
US20150050269A1 (en) 2011-09-30 2015-02-19 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule promoting disappearance of antigens having plurality of biological activities
TWI593705B (zh) 2011-12-28 2017-08-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Humanized anti-epiregulin antibody and cancer therapeutic agent containing the antibody as an active ingredient
NZ630363A (en) 2012-07-25 2018-09-28 Celldex Therapeutics Inc Anti-kit antibodies and uses thereof
AU2013305534B2 (en) * 2012-08-23 2018-05-31 Agensys, Inc. Antibody drug conjugates (ADC) that bind to 158P1D7 proteins
US9273093B2 (en) * 2012-10-11 2016-03-01 Protagonist Therapeutics, Inc. α4β7 peptide dimer antagonists
UY35148A (es) 2012-11-21 2014-05-30 Amgen Inc Immunoglobulinas heterodiméricas
EP2968443B1 (en) 2013-03-15 2021-09-29 Protagonist Therapeutics, Inc. Hepcidin analogues and uses thereof
WO2014144817A2 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Amgen Inc. Inhibitory polypeptides specific to wnt inhibitors
BR112015032414A2 (pt) 2013-06-24 2017-11-07 Chugai Pharmaceutical Co Ltd agente terapêutico compreendendo anticorpo antiepirregulina humanizado como ingrediente ativo para carcinoma de pulmão de célula não pequena excluindo adenocarcinoma
US10227370B2 (en) 2013-08-02 2019-03-12 California Institute Of Technology Heparan sulfate/heparin mimetics with anti-chemokine and anti-inflammatory activity
US9770461B2 (en) 2013-08-02 2017-09-26 California Institute Of Technology Tailored glycopolymers as anticoagulant heparin mimetics
US11427627B2 (en) 2013-09-05 2022-08-30 Amgen Inc. Fc-containing molecules exhibiting predictable, consistent, and reproducible glycoform profiles
BR122023024195A2 (pt) 2013-09-20 2023-12-26 Bristol-Myers Squibb Company Usos de anticorpos anti-lag-3 e anticorpos anti-pd-1
DK3050896T3 (da) 2013-09-27 2021-07-19 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Fremgangsmåde til fremstilling af en polypeptid-heteromultimer
LT3143037T (lt) 2014-05-16 2021-10-11 Protagonist Therapeutics, Inc. Alfa4beta7 integrino tioeterio peptidų antagonistaii
MX2016014761A (es) 2014-05-16 2017-05-25 Amgen Inc Ensayo para detectar poblaciones celulares linfocitos t colaboradores 1 (th1) y linfocitos t colaboradores (th2).
JP6768639B2 (ja) 2014-05-23 2020-10-21 セルデックス セラピューティクス，インコーポレーテッド 好酸球又はマスト細胞関連障害の治療
CN113563423A (zh) 2014-07-17 2021-10-29 领导医疗有限公司 白细胞介素-23受体的口服肽抑制剂以及其治疗炎症性肠病的用途
MA40764A (fr) 2014-09-26 2017-08-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Agent thérapeutique induisant une cytotoxicité
US9809623B2 (en) 2014-10-01 2017-11-07 Protagonist Therapeutics, Inc. α4β7 peptide monomer and dimer antagonists
EP3201217A4 (en) 2014-10-01 2018-07-18 Protagonist Therapeutics Inc. Novel cyclic monomer and dimer peptides having integrin antagonist activity
US20170327584A1 (en) 2014-11-26 2017-11-16 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Vedolizumab for the Treatment of Fistulizing Crohn's Disease
CN113045650A (zh) 2014-12-19 2021-06-29 中外制药株式会社 抗-c5抗体及使用方法
CA2963760A1 (en) 2014-12-19 2016-06-23 Yoshinao Ruike Anti-myostatin antibodies, polypeptides containing variant fc regions, and methods of use
CA2916283A1 (en) * 2015-01-09 2016-07-09 Pfizer Inc. Dosage regimen for madcam antagonists
EA201791754A1 (ru) 2015-02-05 2019-01-31 Чугаи Сейяку Кабусики Кайся АНТИТЕЛА, СОДЕРЖАЩИЕ ЗАВИСЯЩИЙ ОТ КОНЦЕНТРАЦИИ ИОНОВ АНТИГЕНСВЯЗЫВАЮЩИЙ ДОМЕН, ВАРИАНТЫ Fc-ОБЛАСТИ, IL-8-СВЯЗЫВАЮЩИЕ АНТИТЕЛА И ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
KR101892883B1 (ko) 2015-02-27 2018-10-05 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 Il-6 관련 질환 치료용 조성물
WO2016159213A1 (ja) 2015-04-01 2016-10-06 中外製薬株式会社 ポリペプチド異種多量体の製造方法
US10787490B2 (en) 2015-07-15 2020-09-29 Protaganist Therapeutics, Inc. Peptide inhibitors of interleukin-23 receptor and their use to treat inflammatory diseases
EP3394098A4 (en) 2015-12-25 2019-11-13 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha ANTI-MYOSTATIN ANTIBODIES AND METHODS OF USE
JP7219005B2 (ja) 2015-12-28 2023-02-07 中外製薬株式会社 Ｆｃ領域含有ポリペプチドの精製を効率化するための方法
WO2017117411A1 (en) 2015-12-30 2017-07-06 Protagonist Therapeutics, Inc. Analogues of hepcidin mimetics with improved in vivo half lives
CN117298268A (zh) 2016-03-14 2023-12-29 千禧制药公司 治疗或预防移植物抗宿主疾病的方法
MX2018011169A (es) 2016-03-14 2018-12-06 Millennium Pharm Inc Metodo para prevenir la enfermedad del injerto contra huesped.
TW202214700A (zh) 2016-03-14 2022-04-16 日商中外製藥股份有限公司 用於癌之治療的細胞傷害誘導治療劑
CN109195618A (zh) 2016-03-23 2019-01-11 领导医疗有限公司 用于合成α4β7肽拮抗剂的方法
EP3433275A1 (en) 2016-03-24 2019-01-30 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating gastrointestinal immune-related adverse events in immune oncology treatments
TW201735949A (zh) 2016-03-24 2017-10-16 千禧製藥公司 治療抗ctla4及抗pd-1組合治療中的胃腸道免疫相關不良事件之方法
KR101877349B1 (ko) 2016-08-05 2018-07-17 농업회사법인 주식회사 한라종합식품 황칠 구운 소금 제조방법
CA3026050A1 (en) 2016-08-05 2018-02-08 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Composition for prophylaxis or treatment of il-8 related diseases
MA47775A (fr) 2017-03-14 2020-01-22 Amgen Inc Contrôle des glycoformes afucosylées totales d'anticorps produits en culture cellulaire
CA3056630A1 (en) * 2017-03-15 2018-09-20 Pandion Therapeutics, Inc. Targeted immunotolerance
WO2018203545A1 (ja) 2017-05-02 2018-11-08 国立研究開発法人国立精神・神経医療研究センター Ｉｌ－６及び好中球の関連する疾患の治療効果の予測及び判定方法
CN111010866A (zh) * 2017-05-24 2020-04-14 潘迪恩治疗公司 靶向免疫耐受性
HUE065242T2 (hu) 2017-05-30 2024-05-28 Bristol Myers Squibb Co LAG-3-pozitív tumorok kezelése
CA3065304A1 (en) 2017-05-30 2018-12-06 Bristol-Myers Squibb Company Compositions comprising an anti-lag-3 antibody or an anti-lag-3 antibody and an anti-pd-1 or anti-pd-l1 antibody
KR20200009095A (ko) 2017-05-31 2020-01-29 프로메테우스 바이오사이언시즈, 인크. 크론병 환자에서 점막 치유를 평가하는 방법
BR112020000698A2 (pt) * 2017-07-14 2020-07-14 Pfizer Inc. anticorpos contra madcam
US10278957B2 (en) 2017-09-11 2019-05-07 Protagonist Therapeutics, Inc. Opioid agonist peptides and uses thereof
US10174091B1 (en) 2017-12-06 2019-01-08 Pandion Therapeutics, Inc. IL-2 muteins
EP3720871A4 (en) * 2017-12-06 2021-09-15 Pandion Operations, Inc. TARGETED IMMUNTOLERANCE
US10946068B2 (en) 2017-12-06 2021-03-16 Pandion Operations, Inc. IL-2 muteins and uses thereof
WO2019114804A1 (zh) 2017-12-13 2019-06-20 凯惠科技发展(上海)有限公司 一种EGFRvIII抗体及其偶联物、制备方法和应用
CA3089868A1 (en) 2018-02-08 2019-08-15 Protagonist Therapeutics, Inc. Conjugated hepcidin mimetics
MA52186A (fr) 2018-03-26 2021-02-17 Amgen Inc Glycoformes afucosylées totales d'anticorps produits en culture cellulaire
JP2022501433A (ja) * 2018-09-18 2022-01-06 パンディオン・オペレーションズ・インコーポレイテッド 標的化された免疫寛容
AU2020279240A1 (en) * 2019-05-20 2021-12-23 Pandion Operations, Inc. MAdCAM targeted immunotolerance
MX2022000397A (es) 2019-07-10 2022-04-25 Protagonist Therapeutics Inc Inhibidores peptídicos del receptor de interleucina-23 y su uso para tratar enfermedades inflamatorias.
US20220349898A1 (en) 2019-09-26 2022-11-03 Amgen Inc. Methods of producing antibody compositions
CN110887966B (zh) * 2019-12-17 2021-02-12 丹娜(天津)生物科技股份有限公司 一种曲霉菌的化学发光检测试剂盒及其应用
CR20220332A (es) 2020-01-15 2022-11-28 Janssen Biotech Inc Inhibidores de péptidos del receptor de interleucina-23 y su uso para tratar enfermedades inflamatorias
WO2021146454A1 (en) 2020-01-15 2021-07-22 Janssen Biotech, Inc. Peptide inhibitors of interleukin-23 receptor and their use to treat inflammatory diseases
US11981715B2 (en) 2020-02-21 2024-05-14 Pandion Operations, Inc. Tissue targeted immunotolerance with a CD39 effector
EP4162257A1 (en) 2020-06-04 2023-04-12 Amgen Inc. Assessment of cleaning procedures of a biotherapeutic manufacturing process
CN111714781B (zh) * 2020-06-24 2022-08-05 北京夏禾科技有限公司 一种牙齿美白组合及其使用方法
KR20230087539A (ko) 2020-10-15 2023-06-16 암젠 인크 항체 생산 방법에서의 상대적인 비결합 글리칸
PE20240631A1 (es) 2020-11-20 2024-03-26 Janssen Pharmaceutica Nv Composiciones de inhibidores peptidicos del receptor de interleucina-23
CA3222409A1 (en) 2021-06-07 2022-12-15 Amgen Inc. Using fucosidase to control afucosylation level of glycosylated proteins
KR20240032857A (ko) * 2021-06-21 2024-03-12 인스티튜트 구스타브 루시 암- 또는 항생제-유도된 디스바이오시스를 진단하는 방법 및 면역요법에 의한 암 치료를 개선시키기 위한 그의 용도
WO2023059607A1 (en) 2021-10-05 2023-04-13 Amgen Inc. Fc-gamma receptor ii binding and glycan content
US20230326136A1 (en) * 2022-04-06 2023-10-12 Qualcomm Incorporated Apparatus and methods for image reconstruction using machine learning processes
WO2023215725A1 (en) 2022-05-02 2023-11-09 Fred Hutchinson Cancer Center Compositions and methods for cellular immunotherapy
WO2024110868A1 (en) 2022-11-22 2024-05-30 Takeda Pharmaceutical Company Limited DOSAGE REGIMEN OF MAdCAM-1 ANTIBODY FOR TREATMENT OF NON-ALCOHOLIC STEATOHEPATITIS

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20010046496A1 (en) * 2000-04-14 2001-11-29 Brettman Lee R. Method of administering an antibody
US20020065220A1 (en) * 1999-09-03 2002-05-30 Young Paul E. Immunoglobulin superfamily polynucleotides, polypeptides, and antibodies

Family Cites Families (98)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4634665A (en) 1980-02-25 1987-01-06 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US5179017A (en) 1980-02-25 1993-01-12 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4510245A (en) 1982-11-18 1985-04-09 Chiron Corporation Adenovirus promoter system
US4740461A (en) 1983-12-27 1988-04-26 Genetics Institute, Inc. Vectors and methods for transformation of eucaryotic cells
US5168062A (en) 1985-01-30 1992-12-01 University Of Iowa Research Foundation Transfer vectors and microorganisms containing human cytomegalovirus immediate-early promoter-regulatory DNA sequence
JP2532858B2 (ja) 1985-04-01 1996-09-11 セルテツク リミテツド 形質転換したミエロ―マ細胞系
US4968615A (en) 1985-12-18 1990-11-06 Ciba-Geigy Corporation Deoxyribonucleic acid segment from a virus
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
US4959455A (en) 1986-07-14 1990-09-25 Genetics Institute, Inc. Primate hematopoietic growth factors IL-3 and pharmaceutical compositions
US4912040A (en) 1986-11-14 1990-03-27 Genetics Institute, Inc. Eucaryotic expression system
US5151540A (en) * 1986-11-26 1992-09-29 Hoechst Celanese Corporation Thio carbamates and their derivatives
US5750172A (en) 1987-06-23 1998-05-12 Pharming B.V. Transgenic non human mammal milk
GB8717430D0 (en) 1987-07-23 1987-08-26 Celltech Ltd Recombinant dna product
GB8809129D0 (en) 1988-04-18 1988-05-18 Celltech Ltd Recombinant dna methods vectors and host cells
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US5175384A (en) 1988-12-05 1992-12-29 Genpharm International Transgenic mice depleted in mature t-cells and methods for making transgenic mice
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5959177A (en) 1989-10-27 1999-09-28 The Scripps Research Institute Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies
US5633076A (en) 1989-12-01 1997-05-27 Pharming Bv Method of producing a transgenic bovine or transgenic bovine embryo
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US20040010810A1 (en) 1990-01-12 2004-01-15 Abgenix, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US6150584A (en) * 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
DE69133566T2 (de) 1990-01-12 2007-12-06 Amgen Fremont Inc. Bildung von xenogenen Antikörpern
US5151510A (en) 1990-04-20 1992-09-29 Applied Biosystems, Inc. Method of synethesizing sulfurized oligonucleotide analogs
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
GB9014932D0 (en) 1990-07-05 1990-08-22 Celltech Ltd Recombinant dna product and method
DK0585287T3 (da) 1990-07-10 2000-04-17 Cambridge Antibody Tech Fremgangsmåde til fremstilling af specifikke bindingsparelementer
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US5165424A (en) 1990-08-09 1992-11-24 Silverman Harvey N Method and system for whitening teeth
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
DE69133557D1 (de) 1990-08-29 2007-03-15 Pharming Intellectual Pty Bv Homologe rekombination in säugetier-zellen
US5789650A (en) 1990-08-29 1998-08-04 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5462990A (en) * 1990-10-15 1995-10-31 Board Of Regents, The University Of Texas System Multifunctional organic polymers
CA2405246A1 (en) 1990-12-03 1992-06-11 Genentech, Inc. Enrichment method for variant proteins with alterred binding properties
ES2330052T3 (es) 1991-03-01 2009-12-03 Dyax Corporation Proteina quimerica que comprende micro-proteinas que tienen dos o mas puentes disulfuro y relaizaciones de las mismas.
DE69233750D1 (de) 1991-04-10 2009-01-02 Scripps Research Inst Bibliotheken heterodimerer Rezeptoren mittels Phagemiden
WO1994004679A1 (en) 1991-06-14 1994-03-03 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
CA2103059C (en) 1991-06-14 2005-03-22 Paul J. Carter Method for making humanized antibodies
DE4122599C2 (de) 1991-07-08 1993-11-11 Deutsches Krebsforsch Phagemid zum Screenen von Antikörpern
WO1993004169A1 (en) 1991-08-20 1993-03-04 Genpharm International, Inc. Gene targeting in animal cells using isogenic dna constructs
WO1993006213A1 (en) 1991-09-23 1993-04-01 Medical Research Council Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach
JPH05244982A (ja) 1991-12-06 1993-09-24 Sumitomo Chem Co Ltd 擬人化ｂ−ｂ１０
US5777085A (en) 1991-12-20 1998-07-07 Protein Design Labs, Inc. Humanized antibodies reactive with GPIIB/IIIA
ATE208374T1 (de) 1992-02-18 2001-11-15 Otsuka Kagaku Kk Beta-laktam und cepham verbindungen und ihre herstellung
US5714350A (en) 1992-03-09 1998-02-03 Protein Design Labs, Inc. Increasing antibody affinity by altering glycosylation in the immunoglobulin variable region
JPH07509137A (ja) 1992-07-24 1995-10-12 セル　ジェネシス，インク． 異種抗体の生産
AU5675794A (en) 1992-12-15 1994-07-04 Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Mucosal vascular addressin, dna and expression
PT804070E (pt) 1993-03-09 2000-11-30 Genzyme Corp Isolamento de componentes de interesse a partir do leite.
US5827690A (en) 1993-12-20 1998-10-27 Genzyme Transgenics Corporatiion Transgenic production of antibodies in milk
US5643763A (en) 1994-11-04 1997-07-01 Genpharm International, Inc. Method for making recombinant yeast artificial chromosomes by minimizing diploid doubling during mating
US6046037A (en) 1994-12-30 2000-04-04 Hiatt; Andrew C. Method for producing immunoglobulins containing protection proteins in plants and their use
US7750137B2 (en) 1995-09-01 2010-07-06 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Mucosal vascular addressins
US6551593B1 (en) * 1995-02-10 2003-04-22 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Treatment of Inflammatory bowel disease by inhibiting binding and/or signalling through α 4 β 7 and its ligands and madcam
US7803904B2 (en) 1995-09-01 2010-09-28 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Mucosal vascular addressing and uses thereof
AU4986296A (en) * 1995-02-10 1996-08-27 Leukosite Incorporated Mucosal vascular addressins and uses thereof
US6091001A (en) 1995-03-29 2000-07-18 Abgenix, Inc. Production of antibodies using Cre-mediated site-specific recombination
US6130364A (en) 1995-03-29 2000-10-10 Abgenix, Inc. Production of antibodies using Cre-mediated site-specific recombination
EP0826034A4 (en) 1995-04-21 2002-06-19 Cell Genesys Inc PRODUCTION OF LARGE GENOMIC DNA DELETIONS
KR20050085971A (ko) 1995-04-27 2005-08-29 아브게닉스, 인크. 면역화된 제노마우스 유래의 인간 항체
AU2466895A (en) 1995-04-28 1996-11-18 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
WO1997007671A1 (fr) 1995-08-29 1997-03-06 Kirin Beer Kabushiki Kaisha Animal chimerique et procede de constitution
US6037324A (en) 1996-01-04 2000-03-14 Leukosite, Inc. Inhibitors of MAdCAM-1-mediated interactions and methods of use therefor
US5714352A (en) 1996-03-20 1998-02-03 Xenotech Incorporated Directed switch-mediated DNA recombination
US5994619A (en) 1996-04-01 1999-11-30 University Of Massachusetts, A Public Institution Of Higher Education Of The Commonwealth Of Massachusetts, As Represented By Its Amherst Campus Production of chimeric bovine or porcine animals using cultured inner cell mass cells
US7147851B1 (en) 1996-08-15 2006-12-12 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Humanized immunoglobulin reactive with α4β7 integrin
US5916771A (en) 1996-10-11 1999-06-29 Abgenix, Inc. Production of a multimeric protein by cell fusion method
EP2314625B1 (en) 1996-12-03 2014-05-07 Amgen Fremont Inc. Transgenic mammals having human Ig loci including plural VH and Vkappa regions and antibodies produced therefrom
US6235883B1 (en) 1997-05-05 2001-05-22 Abgenix, Inc. Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor
CA2322749A1 (en) 1998-03-03 1999-09-10 Abgenix, Inc. Cd147 binding molecules as therapeutics
US20020029391A1 (en) 1998-04-15 2002-03-07 Claude Geoffrey Davis Epitope-driven human antibody production and gene expression profiling
DK1078006T3 (da) * 1998-05-13 2009-06-02 Genentech Inc Diagnose og behandling af leverlidelser
US7090845B2 (en) * 1998-05-13 2006-08-15 Genentech, Inc. Diagnosis and treatment of hepatic disorders
CA2341029A1 (en) 1998-08-17 2000-02-24 Abgenix, Inc. Generation of modified molecules with increased serum half-lives
EA006972B1 (ru) 1998-12-23 2006-06-30 Пфайзер Инк. Моноклональное антитело человека к ctla-4 и способы его применения
US6517529B1 (en) 1999-11-24 2003-02-11 Radius International Limited Partnership Hemodialysis catheter
JP2003089656A (ja) * 2001-09-19 2003-03-28 Nippon Kayaku Co Ltd 移植による免疫反応抑制剤
KR100913714B1 (ko) 2001-11-08 2009-08-24 패시트 바이오테크 코포레이션 Ｉｇｇ 항체의 안정한 액상 약학 제형물
AR039067A1 (es) 2001-11-09 2005-02-09 Pfizer Prod Inc Anticuerpos para cd40
SI2336184T1 (sl) 2002-02-25 2015-04-30 Biogen Idec Ma Inc. Dajanje sredstev za zdravljenje vnetij
US20070202097A1 (en) 2003-03-10 2007-08-30 Krissansen Geoffrey W Monoclonal Antibodies That Recognise Mucosal Addressin Cell Adhesion Molecule-1 (Madcam-1), Soluble Madcam-1 And Uses Thereof
EP1610820B2 (en) 2003-04-04 2013-08-21 Genentech, Inc. High concentration antibody and protein formulations
AP2006003689A0 (en) 2004-01-09 2006-08-31 Pfizer Antibodies to MAdCAM
NZ584288A (en) 2004-02-06 2011-10-28 Elan Pharm Inc Methods and compositions for treating tumors and metastatic disease
WO2006096490A2 (en) 2005-03-08 2006-09-14 Pharmacia & Upjohn Company Llc ANTI-MAdCAM ANTIBODY COMPOSITIONS
JP2009500390A (ja) 2005-07-08 2009-01-08 ファイザー・リミテッド 新規ＭＡｄＣＡＭ抗体
EP1904103A2 (en) 2005-07-08 2008-04-02 Pfizer Limited Use of anti-madcam antibodies for the treatment of coeliac disease and tropical sprue
WO2007007159A2 (en) 2005-07-11 2007-01-18 Pfizer Limited Anti-madcam antibodies to treat uterine disorders
KR20080017094A (ko) 2005-07-11 2008-02-25 화이자 리미티드 간 섬유증을 치료하기 위한 항-ＭＡｄＣＡＭ 항체 및항섬유성 캐스파아제 억제제의 신규한 조합물
WO2007007160A2 (en) 2005-07-11 2007-01-18 Pfizer Limited Anti-madcam antibodies to treat fever
WO2007007152A2 (en) 2005-07-11 2007-01-18 Pfizer Limited Anti-madcam antibodies to treat metastatic cancers and chloroma
WO2007007151A2 (en) 2005-07-11 2007-01-18 Pfizer Limited Use of anti-mad-cam antibody for the treatment of emphysema

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020065220A1 (en) * 1999-09-03 2002-05-30 Young Paul E. Immunoglobulin superfamily polynucleotides, polypeptides, and antibodies
US20010046496A1 (en) * 2000-04-14 2001-11-29 Brettman Lee R. Method of administering an antibody

Also Published As

Publication number Publication date
IL176749A0 (en) 2006-10-31
JP2012250982A (ja) 2012-12-20
KR101262032B1 (ko) 2013-05-13
TWI363762B (en) 2012-05-11
US20080124339A1 (en) 2008-05-29
EP1709080A2 (en) 2006-10-11
MA28430B1 (fr) 2007-02-01
US20050232917A1 (en) 2005-10-20
EP2177537A3 (en) 2010-05-05
EP2177537A2 (en) 2010-04-21
CA2552523A1 (en) 2005-07-28
JP5836896B2 (ja) 2015-12-24
JP2010042025A (ja) 2010-02-25
WO2005067620A2 (en) 2005-07-28
EP2177537B1 (en) 2011-08-31
JP2018148901A (ja) 2018-09-27
ECSP066741A (ru) 2006-10-31
PE20051053A1 (es) 2005-12-12
USRE45847E1 (en) 2016-01-19
NL1027975A1 (nl) 2005-07-12
NO20063601L (no) 2006-08-08
JP4729076B2 (ja) 2011-07-20
PL2177537T3 (pl) 2012-06-29
OA13358A (en) 2007-04-13
WO2005067620A8 (en) 2006-09-21
AU2005204678B2 (en) 2008-09-25
MY140862A (en) 2010-01-29
SI2177537T1 (sl) 2012-01-31
DE602005026779D1 (de) 2011-04-21
CR8485A (es) 2007-02-22
WO2005067620A9 (en) 2009-10-01
TW200535144A (en) 2005-11-01
JP2009005695A (ja) 2009-01-15
CN1956738A (zh) 2007-05-02
CN1956738B (zh) 2013-05-29
ZA200605825B (en) 2007-11-28
PT2177537E (pt) 2011-12-13
TW201217397A (en) 2012-05-01
KR20060129006A (ko) 2006-12-14
MX370489B (es) 2019-12-16
WO2005067620A3 (en) 2005-09-29
EP1709080A4 (en) 2008-03-19
ATE522547T1 (de) 2011-09-15
ES2372733T3 (es) 2012-01-25
US20070166308A1 (en) 2007-07-19
CA2552523C (en) 2019-11-26
TNSN06216A1 (en) 2007-12-03
EP1709080B1 (en) 2011-03-09
AU2005204678A2 (en) 2005-07-28
NL1027975C2 (nl) 2005-12-23
JP6637104B2 (ja) 2020-01-29
TWI366570B (en) 2012-06-21
DOP2005000002A (es) 2005-08-15
JP6423024B2 (ja) 2018-11-14
BRPI0506768B1 (pt) 2021-09-21
MXPA06007843A (es) 2007-01-26
JP5094818B2 (ja) 2012-12-12
HK1099695A1 (en) 2007-08-24
US9328169B2 (en) 2016-05-03
BRPI0506768A (pt) 2007-05-22
JP2008505606A (ja) 2008-02-28
SV2006001990A (es) 2006-01-30
BR122021007893B1 (pt) 2022-04-12
ES2362667T3 (es) 2011-07-11
JP2017079789A (ja) 2017-05-18
US20170051057A1 (en) 2017-02-23
JP2015226539A (ja) 2015-12-17
PA8621301A1 (es) 2006-09-22
JP4315982B2 (ja) 2009-08-19
AR047372A1 (es) 2006-01-18
AU2005204678A1 (en) 2005-07-28
US10259872B2 (en) 2019-04-16
MX350383B (es) 2017-09-04
DK2177537T3 (da) 2011-12-12
NO342054B1 (no) 2018-03-19
JP6215875B2 (ja) 2017-10-18
US7932372B2 (en) 2011-04-26
US20190300605A1 (en) 2019-10-03
EA200601297A1 (ru) 2007-02-27
AP2006003689A0 (en) 2006-08-31
MX2019015195A (es) 2020-02-07
UY28716A1 (es) 2005-08-31
ATE501174T1 (de) 2011-03-15
KR20120048644A (ko) 2012-05-15
NZ548702A (en) 2009-06-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA012872B1 (ru) АНТИТЕЛА ПРОТИВ MAdCAM
CN105101997B (zh) 不减少血小板和不减少血红细胞的cd47抗体及其使用方法
US8329178B2 (en) Antibodies against CXCR4 and methods of use thereof
JP7100221B2 (ja) Ｆｒｉｚｚｌｅｄタンパク質に対する抗体及びその使用方法
CN102317316B (zh) 人抗α突触核蛋白自身抗体
CN103073641B (zh) 在体内具有抗肿瘤活性的抗人Dlk-1抗体
EA013677B1 (ru) Человеческие моноклональные антитела против cd25 и их применение
EA011669B1 (ru) Антитела против m-csf
UA126657C2 (uk) ОДНОЛАНЦЮГОВА КОНСТРУКЦІЯ АНТИТІЛА ДО BCMA І CD3&lt;font face=&#34;Symbol&#34;&gt;e&lt;/font&gt;
UA126441C2 (uk) Химерні антигенні рецептори, націлені на bcma, та способи їх застосування
EA023555B1 (ru) АНТИГЕНСВЯЗЫВАЮЩИЕ БЕЛКИ, СВЯЗЫВАЮЩИЕ c-fms ЧЕЛОВЕКА
UA118749C2 (uk) Конструкція антитіла до cdh19 і cd3
EA030777B1 (ru) Анти-альфа-синуклеинсвязывающие молекулы
EA029793B1 (ru) Антитела к ох40 и способы их применения
EA029419B1 (ru) Нейтрализующие антитела против ccl20
JP2002505097A (ja) 治療薬としてのｃｄ１４７結合分子
UA121844C2 (uk) Людське антитіло до cd27, спосіб його одержання та застосування
EA020465B1 (ru) ИЗОЛИРОВАННЫЕ МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА, КОТОРЫЕ СВЯЗЫВАЮТСЯ С ErbB3, НАБОРЫ И КОМПОЗИЦИИ, ИХ СОДЕРЖАЩИЕ, И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ
EA015534B1 (ru) Антитела к миостатину и способы их применения
EA030182B1 (ru) Антитела, специфические для кадгерина-17
KR20210142638A (ko) Cd3 항원 결합 단편 및 이의 응용
BR112020013475A2 (pt) Anticorpo de pd-l1, fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, e uso farmacêutico do mesmo
CN108025064A (zh) 抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体和其用于诊断与治疗癌症的用途
EP3532099A1 (en) Use of beta-catenin as a biomarker for treating cancers using anti-dkk-1 antibody
CN103534271B (zh) 有免疫抑制活性的单克隆抗体或其抗原结合片段

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM