KR20220027226A - 췌장암 치료를 위한 방법 및 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 췌관 선암 (pancreatic ductal adenocarcinoma, PDAC)과 같은 췌장암의 치료에 유용한 다양한 조성물 및 방법, 및 췌장 조직-특이적 항-종양 T 세포 면역을 활성화하는 방법을 제공한다. 일부 구체예에서, 이러한 방법은 IL33의 투여를 포함한다. 일부 구체예에서, 이러한 방법은 PD-1 억제제 및/또는 PD-L1억제제의 투여를 포함한다.

Description

췌장암 치료를 위한 방법 및 조성물
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2019년 6월 30일에 출원된 미국 가특허 출원번호 제62/868,976호 및 2019년 11월 18일에 출원된 미국 가특허 출원번호 제62/937,219호의 우선권을 주장하며, 이들 각각의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 통합된다.
서열목록
본 출원에는 ASCII 형식으로 전자적으로 제출된 서열목록이 포함되어 있으며, 그 전체가 본원에 참조에 의해 통합된다. 2020년 6월 30일에 생성된 ASCII 사본의 파일명은 MSKCC_042_WO1_SL.txt이고 크기는 15,983 바이트이다.
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PD-1/PD-L1 및 CTLA-4 경로를 표적으로 하는 항체는 효과적인 암 면역요법제이다. 그러나, 대부분의 암은 본래 존재하는 항-종양 T 세포가 부족하고 반응하지 않는다. 췌관 선암 (pancreatic ductal adenocarcinoma, PDAC)은 면역요법에 가장 내성이고 치명적인 암 중 하나이다. 따라서 면역요법에 내성인 PDAC를 포함하여 PDAC의 새롭고 개선된 치료 방법이 시급하다. 본 발명은 이러한 필요를 충족시킨다.
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본 발명은, 부분적으로, 본 특허 명세서의 실시예 항목에서 보다 상세하게 설명된 일련의 중요한 발견에 기초한다. 간단히 요약하자면, 췌관 선암(PDAC)의 장기(long-term) 생존자의 독특한 코호트를 사용하여, 그룹 2 선천성 림프구 세포(group 2 innate lymphoid cell, ILC2), 및 ILC2-활성화인 리간드 인터루킨(IL)-33의 종양 발현이, 종양 면역 세포용해 활성(tumor immune cytolytic activity) 및 장기 환자 생존과 양의(positively) 상관관계가 있음을 발견하였다. PDAC 마우스 모델을 사용하여, IL33-ILC2 축(axis)이 췌장 조직-특이적 항-종양 T 세포 면역을 활성화한다는 것을 발견하였다. 놀랍게도, 재조합 IL33(rIL33)이 PDAC TILC2(tumor ILC2) 및 CD8+ T 세포를 활성화하여 연구에 사용된 마우스의 >70% 를 치료한다는 것을 발견하였다. 또한, 이중(dual) rIL33 치료 및 PD-1/PD-L1 경로 차단(αPD-1 사용)이 췌장 조직-특이적 ILC2를 상승적으로 확장하고 PD-1 부분 민감성 모델 및 PD-1 저항성 모델 모두에서 αPD-1의 항-종양 효능을 높이는 것을 밝혀내었다. 중요하게도, 극도로 공격적인 PD-1-내성 종양 모델에서, rIL33 또는 αPD-1 단독 치료는 효과가 제한적이었지만, rIL33과 αPD-1의 조합은 다른 모든 치료보다 현저하게 더 작은 종양을 초래하여, 종양 부피가 거의 40% 감소하고 생존이 50% 향상되었다. 이러한 발견들과 본원에 제시된 다른 발견들을 바탕으로, 본 발명은 췌장암의 치료를 위한 다양한 신규 및 개선된 조성물 및 방법을 제공한다.
예를 들어, 일 구체예에서 본 발명은 PDAC를 가진 개체에게 유효량의 IL33을 투여함으로써 개체에서 PDAC를 치료하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 개체에서 췌관 선암 (PDAC)을 치료하는 방법을 제공한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 PDAC를 가진 개체에게 유효량의 (a) IL33 및 (b) PD-1 억제제 및/또는 PD-L1 억제제를 투여함으로써 개체에서 PDAC를 치료하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 개체에서 췌관 선암 (PDAC)을 치료하는 방법을 제공한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 PDAC를 가진 개체에게 유효량의 IL33을 투여함으로써 개체에서 췌장 조직-특이적 항-종양 T 세포 면역을 활성화시키는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 개체에서 췌장 조직-특이적 항-종양 T 세포 면역을 활성화하는 방법을 제공한다. 이러한 구체예 중 일부에서, 췌장 조직-특이적 항-종양 T 세포 면역의 활성화는 췌장 ILC2 세포의 활성화/확장(activation/expansion) 및/또는 CD8+ T 세포의 활성화를 포함한다.
또 다른 구체예에서, PDAC를 가진 개체에게 유효량의 (a) IL33 및 (b) PD-1 억제제 및/또는 PD-L1 억제제를 투여함으로써 개체에서 췌장 조직-특이적 항-종양 T 세포 면역을 활성화시키는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 개체에서 췌장 조직-특이적 항-종양 T 세포 면역을 활성화하는 방법을 제공한다. 이러한 구체예 중 일부에서, 췌장 조직-특이적 항-종양 T 세포 면역의 활성화는 췌장 ILC2 세포의 활성화/확장 및/또는 CD8+ T 세포의 활성화를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 췌장 ILC2 세포를 유효량의 IL33과 접촉시켜 췌장 ILC2 세포를 활성화시키는 단계를 포함하는, 췌장 ILC2 세포를 활성화하는 방법을 제공한다.
또 다른 구체예에서, 췌장 ILC2 세포를 유효량의 (a) IL33 및 (b) PD-1 억제제 및/또는 PD-L1 억제제와 접촉시켜 췌장 ILC2 세포를 활성화시키는 단계를 포함하는, 췌장 ILC2 세포를 활성화하는 방법을 제공한다.
또 다른 구체예에서, PDAC 종양 및/또는 췌장 ILC2 세포를 유효량의 IL33과 접촉시켜 PDAC 종양 및/또는 췌장 ILC2 세포를 PD-1 억제제 및/또는 PD-L1 억제제에 대해 감작화시키는 단계를 포함하는, PDAC 종양 및/또는 췌장 ILC2 세포를 PD-1 억제제 및/또는 PD-L1 억제제에 감작화하는 방법을 제공한다.
일부 구체예에서, 본 발명은 (a) IL33 및 (b) PD-1 억제제 및/또는 PD-L1 억제제를 포함하는 조성물을 제공한다. 예를 들어, 일부 구체예에서 본 발명은 (a) IL33 및 (b) PD-1 억제제 및/또는 PD-L1 억제제를 포함하는, PDAC의 치료에 사용하기 위한 조성물을 제공한다.
일부 구체예에서, 상기 요약되거나 본원의 다른 곳에 기재된 방법은 또한, 개체의 종양 및/또는 췌장이 IL-33 수용체를 발현하는 ILC2 세포를 함유하는지 여부를 결정하는 예비 단계, 또는 ILC2 세포가 IL-33 수용체를 발현하는지 여부를 결정하는 예비 단계를 포함한다. 이러한 구체예 중 일부에서, IL33 및/또는 PD-1/PD-L1 억제제는, 개체의 종양 및/또는 췌장이 IL-33 수용체를 발현하는 ILC2 세포를 함유하는 경우에만 개체에게 투여된다. 유사하게, 일부 이러한 구체예에서, ILC2 세포가 IL-33 수용체를 발현하는 경우 ILC2 세포는 IL33 및/또는 PD-1/PD-L1 억제제와만 접촉된다.
일부 구체예에서, 본 발명은 다양한 세포 치료 방법들을 제공한다. 예를 들어, 일 구체예에서, 본 발명은 PDAC를 가진 수용자 개체에게 유효량의 활성화된 공여자 췌장 ILC2 세포를 투여함으로써 수용자 개체에서 PDAC 를 치료하는 단계를 포함하는, 필요로 하는 개체에서 췌관 선암(PDAC)을 치료하는 방법으로서, 상기 공여자 췌장 ILC2 세포는 공여자 개체로부터 얻어지고 IL33과의 접촉에 의해 생체외/시험관내(ex vivo/in vitro)에서 활성화되고, 상기 공여자 개체와 수용자 개체는 동일한 종의 개체인, 방법을 제공한다.
유사하게, 또 다른 구체예에서, 본 발명은 (a) 공여자 개체로부터 얻은 공여자 췌장 ILC2 세포를 생체외/시험관내에서 IL33과 접촉시켜 활성화된 공여자 췌장 ILC2 세포를 생성하는 단계, 및 (b) 활성화된 공여자 췌장 ILC2 세포를 췌관 선암(PDAC)을 가진 수용자 개체에 투여함으로써 수용자 개체에서 PDAC 를 치료하는 단계를 포함하는, 필요로 하는 개체에서 췌관 선암(PDAC)을 치료하는 방법으로서, 상기 공여자 개체와 수용자 개체는 동일한 종의 개체인, 방법을 제공한다.
유사하게, 또 다른 구체예에서, 본 발명은 (a) 공여자 개체로부터 공여자 췌장 ILC2 세포를 얻는 단계, (b) 공여자 췌장 ILC2 세포를 생체외/시험관내에서 IL33과 접촉시켜 활성화된 공여자 췌장 ILC2 세포를 생성하는 단계, 및 (c) 활성화된 공여자 췌장 ILC2 세포를 췌관 선암(PDAC)을 가진 수용자 개체에게 투여함으로써 수용자 개체에서 PDAC 를 치료하는 단계를 포함하는, 필요로 하는 개체에서 췌관 선암(PDAC)을 치료하는 방법으로서, 상기 공여자 개체와 수용자 개체는 동일한 종의 개체인, 방법을 제공한다.
일부 구체예에서, 상기 또는 본원의 다른 곳에서 기재된 세포 치료 방법은 또한, 활성화된 공여자 췌장 ILC2 세포를 수용자 개체에게 투여하기 전에, 생체외/시험관내에서 공여자 췌장 ILC2 세포 및/또는 활성화된 공여자 췌장 ILC2 세포를 확장하는 단계를 포함한다. 상기 또는 본원의 다른 곳에서 기술된 세포 치료 방법 중 일부에서, 수용자 개체에게 투여되는 공여자 췌장 ILC2 세포는 실질적으로 순수한 ILC2 세포 집단이다. 이러한 실질적으로 순수한 ILC2 세포 집단은, 하나 이상의 췌장 ILC2 마커(예를 들어, 본 특허 명세서의 실시예 항목에 기재된 마커)의 존재에 기초한 세포 분류와 같은, 임의의 적합한 세포 단리/정제 방법에 의해 수득될 수 있다. 상기 또는 본원의 다른 곳에서 기술된 세포 치료 방법 중 일부에서, 공여자 개체와 수용자 개체는 동일한 개체이므로, 상기 방법은 자가 세포 치료(autologous cell therapy) 방법이다. 유사하게, 상기 또는 본원의 다른 곳에서 기술된 세포 치료 방법 중 일부에서, 공여자 개체와 수용자 개체는 동일한 MHC/HLA 유형을 갖는다.
상기 요약되거나 본원의 다른 곳에서 설명된 구체예 중 일부에서, 개체(세포 치료 방법의 경우 공여자 개체 및/또는 수용자 개체 포함)는 인간이다. 상기 요약되거나 본원의 다른 곳에서 설명된 구체예 중 일부에서, 개체(세포 치료 방법의 경우 공여자 개체 및/또는 수용자 개체 포함)는 인간이 아닌(non-human) 포유동물이다. 상기 요약되거나 본원의 다른 곳에서 설명된 구체예 중 일부에서, 개체(세포 치료 방법의 경우 공여자 개체 및/또는 수용자 개체 포함)는 마우스이다. 위에 요약되거나 본원의 다른 곳에서 설명된 구체예 중 일부에서, 개체(세포 치료 방법의 경우 공여자 개체 및/또는 수용자 개체 포함)는 PD-1 억제제 및/또는 PD-L1 억제제 치료에 대해 부분적으로 또는 전체적으로 내성인 PDAC를 갖는다.
상기 요약되거나 본원의 다른 곳에서 설명된 일부 구체예에서, IL33은 재조합 IL33이다. 상기 요약되거나 본원의 다른 곳에 기술된 일부 구체예에서, IL33은 인간 IL33이다. 상기 요약되거나 본원의 다른 곳에서 설명된 구체예 중 일부에서, IL33은 재조합 인간 IL33이다. 상기 요약되거나 본원의 다른 곳에서 설명된 구체예 중 일부에서, IL33은 마우스 IL33이다. 상기 요약되거나 본원의 다른 곳에서 설명된 구체예 중 일부에서, IL33은 재조합 마우스 IL33이다.
PD-1 억제제와 관련하여 상기 요약되거나 본원의 다른 곳에서 설명된 구체예에서, 이러한 구체예 중 일부에서 PD-1 억제제는 항체이다. 상기 요약되거나 본원의 다른 곳에 기재된 일부 구체예에서, PD-1 억제제는 펨브롤리주맙(pembrolizumab), 니볼루맙(nivolumab), 세미플리맙(cemiplimab), AMP-224, AMP-514 및 PDR001로 이루어진 군으로부터 선택된다.
PD-L1 억제제와 관련하여 상기 요약되거나 본원의 다른 곳에서 설명된 일부 구체예에서, 이러한 구체예의 일부에서 PD-L1 억제제는 항체이다. 일부 구체예에서 PD-L1 억제제는 아테졸리주맙(atezolizumab), 아벨루맙(avelumab), 더발루맙(durvalumab), BMS-936559 및 CK-301로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 이들 및 다른 측면은 본 특허 출원의 상세한 설명, 도면 및 실시예 항목에서 추가로 설명된다. 또한, 당업자는 이 특허 개시 전체에 걸쳐 설명된 본 발명의 다양한 구체예가 다양한 상이한 방식으로 조합될 수 있고 그러한 조합이 본 발명의 범위 내에 있음을 인식할 것이다.
도 1a-f: IL33-의존성 ILC2는 인간 및 쥐 췌장암에 침투한다. (도 1a) 선택되지 않은 인간 PDAC 환자에서 ILC의 게이팅, 빈도 및 표현형. (도 1b) 단기 및 장기 PDAC 생존자의 종양 조직 마이크로어레이에서 ILC2의 빈도(위) 및 생존 연관성(아래). (도 1c) 단기 및 장기 PDAC 생존자에서, 벌크 종양 IL33 mRNA의 생존과의 연관성 및 종양 세포용해 지수(tumor cytolytic index, CYT)와의 상관관계 (도 1d) PDAC 마우스에서 ILC의 게이팅 및 빈도. (도 1e) aCD90.2 항체 또는 이소타입(Iso) 항체로 처리된 Rag2 -/- PDAC 마우스의 종양내 ILC 빈도 및 수. (도 1f) Il33 +/+ 및 Il33 -/- PDAC 마우스의 게이팅, 빈도 및 ILC 수. 도 1b, 도 1c 에서 High 및 low 는 각각 코호트의 중앙값보다 높거나 낮은 것으로 정의된다. 데이터는 종양 이식 후 14에 수집되었다(도 1d-f). n, 개별 환자 또는 마우스의 종양 수. 수평 막대는 중앙값을 표시한다. 도 1d-f의 데이터는 n≥3/그룹으로 ≥2개의 독립적인 실험에서 수집되었다. 각 점은 개별적으로 분석된 하나의 마우스를 나타낸다. P 값은 Tukey's 검정 (도 1a) 및 Kruskal-Wallis 다중 비교 사후 검정(도 1d) 을 사용한 일원분산분석(one-way ANOVA), 양측 Mann-Whitney 검정 (b, e, f), 양측 로그-순위 (도 1b, c 생존 곡선), 및 선형 회귀(도 1c) 에 의해 결정하였다.
도 2a-g: IL33-ILC2 축은 조직-특이적 암 면역을 활성화한다. Il33 +/+ 및 Il33 -/- 동소위(orthotopic) (도 2a) 또는 피하 (도 2b) PDAC 마우스의 종양 무게, 부피 및 생존. (도 2c) 동소위(orthotopic) Il33 +/+ 및 Il33 -/- 종양에서 모든 CD8 + T 세포 (좌) 및 IFN-γ 생산(우) CD8 + T 세포의 빈도. (도 2d) T 세포-고갈된 Il33 +/+ 및 Il33 -/- 동소위 PDAC 마우스의 종양 무게. (도 2e) Il33 +/+ 및 Il33 -/- 동소위 및 피하 KPC-OVA PDAC 마우스에서 종양 거부 빈도 및 종양 무게. (도 2f) ILC2가 온전하거나 고갈된 iCOS-T 마우스에서 KPC-OVA PDAC 종양의 실험 설계(좌), 종양 거부 빈도(중간) 및 종양 무게(우). (도 2g) ILC2가 온전하거나 고갈된 동소위 KPC-OVA PDAC iCOS-T 마우스의 림프절 배수에서 OVA-특이적 CD8 + T 세포의 빈도. 데이터는 이식 후 14일(도 2a, c, d), 28일(도 2b), 42일(도 2e) 및 8일(도 2f, g)에 수집되었다. 수평 막대는 중앙값을 표시하고 오차 막대는 s.e.m을 표시한다. 데이터는 n≥4/그룹으로 ≥2개의 독립적인 실험에서 풀링되었다; n 및 데이터 점은 개별적으로 분석된 개별 마우스를 나타낸다. P 값은 양측 Mann-Whitney 검정 (도 2a-g), 양측 로그-순위 검정 (도 2a, b, 생존 곡선), Sidak의 다중 비교 검정을 사용한 양방향 ANOVA (도 2a, b, 종양 부피), 및 카이-제곱 검정(도 2e, f, % 거부)에 의해 결정하였다.
도 3a-h: ILC2는 종양내 수지상 세포를 모집함으로써 조직-특이적 암 면역을 자극한다. (도 3a) 비히클 또는 재조합 IL33(rIL33)으로 처리된 동소위 및 피하 PDAC 마우스의 종양 무게, 부피 및 생존. (도 3b) 비히클 또는 재조합 IL18(rIL18)로 처리된 동소위 및 피하 PDAC 마우스의 종양 무게 및 부피. (도 3c) rIL33-처리 동소위 PDAC 마우스에서 ILC2의 게이팅, 빈도 및 수(DLN 비히클, n=13, 종양 비히클, n=12). (도 3d) rIL33-처리된 동소위 PDAC 마우스의 종양에서 CD103+ 수지상 세포(DC)의 게이팅 및 빈도. (도 3e) rIL33-처리된 야생형(WT) 및 ILC2-결핍 동소위 PDAC 마우스의 종양에서 CD103+ DC의 종양 무게, 부피 및 (도 3f) 빈도. (도 3g) rIL33-처리된 WT 및 CD103+ DC 결핍 Batf3-/- 동소위 PDAC 마우스의 종양 부피. (도 3h) Ccl5로의 정제된 DC의 이동. 데이터는 종양 이식 후 5주 (도 3c, d) 및 7주 (도 3e, f)에 수집되었다. 수평 막대는 중앙값을 표시한다; 오차 막대는 s.e.m을 표시한다. 데이터는 n≥3/그룹으로 ≥2개의 독립적인 실험에서 풀링되었다; n 및 데이터 점은 개별적으로 분석된 개별 마우스 또는 (도 3h) 개별 반복실험을 나타낸다. P 값은 양측 로그-순위 검정 (도 3a, 생존 곡선), 양방향 ANOVA (도 3a, b, e, g, 종양 부피), 및 양측 Mann-Whitney 검정(도 3a-f, h)에 의해 결정하였다.
도 4a-i: PD-1 차단은 TILC2를 활성화한다. 상위 15개 주성분의 비선형 표현(nonlinear representation)에서 처리된 PDAC 마우스에서의 (도 4a) 종양 부피 및 생존, (도 4b) 게이팅, 빈도 및 수 및 (도 4c) scRNA-seq(n=7,022 ILC2 단일-세포). 세포는 클러스터(좌) 또는 치료 및 조직(우)에 따라 색상이 지정된다. (도 4a, b)에서, 좌, 우 그래프에서 각각 n=n. (도 4d) αPD-1 + rIL33으로 처리된 야생형(WT) 또는 ILC2-결핍 PDAC 마우스의 종양 부피. (도 4e) TILC2를 rIL33-처리된 WT 또는 Pdcd1 -/- PDAC 마우스에서 분류 정제하고, ILC2-결핍 PDAC 수용자로 옮기고, 종양 부피를 측정하였다. (도 4f-h) TILC2는 rIL33-처리된 PDAC CD45.1 공여자 마우스에서 분류 정제하고, ILC2-결핍 CD45.2 PDAC 수용자 마우스로 옮기고, 세포 전달 후 αPD-1 처리하였다. 세포 전달 후 10주째 수용자 마우스에서 종양 부피 및 종양 무게(도 4f), CD45.1 및 CD45.2 세포의 빈도(도 4g), T 세포의 빈도 (도 4)(TILC2s-: 모든 그룹, n=8, TILC2+: 비장, n=9, DLN, n=7, 종양, n=7). 도 4g에서 빈도 = 살아있는 공여자- 또는 수용자-유래 면역 세포의 백분율. (도 4i) 처리된 PDAC 마우스(KPC 52 세포)의 종양 부피(비히클, n=13; 기타 그룹, n=10) 및 생존(비히클 및 αPD-1, n=15; rIL33, n=24; rIL33 + αPD-1, n= 26). DLN, 배수 림프절(draining lymph node). 데이터는 동소위 종양 세포 이식 후 5주 (도 4b), 10일 (도 4c) 및 6주 (도 4d)에 수집되었다. 수평 막대는 중앙값을 표시하고 오차 막대는 s.e.m을 표시한다. 데이터는 n≥3/그룹으로 ≥2개의 독립적인 실험에서 풀링되었다. n 및 데이터 점은 개별적으로 분석된 개별 마우스를 나타낸다. scRNA-seq에 대한 데이터는 생물학적 복제물(비히클 n=10, rIL33 n=5, αPD-1 + rIL33 n=5)에서 풀링된 정제된 단일-세포를 나타낸다. P 값은 Tukey의 다중 비교 포스트을 사용한 양방향 ANOVA (도 4a, df, i, 종양 부피), 양측 Mann-Whitney (도 4b, d, g, h), 및 양측 로그-순위 (도 4a, i, 생존 곡선) 검정에 의해 결정하였다.
도 5a-h: 췌장암에서 IL33-의존성 ILC의 확인. (도 5a) 인간 ILC를 식별하기 위한 게이팅 전략. 첫 번째 플롯은 살아있는 (DRAQ7-) 세포 및 단일-세포(singlet)에 사전 게이트되었다. 리니지(Lin) 1 칵테일: CD5, CD11b, CD11c, CD16, FcεR1. Lin 2 칵테일: CD3, CD19, TCRα/β. ILC는 Lin- CD56- CD25+ CD127+ 세포로 확인되었다. FMO, 형광 마이너스 원(fluorescence minus one). (도 5b) 단기 및 장기 PDAC 생존자(n=96)의 종양 조직 마이크로어레이에서 ILC2의 면역형광의 대표적인 이미지. 화살표, 추정 ILC2. (도 5c) 위 그림, ILC-자극 사이토카인의 종양내 mRNA 수준 중앙값보다 크거나(high) 또는 작은 (low) 환자의 전체 생존율. 아래 그림, 인간 PDAC의 장기 및 단기 생존자에서 ILC-활성화 사이토카인의 발현과 면역 세포용해 지수(CYT) 간의 상관관계. 곡선은 선형 회귀에 의해 피팅되었다. n=25. (도 5d) 뮤린 ILC를 식별하기 위한 게이팅 전략. 첫 번째 플롯은 살아있는 (DRAQ7-) 세포 및 단일-세포(singlet)에 사전 게이트되었다. 리니지(Lin) 1 칵테일: CD5, CD11b, CD11c, FcεR1. Lin 2 칵테일: CD3, CD19. ILC는 Lin- NK1.1- CD25+ CD127+ 세포로, ILC2는 Lin- NK1.1- CD25+ St2+ 세포로 확인되었다. 동소위 PDAC 마우스의 게이팅을 표시하였다. (도 5e) KPC 세포주 8-1, 18-3으로 확립된 동소위 PDAC 마우스에서 및 자발적 PDAC를 가진 자생적(autochthonous) KPC 마우스(KPCSpont)에서 종양내 ILC 빈도. 비교를 위해 도 1d 및 기타의 복합 ILC 빈도가 포함된다(KPC 4662). (도 5f) PDAC 마우스에서 ILC의 표현형. 회색 곡선은 이소타입 대조군; 숫자는 형광 강도를 말한다. (도 5g) PDAC 마우스 조직에서 ILC의 확장 동역학. (도 5h) αCD90.2 또는 이소타입 항체로 처리된 Rag2 -/- PDAC 마우스에서 비-ILC 세포 빈도의 변화. 데이터는 종양 이식 후 14일(도 5d-f), 10일(도 5h) 또는 표시된 시점에서 분석되었다. n은 n≥2/그룹으로 2 이상의 독립적인 실험에서 개별적으로 분석된 개별 마우스를 나타낸다. 수평 막대는 중앙값을 표시하고 오차 막대는 s.e.m을 표시한다. P 값은 양측 로그-순위(도 5c, 위), 선형 회귀(도 5c, 아래), 또는 양측 Mann-Whitney 검정(도 5g)에 의해 결정하였다. 도 5g의 P 값은 다른 모든 장기에 대한 종양 비교를 나타낸다.
도 6a-o: 숙주-유래 IL33은 췌장 ILC2를 활성화한다. (도 6a) 동소위 PDAC 종양(좌)에서 및 KPC 마우스의 자생적(autochthonous) PDAC 종양(우)에서 이전에 공개된 mRNA 마이크로어레이11 로부터의 ILC1- (IL12, IL15, IL18), ILC2- (IL25, IL33, TSLP), 및 ILC3-유도 사이토카인(IL23) 및 IL33 수용체(ST2)의 mRNA 발현 (도 6b) IL33Low 및 IL33High 인간(조직 마이크로어레이, n=96) 및 마우스 PDAC(n=3/그룹)의 대표적인 IL33 면역조직화학(IHC). (도 6c) 인간 PDAC 종양 마이크로어레이에서 IHC에 의해 IL33 양성을 나타내는 인간 PDAC 환자의 빈도. (도 6d) 마우스 PDAC 에서 IL33, 관 마커 CK19, 골수 마커 CD11b 및 Iba에 대한 다중 면역형광(위). 화살표는 IL33-발현 세포를 나타냄. IL33은 IL33Cit 리포터 PDAC 마우스의 종양에서 비-면역(CD45-), 면역(CD45+), 대식세포(TAM), 단핵구 및 과립구 골수-유래 억제 세포(M-MDSC 및 G-MDSC) 집단에서의 형광 강도(MFI)를 말한다 (아래). (도 6e) Il33 +/+ (WT) 마우스의 동소위 PDAC 종양에서 및 Il33 -/- 마우스의 비-종양-함유 췌장(n=3/그룹) 에서 IHC에 의한 대표적인 IL33 단백질 발현 (도 6f) Il33 +/+ 및 Il33 -/- 동소위 PDAC 마우스의 장기 및 배수 림프절(DLN)에서의 ILC 빈도(위) 및 세포 수(아래). (도 6g) Il33 +/+ 및 Il33 -/- 동소위 PDAC 마우스의 종양내 ILC에서 IL4 및 IL5 발현의 게이팅 및 빈도. 재조합 IL33(rIL33)을 처리하거나 처리하지 않은 동소위 Rag2 -/- 및 Rag2 -/- γ c -/- PDAC 마우스에서의 (도 6h) ILC2 및 (도 6i) 면역 세포 빈도. (도 6j) 피하(SQ) 및 동소위 PDAC를 가진 마우스에서 ST2+ 종양 ILC의 빈도. (k) 동소위 및 피하 PDAC 마우스의 종양. (도 6l) Il33 +/+ 및 Il33 -/- 리터메이트 PDAC 마우스의 종양 무게. (도 6m) 종양 조절에 대한 조혈 세포-유래 IL33의 기여도를 평가하기 위한 골수 키메라의 실험적 도식. CD45.2 Il33 +/+ 또는 CD45.2 Il33 -/- 골수로 재구성된, 조사된(irradiated) CD45.1 콘제닉(congenic) 마우스에서의 (도 6n) 조혈 세포 재구성 및 (도 6o) 종양 무게. 데이터는 종양 이식 후 14일(도 6a, d, f, g, j, o) 및 10일(도 6h, i)에 수집되었다. 수평 막대는 중앙값을 표시한다. n은 n≥2/그룹으로 2개 이상의 독립적인 실험에서 개별적으로 분석된 개별 마우스를 나타낸다. P 값은 일원 ANOVA (도 6a) 또는 양측 Mann-Whitney 검정(도 6d, f-h, j, l, o)에 의해 결정하였다.
도 7a-e: 숙주-유래 IL33은 췌장 T 세포 면역을 활성화한다. (도 7a) Il33 +/+ 및 Il33 -/- PDAC 마우스로부터 정제된 CD45+ 면역 세포로부터의 벌크 RNA-seq의 유전자 세트 농축 분석. 농축 플롯 및 농축 점수는 Il33 -/- 에서 Il33 +/+ 에서의 발현을 비교하는 3개의 유전자 세트에 대해 표시된다(n=3 마우스/그룹). FDR은 위발견율(false discovery rate)을 나타냄. Il33 +/+ 및 Il33 -/- 동소위 PDAC 마우스에서 (도 7b) CD8+ T 세포의 게이팅 및 (도 7c) 다양한 면역 세포 유형(좌) 및 CD4+ T 세포 계통(우)의 빈도(도 7c). (도 7d) Il33 +/+ 및 Il33 -/- 동소위 PDAC 마우스에서 종양 배수 림프절 및 비-종양 배수 원격 림프 기관(서혜부 림프절 및 비장)에서 T 중심 기억(Tcm) 세포(CD45+CD3+CD8+CD44+CD62L+)의 빈도. (도 7e) 피하 PDAC 종양에서 CD8+ T 세포의 빈도. DC, 수지상 세포; MDSC, 골수-유래 억제 세포; NK, 자연 살해 세포; NKT, 자연 살해 T 세포; Treg, 조절 T 세포. 데이터는 종양 이식 14일 후 또는 표시된 시점에서 분석되었다. 수평 막대는 중앙값을 표시하고 오차 막대는 s.e.m을 표시한다. n은 n≥2/그룹으로 2개 이상의 독립적인 실험에서 개별적으로 분석된 개별 마우스를 나타낸다. P 값은 일원 ANOVA에 의해 결정된다 (도 7d).
도 8a-g: IL33 및 ILC는 종양 세포 사멸을 직접 유도하지 않는다. (도 8a) 비히클 또는 재조합 뮤린 IL33(rIL33)으로 처리된 Rag2 -/- 및 Rag2 -/- γc -/- PDAC 마우스의 종양 무게. (도 8b) Il33 +/+ 및 Il33 -/- PDAC 마우스(우)에서 조직학적 종양 세포 분화 상태가 있는 대표적인 헤마톡실린 및 에오신 염색 항목(좌). (도 8c) Il33 +/+ 및 Il33 -/- PDAC 마우스(n=3/그룹)의 종양에서 트리크롬 염색(Trichrome staining). (도 8d) Il33 +/+ 및 Il33 -/- PDAC 마우스(n=3/그룹)의 종양에서 평활근 액틴에 대한 면역조직화학. (도 8e) Il33 +/+ 및 Il33 -/- 동소위 PDAC 마우스에서 KPC 세포에 대한 종양내 ST2 발현. (도 8f) 시험관내 rIL33 처리 후 살아있는 KPC 세포에서의 ST2 발현 (DRAQ7은 죽은 세포를 염색함)(n=3/그룹). (도 8g) 시험관내 rIL33 처리 후 KPC 세포 수, 생존력, 증식(Ki-67) 및 세포자멸사(아넥신)(n=6/그룹). 수평 막대는 중앙값을 표시한다. 도 8a-e의 n은 n≥3/그룹으로 2회 이상의 독립적인 실험에서 개별적으로 분석된 개별 마우스를 나타낸다. 도 8f, g의 n은 기술적 반복실험을 나타내며 2회 이상의 독립적인 실험을 나타낸다. P 값은 양측 Mann-Whitney 테스트에 의해 결정하였다 (도 8a).
도 9a-d: ILC2는 항원-특이적 CD8+ T 세포 프라이밍을 유도한다. (도 9a) ILC-온전한 마우스(디프테리아 독소[DT]-처리된 Icos +/+ ; CD4 Cre/+ ) 및 ILC-고갈된 마우스(DT-처리된 Icosfl. DTR/+ ; CD4 Cre/+ )에서 종양내 ILC2의 게이팅 및 빈도. (도 9b) ILC-온전한 마우스와 ILC-고갈된 마우스의 비장에서 OVA-특이적 CD8+ T 세포의 게이팅 및 빈도. OVA-특이적 T 세포는 SIINFEKL(서열번호 15)-테트라머+ 세포로서 검출되었다. (도 9c) ILC-온전한 및 ILC-고갈된 마우스의 종양 배수 림프절 및 비장에서 중앙 기억 CD8+ T(TCM) 세포(CD45+CD3+CD8+ CD44+CD62L+)의 게이팅 및 빈도. (도 9d) PDAC 마우스에서 종양 이식 후 CD45+CD3+CD8+ T 세포에서 ST2 발현. 데이터는 종양 이식 후 14일째 또는 표시된 시점에서 수집되었다. DLN, 배수 림프절; MFI, 평균 형광 강도. 수평 막대는 중앙값을 표시한다; 오차 막대는 s.e.m을 표시한다. n은 n≥2/그룹으로 2개 이상의 독립적인 실험에서 개별적으로 분석된 개별 마우스를 나타낸다. P 값은 양측 Mann-Whitney 검정 (도 9a-c) 및 Tukey의 다중 비교 사후 검정을 사용한 양방향 ANOVA에 의해 결정하였다 (도 9d, 다른 모든 그룹에 대한 종양 ILC의 비교를 나타냄).
도 10a-i: rIL33-처리 PDAC 마우스의 면역표현형. (도 10a) 비히클(veh) 및 rIL33 처리된 마우스에서 동소위 및 피하 KPC-OVA PDAC 종양의 종양 확립 %. (도 10b) 피하(SQ) 및 동소위 PDAC 마우스에서 종양 ILC에 대한 IL18R1 발현의 게이팅(좌) 및 빈도(우). (도 10c) 동소위 PDAC 마우스에서 rIL33 처리 후 비장 ILC2의 게이팅(좌) 및 빈도(우). (도 10d) 피하 PDAC 마우스에서 rIL33 처리 후 종양 ILC2의 게이팅(좌) 및 빈도(우). (도 10e) 동소위 PDAC 마우스에서 rIL33 처리 후 종양 CD8+ T 세포에서 사이토카인 및 PD-1 발현의 게이팅(좌) 및 빈도(우). (도 10f) 비히클- 및 rIL33-처리된 동소위 PDAC 마우스에서 면역 세포의 빈도. (도 10g) CD103+ 수지상 세포 식별을 위한 게이팅 전략. (도 10h) rIL33 처리 후 야생형(WT) 또는 Rora fl/fl IL7r Cre 마우스(ILC2-결핍) PDAC 마우스의 종양 및 배수 림프절(DLN)에서 ILC2의 게이팅(좌, 종양) 및 빈도(우). (도 10i) rIL33-처리된 WT 및 Batf3 -/- 마우스의 종양에서 PD-1+ CD8+ T 세포의 게이팅(좌) 및 빈도(우). 데이터는 종양 이식 후 6주 (도 10a), 5주 (도 10b) 및 3주 (도 10i)에 수집되었다. 수평 막대는 중앙값을 표시한다. n은 n≥2/그룹으로 2 이상의 독립적인 실험에서 개별적으로 분석된 개별 마우스를 나타낸다. P 값은 양측 Mann-Whitney 검정에 의해 결정하였다 (도 10a, f, i).
도 11a-c: PDAC 마우스에서 종양 및 배수 림프절 ILC2의 단일-세포 RNA 시퀀싱. (도 11a) ILC2의 생체내 처리, 정제 및 단일-세포 분석을 위한 실험 설계. (도 11b, c) 품질 메트릭. (도 11b) 각 세포에 대해 고유한 분자 식별자의 수(UMI의 #)와 유전자의 수(유전자의 #) 사이의 관계를 보여주는 산포도. (도 11c) 각 처리군(열) 및 각 조직(행)에서 유전자의 수(좌), UMI의 수(중간), 및 미토콘드리아 유전자의 정규화된 리드의 백분율(우) 분포를 보여주는 바이올린 플롯. 각 점은 단일-세포를 나타낸다. 각 처리 그룹 및 기관에 대해, 데이터는 n=10 (비히클), n=5 (rIL33) 및 n=5 (αPD-1 + rIL33) PDAC 마우스의 생물학적 반복수(biological replicates)에서 풀링된 정제된 단일-세포를 나타낸다.
도 12a-f: 종양 및 배수 림프절에서 활성화된 ILC2는 뚜렷한 전사 특징을 가지고 있다. (도 12a) 1,634개의 rIL33 활성화 종양 및 배수 림프절(DLN) ILC2의 단일-세포 분석 (도 11a에 설명된 실험 설계). UMAP 플롯은 상위 15개 주성분의 비선형 표현으로 단일-세포(점)를 보여준다. (도 12a) ILC2(Gata3, Id2, Rora) 및 ILC3(gene, Rorc; protein, Rorγt) 전사인자(TF)의 발현, (도 12b) ILC2 표면 마커의 발현, 및 (도 12c) 클러스터 및 기관의 발현. ILC-1 TF Tbx21 (T-bet)의 발현은 검출할 수 없었다. (도 12d, e) (도 12d) 클러스터 및 (도 12e) 기관 (TILC2s 및 DLN ILC2s)에 의해 차등적으로 발현된 유전자. (도 12f) 종양 및 DLN에서 ILC2로부터의 Ccl5 발현 분포; 바이올린 플롯은 최소값, 최대값, 및 중앙값을 나타내는 원이 있는 분포를 보여준다. 도 12a 및 도 12b의 각 점은 단일-세포를 나타낸다. 각 처리 그룹 및 기관에 대해, 데이터는 n=5 rIL33-처리된 PDAC 마우스의 생물학적 반복수에서 풀링된 정제된 단일-세포를 나타낸다. P 값은 양측 쌍별 Wilcoxon 순위 합 검정에 의하였다.
도 13a-i: 조합된 αPD-1 및 rIL33 처리는 종양 ILC2에서 독특한 전사 프로파일을 유도한다. (도 13a) 단일-세포 RNA 시퀀싱(scRNA-seq)에 의한 비히클-처리 PDAC 마우스의 종양 ILC2에서의 공동억제 면역 체크포인트의 발현. (도 13b) 비히클- 및 rIL33-처리된 PDAC 마우스에서 PD-1+ ILC2의 게이팅 및 빈도. DLN, 배수 림프절. (도 13c) 처리된 PDAC 마우스에서 ILC2 빈도. 해당 종양 부피, 무게, 세포 수 및 scRNA-seq는 도 4a-c에 나타내었다. (도 13d) 처리된 PDAC 마우스로부터의 ILC2의 scRNA-seq. 정제된 종양 및 배수 림프절(DLN) ILC2에서 ILC 1(유전자, Tbx21; 단백질, Tbet), ILC2 (Gata3, Id2, Rora) 및 ILC3(유전자, Rorc; 단백질, Rorγt) 전사 인자(TF)의 발현. 클러스터 및 처리에 따른 해당 UMAP 플롯은 도 4c에 나타내었다. 치료 및 조직에 의한 상위 차등 발현 유전자(도 13e), 클러스터(도 13f), 및 치료 및 조직에 의한 선별된 차등 발현된 유전자에 대한 발현 분포(도 13g)(종양: 비히클 n=28, rIL33 n= 752, rIL33 + PD-1 n=2,635; DLN rIL33 n=882, rIL33 + PD-1 n=2,725). (도 13h) 상위 15개 주성분의 비선형 표현에서 3,387개의 단일 종양 ILC2의 UMAP 플롯. (도 13i) 치료에 의해 종양 ILC2에서 차등 발현된 유전자. 도 13d 및 도 13h의 각 점은 단일-세포를 나타내고; 각 처리 그룹 및 기관에 대해 데이터는 n=10 (비히클), n=5 (rIL33) 및 n=5 (αPD-1 + rIL33) PDAC 마우스의 생물학적 복제수에서 풀링된 정제된 단일-세포를 나타낸다. 바이올린 플롯은 최소값, 최대값, 및 중앙값을 나타내는 원이 있는 분포를 보여준다. 도 13b 및 도 13c의 수평 막대는 중앙값을 표시한다. P 값은 양측 Mann-Whitney 검정(도 13b, c) 및 양측 쌍별 Wilcoxon 순위 합 검정(도 13g)에 의하였다.
도 14a-g: 활성화된 종양 ILC2는 PD-1을 발현하고 PD-1+ T 세포와 공존한다. 동소위 PDAC 마우스(C57Bl/6 WT, Pdcd1 -/- , CD45.1)를 10일 동안 매일 500ng의 담체-없는 재조합 쥐 IL33으로 처리하였다(도 4e, f에 나타낸 실험 설계). 살아있는, CD45+, lineage-, CD90+, CD25+, ST2+ 종양 ILC2s(TILC2s)는 이식 후 10일째에 98% 순도로 분류-정제되었다. 5 x 105 TILC2s는 i.p. 주입을 통해 종양 이식 후 7일과 14일에 동소위 종양-함유 Il7r Cre/+ Rora fl/fl (ILC2-결핍) CD45.2 마우스로 ?グ若?. 대조군 마우스는 i.p. 주사를 통해 동일한 부피의 PBS를 투여 받았다. (도 14a) TILC2 분류-정제(위) 및 분류 후 순도(아래)에 대한 대표적인 플롯. (도 14b) 도 4e, f에 요약된 실험 설계에서 WT 및 CD45.1 마우스의 분류-정제된 TILC2에 대한 PD-1 발현을 보여주는 대표적인 플롯. (도 14c) 동소위 KPC 4662-GFP 및 KPC 52 PDAC 종양의 생존 및 종양내 CD8+ T 세포 빈도; c 마크 중앙값의 가로 막대. (도 14d) 인간 PDAC에서 PD-1+ ILC2의 빈도(좌) 및 PD-1+ T 세포와의 상관관계(우). (도 14e) 단기 및 장기 인간 PDAC 생존자의 벌크 종양 전사체에서 IL33 및 PD-1 mRNA의 선형 회귀 분석(좌)과 단기 및 장기 생존자의 종양 조직 마이크로어레이에서 PD-1+ 세포의 생존 연관성(우); high 및 low은 코호트의 중앙값보다 높거나 낮은 것으로 정의된다. (도 14f) 췌장암에서 IL33-TILC2 축을 T 세포 면역에 연결하는 모델. (도 14g) 단일-세포 RNA 시퀀싱에 의한 미처리 종양 ILC2에서 공동자극 분자의 발현 분포. 도 11a에 도시된 바와 같은 실험 설계; 데이터는 n=10 (비히클)의 생물학적 복제수로부터 풀링된 정제된 단일-세포를 나타낸다. 데이터는 n≥4/그룹을 사용한 두 가지 독립적인 실험에서 분류된 TILC2에 대한 순도 및 PD-1 발현을 나타낸다(도 14a, b). n 및 데이터 점은 개별적으로 분석된 개별 마우스 및 환자를 나타낸다. P 값은 양측 Mann-Whitney 검정 (도 14c) 및 양측 로그 순위(도 14c, e, 생존 곡선) 검정, 및 선형 회귀(도 14d, e)에 의해 결정하였다.
본 발명의 주요 구체예 중 일부가 상기 발명의 요약 및 본 특허 출원의 실시예 및 청구범위 항목에 설명되어 있지만, 이 상세한 설명 항목은 본 발명의 조성물 및 방법에 관한 특정 추가 설명을 제공하며, 본 특허 출원의 다른 모든 항목들과 함께 읽도록 의도된다.
정의 및 약어
본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용된 바와 같이, 문맥상 달리 명백하게 지시되지 않는 한, 단수형 "a", "an", 및 "the"는 복수의 대상을 포함한다. 용어 "a"(또는 "an"), 뿐만 아니라 용어 "하나 이상" 및 "적어도 하나"는 상호교환적으로 사용될 수 있다.
또한, "및/또는"은 각각의 2개의 특정된 성질 또는 성분의 다른 하나와 함께 또는 다른 하나 없이 특정한 기재로서 취해지는 것이다. 따라서, "A 및/또는 B"와 같은 구에서 사용되는 바와 같은 용어 "및/또는"은 A 및 B, A 또는 B, A(단독), 및 B(단독)을 포함하는 것이 의도된다. 마찬가지로, "A, B, 및/또는 C"와 같은 구에서 사용되는 바와 같은 용어 "및/또는"은 A, B, 및 C; A, B, 또는 C; A 또는 B; A 또는 C; B 또는 C; A 및 B; A 및 C; B 및 C; A(단독); B(단독); 및 C(단독)를 포함하는 것이 의도된다.
단위, 접두사, 및 부호는 이의 국제단위계(Systeme International de Unites)(SI) 허용 형태로 기재된다. 본원에 제공되는 수치 범위는 범위를 정의하는 수치를 포함한다.
숫자 용어 앞에 "약" 또는 "대략"이 오는 경우, 해당 용어에는 명시된 숫자 및 명시된 숫자의 ±10% 값이 포함된다.
이 특허 명세서에서 텍스트 다음의 괄호 또는 위첨자 안의 숫자는 이 특허 명세서의 "선행기술문헌" 항목에 제공된 번호가 매겨진 참고문헌를 나타낸다.
구체예가 "포함하는"이라는 언어로 설명되는 곳마다 "로 이루어지는" 및/또는 "필수적으로 이루어지는"과 관련하여 설명된 유사한 구체예가 포함된다.
본원에 사용된 약어 "IL33"은 인터루킨 33(interleukin 33)을 말한다.
본원에 사용된 약어 "rIL33"은 재조합 인터루킨 33(recombinant interleukin 33)을 말한다.
본원에 사용된 약어 "PDAC"는 췌관 선암(pancreatic ductal adenocarcinoma)을 말한다.
본원에서 사용된 약어 "ILC2"는 그룹 2 선천성 림프구 세포(group 2 innate lymphoid cell)를 말한다.
본원에 사용된 약어 "TILC2"는 종양 ILC2(tumor ILC2)를 말한다. ILC2를 언급하는 본원에 기술된 모든 구체예는 또한 TILC2를 포함하도록 의도되고, ILC2를 포함하는 것으로 본원에 기술된 모든 방법에 대해, TILC-특이적으로 지시되는 대안도 또한 본 발명에 의해 고려된다는 점에 유의해야 한다.
본원에 사용된 약어 "PDX"는 환자-유래 이종이식편(patient-derived xenograft)을 말한다.
본원에서 사용된 약어 PD-1"은 프로그램된 사멸 1 (Programmed Death 1)을 나타내며, 이는 프로그램된 사멸 단백질 1 (Programmed Death Protein 1) 또는 프로그램된 세포 사멸 단백질 1 (Programmed Cell Death Protein 1)로도 알려져 있다.
본원에서 사용된 약어 PD-L1은 PD-1에 대한 리간드인, 프로그램된 세포 사멸 리간드 1 (Programmed Cell Death Ligand 1)을 나타낸다.
본원에서 사용된 약어 "IP" 또는 "i.p." 는 복강내(intraperitoneal)를 말한다. IP 경로를 통해 마우스에 제제를 투여하는 것이 일반적이며, 이는 IV 경로로 인간 개체에게 제제를 투여하는 것과 유사한 것으로 간주된다.
본원에 사용된 약어 "IT"는 종양내(intratumoral)를 말한다. 예를 들어, 종양에 직접 주사된 약물은 종양내로 전달된다.
본원에 사용된 약어 "IV"는 정맥내(intravenous)를 말한다.
본원에 사용된 바와 같이, "억제하는" 및 "차단하는"이라는 용어는, "억제하다" 또는 "차단하다"라는 용어 및 "억제제" 또는 "차단제"라는 용어와 마찬가지로, 상호교환적으로 사용된다. "억제하다" 및 "차단하다"라는 용어는 주어진 생물학적 활성에서 감지 가능하고 통계적으로 유의한 감소를 말한다.
본원에 사용된 용어 "동종이계(allogeneic)"은 구성원이 유전적으로 관련이 있거나 유전적으로 관련이 없지만 유전적으로 유사한 경우 동일한 종의 구성원, 기원 또는 구성원인 것을 말한다. "동종이계 이식 (allogeneic transplant)" 또는 "동종이계 세포 요법(allogeneic cell therapy)"은 공여자로부터 얻은(또는 공여자로부터 얻은 세포에서 유래된) 세포를 수용자에게 투여하는 것을 의미하며, 여기서 수용자는 공여자와 동일한 종이다. 개체에 대한 동종이계 췌장 ILC2 세포의 투여를 포함하는 본 발명의 구체예에서, 동종이계 세포는 세포가 투여될 개체(즉, 수용자)와 동일한 종의 공여자로부터 수득된다. 일부 구체예에서, 동종이계 세포는 세포가 투여될 개체(즉, 수용자)와 동일한 MHC/HLA 유형을 갖는 공여자로부터 수득된다 - 즉, 세포의 공여자 및 세포의 수용자는 MHC-일치(MHC-matched) 또는 HLA-일치(HLA-matched)이다. 일부 구체예에서, 세포(예를 들어, 췌장 ILC2 세포)는 (a) 공여자로부터 수득되고, (b) 생체외/시험관내(ex vivo/in vitro)에서 유지 및/또는 배양 및/또는 확장 및/또는 활성화되고(예를 들어, IL33을 이용하여) (c) 이후에 공여자와 같은 종의 개체에게 투여된다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 췌장 ILC2 세포는 공여자로부터 수득되고, 생체외/시험관내에서 IL33으로 활성화된 다음, 공여자와 동일한 종의 수용자 개체에게 투여된다. 이러한 방법은 동종이계 이식(allogeneic transplant) 또는 동종이계 전달 (allogeneic transfer) 또는 동종이계 세포 치료 방법(allogeneic cell therapy method)으로 지칭될 수 있으며, 공여자 또는 공여자로부터 얻은 세포는 수용자에 대해 동종이계인 것으로 지칭될 수 있다. 유사하게, 일부 구체예에서, ILC2 세포는 공여자로부터 수득되고, 생체외/시험관내에서 IL-33으로 활성화된 다음, 공여자와 동일한 종 및 동일한 MHC/HLA 유형의 수용자 개체에게 투여된다.
본원에 사용된 용어 "자가(autologous)"는 동일한 개체(즉, 동일한 개인)으로부터 유래하거나 기원하는 것을 말한다. "자가 이식(autologous transplant)" 또는 "자가 세포 요법(autologous cell therapy)"은 공여자로부터 얻은(또는 공여자로부터 얻은 세포에서 유래된) 세포를 수용자에게 투여하는 것을 말하며, 여기서 공여자와 수용자는 동일한 개인이다. 일부 구체예에서, 본 발명의 방법은 자가 췌장 ILC2를 개체에게 투여하는 것을 포함하며, 상기 췌장 ILC2는 췌장 ILC2가 투여될 동일한 개인/개체로부터 수득된다 (즉, 공여자 및 수용자가 동일한 개인임). 일부 구체예에서, 췌장 ILC2는 (a) 개체로부터 수득되고, (b) 생체외/시험관내에서 유지 및/또는 배양 및/또는 확장 및/또는 활성화되고, (c) 이후 동일한 개체에게 투여된다. 예를 들어, 일부 이러한 구체예에서, 췌장 ILC2는 개체로부터 수득되고, 생체외/시험관내에서 IL33으로 활성화된 다음, 동일한 개체에게 투여된다. 이러한 방법은 자가 이식(autologous transplant) 또는 자가 전달(autologous transfer) 또는 자가 세포 치료 방법(autologous cell therapy method)으로 지칭될 수 있고, 공여자 또는 공여자로부터 얻은 세포는 수용자에 대해 자가인 것으로 지칭될 수 있다.
본원에서 세포 집단과 관련하여 사용될 때 용어 "실질적으로 순수한(substantially pure)"은 전체 세포 집단을 구성하는 세포의 약 50% 이상, 바람직하게는 약 75-80% 이상, 보다 바람직하게는 약 85-90% 이상, 가장 바람직하게는 약 95% 이상이 특정 세포 마커 특성/프로파일을 갖는 세포 집단을 말한다. 따라서, "실질적으로 순수한" 세포 집단은 특정 마커 특성/프로파일을 나타내지 않는 세포를 약 50% 미만, 바람직하게는 약 20-25% 미만, 보다 바람직하게는 약 10-15% 미만, 가장 바람직하게는 약 5% 미만 포함한다.
본원에서 세포에 관련하여 사용된 용어 "분류(sorting)" 는 물리적 특성 또는 마커의 존재에 기초한 세포의 분리를 말한다 (예를 들어, 측면 산란(SSC) 및/또는 전방 산란(FSC), 또는 예를 들어 표지된 항체 사용한, 형광 활성화 세포 분류(FACS)를 사용한 분류).
세포와 관련하여 본 명세서에서 사용되는 용어 "단리된(isolated)"은, 특정 세포 유형이 하나 이상의 다른 세포 유형, 예를 들어 자연에서(예를 들어, 체내에서) 상기 특정 세포 유형과 공존하는 다른 세포 유형으로부터 분리된 것을 말한다.
다른 약어 및 정의는 이 특허 명세서의 다른 곳에서 제공되거나 당업계에 잘 알려져 있을 수 있다.
활성제(active agent)
본 발명에 의해 제공되는 방법 및 조성물은 IL33 및 PD-1 억제제를 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 상이한 활성제를 포함한다.
IL33을 포함하는 본 발명의 그러한 구체예에서, 임의의 적합한 IL33 분자가 사용될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 사용된 IL33 분자는 IL33이 투여될 종으로부터의 IL33 분자이다. 예를 들어, 인간에 대한 투여에는 인간 IL33이 사용되는 반면, 마우스에 대한 투여에는 쥐(murine) IL33이 사용된다. 예를 들어, 마우스에 투여하기 위해, 재조합 쥐 IL33 (담체-함유 또는 담체-무함유 형태로 R&D Systems 에서 구입가능)가 사용될 수 있다. UniProtKB/Swiss-Prot: Q8BVZ5.1에 기재된 아미노산 서열을 갖는 마우스 IL33을 사용할 수 있다. 유사하게, 인간에게 투여하기 위해, 재조합 쥐 IL33 (캐리어-함유 또는 캐리어-무함유 형태로 R&D Systems 에서 구입가능)가 사용될 수 있다. UniProtKB/Swiss-Prot: O95760.1에 기재된 아미노산 서열을 갖는 인간 IL33이 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 적합한 인간 IL33 서열의 다른 예는 서열번호 1 또는 서열번호 2를 포함하거나 또는 이로 이루어진 서열이나 이에 제한되지 않는다. 일부 구체예에서, IL33은 이를 생산하는 동물(예를 들어, 마우스, 인간)로부터 단리/정제된다. 일부 구현예에서 IL33은 재조합적으로 생성된다. 즉, IL33을 코딩하는 재조합 DNA로부터 임의의 적합한 발현 시스템에서 발현된다. 일부 구체예에서 IL33은 합성적으로 생성된다. 일부 구체예에서, IL33은 이의 반감기, 안정성, 생체이용률을 증가 또는 개선하거나 임의의 다른 원하는 생물학적 특성을 개선하기 위해 변형된다. 일부 구체예에서, IL33은 반감기 증가 모이어티를 포함한다. 변형된 IL33이 ILC2 세포 상의 IL33 수용체에 결합하고 이를 활성화시키는 능력을 유지하는 한, 당업계에 공지된 임의의 그러한 변형이 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 변형의 예는 페길화, Fc 면역글로불린 도메인(예를 들어, 서열번호 9)에 대한 접합, 알부민-결합 도메인에 대한 접합, 및 헥사데센산 변형을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. IL33의 정제 또는 분비 또는 생산에 유용한 변형들은 발현/정제 태그(예를 들어, 서열번호 3 또는 서열번호 4와 같은 His 태그), 프로테아제 인식 부위(예를 들어, 서열번호 5와 같은 TEV 프로테아제 인식 부위), 분비 신호(예를 들어, 서열번호 6), 및 링커 서열(예를 들어, 서열번호 7 또는 8)을 포함하여 사용될 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 사용될 수 있는 인간 IL33의 변형된 버전의 예는 서열번호 10 (His 태그 및 TEV 프로테아제 인식 부위를 포함함), 서열번호 11 (분비 신호, His 태그 및 링커를 포함함), 또는 서열번호 12 (분비 신호, IgG4-Fc 서열 및 링커를 포함함)로 이루어지거나 또는 이를 포함하거나 또는 이로부터 생산된 것들을 포함하나 이에 제한되지 않는다. IL33을 언급하는 본원의 모든 경우에 대해, 본 발명은 IL33이 서열번호 1, 2, 10, 11 또는 12 중 어느 하나로 이루어지거나 또는 이를 포함하는 구체예들을 고려하고 포함한다.
예시 서열
서열번호 설명 / 명칭 서열
서열번호 1 Hu IL-33 (112-270) SITGISPITEYLASLSTYNDQSITFALEDESYEIYVEDLKKDEKKDKVLLSYYESQHPSNESGDGVDGKMLMVTLSPTKDFWLHANNKEHSVELHKCEKPLPDQAFFVLHNMHSNCVSFECKTDPGVFIGVKDNHLALIKVDSSENLCTENILFKLSET
서열번호 2 IL33 (aa111-270) SSITGISPITEYLASLSTYNDQSITFALEDESYEIYVEDLKKDEKKDKVLLSYYESQHPSNESGDGVDGKMLMVTLSPTKDFWLHANNKEHSVELHKCEKPLPDQAFFVLHNMHSNCVSFECKTDPGVFIGVKDNHLALIKVDSSENLCTENILFKLSET
서열번호 3 His Tag HHHHHHHH
서열번호 4 His Tag HHHHHH
서열번호 5 TEV 프로테아제 인식 부위 ENLYFQG
서열번호 6 분비 신호 MGWSCIILFLVATATGVHS
서열번호 7 링커 GGGG
서열번호 8 링커 GGGGSGGGG
서열번호 9 hIgG4-Fc DKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
서열번호 10 His-TEV Hu IL-33 (112-270) MS HHHHHHHH ENLYFQG SITGISPITEYLASLSTYNDQSITFALEDESYEIYVEDLKKDEKKDKVLLSYYESQHPSNESGDGVDGKMLMVTLSPTKDFWLHANNKEHSVELHKCEKPLPDQAFFVLHNMHSNCVSFECKTDPGVFIGVKDNHLALIKVDSSENLCTENILFKLSET
굵게표시 & 밑줄친 부분은 His-tag 를 나타냄
굵게표시 & 이탤릭체는 TEV 프로테아제 인식 부위를 나타냄
서열번호 11 분비 신호-His-링커-IL33 (aa111-270) MGWSCIILFLVATATGVHS HHHHHH GGGGSSITGISPITEYLASLSTYNDQSITFALEDESYEIYVEDLKKDEKKDKVLLSYYESQHPSNESGDGVDGKMLMVTLSPTKDFWLHANNKEHSVELHKCEKPLPDQAFFVLHNMHSNCVSFECKTDPGVFIGVKDNHLALIKVDSSENLCTENILFKLSET
굵게표시 & 밑줄친 부분은 분비 신호를 나타냄
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이탤릭체는 링커를 나타냄
서열번호 12 분비 신호-hIgG4-Fc (S228P)-링커-IL33 MGWSCIILFLVATATGVHS DKRVESKYGPPCP P CPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK GGGGSGGGGSSITGISPITEYLASLSTYNDQSITFALEDESYEIYVEDLKKDEKKDKVLLSYYESQHPSNESGDGVDGKMLMVTLSPTKDFWLHANNKEHSVELHKCEKPLPDQAFFVLHNMHSNCVSFECKTDPGVFIGVKDNHLALIKVDSSENLCTENILFKLSET
굵게표시 & 밑줄친 부분은 분비 신호를 나타냄
굵게표시 & 이탤릭체는 IgG4-Fc 서열을 나타냄
이탤릭체는 링커를 나타냄
SEQ ID. NO.13 His-TEV Hu IL-33 (112-270) 를 코딩하는 최적화된 뉴클레오티드 서열 ATGTCCCACCATCACCATCACCACCACCACGAAAATCTGTACTTCCAAGGCAGCATCACCGGCATCAGCCCCATCACCGAGTATCTGGCCTCTCTGTCCACCTACAACGACCAGTCCATCACATTCGCTCTGGAGGACGAAAGCTACGAGATCTACGTGGAGGATCTGAAGAAGGACGAGAAGAAGGACAAGGTGCTGCTGTCCTACTACGAGTCCCAGCACCCCTCCAACGAAAGCGGCGACGGCGTGGATGGCAAGATGCTGATGGTGACACTGAGCCCCACCAAGGACTTTTGGCTGCACGCCAACAACAAGGAGCACAGCGTGGAGCTGCACAAGTGCGAGAAACCTCTGCCCGACCAAGCCTTCTTCGTGCTGCACAACATGCACAGCAACTGCGTGTCCTTCGAGTGCAAGACCGACCCCGGCGTGTTCATCGGCGTGAAGGACAACCATCTGGCTCTGATCAAGGTGGACAGCTCCGAGAACCTCTGCACCGAGAACATTCTGTTCAAGCTGTCCGAGACCTGATGA
서열번호 14 His-TEV Hu IL-33 (112-270) 를 코딩하는 최적화된 뉴클레오티드 서열 - 추가적인 제한부위 포함 AAGCTT ATGTCCCACCATCACCATCACCACCACCACGAAAATCTGTACTTCCAAGGCAGCATCACCGGCATCAGCCCCATCACCGAGTATCTGGCCTCTCTGTCCACCTACAACGACCAGTCCATCACATTCGCTCTGGAGGACGAAAGCTACGAGATCTACGTGGAGGATCTGAAGAAGGACGAGAAGAAGGACAAGGTGCTGCTGTCCTACTACGAGTCCCAGCACCCCTCCAACGAAAGCGGCGACGGCGTGGATGGCAAGATGCTGATGGTGACACTGAGCCCCACCAAGGACTTTTGGCTGCACGCCAACAACAAGGAGCACAGCGTGGAGCTGCACAAGTGCGAGAAACCTCTGCCCGACCAAGCCTTCTTCGTGCTGCACAACATGCACAGCAACTGCGTGTCCTTCGAGTGCAAGACCGACCCCGGCGTGTTCATCGGCGTGAAGGACAACCATCTGGCTCTGATCAAGGTGGACAGCTCCGAGAACCTCTGCACCGAGAACATTCTGTTCAAGCTGTCCGAGACCTGATGA GCGGCCGC
HindIII 제한부위- 굵게표시 & 밑줄
Not1 제한부위 - 굵게표시, 밑줄 & 이탤릭체
PD-1 억제제를 포함하는 본 발명의 그러한 구체예에서, 당업계에 공지된 임의의 적합한 PD-1 억제제가 사용될 수 있다. 일부 구체예에서 PD-1 억제제는 항체이다. 일부 구체예에서 PD-1 억제제는 펨브롤리주맙 (Keytruda, Merck), 니볼루맙 (Opdivo, Bristol-Myers Squibb), 세미플리맙 (Libtayo, Regeneron), AMP-224 (GlaxoSmithKline), AMP-514 (GlaxoSmithKline) 및 PDR001 (Novartis) 로 이루어진 군으로부터 선택된다.
PD-L1 억제제를 포함하는 본 발명의 그러한 구체예에서, 당업계에 공지된 임의의 적합한 PD-L1 억제제가 사용될 수 있다. 일부 구체예에서 PD-L1 억제제는 항체이다. 일부 구체예에서 PD-L1 억제제는 아테졸리주맙 (Tecentriq, Roche Genentech), 아벨루맙 (Bavencio, Merck Serono 및 Pfizer), 더발루맙 (Imfinzi, AstraZeneca), BMS-936559 (Bristol-Myers Squibb), CK-301 (Checkpoint Therapeutics) 로 이루어진 군으로부터 선택된다.
상기 및/또는 본원의 다른 곳에서 기재된 본 발명의 많은 구체예는 PD-1 억제제 및/또는 PD-L1 억제제의 사용을 포함한다. 모든 경우에, 본 발명은 또한 PD-1 억제제만이 사용되는 변형을 갖는 동일한 구체예를 포함한다는 점에 유의해야 한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 방법은 본원에 기재된 임의의 특정 활성제와 동등한 유사체, 동족체, 변이체 또는 유도체를 사용하여 수행될 수 있다. 이러한 유사체, 동족체, 변이체 또는 유도체는 본원에 설명된 특정 분자의 주요 기능적 특성을 유지해야 한다. 예를 들어, PD-1 억제제 및/또는 PD-L1 억제제의 경우, PD-1 억제 및/또는 PD-L1 억제 활성을 유지한다면 이러한 제제의 임의의 적합한 유사체, 동족체, 변이체 또는 유도체를 사용할 수 있다. IL33의 경우, ILC2 세포 상의 IL33 수용체에 결합하고 이를 활성화하는 능력을 유지한다면 이러한 제제의 임의의 적합한 유사체, 동족체, 변이체 또는 유도체를 사용할 수 있다.
특정 구체예에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 활성제, 및 개체에게 전달하기 위한 조성물을 제제화하는데 유용한 하나 이상의 다른 성분, 예컨대 희석제, 완충제, 담체, 안정화제, 분산제, 현탁제, 증점제, 부형제, 보존제 등을 포함하는 조성물을 제공한다.
치료 방법
본 발명은 다양한 치료 방법을 제공한다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 본 발명은 치료가 필요한 개체에게 유효량의 본원에 기재된 하나 이상의 활성제(예를 들어, IL33 및/또는 PD-1 억제제 및/또는 PD-L1 억제제)를 투여하는 것을 포함하는 치료 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 췌장 종양(예를 들어, PDAC 종양)에서 ILC2 세포를 활성화하는 다양한 방법을 제공한다. 이들 방법은 또한 일반적으로 이를 필요로 하는 개체에게 유효량의 본원에 기재된 하나 이상의 활성제(예를 들어, IL33 및/또는 PD-1 억제제 및/또는 PD-L1 억제제)를 투여하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 본 발명은 또한 다양한 세포 치료 방법을 제공한다. 이들 세포 치료 방법은 공여자 개체로부터 수득되고 IL33과의 접촉에 의해 생체외/시험관내에서 활성화된, 유효량의 활성화된 공여자 췌장 ILC2 세포를, PDAC를 가진 수용자 개체에게 투여하는 것을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "치료하다", "치료하는" 및 "치료"는 췌장암(예를 들어, PDAC)과 관련된 하나 이상의 임상 지표 또는 증상에서 검출가능한 개선을 달성하는 것 및/또는 달성하는 방법을 수행하는 것을 포함한다. 예를 들어, 이러한 용어는, 췌장 종양(또는 췌장 종양 세포)의 성장 속도 감소, 췌장 종양(또는 췌장 종양 세포)의 성장 정지, 췌장 종양(또는 췌장 종양 세포)의 퇴행 유발, 췌장 종양의 크기 감소(예를 들어, 종양 부피 또는 종양 질량으로 측정시), 췌장 종양의 등급 감소, 췌장 종양(또는 췌장 종양 세포) 제거, 췌장 종양의 재발(반동) 예방, 지연 또는 감속, 췌장 종양과 관련된 증상 개선, 췌장 종양으로부터의 생존 개선, 췌장 종양의 확산(예를 들어, 전이)의 억제 또는 감소 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 치료 방법을 언급하는 본원에 기재된 각각의 구체예에서, 위에 열거된 특정 파라미터 중 임의의 하나 이상을 달성하는 방법이 또한 고려된다. 예를 들어, 췌장암(예를 들어, PDAC)을 치료하는 방법을 언급하는 본원에 기재된 각각의 구체예에 대해, 하기 방법이 또한 고려되고 의도되고 본 발명의 범위 내에 속한다: (a) 췌장 종양(또는 췌장 종양 세포)의 성장 속도를 감소시키는 방법, (b) 췌장 종양(또는 췌장 종양 세포)의 성장을 정지시키는 방법, (c) 췌장 종양(또는 췌장 종양 세포)의 퇴행을 유발하는 방법, (d) 췌장 종양의 크기를 감소시키는 방법(예를 들어, 종양 부피 또는 종양 질량으로 측정시), (e) 췌장 종양의 등급을 감소시키는 방법, (f ) 췌장 종양(또는 췌장 종양 세포)을 제거하는 방법, (g) 췌장 종양의 재발(반동)을 예방, 지연 또는 감속시키는 방법, (h) 췌장 종양과 관련된 증상을 개선하는 방법, (i) 췌장 종양으로부터의 생존을 개선하는 방법, 및 (j) 췌장 종양의 확산(예를 들어, 전이)을 억제하거나 감소시키는 방법.
본원에 사용된 용어 "개체"는 인간, 비인간 영장류, 개, 고양이, 설치류 (예를 들어, 쥐, 마우스 및 기니피그), 소, 돼지, 양, 염소, 말 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 모든 포유동물 종으로서, 축산업에 사용되는 모든 동물종은 물론, 애완동물 및 동물원 등에서 사육되는 동물을 포함한다. 일부 구체예에서 개체는 인간이다.
일부 구체예에서, 본 방법 및 조성물은 이를 필요로 하는 개체(즉, 췌장암을 가진 개체)에서 임의의 췌장 종양을 치료하는 데 사용될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 본 방법 및 조성물은 이를 필요로 하는 개체(즉, PDAC를 가진 개체)에서 췌관 선암(PDAC)에 사용된다. 일부 구체예에서, 본 방법 및 조성물은 이를 필요로 하는 개체(즉, PD-1 억제제 및/또는 PD-L1 억제제 내성 PDAC를 가진 개체)에서 PD-1/PD-L1 억제제 내성 PDAC를 치료하는 데 사용된다.
일부 구체예에서, 개체는 다른 방법 및/또는 조성물을 사용한 치료에 내성인 종양을 갖는다. 본원에 사용된 용어 "내성인" 및 "내성"은 당업계에서 통상적인 용법과 일치하고 암을 치료하는 의사(예를 들어, 종양 전문의)에 의한 이러한 용어의 이해와 일치하여 사용된다. 예를 들어, 당해 분야의 통상적인 의미와 일치하여, 특정 치료 방법의 사용 또는 특정 제제(또는 제제의 조합)의 투여에도 불구하고 개체의 종양(또는 종양 세포)이 성장 및/또는 진행 및/또는 확산 및/또는 전이 및/또는 재발하는 경우, 종양 또는 개체는 그 특정 치료 방법 또는 특정 제제(또는 제제의 조합)를 사용한 치료에 대해 "내성"인 것으로 간주될 수 있다. 어떤 경우에는, 종양이 처음에는 특정 방법이나 제제(또는 제제의 조합)를 사용한 치료에 민감했지만 나중에는 이러한 치료에 내성이 생길 수 있다.
일부 구체예에서, 개체는 화학요법, 방사선 요법, 또는 외과적 절제, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하나 이에 제한되지 않는 다른 조성물 또는 방법을 사용한 선행 치료 후에 재발한 췌장 종양(예를 들어, PDAC)을 갖는다. 일부 구체예에서, 개체는 이전에 치료된 적이 없는 췌장 종양을 갖는다.
본원에 사용된 용어 "유효량"은 상기 "치료" 설명에 기재된 것과 같은 하나 이상의 바람직한 임상 결과를 달성하거나 달성에 기여하기에 충분한, 및/또는 췌장 종양(예를 들어, PDAC 종양)에서 ILC2 세포를 활성화하기에 충분한, 본원에 기재된 바와 같은 활성제 또는 세포의 양을 말한다. 임의의 개별 경우에 적절한 "유효"량은 용량 상승 연구와 같은 당업계에 알려진 표준 기술을 사용하여 결정될 수 있고, 원하는 투여 경로(예를 들어, 전신적 vs. 종양내), 원하는 투여 빈도 등과 같은 요인들을 고려하여 결정될 수 있다. 일부 구체예에서 "유효량"은 임상 시험에서 이미 효과적인 것으로 밝혀지고/거나 인간 개체에 대한 투여에 대해 승인된 양일 수 있다. 예를 들어, 일부 구체예에서 유효량의 IL33, PD-1 억제제 또는 PD-L1 억제제는 임상 시험에서 이미 효과적인 것으로 나타났거나 및/또는 인간 개체에 대한 투여에 대해 이미 승인된 양일 수 있다. 또한, "유효량"은 사용될 임의의 공동-투여 방법의 맥락에서 결정될 수 있다. 당업자는 (단일 제제를 사용하든 제제의 조합을 사용하든 상관없이) 이러한 용량 연구를 쉽게 수행하여 사용할 적절한 용량을 결정할 수 있으며, 예를 들어, 개체 (예를 들어, 용량 연구를 수행하기 위해 약학에서 통상적으로 사용되는 동물 개체)에 대해 본원에 설명된 제제들의 투여를 포함하는, 본 특허 출원의 실시예 항목에 설명된 것과 같은 분석법을 사용하여 결정할 수 있다.
예를 들어, 일부 구체예에서 본 발명의 활성제의 용량은 활성제의 효능 및/또는 유효량을 결정하기 위해 수행된 인간 또는 다른 포유동물에서의 연구에 기초하여 계산될 수 있다. 용량은 당업계에 공지된 방법에 의해 결정될 수 있고, 활성제의 약제학적 형태, 투여 경로, 하나의 활성제만 사용되는지 또는 여러 활성제(예를 들어, 제1 활성제가 제2 활성제와 조합하여 사용되는 경우, 필요한 제1 활성제의 용량은 더 낮아질 수 있음)가 사용되는지 여부, 연령, 체중 또는 약물 대사에 영향을 미치는 의학적 상태의 존재를 포함한 환자 특성과 같은 요인들에 따라 달라질 수 있다.
마우스 연구에 기초하여 투여될 제제의 특정 용량을 언급하는 본원에 기재된 구체예에서, 당업자는 예를 들어 당업계에 공지된 및/또는 본원에 설명되어 있는 용량 연구 및 계산의 유형을 사용하여 마우스 용량에 기초한 인간 연구에 대한 필적하는 용량을 용이하게 결정할 수 있다 다.
일부 구체예에서, 본원에 기재된 다양한 활성제의 적합한 용량은, 예를 들어 이 특허 출원의 실시예 항목에서 마우스에서 효과적인 것으로 나타난 용량을 출발점으로 사용하여, 용량 증량 연구와 같은 당업계의 표준 유형의 용량 연구를 수행함으로써 결정될 수 있다.
일부 구체예에서, 하나 이상의 활성제가, 예를 들어 임상 I상 시험 및/또는 용량 증량 연구에서 결정된 바와 같이, 대략 이의 최대 허용 용량으로 사용된다. 일부 구체예에서, 활성제 중 하나 이상이 이의 최대 허용 용량의 약 90%로 사용된다. 일부 구체예에서, 활성제 중 하나 이상이 이의 최대 허용 용량의 약 80%로 사용된다. 일부 구체예에서, 활성제 중 하나 이상이 이의 최대 허용 용량의 약 70%로 사용된다. 일부 구체예에서, 활성제 중 하나 이상이 이의 최대 허용 용량의 약 60%로 사용된다. 일부 구체예에서, 활성제 중 하나 이상이 이의 최대 허용 용량의 약 50%로 사용된다. 일부 구체예에서, 활성제 중 하나 이상이 이의 최대 허용 용량의 약 50%로 사용된다. 일부 구체예에서, 활성제 중 하나 이상이 이의 최대 허용 용량의 약 40%로 사용된다. 일부 구체예에서, 활성제 중 하나 이상이 이의 최대 허용 용량의 약 30%로 사용된다.
본원에 기재된 치료 방법을 수행함에 있어서, 임의의 적합한 방법 또는 투여 경로를 사용하여 본원에 기재된 활성제 및/또는 세포 또는 이들의 조합을 전달할 수 있다. 일부 구체예에서, 전신 투여, 예를 들어 경구 또는 정맥내(IV) 투여, 또는 당업계에 공지된 임의의 다른 적합한 전신 투여 방법 또는 경로가 사용될 수 있다. 일부 구체예에서 종양내(IT) 전달이 사용될 수 있다. 일부 실시예에서 복강내(IP) 전달이 사용될 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 활성제는 주사, 카테터를 통한 주입, 이식가능한 약물 전달 장치를 사용한 주입, 또는 당업계에 공지된 임의의 다른 수단에 의해 전신적으로 또는 국소적으로 투여될 수 있다. 당업자는 상황에 따라, 예를 들어 활성제 또는 세포가 투여되고 있는지 여부에 따라, 그리고 활성제의 경우에는 활성제의 성질에 따라 (예를 들어, 이의 안정성, 반감기 등) 적절한 전달 방법 또는 경로를 선택할 수 있을 것이다.
특정 구체예에서, 본원에 제공된 조성물 및 치료 방법은 외과적 방법(예를 들어, 종양 절제를 위한), 방사선 치료 방법, 화학요법제를 이용한 치료, 항혈관신생제를 이용한 치료, 티로신 키나제 억제제를 이용한 치료 또는 면역 체크포인트 억제제를 이용한 치료를 포함하나 이에 제한되지 않는 종양 치료요법에 유용한 것으로 알려진 다른 조성물 및 치료 방법과 함께 사용될 수 있다. 유사하게, 특정 구체예에서, 본원에 제공된 치료 방법은 질병 상태/진행을 모니터링하는 데 사용되는 절차, 예를 들어 생검 방법 및 진단 방법(예를 들어, MRI 방법 또는 다른 영상화 방법)과 함께 사용될 수 있다.
예를 들어, 일부 구체예에서 본원에 기재된 방법은 종양의 외과적 절제를 수행하기 전에, 예를 들어 외과적 절제 전에 종양을 수축시키기 위해 수행될 수 있다. 다른 구체예에서, 본원에 기재된 방법은 종양의 외과적 절제를 수행하기 전 및 수행한 후에 수행할 수 있다.
일부 구체예에서, 본원에 기재된 치료 방법은 개체가 요법에 반응할 가능성이 있는 종양을 갖고 있는지 여부를 결정하기 위해 진단 시험을 수행하는 것과 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 치료를 시작하기 전에, 개체가 PDAC를 갖고 있는지 여부를 결정 및/또는 개체가 ST2 와 같은 IL33 수용체를 발현하는 세포, 또는 PD-1 및/또는 PD-L1을 발현하는 세포를 포함하는 췌장암 (예를 들어, PDAC)를 갖고 있는지 여부를 결정하기 위해 진단 분석을 수행할 수 있다.
본원에 기술된 세포 요법-기반 방법에서, 종양에 대한 다른 유형의 세포 요법 (예를 들어, 종양에 대한 다른 유형의 자가 세포 요법)에 사용되는 프로토콜은 ILC2 세포와 함께 사용하기 위해 쉽게 조정될 수 있다. 예를 들어, TIL 치료 방법 및 CAR-T 세포 치료 방법의 변형이 사용될 수 있는데, 이는 이러한 각 방법이 공여자로부터 세포를 얻고, 어떤 방식으로든 이러한 세포를 시험관/생체외에서 조작한 다음, 이들 세포를 수용자에게 투여하는 것을 포함하기 때문이다. 예를 들어, 공여자로부터 림프구를 얻고, 이들 세포를 단리/정제하고, 시험관내/생체외에서 이들 세포를 배양/유지/확장하고, 이러한 세포를 수용자에게 투여하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 이러한 방법의 변형은 본원에 설명된 ILC2-기반 세포 요법과 함께 사용될 수 있다. 개체에서 수득된 췌장 ILC2 세포를 정제하는 것과 관련하여, 이는 FAC-기반 방법과 같은 당업계에 공지된 표준 세포 단리/정제 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 이러한 세포 분리/정제 방법에 사용할 수 있는 여러 ILC2 마커는 이 특허 명세서의 실시예 항목에 설명되어 있다. 다른 적합한 마커는 당업계에 공지되어 있다.
실시예
본 발명은 하기의 비제한적인 "실시예" 및 거기에 언급된 도면에 의해 추가로 설명된다. 실시예 항목의 위첨자 숫자는 본 개시의 선행기술문헌 항목에서 번호가 매겨진 참고문헌을 나타낸다.
실시예 1
조직-특이적 선천성 림프구 세포의 활성화는 췌장암에서 PD-1 체크포인트 차단 면역요법을 증진시킨다
개요
그룹 2 선천성 림프구 세포(ILC2)는 조직의 염증과 면역을 조절한다1. ILC2는 이들 조직의 암에서 검출되지만2, 암 면역 및 면역요법에서의 역할은 불분명하다. 본원에서, 우리는 ILC2가 췌관 선암(PDAC)에 침투하여 조직-특이적 종양 면역을 활성화한다는 것을 확인한다. 인터루킨-33(IL33)은 동소위(orthotopic) 췌장에서 종양 ILC2 (TILC2) 및 CD8+ T 세포를 활성화하지만 이소성(heterotopic) 피부 종양은 활성화하지 않아 췌장-특이적 종양 성장을 제한한다. 휴지기 및 활성화된 TILC2는 억제성 체크포인트 수용체 PD-1을 발현하고, TILC2는 PD-1 차단(αPD-1)으로 종양 조절을 향상시키기 위해 추가로 확장된다. PD-1 차단은 TILC2에 직접 작용하여 항-종양 면역 및 αPD-1 면역요법 효능을 증가시키고, 활성화된 TILC2를 αPD-1의 신규 타겟으로 식별한다. 마지막으로 PD-1+ TILC2와 PD-1+ T 세포는 대부분의 인간 PDAC에 존재한다. 종합적으로, 우리는 PDAC 면역요법을 위한 신규 항암 면역 세포로서 ILC2를 확인한다. 보다 광범위하게, ILC2는 αPD-1 면역요법의 효능을 증폭시키는 암 면역의 조직-특이적 인핸서로 등장한다. ILC2와 T 세포는 활성화 및 억제 경로를 공유하는 인간 암들에 공존하므로, 항암 ILC2와 T 세포의 집단 표적화는 광범위하게 적용가능한 면역치료 접근법일 수 있다.
TILC2는 췌장암에 침투한다
선택되지 않은 원발성(primary) 인간 PDAC에서, 우리는 면역세포 계통 마커(Lin-)가 없지만 ILC (CD25 및 CD127)1 및 ILC2 (IL33 수용체 ST2/IL1RL1/IL33R 및 GATA3) 마커를 발현하는 종양내 세포를 발견하였다(도 1a, 도 5a). 이러한 추정 TILC2는, 차가운 종양(cold tumor)을 가진 단기 생존자와 비교할 때, "뜨거운(hot)" 종양(활성화된 CD8+ T 세포 농축)3을 가진 희귀한 장기 PDAC 생존자에서 풍부했으며, 더 높은 TILC2 빈도는 더 긴 생존과 상관관계가 있었다(도 1b, 도 5b). 일관되게, ILC2-활성화 사이토카인인 IL33의 더 높은 벌크 종양 RNA 발현은 더 긴 생존과 관련이 있었지만, 다른 ILC 활성화 사이토카인들은 그렇지 않았다 (도 1c, 도 5c). 또한, IL33은 더 높은 종양내 면역 세포용해 활성과 상관관계가 있었으나, 다른 ILC-활성화 사이토카인들은 그렇지 않았다 (도 1c, 도 5c). 이러한 데이터는 단백질 함량이 아니라 RNA를 평가하지만, IL33 및 TILC2가 인간 PDAC에서 항-종양 면역을 활성화함을 제시한다.
우리는 다음으로 돌연변이된 Kras 및 p53-구동 자생적(autochthonous) "KPC" 마우스4 및 ILC에 대한 동소위 PDAC 마우스 모델(PDAC 마우스5,6)에서 종양을 조사하였다. 두 모델 모두에서, 우리는 인간 PDAC 및 쥐 ILC21,7과 표현형이 유사한 TILC2를 검출하였다(도 1d, 도 5d-f). 쥐 TILC2는 이들이 상주하는 조직(tissue residency)과 일치하게8 종양에서 확장되었지만 인접 기관에서는 확장되지 않았으며(도 1d, 도 5g), 림프구 항원 CD90.2를 표적으로 함으로써 Rag2 -/- 마우스9,10에서 고갈되었다(도 1e, 도 5h). 따라서 ILC2는 마우스 및 인간 PDAC에서 국소적으로 확장하는, 보존된 세포이다.
TILC2 확장을 유도하는 신호를 식별함에 있어서, 우리는 PDAC와 KPC 마우스 모두11에서 다른 ILC-유도자 사이토카인에 비하여 IL33이 종양에서 가장 높은 발현을 보였고(도 6a)6, 인간과 마우스 PDAC 모두에서 이질적인 발현을 보이고(도 6b-c) 및 종양내 골수 세포에서 최대 발현을 보이는 것 12,13(도 6d, e) 을 발견하였다. PDAC 면역에서 IL33 및 TILC2의 역할을 이해하기 위해, 우리는 장기 인간 PDAC 생존자에서 ILC2가 풍부한 뜨거운(hot) 종양인 IL33High을 반영하는 IL33High PDAC 마우스에서 TILC2 의존성을 연구하였다. TILC2 확장 및 기능은 IL33 의존적이었는데, 이는 Il33 +/+ PDAC 마우스에 비하여, Il33 - / - PDAC 마우스가 TILC2 빈도, 수(도 1f, 도 6f) 및 사이토카인 생산(도 6g)을 감소시켰기 때문이다. 일관되게, 재조합 IL33(rIL33)은 ILC-숙련(ILC-proficient) Rag2 -/- PDAC 마우스에서 ILC를 확장했지만, ILC-결핍 Rag2 - / - γ c - / - PDAC 마우스에서는 그렇지 않았다(도 6h, i). 종합적으로, 이러한 실험은 IL33이 PDAC TILC2를 확장한다는 것을 보여주었다.
TILC2는 조직에서 종양 면역을 향상시킨다.
ILC2가 조직-특이적 표현형을 가지므로14, 우리는 PDAC 면역에 대한 TILC2 효과가 조직-특이적일 것이라고 가정하였다. 이를 테스트하기 위해, 췌장에서 종양 성장에 대한 IL33 결핍의 영향을 피부에 대한 것과 대조하였다 (췌장 TILC2는 ST2를 발현하고, 피부 TILC2는 발현하지 않음; 도 6j14,15). Il33 + / + 동물과 비교하여, 동소위 PDAC를 가진 Il33 - / - 마우스는, IL33-의존적 표현형을 나타내지 않는 피하 PDAC 마우스와는 대조적으로(도 2b, 도 6k), 더 큰 종양, 가속화된 종양 성장 및 더 나쁜 생존을 가졌다(도 6a). 이 마우스들이 동일한 유전적 배경에서 완전히 역교배되었지만, 우리는 Il33 + / + 대비 Il33 - / - 리터메이트(littermate)에서 더 큰 종양을 관찰함으로써, 이러한 차이가 잠재적인 경미한 유전적 불일치로 인한 것이 아님을 확인하였다(도 6l). 이러한 항-종양 효과는 숙주 조혈 세포-유래 IL33-의존적이었는데, 이는 대조군 마우스에 비해 Il33 - / - 골수가 이식된 키메라 마우스가 더 큰 종양을 가졌기 때문이다 (도 6m-o). Il33 +/+ 및 Il33 - / - 동소위 PDAC 마우스의 정제된 CD45+ 종양내 면역 세포의 RNA 시퀀싱(RNA-seq) 결과, Il33 - / - PDAC 면역 세포는 T 세포 활성화 및 MHC-1 항원 프로세싱의 전사적 시그니처를 감소시켰는데(도 7a), 이는 T 세포 프라이밍 결핍을 나타낸다. 일관되게, Il33 - / - 동소위 마우스는 (피하 PDAC 마우스와는 달리), 전체 및 활성화된 종양-침윤 CD8 + T 세포의 빈도가 더 낮았고, 다른 면역 세포 빈도에는 일관된 변화가 없었고, 배수 림프절 (DLN)에서 중심 기억 CD8 + T 세포(TCM)가 감소하였으나 먼 림프절은 그렇지 않았다 (도 2c, 도 7c-e). ll33 +/+ 마우스에 비하여 Il33 - / - 마우스에서의 종양 크기 증가는 pan-T 세포 고갈 시 폐지되었고(도 2d), rIL33-처리된 Rag2 -/- PDAC 마우스에서 종양 무게의 차이는 없었는데(도 8a), 이는 IL33의 항-종양 효과가 T 세포 매개임을 확인하는 것이다. Il33 - / - 및 Il33 +/+ 마우스로부터의 동소위 종양도 유사한 조직학, 콜라겐 및 섬유아세포 함량을 가졌으나(도 8b-d), 시험관내 종양 세포에 대한 rIL33의 영향은 없었는데(도 8e-g), 이는 IL33가 종양이나 기질 세포에 직접적인 영향을 미치지 않았음을 나타낸다. 이러한 데이터는 IL33이 잠재적으로 TILC2를 활성화하여 CD8 + T 세포를 프라이밍함으로써 조직-특이적 암 면역을 활성화한다는 것을 입증하였다.
우리는 다음으로 다른 조직 부위에서 CD8 + T 세포 거부 항원 오브알부민을 발현하는 KPC 세포(KPC-OVA)의 거부 표현형을 대조함으로써 CD8 + T 세포에 대한 IL33의 효과가 조직-특이적인지 조사하였다. 흥미롭게도, Il33 +/+ 마우스의 70%는 동소위 KPC-OVA 종양을 거부한 반면, Il33 - / - 마우스의 0%가 거부하였다. 대조적으로, ll33 +/+ 및 Il33 - / - 마우스의 100%는 피하 KPC-OVA 종양을 거부하였다(도 2e). 이 표현형이 ILC2 결핍 및 비효과적인 CD8 + T 세포 프라이밍으로 인한 것인지 평가하기 위해, 우리는 ICOS+CD4+ T 세포를 보존하면서 디프테리아 독소-매개 ILC2 고갈을 허용하는 iCOS-T 마우스를 사용하여, ILC2를 급격히 고갈시키고 DLN에서 항원-특이적 CD8 + T 세포를 조사하였다16 (도 2f, 도 9a). ILC2 고갈은, 거부 평가 및 고갈 효능 시간의 차이를 고려할 때 Il33 - / - 마우스와 비교하여 예상되는 변동과 함께, 동소위 KPC-OVA 종양에서 더 높은 종양 거부율과 더 큰 종양 크기로 Il33 - / - 표현형을 요약했으며, 피하 종양에서는 차이가 없었다(도 2f). ILC2가 고갈된 동소위 KPC-OVA 마우스에서 테트라머(tetramer) 분석 결과, (Il33 - / - 마우스에서 볼 수 있는 것처럼) DLN과 비장에서 OVA-특이적 CD8+ T 세포의 감소와 DLN에서 CD8+ TCM 의 감소를 보여주었다 (도 2g, 도 9b, c). 따라서 ILC2-결핍은 부분적으로 IL33 결핍을 표현형모사하였다(phenocopy). CD8 + T 세포에 대한 IL33의 직접적인 영향을 배제할 수는 없지만, 종양내 CD8 + T 세포에서 ST2 발현은 발견되지 않았다(도 9d). 요약하면, 이러한 기능 상실 실험은 IL33-TILC2 축(axis)이 조직-특이적 CD8+ T 세포 PDAC 면역을 프라이밍한다는 것을 시사한다.
다음으로, rIL33 치료가 유사한 조직-특이적 항-종양 효과가 있는지 조사하기 위해, 우리는 rIL33이 동소위 PDAC 마우스에서 종양 확립을 방지하고 생존 기간을 연장하고, 피하 PDAC 마우스에는 영향을 미치지 않아 안락사가 필요한 진행성 종양 성장 및 궤양을 초래하고(도 3a) KPC-OVA PDAC 마우스에서 유사한 조직-특이적 항-종양 효과를 나타낸다는 것을 발견하였다 (도 10a). 유사하게, IL18R+ 피부 ILC214를 우선적으로 활성화하는 사이토카인인 rIL18은 IL18R+ ILC에 의해 침투된 피하 PDAC의 성장을 제한했지만, IL18R+ ILC가 없는 동소위 PDAC는 그렇지 않았다 (도 3b, 도 10b). rIL33은 DLN 및 동소위 PDAC 마우스의 종양에서 ILC2를 선택적으로 확장하였으나(도 3c), 비장이나 피하 PDAC에는 변화가 없었다 (도 10c, d). ILC2 확장은, 비록 이들의 기능의 잠재적인 조절을 배제할 수는 없지만, 향상된 종양내 CD8+ T 세포 사이토카인 능력 및 PD-1 상향 조절을 동반하되(도 10e), 다른 종양내 면역 세포에서는 일관된 변화가 없었다(도 10f). 항-종양 CD8+ T 세포를 간접적으로 프라이밍하는 ILC2와 일치하게, rIL33 처리는 CD8+ T 세포를 PDAC로 프라이밍하고 모집하는 종양내 CD103+ 수지상 세포(DC)를 두 배로 늘렸다6(도 3d, 도 10g). rIL33의 효과가 ILC2에 의존하는지 확인하기 위해, 우리는 ILC2가 구성적으로 결핍된 PDAC-보유 Rora fl/fl Il7r Cre/+ 마우스에 rIL33을 투여하였다16. ILC2 결핍(도 10h)은 rIL33 효능을 폐지하였고 (도 3e) 종양에서 CD103+ DC의 감소된 증가를 나타내었다 (도 3f). rIL33 또한 항-종양 효과가 없었고(도 3g) CD103+ DC-결핍 Batf3 -/- 마우스에서 종양내 CD8+ T 세포 PD-1 발현(도 10i)을 유도하지 못하여, CD103+ DC가 rIL33-매개된 종양 조절에 필수적임을 확립하였다. TILC2가 DC를 종양으로 모집하기 위해 케모카인을 생성하는지 확인하기 위해, 단일-세포 RNA-seq (scRNA-seq)(도 11a-c)를 사용하였고, 활성화된 TILC2 및 DLN ILC2가 ILC2 동일성의 마커를 유지하지만 별개의 전사 프로파일을 나타내는 것과(도 12a-e), rIL33-활성화 TILC2가, CD103+ DC를 종양으로 모집하는 케모카인을 코딩하고17 시험관 내에서 효율적인 DC 이동을 유도하는(도 3h) Ccl5를 선택적으로 발현하는 것을 발견하였다. 요약하면, 이러한 데이터는 rIL33이, 잠재적으로 Ccl5 생산을 통해, TILC2를 확장하여 CD103+ DC를 종양으로 모집하고, CD8+ T 세포를 활성화하여 치료적 종양 면역을 유도함을 시사한다.
PD-1 차단은 TILC2를 활성화한다.
rIL33으로 ILC2를 자극하면 항-종양 효과가 있기 때문에, ILC2 활성화를 추가로 높일 수 있는 전략을 찾았다. 최근 데이터에 따르면, T 세포와 마찬가지로 ILC2도 공동억제2,18 면역 체크포인트 경로를 통해 이들의 활성을 조절한다. 구체적으로, 면역 체크포인트 PD-1은 마우스 ILC2 발달19을 조절하고, 이펙터 ILC19를 표시하며, 유전적으로 결핍되거나 차단 항체 (αPD-1)로 억제될 때 IL33-활성화 ILC2는 마우스와 인간에서 더 큰 확장 및 이펙터 기능을 나타낸다20. PD-1+ILC2는 인간 종양에서도 발견된다2. 그러나, 암 치료를 위한 동시적 ILC2 활성화 및 억제는 상대적으로 탐구되지 않았다.
scRNA-seq(도 11a-c)를 사용하여, PD-1이 기준선에서 TILC2에 의해 발현되는 유일한 검출가능한 공동억제 분자임을 발견하였다(도 13a). rIL33 처리는 TILC2 분획에서 PD-1을 상향 조절했지만 DLN ILC2에서는 그렇지 않았는데(도 13b), 이는 PD-1이 활성화된 TILC2를 기능적으로 억제할 수 있음을 시사한다. 따라서 우리는 rIL33과 αPD-1 의 조합이 TILC2를 협력적으로 활성화하여 항-종양 효능을 향상시킬 수 있는지 조사하였다. rIL33-활성화 TILC2에서만 PD-1 발현과 일치하게, αPD-1 단독은, PDAC에서 이전에 보고된 바와 같이6 부분 반응을 유도했지만(도 4a), TILC2 빈도를 크게 변경하지 않았다(도 4b, 도 13c). rIL33과 αPD-1 의 조합은 종양 및 DLN에서 ILC2을 최대로 확장시키고 (도 4b), αPD-1 단독과 비교하여 종양 조절을 향상시켰다(도 4a). αPD-1 이 세포-고유 PD-1 차단에 의해 ILC2를 활성화하는지 알아보기 위해, 생체내 치료 후 TILC2와 DLN ILC2의 단일-세포 전사 프로파일을 비교하였다. TILC2는 처리에 관계없이 ILC2의 전사 및 세포 동일성을 유지했지만(도 13d), rIL33 및 αPD-1 처리된 PDAC 마우스에서의 TILC2는 다른 모든 조건과 비교하여 독특한 전사 표현형을 가졌으며(도 4c), ILC2-특이적 마커, 표준(암피레귤린[Areg])14 및 비표준(CXCL2)21 이펙터 분자, 세포 활성화 기구(Junb, Fosl2, Ybx1) 및 공동억제 면역 체크포인트의 발현이 증가하였다(도 13e-i). 마지막으로, 이중 요법의 항-종양 효과는 ILC2-결핍 마우스에서 폐지되었으며(도 4d), 이는 ILC2가 이중 요법(αPD-1 및 rIL33 요법)의 효능에 필요함을 입증한다. 이러한 결과는 αPD-1 가 T 세포에서만이 아니라 ILC2에서 PD-1 경로를 억제할 수 있어 활성화된 TILC2를 우선적으로 증폭함을 제시한다.
PD-1 TILC2 억제는 세포-고유한 것이다
활성화된 TILC2에 대한 세포-고유 PD-1 경로 중단이 이중 요법의 항-종양 효과에 기여했는지 확인하기 위해, 분류-정제된 rIL33-활성화 PD-1-숙련(PD-1-proficient)(야생형[WT]) 또는 PD-1 결핍(Pdcd1 -/-) TILC2를 종양 보유 ILC2-결핍 마우스로 이식하였다(도 4e, 도 14a). WT TILC2 이식은 확립된 종양에서 항-종양 효능이 없었지만, Pdcd1 -/- TILC2는 종양 성장을 제한하였는데, 이는 TILC2에서 PD-1 신호 전달을 방해하면 종양 제어를 향상시킬 수 있음을 나타낸다(도 4e). 다음으로 rIL33-활성화 PD-1+ TILC2가 확립된 종양에서 αPD-1 요법의 효능을 직접적으로 증폭할 수 있는지 테스트하였다. 분류-정제된 rIL33-활성화된 유사유전자형(congenic) CD45.1+ TILC2를 종양이 확립된 CD45.2+ ILC2-결핍 마우스로 이식하고 αPD-1 를 이식후 처리하였다(post-transfer) (도 4f). 이식된 TILC2는 >97% PD-1+ (도 10b)이었고 이식 후 최대 9주까지 지속적으로 αPD-1 처리된 수용자 마우스의 종양 및 DLN에 축적되었으나 비장에는 축적되지 않았다 (도 4g). PD-1+ TILC2 이식으로 수용자 세포의 αPD-1 효능이 증가하고, 종양 성장이 제한되고, 종양 및 DLN에서 T 세포빈도가 증가하였으나, 비장에서는 그렇지 않았다 (도 4h). 이러한 데이터는 rIL33-활성화 TILC2에 대한 PD-1 신호전달의 차단이 직접적인 항-종양 효과를 갖고 αPD-1 효능을 증폭시켰음을 종합적으로 입증한다.
IL33Low αPD-1-내성 종양에서 rIL33 및 αPD-1 효능을 조사하기 위해, IL33Low 종양을 생성하고(도 6b) CD8+T 세포가 50% 더 적고 2주의 중앙 생존 기간을 가짐으로써(도 14c) IL33Low 단기 인간 PDAC 생존자의 면역학적 및 생존 특징을 모방하는, 공격적인 "차가운(cold)" PDAC 모델(KPC 52)을 선택하였다. KPC 52 PDAC 마우스는 자발적(spontaneous) KPC 마우스에서 볼 수 있는 바와 같이 사전-침습성 신생물에서 침습성 PDAC에 이르는 PDAC 종양형성의 순차적 단계를 나타내지 않지만, 자발적 KPC 마우스 및 인간 PDAC에서 볼 수 있는 αPD-1 내성을 나타낸다 (도 4i). 우리는 rIL33과 αPD-1 의 조합이 종양 부피를 거의 40%까지 감소시키고, 마우스 생존은 거의 50% 개선했음을 발견하였다(도 4i). 마지막으로, PDAC 환자를 이중 rIL33 및 αPD-1 요법으로 치료할 수 있는 가능성을 평가하기 위해, 인간 PDAC의 거의 60%에서 PD-1+ TILC2 및 PD-1+ T 세포의 빈도가 낮고, 두 세포 유형 사이에 유의적인 상관관계가 있음을 발견하였는데(도 14d), 이는 이들이 인간 PDAC에서 빈번하게 동시-발생함을 시사한다. 또한, IL33 mRNA는 더 긴 생존과 관련되어 있는 PD-1 mRNA와 유의하게 상관관계가 있는데(도 14e), 이는 IL33-PD-1 축이 인간 PDAC 생존에 긍정적인 영향을 미칠 수 있음을 시사한다. 요약하면, rIL33으로 ILC2를 활성화하면 PD-1 부분적으로 민감한 종양과 PD-1 내성 종양 모두에서 αPD-1 에 대한 반응을 증폭할 수 있다.
논의
우리의 결과는 ILC2를 활성화하는 것이 ILC2-침윤된 암에서 T 세포 프라이밍을 향상시키는 광범위한 전략이 될 수 있음을 시사한다(도 14f). 그러나, ILC2의 조직-특이적 표현형을 고려할 때, ILC2를 활성화하는 것이 다양한 암에 걸쳐 유사한 효과를 가질 것인지 여부는 추가 연구가 필요한다.
ILC2는 면역 체크포인트를 발현할 수 있지만, 면역 체크포인트차단 요법에 의해 활용되는 능력은 아직 불분명한다. 우리는 활성화된 ILC2에서 PD-1을 차단하는 것이 항-종양 효과가 있음을 확인하였는데, 에는 ILC2가 인간 암에서 PD-1 경로 차단의 효능에 부분적으로 기여할 수 있음을 시사하고, 차등 체크포인트 차단 반응이 조직-특이적 요인에 의존할 수 있음을 보다 광범위하게 강조한다.
활성화된 ILC2에 의한 여러 면역 조절 분자의 발현(도 14g)은, 보다 광범위한 체크포인트 어레이가 종양에서 ILC2 및 T 세포를 표적으로 할 수 있음을 시사한다. ILC2와 T 세포는 공동자극 및 공동억제 경로를 공유하는 인간 암에 공존하므로, 암 면역요법을 위해 ILC2와 T 세포를 집합적으로 표적화하는 전략이 필요하다.
이 실시예에 제시된 데이터는 본 발명자들이 Nature 저널에 발표하였다(Moral et al., "ILC2s amplify PD-1 blockade by activating tissue-specific cancer immunity," Nature, 2020, Mar, Vol. 579(7797), pp 130-135.doi: 10.1038/s41586-020-2015-4, Epub 2020 Feb 19.) 보충 자료를 포함한 이 간행물의 전체 내용이 본원에 참조에 의해 통합된다.
실시예 2
실험재료 및 방법
본 실시예는 실시예 1에 기재된 실험을 수행하는데 사용된 실험재료 및 방법을 기술한다.
마우스
C57BL/6 야생형, WT, CD45.2), C57BL/6 CD45.1, Rag2 -/-, Rag2 -/- γc -/-, Batf3 -/-, 및 Pdcd1 -/- 마우스는 잭슨 연구소에서 구입하였다 Il33 -/-, Il33 Cit/+ 은 M.J. 에게 선물받았다. Rosen. Cd4 Cre/+ Icos fl-Dtr/+ 및 Il7r Cre/+ Rora fl/fl 는 A.N.J. McKenzie 에게 선물받았고 이전에 설명되어 있다16,23. 모든 실험에서 6-12주령 마우스는 연령과 성별을 기준으로 짝을 이루고 무작위로 특정 처리 그룹에 할당되었으며 전체에 걸쳐 최소 2회의 독립적인 실험이 수행하였다. Pdx1-Cre;LSL-Kras G12D/+ ;LSL-Trp53 R172H/+ (KPC 마우스)는 이전에 설명되어 있다4. 실험을 위한 표본 크기는 공식적인 검정력 계산 없이 결정하였다. 동물은 특정 병원체 없는 동물 시설에서 사육 및 유지되었으며, 모든 실험은 메모리얼 슬론 케터링 암 센터(Memorial Sloan Kettering Cancer Center, MSKCC)에서 기관동물관리 및 사용위원회(IACUC) 승인 프로토콜에 따라 수행되었으며 모든 관련 윤리 규정을 준수하였다.
세포주 및 동물 실험절차
모든 종양 세포주는 KPC 마우스에서 유래되었다. Pdx1-Cre;LSL-Kras G12D/+ ;LSL-Trp53 R172H/+ (R.H. Vonderheide의 선물)의 KPC 4662 세포를 GFP로 형질감염시키고, 달리 지시되지 않는 한 모든 실험에 사용하였다. Ptf1a-Cre;LSL-Kras G12D/+ ;LSL-Trp53 R172H/+ 마우스에서 유래한 KPC 8-1, 18-3, 및 52 세포는 C. Iacobuzio-Donahue 에게 선물받았다. OVA 를 발현하도록 조작된 KPC 4662 세포는 이전에 기술되어 있다24 (R.H.Vonderheide의 선물). 모든 세포주는 전담 췌장암 병리학자에 의한 조직병리학적 검증을 기반으로 하여 bonafide PDAC 세포주로 인증되었다. KPC 4662 세포를 이용하여 확립된 동소위 종양은 IL33High 이었고 이식 시 시작된 αPD-1 요법으로 크기가 일시적으로 감소하였다(αPD-1 부분 민감성). KPC 52 세포를 이용해 확립된 동소위 종양은 IL33Low 이었고 이식 시 시작된 αPD-1 요법으로으로 크기가 감소하지 않았다(PD-1 내성). 모든 세포주는 MycoAlert Mycoplasma Detection Kit(Lonza)를 사용하여 정기적으로 테스트되었다. 동소위 PDAC 종양은 이전에 기술된 바와 같이 확립되었다5. 간단히 말해서, 케타민/자일라진 칵테일을 사용하여 마우스를 마취시키고 왼쪽 복부를 작게(7mm) 절개 하였다. 종양 세포(106 KPC 세포/마우스; 1.25 x 105KPC-OVA 세포/마우스)를 Matrigel (Becton Dickinson)에 현탁하고, 차가운 인산염-완충 식염수(PBS)로 1:1 희석하고(총 부피 50ml), 26-게이지 바늘을 사용하여 췌장 꼬리에 주입하였다. 성공적인 주입은 복강 내 누출 없이 유체 기포의 출현으로 확인되었다. 복벽은 흡수성 Vicryl RAPIDE 봉합사(Ethicon)로 봉합하고 피부는 상처 클립(Roboz)으로 봉합하였다. 피하 PDAC 종양의 경우, 종양 세포(106 KPC 세포/마우스; 1.25 x 105 KPC-OVA 세포/마우스)를 멸균 PBS(Fisher Scientific)에 재현탁하고 피하 이식하였다. 표시된 시점에서 마우스를 희생시키고 조직학 또는 유세포 분석을 위해 처리하였다. 자생적(autochthonous) KPC 마우스는 초음파로 종양을 감지할 수 있을 때 희생하였다. 종양 부피는 이전에 기술된 대로25 동소위 종양에 대해 직렬 초음파(Vevo 2100 Linear Array Imaging and Vivo LAB Version 3.1.1, Fuji Film Visual Sonics)를 사용하여 측정하였다. 피하 종양의 경우, 종양 길이와 너비를 2-3일마다 캘리퍼스로 측정하고, 종양 부피를 부피 = 1/2 길이 × 너비2로 계산하였다. 생존 분석의 경우, 생존은 ≥500 mm3 의 부피 또는 기관 IACUC 가이드라인에 정의된 안락사가 필요한 마우스 건강에 의해 결정하였다. 어떤 마우스 종양도 IACUC에서 정의한 최대 종양 부피 ≥2 cm3 을 초과하지 않았다. 실험적 마우스 개입에서는 블라인딩(blinding)이 수행되지 않았는데, 이는 처리 그룹에 대한 지식이 필요했기 때문이다.
T 세포 고갈
CD4 및 CD8 세포는 250mg의 항-마우스 CD4 항체(클론 GK1.5, BioXcell, InVivoPlus) 및 250mg의 항-마우스 CD8a 항체(클론 2.43, BioXcell, InVivoPlus)의 복강내(ip) 주사에 의해 고갈시켰다. 대조군 마우스는 래트 IgG2b 이소형 대조군(클론 LTF-2, BioXcell, InVivoPlus)으로 처리하였다. 마우스는 종양 이식 전 3일 동안 매일 처리되었고, 그 다음 실험 기간 동안 3일마다 처리되었다. CD4+ 및 CD8+ T 세포 고갈은 종양 및 이차 림프 기관의 유세포 분석에 의해 확인하였다 (>85% 고갈).
ILC 고갈
ILC는 이전에 기술된 바와 같이26 종양 이식 후 0, 1, 3, 6, 9 및 13일에 300mg의 항-마우스 CD90.2(클론 30-H12, BioXCell) 을 i.p.주입함으로써 Rag2 -/- 마우스에서 고갈시켰다. ILC2는 Cd4 Cre/+ Icos fl-DTR/+ 실험용 마우스와 Cd4 Cre/+ Icos +/+ 대조군 마우스에 마우스 체중 그램당 25ng의 용량으로 디프테리아 독소(Sigma Aldrich) 를 i.p. 주사로 처리하여 고갈시켰다. 마우스는 이전에 기술된 바와 같이16 종양 이식 전날 처리한 다음 이틀에 한 번씩 총 5회 투여하였다. ILC2 고갈은 종양의 유세포 분석에 의해 확인하였다(도 9a).
골수 키메라
CD45.2 유전적 표지(congenically labeled) 공여자 마우스로부터 골수를 채취하고, 70mm 필터를 통해 여과하고, 원심분리하고, 멸균 PBS에 200l 당 108개 살아있는 세포의 농도로 재현탁시켰다. CD45.1 유전적으로 표지된 (congenically labeled) C57BL/6J 수용자 마우스는 골수 이식 24시간 전에 방사선 조사(5.5 Gy x 2, 6시간 간격)되었고 방사선 조사 후 4주 동안 엔도플록사신 물에서 유지되었다. 멸균 PBS 중 CD45.2 골수 키메라의 단일-세포 현탁액(수용자 마우스당 108개의 살아있는 세포)을 안와후주사(retroorbital injection)에 의해 각 수용자 마우스에 이식하였다. 재구성은 이식 후 4주 및 8주에 말초 혈액의 유세포 분석에 의해 확인하였다. 종양 이식 실험은 이식 후 12주에 수행하였다.
재조합 IL33, IL18 및 PD-1 차단
rIL33의 경우, 이전에 기술된 바와 같이15 마우스를 무균 PBS 중의 500 ng의 무-캐리어 재조합 쥐 IL33 (R&D 시스템)을 매일 복강 내 주사(i.p.)로 7일 동안, 그 후 2일에 한 번씩 처리하였다. rIL18의 경우, 이전에 기술된 바와 같이27 마우스를 무균 PBS 중의 2 mg 의 무-캐리어 재조합 쥐 IL-18 (R&D 시스템)을 종양 접종 후 3, 7, 11 및 15일에 i.p. 주사로 처리하였다. 마우스 IgG1 이소타입 모노클로날 항체(mAb)로 조작된 본 연구에서 사용된 키메라 항-마우스 PD-1 항체(4H2)는, PD-1을 발현하는 CHO 형질감염체에 결합하고 PD-L1 및 PD-L2가 이들 세포에 결합하는 것을 차단하는 것으로 나타났다. PD-1-Fc를 사용하여 표면 플라즈몬 공명에 의해 결정된 마우스 PD-1에 대한 4H2의 친화도는 4.68×10-9 M이었다. 항체는 BMS (Bristol Myers Squibb)에서 생산 및 정제되었다. 각 배치는 <0.5 EU/mg 내독소를 갖고 >95% 순도인 것으로 인증되었다. 모든 투여 용액은 PBS에서 제조되었다. 마우스는 250mg 항-PD1를 2일마다 i.p. 주사로 처치하였다. 지속적인 αPD-1 처치 중 종양 크기의 일시적인 감소는 있지만 재성장이 계속되는 경우 부분적 반응으로 정의하였다. 지속적인 αPD-1 처치 중 종양크기 감소가 없는 경우 내성으로 정의하였다.
인간 샘플
모든 조직은 MSKCC 기관검토위원회의 연구 프로토콜 승인에 따라 MSKCC에서 수집되었다. 모든 환자에 대해 사전 동의를 얻었다. 본 연구는 모든 제도적 윤리 규정을 엄격하게 준수하여 수행하였다. 모든 종양 샘플은 외과적으로 절제된 원발성 PDAC였다.
조직 마이크로어레이: 조직 마이크로어레이(TMA)는 이전에 기술된 바와 같이3 PDAC의 단기 생존자(n=45 종양, n=5 정상 조직) 및 장기 생존자(n=51 종양, n=5 정상 조직)의 포르말린-고정, 파라핀-포매 조직 블록에서 종양 및 인접 비종양 코어로 구성되었다. 환자 하위집합은 조직 마이크로어레이를 위해 무작위로 선택되었다. 선행 항암화학요법(neoadjuvant chemotherapy) 으로 치료받은 환자는 제외하였다. 모든 종양은 분석 전에 두 명의 전문 PDAC 병리학자에 의해 병리학적 재검토 및 조직학적 확인을 거쳤다. 장기 생존자는 전체 생존 기간이 수술 후 >3년인 환자로, 단기 생존자는 수술 후 생존 기간이 >3개월 및 <1 미만인 환자로 정의하여 수술 전후 사망률을 제외하였다. ILC2High 및 ILC2Low 는 각각 전체 TMA 코호트에 대한 중간 ILC2 빈도보다 크거나 적은 것으로 정의되었다.
종양 전사체 프로파일링: 이전에 기술된 바와 같이3 전사체 프로파일링을 수행하기 위해 환자 서브세트를 무작위로 선택하였다. 전사체 평가에 이용가능한 종양 조직을 가진 TMA 코호트의 환자를 도 10의 분석에 포함시켜 RNA 발현의 단백질을 확인하였다. 추출된 RNA를 Agilent BioAnalyzer에서 검증하고 형광측정법(Ribogreen)으로 정량화하였다. 전체 전사체 발현 분석을 위한 RNA의 준비는 WT Pico Reagent Kit(Affymetrix)를 사용하여 수행하였다. 역전사는 폴리-A 꼬리뿐만 아니라 RNA의 전체 길이에 걸쳐 개시되어 코딩 및 비-코딩 RNA의 다중 형태 모두를 포획하였다. RNA 증폭은 저-주기 PCR을 사용한 후 T7 시험관내 전사 기술을 사용한 선형 증폭을 사용하여 달성하였다. 그런 다음 cRNA는 비오틴화된 센스-가닥 DNA 혼성화 표적으로 전환하였다. 준비된 타겟을 GeneChip Human Transcriptome Array 2.0(Affymetrix)에 혼성화하였다. Fluidics Station 450/250을 사용하여 GeneChip 혼성화, 세척 및 염색 키트를 사용하여 세척을 수행하였다. GeneChip Scanner 3000을 사용하여 어레이를 스캔하였다. 어레이에 대한 데이터 분석은 Affymetrix Expression Console Software(어레이 프로브 세트의 신호를 요약하기 위한 SST-RMA 알고리즘)를 사용하여 수행하였다. 면역 세포용해 활성은 이전에 기술된 바와 같이 결정하였다28.
세포 단리
마우스 및 인간 PDAC 종양 및 인접 췌장을 기계적으로 분리하고 콜라게나제(쥐 종양의 경우 콜라게나제 II, 인간 종양의 경우 콜라게나제 IV, 둘 다 5mg/ml; Worthington Biochemical Corp., Fisher Scientific), DNAse I (0.5mg/ml; Roche Diagnostics), 및 Hank의 균형 염 용액(Gibco, Fisher Scientific)을 37℃ 에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 그 다음, 소태아 혈청(FBS, Life Technologies)으로 분해(digestion)를 켄칭하고, 세포를 100- 및 40-mm 나일론 세포 여과기(Falcon, Fisher Scientific)를 통해 순차적으로 여과하였다. 종양, 인접한 췌장 및 림프절을 기계적으로 분리하고 1% FBS(Life Technologies)가 포함된 PBS를 사용하여 100- 및 40-mm 나일론 세포 여과기(Falcon, Fisher Scientific)를 통해 여과하였다. 비장을 기계적으로 분리하고 1% FBS가 포함된 PBS를 사용하여 70mm 및 40mm 나일론 세포 여과기(Falcon, Fisher Scientific)를 통해 여과한 후 RBC 용해(RBC 용해 완충액, ThermoFisher Scientific)를 수행하였다. 마우스 Fc 수용체는 FceRIII/II-특이적 항체(1 x 106 세포당 1mg, 클론 2.4G2, Bio X Cell)로 차단하였다.
ILC2 입양 전달(adoptive transfer)
CD45.1 C57Bl/6 또는 Pdcd1 -/- 동소위 PDAC 마우스는 멸균 PBS 중 500ng의 무-캐리어 재조합 쥐 IL33 (R&D Systems)로 매일 10일간 처리하였다. 살아있는, CD45+, lineage-, CD90+, CD25+, ST2+ TILC2를 이식 후 10일째에 Aria Cell 분류기(BD Biosciences)를 사용하여 98% 순도로 분류-정제하였다. 5 x 105 종양 ILC2를 i.p. 주사를 통해 종양 이식 후 7일 및 14일에 동소위 PDAC 종양-보유 Il7r Cre/+ Rora fl/fl CD45.2 마우스로 즉시 이식하였다. 대조군 마우스는 동일한 부피의 PBS를 i.p.주사받았다. 수용자 마우스에서 αPD-1 치료는 ILC2 세포 이식 당일에 시작되었다. 표시된 시점에서 조직을 수확하였다.
유세포분석
단일-세포 현탁액을 4℃의 암실에서 항체 칵테일을 사용하여 염색하고 세척하고 FACS LSR Fortessa(BD Biosciences)에서 분석하였다. 마우스 ILC는 이전에 기술된 바와 같이7,1 살아있는, CD45+, lineage- (CD3, CD5, NK1.1, CD11b, CD11c, CD19, FceR1), CD25+, CD127+ 세포로 정의되었다. 마우스 면역 세포는 다음과 같이 정의되었다: ILC2s = 살아있는, CD45+, lineage- CD25+, ST2+ 세포; 중심 메모리 T 세포 = 살아있는, CD45+, CD3+, NK1.1-, CD8+, CD62l+, CD44+; 수지상 세포 = 살아있는, CD45+, CD3-, NK1.1-, Gr1-, F4/80-, CD11c+, MHC-II+; B 세포 = 살아있는, CD45+, CD3-, CD19+; T 세포 = 살아있는, CD45+, CD3+; CD4+ T 세포 = 살아있는, CD45+, CD3+, CD4+; CD8+ T 세포 = 살아있는, CD45+, CD3+, CD8+; 조절성 T 세포 = 살아있는, CD45+, CD3+, CD4+ FoxP3+; 종양 연관된 대식세포 = 살아있는, CD45+, CD11b+, F480+, GR1-; 골수 유래 억제자 세포(MDSCs) = 살아있는, CD45+, CD3-, CD11b+, F480-, GR1+. 쥐 세포를 다음 항체로 염색하였다: Biolegend 로부터, CD45 (clone 30-F11, Pacific Blue), CD45.1 (clone A20, BV711), NK1.1 (clone PK136, APC), Gr-1 (clone RB6-8C5, BV605), CD103 (clone 2E7, BV711); BD Biosciences 로부터, CD5 (clone 53-7.3, APC), CD11c (clone HL3, APC), NK1.1 (clone PK136, BV605), CD4 (clone RM4-5, BV786), CD62L (clone MEL-14, APC), CD19 (clone 1D3, BV510), Ly6C (clone AL-21, PerCP-Cy5.5), Ly6G (clone 1A8, AF700), PD1 (clone J43 BV605), TNF-a (clone MP6-XT22, BV510), IFN-γ (clone XMG1.2, APC-Cy7), CD90.2 (clone 53-2.1, BV786), Tbet (clone Q4-46, BV711), Rorγ-t (clone Q31-378, BV786), Gata3 (clone L50-823, PE-Cy7), and IL4 (clone 11B11, BV650); ThermoFisher Scientific 로부터, CD3 (clone 17A2, Alexa Fluor 700), CD11b (clone M1/70, APC), CD11b (clone M1/70, PerCP-Cy5.5), CD8 (clone 53-6.7, Alexa Fluor 700), CD19 (clone 1D3, Alexa Fluor 700), FceR1 (clone MAR-1, APC), F4/80 (clone BM8, PE-Cy5), CD3 (clone 145-2C11, PE-Cy7), MHC-II (clone M5/114.15.2, Alexa Fluor 700), CD44 (clone IM7, PerCP-Cy5.5), CD127 (clone A7R34, FITC), CD25 (clone PC61.5, PerCP-Cy5.5), IL5 (clone TRFK5, PE), CD86 (clone GL1, PE), CD11c (clone N418, FITC), ST2 (clone RMST2-2, PE-Cy7), and FoxP3 (clone FJK-16S, APC); 및 MBL international 로부터, SINFEKL tetramer (catalog # TB-5001-1, PE).
인간 ILC는 이전에 기술된 바와 같이7 살아있는 CD45+, lineage- (CD3, CD5, CD56, CD11b, CD11c, CD16, CD19, TCRa/b, FceR1), CD25+, CD127+ 세포로 정의되었다. 인간 세포를 다음 항체로 염색하였다: BD Biosciences로부터, GATA3 (clone L50-823, BV711), TBET (clone O4-46, BV650), RORγ-T (clone Q21-559, PE); Biolegend로부터, CRTH2 (clone BM16, PE-Cy7), CD11b (clone ICRF44, APC), CD56 (clone NCAM16.2, BV650), CD25 (clone BC96, PerCP-Cy5.5), CD45 (clone HI30, Pacific Blue), TCRa/b (clone IP26, APC); ThermoFisher Scientific로부터, CD16 (clone CB16, APC), CD11c (clone 3.9, APC), CD127 (clone RDR5, FITC), CD3 (clone OKT3, Alexa Fluor 700), ST2 (clone hIL33Rcap, PE), CD5 (clone L17F12, APC), CD19 (clone HIB19, AF700), FceR1 (clone AER-37, APC). IL33에 대한 인간 특이적 항체(클론 390412, PE)는 @@@ 에서 구입하였다. 유세포 분석을 위한 모든 샘플은 선택되지 않은 PDAC 환자로부터 전향적으로 수집하였다.
세포 내 사이토카인 생산을 조사하기 위해, 종양의 단일-세포 현탁액을 37℃에서 브레펠딘 A (10 μg/ml) (모두 Sigma-Aldrich로부터 입수) 의 존재 하에 포르볼 12-미리스테이트 (PMA, 100 ng/ml) 및 이오노마이신(1ng/ml)을 생체외에서 6시간 자극하였다. 그런 다음 세포를 제조업체의 권장 사항(Invitrogen, ThermoFisher Scientific)에 따라 고정 및 투과성 버퍼 키트를 사용하여 사이토카인 생산을 위해 표면-염색, 고정, 투과화하고 염색하였다. 표시된 대로 적절한 이소타입 대조군을 사용하였다. FlowJo(버전 9 및 10, Tree Star)에서 분석을 수행하였다.
면역조직화학
조직을 파라포름알데히드(Fisher Scientific)에서 24시간 동안 고정하고 파라핀에 포매하였다. 조직 절편을 EZPrep 완충액(Ventana Medical Systems)으로 탈파라핀화한 다음, CC1 완충액(Ventana Medical Systems)으로 항원 복구(antigen retrieval)를 수행하였다. 절편을 Background Buster 용액(Innovex)으로 30분 동안 차단한 다음, 8분 동안 아비딘-비오틴 차단(Ventana Medical Systems)을 수행하였다. 마우스 IL33 (AF3626, R&D Systems), 마우스 평활근 액틴(Abcam) 및 인간 IL33 (AF3625, R&D Systems) 항체를 적용하고, 졀편들을 4시간 동안 인큐베이션한 후, 비오틴화된 토끼 항- 염소 IgG(Vector labs) 또는 1:200 희석의 비오틴화된 염소 항-토끼 IgG(Vector labs)로 60분 인큐베이션하였다. 제조업체의 지침에 따라 DAB 감지 키트(Ventana Medical Systems)를 사용하여 검출을 수행하였다. IL33에 대한 세포질 또는 핵 양성을 나타내는 세포를 포함하는 절편은 양성 염색을 갖는 것으로 지정되었다. 슬라이드는 메이슨 트리크롬(Masson's trichrome) 또는 헤마톡실린과 에오신으로 대조염색하고 Permount(Fisher Scientific)로 커버 슬립하였다. 모든 조직학적 절편은 독립적인 PDAC 병리학자가 평가하였다.
면역형광
마우스
IL33/CD11b/CK19/Iba1 면역형광: 다중 면역형광 염색은 이전에 설명된 대로29 Discovery XT 프로세서(Ventana Medical Systems)를 사용하여 수행하였다.
IL33: 먼저, 절편들을 항-mIL33 (R&D Systems, 카탈로그#AF3626, 1μg/ml)과 함께 4시간 동안 인큐베이션한 다음, 1:200 희석의 비오틴화된 말 항-염소 IgG(Vector Laboratories)와 함께 60분 동안 인큐베이션하였다. 검출은 스트렙타비딘-HRP D (DABMap 키트의 일부, Ventana Medical Systems)를 이용해 수행한 다음, 미리 정해진 희석액과 함께 제조업체의 지침에 따라 준비한 Tyramide Alexa Fluor 488(Invitrogen)과 함께 인큐베이션하였다.
CD11b: 다음으로, 절편들을 항-CD11b(Abcam, 클론 EPR1544)와 함께 5시간 동안 인큐베이션한 다음, 1:200 희석의 비오틴화된 염소 항-토끼 IgG(Vector Laboratories)와 함께 60분 동안 인큐베이션하였다. 검출은 스트렙타비딘-HRP D (DABMap 키트의 일부, Ventana Medical Systems)를 이용해 수행한, 다음 미리 정해진 희석액과 함께 제조업체의 지침에 따라 준비한 Tyramide Alexa 594(Invitrogen)과 함께 인큐베이션하였다.
CK19: 다음으로, 슬라이드를 항-CK19(Abcam, 클론 EP1580Y)와 함께 5시간 동안 인큐베이션한 다음, 1:200 희석의 비오틴화된 염소 항-토끼(Vector Laboratories)와 함께 60분 동안 인큐베이션하였다. 스트렙타비딘-HRP D (DABMap 키트의 일부, Ventana Medical Systems)를 이용해 검출을 수행한 다음, 미리 정해진 희석액과 함께 제조업체의 지침에 따라 제조된 Tyramide Alexa Fluor 546(Invitrogen) 과 함께 인큐베이션하였다.
Iba1: 마지막으로, 절편들을 항-Iba1(Wako, 카탈로그 #019-19741)과 함께 5시간 동안 인큐베이션한 다음, 1:200 희석의 비오틴화된 염소 항-토끼 IgG(Vector Laboratories)와 함께 60분 동안 인큐베이션하였다. 스트렙타비딘-HRP D (DABMap 키트의 일부, Ventana Medical Systems)를 이용해 검출을 수행한 다음, 미리 정해진 희석액으로 제조업체의 지침에 따라 준비한 Tyramide Alexa 647(Invitrogen)과 함께 인큐베이션하였다. 염색 후, 슬라이드를 DAPI(Sigma Aldrich)로 10분 동안 대조염색하고 Mowiol로 커버 슬립하였다.
인간
조직 절편은 독점적인 Leica Bond 완충액(Leica Biosystems)으로 탈파라핀화하고, 항원 복구는 Leica Bond ER2 완충액(Leica Biosystems)으로 수행하였다. 먼저, 절편들을 항-PD-1 항체(Cell Marque, 클론 NAT105)와 함께 1시간 동안 인큐베이션한 후 Bond Polymer Refine Detection 키트(Leica Biosystems) 및 Tyramide Alexa Fluor 488(Invitrogen)을 이용해 검출하였다. 다음으로, 절편들을 항-CD3 항체(DAKO, 카탈로그 #A0452)와 함께 1시간 동안 인큐베이션한 후 Bond Polymer Refine Detection 키트(Leica Biosystems) 및 Tyramide CF594(Biotum)을 이용해 검출하였다. 다음으로, 절편들을 항-GATA3 항체(Cell Marque, 클론 L50-823)와 함께 1시간 동안 인큐베이션한 후 Bond Polymer Refine Detection 키트(Leica Biosystems) 및 CF 543(Biotum)을 이용해 검출하였다. 마지막으로, 절편들을 항-CD45 항체(DAKO, 클론 2B11 + PD7/26)와 함께 1시간 동안 인큐베이션한 후 Bond Polymer Refine Detection 키트(Leica Biosystems) 및 Tyramide Alexa Fluor 647(Invitrogen)을 이용해 검출하였다. 모든 검출은 미리 결정된 희석액으로 제조업체 지침에 따라 준비되었다. 염색 후, 슬라이드를 DAPI(Sigma Aldrich)로 10분 동안 대조염색하고 Mowiol로 커버 슬립하였다.
디지털 이미지 처리 및 분석
슬라이드는 A488, A546, A594 및 A647용 Zeiss 20x/0.8NA 대물렌즈와 맞춤형 필터를 사용하여 Panoramic Flash 250(3Dhistech, Budapest Hungary)을 사용하여 디지털화하였다. 각 코어는 다중 채널 tiff 파일로 내보내고 FIJI/ImageJ로 작성된 사용자 정의 매크로를 사용하여 분석하였다. 정량화를 위해, 적절한 처리 및 배경 제거 후 DAPI 채널을 사용하여 각 핵을 분할하였다. 그런 다음 각 유핵 세포에 대해, 각 마커에 대한 적절한 임계값을 설정한 후 다른 마커의 존재 여부를 평가하였다. 마커의 특정 조합을 가진 세포의 수를 집계하였다. ILC2는 CD45+ CD3- GATA3+ 유핵 세포로 정의되었고, PD-1 발현 ILC2는 CD45+ CD3- GATA3+ PD-1+ 유핵 세포로 정의되었으며, PD-1 발현 T 세포는 CD45+ CD3+ PD-1+ 유핵 세포로 정의되었다. 각 환자에 대해 모든 유핵 세포의 일부로서 각 세포 유형의 빈도를 3중 코어에서 계산한 다음, 환자당 최종 세포 빈도를 계산하기 위해 3중 코어의 평균 빈도를 결정하였다.
RNA 시퀀싱
마우스: 동소위 PDAC 마우스(n=6)의 조직을 수확하고 위에서 설명한 대로 단일-세포 현탁액으로 분리하였다. 종양-침윤 백혈구는 마우스 CD45 MicroBeads(Miltenyi Biotec)를 사용한 자기 활성화 세포 분류에 의해 양성으로 선택되었다. 자기적으로 활성화된 분류된 세포의 정제는 유세포 분석에 의해 확인되었으며 >95%였다. RNA는 RNeasy Plus Mini Kit(Qiagen)를 사용하여 분류된 세포에서 분리하였다. Poly(A) 캡처 및 paired-end RNA-seq는 MSKCC Integrated Genomics Core Facility에서 수행하였다. 구체적으로, Agilent BioAnalyzer에 의한 RiboGreen 정량화 및 품질 관리 후, Illumina(TruSeq Stranded mRNA LT Kit, 카탈로그 # RS-122-2102)에서 제공한 지침에 따라 총 RNA 500ng에 대해 polyA 선택 및 TruSeq 라이브러리 및 PCT 8 사이클을 수행하였다. 샘플은 HiSeq 3000/4000 SBS Kit(Illumina)를 사용하여 100bp/100bp paired-end 실행으로 HiSeq 4000에서 바코드화하고 실행하였다. 샘플당 평균 8,300만 쌍의 리드가 생성되었다. 리보솜 리드은 생성된 총 리드의 최대 0.03%를 나타내고 mRNA 염기의 백분율은 평균 76.6%이다. 발현 데이터세트는 Gene Set Enrichment Analysis(GSEA) 3.0에 로드하였다. 탐색적 발견을 용이하게 하기 위해 MSIGDB v6.1에서 ≤0.25 의 오류발견율로 항원 제시 및 T 세포 매개 면역을 위한 유전자 세트 데이터베이스를 선택하였다. GSEA는 1000개의 순열로 실행하였다. 3개의 유전자 세트 데이터베이스가 이 임계값을 충족하였다: GO 0002474 MHC 클래스 I을 통한 펩티드 항원의 항원 처리 및 제시, GO 0002711 T 세포 매개 면역의 양성 조절, 및 GSE19825 Naοve vs Day 3 Effector CD8 T Cell Up.
단일-세포 RNA 시퀀싱
단일-세포 면역 프로파일링, 시퀀싱 및 원시 데이터의 후처리를 위한 라이브러리 준비는 Weill Cornell Medicine의 Epigenomics Core에서 수행하였다.
단일-세포 RNA 라이브러리 준비 및 시퀀싱
비히클, IL33 단독, 및 IL33 + αPD-1 처리된 췌장 KPC 종양 및 장간막 DLN으로부터 형광 활성화된 세포(FAC)-분류된 ILC2 세포의 단일-세포 현탁액을 위에서 설명한 대로 준비하였다. scRNA-seq 라이브러리는 10X Genomics 사양에 따라 준비하였다 (Chromium Single Cell V(D)J User Guide PN-1000006, 10x Genomics, Pleasanton, CA, USA). 90-200 cells/ml 농도의 4개의 독립적인 세포 현탁액(85-90% 생존)을 10x Genomics Chromium 플랫폼에 로드하여 샘플 당 약 2,000개의 단일-세포를 표적으로 하는 겔 비드-인-에멀젼(GEM)을 생성하였다. GEM 생성 후, 샘플을 96-Deep Well Reaction Module(Bio-Rad, Hercules)이 있는 C1000 Touch Thermal 사이클러에서 53℃에서 45분 동안 인큐베이션하여, 세포 바코드 및 UMI(Unique Molecular Identifiers)에 연결된 템플릿 스위치 올리고(TSO) 추가에 의해 5' 말단에 바코딩된 polyA cDNA를 생성하였다. GEM이 파손되었고 단일 가닥 cDNA가 DynaBeads MyOne Silane Beads(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)로 정리되었다. cDNA를 16사이클 동안 증폭하였다(98℃에서 45초, 98℃에서 20초, 67℃에서 30초, 72℃에서 1시간). Agilent Bioanalyzer 2100 (Santa Clara, CA)을 사용하여 cDNA의 품질을 평가하여 약 1,200bp의 생성물을 얻었다. 50ng의 cDNA를 효소적으로 단편화하고, 말단을 수리하고, A-테일화하고, SPRIselect 비드(Beckman Coulter, Indianapolis, IN)를 사용하여 양면 크기 선택을 수행하고, 키트에 제공된 어댑터에 연결하였다. 키트에 제공된 인덱스를 사용하여 14사이클의 PCR 증폭을 통해 각 라이브러리에 대한 고유한 샘플 인덱스를 도입하였다(98℃에서 45초; 98℃에서 20초, 54℃에서 30초, 72℃에서 20초로 14 사이클; 72℃에서 1 분; 4℃에서 유지). 인덱싱된 라이브러리는 두 번째 양면 크기 선택을 거친 다음 Qubit 형광 정량화(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)를 사용하여 라이브러리를 정량화하였다.
Agilent Bioanalyzer 2100에서 품질을 평가한 결과 평균 라이브러리 크기가 450bp였다. 어떤 처리 샘플도 검출가능한 한계 미만의 농도를 나타내지 않았으며 cDNA 증폭은 18 사이클로, 샘플 인덱스는 16 사이클로 수행하였다. 라이브러리를 10nM으로 희석하고 페어 엔드 리드 플로우 셀에서 NovaSeq600을 사용하여 클러스터링하고 R1(10x 바코드 및 UMI)에서 28사이클 동안 시퀀싱한 다음, I7 인덱스(샘플 인덱스)의 8사이클 및 R2(transcript)에서 89개 염기를 시퀀싱하여, 약 천만에서 클러스터된 비히클-처리된 마우스의 종양을 제외하고, 샘플당 약 1억 클러스터를 얻었다. 시퀀싱 이미지의 1차 처리는 Illumina의 RTA(실시간 분석 소프트웨어)를 사용하여 수행하였다. 10x Genomics Cell Ranger Single Cell Software suite v3.0.2 (https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/what-is-cell-ranger) 를 사용하여 샘플 역다중화, 마우스 게놈 참조 mm10에 대한 정렬, 필터링, UMI 계수, 단일-세포 5' 말단 유전자 계수, 및 제조업체 매개변수를 사용한 품질 관리를 수행하였다. 품질 관리를 통과한 약 11,000개의 단일 세포로부터 데이터가 세포 당 약 41,000개의 평균 리드로 획득되었다(48% 시퀀싱 포화).
scRNA-seq 데이터 처리
Seurat R 패키지 버전 3.1 파이프라인은 결합된 데이터 세트30에서 클러스터를 식별하는 데 사용되었다. 먼저 개별 데이터 세트를 카운트 매트릭스로 R로 판독하고 Seurat 개체로 변환하여 ≥3개 세포 및 200개 이상의 검출된 유전자를 가진 세포에서 발현된 유전자를 선택하였다. 그런 다음 표준 전처리 워크플로를 사용하여 2,500개 이상 또는 200개 미만의 고유 유전자가 발현된 세포와 미토콘드리아 유전자 함량이 5% 이상인 세포를 제외하여 세포를 필터링하였다.
필터링 후, 샘플을 병합하고, 보유된 세포에 대한 유전자 발현 측정을 로그 변환하고, 세포당 총 발현으로 정규화하고, 세포당 10,000개 분자로 규모를 조정하였다. 그런 다음 단일-세포에서 상위 2,000개의 매우 가변적인 유전자를 식별하고 주성분(PC) 분석을 수행하였다. jackstraw 및 엘보우 플롯을 조사한 후, 클러스터 해상도가 0.4로 설정된 KNN (K-Nearest Neighbor) 클러스터링을 사용한 클러스터링을 위해 상위 15개 PC를 선택하여 모든 샘플-결합 및 종양-결합 병합 데이터 세트에서 6-8개의 클러스터를 식별하였다. UMAP을 사용한 비선형 차원 축소를 사용하여 역시 상위 15개 PC를 사용하는 데이터 세트를 시각화하였다. 클러스터 전반에 걸친 유전자 마커 발견을 위한 차등 유전자 발현은 Seurat 패키지에 사용된 Wilcoxon 순위 합계 테스트를 사용하여 수행하였다. Wilcoxon rank sum test를 이용한 pairwise 비교는 holm P 값 조정 방법으로 수행하여 샘플 간의 유전자 발현을 비교하였다.
시험관내 분석
KPC 4662-GFP 세포는 완전 배지에서 96-웰 평평한 바닥 플레이트(Falcon)에서 1주일 동안 배양되었다: L-글루타민(Gibco, ThermoFisher), 10% 소 태아 혈청(Life Technologies), 100 units/ml 페니실린, 100mg/ml 스트렙토마이신, 및 0, 10, 100 및 500ng/ml 농도의 재조합 IL33이 첨가된 RPMI-1640. 배양 배지 및 사이토카인을 48시간마다 보충하였다. 생존력은 제조업체의 지침에 따라 비색 테트라졸륨 염 분석(Cell Counting Kit, Dojindo Molecular Technologies)을 사용하여 측정하고 Synergy HT 다중 검출 마이크로플레이트 판독기(Biotek)에서 판독하였다. 세포를 수확하고 Annexin V (ThermoFisher Scientific), Ki-67 (클론 SolA15, ThermoFisher Scientific) 및 ST2 (클론 RMST2, ThermoFisher Scientific)에 대해 염색하였다. 모든 시험관내 실험의 경우 독립적인 실험당 2-3회의 기술 복제를 수행하였다.
시험관내 수지상 세포 이동 분석
쥐의 비장 DC는 제조업체의 프로토콜(Miltenyi Biotech)에 따라 마우스 pan DC 분리 키트를 사용하여 분리하고 농축하였다. 유세포 분석을 사용하여 DC 순도(살아있는 세포의 >70% CD11c+ )를 평가하였다. 세포를 50ng/ml의 재조합 마우스 GM-CSF(Biolegend)와 함께 5x105 세포/ml로 완전한 RPMI 배지에 밤새 플레이팅하였다. 비장 DC의 주화성은 트랜스웰 이동 분석에 의해 분석하였다. 100ng/ml의 재조합 마우스 Ccl5 (Biolegend)가 있거나 없는 600㎕의 RPMI를 5.0μm 공극 폴리카보네이트 멤브레인 삽입물(Sigma Aldrich)이 있는 6.5mm Transwell 플레이트의 하부 챔버에 첨가하였다. 200 μl 의 RPMI를 또한 상부 챔버에 첨가하고 플레이트를 15분 동안 5% CO2에서 37℃에서 평형화되도록 하였다. 그런 다음 100μl RPMI에 있는 1x105 비장 DC를 상부 챔버에 로드하고 5% CO2에서 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 멤브레인 삽입물을 조심스럽게 제거하고, 세포를 하부 챔버에서 수확하였다. 이동된 DC를 4℃에서 20분 동안 DAPI 및 CD11c 항체와 함께 인큐베이션하고 Precision Count Beads™(Biolegend)를 추가하여 제조업체의 프로토콜에 따라 유세포 분석을 사용하여 이동된 살아있는 CD11c+ 세포의 수를 정량화하였다.
통계
데이터는 중앙값으로 표시된다. 사전 표본 크기 계산 없이 데이터에서 많은 통계적으로 유의한 효과를 관찰했기 때문에 표본 크기를 결정하는 데 통계적 방법을 사용하지 않았다. 두 그룹 간의 비교는 여러 시점 비교(양측)를 위해 Benjamini-Krieger-Yekutieli 오류 발견 접근 방식과 unpaired Mann-Whitney 테스트를 사용하여 수행하였다.여러 그룹 간의 비교는 1-way ANOVA 테스트에 이어 Kruskal Wallis 다중 비교 사후 테스트를 사용하여 수행하였다. 여러 시점에 걸친 여러 그룹 간의 비교는 2-way ANOVA 테스트를 사용하여 수행하였다. 선형 회귀를 사용하여 두 변수 간의 상관 관계를 계산하였다. 생존 곡선은 양측 로그 순위 검정으로 비교하였다. 종양 발생률은 카이제곱 검정으로 비교하였다. 모든 알파 수준은 0.05였으며 P<0.05 는 유의한 차이로 간주되었다. 통계 분석은 Prism 7.0(GraphPad Software)을 사용하여 수행하였다.
이 실시예에 제시된 정보는 발명자들이 Nature 저널에 발표하였다(Moral et al., "ILC2s amplify PD-1 blockade by activating tissue-specific cancer immunity," Nature, 2020, Mar, Vol. 579(7797), pp 130-135.doi: 10.1038/s41586-020-2015-4, Epub 2020 Feb 19.). 보충 자료를 포함한 이 간행물의 전체 내용은 본원에 참조에 의해 통합된다.
실시예 3
마우스에서 IL33-활성화 ILC2 세포 요법을 사용한 PDAC의 효과적인 치료
PDAC의 마우스 모델을 사용하여 IL33-활성화 ILC2 세포 요법의 효능을 평가하기 위한 실험을 수행하였다. 달리 명시되지 않는 한, 마우스, PDAC 모델, 활성제(IL33, αPD-1) 및 프로토콜은 상기 실시예 1에 기재된 바와 같았다. 췌장 종양 ILC2 세포를 활성화하기 위해 IL33을 "공여자" 마우스에 투여하엿다. 이어서, 췌장 종양 ILC2 세포를 공여자 마우스로부터 단리하고, 정제하고, 확립된 PDAC 종양을 갖는 "수용자" ILC2-결핍 마우스에 투여하였다. 일부 수용자 마우스에도 항-PD-1 항체를 투여하였다. 공여자 ILC2 세포만 투여받은 수용자 마우스에서는 PDAC 종양에 유의한 영향이 없었지만, 공여자 ILC2 세포와 항-PD-1 항체를 받은 수용자 마우스에서는 PDAC 종양 크기가 유의하게 감소하였다.
실시예 4
인간 임상 시험
임상 시험은 PDAC 치료의 안전성 및/또는 효능을 입증하기 위해 수행된다. 임상 시험은 성인 인간 개체에서 IL33 및/또는 PD-1/PD-L1 억제제를 사용한 PDAC 치료의 안전성 및/또는 효능을 입증하기 위해 수행된다. PDAC 를 가진 환자가 식별되고 등록된다. 환자는 특정 그룹에 할당된다. 다른 그룹은 다음 중 하나를 투여받는다: (a) IL33 단독, (b) 승인된 PD-1 억제제 및/또는 PD-L1 억제제 단독, 또는 (c) IL33 및 승인된 PD-1 억제제 및/또는 PD-L1 억제제. 각 그룹 내에서, 상이한 작용제(예를 들어, 상이한 PD-1/PD-L1 억제제), 상이한 용량, 상이한 투여 일정 등이 사용되는 상이한 다수의 하위 그룹이 있을 수 있다. IL33은 정맥내(IV) 투여된다. 일부 하위 그룹에서 IL33은 원래 형태(native form)일 수 있다. 일부 하위 그룹에서 IL33은 하나 이상의 반감기 개선 모이어티를 포함함으로써 변형될 수 있다. 다른 하위 그룹은 (가능한 용량 범위 내에서) 다른 용량의 IL33을 받을 수 있다. 다른 하위 그룹은 다른 빈도로 (예를 들어, 매일 또는 2, 3, 4, 5, 6 또는 7일마다) IL33을 받을 수 있다. 승인된 PD-1 억제제 및/또는 PD-L1 억제제는 승인된 용량, 승인된 투여 일정 및 승인된 투여 경로(예를 들어, 임의의 암 치료에 대해 승인된 기준을 기반으로 함)로 투여된다.
SEQUENCE LISTING <110> MEMORIAL SLOAN KETTERING CANCER CENTER <120> METHODS AND COMPOSITIONS FOR TREATMENT OF PANCREATIC CANCER <130> MSKCC.042.WO1 <140> <141> <150> 62/937,219 <151> 2019-11-18 <150> 62/868,976 <151> 2019-06-30 <160> 15 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 159 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 1 Ser Ile Thr Gly Ile Ser Pro Ile Thr Glu Tyr Leu Ala Ser Leu Ser 1 5 10 15 Thr Tyr Asn Asp Gln Ser Ile Thr Phe Ala Leu Glu Asp Glu Ser Tyr 20 25 30 Glu Ile Tyr Val Glu Asp Leu Lys Lys Asp Glu Lys Lys Asp Lys Val 35 40 45 Leu Leu Ser Tyr Tyr Glu Ser Gln His Pro Ser Asn Glu Ser Gly Asp 50 55 60 Gly Val Asp Gly Lys Met Leu Met Val Thr Leu Ser Pro Thr Lys Asp 65 70 75 80 Phe Trp Leu His Ala Asn Asn Lys Glu His Ser Val Glu Leu His Lys 85 90 95 Cys Glu Lys Pro Leu Pro Asp Gln Ala Phe Phe Val Leu His Asn Met 100 105 110 His Ser Asn Cys Val Ser Phe Glu Cys Lys Thr Asp Pro Gly Val Phe 115 120 125 Ile Gly 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Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 180 185 190 Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val 195 200 205 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 210 215 220 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 225 230 <210> 10 <211> 176 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 10 Met Ser His His His His His His His His Glu Asn Leu Tyr Phe Gln 1 5 10 15 Gly Ser Ile Thr Gly Ile Ser Pro Ile Thr Glu Tyr Leu Ala Ser Leu 20 25 30 Ser Thr Tyr Asn Asp Gln Ser Ile Thr Phe Ala Leu Glu Asp Glu Ser 35 40 45 Tyr Glu Ile Tyr Val Glu Asp Leu Lys Lys Asp Glu Lys Lys Asp Lys 50 55 60 Val Leu Leu Ser Tyr Tyr Glu Ser Gln His Pro Ser Asn Glu Ser Gly 65 70 75 80 Asp Gly Val Asp Gly Lys Met Leu Met Val Thr Leu Ser Pro Thr Lys 85 90 95 Asp Phe Trp Leu His Ala Asn Asn Lys Glu His Ser Val Glu Leu His 100 105 110 Lys Cys Glu Lys Pro Leu Pro Asp Gln Ala Phe Phe Val Leu His Asn 115 120 125 Met His Ser Asn Cys Val Ser Phe Glu Cys Lys Thr Asp Pro Gly Val 130 135 140 Phe Ile Gly Val Lys Asp Asn His Leu Ala Leu Ile Lys Val Asp Ser 145 150 155 160 Ser Glu Asn Leu Cys Thr Glu Asn Ile Leu Phe Lys Leu Ser Glu Thr 165 170 175 <210> 11 <211> 189 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 11 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser His His His His His His Gly Gly Gly Gly Ser Ser Ile 20 25 30 Thr Gly Ile Ser Pro Ile Thr Glu Tyr Leu Ala Ser Leu Ser Thr Tyr 35 40 45 Asn Asp Gln Ser Ile Thr Phe Ala Leu Glu Asp Glu Ser Tyr Glu Ile 50 55 60 Tyr Val Glu Asp Leu Lys Lys Asp Glu Lys Lys Asp Lys Val Leu Leu 65 70 75 80 Ser Tyr Tyr Glu Ser Gln His Pro Ser Asn Glu Ser Gly Asp Gly Val 85 90 95 Asp Gly Lys Met Leu Met Val Thr Leu Ser Pro Thr Lys Asp Phe Trp 100 105 110 Leu His Ala Asn Asn Lys Glu His Ser Val Glu Leu His Lys Cys Glu 115 120 125 Lys Pro Leu Pro Asp Gln Ala Phe Phe Val Leu His Asn Met 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Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala 130 135 140 Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln 145 150 155 160 Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly 165 170 175 Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro 180 185 190 Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser 195 200 205 Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu 210 215 220 Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 225 230 235 240 Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Gly Gly Gly Gly 245 250 255 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Ile Thr Gly Ile Ser Pro Ile Thr Glu 260 265 270 Tyr Leu Ala Ser Leu Ser Thr Tyr Asn Asp Gln Ser Ile Thr Phe Ala 275 280 285 Leu Glu Asp Glu Ser Tyr Glu Ile Tyr Val Glu Asp Leu Lys Lys Asp 290 295 300 Glu Lys Lys Asp Lys Val Leu Leu Ser Tyr Tyr Glu Ser Gln His Pro 305 310 315 320 Ser Asn Glu Ser Gly Asp Gly Val Asp Gly Lys Met Leu Met Val Thr 325 330 335 Leu Ser Pro Thr Lys Asp Phe Trp Leu His Ala Asn Asn Lys Glu His 340 345 350 Ser Val Glu Leu His Lys Cys Glu Lys Pro Leu Pro Asp Gln Ala Phe 355 360 365 Phe Val Leu His Asn Met His Ser Asn Cys Val Ser Phe Glu Cys Lys 370 375 380 Thr Asp Pro Gly Val Phe Ile Gly Val Lys Asp Asn His Leu Ala Leu 385 390 395 400 Ile Lys Val Asp Ser Ser Glu Asn Leu Cys Thr Glu Asn Ile Leu Phe 405 410 415 Lys Leu Ser Glu Thr 420 <210> 13 <211> 534 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 13 atgtcccacc atcaccatca ccaccaccac gaaaatctgt acttccaagg cagcatcacc 60 ggcatcagcc ccatcaccga gtatctggcc tctctgtcca cctacaacga ccagtccatc 120 acattcgctc tggaggacga aagctacgag atctacgtgg aggatctgaa gaaggacgag 180 aagaaggaca aggtgctgct gtcctactac gagtcccagc acccctccaa cgaaagcggc 240 gacggcgtgg atggcaagat gctgatggtg acactgagcc ccaccaagga cttttggctg 300 cacgccaaca acaaggagca cagcgtggag ctgcacaagt gcgagaaacc tctgcccgac 360 caagccttct tcgtgctgca caacatgcac agcaactgcg tgtccttcga gtgcaagacc 420 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Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 15 Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu 1 5

Claims (39)

  1. 췌관 선암 (pancreatic ductal adenocarcinoma, PDAC)을 가진 개체에게 유효량의 IL33을 투여함으로써 개체에서 PDAC를 치료하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 개체에서 췌관 선암 (PDAC)을 치료하는 방법.
  2. PDAC를 가진 개체에게 유효량의 (a) IL33 및 (b) PD-1 억제제 및/또는 PD-L1 억제제를 투여함으로써 개체에서 PDAC를 치료하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 개체에서 췌관 선암 (PDAC)을 치료하는 방법.
  3. PDAC를 가진 개체에게 유효량의 IL33을 투여함으로써 개체에서 췌장 조직-특이적 항-종양 T 세포 면역을 활성화시키는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 개체에서 췌장 조직-특이적 항-종양 T 세포 면역을 활성화하는 방법.
  4. PDAC를 가진 개체에게 유효량의 (a) IL33 및 (b) PD-1 억제제 및/또는 PD-L1 억제제를 투여함으로써 개체에서 췌장 조직-특이적 항-종양 T 세포 면역을 활성화시키는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 개체에서 췌장 조직-특이적 항-종양 T 세포 면역을 활성화하는 방법.
  5. 췌장 ILC2 세포를 유효량의 IL33과 접촉시켜 췌장 ILC2 세포를 활성화시키는 단계를 포함하는, 췌장 ILC2 세포를 활성화하는 방법.
  6. 췌장 ILC2 세포를 유효량의 (a) IL33 및 (b) PD-1 억제제 및/또는 PD-L1 억제제와 접촉시켜 췌장 ILC2 세포를 활성화시키는 단계를 포함하는, 췌장 ILC2 세포를 활성화하는 방법.
  7. 제5항 또는 제6항에 있어서,
    ILC2 세포가 시험관내(in vitro)/생체외(ex vivo)에서 IL33, PD-1 억제제 또는 PD-L1 억제제와 접촉되는 것인, 방법.
  8. 제5항 또는 제6항에 있어서,
    ILC2 세포가 생체내에서(in vivo) IL33, PD-1 억제제 또는 PD-L1 억제제와 접촉되는 것인, 방법.
  9. PDAC 종양 및/또는 췌장 ILC2 세포를 유효량의 IL33과 접촉시켜 PDAC 종양 및/또는 췌장 ILC2 세포를 PD-1 억제제 및/또는 PD-L1 억제제에 대해 감작화시키는 단계를 포함하는,
    PDAC 종양 및/또는 췌장 ILC2 세포를 PD-1 억제제 및/또는 PD-L1 억제제에 감작화하는 방법
  10. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 개체가 인간인, 방법.
  11. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 개체가 인간이 아닌 포유동물인, 방법.
  12. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 개체가 마우스인, 방법.
  13. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 개체가 PD-1 억제제 및/또는 PD-L1 억제제 치료에 대해 부분적으로 또는 전체적으로 내성인 PDAC를 가진 것인, 방법.
  14. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    IL33이 재조합 IL33인, 방법.
  15. 제10항에 있어서,
    IL33이 인간 IL33인, 방법.
  16. 제10항에 있어서,
    IL33이 재조합 인간 IL33인, 방법.
  17. 제12항에 있어서,
    IL33이 마우스 IL33인, 방법.
  18. 제12항에 있어서,
    IL33이 재조합 마우스 IL33인, 방법.
  19. 제2항, 제4항, 제6항 및 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    PD-1 억제제가 항체인, 방법.
  20. 제2항, 제4항, 제6항 및 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    PD-1 억제제가 펨브롤리주맙, 니볼루맙, 세미플리맙, AMP-224, AMP-514 및 PDR001로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
  21. 제2항, 제4항, 제6항 및 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    PD-L1 억제제가 항체인, 방법.
  22. 제2항, 제4항, 제6항 및 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    PD-L1 억제제가 아테졸리주맙, 아벨루맙, 더발루맙, BMS-936559 및 CK-301로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
  23. (a) IL33 및 (b) PD-1 억제제 및/또는 PD-L1 억제제를 포함하는, 약학 조성물.
  24. (a) IL33 및 (b) PD-1 억제제 및/또는 PD-L1 억제제를 포함하는,
    PDAC의 치료에 사용하기 위한 약학 조성물.
  25. (a) 췌관 선암(PDAC) 가진 수용자 개체에게 유효량의 활성화된 공여자 췌장 ILC2 세포를 투여함으로써 수용자 개체에서 PDAC 를 치료하는 단계를 포함하는,
    필요로 하는 개체에서 PDAC을 치료하는 방법으로서,
    상기 공여자 췌장 ILC2 세포는 공여자 개체로부터 얻어지고 IL33과의 접촉에 의해 생체외/시험관내에서 활성화되고,
    상기 공여자 개체와 수용자 개체는 동일한 종의 개체인, 방법.
  26. (a) 공여자 개체로부터 얻은 공여자 췌장 ILC2 세포를 생체외/시험관내에서 IL33과 접촉시켜 활성화된 공여자 췌장 ILC2 세포를 생성하는 단계, 및 (b) 활성화된 공여자 췌장 ILC2 세포를 췌관 선암(PDAC)을 가진 수용자 개체에 투여함으로써 수용자 개체에서 PDAC 를 치료하는 단계를 포함하는,
    필요로 하는 개체에서 췌관 선암(PDAC)을 치료하는 방법으로서,
    상기 공여자 개체와 수용자 개체는 동일한 종의 개체인, 방법.
  27. (a) 공여자 개체로부터 공여자 췌장 ILC2 세포를 얻는 단계, (b) 공여자 췌장 ILC2 세포를 생체외/시험관내에서 IL33과 접촉시켜 활성화된 공여자 췌장 ILC2 세포를 생성하는 단계, 및 (c) 활성화된 공여자 췌장 ILC2 세포를 췌관 선암(PDAC)을 가진 수용자 개체에게 투여함으로써 수용자 개체에서 PDAC 를 치료하는 단계를 포함하는,
    필요로 하는 개체에서 췌관 선암(PDAC)을 치료하는 방법으로서,
    상기 공여자 개체와 수용자 개체는 동일한 종의 개체인, 방법.
  28. 제25항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서,
    활성화된 공여자 췌장 ILC2 세포를 수용자 개체에게 투여하기 전에, 생체외/시험관내에서 공여자 췌장 ILC2 세포 및/또는 활성화된 공여자 췌장 ILC2 세포를 확장(expanding)하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  29. 제25항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서,
    공여자 개체 및 수용자 개체가 동일한 개인이어서, 상기 방법이 자가(autologous) 세포 치료 방법인, 방법.
  30. 제25항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서,
    공여자 개체 및 수용자 개체가 동일한 MHC/HLA 유형을 갖는 것인, 방법.
  31. 제25항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서,
    공여자 개체 및 수용자 개체가 인간인, 방법.
  32. 제25항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서,
    공여자 개체 및 수용자 개체가 인간이 아닌 포유동물인 방법.
  33. 제25항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서,
    공여자 개체 및 수용자 개체가 마우스인, 방법.
  34. 제25항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서,
    수용자 개체가 PD-1 억제제 및/또는 PD-L1 억제제 치료에 대해 부분적으로 또는 전체적으로 내성인 PDAC를 갖는 것인, 방법.
  35. 제25항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서,
    IL33이 재조합 IL33인, 방법.
  36. 제25항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서,
    공여자 개체 및 수용자 개체가 인간이고, IL33이 인간 IL33인, 방법.
  37. 제25항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서,
    공여자 개체 및 수용자 개체가 인간이고, IL33이 재조합 인간 IL33인, 방법.
  38. 제25항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서,
    공여자 개체 및 수용자 개체가 마우스이고, IL33이 마우스 IL33인, 방법.
  39. 제25항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서,
    공여자 개체 및 수용자 개체가 마우스이고, IL33이 재조합 마우스 IL33인, 방법.
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