KR20240032857A - 암- 또는 항생제-유도된 디스바이오시스를 진단하는 방법 및 면역요법에 의한 암 치료를 개선시키기 위한 그의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 항암 면역요법 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 암 치료의 효능에서 MAdCAM-1/α4β7 축 장내 미생물총의 역할에 관한 것이며, 환자가 암 치료, 더 정확하게는 면역-종양학 (I-O) 요법, 예컨대 면역 체크포인트 차단제 PD1, PD-L1 또는 PD-L2에 대한 항체를 단독으로 또는 CTLA4 및/또는 화학요법과 함께 투여하는 것을 포함하는 치료로부터 이익을 얻을 가능성이 있는지 결정하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 이를 필요로 하는 환자에서 이러한 치료의 효능을 개선시키는 방법을 제공한다.

Description

암- 또는 항생제-유도된 디스바이오시스를 진단하는 방법 및 면역요법에 의한 암 치료를 개선시키기 위한 그의 용도

본 발명은 항암 면역요법 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 암 치료의 효능에서 장내 미생물총의 MAdCAM-1/α4β7 축의 역할에 관한 것이며, 환자가 암 치료, 더 정확하게는 면역-종양학 (I-O) 요법, 예컨대 면역 체크포인트 차단제 PD1, PD-L1 또는 PD-L2에 대한 항체를 단독으로 또는 CTLA4와 함께 투여하는 것을 포함하는 치료로부터 이익을 얻을 가능성이 있는지 결정하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 이를 필요로 하는 환자에서 이러한 치료의 효능을 개선시키는 방법을 제공한다.

지난 10년 동안, 장내 마이크로바이옴은 다양한 진행성 악성종양에 걸쳐 면역 체크포인트 차단에 대한 일차 저항성에서 장내 디스바이오시스의 역할에 대한 설득력 있는 증거를 통해 면역-종양학의 진화와 관련하여 많은 주목을 받아 왔다. 이러한 주장은 병기 III 및 IV 폐암, 신장암, 방광암 및 흑색종에서 항-PD-1/항-PD L-1 항체 (Ab)의 임상 결과에서 광범위 스펙트럼 항생제의 해로운 영향을 지적하는 수많은 역학적 연구에 의해 뒷받침되었다. 주목할 점은 장 생태계의 감소된 풍부도는 T 세포 침윤물에서 불량한 종양 미세환경과 연관되어 있다는 것이다.

치료 실패에 있어서 장내 디스바이오시스의 잠재적인 기여에 대한 증가된 인식은 많은 조사관들이 면역요법에 대한 저항성과 연관된 메타게노믹스-기반 장 청사진을 설명하도록 하였다. 그러나, 암-연관된 디스바이오시스가 종양형성 프로세스보다 어느 정도 선행하며, 따라서 신생물 발생과 원인이 연관되어 있는지, 아니면 단순히 직접적인 결과인지는 아직 알려지지 않았다.

β7 인테그린-함유 이종이량체는 백혈구가 장으로 귀소하고 상피 표면에 체류하는데 중심적인 역할을 한다. β7 인테그린 서브유닛은 α4 (CD49d) 인테그린 서브유닛과 이종이량체를 형성하여 α4β7 인테그린 ("림프구 파이어 패치 부착 분자-1" (LPAM-1)이라고도 함)을 초래할 수 있다. 카운터-수용체 점막 어드레신 세포 부착 분자-1 (MAdCAM-1)과의 상호작용을 통해, α4β7 인테그린은 혈관 내피 장벽을 가로지르는 순환으로부터 장-연관된 이차 림프상 조직 (GALT) 또는 장 고유판 (LP)으로의 림프구 부착 및 누출을 매개한다. 막횡단 부착 분자 MAdCAM-1은 LP 세정맥 및 GALT 고내피 세정맥 (HEV)에서 구성적으로 발현되며, 전염증성 시토카인에 의해 유도가능하다 (Briskin et al., 1997; Gorfu et al., 2009; Ogawa et al., 2005). CD103+ 수지상 세포를 발현하는 레티노산 (RA)은 GALT에서 α4β7 인테그린 및 CCR9 수용체의 발현을 제어하여 MAdCAM-1에 결합하고 장 CCR9 리간드인 CCL25를 통해 림프구의 장 점막으로의 귀소를 가능하게 한다. 순환으로부터 장으로의 염증성 β7+ T 세포의 유입 및 혈관외유출을 방지함으로써, α4β7 또는 MAdCAM-1을 표적화하는 항체는 동물 모델 및 염증성 장 질환을 앓고 있는 환자에서 결장염의 중증도를 유의하게 감소시켰다 (Hassan-Zahraee et al., 2018; Reinisch et al., 2021). 장 상피 장벽 무결성을 보장하기 위해 장 Treg 및 TH17 세포의 조절 기능을 유지하는데 장내 미생물총이 수행하는 역할에 대한 인식이 커지고 있다 (Littman and Rudensky, 2010; Pandiyan et al., 2019).

장에서의 정액 항상성 역할 외에, TH17은 또한 장외 염증성 병변을 제어한다 (Krebs et al., 2016; Lee et al., 2011a; Magnuson et al., 2015; Morton et al., 2014; Wu et al., 2010). 중요하게는, TH17 및 이의 계통-관련된 FoxP3⁺ 조절 세포는 만성 발암 과정에서 유도된 염증 동안 관용성을 회복함으로써 항종양 면역감시를 둔화시킨다 (Cochaud et al., 2013; Fridman et al., 2012; Guery and Hugues, 2015; Langowski et al., 2006; Young, 2016). RORγt 발현은 장내 공생균에 의해 유도되는 인간 및 마우스에서 표현형적으로 안정적인 종양-침윤 Treg 집단을 식별하였다 (Sefik et al., 2015). 조건부 RORγt 녹아웃 마우스는 수지상 세포와 관련된 간접적인 메커니즘을 통해 감소된 종양 발생률 또는 폴립 형성을 나타내었다 (Blatner et al., 2012; Rizzo et al., 2018).

면역 체크포인트 억제제 (ICI)는 종양 면역감시를 복구하고, 여러 조직학적 유형의 암의 임상 관리를 위한 치료 표준이 되었다 (Brahmer et al., 2015; Robert et al., 2011). ICI에 대한 일차 저항성은 주로 낮은 종양 돌연변이 부담 및 종양 세포의 불량한 내인성 항원성 (Riaz et al., 2016; Rizvi et al., 2015), 결함있는 항원 제시 (Spranger et al., 2015), 종양내 T 세포 소진 (Smyth et al., 2016), 인터페론-γ (IFNγ) 신호전달 경로에서의 게놈 결함 (Gao et al., 2016), CSF1-의존적 종양 연관 대식세포 (Neubert et al., 2018), 및 면역저해 대사 단서 (Smyth et al., 2016)에 기인하였다. 또한, 여러 연구는 이탈된 장내 마이크로바이옴 레퍼토리가 ICI 효능에 부정적인 영향을 미친다는 것을 나타내었으며, 이는 암-면역 설정점에 영향을 미치는 공생균의 결정적인 중요성을 시사한다 (Chen and Mellman, 2017). 환자 생존에 대한 항생제 (ATB)의 영향을 분석하는 후향적 및 전향적 연구는 면역 체크포인트 차단 동안 임상 결과에 대한 부정적인 예측 영향을 밝혔다 (Elkrief et al., 2019b; Mohiuddin et al., 2021; Routy et al., 2017; Tinsley et al., 2019; Derosa et al. 2022). 메타-분석은 ATB 섭취가 항-PD1/PDL-1 Ab의 처음 전신 투여 (동안보다는) 전에 투여될 때 임상 결과에 더 해롭다는 것을 밝혔으며, 이는 직접적인 의원성 효과보다는 ATB 과정 후 재집락화가 해로울 수 있음을 시사한다 (Derosa et al., 2021). 실제로, ATB-치료 환자는 별개의 종 (예컨대 훈가텔라 하테와이이(Hungatella hathewayi)에 의해 집락화되는 경향이 있었다 (Derosa et al. 2022). 이들 역학적 발견은 ATB가 장 생태계의 조성에 영향을 미침으로써 장내 항상성 조절 T 세포 서브세트 (38)의 장/종양 트래픽킹에 영향을 미침으로써 종양내 이펙터와 조절 T 세포 사이의 평형을 기울일 수 있으며, 이에 의해 암 면역저해를 악화시킬 수 있다는 가설로 이어졌다.

최근, 본 발명자들은 ATB 섭취가 항-PD1/PDL-1 Ab의 처음 전신 투여 (동안보다는) 전에 투여될 때 임상 결과에 더 해롭다는 것을 밝힌 메타-분석을 수행하였으며, 이는 직접적인 의원성 효과보다는 ATB 과정 후 재집락화가 해로울 수 있음을 시사한다 (Derosa et al., Cancer Discovery, 2021).

이어지는 실험 파트에서, 본 발명자들은 이러한 가설을 확인하고 장내 미생물총이 여러 유형의 암의 진화 및 면역요법에 대한 환자의 반응에 원위 영향을 미치는 경로를 제시한다.

실제로, 본 발명자들은 ATB-유도된 디스바이오시스 (Routy et al., 2018; Vetizou et al., 2015)가 점막 어드레신 세포 부착 분자-1 (MAdCAM-1)과 장친화성 T 세포에 의해 발현된 수용체 α4β7 사이의 상호작용의 파괴를 초래한다는 것을 제시하였다.

ATB 과정이 중단되면, 엔테로클로스터(Enterocloster) 신규 속의 박테리아로부터 선택된 종 (예컨대 엔테로클로스터 클로스트리디오포르미스 신규 조합 (Haas and Blanchard, 2020), 이전에 클로스트리디아 강의 박테리아로 분류됨)은 회장 점막 어드레신 세포 부착 분자-1 (madcam1) 유전자 및 회장 고유판 및 고내피 세정맥 상의 세포 표면 단백질 발현을 인계받아 하향조절한다. MAdCAM-1의 손실은 장내 귀소 α4β7⁺ TH17 및 RORγt⁺Treg CD4⁺T 세포의 종양층으로의 탈출을 유발하여, 암 미세환경을 관용하고 PD-1 차단에 대한 저항성을 최고조에 이르게 한다.

본 발명은 이들 결과에 기초하고, 먼저 혈청 또는 회장 및/또는 장내 온코마이크로바이옴 시그니처 (GOMS)에서 MAdCAM의 하향조절에 기초하여, 암을 갖는 개체가 또한 암- 또는 항생제-연관된 디스바이오시스를 갖는지 여부를 시험관내 평가하는 방법에 관한 것이다. 이러한 방법은 또한 환자에서 미생물총-중심 중재 (MCI)의 효과를 추적조사하는데 사용될 수 있다.

이러한 암- 및/또는 ATB-관련된 디스바이오시스를 진단하는 것은 대상체가 특히 면역 체크포인트 억제제 (ICI) 또는 또 다른 면역-종양학 (I-O) 요법을 사용한 치료를 받기 전에 보상성 미생물총-중심 중재 (MCI)를 필요로 함을 나타낸다.

I-O 요법에 대한 민감성을 회복시키기 위한, 경구용 반코마이신 항생제, 엔테로클로스터 신규 속 클레이드의 박테리아를 사멸시킬 수 있는 파지 및 희귀-절단 엔도뉴클레아제, 악케르만시아(Akkermansia) 종 및/또는 악케르만시아 무시니필라(Akkermansia muciniphila), 가능하게는 다른 유익한 박테리아와 혼합된 것, 레티노산, 분변 미생물 이식, 및 이들의 혼합물을 포함하는 이러한 MCI의 용도가 또한 본 발명의 일부이다.

본 발명은 또한 (i) 항-PD1 또는 항-PDL1 항체 및 (ii) 항-IL-17A 또는 항-IL-17R 항체 및/또는 재조합 IL-7을 사용한, 혈청 가용성 MAdCAM의 낮은 수준을 갖는 암 환자를 위한 조합된 요법에 관한 것이다.

본 발명은 또한 고유판의 내피 세포에서 MAdCAM-1 발현 수준을 정규화할 수 있는 작용제를 식별하기 위한 스크리닝 방법에 관한 것이다.

도 1. 광범위 스펙트럼 항생제 (ATB)는 회장 혈관계에서 MADCAM-1 발현을 하향조절한다.
A-D. 연속적인 광범위 스펙트럼 항생제 (ATB: 암피실린, 콜리스틴, 스트렙토마이신) 후 또는 ATB 중단 후 4 내지 7일 자발적 재집락화 (ATB_RECO) 후 C57BL/6J 마우스에서 회장 (A-D) 또는 결장 (A) 조직의 RT-PCR (A), LP 세정맥 (상부 현미경 사진) 및 고내피 세정맥 (HEV, 하부 현미경 사진)에서 MAdCAM-1의 면역조직화학 염색 (B), LP의 CD45^- 세포에 대한 유동 세포계측법 게이팅 (C) 또는 ELISA (D)를 사용하여 수득된 Madcam1 유전자 산물의 상대적 전사 (A) 및 단백질 (B-D) 수준. 각 도트는 하나의 회장 또는 결장을 나타낸다. E-F. 경구용 반코마이신 (E) 또는 광범위 스펙트럼 ATB로 8일 동안 치료된 후, 이어서 4-7일 동안 재집락화 (ATB_RECO) (F)하고, 이어서 7일 후 희생되기 전에 1회 엔테로클로스터 클로스트리디오포르미스로 위관영양으로 보충한 마우스의 회장 점막에서 상대적 madcam1 유전자 발현의 정량적 RT-PCR. 각 그래프는 유사한 결과를 산출하는 2-3마리 중 대표적인 실험 (5-6마리의 마우스/그룹 포함)을 도시한다. 패널 A 또는 E 좌측 패널은 2개의 실험 데이터를 풀링하였다. G. E.와 동일하지만 x 축에 정렬된 박테리아 종을 사용하여 SPF 조건 (ATB 조건화 없음)에서 사육된 C57BL/6J 마우스에서 경구 위관영양을 수행하였다. H. 좌측 패널: 나이브 특이적-병원체 없는 (SPF) 마우스 그룹 (log10 축)에서 정규화된 회장 Madcam1 유전자 발현에 대한 진단 (PD-1 차단 전)에서 NSCLC 환자로부터의 분변을 사용하여 3일-ATB 치료된 수용자 마우스에서 분변 미생물총 이식 (FMT)의 영향. 각 실험은 상이한 FMT 공여자를 사용하였고 5-6마리의 동물/그룹을 포함하였다. 각 도트는 하나의 회장을 나타낸다. 우측 패널: 높은 유병률 >25% 및 임상적 관련성을 갖는 박테리아를 선택하는, 공여자 분변의 분류학적 조성의 비감독된 계층적 클러스터링 (샷건 MG 시퀀싱을 사용하여 정의됨). I. 연속 ATB 동안 또는 ATB_RECO 단계에서 회장 고유판 CD4⁺ T 세포 서브세트 (α4β7⁺ vs CD25⁺ FoxP3⁺ Treg vs RORγt⁺ CD4⁺ (T_H17) 세포)의 유동 세포계측법 분석을 수행하는 A-D와 동일한 실험 (각 도트는 하나의 회장을 나타냄). 유사한 결과를 산출하는 2개의 대표적인 Facs 분석이 도시되어 있다. 또한, 유사한 회장 점막 조직에 대한 qPCR-관련된 데이터에 대해서는 도 5H-I를 참조한다. J. A.와 동일하지만, ATB 조건화 없이 Madcam-1 유전자 결핍 마우스 (회장 MADCAM-1 발현 수준에 영향을 미치지 않는 항-PD1 Ab로 치료되거나 치료되지 않음, 제시되지 않음)에서. 각 도트는 하나의 회장의 qPCR 데이터를 나타낸다. K. 9명의 대조군 (ATB 없음) 환자 및 7명의 ATB-치료된 환자에서 내시경검사 중재 동안 수집된 장 생검에서 인간 MADCAM-1, FOXP3, RORC 유전자의 RT-PCR-기반 전사 수준 (표 1). 각 도트는 회장, 결장 및 맹장으로부터의 하나의 생검을 나타내며, 단일 환자는 1 내지 3회 나타낸다. ANOVA 통계 분석 (크루스칼-왈리스(Kruskal-wallis) 테스트): *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001.

표 1. FMT를 공여하는 환자의 설명.
도 2. ATB 후 박테리아 재집락화에 의해 유도된 종양층으로의 장친화성 IL-17A 및 IL-22 분비- α4β7 ⁺ CD4 ⁺ T 및 Treg 세포의 이동.
A-B. 스키마에 따라 조명 후 카에데(Kaede) 마우스에서 평가된 이차 림프상 장기 (장간막 LN, 비장, tdLN: 종양 배액 LN) (A, 좌측 패널)에서 또는 야생형 마우스에서 mLN으로의 CFSE 주사 (B, 좌측 패널)에 의해 광전환된 (A) 또는 CFSE 라벨링된 (B) 장-유래 세포의 유동 세포계측법 결정. 좌측 패널은 실험 설정의 그래픽 스키마를 도시하고, 우측 패널은 다양한 이차 림프상 장기에서 조직 UV-A 조명 또는 mLN에서 CFSE 주사 후 24시간에 색상 구배 (A) 또는 CFSE 라벨링된 vs 상주 (비라벨링된) 세포 (B)를 사용하여 선으로 자세히 설명된 각 서브세트에서 광전환된 (PC) 대 상주 비-광전환된 (NPC) 세포의 상대적 축적 (log2 배수 변화 (FC))을 제시한다. 통계: 벤자미니-호치버그 방법에 의해 조정된 p-값을 사용한 만-위트니 테스트, *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001. C. 카에데 (좌측) 또는 mLN- CFSE 주사된 WT 마우스에서 tdLN (중간 패널)을 향한 또는 대측성 LN (우측 패널)을 향한 장-유래된 세포의 재순환에 대한 αMAdCAM-1 mAb를 사용한 MAdCAM-1의 중화 효과. 각 도트는 1마리의 마우스를 나타낸다. 둘 중 대표적인 실험이 도시되어 있으며, 유사한 결론에 도달한다. D. 5마리의 MCA205 종양-보유 동물에서 mLN으로부터 세포-분류된 α4β7^높음 대 α4β7^neg CD4⁺ 림프구의 RNA 시퀀싱에서 차등 유전자 전사를 도시하는 화산 플롯. 5마리의 마우스에 대해 각 세포 유형에서 발현된 각 유전자 산물에 대해 산출하여 화산 플롯을 생성하였다: i) α4β7^높음 대 α4β7^neg CD4⁺ 림프구에서 정규화 후 전사체의 평균 상대적 존재비 중 배수 비율 (FR)의 log2 (x 축); ii) 절대 값의 상대적 존재비에 대해 계산된 만-위트니 U 테스트로부터 파생된 p-값의 co-log10 (y 축). 검정색 및 회색 도트는 유의한 것으로 간주되지만 (p<0.05), 뒷면 도트는 그렇지 않다 (p>0.05). E. ATB 조건화 (암피실린, 콜리스틴, 스트렙토마이신) 후 ATB_RECO 단계 동안 tdLN에 도달하는 CFSE⁺ (mLN으로부터 유래됨, 회색 도트) 또는 CFSE^- 세포 (tdLN 상주 세포, 검정색 도트) 내의 IL-17A⁺ 분비 α4β7⁺ Treg (중간 패널) 또는 α4β7⁺ Tconv (우측 패널) CD4⁺ T 세포의 실험 설정 (좌측 패널) 및 유동 세포계측법 평가. 각 그래프는 2개의 독립적이고 풀링된 실험 (5-6마리의 마우스/그룹 포함)을 도시한다. F. mLN에서 CFSE 주사 후 MCA205 보유 WT 대 Madcam1 ^-/- 마우스 (ATB로 치료되지 않음)에서 tdLN 또는 대측성 LN에 도달하는 CFSE⁺ Treg 세포의 유동 세포계측법 결정. 각 도트는 1마리의 마우스를 나타내며, 유사한 결과를 산출하는 둘 중 대표적인 실험이 도시되어 있다. G. E.와 마찬가지로, 항-MADCAM-1 Ab로 치료되거나 치료되지 않은 카에데 마우스, 여기서 유동 세포계측법은 CD25 및 CD127에 대한 막 염색을 사용하여 Treg를 식별할 수 있다. H. 엔테로클로스터 종에서 강제된 경구 위관영양이 있는 또는 없는 장친화성 CD4⁺ T 세포의 재순환에 대한 ATB 과정을 중단한 후 박테리아 재집락화의 단기간 (4-7일) 효과를 평가하기 위한 실험 설정 (좌측 패널). ATB_RECO 단계 동안 tdLN에 도달하는 PC (mLN으로부터 유래됨) 또는 NPC 세포 (tdLN 상주 세포) 내의 카에데 마우스에서 높은 수준의 CD25 (Tr17-유사, 중간 패널) 또는 TH17 conv.(우측 패널)를 발현하는 TH17 세포의 유동 세포계측법 표현형분석 (G). 각 도트는 1마리의 마우스를 나타내고, 그래프는 2개의 풀링된 실험을 도시한다. ANOVA 통계 분석 (크루스칼-왈리스 테스트) 또는 윌콕슨 매치된-쌍 부호 순위 테스트: 원시 p 값이 표시된다. I. 물 (그룹 1)로 치료되거나, 7일 동안 ATB로 치료되거나, 지속적으로 ATB로 치료되거나 (그룹 2), 또는 4일 이후 ATB 치료가 중단되거나 (ATB_RECO) (그룹 3) 또는 4일 동안 이. 클로스트리디오포르미스로 경구 위관영양에 의해 대체된 (그룹 4) MCA205 종양 보유자에서 tdLN으로 이동하는 CFSE⁺ mLN -유래된 CD4⁺ T 세포의 단일 세포 전사체학 분석 (실험은 5마리의 동물/그룹을 함유함). 비감독된 클러스터링에 의한 플레이트-기반 전장 단일-세포 RNA-seq 데이터에서 이동하는 CFSE⁺ CD4⁺ T 세포의 4개 서브세트에서 UMAP 유전자 패턴은 4개의 마우스 그룹을 오버레이한다 (I, 좌측 패널). Log2 p 값에 따라 각 특이적 세포 유형과 연관된 차등 유전자 발현 패턴의 화산 플롯, 및 나머지 3개의 하위유형 (Treg (I, 중간 패널) 및 증식 세포 (I, 우측 패널)과 비교하여 각 하위유형의 비율에 대한 배수 비율. 4개 실험 그룹 각각에 따른 세포 유형 유전자 패턴에 대해서는 도 7을 참조한다.
도 3. MAdCAM-1/α4β7 축의 파괴는 마우스에서 αPD-1-기반 면역요법에 대한 부적응 반응을 유도하였다.
A. 야생형 (wt) 대 Itgb7 또는 Madcam1 유전자 결핍 마우스에 이식된 피하 MCA205 (C57BL/6J의 동계)의 종양 성장 동역학. 2개의 치료 그룹 (항-PD1 대 isoCtl Ab)에서 시간 경과에 따른 5-6마리의 마우스/그룹 중 종양 크기의 평균±SEM. B-D. 항-PD1 치료용 항체 (또는 iso-Ctl Ab)를 받는 동안 이소타입 대조군, 항-α4β7 mAb 또는 -αMAdCAM-1 mAb로 치료된 동물에서 피하 MCA205 (B), 유방 4T1 (BALB/c의 동계, C) 및 폐-동소이식 TC1-luc (C57BL/6J의 동계, D) 종양의 이식 후 종양 성장 동역학 또는 종양 발광. 폐-동소이식 TC1 종양의 경우, IVIS, 이미지화 시스템을 사용한 전신 발광을 사용하여 폐에서 루시퍼라제-발현 TC1 동역학을 정량화하였다. 이소타입 대조군 mAb, αα4β7 mAb 또는 αMAdCAM-1 mAb를 사용한 PD-1 차단 전과 후 사이의 비율을 계산하였다. E. 야생형 (wt) 대 Madcam1 유전자 결핍 마우스에서 CD4+ T 세포 비장세포 및 종양 침윤 림프구 (TIL) 상의 α4β7 발현의 유동 세포계측법 분석. 각 도트는 1마리의 마우스를 나타낸다. 그래프는 5마리의 마우스/그룹의 2개의 독립적 실험을 풀링하였다. 스튜던트 t 테스트. F. 중화 αMAdCAM-1 mAb 또는 이소타입 대조군 mAb로 치료된 마우스에서 다양한 면역 α4β7⁺ CD4⁺ T 세포 서브세트 (확립된 s.c. MCA205로부터 해리된 TIL의 유동 세포계측법 분석에 의해 결정됨)의 상대적 백분율을 제시하는 히트맵에 표시된 비감독된 계층적 클러스터링. G-I. 야생형 (wt) 대 Madcam1 유전자 결핍 마우스 (G)에서 또는 항-PD1 Ab로 치료된 또는 치료되지 않은 ATB 조건화 레지멘 ((ATB 중단 후 4일 (ATB_RECO-S) 또는 ATB 중단 후 12일 (ATB_RECO-L))을 받은 wt MCA205 종양 보유 마우스 (H,I)에서 α4β7+Treg TIL에서 Rorγt 발현의 세포내 유동 세포계측법 분석. 각 도트는 1마리의 마우스를 나타낸다. 유사한 결과를 산출하고 5마리의 마우스/그룹을 포함하는 2개의 독립적 실험 중 대표적인 실험이 도시되어 있다 (G, I). 스튜던트 t 테스트 (G). J. PD-1 차단 설정에서 이소타입 대조군 mAb, αα4β7 mAb 또는 αMAdCAM-1 mAb로 치료된 s.c. MCA205 종양-보유 마우스에서 CCR5⁺ CD8⁺ 이펙터 T 세포에 대한 종양 침윤 세포 (TIL)의 유동 세포계측법 분석. K. 면역요법과 병행하여 αIL-17A mAb (ip)를 사용한 IL-17A의 전신 중화 및 ATB_RECO 단계 동안 αPD-1 mAb를 사용한 요법 후 희생된 s.c. 4T1 WT (좌측) 또는 4T1 IL-22Rα1 KO (우측) 종양 세포주의 종양 크기 (평균±SEM)의 실험 설정 (좌측 패널) 및 횡단적 연구의 스키마. 각 실험에서, ATB_RECO 단계 동안 3일마다 4개의 αPD-1 복강내 (i.p.) 주사를 투여하였다. 각 실험은 6마리의 마우스/그룹을 포함하였다. 2-3 중 대표적인 실험이 도시되어 있다. ANOVA 통계 분석 (크루스칼-왈리스 테스트): *원시 p 값이 표시된다.
도 4. 혈청 가용성 MADCAM-1은 NSCLC 환자에서 PD1 차단에 대한 임상적 이익의 예측자 및 장내 디스바이오시스에 대한 프록시이다.
A. 65마리의 MCA205 종양 보유 마우스에서 RT-PCR-결정된 회장 Madcam1 유전자 발현 수준과 혈청 가용성 MADCAM-1 (ELISA에 의해 결정됨) 사이의 스피어만(Spearman) 상관관계 (각 도트는 1마리의 동물을 나타냄). B. 건강한 지원자 (HV, n=70)의 혈청 수준과 비교하여 최근 ATB 섭취 이력 (우측 패널)에 따라 2개의 독립적 코호트 (C01, C02, 좌측 패널)에 속하는 301명의 NSCLC 환자의 가용성 MADCAM-1의 혈청 수준의 ELISA 모니터링. 각 도트는 1명의 환자의 혈청을 나타낸다. C-D. NSCLC 환자의 혈청 sMADCAM-1 수준에 따른 장내 미생물총의 분류학적 내용물의 알파 및 베타 다양성. 95명의 NSCLC 환자로 구성된 전체 집단에서 sMADCAM-1의 중앙값에 따른 샷건 MG 시퀀싱의 MGS 다양성-기반 풍부도 평가 (C) 및 두 그룹 모두에서 조성의 개체간 가변성 (D). E-F. PFS (E) 및 OS (F)에 대한 αPD-1 mAb 면역요법 (환자 설명 및 다변량 분석에 대해서는 표 5-6을 참조함)으로 치료된 병기 IV NSCLC의 2개의 독립적 (좌측 및 우측 컬럼) 코호트에서 각 코호트의 중앙값에 따라 분할된 sMADCAM-1의 혈청 수준의 예측 값의 카플란 마이어(Kaplan Meier) 생존 곡선 및 Cox 회귀 선형 분석. G. sMADCAM-1 혈청 수준 (< (낮음) 또는 > (높음) 중앙값)에 따른 MGS (유병률>10%)의 감독된 계층적 클러스터링, 다양한 파이프라인 및 알고리즘을 사용하여 좌측 컬럼의 막대 그래프에 정렬된 각 유의한 종의 상대적 존재비를 나타내는 색상 코드. H. sMADCAM-1 혈청 수준 (< (낮음) 또는 > (높음) 중앙값)에 따라 두 그룹으로 분할된 95명의 환자의 분변 물질에서 모든 MGS 종 중 이. 클로스트리디오포르미스의 상대적 존재비 (백분율). 각 도트는 하나의 분변/혈청/환자를 나타낸다. 스튜던트 t 테스트.
도 5. ATB-유도된 디스바이오시스는 장 고유판의 면역 유전자 산물의 전사 프로그램에 영향을 미친다.
A. 조직 용해물의 ELISA (좌측 패널) 및 RT-PCR (우측 패널)에서 케모카인 (좌측 패널) 및 시토카인/전사 인자 (우측 패널) 발현 프로파일에 대한 ATB-치료된 및 치료되지 않은 (물) 회장, 결장, 뿐만 아니라 종양층 사이의 log2 배수 변화 비율의 히트맵. 통계: 벤자미니-호치버그 방법에 의해 조정된 p-값을 사용한 만-위트니 테스트, *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001. B. ATB-치료된 마우스에서 IHC에 의한 회장 HEV 상의 CD31 발현의 평가. C. 회장 조직 (좌측) 또는 장간막 림프절 (우측)에서 Madcam1 유전자의 상대적 전사 수준에 대한 ATB_RECO 후 또는 다양한 항생제 레지멘을 사용한 7일 조건화의 영향의 RT-PCR 평가. 연속적인 (c.), AmpiC: c. 암피실린, ColistC: c. 콜리스틴, StreptoC: c. 스트렙토마이신, VancoC : c. 반코마이신, ErythrC : c. 에리트로마이신. 각 도트는 하나의 회장을 나타낸다. 그래프는 5마리의 마우스/그룹을 포함하는 2-3개의 실험을 수집하였다. D-E. 파이어 패치 (PP) (D) 또는 다양한 림프절 (LN) (mLN: 장간막 LN, sk: 피부 LN, td: 종양 배액 LN) (E)에서 Madcam1(D, E) 및 VCAM1 (E) 유전자의 상대적 발현의 RT-PCR 평가. 각 도트는 하나의 회장을 나타낸다. 그래프는 5마리의 마우스/그룹을 포함하는 2개의 실험을 수집하였다. F. 호기성 및 혐기성 조건에서 다양한 ATB 레지멘 (C 참조)으로 치료하고 중단 후 4일차에 희생된 마우스로부터 수확된 회장 내용물의 컬처로믹스. G. 각 조건에서 배양된 종의 질량 분광법에 의한 정성적 식별. H-I. ATB로 치료되거나 치료되지 않은 마우스의 회장 조직에서 뮤린 Foxp3, RORc 및 IL17a 유전자의 RT-PCR 평가 (H) 및 마우스에서 회장 Madcam1과 Rorc 또는 Foxp3 발현 수준 사이의 스피어만 상관관계 (I). 각 도트는 1마리의 동물을 나타낸다. 3개의 독립적 실험으로부터의 연접된 데이터. J. 9명의 대조군 (ATB 없음) 환자 및 7명의 ATB-치료된 환자 (표 1)에서 내시경검사 중재 동안 수집된 장 생검에서 인간 FOXP3 ( 좌측 ), 및 IL-17A ( 우측 ) 및 Madcam-1 유전자의 RT-PCR-기반 전사 수준 사이의 스피어만 상관관계. 각 도트는 회장, 결장 및 맹장으로부터의 하나의 생검을 나타내며, 단일 환자는 1 내지 3회 표시된다. ANOVA 통계 분석 (크루스칼-왈리스 테스트): *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001.
도 6. 다양한 구획에서 장-유래 세포의 프로파일링.
A. 종양-보유 카에데 마우스에서 장 (회장, 맹장, mLN)의 UV-A 조명 실험 설정 및 tdLN (상부 패널) 및 mLN (하부 패널)에서 광전환된 세포 (PC)의 유동 세포계측법 게이팅 전략의 개략적 개요. 개복술 전, 5분 후 및 24시간 후 표적 장기의 PC 빈도 및 장 구획의 UV-A 조명이 표시된다. B. A.와 마찬가지로 24시간에 mLN, 비장, tdLN 및 종양층에서 PC 세포의 백분율이 자세히 나와 있으며, 각 도트는 1마리의 마우스를 나타낸다. 유사한 결과를 산출하는 3개의 실험 중 전형적인 실험이 도시되어 있다. C. 상이한 조직 (x 축)에서 mLN에서 CFSE 주사 후 24시간에 CFSE+ 세포의 실험 설정 (좌측 패널) 및 유동 세포계측법 결정 (각 도트는 1마리의 마우스를 나타냄). 3개의 독립적 실험으로부터의 데이터가 풀링된다. D. B.와 마찬가지로 tdLN 또는 종양층을 향한 "장" (회장+맹장+mLN) 대 회장만의 UV-A 조명 후 장친화성 세포의 동원의 모니터링 (각 도트는 1마리의 마우스를 나타냄). 유사한 결과를 산출하는 2개의 실험 중 전형적인 실험이 도시되어 있다. E-F. UV-A 조명 구역 (회장 vs "장" (회장+맹장+mLN))에 따라 카에데 마우스의 비장, tdLN 또는 종양층에서 상주 (NPC) 또는 재순환 (PC) CD4⁺ T 세포에 의해 또는 mLN에 CFSE 주사된 WT 마우스 (F)에서 장 인테그린 α4β7 발현의 유동 세포계측법 평가. G-H. ATB로 치료되거나 치료되지 않고 피하 MCA205를 보유하고 24시간 전에 mLN에 CFSE 주사를 받은 동물에서 CFSE 라벨링에 의해 추적된 tdLN에서 상이한 CD4+ Treg 세포 유형 (α4β7, IL-17, IL-22의 발현에 따라 다름)의 유동 세포계측법 평가. ANOVA 통계 분석 (크루스칼-왈리스 테스트): *주석이 달린 원시 p 값.
도 7. 재집락화에 의해 유도된 유전자 발현 프로파일링.
A. scRNA seq 데이터 수집을 위한 실험 설계. 단일 세포 전사체학은 5마리의 MCA205 종양-보유 동물을 함유하는 4개의 실험 그룹의 마우스 (물, 연속 ATB, ATB_RECO, 이. 클로스트리디포르미스)에서 mLN에 CFSE 접종 후 24시간에 tdLN으로부터 수확된 CFSE+ CD4+ T 세포에 대해 수행되었다. B. 품질 제어 및 시퀀싱 후 각 조건에 대해 tdLN에서 회수된 CFSE+ 세포의 절대 수. C. 그룹 ATB_RECO 대 물 그룹 (대조군)에서 Treg 서브세트 세포에 속하는 CFSE+ CD4+ T 세포의 RNA 시퀀싱에서 차등 유전자 전사를 도시하는 화산 플롯. 5마리의 마우스에 대해 각 세포 유형에서 발현된 각 유전자 산물에 대해 산출하여 화산 플롯을 생성하였다: i) 그룹 3 대 그룹 1에서 정규화 후 전사체의 평균 상대적 존재비 중 배수 비율 (FR)의 log2 (x 축); ii) 절대 값의 상대적 존재비에 대해 계산된 만-위트니 U 테스트로부터 파생된 p-값의 co-log10 (y 축). 파란색 (하향조절된 유전자 산물) 및 빨간색 (상향조절된 유전자 산물) 도트는 유의한 것으로 간주되지만 (p<0.05), 뒷면 도트는 그렇지 않다 (p>0.05). D. C와 동일하지만 ATB_RECO (그룹 3, 좌측 패널) 또는 ATB 이. 클로스트리디오포르미스 (그룹 4) 내의 Treg 대 다른 T 세포 서브세트의 유전자 전사체를 비교한다. E. D와 동일하지만 음성 대조군 그룹 (물, 그룹 1, 좌측 패널) 및 ATB_RECO (그룹 3, 우측 패널) 내의 증식성 T 세포 서브세트 대 다른 T 세포 서브세트의 유전자 전사체를 비교한다. F. E와 동일하지만 좌측 패널에서 두 그룹의 마우스 (물, 그룹 1 대 ATB_RECO (그룹 3)의 클러스터 1 (UMAP, 도 2I)에 속하는 세포의 유전자 전사체를 비교하고, 이어서 이들 클러스터 1 세포 서브세트의 전사 프로파일을 ATB_RECO (그룹 3)의 다른 클러스터와 비교한다 (우측 패널). G. E와 동일하지만 두 그룹의 마우스 (물, 그룹 1 대 ATB_RECO (그룹 3)에서 클러스터 0 (UMAP, 도 2I)에 속하는 세포의 유전자 전사체를 비교한다.
도 8. αPD-1 mAb는 ATB-유도된 디스바이오시스에 의해 야기되는 종양 병변을 향한 장친화성 α4β7 ⁺ RORγt ⁺ T _reg 또는 IL-17A ⁺ IL-22 ⁺ T _reg 의 축적을 악화시킨다.
A. MCA205 종양 보유 (항-PD1 또는 이소타입 Ctl Ab-치료된) 마우스에서 회장 Madcam1과 종양 크기 사이의 스피어만 상관관계. 각 도트는 1마리의 마우스를 나타낸다. ANOVA 통계 분석 (크루스칼-왈리스 테스트): *주석이 달린 원시 p 값. B. 피하 MCA205 종양의 α4β7⁺ 또는 α4β7^- CD4⁺ TIL 분획 중에서의 RORγt⁺ Treg (T_r17)의 유동 세포계측법 평가. 각 도트는 하나의 종양 및 마우스를 나타낸다. C. 종양 보유자에서 다양한 지속시간의 ATB 간격 동안 PD1 차단의 실험 설정. D-F. mLN (D) 또는 피하 MCA205 (E) 또는 4T1 (F) 종양에서 Treg 내의 RORγt⁺ 또는 IL-17A⁺ IL-22⁺ 세포의 유동 세포계측법 평가. G. ATB 중단 및 αPD-1-기반 요법 동안 이. 클로스트리디오포르미스 또는 엘. 루테리(L. reuteri) 박테리아를 사용한 자발적 ATB_RECOL +/- 강제된 장내 집락화 후 PD1 차단에 의해 치료된 피하 (s.c.) MCA205 종양에서 IL-17A⁺ IL-22⁺ 분비 Treg (좌측) 및 α4β7⁺ Treg 세포 (우측)의 유동 세포계측법 결정. 각 도트는 유사한 결과를 산출하는 2마리 중 6마리의 마우스/그룹을 함유하는 전형적인 실험에서 희생 시 각 동물의 종양 크기를 나타낸다. 자세한 표현형에 대해서는 표 4를 참조한다. ANOVA 통계 분석 (크루스칼-왈리스 테스트): *주석이 달린 원시 p 값.
도 9. 악케르만시아 무시니필라는 회장 Madcam-1 유전자 발현을 상향조절하고 MADCAM-1-의존적 방식으로 종양층으로의 장친화성 T 세포의 재순환을 방지하였다.
A. 살아있는 또는 저온살균된 에이. 무시니필라 SGB9228 (A. muc, 좌측 패널)의 경구 위관영양로 보충되거나 보충되지 않은 PD1 불응성 NSCLC 환자로부터의 FMT (FMT NR)를 사용하여 3일 ATB로 치료되고 장 인간화된 MCA205 종양 보유 마우스에서 희생 시 종양 크기. tdLN 배액 s.c. MCA205 육종에서 CD4⁺ T 세포에 의한 α4β7 및/또는 CCR9 발현의 유동 세포계측법 평가 (중간 및 우측 패널). B. PD1 차단에 대한 반응에 대한 저온살균된 에이. 무시니필라 SGB9228의 보상 효과에 대한 항-MADCAM-1 중화 항체의 효과는 박테리아 +/- 항-MADCAM-1 Ab로 보상된 항-PD1-치료된 FMT NR 아바타 마우스에서 종양 크기 사이의 비율로 도시된다. C-D. FMT NR로 집락화되고 악케르만시아 무시니필라 (A.muc)를 사용한 경구 위관영양에 의해 보충되고 αMAdCAM-1 mAb 치료를 받거나 받지 않고 αPD-1 mAb (C)로 치료된 마우스의 tdLN에서 CD4⁺ T 및 Treg 세포에 의한 IL-17A 및 IL-22 시토카인 분비의 유동 세포계측법 평가. Tr17의 장 탈출을 방지하기 위한 저온살균된 에이. 무시니필라 SGB9228의 예방적 효과에 대한 항-MADCAM-1 중화 항체의 효과는 박테리아 +/- 항-MADCAM-1 Ab로 보상된 항-PD1-치료된 FMT NR 아바타 마우스에서 IL-17⁺IL-22⁺ Treg 또는 tdLN에 도달하는 총 CD4⁺ T 세포 사이의 비율로서 도시된다 (D). ANOVA 통계 분석 (크루스칼-왈리스 테스트) 또는 윌콕슨 매치된-쌍 부호 순위 테스트: *원시 p 값에 주석이 달린다. E. ATB-유도된 디스바이오시스의 맥락에서 회장 HEV에서 MADCAM-1 발현의 파괴가 있는 경우에 발생하는 장-프라이밍된 IL-17A⁺ IL-22⁺ RORγt⁺ α4β7⁺ Treg (T_r17) 세포의 종양 미세환경을 향한 재순환을 예시하는 그래픽 요약.
도 10. 가용성 MADCAM-1 혈청 수준은 PD-1 차단에 대한 임상적 이익의 강력한 예측자이다.
A. 4개 매듭를 갖는 제한된 입방 스플라인 (RCS)을 사용하여 표 5에 기재된 각 코호트 C01 및 C02에서 PD1 차단 및 혈청 sMADCAM-1 (ELISA에서 모니터링됨) 동안 진행 또는 사망 위험에 대한 위험 비율 (HR)을 평가하는 Cox 선형 회귀 분석. 매듭 수는 아카이케(Akaike) 정보 기준에 따라 선택되었다. 좌측 패널 (C01): N=115 NSCLC 환자, 62명 사망, 중앙값 OS= 15개월 (95%C.I: 11.2-25 mo), HR= 0.92 (95% C.I: 0.88-0.97, p=0.001). 우측 패널 (C02): N=186 NSCLC 환자, 83명 사망, 중앙값 OS= 12개월 (95%C.I: 9-17 mo), HR= 0.97 (95% C.I: 0.94-0.99, p=0.02). B. Prevalung 연구: 추적 조사 2년 이내에 폐암으로 진단될 환자 (N=9) 대 그렇지 않은 환자 (N=56 대조군)에서 폐암 발생 전 CVD 흡연자의 혈청 sMADCAM-1 수준. C. 혈청 sMADCAM-1 및 순환 α4β7+ Rorγt Treg 사이의 스피어만 상관관계. D-E. sMADCAM-1 쌍형성된 혈청 수준에 따른 NSCLC 환자의 분변의 샷건 MG 시퀀싱 및 분류학적 MGS-기반 클러스터링과 sMADCAM-1 중앙값 사이의 구분의 ANOVA 통계 분석에 기초한 분류학적 조성의 비감독된 계층적 클러스터링.
도 11. 혈청 내 sMAdCAM-1의 중앙값에 따라 212명의 RCC 환자의 로그 순위 통계 테스트를 사용한 카플란 마이어 전체 생존 곡선 및 Cox 회귀 단변량 분석. 티로신 키나제 억제제의 실패 후 항-PD1 Ab에 기초한 제2 라인 면역요법의 RCC.
도 12. 혈청 내 sMAdCAM-1의 중앙값에 따라 212명의 RCC 환자의 로그 순위 통계 테스트를 사용한 카플란 마이어 무진행 생존 곡선 및 Cox 회귀 단변량 분석. 티로신 키나제 억제제의 실패 후 항-PD1 Ab에 기초한 제2 라인 면역요법의 RCC.
도 13. 사전-치료된 제2 라인 전이성 방광암 환자에서 항-PDL-1 Ab 두르발루맙에 대한 임상적 이익을 예측하는 바이오마커 sMAdCAM-1의 효능.
A. 반응자 (엘리트 환자, PFS>5개월) 및 비반응자 (진행자 OS>6개월)에서 두르발루맙 전 기준선 및 1개월 및 4개월에 요법 동안 환자 혈청 내 sMAdCAM_1의 농도 (각 도트는 하나의 시점 및 환자를 나타내며, 각 환자는 3회 표시됨). B-C. 전체 코호트 내에서 MAdCAM_1의 중앙값에 따라 구분된 환자에서 sMAdCAM_1의 예측 값의 로그 순위 단변량 분석 및 생존 (OD, B) 및 PFS (C)의 카플란 마이어 곡선.

제1 측면에 따르면, 본 발명은 암을 갖는 개체에서 암- 또는 항생제-연관된 장내 디스바이오시스를 시험관내 진단하는 방법으로서, 상기 개체로부터의 혈청 샘플에서 가용성 MAdCAM-1을 (예를 들어, ELISA에 의해) 측정하는 것을 포함하며, 여기서 혈청 가용성 MAdCAM-1의 감소된 수준은 개체가 암- 또는 항생제-연관된 장내 디스바이오시스를 갖는다는 것을 나타내는 것인 방법에 관한 것이다.

대안적으로, 상기 방법은 환자로부터의 회장 생검에서 회장 고유판 (LP) 세정맥 또는 고내피 세정맥 (HEV)에서 MAdCAM-1의 발현을 평가함으로써 수행될 수 있으며, 여기서 LP 또는 HEV에서 MAdCAM-1 발현의 감소는 개체가 암-연관된 회장병증/디스바이오시스를 갖는다는 것을 나타낸다. 이러한 경우, MAdCAM-1의 발현은 RT-PCR에 의해 또는 ELISA 또는 유동 세포계측법 또는 생검에서 수행되는 면역조직화학을 사용하여 측정될 수 있다.

그러므로 본 발명은 암- 또는 항생제-연관된 디스바이오시스의 마커로서의 혈청 가용성 MAdCAM-1 수준의 용도로서, 여기서 혈청 가용성 MAdCAM-1의 감소된 수준은 암- 또는 항생제-연관된 디스바이오시스의 마커인 용도에 관한 것이다.

하기 실험 파트에 제시된 바와 같이, 본 발명자들은 개체의 혈청 내 가용성 MAdCAM-1 수준이 또한 면역-종양학 (I-O) 요법에 대한 저항성 또는 민감성의 마커임을 입증하였으며, 여기서 혈청 가용성 MAdCAM-1의 감소된 수준은 I-O 요법에 대한 저항성의 마커이다.

그러므로 본 발명에 따르면, 개체의 혈청 내 가용성 MAdCAM-1 수준은 개체가 면역-종양학 (I-O) 요법 (낮은 수준)에 저항할 가능성이 있는지 여부를 평가하는데 사용될 수 있다. 혈청 가용성 MAdCAM-1의 정상 (또는 상승) 수준은 임상적 이익의 마커이다.

본 명세서에서, 문구 "I-O 요법"은 면역 체크포인트 억제제 (ICI), 뿐만 아니라 CAR-T 세포, 입양 TIL 전달 및 이들의 조합을 포함한다. 본 발명의 맥락에서, "I-O 요법"은 또한 상기 I-O 작용제 중 하나 및 다른 항신생물 치료, 예컨대 화학요법을 포함하는 조합된 요법, 특히 면역 체크포인트 억제제 (ICI)와 탁산, 페메트렉시드, 시스플라틴 및/또는 옥살리플라티늄 또는 EGFR 억제제의 임의의 조합을 포함한다.

본 발명의 맥락에서, "ICI"는 항-PD1 항체 (Ab), 항-PDL-1 Ab, 항-CTLA4 Ab, 항-Lag3 Ab, 항-Tim3 Ab, 항-TIGIT Ab, 항-OX40 Ab, 항-41BB Ab, 항-VISTA Ab, PD1 및 Lag3을 표적화하는 이중특이적 항체, 뿐만 아니라 동일한 기능(들)을 발휘하는 다른 분자, 예컨대 상기 면역 체크포인트 중 임의의 것을 차단하는 비-Ab 분자를 포함한다. 특정 실시양태에 따르면, I-O 요법은 항-PD1/PDL-1 Ab, 예를 들어 PD1 또는 PDL-1을 차단하는 모노클로날 Ab를 포함한다.

치료 저항성의 특정 경우에, ICI 약물은 쓸모없을 뿐만 아니라 해로운 효과를 가져 급속한 종양 진행 (즉, 과다진행성 질환 또는 HPD)을 유발할 수 있는 것으로 제시된 바 있다. 그러므로 I-O 치료에 저항할 가능성이 있는 환자를 식별하는 것은 적어도 HPD 발병을 회피하기 위한 보상성 치료 또는 조합된 요법 없이는 이러한 환자에게 I-O 치료를 투여하지 않기로 결정하는데 매우 중요하다.

본 발명은 I-O 요법/ICI의 제1 투여 전 60일부터 투여 후 42일까지의 기간 동안 광범위 스펙트럼 항생제를 복용한 개체의 저항성 상태를 평가하는데 특히 유용하다. 실제로, 하기 실험 파트에 제시된 바와 같이, 광범위 스펙트럼 항생제는 I-O 저항성과 연관된 디스바이오시스의 위험을 증가시킨다.

상기 방법을 수행할 때, 혈청 가용성 MAdCAM-1의 수준은 미리 결정된 역치보다 낮을 때 감소된 것으로 간주된다. 이러한 역치는 예를 들어 대표적인 코호트에서의, 예컨대 암, 바람직하게는 테스트된 개체와 동일한 암을 앓고 있는 개체 코호트에서의 가용성 MAdCAM-1 수준의 중앙값일 수 있다. 더욱 더 바람직하게는, 대표적인 코호트는 테스트된 개체와 동일한 암을 앓고 있으며 동일한 치료 계획 (특히, 동일한 라인의 요법으로서, 적어도 1L vs ≥ 2L 요법의 차별화)으로 I-O 요법/ICI를 받고 있는 개체의 코호트이다. 통상의 기술자는 동일한 치료 이력을 공유하고 동일한 I-O 요법을 받은 환자 코호트에서 가용성 MAdCAM-1 수준의 중앙값을 측정함으로써 역치를 개량할 수 있다. 하기 개시된 실험 결과에서, 이러한 중앙값의 값은 화학요법과 함께 또는 없이 항-PD1/L-1 항체로 치료된 진행성 비소세포 폐암 (NSCLC) 환자에서 발견 및 검증 코호트에서 각각 177.1 ng/ml 및 233.3 ng/ml였지만 (실시예 1), 제2 라인 요법에서 니볼루맙으로 치료된 신장암을 갖는 환자의 코호트에서 88.8 ng/ml이고 (실시예 2.1), 두르발루맙으로 치료된 사전-치료된 전이성 방광을 갖는 암 환자의 코호트에서 158.8 ng/ml였다 (실시예 2.2).

대안적으로, 미리 결정된 역치는 암을 앓고 있지 않은 개체의 코호트로부터 계산될 수 있다. 예를 들어, 혈청 가용성 MAdCAM-1의 수준은 그것이 암을 앓고 있지 않은 개체의 코호트의 하위 삼분위수에 있는 경우에 감소된 것으로 간주될 수 있다.

상기 방법은 면역요법 단독으로 또는 화학요법 또는 티로신 키나제 억제제 또는 호르몬요법 (안드로겐 또는 에스트로겐 결핍 또는 LHRH 길항제)과 조합하여 치료할 수 있는 암을 앓고 있는 환자에게 특히 흥미롭다.

이러한 암의 예는 유방암, 만성 골수단구성 백혈병 (CMML), 결장직장암, 신장암, 폐암 (예를 들어 NSCLC), 요로상피암, 흑색종, 난소암, 위 및 식도 암, 중피종, 간암종, 전립선암 및 항-PD1 Ab에 대한 FDA-승인을 받은 불가지론적 조직학이 있는 임의의 미스매치 복구 부전 (MSI) 높은 종양을 포함한다. 특정 실시양태에 따르면, 개체는 NSCLC, 흑색종, 유방암, 신장암, 방광암 및 결장직장암으로 이루어진 군으로부터 선택된 암을 앓고 있다.

본 발명은 또한 암을 갖는 개체가 면역-종양학 (I-O) 요법의 투여 전에 보상성 미생물총-중심 중재 (MCI)를 필요로 하는지 결정하기 위한 테라노스틱 방법으로서, 상기 방법에 의해 개체가 암- 또는 항생제-연관된 디스바이오시스를 갖는지 여부를 평가하는 것을 포함하며, 여기서 개체가 암- 또는 항생제-연관된 디스바이오시스를 갖는 경우에, 개체는 I-O 요법을 사용한 치료의 투여 전에 MCI를 필요로 하는 것인 방법에 관한 것이다.

폐암과 같은 특정 경우에, MCI는 또 다른 치료, 예를 들어 HPD를 회피하기 위한 화학요법과 조합될 수 있다.

본 명세서에서, 문구 "미생물총-중심 중재 (MCI)"는 장내 미생물총 조성에 직접적 또는 간접적인 효과를 갖는 임의의 치료를 나타낸다.

본 발명에 따른 MCI의 예는 하기를 포함한다:

- 경구용 반코마이신 항생제 (예를 들어, 씨. 디피실레(C. difficile) 감염 치료와 동일한 프로토콜),

- 엔테로클로스터(Enterocloster) 신규 속 클레이드의 박테리아를 사멸시키는 파지,

- 엔테로클로스터 신규 속 클레이드의 박테리아를 사멸시키도록 조작된 희귀-절단 엔도뉴클레아제 예컨대 Crispr Cas9,

- 악케르만시아(Akkermansia) 종 및/또는 악케르만시아 무시니필라(Akkermansia muciniphila), 가능하게는 다른 유익한 박테리아와 혼합된 것,

- 레티노산,

- 분변 미생물 이식 (FMT), 특히 예를 들어 하기 기재된 바와 같은 방법에 의해 고유판의 내피 세포에서 MAdCAM-1 발현 수준을 증가시키는 것으로 증명된 산물을 사용한 경우, 및

- 상기 치료의 혼합물.

상기에서, 파지 및 엔도뉴클레아제는 문헌 [Haas and Blanchard, Int J Syst Evol Microbiol 2020;70:23-34]에 보고된 클래딩 분류학에 상응하는 엔테로클로스터 목록의 종 중 적어도 하나의 박테리아를 사멸시킬 수 있는 경우에 "엔테로클로스터 신규 속 클레이드의 박테리아를 사멸시키는 것"으로 간주된다.

이 목록은 하기를 포함한다:

클로스트리디움(Clostridium)/엔테로클로스터 아스파라기포르미스(Enterocloster asparagiformis)

클로스트리디움/엔테로클로스터 라발렌세(Enterocloster lavalense)

클로스트리디움/엔테로클로스터 볼테아에(Enterocloster bolteae)

클로스트리디움/엔테로클로스터 클로스트리디오포르메(Enterocloster clostridioforme)

클로스트리디움/엔테로클로스터 시트로니아에(Enterocloster citroniae)

클로스트리디움/엔테로클로스터 알데넨세(Enterocloster aldenense)

클로스트리디움/엔테로클로스터 심보시움(Enterocloster symbosium)

훈가텔라 하테와이이(Hungatella hathewayi)

훈가텔라 에플루비아(Hungatella effluvia)

본 발명은 또한 암-유도된 디스바이오시스를 갖는 개체에서 I-O 요법과 조합하여 암을 치료하기 위한, 상기 나열된 바와 같은 MCI용 작용제의 용도에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 MCI의 성공을 추적하는 방법으로서, 혈청 가용성 MAdCAM-1의 수준을 측정하는 것을 포함하며, 여기서 혈청 가용성 MAdCAM-1의 정규화된 수준은 MCI가 장내 유바이오시스를 성공적으로 회복시켰거나 또는 디스바이오시스를 적어도 부분적으로 교정시켰다는 것을 나타낸다.

이 방법을 수행할 때, 혈청 가용성 MAdCAM-1의 수준은 그것이 (상기 기재된 바와 같이) 미리 결정된 역치보다 높은 경우에 "정규화된" 것으로 간주될 수 있다. 대안적으로, 그것이 MCI 이전보다 높은 경우에 "정규화된" 또는 적어도 "부분적으로 정규화된" 것으로 간주될 수 있다.

본 발명은 또한 심혈관 사건 (HRHSCV)을 경험하는 고위험 과다 흡연자에서 초기 NSCLC 발생률을 예측하는 바이오마커로서의 혈청 가용성 MAdCAM-1 수준의 용도로서, 여기서 혈청 가용성 MAdCAM-1의 감소된 수준은 NSCLC 발병을 예측하는 마커인 용도에 관한 것이다.

이어지는 실험 파트에서, 본 발명자들은 장내 디스바이오시스의 설정에서, PD1 차단이 GALT에서 TH17/Tr17의 증폭 및 종양으로의 귀소를 용이하게 한다는 것을 입증하였다. 그들은 또한 이러한 상황에서 IL-17A 생체활성을 차단하는 것이 디스바이오시스의 해로운 효과를 회피할 수 있음을 제시하였다.

따라서, IL-17A 및 PD1 차단을 조합하는 것은 상기 기재된 방법 중 하나에 의해 항-PD1 Ab를 사용한 치료에 저항할 가능성이 있는 것으로 식별된 환자에게 임상적으로 매우 흥미롭다.

게다가, IL-7은 α4β7 인테그린 발현을 제어하고 T 세포에 장-귀소 특이성을 각인하여 염증성 장 질환에서 Tr17 이동 시 고도로 발현되는 CD127에 작용한다 (Belarif et al. J. Cin Invest May 2019, vol 129, numero 5).

결과적으로, 재조합 IL-7을 PD1 차단과 조합하는 것은 상기 기재된 방법 중 하나에 의해 항-PD1 Ab를 사용한 치료에 저항할 가능성이 있는 것으로 식별된 환자에게 임상적으로 매우 흥미로운 또 다른 옵션이다.

그러므로, 본 발명의 또 다른 측면은 가용성 MAdCAM의 낮은 혈청 수준을 갖는 환자에서 암 치료를 위한, (i) 항-PD1 또는 항-PDL1 항체 및 (ii) 항-IL17A 또는 항-IL-17R 항체 및/또는 재조합 IL-7을 포함하는 조합된 요법의 용도이다.

상기 조합된 요법에서, IL-17R 또는 IL-17을 차단하고 이어서 PD1 또는 PDL-1/PDL-2를 억제하는 것부터 시작하여 2개 이상의 작용제가 함께 또는 별도로 투여될 수 있다.

본 발명의 다른 측면은 고유판의 내피 세포에서 MAdCAM-1 발현 수준을 정규화할 수 있는 작용제를 식별하기 위한 방법 및 도구에 관한 것이다.

이러한 방법은 (i) MAdCAM-1을 발현하는 또는 MAdCAM-1 프로모터의 제어 하에 리포터 유전자를 발현하도록 조작된 세포를 테스트될 화합물과 시험관내 접촉시키는 단계 및 (ii) 상기 화합물 중 어느 것이 MAdCAM-1의 발현 또는 MAdCAM-1 프로모터의 제어 하에 발현되는 리포터 유전자의 발현을 유도하는지 평가하는 단계를 포함한다.

이 방법을 수행하는데 사용될 수 있는 세포의 예는 인간 제대 정맥 내피 세포 (HUVEC), 형질전환된 동양혈관 내피 세포 (TSEC), bEnd.3 세포 및 이의 유도체 (특히, MAdCAM-1 조절 요소의 제어 하에 리포터 유전자를 안정적으로 통합함으로써 이들 세포주로부터 유래된 조작된 세포)를 포함한다.

또 다른 방법에 따르면, 테스트될 화합물을 장 인간화 아바타 마우스에 투여하고, 상기 마우스의 내피 세포에서 MAdCAM-1의 발현을 측정한다.

2개의 방법은 또한 조합될 수 있다.

이러한 조합된 스크리닝 방법에서, 시험관내 결과는 아바타 마우스에서 검증 단계에 의해 완료되며, 여기서 아바타 마우스는 8-10일 광범위 스펙트럼 ATB로 사전-치료되고 이어서 경구 위관영양에 의해 인간 FMT 산물에 의해 재집락화된 장 인간화 마우스이고, 여기서:

(i) FMT 산물은 MAdCAM-1을 발현하는 또는 MAdCAM-1 프로모터의 제어 하에 리포터 유전자를 발현하도록 조작된 세포에서 MAdCAM-1의 발현을 유도하는 것으로 식별되었거나, 또는

(ii) FMT 산물은 이러한 세포에서 MAdCAM-1의 발현을 유도하지 않는 것으로 식별되었고, 이들 세포에서 MAdCAM-1의 발현을 유도하는 것으로 식별된 또 다른 작용제로 풍부화되었거나, 또는

(iii) FMT는 유바이오시스 또는 높은 가용성 MADCAM-1과 연관된 분류학적 조성을 갖는다 (본 발명자들의 데이터베이스에서 또는 임의의 이전 실험의 결과로서).

본 발명에 따른 방법은 또한 하기를 포함할 수 있다:

(i) 위관영양 후 8일까지, FMT 수용자에서 MAdCAM-1 및 Foxp3-기반 회장 PCR을 실행하기 위해 장 인간화 아바타 마우스 중 일부를 희생시키고 (및 임의로, IHC 염색) 이를 대조군과 비교하는 단계 (연속 ATB);

(ii) 장-인간화 아바타 마우스에서 MAdCAM-1의 유의한 상향조절의 경우, 각 그룹의 적어도 3마리의 마우스에 피하 육종을 접종하고 이들을 항-PD1 Ab로 치료하여 이러한 FMT가 ATB-치료된 마우스와 비교하여 치료 효능을 매개할 수 있다는 것을 보장하는 단계;

(iii) 장-인간화 아바타 마우스가 항-PD1 Ab를 사용한 치료에 반응하는 경우에, FMT 산물 또는 이를 풍부화하는데 사용된 비-FMT 작용제가 고유판의 내피 세포에서 MAdCAM-1 발현 수준을 정규화할 수 있는 것으로 추론하는 단계.

상기 방법을 수행하기 위한 스크리닝 플랫폼은 또한 본 발명의 일부이다. 이러한 플랫폼은 MAdCAM-1 프로모터의 제어 하에 리포터 유전자를 발현하는 세포 (예를 들어, HUVEC, TSEC 또는 bEnd.3 세포, 또는 이로부터 유래된 세포), 및 산물의 은행에서 작용제를 픽킹하고 이들을 배양된 세포에 전달하고 리포터 유전자의 발현 (예를 들어 리포터 유전자가 형광 단백질을 발현하는 경우에 형광을 측정함으로써)을 평가하도록 구성된 로봇을 포함한다.

상기 언급된 바와 같이, 암 환자의 혈청 내 가용성 MAdCAM의 낮은 수준은 이러한 환자의 장내 디스바이오시스의 마커이며, I-O 요법에 대한 저항성을 유도할 가능성이 있으므로 이러한 환자는 I-O 요법 전에 보상 제제를 필요로 하며 하기 단계를 포함하는 치료로부터 유리하게 이익을 얻을 수 있다:

(i) 상기 기재된 것으로부터 선택된 MCI를 투여하는 단계, 및

(ii) 상기 기재된 것으로부터 선택된 I-O 요법을 투여하는 단계.

I-O 요법을 시작하거나 지속하기 전에 (예를 들어, 상기 기재된 방법에 의해) 암 환자의 혈청 내 가용성 MAdCAM의 수준을 측정하는 것은 환자가 조합된 치료 (MCI + I-O)를 필요로 하는지 결정하는데 도움이 된다.

이 측정이 특히 유용한 환자는 ICI, 특히 항-PD1/PDL-1 Ab의 제1 투여 전 60일부터 투여 후 42일까지의 기간 동안 광범위 스펙트럼 항생제를 복용한 환자이며, 중증 장내 디스바이오시스를 가질 가능성이 더 높기 때문이다.

유리하게는, 가용성 MAdCAM의 혈청 수준의 새로운 측정은 MCI가 암-연관된 디스바이오시스를 감소시켰는지 여부를 체크하기 위해 상기 단계 (ii) 전에 수행된다.

상기 조합된 치료 (MCI + I-O)를 수행할 때, 60일 미만 전에 광범위 스펙트럼 항생제를 받은 개체는 유리하게는, 가능하게는 저온살균된 악케르만시아 종 및/또는 악케르만시아 무시니필라로 풍부화된 분변 미생물 이식을 받을 수 있으며; 60일 미만 전에 광범위 스펙트럼 항생제를 받지 않은 개체는 유리하게는 살아있는 악케르만시아 종 및/또는 악케르만시아 무시니필라를 받을 수 있다.

본 발명의 다른 특징은 또한 본 발명의 프레임워크 내에서 수행되고 그 범위를 제한하지 않고 필요한 실험적 지원을 제공하는 생물학적 검정에 대한 설명 과정에서 명백해질 것이다.

실시예

실시예 1: 항생제는 PD-1 차단 동안 종양 면역감시를 손상시키는 회장 MAdCAM-1/α4β7 축을 파괴한다

재료 및 방법

중개 연구에 대한 의료 센터 및 규제 승인.

분변 물질. 분변 수집을 위해, 현지 CCPPRB의 윤리 가이드라인 및 승인에 따라 구스타브 루시 연구소(Institut Gustave Roussy)/프랑스에서 보조 연구가 수행되었다. 연구 명칭은 "Oncobiotics", B2M 윤리 프로토콜 번호 PP: 15-013이었다. 모든 환자로부터 헬싱키 선언에 따른 서면 동의서를 얻었다. 내시경검사 및 혈액 샘플 수집을 위해, 카를스루에 지역 협의회(Regierungspraesisium Karlsruhe)의 윤리 가이드라인 및 승인에 따라 하이델베르그 대학 클리닉/독일에서 임상 연구 "고형 종양 환자의 장내 케모카인 네트워크에 대한 항생제의 영향"을 수행하였다. 적격 환자는 편평 또는 비편평 조직학을 갖는 병기 IIIA-IV 비소세포 폐암 (NSCLC)을 가졌으며 적어도 하나의 이전 치료 라인 이후 재발 또는 진행을 문서화하였다. 참여 장소는 구스타브 루시 캔서 캠퍼스(Gustave Roussy Cancer Campus) (프랑스 빌레쥐프)였다. NSCLC 환자는 유럽 의약품청 (EMA)이 승인한 치료 방식의 일부로서 항-PD-1 mAb인 니볼루맙을 받았다. 고형 종양 버전 1.1 (RECIST1.1)의 반응 평가 기준을 사용하여 종양 반응을 평가하였다. 기준선 및 첫 해에는 8 내지 12주마다, 그리고 이어서 질환 진행까지 12 내지 15주마다 컴퓨터 단층촬영 (CT) 스캔을 수행하였다. 처음 주사 (T0) 전에 국제 인간 마이크로바이옴 표준 (IHMS) 가이드라인 (SOP 03 V1)에 따라 분변을 수집하였다. 간략하게, 혐기성 발생기 (비오메리으(Biomerieux))를 포함하는 수집 키트를 환자에게 제공하였다. 환자는 집에서 샘플을 수집하고, BHI + 2 % 글리세롤을 포함하거나 포함하지 않는 플라스틱 튜브 (1000-Sarstedt에 의한 플라스틱 용기)에서 구스타브 루시 캔서 캠퍼스에서 -80℃에서 4 내지 24시간 후에 동결시켰다.

내시경검사 샘플 및 혈액 샘플의 수집. 적격 환자는 2018년 7월 내지 2019년 11월 사이에 비연구 관련 적응증에 대한 임상 표준 프로토콜 (표 1)에 따라 회장-결장경검사를 받았다. 가능한 경우, 말단 회장, 맹장, 및 우측 및 좌측 결장의 점막의 내시경검사 생검을 각 환자에 대해 수행하였다. 조직 샘플을 액체 질소에서 급속 동결하고 -80℃에서 저장하거나 조직학을 위해 2% PFA에 침지하였다. 또한, 회장-결장경검사 전에 2개의 혈액 샘플 (10 ml EDTA 튜브)을 수집하였다. 포함된 모든 환자는 식이 이력을 평가하기 위해 설문지에 응답하였으며 임상 기준선 데이터를 지역 임상 정보 시스템으로부터 검색하였다.

세포 배양, 시약 및 종양 세포주. MCA-205 섬유육종 세포, MC38 및 RET 흑색종 세포 (즉, 자발적 흑색종발생을 구동하는 메탈로티오네인-1 프로모터의 제어 하에 Ret 원종양유전자의 트랜스진-강제된 발현에 의해 생성된 흑색종, 빅터 우만스키(Viktor Umansky) 교수가 친절하게 제공함) (C57BL/6 마우스에 대해 모두 동계임)를 10% FCS, 2 mM L-글루타민, 100 UI/ml 페니실린/스트렙토마이신, 1 mM 피루브산나트륨 및 MEM 비필수 아미노산을 함유하는 RPMI 1640 (이하 완전 RPMI 1640으로 지칭됨)에서 5% CO₂의 존재 하에 37℃에서 배양하였다. 루시퍼라제-트랜스펙션된 TC-1 세포주 (C57bl6 마우스에 대해 동계임, 프랑스 구스타브 루시 연구소의 에릭 도이치(Eric Deutsch) 교수가 친절하게 제공함)를 완전 RPMI 1640 및 1mM Hepes 완충액 중 5% CO₂의 존재 하에 37℃에서 배양하였다. 세포주를 미코플라스마 오염에 대해 정기적으로 테스트하였으며, 10회 초과의 계대 후에는 사용하지 않았다.

마우스. 모든 동물 실험은 프랑스 및 유럽 법률 및 규정을 준수하여 수행하였다. 지역 기관 동물 윤리 위원회 및 프랑스 연구부(French Ministere de la Recherche)는 모든 마우스 실험을 승인하였다 (허가 번호: 2016-049-4646, 2017_049_99741, 2019_036_21124). 정부 및 기관 가이드라인 및 규정에 따라 실험을 수행하였다. 여성 C57BL/6을 할런(Harlan) (프랑스)으로부터 구입하였다. 7 내지 12주령 사이의 마우스를 사용하였다. MAdCAM-1-KO 및 ITGB7-KO 마우스는 독일 아헨 소재의 아헨 대학 병원의 안젤라 쉬퍼스(Angela Schippers)로부터의 친절한 선물이었다. MAdCAM-1-KO 및 ITGB7-KO 마우스 및 대조군 한배 새끼는 C57BL/6 배경에서 역교배되었으며 아헨 대학 병원의 지역 동물 보호 시설에서 사내 사육으로부터 수득된 것이었다. CCR5-KO 마우스는 프랑스 파리 소재의 살페트리에르 병원(Hopital Salpetriere)의 크리스토프 콤바디에르(Christophe Combadiere)로부터의 친절한 선물이었다. CCR9-KO 마우스는 독일 하노버 소재의 하노버 대학 병원의 라인홀드 푀르스터(Reinhold Foerster)의 친절한 선물이었다. CCR5-KO 및 CCR9-KO 마우스는 둘 모두 C57BL/6 배경에서 유지되었다. 동물이 특정 병원체-무함유 조건에서 사육된 구스타브 루시 캔서 캠퍼스의 동물 시설에서 모든 마우스 실험을 수행하였다.

항생제 치료. 달리 명시되지 않은 경우, 마우스의 멸균 식수에 첨가된 암피실린 (1 mg/ml), 스트렙토마이신 (5 mg/ml) 및 콜리스틴 (1 mg/ml) (시그마-알드리치(Sigma-Aldrich))을 함유하는 광범위 스펙트럼 항생제 용액 (ATB)으로 마우스를 치료하였다. 단일 항생제를 사용한 실험에서, 농도는 각각 암피실린 (1 mg/ml), 스트렙토마이신 (5 mg/ml), 콜리스틴 (1 mg/ml), 에리트로마이신 (1 mg/ml) 또는 시프로플록사신 (0.1 mg/ml)이었다. 용액 및 병을 매주 2회 교체하였다. 항생제 믹스가 사용된 실험에서 항생제 활성은 BHI+15% 글리세롤 (0.1 g/ml)에 재현탁된 분변 펠렛을 COS (5% 양 혈액을 갖는 콜럼비아 한천) 플레이트에서 48시간 동안 37℃에서 호기성 및 혐기성 조건에서 매주 배양함으로써 확인되었다. ATB 치료 지속시간은 실험 설정에 기초하여 약간 상이하였으며 (aPD-1 치료 전 7-14일), 각 실험 결과에 표시된다. 간략하게, 항-PD-1 mAb의 효능을 손상시키기 위해, 마우스를 종양 이식 전 1-2주 동안 ATB로 치료하였고, ATB는 실험 전반에 걸쳐 지속되거나, 개별 실험에 표시된 바와 같이 항-PD-1 치료 개시일에 중단되었다. 분변 미생물 이식 실험의 맥락에서, 마우스는 3일의 ATB를 받은 후, 다음날 동물 급식 바늘을 사용하여 경구 위관영양에 의해 분변 미생물 이식을 받았다. TC-1 모델에서, ATB 치료는 종양 주사전 3일에 시작되었고 처음 박테리아 위관영양 하루 전에 중단되었다.

MCA-205 육종, MC38 및 RET 흑색종의 피하 모델. 동계 C57BL/6 마우스에 각각 0.8 × 10⁶개 MCA-205 육종, 1.0 × 10⁶개 MC38 또는 0.5 x 10⁶개 RET 흑색종 세포를 피하 이식하고, 종양이 20 내지 40 ㎟의 크기에 도달하였을 때 항-PD-1 mAb (250μg/마우스; 클론 RMP1-14,) 또는 이소타입 대조군 (클론 2A3)으로 복강내 (i.p.) 치료하였다. 마우스에게 항-PD-1 mAb를 3일 간격으로 4회 주사하였다. 종양 길이 및 폭을 캘리퍼를 사용하여 매주 3회마다 정기적으로 모니터링하였다. 항-a4b7 mAb (DATK32, 마우스당 200μg) 또는 항-MadCAM mAb (MECA-367, 마우스당 200μg)를 사용한 실험에서, mAb (또는 두 경우 모두에서 해당 이소타입 대조군, 클론 2A3)를 최종 항-PD-1 주사까지 0일차부터 시작하여 3일마다 i.p. 주사하였다. 모든 항체는 미국 뉴햄프셔주 소재의 바이오엑스셀(BioXcell)로부터 구입하였다.

동소이식 루시퍼라제 조작된-TC-1. C57BL/6 마우스를 이소플루란으로 마취시켰다. 멸균 조건 하에 각 마우스의 흉벽에 측면 절개를 만들고, 10μl 마트리겔 (코닝(Corning)) 중 6x10⁵개 TC-1-Luc 세포를 폐에 주사하였다. 피부 절개를 수술용 피부 클립으로 봉합하였다. 종양 성장을 IVIS 이미지화 시스템 50 시리즈 (캘리퍼 라이프 사이언시스(Caliper Life Sciences)/제노젠(Xenogen))에서 매주 2회 모니터링하였다. 3일차에 시작하여 마우스에게 상기와 동일한 용량 및 스케쥴에 따라 항-PD-1 mAb 또는 권장 이소타입을 주사하였다.

FMT 실험. 분변 물질을 해동함으로써 분변 미생물총 전달 (FMT)을 수행하였다. 마우스를 새로운 케이지에 배치하였다. 그 후, 200 μL의 현탁액을 경구 위관영양에 의해 각각의 무균 또는 ATB 사전-치료된 (3일) 수용자에게 옮겼다. 또한, 각 동물의 모피에 추가 100μL를 적용하였다. FMT 2주 후, 종양 세포를 피하로 또는 동소이식적으로 주사하고, 마우스를 상기 언급된 바와 같이 항-PD-1 또는 이소타입 대조군으로 치료하였다. 경구 박테리아 위관영양을 하기 기재된 바와 같이 aPD-1 치료와 동일한 날에 수행하였다.

공생 종을 사용한 경구 박테리아 위관영양. 악케르만시아 무시니필라 CSUR P2261 및 에이. 인디스틴크투스(A. indistinctus) CSUR P723은 프랑스 마르세유 소재의 지중해 감염 대학 병원 연구소(Institut hospitalo-universitaire Mediterranee Infection)에 의해 제공되었다. 엔테로코쿠스 히라에(Enterococcus hirae) 13144 단리주는 원래 구스타브 루시 캔서 캠퍼스에서 CTX로 치료된 SPF 마우스의 비장 또는 장간막 림프절로부터 단리되었다. 에이. 무시니필라를 37℃에서 적어도 72시간 동안 3개의 혐기성 발생기 (비오메리으)를 사용하여 생성된 혐기성 분위기에서 COS 플레이트에서 성장시켰다. 이. 히라에 13144를 호기성 조건에서 37℃에서 24시간 동안 5% 양 혈액 풍부화된 콜럼비아 한천에서 성장시켰다. 1 × 10⁸개 박테리아를 함유하는 100 μl의 현탁액을 사용한 경구 위관영양에 의해 ATB d사전-치료된 또는 GF C57BL/6 마우스의 집락화를 수행하였다. 박테리아 위관영양의 경우: PBS에서 600 nm의 광학 밀도에서 형광 분광광도계 (에펜도르프(Eppendorf))를 사용하여 10⁹ CFU/mL의 현탁액을 수득하였다. 항-PD-1 mAb의 처음 주사 전 처음 24시간에 및 후속적으로 항-PD-1 mAb 주사와 동일한 날에 4회, 각 마우스에 대해 5회의 박테리아 위관영양을 수행하였다. 위관영양 후 48시간에 분변을 배양함으로써 이. 히라에 13144를 사용한 집락화 효능을 확인하였다. 분변 펠렛을 수확하고, BHI+15% 글리세롤에 0.1 g/ml로 재현탁하였다. 분변의 연속 희석액을 5% 양 혈액 풍부화된 콜럼비아 한천에 플레이팅하고, 호기성 및 혐기성 조건에서 37℃에서 48시간 동안 인큐베이션하였다. 48시간 후, 단일 콜로니를 단리하고 그람 염색을 수행하였다. 매트릭스-보조 레이저 탈착/ 이온화 비행 시간 (MALDI-TOF) 질량 분광기 (안드로마스(Andromas), 벡크만 쿨터(Beckman Coulter), 프랑스)를 사용하여 특정 박테리아의 식별을 성취하였다.

유동 세포계측법 분석. 종양, 장간막 림프절 (mLN), 배액 림프절 (tdLN) 및 비장을 개별 실험에 표시된 바와 같이 상이한 시점에 수확하였다. 절제된 종양을 작은 조각으로 절단하고, 25 μg/mL의 리베라제™ (로슈) 및 150 UI/mL의 DNase1 (로슈)을 함유하는 RPMI 배지에서 30분 동안 37℃에서 소화시키고, 이어서 분쇄하고, 100 및 70 μm 세포 스트레이너 (벡톤 & 디킨슨)를 사용하여 2회 여과하였다. 림프절 및 비장을 RPMI 배지에서 분쇄하고, 후속적으로 100 μm 세포 스트레이너를 통해 2회 여과하였다. 400만 개의 종양 세포, 림프절 세포 또는 비장세포를 정제된 항-마우스 CD16/CD32 (클론 93; 이바이오사이언스(eBioscience))와 함께 30분 동안 4℃에서 사전-인큐베이션한 후, 막 염색을 수행하였다. 세포내 염색을 위해, Foxp3 염색 키트 (이바이오사이언스)를 사용하였다. 라이브/데드 고정가능한 옐로우 죽은 세포 염색 키트 (라이프 테크놀로지스(Life Technologies)) 또는 라이브/데드™ 고정가능한 아쿠아 죽은 세포 염색 키트를 사용하여 죽은 세포를 배제하였다. CD3 (145-2C11), CD4 (GK1.5 또는 RM4-5), CD8 (53-6.7), CD25 (3C7), CD44 (IM7), CD45 (30-F11), CD62L (MEL-14), CD127 (A7R34), Foxp3 (150D), RORγt (B2D), CXCR3 (FAB1685P), CXCR5 (J252D4), CCR2 (SA203G11), CCR4 (2G12), CCR5 (HM-CCR5), CCR6 (29-2L17), CCR7 (4B12), CCR9 (CW-1.2), 베타7 (FIB504), a4b7/LPAM-1 (DATK32 및 REA457), MadCAM-1 (MECA367) 모두 밀테니(Miltenyi), 바이오레전드(BioLegend) 및 이바이오사이언스로부터 구입됨)에 대한 항-마우스 항체를 사용하여 세포를 염색하였다. 염색된 샘플을 CytoFLEX S 13 색상 (벡크만 쿨터) 또는 BD Facs CANTO II (BD)에서 획득하고, 칼루자(Kaluza) 소프트웨어 1.5 (벡크만 쿨터)를 사용하여 분석을 수행하였다. T 중추 기억 (TCM) 게이팅: 살아있는 CD3+에 대한 게이팅 후, CD4+가 선택되고, 이어서 TCM은 CD62L+로서 식별되었다. 이펙터 기억 T (TEM) 세포는 CD62L 및 CD44+로서 선택되었다. Th17 게이팅은 사용된 마우스 모델에 따라 달라졌다. 카에데 형광색소는 PFA로 고정 시 광전환된 상태를 유지하지 않는다. Th17 게이팅: 살아있는 CD3+에 대한 게이팅 후, CD4+가 선택되고, 이어서 Th17은 RORγt+로서 식별되었다. 비고정된 세포의 경우에 Th17은 CXCR3- 및 CCR6+로서 식별되었다. Treg 게이팅: 살아있는 CD3+에 대한 게이팅 후, CD4+가 선택되었으며, 고정된 세포의 경우, Treg는 FoxP3+ CD25+로서 식별되었다. 비고정된 세포의 경우에 Treg는 CD127- CD25+로서 식별되었다. 컷오프 값의 정의를 위해 형광 마이너스 1 (FMO) 대조군을 적절하게 사용하였다.

면역조직화학. 포르말린-고정된 파라핀-포매된 뮤린 회장 및 결장의 3 μm 두께 섹션을 "스위스 롤"로서 준비하고, 폴리-L-리신-코팅된 슬라이드에 마운팅하고, 탈파라핀화하고, 등급별 알콜을 통해 물로 수화시켰다. 섹션을 98℃의 완충액에서 30분 동안 가열함으로써 항원 검색을 수행하였다 (각각 CD3 염색의 경우에 0.01 M 시트르산나트륨 완충액, pH 6.0, 및 FoxP3 염색의 경우에 1 mM EDTA, pH 8.0 사용). 내인성 퍼옥시다제 활성을 3% 수소 퍼옥시다제 (DAKO)로 10분 동안 억제하고, 이어서 파워비전(PowerVision) IHC/ISH 슈퍼 블로킹 용액 (라이카 바이오시스템스(Leica Biosystems), #PV6122)으로 20분 동안 포화시켰다. 세척 없이, 토끼 항-인간 CD3 폴리클로날 Ab (즉시 사용 가능, DAKO, # IS503) 및 토끼 항-마우스 Foxp3 폴리클로날 Ab (2μg/ml, 인비트로젠(Invitrogen), #PA1-46126) 일차 항체를 적용하고, 1시간 동안 인큐베이션한 후, 이차 Ab, 파워비전 폴리-호스래디시 퍼옥시다제-접합된 항-토끼 항체 (라이카 바이오시스템스 # PV6119)를 적용하였다. 디 아미노 벤지딘 (DAB)-퍼옥시다제 기질 키트 (DAKO)를 사용하여 퍼옥시다제를 검출하였으며, 섹션을 메이어(Mayer)의 헤마톡실린으로 대조염색하였다. CD4의 면역조직화학 염색을 자동화된 면역염색기 (더 벤치마크 울트라(The BenchMark ULTRA), 벤타나(Ventana), IGR)에서 수행하였다. 95℃에서 32분 동안 EDTA 완충액 (pH 8.0)에서 열-유도된 항원 검색을 수행하였다. 일차 모노클로날 항-마우스 CD4 항체 (1,246μg/mL, #ab183685, Abcam)를 항체 희석제 (Zytomed)에 1:500 희석하고, 슬라이드를 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 색소원으로서 DAB를 사용하는 비오틴-무함유 퍼옥시다제 검출 기술 시스템을 적용하였다 (키트 울트라뷰 범용 DAB 검출 키트, 벤타나). 슬라이드를 또한 헤마톡실린 키트 (벤타나)를 사용하여 대조염색하였다.

카에데 실험. 카에데 마우스는 일본 교토 소재의 교토 대학교의 미치오 토무라(Michio Tomura)로부터의 친절한 선물이었고, 역교배되어 C57BL/6 배경에서 유지되었다. 카에데 트랜스제닉 마우스를 2 내지 2.5% 이소플루란으로 마취시키고, 진통을 위해 부프레노르핀 (0.01 mg/kg)을 i.p. 투여하였다. 회장의 광전환을 위해, 복부 피부 및 복막을 정중선에서 절단하여 복강내 말단 회장에 접근하였다. 장간막 림프절을 포함하는 결장, 회장 또는 회장의 광전환을 위해, 맹장 극을 식별하고, 말단 회장, 장간막 림프절 및 근위 결장을 포함하는 맹장 극을 복부중앙 절개를 통해 멸균 플라스틱 코팅된 수술용 드레이프로 부드럽게 동원하였다. 비-표적 구조를 알루미늄 호일로 덮었다. 표적 구조의 배쪽 및 등쪽 부분을 각각 30초 동안 395nm 파장 방출 다이오드 (윈즈원(Winzwon)) 광으로부터 방출되는 보라색 광에 노출시켰다. 조명 후 조직을 멸균 등장성 염화나트륨으로 적시고 복강 내로 부드럽게 재배치하였다. 복막을 5-0 모노파일 나일론 봉합사 (에치콘(Ethicon))를 사용한 연속 스티치에 의해 봉합하였다. 피부를 2개의 9mm 상처 클립 (이지 클립 키트(EZ Clip Kit))으로 봉합하였다.

CFSE를 사용하여 장간막 및 종양 배액 림프절로부터 백혈구의 이동의 추적. C57Bl6 마우스를 2 내지 2.5% 이소플루란으로 마취시키고, 진통을 위해 부프레노르핀 (0.01 mg/kg)을 i.p. 투여하였다. 복부 피부 및 복막을 정중선에서 절단하여 장간막 림프절에 접근하였다. 장간막 림프절을 복부중앙 절개를 통해 멸균 플라스틱 코팅된 수술용 드레이프로 부드럽게 동원하였다. 회장 배액 장간막 림프절은 혈관계에 따라 시각적으로 식별되었다. 가장 두드러진 2개의 장간막 림프절에 30G 인슐린 주사기를 사용하여 5μl PBS에 희석된 100μM CFSE를 주사하였다. 장간막 림프절의 재배치 후, 복막을 5-0 모노파일 나일론 봉합사 (에치콘)를 사용한 연속 스티치에 의해 봉합하였다. 종양 배액 림프절의 경우, 복막을 제외하고 정중선에서 복부 피부를 절개하였다. 가위를 사용하여 복부 피부 및 복막을 부드럽게 분리함으로써 종양 배액 림프절을 시각화하였다. 30G 인슐린 주사기를 사용하여 5μl PBS에 희석된 100μM CFSE를 종양 배액 림프절에 주사하였다. 피부를 2개의 9mm 상처 클립 (이지 클립 키트)으로 봉합하였다.

RNA 추출 및 rtPCR. 용해 및 추출 프로토콜은 인간 및 마우스 샘플에 대해 동일하였다. 종양 또는 장내 샘플을 0.1% 베타 머캅토에탄올을 함유하는 RLT 플러스 완충액의 액체 질소에서 급속 동결하였다. 추출 당일, 샘플을 4℃에서 해동하고, RNA-무함유 유리 비드 튜브 (도이처(Dutscher))의 마이크로튜브 균질화기 (벤치마크 사이언티픽(Benchmark Scientific))에서 균질화하였다. 제조업체의 권장사항에 따라 RNeasy 미니 키트 (퀴아젠(Qiagen))를 사용하여 총 RNA 추출 및 게놈 DNA 제거를 수행하였다. 나노드롭(NanoDrop)™ 분광광도계 (써모피셔 사이언티픽(Thermo Fischer Scientific))를 사용하여 측정된 최대 1 μg의 RNA를 SuperScript III 역전사효소 (라이프 테크놀로지스), RNaseOUTTM 재조합 리보뉴클레아제 억제제 (라이프 테크놀로지스), 랜덤 프라이머 (프로메가(Promega)) 및 데옥시뉴클레오시드 트리포스페이트 Set, PCR 등급 (로슈 디아그노스틱스(Roche Diagnostics))으로 구성된 믹스을 사용하여 cDNA로 역전사시켰다.

랩소디에 의한 단일 세포 RNA 시퀀싱. 유동 세포계측법에 의한 CFSE+ CD4+ T 세포의 단리 후, 세포를 냉 PBS에 세척하고, 10,000개 세포를 BD 랩소디™ 카트리지에 로딩하고, 미리 설계된 면역 반응 패널 (마우스)을 사용하여 표적화된 단일-세포 RNA-seq에 대한 제조업체의 지침에 따라 프로세싱하였다. 라이브러리를 NextSeq500 시스템 (일루미나(Illumina))에서 1.75pM로 클러스터링하여 고출력 v2 화학을 사용하여 세포당 ~40,000개의 쌍형성된 말단 (2*75bp) 판독값을 생성하였다. bcl2fastq2 v2.20을 사용하여 시퀀싱된 단일-세포 데이터를 역다중화하였다.

정량적 유전자 발현 검정. 스텝원플러스(StepOnePlus)™ 실시간 PCR 시스템 (라이프 테크놀로지스)에서 범용 마스터 믹스 II를 사용하는 TaqMan® 유전자 발현 검정을 사용하여 B2M, FoxP3, IFNγ, IL-10, IL-17, MadCAM, Ppia, RORc, TNFα (모두 라이프 테크놀로지스 제품)의 발현을 분석하였다. 하기 램핑 프로파일을 사용하여 증폭을 수행하였다: 95℃에서 10분 동안 1 사이클, 이어서 95℃에서 30초, 60℃에서 1분 동안 45 사이클. 정량적 RT-PCR 데이터는 2-ΔCt 방법에 의해 각 도면에 표시된 바와 같이 하우스키핑 유전자 β2M 또는 Ppia의 발현 수준에 10⁶을 곱한 값으로 정규화되었다.

조직 용해 및 케모카인 분석. 장 및 종양 샘플을 50 mM Tris HCL pH 7.4, 150 mM NaCL, 300 mM 수크로스, 10 mM EDTA 및 0.1% 트리톤 100X를 함유하는 비변성 세포 용해 완충액의 액체 질소에서 급속 동결시켰다. 후속 용해를 위해, 샘플을 4℃에서 해동하고, 세라믹 비드 용해 튜브 (프리셀리스(Precellys))에서 튜브 균질화기 (프리셀리스)에서 용해시켰다. 조직 균질액을 4000g에서 5분 동안 원심분리하였다. 후속 분석을 위해 상청액을 사용하였다. CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CCL25 및 MadCAM Duoset ELISA 키트 (RnD)를 사용하거나 CytoFLEX S (벡크만 쿨터)에서 수행된 세포계측법 분석과 함께 레전드플렉스(Legendplex) 마우스 전염증성 케모카인 패널 (바이오레전드)을 사용하여 제조업체 권장사항에 따라 조직 용해물 내 케모카인 농도를 결정하였다.

통계. 마우스. 통계 환경 R (http://www.R-project.org/) 또는 프리즘(Prism) 6 (그래프패드(GraphPad), 미국 캘리포니아주 샌디에고)을 사용하여 데이터 분석을 수행하였다. 비모수적 t-테스트를 사용하여 종양 크기 차이를 계산하였다. 모든 보고된 테스트는 양측 테스트이며, p<0.05에서 유의한 것으로 간주되었다. 환자. MADCAM-1은 NSCLC 환자의 PD1 차단에 대한 반응 예측자이다. sMadCAM1 수준의 예후 역할을 4개 매듭를 갖는 제한된 입방 스플라인 (RCS)을 사용하여 연구하였다. 매듭 수는 아카이케 정보 기준에 따라 선택되었다. 바이오마커 효과의 비선형성을 테스트하였다. 선형성 가설이 기각되지 않은 경우에, 선형 코딩을 사용하여 바이오마커의 효과를 추정하였다.

결과

1.1. ATB는 마우스 및 환자에서 MAdCAM-1 회장 발현을 하향조절한다.

광범위 스펙트럼 ATB 칵테일 (암피실린, 콜리스틴 및 스트렙토마이신)을 사용한 마우스의 장 멸균이 PD-1 차단의 항암 효능을 둔화시켰다고 보고하였다 (Routy et al., 2018a). 먼저 항-PD-1 mAb로 치료된 MCA205 종양-보유 마우스의 장에서 케모카인 및 인테그린 리간드의 발현의 ATB-유도된 변동을 분석하였다. ATB는 대부분의 회장 케모카인 및 Madcam1 유전자 산물의 발현의 유의한 손실을 유도하였지만 (도 5A, 좌측 및 우측 패널, 도 1A 좌측 패널), 결장 및 종양 케모카인 및 Madcam1 유전자 패턴에는 영향을 미치지 못하였다 (도 1A 우측 패널, 도 5A 우측 패널). 회장 Madcam1 유전자 발현의 감소는 회장 조직의 면역조직화학 (도 1B), 회장 CD45^- LP 세포의 유동 세포계측법 (도 1C), 및 회장 용해물에서 면역효소적 검정 (도 1D)에서 측정된 바와 같이 전사 뿐만 아니라 단백질 수준에서 모니터링되었다. 주목할 점은 CD31⁺ 혈관 수의 안정화에 의해 제시된 바와 같이 ATB 투여 하에 장 아키텍처 및 혈관계의 무결성이 보존되었다는 것이다 (도 5B). Madcam1 유전자 발현의 감소는 ATB 투여 3일차에 시작되었으며, ATB를 7 내지 14일 동안 복용한 경우에 자발적 재집락화 (RECO) 동안 ATB 중단 후 12일차까지 회복되지 않았다 (도 1D). 광범위 스펙트럼 ATB 외에도, 다른 ATB 레지멘은 회장 LP, 뿐만 아니라 Madcam1 유전자 발현이 LP보다 높은 장간막 림프절 (mLN) (도 5C, 좌측 및 우측 패널)에서, 뿐만 아니라 파이어 패치 (PP) (도 5D)에서도 스트렙토마이신과 같은 Madcam1 유전자 발현을 하향조절하였다. 암피실린 또는 에리트로마이신과 대조적으로, 반코마이신은 mLN Madcam1 발현을 하향조절하지 못하였으며, 심지어 회장 LP에서 Madcam1 전사를 증가시켰다 (각각 도 5C, 우측 및 좌측 패널). 주목할 점은 Madcam1 (Vcam1은 아님) 유전자 발현 수준이 mLN보다 종양 배액 LN에서 10배 더 낮았다는 것이다 (도 5E). GALT Madcam1에 대한 ATB의 강력한 억제 효과에 흥미를 느껴, 다양한 ATB 레지멘으로 치료된 동물의 회장 내용물의 호기성 및 혐기성 조건 하에 배양을 수행하였다. 회장 박테리아 콜로니의 질량 분광법 식별은 ATB 중단 후 4일에 우세하였지만 다른 실험 조건에서는 우세하지 않은 (도 5F) 엔테로클로스터 신규 속 클레이드의 박테리아에 속하는 여러 종 (spp.) (예컨대 엔테로클로스터 클로스트리디오포르미스 신규 조합, 엔테로클로스터 볼테아에 신규 조합을 밝혔다 (Haas and Blanchard, 2020)). 상기 엔테로클로스터 종은 PD1 차단에 저항성인 신장암 및 폐암 환자의 대변에서 이전에 식별되었다 (Derosa et al., 2020), (Derosa et al. 2022). (엔테로클로스터 종을 사멸시키는) 반코마이신은 회장 Madcam1 유전자 전사를 상향조절하였지만 (도 5C, 좌측 패널), 엔테로클로스터 클로스트리디오포르미스를 사용한 경구 보충은 이러한 효과를 소멸시키고 어드레신 발현에 추가로 영향을 미쳤다 (도 1E). 유사하게, 자발적 재집락화 단계 동안 ATB 중단 후 엔테로클로스터 클로스트리디오포르미스를 사용한 경구 위관영양은 Madcam1 발현의 손실을 악화시켰다 (도 1F). 대조적으로, 면역원성 공생균 예컨대 악케르만시아 무시니필라 (Routy et al., 2018a), (Derosa et al. 2022) 또는 엔테로코쿠스 히라에 (Daillere et al., 2016; Goubet et al., 2021)를 사용한 경구 위관영양은 특정 병원체-무함유 (SPF) 조건에서 사육된 유바이오시스 마우스로부터의 회장 조직에서의 기초 Madcam1 발현을 추가로 증가시킬 수 있다 (도 1G).

PD1 차단으로부터 이익을 받은 흑색종 환자로부터의 대변의 분변 미생물 전달 (FMT)은 전이성 흑색종 수용자의 1/3에서 ICI에 대한 일차 저항성을 회피할 수 있었다 (Baruch et al., 2021; Davar et al., 2021). 실제로, 별개의 공여자 FMT는 임상적 이익을 수용자에게 전달하지 못하였다 (표 1). 따라서, ATB에 의해 치료된 아바타 마우스 (이전에 보고된 바와 같이, (Routy et al., 2018a, 2018b)로의 폐암 또는 신장암 환자로부터의 랜덤 FMT가 SPF 조건에서 사육된 수용자 마우스의 회장 Madcam1 유전자 발현을 하향조절할 수 있는지 여부를 테스트하였다. 6개 FMT 중 3개는 샷건 메타게노믹스-기반 분석 (도 1H, 우측 패널)에서 엔테로클로스터 종 (Haas and Blanchard, 2020)과 동일한 클레이드를 공유하는 이. 클로스트리디오포르미스 (또는 ATB-연관된 훈가텔라 하테와이이 (Derosa et al., 2020)를 포함하여 엔테로클로스터 종의 과다표현에 의해 정의된 별개의 분류학적 조성에 상응하여 그렇게 하였다 (도 1H, 좌측 패널).

전염증성 아토포비움 파르불룸(Atopobium parvulum), 엘. 루테리를 포함하지만 에이치. 하테와이이는 포함하지 않는 다양한 공생균을 사용한 FMT 수용자의 경구 보충은 Madcam1 회장 유전자 발현에 추가로 영향을 미칠 수 있었다 (도 5G).

회장에서의 ATB-유도된 Madcam1 유전자 하향조절은 조절성 시토카인 및 전사 인자 (예컨대 Il17a, Il22, Foxp3, RORc)의 하향조절과 평행하고 상관관계가 있었다 (도 5A 좌측 패널, 도 5H-I). 이들 PCR 결과는 ATB가 회장 LP에서 점막 CD25⁺FoxP3⁺ CD4⁺ T 세포 (Treg) 및 RORγt⁺ CD4⁺ (TH17) T 세포 집단의 유의한 손실을 유도하였음을 제시하는 유동 세포계측법 분석에 의해 뒷받침되었다 (도 1I). 실제로, ATB는 회장 LP에서 Madcam1 유전자 결핍 또는 MADCAM1의 항체 중화의 회장 면역조정 효과를 표현형모사하였다 (도 1J).

마우스에서 나타난 바와 같이, ATB를 복용하고 다양한 적응증에 대해 장 내시경검사 및 생검을 받은 16명의 환자에서 Madcam1, Foxp3 및 Rorc의 장 발현에 대한 ATB의 조화된 억제 효과를 확인하였다 (도 1K, 도 5J, 표 2).

전체적으로, 광범위 스펙트럼 ATB 레지멘은 마우스 및 인간에서 회장 점막 어드레신 MADCAM1의 지속적인 하향조절을 유도하였으며, 이는 감소된 회장 Foxp3, Il17a 및 RORc 발현과 현저한 상관관계가 있다.

1.2. 장으로부터 종양 배액 림프절로의 장친화성 α4β7 ⁺ CD4 ⁺ T 세포의 ATB-유도된 탈출

MADCAM-1 분자의 손실이 GALT에서 α4β7 수용체를 발현하는 장친화성 T 세포의 귀소 또는 체류에 영향을 미칠 수 있다는 가설을 세웠다. 종양-보유 숙주에서 회장 T 세포의 이동을 추적하기 위해, 두 가지 보완적인 실험 전략을 활용하였다. 첫째, 세포 무결성을 파괴하지 않고 세포를 비가역적으로 라벨링하는 것을 허용하는 트랜스제닉 카에데 마우스 모델을 사용하였다. 이러한 모델은 350-400nm 파장의 자외선에 노출 후 녹색에서 빨간색으로 광전환될 수 있는 산호 유래된 광전환가능한 형광 단백질 카에데 (Tomura et al., 2008)를 보편적으로 발현하는 리포터 마우스를 사용한다. 카에데 마우스는 이동성 장 T_H17 세포를 염증이 있는 말초 장기로 추적하기 위한 강력한 도구를 나타낸다 (Krebs et al., 2016; Magnuson et al., 2015; Morton et al., 2014). MCA205 종양 보유자에서 GALT 세포의 운명을 추적하기 위해, 회장, 맹장 및 장간막 LN은 피하 종양 이식 후 10일차 (D10)에 광전환되었으며, 유동 세포계측법에 의해 다양한 장기에서 광전환된 세포의 검출을 위해 24시간 후에 마우스를 죽였다 (도 2A, 도 6A). 조명 후 5분에 장간막 LN에서 대략 60%의 광전환율을 달성하였다 (도 6A). 24시간에, 장-광전환된 (PC) 백혈구의 22.8±2.6%만이 mLN에 남아 있었지만, 상당한 백분율의 GALT-배출 광전환된 (PC) 세포가 비장 (5.1±0.5%) 및 종양 배액 림프절 (tdLN) (4.0±0.3%)에서 원위 부위에서 검출될 수 있었다 (도 2A, 도 6A-B). 제2 접근법을 사용하여, 수술 절차에 의해 mLN의 직접 CFSE 라벨링 후 카르복시플루오레세인 숙신이미딜 에스테르 (CFSE) 라벨링된 세포를 직접 추적하였다 (Singh et al., 2016) (도 2B, 도 6C, 좌측 패널). CFSE 주사 후 24시간 이내에 최대 1.0±0.2% 비장세포, 0.8±0.1% tdLN 세포 및 0.2±0.02%의 종양 상주 백혈구가 mLN-유래된 백혈구로 대체되었다 (도 6C, 우측 패널). 회장 조명은 장 백혈구의 탈출을 tdLN 또는 sc 종양으로 동원하는데 GALT 표적화된 조명보다 덜 능숙하였다 (도 6D). 그러나, 국소 조명 및 GALT 조명 둘 모두는 24시간에 광전환된 (PC) (장 유래)-CD4⁺T 세포의 α4β7⁺ 분획의 비장, tdLN 및 sc MCA205로의 선택적 동원을 유도하였지만, 다른 PC 세포 서브세트는 조직 상주 (비 PC) 세포와 비교하여 풍부화되지 않았다 (도 2A-B 및 도 6E). 다시, 종양 미세환경 (TME) 내의 α4β7⁺ CD4⁺T 세포의 대다수는 CFSE mLN 라벨링 후 CFSE⁺였다 (도 2B, 도 6F). CD4⁺ T 세포 장 탈출에 α4β7 인테그린의 분자적 관련성을 확인하면서, tdLN (대측성 LN은 아님)에서 세포의 광전환 또는 CFSE 라벨링이 중화 항-MAdCAM-1 Ab로 치료된 종양 보유 마우스에서 유의하게 증가되었음을 제시하였다 (도 2C, 좌측, 중간 및 우측 패널).

장간막 LN으로부터 이동하는 α4β7⁺ CD4⁺ T 세포의 표현형을 해독하기 위해, 종양 보유자의 mLN으로부터 정제된 α4β7^- CD4⁺ T 세포와 비교하여 α4β7^높음 CD4⁺ T 세포의 벌크-RNA 시퀀싱을 수행하였다. α4β7^높음 CD4⁺ T의 전사 프로파일은 Itga4 (α4β7 인테그린을 코딩하는) 장 홀마크, 뿐만 아니라 Treg 기능 (예컨대 Icos, Ctla4, Cd74, Mki67, P2rx7 (Daniel et al., 2010) 및 T_H17 (Il17re, Tnfsf11, Il22) 분극화와 연관된 유전자 산물의 현저한 증가를 강조하였지만, Tnfrsf9 T-세포 공동자극 유전자 산물 (4-1BB)은 이러한 서브세트에서 유의하게 하향조절되었다 (도 2D).

다음으로, ATB-유도된 디스바이오시스가 세포내 유동 세포계측법과 조합된 두 이미지화 접근법 모두를 사용하여 종양 배액 LN으로의 장친화성 α4β7⁺ CD4⁺ T 세포의 탈출에 어떻게 영향을 미치는지를 다루었다 (도 2E-F). 재집락화는 IL-17A 분비 α4β7⁺ Foxp3⁺CD4⁺ T 세포 (장 유래 Tr17)의 귀소를 촉진하였지만, α4β7^- Foxp3⁺CD4⁺ T 세포 (tdLN 상주- Tr17) 또는 IL-17A⁺ α4β7⁺ Foxp3^-CD4⁺ T 세포의 tdLN으로의 귀소는 촉진하지 않았다 (도 2E, 도 6G). ATB는 madcam1 유전자 결핍을 표현형모사하였다 (도 2F). 실제로, ATB는 국부적으로 확장된 (장외, CFSE 음성) 세포로 구성된 tdLN의 선의의 Treg 풀을 거의 증가시키지 않았다 (도 6H, 좌측 패널). Tr17의 α4β7⁺ CFSE⁺ 장 이동 분획은 ATB 후 재집락화 동안 24시간당 도달된 tdLN에서 총 CD4⁺의 0.2±0.1%를 나타낸다 (도 6H, 중간 패널). 주목할 점은 재집락화 동안 이동한 장친화성 Tr17이 IL-17 뿐만 아니라 IL-22도 생성하였다는 것이다 (도 6H, 우측 패널).

중화 항-MADCAM-1 항체는 또한 CD25^높음 α4β7⁺ CD4⁺ T의 이동을 촉진하였다 (도 2G). ATB 과정 후 재집락화는 이. 클로스트리디오포르미스를 사용한 강제된 경구 위관영양에 의해 모방하려고 시도한 엔테로클로스터 종 (도 5F)의 출현이 동반되었다. 실제로, 이러한 박테리아는 PC (그러나 비 PC가 아님) TH17 CD25^높음 (및 CD25^-가 아님) α4β7⁺ Tr17-유사 CD4⁺T 세포의 tdLN 방향으로의 장 퇴거를 촉진하였다 (도 2H).

광전환은 정확한 세포내 염색 및 고차원 표현형분석을 허용하지 않기 때문에, 이. 클로스트리디오포르미스가 보충되거나 보충되지 않은 14일 ATB 과정 (또는 ATB 없음) 후 4일차에 mLN의 CFSE 주사 후 24시간에 tdLN에 도달하는 CFSE⁺ CD4⁺ T 세포의 랩소디-기반 단일 세포 RNA 시퀀싱을 수행하는 장 이동 세포의 더 깊은 특징화에 대해 자세히 살펴보았다 (도 7A-B). 각 4개 그룹에 각각 분배된 수확된 총 451,246개의 개별 CFSE⁺ CD4⁺ tdLN T 세포를 프로파일링하고 (도 7A-B), ATB-유도된 디스바이오시스와 연관된 유전자 시그니처를 특징화하였다. CFSE⁺ CD4⁺ T 세포의 비감독된 클러스터링은 데이터를 4개의 세포 클러스터로 분배하였으며 (도 2H, 좌측 패널), 이를 t-확률적 이웃 임베딩을 사용하여 시각화하고 보고된 마커 유전자의 발현에 의해 사후 라벨링하였다 (Cano-Gamez et al., 2020). 각 클러스터는 별개의 표현형과 연관되어 있었다. 작은 클러스터는 Foxp3, Nrp1, Il2ra, Tnfsf4, Ctla4에 의해 정의된 프로토타입 범-조직 이펙터 Treg 발현 패턴, 및 Tcf7 및 Cd52의 하향조절이 있는 장-특이적 유전자 발현 각인 (Tnfsf18, Rgs1)을 특징으로 한다 (Sefik et al., 2015) (도 2H, 중간 패널). 이러한 Treg 서브세트는 종양 면역저해에 관여하는 음성 면역 조절인자 Pik3ip1을 과다발현하였고 (Chen et al., 2019), 정상 상태와 비교하여 재집락화 단계 동안 CD4⁺ T 세포의 CD95L-매개 아폽토시스에 관여하는 전사 인자 AP1의 구성원인 Fosb를 하향조절하였으며 (Baumann et al., 2003) (도 7C), 또한 이. 클로스트리디오포르미스를 사용한 경구 위관영양 또는 재집락화 단계 동안 Tr17 청사진 (Sefik et al., 2015) (Iksf2 (헬리오스라고도 함) 및 Lrrc32 (TGFβ 활성화제 GARP라고도 함)와 연관된 유전자의 과다발현에 의해 모든 다른 이동 세포와 대조적이다 (도 7D 우측 및 좌측 패널). 대조적으로, 증식적 홀마크가 있는 또 다른 클러스터 (Pcna, Myc, Mapk1, Fyn, Hif1a)는 Irf8, 뿐만 아니라 Pou2af1 (전사 인자 OCT1 또는 OCT2의 전사 공동-활성화제로서 작용하는 OBF1이라고도 함) 및 Fas에 의해 지배되었으며, 둘 모두는 각각 IL-2 또는 IFNγ 발현을 저해함으로써 TH17 프로그램을 촉진한다 (Yosef et al., 2013) (도 2H, 우측 패널). 이러한 증식성 TH17 서브세트는 또한 범-조직 Treg (Il2rb, Ctla4, Icos), 장 Treg (예컨대 Bcl2a1a, Bcl6) 및 피부 Treg (Lgals3)와 프로토타입 마커를 공유하였다. 이. 클로스트리디오포르미스를 사용한 보충 및 ATB 중단-유도된 재집락화 동안, 인플라마솜과 독립적으로 병원체-특이적 Th17 반응의 최적 프라이밍에 필수적인 T 세포-내인성 유전자로서 설명된 카스파제 1 유전자 (Gao et al., 2020)는 TNFRSF 및 시토카인/케모카인 형질도입 및 NFkb 활성화 경로 (Nfkb1, Cxcr3, Cxcr5, Eomes, Tnfrsf8, Tnfrsf9, Tnf, Fasl, Fas, Tigit, Icam1, Runx3, Jak2)와 함께 상향조절되었다 (도 7E, 표 3). 나머지 두 개의 우세한 세포 클러스터는 장 염증 활성화 및/또는 저해의 프로토타입 Il7r 및 Pik3ip1 유전자 홀마크의 발현을 공유하였다 (Belarif et al., 2019; Chen et al., 2019). 이들은 재집락화 동안 Btla, Cnot2 및 Dusp2에 비해 다른 지문 예컨대 Egr1, Foxo1, Stat6, Ikbkb 전사 인자에 대해서는 약간 상이하지만 (도 7F-G), 모두 종양 면역저해 특성을 향해 수렴된다 (Dan Lu et al., 2020; Kim et al., 2019; Li et al., 2012).

따라서, 항-MAdCAM-1 mAb 또는 ATB-유도된 재집락화에 의해 MAdCAM-1/α4β7 축이 손상된 조건에서 2개의 독립적 추적 방법론에 의해 GALT로부터 종양 배액 림프절로 종양 면역감시에 잠재적으로 해로운 면역저해 지문을 나타내는 장친화성 α4β7⁺ CD4⁺, 가장 구체적으로 T_r17 세포의 퇴거를 입증하였다.

1.3. PD1 차단의 항암 효능은 MAdCAM-1/ α4β7 축에 의존한다

암 면역-감시 동안 Tr17 세포의 보고된 면역저해적 역할 (Blatner et al., 2012; Rizzo et al., 2018; Voigt et al., 2017) 및 이들 T 세포 서브세트를 유지하는 건강한 장의 능력을 고려하면, MADCAM-1 어드레신 또는 β7 인테그린의 유전적 결함 또는 특이적 항체에 의한 MADCAM-1 또는 α4β7 이종이량체의 숙주 중화는 치료용 항-PD-1 mAb의 면역자극 능력을 방해할 수 있다고 예상하였다.

첫째, 회장 Madcam1 발현의 손실은 PD1 차단과 상관없이 MCA205 종양 보유 동물의 증가된 종양 크기와 상관관계가 있었다 (도 8A). 다음으로, C57BL/6 마우스로부터의 동계 이식가능한 MCA205 섬유육종을 보유하는 야생형 동물과 비교하여 Itgb7 ^-/- 또는 Madcam1 ^-/- 마우스에서 PD-1 억제의 현저하게 감소된 항암 효능을 관찰하였다 (도 3A). 유사하게, MCA205 섬유육종, 동소이식 TC1 폐암 및 BALB/c 마우스로부터의 동계 4T1 유방암은 중화 항-MAdCAM-1 또는 항-α4β7 이종이량체 항체의 존재 하에 PD1 차단에도 불구하고 생체내에서 성장하였지만, MADCAM1/ α4β7 축이 영향을 받지 않았을 때 ICI에 반응하였다 (도 3B-D). Madcam1 ^-/- 마우스에서, 비장 (도 3E, 좌측 패널) 및 TIL의 최대 3%를 나타내는 종양 (도 3E, 우측 패널)에서 α4β7⁺ CD4⁺ T 세포의 재순환의 구성적 증가가 있었으며, 이는 이미 설명된 바와 같다 (Denning et al., 2005)). 유동 세포계측법 분석은 자발적 종양 진행 동안 중화 항-MADCAM-1 Ab를 사용한 MAdCAM-1 어드레신/ α4β7 인테그린 축의 차단이 TME를 재형성화하고 RORγt⁺ Treg (Foxp3⁺CD25⁺) T_r17 세포의 종양내 축적의 약 3배 증가를 유발하였음을 밝혔다 (도 3F-G). α4β7⁺ CD4⁺ TIL 중 최대 76±1.5%는 임의의 조작 없이 MCA205 TME의 α4β7^- CD4⁺ TIL (도 8B) 내에 함유된 2-3배 적은 (17±0.9%) RORγt⁺ Treg였다. 피하 종양에서, Treg는 α4β7⁺ CD4⁺ TIL의 12.1±1.0%를 나타내었고, 이들 Treg 중에서 30.4±4.5%는 RORγt⁺였다 (표 4).

표 4. MCA205 및 4T1 종양을 침범하는 장친화성 Tr17 서브세트 비율의 디콘볼루션.

4일 ATB 중단 후 재집락화는 madcam-1 유전자 결핍을 표현형모사하여 종양층에서 RORγt⁺ Treg (Tr17)의 비율의 3-5배 증가를 유도하였다 (도 3H). 주목할 점은 이러한 Tr17 종양내 귀소가 일시적이었으며 항-PD1 Ab가 투여된 경우를 제외하고는 ATB 중단 후 12일까지 더 이상 관찰되지 않았다는 것이다 (도 3H-I, 도 8C). 실제로, 항-PD1 Ab는 MCA205 종양 보유 마우스의 장간막 LN에서 Tr17의 프라이밍 및/또는 확장을 촉진하였다 (도 8D). 항-PD1 Ab는 MCA205 (도 3I, 도 8E) 뿐만 아니라 4T1 종양 보유자 (도 8F, 좌측 및 우측 패널)에서 Rorγt⁺ Treg 또는 IL-17⁺IL-22⁺ Treg로서 정의된 Tr17의 종양내 축적의 유지 및/또는 증폭에 기여하였다. 이러한 맥락에서, 종양내 Treg는 α4β7⁺ CD4⁺ TIL의 18.7±3.4%를 나타내었고 이들 Treg 중에서 56.7±8.3%는 RORγt⁺ 였다 (표 4).

PD1 억제에 의해 촉진된 Tr17 모집은 이. 클로스트리디오포르미스가 ATB 중단 후 경구 위관영양에 의해 보충되었을 때 추가로 증가된 반면, 유사한 조건에서 경구 락토바실러스 루테리는 그렇게 하지 못하였다 (도 8G, 우측 패널 및 좌측 패널). 놀랄 것 없이, 항-PD-1 mAb 요법 동안 MAdCAM-1/α4β7 축의 차단은 이펙터 CCR5⁺ CD8⁺ TIL의 침윤을 극적으로 손상시켰다 (도 3J).

IL-17 및 IL-22가 직간접적으로 프로-혈관신생 및 프로-종양형성 효과를 갖는다는 점을 고려하면 (Lim and Savan, 2014; Voigt et al., 2017), 시토카인 중 하나 또는 둘 모두를 중화하는 것은 PD1 억제 동안 ATB 후 재집락화의 해로운 효과를 회피할 수 있다. 항-IL-17A 중화 항체와 함께 항-PD1 Ab의 ip 주사에 의해 WT 또는 IL-22Rα1^-/- 결핍 유방 4T1 종양 세포의 종양형성 용량으로 접종된 마우스를 치료하는 작업을 수행하였다 (도 3K, 좌측 패널). 예상된 바와 같이, IL-22Rα1^-/- 결핍 유방 4T1은 WT 대응물보다 더 느리게 성장하였다. 흥미롭게도, 항-IL-17A 항체는 WT 또는 IL-22Rα1^-/- 결핍 4T1 둘 모두에 대해 유사한 정도로 ATB의 해로운 효과를 회피할 수 있으며 (도 3K), 이는 IL-22에 대한 종양 세포 반응성이 ATB의 면역저해 효과를 뒷받침하는 필수 메커니즘이 아니라는 것을 시사한다.

따라서, PD1 차단이 장내 디스바이오시스의 설정에서 GALT에서 TH17/Tr17의 종양으로의 귀소 및 증폭을 촉진한다고 결론을 내렸다.

외부 조작에 의해 α4β7/MAdCAM-1 축의 적합성을 재확립하는 것은 ATB로 치료되거나 명백한 장내 디스바이오시스를 앓고 있는 종양 보유자에서 PD-1 차단에 대한 저항성을 되돌릴 수 있다. PD1 차단을 시작하기 전에 장내 유바이오시스를 회복시키는 것은 합리적인 옵션을 나타낼 수 있다. 숙주가 경구 악케르만시아 무시니필라로 보상받지 않는 한, 단기간 ATB에 이어서 αPD-1 Ab에도 불구하고 재발하는 환자로부터의 분변 미생물 전달은 회장 Madcam1 하향조절 (도 1G) 및 PD-1 차단의 비효율성을 야기하였다 ((Routy et al., 2017), 도 1F, 도 9A). 외인성 에이. 무시니필라의 보상 효과는 중화 항체가 이러한 공생 약물의 유익한 효과를 방지하였기 때문에 MAdCAM-1 기능에 의존하였다 (도 9B). 에이. 무시니필라는 α4β7⁺ 및 CCR9⁺ 단일 또는 이중 양성 CD4⁺T 세포의 장 탈출 및 TME로의 재순환, tdLN으로의 재순환 (도 9A, 우측 패널) 뿐만 아니라 MADCAM-1 (도 9D)에 의존적인 방식으로 α4β7⁺ CD4⁺ IL-17⁺ IL-22⁺ 및 Tr17 (도 9C-D)의 것을 방지할 수 있었다.

따라서, 장내 유바이오시스를 회복시키거나 IL-17A를 중화하는 것은 PD1 차단에 대한 ATB-유도된 저항성에 대응하는 잠재적 옵션을 나타낸다.

1.4. 가용성 MAdCAM-1은 진행성 NSCLC 환자에서 PD1 차단에 대한 저항성의 예측적 바이오마커이다

장 조직 생검을 수득하기 어렵기 때문에, IBD를 앓고 있고 항-이종이량체 α4β7 항체 (예컨대 베돌리주맙)로 치료된 환자의 추적 조사를 연구하기 위해 사용하기 친숙한 혈액 검정 예컨대 sMAdCAM-1 ELISA가 개발되었다 (Holmer et al., 2020). 그러나, 가용성 MAdCAM-1 수준은 또한 마우스에서 모니터링되지 않았다. 회장 madcam1 유전자 발현과 혈청 가용성 MAdCAM-1 사이의 강력한 상관관계를 발견하였다 (도 4A). 다음으로, 프랑스 (N=186) 및 프랑스 및 캐나다 (N=115)에서 화학요법과 함께 또는 없이 항-PD1/L-1 항체로 치료된 진행성 비소세포 폐암 (NSCLC) 환자의 2개의 독립적 코호트에서 진단 시 혈청 가용성 MAdCAM-1의 임상적 유의성을 분석하였다 (표 5). 첫째, NSCLC 환자는 건강한 지원자와 비교하여 두 코호트 모두에서 감소된 순환 혈청 sMAdCAM-1 농도를 보였으며, ATB를 복용한 환자에서는 더욱 그렇다 (도 4B, 좌측 및 우측 패널). 실제로, ATB를 복용한 환자는 sMAdCAM-1 발현의 하위 삼분위수에 속하는 ATB-무함유 개체와 동일한 범위의 sMAdCAM-1 혈청 수준을 나타내었다 (도 4B). 전체 코호트의 중앙값보다 높은 sMAdCAM-1 혈청 수준을 나타내는 환자는 두 코호트 모두에서 나머지 절반과 비교하여 연장된 무진행 및 전체 생존을 가졌다 (도 4G). sMAdCAM-1 절대 혈청 농도의 증대와 각 코호트에 대한 바이오마커의 +10 U/ml 증가마다 8-10% 위험 감소로 사망 위험의 감소 사이에 선형 관계가 있었다 (도 10A, 우측 및 좌측 패널). ATB-치료된 환자는 MAdCAM-1^낮음 서브그룹에서 최악의 PFS를 나타내었다 (도 4F). 더욱이, 모델에서 ECOG-PS, 연령, 성별, PD-L1 발현, 요법 라인을 고려한 다변량 Cox 회귀 분석은 sMAdCAM-1이 NSCLC 환자에서 PD1 차단에 대한 임상적 이익의 독립적 예측자라는 결론을 내렸다 (표 6). 심혈관 사건 (HRHSCV)을 경험하는 고위험 과다 흡연자에서 초기 NSCLC 발생률을 예측하는 바이오마커로서 PD1 억제를 넘어 이러한 바이오마커의 임상적 관련성을 확장하였다 (PREVALUNG 연구, 표 7). 실제로, sMAdCAM-1 혈청 수준은 NSCLC 진단 6-12개월 전에 폐암 결절이 발생한 것으로 간주된 13명의 HRHSCV 개체에서 그렇지 않은 99명의 쌍형성된 대조군과 비교하여 유의하게 더 낮았다 (도 10B). 가용성 MAdCAM-1 수준은 전체 코호트에서 순환 α4β7⁺ Rorγt⁺ CD4⁺ T 세포 (도 10C)와 반상관관계가 있었다.

마지막으로, 진행성 NSCLC 환자에서 가용성 MAdCAM-1 혈청 수준과 장내 디스바이오시스 사이의 관계를 직접적으로 제시하기 위해, 정보의 요청된 모든 MG 및 혈청 조각을 제공하는 n=95 환자에서 샷건 메타게노믹스 (MG) 분석을 사용하여 sMAdCAM-1 혈청 수준의 중앙값에 따라 장내 미생물총의 분류학적 조성을 정의하는 메타게노믹스 종 (MGS)의 비감독된 및 감독된 계층적 클러스터링을 수행하였다. 첫째, MAdCAM-1^낮음 환자에서 MGS 풍부도의 감소가 있었다 (모든 112명의 NSCLC 환자의 중앙값에 기초하여 구분됨) (도 4C). 더욱이, 이러한 상이한 알파 다양성은 유의하게 상이한 베타-다양성이 동반되었는데, 이는 분류학적 장 조성이 두 서브세트 모두에서 유사하지 않았음을 의미한다 (도 5F). 비감독된 MG 분석은 실제로 또한 MAdCAM-1 중앙값에 기초하여 환자를 구분한 2개의 클러스터를 밝혔다 (피셔의 정확한 방법, p<0.05, 도 10D-E).

최종적으로, 마우스에서 발견되고 (도 1G 우측 패널) 대규모 NSCLC 환자에서 암울한 예후와 임상적으로 연관된 MGS 목록만을 선택하여 (Tsay et al., 2021; Zitvogel and Kroemer, 2021), (Derosa et al. 2022), 장내 이. 클로스트리디오포르미스 및 브이. 파르불라(V. parvula)의 더 높은 유병률을 갖는 환자가 낮은 수준의 sMAdCAM-1을 나타내는 환자라는 결론을 내리고 확인한다.

전체적으로, 이들 발견은 가용성 MAdCAM-1이 암 환자에서 PD1 차단에 대한 저항성을 예측하는 장내 디스바이오시스의 대용 마커임을 나타낸다.

표 5. MAdCAM-1 및 MG 조사를 위한 코호트 설명.

표 6. NSCLC 환자에서 sMAdCAM-1의 예측 값을 조사하는 다변량 분석.

표 7. 심혈관 질환을 앓고 있는 흡연자의 임상적 특징 및 폐암 발생률에 대한 추적조사 (Prevalung 연구).

논의

본 발명자들의 발견은 GALT가 장친화성 면역저해 T_H22/T_H17의 이동을 계속 체크하는 종양형성 프로세스에 의해 도전받는 숙주에서 회장의 중추적인 역할을 밝혔으며, 그 중 최대 20%는 Foxp3⁺CD25⁺ T_reg 세포이다. 장 및 TME 둘 모두는 수용체 또는 리간드 쌍을 발현하는 순환 림프구를 두고 경쟁하는 세포 인력 및 귀소 분자가 풍부하다. GALT로부터 종양층으로의 운명 맵핑을 가능하게 하는 도구를 사용하여, 장 거주성과 종양 침착물을 향한 화학유인 사이의 장친화성 T 세포의 운명 결정이 MAdCAM-1 어드레신/ α4β7 인테그린 분자 상호작용에 의해 적어도 부분적으로 제어된다는 것을 발견하였다.

첫째, ATB는 LP 회장 세정맥 및 점막 및 mLN의 HEV에서 MAdCAM-1 발현을 하향조절하여 장외 병변을 향한 α4β7+ Th17/Tr17 세포의 회장 탈출을 선호하였다. 둘째, MAdCAM 결핍 또는 중화는 ATB의 효과를 표현형모사하였다. Madcam-1 또는 β7 인테그린 유전자 결핍 마우스 또는 이들 분자를 표적화하는 중화 Ab를 받은 동물은 TME에 장-유래된 α4β7+ Tr17/TH17 세포를 축적함으로써 ICI에 반응하지 못하였다. 셋째, 회장 HEV (예컨대 에이. 무시니필라)에서 MAdCAM-1 발현을 회복시키거나 IL-17A 생체활성을 차단하는 것을 목표로 하는 조작은 종양 면역감시에서 ATB의 억제 효과를 보상하였다. 넷째, 엔테로클로스터 종 (예컨대 이. 클로스트리디오포르미스)을 사용한 강제된 경구 위관영양은 장친화성 Tr17의 tdLN으로의 탈출을 악화시켰다. 최종적으로, PD1 차단은 mLN에서 α4β7+ Tr17 세포의 확장 및/또는 프라이밍을 악화시키고 종양으로 다시 귀소시키고 암 면역감시를 손상시키는 경향이 있었다. 이러한 모든 증거는 ICI 시작 도중 또는 이후와는 대조적으로 ICI 투여 전에 ATB의 해로운 효과를 가리키는 역학적 연구를 뒷받침한다 (Derosa et al. 2022). 결과적으로, 혈청 가용성 MADCAM-1이 회장 madcam1 유전자 발현에 대한 생물학적 프록시이며 적어도 NSCLC 환자에서 PD1 차단에 대한 반응의 신뢰가능한 예측자를 나타냄을 제시한다. 낮은 sMADCAM-1 혈청 수준은 프로-TH17 박테리아 (예컨대 베일로넬라 파르불라) 또는 생리병리학적 장애와 연관된 엔테로클로스터 속으로부터의 종에 의해 지배되는 장내 디스바이오시스를 반영하였다 (Ghosh et al., 2020; Tsay et al., 2021; Zitvogel and Kroemer, 2021) (Derosa et al. 2022).

이 입증은 장-유래된 T_H17이 또한 장외 자가면역 (Magnuson et al., 2015; Morton et al., 2014; Wu et al., 2010) (Krebs et al., 2016; Lee et al., 2011b) 또는 염증성/허혈성 병변 (Benakis et al., 2016; Liesz et al., 2009)을 제어한다는 것을 제시하는 이전 증거를 따른다. RORγt⁺ Treg는 또한 본 발명자들의 ATB-유도된 장내 디스바이오시스 설정에서 상향조절된 것으로 밝혀진 유전자 산물 (예컨대 Ctla4, Icos, Havcr2 (Sefik Science 2015)의 과다발현이 있는 계통 관련된-Treg와 비교하여 악화된 면역저해적 표현형을 보유한다. 더욱이, 이전에 랜드마크 논문 (Miragaia et al., 2019; Munoz-Rojas and Mathis, 2021)에 기재된 본 발명자들의 Tr17 지문에서 장-특이적 Treg 특색, TH17 관련된 청사진 (Yosef et al., 2013) 뿐만 아니라 종양 면역감시와 기능적으로 관련된 면역저해 형질 (예컨대 Dusp2/PCA1 (Dan Lu et al., 2020), PIK3ip1 (Uche et al., 2018)을 식별하였다.

암 보유자에서 이러한 예시는 염증성 장 질환을 앓고 있는 환자 또는 마카크에서 수행된 이전 연구와 일치하며, 항-α4β7 항체 베돌리주맙을 사용한 치료 동안 장외 α4β7⁺ T_reg 및 중추 기억 T 세포 또는 CCR6⁺ CD4⁺ T 림프구의 증가된 재순환을 보고하였다 (Calenda et al., 2018; D'Haens et al., 2018; Fischer et al., 2016). 본 발명자들의 발견은 중요한 임상적 의미를 갖는다. 지금까지, 베돌리주맙은 장-제한된 작용 방식으로 인해 ICI-유도된 자가면역 결장염을 앓고 있는 암 환자에서 TNFα 억제에 대한 더 안전한 대안으로서 간주되었다 (Sandborn et al., 2016). 그러나, 전향적 연구는 마이크로바이옴 조성, 장 또는 가용성 혈청 MAdCAM-1 발현, 뿐만 아니라 CCR9 α4β7⁺ T_reg, Tr17 및 T_h22 세포 서브세트의 재순환을 모니터링하여 이들 신규 파라미터를 ICI로 치료된 환자의 임상 결과 및 독성 프로파일과 연관시켜야 한다. 최종적으로, 분변 미생물 이식 분야는 암 보유 수용자의 MADCAM-1 수준을 정규화하는 능력에 기초하여 공여자 분변 선택을 안내하는 방향으로 진화할 수 있다.

이러한 발견은 암 보유 환자가 가장 강력한 장 면역 체크포인트 MADCAM-1 중 하나를 변경하는 항생제를 복용함으로써 암-연관된 회장병증을 악화시킬 수 있다는 개념을 뒷받침한다 (Yonekura et al., 2022). ATB-유도된 디스바이오시스 및 가장 구체적으로 ATB 과정 후 재집락화가 장 면역 체크포인트 MADCAM-1의 주요 조절인자라고 추측한다. 여러 분자 단서는 GALT MADCAM-1의 변경 예컨대 담즙 염의 박테리아-유도된 대사의 교란 (Campbell et al., 2020; Song et al., 2020), 및 예를 들어 추가 조사가 필요한 교감 신경계의 활성화 (Schiller et al., 2021; Yan et al., 2021)와 장내 디스바이오시스를 연결할 수 있다.

실시예 2: 가용성 MAdCAM-1은 여러 고형암에서 PD1 차단에 대한 저항성의 예측적 바이오마커이다

2.1. 가용성 MADCAM-1은 신장암 환자에서 PD1 차단에 대한 저항성의 예측적 바이오마커이다

실시예 1에서, 진행성 비소세포 폐암 환자 (NSCLC)의 2개의 독립적 코호트에서, 혈청 가용성 MAdCAM-1 수준이 면역-종양학 (I-O) 요법에 대한 저항성 또는 민감성의 마커라는 것을 제시하였으며, 여기서 혈청 가용성 MAdCAM-1의 감소된 수준은 I-O 요법에 대한 저항성의 마커이다.

여기서, 이러한 발견을 또 다른 암 유형으로 확장한다: 제2 라인 요법에서 니볼루맙으로 치료된 신장암 (티로신 키나제 억제제의 실패 후) (표 8).

표 8. 환자의 임상적 특징

전반적으로, NIVOREIN 코호트로부터의 212명의 환자가 항-PD1 mAb (니볼루맙, BMS)를 받기 위해 등록되었다. 31명은 항생제 사용자 (치료 개시 후 -60일차부터 +42일차 사이)였으며, 176명은 항생제를 복용하지 않았다. 기준선에서 혈청 가용성 MAdCAM-1의 ELISA 모니터링을 수행하였으며, 이는 이들 212명의 전이성 투명 세포 신장 세포 암종 (RCC) 환자의 경우에 중앙값 (min,max)은 88.8 ng/ml (19.1, 174.7) (및 평균±SD는 88.4 ±27.7 ng/ml)임을 밝혔다. NSCLC 환자에 대해 제시된 바와 같이, 항생제 섭취 (ATB)는 sMAdCAM-1의 농도를 감소시키는 경향이 있었다 (ATB 복용을 자제한 환자에서 중앙값은 88.7 ng/ml이며, 이는 ATB를 복용한 환자에서 76.3 ng/ml로 감소하였음). 주목할 점은 이들 ATB+환자의 대다수 (23/31)가 (임상적으로 덜 유의한) 항-PD1 Ab의 개시 후 ATB를 복용하였기 때문에 이는 과소추정되었다는 것이다.

212명의 환자의 전체 코호트에 대해 항-PD1 Ab 개시 직전 sMAdCAM-1 기준선 수준의 중앙값에 따라 전체 생존 (OS)을 분석하였다. RCC 환자의 카플란 마이어 OS 곡선은 sMAdCAM-1 혈청 수준 <88.8 ng/ml를 나타내는 환자가 72/106 사례에서 사망한 반면, sMAdCAM-1 혈청 농도 ≥88.8 ng/ml를 갖는 환자에서 사망률은 36/106임을 제시한다 (p<10e-4) (도 11). 병기 IV RCC의 생존에 영향을 미치는 모든 임상적 인자 예컨대 연령, IMDC 스코어, 요법 라인 및 전이 위치 및 저알부민혈증을 포함하는 다변량 분석으로 이러한 예후 파라미터를 분석하였다. 다변량 분석은 sMAdCAM-1 <88.8 ng/ml가 위험 비율로 IMDC 스코어보다 우수함을 밝혔다: sMAdCAM-1의 경우에 2.40 (1.52-3.80, p=0.0002) 대 IMDC 중증의 경우에 HR= 2.29 (1.11-4.76, p=0.08) (표 9).

표 9. 병기 IV 제2 라인 aPD1 Ab-치료된 RCC 환자의 전체 생존에 대한 혈청 sMAdCAM-1 <88.8ng/ml의 예후 유의성의 다변량 Cox 모델

212명의 환자의 전체 코호트에 대해 항-PD1 Ab 개시 직전 sMAdCAM-1 기준선 수준의 중앙값에 따라 무진행 생존 (PFS)을 분석하였다. RCC의 카플란 마이어 PFS 곡선은 sMAdCAM-1 혈청 수준 <88.8 ng/ml를 나타내는 환자가 99/106 사례에서 진행한 반면, sMAdCAM-1 혈청 농도 ≥88.8 ng/ml를 갖는 환자에서 진행률은 86/106임을 제시한다 (p<10e-4) (도 12). 병기 IV RCC의 생존에 영향을 미치는 모든 임상적 인자 예컨대 연령, IMDC 스코어, 요법 라인 및 전이 위치 및 저알부민혈증을 포함하는 다변량 분석으로 이러한 예후 파라미터를 분석하였다. 다변량 분석은 sMAdCAM-1 <88.8 ng/ml가 IMDC 스코어만큼 양호함을 밝혔다 (표 10, HR= 1.55, p=0.0071).

표 10. 병기 IV 제2 라인 aPD1 Ab-치료된 RCC 환자의 무진행 생존에 대한 혈청 sMAdCAM-1 <88.8ng/ml의 예후 유의성의 다변량 분석

객관적 반응률 (ORR)에 관하여, NIVOREN 연구 (N=729 RCC 환자)는 20.8%의 객관적 반응률 (1.2%의 완전 반응 및 19.6%의 부분 반응, 79.2%의 진행성 질환 (PD))을 기록하였다. 흥미롭게도, sMAdCAM-1 혈청 수준이 이용가능한 212명의 RCC 환자의 서브그룹은 ATB 섭취 예/아니오 및 sMAdCAM-1 (≥88.8 대 <88.8 ng/ml)에 따라 세분화되었다. 첫째, sMAdCAM-1에 따른 최상의 객관적 반응의 서브그룹 분석은 sMAdCAM-1 ≥88.8 대 <88.8 ng/ml를 갖는 환자에서 PD 백분율이 각각 36.7% vs 62.6%임을 밝혔다 (p=0.0003) (표 10). 다음으로, ATB를 복용하지 않은 환자만을 고려하였을 때, sMAdCAM-1에 따른 최상의 객관적 반응의 동일한 서브그룹 분석은 sMAdCAM-1 ≥88.8 vs <88.8 ng/ml를 갖는 환자에서 PD 백분율이 각각 38.6% vs 60.5%임을 밝혔다 (p=0.0044). 셋째, ATB를 복용한 RCC 환자를 고려하였을 때, sMAdCAM-1에 따른 최상의 반응률의 이러한 서브그룹 분석은 sMAdCAM-1 ≥88.8 대 <88.8 ng/ml를 갖는 환자에서 PD 백분율이 각각 36.4% 대 76.9%임을 밝혔다 (p=0.0446). ATB-치료된 서브그룹에서, 완전 반응자의 백분율은 sMAdCAM-1 ≥88.8 대 <88.8 ng/ml를 갖는 갖는 환자에서 각각 18.2% 대 7.7%였다 (하기 표 11).

표 11. 전체 반응률

전체적으로, 이들 발견은 혈청 가용성 MAdCAM-1의 높은 수준이 RCC의 제2 라인 면역요법에서 PD1 차단에 대한 증가된 반응과 연관되어 있으며 항생제를 복용한 환자의 경우에 더욱 그러하다는 것을 입증한다. 88 ng/ml의 역치는 제2 라인에 유효하지만 제1 라인 환자를 대표하지는 않는다. 일상적 사용의 경우, 1L 또는 2L 요법의 코호트의 중앙값을 고려해야 한다.

2.2. 가용성 MADCAM-1은 방광암 환자에서 PD1 차단에 대한 저항성의 예측적 바이오마커이다

최종적으로, 1500 mg의 두르발루맙 iv (항-PD-L1 Ab)/4주의 고정된 용량을 받는 사전-치료된 전이성 방광암 환자를 등록시킨 3a상 연구의 서브코호트에서 sMAdCAM-1의 예측 값을 3중으로 하고자 하였다. 이러한 STRONG 연구에서, 79명의 환자만을 분석하였으며, 전체 중앙값 OS는 5.79개월이고 중앙값 PFS는 2.79개월이었다. STRONG 코호트의 극단, 30명의 엘리트 환자 (OS>6개월, PFS>5개월, PR+CR만) 및 급속 진행자 (n=49, OS<6개월 및 PFS<5개월 및 제1 CT 스캔에서 PD)를 선택하였다. 이러한 코호트에서, MAdCAM-1 중앙값 (min,max)은 158.8 ng/ml (53.41, 244.36)였다. 도 13A에서, sMAdCAM-1의 중앙값 ±SEM이 진행자에서 극적으로 감소되었으며 OS가 다른 절반과 비교하여 sMAdCAM-1 > 158.8 ng/ml의 기준선 수준을 나타내는 환자의 전반부에서 유의하게 더 양호하였음을 제시한다 (도 13B, p=0.03). PFS는 높은 MAdCAM-1 수준을 갖는 환자에서 우수한 경향이 있었다 (도 13C, ns).

2.3. 결론

전체적으로, 이들 발견은 혈청 가용성 MAdCAM-1의 높은 수준이 RCC의 제2 라인 면역요법, 제2 라인 전이성 방광 종양 및 ATB 섭취와 상관없이 펨브롤리주맙으로 치료된 1L 및 2L NSCLC에서 PD1/PDL-1 차단에 대한 증가된 반응과 연관되어 있음을 입증한다.

약어:

α4β7: 알파4베타7, Ab: 항체, ACS: 암피실린, 콜리스틴, 스트렙토마이신, ATB: 항생제, ATRA: 올-트랜스 레티노산, CCL: 케모카인 리간드, CCR: 케모카인 수용체, CD: 분화 클러스터, cDC1: 고전적 수지상 세포 유형 1, CFSE: 카르복시플루오레세인 숙신이미딜 에스테르, cLN: 대측성 림프절, CSF-1: 콜로니 자극 인자 1, CTL: 세포독성 T 림프구, FMT: 분변 점막 전달, FoxP3: 포크헤드 박스 P3, GALT: 장-연관된 림프상 조직, HEV: 고내피 세정맥, IBD: 염증성 장 질환, ICI: 면역 체크포인트 억제제, IFNγ: 인터페론 γ, LP: 고유판, mAB: 모노클로날 항체, MAdCAM-1: 점막 어드레신 세포 부착 분자-1, mLN: 장간막 림프절, PP: 파이어 패치, RA: 레티노산, RORC: RAR-관련된 고아 수용체 C, SLO: 이차 림프상 장기, tdLN: 종양 배액 림프절, T_H17: T-헬퍼 17-CD4-T-세포, TME: 종양 미세환경, TNFα: 종양 괴사 인자 알파, T_reg: 조절 T-세포, Tr17: RORγt+ T_reg -CD4-T-세포.

Claims (16)

1. 면역-종양학 (I-O) 요법에 대한 저항성 또는 민감성의 마커로서의 혈청 가용성 MAdCAM-1 수준의 용도로서, 여기서 혈청 가용성 MAdCAM-1의 감소된 수준은 I-O 요법에 대한 저항성의 마커인 용도.
2. 암- 또는 항생제-연관된 디스바이오시스의 마커로서의 혈청 가용성 MAdCAM-1 수준의 용도로서, 여기서 혈청 가용성 MAdCAM-1의 감소된 수준은 암- 또는 항생제-연관된 디스바이오시스의 마커인 용도.
3. 암을 갖는 개체에서 암 또는 항생제-연관된 장내 디스바이오시스를 시험관내 진단하는 방법으로서, 혈청 가용성 MAdCAM-1을 측정하는 것을 포함하며, 여기서 혈청 가용성 MAdCAM-1의 감소된 수준은 개체가 암- 또는 항생제-연관된 장내 디스바이오시스를 갖는다는 것을 나타내는 것인 방법.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 혈청 가용성 MAdCAM-1의 수준이, 그것이 대표적인 코호트에서의 가용성 MAdCAM-1 수준의 중앙값보다 낮은 경우에 감소된 것으로 간주되는 것인 용도 또는 방법.
5. 암을 갖는 개체가 면역-종양학 (I-O) 요법의 투여 전에 보상성 미생물총-중심 중재 (MCI)를 필요로 하는지 결정하기 위한 테라노스틱 방법으로서, 제3항 또는 제4항에 따른 방법을 사용하여 개체가 암- 또는 항생제-연관된 디스바이오시스를 갖는지 여부를 평가하는 것을 포함하며, 여기서 개체가 암- 또는 항생제-연관된 디스바이오시스를 갖는 경우에, 개체는 I-O 요법을 사용한 치료의 투여 전에 MCI를 필요로 하는 것인 테라노스틱 방법.
6. 제5항에 있어서, I-O 요법을 사용한 상기 치료가, 단독의 또는 또 다른 항신생물제와 조합된, 항-PD1 항체 (Ab), 항-PDL-1 Ab, 항-CTLA4 Ab, 항-Lag3 Ab, 항-Tim3 Ab, 항-TIGIT Ab, 항-OX40 Ab, 항-41BB Ab, 항-VISTA Ab, PD1 및 Lag3을 표적화하는 이중특이적 항체, CAR-T 세포, 입양 TIL 전달 및 이들의 임의의 조합, 특히 면역 체크포인트 억제제 (ICI)와 탁산, 시스플라틴 및/또는 옥살리플라티늄의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 테라노스틱 방법.
7. 제5항 또는 제6항에 있어서, MCI가 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 테라노스틱 방법:
   - 경구용 반코마이신 항생제,
   - 엔테로클로스터(Enterocloster) 신규 속 클레이드의 박테리아를 사멸시키는 파지,
   - 엔테로클로스터 신규 속 클레이드의 박테리아를 사멸시키도록 조작된 희귀-절단 엔도뉴클레아제 예컨대 Crispr Cas9,
   - 악케르만시아(Akkermansia) 종 및/또는 악케르만시아 무시니필라(Akkermansia muciniphila), 가능하게는 다른 유익한 박테리아와 혼합된 것,
   - 레티노산
   - 분변 미생물 이식, 및
   - 이들의 혼합물.
8. 암-유도된 디스바이오시스를 갖는 개체에서 I-O 요법과 조합하여 암을 치료하기 위한 MCI용 작용제로서, 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 작용제:
   - 경구용 반코마이신 항생제,
   - 엔테로클로스터 신규 속 클레이드의 박테리아를 사멸시키는 파지,
   - 엔테로클로스터 신규 속 클레이드의 박테리아를 사멸시키도록 조작된 희귀-절단 엔도뉴클레아제 예컨대 Crispr Cas9,
   - 악케르만시아 종 및/또는 악케르만시아 무시니필라, 가능하게는 다른 유익한 박테리아와 혼합된 것,
   - 분변 미생물 조성물, 및
   - 이들의 혼합물.
9. MCI의 성공을 추적조사하는 방법으로서, 혈청 가용성 MAdCAM-1을 측정하는 것을 포함하며, 여기서 혈청 가용성 MAdCAM-1의 정규화된 수준은 MCI가 장내 유바이오시스를 성공적으로 회복시켰다는 것을 나타내는 것인 방법.
10. 심혈관 사건 (HRHSCV)을 경험하는 고위험 과다 흡연자에서 초기 NSCLC 발생률을 예측하는 바이오마커로서의 혈청 가용성 MAdCAM-1 수준의 용도로서, 여기서 혈청 가용성 MAdCAM-1의 감소된 수준은 NSCLC 발병을 예측하는 마커인 용도.
11. 가용성 MAdCAM의 낮은 혈청 수준을 갖는 환자에서 암 치료에 사용하기 위한, (i) 항-PD1 또는 항-PDL1 항체 및 (ii) 항-IL17A 또는 항-IL17R 항체 및/또는 재조합 IL-7을 포함하는 조합된 요법.
12. (i) MAdCAM-1을 발현하는 또는 MAdCAM-1 프로모터의 제어 하에 리포터 유전자를 발현하도록 조작된 배양된 세포를 테스트 화합물과 시험관내 접촉시키는 단계 및 (ii) 상기 화합물 중 어느 것이 MAdCAM-1의 발현 또는 MAdCAM-1 프로모터의 제어 하에 발현되는 리포터 유전자의 발현을 유도하였는지 평가하는 단계를 포함하는, 고유판의 내피 세포에서 MAdCAM-1 발현 수준을 정규화할 수 있는 작용제를 식별하기 위한 스크리닝 방법.
13. 테스트 화합물을 장 인간화 아바타 마우스에 투여하는 것을 포함하는, 고유판의 내피 세포에서 MAdCAM-1 발현 수준을 정규화할 수 있는 작용제를 식별하기 위한 스크리닝 방법.
14. 제12항 또는 제13항에 있어서, 배양된 세포 상에서 또는 아바타 마우스에서의 다른 실험에서 수득된 결과를 검증하는 단계를 포함하며, 여기서 아바타 마우스는 8-10일 광범위 스펙트럼 ATB로 사전-치료되고 이어서 경구 위관영양에 의해 인간 FMT 산물에 의해 재집락화된 장 인간화 마우스이고, 여기서:
    (i) FMT 산물은 배양된 세포에서 MAdCAM-1의 발현을 유도하는 것으로 식별된 화합물이거나, 또는
    (ii) FMT 산물은 배양된 세포에서 MAdCAM-1의 발현을 유도하지 않는 것으로 식별되었고, HUVEC 세포에서 MAdCAM-1의 발현을 유도하는 것으로 식별된 또 다른 화합물로 풍부화되었거나; 또는
    (iii) FMT은 유바이오시스 또는 높은 가용성 MADCAM-1과 연관된 분류학적 조성을 갖는 것인
    방법.
15. 제13항 또는 제14항에 있어서, 하기를 포함하는 방법:
    (i) 위관영양 후 8일까지, FMT 수용자에서 MAdCAM-1 및 Foxp3-기반 회장 PCR을 실행하기 위해 장 인간화 아바타 마우스 중 일부를 희생시키고 이를 대조군과 비교하는 단계;
    (ii) 장-인간화 아바타 마우스에서 MAdCAM-1의 유의한 상향조절의 경우, 각 그룹의 적어도 3마리의 마우스에 피하 육종을 접종하고 이들을 항-PD1 Ab로 치료하여 이러한 FMT가 ATB-치료된 마우스와 비교하여 치료 효능을 매개할 수 있다는 것을 보장하는 단계;
    (iii) 장-인간화 아바타 마우스가 항-PD1 Ab를 사용한 치료에 반응하는 경우에, FMT 산물 또는 이를 풍부화하는데 사용된 비-FMT 화합물이 고유판의 내피 세포에서 MAdCAM-1 발현 수준을 정규화할 수 있는 것으로 추론하는 단계.
16. MAdCAM-1 프로모터의 제어 하에 리포터 유전자를 발현하는 세포, 및 산물의 은행에서 작용제를 픽킹하고 이들을 배양된 세포에 전달하고 리포터 유전자의 발현을 평가하도록 구성된 로봇을 포함하는, 제12항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 방법을 수행하기 위한 스크리닝 플랫폼.

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