JP2022539584A - 膵臓癌の処置のための方法および組成物 - Google Patents

Abstract

本発明は、膵管腺癌（ＰＤＡＣ）などの膵臓癌の処置に有用な種々の組成物および方法、ならびに膵臓組織特異的抗腫瘍Ｔ細胞免疫を活性化するための方法を提供する。ある態様において、かかる方法は、ＩＬ３３の投与を含む。ある態様において、かかる方法は、ＰＤ－１および／またはＰＤ－Ｌ１阻害剤の投与を含む。

Description

関連出願相互参照
本出願は、２０１９年６月３０日に出願された米国仮特許出願第６２／８６８，９７６号および２０１９年１１月１８日に出願された米国仮特許出願第６２／９３７，２１９号に基づく優先権の利益を主張し、それぞれの内容は、引用によりその全体が本明細書中に包含される。

配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含み、その全体が引用により本明細書に包含される。２０２０年６月３０日に作成された当該ＡＳＣＩＩコピーは、MSKCC_042_WO1_SL.txtと称され、１５，９８３バイトのサイズである。

引用による包含
引用による包含が認められている法制下において、本明細書で引用されたすべての文献は、その内容全体が引用により本明細書中に包含される。また、本明細書で引用または言及された製品の製造者の説明書またはカタログも、引用することにより包含される。引用により本明細書中に包含された文献、またはその中の何らかの教示は、本発明の実施に用いられ得る。本明細書の文章に続く上付きの数字は、本特許出願の“文献リスト”のセクションで特定される番号の付いた文献を意味する。

背景
ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１経路およびＣＴＬＡ－４経路を標的とする抗体は、がん免疫療法として有用である。しかしながら、ほとんどの癌は、既存の抗腫瘍Ｔ細胞を欠き、応答しない。膵管腺癌（ＰＤＡＣ）は、最も免疫療法に対する耐性が高く、致死性の癌の一つである。そのため、免疫療法耐性ＰＤＡＣを含むＰＤＡＣの新規かつ改善された治療方法が緊急に必要とされている。本発明は、この必要性を満たすものである。

発明の概要
本発明は、本明細書の実施例により詳細に記載されている一連の重要な発見に一部分基づくものである。簡単にまとめると、膵管腺癌（ＰＤＡＣ）の長期生存者のユニークなコホートを用いて、グループ２先天性リンパ球（ＩＬＣ２）およびＩＬＣ２活性化リガンドインターロイキン（ＩＬ）－３３の腫瘍発現が、腫瘍免疫細胞溶解活性および長期患者生存と正の相関を示すことが見出された。ＰＤＡＣマウスモデルを用いて、ＩＬ３３－ＩＬＣ２軸が膵臓組織特異的抗腫瘍Ｔ細胞免疫を活性化することが見いだされた。驚くべきことに、組換えＩＬ３３（ｒＩＬ３３）がＰＤＡＣ ＴＩＬＣ２およびＣＤ８^＋ Ｔ細胞を活性化し、試験対象のマウスの７０％以上を治癒させることが見いだされた。さらに、ｒＩＬ３３治療およびＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１経路遮断（αＰＤ－１を使用）の併用により、ＰＤ－１部分感受性モデルおよびＰＤ－１耐性モデルの両方で、膵臓組織特異的ＩＬＣ２が相乗的に増殖し、αＰＤ－１の抗腫瘍効果が増強されることが明らかにされた。重要なことは、極めて侵攻性の高いＰＤ－１耐性腫瘍モデルにおいて、ｒＩＬ３３またはαＰＤ－１単独での処置では効果が限られていたのに対し、ｒＩＬ３３とαＰＤ－１を併用すると、他のすべての治療よりも腫瘍が著しく小さくなり、腫瘍体積が約４０％減少し、生存期間が５０％改善した。これらの発見、および本明細書に記載の他の発見に基づいて、本発明は、膵臓癌の処置のための様々な新規かつ改良された組成物および方法を提供する。

例えば、一態様において、本発明は、それを必要とする対象において膵管腺癌（ＰＤＡＣ）を処置する方法を提供し、この方法は、ＰＤＡＣを有する対象に有効量のＩＬ３３を投与し、それによって該対象におけるＰＤＡＣを処置することを含む。

別の態様において、本発明は、それを必要とする対象において膵管腺癌（ＰＤＡＣ）を処置する方法であって、ＰＤＡＣを有する対象に有効量の：（ａ）ＩＬ３３および（ｂ）ＰＤ－１および／またはＰＤ－Ｌ１阻害剤とを投与し、それによって、対象におけるＰＤＡＣを処置することを含む、方法を提供する。

さらに別の態様において、本発明は、それを必要とする対象において膵臓組織特異的抗腫瘍Ｔ細胞免疫を活性化する方法であって、ＰＤＡＣを有する対象に有効量のＩＬ３３を投与し、それによって対象における組織特異的抗腫瘍Ｔ細胞免疫を活性化することを含む、方法を提供する。そのような態様のいくつかでは、膵臓組織特異的抗腫瘍Ｔ細胞免疫の活性化は、膵臓ＩＬＣ２細胞の活性化／増殖および／またはＣＤ８^＋Ｔ細胞の活性化を含む。

別の態様において、本発明は、それを必要とする対象において膵臓組織特異的抗腫瘍Ｔ細胞免疫を活性化する方法であって、ＰＤＡＣを有する対象に有効量の（ａ）ＩＬ３３および（ｂ）ＰＤ－１および／またはＰＤ－Ｌ１阻害剤とを投与し、それによって、対象において膵臓組織特異的な抗腫瘍Ｔ細胞免疫を活性化することを含む、方法を提供する。そのような態様のいくつかでは、膵臓組織特異的抗腫瘍Ｔ細胞免疫の活性化は、膵臓ＩＬＣ２細胞の活性化／増殖および／またはＣＤ８^＋Ｔ細胞の活性化を含む。

別の態様において、本発明は、膵臓ＩＬＣ２細胞を活性化する方法であって、膵臓ＩＬＣ２細胞を有効量のＩＬ３３と接触させ、それによって膵臓ＩＬＣ２細胞を活性化することを含む、方法を提供する。

別の態様において、本発明は、膵臓ＩＬＣ２細胞を活性化する方法であって、膵臓ＩＬＣ２細胞を有効量（ａ）ＩＬ３３および（ｂ）ＰＤ－１および／またはＰＤ－Ｌ１阻害剤と接触させ、それによって膵臓ＩＬＣ２細胞を活性化させることを含む、方法を提供する。

別の態様において、本発明は、ＰＤＡＣ腫瘍および／または膵臓ＩＬＣ２細胞をＰＤ－１および／またはＰＤ－Ｌ１阻害剤に対して感受性にする方法であって、ＰＤＡＣ腫瘍および／または膵臓ＩＬＣ２細胞を有効量のＩＬ３３と接触させ、それによってＰＤＡＣ腫瘍および／または膵臓ＩＬＣ２細胞をＰＤ－１および／またはＰＤ－Ｌ１阻害剤に対して感受性にすることを含む、方法を提供する。

いくつかの態様において、本発明は、（ａ）ＩＬ３３および（ｂ）ＰＤ－１および／またはＰＤ－Ｌ１阻害剤を含む組成物を提供する。例えば、いくつかの態様において、本発明は、（ａ）ＩＬ３３および（ｂ）ＰＤ－１および／またはＰＤ－Ｌ１阻害剤を含む、ＰＤＡＣの処置における使用のための組成物を提供する。

いくつかの態様において、上記にまとめた、または本明細書の他の箇所に記載された方法は、対象の腫瘍および／または膵臓がＩＬ－３３受容体を発現するＩＬＣ２細胞を含むかどうかを決定する予備的工程、またはＩＬＣ２細胞がＩＬ－３３受容体を発現するかどうかを決定する予備的工程もまた含む。そのような態様のいくつかにおいて、ＩＬ３３および／またはＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、対象の腫瘍および／または膵臓がＩＬ－３３受容体を発現するＩＬＣ２細胞を含む場合にのみ、対象に投与される。同様に、そのような態様のいくつかにおいて、ＩＬＣ２細胞がＩＬ－３３受容体を発現している場合にのみ、ＩＬＣ２細胞をＩＬ３３および／またはＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１阻害剤と接触させる。

いくつかの態様において、本発明は、様々な細胞治療方法を提供する。例えば、一態様において、本発明は、それを必要とする対象における膵管腺癌（ＰＤＡＣ）を処置する方法であって、ＰＤＡＣを有するレシピエント対象に有効量の活性化ドナー膵臓ＩＬＣ２細胞を投与することであって、ここでドナー膵臓ＩＬＣ２細胞はドナー対象から得られ、そしてＩＬ３３との接触によりエクスビボ／インビトロで活性化しており、かつドナー対象およびレシピエント対象が同種であり、それによってレシピエント対象におけるＰＤＡＣを処置することを含む、方法を提供する。

同様に、別の態様において、本発明は、それを必要とする対象において膵管腺癌（ＰＤＡＣ）を処置する方法であって、（ａ）ドナー対象から得られたドナー膵臓ＩＬＣ２細胞をＩＬ３３とエクスビボ／インビトロで接触させて、活性化ドナー膵臓ＩＬＣ２細胞を作製すること、および（ｂ）ドナー活性化膵臓ＩＬＣ２細胞を膵管腺癌（ＰＤＡＣ）を有するレシピエント対象に投与し、ここでドナー対象およびレシピエント対象は同種であり、それによりレシピエント対象においてＰＤＡＣを処置することを含む、方法を提供する。

同様に、さらに別の態様において、本発明は、それを必要とする対象において膵管腺癌（ＰＤＡＣ）を処置する方法であって、（ａ）ドナー対象からドナー膵臓ＩＬＣ２細胞を得ること、（ｂ）ドナー膵臓ＩＬＣ２細胞をＩＬ３３とエクスビボ／インビトロで接触させて活性化ドナー膵臓ＩＬＣ２細胞を作製すること、および（ｃ）膵管腺癌（ＰＤＡＣ）を有するレシピエント対象に対して活性化ドナー膵臓ＩＬＣ２細胞を投与し、ここでドナー対象およびレシピエント対象が同種であり、それによりレシピエント対象におけるＰＤＡＣを処置することを含む、方法を提供する。

いくつかの態様において、上記または本明細書の他の箇所に記載された細胞治療方法はまた、活性化ドナー膵臓ＩＬＣ２細胞をレシピエント対象に投与する前に、ドナー膵臓ＩＬＣ２細胞および／または活性化ドナー膵臓ＩＬＣ２細胞をエクスビボ／インビトロで増殖させる工程も含む。上記または本明細書の他の箇所に記載された細胞治療方法のいくつかにおいて、レシピエント対象に投与されるドナー膵臓ＩＬＣ２細胞は、ＩＬＣ２細胞の実質的に純粋な集団である。ＩＬＣ２細胞のそのような実質的に純粋な集団は、任意の適切な細胞単離／精製方法、例えば、１以上の膵臓ＩＬＣ２マーカー（本特許出願明細書の実施例部分に記載されているものなど）の存在に基づく細胞選別によって得ることができる。上記または本明細書の他の箇所に記載された細胞治療方法のいくつかでは、ドナー対象およびレシピエント対象は、方法が自己細胞治療方法であるように、同じ個体である。同様に、上記または本明細書の他の箇所に記載された細胞治療方法のいくつかでは、ドナー対象およびレシピエント対象は、同じＭＨＣ／ＨＬＡ型を有する。

上記でまとめたまたは本明細書の他の箇所に記載された態様のいくつかでは、対象（細胞治療方法の場合、ドナー対象および／またはレシピエント対象を含む）は、ヒトである。本明細書において上記にまとめたまたは他の箇所に記載された態様のいくつかでは、対象（細胞治療方法の場合、ドナー対象および／またはレシピエント対象を含む）は、非ヒト哺乳動物である。本明細書において上記にまとめたまたは他の箇所に記載された態様のいくつかでは、対象（細胞治療方法の場合、ドナー態様および／またはレシピエント対象を含む）は、マウスである。本明細書において上記にまとめたまたは他の箇所に記載された態様のいくつかでは、対象（細胞療法方法の場合、ドナー対象および／またはレシピエント対象を含む）は、ＰＤ－１および／またはＰＤ－Ｌ１阻害剤処置に対して部分的または完全に耐性を有するＰＤＡＣを有する。

上記でまとめたまたは本明細書の他の箇所に記載された態様のいくつかでは、ＩＬ３３は、組換えＩＬ３３である。上記でまとめた、または本明細書の他の箇所に記載された態様のいくつかでは、ＩＬ３３はヒトＩＬ３３である。本明細書において上記にまとめた、または他の箇所に記載された態様のいくつかでは、ＩＬ３３は組換えヒトＩＬ３３である。上記でまとめたまたは本明細書の他の箇所に記載された態様のいくつかでは、ＩＬ３３はマウスＩＬ３３である。本明細書において上記にまとめた、または他の箇所に記載された態様のいくつかでは、ＩＬ３３は組換えマウスＩＬ３３である。

ＰＤ－１阻害剤を含む上記でまとめたまたは本明細書の他の箇所に記載されたそれらの態様において、そのような態様のいくつかでは、ＰＤ－１阻害剤は抗体である。本明細書において上記にまとめたまたは他の箇所に記載された態様のいくつかでは、ＰＤ－１阻害剤は、ペムブロリズマブ、ニボルマブ、セミプリマブ、ＡＭＰ－２２４、ＡＭＰ－５１４およびＰＤＲ００１からなる群より選択される。

ＰＤ－Ｌ１阻害剤を含む、上記でまとめた態様の一部または本明細書の他の箇所に記載されたそれらの態様において、そのような態様の一部において、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、抗体である。いくつかの態様において、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、ＢＭＳ－９３６５５９およびＣＫ－３０１からなる群より選択される。

本発明のこれらおよび他の態様は、本特許出願の詳細な説明、図面および実施例部分でさらに説明される。さらに、当業者であれば、本特許出願明細書を通じて記載される本発明の様々な態様は、様々な異なる方法で組み合わせることができ、そのような組み合わせは本発明の範囲内であることを認識し得る。

図１ａ－ｆ：ＩＬ３３依存性ＩＬＣ２はヒトおよびマウス膵臓癌に浸潤する。（図１ａ）非選択ヒトＰＤＡＣ患者におけるＩＬＣのゲーティング、頻度および表現型。（図１ｂ）短期および長期のＰＤＡＣ生存者の腫瘍組織マイクロアレイにおけるＩＬＣ２の頻度（上）および生存期間との関連（下）。（図１ｃ）短期および長期のＰＤＡＣ生存者のバルク腫瘍ＩＬ３３ ｍＲＮＡの生存との関連および腫瘍細胞溶解指数（ＣＹＴ）との相関。（図１ｄ）ＰＤＡＣマウスにおけるＩＬＣのゲーティングおよび頻度。（図１ｅ）αＣＤ９０．２またはアイソタイプ（Ｉｓｏ）抗体を投与したＲａｇ２^－／－ＰＤＡＣマウスの腫瘍内ＩＬＣの頻度と数。（図１ｆ）Ｉｌ３３^＋／＋およびＩｌ３３^－／－ＰＤＡＣマウスにおけるＩＬＣのゲーティング、頻度および数。図１ｂのＨｉｇｈとＬｏｗ、図１ｃのＬｏｗは、それぞれコホートの中央値より高いか低いかを定義した。データは腫瘍移植後１４日目（図１ｄ－ｆ）に収集した。ｎ、個々の患者またはマウスからの腫瘍の数。横棒は中央値を示す。図１ｄ－ｆのデータは、ｎ≧３／群の≧２個の独立した実験からプールされたものであり、各点は、別々に分析された１匹のマウスを示す。Ｐ値は、Ｔｕｋｅｙの一元配置分散分析（図１ａ）およびＫｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ多重比較後検定（図１ｄ）、両側Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ検定（図１ｂ、ｅ、ｆ）、両側ログランク（図１ｂ、ｃ、生存曲線）、および線形回帰（図１ｃ）によって決定した。 図２ａ－ｇ：ＩＬ３３－ＩＬＣ２軸は組織特異的癌免疫を活性化する。Ｉｌ３３^＋／＋およびＩｌ３３^－／－の同所性（orthotopic）（図２ａ）または皮下（図２ｂ）ＰＤＡＣマウスの腫瘍重量、体積および生存率。(図２ｃ）同所性Ｉｌ３３^＋／＋およびＩｌ３３^－／－ＰＤＡＣ腫瘍における全ＣＤ８^＋Ｔ細胞（左）およびＩＦＮ－産生（右）細胞の頻度。(図２ｄ）Ｔ細胞枯渇Ｉｌ３３^＋／＋およびＩｌ３３^－／－同所性ＰＤＡＣマウスの腫瘍重量。(図２ｅ）Ｉｌ３３^＋／＋およびＩｌ３３^－／－同所性および皮下ＫＰＣ－ＯＶＡ ＰＤＡＣマウスにおける腫瘍拒絶の頻度および腫瘍重量。(図２ｆ）無傷のまたは枯渇したＩＬＣ２を有するｉＣＯＳ－ＴマウスにおけるＫＰＣ－ＯＶＡ ＰＤＡＣ腫瘍の試験デザイン（左）、腫瘍拒絶反応の頻度（中）および腫瘍重量（右）。(図２ｇ）無傷のまたは枯渇したＩＬＣ２を有する同所的ＫＰＣ－ＯＶＡ ＰＤＡＣ ｉＣＯＳ－Ｔマウスの排出リンパ節におけるＯＶＡ特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞の頻度。データは、移植後１４日（図２ａ、ｃ、ｄ）、２８日（図２ｂ）、４２日（図２ｅ）および８日（図２ｆ、ｇ）に収集された。横棒は中央値、エラーバーはｓ.ｅ.ｍ.を示す。データは、ｎ≧４／群の２以上の独立した試験からプールされ、ｎおよびデータ点は別々に分析した個々のマウスを示す。Ｐ値は、両側Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ検定（図２ａ－ｇ）、両側ｌｏｇ－ｒａｎｋ検定（図２ａ、ｂ、生存曲線）、Ｓｉｄａｋの多重比較検定による二元配置分散分析（図２ａ、ｂ、腫瘍体積）およびカイ二乗検定（図２ｅ、ｆ％拒絶反応）により決定された。 図３ａ－ｈ：ＩＬＣ２は、腫瘍内樹状細胞を動員することにより組織特異的な癌免疫を刺激する。（図３ａ）ビークルまたは組換えＩＬ３３（ｒＩＬ３３）で処置した同所性および皮下ＰＤＡＣマウスの腫瘍重量、体積および生存率。（図３ｂ）ビークルまたは組換えＩＬ１８（ｒＩＬ１８）で処置した同所性および皮下ＰＤＡＣマウスの腫瘍重量および体積。（図３ｃ)ｒＩＬ３３で処置した同所性ＰＤＡＣマウスにおけるＩＬＣ２のゲーティング、頻度および数（ＤＬＮビークル、ｎ＝１３；腫瘍ビークル、ｎ＝１２）。（図３ｄ）ｒＩＬ３３で処置した同所性ＰＤＡＣマウスの腫瘍におけるＣＤ１０３^＋樹状細胞（ＤＣ）のゲーティングおよび頻度。（図３ｅ）ｒＩＬ３３で処置した野生型（ＷＴ）およびＩＬＣ２欠損同所性ＰＤＡＣマウスの腫瘍における腫瘍重量、体積および（図３ｆ）ＣＤ１０３^＋ ＤＣの頻度。（図３ｇ）ｒＩＬ３３で処置したＷＴおよびＣＤ１０３^＋ ＤＣ欠損Ｂａｔｆ３^－／－同所性ＰＤＡＣマウスの腫瘍体積。（図３ｈ）精製ＤＣのＣｃｌ５への移動。データは腫瘍移植後５週目（図３ｃ、ｄ）および７週目（図３ｅ、ｆ）に収集した。データは、２以上の独立した試験からプールし、ｎ≧３／群であった。ｎおよびデータ点は、別々に分析した個々のマウスまたは（図３ｈ）個々の複製を示す。Ｐ値は、両側ログランク検定（図３ａ、生存曲線）、二元配置分散分析（図３ａ、ｂ、ｅ、ｇ、腫瘍体積）、および両側Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ検定（図３ａ～ｆ、ｈ）によって決定した。

図４ａ－ｉ：ＰＤ－１遮断はＴＩＬＣ２を活性化する。処置されたＰＤＡＣマウスにおける、上位１５主成分の非線形表現での（図４ａ）腫瘍体積および生存、（図４ｂ）ゲーティング、頻度および数、ならびに（図４ｃ）ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ（ｎ＝７，０２２ ＩＬＣ２単一細胞）。細胞はクラスター（左）または処置および組織（右）ごとに色分けされている。（図４ａ、ｂ）において、左、右のグラフでそれぞれｎ＝ｎ。（図４ｄ）αＰＤ－１＋ｒＩＬ３３で処置した野生型（ＷＴ）またはＩＬＣ２欠損ＰＤＡＣマウスの腫瘍体積。（図４ｅ）ｒＩＬ３３で処置したＷＴまたはＰｄｃｄ１^－／－ＰＤＡＣマウスからＴＩＬＣ２を選別精製し、ＩＬＣ２欠損ＰＤＡＣレシピエントに移植し、腫瘍体積を測定した。（図４ｆ－ｈ）ＴＩＬＣ２をｒＩＬ３３で処置したＰＤＡＣ ＣＤ４５．１ドナーマウスから選別精製し、ＩＬＣ２欠損ＣＤ４５．２ ＰＤＡＣレシピエントマウスに移植し、細胞移植後にαＰＤ－１で処置した。細胞移植後１０週間のレシピエントマウスの腫瘍体積および腫瘍重量（図４ｆ）、ＣＤ４５．１およびＣＤ４５．２細胞の頻度（図４ｇ）ならびにＴ細胞の頻度（図４）（ＴＩＬＣ２ｓ－：全群、ｎ＝８；ＴＩＬＣ２＋：脾臓、ｎ＝９；ＤＬＮ、ｎ＝７；腫瘍、ｎ＝７）を示す。図４ｇ中の頻度＝生きたドナーまたはレシピエント由来の免疫細胞の割合。（図４ｉ）処置したＰＤＡＣマウス（ＫＰＣ ５２細胞）の腫瘍体積（ビークル、ｎ＝１３；他の群、ｎ＝１０）および生存率（ビークルおよびαＰＤ－１、ｎ＝１５；ｒＩＬ３３、ｎ＝２４；ｒＩＬ３３＋ＰＤ－１、ｎ＝２６）。ＤＬＮ、排出リンパ節。データは、同所腫瘍細胞移植後５週間（図４ｂ）、１０日（図４ｃ）および６週間（図４ｄ）に収集された。水平バーは中央値を、エラーバーはs.e.m.を示す。データは、ｎ≧３／群の２以上の独立した試験からプールされ、ｎおよびデータ点は、別々に分析された個々のマウスを示す。ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑのデータは、生物学的複製（ビークルｎ＝１０、ｒＩＬ３３ ｎ＝５、αＰＤ－１＋ｒＩＬ３３ ｎ＝５）からプールされた精製単一細胞を表す。Ｐ値は、Ｔｕｋｅｙの多重比較ポストによる二元配置ＡＮＯＶＡ（図４ａ、ｄ－ｆ、ｉ、腫瘍体積）、両側Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ（図４ｂ、ｄ、ｇ、ｈ）、および両側ｌｏｇ－ｒａｎｋ（図４ａ、ｉ、生存曲線）検定により決定した。 図５ａ－ｈ：膵臓癌におけるＩＬ３３依存性ＩＬＣの同定。（図５ａ）ヒトＩＬＣを同定するためのゲーティング戦略。最初のプロットは、生細胞（ＤＲＡＱ７^－）とシングレット（singlet）にあらかじめゲーティングを施したものである。Lineage（Ｌｉｎ）１カクテル：ＣＤ５, ＣＤ１１ｂ, ＣＤ１１ｃ, ＣＤ１６, ＦｃεＲ１。Ｌｉｎ２カクテル：ＣＤ３、ＣＤ１９、ＴＣＲα／β。ＩＬＣはＬｉｎ^－ ＣＤ５６^－ ＣＤ２５^＋ ＣＤ１２７^＋細胞として同定された。ＦＭＯ, 蛍光マイナスワン対照（fluorescence minus one）。（図５ｂ）短期および長期ＰＤＡＣ生存者（ｎ＝９６）の腫瘍組織マイクロアレイにおけるＩＬＣ２の免疫蛍光の代表的画像。矢印，推定ＩＬＣ２。（図５ｃ）上段、ＩＬＣ刺激サイトカインの腫瘍内ｍＲＮＡレベルが中央値より大きい（高い）または小さい（低い）患者の全生存率。下段、ヒトＰＤＡＣの長期生存者および短期生存者におけるＩＬＣ活性化サイトカインの発現および免疫細胞溶解指数（ＣＹＴ）の相関。曲線は線形回帰でフィッティングさせた。（図５ｄ）マウスＩＬＣを同定するためのゲーティング戦略。最初のプロットは、生細胞（ＤＲＡＱ７^－）とシングレットにあらかじめゲーティングを施したものである。Lineage（Ｌｉｎ）１カクテル：ＣＤ５、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＦｃεＲ１。Ｌｉｎ２カクテル：ＣＤ３、ＣＤ１９。ＩＬＣはＬｉｎ^－ ＮＫ１．１^－ ＣＤ２５^＋ ＣＤ１２７^＋、ＩＬＣ２はＬｉｎ^－ ＮＫ１．１^－ ＣＤ２５^＋ Ｓｔ２^＋細胞として同定された。同所性ＰＤＡＣマウスでのゲーティングを示す。（図５ｅ）ＫＰＣ細胞株８－１、１８－３で樹立した同所性ＰＤＡＣマウス、および自然発症ＰＤＡＣを有する自己由来ＫＰＣマウス（ＫＰＣ^{Ｓｐｏｎｔ}）における腫瘍内ＩＬＣ頻度を示す。比較のため、図１ｄなどの複合ＩＬＣ頻度を含む（ＫＰＣ ４６６２）。（図５ｆ）ＰＤＡＣマウスにおけるＩＬＣの表現型。グレーの曲線、アイソタイプ対照；数字、平均蛍光強度。(図５ｇ）ＰＤＡＣマウスの組織におけるＩＬＣの増殖速度。（図５ｈ）αＣＤ９０．２またはアイソタイプ抗体で処理したＲａｇ２^－／－ＰＤＡＣマウスにおける非ＩＬＣ細胞頻度の変化。データは、腫瘍移植後１４日目（図５ｄ－ｆ）、１０日目（図５ｈ）または示された時点で分析した。ｎは、ｎ≧２／群で少なくとも２つの独立した試験において別々に分析した個々のマウスを示す。Ｐ値は、両側対数順位（図５ｃ、上段）、線形回帰（図５ｃ、下段）または両側マン・ホイットニー検定（図５ｇ）により決定された。図５ｇのＰ値は、他のすべての臓器に対する腫瘍の比較を示す。

図６ａ－ｏ：宿主由来のＩＬ３３は、膵臓ＩＬＣ２を活性化する。（図６ａ）既報のｍＲＮＡマイクロアレイから、同所性ＰＤＡＣ腫瘍（左）およびＫＰＣマウスの自己由来ＰＤＡＣ腫瘍（右）における、ＩＬＣ１^－（ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ１８）、ＩＬＣ２^－（ＩＬ２５、ＩＬ３３、ＴＳＬＰ）、ＩＬＣ３誘導サイトカイン（ＩＬ２３）およびＩＬ３３受容体（ＳＴ２）のｍＲＮＡ発現を算出した。（図６ｂ）ＩＬ３３^ＬｏｗおよびＩＬ３３^Ｈｉｇｈのヒト（組織マイクロアレイ、ｎ＝９６）およびマウスＰＤＡＣ（ｎ＝３／群）の代表的なＩＬ３３免疫組織化学（ＩＨＣ）。（図６ｃ）ヒトＰＤＡＣ腫瘍マイクロアレイでＩＨＣによりＩＬ３３陽性を示すヒトＰＤＡＣ患者の頻度。（図６ｄ）マウスＰＤＡＣにおけるＩＬ３３、管状腺癌マーカーＣＫ１９、骨髄系細胞癌マーカーＣＤ１１ｂおよびＩｂａの多重免疫蛍光（上段）。矢印、ＩＬ３３発現細胞。ＩＬ３３^ＣｉｔレポーターＰＤＡＣマウスの腫瘍における非免疫性（ＣＤ４５^－）、免疫性（ＣＤ４５^＋）、マクロファージ（ＴＡＭ）、ならびに単球性および顆粒球性骨髄由来抑制細胞（Ｍ－ＭＤＳＣおよびＧ－ＭＤＳＣ）集団のＩＬ３３平均蛍光強度（ＭＦＩ）（下段）。（図６ｅ）Ｉｌ３３^＋/＋（ＷＴ）マウスの同所性ＰＤＡＣ腫瘍、およびＩｌ３３^－/－マウスの非腫瘍含有膵臓におけるＩＨＣによる代表的ＩＬ３３タンパク質発現（ｎ＝３／群）。（図６ｆ）Ｉｌ３３^＋／＋及びＩｌ３３^－／－同所性ＰＤＡＣマウスの臓器および排出リンパ節（ＤＬＮ）におけるＩＬＣ頻度（上段）および細胞数（下段）。（図６ｇ）Ｉｌ３３^＋/＋およびＩｌ３３^－/－同所性ＰＤＡＣマウスの腫瘍内ＩＬＣにおけるＩＬ４発現およびＩＬ５発現のゲーティングおよび頻度。（図６ｈ）組換えＩＬ３３（ｒＩＬ３３）で処理した、または処理していない同所性Ｒａｇ２^－/－およびＲａｇ２^－/－γｃ^－/－ＰＤＡＣマウスのＩＬＣ２および免疫細胞頻度（図６ｉ）。（図６ｊ）皮下（ＳＱ）および同所性ＰＤＡＣを有するマウスにおけるＳＴ２^＋腫瘍ＩＬＣの頻度。（図６ｋ）同所性ＰＤＡＣマウスおよび皮下ＰＤＡＣマウスにおける腫瘍。（図６ｌ）Ｉｌ３３^＋/＋およびＩｌ３３^－/－同腹ＰＤＡＣマウスにおける腫瘍の重量。（図６ｍ）腫瘍制御に対する造血細胞由来のＩＬ３３の寄与を評価するための骨髄キメラの試験スキーム。（図６ｎ）ＣＤ４５．２ Ｉｌ３３^＋/＋またはＣＤ４５．２ Ｉｌ３３^－/－のいずれかの骨髄で再構成された照射ＣＤ４５．１コンジェニックマウスにおける造血細胞再構成および腫瘍重量（図６ｏ）。データは腫瘍移植後１４日目（図６あ、ｄ、ｆ、ｇ、ｊ、ｏ）および１０日目（図６ｈ、ｉ）に収集した。ｎは、少なくとも２つの独立した試験で別々に分析した個々のマウスを示し、ｎ≧２／群である。Ｐ値は、一元配置分散分析（図６ａ）または両側Mann-Whitney検定（図６ｄ、ｆ－ｈ、ｊ、ｌ、ｏ）により決定された。 図７ａ－ｅ：宿主由来のＩＬ３３は膵臓のＴ細胞免疫を活性化する。（図７ａ）Ｉｌ３３^＋/＋およびＩｌ３３^－/－ＰＤＡＣマウスから精製したＣＤ４５^＋免疫細胞からのバルクＲＮＡ－ｓｅｑの遺伝子セット濃縮分析。Ｉｌ３３^＋/＋における発現に対してＩｌ３３^－/－における発現を比較した３つの遺伝子セットについてのエンリッチメントプロットおよびエンリッチメントスコアを示す（ｎ＝３マウス／群）。ＦＤＲ、誤検出率。（図７ｂ）Ｉｌ３３^＋/＋およびＩｌ３３^－/－同所性ＰＤＡＣマウスにおけるＣＤ８^＋ Ｔ細胞のゲーティングならびに（図７ｃ）種々の免疫細胞タイプの頻度（左）およびＣＤ４^＋ Ｔ細胞系統の頻度（右）。（図７ｄ）Ｉｌ３３^＋/＋およびＩｌ３３^－/－同所性ＰＤＡＣマウスにおける腫瘍排出リンパ節および非腫瘍排出遠隔リンパ系臓器（鼠径リンパ節および脾臓）でのＴ細胞セントラルメモリー（Ｔ_ｃｍ）細胞（ＣＤ４５^＋ＣＤ３^＋ＣＤ８^＋ＣＤ４４^＋ＣＤ６２Ｌ^＋）の頻度。（図７ｅ）皮下ＰＤＡＣ腫瘍におけるＣＤ８^＋ Ｔ細胞の頻度。ＤＣ、樹状細胞；ＭＤＳＣ、骨髄由来抑制細胞；ＮＫ、ナチュラルキラー細胞；ＮＫＴ、ナチュラルキラーＴ細胞；Ｔ_ｒｅｇ、制御性Ｔ細胞。データは、腫瘍移植後１４日目または示された時点で解析した。横棒は中央値、エラーバーはs.e.m.を示す。ｎは、少なくとも２つの独立した試験で別々に分析した個々のマウスを示し、ｎ≧２／群である。Ｐ値は、一元配置分散分析によって決定した（図７ｄ）。 図８ａ－ｇ：ＩＬ３３およびＩＬＣは、腫瘍細胞死を直接には誘導しない。（図８ａ）Ｒａｇ２^－/－およびＲａｇ２^－/－γｃ^－/－ＰＤＡＣマウスにビークルまたは組換えマウスＩＬ３３（ｒＩＬ３３）を投与したときの腫瘍重量。（図８ｂ）Ｉｌ３３^＋/＋およびＩｌ３３^－/－ＰＤＡＣマウスにおける組織学的腫瘍細胞分化状態（右）と代表的なヘマトキシリンおよびエオシン染色切片（左）。（図８ｃ）Ｉｌ３３^＋/＋およびＩｌ３３^－/－ＰＤＡＣマウスの腫瘍におけるトリクロム染色（ｎ＝３／群）。（図８ｄ）Ｉｌ３３^＋/＋およびＩｌ３３^－/－ＰＤＡＣマウスの腫瘍における平滑筋アクチンの免疫組織化学（ｎ＝３／群）。（図８ｅ）Ｉｌ３３^＋/＋およびＩｌ３３^－/－同所性ＰＤＡＣマウスのＫＰＣ細胞上の腫瘍内ＳＴ２発現。（図８ｆ）インビトロでのｒＩＬ３３処理後の生ＫＰＣ細胞上のＳＴ２発現（ＤＲＡＱ７は死細胞を染色する）（ｎ＝３／群）。（図８ｇ）インビトロでのｒＩＬ３３処理後のＫＰＣ細胞数、生存率、増殖（Ｋｉ－６７）およびアポトーシス（アネキシン）（ｎ＝６／群）。図８ａからｅのｎは、少なくとも２回の独立した試験で別々に分析した個々のマウスを示し、ｎ≧３／群である。図８ｆ、ｇのｎは、技術的複製を示し、少なくとも２回の独立した試験の代表例である。Ｐ値は、両側Mann-Whitney検定によって決定した（図８ａ）。

図９ａ－ｄ：ＩＬＣ２が抗原特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞のプライミングを誘導する。（図９ａ）ＩＬＣ２不活性マウス（ジフテリア毒素［ＤＴ］処理Ｉｃｏｓ^＋/＋；ＣＤ４^{Ｃｒｅ/＋}）およびＩＬＣ２欠失マウス（ＤＴ処理Ｉｃｏｓｆｌ.^{ＤＴＲ/＋}；ＣＤ４^{Ｃｒｅ/＋}）における腫瘍内ＩＬＣ２のゲーティングおよび頻度。（図９ｂ）ＩＬＣインタクトマウスおよびＩＬＣ欠失マウスの脾臓におけるＯＶＡ特異的ＣＤ８^＋ Ｔ細胞のゲーティングおよび頻度。ＯＶＡ特異的Ｔ細胞は、ＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号１５）－テトラマー^＋細胞として検出された。（図９ｃ）ＩＬＣインタクトマウスおよびＩＬＣ欠失マウスの腫瘍排出リンパ節および脾臓におけるセントラルメモリーＣＤ８^＋ Ｔ（ＴＣＭ）細胞（ＣＤ４５^＋ＣＤ３^＋ＣＤ８^＋ＣＤ４４^＋ＣＤ６２Ｌ^＋）のゲーティングおよび頻度。（図９ｄ）ＰＤＡＣマウスの腫瘍移植後のＣＤ４５^＋ＣＤ３^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞におけるＳＴ２発現。データは腫瘍移植後１４日目または示された時点で収集した。ＤＬＮ、排出リンパ節；ＭＦＩ、平均蛍光強度。横棒は中央値を示し、エラーバーはs.e.m.を示す。ｎは、ｎ≧２／群で少なくとも２つの独立した試験において別々に分析した個々のマウスを示す。Ｐ値は、両側Mann-Whitney検定（図９ａ～ｃ）およびTukeyの多重比較後検定を伴う二元配置分散分析（図９ｄ、腫瘍ＩＬＣの他のすべての群との比較を示す）によって決定した。 図１０ａ－ｉ：ｒＩＬ３３処置したＰＤＡＣマウスにおけるイムノフェノタイピング。（図１０ａ）ビークル（ｖｅｈ）およびｒＩＬ３３処理マウスにおける、同所性および皮下ＫＰＣ－ＯＶＡ ＰＤＡＣ腫瘍の腫瘍確立率。（図１０ｂ）皮下（ＳＱ）および同所性ＰＤＡＣマウスにおける腫瘍ＩＬＣ上のＩＬ１８Ｒ１発現のゲーティング（左）および頻度（右）。（図１０ｃ）同所性ＰＤＡＣマウスにおけるｒＩＬ３３処理後の脾臓ＩＬＣ２のゲーティング（左）および頻度（右）。（図１０ｄ）皮下ＰＤＡＣマウスにおけるｒＩＬ３３処理後の腫瘍ＩＬＣ２のゲーティング（左）および頻度（右）。（図１０ｅ）同所性ＰＤＡＣマウスにおけるｒＩＬ３３処理後の腫瘍ＣＤ８^＋Ｔ細胞上のサイトカインおよびＰＤ－１発現のゲーティング（左）および頻度（右）。（図１０ｆ）ビークルおよびｒＩＬ３３で処理した同所性ＰＤＡＣマウスにおける免疫細胞の頻度。（図１０ｇ）ＣＤ１０３^＋樹状細胞を同定するためのゲーティング戦略。（図１０ｈ）ｒＩＬ３３処理後の野生型（ＷＴ）またはＲｏｒａ^{ｆｌ/ｆｌ} ＩＬ７ｒ^Ｃｒｅマウス（ＩＬＣ２欠損）ＰＤＡＣマウスの腫瘍および排出リンパ節（ＤＬＮ）におけるＩＬＣ２のゲーティング（左；腫瘍）および頻度（右）。（図１０ｉ）ｒＩＬ３３処理したＷＴおよびＢａｔｆ３^－/－マウスの腫瘍におけるＰＤ－１^＋ ＣＤ８^＋Ｔ細胞のゲーティング（左）および頻度（右）。データは腫瘍移植後６週間（図１０ａ）、５週間（図１０ｂ）、３週間（図１０ｉ）に収集した。ｎは、少なくとも２つの独立した試験で別々に分析した個々のマウスを示し、ｎ≧２／群である。Ｐ値は、両側Mann-Whitney検定により決定した（図10ａ、ｆ、ｉ）。 図１１ａ－ｃ：ＰＤＡＣマウスの腫瘍および排出リンパ節ＩＬＣ２の単一細胞ＲＮＡ配列決定。（図１１ａ）ＩＬＣ２のインビボ処理、精製および単一細胞解析のための試験デザイン。（図１１ｂ, ｃ）品質評価指標。（図１１ｂ）各細胞について、ユニークな分子識別子の数（＃ of UMI）と遺伝子の数（＃ of genes）の関係を示す散布図。（図１１ｃ）各処置群（列）、各組織（行）における遺伝子数（左）、ＵＭＩ数（中）、ミトコンドリア遺伝子からの正規化リードの割合（右）の分布を示すバイオリンプロット（Violin plot）である。各ドットは単一細胞を表す。各処置群および臓器について、データは、ｎ＝１０（ビークル）、ｎ＝５（ｒＩＬ３３）およびｎ＝５（αＰＤ－１＋ｒＩＬ３３）ＰＤＡＣマウスの生物学的複製から集めた精製単一細胞を表す。 図１２ａ－ｆ：腫瘍および排出リンパ節からの活性化ＩＬＣ２には、異なる転写の特徴がある。（図１２ａ）１，６３４個のｒＩＬ３３活性化腫瘍および排出リンパ節（ＤＬＮ）ＩＬＣ２の単一細胞解析（図１１ａに概略を示す試験デザイン）。ＵＭＡＰプロットは、上位１５主成分の非線形表現における単一細胞（点）を示す。（図１２ａ）ＩＬＣ２（Ｇａｔａ３、Ｉｄ２、Ｒｏｒａ）およびＩＬＣ３（遺伝子、Ｒｏｒｃ、タンパク質、Ｒｏｒγｔ）の転写因子（ＴＦ）の発現、（図１２ｂ）ＩＬＣ２表面マーカーの発現、および（図１２ｃ)クラスターおよび臓器の発現。ＩＬＣ－１ ＴＦ Ｔｂｘ２１（Ｔ－ｂｅｔ）の発現は検出不能であった。（図１２ｄ、ｅ）クラスターおよび（図１２ｅ）臓器別の差次的発現遺伝子（ＴＩＬＣ２およびＤＬＮ ＩＬＣ２）。（図１２ｆ）腫瘍およびＤＬＮのＩＬＣ２からのＣｃｌ５発現の分布。バイオリンプロットは、最小値、最大値、および中央値を示す丸で分布を示す。図１２ａおよび図１２ｂの各点は、単一細胞を表す。各処置群および臓器について、データは、ｎ＝５匹のｒＩＬ３３処置ＰＤＡＣマウスの生物学的複製からプールした精製単一細胞を表す。Ｐ値は、両側ペアワイズウィルコクソン符号順位検定によるものである。

図１３ａ－ｉ：αＰＤ－１およびｒＩＬ３３の組合せ処理により、腫瘍ＩＬＣ２においてユニークな転写プロファイルが誘導される。（図１３ａ）単一細胞ＲＮＡ配列決定（ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ）による、ビークル処置したＰＤＡＣマウスの腫瘍ＩＬＣ２における共阻害免疫チェックポイントの発現。（図１３ｂ）ビークル処置およびｒＩＬ３３処置ＰＤＡＣマウスにおけるＰＤ－１^＋ ＩＬＣ２のゲーティングおよび頻度。ＤＬＮ、流入領域リンパ節（draining lymph node）。（図１３ｃ）処置したＰＤＡＣマウスにおけるＩＬＣ２頻度。対応する腫瘍体積、重量、細胞数およびｓｃＲＮＡ－ｓｅｑを図４ａ～ｃに示す。（図１３ｄ）処置したＰＤＡＣマウスからのＩＬＣ２のｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ。精製腫瘍および排出リンパ節（ＤＬＮ）ＩＬＣ２におけるＩＬＣ１（遺伝子、Ｔｂｘ２１；タンパク質、Ｔｂｅｔ）の発現、ＩＬＣ２（Ｇａｔａ３、Ｉｄ２、Ｒｏｒａ）の発現、およびＩＬＣ３（遺伝子、Ｒｏｒｃ；タンパク質、Ｒｏｒγｔ）転写因子（ＴＦ）の発現。クラスターおよび処置による対応するＵＭＡＰプロットは、図４ｃに示す。処置および組織別の上位差次発現遺伝子（図１３ｅ）、クラスター（図１３ｆ）ならびに処置および組織別の選択された差次発現遺伝子の発現分布（図１３ｇ）（腫瘍：ビークル ｎ＝２８、ｒＩＬ３３ ｎ＝７５２、ｒＩＬ３３＋ＰＤ－１ ｎ＝２、６３５；ＤＬＮｒＩＬ３３ ｎ＝８８２、ｒＩＬ３３＋ＰＤ－１ ｎ＝２，７２５）。（図１３ｈ）上位１５主成分の非線形表現における、３，３８７個の単一腫瘍ＩＬＣ２のＵＭＡＰプロット。（図１３ｉ）腫瘍ＩＬＣ２における治療による差次的発現遺伝子。図１３ｄおよび図１３ｈの各点は、単一細胞を表す。各処置群および臓器について、データは、ｎ＝１０（ビークル）、ｎ＝５（ｒＩＬ３３）およびｎ＝５（αＰＤ－１＋ｒＩＬ３３）ＰＤＡＣマウスの生物学的複製からプールした精製単一細胞を表している。バイオリンプロットは、最小値、最大値、および中央値を示す円による分布を示す。図１３ｂおよび図１３ｃの横棒は中央値を示す。Ｐ値は、両側Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ検定（図１３ｂ、ｃ）および両側Ｗｉｌｃｏｘｏｎ順位和検定（図１３ｇ）により求めた。 図１４ａ－ｇ：活性化された腫瘍ＩＬＣ２はＰＤ－１を発現し、ＰＤ－１^＋ Ｔ細胞と共存している。同所性ＰＤＡＣマウス（Ｃ５７Ｂｌ／６ ＷＴ、Ｐｄｃｄ１^－／－、ＣＤ４５．１）に、５００ｎｇの担体不含有組換えマウスＩＬ３３を毎日１０日間投与した（図４ｅ、ｆに示す試験デザイン）。生ＣＤ４５^＋、Lineage^－、ＣＤ９０^＋、ＣＤ２５^＋、ＳＴ２^＋腫瘍ＩＬＣ２（ＴＩＬＣ２）を、移植後１０日目に９８％純度で選別精製した。５ｘ１０^５ ＴＩＬＣ２を、腫瘍移植後７日目と１４日目に、腹腔内（ｉ．ｐ．）投与により、同所性ＰＤＡＣ腫瘍を有するＩＬ７ｒ^{Ｃｒｅ／＋}Ｒｏｒａ^{ｆｌ／ｆｌ}（ＩＬＣ２欠損）ＣＤ４５．２マウスに直ちに移した。対照マウスは、ｉ．ｐ．注射を介して等量のＰＢＳを受容した。（図１４ａ）ＴＩＬＣ２選別精製（上）および分別後の純度（下）の代表的なプロットである。（図１４ｂ）図４ｅ、ｆに概略を示した試験デザインにおけるＷＴマウスおよびＣＤ４５．１マウスからの選別精製ＴＩＬＣ２上のＰＤ－１発現を示す代表プロット。（図１４ｃ）同所性ＫＰＣ ４６６２－ＧＦＰおよびＫＰＣ ５２ ＰＤＡＣ腫瘍の生存率および腫瘍内ＣＤ８^＋Ｔ細胞頻度；ｃの横棒は中央値であることを表す。（図１４ｄ）ヒトＰＤＡＣにおけるＰＤ－１^＋ ＩＬＣ２の頻度（左）およびＰＤ－１^＋ Ｔ細胞との相関（右）。（図１４ｅ）短期および長期ＰＤＡＣ生存者のバルク腫瘍トランスクリプトームにおけるＩＬ３３およびＰＤ－１ ｍＲＮＡの線形回帰分析（左）および短期および長期ＰＤＡＣ生存者の腫瘍組織マイクロアレイにおけるＰＤ－１^＋細胞の生存関連（右）；高および低は、コホートの中央値より高いまたは低いと定義される。（図１４ｆ）ＩＬ３３－ＴＩＬＣ２軸を膵臓癌のＴ細胞免疫に関連付けるモデル。（図１４ｇ）単一細胞ＲＮＡ配列決定による、未処置腫瘍ＩＬＣ２における共刺激分子の発現分布。図１１ａに示す試験デザイン；データは、ｎ＝１０（ビークル）の生物学的複製からプールされた精製単一細胞を表す。データは、ｎ≧４／群の２つの独立した試験における選別されたＴＩＬＣ２における純度およびＰＤ－１発現の代表である（図１４ａ、ｂ）。ｎおよびデータ点は、別々に分析した個々のマウスおよび患者を示す。Ｐ値は、両側Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ（図１４ｃ）、および両側ｌｏｇ ｒａｎｋ（図１４ｃ、ｅ、生存曲線）検定、および線形回帰（図１４ｄ、ｅ）により決定した。

詳細な説明
本発明の主要な態様のいくつかは、本特許出願の上記発明の概要および実施例および特許請求の範囲に記載されているが、この詳細な説明セクションでは、本発明の組成物および方法に関する特定の追加の説明を提供し、本特許出願の他のすべてのセクションと関連して読まれることを意図している。

定義および略語
本明細書および特許請求の範囲で用いる、単数形“ａ”、“ａｎ”および“ｔｈｅ”は、文脈上明らかに他に記載されない限り、複数の指示語を含む。用語“ａ”（または“ａｎ”）ならびに用語“１以上の”および“少なくとも１つ”は互換的に用いられ得る。

さらに、“および／または”は、２つの指定された特徴または構成要素の各々について、他方を伴うかまたは伴わない具体的な開示として受け取られる。したがって、“Ａおよび／またはＢ”などのフレーズで用いられる用語“および／または”は、ＡおよびＢ、ＡまたはＢ、Ａ（単独）ならびにＢ（単独）を含むことを意図している。同様に、“Ａ、Ｂおよび／またはＣ”などのフレーズで用いられる用語“および／または”は、Ａ、ＢおよびＣ；Ａ、ＢまたはＣ；ＡまたはＢ；ＡまたはＣ；ＢまたはＣ；ＡおよびＢ；ＡおよびＣ；ＢおよびＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；ならびにＣ（単独）などを意図する。

単位、接頭辞および記号は、国際単位系（ＳＩ）で認められている形式で表記されている。数値範囲は、その範囲を定義する数値を含む。

数値の前に“約（about）”または“およそ（approximately）”が付く場合、その数値および数値の±１０％の値を含む。

本明細書中の括弧内または上付き数字は、本明細書の末尾にある“文献リスト”に記載された番号付き文献を意味する。

態様が語句“～を含む”と共に記載される場合、そうでなければ、“～からなる”および／または“～から本質的になる”という用語で記載される類似の態様が含まれる。

本明細書で用いる略語“ＩＬ３３”は、インターロイキン３３を意味する。
本明細書で用いる略語“ｒＩＬ３３”は、組換えインターロイキン３３を意味する。
本明細書で用いる略語“ＰＤＡＣ”は、膵管腺癌を意味する。
本明細書で用いる略語“ＩＬＣ２”は、グループ２の先天性リンパ系細胞を意味する。
本明細書で用いる略語“ＴＩＬＣ２”は、腫瘍ＩＬＣ２を意味する。ＩＬＣ２に言及する本明細書に記載の態様の全ては、ＴＩＬＣ２を包含することも意図しており、ＩＬＣ２を含むものとして本明細書に記載の方法の全てについて、ＴＩＬＣに特異的に向けられるＩＬＣ２代替物(alternatives)も本発明によって企図されていることに留意すべきである。

本明細書で用いる略語“ＰＤＸ”は、患者由来異種移植片を意味する。

本明細書で用いる略語“ＰＤ－１”は、プログラムされた死タンパク質１またはプログラムされた細胞死タンパク質１としても知られるプログラムされた死１を意味する。

本明細書で用いる略語ＰＤ－Ｌ１は、プログラムされた細胞死リガンド１－これはＰＤ－１のリガンドである－を意味する。

本明細書で用いる略語“ＩＰ”または“ｉ.ｐ.”は腹腔内投与を意味する。マウスへの薬剤の投与はＩＰ経路が一般的であり、これはヒトへの薬剤の投与がＩＶ経路であることと類似していると考えられる。

本明細書で用いる略語“ＩＴ”は、腫瘍内投与を意味する。例えば、腫瘍に直接注入される薬剤は、腫瘍内に送達される。

本明細書で用いる略語“ＩＶ”は、静脈内投与を意味する。

本明細書で用いる用語“阻害（inhibiting）”および“遮断（blocking）”は、用語“阻害する（inhibit）”または“遮断する（block）”および用語“阻害剤”または“ブロッカー”と互換的に用いられる。用語“阻害する”および“遮断する”は、所定の生物学的活性における任意の検出可能かつ統計的に有意な減少を意味する。

本明細書で用いる用語“同種”とは、メンバーが遺伝的に関連しているか、または遺伝的に関連していないが遺伝的に類似している場合、同じ種に由来すること（deriving from）、同じ種を起源とすること（originating in）、または同じ種のメンバーであることを意味する。“同種移植”または“同種細胞治療”とは、ドナーから得られた細胞（またはドナーから得られた細胞に由来する細胞）をレシピエントに投与することを意味し、ここで、レシピエントはドナーと同じ種である。対象への同種膵臓ＩＬＣ２細胞の投与を含む本発明の態様において、同種細胞は、細胞が投与される対象（すなわち、レシピエント）と同じ種のドナーから得られる。ある態様において、同種細胞は、細胞が投与される対象（すなわち、レシピエント）と同じＭＨＣ／ＨＬＡ型を有するドナーから得られる、すなわち、細胞のドナーおよび細胞のレシピエントはＭＨＣ一致またはＨＬＡ一致である。ある態様において、細胞（例えば、膵臓ＩＬＣ２細胞）は、（ａ）ドナーから得られ、（ｂ）エクスビボ／インビトロで維持および／または培養および／または増殖および／または（例えば、ＩＬ３３で）活性化され、そして（ｃ）その後、ドナーと同じ種の対象に投与される。例えば、ある態様において、膵臓ＩＬＣ２細胞はドナーから得られ、ＩＬ３３でエクスビボ／インビトロで活性化され、次いでドナーと同じ種のレシピエント対象に投与される。このような方法は、同種移植または移植もしくは細胞治療法と称することができ、ドナーまたはドナーから得られた細胞は、レシピエントに関して同種であると称することができる。同様に、ある態様において、ＩＬＣ２細胞はドナーから得られ、ＩＬ－３３エクスビボ／インビトロで活性化され、その後、ドナーと同じ種および同じＭＨＣ／ＨＬＡ型のレシピエント対象に投与される。

本明細書で用いる用語“自家”とは、同じ対象（すなわち、同じ個体）に由来すること、または同じ対象を起源とすることを意味する。“自家移植”または“自家細胞療法”とは、ドナーから得られた細胞（またはドナーから得られた細胞に由来する細胞）をレシピエントに投与することを意味し、ここで、ドナーおよびレシピエントは同じ個体である。ある態様において、本発明の方法は、自己膵臓ＩＬＣ２を対象に投与することを含み、ここで、膵臓ＩＬＣ２は、該膵臓ＩＬＣ２が投与される同じ個体／対象から得られる（すなわち、ドナーおよびレシピエントは同じ個人である）。ある態様において、膵臓ＩＬＣ２は、（ａ）対象から得られ、（ｂ）エクスビボ／インビトロで維持および／または培養および／または増殖および／または活性化され、（ｃ）その後、同じ対象に投与される。例えば、いくつかのそのような態様において、膵臓ＩＬＣ２は、対象から得られ、エクスビボ／インビトロでＩＬ３３で活性化され、その後、同じ対象に投与される。かかる方法は、自家移植または移植もしくは細胞療法と称することができ、ドナーまたはドナーから得られた細胞は、レシピエントに関して自家であると称することができる。

本明細書で用いる用語“実質的に純粋な”は、細胞集団に関して用いる場合、全細胞集団を構成する細胞の少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約７５～８０％、より好ましくは少なくとも約８５～９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％の、特定の細胞マーカー特性／プロファイルを有する細胞の集団のことを意味する。したがって、“実質的に純粋な”細胞集団は、所定のマーカー特性／プロファイルを示さない細胞を約５０％未満、好ましくは約２０～２５％未満、より好ましくは約１０～１５％未満、および最も好ましくは約５％未満含む。

本明細書で用いる、細胞に関する用語“ソーティング”は、物理的特性またはマーカーの存在に基づく細胞の分離（例えば、側面散乱（ＳＳＣ）および／または前方散乱（ＦＳＣ）を用いたソーティング、あるいは蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）、例えば標識抗体を用いたソーティング）を意味する。

本明細書で用いる、細胞に関する用語“単離された”は、少なくとも１つの他の細胞型、例えば指定された細胞型が自然界－例えば体内－で共存する別の細胞型から分離される指定された細胞型を意味する。

他の略語および定義は、本明細書の他の箇所に記載されているか、または当技術分野においてよく知られている。

活性剤
本発明によって提供される方法および組成物は、ＩＬ３３およびＰＤ－１阻害剤を含むがこれらに限定されない、様々な異なる活性剤を含む。

ＩＬ３３を含む本発明のそれらの態様において、任意の適切なＩＬ３３分子を用いることができる。好ましい態様において、用いられるＩＬ３３分子は、該ＩＬ３３が投与される種からのＩＬ３３分子である。例えば、ヒトへの投与の場合、ヒトＩＬ３３が用いられ、一方、マウスへの投与の場合、マウスＩＬ３３が用いられる。例えば、マウスへの投与には、組換えマウスＩＬ３３（R&D Systems社から市販されており、担体含有形態または担体不含有形態）を用いることができる。UniProtKB/Swiss-Prot.：Q8BVZ5.1に規定されるアミノ酸配列を有するマウスＩＬ３３を用いることができる。同様に、ヒトへの投与には、組換えマウスＩＬ３３（R&D Systemsから市販されており、担体含有形態または担体不含有形態）を用いることができる。UniProtKB/Swiss-Prot.：O95760.1に規定されるアミノ酸配列を有するヒトＩＬ３３を用いることができる。使用できる適切なヒトＩＬ３３配列の他の例としては、配列番号１または配列番号２からなるものまたはそれを含むものが挙げられるが、これらに限定されない。ある態様において、ＩＬ３３は、それを産生する動物（例えば、マウス、ヒト）から単離／精製される。ある態様において、ＩＬ３３は組換え生産される－すなわち、それはＩＬ３３をコードする組換えＤＮＡから何らかの適切な発現系で発現される。ある態様において、ＩＬ３３は合成的に産生される。ある態様において、ＩＬ３３は、その半減期、安定性、生物学的利用能を増加もしくは改善するため、または任意の他の所望の生物学的特性を改善するために、改変される。ある態様において、ＩＬ３３は、半減期増加部分を含む。改変されたＩＬ３３が、ＩＬＣ２細胞上のＩＬ３３受容体に結合し、活性化する能力を保持する限り、当技術分野で知られている何れかのそのような改変体を用いることができる。使用できる修飾の例としては、ペグ化、Ｆｃ免疫グロブリンドメイン（例えば、配列番号９など）へのコンジュゲーション、アルブミン結合ドメインへのコンジュゲーションおよびヘキサデセン酸修飾が挙げられるが、これらに限定されない。ＩＬ３３の精製または分泌または産生に有用な修飾を用いてもよく、発現／精製タグ（例えば、配列番号３または配列番号４などのＨｉｓタグ）、プロテアーゼ認識部位（例えば、配列番号５などのＴＥＶプロテアーゼ認識部位）、分泌シグナル（配列番号６など）およびリンカー配列（配列番号７または８など）などがあるが、これらに限定されない。使用できるヒトＩＬ３３の改変型の例としては、配列番号１０（ＨｉｓタグおよびＴＥＶプロテアーゼ認識部位を含む）、配列番号１１（分泌シグナル、Ｈｉｓタグおよびリンカーを含む）または配列番号１２（分泌シグナル、ＩｇＧ４－Ｆｃ配列およびリンカーを含む）からなるかあるいはそれから生成するものが挙げられるが、それらに限定されない。ＩＬ３３に言及する本明細書のすべての例について、本発明は、ＩＬ３３が配列番号１、２、１０、１１または１２のいずれか１つからなるか、あるいはそれを含む態様を企図し、包含する。

ＰＤ－１阻害剤を伴う本発明のそれらの態様において、当技術分野で知られている何れかの適切なＰＤ－１阻害剤を用いることができる。ある態様において、ＰＤ－１阻害剤は抗体である。ある態様おいて、ＰＤ－１阻害剤は、ペムブロリズマブ（Keytruda、Merck）、ニボルマブ（オプジーボ、Bristol-Myers Squibb）、セミプリマブ（Libtayo、Regeneron）、ＡＭＰ－２２４（GlaxoSmithKline）、ＡＭＰ－５１４（GlaxoSmithKline）およびＰＤＲ００１（Novartis）からなる群より選択される。

ＰＤ－Ｌ１阻害剤を伴う本発明のそれらの態様において、当技術分野で知られている何れかの適切なＰＤ－Ｌ１阻害剤を用いることができる。ある態様において、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、抗体である。ある態様において、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、アテゾリズマブ（Tecentriq、Roche Genentech）、アベルマブ（Bavencio、Merck Serono and Pfizer）、デュルバルマブ（Imfinzi、AstraZeneca）、ＢＭＳ－９３６５５９（Bristol-Myers Squibb）、ＣＫ－３０１（Checkpoint Therapeutics）からなる群より選択される。

上記および／または本明細書の他の箇所に記載された本発明の態様の多くは、ＰＤ－１および／またはＰＤ－Ｌ１阻害剤の使用を含む。すべての場合において、本発明はまた、ＰＤ－１阻害剤のみが用いられるというバリエーションを有する同じ態様を含むことに留意すべきである。

ある態様において、本発明の方法は、本明細書に記載される特定の活性剤の何れかの等価体である類似体、同族体、変異体または誘導体を用いて実施することができる。そのような類似体、同族体、変異体または誘導体は、本明細書に記載される特定の分子の主要な機能特性を保持すべきである。例えば、ＰＤ－１および／またはＰＤ－Ｌ１阻害剤の場合、ＰＤ－１および／またはＰＤ－Ｌ１阻害活性を保持することを条件として、そのような薬剤の任意の適切な類似体、同族体、変異体または誘導体を用いることができる。ＩＬ３３の場合、ＩＬＣ２細胞上のＩＬ３３受容体に結合し、活性化する能力を保持していれば、そのような薬剤の何れかの適切な類似体、同族体、変異体または誘導体を用いることができる。

特定の態様において、本発明は、本明細書に記載の少なくとも１つの活性剤と、希釈剤、緩衝剤、担体、安定化剤、分散剤、懸濁化剤、濃化剤、賦形剤、防腐剤などの、対象への送達のための組成物を処方するのに有用な１以上の他の成分とを含む、組成物を提供する。

処置方法
本発明は、様々な処置方法を提供する。例えば、ある態様において、本発明は、本明細書に記載の活性剤（例えば、ＩＬ３３および／またはＰＤ－１および／またはＰＤ－Ｌ１阻害剤）の１以上の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、処置方法を提供する。本発明はまた、膵臓腫瘍（例えば、ＰＤＡＣ腫瘍）においてＩＬＣ２細胞を活性化する様々な方法を提供する。これらの方法はまた、一般に、本明細書に記載の活性剤（例えば、ＩＬ３３および／またはＰＤ－１および／またはＰＤ－Ｌ１阻害剤）の１以上の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む。ある態様において、本発明は、様々な細胞療法も提供する。これらの細胞療法は、ＰＤＡＣを有するレシピエント対象に、ドナー対象から得られ、ＩＬ３３との接触によりエクスビボ／インビトロで活性化された有効量の活性化ドナー膵臓ＩＬＣ２細胞を投与することを含む。

本明細書で用いる用語“処置する（treat）”、“処置（treating）”および“処置（treatment）”は、膵臓癌（例えば、ＰＤＡＣ）に関連する１以上の臨床的指標または症状における検出可能な改善を達成する、および／または達成する方法を実行することを包含する。例えば、このような用語には、膵臓腫瘍（または膵臓腫瘍細胞）の増殖速度を低減すること、膵臓腫瘍（または膵臓腫瘍細胞）の増殖を停止すること、膵臓腫瘍（または膵臓腫瘍細胞）の退行を引き起こすこと、膵臓腫瘍の大きさ（例えば、腫瘍体積または腫瘍質量に関して測定）を低減すること、膵臓腫瘍のグレードを下げること、膵臓腫瘍（または膵臓腫瘍細胞）を除去すること、膵臓腫瘍の再発（リバウンド）を防止、遅延または減速すること、膵臓腫瘍に関連する症状を改善すること、膵臓腫瘍からの生存率を改善すること、膵臓腫瘍の拡大（例えば、転移）を阻害または低減することなどが含まれるが、これらに限定されない。処置方法に言及する本明細書に記載の各態様において、上記の特定のパラメーターのいずれか１以上を達成する方法も企図される。例えば、膵臓癌（例えばＰＤＡＣ）を処置する方法に言及する本明細書に記載の各態様について、以下の方法も企図され、意図され、本発明の範囲に含まれる：（ａ）膵臓腫瘍（または膵臓腫瘍細胞）の増殖速度を低下させる方法、（ｂ）膵臓腫瘍（または膵臓腫瘍細胞）の増殖を停止させる方法、（ｃ）膵臓腫瘍（または膵臓腫瘍細胞）の退行を引き起こす方法、（ｄ）膵臓腫瘍のサイズ（例えば、腫瘍体積または腫瘍質量で測定）を減少させる方法、（ｅ）膵臓腫瘍のグレードを下げる方法、（ｆ）膵臓腫瘍（または膵臓腫瘍細胞）を除去する方法、（ｇ）膵臓腫瘍の再発（リバウンド）を防止、遅延、または遅らせる方法、（ｈ）膵臓腫瘍に伴う症状を改善する方法、（ｉ）膵臓腫瘍からの生存率を改善する方法、および（ｊ）膵臓腫瘍の拡大（例えば、転移）を阻害または低減する方法。

本明細書で用いる用語“対象”は、ヒト、非ヒト霊長動物、イヌ、ネコ、げっ歯動物（ラット、マウス、モルモットなど）、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマなど－動物飼育に用いられるすべての哺乳動物種、ならびにペットとして、動物園などで飼育されている動物を含むが、これらに限定されないすべての哺乳動物を包含する。ある態様において、対象はヒトである。

ある態様において、本発明の方法および組成物は、それを必要とする対象（すなわち、膵臓癌を有する対象）の何らかの膵臓腫瘍を処置するために用いることができる。好ましい態様において、本方法および組成物は、それを必要とする対象（すなわち、ＰＤＡＣを有する対象）において膵管腺癌（ＰＤＡＣ）に用いられる。ある態様において、本方法および組成物は、それを必要とする対象（すなわち、ＰＤ－１および／またはＰＤ－Ｌ１阻害剤耐性ＰＤＡＣを有する対象）におけるＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１阻害剤耐性ＰＤＡＣを処置するために用いられる。

ある態様において、対象は、他の方法および／または組成物を用いた処置に対して抵抗性の腫瘍を有する。本明細書で用いる用語“耐性”および“抵抗性”は、当技術分野におけるそれらの通常の使用と一致し、癌を処置する医師（例えば、腫瘍専門医）によるそれらの用語の理解と一致するように用いられる。例えば、当技術分野における通常の意味と一致して、腫瘍または対象は、ある処置方法またはある薬剤（または薬剤の組合せ）による処置に対して、その方法を使用するかまたはその薬剤（または薬剤の組合せ）を投与したにもかかわらず、対象の腫瘍（または腫瘍細胞）が増殖する、および／または進行する、および／または転移する、および／または再発する場合に“耐性”と見なされることがある。いくつかの例において、腫瘍は、最初は特定の方法または薬剤（または薬剤の組合せ）による処置に感受性であるが、後にそのような処置に対して耐性となる場合がある。

ある態様において、対象は、化学療法、放射線療法もしくは外科的切除、またはそれらの何れかの組み合わせを含むがこれらに限定されない他の組成物または方法による先行治療後に再発した膵臓腫瘍（例えば、ＰＤＡＣ）を有する。ある態様において、対象は、以前に処置されたことのない膵臓腫瘍を有する。

本明細書で用いる用語“有効量”は、上記の“処置”の説明で記載されるような１以上の望ましい臨床結果を達成する、もしくは達成に向けて寄与するのに十分な、および／または膵臓腫瘍（例えば、ＰＤＡＣ腫瘍）においてＩＬＣ２細胞を活性化するのに十分な、本明細書に記載の活性剤または細胞の量を意味する。何れかの個々の場合における適切な“有効”量は、用量漸増試験などの当技術分野で知られる標準的技術を用いて決定されてもよく、所望の投与経路（例えば、全身投与 対 腫瘍内投与）、所望の投与頻度などの要因を考慮して決定されてもよい。ある態様において、“有効量”は、臨床試験において有効であることが既に判明している量、および／またはヒト対象への投与が承認されている量であってよい。例えば、ある態様において、ＩＬ３３、ＰＤ－１阻害剤またはＰＤ－Ｌ１阻害剤の有効量は、臨床試験において有効であることが既に示されている量、および／またはヒト対象への投与が既に承認されている量であってもよい。さらに、“有効量”は、使用される何れかの共投与方法にて決定され得る。当業者は、例えば、本特許の実施例に記載のアッセイを用いて、使用する適切な用量を決定するために、このような投与試験を容易に行うことができる－これは、対象（投与試験を行うために薬学分野で常用される動物対象など）に本明細書に記載の薬剤を投与することを含む。

例えば、ある態様において、本発明の活性剤の用量は、活性剤の有効性および／または有効量を決定するために実施されたヒトまたは他の哺乳動物における試験に基づいて計算されてもよい。用量は、当技術分野において知られている方法によって決定されてもよく、活性剤の医薬形態、投与経路、１つの活性剤のみが使用されるかもしくは複数の活性剤（例えば、第１の活性剤が第２の活性剤と組み合わせて使用されるとき、必要となるかかる第１の活性剤の投与量は少なくてもよい）、および年齢、体重または薬物代謝に影響を及ぼす何らかの病状の存在を含む患者の特性などの要因によって変化し得る。

マウス試験に基づいて投与されるべき薬剤の特定の用量に言及する本明細書に記載の態様において、当業者は、例えば、当技術分野で知られているおよび／または本明細書に記載される種類の投与試験および計算法を用いて、マウス用量に基づいてヒト試験用の同等用量を容易に決定することができる。

ある態様において、本明細書に記載の様々な活性剤の適切な用量は、例えば、本特許出願の実施例においてマウスに有効であることが示された用量を出発点として、用量漸増試験などの当技術分野で標準的な種類の用量試験を行うことによって決定することができる。

ある態様において、１以上の活性剤は、例えば第Ｉ相臨床治験および／または用量漸増試験で決定されたように、およそその最大耐用量で使用される。ある態様において、１以上の活性剤は、その最大耐用量の約９０％で使用される。ある態様において、１以上の活性剤は、その最大耐用量の約８０％で使用される。ある態様において、１以上の活性剤は、その最大耐用量の約７０％で使用される。ある態様において、１以上の活性剤は、その最大耐用量の約６０％で使用される。ある態様において、１以上の活性剤は、その最大耐用量の約５０％で使用される。ある態様において、１以上の活性剤は、その最大耐用量の約４０％で使用される。ある態様において、１以上の活性剤は、その最大耐用量の約３０％で使用される。

本明細書に記載の処置方法を実施する際、本明細書に記載の活性剤および／または細胞またはそれらの組合せを送達するために、何らかの適切な方法または投与経路を用いることができる。ある態様において、全身投与が採用され得て、例えば、経口投与もしくは静脈内（ＩＶ）投与、または当技術分野で知られている全身投与の何らかの他の適切な方法もしくは経路が採用され得る。ある態様において、腫瘍内（ＩＴ）投与が採用されてもよい。ある態様において、腹腔内（ＩＰ）送達が採用されてもよい。例えば、本明細書に記載される活性剤は、注射によって、カテーテルを介した注入によって、移植可能な薬物送達デバイスを用いて、または当技術分野で知られている他の何らかの手段によって、全身的にまたは局所的に投与されてもよい。当業者であれば、状況に応じて、例えば活性剤と細胞のどちらが投与されるかに応じて、また活性剤の場合には活性剤の性質（例えばその安定性、半減期など）に応じて、適切な送達方法または経路を選択することができる。

特定の態様において、本明細書で提供される組成物および処置方法は、外科的方法（例えば、腫瘍切除のための）、放射線療法方法、化学療法剤による処置、血管新生剤による処置、チロシンキナーゼ阻害剤による処置または免疫チェックポイント阻害剤による処置などが挙げられるが、これらに限定されない、腫瘍療法に有用であると知られている他の組成物および処置方法と共に用いられ得る。同様に、特定の態様において、本明細書で提供される処置方法は、生検法および診断法（例えば、ＭＲＩ法または他の画像診断法）などの、疾患の状態／進行をモニターするために用いられる方法と共に用いられ得る。

例えば、ある態様において、本明細書に記載の方法は、例えば外科的切除の前に腫瘍を縮小するために、腫瘍の外科的切除を行う前に実施されてもよい。他の態様において、本明細書に記載の方法は、腫瘍の外科的切除を行う前後の両方で実施されてもよい。

ある態様において、本明細書に記載の処置方法は、対象が治療に反応しやすい腫瘍を有するかどうかを判断するための診断検査の実施と組み合わせて用いられ得る。例えば、ある態様において、処置を開始する前に、診断アッセイを実施して、対象がＰＤＡＣを有するかどうか、および／またはＰＤ－１および／もしくはＰＤ－Ｌ１を発現する細胞のうちＳＴ２などのＩＬ３３受容体を発現する細胞を含む膵臓癌（例えば、ＰＤＡＣ）を有するかどうかを決定する。

本明細書に記載の細胞療法に基づく方法において、腫瘍に対する他のタイプの細胞療法（例えば、腫瘍に対する他のタイプの自己細胞療法）に用いられるプロトコールは、ＩＬＣ２細胞と共に用いるために容易に適合させることができる。例えば、ＴＩＬ療法およびＣＡＲ－Ｔ細胞療法の改変法を用いることができる。これらの方法の各々は、ドナーから細胞を取得し、それらの細胞をインビトロ／エクスビボで何らかの方法で操作し、その後、それらの細胞をレシピエントに投与することを含む。例えば、ドナーからリンパ球を得る方法、それらの細胞を分離／精製する方法、それらの細胞をインビトロ／エクスビボで培養／維持／増殖する方法、ならびにそれらの細胞をレシピエントに投与する方法は、当技術分野でよく知られており、そのような方法の改変法は、本明細書に記載のＩＬＣ２ベースの細胞療法と組み合わせて用いることができる。対象で得られた膵臓ＩＬＣ２細胞の精製に関して、これは、ＦＡＣに基づく方法など、当技術分野で知られている標準的な細胞分離／精製方法を用いて実施することができる。このような細胞分離／精製方法において用いることができるいくつかのＩＬＣ２マーカーは、本明細書の実施例に記載されている。他の適切なマーカーは、当技術分野で知られている。

実施例
本発明は、以下の限定されない“実施例”および本明細書中参照される図面によってさらに説明される。実施例における上付きの数字は、本明細書中の文献リストにおける番号付けされた参考文献を示す。

実施例１
組織特異的な先天性リンパ系細胞の活性化は、膵臓癌におけるＰＤ－１チェックポイント阻害免疫療を強化する
概要
グループ２先天性リンパ系細胞（ＩＬＣ２）は、組織における炎症および免疫を制御している^１。ＩＬＣ２は、これらの組織の癌において検出されるが^２、癌免疫および免疫療法における役割は不明である。ここでは、本発明者らは、ＩＬＣ２が膵管腺癌（ＰＤＡＣ）に浸潤し、組織特異的な腫瘍免疫を活性化することを見出した。インターロイキン－３３（ＩＬ３３）は、異所性皮膚腫瘍ではなく、同所性膵臓腫瘍において腫瘍ＩＬＣ２（ＴＩＬＣ２）およびＣＤ８^＋ Ｔ細胞を活性化し、膵臓特異的な腫瘍の増殖を制限する。安静時および活性化ＴＩＬＣ２は、阻害性チェックポイント受容体ＰＤ－１を発現し、ＴＩＬＣ２はＰＤ－１遮断薬（αＰＤ－１）によりさらに増殖し、腫瘍制御を強化する。ＰＤ－１遮断薬はＴＩＬＣ２に直接作用して抗腫瘍免疫およびαＰＤ－１免疫療法の効果を増強し、活性化ＴＩＬＣ２がαＰＤ－１の新規標的であることが明らかになった。最後に、ＰＤ－１^＋ ＴＩＬＣ２およびＰＤ－１^＋ Ｔ細胞の両方が、ヒトＰＤＡＣの大部分に存在することが確認された。以上のことから、本発明者らは、ＩＬＣ２がＰＤＡＣ免疫療法のための新規抗癌免疫細胞であることを明らかにした。より広く言えば、ＩＬＣ２はαＰＤ－１免疫療法の効果を増幅する組織特異的な癌免疫エンハンサーとして出現する。ＩＬＣ２およびＴ細胞は、活性化および阻害の経路を共有しながらヒトの癌に共存していることから、抗癌性のＩＬＣ２およびＴ細胞の共標的化は、広く適用できる免疫療法アプローチであり得る。

ＴＩＬＣ２は、膵臓癌に浸潤する
未選択のヒト初代ＰＤＡＣにおいて、本発明者らは、免疫細胞系統マーカー（Ｌｉｎ^－）を欠くが、ＩＬＣ（ＣＤ２５、ＣＤ１２７）^１、ならびにＩＬＣ２（ＩＬ３３－受容体 ＳＴ２／ＩＬ１ＲＬ１／ＩＬ３３ＲおよびＧＡＴＡ３）マーカーを発現する腫瘍内細胞を見出した（図１ａ、図５ａ）。これらの推定ＴＩＬＣ２は、非炎症性（cold）腫瘍の短期生存者と比較して、“炎症性（hot）”腫瘍（活性化ＣＤ８^＋Ｔ細胞に富む）^３を有するまれな長期ＰＤＡＣ生存者において濃縮されており、ＴＩＬＣ２頻度の高さは生存期間の長さと相関していた（図１ｂ，図５ｂ）。一貫して、ＩＬＣ２活性化サイトカインＩＬ３３のバルク腫瘍ＲＮＡ発現が高いが、他のＩＬＣ活性化サイトカインは発現していないことは、より長期の生存期間と関連していた（図１ｃ、図５ｃ）。さらに、ＩＬ３３は、他のＩＬＣ活性化サイトカインではなく、腫瘍内免疫細胞溶解活性の高さと相関していた（図１ｃ、図５ｃ）。これらのデータは、タンパク質量ではなくＲＮＡ量を評価しているが、ＩＬ３３およびＴＩＬＣ２がヒトＰＤＡＣにおいて抗腫瘍免疫を活性化することが示唆された。

次に、本発明者らは、Ｋｒａｓおよびｐ５３を変異させた特発性（autochthonous）“ＫＰＣ”マウス^４ならびに同所性ＰＤＡＣマウスモデル（ＰＤＡＣマウス^５、６）の腫瘍を対象としてＩＬＣの有無を調べた。両モデルとも、ヒトＰＤＡＣにおけるものとマウスＩＬＣ２^１，７に類似した表現型のＴＩＬＣ２が検出された（図１ｄ、図５ｄ－ｆ）。マウスＴＩＬＣ２は腫瘍で増殖したが、隣接臓器では増殖せず（図１ｄ、図５ｇ）、その組織常在性と一致し^８、Ｒａｇ２^－／－マウスではリンパ球抗原ＣＤ９０．２を標的として減少させた（図１ｅ、図５ｈ）。したがって、ＩＬＣ２は、マウスおよびヒトＰＤＡＣにおいて局所的に増殖する保存された細胞である。

ＴＩＬＣ２の増殖を誘導するシグナルの同定において、ＰＤＡＣマウスおよびＫＰＣマウス^１１の両方で、ＩＬ３３が他のＩＬＣ誘導サイトカインと比較して腫瘍内で最も高い発現を示し（図６ａ）^６、ヒトおよびマウスＰＤＡＣの両方で不均一な発現であり（図６ｂ－ｃ）、腫瘍内骨髄系細胞^{１２、１３}で最大発現であることがわかった（図６ｄ、ｅ）。ＰＤＡＣ免疫におけるＩＬ３３およびＴＩＬＣ２の役割を理解するために、本発明者らは、ヒトＰＤＡＣ長期生存者のＩＬ３３^Ｈｉｇｈ、ＩＬＣ２濃縮炎症性腫瘍を反映するＩＬ３３^Ｈｉｇｈ ＰＤＡＣマウスにおけるＴＩＬＣ２依存性を試験した。ＩＬ３３^－／－ＰＤＡＣマウスは、Ｉｌ３３^＋／＋ＰＤＡＣマウスと比較して、ＴＩＬＣ２の頻度、数（図１ｆ、図６ｆ）およびサイトカイン産生（図６ｇ）が減少したことから、ＴＩＬＣ２の増殖および機能はＩＬ３３依存性であることが分かった。一貫して、組換えＩＬ３３（ｒＩＬ３３）は、ＩＬＣ－潤沢（proficient） Ｒａｇ２^－／－ ＰＤＡＣマウスのＩＬＣを増殖させたが、ＩＬＣ－欠損（deficient） Ｒａｇ２^－／－γｃ^－／－ ＰＤＡＣマウスでは増殖させなかった（図６ｈ、ｉ）。これらの試験から、ＩＬ３３はＰＤＡＣのＴＩＬＣ２を増殖させることが示された。

ＴＩＬＣ２は、組織における腫瘍免疫力を高める
ＩＬＣ２は組織特異的な表現型を有しているため^１４、本発明者らは、ＰＤＡＣ免疫に対するＴＩＬＣ２の効果は組織特異的であるとの仮設立てをした。これを検証するために、膵臓と皮膚の腫瘍増殖に対するＩＬ３３欠失の効果を対比した（膵臓のＴＩＬＣ２はＳＴ２を発現し、皮膚のＴＩＬＣ２は発現しない；図６ｊ^{１４、１５}）。Ｉｌ３３^＋／＋動物と比較して、同所的ＰＤＡＣを有するＩｌ３３^－／－マウスは、ＩＬ３３依存性の表現型を示さない皮下ＰＤＡＣマウスとは対照的に、腫瘍が大きく、腫瘍増殖が加速し、生存率が悪かった（図６ａ）（図２ｂ、図６ｋ）。これらのマウスは同一の遺伝的背景に完全に戻し交配されているが、ＩＬ３３^－／－ 対 ＩＬ３３^＋／＋同腹子でより大きな腫瘍を観察することにより、これらの違いが潜在的な小さな遺伝的ミスマッチに起因しないことを確認した（図６ｌ）。Ｉｌ３３^－／－骨髄を移植したキメラマウスは対照マウスと比較して腫瘍が大きかったことから、これらの抗腫瘍効果は宿主造血細胞由来のＩＬ３３依存性であった（図６ｍ－ｏ）。Ｉｌ３３^＋／＋およびＩｌ３３^－／－同所性ＰＤＡＣマウスから精製したＣＤ４５^＋腫瘍内免疫細胞のＲＮＡ配列決定（ＲＮＡ－ｓｅｑ）により、Ｉｌ３３^－／－ＰＤＡＣ免疫細胞はＴ細胞活性化およびＭＨＣ－Ｉ抗原処理に関する転写シグナルが減少しており、Ｔ細胞プライミング不足が示唆された（図７ａ）。一貫して、Ｉｌ３３^－／－同所性ＰＤＡＣマウスは、皮下ではなく、腫瘍浸潤ＣＤ８^＋ Ｔ細胞の頻度が低く、他の免疫細胞の頻度には一貫した変化がなく、排出リンパ節（ＤＬＮ）においてセントラルメモリーＣＤ８^＋ Ｔ細胞（ＴＣＭ）が減少したが、遠隔リンパ節には認められなかった（図２ｃ、図７ｃ－ｅ）。Ｉｌ３３^＋／＋マウスと比較したＩＬ３３^－／－マウスの腫瘍サイズの増加は、pan-Ｔ細胞枯渇により消失し（図２ｄ）、ｒＩＬ３３処理したＲａｇ２^－／－ＰＤＡＣマウスの腫瘍重量には差がなかった（図８ａ）ことから、ＩＬ３３の抗腫瘍効果がＴ細胞介在性であることが確認された。Ｉｌ３３^－／－およびＩｌ３３^＋／＋ ＰＤＡＣマウスの同所性腫瘍もまた、同様の組織学、コラーゲンおよび線維芽細胞含量を有しており（図８ｂ－ｄ）、ｒＩＬ３３の腫瘍細胞に対するインビトロでの効果はなく（図８ｅ－ｇ）、ＩＬ３３が腫瘍または間質細胞に直接影響を及ぼさないことを示している。これらのデータから、ＩＬ３３はＴＩＬＣ２を活性化してＣＤ８^＋Ｔ細胞を誘導することにより、組織特異的ながん免疫力を活性化することが明らかになった。

本発明者らは、次に、ＣＤ８^＋ Ｔ細胞に対するＩＬ３３の効果が組織特異的であるかどうかを、ＣＤ８^＋ Ｔ細胞拒絶抗原オボアルブミンを発現するＫＰＣ細胞（ＫＰＣ－ＯＶＡ）の拒絶表現型を異なる組織部位で対比することにより検討した。興味深いことに、Ｉｌ３３^＋／＋マウスの７０％は同所性のＫＰＣ－ＯＶＡ腫瘍を拒絶したが、Ｉｌ３３^－／－マウスは０％であった。一方、Ｉｌ３３^＋／＋およびＩｌ３３^－／－マウスの１００％が皮下ＫＰＣ－ＯＶＡ腫瘍を拒絶した（図２ｅ）。この表現型がＩＬＣ２欠失と効果的でないＣＤ８^＋ Ｔ細胞のプライミングに起因するかどうかを評価するために、ＩＣＯＳ^＋ＣＤ４^＋Ｔ細胞^１６を温存しながらジフテリア毒素によるＩＬＣ２枯渇を可能にするｉＣＯＳ－Ｔマウスを用いて、ＤＬＮにおける抗原特異的ＣＤ８^＋ Ｔ細胞の急性枯渇および試験を行った（図２ｆ、図９ａ）。ＩＬＣ２枯渇は、Ｉｌ３３^－／－表現型を再現し、同所的ＫＰＣ－ＯＶＡ腫瘍では腫瘍拒絶率が高く、腫瘍サイズが大きく、皮下腫瘍では差がなかった（図２ｆ）が、拒絶評価時間および枯渇効果の差を考えると、Ｉｌ３３^－／－マウスと比較して予想される変動であった。ＩＬＣ２枯渇同所性ＫＰＣ－ＯＶＡマウスにおけるテトラマー分析は、ＤＬＮおよび脾臓におけるＯＶＡ特異的ＣＤ８^＋ Ｔ細胞の減少、およびＤＬＮにおけるＣＤ８^＋ ＴＣＭの減少（ＩＬ３３^－／－マウスで見られたように）を示した（図２ｇ、図９Ｂ、Ｃ）。したがって、ＩＬＣ２欠失はＩＬ３３欠失を部分的に表現している。ＩＬ３３のＣＤ８^＋Ｔ細胞への直接的な影響は否定できないが、腫瘍内ＣＤ８^＋Ｔ細胞にはＳＴ２が発現していないことが分かった（図９ｄ）。まとめると、これらの機能喪失試験は、ＩＬ３３－ＴＩＬＣ２軸が組織特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞ＰＤＡＣ免疫をプライミングさせることを示唆した。

次に、ｒＩＬ３３処理が同様の組織特異的抗腫瘍効果を有するかどうかを調べるために、本発明者らは、ｒＩＬ３３が同所的ＰＤＡＣマウスにおける腫瘍形成を阻止し、生存期間を延長し、皮下ＰＤＡＣマウスには効果がなく、安楽死を要する進行性の腫瘍増殖および潰瘍化をもたらし（図３ａ）、ＫＰＣ－ＯＶＡ ＰＤＡＣマウスにおいて同様の組織特異的抗腫瘍効果を有することを見出した（図１０ａ）。同様に、ＩＬ１８Ｒ^＋皮膚ＩＬＣ２ｓ^１４を優先的に活性化するサイトカインであるｒＩＬ１８は、ＩＬ１８Ｒ^＋ＩＬＣが浸潤した皮下ＰＤＡＣの増殖を制限したが、ＩＬ１８Ｒ^＋ＩＬＣを有さない同所性ＰＤＡＣは制限しなかった（図３ｂ、図１０ｂ）。ｒＩＬ３３は、同所性ＰＤＡＣマウスのＤＬＮと腫瘍でＩＬＣ２を選択的に増殖させ（図３ｃ）、脾臓または皮下ＰＤＡＣでは変化がなかった（図１０ｃ、ｄ）。ＩＬＣ２の増殖は、腫瘍内ＣＤ８^＋ Ｔ細胞サイトカイン能力の増強およびＰＤ－１の上方制御を伴い（図１０ｅ）、他の腫瘍内免疫細胞には一貫した変化が見られなかった（図１０ｆ）が、それらの機能を調節する可能性を否定することはできない。ＩＬＣ２が間接的に抗腫瘍ＣＤ８^＋ Ｔ細胞のプライミングを行うことと一致して、ｒＩＬ３３処理により腫瘍内ＣＤ１０３^＋樹状細胞（ＤＣ）が倍増し（図３ｄ、図１０ｇ）、ＣＤ８^＋ Ｔ細胞のプライミングおよびＰＤＡＣへ動員した^６。本発明者らは、ｒＩＬ３３の効果がＩＬＣ２に依存するかどうかを調べるため、ＰＤＡＣを有するＲｏｒａ^{ｆｌ／ｆｌ}Ｉｌ７ｒ^{Ｃｒｅ／＋}マウスにｒＩＬ３３を投与し、ＩＬＣ２を構成的に欠失させた^１６。ＩＬＣ２欠失（図１０ｈ）により、ｒＩＬ３３の有効性（図３ｅ）が損なわれ（図３ｆ）、腫瘍内のＣＤ１０３^＋ ＤＣの増加が弱まった。ｒＩＬ３３は、ＣＤ１０３^＋ ＤＣ欠失損Ｂａｔｆ３^－／－マウスでは抗腫瘍効果を示さず（図３ｇ）、腫瘍内ＣＤ８^＋ Ｔ細胞ＰＤ－１の発現も誘導できない（図１０ｉ）ため、ｒＩＬ３３による腫瘍制御にはＣＤ１０３^＋ ＤＣが不可欠であると立証することができた。ＴＩＬＣ２がケモカインを産生してＤＣを腫瘍に勧誘するかどうかを確認するために、単一細胞ＲＮＡ－ｓｅｑ（ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ）を使用し（図１１ａ－ｃ）、活性化ＴＩＬＣ２およびＤＬＮ ＩＬＣ２がＩＬＣ２同一性のマーカーを保持しているが、異なる転写プロファイルを示していることが見いだされ（図１２ａ－ｅ）、ｒＩＬ３３で活性化されたＴＩＬＣ２は、ＣＤ１０３^＋ ＤＣを腫瘍に動員するケモカインをコードするＣｃｌ５（図１２ｆ）を選択的に発現し^１７、インビトロで効率的なＤＣ移動を誘導することがわかった（図３ｈ）。まとめると、これらのデータは、ｒＩＬ３３がＴＩＬＣ２を増殖させ、Ｃｃｌ５産生を介して潜在的にＣＤ１０３^＋ ＤＣを腫瘍に動員し、ＣＤ８^＋ Ｔ細胞を活性化して治療的腫瘍免疫を誘導することを示唆した。

ＰＤ－１遮断薬によるＴＩＬＣ２の活性化
ｒＩＬ３３でＩＬＣ２を刺激すると抗腫瘍効果があることから、本発明者らは、ＩＬＣ２の活性化をさらに高める方策を探した。最近のデータでは、Ｔ細胞と同様に、ＩＬＣ２も共阻害剤^２，１８免疫チェックポイント経路を通じてその活性を制御していることが示されている。具体的には、免疫チェックポイントＰＤ－１は、マウスＩＬＣ２の発生を制御し^１９、エフェクターＩＬＣをマークし^１９、遺伝的に欠失させるかブロッキング抗体（ＰＤ－１）で阻害すると、ＩＬ３３活性化ＩＬＣ２がマウスおよびヒトでより大きな増殖およびエフェクター機能を示すようになる^２０。ＰＤ－１^＋ＩＬＣ２は、ヒトの腫瘍にも存在する^２。しかし、がん治療のためのＩＬＣ２の活性化と阻害の同時進行は、比較的未解決の分野である。

ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ（図１１ａ－ｃ）を用いて、本発明者らは、ＰＤ－１がＴＩＬＣ２によりベースラインで発現される唯一の検出可能な共阻害分子であることを見出した（図１３ａ）。ｒＩＬ３３処理により、ＴＩＬＣ２の一部でＰＤ－１が上方制御されたが、ＤＬＮ ＩＬＣ２には見られなかったことから（図１３ｂ）、ＰＤ－１は活性化ＴＩＬＣ２を機能的に抑制する可能性が示唆された。そこで、本発明者らは、ｒＩＬ３３とαＰＤ－１を組み合わせることで、ＴＩＬＣ２を協調的に活性化し、抗腫瘍効果を高めることができるかどうかを検討した。ＰＤ－１がｒＩＬ３３活性化ＴＩＬＣ２上にのみ発現していることと一致して、αＰＤ－１単独では、ＰＤＡＣ_６で以前に報告されたように部分的な反応を誘導したが（図４ａ）、ＴＩＬＣ２頻度には顕著な変化は見られなかった（図４ｂ、図１３ｃ）。ｒＩＬ３３とαＰＤ－１を組み合わせることで、腫瘍およびＤＬＮにおけるＩＬＣ２が最大限に増加し（図４ｂ）、ＰＤ－１単独と比較して腫瘍制御が強化された（図４ａ）。αＰＤ－１が細胞内在性のＰＤ－１遮断によってＩＬＣ２を活性化しているかどうかを調べるために、本発明者らは、インビボ処理後のＴＩＬＣ２およびＤＬＮ ＩＬＣ２の単一細胞の転写プロファイルを比較した。ＴＩＬＣ２は処理に関係なくＩＬＣ２の転写および細胞同一性を保持していたが（図１３ｄ）、ｒＩＬ３３およびαＰＤ－１処理ＰＤＡＣマウスのＴＩＬＣ２は、他のすべての条件と比較してユニークな転写表現型を有しており（図４ｃ）、ＩＬＣ２特異的マーカー、正規（canonical）（アンフィレグリン［Ａｒｅｇ］）^１４および非正規（non-canonical）（ＣＸＣＬ２）^２１エフェクター分子、細胞活性化機構（Ｊｕｎｂ、Ｆｏｓｌ２、Ｙｂｘ１）、共阻害免疫チェックポイントの発現増加が見られた（図１３ｅ－ｉ）。最後に、二重治療の抗腫瘍効果はＩＬＣ２欠失マウスで消失し（図４ｄ）、ＩＬＣ２がαＰＤ－１およびｒＩＬ３３の二重治療の有効性に必要であることが実証された。これらの結果は、αＰＤ－１がＴ細胞のみではなく、ＩＬＣ２上のＰＤ－１経路をおそらく阻害することによって、活性化ＴＩＬＣ２を優先的に増幅することを示唆した。

ＰＤ－１ ＴＩＬＣ２阻害は細胞内在性である
活性化ＴＩＬＣ２における細胞内ＰＤ－１経路の遮断が二重療法の抗腫瘍効果に寄与しているかどうかを確認するために、本発明者らは、選別精製したｒＩＬ３３活性化ＰＤ－１プロフィシェント（野生型［ＷＴ］）またはＰＤ－１欠失（Ｐｄｃｄ１^－／－）ＴＩＬＣ２を腫瘍を有するＩＬＣ２欠損マウスに移植した（図４ｅ，図１４ａ）。ＷＴ ＴＩＬＣ２送達は確立された腫瘍において抗腫瘍効果を示さなかったが、Ｐｄｃｄ１^－／－ ＴＩＬＣ２は腫瘍の増殖を制限し、ＴＩＬＣ２上のＰＤ－１シグナルを中断することで腫瘍制御を強化できることを示す（図４ｅ）。次に、ｒＩＬ３３で活性化されたＰＤ－１^＋ ＴＩＬＣ２が、確立した腫瘍におけるＰＤ－１療法の効果を直接増幅することができるかどうかを検証した。本発明者らは、選別精製したｒＩＬ３３活性化コンジェニック系統ＣＤ４５．１^＋ ＴＩＬＣ２を、腫瘍が確立したＣＤ４５．２^＋ ＩＬＣ２欠損マウスに移植し、移植後にＰＤ－１で処理した（図４ｆ）。移植されたＴＩＬＣ２は９７％以上ＰＤ－１^＋であり（図１０ｂ）、αＰＤ－１処理したレシピエントマウスの腫瘍およびＤＬＮに蓄積したが、脾臓には蓄積せず、移植後９週間まで持続した（図４ｇ）。ＰＤ－１^＋ ＴＩＬＣ２の移植は、αＰＤ－１の効力を増強し、腫瘍の増殖を制限し、レシピエントマウスの腫瘍およびＤＬＮ（脾臓は含まない）におけるＴ細胞頻度を増加させた（図４ｈ）。これらのデータは合して、ｒＩＬ３３活性化ＴＩＬＣ２におけるＰＤ－１シグナルの遮断が直接的な抗腫瘍効果を有し、ＰＤ－１効果を増幅することを示した。

ＩＬ３３^Ｌｏｗ αＰＤ－１耐性腫瘍におけるｒＩＬ３３およびＰＤ－１効力を調べるために、ＩＬ３３^Ｌｏｗ短期ヒトＰＤＡＣ生存者の免疫学的特徴および生存特徴を模倣するために、ＩＬ３３^Ｌｏｗ腫瘍（図６ｂ）を作製し、ＣＤ８^＋Ｔ細胞が５０％少なく、生存期間の中央値がわずか２週間（図１４ｃ）の攻撃的“非炎症性”ＰＤＡＣモデル（ＫＰＣ５２）を選択した。ＫＰＣ５２ ＰＤＡＣマウスは、自発的なＫＰＣマウスに見られるような前浸潤性新生物から浸潤性ＰＤＡＣへのＰＤＡＣ腫瘍形成の連続した段階を示さないが、自発的なＫＰＣマウスおよびヒトＰＤＡＣに見られるαＰＤ－１耐性を再現している（図４ｉ）。本発明者らは、ｒＩＬ３３およびαＰＤ－１の併用により、腫瘍体積が４０％近く減少し、マウスの生存率が５０％近く改善することを見出した（図４ｉ）。最後に、ｒＩＬ３３およびαＰＤ－１の併用療法によるＰＤＡＣ患者の処置可能性を評価するために、ヒトＰＤＡＣの６０％近くでＰＤ－１^＋ ＴＩＬＣ２およびＰＤ－１^＋ Ｔ細胞の頻度が低く、この２つの細胞タイプ間に有意な相関があり（図１４ｄ）、それらはヒトＰＤＡＣにおいて頻繁に同時に生じていることが示唆された。さらに、ＩＬ３３ ｍＲＮＡは、生存期間の延長と関連しているＰＤ－１ ｍＲＮＡと有意な相関があり（図１４ｅ）、ＩＬ３３－ＰＤ－１軸がヒトＰＤＡＣの生存にプラスの影響を与える可能性が示唆された^２２。まとめると、ｒＩＬ３３でＩＬＣ２を活性化すると、ＰＤ－１部分感受性腫瘍およびＰＤ－１耐性腫瘍の両方においてαＰＤ－１に対する反応を増幅することができる。

考察
本発明者らの結果は、ＩＬＣ２を活性化することが、ＩＬＣ２浸潤性の癌においてＴ細胞のプライミングを促進するためのより広い戦略である可能性を示唆している（図１４ｆ）。しかしながら、ＩＬＣ２の組織特異的表現型を考慮すると、それらを活性化することが多様な癌種において同様の効果をもたらすかどうかについては、さらなる試験が必要である。

ＩＬＣ２は免疫チェックポイントを発現しているが、免疫チェックポイント阻害療法によってその能力を発揮できるかは不明であった。本発明者らは、活性化したＩＬＣ２上のＰＤ－１を遮断すると抗腫瘍効果があることを確認し、ＩＬＣ２がヒト癌におけるＰＤ－１経路遮断の効果に部分的に寄与することを示唆するとともに、チェックポイント遮断反応の差は組織特異的要因に依存し得ることをより広く強調している。

活性化されたＩＬＣ２によるいくつかの免疫調節分子の発現（図１４ｇ）は、腫瘍のＩＬＣ２およびＴ細胞において、より広範囲のチェックポイントが標的となり得ることを示唆している。ＩＬＣ２およびＴ細胞は、共通の共刺激経路および共阻害経路を有してヒト癌に共存しているため、癌免疫療法のためにＩＬＣ２およびＴ細胞をまとめて標的とする戦略が必要である。

この実施例で示されたデータは、本発明者らによって雑誌「Nature」に掲載された（Moral et al., “ILC2s amplify PD-1 blockade by activating tissue-specific cancer immunity” Nature, 2020, Mar, Vol. 579(7797), pp 130-135.doi: 10.1038/s41586-020-2015-4, Epub 2020 Feb 19参照のこと）。補足資料を含むこの文献の内容全体は、引用により本明細書中に包含させる。

実施例２
材料および方法
本実施例では、実施例１に記載の実験を行う際に用いた材料および方法について説明する。
マウス
Ｃ５７ＢＬ／６（野生型、ＷＴ、ＣＤ４５．２）、Ｃ５７ＢＬ／６ ＣＤ４５．１、Ｒａｇ２^－／－、Ｒａｇ２^－／－ｃ^－／－、Ｂａｔｆ３^－／－およびＰｄｃｄ１^－／－マウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓから購入した。Ｉｌ３３^－／－、Ｉｌ３３^{Ｃｉｔ／＋}は、Ｍ．Ｊ．Ｒｏｓｅｎから贈られたものである。Ｃｄ４^{Ｃｒｅ／＋}Ｉｃｏｓ^{ｆｌ－Ｄｔｒ／＋}およびＩｌ７ｒ^{Ｃｒｅ／＋}Ｒｏｒα^{ｆｌ／ｆｌ}はＡ．Ｎ．Ｊ．ＭｃＫｅｎｚｉｅから贈られたものであり、既報である^{１６，２３}。すべての実験について、６－１２週齢のマウスを週齢および性別で一致させ、特定の処理群に無作為に割り当て、全体で少なくとも２つの独立した実験を行った。Ｐｄｘ１－Ｃｒｅ；ＬＳＬ－Ｋｒａｓ^{Ｇ１２Ｄ／＋}；ＬＳＬ－Ｔｒｐ５３^{Ｒ１７２Ｈ／＋} （ＫＰＣマウス）は、既報である^４。実験のサンプルサイズは、正式な検出力計算（power calculation）を行わずに決定した。動物は、特定の病原体を含まない動物施設で飼育・維持され、すべての実験は、Memorial Sloan Kettering Cancer Center (MSKCC)のInstitutional Animal Care and Use Committee (IACUC)承認プロトコールに従い、すべての関連倫理法規を遵守して実施された。

細胞株および動物実験
すべての腫瘍細胞株はＫＰＣマウスに由来する。Ｐｄｘ１－Ｃｒｅ；ＬＳＬ－Ｋｒａｓ^{Ｇ１２Ｄ／＋}；ＬＳＬ－Ｔｒｐ５３^{Ｒ１７２Ｈ／＋}（Ｒ．Ｈ．Ｖｏｎｄｅｒｈｅｉｄｅより寄贈）のＫＰＣ４６６２細胞をＧＦＰでトランスフェクトし、他に指示がない限りすべての実験に使用した。Ｐｔｆ１ａ－Ｃｒｅ；ＬＳＬ－Ｋｒａｓ^{Ｇ１２Ｄ／＋}；ＬＳＬ－Ｔｒｐ５３^{Ｒ１７２Ｈ／＋} マウス由来のＫＰＣ８－１，１８－３，５２細胞はＣ．Ｉａｃｏｂｕｚｉｏ－Ｄｏｎａｈｕｅから贈られたものである。ＯＶＡを発現するように操作されたＫＰＣ４６６２細胞は、既報である^２４（Ｒ．Ｈ．Ｖｏｎｄｅｒｈｅｉｄｅからの寄贈）。すべての細胞株は、専門の膵臓癌病理医による病理組織学的検証に基づいて、本物の（bonafide）ＰＤＡＣ細胞株として認められた。ＫＰＣ４６６２細胞で樹立した同所性腫瘍はＩＬ３３^Ｈｉｇｈで、移植時に開始したＰＤ－１療法により一過性にサイズが縮小した（ＰＤ－１部分感受性）。ＫＰＣ５２細胞で樹立した同所性腫瘍はＩＬ３３^Ｌｏｗであり、移植時に開始したＰＤ－１療法によってもサイズが減少しなかった（ＰＤ－１耐性）。すべての細胞株は、ＭｙｃｏＡｌｅｒｔ Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｌｏｎｚａ）を用いて定期的に検査した。同所性ＰＤＡＣ腫瘍は、既報のように確立された^５。まとめると、マウスをケタミン／キシラジンカクテルを用いて麻酔し、小さな（７ｍｍ）左腹部側切開を行った。腫瘍細胞（１０^６ ＫＰＣ細胞／マウス；１．２５×１０^５ ＫＰＣ－ＯＶＡ細胞／マウス）をマトリゲル（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）に懸濁し、冷リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で１：１に希釈し（総容量５０μｌ）、２６ゲージ針で膵臓尾部に注入した。注入の成功を、腹腔内漏出のない液泡の出現によって確認した。腹壁は吸収性Ｖｉｃｒｙｌ ＲＡＰＩＤＥ縫合糸（Ｅｔｈｉｃｏｎ社製）で、皮膚は創傷クリップ（Ｒｏｂｏｚ社製）で閉じた。皮下ＰＤＡＣ腫瘍については、腫瘍細胞（１０^６ ＫＰＣ細胞／マウス；１．２５×１０^５ ＫＰＣ－ＯＶＡ細胞／マウス）を無菌ＰＢＳ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中に再懸濁し、皮下に移植した。マウスを、示された時点で屠殺し、組織試験またはフローサイトメトリー用に処理した。自家（Autochthonous）ＫＰＣマウスは、腫瘍が超音波によって検出可能であったときに屠殺した。腫瘍体積は、既報のように、同所性腫瘍について連続超音波（Ｖｅｖｏ ２１００ Ｌｉｎｅａｒ Ａｒｒａｙ Ｉｍａｇｉｎｇ ａｎｄ Ｖｉｖｏ ＬＡＢ Ｖｅｒｓｉｏｎ ３．１．１， Ｆｕｊｉ Ｆｉｌｍ Ｖｉｓｕａｌ Ｓｏｎｉｃｓ）を用いて測定した^２５。皮下腫瘍の場合、腫瘍の長さおよび幅をノギスで２－３日毎に測定し、腫瘍体積を、体積（Ｖｏｌｕｍｅ）＝１／２ 長さ×幅^２として計算した。生存解析のために、生存は、腫瘍体積が５００ｍｍ^３を超える大きさになるか、または機関ＩＡＣＵＣガイドラインで定義された安楽死を必要とするマウスの健康状態によって決定された。マウスの腫瘍は、ＩＡＣＵＣが定義した最大腫瘍体積２ｃｍ^３を超えるものはなかった。処置群を知る必要があったため、実験用マウスの取扱い際して無作為化は行わなかった。

Ｔ細胞枯渇
抗マウスＣＤ４抗体（クローンGK1.5、BioXcell、InVivoPlus）２５０μｇおよび抗マウスＣＤ８ａ抗体（クローン2.43、BioXcell、InVivoPlus）２５０μｇを腹腔内（ｉ．ｐ．）注射してＣＤ４細胞およびＣＤ８細胞を枯渇させた。対照マウスには、ラットＩｇＧ２ｂアイソタイプ対照（クローンLTF-2、BioXcell、InVivoPlus）を投与した。マウスを、腫瘍移植の３日前から毎日処理し、その後、実験期間中、３日毎に処理した。ＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋ Ｔ細胞の枯渇は、腫瘍および二次リンパ臓器のフローサイトメトリー分析によって確認した（＞８５％の枯渇）。

ＩＬＣ枯渇
Ｒａｇ２^－／－マウスのＩＬＣは、既報のように、腫瘍移植後０日目、１日目、３日目、６日目、９日目および１３日目に抗マウスＣＤ９０．２（クローン３０－Ｈ１２、ＢｉｏＸＣｅｌｌ）３００μｇをｉ．ｐ．注射して減少させた^２６。Ｃｄ４^{Ｃｒｅ／＋}Ｉｃｏｓ^{ｆｌ－ＤＴＲ／＋}実験マウスおよびＣｄ４^{Ｃｒｅ／＋}Ｉｃｏｓ^＋／＋対照マウスに、ジフテリア毒素（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）をマウス体重１ｇあたり２５ｎｇの用量でｉ．ｐ．注射して処理して、ＩＬＣ２を枯渇させた。マウスは、腫瘍移植の前日に処理し、その後隔日で合計５用量投与したことは、既報のとおりである^１６。ＩＬＣ２枯渇は、腫瘍のフローサイトメトリー分析により確認した（図９ａ）。

骨髄キメラ
骨髄をＣＤ４５．２先天性標識ドナーマウスから採取し、７０ｍｍフィルターでろ過して遠心分離し、滅菌ＰＢＳに再懸濁し、２００μｌあたり１０^８個の生細胞の濃度とした。ＣＤ４５．１先天性標識Ｃ５７ＢＬ／６Ｊレシピエントマウスを、骨髄移植の２４時間前に照射（５．５Ｇｙ×２、６時間間隔）し、照射後４週間エンドフロキサシン水で維持した。滅菌ＰＢＳ中のＣＤ４５．２骨髄キメラの単一細胞懸濁液（レシピエントマウスあたり１０^８個の生細胞）を、後眼窩注射により各レシピエントマウスに移植した。移植後４週間および８週間の末梢血のフローサイトメトリーにより再構成を確認した。腫瘍移植実験を移植後１２週目に行った。

組換えＩＬ３３、ＩＬ１８およびＰＤ－１遮断
ｒＩＬ３３については、マウスに滅菌ＰＢＳ中の５００ｎｇのキャリアフリーの組換えマウスＩＬ３３（R&D Systems）を７日間毎日腹腔内注射し、その後は２日毎に、既報のように処理した^１５。ｒＩＬ１８については、腫瘍接種後３日目、７日目、１１日目および１５日目に、滅菌ＰＢＳ中のキャリアフリーの組換えマウスＩＬ－１８（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）２μｇのｉ．ｐ．注射でマウスを処理した^２７。マウスＩｇＧ１アイソタイプモノクローナル抗体（ｍＡｂ）として設計されたこの試験で用いられたキメラ抗マウスＰＤ－１抗体（４Ｈ２）は、ＰＤ－１を発現するＣＨＯトランスフェクタントに結合し、これらの細胞へのＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２の結合を阻止することが示された。ＰＤ－１－Ｆｃを用いた表面プラズモン共鳴法により測定した４Ｈ２のマウスＰＤ－１に対する親和性は４．６８×１０^－９Ｍであった。各バッチは、＜０．５ ＥＵ／ｍｇ エンドトキシンおよび＞９５％純度であることが証明されている。すべての投与溶液はＰＢＳで調製した。マウスは、２５０μｇの抗ＰＤ１抗体を２日毎にｉ．ｐ．注射して処理した。αＰＤ－１を継続投与している間に腫瘍サイズが一過性に縮小したが、その後再増殖した場合を部分奏効と定義した。αＰＤ－１を継続投与している間、腫瘍サイズの縮小が見られない場合は、抵抗性と定義した。

ヒト試料
すべての組織は、ＭＳＫＣＣ施設審査委員会による試験プロトコールの承認後、ＭＳＫＣＣで収集された。すべての患者について、インフォームドコンセントを得た。この試験は、すべての施設の倫理規定を厳密に遵守して実施された。すべての腫瘍サンプルは、外科的に切除された原発性ＰＤＡＣであった。

組織マイクロアレイ。組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）を、ＰＤＡＣの短期生存者（ｎ＝４５腫瘍、５正常組織）および長期生存者（ｎ＝５１腫瘍、５正常組織）のホルマリン固定、パラフィン包埋組織ブロックの腫瘍および隣接非腫瘍コアから既報のように構築した^３。組織マイクロアレイ構築のために、患者サブセットを無作為に選択した。ネオアジュバント療法を受けた患者は除外した。すべての腫瘍は、解析前にＰＤＡＣ専門病理医２名による病理学的再レビューと組織学的確認を受けた。周術期死亡を除外するため、長期生存者を手術から全生存期間が３年超の患者、短期生存者を手術から生存期間が３カ月超１年未満の患者と定義した。ＩＬＣ２^ＨｉｇｈおよびＩＬＣ２^Ｌｏｗを、それぞれＴＭＡコホート全体のＩＬＣ２頻度中央値より大きいかまたは小さいと定義した。

腫瘍のトランスクリプトームプロファイリング。患者サブセットを無作為に選択し、既報のようにトランスクリプトームプロファイリングを行った^３。トランスクリプトーム評価に利用できる腫瘍組織を有するＴＭＡコホート内の患者を、ＲＮＡ発現をタンパク質で確認できるように、図１ｂの解析に含めた。抽出したＲＮＡを、Agilent BioAnalyzerで定性化し、蛍光測定（Ribogreen）により定量化した。全トランスクリプトーム発現解析のためのＲＮＡの調製を、WT Pico Reagent キット（Affymetrix社製）を用いて行った。コーディングＲＮＡと複数の非コーディングＲＮＡの両方を捕捉するために、ＲＮＡの全長だけでなくポリＡテイルで逆転写を開始した。ＲＮＡ増幅を、低サイクルＰＣＲおよびＴ７ インビトロ転写技術を用いた線形増幅により達成した。その後、ｃＲＮＡをビオチニル化センス鎖ＤＮＡハイブリダイゼーション標的に変換した。調製した標的をGeneChip Human Transcriptome Array 2.0 (Affymetrix)にハイブリダイズさせた。Fluidics Station 450/250 を用いて、GeneChip Hybridization, Wash and Stain キットを用いて洗浄を行った。アレイのスキャンを、GeneChip Scanner 3000で行った。アレイのデータ解析を、Affymetrix Expression Console ソフトウェア（SST-RMA algorithm to summarize the signal from array probesets）を用いて行った。免疫細胞溶解活性を、既報のように決定した^２８。

細胞の単離
マウスＰＤＡＣ腫瘍およびヒトＰＤＡＣ腫瘍と隣接する膵臓を機械的に分離し、コラゲナーゼ（マウス腫瘍はコラゲナーゼＩＩ、ヒト腫瘍はコラゲナーゼＩＶ、ともに５ｍｇ／ｍｌ；Worthington Biochemical Corp., Fisher Scientific）、ＤＮＡｓｅ Ｉ（０．５ｍｇ／ｍｌ；Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）およびハンク平衡塩溶液（Ｇｉｂｃｏ、Fisher Scientific）中で３７℃にて３０分間インキュベートした。その後、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、Life Technologies）で消化を停止し、細胞を１００ｍｍおよび４０ｍｍのナイロン製セルストレーナー（Ｆａｌｃｏｎ、Fisher Scientific）で順次濾過した。次いで、腫瘍、隣接する膵臓およびリンパ節を機械的に分離し、１％ＦＢＳ（Life Technologies）入りＰＢＳを用いて１００ｍｍおよび４０ｍｍナイロンセルストレーナー（Ｆａｌｃｏｎ、Fisher Scientific）により濾過した。脾臓を機械的に分離し、１％ＦＢＳ入りＰＢＳを用いて７０ｍｍおよび４０ｍｍナイロンセルストレーナー（Ｆａｌｃｏｎ、Fisher Scientific）でろ過し、その後、赤血球溶解（ＲＢＣ ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ、ThermoFisher Scientifiｃ）した。マウスＦｃ受容体を、ＦｃεＲＩＩＩ／ＩＩ特異的抗体（１×１０^６細胞あたり１μｇ；クローン２．４Ｇ２、Ｂｉｏ Ｘ Ｃｅｌｌ）でブロックした。

ＩＬＣ２養子細胞移植
ＣＤ４５．１ Ｃ５７Ｂｌ／６またはＰｄｃｄ１^－／－同所性ＰＤＡＣマウスに、無菌ＰＢＳ中５００ｎｇのキャリアフリー組換えマウスＩＬ３３（Ｒ＆Ｄ Systems）を１０日間投与した。生細胞、ＣＤ４５^＋、系統^－、ＣＤ９０^＋、ＣＤ２５^＋、ＳＴ２^＋のＴＩＬＣ２を、Ａｒｉａ Ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｅｒ（BD Biosciences）を用いて移植後１０日目に９８％の純度で選別精製した。５×１０^５個の腫瘍ＩＬＣ２を、腫瘍移植後７日目と１４日目に、ｉ．ｐ．注射により同所性ＰＤＡＣ腫瘍を有するＩＬ７ｒ^{Ｃｒｅ／＋}Ｒｏｒ^{ｆｌ／ｆｌ} ＣＤ４５．２マウスに直ちに移植した。対照マウスには、同量のＰＢＳをｉ．ｐ．注射で投与した。レシピエントマウスにおけるαＰＤ－１処置は、ＩＬＣ２細胞移植の日に開始した。組織を、指定された時点で採取した。

フローサイトメトリー
単一細胞懸濁液を４℃にて暗所で抗体カクテルを用いて染色し、洗浄後、ＦＡＣＳ ＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａ（BD Biosciences）で分析した。マウスＩＬＣは、既報のとおり、生細胞、ＣＤ４５^＋、系統^－（ＣＤ３、ＣＤ５、ＮＫ１．１、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１９、ＦｃεＲ１）、ＣＤ２５^＋、ＣＤ１２７^＋細胞と定義した^７、１。マウス免疫細胞を、以下のように定義した：ＩＬＣ２＝生細胞，ＣＤ４５^＋，ｌｉｎｅａｇｅ^－，ＣＤ２５^＋，ＳＴ２^＋細胞；セントラルメモリーＴ細胞＝生細胞，ＣＤ４５^＋，ＣＤ３^＋，ＮＫ１．１^－，ＣＤ８^＋，ＣＤ６２ｌ^＋，ＣＤ４４^＋；樹状細胞＝生細胞，ＣＤ４５^＋，ＣＤ３^－，ＮＫ１．１^－，Ｇｒ１^－、Ｆ４／８０^－、ＣＤ１１ｃ^＋、ＭＨＣ－ＩＩ^＋；Ｂ細胞＝生細胞、ＣＤ４５^＋、ＣＤ３^－、ＣＤ１９^＋；Ｔ細胞＝生細胞、ＣＤ４５^＋、ＣＤ３^＋；ＣＤ４^＋ Ｔ細胞＝生細胞、ＣＤ４５^＋、ＣＤ３^＋、ＣＤ４^＋；ＣＤ８^＋ Ｔ細胞＝生細胞、ＣＤ４５^＋、ＣＤ３^＋、ＣＤ８^＋；制御性Ｔ細胞＝生細胞、ＣＤ４５^＋、ＣＤ３^＋、ＣＤ４^＋ ＦｏｘＰ３^＋；腫瘍関連マクロファージ＝生細胞、ＣＤ４５^＋、ＣＤ１１ｂ^＋、Ｆ４／８０^＋、ＧＲ１^－；骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）＝生細胞、ＣＤ４５^＋、ＣＤ３^－、ＣＤ１１ｂ^＋、Ｆ４／８０^－、ＧＲ１^＋；マウス細胞を以下の抗体で染色した：BiolegendのＣＤ４５（クローン３０－Ｆ１１、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ）、ＣＤ４５．１（クローンＡ２０、ＢＶ７１１）、ＮＫ１．１（クローンＰＫ１３６、ＡＰＣ）、Ｇｒ－１（クローンＲＢ６－８Ｃ５、ＢＶ６０５）、ＣＤ１０３（クローン２Ｅ７、ＢＶ７１１）；BD Biosciencesの、ＣＤ５（クローン５３－７．３、ＡＰＣ）、ＣＤ１１ｃ（クローンＨＬ３、ＡＰＣ）、ＮＫ１．１（クローンＰＫ１３６、ＢＶ６０５）、ＣＤ４（クローンＲＭ４－５、ＢＶ７８６）、ＣＤ６２Ｌ（クローンＭＥＬ－１４、ＡＰＣ）、ＣＤ１９（クローン１Ｄ３、ＢＶ５１０）、Ｌｙ６Ｃ（クローンＡＬ－２１、ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５）、Ｌｙ６Ｇ（クローン１Ａ８、ＡＦ７００）、ＰＤ１（クローンＪ４３、ＢＶ６０５）、ＴＮＦ－α（クローンＭＰ６－ＸＴ２２、ＢＶ５１０）、ＩＦＮ－γ（クローンＸＭＧ１．２、ＡＰＣ－Ｃｙ７）、ＣＤ９０．２（クローン５３－２．１、ＢＶ７８６）、Ｔｂｅｔ（クローンＱ４－４６、ＢＶ７１１）、Ｒｏｒ－ｔ（クローンＱ３１－３７８、ＢＶ７８６）、Ｇａｔａ３（クローンＬ５０－８２３、ＰＥ－Ｃｙ７）およびＩＬ４（クローン１１Ｂ１１、ＢＶ６５０）；ThermoFisher Scientificの ＣＤ３（クローン１７Ａ２、アレクサフルール７００）、ＣＤ１１ｂ（クローンＭ１／７０、ＡＰＣ）、ＣＤ１１ｂ（クローンＭ１／７０，ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５）、ＣＤ８（クローン５３－６．７、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７００）、ＣＤ１９（クローン１Ｄ３、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７００）、ＦｃＲ１（クローンＭＡＲ－１、ＡＰＣ）、Ｆ４／８０（クローンＢＭ８、ＰＥ－Ｃｙ５）、ＣＤ３（クローン１４５－２Ｃ１１、ＰＥ－Ｃｙ７）、ＭＨＣ－ＩＩ（クローンＭ５／１１４．１５．２、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７００）、ＣＤ４４（クローンＩＭ７、ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５）、ＣＤ１２７（クローンＡ７Ｒ３４、ＦＩＴＣ）、ＣＤ２５（クローンＰＣ６１．５、ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５）、ＩＬ５（クローンＴＲＦＫ５、ＰＥ）、ＣＤ８６（クローンＧＬ１、ＰＥ）、ＣＤ１１ｃ（クローンＮ４１８、ＦＩＴＣ）、ＳＴ２（クローンＲＭＳＴ２－２、ＰＥ－Ｃｙ７）およびＦｏｘＰ３（クローンＦＪＫ－１６Ｓ、ＡＰＣ）；ならびに、MBL internationalの、ＳＩＮＦＥＫＬ ｔｅｔｒａｍｅｒ（カタログ番号ＴＢ－５００１－１、ＰＥ）。

ヒトＩＬＣを、既報のように、生細胞ＣＤ４５^＋、系統^－（ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ５６、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＴＣＲα／β、ＦｃεＲ１）、ＣＤ２５^＋、ＣＤ１２７^＋細胞として定義した^７。ヒト細胞を以下の抗体で染色した：BD Biosciences社製、ＧＡＴＡ３（クローンＬ５０－８２３、ＢＶ７１１）、ＴＢＥＴ（クローンＯ４－４６、ＢＶ６５０）、ＲＯＲγ－Ｔ（クローンＱ２１－５５９、ＰＥ）；Biolegend社製、ＣＲＴＨ２（クローンＢＭ１６、ＰＥ－Ｃｙ７）、ＣＤ１１ｂ（クローンＩＣＲＦ４４、ＡＰＣ）、ＣＤ５６（クローンＮＣＡＭ１６．２、ＢＶ６５０）、ＣＤ２５（クローンＢＣ９６，ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５）、ＣＤ４５（クローンＨＩ３０、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ）、ＴＣＲα／β（クローンＩＰ２６、ＡＰＣ）；ThermoFisher Scientific社製、ＣＤ１６（クローンＣＢ１６、ＡＰＣ）、ＣＤ１１ｃ（クローン３．９、ＡＰＣ）、ＣＤ１２７（クローンＲＤＲ５、ＦＩＴＣ）、ＣＤ３（クローンＯＫＴ３、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７００）、ＳＴ２（クローンｈＩＬ３３Ｒｃａｐ、ＰＥ）、ＣＤ５（クローンＬ１７Ｆ１２、ＡＰＣ）、ＣＤ１９（クローンＨＩＢ１９、ＡＦ７００）、ＦｃεＲ１（クローンＡＥＲ－３７、ＡＰＣ）。ＩＬ３３に対するヒト特異的抗体（クローン３９０４１２、ＰＥ）は、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから購入した。フローサイトメトリー用のサンプルはすべて、前向きに採取された非選択ＰＤＡＣ患者由来のものである。

細胞内サイトカイン産生を調べるために、腫瘍の単一細胞懸濁液を、ブレフェルディンＡ（１０μｇ／ｍｌ）（すべてSigma-Aldrich社製）の存在下で、フォルボール１２－ミリスチン酸（ＰＭＡ、１００ｎｇ／ｍｌ）およびイオノマイシン（１ｎｇ／ｍｌ）で３７℃にて６時間エクスビボで刺激した。その後、細胞を表面染色し、固定し、透過させ、Fixation and Permeabilization Buffer キットを製造者の推奨に従って用いてサイトカイン産生を染色した（Invitrogen, ThermoFisher Scientific）。適切なアイソタイプ対照を指示通りに用いた。解析はFlowJo（バージョン９および１０、Tree Star）で行った。

免疫組織化学
組織をパラホルムアルデヒド（Fisher Scientific）で２４時間固定し、パラフィンに包埋した。組織切片をＥＺＰｒｅｐ緩衝液（Ventana Medical Systems）で脱パラフィン化した後、ＣＣ１緩衝液（Ventana Medical Systems）で抗原賦活化を行った。切片をBackground Buster solution (Innovex) で３０分間ブロッキングした後、アビジン－ビオチンブロッキングを８分間行った（Ventana Medical Systems）。マウスＩＬ３３（AF3626, R&D Systems）、マウス平滑筋アクチン（Abcam）、ヒトＩＬ３３（AF3625, R&D Systems）抗体を適用し、切片を４時間インキュベートした後、１：２００希釈のビオチニル化ウサギ抗ヤギＩｇＧ（Vector labs）またはビオチン化ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Vector labs）で６０分間インキュベートした。検出は、ＤＡＢ検出キット（Ventana Medical Systems）を用いて、製造者の指示に従って行った。ＩＬ３３の細胞質または核の陽性を示す細胞を含む切片はすべて、陽性染色を有すると指定した。スライドをマッソントリクローム、またはヘマトキシリン、およびエオジンで対比染色し、パーマウント（Fisher Scientific）でカバースリップした。すべての組織切片は独立したＰＤＡＣ病理専門医が評価した。

免疫蛍光法
マウス
ＩＬ３３／ＣＤ１１ｂ／ＣＫ１９／Ｉｂａ１免疫蛍光：マルチプレックス免疫蛍光染色を、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ＸＴプロセッサー（Ventana Medical Systems）を用いて、記載のとおりに行った^２９。
ＩＬ３３：まず、切片を抗ｍＩＬ３３（R&D Systems、カタログ番号ＡＦ３６２６、１μｇ／ｍｌ）で４時間インキュベートし、次いでビオチニル化ウマ抗ヤギＩｇＧ（Vector Laboratories）と１：２００希釈で６０分間インキュベートした。検出は、ストレプトアビジン－ＨＲＰ Ｄ（ＤＡＢＭａｐキットの一部、Ventana Medical Systems）で行い、その後、製造者の指示に従って所定の希釈率で調製したＴｙｒａｍｉｄｅ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（Invitrogen）と共にインキュベーションした。

ＣＤ１１ｂ：次に、切片を抗ＣＤ１１ｂ（Abcam、クローンＥＰＲ１５４４）と共に５時間インキュベートし、その後ビオチン化ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Vector Laboratories）と共に１：２００希釈で６０分間インキュベートした。検出は、ストレプトアビジン－ＨＲＰ Ｄ（DABMapキットの一部、Ventana Medical Systems）で行い、その後、製造者の指示に従って所定の希釈率で調製したTyramide Alexa 594（Invitrogen）と共にインキュベーションした。

ＣＫ１９：次に、スライドを抗ＣＫ１９（Abcam、クローンEP1580Y）と共に５時間インキュベートし、その後、１：２００希釈したビオチン化ヤギ抗ウサギ（Vector Laboratories）と共に６０分間インキュベートした。検出は、ストレプトアビジン－ＨＲＰ Ｄ（DABMapキットの一部、Ventana Medical Systems）で行い、その後、製造者の指示に従って所定の希釈率で調製したTyramide Alexa Fluor 546（Invitrogen）と共にインキュベーションした。

Ｉｂａ１：最後に、切片を抗Ｉｂａ１（Wako、カタログ番号019-19741）で５時間インキュベートし、次に１：２００希釈したビオチン化ヤギ抗ウサギIgG（Vector Laboratories）で６０分間インキュベートした。検出は、ストレプトアビジン－ＨＲＰ Ｄ（DABMap kitの一部、Ventana Medical Systems）を用いて行い、その後、製造者の指示に従って所定の希釈率で調製したTyramide Alexa 647（Invitrogen）を用いてインキュベーションを行った。染色後、スライドをＤＡＰＩ（Sigma Aldrich）で１０分間カウンター染色し、Mowiolでカバースリップした。

ヒト
組織切片を、Leica Bond buffer（Leica Biosystems特製）で脱パラフィン化し、Leica Bond ER2 buffer（Leica Biosystems）で抗原賦活化を行った。まず、切片を抗ＰＤ－１抗体（Cell Marque, clone NAT105）と共に１時間インキュベートし、Bond Polymer Refine Detection kit（Leica Biosystems）およびTyramide Alexa Fluor 488（Invitrogen）を用いて検出を行った。次に、切片を抗ＣＤ３抗体（DAKO, カタログ番号A0452）で１時間インキュベートし、Bond Polymer Refine Detection kit (Leica Biosystems) およびTyramide CF594 (Biotum) で検出を行った。次に、切片を抗ＧＡＴＡ３抗体（Cell Marque, clone L50-823）と共に１時間インキュベートし、Bond Polymer Refine Detection kit（Leica Biosystems）およびCF 543（Biotum）で検出を行った。最後に、切片を抗ＣＤ４５抗体（DAKO, clone 2B11 + PD7/26）と共に１時間インキュベートし、Bond Polymer Refine Detection kit (Leica Biosystems) およびTyramide Alexa Fluor 647 (Invitrogen) で検出を行った。すべての検出は、製造元の指示に従い、所定の希釈率で調製した。染色後、スライドをＤＡＰＩ（Sigma Aldrich）で１０分間カウンター染色し、Mowiolでカバースリップした。

デジタル画像処理および解析
スライドはPanoramic Flash 250 (3Dhistech, Budapest Hungary) を用いて、Zeiss 20x/0.8NA 対物レンズおよびＡ４８８、Ａ５４６、Ａ５９４およびＡ６４７用のカスタムフィルターでデジタル化した。各コアをマルチチャンネルＴＩＦＦファイルにエクスポートし、ＦＩＪＩ／ＩｍａｇｅＪで書かれたカスタムマクロを用いて解析した。定量化のために、各核を適切な処理とバックグラウンド減算の後、ＤＡＰＩチャンネルを用いてセグメント化した。次に、各有核細胞について、他のマーカーの有無を、各マーカーに適切な閾値を設定した後に評価した。特定のマーカーの組み合わせを有する細胞の数を集計した。ＩＬＣ２は、ＣＤ４５^＋ ＣＤ３^－ ＧＡＴＡ３^＋有核細胞、ＰＤ－１発現ＩＬＣ２は、ＣＤ４５^＋ ＣＤ３^－ ＧＡＴＡ３^＋ＰＤ－１^＋有核細胞、ＰＤ－１発現Ｔ細胞は、ＣＤ４５^＋ ＣＤ３^＋ＰＤ－１^＋有核細胞と定義された。各患者について、全有核細胞の割合としての各細胞タイプの頻度をトリプリケートコアで計算し、次にトリプリケートコアの平均頻度を決定して、患者あたりの最終的な細胞頻度を計算した。

ＲＮＡ配列決定
マウス：同所性ＰＤＡＣマウス（ｎ＝６）の組織を採取し、上記のように単一細胞懸濁液中に分散させた。腫瘍浸潤白血球を、マウスCD45 MicroBeads (Miltenyi Biotec) を用いた磁気活性化細胞選別により陽性選択した。磁気活性化選別された細胞の精製を、フローサイトメトリーで確認し、９５％以上であった。RNeasy Plus Mini Kit（Qiagen）を用いて、選別した細胞からＲＮＡを分離した。ポリ（Ａ）捕捉およびペアエンド（paired-end）RNA-seqを、MSKCC Integrated Genomics Core Facilityによって実施した。具体的には、RiboGreen定量およびAgilent BioAnalyzerによる品質管理の後、５００ｎｇの全ＲＮＡを、Illuminaの指示書に従い、ポリＡ選択とTruSeqライブラリー調製（TruSeq Stranded mRNA LT Kit, カタログ番号 RS-122-2102）を行い、８サイクルのＰＣＲを実施した。サンプルをバーコード化し、HiSeq 3000/4000 SBS Kit（Illumina）を用いて、１００ｂｐ／１００ｂｐペアエンド泳動でHiSeq 4000で実行した。サンプルあたり平均８３００万のペアリードが生成された。リボソームリードは生成された全リードの最大０．０３％であり、ｍＲＮＡ塩基の割合は平均７６．６％であった。発現データセットをGene Set Enrichment Analysis (GSEA) 3.0にロードした。抗原提示およびＴ細胞媒介性免疫の遺伝子セットデータベースは、MSIGDB v6.1から選択し、探索的発見を促進するために偽発見率を０．２５以下に設定した。ＧＳＥＡは１０００回の順列で実行された。GO 0002474 Antigen Processing and Presentation of Peptide Antigen Via MHC Class I、GO 0002711 Positive Regulation of T Cell Mediated Immunity、GSE19825 Naive vs Day 3 Effector CD8 T Cell Upの３つの遺伝子セットデータベースがこの閾値を満たした。

単一細胞ＲＮＡ配列決定
単一細胞免疫プロファイリングのためのライブラリー調製、配列決定、生データの後処理を、Weill Cornell MedicineのEpigenomics Coreで行った。

単一細胞ＲＮＡライブラリーの調製および配列決定
ビークル、ＩＬ３３単独、ＩＬ３３^＋ ＰＤ－１処理膵臓ＫＰＣ腫瘍および腸間膜ＤＬＮからの蛍光活性化細胞（ＦＡＣ）選別したＩＬＣ２細胞の単一細胞懸濁液を上記のように調製した。scRNA-seqライブラリーを、10X Genomics仕様（Chromium Single Cell V(D)J User Guide PN-1000006, 10x Genomics, Pleasanton, CA, USA）に従って作製した。９０－２００細胞／μｌの濃度で４つの独立した細胞懸濁液（８５－９０％生存）を10x Genomics ChromiumプラットフォームにロードしてGel Beads-in-Emulsion (GEM) を生成し、サンプルあたり約２０００個の単一細胞を標的にした。ＧＥＭ生成後、サンプルをC1000 Touch Thermal cycler with 96-Deep Well Reaction Module (Bio-Rad, Hercules) で５３℃にて４５分間インキュベートし、細胞バーコードおよびUnique Molecular Identifiers (UMI) に結合したTemplate Switch Oligo (TSO) を添加して、５’末端でバーコード付きのポリＡ ｃＤＮＡを生成した。ＧＥＭを切断し、一本鎖ｃＤＮＡをDynaBeads MyOne Silane Beads (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) でクリーンアップした。ｃＤＮＡを１6サイクル（９８℃ ４５秒、９８℃ ２０秒、６７℃ ３０秒、７２℃ １時間）増幅させた。ｃＤＮＡの品質をAgilent Bioanalyzer 2100 (Santa Clara, CA)を用いて評価し、約１，２００ｂｐの生成物を得た。５０ｎｇのｃＤＮＡを酵素で断片化し、末端を修復してＡテイルとし、SPRIselect beads (Beckman Coulter, Indianapolis, IN) で両面サイズ選択（double-sided size selection）を行い、キットに含まれるアダプターにライゲーションした。キットに付属のインデックスを用いたＰＣＲ増幅を１４サイクル（９８℃ ４５秒、９８℃ ２０秒、５４℃ ３０秒、７２℃ ２０秒×１４サイクル、７２℃ １分、４℃保持）行い、各ライブラリーに固有のサンプルインデックスを導入した。インデックス付けされたライブラリーは、２回目の両面サイズ選択を行い、その後、Qubit蛍光定量法（Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA）を用いてライブラリーを定量化した。Agilent Bioanalyzer 2100で品質を評価し、４５０ｂｐの平均ライブラリーサイズを得た。検出限界以下の濃度の処理サンプルはなく、ｃＤＮＡ増幅を１８サイクル行い、サンプルインデックスを１６サイクル行った。ライブラリーを１０ｎＭに希釈し、ペアエンドリードフローセルのNovaSeq600を用いてクラスタリングし、Ｒ１（10xバーコードおよびUMI）を２８サイクル、Ｉ７ Ｉｎｄｅｘ（サンプルインデックス）を８サイクル、Ｒ２（転写物）を８９塩基で配列決定し、１サンプルあたり約１億クラスターを得た（ただし、ビークル処理マウスの腫瘍は約１千万クラスターであった）が、このうち、ビークル処理した腫瘍のクラスタリングは、１サンプルで１億クラスターを得た。シーケンス画像の一次処理を、イルミナのReal Time Analysisソフトウェア（RTA）を用いて行った。10x Genomics Cell Ranger Single Cell Software suite v3.0.2 (https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/what-is-cell-ranger) を用いて、サンプルデマルチプレックス、マウスゲノムリファレンスmm10へのアライメント、フィルタリング、UMIカウント、単一細胞５’末端遺伝子カウント、およびメーカーパラメーターを用いた品質管理を実施した。品質管理に合格した約１１，０００個の単一細胞から、細胞あたり平均約４１，０００リードのデータが得られた（配列飽和度４８％）。

ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑデータ処理
結合データセットのクラスターを同定するために、Seurat Rパッケージバージョン3.1パイプラインを用いた^３０。まず、個々のデータセットをカウントマトリックスとしてＲに読み込み、Seuratオブジェクトに変換し、３個以上の細胞で発現した遺伝子と、少なくとも２００個の遺伝子が検出された細胞について選択した。次に、標準的な前処理ワークフローを用いて、発現したユニークな遺伝子が２，５００以上または２００未満の細胞、およびミトコンドリア遺伝子含有量が５％以上の細胞を除外することに基づいて、細胞をフィルタリングした。

フィルタリング後、サンプルを統合し、保持された細胞の遺伝子発現測定値を対数変換し、細胞あたりの総発現量で正規化し、細胞あたり１０，０００分子でスケーリングした。次に、単一細胞全体で変動が大きい上位２，０００個の遺伝子を同定し、主成分（ＰＣ）分析を行った。ジャックストロープロットおよびエルボープロットを検討した後、クラスター分解能を０．４に設定したK-nearest neighbor (KNN) クラスタリングを用いて、上位１５個のＰＣを選択し、すべてのサンプル結合および腫瘍結合マージデータセットにおいて６－８クラスターを同定した。また、ＵＭＡＰを用いた非線形次元削減により、上位１５個のＰＣを用いてデータセットを可視化した。クラスター間の遺伝子マーカー探索のための遺伝子発現の差は、Seuratパッケージで使用されているWilcoxon順位和検定を用いて実行した。サンプル間の遺伝子発現を比較するために、Wilcoxon順位和検定を用いた一対比較（Pairwise comparison）をholm P値調整を用いて行った。

インビトロアッセイ
KPC 4662-GFP細胞を、９６ウェル平底プレート（Falcon）において、完全培地：１０％牛胎仔血清（Life Technologies）、１００単位／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、０、１０、１００および５００ｎｇ／ｍｌ濃度の組換えＩＬ３３を加えた、Ｌ－グルタミンを含むRPMI-1640（Gibco、ThermoFisher）中で１週間培養した。培養液およびサイトカインを４８時間ごとに補充した。生存率は、製造者の指示に従い、比色テトラゾリウム塩アッセイ（Cell Counting Kit, Dojindo Molecular Technologies）を用いて測定し、Synergy HT Multi-Detection Microplate Reader（Biotek）で読みとった。細胞を採取し、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ（ThermoFisher Scientific）、Ｋｉ－６７（クローンSolA15、ThermoFisher Scientific）およびＳＴ２（クローンRMST2、ThermoFisher Scientific）について染色した。すべてのインビトロ試験において、独立した試験ごとに２－３回の技術的複製を行った。

インビトロ樹状細胞移動アッセイ
マウス脾臓ＤＣを、製造元のプロトコールに従って、マウスパンＤＣ分離キット（Miltenyi Biotech）を用いて分離・濃縮した。ＤＣ純度の評価にはフローサイトメトリーを用いた（生細胞の７０％以上のＣＤ１１ｃ^＋）。細胞を、５０ｎｇ／ｍｌの組換えマウスＧＭ－ＣＳＦ（Biolegend）を加えた５ｘ１０^５細胞／ｍｌの完全ＲＰＭＩ培地で一晩播種した。次に、脾臓ＤＣの走化性をトランスウェル移動アッセイにより分析した。６００μｌのＲＰＭＩに１００ｎｇ／ｍｌの組換えマウスＣｃｌ５（Biolegend）を添加または無添加で、５．０－μｍ孔ポリカーボネート膜インサート（Sigma Aldrich）を有する６．５ｍｍ トランズウェルプレートの下部チャンバーに添加した。２００μｌのＲＰＭＩを上部チャンバーにも添加し、プレートを３７℃にて５％ ＣＯ_２で１５分間平衡化した。次いで、１００μｌのＲＰＭＩ中の１ｘ１０^５個の脾臓ＤＣを上部チャンバーに添加し、５％ＣＯ_２中３７℃にて２時間インキュベートした。インキュベーション後、膜インサートを慎重に取り出し、下部チャンバーから細胞を採取した。移動したＤＣをＤＡＰＩおよびＣＤ１１ｃ抗体と共に４℃にて２０分間インキュベートし、Precision Count Beads(商標）(Biolegend) を加えて、製造元のプロトコールに従ってフローサイトメトリーを用いて生細胞、移動した細胞、ＣＤ１１ｃ^＋細胞の数を定量化した。

統計処理
データは中央値で表示する。事前分析サンプルサイズを計算することなく、データ中に多くの統計的に有意な効果を認めたため、サンプルサイズを決定するための統計的手法は用いていない。２群間の比較を、複数時点の比較にBenjamini-Krieger-Yekutieli false discovery approachを用いた対応のないMann-Whitney検定で行った（2-tailed）。複数群間の比較を、１方向ＡＮＯＶＡ検定に続きKruskal Wallis多重比較後検定を用いて行った。複数の時点にわたる複数のグループ間の比較は、２方向ＡＮＯＶＡ検定を用いて行った。２変数間の相関を、線形回帰を用いて計算した。生存曲線は、両側log-rank検定により比較した。腫瘍の発生率を、カイ二乗検定で比較した。すべてのαレベルは０．０５であり、Ｐ＜０．０５は有意差とみなした。統計解析をPrism 7.0 (GraphPad Software)を用いて行った。

本実施例に示された情報は、本発明者らによって雑誌“Nature”に掲載された（Moral et al., “ILC2s amplify PD-1 blockade by activating tissue-specific cancer immunity,” Nature, 2020, Mar, Vol. 579(7797)、pp 130-135.doi: 10.1038/s41586-020-2015-4、Epub 2020 Feb 19参照）。補足資料を含む本出版物の内容全体は、引用により本明細書に包含させる。

実施例３
ＩＬ３３活性化ＩＬＣ２細胞療法を用いたマウスのＰＤＡＣの効果的な処置法
ＰＤＡＣのマウスモデルを用いて、ＩＬ３３活性化ＩＬＣ２細胞療法の有効性を評価するための試験を実施した。特記しない限り、マウス、ＰＤＡＣモデル、活性剤（ＩＬ３３、αＰＤ－１）およびプロトコールは、上記の実施例１および２に記載のとおりであった。ＩＬ３３を“ドナー”マウスに投与し、膵臓腫瘍ＩＬＣ２細胞を活性化させた。次に、ドナーマウスから膵臓腫瘍ＩＬＣ２細胞を分離し、精製し、ＰＤＡＣ腫瘍を確立した“レシピエント”ＩＬＣ２欠損マウスに投与した。また、一部のレシピエントマウスには、抗ＰＤ－１抗体も投与した。ドナーＩＬＣ２細胞のみを投与したレシピエントマウスでは、ＰＤＡＣ腫瘍に対する有意な効果は認められなかったが、ドナーＩＬＣ２細胞および抗ＰＤ－１抗体を投与したレシピエントマウスでは、ＰＤＡＣ腫瘍の大きさが有意に減少していることが確認された。

実施例４
ヒト臨床治験
臨床治験は、ＰＤＡＣの処置の安全性および／または有効性を実証するために行われる。臨床治験は、成人ヒト対象において、ＩＬ３３および／またはＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１阻害剤を用いたＰＤＡＣの処置の安全性および／または有効性を実証するために行われる。ＰＤＡＣ患者を特定し、登録する。患者を特定のグループに割り当てる。異なるグループには、以下のいずれかを投与する：（ａ）ＩＬ３３単独、（ｂ）承認されたＰＤ－１および／またはＰＤ－Ｌ１阻害剤単独、あるいは（ｃ）ＩＬ３３および承認されたＰＤ－１および／またはＰＤ－Ｌ１阻害剤のいずれかを受ける。各群内には、異なる薬剤（例えば、異なるＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１阻害剤）、異なる用量、および異なる投与スケジュール等が使用される複数の異なるサブグループが存在し得る。ＩＬ３３は静脈内投与（ＩＶ）される。いくつかのサブグループにおいて、ＩＬ３３はその天然形態であってもよい。いくつかのサブグループでは、ＩＬ３３は、１以上の半減期改善部位を含むことによって修飾されていてもよい。異なるサブグループは、異なる用量のＩＬ３３（可能な用量の範囲内）を受けてもよい。異なるサブグループは、異なる頻度（例えば、毎日、または２日、３日、４日、５日、６日もしくは７日毎）でＩＬ３３を受けることができる。承認されたＰＤ－１および／またはＰＤ－Ｌ１阻害剤は、承認された用量で、承認された投与スケジュールによって、および承認された投与経路によって（例えば、ある癌の処置について承認されているような基準に基づいて）投与される。

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Claims (40)

1. それを必要とする対象において膵管腺癌（ＰＤＡＣ）を処置する方法であって、ＰＤＡＣを有する対象に有効量のＩＬ３３を投与し、それによって該対象におけるＰＤＡＣを処置することを含む、方法。
2. それを必要とする対象において膵管腺癌（ＰＤＡＣ）を処置する方法であって、ＰＤＡＣを有する対象に有効量の（ａ）ＩＬ３３および（ｂ）ＰＤ－１および／またはＰＤ－Ｌ１阻害剤とを投与し、それによって該対象におけるＰＤＡＣを処置することを含む、方法。
3. それを必要とする対象において膵臓組織特異的抗腫瘍Ｔ細胞免疫を活性化する方法であって、ＰＤＡＣを有する対象に有効量のＩＬ３３を投与し、それによって該対象において膵臓組織特異的抗腫瘍Ｔ細胞免疫を活性化することを含む、方法。
4. それを必要とする対象において膵臓組織特異的抗腫瘍Ｔ細胞免疫を活性化する方法であって、ＰＤＡＣを有する対象に有効量の（ａ）ＩＬ３３および（ｂ）ＰＤ－１および／またはＰＤ－Ｌ１阻害剤とを投与し、それによって該対象の膵臓組織特異的抗腫瘍Ｔ細胞免疫を活性化することを含む、方法。
5. 膵臓ＩＬＣ２細胞を活性化する方法であって、膵臓ＩＬＣ２細胞を有効量のＩＬ３３と接触させ、それによって膵臓ＩＬＣ２細胞を活性化することを含む、方法。
6. 膵臓ＩＬＣ２細胞を活性化する方法であって、膵臓ＩＬＣ２細胞を有効量の（ａ）ＩＬ３３および（ｂ）ＰＤ－１および／またはＰＤ－Ｌ１阻害剤に接触させ、それによって膵臓ＩＬＣ２細胞を活性化させる、方法。
7. ＩＬＣ２細胞を、インビトロ／エクスビボでＩＬ３３、ＰＤ－１阻害剤またはＰＤ－Ｌ１阻害剤と接触させる、請求項５または６に記載の方法。
8. ＩＬＣ２細胞を、インビボでＩＬ３３、ＰＤ－１阻害剤またはＰＤ－Ｌ１阻害剤と接触させる、請求項５または６に記載の方法。
9. ＰＤＡＣ腫瘍および／または膵臓ＩＬＣ２細胞をＰＤ－１阻害剤および／またはＰＤ－Ｌ１阻害剤に対して感受性にする方法であって、ＰＤＡＣ腫瘍および／または膵臓ＩＬＣ２細胞を有効量のＩＬ３３と接触させ、それによってＰＤＡＣ腫瘍および／または膵臓ＩＬＣ２細胞をＰＤ－１阻害剤および／またはＰＤ－Ｌ１阻害剤に対して感受性にすることを含む、方法。
10. 対象がヒトである、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
11. 対象が非ヒト哺乳動物である、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
12. 対象がマウスである、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
13. 対象が、ＰＤ－１および／またはＰＤ－Ｌ１阻害剤処置に対して部分的または全体的に耐性を有するＰＤＡＣを有する、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
14. ＩＬ３３が組換えＩＬ３３である、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
15. ＩＬ３３がヒトＩＬ３３である、請求項１０に記載の方法。
16. ＩＬ３３が組換えヒトＩＬ３３である、請求項１０に記載の方法。
17. ＩＬ３３がマウスＩＬ３３である、請求項１２に記載の方法。
18. ＩＬ３３が組換えマウスＩＬ３３である、請求項１２に記載の方法。
19. ＰＤ－１阻害剤が抗体である、請求項２、４、６および９のいずれか一項に記載の方法。
20. ＰＤ－１阻害剤が、ペムブロリズマブ、ニボルマブ、セミプリマブ、ＡＭＰ－２２４、ＡＭＰ－５１４およびＰＤＲ００１からなる群より選択される、請求項２、４、６および９のいずれか一項に記載の方法。
21. ＰＤ－Ｌ１阻害剤が抗体である、請求項２、４、６および９のいずれか一項に記載の方法。
22. ＰＤ－Ｌ１阻害剤が、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、ＢＭＳ－９３６５５９およびＣＫ－３０１からなる群より選択される、請求項２、４、６および９のいずれか一項に記載の方法。
23. （ａ）ＩＬ３３および（ｂ）ＰＤ－１および／またはＰＤ－Ｌ１阻害剤を含む、医薬組成物。
24. ＰＤＡＣの処置に用いるための医薬組成物であって、（ａ）ＩＬ３３および（ｂ）ＰＤ－１および／またはＰＤ－Ｌ１阻害剤を含む、医薬組成物。
25. それを必要とする対象において膵管腺癌（ＰＤＡＣ）を処置する方法であって、（ａ）ＰＤＡＣを有するレシピエント対象に有効量の活性化ドナー膵臓ＩＬＣ２細胞を投与すること、ここで、ドナー膵臓ＩＬＣ２細胞がドナー対象から得られ、ＩＬ３３との接触によってエクスビボ／インビトロで活性化されており、かつドナー対象およびレシピエント対象が同種であり、それによってレシピエント対象におけるＰＤＡＣを処置することを含む、方法。
26. それを必要とする対象において膵管腺癌（ＰＤＡＣ）を処置する方法であって、（ａ）ドナー対象から得られたドナー膵臓ＩＬＣ２細胞をＩＬ３３とエクスビボ／インビトロで接触させて活性化ドナー膵臓ＩＬＣ２細胞を産生すること、および（ｂ）ドナー活性化膵臓ＩＬＣ２細胞を膵管腺癌（ＰＤＡＣ）を有するレシピエント対象に投与し、ここでドナー対象およびレシピエント対象が同種であり、それによりレシピエント対象におけるＰＤＡＣを処置することを含む、方法。
27. それを必要とする対象において膵管腺癌（ＰＤＡＣ）を処置する方法であって、（ａ）ドナー対象からドナー膵臓ＩＬＣ２細胞を得ること、（ｂ）ドナー膵臓ＩＬＣ２細胞をＩＬ３３とエクスビボ／インビトロで接触させて活性化ドナー膵臓ＩＬＣ２細胞を作製すること、（ｃ)膵管腺癌（ＰＤＡＣ）を有するレシピエント対象に活性化ドナー膵臓ＩＬＣ２細胞を投与し、ここでドナー対象およびレシピエント対象は同種であり、それによりレシピエント対象におけるＰＤＡＣを処置することを含む、方法。
28. 活性化されたドナー膵臓ＩＬＣ２細胞をレシピエント対象に投与する前に、ドナー膵臓ＩＬＣ２細胞および／または活性化ドナー膵臓ＩＬＣ２細胞をエクスビボ／インビトロで増殖させることをさらに含む、請求項２５から２７のいずれか一項に記載の方法。
29. ドナー対象およびレシピエント対象が同一人物である、請求項２５から２８のいずれか一項に記載の方法であって、当該方法が自己細胞療法である、方法。
30. ドナー対象およびレシピエント対象が同じＭＨＣ／ＨＬＡ型を有する、請求項２５から２８のいずれか一項に記載の方法。
31. （なし）
32. ドナー対象およびレシピエント対象がヒトである、請求項２５から３０のいずれか一項に記載の方法。
33. ドナー対象およびレシピエント対象が非ヒト哺乳動物である、請求項２５から３０のいずれか一項に記載の方法。
34. ドナー対象およびレシピエント対象がマウスである、請求項２５から３０のいずれか一項に記載の方法。
35. レシピエント対象が、ＰＤ－１および／またはＰＤ－Ｌ１阻害剤処置に対して部分的または全体的に耐性を有するＰＤＡＣを有する、請求項２５から３４のいずれか一項に記載の方法。
36. ＩＬ３３が組換えＩＬ３３である、請求項２５から３５のいずれか一項に記載の方法。
37. ドナー対象およびレシピエント対象がヒトであり、ＩＬ３３がヒトＩＬ３３である、請求項２５から３５のいずれか一項に記載の方法。
38. ドナー対象およびレシピエント対象がヒトであり、ＩＬ３３が組換えヒトＩＬ３３である、請求項２５から３５のいずれか一項に記載の方法。
39. ドナー対象およびレシピエント対象がマウスであり、ＩＬ３３がマウスＩＬ３３である、請求項２５から３５のいずれか一項に記載の方法。
40. ドナー対象およびレシピエント対象がマウスであり、ＩＬ３３が組換えマウスＩＬ３３である、請求項２５から３５のいずれか一項に記載の方法。

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