CN103534271B - 有免疫抑制活性的单克隆抗体或其抗原结合片段 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及优良的有免疫抑制活性的单克隆抗体或其抗原结合片段。更具体而言,本发明涉及是与由SSVLYGGPPSAA(SEQ ID NO:1)所示的氨基酸序列构成的肽或该肽和药学上可容许的载体的结合体结合的单克隆抗体或其抗原结合片段,相比对组蛋白H1的结合亲和性,对核心组蛋白的结合亲和性更高的单克隆抗体或其抗原结合片段。
Description
【关联申请的参照】
本专利申请伴随基于2010年8月20日申请的日本专利申请2010-185406号的优先权的主张,将该在先的专利申请的全部公开内容通过引用作为本说明书的公开之一部分。
【技术领域】
本发明涉及有优良的免疫抑制活性的单克隆抗体或其抗原结合片段及产生它们的杂交瘤。
【背景技术】
在器官移植医疗中,为了抑制器官移植后的排斥反应,从前使用各种的免疫抑制剂。作为这样的免疫抑制剂,可举出例如,他克莫司(FK506)、环孢菌素A等(JpnJPharmacol,71,89-100,1996)。但是,从前的免疫抑制剂中,癌细胞的增殖促进、骨髓功能抑制等是强的副作用、感染症、还有永续施用的必要性等成为问题(非专利文献1:Transplantation,58,170-178,1994)。
另外,一般而言,判断免疫抑制剂的退药时期是困难的。例如,有不继续免疫抑制剂的施用也组织植入的情况。这时如果不小心继续免疫抑制剂的施用,则有对患者给单单由毒性的损伤的担忧。
另一方面,也有通过中断免疫抑制剂的施用,植入的组织转为排斥的可能性。此时,再开始免疫抑制剂的施用也多免不了排斥的情况。
另一方面,进行着与器官移植相关的各种的研究。例如,在大鼠原位肝移植(OLT:orthotopiclivertaransplantation)的系中,将移植片的植入率高的供体DA大鼠肝(MHChaplotypeRT1a)移植到受者PVG大鼠(RT1c)时,被报告不施用免疫抑制剂而植入移植片(非专利文献2:Transplantation,35,304-311,1983)。
另外,通过将移植DA大鼠肝的受者PVG大鼠的血清(post-OLTserum)向发生排斥反应的组合的移植模型系统术前施用1次,报告移殖片的排斥反应被抑制(非专利文献3:J.Surg.Res.,80,58-61,1998)。
另外公开,通过将抗组蛋白H1多克隆抗体向排斥反应必发生的DA(RT1a)及LWIS大鼠(RT1l)的心移植系统(invivo)术后施用,排斥反应被抑制,受者生存(非专利文献4:Transplantation,77,1595-1603,2004)。
另外公开,本发明人之一部分通过使用PVG大鼠来源移植后初期血清而混合淋巴细胞培养反应(MLR;mixedlymphocytereaction)被抑制,及抗组蛋白H1抗体示MLR抑制活性(专利文献1:特开2004-149507号公报)。
另外公开,本发明人之一部分制造了抗组蛋白H1单克隆抗体,及,杂交瘤16G9(保藏号FERMBP-10413)产生的抗组蛋白H1单克隆抗体与包含由噬菌体展示法得到的SEQIDNO:1所示的氨基酸序列的肽结合(专利文献2:WO2006/025580号公报)。
另外报告,本发明人之一部分制造了将包含SEQIDNO:1所示的氨基酸序列的肽作为抗原的多克隆抗体(专利文献3:US-2009-0081247-A1)。
但是,在器官移植中,依然要求创造可在移植排斥抑制中利用的,有优良的免疫抑制活性的单克隆抗体。
【现有技术文献】
【非专利文献】
非专利文献1:Transplantation,58,170-178,1994
非专利文献2:Transplantation,35,304-311,1983
非专利文献3:J.Surg.Res.,80,58-61,1998
非专利文献4:Transplantation,77,1595-1603,2004
【专利文献】
专利文献1:特开2004-149507号公报
专利文献2:WO2006/025580号公报
专利文献3:US-2009-0081247-A1
【发明概述】
本发明人此番、发现了有显著的免疫抑制活性的,新颖的单克隆抗体及其抗原结合片段、及产生它们的杂交瘤。本发明便基于这样的见解。
从而,本发明旨在提供有显著的免疫抑制活性的,新颖的单克隆抗体及其抗原结合片段、及产生它们的杂交瘤。
然后,本发明的单克隆抗体或抗原结合片段与包含SSVLYGGPPSAA(SEQIDNO:1)所示的氨基酸序列的肽或该肽和药学上可容许的载体的结合体结合,并且,特征在于相比对组蛋白H1的结合亲和性,对核心组蛋白的结合亲和性更高。
另外,本发明的杂交瘤产生上述单克隆抗体或抗原结合片段。
本发明的单克隆抗体有显著的免疫抑制活性,可在器官移植中的移植排斥抑制中有利地利用。
【附图说明】
【图1】示本发明的单克隆抗体(以下,也称为“SSVmAb”)的同种型的鉴定试验的结果。
【图2】关于本发明的单克隆抗体(SSVmAb),示比较对组蛋白H1、组蛋白H2A、H2B、H3或H4的结合亲和性的试验的结果。
【图3】参考例;关于具有保藏号FERMBP-10413的保藏的杂交瘤16G9产生的单克隆抗体(以下,也称为“16G9mAb”),示比较对组蛋白H1、组蛋白H2A、H2B、H3或H4的结合亲和性的试验的结果。
【图4】示使用本发明的单克隆抗体(SSVmAb)及16G9mAb的混合淋巴细胞反应(MLR)试验的结果。
【图5】示将本发明的单克隆抗体(SSVmAb)及16G9mAb的对T细胞的反应性由流式细胞术比较的结果。
【图6】A涉及本发明的单克隆抗体(SSVmAb)及对照试剂(IsotypeIgG1)的,示使用ATP合成酶不由siRNA敲除的脾脏细胞的MLR试验的结果。B涉及本发明的单克隆抗体(SSVmAb)及对照试剂(IsotypeIgG1),示使用将ATP合成酶由siRNA敲除的脾脏细胞的MLR试验的结果。
【实施方式】
【保藏】
本发明的杂交瘤小鼠-小鼠杂交瘤SSV-C93-3,其原保藏日为2010年8月17日,在独立行政法人制品评价技术基盘机构专利微生物保藏中心(住所:日本千叶县木更津市上总镰足2-5-8生物技术本部),以保藏号NITEBP-972保藏。
【单克隆抗体及杂交瘤】
本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段与由SSVLYGGPPSAA(SEQIDNO:1)所示的氨基酸序列构成的肽或该肽和药学上可容许的载体的结合体结合,并且,其特征在于相比对接头组蛋白(组蛋白H1)的结合亲和性,对核心组蛋白的结合亲和性更高。有涉及的反应性的单克隆抗体或其抗原结合片段有显著的免疫抑制活性是意外的事实。
根据本发明的优选的实施方式,上述抗体或其抗原结合片段针对由SSVLYGGPPSAA(SEQIDNO:1)所示的氨基酸序列构成的肽或该肽和药学上可容许的载体的结合体。
另外,根据本发明的优选的实施方式,核心组蛋白是组蛋白H2A、H2B、H3或H4,更优选为H2A、H3或H4。
另外,本发明的抗体或其抗原结合片段可含重链及/或轻链。各轻链及重链可在其N-末端有可变区域,各可变区域优选交替含4个框架区域(frameworkregion)(FR)和3个互补性决定区域(CDR)。可变区域中的残基根据由Kabat等考虑的系统惯用地编号。此系统如Kabat等,1987、SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,USDepartementofHealth及HumanServices,NIH,USA所述。如不特别说明,在本说明书使用此编号体系。基于这样的Kabat等的方法的编号,可例如,使用Web位点http://www.bioinf.org.uk/abysis/tools/analyze.cgi简易地进行。
Kabat残基命名法不与氨基酸残基的直线的编号必然直接一致。实际的直线的氨基酸序列,由基本可变区域结构的结构的要素、框架或CDR之任何而,对应于其缩短或插入,有相比在严格的Kabat编号更少的或追加的氨基酸的情况。残基的正确的Kabat的编号,对于给定抗体,通过将“标准的”Kabat编号的序列与抗体的序列中的相同性残基对齐而确定。
根据一个实施方式,本发明的抗体或其抗原结合片段的轻链可变区域包括:由RASSSVSYMH(SEQIDNO:2)所示的氨基酸序列构成的CDR1、由ATSNLAS(SEQIDNO:3)所示的氨基酸序列构成的CDR2、及由QQWSSNPWT(SEQIDNO:4)所示的氨基酸序列构成的CDR3。根据再优选的实施方式,上述轻链可变区域包括SEQIDNO:6的第23位~第128位所示的氨基酸序列。
另外,根据别的实施方式,本发明的抗体或其抗原结合片段的重链可变区域包括:由GYNMN(SEQIDNO:7)所示的氨基酸序列构成的CDR1、由NINPYYGSTSYNQKFKG(SEQIDNO:8)所示的氨基酸序列构成的CDR2、及由SPYYSNYWRYFDY(SEQIDNO:9)所示的氨基酸序列构成的CDR3。根据再优选的实施方式,上述重链可变区域包括SEQIDNO:11的第20位~第141位所示的氨基酸序列。
另外,根据本发明的更加优选的实施方式,本发明的抗体或其抗原结合片段包括:包含由RASSSVSYMH(SEQIDNO:2)所示的氨基酸序列构成的CDR1、由ATSNLAS(SEQIDNO:3)所示的氨基酸序列构成的CDR2、及由QQWSSNPWT(SEQIDNO:4)所示的氨基酸序列构成的CDR3的轻链可变区域;以及包括:包含由GYNMN(SEQIDNO:7)所示的氨基酸序列构成的CDR1、由NINPYYGSTSYNQKFKG(SEQIDNO:8)所示的氨基酸序列构成的CDR2、及由SPYYSNYWRYFDY(SEQIDNO:9)所示的氨基酸序列构成的CDR3的重链可变区域。
另外,根据本发明的更加优选的实施方式,本发明的抗体或其抗原结合片段包括:包括SEQIDNO:6的第23位~第128位所示的氨基酸序列的轻链可变区域,以及包括SEQIDNO:11的第20位~第141位所示的氨基酸序列的重链可变区域。
另外,根据本发明的优选的实施方式,上述单克隆抗体或其抗原结合片段可下调ATP合成酶活性。另外,根据本发明的更优选的实施方式,上述ATP合成酶是线粒体的ATP合成酶。
本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的上述结合亲和性及ATP合成酶活性的下调活性根据,例如,本申请说明书的试验例2及4记载的方法确认。
另外,本发明的单克隆抗体,优选为,嵌合抗体、人源化抗体或完全人型抗体。这些抗体,本领域技术人员可基于,例如,在Morrison,S.L.,Oi,V.T.,“immunoglobulingenes”AcademicPress(London),260-274(1989)、Roguska,M.L.et.Al.,Humanizationofmurinemonoclonalantibodiesthroughvariabledomainresurfacing,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,91,969-973(1994)、Tomizuka,K.et.al.Functionalexpressionandgermlinetransmissionofahumanchromosomefragmentinchimaericmice,NatureGenet.,16,133-143(1997)、Winter,G.et.al.,Makingantibodiesbyphagedisplaytechnology,Ann.Rev.Immunol.,12,433-455(1994)、Griffiths,A.D.et.al.,Isolationofhighaffinityhumanantibodiesdirectlyfromlargesyntheticrepertoires,EMBO.J.,13,3245-3260(1994)等中记载的所述技术领域的公知技术来制造。
另外,根据本发明的优选的实施方式,上述抗原结合片段,优选为,Fab、Fab’、(Fab’)2、Fv或scFv。
另外,根据本发明的别的实施方式,提供产生上述单克隆抗体或其抗原结合片段的杂交瘤。另外,根据本发明的优选的别的实施方式,杂交瘤是小鼠-小鼠杂交瘤SSV-C93-3。
本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段、及杂交瘤,例如,可如以下一样制造。即,首先,本发明的杂交瘤将由SSVLYGGPPSAA(SEQIDNO:1)所示的氨基酸序列构成的肽或该肽和药学上可容许的载体的结合体作为致敏抗原使用,将用此致敏抗原免疫的哺乳动物的浆细胞(免疫细胞)与哺乳动物的骨髓瘤细胞融合,将得到的杂交瘤克隆,通过从该杂交瘤中筛选而可得到。然后,本发明的单克隆抗体可通过培养本发明的杂交瘤,回收其产生的抗体而得到。
作为免疫哺乳动物的方法,可使用在所述技术领域的一般施用法,具体而言,可举出腹腔内注射、脾脏内注射、肌肉内注射、皮下注射、皮内注射、经口施用、经粘膜施用、经皮施用等。但优选为腹腔内注射、脾脏内注射。致敏抗原的施用间隔根据致敏抗原的施用量及哺乳动物的种类等而适宜决定,例如,可为每1个月间数次。
免疫的哺乳动物不特别限定,考虑与细胞融合中使用的骨髓瘤细胞的适合性等而选择是优选的,可举出例如,小鼠、大鼠、仓鼠等,优选为小鼠。
另外,作为免疫细胞,优选为使用脾细胞。
作为本发明中使用的骨髓瘤细胞,可举出例如,P3(P3×63Ag8.653)(J.Immunol.,123,1548,1978)、p3-U1(CurrentTopicsinMicro-biologyandImmunology,81,1-7,1978)、NS-1(Eur.J.Immunol.,6,511-519,1976)、MPC-11(Cell,8,405-415,1976)、Sp2/0-Ag14(Nature,276,269-270,1978)、FO(J.Immunol.Meth.,35,1-21,1980)、S194(J.Exp.Med.,148,313-323,1978)、及R210(Nature,277,131-133,1979)等,优选为P3或p3-U1,更优选为P3。
免疫细胞和骨髓瘤细胞的细胞融合可根据例如,Milstein等(Milsteinet.al.)的方法(MethodsEnzymol.,73,3-46,1981)等进行。具体而言,细胞融合,例如,可通过在融合促进剂的存在下、在培养基中将免疫细胞和骨髓瘤细胞混合来实施。然后,在细胞融合中,可添加适宜培养基而重复离心分离的操作来生成杂交瘤。
作为细胞融合中使用的培养基,可举出例如,RPMI-1640培养基、MEM培养基等的在细胞融合中通常使用的培养基。另外,可适宜联用牛胎儿血清(FBS)等的血清补液。
另外,细胞融合温度优选为25~37℃,更优选为30~37℃。
另外,骨髓瘤细胞和免疫细胞的混合比率优选为1:1~1:10左右。
作为融合促进剂,可举出例如,聚乙二醇(PEG)、仙台病毒(HVJ)等,优选为PEG。PEG的分子量可适宜选择,例如,平均分子量可为1,000~6,000左右。另外,培养基中的PEG的浓度优选为约30~60%(W/V)。
另外,根据期望,可将二甲基亚砜等的辅助剂向培养基中适宜添加。
本发明的杂交瘤的选择可通过将由细胞融合得到的杂交瘤,例如,在HAT培养基等的通常的选择培养基中培养,使用通常的有限稀释法,例如,以针对由SSVLYGGPPSAA(SEQIDNO:1)所示的氨基酸序列构成的肽或该肽和药学上可容许的载体的结合体的抗体价等作为指标来筛选来实施。由HAT培养基的培养期间是杀灭作为目的的杂交瘤以外的细胞(未融合细胞)充分的时间,通常、可为数天~数周。如此得到的本发明的杂交瘤可在通常的培养基中继代培养,另外,可在液氮中长期保存。
另外,作为回收本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的方法,可举出例如,将杂交瘤根据常规方法培养而从其培养上清得单克隆抗体等的方法、或者将杂交瘤施用到与其有适合性的哺乳动物而使增殖,从其腹水得单克隆抗体等的方法等。其中,前者的方法在得高纯度的抗体中优选,另一方面,后者的方法对于大量地生产抗体是优选的。
再者,本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段可由盐析法、凝胶过滤法、亲和层析等的方法纯化至高纯度。
本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段,如上所述,有显著的免疫抑制活性。本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段,直接使用也可,与药学容许的添加剂等一起作为医药组合物使用也可。从而,根据本发明的一实施方式,提供包括本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的医药组合物。另外,根据本发明的优选的实施方式,上述医药组合物作为免疫抑制剂使用。另外,根据本发明的别的实施方式,提供在医药组合物的制造中的本发明的单克隆抗体的使用。
本发明的医药组合物可为由心脏、肾脏、肝脏、骨髓、皮肤等的器官的移植的排斥反应的抑制或其发生风险的降低,还为自身免疫疾病等的治疗而有利地利用。本发明的医药组合物,可例如,将本发明的单克隆抗体在注射用生理盐水、注射用蒸馏水、注射用缓冲溶液等中溶解来制备。再者,在本发明的免疫抑制用组合物中可含有,适当的溶剂、溶解辅助剂、保存剂、稳定剂、乳化剂、悬浮剂、无痛化剂、等张化剂、缓冲剂、赋形剂、增粘剂、着色剂、公知的载体(各种脂质体、聚氨基酸载体、合成高分子、天然高分子等)等。
另外,根据本发明的别的实施方式,提供以免疫抑制作为必要的哺乳动物的治疗方法,包括施用有效量的本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的方法。其中,“治疗”是指改善确立的病态。另外,根据本发明的别的实施方式,提供轻减移植排斥的发生风险的方法,包括将有效量的本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段给接受器官移植的哺乳动物施用。
另外,根据一个实施方式,上述哺乳动物接受器官移植。作为上述哺乳动物及移植器官的供体,可举出人、猪、狒狒等,优选为人。
另外,作为移植的器官,可举出例如,肝脏、心脏、肾脏、皮肤等。
另外,本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段与器官移植中使用的其他免疫抑制剂组合而同时或依次施用给哺乳动物也可。作为涉及的其他免疫抑制剂,不特别限定,可举出例如,环磷酰胺等的烷基化剂、硫唑嘌呤、甲氨喋呤、咪唑立宾等的代谢拮抗剂、环孢菌素、他克莫司等的T细胞活性抑制剂、泼尼松龙、甲基泼尼松龙、麦考酚酸吗替酯、硫唑嘌呤等的类固醇剂、巴利昔单抗、莫罗单抗等的淋巴细胞表面功能抑制剂或它们的组合等。
另外,本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段可全身或局部地施用,作为具体性的施用方法,可举出点滴、静脉内注射、肌肉内注射、皮下注射、皮内注射、经口施用、经粘膜施用、经皮施用等。
另外,本发明的单克隆抗体或抗原结合片段的有效量不特别限定,由本领域技术人员根据哺乳动物的种类、性质、性别、年龄等适宜决定。例如,作为涉及的有效量,可举出将0.05~40mg/体重kg/日、优选为0.1~1.0mg/体重kg/日施用1次或数次等。
【实施例】
以下,举实施例具体说明本发明,本发明不限于这些实施例。
【实施例1:单克隆抗体(SSVmAb)的制造】
【抗原物质的制造】
作为抗原物质,使用由SEQIDNO:1所示的氨基酸序列构成的肽及KLH的结合体。
在抗原物质的制备中,首先,由SEQIDNO:1所示的氨基酸序列构成的肽由Fmoc肽固相合成法(制造装置;ABI430型AppliedBiosystems公司制)合成。再者,上述肽及KLH(SIGMA公司制)的结合体是将上述肽5mg、KLH约20mg及戊二醛30μg(片山化学工业株式会社)在磷酸缓冲液(pH8.0)中,于室温搅拌约6小时而合成。
【杂交瘤的制造】
【免疫】
将在PBS中溶解抗原物质的溶液0.8mL(抗原物质浓度:0.5mg/mL)和弗氏完全佐剂(和光纯药株式会社制)0.8mL混合,得到悬浮液(抗原浓度:0.25mg/mL)。接下来,将此悬浮液0.2mL给BALB/c小鼠腹腔内施用。再者,将此悬浮液每2周同量给小鼠施用。然后,从施用开始16周后,将在PBS中溶解抗原的溶液0.2mL(抗原浓度:600~1000mg/mL)最终施用到小鼠腹腔内。再有,在施用之时,由眼底静脉进行采血,由ELISA测定抗体价。最终施用的4天后,进行全采血,将得到的血液离心分离(2000rpm、20分钟),得抗血清而作为以下的实验的对照抗血清使用。另外,全采血后,从大鼠摘出脾脏,将得到的脾细胞在以下的细胞融合中使用。
【细胞融合】
将上述的脾细胞及骨髓瘤细胞(P3×63-Ag.8.653)以脾细胞:骨髓瘤细胞=10:1~10混合而离心分离(1500rpm,5分钟)。离心分离之后,使用吸吐器除去上清,向得到的细胞沉淀经1分钟添加37℃的聚乙二醇4000(50%PBS溶液)1mL而作为混合液。将此混合液于37℃静置1分钟之后,每30秒钟加各1mL37℃的IMDM培养基(计9mL)之后,离心分离(1500rpm、5分钟)。离心分离后,吸引除去上清,适量添加37℃的含有15%FCS(JRHBIOSCIENCES制)的IMDM(GIBCO制)培养基。将得到的悬浮液向96孔培养板分注各100mL,在37℃/5%CO2温育器中培养1天。再者,添加100mLHAT培养基(将HAT粉末(HATMEDIASUPPLEMENT(×50)、SIGMA制)在无血清IMDM培养基10mL中溶解,用含有10%FCS的IMDM培养基稀释50倍),在37℃/5%CO2温育器中培养。每2~3天进行HAT培养基的交换,10天后,切换到HT培养基(将HT粉末(HTMEDIASUPPLEMENT、SIGMA制)在无血清IMDM培养基10mL中溶解,用含有10%FCS的IMDM培养基稀释50倍)中,在37℃/5%CO2温育器中进行3天培养。之后每2~3天进行培养基(HT培养基)的交换。用显微镜确认细胞增殖之后,回收培养上清(约100mL)。使用此培养上清,进行由抗体价测定的杂交瘤的筛选。
【杂交瘤细胞的筛选】
【抗体价测定】
向96孔平底板以每1孔各50μL添加含上述抗原物质(5mg)的缓冲液(Baicarbonatebuffer:100mMNaHCO3-NaOH、pH9.2~9.5、肽浓度:1μg/mL),于室温静置2小时而包被。将板用清洗缓冲液(PBST)清洗3次,以200~250μL/孔加封闭缓冲液(3%脱脂乳1%BSA、PBS),于4℃一昼夜反应之后,清洗3次。然后,以100μL/孔加杂交瘤的培养上清,于37℃反应4小时或于4℃反应一昼夜。将板清洗3次之后,以50μL/孔加用稀释缓冲液(10mMTris-HCl(pH8.0)、0.9%(W/V)NaCl、0.05%(W/V)Tween20)稀释10000倍的生物素标记抗小鼠IgG(Biotion-labeledanti-mouseIgG、SIGMA),于室温反应2小时。其后清洗6次之后,以50μL/孔加用稀释缓冲液稀释1000倍的碱性磷酸酶标记Streptaridin(Streptaridin),于室温反应1~2小时。其后进行6次清洗,加50μL/孔荧光底物缓冲液(Attophossubstratebuffer、Roche-Diagnostics公司制)而将板遮光发色。荧光强度用CytoFluorII(パーセプティブ公司制)测定。
【杂交瘤的筛选】
向用上述抗体价测定示阳性的结果的孔(1×105细胞/mL)加含有15%FCS10%HCF(Hybridomacloningfactor、Origin公司制)的IMDM培养基,分注到96孔培养板至成约200细胞/孔,在37℃5%CO2温育器中进行培养。然后,与上述同样地进行抗体价测定,选择产生抗体的量多的杂交瘤。
再者,进行有限稀释,用含有15%FCS10%HCF的IMDM培养基稀释至选择的杂交瘤成0.5~1细胞/孔,在37℃/5%CO2温育器中培养约3~4天之后,与上述同样地进行抗体价测定,选择产生抗体的量多的杂交瘤。再者,重复有限稀释,得到产生针对上述抗原物质的单克隆抗体的杂交瘤。其中,选择抗体价最高的杂交瘤而命名为小鼠-小鼠杂交瘤SSV-C93-3。
【单克隆抗体的取得】
杂交瘤小鼠-小鼠杂交瘤SSV-C93-3使用含有15%FCS的RPMI培养基培养(1×106细胞/mL)。接下来,回收杂交瘤培养液,为除去死细胞片而用滤器过滤。接下来,向培养上清加硫酸铵至终浓度成40%,于40℃搅拌1小时。接下来,进行离心分离(3000g、30分钟、4℃),舍去上清而回收沉淀。将此沉淀在上述培养上清的1/10量的PBS中溶解,将PBS作为外液透析一晚。
接下来,将上述沉淀用20mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)稀释2倍,与1MTris-HCl缓冲液一同添加到HiTrapNHS活化柱。再者,用0.1M甘氨酸-HCl溶液(pH2.7)将抗体溶出,回收到级分管。
【试验例1:SSVmAb的同种型的鉴定】
为了鉴定实施例1的单克隆抗体(SSVmAb)的同种型,进行使用MouosMonoclonalAntibodyIsotypingReagents(SIGMA)的同种型鉴定试验。
结果如图1所示,IgG1示最高的值。
另外,将小鼠IgG1(eBioscience公司)及实施例1的单克隆抗体(SSVmAb)用2-巯基乙醇还原,用SDS-PAGE处理时,均在同样的位置(50KD、25KD)确认与重链及轻链相当的条带。另一方面,代替小鼠IgG1而使用小鼠IgM(eBioscience公司)而进行同样的实验时,无法确认同样的条带。
从图1及SDS-PAGE的结果确认,实施例1的单克隆抗体(SSVmAb)的同种型是IgG1。
【试验例2:SSVmAb的对核心组蛋白的亲和性的确认】
在WO2006/025580号公报中,作为可免疫抑制中使用,与由SEQIDNO:1所示的氨基酸序列构成的肽结合的抗H1单克隆抗体,报告了杂交瘤16G9(保藏号FERMBP-10413)产生的单克隆抗体(16G9mAb)。
从而,将WO2006/025580号公报中记载的抗体(16G9mAb)作为参考例1,进行与实施例1的单克隆抗体(SSVmAb)的对抗原的亲和性的比较。
作为抗原,选择作为参考例1(16G9mAb)的抗原的组蛋白H1、及作为组蛋白H1类似抗原的核心组蛋白H2A、H2B、H3及H4。
用ELISA测定组蛋白H1或核心组蛋白与SSVmAb的亲和性。
将96孔微板用组蛋白H1、H2A、H2B、H3或H4包被。各自的组蛋白使用在100mM碳酸钠缓冲液(pH9.3)中溶解的。将该板用PBS-吐温20(0.05%)清洗,用3%脱脂乳和1%BSA封闭1小时。将SSVmAb5μg/mL添加到各孔,温育1小时。将结合的SSVmAb使用过氧化物酶(HRP)缀合物抗小鼠IgG1Ab(SIGMA)检测,温育1小时。将结合的SSVmAb使用ABTS[2,2’-连氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-磺酸)]底物溶液检测,使用MultiskanAscent(ThermoFisherScientificInc.,Waltham,MA)测定405nm的吸光度。
结果如图2及3所示。
如图2所示,在实施例1(SSVmAb)中,相比对组蛋白H1的亲和性,对组蛋白H2A、H2B、H3或H4的亲和性更高。
另一方面,如图3所示,在参考例1(16G9)中,相比对组蛋白H2A、H2B、H3及H4的亲和性,对组蛋白H1的亲和性更高。
【试验例3:MLR试验】
使用无处理的DA大鼠来源的脾脏淋巴细胞(应答细胞)及进行丝裂霉素C(协和发酵工业株式会社制)处理的LEW大鼠来源的脾脏淋巴细胞(刺激细胞)。应答细胞用10%FCS-RPMI培养基调节到5×105细胞/mL,刺激细胞用10%FCS-RPMI培养基调节到8×106细胞/mL。将此应答细胞悬浮液及刺激细胞悬浮液各自100μL接种到96孔圆底板(NuncBrandProducts公司制)之后,在混合培养开始时添加参考例1的单克隆抗体16G9mAb(0.1、2、4或6μg/mL/孔)或实施例1的单克隆抗体SSVmAb(4μg/mL/孔),在37℃,5%CO2/95%空气的条件下培养3.5天以上。另外,作为阳性对照,添加免疫抑制剂他克莫司(FK506:藤泽药品公司制、1nM/孔)。再者,培养结束15小时前添加溴脱氧尿苷(BrdU)10μL。然后,使用BrdU标记&检测试剂盒III(RocheDiagnostics公司制),以细胞内DNA中摄入的BrdU量作为指标,测定由免疫抑制物质处理的细胞的增殖能力,作为免疫抑制水平的指标。
结果如图4所示。
在实施例1(SSVmAb)中,示BrdU量摄入的吸光度相比参考例1(16G9mAb)及他克莫司(FK506)的其更低。特别是,将实施例1(SSVmAb)的吸光度0.552±0.114(平均±S.E.)与同添加量(4μg/mL/孔)的参考例1(16G9mAb)的吸光度1.351±0.389(平均±S.E.)比较,则实施例1的平均值是参考例1的平均值的约41%左右。
【试验例4:对单克隆抗体(SSVmAb)T细胞的反应性的确认】
由以下的方法,从C57BL/6小鼠(5周龄、雌、日本CharlesRiver公司制)摘出脾脏,制备全脾细胞。
首先,在放入5ml的RPMI1640培养基(Sigma-Aldrich公司制R-8758)的5ml培养皿(BDBioscience公司制FALCON351007)中用解剖用夹和镊子小心解剖脾脏而将脾细胞悬浮后,移到15ml离心管(BDBioscience公司制FALCON352096)。接下来,将5ml皿上用磷酸缓冲盐水(PBS,Invitrogen公司制20012-027)清洗数次,将这些也加到先前的细胞悬浮液中而静置后,将上清回收到别的15ml离心管。再者,也向残渣的不溶性脾脏组织再加RPMI1640培养基5ml而仅回收静置后上清,将这与上述的细胞悬浮液合并而进行1,500rpm,5min的离心分离。向回收的细胞加2ml裂解缓冲液(150mMNH4Cl/15mMNaHCO3/0.1mMEDTA-Na2,pH7.3)而由叩敲溶血后,将加PBS10ml而以1,500rpm,5min离心清洗3次的细胞作为全脾细胞。
接下来,根据以下记载的方法,使用PanTCellIsolationKit,mouse(MiltenyiBiotec公司制130-090-861),由磁筛选(MACS)从本脾细胞纯化全T细胞。
首先,将脾细胞用MACS缓冲液(0.5%牛血清白蛋白(BSA,Nacalaitesque公司制08777-36)/PBS)以5x107细胞/200μl的比例悬浮,添加50μlBiotin-antibodycocktail/5x107细胞而在4℃温育10min。将其悬浮到150μlMACS缓冲液/5x107细胞后,添加100μl抗生物素微珠/5x107细胞而在4℃温育15min。向其添加MACS缓冲液(10ml)而以1500rpm离心清洗5min后,将回收细胞悬浮于MACS缓冲液500μl。将MACS柱(MS柱、MiltenyiBiotec公司制130-042-201)设置为磁体(MiniMACSseparationUnit、MiltenyiBiotec公司制130-090-312)而用500μlMACS缓冲液将柱平衡化后,供到上述的细胞悬浮液。回收过而不停级分500μl及其后的由MACS缓冲液的柱清洗级分(1.5ml)而作为纯化未刺激T细胞(纯度约97%)。
将上述的未刺激和16G9mAb或SSVmAb的反应性由流式细胞术(FACS)解析。
首先,将各T细胞样品(1x106细胞)悬浮于89μl的FACS缓冲液(0.5%FBS/PBS/0.02%NaN3)后,加1μg的抗-小鼠CD16/32-blocksFc结合(eBioscience公司制14-0161-85)而在4℃温育20min。向其作为1次抗体加16G9mAb或SSVmAb(100μg/ml)10μl而在4℃温育60min。用FACS缓冲液将细胞离心清洗2次后,加100μl2次抗体(生物素-缀合的大鼠抗-小鼠IgMmAb(eBioscience公司制13-5780-85)或生物素-缀合的大鼠抗-小鼠IgG1mAb(BDBiosciences公司制553441)、各1μg/ml)而在4℃温育30min。再用FACS缓冲液将细胞离心清洗2次后,加100μlStreptavidin-PE-Cy7(BDBiosciences公司制556463、1μg/ml),向其添加FITC-缀合的大鼠抗-小鼠CD3mAb(BDBiosciences公司制553062)至终浓度成1μg/ml,在4℃温育30min。用FACS缓冲液离心清洗2次,及用40μm细胞滤器(BDBioscience公司制FALCON352340)过滤处理后,将各样品提供到FACSCalibur流式细胞仪及CellQuest软件(BDBioscience公司制)而解析16G9mAb或SSVmAb阳性/CD3阳性T细胞数。
结果如图5所示。
如果比较参考例1(16G9mAb)及实施例1(SSVmAb),则在对CD3阳性T细胞的反应性上确认不到显著差异,这些抗体示同等的反应性(studentt-检验、p<0.05)。
【试验例5:由SSVmAb的下调的靶的特定】
用蛋白质组解析鉴定7种由实施例1(SSVmAb)下调的候选蛋白质。
然后,由以下的方法确认7种的候选蛋白质中,ATP合成酶是实施例1(SSVmAb)的靶抗原。
首先,使用ThermoFisher公司的AccellsiRNA试剂盒,取得线粒体ATP合成酶被敲除的Balb/c小鼠来源的T细胞。
接下来,使用根据试验例2的方法得到的T细胞,以实施例1(SSVmAb)作为试验物质进行MLR试验。
其中,作为对照试剂使用IsotypeIgG1(eBioscience公司)。另外,作为对照试验,进行使用未敲除ATP合成酶的小鼠来源的T细胞的同样的试验。
结果如图6A及B所示。
如图6A所示,在未敲除ATP合成酶时,实施例1(SSVmAb)相比IsotypeIgG1显著地抑制细胞增殖。
另一方面,如图6B所示,在敲除ATP合成酶时,关于细胞增殖的抑制,在实施例1(SSVmAb)与IsotypeIgG1之间确认不到显著差异。
图6A及B中提示,由ATP合成酶的敲除而SSVmAb的免疫抑制活性降低,SSVmAb在免疫抑制之时,下调ATP合成酶活性。
【试验例6:SSVmAb的轻链及重链的可变区域序列的鉴定】
【杂交瘤cDNA的合成】
使用FastPureRNAKit(TaKaRa公司制),从试验例1中取得的杂交瘤(小鼠-小鼠杂交瘤SSV-C93-3)1.6×107细胞制备总RNA。使用Poly(A)+IsolationKitfromTotalRNA(NIPPONGENE制),从240μg的总RNA制备mRNA。使用Etachinmate(NIPPONGENE公司制)进行乙醇沉淀,将mRNA沉淀。用75%乙醇清洗之后,将mRNA干燥。向其加10μL无RNase水,将mRNA溶解。将得到的mRNA溶液于-80℃保存。使用SMARTerRACEcDNAAmplificationKit(Clontech公司制),合成1μg的SSV杂交瘤mRNA-5’-RACE用的cDNA。得到的cDNA溶液于-20℃保存。
【SSVmAb轻链及重链中的互补性决定区域(CDR)的鉴定】
以小鼠IgG1重链恒定区的碱基序列为基础,制备引物5’-CACCATGGAGTTAGTTTGGGCAGCAG-3’(SEQIDNO:12)。以小鼠轻链κ恒定区的碱基序列为基础制备引物5’-CACGACTGAGGCACCTCCAGATG-3’(SEQIDNO:13)。使用各自的引物和UniversalPrimerAMix(SMARTerRACEcDNAAmplificationKit附属引物),进行以cDNA作为模板的5'-RACE。RACE反应使用Advantage2PCRKit(Clontech公司制)。将反应液琼脂糖电泳,将约600bp的重链5’-RACE产物及约550bp的轻链5’-RACE产物用E.Z.N.A.GelExtractionKit(OMEGAbio-tek公司制)从凝胶纯化。将其连结到pGEM-TEasyVector(Prω公司制),转化Competenthigh大肠杆菌(E.coli)DH5α(TOYOBO公司制)。从得到的转化体,使用E.Z.N.A.PlasmidMiniprepKitI(OMEGAbio-tek公司制)制备质粒。将制备的质粒作为模板,使用BigDyeTerminatorv3.1CycleSequencingKit(AppliedBiosystems公司制)进行循环反应。
接下来,使用DNA测序仪(AppliedBiosystems制),解析轻链及重链可变区域的碱基序列。
结果,轻链可变区域的碱基序列以SEQIDNO:5的第67位~第384位表示。
另外,重链可变区域的碱基序列以SEQIDNO:10的第58位~第423位表示。
再有,基于翻译起始密码子和由Kabat等的方法确定的FR(恒定区)1的位置推定,SEQIDNO:5的第1位~第66位是轻链信号肽的碱基序列,及SEQIDNO:10的第1位~第57位是重链的信号肽的碱基序列。
接下来,从得到的碱基序列推定轻链及重链的可变区域的氨基酸序列,根据Kabat等的方法鉴定CDR区域。
结果,轻链的可变区域的氨基酸序列以SEQIDNO:6的第23位~第128位表示。其中,SEQIDNO:6的第1位~第22位是轻链信号肽的氨基酸序列。
另外确认,在轻链可变区域可变区域的氨基酸序列之中,CDR1由RASSSVSYMH(SEQIDNO:2)所示,CDR2由ATSNLAS(SEQIDNO:3)所示,CDR3由QQWSSNPWT(SEQIDNO:4)所示。
另外,重链的可变区域的氨基酸序列以SEQIDNO:11的第20位~第141位表示。其中,SEQIDNO:11的第1位~第19位是重链信号肽的氨基酸序列。
另外确认,重链可变区域的氨基酸序列之中,CDR1由GYNMN(SEQIDNO:7)所示,CDR2由NINPYYGSTSYNQKFKG(SEQIDNO:8)所示,CDR3由SPYYSNYWRYFDY(SEQIDNO:9)所示。
Claims (13)
1.单克隆抗体或其抗原结合片段,
其与由SSVLYGGPPSAA(SEQIDNO:1)所示的氨基酸序列构成的肽或该肽和药学上可容许的载体的结合体结合,且
其与选自下列的至少一种核心组蛋白结合:组蛋白H2A、H2B、H3及H4,
所述单克隆抗体或其抗原结合片段包含:
轻链可变区域,所述轻链可变区域包含:
由RASSSVSYMH(SEQIDNO:2)所示的氨基酸序列构成的CDR1、
由ATSNLAS(SEQIDNO:3)所示的氨基酸序列构成的CDR2、及
由QQWSSNPWT(SEQIDNO:4)所示的氨基酸序列构成的CDR3,以及
重链可变区域,所述重链可变区域包含:
由GYNMN(SEQIDNO:7)所示的氨基酸序列构成的CDR1、
由NINPYYGSTSYNQKFKG(SEQIDNO:8)所示的氨基酸序列构成的CDR2、及
由SPYYSNYWRYFDY(SEQIDNO:9)所示的氨基酸序列构成的CDR3。
2.权利要求1所述的单克隆抗体或其抗原结合片段,其针对由SSVLYGGPPSAA(SEQIDNO:1)所示的氨基酸序列构成的肽或该肽和药学上可容许的载体的结合体。
3.权利要求1或2所述的单克隆抗体或其抗原结合片段,其中上述单克隆抗体或其抗原结合片段的轻链可变区域由SEQIDNO:6的第23位~第128位所示的氨基酸序列构成。
4.权利要求1或2所述的单克隆抗体或其抗原结合片段,其中上述单克隆抗体或其抗原结合片段的重链可变区域由SEQIDNO:11的第20位~第141位所示的氨基酸序列构成。
5.权利要求1或2所述的单克隆抗体或其抗原结合片段,其下调ATP合成酶活性。
6.权利要求1或2所述的单克隆抗体或其抗原结合片段,其中上述单克隆抗体是嵌合抗体、人源化抗体、或者人抗体。
7.权利要求1或2所述的单克隆抗体或其抗原结合片段,其中上述药学上可容许的载体是钥孔青贝血蓝蛋白、卵白蛋白或牛血清白蛋白。
8.权利要求1或2所述的单克隆抗体或其抗原结合片段,其由以保藏号NITEBP-972保藏的杂交瘤小鼠-小鼠杂交瘤SSV-C93-3产生。
9.权利要求1或2所述的单克隆抗体或其抗原结合片段,其中上述抗原结合片段是Fab、Fab’、(Fab’)2、Fv或scFv。
10.杂交瘤,其产生权利要求1~9之任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段。
11.权利要求10所述的杂交瘤,其是以保藏号NITEBP-972保藏的杂交瘤小鼠-小鼠杂交瘤SSV-C93-3。
12.权利要求1~9之任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段用于制造免疫抑制剂的用途。
13.权利要求1~9之任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段用于制造抑制移植排斥或降低其发生风险中使用的医药组合物的用途。
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