CN118202247A - 用于诊断癌症或抗生素诱导的生态失调的方法及其用于提升通过免疫疗法的癌症治疗的用途 - Google Patents
用于诊断癌症或抗生素诱导的生态失调的方法及其用于提升通过免疫疗法的癌症治疗的用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及抗癌免疫疗法的领域。特别地，本发明涉及MAdCAM‑1/α4β7轴、肠道微生物群在癌症治疗功效中的作用，并且提供了用于确定患者是否可能受益于癌症治疗，以及更准确地免疫肿瘤学(I‑O)疗法(诸如包括单独或与CTLA4和/或化疗一起施用针对免疫检查点阻断剂PD1、PD‑L1或PD‑L2的抗体的治疗)的方法。本发明还提供了在有此需要的患者中提升此类治疗的功效的方法。
Description
技术领域
本发明涉及抗癌免疫疗法的领域。特别地，本发明涉及MAdCAM-1/α4β7轴、肠道微生物群在癌症治疗功效中的作用，并且提供了用于确定患者是否可能受益于癌症治疗，以及更准确地免疫肿瘤学(I-O)疗法(诸如包括单独或与CTLA4和/或化疗一起施用针对免疫检查点阻断剂PD1、PD-L1或PD-L2的抗体的治疗)的方法。本发明还提供了在有此需要的患者中提升此类治疗的功效的方法。
背景技术
在过去的十年期间，肠道微生物组在逐步发展的免疫肿瘤学背景下获得了广泛关注，有令人信服的证据表明，在各种各样的晚期恶性肿瘤中，肠生态失调在对免疫检查点阻断的原发性抗性中起作用。此观点得到了许多流行病学研究的支持，这些研究指出广谱抗生素在III和IV期肺癌、肾癌、膀胱癌和黑素瘤中抗PD-1/抗PD L-1抗体(Ab)的临床结果中产生有害影响。值得注意的是，肠生态系统丰富度的下降与T细胞浸润中不良的肿瘤微环境相关联。
越来越意识到肠道生态失调在治疗失败中的潜在贡献，导致了许多研究者描述与免疫疗法抗性相关联的基于宏基因组学的肠蓝图。然而，与癌症相关联的生态失调在多大程度上先于肿瘤发生过程并因此与瘤形成发展有因果关系或者仅仅是其直接后果仍然是未知的。
含β7整合素的异源二聚体在白细胞归巢至肠道并滞留在上皮表面中发挥核心作用。β7整合素亚单位可以与α4(CD49d)整合素亚单位形成异源二聚体，从而导致α4β7整合素(也称为“淋巴细胞派尔斑粘附分子-1”(Lymphocyte Peyer’s patch Adhesion Molecule-1，LPAM-1))。通过与其反受体黏膜地址素细胞黏附分子-1(Mucosal Addressin CellularAdhesion Molecule-1，MAdCAM-1)相互作用，α4β7整合素介导淋巴细胞粘附以及从循环中渗出穿过血管内皮屏障进入肠相关联的次级淋巴组织(GALT)或肠固有层(LP)(laminapropria)中。跨膜粘附分子MAdCAM-1在LP小静脉和GALT高内皮小静脉(HEV)上组成性表达，并且可由促炎细胞因子诱导((Briskin et al.,1997；Gorfu et al.,2009；Ogawa et al.,2005)。表达视黄酸(RA)的CD103+树突状细胞控制GALT中α4β7整合素和CCR9受体的表达，以使得能够与MAdCAM-1结合并使淋巴细胞通过肠CCR9配体CCL25而归巢至肠粘膜。通过阻止炎性β7+ T细胞从循环流入和外渗到肠道，靶向α4β7或MAdCAM-1的抗体显著地降低了动物模型和患有炎性肠病的患者中结肠炎的严重程度((Hassan-Zahraee et al.,2018；Reinisch et al.,2021)。越来越意识到肠微生物群在维持肠Treg和TH17细胞的调节功能以确保肠道上皮屏障完整性中所发挥的作用(Littman and Rudensky,2010；Pandiyan etal.,2019)。
除了其在肠中有重大意义的稳态作用之外，TH17还控制肠外炎性病变(Krebs etal.,2016；Lee et al.,2011a；Magnuson et al.,2015；Morton et al.,2014；Wu et al.,2010)。重要地，TH17及其谱系相关的FoxP3+调节细胞通过在慢性癌变过程中诱导的炎症期间恢复耐受性来减弱抗肿瘤免疫监视Cochaud et al.,2013；Fridman et al.,2012；Guéryand Hugues,2015；Langowski et al.,2006；Young,2016)。RORγt表达鉴定出人类和小鼠中由肠道共生体诱导的表型稳定的肿瘤浸润性Treg群体(Sefik et al.,201)。条件性RORγt敲除小鼠通过涉及树突状细胞的间接机制显示出肿瘤发生率或息肉形成减少Blatneret al.,2012；Rizzo et al.,2018)。
免疫检查点抑制剂(ICI)恢复肿瘤免疫监视，并已成为数种组织学类型的癌症的临床管理标准护理(Brahmer et al.,2015；Robert et al.,2011)。对ICI的原发性抗性主要归因于肿瘤突变负荷低以及肿瘤细胞的内在抗原性差(Riaz et al.,2016；Rizvi etal.,2015)、缺陷性抗原呈递Spranger et al.,2015)、瘤内T细胞衰竭(Smyth et al.,2016)、干扰素-γ(IFNγ)信号传导通路的基因组缺陷(Gao et al.,2016)、CSF1依赖性肿瘤相关的巨噬细胞(Neubert et al.,2018)，以及免疫抑制性代谢线索(Smyth et al.,2016)。此外，若干项研究指示，肠道微生物组库的偏差会对ICI功效产生负面影响，这表明共生体在影响癌症免疫设定点中至关重要(Chen和Mellman,2017)。分析抗生素(ATB)对患者生存的影响的回顾性和前瞻性研究揭示了抗生素在免疫检查点阻断期间对临床结果的负面预测影响(Elkrief et al.,2019b；Mohiuddin et al.,2021；Routy et al.,2017；Tinsley et al.,2019；Derosa et al.2022)。荟萃分析揭示，ATB摄取在首次全身施用抗PD1/PDL-1 Ab之前(而非期间)施用时对临床结果更为有害，表明ATB进程后的再定植而非直接医源性效应可能是有害的(Derosa et al.,2021)。事实上，ATB治疗的患者倾向于被不同的菌种定植(诸如哈撒韦氏亨盖特氏菌(Hungatella hathewayi)(Derosa et al.,2022)。这些流行病学发现导致这样的假设：通过影响肠生态系统的组成，ATB可以通过影响肠稳态调节T细胞亚群的肠道/肿瘤运输使瘤内效应细胞与调节T细胞之间的平衡发生倾斜(38)，由此加剧癌症免疫抑制。
发明内容
近期，发明人进行了荟萃分析，其揭示ATB摄取在首次全身施用抗PD1/PDL-1 Ab之前(而非期间)施用时对临床结果更为有害，表明ATB进程后的再定植而非直接医源性效应可能是有害的(Derosa et al.,Cancer Discovery,2021)。
在接下来的实验部分中，发明人确认了这一假设，并且显示肠道微生物群通过其远程影响数种类型的癌症演化以及患者对免疫疗法的应答的途径。
事实上，发明人显示ATB诱导的生态失调(Routy et al.,2018；Vétizou et al.,2015)导致了黏膜地址素细胞黏附分子-1(MAdCAM-1)与其由向肠性T细胞表达的受体α4β7之间相互作用的破坏。
当ATB进程停止时，选自肠道梭状菌(Enterocloster)新属细菌的菌种(诸如小梭形肠道梭状菌(Enterocloster clostridioformis)新组合(Haas和Blanchard,2020)，此前被分类为梭菌纲(Clostridia class)细菌)接管并下调回肠黏膜地址素细胞黏附分子-1(madcam1)基因以及回肠固有层和高内皮小静脉上的细胞表面蛋白表达。MAdCAM-1的丧失引发肠道归巢α4β7+TH17和RORγt+Treg CD4+T细胞外流至肿瘤床，从而耐受癌症微环境并最终产生对PD-1阻断的抗性。
本发明基于这些结果，并且首先涉及在体外评估患有癌症的个体是否也患有与癌症或抗生素相关联的生态失调的方法，其基于血清或回肠和/或肠道癌微生物标志物(GutOncoMicrobiome Signature，GOMS)中MAdCAM的下调，。该方法还可以用于追踪以微生物群为中心的干预(MCI)在患者中的作用。
诊断此类癌症和/或ATB相关生态失调指示受试者需要补偿性以微生物群为中心的干预(MCI)，尤其是在接受免疫检查点抑制剂(ICI)或另一种免疫肿瘤学(I-O)疗法的治疗之前。
此类MCI，包含口服万古霉素抗生素、能够杀伤肠道梭状菌新属进化枝细菌的噬菌体和稀有切割核酸内切酶、可能与其它有益细菌混合的阿克曼氏菌属(Akkermansia spp)和/或嗜黏蛋白阿克曼氏菌(Akkermansia muciniphila)、视黄酸、粪便微生物移植，以及它们的混合物用于恢复对I-O疗法的敏感性的用途也是本发明的一部分。
本发明还涉及用于具有低血清可溶性MAdCAM水平的癌症患者的联合疗法，其具有(i)抗PD1或抗PDL1抗体，以及(ii)抗IL-17A或抗IL-17R抗体和/或重组IL-7。
本发明还涉及用于鉴定能够使固有层内皮细胞中的MAdCAM-1表达水平正常化的药剂的筛选方法。
附图简要说明
图1.广谱抗生素(ATB)下调回肠脉管系统中的MADCAM-1表达。
A-D.在连续广谱抗生素(ATB：氨苄青霉素、粘菌素、链霉素)之后或ATB停止后4至7天自发再定植(ATBRECO)之后，C57BL/6J小鼠中回肠(A-D)或结肠(A)组织的用RT-PCR(A)、LP小静脉(上显微照片)和高内皮小静脉(HEV，下显微照片)中MAdCAM-1的免疫组织化学染色(B)、对LP的CD45-细胞的流式细胞术门控(C)或ELISA(D)所获得的Madcam1基因产物的相对转录(A)和蛋白质(B-D)水平。每个点代表一个回肠或结肠。E-F.小鼠的回肠粘膜中相对madcam1基因表达的定量RT-PCR，小鼠用8天的口服万古霉素(E)或广谱ATB继之以4-7天的再定植(ATBRECO)(F)处理，并然后经小梭形肠道梭状菌强饲补充一次，7天后处死。每张图描绘了产生类似结果的2-3个实验中的代表性实验(包含5-6只小鼠/组)。图A或E左图合并了2次实验的数据。G.与上文E.相同，但在SPF条件(无ATB调节)下饲养的C57BL/6J小鼠中使用在x轴上排列的细菌属执行口服强饲。H.左图：诊断时(PD-1阻断之前)使用NSCLC患者的粪便在3天ATB处理的接受者小鼠中粪菌移植(FMT)对根据未曾接受过处理的无特定病原体(SPF)小鼠组标准化的回肠Madcam1基因表达(log10轴)的影响。每个实验使用不同的FMT供体并包含5-6只动物/组。每个点代表回肠。右图：对供体粪便的分类组成进行非监督分层聚类(使用鸟枪MG测序定义)，选择高流行率>25％且临床相关的细菌。I.与A-D中相同的实验，在连续ATB期间或ATBRECO阶段对回肠固有层CD4+ T细胞亚群(α4β7+vs CD25+FoxP3+Treg vsRORγt+CD4+(TH17)细胞)执行流式细胞术分析，每个点代表一个回肠。描绘了产生类似结果的2项分析中的代表性Facs分析。对于类似回肠粘膜组织的qPCR相关数据另参见图5H-I。J.与上文A.相同，但在Madcam-1基因缺陷小鼠中(经或未经不影响回肠MADCAM-1表达水平的抗PD1 Ab处理，未显示)，没有ATB调节。每个点代表一个回肠的qPCR数据。K.9名对照(无ATB)患者和7名ATB处理的患者在内窥镜干预期间收集的肠活检中基于RT-PCR的人MADCAM-1、FOXP3、RORC基因的转录水平(表1)。每个点代表来自回肠、结肠和盲肠的一个活检，单个患者被代表1至3次。方差分析统计分析(非参数秩和检验(Kruskal-wallis test))：*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
表1.捐献FMT的患者描述。
图2.ATB后细菌再定植诱导的向肠性IL-17A和IL-22分泌-α4β7+CD4+T和Treg细胞向肿瘤床的迁移。
A-B.在根据方案照射(A，左图)或通过将CFSE注射到野生型小鼠的mLN中(B，左图)之后，Kaede小鼠中评估的次级淋巴器官(肠系膜LN、脾、tdLN：肿瘤引流LN)中光转化的(A)或CFSE标记的(B)肠源性细胞的流式细胞术测定。左图描述了实验设置的图形化方案，并且右图显示了在组织UV-A照射或CFSE注射到mLN中后24小时，在各种次级淋巴器官中，使用颜色梯度(A)或CFSE标记细胞与常驻(未标记)细胞(B)，以线条详细描述的每个亚组中光转化(PC)与常驻(非光转化，NPC)细胞的相对积聚(log2倍数变化(FC))。统计学：Mann-Whitney检验，p值用Benjamini-Hochberg方法调整，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。C.使用αMAdCAM-1 mAb中和MAdCAM-1对肠源性细胞向Kaede(左)或mLN-CFSE注射的WT小鼠(中图)中的tdLN或向对侧(controlatreal)LN(右图)再循环的效应。每个点代表一只小鼠。描绘了达到类似结论的两个实验中的代表性实验。D.描绘5只MCA205荷瘤动物中从mLN中分选的α4β7高与α4β7阴性CD4+淋巴细胞的RNA测序中的差异基因转录的火山图。生成火山图，其计算5只小鼠的每种细胞类型中表达的每种基因产物：i)α4β7高与α4β7阴性CD4+淋巴细胞中归一化后转录物平均相对丰度的倍数比(FR)的log2(x轴)；ii)根据绝对值的相对丰度计算的Mann-Whitney U检验得出的p-值的co-log10(y轴)。黑点和灰点被认为是显著的(p<0.05)，而背面的点则不显著(p>0.05)。E.在ATB调节(氨苄青霉素、粘菌素、链霉素)后的ATB RECO阶段期间，到达tdLN的CFSE+(源自mLN，灰点)或CFSE-细胞(tdLN驻留细胞，黑点)内分泌IL-17A+的α4β7+Treg(中图)或α4β7+Tconv(右图)CD4+ T细胞的实验设置(左图)和流式细胞术评价。每个图描绘了两个独立和合并的实验(包含5-6只小鼠/组)。F.在CFSE注射到mLN中后，携带MCA205的WT与Madcam1-/-小鼠(未经ATB处理)中到达tdLN或对侧LN的CFSE+Treg细胞的流式细胞仪测定。每个点代表一只小鼠，描绘了产生类似结果的两个实验中的代表性实验。G.与上文E.相同，但是在经或未经抗MADCAM-1 Ab处理的Kaede小鼠中，流式细胞术可使用针对CD25和CD127的膜染色来鉴定Treg。H.在采用或不采用肠道梭状菌属强制口服强饲的情况下，评估停止ATB过程后细菌再定植对向肠性CD4+ T细胞再循环的短期(4-7天)效应的实验设置(左图)。在ATB RECO阶段期间，到达tdLN的PC(源自mLN)或NPC细胞(tdLN驻留细胞)内Kaede小鼠中表达高水平CD25(Tr17样，中图)或TH17 conv.(右图)的TH17细胞的流式细胞术表型分析(G)。每个点代表一只小鼠，并且图描绘了两个合并的实验。方差分析统计分析(非参数秩和检验)或Wilcoxon配对符号秩和检验：指示原始p值。I.在用水(组1)、用ATB 7天——ATB是连续的(组2)，或ATB自第4天起停止(ATBRECO)(组3)或用小梭形肠道梭状菌口服强饲4天替代(组4)处理的MCA205肿瘤携带者中，CFSE+mLN衍生的CD4+ T细胞迁移到tdLN的单细胞转录组学分析，实验含有5只动物/组。通过覆盖四个组的小鼠的无监督聚类，在基于平板的全长单细胞RNA-seq数据中的4个迁移CFSE+CD4+ T细胞亚群中的UMAP基因模式(I，左图)。根据Log2 p值和每种亚型与其它3种亚型(Treg(I，中图)和增殖细胞(I，右图)相比的比例的倍数比，与每种特定细胞类型相关联的差异基因表达模式的火山图。对于根据4个实验组中每者的细胞类型基因模式参见图7。
图3.MAdCAM-1/α4β7轴的破坏诱导小鼠对基于αPD-1的免疫疗法的不适应性应答。
A.植入野生型(wt)与Itgb7或Madcam1基因缺陷小鼠中的皮下MCA205(C57BL/6J的同基因)的肿瘤生长动力学。2个治疗组(抗PD1与isoCtl Ab)中5-6只小鼠/组随时间推移的肿瘤尺寸的平均值±SEM。B-D.在接受抗PD1治疗性抗体(或iso-Ctl Ab)的同时，用同种型对照、抗-α4β7mAb或-αMAdCAM-1 mAb处理的动物中植入皮下MCA205(B)、乳腺4T1(与BALB/c同基因，C)和肺原位TC1-luc(与C57BL/6J同基因，D)肿瘤后的肿瘤生长动力学或肿瘤发光。对于肺原位TC1肿瘤，使用IVIS成像系统的全身发光来量化肺中表达荧光素酶的TC1动力学。计算用同种型对照mAb、αα4β7mAb或αMAdCAM-1 mAb阻断PD-1前后之间的比率。E.野生型(wt)与Madcam1基因缺陷小鼠中脾细胞和肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)CD4+ T细胞上α4β7表达的流式细胞术分析。每个点代表一只小鼠。该图合并了2个独立实验，每组5只小鼠。学生t检验。F.热图中表示的非监督分层聚类，其显示用中和αMAdCAM-1 mAb或同种型对照mAb处理的小鼠中各种免疫α4β7+CD4+ T细胞亚群的相对百分比(通过从建立的s.c.MCA205分离的TIL的流式细胞术分析来测定)。G-I.野生型(wt)与Madcam1基因缺陷小鼠(G)或者经或未经抗PD1 Ab(H，I)处理的接受ATB调节方案((ATB停止后4天(ATBRECO-S)或ATB停止后12天(ATBRECO-L))的wt MCA205荷瘤小鼠中α4β7+Treg TIL中的Rorγt表达的细胞内流式细胞术分析。每个点代表一只小鼠。描绘了产生类似结果且包含5只小鼠/组的2个独立实验中的代表性实验(G，I)。学生t检验(G)。J.在PD-1阻断的情况下，对经同种型对照mAb、αα4β7mAb或αMAdCAM-1 mAb处理的s.c.MCA205荷瘤小鼠中的肿瘤浸润性细胞(TIL)的CCR5+CD8+效应T细胞的流式细胞术分析。K.实验设置方案(左图)以及在ATBRECO阶段期间αPD-1 mAb的疗法以及与免疫疗法并行使用αIL-17A mAb(ip)全身中和IL-17A之后处死时s.c.4T1 WT(左)或4T1 IL-22Rα1KO(右)肿瘤细胞系的肿瘤尺寸(平均值±SEM)的横断面研究。在每个实验中，ATBRECO阶段期间每三天施用四次αPD-1腹膜内(i.p.)注射。每个实验包含6只小鼠/组。描绘了2-3个实验中的代表性实验。方差分析统计分析(非参数秩和检验)：*指示了原始p值。
图4.血清可溶性MADCAM-1是NSCLC患者中PD1阻断的临床益处的预测因子以及肠道生态失调的代表.
A.在65只MCA205荷瘤小鼠中，RT-PCR测定的回肠Madcam1基因表达水平与血清可溶性MADCAM-1(通过ELISA测定)之间的Spearman相关性，每个点代表一只动物。B.与健康志愿者(HV，n＝70)的血清水平相比，根据其近期ATB摄取史(右图)，属于2个独立队列(C01、C02，左图)的301名NSCLC患者中的血清可溶性MADCAM-1水平的ELISA监测。每个点代表一名患者的血清。C-D.根据NSCLC患者中的血清sMADCAM-1水平的肠微生物群的分类内容的α和β多样性。根据由95名NSCLC患者构成的整个群体中sMADCAM-1的中值(C)以及两组中的组成的个体间变异性(D)，鸟枪MG测序中的基于MGS多样性的丰富度评价。E-F.Kaplan-Meier存活曲线以及血清sMADCAM-1水平预测值的Cox回归线性分析，针对PFS(E)和OS(F)根据用αPD-1 mAb免疫疗法治疗的IV期NSCLC的两个独立(左列和右列)队列中每个队列的中值(患者描述和多变量分析参见表5-6)进行分割。G.根据sMADCAM-1血清水平(<(低)或>(高)中值)对MGS(流行率>10％)进行监督分层聚类，颜色代码特征为每个重要菌种的相对丰度，使用各种流水线和算法在左栏的柱形图中对齐。H.95名患者粪便材料中小梭形肠道梭状菌相对丰度占所有MGS物种的百分比，根据其sMADCAM-1血清水平分为两组(<(低)或>(高)中值)。每个点代表一种粪便/血清/患者。学生t检验。
图5.ATB诱导的生态失调影响肠固有层中免疫基因产物的转录程序。
A.对于组织裂解物的ELISA(左图)和RT-PCR(右图)中趋化因子(左图)和细胞因子/转录因子(右图)表达谱，经ATB处理与未经处理的(水)回肠、结肠以及肿瘤床之间的log2倍数变化率的热图。统计学：Mann-Whitney检验，p值用Benjamini-Hochberg方法调整，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。B.经ATB处理小鼠中通过IHC评价回肠HEV上的CD31表达。C.采用各种抗生素方案调节7天或ATBRECO之后对回肠组织(左)或肠系膜淋巴结(右)中Madcam1基因相对转录水平的影响的RT-PCR评价。连续(c.)，AmpiC：c.氨苄青霉素，ColistC：c.粘菌素，StreptoC：c.链霉素，VancoC：c.万古霉素，ErythrC：c.红霉素。每个点代表一个回肠。该图收集了包含5只小鼠/组的2-3个实验。D-E.派尔斑(Peyer’s patches，PP)(D)或各种淋巴结(LN)(mLN：肠系膜LN，sk：皮肤LN，td：肿瘤引流LN)(E)中Madcam1(D，E)和VCAM1(E)基因的相对表达的RT-PCR评估。每个点代表一个回肠。该图收集了包含5只小鼠/组的2个实验。F.在需氧和厌氧条件下，从用各种ATB方案(参见C)处理并在其停止后第4天处死的小鼠中收获的回肠材料的培养组学。G.通过质谱对每种条件下培养的菌种的定性鉴定。H-I.对经或未经ATB处理的小鼠的回肠组织中的鼠Foxp3、RORc和IL17a基因的RT-PCR评价(H)以及小鼠中回肠Madcam1和Rorc或Foxp3表达水平之间的Spearman相关性(I)。每个点代表一只动物。来自3个独立实验的并置数据。J.9名对照(无ATB)患者和7名经ATB处理的患者中内镜干预期间收集的肠活检中基于RT-PCR的人FOXP3(左)，以及IL-17A(右)和Madcam-1基因转录水平之间的Spearman相关性(表1)。每个点代表来自回肠、结肠和盲肠的一个活检，单个患者被代表1至3次。方差分析统计分析(非参数秩和检验)：*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
图6.对各种区室中的肠道起源细胞的分析.
A.荷瘤Kaede小鼠中的肠(回肠、盲肠、mLN)的UV-A照射实验设置的示意性概述，以及tdLN(上图)和mLN(下图)中光转化细胞(PC)的流式细胞术门控策略。指示了剖腹术和肠区室的UV-A照射之前、之后5分钟和24小时的目标器官中的PC频率。B.与上文A.相同，在24小时mLN、脾、tdLN和肿瘤床中PC细胞的详细百分比，每个点代表一只小鼠。描绘了产生类似结果的3个实验中的典型实验。C.实验设置(左图)以及CFSE注射到mLN、不同组织(x轴)中后24小时的CFSE+细胞的流式细胞术测定，每个点代表一只小鼠。合并了来自3个独立实验的数据。D.与上文B.相同，监测“肠”(回肠+盲肠+mLN)与仅回肠的UV-A照射后向肠性细胞向tdLN或肿瘤床的动员，每个点代表一只小鼠。描绘了产生类似结果的2个实验中的典型实验。E-F.根据UV-A照射区域(回肠与“肠”(回肠+盲肠+mLN)的Kaede小鼠或者CFSE注射到mLN中的野生型小鼠(F)中的脾、tdLN或肿瘤床中常驻(NPC)或再循环(PC)CD4+ T细胞的肠道整合素α4β7表达的流式细胞术评价。G-H.在经或未经ATB处理且具有皮下MCA205且24小时前经受CFSE注射到mLN中的动物中，通过CFSE标记追踪的tdLN中不同CD4+Treg细胞类型(α4β7、IL-17、IL-22的表达不同)的流式细胞术评价。方差分析统计分析(非参数秩和检验)：*注释原始p值。
图7.由再定植诱导的基因表达谱.
A.-scRNA seq数据收集的实验设计.在含有5只MCA205荷瘤动物的4个实验小鼠组(水、连续ATB、ATB RECO、小梭形肠道梭状菌)的mLN中，在CFSE接种后24小时，对从tdLN中收获的CFSE+CD4+ T细胞执行单细胞转录组学。B.在质量控制和测序后，每种情况下tdLN中回收的CFSE+细胞的绝对数量。C.描绘属于ATBRECO组与水组(对照)中Treg亚群细胞的CFSE+CD4+ T细胞的RNA测序中的差异基因转录的火山图。生成火山图，其计算5只小鼠的每种细胞类型中表达的每种基因产物：i)组3与组1中归一化后转录物平均相对丰度的倍数比(FR)的log2(x轴)；ii)根据绝对值的相对丰度计算的Mann-Whitney U检验得出的p-值的co-log10(y轴)。蓝色(下调的基因产物)和红色(上调的基因产物)点被认为是显著的(p<0.05)，而背面的点则不显著(p>0.05)。D.与上文C相同，但比较了ATBRECO(组3，左图)或ATB小梭形肠道梭状菌(组4)内的Treg与其它T细胞亚群中的基因转录物。E.与上文D相同，但比较了阴性对照组(水，组1，左图)和ATBRECO(组3，右图)内增殖性T细胞亚群与其它T细胞亚群的基因转录物。F.与上文E相同，但比较了属于两组小鼠(水(组1)与ATBRECO(组3)，左图中)中的簇1(UMAP中，图2I)的细胞中的基因转录物，然后将这些簇1细胞亚群的转录谱与ATBRECO(组3)中的其它簇进行比较(右图)。G.与上文E相同，但比较了属于两组小鼠(水(组1)与ATBRECO(组3))中的簇0(UMAP中，图2I)的细胞中的基因转录物。
图8.αPD-1 mAb加剧了向肠性α4β7+RORγt+Treg或IL-17A+IL-22+Treg向ATB诱导的生态失调所引起的肿瘤病灶的积聚.
A.MCA205荷瘤(抗PD1或同种型Ctl Ab-处理的)小鼠中回肠Madcam1与肿瘤尺寸之间的Spearman相关性。每个点代表一只小鼠。方差分析统计分析(非参数秩和检验)：*注释原始p值。B.皮下MCA205肿瘤中α4β7+或α4β7-CD4+TIL级分中RORγt+Treg(Tr17)的流式细胞术评估。每个点代表一个肿瘤和小鼠。C.在肿瘤携带者中不同持续时间的ATB间隔期间PD1阻断的实验设置。D-F.mLN(D)或皮下MCA205(E)或4T1(F)肿瘤中Treg内的RORγt+或IL-17A+IL-22+细胞的流式细胞术评估。G.在ATB停止并经小梭形肠道梭状菌或罗伊氏乳杆菌(L.reuteri)自发ATBRECOL+/-增强的肠道定植后通过PD1阻断处理的皮下(s.c.)MCA205肿瘤中，分泌IL-17A+IL-22+的Treg(左)和α4β7+Treg细胞(右)的流式细胞术测定。在产生类似结果的两个实验中含有6只小鼠/组的典型实验中，每个点代表每只动物处死时的肿瘤尺寸。详细表型参见表4。方差分析统计分析(非参数秩和检验)：*注释原始p值。
图9.嗜黏蛋白阿克曼氏菌上调回肠Madcam-1基因表达并且以MADCAM-1依赖性方式阻止向肠性T细胞再循环至肿瘤床.
A.补充或不补充口服强饲的活的或巴氏灭菌的嗜黏蛋白阿克曼氏菌(A.muciniphila)SGB9228(A.muc，左图)，经3天ATB处理或使用来自PD1难治性NSCLC患者的FMT(FMT NR)肠道人源化的MCA205荷瘤小鼠处死时的肿瘤尺寸。tdLN引流s.c.MCA205肉瘤中CD4+ T细胞的α4β7和/或CCR9表达的流式细胞术评价(中图和右图)。B.抗MADCAM-1中和抗体对巴氏灭菌的嗜黏蛋白阿克曼氏菌SGB9228对于PD1阻断的应答的补偿效应的影响，描绘为用细菌+/-抗MADCAM-1 Ab补偿的抗PD1处理的FMT NR替身小鼠中肿瘤尺寸之间的比率。C-D.小鼠的tdLN中CD4+ T和Treg细胞的IL-17A和IL-22细胞因子分泌的流式细胞术评价，该小鼠用FMT NR定植并经口服强饲补充嗜黏蛋白阿克曼氏菌(A.muc)，接受或不接受αMAdCAM-1 mAb处理并用αPD-1单抗αPD-1 mAb处理(C)。抗MADCAM-1中和抗体对巴氏灭菌的嗜黏蛋白阿克曼氏菌SGB9228阻止Tr17肠道外流的预防效应的影响，描绘为到达用细菌+/-抗MADCAM-1 Ab补偿的抗PD1-处理的FMT NR替身小鼠中的tdLN的IL-17+IL-22+Treg或总CD4+ T细胞的比率(D)。方差分析统计分析(非参数秩和检验)或Wilcoxon配对符号秩和检验：*注释了原始p值。E.图解摘要示出了在ATB诱导的生态失调的情况下，当回肠HEV中MADCAM-1表达破坏时，发生肠道引发的IL-17A+IL-22+RORγt+α4β7+Treg(Tr17)细胞向肿瘤微环境的再循环。
图10.可溶性MADCAM-1血清水平是PD-1阻断临床益处的稳健预测因子.
A.使用4节点的限制性立方样条(RCS)，评价表5中所描述的每个C01和C02队列中PD1阻断期间进展或死亡风险的危险比(HR)以及血清sMADCAM-1(ELISA中监测)的Cox线性回归分析。根据Akaike信息标准选择节点的数量。左图(C01)：N＝115名NSCLC患者，62名死亡，中值OS＝15个月(95％C.I：11.2-25mo)，HR＝0.92(95％ C.I：0.88-0.97，p＝0.001)。右图(C02)：N＝186名NSCLC患者，83名死亡，中值OS＝12个月(95％C.I：9-17mo)，HR＝0.97(95％ C.I：0.94-0.99，p＝0.02)。B.普及(Prevalung)研究：随访2年内，诊断患有肺癌的那些患者(N＝9)与未诊断患有肺癌的患者(N＝56对照)中的肺癌发病率之前CVD吸烟者中的血清sMADCAM-1水平。C.血清sMADCAM-1和循环α4β7+Rorγt Treg之间的Spearman相关性。D-E.根据sMADCAM-1配对血清水平基于NSCLC患者粪便的鸟枪MG测序对分类组成的非监督分层聚类，以及基于分类MGS的聚类与sMADCAM-1中值之间的分离的方差分析统计分析。
图11.Kaplan-Meier总生存期曲线以及Cox回归单变量分析，其根据血清中sMAdCAM-1的中值使用212名RCC患者的Logrank统计检验。酪氨酸激酶抑制剂失效后基于抗PD1 Ab的二线免疫疗法中的RCC。
图12.Kaplan-Meier无进展生存期曲线以及Cox回归单变量分析，其根据血清中sMAdCAM-1的中值使用212名RCC患者的Logrank统计检验。酪氨酸激酶抑制剂失效后基于抗PD1 Ab的二线免疫疗法中的RCC。
图13.生物标志sMAdCAM-1预测抗PDL-1 Ab德瓦鲁单抗在预治疗的二线转移性膀胱癌患者中的临床益处的功效.
A.反应者(精英患者，PFS>5个月)和非反应者(进展者，OS>6个月)中，在德瓦鲁单抗之前基线时以及疗法期间1个月和4个月时患者血清中sMAdCAM_1浓度，每个点代表一个时间点和患者，每个患者被代表3次。B-C.根据整个队列内MAdCAM_1的中值分离的患者中sMAdCAM_1和Kaplan-Meier生存曲线(OD，B)和PFS(C)的预测值的Logrank单变量分析。
具体实施方式
根据第一方面，本发明涉及一种用于在患有癌症的个体中体外诊断癌症或抗生素相关联的肠生态失调的方法，该方法包括测量来自所述个体的血清样品中的可溶性MAdCAM-1(例如，通过ELISA)，其中血清可溶性MAdCAM-1水平的降低指示个体患有癌症或抗生素相关联的肠道生态失调。
或者，可以通过评估患者回肠活检中回肠固有层(LP)小静脉或高内皮小静脉(HEV)中MAdCAM-1的表达来执行以上方法，其中LP或HEV中MAdCAM-1表达的降低指示该个体患有癌症相关联的回肠病变(ileopathy)/生态失调。在这种情况下，MAdCAM-1的表达可以通过RT-PCR或采用ELISA或流式细胞术或对活检执行的免疫组织化学法进行测量。
本发明因此涉及血清可溶性MAdCAM-1水平作为癌症或抗生素相关联的生态失调的标志的用途，其中血清可溶性MAdCAM-1水平的降低是癌症或抗生素相关联的生态失调的标志。
如以下实验部分所显示，本发明人已展示，个体血清中可溶性MAdCAM-1的水平也是对免疫肿瘤学(I-O)疗法的抗性或敏感性的标志，其中血清可溶性MAdCAM-1水平的降低是对I-O疗法的抗性的标志。
根据本发明，个体血清中可溶性MAdCAM-1的水平可因此用于评估该个体是否可能对免疫肿瘤学(I-O)疗法产生抗性(低水平)。血清可溶性MAdCAM-1水平正常(或升高)是临床益处的标志。
在本文中，短语“I-O疗法”包括免疫检查点抑制剂(ICI)，以及CAR-T细胞、过继性TIL转移以及它们的组合。在本发明的上下文中，“I-O疗法”还包括联合疗法，包括上述I-O试剂之一以及其它抗肿瘤治疗剂，如化疗，尤其是免疫检查点抑制剂(ICI)与紫杉烷、培美曲塞、顺铂和/或奥沙利铂(oxaliplatinum)、或EGFR抑制剂的任何组合。
在本发明的上下文中，“ICI”包括抗PD1抗体(Ab)、抗PDL-1 Ab、抗CTLA4 Ab、抗Lag3 Ab、抗Tim3 Ab、抗TIGIT Ab、抗OX40 Ab、抗41BB Ab、抗VISTA Ab、靶向PD1和Lag3的双特异性抗体，以及发挥一种或多种相同功能的其它分子，如阻断任何上述免疫检查点的非-Ab分子。根据具体实施方案，I-O疗法包括抗PD1/PDL-1 Ab，例如阻断PD1或PDL-1的单克隆Ab。
在某些治疗抗性的情况下，已经显示ICI药物不仅无效，而且甚至具有有害效应，导致快速肿瘤进展(即，超进展性疾病或HPD)。因此，至少在不采用补偿性治疗或联合疗法以避免HPD发作的情况下，鉴定出可能抵抗I-O治疗的患者对于决定不对该患者施用I-O治疗至关重要。
本发明特别可用于评估在首次施用I-O疗法/ICI之前60天和之后42天范围内时段期间服用广谱抗生素的个体的抗性状态。事实上，如下实验部分所显示，广谱抗生素提高了与I-O抗性相关联的生态失调的风险。
当执行以上方法时，当血清可溶性MAdCAM-1水平低于预定阈值时，认为该血清可溶性MAdCAM-1水平降低。该阈值可为例如代表性队列，如患有癌症(优选地与测试个体相同的癌症)的个体的队列中可溶性MAdCAM-1水平的中值。甚至更优选地，代表性队列是患有与测试个体相同的癌症并且在相同的治疗方案中接受I-O疗法/ICI的个体的队列(尤其地，作为同一疗法线，至少区分开1L vs≥2L疗法)。技术人员可以通过测量享有相同治疗史并接受相同I-O疗法的患者队列中可溶性MAdCAM-1水平的中值来改进阈值。在以上所公开的实验结果中，在采用或不采用化学疗法的情况下，在用抗PD1/L-1抗体治疗的晚期非小细胞肺癌(NSCLC)患者的探索和验证队列中，该中值分别为177.1ng/ml和233.3ng/ml(实施例1)，而其在二线疗法中用纳武单抗治疗的肾癌患者的队列中为88.8ng/ml(实施例2.1)，并且在用德瓦鲁单抗治疗的预治疗的转移性膀胱癌患者的队列中为158.8ng/ml(实施例2.2)。
或者，可以由未患有癌症的个体的队列来计算预定阈值。例如，如果血清可溶性MAdCAM-1水平处于未患有癌症的个体的队列的下三分位数，则可认为该血清可溶性MAdCAM-1水平降低。
对于患有适合于单独地或与化学疗法或酪氨酸激酶抑制剂或激素疗法(雄激素或雌激素剥夺、或LHRH拮抗剂)联合的免疫疗法的癌症的患者，以上方法特别令人感兴趣。
这样的癌症的实例包括乳腺癌、慢性粒单核细胞性白血病(CMML)、结直肠癌、肾癌、肺癌(例如NSCLC)、尿路上皮癌、黑素瘤、卵巢癌、胃癌和食道癌、间皮瘤、肝癌、前列腺癌，以及组织学不可知且FDA针对其批准抗PD1 Ab的任何错配修复功能不全(MSI)高肿瘤。根据具体实施方案，个体患有选自NSCLC、黑素瘤、乳腺癌、肾癌、膀胱癌以及结直肠癌的癌症。
本发明还涉及一种用于确定患有癌症的个体在施用免疫肿瘤学(I-O)疗法之前是否需要补偿性以微生物群为中心的干预(MCI)的治疗诊断方法，该方法包括通过以上方法来评估该个体是否患有癌症或抗生素相关联的生态失调，其中如果该个体患有癌症或抗生素相关联的生态失调，则他/她在施用I-O疗法的治疗之前需要MCI。
在某些病例(诸如肺癌)中，MCI可以与另一种治疗，例如与化疗联合以避免HPD。
在本文中，短语“以微生物群为中心的干预(MCI)”指定了对肠微生物群的组成具有直接或间接效应的任何治疗。
根据本发明的MCI的实例包括：
-口服万古霉素抗生素(例如，与治疗艰难梭菌(C.difficile)感染相同的方案)，
-杀伤肠道梭状菌(Enterocloster)新属进化枝细菌的噬菌体，
-稀有切割核酸内切酶，诸如工程化成杀伤肠道梭状菌新属进化枝细菌的CrisprCas9，
-可能与其它有益细菌混合阿克曼氏菌属和/或嗜黏蛋白阿克曼氏菌，
-视黄酸，
-粪微生物移植(FMT)，尤其是采用经证明提高固有层内皮细胞中MAdCAM-1表达水平的产品，例如通过如下所述的方法，以及
-以上治疗的混合物。
在以上中，如果噬菌体和核酸内切酶能够杀伤与Haas和Blanchard,Int J SystEvol Microbiol 2020；70:23–34中报道的分支分类学相对应的肠道梭状菌列表的至少一个菌种的细菌，则噬菌体和核酸内切酶被认为是“杀伤肠道梭状菌新属进化枝的细菌”。
该列表包括：
asparagiformis梭菌/芦笋状肠道梭状菌(Clostridium/Enteroclosterasparagiformis)
lavalense梭菌/肠道梭状菌(Clostridium/Enterocloster lavalense)
boltae梭菌/波尔特氏肠道梭状菌(Clostridium/Enterocloster boltae)
clostridioforme梭菌/小梭形肠道梭状菌(Clostridium/Enteroclosterclostridioforme)
奇特龙梭菌/奇特龙氏肠道梭状菌(Clostridium/Enterocloster citroniae)
阿尔顿梭菌/aldenense肠道梭状菌(Clostridium/Enterocloster aldenense)
共生梭菌/symbosium肠道梭状菌(Clostridium/Enterocloster symbosium)
哈撒韦氏亨盖特氏菌(H.Hathewayi)
Hungatella effluvia
本发明还涉及用于MCI的试剂(如上所列的那些)与I-O疗法联合用于在患有癌症诱导的生态失调的个体中治疗癌症的用途。
本发明的另一个目的是一种用于追踪MCI的成功的方法，该方法包括测量血清可溶性MAdCAM-1水平，其中血清可溶性MAdCAM-1的正常化水平指示MCI成功地恢复了肠道生态平衡、或至少部分地纠正了生态失调。
当执行该方法时，如果血清可溶性MAdCAM-1水平高于预定阈值(如上所述)，则该血清可溶性MAdCAM-1水平可被视为“正常化”。或者，如果其高于MCI之前，则其可被视为“正常化”或至少“部分正常化”。
本发明还涉及血清可溶性MAdCAM-1水平作为预测经历心血管事件的高危重度吸烟者(HRHSCV)中早期NSCLC发病率的生物标志的用途，其中血清可溶性MAdCAM-1水平的降低是预测NSCLC发作的标志。
在随后的实验部分中，发明人展示，在肠生态失调的情况下，PD1阻断有利于GALT中的TH17/Tr17扩增和归巢至肿瘤。它们还显示在这种情况下，阻断IL-17A生物活性可以规避生态失调的有害效应。
因此，对于通过上述方法之一而被鉴定为可能对抗PD1 Ab治疗有抵抗的患者，联合IL-17A和PD1阻断在临床上非常令人感兴趣。
此外，IL-7控制α4β7整合素表达并且在T细胞上印记肠道归巢特异性，作用于在炎性肠病中迁移性Tr17上高度表达的CD127(Belarif等人,J.Cin Invest,2019年5月,第129卷,第5期)。
因此，对于通过上述方法之一而被鉴定为可能对抗PD1 Ab治疗有抵抗的患者，联合重组IL-7与PD1阻断是另一临床上非常令人感兴趣的选项。
因此，本发明的另一方面是联合疗法用于在具有低血清可溶性MAdCAM水平的患者中治疗癌症的用途，该联合疗法包含(i)抗PD1或抗PDL1抗体，以及(ii)抗IL17A或抗IL-17R抗体和/或重组IL-7。
在以上联合疗法中，两种或更多种试剂可以一起或分开施用，首先通过阻断IL-17R或IL-17，然后抑制PD1或PDL-1/PDL-2。
本发明的其它方面涉及用于鉴定能够使固有层内皮细胞中的MAdCAM-1表达水平正常化的试剂的方法和工具。
这样的方法包括(i)将表达MAdCAM-1、或工程化成在MAdCAM-1启动子的控制下表达报告基因的细胞与待测试的化合物在体外接触，以及(ii)评估所述化合物中的何种诱导了MAdCAM-1或在MAdCAM-1启动子的控制下表达的报告基因的表达。
可用于执行该方法的细胞的实例包括人脐静脉内皮细胞(HUVEC)、转化的窦内皮细胞(TSEC)、bEnd.3细胞以及它们的衍生物(特别是通过在MAdCAM-1调控元件的控制下稳定整合报告基因而从这些细胞系衍生的工程化细胞)。
根据另一种方法，将待测试的化合物施用于肠道人源化替身小鼠，并且测量所述小鼠的内皮细胞中MAdCAM-1的表达。
这两种方法也可以结合起来。
在这种组合的筛选方法中，体外结果是通过在替身小鼠中验证的步骤来完成的，其中替身小鼠是用8-10天广谱ATB预处理并然后经口服强饲法用人FMT产品再定植的肠道人源化小鼠，其中：
(i)FMT产品已被鉴定为在表达MAdCAM-1或工程化成在MAdCAM-1启动子的控制下表达报告基因的细胞中诱导MAdCAM-1的表达，或者
(ii)FMT产品已被鉴定为不诱导这样的细胞中MAdCAM-1的表达，并且富含有另一种已被鉴定为诱导这些细胞中MAdCAM-1表达的试剂，或者
(iii)FMT具有与生态平衡或高可溶性MADCAM-1相关联的分类组成(在我们的数据库中或作为任何先前实验的结果)。
根据本发明的方法还可包括：
(i)在强饲后8天，处死所述肠道人源化替身小鼠中的一些以在FMT接受者中运行基于MAdCAM-1和Foxp3的回肠PCR(并任选地IHC染色)，并将它们与对照(连续ATB)进行比较；
(ii)在肠道人源化替身小鼠中的MAdCAM-1显著上调的情况下，在每组至少3只小鼠中接种皮下肉瘤并用抗PD1 Ab对它们进行治疗，以确保与ATB治疗的小鼠相比，这种FMT可以介导治疗功效；
(iii)如果肠道人源化替身小鼠对所述抗PD1 Ab的治疗作出反应，则推断用于富集它的FMT产品或非FMT试剂能够使固有层的内皮细胞中的MAdCAM-1表达水平正常化。
用于执行以上方法的筛选平台也是本发明的一部分。这样的平台包含在MAdCAM-1启动子的控制下表达报告基因的细胞(例如，HUVEC、TSEC或bEnd.3细胞、或由它们衍生的细胞)以及机器人，该机器人被配置用于在产品库中挑选试剂，将这些递送至培养的细胞并评估报告基因的表达(例如，如果报告基因表达荧光蛋白，则通过测量荧光)。
如上所提及，癌症患者的血清中可溶性MAdCAM的低水平是该患者中肠道生态失调的标志，可能诱导对I-O疗法的抗性，使得该患者需要I-O疗法之前的补偿性制备剂，并且可以有利地受益于包括以下步骤的治疗：
(i)施用选自上述那些的MCI，以及
(ii)施用选自上述那些的I-O疗法。
在开始或继续I-O疗法之前测量癌症患者的血清中可溶性MAdCAM的水平(例如，通过上述方法)有助于确定患者是否需要联合治疗(MCI+I-O)。
该措施特别有用的患者是在首次施用ICI，尤其是抗PD1/PDL-1 Ab之前60天和之后42天范围内时段期间服用广谱抗生素的那些，因为他们更有可能患有严重的肠道生态失调。
有利地，可溶性MAdCAM血清水平的新测量在以上步骤(ii)之前进行，以检查MCI是否降低了癌症相关联的生态失调。
当执行以上联合治疗(MCI+I-O)时，在不到60天前接受过广谱抗生素的个体可以有利地接受粪便微生物移植，其可能富集经巴氏灭菌的阿克曼氏菌属和/或嗜黏蛋白阿克曼氏菌；并且在不到60天前未曾接受过广谱抗生素的个体可以有利地接受活的阿克曼氏菌属和/或嗜黏蛋白阿克曼氏菌。
本发明的其它特征也将在随后在本发明的框架内执行的生物测定的描述过程中变得显而易见，并且该生物测定为本发明提供了所需的实验支持，而不限制其范围。
实施例
实施例1：抗生素破坏回肠MAdCAM-1/α4β7轴，从而在PD-1阻断期间损害肿瘤免疫
监视
材料和方法
医疗中心和转化研究的监管批准。
粪便材料.对于粪便收集，根据伦理准则和当地CCPPRB的批准，在InstitutGustave Roussy/France进行了辅助研究。研究名称为“Oncobiotics”，B2M伦理协议编号PP：15-013。从所有患者获得了根据赫尔辛基宣言(Declaration of Helsinki)的书面知情同意书。为了收集内窥镜和血液样品，根据伦理准则和Karlsruhe的批准，在University Clinics Heidelberg/Germany进行了临床研究“Einfluss vonAntibiotika auf das Darm-Chemokinnetzwerk bei Patienten mit soliden Tumoren”。符合条件的患者患有鳞状或非鳞状组织学的IIIA-IV期非小细胞肺癌(NSCLC)，并在至少一线既往治疗后记录了复发或进展。参与地点为古斯塔夫鲁西癌症中心(Gustave RoussyCancer Campus)(Villejuif,France)。NSCLC患者接受过抗PD-1 mAb纳武单抗，作为欧洲医疗机构(European Medical Agency，EMA)批准的治疗模式的一部分。使用实体瘤反应评价标准1.1版(Response Evaluation Criteria in Solid Tumors version 1.1，RECIST1.1)评估肿瘤反应。计算机断层摄影(CT)扫描在基线处执行，以及在第一年每8至12周，并然后每12至15周执行，直到疾病进展。在首次注射(T0)之前，根据国际人类微生物组标准(International Human Microbiome Standards，IHMS)指南(SOP 03V1)收集粪便。简而言之，向患者给予包括厌氧发生器(Biomerieux)的采集盒。样品由患者在家中收集，并之后在古斯塔夫鲁西癌症中心，在含有或不含BHI+2％甘油的塑料管(1000-Sarstedt的塑料容器)中于-80℃冷冻4至24小时。
收集内窥镜样品和血液样品.符合条件的患者在2018年7月至2019年11月之间根据非研究相关适应症的临床标准方案(表1)经历了回肠结肠镜检查。当可行时，对每名患者执行末端回肠、盲肠，以及左右结肠的粘膜的内窥镜活检。组织样品在液氮中急冻并储存于-80℃下，或者浸入到2％ PFA中以供组织学检查。此外，在回肠结肠镜检查之前收集两份血液样品(10ml EDTA管)。所有纳入的患者均回答了一份评估饮食史的问卷，并从当地临床信息系统中检索临床基线数据。
细胞培养物、试剂和肿瘤细胞系。将MCA-205纤维肉瘤细胞、MC38和RET黑素瘤细胞(即，在驱动自发黑色素瘤形成的金属硫蛋白-1启动子的控制之下，通过转基因强制表达Ret原癌基因而生成的黑素瘤，由Prof.Viktor Umansky友情提供)(均为C57BL/6小鼠的同基因)在5％ CO2存在下在含有10％ FCS、2mM L-谷氨酰胺、100UI/ml青霉素/链霉素、1mM丙酮酸钠和MEM非必需氨基酸的RPMI 1640(此后称为完全RPMI 1640)中于37℃培养。将荧光素酶转染的TC-1细胞系(C57bl6小鼠的同基因，由Pr.Eric Deutsch,Institut GustaveRoussy,France友情提供)在5％ CO2存在下在完全RPMI 1640和1mM Hepes缓冲液中于37℃培养。定期测试细胞系的支原体污染，并且超过10代后不再使用。
小鼠。所有动物实验均遵守法国和欧洲法律法规进行。当地机构动物伦理委员会和French Ministère de la Recherche批准了所有小鼠实验(许可号：2016-049-4646,2017_049_99741,2019_036_21124)。实验根据政府和机构的指南和法规执行。雌性C57BL/6购自Harlan(France)。使用7至12周龄的小鼠。MAdCAM-1-KO和ITGB7-KO小鼠是来自AngelaSchippers(University hospital Aachen,Aachen,Germany)的友好礼物。将MAdCAM-1-KO和ITGB7-KO小鼠与对照同窝仔在C57BL/6背景下进行回交，并且从University HospitalAachen的当地动物护理设施的内部品种获得。CCR5-KO小鼠是来自Christophe Combadière(Hopital Salpetrière,Paris,France)的友好礼物。CCR9-KO小鼠是Reinhold(University hospital Hannover,Hannover,Germany)的友好礼物。CCR5-KO和CCR9-KO小鼠均维持在C57BL/6背景下。所有小鼠实验均在古斯塔夫鲁西癌症中心的动物设施处执行，其中动物在无特定病原体条件下圈养。
抗生素处理。如果未另外指明，采用添加到小鼠无菌饮用水中的含有氨苄青霉素(1mg/ml)、链霉素(5mg/ml)和粘菌素(1mg/ml)(Sigma-Aldrich)的广谱抗生素溶液(ATB)对小鼠进行处理。在使用单一抗生素的实验中，浓度分别为氨苄青霉素(1mg/ml)、链霉素(5mg/ml)、粘菌素(1mg/ml)、红霉素(1mg/ml)或环丙沙星(0.1mg/ml)。溶液和瓶每周更换2次。在使用抗生素混合物的实验中，通过在37℃以及有氧和无氧条件下，每周在COS(含有5％羊血的哥伦比亚琼脂)平板上培养以0.1g/ml重悬于BHI+15％甘油中的粪便颗粒48小时，对抗生素活性进行确认。基于实验设置，ATB处理的持续时间略有不同(aPD-1处理前7-14天)，并在每个实验的结果中指示。简而言之，为了损害抗PD-1 mAb的功效，在肿瘤植入前用ATB处理小鼠一至两周，并且ATB在整个实验中持续或者在抗PD-1处理开始的当天停止，如单独实验所指示。在粪便微生物移植实验的上下文中，小鼠接受3天的ATB，然后次日使用动物喂食针经口服强饲经历粪便微生物移植。在TC-1模型中，ATB处理在肿瘤注射前3天开始，并在第一次细菌强饲前一天停止。
MCA-205肉瘤、MC38和RET黑素瘤的皮下模型。向同基因C57BL/6小鼠经皮下分别植入0.8×106个MCA-205肉瘤、1.0×106个MC38或0.5×106个RET黑素瘤细胞，并在肿瘤尺寸达到20至40mm2时经腹膜内(i.p.)用抗PD-1 mAb(250μg/小鼠；克隆RMP1-14)或同种型对照(克隆2A3)处理。小鼠以3天的间隔注射4次抗PD-1 mAb。每周借助于卡尺常规监测肿瘤长度和宽度3次。在使用抗a4b7 mAb(DATK32，每只小鼠200μg)或抗MadCAM mAb(MECA-367，每只小鼠200μg)的实验中，从第0天开始每3天i.p.注射mAb(或其同种型对照，两种情况下均为克隆2A3)直到最终抗PD-1注射。所有抗体均购自BioXcell,NH,USA。
原位荧光素酶工程化-TC-1。C57BL/6小鼠用异氟烷麻醉。在无菌条件下，在每只小鼠的胸壁上作出一个侧切口，并将10μl基质胶(Corning)中的6×105个TC-1-Luc细胞注射到肺中。用手术皮肤小夹钳闭合皮肤切口。在IVIS Imaging System 50系列(Caliper LifeSciences/Xenogen)上每周监测肿瘤生长两次。在第3天开始，根据与以上相同的剂量和计划表，向小鼠注射抗PD-1 mAb或推荐的同种型。
FMT实验。通过解冻粪便材料执行粪便微生物群转移(FMT)。小鼠置入新笼中。然后将200μL悬浮液经口服强饲转移到每个无菌或ATB预处理的(3天)接受者中。此外，将另100μL施加到每只动物的毛皮上。在FMT后两周，皮下或原位注射肿瘤细胞，并用如上所提及的抗PD-1或同种型对照处理小鼠。如下所述，在aPD-1处理的同一天执行口腔细菌强饲。
用共生菌种的口服细菌强饲。嗜黏蛋白阿克曼氏菌CSUR P2261和A.indistinctusCSUR P723由Institut hospitalo-universitaire Méditerranée Infection(Marseille,France)提供。小肠肠球菌(Enterococcus hirae)13144分离株最初从古斯塔夫鲁西癌症中心经CTX处理的SPF小鼠的脾或肠系膜淋巴结中分离出。嗜黏蛋白阿克曼氏菌在COS平板上在使用三柱厌氧发生器(Biomerieux)创建的厌氧气氛中于37℃生长至少72小时。使小肠肠球菌(E.hirae)13144在37℃和有氧条件下在富含5％羊血的哥伦比亚琼脂上生长24小时。用100μl的含有1×108个细菌的悬浮液经口服强饲对ATB预处理的或GF C57BL/6小鼠执行定植。对于细菌强饲：使用荧光分光光度计(Eppendorf)以600nm的光密度在PBS中获得109CFU/mL的悬浮液。对每只小鼠执行五次细菌强饲——第一次在首次注射抗PD-1 mAb之前24小时，以及随后四次在抗PD-1 mAb注射的同一天。通过在强饲后48小时培养粪便来确认小肠肠球菌13144定植的功效。收获粪便颗粒并以0.1g/ml重悬于BHI+15％甘油中。将粪便的系列稀释液铺板到富含5％绵羊血的哥伦比亚琼脂上，并在需氧和厌氧条件下于37℃孵育48小时。48小时后，分离单菌落并执行革兰氏染色。特定细菌的鉴定使用基质辅助激光解吸/电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱仪(Andromas,Beckman Coulter,France)实现。
流式细胞术分析。如单独实验所指示，在不同时间点收获肿瘤、肠系膜淋巴结(mLN)、引流淋巴结(tdLN)和脾。将切除的肿瘤切成小块，并在含有25μg/mL的LiberaseTM(Roche)以及150UI/mL的DNase1(Roche)的RPMI培养基中于37℃消化30分钟，然后粉碎并使用100和70μm细胞过滤网(Becton&Dickinson)过滤两次。使淋巴结和脾在RPMI培养基中粉碎，随后通过100μm细胞过滤网过滤两次。在膜染色之前，将400万个肿瘤细胞、淋巴结细胞或脾细胞与纯化抗小鼠CD16/CD32(克隆93；eBioscience)一起在4℃下预孵育30分钟。对于细胞内染色，使用Foxp3染色试剂盒(eBioscience)。死细胞使用Live/Dead可固定黄色死细胞染色试剂盒(Life Technologies)或LIVE/DEADTM可固定浅绿色死细胞染色剂试剂盒排除。针对CD3(145-2C11)、CD4(GK1.5或RM4-5)、CD8(53-6.7)、CD25(3C7)、CD44(IM7)、CD45(30-F11)、CD62L(MEL-14)、CD127(A7R34)、Foxp3(150D)、RORγt(B2D)、CXCR3(FAB1685P)、CXCR5(J252D4)、CCR2(SA203G11)、CCR4(2G12)、CCR5(HM-CCR5)、CCR6(29-2L17)、CCR7(4B12)、CCR9(CW-1.2)、β7(FIB504)、a4b7/LPAM-1(DATK32和REA457)、MadCAM-1(MECA367)的抗小鼠抗体(均购自Miltenyi、BioLegend和eBioscience)用于染色细胞。在CytoFLEX S13 colours(Beckman Coulter)或BD Facs CANTO II(BD)上采集染色样品，并用Kaluza软件1.5(Beckmann Coulter)执行分析。T中枢记忆(TCM)门控：对CD3+活进行门控后，选择CD4+，然后TCM被鉴定为CD62L+。效应记忆T(TEM)细胞被选择为CD62L和CD44+。Th17门控取决于所使用的小鼠模型。Kaede荧光染料在用PFA固定后不保留其光转化状态。Th17门控：对CD3+活进行门控后，选择CD4+，然后Th17被鉴定为RORγt+。对于未固定的细胞，Th17被鉴定为CXCR3-和CCR6+。Treg门控：对CD3+活进行门控后，选择CD4+，对于固定的细胞，Treg被鉴定为FoxP3+CD25+。对于未固定的细胞，Treg被鉴定为CD127-CD25+。为了定义截止值，视情况而定使用荧光减一(FMO)对照。
免疫组织化学。将福尔马林固定、石蜡包埋的鼠回肠和结肠的3μm厚切片制备为“瑞士卷”，并固定到聚-L-赖氨酸包被的载玻片上，脱蜡并通过分级醇水合到水中。通过在98℃下缓冲液中加热切片30分钟进行抗原修复(分别用0.01M柠檬酸钠缓冲液，pH 6.0，用于CD3染色，以及用1mM EDTA，pH 8.0，用于FoxP3染色)。内源性过氧化物酶活性采用3％过氧化氢酶(DAKO)抑制10分钟，然后用PowerVision IHC/ISH Super封闭溶液(LeicaBiosystems,#PV6122)饱和20分钟。在不洗涤的情况下，施加兔抗人CD3多克隆Ab(即用型，DAKO，#IS503)和兔抗小鼠Foxp3多克隆Ab(2μg/ml，Invitrogen，#PA1-46126)一抗并孵育1小时，继之以二抗，即PowerVision聚辣根过氧化物酶缀合的抗兔抗体(Leica Biosystems#PV6119)。借助于二氨基联苯胺(DAB)-过氧化物酶底物试剂盒(DAKO)检测过氧化物酶，并用Mayer苏木精对切片进行复染。CD4的免疫组织化学染色在自动免疫染色仪(The BenchMarkULTRA,Ventana,IGR)上执行。在EDTA缓冲液(pH 8.0)中于95℃执行热诱导的抗原修复32分钟。将一抗单克隆抗小鼠CD4抗体(1,246μg/mL，#ab183685，Abcam)用抗体稀释剂(Zytomed)以1:500稀释，并将载玻片在37℃下孵育1小时。应用以DAB为色原的无生物素过氧化物酶检测技术系统(kit ultraView Universal DAB Detection kit,Ventana)。还借助于苏木精试剂盒(Ventana)对载玻片进行复染。
Kaede实验。Kaede小鼠是来自Michio Tomura(Kyoto University,Kyoto,Japan)的友好礼物，并在C57BL/6背景下回交并维持。将Kaede转基因小鼠用2至2.5％异氟烷麻醉，并i.p.施用丁丙诺啡(0.01mg/kg)用于镇痛。对于回肠的光转化，在中线处切割腹部皮肤和腹膜以进入腹膜内末端回肠。对于结肠、回肠或包括肠系膜淋巴结在内的回肠的光转化，鉴定盲肠窝，并将盲肠窝(包括末端回肠、肠系膜淋巴结和近端结肠)通过腹中线切口轻轻地移动到无菌塑料涂层外科盖布上。非目标结构用铝箔覆盖。使目标结构的腹侧和背侧部分暴露于从395nm波长发射二极管(Winzwon)灯发出的紫外光中各30秒。在照射后，将组织用无菌等渗氯化钠润湿并轻轻地重新定位到腹膜腔中。腹膜用5-0单丝尼龙缝线(Ethicon)连续缝合进行闭合。皮肤用两个9mm创伤夹(EZ Clip Kit)进行闭合。
使用CFSE追踪肠系膜和肿瘤引流淋巴结中白细胞的迁移。将C57Bl6小鼠用2至2.5％异氟烷麻醉，并i.p.施用丁丙诺啡(0.01mg/kg)用于镇痛。在中线处切割腹部皮肤和腹膜以进入肠系膜淋巴结。将肠系膜淋巴结通过腹中线切口轻轻移动到无菌塑料涂层外科盖布上。回肠引流肠系膜淋巴结根据其脉管系统进行视觉鉴定。使用30G胰岛素注射器，向两个最突出的肠系膜淋巴结注射经5μl PBS稀释的100μM CFSE。在重新定位肠系膜淋巴结之后，腹膜用5-0单丝尼龙缝线(Ethicon)连续缝合进行闭合。在肿瘤引流淋巴结的情况下，在中线切开腹部皮肤，使腹膜不受伤害。通过使用剪刀轻轻分离腹部皮肤和腹膜来可视化肿瘤引流淋巴结。使用30G胰岛素注射器，向肿瘤引流淋巴结注射经5μl PBS稀释的100μMCFSE。皮肤用两个9mm创伤夹(EZ Clip Kit)进行闭合。
RNA提取和rtPCR。对于人类和小鼠样品，裂解和提取方案相同。将肿瘤或肠样品在液氮中急冻在含有0.1％β巯基乙醇的RLT Plus缓冲液中。在提取当天，将样品在4℃下解冻，并且在微型管匀浆器(Benchmark Scientific)上无RNA玻璃微珠管(Dutscher)中均质化。按照制造商的建议，用RNeasy Mini试剂盒(Qiagen)执行总RNA提取和基因组DNA移除。采用由SuperScript III逆转录酶(Life Technologies)、RNaseOUTTM重组核糖核酸酶抑制剂(Life Technologies)、随机引物(Promega)和PCR级脱氧核苷三磷酸(DeoxynucleosideTriphosphate Set)(Roche Diagnostics)构成的混合物，使通过使用NanoDropTM分光光度计(Thermo Fischer Scientific)测量的最多1μg的RNA逆转录成cDNA。
通过Rhapsody进行单细胞RNA测序。在通过流式细胞术分离CFSE+CD4+ T细胞之后，将细胞在冷PBS中洗涤，将10.000个细胞加载到BD RhapsodyTM柱上，并根据制造商针对靶向单细胞RNA-seq的说明书，使用预先设计的免疫反应组(Immune Response Panel)(小鼠)进行处理。文库在NextSeq500系统(Illumina)上以1.75pM聚集，以使用High Output v2chemistry为每个细胞生成约40.000个配对末端(2*75bp)读段。使用bcl2fastq2 v2.20，对测序的单细胞数据进行解复用。
定量基因表达测定。B2M、FoxP3、IFNγ、IL-10、IL-17、MadCAM、Ppia、RORc、TNFα(均来自Life Technologies)的表达在StepOnePlusTM实时PCR系统(Life Technologies)上使用Universal Master Mix II采用基因表达测定进行分析。使用以下斜坡曲线进行扩增：95℃下10分钟的1个循环，继之以95℃下30秒、60℃下1分钟的45个循环。定量RT-PCR数据借助于2-ΔCt法乘以106归一化为管家基因β2M或Ppia的表达水平，如每个图所指示。
组织裂解和趋化因子分析。将肠和肿瘤样品在液氮中急冻在含有50mM Tris HCLpH 7.4、150mM NaCL、300mM蔗糖、10mM EDTA和0.1％ Triton 100X的非变性细胞裂解缓冲液中。对于后续裂解，将样品在4℃下解冻，并管式匀浆器(Precellys)上陶瓷珠裂解管(Precellys)中裂解。将组织匀浆以4000g离心5分钟。上清液用于后续分析。使用CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL25和MadCAM Duoset ELISA试剂盒(RnD)或者使用Legendplex小鼠促炎性趋化因子小组(Biolegend)，采用在CytoFLEX S(Beckmann coulter)上执行的细胞术分析，根据制造商的建议测定组织裂解物中的趋化因子浓度。
统计学。小鼠。数据分析使用统计环境R(http://www.R-project.org/)或Prism 6(GraphPad,San Diego,CA,USA)执行。使用非参数t检验计算肿瘤尺寸差异。所有报告的检验都是双尾的，并且在p<0.05下被认为是显著的。患者。MADCAM-1作为NSCLC患者对PD1阻断反应的预测因子.使用4节点的限制性立方样条(RCS)研究了sMadCAM1水平的预后作用。根据Akaike信息标准选择节点的数量。我们测试了生物标志效应的非线性度。当线性假设未被拒绝时，使用线性编码来估计生物标志的效应。
结果
1.1.ATB下调小鼠和患者中MAdCAM-1回肠表达
我们报道了用广谱ATB混合物(氨苄青霉素、粘菌素和链霉素)对小鼠进行肠道灭菌减弱了PD-1阻断的抗癌功效(Routy等人,2018a)。我们首先分析了经抗PD-1 mAb处理的MCA205荷瘤小鼠的肠中ATB诱导的趋化因子和整合素配体表达的波动。ATB诱导了大多数回肠趋化因子和Madcam1基因产物的表达显著损失(图5A，左和右图，图1A左图)，同时未能影响结肠和肿瘤趋化因子和Madcam1基因模式(图1A右图，图5A右图)。不仅在转录水平上，而且在蛋白质水平上监测了回肠Madcam1基因表达的降低，如在回肠组织的免疫组织化学(图1B)中、通过回肠CD45-LP细胞的流式细胞术(图1C)，以及回肠裂解物的免疫酶测定(图1D)中所测量。值得注意的是，在ATB施用下，肠构造和脉管系统的完整性得以保持，如由稳定化的CD31+血管数量所显示(图5B)。Madcam1基因表达的下降从施用ATB的第3天开始，并且当在服用ATB 7至14天时，在自发再定植(RECO)期间ATB停止后第12天没有恢复(图1D)。除了广谱ATB之外，其它ATB方案(如链霉素)不仅在回肠LP中，而且在肠系膜淋巴结(mLN)中也下调Madcam1基因表达，在该肠系膜淋巴结中Madcam1基因表达高于LP(图5C，左和右图)中以及派尔斑(PP)(图5D)中。与氨苄青霉素或红霉素相比，万古霉素未能下调mLN Madcam1表达，甚至增加了回肠LP中的Madcam1转录(图5C，分别右和左图)。值得注意的是，Madcam1(而非Vcam1)基因表达水平在肿瘤引流LN中比mLN中低10倍(图5E)。出于对于ATB对GALTMadcam1的有效抑制效应的兴趣，我们对经各种ATB方案处理的动物的回肠内容物在需氧和厌氧条件下进行了培养。回肠细菌菌落的质谱鉴定揭示了在ATB停止后4天普遍存在的属于肠道梭状菌新属进化枝细菌(如小梭形肠道梭状菌新组合、波尔特氏肠道梭状菌新组合(Haas和Blanchard,2020))的几个菌种(属)，但在其它实验条件下却非如此(图5F)。那些肠道梭状菌属此前在对PD1阻断有抗性的肾癌和肺癌患者的粪便中被鉴定出(Derosa等人,2020)、(Derosa等人,2022)。虽然万古霉素(其杀伤肠道梭状菌属)上调回肠Madcam1基因转录(图5C，左图)，但口服补充小梭形肠道梭状菌会消除这种效应，并进一步影响地址素表达(图1E)。相似地，在自发再定植阶段期间ATB停止后口服强饲小梭形肠道梭状菌会加剧Madcam1表达的丧失(图1F)。相比之下，口服强饲免疫原性共生体，如嗜黏蛋白阿克曼氏菌(Routy等人,2018a)、(Derosa等人,2022)或小肠肠球菌(Daillère等人,2016；Goubet等人,2021)可以进一步提高在无特定病原体(SPF)条件下饲养的易生小鼠的回肠组织中的基础Madcam1表达(图1G)。
来自受益于PD1阻断的黑素瘤患者的粪便的粪便微生物转移(FMT)可以规避三分之一转移性黑素瘤接受者对ICI的原发性抗性(Baruch等人,2021；Davar等人,2021)。事实上，不同的供体FMT未能将临床益处转移给接受者(表1)。因此，我们测试了来自肺癌或肾癌患者的随机FMT进入ATB处理的替身小鼠(如先前所报道，(Routy等人,2018a,2018b))是否可以下调在SPF条件下饲养的接受者小鼠中的回肠Madcam1基因表达。6种FMT中有三种做到了这一点(图1H，左图)，其对应于不同的分类组成，肠道梭状菌属的过高比例所定义，包括小梭形肠道梭状菌(或ATB相关的哈撒韦氏亨盖特氏菌(Derosa等人,2020)，在基于鸟枪宏基因组学的分析中与肠道梭状菌属共享相同的进化枝(Haas和Blanchard,2020))(图1H，右图)。
向FMT接受者口服补充各种共生体，包括促炎性极小陌生菌(Atopobiumparvulum)、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)而非哈撒韦氏亨盖特氏菌，可以进一步影响Madcam1回肠基因表达(图5G)。
回肠中ATB诱导的Madcam1基因下调与调节性细胞因子和转录因子(如Il17a、Il22、Foxp3、RORc)的下调平行且相关(图5A左图，图5H-I)。这些PCR结果得到了流式细胞术分析的支持，显示出ATB诱导的回肠LP中粘膜CD25+FoxP3+CD4+ T细胞(Treg)和RORγt+CD4+(TH17)T细胞群的显著损失(图1I)。事实上，ATB表型模拟了回肠LP中Madcam1基因缺陷或MADCAM1的抗体中和的回肠免疫调节效应(图1J)。
如小鼠中所显示，我们确认在16名服用ATB并经历针对各种适应症的肠内窥镜和活检的患者中ATB对Madcam1、Foxp3和Rorc肠表达的协调抑制效应(图1K，图5J，表2)。
总之，广谱ATB方案诱导了小鼠和人类中回肠黏膜地址素MADCAM1的持续下调，这与回肠Foxp3、Il17a和RORc表达的降低显著相关。
1.2.ATB-诱导向肠性α4β7+CD4+ T细胞从肠道外流到肿瘤引流淋巴结
我们假设MADCAM-1分子的丧失可影响GALT中表达其α4β7受体的向肠性T细胞的归巢或滞留。为了追踪荷瘤宿主中回肠T细胞的迁移，我们利用了两种互补的实验策略。首先，我们使用了转基因Kaede小鼠模型，其允许不可逆地标记细胞而不破坏其细胞完整性。该模型利用了遍在表达珊瑚衍生的可光转化荧光蛋白Kaede的报告小鼠(Tomura等人,2008)，该荧光蛋白在暴露于波长为350-400nm的紫外光后可从绿色光转化为红色。Kaede小鼠代表追踪肠TH17细胞向发炎外周器官迁移的强大工具(Krebs等人,2016；Magnuson等人,2015；Morton等人,2014)。为了追踪MCA205肿瘤携带者中GALT细胞的命运，在皮下肿瘤植入后第10天(D10)对回肠、盲肠和肠系膜LN进行光转化，并且在24小时后处死小鼠，以通过流式细胞术检测各种器官中的光转化细胞(图2A，图6A)。在照射五分钟后，我们在肠系膜LN中实现了大约60％的光转化率(图6A)。在24小时，仅22.8±2.6％的肠光转化(PC)白细胞保留在mLN中，但在远处部位，在脾(5.1±0.5％)和肿瘤引流淋巴结(tdLN)(4.0±0.3％)中可以检测到相当大百分比的GALT输出光转化(PC)细胞(图2A，图6A-B)。使用第二种方法，我们在通过外科规程直接CFSE标记mLN之后直接追踪羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记的细胞(Singh等人,2016)(图2B，图6C，左图)。在注射CFSE后24小时内，多至1.0±0.2％脾细胞、0.8±0.1％tdLN细胞以及0.2±0.02％的肿瘤驻留白细胞被mLN衍生的白细胞替代(图6C，右图)。回肠照射在动员肠道白细胞外流至tdLN或sc肿瘤方面不如GALT靶向方式那么有效(图6D)。然而，在24小时，局部和GALT照射均诱导了光转化的(PC)(肠衍生的)-CD4+T细胞的α4β7+级分选择性动员至脾、tdLN和sc MCA205，而与组织驻留(非PC)细胞相比，其它PC细胞亚群并未富集(图2A-B和图6E)。同样，在CFSE mLN标记后，肿瘤微环境(TME)内的绝大多数α4β7+CD4+T细胞为CFSE+(图2B，图6F)。证实了α4β7整合素在CD4+ T细胞肠道外流中的分子参与，我们显示出在用中和抗MAdCAM-1 Ab处理的荷瘤小鼠中，tdLN(而非对侧LN)中光转化或CFSE标记的细胞显著增加(图2C，左、中间和右图)。
为了解读从肠系膜LN迁移的α4β7+CD4+ T细胞的表型，我们执行了与从肿瘤携带者的mLN纯化的α4β7-CD4+ T细胞相比，对α4β7高CD4+ T细胞的批量RNA测序。α4β7高CD4+ T的转录谱突出显示了——不仅其Itga4(编码α4β7整合素)肠道标志——而且与Treg功能相关联的基因产物(如Icos、Ctla4、Cd74、Mki67、P2rx7(Daniel等人,2010))以及TH17(Il17re、Tnfsf11、Il22)极化也显著增加，而Tnfrsf9 T细胞共刺激基因产物(4-1BB)在该亚群中显著下调(图2D)。
接下来，我们结合使用两种成像方法与细胞内流式细胞术，探讨了ATB诱导的生态失调如何影响向肠性α4β7+CD4+ T细胞向肿瘤引流LN的外流(图2E-F)。再定植有利于分泌IL-17A的α4β7+Foxp3+CD4+ T细胞(肠衍生的Tr17)巢，而非α4β7-Foxp3+CD4+ T细胞(tdLN驻留-Tr17)或IL-17A+α4β7+Foxp3-CD4+ T细胞归巢至tdLN(图2E，图6G)。ATB表型模拟了madcam1基因缺陷(图2F)。实际上，ATB几乎没有增加tdLN的真正Treg库，该库由且主要由局部扩增的(肠外，CFSE阴性)细胞构成(图6H，左图)。Tr17的α4β7+CFSE+肠道迁移分数占在ATB后再定植期间每24小时达到tdLN中的总CD4+的0.2±0.1％(图6H，中图)。值得注意的是，在再定植期间迁移的向肠性Tr17不仅产生IL-17，而且产生IL-22(图6H，右图)。
中和抗MADCAM-1抗体也促进CD25高α4β7+CD4+ T的迁移(图2G)。ATB过程后的再定植伴随着肠道梭状菌属的出现(图5F)，我们试图通过强制口服强饲小梭形肠道梭状菌来模拟。事实上，这种细菌有利于PC(但不是非PC)TH17 CD25高(而非CD25-)α4β7+Tr17样CD4+T细胞向tdLN的肠道排出(图2H)。
由于光转化不允许精确的细胞内染色和高维表型分析，我们考虑了对肠道迁移细胞的更深入表征，对补充或未补充小梭形肠道梭状菌的14天ATB过程(或无ATB)后第4天CFSE注射mLN后24小时到达tdLN的CFSE+CD4+ T细胞执行了基于Rhapsody的单细胞RNA测序(图7A-B)。我们分析了收获的总共451,246个单独的CFSE+CD4+tdLN T细胞，分别在四组中各自分配(图7A-B)，并且表征了与ATB诱导的生态失调相关联的基因特征。CFSE+CD4+ T细胞的无监督聚类将数据分配到4个细胞簇中(图2H，左图)，我们使用t随机邻域嵌入对其进行了可视化，并通过报告的标记基因的表达进行了事后标记(Cano-Gamez等人,2020)。每个簇与不同的表型相关联。一个小簇的特征是由Foxp3、Nrp1、Il2ra、Tnfsf4、Ctla4和肠特异性基因表达印记(Tnfsf18，Rgs1)定义的原型泛组织效应Treg表达模式，且Tcf7和Cd52下调(Sefik等人,2015)(图2H，中图)。与稳态相比，该Treg亚群过表达了参与肿瘤免疫抑制的负免疫调节因子Pik3ip1(Chen等人,2019)并且下调了Fosb，即在再定植阶段期间参与CD95L介导的CD4+ T细胞凋亡的转录因子AP1的成员(Baumann等人,2003)(图7C)，这也与通过在再定植阶段或口服强饲小梭形肠道梭状菌期间Tr17蓝图(Sefik等人,2015)(Iksf2(也称为helios)和Lrrc32(也称为TGFβ激活剂GARP))相关联的基因的过表达而与所有其它迁移细胞形成对比(图7D右和左图)。相比之下，另一个具有增殖标志的簇(Pcna、Myc、Mapk1、Fyn、Hif1a)由Irf8，以及Pou2af1(也称为OBF1，其充当转录因子OCT1或OCT2的转录共活化剂)和Fas(这两者均分别通过抑制IL-2或IFNγ表达来促进TH17程序)主导(Yosef等人,2013)(图2H，右图)。该增殖性TH17亚群还与泛组织Treg(Il2rb、Ctla4、Icos)、肠Treg(如Bcl2a1a、Bcl6)以及皮肤Treg(Lgals3)共享原型标志。在ATB停止诱导的再定植和补充小梭形肠道梭状菌期间，caspase 1基因上调，伴随TNFRSF和细胞因子/趋化因子转导以及NFkb激活途径(Nfkb1、Cxcr3、Cxcr5、Eomes、Tnfrsf8、Tnfrsf9、Tnf、Fasl、Fas、Tigit、Icam1、Runx3、Jak2)，该caspase 1基因被描述为T细胞固有基因，独立于炎症小体，对于最佳引发病原体特异性Th17反应不可或缺(Gao等人,2020)(图7E，表3)。两个剩下的优势细胞簇享有肠道炎性活化和/或抑制的原型Il7r和Pik3ip1基因标志的表达(Belarif等人,2019；Chen等人,2019)。它们对于再定植期间的其它指纹(如Egr1、Foxo1、Stat6、Ikbkb转录因子与Btla、Cnot2和Dusp2)略有不同(图7F-G)，但都趋向于肿瘤免疫抑制特性(Dan Lu等人,2020；Kim等人,2019；Li等人,2012)。
因此，我们通过两种独立的追踪方法展示，在MAdCAM-1/α4β7轴受到损害的情况(通过抗MAdCAM-1 mAb或ATB-诱导的再定植)下，表现出免疫抑制性指纹的向肠性α4β7+CD4+(尤其是Tr17细胞)从GALT排出到肿瘤引流淋巴结对肿瘤免疫监视潜在有害。
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1.3.PD1阻断的抗癌功效依赖于MAdCAM-1/α4β7轴
鉴于报道的Tr17细胞在癌症免疫监视期间的免疫抑制作用(Blatner等人,2012；Rizzo等人,2018；Voigt等人,2017)以及健康肠道保留这些T细胞亚群的能力，我们预计MADCAM-1地址素或β7整合素的遗传缺陷或特异性抗体对MADCAM-1或α4β7异源二聚体的宿主中和可能会干扰治疗性抗PD-1mAb的免疫刺激能力。
首先，无论PD1阻断如何，回肠Madcam1表达的丧失均与MCA205荷瘤动物中肿瘤尺寸的增加相关(图8A)。接下来，我们观察到与携带来自C57BL/6小鼠的同基因可移植MCA205纤维肉瘤的野生型动物相比，Itgb7-/-或Madcam1-/-小鼠中PD-1抑制的抗癌功效显著降低(图3A)。类似地，尽管在中和抗MAdCAM-1或抗α4β7异源二聚体抗体的存在下PD1阻断，但来自BALB/c小鼠的同基因MCA205纤维肉瘤、原位TC1肺癌和4T1乳腺癌在体内生长，同时在MADCAM1/α4β7轴不受影响时对ICI作出反应(图3B-D)。在Madcam1-/-小鼠中，在脾(图3E，左图)和肿瘤中α4β7+CD4+ T细胞的再循环持续增加，其中它们占TIL的多至3％(图3E，右图)，如已经有描述(Denning等人,2005)。流式细胞术分析揭示，在自发性肿瘤进展期间，使用中和抗MADCAM-1 Ab阻断MAdCAM-1地址素/α4β7整合素轴重塑了TME，并导致RORγt+Treg(Foxp3+CD25+)Tr17细胞的瘤内积聚增加约3倍(图3F-G)。在没有任何操作的情况下，在MCA205 TME中，α4β7+CD4+TIL中多至76±1.5％为RORγt+Treg，其中α4β7-CD4+TIL内的含量低2-3倍(17±0.9％)(图8B)。在皮下肿瘤中，Treg占α4β7+CD4+TIL的12.1±1.0％，并且在这些Treg中，30.±+4.5％为RORγt+(表4)。
表4.侵入MCA205和4T1肿瘤的向肠性Tr17亚群比例的去卷积。
ATB停止后4天的再定植表型模拟了madcam-1基因缺陷，其诱导肿瘤床中RORγt+Treg(Tr17)的比例增加3-5倍(图3H)。值得注意的是，这种Tr17瘤内归巢是短暂的，并且在ATB停止后十二天不再观察到，除非施用抗PD1Ab时(图3H-I，图8C)。事实上，抗PD1 Ab有利于MCA205荷瘤小鼠中肠系膜LN中Tr17的引发和/或扩增(图8D)。抗PD1 Ab有助于维持和/或扩增Tr17的瘤内积聚，Tr17在MCA205(图3I，图8E)以及4T1肿瘤携带者(图8F，左和右图)中定义为Rorγt+Treg或IL-17+IL-22+Treg。在该上下文中，瘤内Treg占α4β7+CD4+TIL的18.7±3.4％，并且在这些Treg中，56.7±8.3％为RORγt+(表4)。
当ATB停止后经口服强饲补充小梭形肠道梭状菌时，由PD1抑制促进的Tr17募集进一步增加，而在类似条件下，口服罗伊氏乳杆菌则未能如此(图8G，右图和左图)。毫不奇怪地，抗PD-1 mAb疗法期间MAdCAM-1/α4β7轴的阻断显著损害了效应子CCR5+CD8+TIL的浸润(图3J)。
鉴于IL-17和IL-22具有直接和间接的促血管生成和促肿瘤生成效应(Lim和Savan,2014；Voigt等人,2017)，中和这一种或两种细胞因子可规避PD1抑制期间ATB后再定植的有害效应。我们通过ip注射抗PD1 Ab连同抗IL-17A中和抗体，对接种致瘤剂量的WT或IL-22Rα1-/-缺陷型乳腺4T1肿瘤细胞的小鼠进行处理(图3K，左图)。如所预期，IL-22Rα1-/-缺陷型乳腺4T1的生长比其WT对应物更缓慢。令人感兴趣地，抗IL-17A抗体可规避ATB的有害效应，对于WT或IL-22Rα1-/-缺陷型4T1的程度相似(图3K)，这表明肿瘤细胞对IL-22的反应性并非构成ATB免疫抑制效应的根本机制。
因此，我们得出结论，在肠生态失调的情况下，PD1阻断有利于GALT中TH17/Tr17的扩增和归巢至肿瘤。
通过外部操作重建α4β7/MAdCAM-1轴的适应度可能会恢复经ATB处理或患有明显肠道生态失调的肿瘤携带者对PD-1阻断的抗性。在开始PD1阻断之前恢复肠道生态平衡可能代表合理的选项。尽管有αPD-1 Ab，但短期ATB继之以来自复发患者的粪便菌群转移引起了回肠Madcam1下调(图1G)和PD-1阻断效率低下，除非宿主经口服嗜黏蛋白阿克曼氏菌进行补偿((Routy等人,2017)，图1F，图9A)。外源性嗜黏蛋白阿克曼氏菌的补偿效应取决于MAdCAM-1功能，因为中和抗体阻碍了这种共生药物的有益效应(图9B)。嗜黏蛋白阿克曼氏菌可以阻止α4β7+和CCR9+单或双阳性CD4+T细胞的肠道外流以及它们再循环至TME、再循环至tdLN(图9A，右图)，并且α4β7+CD4+IL-17+IL-22+和Tr17(图9C-D)以取决于MADCAM-1的方式(图9D)也是如此。
因此，恢复肠道生态平衡或中和IL-17A代表了抵消ATB诱导的对PD1阻断的抗性的潜在选项。
1.4.可溶性MAdCAM-1是晚期NSCLC患者对PD1阻断的抗性的预测生物标志物
由于肠组织活检难以获得，开发了友好使用的血液测定法，如sMAdCAM-1ELISA，以研究患有IBD并用抗异源二聚体α4β7抗体(如维多珠单抗)治疗的患者的随访(Holmer等人,2020)。然而，还没有在小鼠中监测到可溶性MAdCAM-1水平。我们发现了回肠madcam1基因表达与血清可溶性MAdCAM-1之间的稳健相关性(图4A)。接下来，我们分析了在法国(N＝186)以及法国和加拿大(N＝115)，在采用或不采用化疗情况下，在经抗PD1/L-1抗体治疗的两个独立的晚期非小细胞肺癌(NSCLC)患者队列中诊断时血清可溶性MAdCAM-1的临床意义(表5)。首先，与健康志愿者相比，NSCLC患者在两个队列中均具有降低的循环血清sMAdCAM-1浓度，服用ATB的患者更是如此(图4B，左和右图)。实际上，服用ATB的患者呈现的sMAdCAM-1血清水平与属于sMAdCAM-1表达的较低三分位数的那些未服用ATB的个体处于相同的范围(图4B)。在两个队列中，表现出高于整个队列的中值的sMAdCAM-1血清水平的患者与另一半相比具有延长的无进展生存期和总生存期(图4G)。sMAdCAM-1绝对血清浓度的增加与死亡风险的降低之间存在着线性关系，并且每个队列的生物标志每增加+10U/ml，风险就会降低8-10％(图10A，右和左图)。在MAdCAM-1低亚组中，ATB-处理的患者表现出最差PFS(图4F)。此外，考虑到ECOG-PS、年龄、性别、PD-L1表达、模型中的疗法线的多变量Cox回归分析得出结论，sMAdCAM-1是NSCLC患者中PD1阻断的临床益处的独立预测因子(表6)。我们将这种生物标志的临床相关性扩展到PD1抑制以外，作为预测经历心血管事件的高危重度吸烟者(HRHSCV)中早期NSCLC发病率的生物标志(普及(PREVALUNG)研究，表7)。实际上，与99名未发展肺癌结节的配对对照相比，在那些13名被认为在诊断出NSCLC之前6-12个月发展肺癌结节的HRHSCV个体中，sMAdCAM-1血清水平显著更低(图10B)。在整个队列中，可溶性MAdCAM-1水平与循环α4β7+Rorγt+CD4+ T细胞呈反相关(图10C)。
最后，为了直接显示晚期NSCLC患者中可溶性MAdCAM-1血清水平与肠道生态失调之间的关系，我们使用提供所有要求的MG和血清信息片段的n＝95名患者中的鸟枪宏基因组学(MG)分析，根据sMAdCAM-1血清水平中值定义肠道微生物群的分类组成，对宏基因组物种(MGS)执行了非监督和监督层次聚类。首先，MAdCAM-1低患者中的MGS丰富度降低(基于所有112名NSCLC患者的中值进行分离)(图4C)。此外，这种不同的α多样性伴随着显著不同的β多样性，这意味着两个亚群中的分类肠道组成并不相似(图5F)。非监督MG分析揭示了两个聚类，它们实际上也基于MAdCAM-1中值分离患者(Fisher精确方法，p<0.05，图10D-E)。
最后，仅选择在小鼠中存在的MGS的列表(图1G右图)，并且在临床上与大量NSCLC患者的不良预后相关联(Tsay等人,2021；Zitvogel和Kroemer,2021)，(Derosa等人,2022)，我们得出结论并确认，肠小梭形肠道梭状菌和小韦荣球菌(V.Parvula)的流行率较高的患者是呈现低水平sMAdCAM-1的那些。
总之，这些发现指示可溶性MAdCAM-1是肠生态失调的替代标志，从而预测癌症患者对PD1阻断的抗性。
表5.MAdCAM-1和MG探究的队列描述.
表6.探究NSCLC患者中sMAdCAM-1的预测值的多变量分析.
表7.患有心血管疾病的吸烟者的临床特征和肺癌发病率随访(普及研究).
讨论
我们的发现揭示了在受肿瘤发生过程攻击的宿主中回肠的关键作用，由此GALT控制肠道趋向性免疫抑制性TH22/TH17的迁移，其中多至20％是Foxp3+CD25+Treg细胞。肠道和TME均富含细胞吸引和归巢分子，这些分子竞争表达其受体或配体对的循环淋巴细胞。使用允许从GALT到肿瘤床的命运映射的工具，我们发现向肠性T细胞在肠道驻留与对肿瘤沉积的趋化作用之间的命运决定至少部分地由MAdCAM-1地址素/α4β7整合素分子相互作用控制。
首先，ATB下调LP回肠小静脉以及粘膜的HEV和mLN中的MAdCAM-1表达，有利于α4β7+Th17/Tr17细胞向肠外病变的回肠外流。其次，MAdCAM缺陷或中和表型模拟了ATB的效应。接受靶向这些分子的中和Ab的Madcam-1或β7整合素基因缺陷小鼠或动物通过在TME中积聚肠道衍生的α4β7+Tr17/TH17细胞而未能对ICI作出反应。第三，旨在恢复回肠HEV上的MAdCAM-1表达(如嗜黏蛋白阿克曼氏菌)或阻断IL-17A生物活性的操作补偿了ATB在肿瘤免疫监测中的抑制效应。第四，强制口服强饲肠道梭状菌属(如小梭形肠道梭状菌)加速了向肠性Tr17向tdLN的外流。最后，PD1阻断倾向于加剧mLN中α4β7+Tr17细胞的扩增和/或引发并归巢到肿瘤，从而损害癌症免疫监视。所有这些证据线索都支持流行病学研究，指出在ICI施用前(而不是在ICI开始期间或之后)ATB的有害效应(Derosa等人,2022)。因此，我们显示血清可溶性MADCAM-1是回肠madcam1基因表达的生物学代表，并且至少在NSCLC患者中代表着对PD1阻断的反应的可靠预测因子。低sMADCAM-1血清水平反映了由促-TH17细菌(如小韦荣球菌(Veilonella parvula))或与生理病理障碍相关联的肠道梭状菌属菌种主导的肠生态失调(Ghosh等人,2020；Tsay等人,2021；Zitvogel和Kroemer,2021)(Derosa等人,2022)。
这一证明遵循了先前的证据，显示了肠衍生的TH17也控制肠外自身免疫(Magnuson等人,2015；Morton等人,2014；Wu等人,2010)(Krebs等人,2016；Lee等人,2011b)或炎性/缺血性病变(Benakis等人,2016；Liesz等人,2009)。RORγt+Treg与其谱系相关的Treg相比具有加剧的免疫抑制表型，且基因产物(如Ctla4、Icos、Havcr2(Sefik Science2015))过表达，我们还发现这些基因产物在ATB诱导的肠道生态失调情况下上调。此外，我们在此前具有里程碑意义的论文(Miragaia等人,2019；和Mathis,2021)中所描述的Tr17指纹中鉴定了肠道特异性Treg特征、TH17相关蓝图(Yosef等人,2013)以及与肿瘤免疫监视在功能上相关的免疫抑制性状(如Dusp2/PCA1(Dan Lu等人,2020)、PIK3ip1(Uche等人,2018))。
这种在癌症携带者中的例证与此前在患有炎性肠病的患者或猕猴中执行的研究一致，该研究报告称，在用抗α4β7抗体维多珠单抗治疗期间，肠外α4β7+Treg和中枢记忆T细胞或CCR6+CD4+ T淋巴细胞的再循环增加(Calenda等人,2018；D’Haens等人,2018；Fischer等人,2016)。我们的发现具有重要的临床意义。迄今为止，在患有ICI诱导的自身免疫性结肠炎的癌症患者中，维多珠单抗被认为是TNFα抑制的更安全替代形式，因为它们的肠道作用模式受限(Sandborn等人,2016)。然而，前瞻性研究应当监测微生物组组成、肠道或可溶性血清MAdCAM-1表达，以及CCR9α4β7+Treg、Tr17和Th22细胞亚群的再循环，以将这些新型参数与ICI治疗的患者的临床结果和毒性特征相关联。最后，粪便微生物移植领域可能逐渐演变成基于供体粪便使携带癌症的接受者中MADCAM-1水平正常化的能力来指导供体粪便的选择。
这些发现推动了这样一种观念，即携带癌症的患者通过服用改变最有效的肠道免疫检查点MADCAM-1之一的抗生素而可能加剧其癌症相关联的回肠病变(Yonekura等人,2022)。我们推测ATB诱导的生态失调，并且最特别地ATB过程后的再定植是肠道免疫检查点MADCAM-1的主要调节因子。几种分子线索可能将肠道生态失调与GALT MADCAM-1的改变联系起来，如细菌诱导的胆盐代谢的扰动(Campbell等人,2020；Song等人,2020)，以及例如交感神经系统的活化(Schiller等人,2021；Yan等人,2021)，这些都值得进一步探究。
实施例2：可溶性MAdCAM-1是数种实体癌中对PD1阻断的抗性的预测生物标志物
2.1.可溶性MADCAM-1是肾癌患者对PD1阻断的抗性的预测生物标志物
在实施例1中，我们在两个独立的晚期非小细胞肺癌患者(NSCLC)的队列中显示，血清可溶性MAdCAM-1水平是对免疫肿瘤学(I-O)疗法的抗性或敏感性的标志，其中血清可溶性MAdCAM-1水平的降低是对I-O疗法的抗性的标志。
在此，我们将这一发现扩展到另一种癌症类型：二线疗法中用纳武单抗治疗的肾癌(酪氨酸激酶抑制剂失败后)(表8)。
表8.患者的临床特征
总体而言，NIVOREIN队列中的212名患者入组接受抗PD1 mAb(纳武单抗，BMS)。31名是抗生素使用者(治疗开始后第-60天与+42天之间)，且176名没有服用抗生素。对基线处血清可溶性MAdCAM-1执行ELISA监测，揭示了这些212名转移性透明细胞肾细胞癌(RCC)患者的中值(最小值，最大值)为88.8ng/ml(19.1，174.7)(且平均值±SD为88.4±27.7ng/ml)。如NSCLC患者所显示，抗生素摄入(ATB)往往会降低sMAdCAM-1浓度(从不服用ATB的那些患者的中值88.7ng/ml降至服用ATB的那些的76.3ng/ml)。值得注意的是，这被低估了，因为这些ATB+患者中的绝大多数(23/31)在开始抗PD1Ab后服用了ATB(临床上不太显著)。
根据紧接开始抗PD1 Ab之前sMAdCAM-1基线水平的中值，分析了整个212名患者队列的总生存期(OS)。RCC患者的Kaplan-Meier OS曲线显示，呈现sMAdCAM-1血清水平<88.8ng/ml的那些有72/106例死亡，而sMAdCAM-1血清浓度≥88.8ng/ml(p<10e-4)的那些中死亡率为36/106(图11)。在涵盖影响IV期RCC生存的所有临床因素，如年龄、IMDC评分、疗法线和转移位置以及低白蛋白血症的多变量分析中，分析了该预后参数。多变量分析揭示，sMAdCAM-1<88.8ng/ml优于IMDC评分，其中对于sMAdCAM-1而言危险比：2.40(1.52-3.80，p＝0.0002)，而对于严重IMDC而言HR＝2.29(1.11-4.76，p＝0.08)(表9)。
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表9.血清sMAdCAM-1<88.8ng/ml对于IV期二线aPD1 Ab治疗的RCC患者总生存期的预后意义的多变量Cox模型
根据紧接开始抗PD1 Ab之前sMAdCAM-1基线水平的中值，分析了整个212名患者队列的无进展生存期(PFS)。RCC的Kaplan-Meier PFS曲线显示，呈现sMAdCAM-1血清水平<88.8ng/ml的患者有99/106例进展，而sMAdCAM-1血清浓度≥88.8ng/ml(p<10e-4)的那些中进展率为86/106(图12)。在涵盖影响IV期RCC生存的所有临床因素，如年龄、IMDC评分、疗法线和转移位置以及低白蛋白血症的多变量分析中，分析了该预后参数。多变量分析揭示，sMAdCAM-1<88.8ng/ml与IMDC评分一样好(表10，HR＝1.55，p＝0.0071)。
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表10.血清sMAdCAM-1<88.8ng/ml对于IV期二线aPD1 Ab治疗的RCC患者无进展生存期的预后意义的多变量分析
就客观应答率(ORR)而言，NIVOREN试验(N＝729名RCC患者)记录的客观应答率为20.8％(完全反应为1.2％，且部分反应为19.6％，进展性疾病(PD)为79.2％)。令人感兴趣地，212名可获得sMAdCAM-1血清水平的RCC患者的亚组根据ATB摄取是/否以及sMAdCAM-1分(≥88.8与<88.8ng/ml)进行细。首先，根据sMAdCAM-1对最佳客观反应的亚组分析揭示，sMAdCAM-1≥88.8与<88.8ng/ml的患者中PD百分比分别为36.7％与62.6％(p＝0.0003)(表10)。接下来，当我们仅考虑未服用ATB的患者时，根据sMAdCAM-1对最佳客观反应的相同亚组分析揭示，sMAdCAM-1≥88.8与<88.8ng/ml的患者中PD百分比分别为38.6％与60.5％(p＝0.0044)。第三，当我们考虑服用ATB的RCC患者时，根据sMAdCAM-1对最佳应答率的该亚组分析揭示，sMAdCAM-1≥88.8与<88.8ng/ml的患者中PD百分比分别为36.4％与76.9％(p＝0.0446)。在ATB处理的亚组中，sMAdCAM-1≥88.8与<88.8ng/ml的患者中完全反应者的百分比分别为18.2％与7.7％(下表11)。
表11.总应答率
总之，这些发现展示，高水平的血清可溶性MAdCAM-1与RCC二线免疫疗法中对PD1阻断的反应增加相关联，并且在服用抗生素的患者中更是如此。88ng/ml的阈值对于二线有效，但不代表一线患者。对于常规使用，必须考虑1L或2L疗法队列的中值。
2.2.可溶性MADCAM-1是膀胱癌患者对PD1阻断的抗性的预测生物标志物
最后，我们试图在招募接受固定剂量1500mg的德瓦鲁单抗iv(抗PD-L1 Ab)/4周的预治疗的转移性膀胱癌患者的3a期试验的子队列中，重复三次sMAdCAM-1的预测值。在该STRONG研究中，仅分析了79名患者，其中总体中值OS为5.79个月，且中值PFS为2.79个月。我们选择了STRONG队列的极端情况，即30名精英患者(OS>6个月，PFS>5个月，仅PR+CR)和快速进展者(n＝49，其中OS<6个月且PFS<5个月，且首次CT扫描时PD)。在该队列中，MAdCAM-1中值(最小值，最大值)为158.8ng/ml(53.41，244.36)。在图13A中，我们显示，sMAdCAM-1的中值±SEM在进展者中显著降低，并且呈现sMAdCAM-1基线水平>158.8ng/ml的前一半患者的OS与另一半相比显著更好(图13B，p＝0.03)。高MAdCAM-1水平患者的PFS往往更优异(图13C，ns)。
2.3.结论
总之，这些发现说明，在RCC二线免疫疗法、二线转移性膀胱肿瘤以及经派姆单抗(pembrolizumab)治疗的1L和2L NSCLC中，高水平的血清可溶性MAdCAM-1与对PD1/PDL-1阻断的反应增加相关联，而与ATB的摄取无关。
缩写：
α4β7：alpha4beta7，Ab：抗体，ACS：氨苄青霉素、粘菌素、链霉素，ATB：抗生素，ATRA：全反式视黄酸，CCL：趋化因子配体，CCR：趋化因子受体，CD：分化簇，cDC1：经典树突状细胞1型，CFSE：羧基荧光素琥珀酰亚胺酯，cLN：对侧淋巴结，CSF-1：集落刺激因子1，CTL：细胞毒性T淋巴细胞，FMT：粪便粘膜转移，FoxP3：叉头框蛋白P3，GALT：肠相关淋巴组织，HEV：高内皮小静脉，IBD：炎性肠病，ICI：免疫检查点抑制剂，IFNγ：干扰素γ，LP：固有层，mAB：单克隆抗体，MAdCAM-1：黏膜地址素细胞黏附分子-1，mLN：肠系膜淋巴结，PP：派尔斑，RA：视黄酸，RORC：RAR-相关孤儿受体C，SLO：次级淋巴器官，tdLN：肿瘤引流淋巴结，TH17：T-辅助性17-CD4-T-细胞，TME：肿瘤微环境，TNFα：肿瘤坏死因子α，Treg：调节T细胞，Tr17：RORγt+Treg-CD4-T-细胞。
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Claims (16)
1.血清可溶性MAdCAM-1水平作为对免疫肿瘤学(I-O)疗法的抗性或敏感性的标志物的用途，其中血清可溶性MAdCAM-1水平的降低是对所述I-O疗法的抗性的标志。
2.血清可溶性MAdCAM-1水平作为与癌症或抗生素相关联的生态失调的标志物的用途，其中血清可溶性MAdCAM-1水平的降低是与癌症或抗生素相关联的生态失调的标志。
3.用于在患有癌症的个体中体外诊断与癌症或抗生素相关联的肠生态失调的方法，其包括测量血清可溶性MAdCAM-1，其中血清可溶性MAdCAM-1水平的降低指示所述个体患有与癌症或抗生素相关联的肠生态失调。
4.权利要求1或权利要求2所述的用途、或权利要求3所述的方法，其中如果所述血清可溶性MAdCAM-1水平低于代表性队列中可溶性MAdCAM-1水平的中值，则认为所述血清可溶性MAdCAM-1的水平降低。
5.用于确定患有癌症的个体在施用免疫肿瘤学(I-O)疗法之前是否需要补偿性以微生物群为中心的干预(MCI)的治疗诊断方法，其包括使用根据权利要求3和4中任一项所述的方法来评估所述个体是否患有与癌症或抗生素相关联的生态失调，其中如果所述个体患有与癌症或抗生素相关联的生态失调，则他/她在施用I-O疗法的治疗之前需要MCI。
6.权利要求5所述的治疗诊断方法，其中所述I-O疗法的治疗选自由以下组成的组：抗PD1抗体(Ab)、抗PDL-1Ab、抗CTLA4 Ab、抗Lag3Ab、抗Tim3 Ab、抗TIGIT Ab、抗OX40 Ab、抗41BB Ab、抗VISTA Ab、靶向PD1和Lag3的双特异性抗体、CAR-T细胞、过继性TIL转移及其任何组合，其单独地或与另一种抗肿瘤剂组合，尤其是免疫检查点抑制剂(ICI)与紫杉烷、顺铂和/或奥沙利铂的任何组合。
7.权利要求5和6中任一项所述的治疗诊断方法，其中所述MCI选自由以下组成的组：
-口服万古霉素抗生素，
-杀伤肠道梭状菌新属进化枝细菌的噬菌体，
-稀有切割核酸内切酶，诸如工程化为杀伤肠道梭状菌新属进化枝细菌的CrisprCas9，
-可能与其它有益细菌混合的阿克曼氏菌属和/或嗜黏蛋白阿克曼氏菌，
-视黄酸，
-粪便微生物移植，以及
-其混合物。
8.用于在患有癌症诱导的生态失调的个体中与I-O疗法联合治疗癌症的用于MCI的药剂，其中所述药剂选自由以下组成的组：
-口服万古霉素抗生素，
-杀伤肠道梭状菌新属进化枝细菌的噬菌体，
-稀有切割核酸内切酶，诸如工程化为杀伤肠道梭状菌新属进化枝细菌的CrisprCas9，
-可能与其它有益细菌混合的阿克曼氏菌属和/或嗜黏蛋白阿克曼氏菌，
-粪便微生物组合物，以及
-其混合物。
9.用于追踪MCI的成功的方法，其包括测量血清可溶性MAdCAM-1，其中血清可溶性MAdCAM-1的正常化水平指示所述MCI成功地恢复了肠道生态平衡。
10.血清可溶性MAdCAM-1水平作为预测经历心血管事件的高危重度吸烟者(HRHSCV)中的早期NSCLC发病率的生物标志物的用途，其中血清可溶性MAdCAM-1水平的降低是预测NSCLC发作的标志。
11.包含(i)抗PD1或抗PDL1抗体和(ii)抗IL17A或抗IL17R抗体和/或重组IL-7的联合疗法，其用于具有低血清水平的可溶性MAdCAM的患者中的癌症治疗。
12.用于鉴定能够使固有层的内皮细胞中的MAdCAM-1表达水平正常化的药剂的筛选方法，其包括(i)使表达MAdCAM-1或工程化为在所述MAdCAM-1启动子的控制下表达报告基因的培养细胞与测试化合物在体外接触，和(ii)评估哪一种所述化合物诱导了MAdCAM-1或在所述MAdCAM-1启动子的控制下表达的报告基因的表达。
13.用于鉴定能够使固有层的内皮细胞中MAdCAM-1表达水平正常化的药剂的筛选方法，其包括向肠道人源化替身小鼠施用测试化合物。
14.权利要求12或权利要求13所述的方法，其包括验证在培养细胞中或在替身小鼠中的其它实验中所获得的结果的步骤，其中替身小鼠是用8-10天广谱ATB预处理并且然后用人FMT产品经口服强饲法再定植的肠道人源化小鼠，其中：
(i)所述FMT产品是已被鉴定为诱导所述培养细胞中MAdCAM-1的表达的化合物，或
(ii)所述FMT产品已被鉴定为不诱导所述培养细胞中MAdCAM-1的表达，并且已经富集另一种已被鉴定为诱导HUVEC细胞中MAdCAM-1的表达的化合物；或
(iii)所述FMT具有与生态平衡或高可溶性MADCAM-1相关联的分类组成。
15.权利要求13或14所述的方法，其包括：
(i)在强饲后8天，处死所述肠道人源化替身小鼠中的一些以在FMT接受者中运行基于MAdCAM-1和Foxp3的回肠PCR，并将它们与对照进行比较；
(ii)在所述肠道人源化替身小鼠中的MAdCAM-1显著上调的情况下，在每组至少3只小鼠中接种皮下肉瘤并用抗PD1 Ab对它们进行治疗，以确保与ATB治疗的小鼠相比，这种FMT可以介导治疗功效；
(iii)如果肠道人源化替身小鼠对抗PD1 Ab的治疗应答，则推断所述FMT产品或所述用于富集其的非FMT化合物能够使所述固有层的内皮细胞中的MAdCAM-1表达水平正常化。
16.用于执行根据权利要求12至15中任一项所述的方法的筛选平台，其包含在所述MAdCAM-1启动子的控制下表达报告基因的细胞，和配置为用于在产品库中挑选药剂、将这些递送至培养的细胞并评估所述报告基因的表达的机器人。
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