JP2024503710A - 抗ｐｄ１薬に対するがん患者の応答の予測に役立つ、腸内ディスバイオシスの生物学的マーカー - Google Patents

Abstract

本発明は、抗がん治療の分野に関する。特に本発明は、免疫チェックポイント阻害剤（ＩＣＩ）に基づく治療の有効性における腸内微生物叢の役割に関するものであり、ある患者が、ＩＣＩに基づく治療、より厳密にはＰＤ１またはＰＤ－Ｌ１に向かう抗体の投与を含む治療からの利益を得る可能性が大きいかどうかを判断するための方法を提供する。本発明は、がん患者を、彼らがＩＣＩに基づく治療を受ける前の細菌補償の潜在的な必要性に従って層化する方法を提供する。本発明は、ある個人が腸内ディスバイオシスを持つかどうかを判断するための簡単な方法も提供する。

Description

本発明は、抗がん治療の分野に関する。特に本発明は、免疫チェックポイント阻害剤（ＩＣＩ）に基づく治療の有効性における腸内微生物叢の役割に関するものであり、ある患者が、ＩＣＩに基づく治療、より厳密にはＰＤ１またはＰＤ－Ｌ１に向かう抗体の投与を含む治療からの利益を得る可能性が大きいかどうかを判断するための方法を提供する。

本発明は、がん患者を、彼らがＩＣＩに基づく治療を受ける前の細菌補償の潜在的な必要性に従って層化する方法を提供する。

本発明は、ある個人が腸内ディスバイオシスを持つかどうかを判断するための簡単な方法も提供する。

ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用を標的とする免疫チェックポイント阻害剤（ＩＣＩ）の開発が、進行した非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）を持つ患者の治療状況を変えた（Ｈｅｒｂｓｔ ｅｔ ａｌ． ２０１６；Ｂｒａｈｍｅｒ ｅｔ ａｌ． ２０１５；Ｂｏｒｇｈａｅｉ ｅｔ ａｌ． ２０１５；Ｇａｎｄｈｉ ｅｔ ａｌ． ２０１８；Ｐａｚ－Ａｒｅｓ ｅｔ ａｌ． ２０１８；Ｒｅｃｋ ｅｔ ａｌ． ２０１６）。以前に治療を受けた進行したＮＳＣＬＣを持つ患者で実施された画期的な試験は、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１阻害を利用すると標準的な化学療法と比べて優れた全生存期間（ＯＳ）になることを実証した（Ｈｅｒｂｓｔ ｅｔ ａｌ． ２０１６；Ｂｒａｈｍｅｒ ｅｔ ａｌ． ２０１５；Ｂｏｒｇｈａｅｉ ｅｔ ａｌ． ２０１５）。以前は治療できなかった進行したＮＳＣＬＣを持つ患者を対象とした第ＩＩＩ相無作為化試験からの未曾有のＯＳ結果を受けて、ＩＣＩが、第１選択の設定において、腫瘍細胞表面の腫瘍ＰＤ－Ｌ１の発現が５０％以上である患者のための単剤療法として、またはＰＤ－Ｌ１発現とは無関係にプラチナ併用化学療法との組み合わせで承認された（Ｇａｎｄｈｉ ｅｔ ａｌ． ２０１８；Ｐａｚ－Ａｒｅｓ ｅｔ ａｌ． ２０１８；Ｒｅｃｋ ｅｔ ａｌ． ２０１６；Ａｒｉｅｌｌｅ Ｅｌｋｒｉｅｆ ｅｔ ａｌ． ２０２０）。しかし患者の半数未満しか（３５％）ＩＣＩに対する持続的奏功の利益を得られない（Ｇａｄｇｅｅｌ ｅｔ ａｌ． ２０２０）。ＮＳＣＬＣ患者の過半数は、一次または二次の耐性、または「ハイパープログレッション」と呼ばれる疾患の加速を示すことがある（Ｆｅｒｒａｒａ ｅｔ ａｌ． ２０１８）。さらに、ＩＣＩに対する応答の現在のバイオマーカーは、低い感度と特異度のために満足のゆくものではないため、ＩＣＩに対する耐性の機構を理解して耐性のロバストなバイオマーカーを同定することが強く必要とされている。

一次耐性は、腫瘍細胞の少ない腫瘍変異量と乏しい固有抗原性（Ｒｉａｚ ｅｔ ａｌ． ２０１７；Ｒｉｚｖｉ ｅｔ ａｌ． ２０１５）、異常な抗原提示（Ｓｐｒａｎｇｅｒ， Ｂａｏ， ｅｔ Ｇａｊｅｗｓｋｉ ２０１５）、Ｔ細胞の疲弊に関係する限定された腫瘍内浸潤（Ｓｍｙｔｈ ｅｔ ａｌ． ２０１６）、および免疫抑制性代謝経路（Ｋｏｙａｍａ ｅｔ ａｌ． ２０１６；Ｙｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ． ２０１６）に帰されてきた。「がん免疫セット－ポイント」（その値を超えると腫瘍保持者で有効な免疫応答が起こることのできる閾値）の主要な調節因子を解明するため、高次元オミクス技術が現在開発されている（Ｃｈｅｎ ｅｔ Ｍｅｌｌｍａｎ ２０１７）。

最近の一連のエビデンスは、がんを持つ患者において末梢免疫緊張（ｔｏｎｕｓ）とＩＣＩの有効性に影響を与える腸内微生物叢の組成の生物学的重要性に向けられている。１０^１３個の微生物からなるヒト腸内マイクロバイオームは宿主の多くのプロセス（代謝、炎症、蠕動、病原体と生体異物の排除、微生物抗原と食物抗原に対する寛容を維持するための免疫機能の成熟のほか、腸管上皮バリアの健康度が含まれる）を変化させる（Ｒｏｕｔｙ， Ｇｏｐａｌａｋｒｉｓｈｎａｎ， ｅｔ ａｌ． ２０１８）。より最近になり、腸内マイクロバイオームが意外なことにＩＣＩの有効性に影響を与えることが示された（Ｒｏｕｔｙ， Ｌｅ Ｃｈａｔｅｌｉｅｒ， ｅｔ ａｌ． ２０１８）。第１に、前臨床モデルでは、無菌マウスまたは抗生剤（ＡＴＢ）で治療したマウスを用いた実験により、ＩＣＩの抗腫瘍活性に腸内微生物構成要素の存在が必要とされることが解明された（Ｖｅｔｉｚｏｕ ｅｔ ａｌ． ２０１５）。同様に、ＩＣＩ開始前のＡＴＢは、さまざまなタイプのがん（黒色腫、進行したＮＳＣＬＣ、腎細胞癌（ＲＣＣ）、および尿路上皮がん）の患者のいくつかのコホートにおいて、臨床上の利益と生存率を劇的に低下させた（Ｒｏｕｔｙ， Ｌｅ Ｃｈａｔｅｌｉｅｒ， ｅｔ ａｌ． ２０１８；Ｇｏｐａｌａｋｒｉｓｈｎａｎ ｅｔ ａｌ． ２０１８；Ｌ． Ｄｅｒｏｓａ ｅｔ ａｌ． ２０１８；Ｌｉｓａ Ｄｅｒｏｓａ ｅｔ Ｚｉｔｖｏｇｅｌ ２０２０）。この観察結果は前向き試験と大規模メタ分析において確認されたため、ＩＣＩの作用の免疫賦活モードにとって腸内微生物叢が有用である可能性があることを示唆する（Ｌｕｒｉｅｎｎｅ ｅｔ ａｌ． ２０２０）。

この主張の裏づけとして、上皮腫瘍と黒色腫を持つ患者における抗ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１抗体に対する一次応答は、少なくとも一部を腸内微生物叢の組成に帰することができることをわれわれと他の研究者たちは報告した（Ｒｏｕｔｙ， Ｌｅ Ｃｈａｔｅｌｉｅｒ， ｅｔ ａｌ． ２０１８；Ｇｏｐａｌａｋｒｉｓｈｎａｎ ｅｔ ａｌ． ２０１８；Ｍａｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ． ２０１８）。多様な微生物叢と、特定の細菌（アッカーマンシア・ムシニフィラ（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）、ルミノコッカス属、またはビフィドバクテリウム属など）の存在が、ＩＣＩに対する改善された臨床応答と関係しており、全身性免疫緊張の増大と相関していた（Ｒｏｕｔｙ， Ｌｅ Ｃｈａｔｅｌｉｅｒ， ｅｔ ａｌ． ２０１８；Ｇｏｐａｌａｋｒｉｓｈｎａｎ ｅｔ ａｌ． ２０１８；Ｍａｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ． ２０１８）。われわれの以前の研究は、難治性ＮＳＣＬＣまたはＲＣＣと診断されて第２選択または第３選択の治療として抗ＰＤ－１抗体で治療された１００人の患者のメタゲノミクスに基づくマイクロバイオームのプロファイリングを報告しており、Ａ．ムシニフィラ（Ａｋｋ）の占有率が、部分奏功または安定を示す患者では、進行した患者と比べて増大していると結論した（それぞれ６１％と３４％、ｐ＝０．００７）（Ｒｏｕｔｙ， Ｌｅ Ｃｈａｔｅｌｉｅｒ， ｅｔ ａｌ． ２０１８）。Ａｋｋは、ＮＳＣＬＣを持つ６０人の患者のサブグループを分析したとき、無増悪生存期間（ＰＦＳ）が３ヶ月超の患者でも過剰に存在していた（Ｒｏｕｔｙ， Ｌｅ Ｃｈａｔｅｌｉｅｒ， ｅｔ ａｌ． ２０１８）。別の１つの群で３７人のＮＳＣＬＣ患者の糞便の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子アンプリコンのシークエンシングを実施し、ＡｋｋがＩＣＩに応答する患者において豊富であることを確認した（Ｊｉｎ ｅｔ ａｌ． ２０１９）。アビラテロンで治療した前立腺腺癌を持つ患者では、腸内Ａｋｋは治療反応とも相関していた（Ｄａｉｓｌｅｙ ｅｔ ａｌ． ２０２０）。Ａｋｋは、（無疾患百寿者におけるその存在によって示されるように）臨床試料において、低いボディ・マス指数、フィットネス、一般的な健康、およびサクセスフル・エイジングと関連づけられてきた（Ｓａｎｔｏｒｏ ｅｔ ａｌ． ２０１８）。動物モデルにおいて、Ａｋｋ補充は、肥満（Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ． ２０２０）とその合併症を減らし、神経変性障害を緩和し（Ｂｌａｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ． ２０１９）、早老症に対抗する（Ｂａｒｃｅｎａ ｅｔ ａｌ． ２０１９）。したがってＡｋｋをメタ生物におけるホメオスタシスの潜在的な主要調節因子と見なすことができよう。

合わせると、地理的分布がさまざまな小さなコホートにおけるこれらの予備的結果は、腸内マイクロバイオーム組成が、より具体的には診断時のＡｋｋの存在が、進行したＮＳＣＬＣと他のがんを持つ患者のＩＣＩに対する応答を予測する潜在的なバイオマーカーになりうるかどうかという疑問を提起する。この仮説を検証するため、われわれは前向き多施設研究を実施し、抗ＰＤ－１抗体で治療した進行したＮＳＣＬＣを持つ３１１人の患者でメタゲノミクスに基づくマイクロバイオームのプロファイルを分析した。

発明者らは、１人のがん患者からの糞便サンプル中のアッカーマンシア・ムシニフィラの不在がＰＤ１阻害に対する耐性を意味することを以前に示した（ＷＯ２０１８１１５５１９）。

発明者らは、下に報告する実験において、驚くべきことに、悪い転帰と相関していた高レベルのアッカーマンシア・ムシニフィラを有する一群の患者を同定した。

そこで発明者らは、患者を三分法でＡｋｋ^－の個人、Ａｋｋ^低（７５パーセンタイル未満）の個人、およびＡｋｋ^高（７５パーセンタイル超）の個人に層化することを考えたところ、全生存期間に関して二分法（Ａｋｋ^－対Ａｋｋ^＋）の分割よりも正確な独立な予測因子が生成した。この３つの群への患者層化を利用すると、アッカーマンシア・ムシニフィラのレベルが、ＰＤ－１阻害を利用した免疫療法を受けている患者に関する予後のより信頼できるバイオマーカーであっただけでなく、ＰＤ－Ｌ１が２Ｌ以上のＮＳＣＬＣ患者におけるＩＣＩに対する応答の予測バイオマーカーであることが否定されさえした。

次いで発明者らは、アッカーマンシアＳＧＢ９２２８がアッカーマンシア・ムシニフィラと同じ振る舞いをすること、すなわち腸内の「正常レベル」のＡ．ムシニフィラ（Ａ．ムシニフィラ^低）またはアッカーマンシアＳＧＢ９２２８（Ａ．ＳＧＢ９２２８^低）の存在を、宿主の腸健康度の１つの代替指標と見なせることを実証した。逆に、宿主腸内微生物叢の中にアッカーマンシア属の細菌が不在である、または過度に高レベルで存在している（特に過度に高レベルのＡ．ムシニフィラおよび／またはアッカーマンシアＳＧＢ９２２８）と、宿主はＩＣＩ療法に応答するのに細菌補償を必要とする。

したがって第１の側面によれば、本発明は、あるがん患者が免疫チェックポイント阻害剤（ＩＣＩ）に基づく療法に対する良いレスポンダーである可能性が大きいかどうかを判断するインビトロセラノスティクス法に関するものであり、この方法は、前記患者からのサンプル中でアッカーマンシア属の細菌（例えばアッカーマンシア・ムシニフィラおよび／またはアッカーマンシアＳＧＢ９２２８）の相対量を測定することを含み、前記アッカーマンシアが所定の閾値未満で存在することが、前記患者がＩＣＩに基づく前記療法に対する良いレスポンダーである可能性が大きいことを示している。

下記の実験部分に示されているように、腸内の正常レベルのアッカーマンシア・ムシニフィラ（Ａｋｋ^低）および／またはアッカーマンシアＳＧＢ９２２８（Ａｋｋ．ＳＧＢ９２２８^低）の存在は、宿主の腸健康度と免疫細胞が侵入した微小環境の代替指標と見なすことができ、そのことによってＩＣＩ治療に応答する可能性が大きい患者が同定される一方で、アッカーマンシア・ムシニフィラおよび／またはアッカーマンシアＳＧＢ９２２８のは、超生理学的レベルであると悪い予後を示しており、それはＡＴＢまたは他の有害因子によって誘導される腸の傷治癒を反映している可能性がある。したがって腸内マイクロバイオームの中のアッカーマンシア・ムシニフィラおよび／またはアッカーマンシアＳＧＢ９２２８の不在と過剰な存在の両方とも、患者が、ＩＣＩに基づく治療に応答する可能性を改善するためにはＩＣＩに基づくその治療を始める前に補償微生物治療を受けるべき状況であることを証明している。

そこで本発明は、あるがん患者がＩＣＩに基づく療法の投与前に細菌補償を必要とするかどうかを判断する方法にも関係しており、この方法は、患者からのサンプル中でアッカーマンシアの相対量を測定することを含み、
（ｉ）アッカーマンシアがサンプル中に存在しない場合には、患者は、ＩＣＩ投与の前に少なくともアッカーマンシア属の細菌を用いた細菌補償を必要とし；
（ｉｉ）アッカーマンシア属の細菌が所定の閾値未満でサンプル中に存在する場合には、患者はＩＣＩ投与の前にいかなる細菌補償も必要とせず；
（ｉｉｉ）アッカーマンシア属の細菌が所定の閾値を超えてサンプル中に存在する場合、特にこの過剰な存在が、抗生物質曝露の結果である、および／またはガンマプロテオバクテリア綱および／またはデスルホビブリオ科に属する種の過剰な存在に関係する場合には、患者は、多微生物共同体（特に複合多微生物共同体、すなわち少なくとも５つ、好ましくは少なくとも７つ、例えば１０種類超の異なる微生物株）を用いた細菌補償、および／または健康な個人からの、またはＩＣＩに基づく前記療法にうまく応答したがん患者からの糞便微生物移植（ＦＭＴ）を通じた細菌補償を必要とする。

下に報告する実験は、７５パーセンタイル以内の相対量のアッカーマンシア・ムシニフィラと糞便のアルファ多様性（シャノン多様性指数）の関連性によって示されるように、アッカーマンシア・ムシニフィラが腸内に棲息していることが腸エコシステムの豊かさの間接的マーカーであることも示す。その結果として、アッカーマンシア・ムシニフィラのレベルを測定して腸内ディスバイオシスを迅速かつ容易に同定することができる。これは、微生物叢を中心とするあらゆる介入にとって非常に有用である。

したがって本発明の別の１つの側面は、ある個人が腸内ディスバイオシスを持つかどうかを判断する方法であり、この方法は、前記個人からのサンプル中で、アッカーマンシア、特にアッカーマンシア・ムシニフィラおよび／またはアッカーマンシアＳＧＢ９２２８の相対量を測定することを含み、アッカーマンシア属の前記細菌の存在が所定の閾値未満であることが、腸内微生物叢ディスバイオシスが存在していないことを示しており、アッカーマンシア属の細菌（特にアッカーマンシア・ムシニフィラおよび／またはアッカーマンシアＳＧＢ９２２８）が不在であること、または所定の閾値を超えてそれが存在することが、腸内ディスバイオシスであることを示している。

本発明は、自らの腸内微生物叢にアッカーマンシア属、特にアッカーマンシア・ムシニフィラおよび／またはアッカーマンシアＳＧＢ９２２８が過剰に存在しているがん患者を（ＩＣＩ治療の前に、およびＩＣＩ治療との組み合わせで）治療するため、多微生物共同体またはＦＭＴを特に健康な個人からの材料、またはＩＣＩに基づく療法にうまく応答したがん患者からの材料とともに使用することにも関する。

本発明の別の１つの側面は、自らの腸内微生物叢にアッカーマンシア・ムシニフィラもアッカーマンシアＳＧＢ９２２８も棲息していないがん患者を（ＩＣＩ治療の前に、およびＩＣＩ治療との組み合わせで）治療するためのアッカーマンシア属の細菌（特にアッカーマンシアＳＧＢ９２２８および／またはアッカーマンシア・ムシニフィラ）を含む細菌組成物である。より具体的には、アッカーマンシアＳＧＢ９２２８（Ａｋｋｓｐ２２６１など）の凍結乾燥されてカプセル化された株を治療用に補充すると、特にそれがマイクロバイオームを好ましい健康関連種（すなわちインテスティニモナス・ブチリシプロドゥセンス、オドリバクター・スプランクニカス、パラステレラ・エクスクレメンティホミニス、ロゼブリア・フェシス）へとシフトさせるとき、ＡＴＢに曝露されていなくて内在性アッカーマンシア・ムシニフィラと内在性アッカーマンシアＳＧＢ９２２８が欠如している前記患者に利益をもたらす。

図１ 糞便のＡ．ムシニフィラ（Ａｋｋ）はＩＣＩの臨床上の利益と関係している。

Ａ～Ｂ １Ｌ＋２Ｌ（ｎ＝３３８）および１Ｌ免疫療法ＮＳＣＬＣ（ｎ＝８６）の患者における糞便のＡｋｋとＯＲＲの間の相関。ＣＲ；完全奏功。ＰＲ；部分奏功、ＳＤ；安定、ＰＤ；進行をカイ二乗検定を用いて分析。Ｐ値は、多重比較のための調整なしの両側である。Ｃ～Ｄ Ａｋｋの状態による、１Ｌ＋２Ｌ（ｎ＝３３８）と２Ｌ（ｎ＝２４３）の全生存率（ＯＳ）のカプラン・マイヤー曲線とコックス回帰分析。Ａｋｋの状態は層別ログランク検定を用いて比較した。Ｐ値は調整なしの片側である。Ｅ．１Ｌ免疫療法（ＩＯ）におけるＯＳが１２ヶ月未満の患者と１２ヶ月超の患者の間のＡｋｋの腸占有率の差をカイ二乗検定を用いて分析。Ｐ値は、多重比較のための調整なしの両側である。Ｆ～Ｈ．４４人のＮＳＣＬＣ患者のサブグループ（１７人の非転移患者と２７人の転移患者、表６）における腫瘍生検のＲＮＡシークエンシング。Ｆ．Ａｋｋの腸占有率に応じて発現が異なる遺伝子の主成分分析（ＰＣｏＡ）であり、Ｏｎｃｏｍｉｎｅ Ｉｍｍｕｎｅ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ａｓｓａｙの３９５免疫関連遺伝子選択を利用しており、ユークリッド距離を用いたＰＥＲＭＡＮＯＶＡ検定を通じ、マン－ホイットニーのｐ値＜０．１０を用いて有意差を示す。Ｇ．（Ａｋｋ＋患者とＡｋｋ－患者の間で）発現が異なる遺伝子産物の規格化後のヒートマップであり、カテゴリーによって分類されている。Ｈ．Ａｋｋ 群ごとの、すなわちＡｋｋ＋患者（ｎ＝２２）とＡｋｋ－患者（ｎ＝２２）（表６）での、選択された遺伝子発現値の箱ひげ図。群の間の差はマン－ホイットニー検定で評価した。Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフケモカインリガンド１０（ＣＸＣＬ１０）、Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフケモカインリガンド９（ＣＸＣＬ９）、グアニル酸結合タンパク質１（ＧＢＰ１）、血管細胞接着タンパク質１（ＶＣＡＭ１）、Ｃ－Ｃケモカイン受容体５型（ＣＣＲ５）、グランザイムＨ（ＧＺＭＨ）。箱の中央の線は中央値を表わす。下側と上側のヒンジは、第１と第３四分位数（２５パーセンタイルと７５パーセンタイル）に対応する。上側のひげはヒンジから最大値まで延びるが、ヒンジから１．５×ＩＱＲを超えない（ただしＩＱＲは、四分位数内の範囲、すなわち第１と第３四分位数の間の距離である）。下側のひげはヒンジから最小値まで延び、最大でヒンジの１．５×ＩＱＲまでである。ひげの末端を超えるデータは「外れ」点と呼ばれ、個別にプロットされる。

図２ Ａｋｋの相対量はＩＣＩの予後マーカーである。

Ａ． Ａｋｋ^－群とＡｋｋ^＋群について各サブグループの中でＯＳが１２ヶ月未満または１２ヶ月以上の間の主座標分析（ＰＣｏＡ）によって表わされるブレイ－カーティス指数によって測定したベータ多様性。ＯＳ；全生存期間。ｐ値はＰＥＲＭＡＮＯＶＡを用いて９９９の並べ替えで計算した。Ｂ．２つの変数、すなわち３３８人の患者のコホート全体の中のＯＳが１２未満または１２以上とＡｋｋの相対量を並べたカーネル密度推定。利用した検定は２×２分別表での両側フィッシャーの正確検定であった。この検定のための調整は必要なかった。Ｃ．７７パーセンタイルに従う検出可能なＡｋｋを有する患者におけるＡｋｋの相対量の分布（左のグラフ）と、Ａｋｋ相対量の３つの群それぞれの中の患者の割合（右のグラフ）。Ａｋｋ^－：Ａｋｋを検出できない、Ａｋｋ^低：Ａｋｋ相対量が０．０３５～４．７９９％、Ａｋｋ^高：４．７９９％（７７パーセンタイル）超。箱ひげ図の下側と上側のヒンジはそれぞれ２５パーセンタイルと７５パーセンタイルに対応する。中央の線は中央値である。上側と下側のひげはヒンジから最大（または最小）値まで延びるが、ヒンジから、２５パーセンタイルと７５パーセンタイルの間の距離として定義される四分位数の１．５倍の範囲を超えない。Ｄ～Ｆ．３３８人のＮＳＣＬＣ患者における全生存率のカプラン・マイヤー曲線とコックス回帰多変量解析であり、３つの群（Ａｋｋ^－、Ａｋｋ^低、およびＡｋｋ^高）に分別したＡｋｋ相対量による場合（Ｄ）と、さらにＰＤ－Ｌ１発現を考慮した場合（Ｆ）を示す。Ａｋｋの状態は、層別ログランク検定を利用して比較した。Ｐ値は調整なしの片側である。３つの群（Ａｋｋ^－、Ａｋｋ^低、およびＡｋｋ^高）に分別したＡｋｋ相対量と、関連する他のあらゆる臨床パラメータによる、３３８人のＮＳＣＬＣ患者における全生存率のコックスロジスティック回帰多変量解析（Ｅ）。Ｐ値は、コックス比例ハザード回帰モデルの中のあらゆる共変量を含めワルド検定を用いて計算した。正確なＰ値は表４の中にある。ＯＳ：全生存率。ＥＣＯＧ；ｅａｓｔｅｒｎ ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ ｏｎｃｏｌｏｇｙ ｇｒｏｕｐパフォーマンスステータス。ＡＴＢ：抗生剤。Ｇ．２つの群（Ａｋｋ^低とＡｋｋ^高）に分別したＡｋｋ相対量とＡＴＢ使用（ｎｏＡＴＢ：ＡＴＢへの曝露なし、ＡＴＢ：ＩＣＩを開始する前２ヶ月以内に抗生剤曝露）による患者の分布。Ｈ．３つの群（Ａｋｋ^－、Ａｋｋ^低、およびＡｋｋ^高）に分別したＡｋｋ相対量とＡＴＢ使用（ｎｏＡＴＢ ｎ＝２６９、上のグラフと、ＡＴＢ ｎ＝６９、下のグラフ）による、３３８人のＮＳＣＬＣ患者での全生存率のカプラン・マイヤー曲線とコックス回帰多変量解析。Ａｋｋの状態は、層別ログランク検定を利用して比較した。Ｐ値は調整なしの片側である。

図３ Ａｋｋ関連エコシステムの他の構成要素に基づく臨床転帰の層化。

Ａ．Ａｋｋとの関連性、すなわちＡｋｋ^－が豊富なエコシステムと有意に関連している種であるか、そのエコシステムから除外される種（Ａｋｋ^＋、濃い点、Ａｋｋ^－、下線）であるかに基づいて３３８人の患者のベースライン糞便試料の中の（占有率が２．５％超の）分類学的種をその相対量に従って分離するためのボルケーノプロット（Ｍａａｓｌｉｎ２統計分析における倍数変化（ＦＣ）とｐ値を示す）。Ｐ値は、帰無仮説を検定し、両側検定を用いて計算した。Ｂ、Ｄ、Ｆ．ＬＥｆＳｅモデル、ＭａＡｓＬｉｎ２、およびボルケーノプロット／ＡＮＯＶＡ 表７）に示されている有益な細菌または有害な細菌の相対量の三分法分布（検出不能な細菌：^－、^低、および^高）による、３３８人のＮＳＣＬＣ患者におけるカプラン・マイヤー全生存率曲線。三分法分布を層別ログランク検定を用いて比較した。Ｐ値は調整なしの片側である。Ｃ、Ｅ、Ｇ．ＯＲＲとＯＳに対するＡｋｋ関連効果における二分法パターン（存在／不在）での（表８に示されている）Ａｋｋに関連する付随細菌の影響を示しており、カイ二乗検定（ＯＲＲについて、左のグラフ、Ｐ値は多重比較のための調整なしの両側である）を利用。カプラン・マイヤー曲線（右のグラフ、三分法分布は層別ログランク検定を用いて比較した。Ｐ値は調整なしの片側である）についてはコックス回帰多変量解析。ＣＲ；完全奏功。ＰＲ；部分奏功、ＳＤ；安定、ＰＤ；進行。

図４ ＮＳＣＬＣ ＯＮＣＯＢＩＯＴＩＣＳコホート全体での糞便回収を記述するＣｏｎｓｏｒｔダイヤグラム。

糞便の入手可能性、アッカーマンシア・ムシニフィラ（Ａｋｋ）の存在、および腫瘍ＰＤ－Ｌ１の発現レベルに応じて患者をＯＮＣＯＢＩＯＴＩＣＳ研究（ｎ＝４９３）に組み込むためのＣｏｎｓｏｒｔｉｕｍダイヤグラム。Ｖ１：ベースライン糞便サンプル。Ｖ２；免疫チェックポイント阻害剤を最初に注射する前；ＭＧＳ：メタゲノムシークエンシング。Ａｋｋ^＋：Ａｋｋの検出；Ａｋｋ^－：診断時にショットガンメタゲノミクスシークエンシング（ＭＧＳ）分析によってＡｋｋが検出されない。

図５ 患者における糞便Ａ．ムシニフィラ（Ａｋｋ）とＩＣＩに対する臨床的利点の間の関連性のＭｅｔａＯＭｉｎｅＲに基づく分析。

Ａ～Ｂ．１＋２ＬのＮＳＣＬＣ患者（Ｎ＝３３８、Ａ～Ｂ）におけるＡｋｋの糞便占有率（ＭｅｔａＯＭｉｎｅＲパイプライン）とＯＲＲの間の相関（Ａ）、またはＯＳ（Ｂ）であり、ＭｅｔａＯＭｉｎｅＲアルゴリズム（ＩＮＲＡＥ）でのＡｋｋのＭＧＳ同定に基づく。２つの群で分析した検出可能なＡｋｋまたは検出不能なＡｋｋ（Ａｋｋ^＋またはＡｋｋ）のカイ二乗検定（Ａ）と、カプラン・マイヤー曲線に示されている全生存期間（ＯＳ）中央値に関するコックス回帰分析（Ｂ、左のグラフ）、または３つの群への分別（Ａｋｋ^－、Ａｋｋ^低、およびＡｋｋ^高）の場合（Ｂ、右のグラフ）。カイ二乗検定のＰ値は多重比較のための調整なしの両側である（Ａ）。Ａｋｋの状態は層別ログランク検定を用いて比較した。Ｐ値は調整なしの片側である（Ｂ）。Ｃ．アバターマウスの実験設定。Ａｋｋの存在または不在に従って分別したＮＳＣＬＣ患者のＦＭＴ（表６）を、ＭＣＡ－２０５腫瘍を担持するＣ５７ＢＬ／６マウスに入れる。治療は、矢印（ＡＴＢ、ＦＭＴ、抗ＰＤ－１（ＩＣＩ）ｍＡｂ、またはアイソタイプ対照ｍＡｂ（Ｉｓｏ））によって示されている。Ｄ．アイソタイプＣｔｌ治療マウスと抗ＰＤ－１ ｍＡｂ治療マウスにおける、Ａｋｋの占有率ごとの、ＦＭＴの各群でのＭＣＡ－２０５腫瘍の増殖動態。データは、６匹の動物／群の中の腫瘍サイズの平均値±ＳＥＭとして表わす。（ＮＳＣＬＣ患者の異なる糞便を使用した）少なくともｎ＝８回の実験（６匹のマウス／群を含む）の連結。ＦＭＴ Ａｋｋ^－（Ｄ、左のグラフ）とＡｋｋ＋（Ｄ、右のグラフ）での腫瘍サイズが示されており、各点は１匹のマウスを表わす。統計は、長手方向腫瘍増殖分析のための特別なソフトウエアを用いた混合効果モデリングであった（（ｈｔｔｐｓ：／／ｋｒｏｅｍｅｒｌａｂ．ｓｈｉｎｙａｐｐｓ．ｉｏ／ＴｕｍＧｒｏｗｔｈ／）。Ｐ値が示されている。Ｅ．（表６の患者に由来する）ＦＭＴに使用した糞便の各カテゴリーにおいて応答したマウス（抗ＰＤ－１ ｍＡｂ治療群における対照の平均と比べて２５％超の腫瘍縮小）と患者（ＯＲＲ）の割合。ＣＲ；完全奏功。ＰＲ；部分奏功、ＳＤ；安定、ＰＤ；進行。

図６ Ａｋｋ^＋糞便を特徴づけるメタゲノム種と患者の生存。

糞便試料（Ｎ＝３３８）のＡｋｋ^＋群とＡｋｋ^－群の中の糞便アルファ多様性を表わすシャノン多様性指数（Ａ、上図）。１＋２Ｌのコホート全体におけるＡｋｋ^＋群とＡｋｋ^－群の間の主座標分析（ＰＣｏＡ）によって表わされるブレイ－カーティス指数によって測定したベータ多様性（Ａ、下図）。ｐ値は、ＰＥＲＭＡＮＯＶＡを用いて９９９の並べ替えで計算した。箱ひげ図の下側と上側のヒンジはそれぞれ２５パーセンタイルと７５パーセンタイルに対応する。中央の線は中央値である。上側と下側のひげはヒンジから最大（または最小）値まで延びるが、ヒンジから、２５パーセンタイルと７５パーセンタイルの間の距離として定義される四分位数内の範囲の１．５倍を超えない。Ｐ値は、帰無仮説を検定し、両側検定を利用して計算した。正確なｐ値：３．８４５７３ｅ－０５。Ｂ～Ｃ．Ａ．ムシニフィラ（Ａｋｋ）の存在（Ｂ）と、Ａｋｋ＋群（Ｃ、左のグラフ）とＡｋｋ－群（Ｃ、右のグラフ）の中の１２ヶ月の時点のＯＳ（Ｃ）に従い、有効サイズの線形判別分析（ＬＥｆＳｅ）によって測定したメタゲノム種の存在量の差。ＬＤＡ：線形判別分析。ＯＳ：全生存期間。Ｐ値は、両側ノンパラメトリック要因クラスカル－ウォリス（ＫＷ）順位和検定を用いて計算した。＃偽発見率（ＦＤＲ）調整済みｐ値を０．２未満にした多変量解析（ＡＮＣＯＭ－ＢＣ／Ｍａａｓｌｉｎ２）。

図７ Ａｋｋ相対量に従って分別した、ＮＳＣＬＣ患者の糞便における組成の分類学的差。

Ａ．３つの群、すなわちＡｋｋ^－：Ａｋｋを検出できない、Ａｋｋ^低：Ａ．ムシニフィラの相対量が０．０３５～４．７９９％（陽性サンプルの７７パーセンタイル未満）、およびＡｋｋ^高：４．７９９％（７７パーセンタイル超）に分別したＡｋｋ相対量によるアルファ多様性（Ｎ＝３３８）。箱ひげ図の下側と上側のヒンジはそれぞれ２５パーセンタイルと７５パーセンタイルに対応する。中央の線は中央値である。上側と下側のひげはヒンジから最大（または最小）値まで延びるが、ヒンジから、２５パーセンタイルと７５パーセンタイルの間の距離として定義される四分位数内の範囲の１．５倍を超えない。Ｐ値は、両側ノンパラメトリックウィルコクソンウィルコクソン順位和検定を用いて計算した。Ｂ～Ｃ．Ａｋｋ^－とＡｋｋ^低の間（Ｂ）と、Ａｋｋ^低とＡｋｋ^高の間（Ｃ）のＰＣｏＡを用いたベータ多様性。ｐ値は、ＰＥＲＭＡＮＯＶＡを用いて９９９の並べ替えで計算した。ＰＥＲＭＡＮＯＶＡ検定でオブジェクトの群を比較し、群の重心と分散が同等であるという帰無仮説を検定する。Ｐ値は、実際のＦ検定を、群間のオブジェクトのランダムな並べ替え（この場合には９９９）から得られた結果と比較することによって計算する。ｐが０．０５未満である場合には、帰無仮説は棄却され、群の間の重心と分散は同等でないと結論される。Ｄ～Ｅ．Ａｋｋ^－とＡｋｋ^低の間（Ｄ）と、Ａｋｋ^低とＡｋｋ^高の間（Ｅ）の、Ａｋｋ相対量による分類学的糞便組成の変数重要度プロット（ＶＩＰ）判別分析。細菌占有率と存在量の差が倍数比でこれらＶＩＰプロットに示されている。ＶＩＰ：変数重要度プロット。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。Ｐ値は、両側ノンパラメトリックウィルコクソン順位和検定を用いて計算した。＃偽発見率（ＦＤＲ）調整済みｐ値を０．２未満にした多変量解析（ＡＮＣＯＭ－ＢＣ／Ｍａａｓｌｉｎ２）

図８ 生存率とマイクロバイオーム組成に対するＡＴＢとＡ．ムシニフィラの間の相互作用。

Ａ．検出可能なＡｋｋと検出不能なＡｋｋ（Ａｋｋ^＋とＡｋｋ^－）およびＡＴＢの使用（ｎｏＡＴＢ：ＡＴＢへの曝露なし。ＡＴＢ：ＩＣＩを開始する前２ヶ月以内に抗生剤曝露）による、ｎ＝３３８人の患者における全生存率のカプラン・マイヤー曲線とコックス回帰分析。Ａｋｋの状態とＡＴＢの使用を層別ログランク検定を用いて比較した。Ｐ値は調整なしの片側である。Ｂ．ＡＴＢに曝露された患者または曝露されていない患者からの糞便試料のＡｋｋ^＋群とＡｋｋ^－群における糞便アルファ多様性を表わすシャノン多様性指数（Ｎ＝３３８）。箱ひげ図の下側と上側のヒンジはそれぞれ２５パーセンタイルと７５パーセンタイルに対応する。中央の線は中央値である。上側と下側のひげはヒンジから最大（または最小）値まで延びるが、ヒンジから、２５パーセンタイルと７５パーセンタイルの間の距離として定義される四分位数内の範囲の１．５倍を超えない。Ｐ値は、両側ノンパラメトリックウィルコクソン順位和検定を用いて計算した。Ｃ．ｎ＝３３８人の患者において、１２ヶ月の時点の全生存とＡＴＢへの曝露の有無によるＡｋｋの相対量（平均値±ＳＥＭ）を表わす箱ひげ図。箱ひげ図の下側と上側のヒンジはそれぞれ２５パーセンタイルと７５パーセンタイルに対応する。中央の線は中央値である。上側と下側のひげはヒンジから最大（または最小）値まで延びるが、ヒンジから、２５パーセンタイルと７５パーセンタイルの間の距離として定義される四分位数内の範囲の１．５倍を超えない。利用した検定は、クラスカル－ウォリス、両側、有意性レベル５％であった。多重比較のための調整はしなかった。

図９ アッカーマンシアｐ２２６１がマウスマイクロバイオームの組成を変化させ、ＰＤ－１阻害に対する応答性を救った。

Ａ．実験の設定。マウスにおいて、ＡＴＢの３日後、ＦＭＴを、Ａｋｋ（Ａｋｋ^＋とＡｋｋ^－）に従って分類した患者の糞便を用いる経口強制投与によって実施した。１４日後にＭＣＡ－２０５腫瘍を皮下接種し、マウスを３日ごとに抗ＰＤ－１またはｉｓｏ－対照ｍＡｂで４回治療すると同時に、アッカーマンシアｐ２２６１を３日ごとに４回経口補充した。Ｂ～Ｄ．アッカーマンシアｐ２２６１の補充あり、またはなしの各ＦＭＴ群（Ａｋｋ^＋とＡｋｋ^－）のほか、ＳＰＦ条件（ＦＭＴ－）で育てられた動物について、抗ＰＤ－１ ｍＡｂを治療用に４回注射してから１２日後の平均ＭＣＡ－２０５腫瘍のサイズ±ＳＥＭが示されている。Ｉｓｏ群ではｎ＝５３匹のマウス、Ｉｓｏ ＦＭＴ＋群ではｎ＝５１、抗ＰＤ－１群と抗ＰＤ－１ ＦＭＴ＋群ではｎ＝５６を用いた２５回超の実験の連結。各実験は６匹のマウス／群を含み、それぞれのＦＭＴについて少なくとも２回実施した（表７）（Ｂ）。ＦＭＴ Ａｋｋ^－（Ｃ左、ｎ＝７２匹／群；Ｃ右、Ｉｓｏ群ではｎ＝４９、他の群ではｎ＝４８）とＦＭＴ Ａｋｋ^＋（Ｄ上、ｎ＝６匹／群、Ｄ下、Ｉｓｏ群と抗ＰＤ－１群ではｎ＝１２、抗ＰＤ－１＋アッカーマンシアｐ２２６１ではｎ＝１４）による腫瘍のサイズが示されており、各点は１匹のマウスを表わす。統計は、長手方向腫瘍増殖分析のための特別なソフトウエアを用いた混合効果モデリング（（ｈｔｔｐｓ：／／ｋｒｏｅｍｅｒｌａｂ．ｓｈｉｎｙａｐｐｓ．ｉｏ／ＴｕｍＧｒｏｗｔｈ／）（Ｄ）と、（複数の群についてダンの検定を用いてクラスカル-ウォリス検定を実施した後に）２つの独立な群を比べるマン－ホイットニー Ｕ検定（Ｂ～Ｃ）であった。ｎｓ＝有意差なし。Ｅ．ＦＭＴにおけるＰＤ－１ ｍＡｂの１２～１５日後の時点のＡｋｋｐ２２６１に関連した腫瘍縮小の比のクラスターマップであり、ＳＰＦマウスで得られた比に規格化されている。相対的な腫瘍サイズ縮小は灰色コードに従う（濃いほど程度が大きい；Ｒ、レスポンダー））。２９回のＦＭＴをＡに従って実施した。Ｎ＝合計２９～３０匹のマウス／群。各実験に６匹のマウス／群が含まれており、実験はそれぞれの腫瘍モデルについて２～３回実施した（Ｅ、左図）。４回の抗ＰＤ－１ Ａｂの注射と、アッカーマンシアｐ２２６１の４回の経口強制投与から１２日後の時点でレシピエントアバター腫瘍担持者から回収した糞便の遺伝子アンプリコンの１６Ｓ ｒＲＮＡシークエンシングが、薄い灰色（Ｒ）と濃い灰色（ＮＲ）の群に分けられている。判別メタゲノム種を分けるＶＩＰプロットであり、経口アッカーマンシアｐ２２６１に応答したマウス（Ｒ、薄い灰色の棒）または応答しなかったマウス（ＮＲ、濃い灰色の棒）の群に分別される。（Ｅ、右図）。星印は、１０％のＦＤＲなしの有意なマン－ホイットニーＵ検定を表わす。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。Ｐ値は、両側ノンパラメトリックウィルコクソン順位和検定を用いて計算した。多重比較のための調整はしなかった。

図１０ Ａｋｋ相対量はＩＣＩの予後マーカーである。３つの群（Ａｋｋ^－、Ａｋｋ^低、およびＡｋｋ^高）と、２つの分岐群ＳＧＢ９２２６（Ａ．ムシニフィラの代替物）およびＳＧＢ９２２８に分別したＡｋｋ相対量による、ＮＳＣＬＣ患者における全生存率のカプラン・マイヤー曲線。

図１１ ＳＰＦマウスと非レスポンダー患者からのＦＭＴを受けたマウスにおいてアッカーマンシアの株がチェックポイント阻害に対する治療応答に及ぼす効果。ＡＴＢで治療したマウスに１人の非レスポンダー患者だけからの糞便微生物移植をした後、ＭＣＡ－２０５肉腫とＰＤ－１阻害を接種した場合の腫瘍サイズを示す（各群でｎ＝６）。１つの代表的な実験が示されている。アッカーマンシア株２２６１、５８０１、５１２６、４５３１、または３２８４の添加によって腸内ディスバイオシスの補償を試みた。分散分析の統計 ＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。

図１２ いくつかの片利共生細菌に曝露された骨髄由来樹状細胞（ＢＭ－ＤＣ）（ＭＯＩ １：２０）によるＩＬ－１２産生。骨髄－樹状細胞をＧＭ－ＣＳＦ／ＩＬ－４の中でのインビトロ培養によって取得し、（ｘ軸に並べた）アッカーマンシアの生きた株とともに１時間刺激し、次いでそれをその後適切なＡＴＢによって中和した後、２４時間の時点で上清を回収し、市販のＥＬＩＳＡによってＩＬ－１２ｐ７０の濃度をモニタした。分散分析の統計 ＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。

図１３ アッカーマンシアの両方の種（ＳＧＢ９２２６／９２２８、左上のグラフ）、アッカーマンシア・ムシニフィラ株（アッカーマンシアＳＧＢ９２２６、右上のグラフ）、アッカーマンシアＳＧＢ９２２８株（左下のグラフ）のいずれかを認識するプライマー、またはｐ２２６１株に対して特異的なプライマー（右下のグラフ）のいずれかを用いてｑＰＣＲに基づいて同定したアッカーマンシア・ムシニフィラ株（５８０１、５１２６、および５１４５）またはアッカーマンシアＳＧＢ９２２８株（４５３１と２２６１）。

本明細書では、以下の一般的な定義を用いる：

腸内微生物叢

「腸内微生物叢」（以前は腸内フローラまたはマイクロフローラと呼ばれていた）は、動物界に属する任意の生物（ヒト、動物、昆虫など）の腸に棲息する微生物の集団を意味する。各個人は独自の微生物叢組成を持つ（合計で４００～５００の異なる細菌種／個人のうちで６０～８０の細菌種が、サンプリングした集団の５０％超で共有されている）が、腸内微生物叢は常に似た主要な生理学的機能を果たしており、個人の健康に直接影響を与える：
・腸内微生物叢は、胃と小腸が消化できないある食品（主に消化されない繊維）の消化に寄与する；
・腸内微生物叢は、いくつかのビタミン（ＢとＫ）の産生に寄与する；
・腸内微生物叢は、他の微生物からの攻撃から保護し、腸粘膜の完全性を維持する；
・腸内微生物叢は、適切な免疫系の発達に重要な役割を果たす；
・健康で多様でバランスの取れた腸内微生物叢は、適切な腸機能を保証する鍵である。

腸内微生物叢は、身体が正常に機能する上で主要な役割を果たしていることと、さまざまな機能を実現していることが考慮され、今や１つの「器官」と見なされている。しかし腸内微生物叢は「獲得された」器官である。というのも、赤ん坊は無菌で誕生するからである。すなわち腸への定着は誕生の直後に始まり、その後変化していくからである。

腸内微生物叢の発達は誕生時に始まる。子宮内は無菌であるため、新生児の消化管には、送達が起こる環境（空気など）である母親（膣、皮膚、乳房など）からの微生物が素早く定着する。３日目からは、腸内微生物叢の組成は、乳児がどのように栄養を摂るかに直接依存する。例えば母乳で育った赤ん坊の腸内微生物叢は、乳児用調整乳で育った赤ん坊と比べて主にビフィドバクテリウム属に支配されている。

腸内微生物叢の組成は誕生から老年まで生涯を通じて変化しており、異なる環境の影響の結果である。腸内微生物叢のバランスは加齢していく間に影響を受ける可能性があるため、その帰結として老齢者はより若い成人と比べて実質的に異なる微生物叢を持つ。

優勢な腸内微生物叢の一般的な組成はたいていの健康な人で似ている（４つの主要な門、すなわちファーミキューテス、バクテロイデス、アクチノバクテリア、およびプロテオバクテリア）が、種レベルの組成は高度に個別化されており、主に個人の遺伝子、環境、および食事によって決まる。腸内微生物叢の組成は、一時的または恒久的に食品成分に合ったものになる可能性がある。例えば日本人は、彼らの微生物叢が海洋細菌から獲得した特殊な酵素のおかげで海藻（彼らの毎日の食事の一部）を消化することができる。

ディスバイオシス

腸内微生物叢は変化に適応できるため大きな復元能力を持つが、いくつかの特定の状況ではその組成のバランスが崩れる可能性がある。これは「ディスバイオシス」と呼ばれており、腸内の潜在的に「有害な」細菌と「有益な」細菌の間の平衡が乱れ、または主要な細菌群の組成と多様性に関して「健康な」微生物叢と見なされている状態からのあらゆるずれを意味する。ディスバイオシスは健康問題（機能性腸障害、炎症性腸疾患、アレルギー、肥満、および糖尿病など）と結びついている可能性がある。ディスバイオシスは治療（細胞傷害性治療または抗生剤治療など）の帰結である可能性もある。

免疫チェックポイント阻害剤

本明細書では、「免疫チェックポイント阻害剤」または「ＩＣＩ」、「免疫チェックポイントを阻止する薬」、または「免疫チェックポイントブロッカー」または「免疫チェックポイント阻害薬」は、免疫チェックポイントを阻害する任意の薬、分子、または組成物を意味する。特に、前記用語は、抗ＰＤ１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体（アテゾリズマブまたはデュルバルマブなど）、抗ＣＴＬＡ－４抗体、および抗ＰＤ－Ｌ２抗体を包含する。より具体的には、前記用語として、抗ＰＤ１モノクローナル抗体（ニボルマブまたはペムブロリズマブなど）が可能である。

「抗ＰＤ１／ＰＤ－Ｌ１ Ａｂに基づく療法」は、本明細書では、ＰＤ１またはＰＤ－Ｌ１に拮抗するあらゆる薬を意味する。ＰＤ１またはＰＤ－Ｌ１に拮抗する現在使用されている薬はモノクローナル抗体だが、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する他の分子を用いて将来のＩＣＩ（例えば抗体断片または特別に設計されたアプタマーなど）を開発できる可能性がある。もちろん、「抗ＰＤ１／ＰＤ－Ｌ１ Ａｂに基づく療法」という表現は、ＰＤ１またはＰＤ－Ｌ１に拮抗する活性分子を用いたあらゆる療法を包含する。

がん、治療など

本明細書では、「がん」は、あらゆるタイプのがんを意味する。特に、がんとして固形がんまたは非固形がんが可能である。がんの非限定的な例は、癌腫または腺癌（乳がん、前立腺がん、卵巣がん、肺がん、膵臓がん、または大腸がん、肉腫、リンパ腫、黒色腫、白血病、胚細胞がん、および芽腫など）である。

免疫系はがんに対して二重の役割を果たす。すなわち免疫系は腫瘍細胞の増殖を阻止し、しかも腫瘍細胞の免疫原性も生じさせる。したがって免疫チェックポイントを阻害する薬を用いてほぼあらゆるタイプのがんを治療することができる。したがって本発明による方法は、がんを持つ患者にとって潜在的に有用であり、そのがんの選択は、副腎皮質がん、肛門がん、胆管がん（例えば末梢（ｐｅｒｉｐｈｉｌａｒ）がん、遠位胆管がん、肝内胆管がん）、膀胱がん、骨がん（例えば骨芽細胞腫、骨軟骨腫、血管腫、軟骨粘液線維腫、骨肉腫、軟骨肉腫、線維肉腫、悪性線維性組織球腫、骨の巨大細胞腫、脊索腫、リンパ腫、多発性骨髄腫）、脳と中枢神経系のがん（例えば髄膜腫、星細胞腫、乏突起膠腫、上衣腫、神経膠腫、髄芽腫、神経節膠腫、シュワン細胞腫、胚細胞腫、頭蓋咽頭腫）、乳がん（例えば非浸潤性乳管癌、浸潤性乳管癌、浸潤性小葉癌、非浸潤性小葉癌、女性化乳房）、キャッスルマン病（例えば巨大リンパ節過形成、血管濾胞性リンパ節過形成）、子宮頸がん、結腸直腸がん、子宮内膜がん（例えば子宮内膜腺癌、腺棘細胞腫（ａｄｅｎｏｃａｎｔｈｏｍａ）、乳頭状漿液性腺癌、明細胞）、食道がん、胆嚢がん（粘液腺癌、小細胞癌）、消化管カルチノイド腫瘍（例えば絨毛がん、破壊性絨毛腺癌）、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、カポジ肉腫、腎臓がん（例えば腎細胞がん）、咽頭と下咽頭のがん、肝臓がん（例えば血管腫、肝腺腫、限局性結節性過形成、肝細胞癌）、肺がん（例えば小細胞肺がん、非小細胞肺がん）、中皮腫、形質細胞腫、鼻腔と副鼻腔のがん（例えば嗅神経芽腫、正中肉芽腫）、上咽頭がん、神経芽腫、口腔と咽頭のがん、卵巣がん、膵臓がん、陰茎がん、下垂体がん、前立腺がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫（例えば胎児性横紋筋肉腫、胞巣性横紋筋肉腫、多形性横紋筋肉腫）、唾液腺がん、皮膚がん（例えば黒色腫、黒色腫皮膚がん）、胃がん、精巣がん（例えばセミノーマ、非セミノーマ生殖細胞がん）、胸腺がん、甲状腺がん（例えば濾胞癌、退形成性癌、低分化癌、甲状腺髄様癌、甲状腺リンパ腫）、膣がん、陰門がん、および子宮がん（例えば子宮平滑筋肉腫）の中からなされる。より具体的には、本発明の方法を用いて免疫チェックポイントを標的とする薬に対する患者の応答を予測し、最適化することができる。ただしその患者が持つがんの選択は、転移性黒色腫、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）、中皮腫、膀胱がん、腎細胞癌、頭頸部がん、食道がんと胃がん、直腸がん、肝細胞癌、肉腫、ウィルムス腫瘍、ホジキンリンパ腫、ＡＬＫ－神経芽腫、（ホルモン抵抗性）前立腺がん、およびＧＩＳＴからなるグループからなされる。

他の定義は、必要なときに下でなされるであろう。

第１の側面によれば、本発明は、あるがん患者が、免疫チェックポイント阻害剤（ＩＣＩ）に基づく療法に対する良いレスポンダーであるかどうかを判断するインビトロセラノスティクス法に関するものであり、この方法は、前記患者からのサンプル中でアッカーマンシア・ムシニフィラおよび／またはアッカーマンシアＳＧＢ９２２８の相対量を測定することを含み、アッカーマンシア・ムシニフィラおよび／またはアッカーマンシアＳＧＢ９２２８が所定の閾値（「上閾値」）未満で存在していることが、前記患者がＩＣＩに基づく療法に対する良いレスポンダーである可能性が大きいことを示している。

アッカーマンシア・ムシニフィラとアッカーマンシアＳＧＢ９２２８は２つの最も優勢なアッカーマンシア種であり、例えばあらゆるアッカーマンシアに共通する遺伝子にハイブリダイズするプライマーを用いて合わせて検出することができる。別の一実施形態によれば、本発明はしたがって、あるがん患者が、免疫チェックポイント阻害剤（ＩＣＩ）に基づく療法に対する良いレスポンダーである可能性が大きいかどうかを判断するインビトロセラノスティクス法に関するものであり、この方法は、前記患者からのサンプル中でアッカーマンシア属の相対量を測定することを含み、アッカーマンシア属が所定の閾値（「上閾値」）未満で存在していることが、前記患者がＩＣＩに基づく療法に対する良いレスポンダーである可能性が大きいことを示している。

発明者らは、ＷＯ２０１８１１５５１９において、がん患者からの糞便サンプル中にアッカーマンシア・ムシニフィラが不在であることが、ＰＤ１阻害に対する耐性を表わすことをすでに示した。発明者らは、下に報告する実験において、今度は、糞便サンプル中のアッカーマンシア・ムシニフィラおよび／またはアッカーマンシアＳＧＢ９２２８の過剰な存在が、すなわちそれが上閾値を超えて存在することが、ＩＣＩ治療にもかかわらず悪い予後を示していることを実証した。少なくとも図２Ｄに示されているように、アッカーマンシア・ムシニフィラが超生理学的レベルで存在することは、糞便中にアッカーマンシア・ムシニフィラが存在しない患者の全生存率よりも有意に低い全生存率と相関しており、アッカーマンシア・ムシニフィラが存在しない患者の全生存率そのものも、アッカーマンシア・ムシニフィラが（報告されている実験における検出限界に対応する）下閾値と上閾値の間の間に含まれるレベル（今後は「所定の閾値」と呼ぶ）である患者の全生存率よりも低い。

本発明の枠組みで「所定の閾値」として使用できる閾値の一例が、下記の実験の部分に開示されている。もちろん当業者は、アッカーマンシア・ムシニフィラおよび／またはアッカーマンシアＳＧＢ９２２８および／またはアッカーマンシア属の相対量を測定するのに用いる技術（例えばメタゲノミクス、定量ＰＣＲ、マイクロアレイ上のハイブリダイゼーション、またはパイロシークエンシング）、検出されるアッカーマンシアの種、患者の具体的な病状、患者の食事習慣、治療に用いる具体的なＩＣＩ、および他の可能な因子に合わせてこの閾値を変えること、または洗練することができる。例えば上記の方法を実施するときに考慮すべき閾値は、予後を知ろうとする患者と同じがんを持つ複数の個人からなる代表的なコホートにおけるアッカーマンシア・ムシニフィラおよび／またはアッカーマンシアＳＧＢ９２２８、および／またはアッカーマンシア属の相対量を測定し、閾値として７５パーセンタイルの値を選択することによってあらかじめ決めることができる。この閾値は、アッカーマンシア・ムシニフィラとアッカーマンシアＳＧＢ９２２８で異なる可能性がある。

説明を目的として、健康なボランティア（入手可能な文献から）と、黒色腫であるか、腎臓がんまたは肺がんであると診断された転移患者の３つのコホートから得られたアッカーマンシア・ムシニフィラの相対量の値を下に示す。

本明細書では、「アッカーマンシア・ムシニフィラが所定の閾値未満で存在すること」はしたがって、アッカーマンシア・ムシニフィラが２つの閾値の間、すなわち下閾値（０近く、典型的には０．００１未満、例えば０．０００５）と上閾値（上記の「所定の閾値」）の間で存在することを意味する。同じことが、アッカーマンシアＳＧＢ９２２８とアッカーマンシア属に当てはまる。

本発明の特別な一実施形態によれば、所定の閾値は、１と１０％の間（例えば３と６．５％の間）の相対量に対応する。

別の特別な一実施形態によれば、所定の閾値は、７５パーセンタイルと７７パーセンタイルの間になるように選択される。それは、グリッド検索アルゴリズムによって選択することができる。下記の実験の部分で用いたコホートでは、選択されたカットオフ（所定の閾値）は４．７９（７７パーセンタイル）であり、測定誤差４．７５±０．１に対応する。したがって本発明の方法を実施するとき４．７５±０．１という所定の閾値を上閾値として用いることができる。もちろんすでに述べたように、この閾値は、当業者が定型的な実験によって洗練すること、変えることができる。

本発明の別の特別な一実施形態によれば、ＩＣＩに基づく療法は、抗ＰＤ１／ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２ Ａｂに基づく療法（非限定的な例は、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、アテゾリズマブ、およびデュルバルマブなど）または抗ＣＴＬＡ４ Ａｂに基づく療法（非限定的な例は、イプリムマブなど）、またはこれらの組み合わせである。

下記の実験の部分に示されているように、本発明は、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）または腎臓がんを患っている患者、またはＰＤ１／ＰＤＬ－１またはＣＴＬＡ４の阻害に適したあらゆるがんを患っている患者にとって特に有用である。

より一般に、本発明の方法は、免疫療法に適したあらゆるがんを患っているがん患者で有利に実施することができ、がんの非限定的な例は、黒色腫；腎細胞癌（ＲＣＣ）；非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）；頭頸部扁平上皮細胞癌（ＨＮＳＣＣ）；メルケル細胞癌（ＭＣＣ）；膀胱がん；ホジキンリンパ腫；扁平上皮細胞癌；乳がん、特にトリプルネガティブ乳がん；胃がん；小細胞肺癌；原発性縦隔Ｂ細胞リンパ腫；子宮頸がん；肝細胞癌；食道がん；マイクロサテライト不安定性を伴うがん；子宮内膜がん、および腫瘍変異量が少ない任意のがん（ＴＭＢ－Ｈがん）などである。

下記の実験の部分に示されているように、本発明は、ＩＣＩに基づく療法が第１選択療法または第２選択療法またはそれ以後（第３選択、または第４選択）として投与される状況において有用である。

本発明の特別な１つの側面によれば、所定の閾値は、アッカーマンシア・ムシニフィラ、および／またはアッカーマンシアＳＧＢ９２２８、および／またはアッカーマンシア属がこの閾値を超えて存在することが、ＩＣＩに基づく療法にもかかわらず悪い予後を示しているように選択される。

別の１つの側面によれば、本発明は、あるがん患者がＩＣＩに基づく療法を投与する前に細菌補償を必要とするかどうかをインビトロで判断し、患者がその治療に応答する可能性を改善することのできる補償のタイプに関する情報を医師に提供する方法に関する。

特別な一実施形態によれば、この方法は、前記患者からのサンプル中でアッカーマンシア・ムシニフィラおよび／またはアッカーマンシアＳＧＢ９２２８の相対量を測定し、医師に以下のガイドを提供することを含む：
（ｉ）アッカーマンシア・ムシニフィラおよび／またはアッカーマンシアＳＧＢ９２２８がサンプル中に存在しない場合には、患者は、ＩＣＩ投与の前に少なくともアッカーマンシア・ムシニフィラおよび／またはアッカーマンシアＳＧＢ９２２８を用いた細菌補償を必要とする；
（ｉｉ）アッカーマンシア・ムシニフィラおよび／またはアッカーマンシアＳＧＢ９２２８が所定の閾値未満でサンプル中に存在する場合には、患者はＩＣＩ投与の前にいかなる細菌補償も必要としない；および
（ｉｉｉ）アッカーマンシア・ムシニフィラおよび／またはアッカーマンシアＳＧＢ９２２８が所定の閾値を超えてサンプル中に存在する場合、特にこの過剰な存在が、抗生物質曝露の結果である、および／またはガンマプロテオバクテリア綱および／またはデスルホビブリオ科に属する種の過剰な存在に関係する場合には、患者は、多微生物共同体を用いた細菌補償、および／または健康な個人から、またはＩＣＩに基づく前記療法にうまく応答したがん患者からの糞便微生物移植（ＦＭＴ）を通じた細菌補償を必要とする。

別の特別な一実施形態によれば、あるがん患者が、ＩＣＩに基づく療法を投与する前に細菌補償を必要とするかどうかをインビトロで判断する方法は、前記患者からのサンプル中でアッカーマンシア属の相対量を測定し、医師に以下のガイドを提供することを含む：
（ｉ）アッカーマンシア属がサンプル中に存在しない場合には、患者は、ＩＣＩ投与の前にアッカーマンシア属の細菌（例えば候補種アッカーマンシアＳＧＢ９２２８の細菌である、Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｄｅ ｓｏｕｃｈｅｓ ｄｅ ｌ’Ｕｎｉｔｅ ｄｅｓ Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉｅｓ（ＣＳＵＲ）に参照番号ＣＳＵＲ Ｐ２２６１で寄託された株、またはＣＳＵＲに参照番号ＣＳＵＲ ４５３１で寄託された株など）を用いた細菌補償を必要とする；
（ｉｉ）アッカーマンシア属の細菌が所定の閾値未満でサンプル中に存在する場合には、患者はＩＣＩ投与の前にいかなる細菌補償も必要としない；および
（ｉｉｉ）アッカーマンシア属の細菌が所定の閾値を超えてサンプル中に存在する場合、特にこの過剰な存在が、抗生物質曝露の結果である、および／またはガンマプロテオバクテリア綱および／またはデスルホビブリオ科に属する種の過剰な存在に関係する場合には、患者は、多微生物共同体を用いた細菌補償、および／または健康な個人から、またはＩＣＩに基づく前記療法にうまく応答したがん患者からの糞便微生物移植（ＦＭＴ）を通じた細菌補償を必要とする。

上記の方法の特別な一実施形態によれば、所定の閾値は、上述のように、アッカーマンシア・ムシニフィラおよび／またはアッカーマンシアＳＧＢ９２２８および／またはアッカーマンシア属の相対量が１と１０％の間であること、例えば３と６．５％の間であること、または他の任意の所定の閾値に対応する。

上記の方法の別の特別な一実施形態によれば、ＩＣＩに基づく療法は、（上に記載したように）抗ＰＤ１／ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２ Ａｂに基づく療法、または抗ＣＴＬＡ４ Ａｂに基づく療法、またはこれらの組み合わせである。

本発明による方法は、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、特に非扁平上皮ＮＳＣＬＣを患っているがん患者が、ＩＣＩに基づく療法を投与する前に細菌補償を必要とするかどうかをインビトロで判断するのに特に有用であるほか、腎臓がん、またはＰＤ１／ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２および／またはＣＴＬＡ４の阻害に適したあらゆるがんを患っているあるがん患者が、ＩＣＩに基づく療法を投与する前に細菌補償を必要とするかどうかをインビトロで判断するのに特に有用である。

上記の方法の特別な１つの側面によれば、前記方法は、ＩＣＩに基づく療法が第１選択療法として投与される前に、患者がこの療法に応答する自らの可能性を改善するために細菌補償を必要とするかどうかを評価することを目的として実施される。

上記の方法の別の特別な１つの側面によれば、前記方法は、ＩＣＩに基づく療法がまたは第２選択療法またはそれ以降（第３選択、第４選択）として投与される前に実施される。

発明者らは、驚くべきことに、７５パーセンタイル以内の相対量のアッカーマンシア・ムシニフィラと糞便のアルファ多様性（シャノン多様性指数）の関連性によって示されるように、アッカーマンシア属の細菌（アッカーマンシア・ムシニフィラやアッカーマンシアＳＧＢ９２２８など）が腸内に棲息していることが、腸エコシステムの豊かさの間接的マーカーであることを実証した。そのためアッカーマンシア・ムシニフィラおよび／またはアッカーマンシアＳＧＢ９２２８および／またはアッカーマンシア属のレベルを測定して腸内ディスバイオシスを迅速かつ容易に同定することができる。

微生物叢を中心とするあらゆる介入に特に有用な本発明の別の１つの側面はしたがって、ある個人が腸内ディスバイオシスを持つかどうかを判断する方法であり、この方法は、前記患者からのサンプル中でアッカーマンシア・ムシニフィラおよび／またはアッカーマンシアＳＧＢ９２２８および／またはアッカーマンシア属の相対量を測定することを含み、アッカーマンシア・ムシニフィラおよび／またはアッカーマンシアＳＧＢ９２２８および／またはアッカーマンシア属が所定の閾値未満で存在することが、腸内ディスバイオシスが存在しないことを示している。

上記の方法の特別な一実施形態によれば、所定の閾値は、上述のように、１と１０％の間、例えば３と６．５％の間の相対量、または他の任意の所定の閾値に対応する。

ここまでの側面のいずれかに従う方法では、前記の患者または個人からのサンプルとして、前記の患者または個人の糞便サンプル、または大腸または回腸管腔の内容物からのサンプル、または前記の患者または個人からの粘膜生検が可能である。

本発明の別の１つの側面によれば、本発明は特に、ＩＣＩに基づく療法の投与前に健康な微生物叢を回復すること、患者が治療に応答する可能性を改善することを目的として、自らの腸内微生物叢にアッカーマンシア・ムシニフィラおよび／またはアッカーマンシアＳＧＢ９２２８および／またはアッカーマンシア属が過剰に存在するがん患者の治療で糞便微生物組成を利用することに関する。実際、下記の実験の部分に示されているように、発明者らは、アッカーマンシア・ムシニフィラおよび／またはアッカーマンシアＳＧＢ９２２８の存在がホメオスタシスに合致したレベルでの存在であるときには好ましい臨床転帰を予測するが、アッカーマンシア・ムシニフィラおよび／またはアッカーマンシアＳＧＢ９２２８の過剰な存在は悪い予後を示していることを実証した。この過剰な存在は、ＡＴＢまたは他の有害因子によって誘導される腸の損傷治癒の結果である可能性があり、ＩＣＩ治療にもかかわらず悪い予後を示す。特別な一実施形態によれば、糞便微生物組成物は、健康な個人に由来するか、ＩＣＩに基づく療法にうまく応答したがん患者に由来する。

下記の実験の部分に示されているように、発明者らは、ＡＴＢで治療した後、治療がうまくいかなかったと判断された患者からのＦＭＴを投与されたアバターマウスのモデルにおいて、ＰＤ－１阻害に対する応答を回復させることができた。発明者らは、最良の有益な効果が、ドナーのＡｋｋが検出不能である実験で得られることを示した。本発明のさらに別の側面によれば、本発明はしたがって、自らの腸内微生物叢にアッカーマンシア・ムシニフィラが存在せず、アッカーマンシアＳＧＢ９２２８が存在しないがん患者の治療において、特にその患者がＩＣＩに基づく治療に応答する可能性を改善するため、アッカーマンシア・ムシニフィラまたはアッカーマンシアＳＧＢ９２２８を含む細菌組成物を使用することに関する。

本発明の細菌組成物の特別な一実施形態によれば、アッカーマンシア細菌は、Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｄｅ ｓｏｕｃｈｅｓ ｄｅ ｌ’Ｕｎｉｔｅ ｄｅｓ Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉｅｓ（ＣＳＵＲ）に参照番号ＣＳＵＲ Ｐ２２６１で寄託された株に由来する。この株は、最初はアッカーマンシア・ムシニフィラとして同定されたが、最近、アッカーマンシアＳＧＢ９２２８候補種に再分類された。

本発明の細菌組成物の別の特別な一実施形態によれば、アッカーマンシア細菌は、Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｄｅ ｓｏｕｃｈｅｓ ｄｅ ｌ’Ｕｎｉｔｅ ｄｅｓ Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉｅｓ（ＣＳＵＲ）に参照番号ＣＳＵＲ ４５３１で寄託された株に由来する。

本発明による糞便微生物組成物または細菌組成物は、および／またはＩＣＩに基づく療法の前に、特に抗ＰＤ１／ＰＤ－Ｌ１ Ａｂに基づく療法、または抗ＣＴＬＡ４ Ａｂに基づく療法、またはこれらの組み合わせを用いた療法と組み合わせて投与される場合に、特に有用である可能性がある。

本発明の特別な一実施形態によれば、上記の微生物組成物または細菌組成物は、上に詳述したように、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、特に非扁平上皮ＮＳＣＬＣ、または腎臓がん、またはＰＤ１／ＰＤＬ－１またはＣＴＬＡ４の阻害に適したあらゆるがんを患っている患者の治療に使用される。

本発明の別の特別な一実施形態によれば、上記の微生物組成物または細菌組成物が、第１選択療法または第２選択療法またはその後の療法として、ＩＣＩに基づく療法を受けた患者の治療で使用される。

上記の方法を実施するとき、アッカーマンシア・ムシニフィラの相対量は以下のプライマーを用いた定量ＰＣＲによって測定することができる：

本発明の他の特徴は、本発明の枠組みで実施された生物学的アッセイに関する以下の記述を読むうちにも明らかになろう。この記述は、本発明の範囲を制限することなく、必要とされる実験的裏づけを本発明に提供する。

実施例１：腸アッカーマンシア・ムシニフィラは、進行した非小細胞肺がん患者におけるＰＤ１阻害に対する臨床応答を予測する

方法

研究設計と治療

倫理的課題。補助的研究を、ＩＲＢに承認された研究に従って設計した（Ｏｎｃｏｂｉｏｔｉｃｓ＊ Ｓｐｏｎｓｏｒ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ Ｎ：Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｓｅｃｕｒｉｔｙ ａｎｄ Ｅｍｅｒｇｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＣＳＥＴ）２０１７／２６１９， Ａｇｅｎｃｅ ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅ ｓｅｃｕｒｉｔｅ ｄｕ ｍｅｄｉｃａｍｅｎｔ ｅｔ ｄｅｓ ｐｒｏｄｕｉｔｓ ｄｅ ｓａｎｔｅ ＩＤ－ＲＣＢ Ｎ：２０１７－Ａ０２０１０－５３ ｈｔｔｐｓ：／／ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ／ｃｔ２／ｓｈｏｗ／ＮＣＴ０４５６７４４６）。この試験は、医薬品の臨床試験実施基準とヘルシンキ宣言の条項に従って実施した。全患者が書面でインフォームドコンセントを提出した。一般データ保護規則の手続きと匿名化規則が、ＣｌｉｎｉｃｏＢｉｏｍｅ、Ｇｕｓｔａｖｅ Ｒｏｕｓｓｙにすでに設置されているＯｎｃｏｂｉｏｍｅ Ｈ２０２０モデルシステムに従って適用された。あらゆるデータとサンプルの回収は、規制、倫理、および欧州ＧＤＰＲの条件に合致するように実施した。

患者の適格性。抗ＰＤ－（Ｌ）１で治療した進行したＮＳＣＬＣ患者の臨床転帰におけるマイクロバイオーム組成物の影響を評価するために設計した多施設前向き観察研究であるＮＣＴ０４５６７４４６。フランス国内の１２箇所の学術機関とカナダ国内の２箇所の学術機関を登録した。成人患者で、進行した非扁平上皮または扁平上皮ＮＳＣＬＣであることが病理学的に確認され、Ｅａｓｔｅｒｎ Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｇｒｏｕｐ（ＥＣＯＧ）パフォーマンスステータススコアが０～２であり、標準治療としてのＩＣＩに適していて、糞便サンプルの提供を強制された者が適格であった。適格な患者は、白金に基づく化学療法計画でがんが進行した後に、ＰＤ－Ｌ１の発現に関係なくニボルマブまたはアテゾリズマブのＩＣＩ、またはＰＤ－Ｌ１が１％以上である場合にはペムブロリズマブのＩＣＩのいずれかを受けた。その後、研究登録期間中に第１選択の設定において第１選択ＩＣＩが承認されたため、ＰＤ－Ｌ１の発現に応じてペムブロリズマブ単剤療法、または白金に基づく化学療法との組み合わせを受けた患者も包含された。標準治療を、疾患進行、許容できない副作用、またはプロトコル通りの終了（２年間のＩＣＩ）まで続けた。完全な適格基準は試験プロトコル（ＮＣＴ０４５６７４４６）に掲載されている。ベースラインの特徴は、ＩＣＩの開始前最後の２ヶ月間に受けた併用薬物治療の詳細なリストと、追跡最終日を含め、各施設において電子的ケース報告の形式で入力された。

仮説。サンプルサイズの計算は、Ｒｏｕｔｙら（Ｒｏｕｔｙ， Ｌｅ Ｃｈａｔｅｌｉｅｒ， ｅｔ ａｌ． ２０１８）の中で提案されている仮説から調査者が評価したＯＲＲとして定義される主要エンドポイントに基づいて実施した。その仮説とは、腸内マイクロバイオームの中にメタゲノミクスで検出可能なＡｋｋ（Ａｋｋ^＋）を有する集団では、応答率が、検出不能なＡｋｋ（Ａｋｋ）を有する集団におけるよりも高くなるであろうというものである。意味のある臨床上の差は、Ａｋｋ^－群における１０％からＡｋｋ^＋群における２０％までのＯＲＲの増分と相関しているであろうと考えた。この優勢仮説があるため、ＥＡＳＴ（登録商標）プログラムを用いて両側アルファレベル５％でパワーを８０％に設定した。そこでわれわれの主要な目的を確認するのに少なくとも２９２人の患者が必要とされると判断した。

研究のエンドポイントと評価。コンピュータ断層撮影スキャンをベースラインで実施し、最初の１年間は８～１２週間ごとに、その後は疾患進行まで１２～１５週間ごとに実施した。腫瘍応答は、「固形がんの治療効果判定」バージョン（ＲＥＣＩＳＴ）１．１（Ｅｉｓｅｎｈａｕｅｒ ｅｔ ａｌ． ２００９）を用いて評価した。主要エンドポイントは、調査者が評価した客観的応答率（ＯＲＲ）であり、それは、確認された完全奏功（ＣＲ）または部分奏功（ＰＲ）の最良総合結果（ＢＯＲ）を持つ患者の数および割合と定義した。最良総合結果（ＢＯＲ）は、最初の治療投与の日付と、ＲＥＣＩＳＴ ｖ１．１によって最初に客観的に記録された腫瘍進行の日付またはその後の治療の日付のどちらか早い方の間に記録された最良応答指定と定義した。進行またはその後の治療の記録がない患者では、入手できるあらゆる応答指定がＢＯＲの決定に寄与した。副次的エンドポイントには、全生存期間（ＯＳ）とマイクロバイオームの変数（アルファ多様性とベータ多様性、および属レベルでの存在量差分析など）が含まれた。全生存期間は、試験への組み込みから、あらゆる原因による死亡までの時間と定義した。データベースロックの時点で生きている患者の追跡は、接触があった最後の記録の日付で打ち切った。

治療法：ペムブロリズマブ（２１日おき）またはニボルマブ（１５日おき）またはアテゾリズマブ（２１日おき）の注射を受けた回数は、８～１２週間の時点で４±２、１２ヶ月の時点で２０±４であった。

ヒト糞便サンプルとメタゲノミクス分析

糞便サンプルは、各施設でＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｈｕｍａｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ（ＩＨＭＳ）のガイドラインに従って前向きに回収した（Ｖ１：ＩＣＩ前、Ｖ２：２回目のＩＣＩ注射の前、Ｖ３：ＩＣＩから３ヶ月後の時点、Ｖ４：ＩＣＩから６ヶ月後の時点）。ベースラインＶ１サンプルだけをこの分析では考慮し、そのようなタイムリーな回収ができなかった患者ではＶ２サンプルを（１）におけるように「ベースライン」と見なした。メタゲノム分析のため、以前に報告されたように（Ｒｏｕｔｙ， Ｌｅ Ｃｈａｔｅｌｉｅｒ， ｅｔ ａｌ． ２０１８；Ｌｉ ｅｔ ａｌ． ２０１４； Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ． ２０１４）、糞便を処理して全ＤＮＡを抽出し、ＭｅｔａＧｅｎｏＰｏｌｉｓ（ＩＮＲＡ）（フランス国）によるイオン・プロトン技術を用いてシークエンシングした。リードのクリーニング、フィルタリング、および分類を２つの異なるパイプライン：ＭｅｔａＯＭｉｎｅＲとＭｅｔａＰｈｌＡｎ ３（Ｂｅｇｈｉｎｉ ｅｔ ａｌ． ２０２０， ３）で実施した。アッカーマンシア・ムシニフィラの存在／不在を明らかにするため、４つのアッカーマンシア候補の種レベルゲノムビン（ＳＧＢ）（ＳＧＢ９２２３－３８個のマーカー、ＳＧＢ９２２４－５４個のマーカー、ＳＧＢ９２２６－１７１個のマーカー、およびＳＧＢ９２２８－２００個のマーカー）（Ｋａｒｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ． ２０２１）から同定した合計４６３個の遺伝子マーカーをＭｅｔａＰｈｌＡｎにおいて使用した。表２に概略が示されているように、ＳＧＢ９２２６として示したＡ．ムシニフィラ（ＭｕｃＴ）のタイプの株がわれわれのコホートで最も優勢な種であった（アッカーマンシア陽性サブセットの８０％超）ため、この論文の主要な図面でＡｋｋの相対量の計算に使用した。

ｍｓｐ＿００２５がＳＧＢ９２２６に対応することが見いだされ、その相対量の値をＭｅｔａＯＭｉｎｅＲにおいてＡ．ムシニフィラの代替指標として使用した。ＤＮＡ精製とメタゲノムパイプライン両方の完全な記述は、Ｄｅｒｏｓａら（Ｌｉｓａ Ｄｅｒｏｓａ ｅｔ ａｌ． ２０２０）で入手することができる。存在量行列から出発し、全サンプルの少なくとも２．５％の中に存在していた分類群だけを考慮し、次いで生データを規格化し、標準化した（Ｓｃｉ－Ｋｉｔ学習バージョン０．２０．３）。

腫瘍ＲＮＡのシークエンシング：

以前に公開されている技術（Ｆｕｍｅｔ ｅｔ ａｌ． ２０１８）を利用して全ＲＮＡを、主要な分析に含まれる進行したＮＳＣＬＣを持つ患者からのほか、限定されたステージの患者からのホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）腫瘍から抽出した（表３）。ライブラリを１２μｌの全ＲＮＡとＴｒｕＳｅｑ Ｓｔｒａｎｄｅｄ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡからＲｉｂｏ－Ｚｅｒｏ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を製造者の指示に従って用いて調製した。ＢＢＭＡＰ ｖ３８．８７を用いてシークエンシングアプタマーをトリミングし、低品質のリードと短すぎるリードを除外した。Ｋａｌｌｉｓｔｏソフトウエア（Ｂｒａｙ ｅｔ ａｌ． ２０１６）を用い、Ｅｎｓｅｍｂｌデータベース、リリース１０１からのＧＲＣｈ３８ ｃＤＮＡ参照トランスクリプトームと比べてＲＮＡ－ｓｅｑデータから転写産物の量を定量した。タンパク質をコードする転写産物と遺伝子だけを下流分析に含めた。１００万当たりの転写産物の値を下流分析で使用した。マン－ホイットニー検定を実施し、アッカーマンシア群ごとの遺伝子の発現を比較した。ユークリッド距離を用いたＰＥＲＭＡＮＯＶＡ検定を利用し、発現が異なる遺伝子のサブセットについて群の間の差を評価した。

前臨床研究の詳細

マウス。すべての動物実験をフランス国と欧州の法律と規制に従って実施した。施設内動物倫理委員会（Ｍｉｎｉｓｔｅｒｅ ｄｅ ｌａ Ｒｅｃｈｅｒｃｈｅ， ｄｅ ｌ’Ｅｎｓｅｉｇｎｅｍｅｎｔ Ｓｕｐｅｒｉｅｕｒ ｅｒ ｄｅ ｌ’Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ）がすべてのマウス実験を承認した（許可番号：２０１６－０４９－４６４６， ２０１８－０２０－５１０２６３０３１ｖ３）。マウスアバター研究は地方と国の動物施設規制委員会（Ｍｉｎｉｓｔｅｒｅ ｄｅ ｌａ Ｒｅｃｈｅｒｃｈｅ， ｄｅ ｌ’Ｅｎｓｅｉｇｎｅｍｅｎｔ Ｓｕｐｅｒｉｅｕｒ ｅｔ ｄｅ ｌ’Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ）（Ｅｖｅｒｉｍｍｕｎｅ ＃１３３６６－２０１８０２０５１０２６３０３１ ｖ３、ＡＰＡＦＩＳ＃１７５３０－２０１８１１４１３３５２７３８ ｖ２（０３／２０１９－０３／２０２４）。ＡＰＡＦＩＳ＃ ２１３７８－２０１９０７０８０８４８４８３４５９）によって承認された。雌のＣ５７Ｂｌ／６とＢＡＬＢ／ｃをそれぞれＨａｒｌａｎ（フランス国）とＪａｎｖｉｅｒ（フランス国）から購入した。マウスは特定の病原体がない条件（ＳＰＦ）で収容して８と１６週齢の間に使用した。すべてのマウス実験をＧｕｓｔａｖｅ Ｒｏｕｓｓｙ Ｃａｎｃｅｒ Ｃａｍｐｕｓ内の動物施設で実施し、そこでは動物をＳＰＦ条件で収容した。

細胞培養、試薬、および腫瘍細胞系。ＭＣ３８、ＭＣＡ－２０５、およびＢ１６Ｆ１０細胞系（Ｃ５７ＢＬ／６マウスからの同系）と４Ｔ１細胞系（ＢＡＬＢ／ｃマウスからの同系）はＡＴＣＣから購入した。４Ｔ１細胞、ＭＣＡ－２０５細胞、およびＭＣ３８細胞は、１０％のＦＣＳ、２ｍＭのＬ－グルタミン、１００ＵＩ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、およびＭＥＭ非必須アミノを含有するＲＰＭＩ １６４０の中で培養した。すべての試薬をＧｉｂｃｏ－Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州、アメリカ合衆国）から購入した。Ｂ１６Ｆ１０細胞とＣＴ２６細胞は、１０％のＦＣＳ＋１００ＵＩ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン＋非必須アミノ酸を含有する含有するＤＭＥＭの中で培養した。全細胞系を３７℃、５％ＣＯ２で培養し、マイコプラズマ汚染がないことを定期的に検査した。

ＭＣＡ－２０５、ＭＣ３８、およびＢ１６Ｆ１０と、４Ｔ１の皮下モデル。同系Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、０．８×１０^６個のＭＣＡ－２０５細胞、１．０×１０^６個のＭＣ３８／ＣＴ２６細胞、または３×１０^５個のＢ１６Ｆ１０細胞のそれぞれを皮下移植した。同系ＢＡＬＢ／ｃマウスに３×１０^５個の４Ｔ１細胞を皮下移植した。腫瘍増殖実験のため、腫瘍を移植したマウスは、腫瘍のサイズが２０～４０ｍｍ^２に到達したとき、抗ＰＤ－１ ｍＡｂ（２５０μｇ／マウス；クローンＲＭＰ１－１４、ロット６９５３１８Ａ１）またはアイソタイプ対照（クローン２Ａ３、ロット６８６３１８Ｆ１）を腹腔内（ｉ．ｐ．）注射して治療した。マウスには抗ＰＤ－１ ｍＡｂを３日の間隔で４回注射した。腫瘍の長さと幅をノギスによって週に３回定期的にモニタした。すべての抗体をＢｉｏＸｃｅｌｌ（ニューハンプシャー州、アメリカ合衆国）から購入した。

抗生剤治療。マウスを、マウスの飲料水に添加されたアンピリシン（１ｍｇ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（５ｍｇ／ｍｌ）、およびコリスチン（１ｍｇ／ｍｌ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有する抗生剤溶液（ＡＴＢ）で治療した。抗生剤の活性を、ＣＯＳ（５％ヒツジ血液を含むコロンビア寒天）プレート上でＢＨＩ＋１５％のグリセロールの中に０．１ｇ／ｍｌで再懸濁させた糞便ペレットを好気性条件と嫌気性条件で３７℃にて４８時間培養することによって確認した。簡単に述べると、糞便微生物移植実験の文脈において、マウスは、ＡＴＢを３日間投与された翌日、動物給餌針を用いた経口強制投与による糞便微生物移植を受けた。

ＦＭＴ実験。糞便材料を解凍することによって糞便微生物叢移植（ＦＭＴ）を実施した。その後、ＡＴＢであらかじめ治療したレシピエントに、（上に説明したようにして）２００μＬの懸濁液を経口強制投与によって移した。それに加え、別の１００μＬを各動物の皮膚に適用した。ＦＭＴの２週間後、腫瘍細胞を皮下注射し、マウスを前に説明したようにして抗ＰＤ－１ ｍＡｂまたはアイソタイプ対照で治療した。ＭＣＡ－２０５線維肉腫を使用した。なぜならそれは、通常は、ＳＰＦユーバイオティックマウスでは抗ＰＤ－１ Ａｂに対して感受性であり、（Ｒｏｕｔｙ， Ｌｅ Ｃｈａｔｅｌｉｅｒ， ｅｔ ａｌ． ２０１８）と（Ｌｉｓａ Ｄｅｒｏｓａ ｅｔ ａｌ． ２０２０）に報告されているわれわれの以前のアバター実験で参照マウスモデルとして使用したからである（両方の論文は、ＭＣＡ－２０５で得られた結果がそれぞれ同所性ＴＣ１肺がんモデルまたはＲＥＮＣＡモデルにおいて再現されたことを示している）。そのため、将来の実験においてＦＭＴまたは分類学的糞便組成を調べるのにこのＭＣＡ－２０５モデル系が生物学的に重要で適していると信頼することできる。

マウスメタ分析（図６Ｅ～Ｆ）。（６匹のマウス／群を含む）６～８つの群を含む２９回の個別の実験を２年間で実施し、そこでは同所性ＭＣＡ－２０５肉腫（と、ＭＣ３８大腸がん（Ｃ５７ＢＬ／６マウスからの同系）、または４Ｔ１乳がんまたはＣＴ２６大腸がん（ＢＡＬＢ／ｃマウスからの同系）またはＢ１６（黒色腫）などの他の腫瘍の増殖動態をアバターマウスモデルにおいてモニタした（Ｒｏｕｔｙ， Ｇｏｐａｌａｋｒｉｓｈｎａｎ， ｅｔ ａｌ． ２０１８）。これらレシピエントは、ＡＴＢで治療された後、２６人の異なるＮＳＣＬＣ患者（ＰＤ１阻害に対する表現型が「レスポンダー、Ｒ」であるか「非レスポンダー、ＮＲ」であるかと、糞便Ａｋｋの相対量（その両方とも表４に記載されている））からの糞便微生物移植（ＦＭＴ）がなされた。次いでマウスに同系腫瘍を移植した後、抗ＰＤ－１抗体を用いた免疫療法を実施した。ＦＭＴは、ＳＰＦ条件（ＦＭＴなし）で育てられたユーバイオシス状態の動物と比較すると、抗ＰＤ－１ Ａｂに対する感受性（糞便がＡｋｋ^＋であったとき）または耐性（糞便がＡｋｋ－であったとき）を与えることができた。次に、原初のＦＭＴの中の糞便Ａｋｋ^＋／^－に応じたアッカーマンシアｐ２２６１の経口補充の利益と補償効果を分析した。注目すべきことに、（アッカーマンシアｐ２２６１特異的プローブのセットを用いたｑＲＴ－ＰＣＲで示されるように）外来性アッカーマンシアｐ２２６１をレシピエントの腸で３０時間超にわたって検出することができなかった。外来性アッカーマンシアｐ２２６１がＲマウスとＮＲマウスにおいてレシピエント腫瘍担持者のマイクロバイオームを異なるようにシフトさせることができるかどうかをより精査するため、２９人の異なるＮＳＣＬＣ患者からのＦＭＴで治療し、次いで抗ＰＤ－１ ｍＡｂ±アッカーマンシアｐ２２６１で治療した後、１６Ｓ ｒＲＮＡに基づくシークエンシングを糞便アンプリコンについて実施するため糞便を回収したＢＡＬＢ／ｃマウス（ＣＴ２６、４Ｔ１）とＣ５７ＢＬ／６マウス（Ｂ１６Ｆ１０、ＭＣＡ－２０５、ＭＣ３８）のあらゆる同系腫瘍モデルを組み合わせた。全動態を知るため、各時点についてＳＰＦマウスにおけるＰＤ－１／Ｃｔｌ ｍＡｂの間の腫瘍サイズの比に規格化した抗ＰＤ－１＋アッカーマンシアｐ２２６１／抗ＰＤ－１＋水）の間の腫瘍サイズの比を割ることによって外来性Ａｋｋの相対的な利益を計算した。外来性アッカーマンシアｐ２２６１ありまたはなしで抗ＰＤ－１ ｍＡｂを用いた腫瘍増殖動態の間の比をユーバイオティック条件におけるＰＤ－１阻害の効果に規格化した値の教師なし階層化クラスタリングから、外来性アッカーマンシアｐ２２６１が約５０％のケースで有効であることが明らかになった（図６Ｅのヒートマップ）。どのアッカーマンシアｐ２２６１関連エコシステムが応答（比＞コホートの平均）と関係しているかを明確にするため、ＬＥｆＳｅを利用して、外来性アッカーマンシアｐ２２６１に対するＲとＮＲを分別する分類学的変化を同定した。これらの種を、図４と図３Ａに記載されているヒト糞便中の細菌と比較した。

アッカーマンシアＣＳＵＲ ｐ２２６１の腸定着。アッカーマンシアＣＳＵＲ ｐ２２６１はＩｎｓｔｉｔｕｔ ｈｏｓｐｉｔａｌｏ－ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｉｒｅ Ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｅ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ（マルセイユ、フランス国）によって提供された。アッカーマンシアｐ２２６１を、３台の嫌気性生成装置（ＢｉｏＭｅｒｉｅｕｘ）を用いて生成させた嫌気性雰囲気中の５％ヒツジ血液を添加したコロンビア寒天（ＣＯＳ）プレート上で３７℃にて少なくとも７２時間にわたって増殖させた。細菌の同定は、マトリックス支援レーザー脱着／イオン化飛行時間（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ）質量分析器（Ｍｉｃｒｏｆｌｅｘ ＬＴ分析器、Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ、ドイツ国）を用いて実施した。ＡＴＢで前処理したマウスのコロニー化を、蛍光分光光度計（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）を用いて６００ｎｍの光学密度で１０^９ＣＦＵ／ｍＬにした懸濁液から得られた１×１０^８個の細菌をＰＢＳの中に含有する１００μｌの懸濁液の経口強制投与によって実施した。５回の細菌強制投与（すなわち初回は、抗ＰＤ－１ ｍＡｂを最初に注射する２４時間前、その後はＩＣＩと同日に４回）を各マウスで実施した：。

マウス糞便ＤＮＡの抽出と微生物叢の特徴づけ。免疫療法の開始後７日と１４日の間にメタゲノミクスを実施するため、糞便をそれぞれのマウスと群で回収した。サンプルは、処理するまで－８０℃で保管した。マウス糞便サンプルの調製とシークエンシングはＩＨＵ Ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｅ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ（マルセイユ、フランス国）で実施した。簡単に述べると、２つのプロトコルを用いてＤＮＡを抽出した。第１のプロトコルは、ガラス粉末とプロテイナーゼＫをそれぞれ用いた物理的溶解と化学的溶解に続くＭａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ ＤＮＡ組織抽出キット（Ｄｕｒｅｎ、ドイツ国）を用いた処理で構成されていた。第２のプロトコルは第１のプロトコルと同じであったが、糖タンパク質溶解工程と脱グリコシル化工程を追加した。得られたＤＮＡをシークエンシングし、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のＶ３-Ｖ４領域に向かわせた。生のＦＡＳＴＱファイルを品質チェックとフィルタリング（シークエンシングのエラー、キメラ）のためワークステーションＤＥＬＬ Ｔ７９１０（ラウンド・ロック、テキサス州、アメリカ合衆国）上でＭｏｔｈｕｒパイプラインｖ．１．３９．５を用いて分析した。生リードをフィルタし、操作的分類学的単位（ＯＴＵ）へとクラスター化した後、数が少ないＯＴＵ（５リードまで）を除去し、アラインメントのため標準化されたパラメータとＳＩＬＶＡ ｒＤＮＡデータベースｖ．１．１９を用いて新規なＯＴＵを９７％ペアワイズ一致で取り上げた。認識されたＯＴＵに関する統計分析のため、２．５％以上の占有率閾値を、Ｐｙｔｈｏｎ ｖ３．８．２を用いて実施して実現した。（前工程でＭｏｔｈｕｒ ｖ．１．３９．５を用いて証明された）各ＯＴＵ内の最も代表的で豊富なリードに対してアメリカ国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）Ｂｌａｓｔソフトウエア（ｎｃｂｉ－ｂｌａｓｔ－２．９．０）と最新のＮＣＢＩ １６Ｓ微生物データベース（ｆｔｐ：／／ｆｔｐ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／ｄｂ／）を用いてヌクレオチドＢｌａｓｔを実施した。細菌相対量の行列を、その後の多変量統計解析ために各分類群レベル（門、綱、目、科、属、種）で構築した。

統計分析

ヒトでは、データ行列を最初に規格化した後、Ｓｃｉ－Ｋｉｔ学習パッケージｖ０．２０．３からのＱｕａｎｔｉｌｅＴｒａｎｓｆｏｒｍｅｒとＳｔａｎｄａｒｄＳｃａｌｅｒ法を用いて標準化した。ｏｕｔｐｕｔ＿ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ＝「ｎｏｒｍａｌ」のオプションを用いた規格化により各変数が厳密にガウス型分布に変換された一方で、標準化の結果として、平均値ゼロと分散１を持つ規格化された各変数が得られた。規格化のこれら２つの工程の後の標準化により、ダイナミックレンジが異なる変数（細菌相対量など）の適切な比較が保証される。微生物叢を分析するため、ＳｃｉＫｉｔ学習パッケージｖ．０．４．１を用いて（サンプル多様性内の）α多様性の指標（豊かさやシャノン指数など）を種レベルで計算した。（サンプル多様性間の）β－多様性の探索的分析を非類似度のＢｒａｙ－Ｃｕｒｔｉｓ指標を用いて計算し、主座標分析（ＰＣｏＡ）と多変量サンプル単位の群を比較するための方法（類似性の分析－ＡＮＯＳＩＭ、分散の並べ替え式多変量解析－ＰＥＲＭＡＮＯＶＡ）において表示し、データ点クラスター化における有意性を評価した。ＡＮＯＳＩＭとＰＥＲＭＡＮＯＶＡは、ＳｃｉＫｉｔ学習パッケージｖ０．４．１の中に実装されているように、９９９の並べ替えの後に自動的に計算された。部分的最小二乗判別分析（ＰＬＳ－ＤＡ）と、教師付き分析としてのその後の変数重要度プロット（ＶＩＰ）を実施し、ＶＩＰ値（大きさの程度）を用いて最大判別細菌種を同定した。すべての分析をＰｙｔｈｏｎ ｖ３．８．２環境内で実施した。一変量存在量差分析を有効サイズの線形判別分析（ＬＥｆＳｅ）によって実施した（Ｓｅｇａｔａ ｅｔ ａｌ． ２０１１）。さらに、共変量（年齢、性別、ＢＭＩ、コホート、およびシークエンシングバッチなど）を含む２つの異なる多変量存在量差法（すなわちＡＮＣＯＭ－ＢＣ（Ｌｉｎ ｅｔ Ｐｅｄｄａｄａ ２０２０）とＭａＡｓＬｉｎ２（Ｍａｌｌｉｃｋ ｅｔ ａｌ． ２０２０））を用いて存在量が異なる種の裏づけを追加した。フランス国のデータ保護法第８条（Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｑｕｅ ｅｔ Ｌｉｂｅｒｔｅｓ［ＣＮＩＬ］）は、人種的起源と民族的起源の分析を禁じている。生のシークエンシングカウントを、種レベルのＭｅｔａＰｈｌＡｎ ３相対量から、これらの値に各サンプルに関するリードの総数を掛けることによって推定し、これらをＡＮＣＯＭ－ＢＣ（ｖ．１．０．１）において、デフォルトパラメータ、ライブラリのサイズのカットオフが５００リード、および構造的ゼロ検出なしとともに使用した。Ｍａｓｓｌｉｎ２（ｖ．１．４．０）を、総和スケーリング（ＴＳＳ）を用いて規格化したＬｏｇｉｔ変換された相対量を用いるとともに、興味ある変数を固定効果として用いて走らせた。

カプラン・マイヤー法を用いて生存曲線を推定し、一変量解析においてログ－ランク検定（マンテル－コックス法）と比較した。コックス回帰モデルを用いて多変量解析を実施し、他の臨床病理学的特徴に関して調整したＯＳのＨＲと９５％信頼区間（ＣＩ）を求めた。コックスｚｐｈ Ｒ関数を用いてシェーンフィールド残差の趨勢を検定し、比例ハザード仮定をチェックした。検定がある変量に関して統計的に有意であったときには、その時間との相互作用をモデルに導入し、異なる関数形（線形、指数、対数、および罰則付きスプライン）を持つｔｔ（時間変換）関数を用いて検定する。異なる予後群を明確にするための各細菌種に関する最適なカットオフは、潜在的交絡因子（年齢、性別、…）を考慮した多変量コックスモデルに基づくグリッド検索アルゴリズムを用いて得られた。グリッドは、それぞれの種について、非ゼロ存在値の分布のパーセンタイルによって定義した。よりよい赤池情報基準（ＡＩＣ、小さいほど優れている）を持つモデルに対応するカットオフを最適なカットオフとして選択した。

すべての検定は両側であり、統計的有意性はｐ値＜０．０５に設定した。統計分析はＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７とＲソフトウエアを用いて実施した（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．Ｒ－ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ／）。

マウスでは、あらゆる腫瘍増殖曲線をＫｒｏｅｍｅｒの実験室で開発されたソフトウエアを用いて分析した：ｈｔｔｐｓ：／／ｋｒｏｅｍｅｒｌａｂ．ｓｈｉｎｙａｐｐｓ．ｉｏ／ＴｕｍＧｒｏｗｔｈ／。マウスの群間比較、全体比較を、クラスカル－ウォリス検定、ダンの検定を用いる事後多重比較を利用して実施した。最後に、マウス実験からの自然な腫瘍増殖データ（実験ごとに６匹のマウス）を各時点（Ｔ０～Ｔ８）で平均した後、共通開始値を１にするため最初の時点を基準にして縦方向に規格化した。次いで平均され規格化されたすべての腫瘍値を倍数比で表示し（ＦＲ、図９Ｅ）、底２の対数にして腫瘍増殖の増加（灰色コード上の星印（濃いほど大きい）または減少（灰色コード（濃いほど大きい）を強化した。ブレイ－カーティス距離に基づく階層型クラスター分析（ＨＣＡ）を縦方向ＦＲデータで実施し、アッカーマンシアｐ２２６１に対するレスポンダー（Ｒ）の枝（薄い灰色のクラスター）、またはアッカーマンシアｐ２２６１に対する非レスポンダー（ＮＲ）の群（濃い灰色のクラスター）を明確にした。報告されたすべてのｐ値でベンジャミニ－ホフバーグ二段階偽発見率（ＦＤＲ）が１０％であった。

結果

アッカーマンシア・ムシニフィラと臨床転帰の間の関連性

２０１５年１２月から２０１９年１１月まで、合計４９３人の患者がこの研究に参加するためスクリーニングされ、３３８人の患者が組み入れ基準に合致し、プロファイリングのため少なくとも１つのベースライン（Ｖ１および／またはＶ２）糞便サンプルを提供した（図４）。ショットガンメタゲノムシークエンシングを利用することで、主要Ａｋｋ種レベルゲノムビンを同定するために拡張されたＭｅｔａＰｈｌＡｎプロファイリングを利用してＡｋｋが１３１人の患者（３９％）で検出可能であり、２０７人の患者（６１％）で不在であることが明らかになった（ＳＧＢ９２２６ ｓｐｐ（Ｋａｒｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ． ２０２１）、表５）。ベースラインの特徴は、性別、ＥＣＯＧパフォーマンスステータス、喫煙歴、腫瘍組織学、ボディ・マス指数（ＢＭＩ）、ＰＤ－Ｌ１発現、および治療ラインに関して検出可能なＡｋｋ（Ａｋｋ^＋）を持つ患者と検出不能なＡｋｋ（Ａｋｋ^－）群の間でよくバランスが取れていた（表５Ａ）。しかしＡｋｋ^＋群のより高齢者で統計的に有意でない傾向が存在していた（６６歳対６４歳、ｐ＝０．０８）。合計６９人の患者（２０％）がＩＣＩを開始する６０日前に抗生剤（ＡＴＢ）を投与されており、Ａｋｋ^＋群とＡｋｋ^－群で似た頻度（ｐ＝０．６８）と計画であった（表５Ａ）。ＡＴＢクラスの中では、ベータ－ラクタムが両方の群において最も一般的に処方された（表５Ｂ、Ａｋｋ^＋における８０％に対してＡｋｋ^－における６４％、ｐ＝０．３３）。

われわれのコホートのＡｋｋ^＋群とＡｋｋ^－群を考えると、客観的奏功率（ＯＲＲ）は、それぞれ２８％と１８％であった（図１Ａ、ｐ＝０．０４）。部分奏功（ＰＲ）、安定（ＳＤ）、および進行（ＰＤ）の割合は、Ａｋｋ^＋群ではそれぞれ２８％、２８％、および４４％であったのに対し、Ａｋｋ^－群では１８％、３１％、および５０％であった。フロント－ライン治療として免疫療法だけを受けた患者のサブグループ（１Ｌ ＩＯ、ｎ＝８６）を考えると、ＯＲＲは、それぞれＡｋｋ^＋とＡｋｋ^－で４１％と１９％であった（図１Ｂ、ｐ＝０．０１６）。注目すべきことに、（治療ラインとは無関係に）患者のコホート全体では、全生存期間中央値（ｍＯＳ）はＡｋｋ^＋群で１８．８ヶ月であったのに対しＡｋｋ^－群では１５．４ヶ月であった（ＨＲ＝０．７２；（９５％ＣＩ：０．７３～１．６２）；ｐ＝０．０３、図１Ｃ、表５Ａ）。２Ｌ以上のＮＳＣＬＣ患者のＯＳ中央値は、Ａｋｋ^＋群では１８．８ヶ月であったのに対し、Ａｋｋ^－群では１３．４ヶ月であった（ＨＲ＝０．７０；（９５％ＣＩ：０．５０～０．９８）；ｐ＝０．０４、図１Ｄ、表５Ａ）。１ＬのＩＯ患者については、５９％のＡｋｋ^＋患者が１２ヶ月後（ＯＳが１２以上）にまだ生きていた一方で、わずか３５％のＡｋｋ^－個人が長期生存者であった（図１Ｅ、ｐ＝０．０４）。ＭｅｔａＯＭｉｎｅＲパイプラインを用いて同じ結論が導かれる（Ｌｅ Ｃｈａｔｅｌｉｅｒ ｅｔ ａｌ． ２０１３）（図５Ａ～Ｂの左のグラフ）。

Ａｋｋの存在（とそのエコシステム）とＩＣＩに対する応答の因果関係を確立するため、アバターマウスモデルにおいて腫瘍増殖動態を追跡した２９回の実験を集めて後ろ向きの前臨床メタ分析を実施した（Ｒｏｕｔｙ， Ｇｏｐａｌａｋｒｉｓｈｎａｎ， ｅｔ ａｌ． ２０１８）。これらレシピエントは、ＡＴＢで治療された後、２６人の異なるＮＳＣＬＣ患者からの糞便微生物移植（ＦＭＴ）を受けた（表６）。次いでマウスに同系同所性ＭＣＡ－２０５肉腫（以前に記載されているように、抗ＰＤ－１抗体に対する感受性のための代表的な腫瘍モデル（Ｒｏｕｔｙ， Ｌｅ Ｃｈａｔｅｌｉｅｒ， ｅｔ ａｌ． ２０１８；Ｌｉｓａ Ｄｅｒｏｓａ ｅｔ ａｌ． ２０２０））を移植した後、ＰＤ－１阻害を実施した（図５Ｃ～Ｅ）。われわれの臨床コホートで観察されたように、ＦＭＴ実験において、マウスにおける治療に対する耐性は、検出可能なＡｋｋの不在と関係していた（図５Ｃ～Ｄ）。

したがって３３８人の進行したＮＳＣＬＣ患者でのこの第２の独立な前向き研究において、ＩＣＩを受けたＮＳＣＬＣを持つ患者では、Ａｋｋの存在が、より高いＯＲＲおよびより長いＯＳと関係していることが、ヒトで２つの異なるメタゲノミクスパイプラインを用いて検証されたほか、マウスで検証された。

Ａｋｋ、腸エコシステム、および腫瘍微小環境

腸内微生物叢の組成の違いと腫瘍免疫ランドスケープの間に相関があり（Ｒｏｕｔｙ， Ｌｅ Ｃｈａｔｅｌｉｅｒ， ｅｔ ａｌ． ２０１８；Ｇｏｐａｌａｋｒｉｓｈｎａｎ ｅｔ ａｌ． ２０１８）、それは組織学的タイプで変化する可能性がある（Ｍｅｎｇ ｅｔ ａｌ． ２０１９）ことが知られているため、糞便Ａｋｋ検出と腫瘍組織学（扁平上皮と非扁平上皮ＮＳＣＬＣ）の間の相互作用に取り組んだ。診断時の糞便中のＡｋｋの存在は組織学に影響を与えなかった（非扁平上皮対扁平上皮ＮＳＣＬＣ（表５Ａの中で多変量解析に関してｐ＝０．５５６）。

Ａｋｋによって駆動される腫瘍内トランスクリプトームの差を解明するため、診断時に局所的に進行しているか転移したＮＳＣＬＣがあるＡｋｋ^＋患者（ｎ＝２２）とＡｋｋ^－患者（ｎ＝２２）から回収した入手可能な腫瘍生検がある患者のサブセットで腫瘍ＲＮＡシークエンシングを実施した（表３）。Ｏｎｃｏｍｉｎｅ Ｉｍｍｕｎｅ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ａｓｓａｙの３９５個の免疫関連遺伝子（Ｈｗａｎｇ ｅｔ ａｌ． ２０２０）の中でのＡｋｋ^＋群とＡｋｋ^－群の間の有意な遺伝子発現差の教師付き分析から、肺がんにおいてＰＤ－１阻害に対する応答と関係する、発現が異なる一群の遺伝子が明らかになった（図１Ｆ）。それは例えば、活性化を伴うＣＤ４^＋ Ｔヘルパー細胞（腫瘍巣内のＴリンパ球の接着と転移に関係するＣＤ４、ＣＤ７４、Ｖｃａｍ－１（Ｎａｋａｊｉｍａ ｅｔ ａｌ． ｓ． ｄ．）、細胞溶解活性に関係するグランザイムＨセリンプロテアーゼＧｚｍｈ）、および疲弊（Ｃｔｌａ４， Ｆａｓ， Ｔｉｇｉｔ， Ｈａｖｃｒ２）のマーカー、およびＩＦＮフィンガープリント（Ｃｃｒ５、Ｃｘｃｌ９、Ｃｘｃｌ１０、Ｔｄｏ２、およびＩＦＮ誘導性グアニル酸結合タンパク質１）である（図１Ｇ～Ｈ）。これらの結果は、マウスモデルで以前に示されているように（Ｒｏｕｔｙ， Ｌｅ Ｃｈａｔｅｌｉｅｒ， ｅｔ ａｌ． ２０１８；Ｖｅｔｉｚｏｕ ｅｔ ａｌ． ２０１５）、ＡｋｋがＴｈ１細胞の誘起または再循環を促進して腫瘍微小環境の中に入らせることができる可能性があることを裏づけている。

次に、Ａｋｋ^＋患者とＡｋｋ^－患者における腸内微生物叢の組成の分類学的違いを調べた。Ａｋｋ^＋患者では、Ａｋｋ^－患者と比べてシャノン多様性指数の有意な上昇（図６Ａの上図、ｐ＜０．０００１）のほか、両方の群の間の全体的微生物コミュニティ組成の違い（図６Ａの下図、ｐ＝０．０００１）が見いだされた。２つの群の間の種相対量の差を調べるためのＬＥｆＳｅ（線形判別分析効果サイズ）分析を利用すると、以前に報告されているようにルミノコッカス科（ルミノコッカス・ブリミイ、Ｒ．ビシルクランス、Ｒ．ラクタリス）、ラクノスピラ科（ユーバクテリウム・シラエウム、Ｅ．エリゲンス）のメンバーとアリスティペス属の種（Ａ．イノプス、Ａ．フィネゴルディイ、Ａ．インディスティンクタス、Ａ．シャヒイ）がＡｋｋ^＋糞便の中に豊富であることが見いだされた（Ｈａｋｏｚａｋｉ ｅｔ ａｌ． ２０２０）一方で、Ａｋｋ^－患者からの糞便には、ベイロネラ・パルブラ、アクチノマイセス属、およびクロストリジウム属（Ｃ．イノキューム、フンガテラ・ハテワイ）が過剰に存在していた（図６Ｂ）。このことは、予後が悪いＮＳＣＬＣを持つ患者の下気道マイクロバイオーム（Ｔｓａｙ ｅｔ ａｌ． ２０２０）のほか、ＩＣＩに対する耐性がある腎臓がんを持つ患者（Ｌｉｓａ Ｄｅｒｏｓａ ｅｔ ａｌ． ２０２０）ですでに記載されている。

さらに、Ａｋｋ^＋群において、ＯＳが１２ヶ月以上の患者とＯＳが１２ヶ月未満の患者の間で全体的微生物組成に有意な差が見いだされたが、この差はＡｋｋ^－患者では観察されなかった（図２Ａ、ｐ＝０．００９対ｐ＝０．０７）。１２ヶ月以上のＯＳを示すＡｋｋ^＋群とＯＳが１２ヶ月未満のＡｋｋ^＋群におけるＬＥｆＳｅ分析から、ＯＳが１２以上の患者でラクノスピラ科のメンバー（ドレア・フォルミシゲネランス、Ｄ．ロンジカテナ、ユーバクテリウム・レクターレ、Ｅ．ハリイ、Ｒ．インテスティナリス、コプロコッカス・コメス）の相対量の増加が明らかになった。逆に、ガンマプロテオバクテリア綱（大腸菌）、クロストリジア綱（Ｒ．ラクタチフォルマンス）、またはバシラス綱（ラクトバチルス・ガセリ、Ｌ．パラガセリ、Ｌ．オリス、Ｌ．バギナリス、ストレプトコッカス・パラサングイニスなど）に属する種、およびベイロネラ・パルブラが、ＯＳが１２未満の患者で優勢であった（図６Ｃ）。

これらの結果は、合わせて考えると、Ａｋｋの存在が、ＮＳＣＬＣ患者の腸内微生物叢と腫瘍微小環境における重要で潜在的な予後関連シフトと関係していることを示している。

Ａｋｋの相対量に基づく臨床転帰の層化

予想に反し、Ａｋｋ^＋群の中のＯＳが１２ヶ月未満の患者にはＡｋｋが過剰に存在していることが見いだされた。これは、Ａｋｋの相対量が、その絶対的な存在または不在よりも予後に影響する可能性があることを示唆している。次に、Ａｋｋの臨床上の重要性を分析するため、カテゴリー変数よりは順序変数を調べた（Ａｋｋ^＋対Ａｋｋ^－）。実際、Ａｋｋ^＋集団の中のＡｋｋの相対量は０．０３５％から６６．２１０％までの範囲であった。ＯＳが１２以上の患者またはＯＳが１２未満の患者のＡｋｋの相対量のカーネル密度推定を利用すると、相対量が７５パーセンタイル超であるＡｋｋ^高の患者（４．６５６％）は、ＯＳが１２ヶ月未満の中でクラスターになることが見いだされた（図２Ｂ～Ｃの左のグラフ、ｐ＝０．００５）。この観察結果を他のリスク因子を調整した上で確認するため、教師付きアプローチを利用してＡｋｋについて最適なカットオフを統計的に定義し、予後が異なるＡｋｋ^＋患者の２つの仮想群を識別した。赤池情報基準をパフォーマンス指数とし、多変量コックスモデル（年齢、性別、ＥＣＯＧパフォーマンスステータス、ＡＴＢ、組織学、ＰＤ－Ｌ１、および治療ラインに関して調整）に基づくグリッド検索アルゴリズムを利用してこの最も細かいカットオフを決定すると、４．７９９（このコホートの７７パーセンタイル）に対応した（図２Ｃの左のグラフ）。３３８人の患者のコホート全体のうちで、わずか９％の患者（Ａｋｋ^＋サブグループの２３％）が４．７９９超であるＡｋｋの「相対的過剰」のカテゴリー（今後は「Ａｋｋ^高」）に入ることが観察された（図２Ｃの右のグラフ）。

さらに、Ａｋｋ^低ではＡｋｋ^－またはＡｋｋ^高の試料と比べてシャノン多様性の有意な増加が見いだされ（図７Ａ、ｐ＝０．００００３）、微生物コミュニティ全体は、Ａｋｋ^－とＡｋｋ^低の間のほか、Ａｋｋ^低患者とＡｋｋ^高患者の間の明確な分離を示した（図７Ｂ－Ｃ、それぞれｐ＝０．０００１とｐ＝０．０００３）。分類学的糞便組成の変数重要度プロット（ＶＩＰ）判別分析から、Ａｋｋが異常に多い（Ａｋｋ^高）エコシステムにはクロストリジウム属の種（クロストリジウム・シンボジウム、Ｃ．イノキューム、Ｃ．シンデンス、Ｃ．ボルタエ、Ｃ．クロストリジオフォルメ）が過剰に存在し、健康な片利共生細菌（Ｆ．プラウスニッツィ、Ｃ．コメス、Ｅ．レクターレ、Ｄ．フォルミシゲネランス、Ｄ．ロンジカテナ、Ｒ．トルケス、図７Ｄ～Ｅ）が犠牲にされていることが明らかになった。

Ａｋｋ相対量による三分法層化を利用したカプラン・マイヤー生存曲線は互いに一致せず（ログランク検定ｐ＝０．０００７、図２Ｄ）、Ａｋｋ^低患者では、有意により長いＯＳ中央値が、Ａｋｋ^高と比べて（２７．２ヶ月に対して７．８ヶ月、コックス調整済みＨＲ：０．３８；９５％ＣＩ：０．２２～０．６５、ｐ＝０．０００５）、そしてＡｋｋ^－患者と比べて（２７．２ヶ月に対して１５．５ヶ月、調整済みＨＲ：０．６３；９５％ＣＩ：０．４４～０．９１、ｐ＝０．０１５０）見られた。多変量コックス回帰解析において他のリスク因子を考慮したＨＲが、図２Ｅと表４に示されている。驚くことではないが、ＥＣＯＧパフォーマンスステータスが１以上であることが、このコホートに関する別の独立な予後因子であった（Ｄｅｓａｉ ｅｔ ａｌ， ２０１６）。比例ハザード仮定はＡＴＢに関してだけ疑問だったが（シェーンフィールド残差傾向検定ｐ＝０．０１６）、時間との統計的に有意な相互作用は同定できなかった。それに加え、ＡＴＢ曝露は、（一変量解析、ｐ＝０．００９（表４Ｂ、表７）と、多変量解析、ｐ＝０．０８８（表７）において、より短いＯＳと関係していた。

腫瘍ＰＤ－Ｌ１の腫瘍発現が利用できる２３５人の進行したＮＳＣＬＣ患者でＡｋｋとＰＤ－Ｌ１の間の相互作用も分析した（表５Ａ、図４）。コホートをＰＤ－Ｌ１発現とＡｋｋ糞便検出に従って６つの群に分別した。多変量コックス回帰解析は、ＡｋｋがＰＤ－Ｌ１よりもＮＳＣＬＣの予後をよく規定することを示した（２３５人の患者でｐ＝０．０１２、図２Ｆ）。

結局、患者を三分法で層化してＡｋｋ^－、Ａｋｋ^低、またはＡｋｋ^高の個人にすると、二分法（Ａｋｋ^－対Ａｋｋ^＋）の分別よりも全生存のより正確な独立な予後因子になる可能性があると結論される（多変量コックスモデルの尤度比検定：ｐ＝０．０００９）。腸内に「正常レベル」のＡｋｋが存在していること（Ａｋｋ^低）は、宿主腸の健康度の代替指標と見なせる可能性がある。Ａｋｋが、ＮＳＣＬＣ患者におけるＩＣＩに対する応答の予測バイオマーカーとしてのＰＤ－Ｌ１を無効にした。

ＡＴＢの使用がＡｋｋ相対量と生存転帰に及ぼす影響

Ａｋｋ^高のレベルのほかＡＴＢ曝露が、ＩＣＩで治療したＮＳＣＬＣ患者におけるより短いＯＳと関係する独立な変数と見なされた。これらの観察結果があるため、最初にＡｋｋに関する患者の二分法分類（Ａｋｋ^－対Ａｋｋ^＋）を、それら患者の以前の抗生剤曝露の履歴と組み合わせ、患者を４つの群に分離した。ＡＴＢ曝露なしのＡｋｋ^＋群は、他の３つの群と比べて最強の臨床的利点を示した（ＯＳ中央値が２３．０ヶ月）（図８Ａ）。次に好ましい予後群は、ＡＴＢ曝露なしのＡｋｋ^－であり、ＯＳ中央値は１６．０ヶ月であった。逆に、ＡＴＢへの曝露は最短のＯＳを示した（ｍＯＳが約９ヶ月、図８Ａ、ｐ＝０．０１７）。したがってＡＴＢはＡｋｋ^＋群のアルファ多様性を低下させる傾向があった（図８Ｂ～Ｃ）。さらに、ＡＴＢ曝露は、すでに記載されている（Ｌｉｓａ Ｄｅｒｏｓａ ｅｔ ａｌ． ２０２０）ように、Ａｋｋ^＋群でガンマプロテオバクテリア（大腸菌）、クロストリジア綱（クロストリジウム・ボルテアエ、ルテニバクテリウム・ラクタチフォルメンス）、およびＨ２Ｓ産生細菌（ビロフィラ・ワーズワーシア）を豊富にし（示さない）、ＡＴＢを投与されなかったＡｋｋ^＋群にも過剰に存在していた健康に関係する細菌（Ｃ．アエロファシエンス、Ｄ．ロンジカテナ、Ｄ．フォルミシゲネランス、ユーバクテリウム属の種ＣＡＧ ３８）（Ｒｏｕｔｙ， Ｇｏｐａｌａｋｒｉｓｈｎａｎ， ｅｔ ａｌ． ２０１８；Ｂｅｎｅｖｉｄｅｓ ｅｔ ａｌ． ２０１７）を犠牲にしていた（示さない）。

ＡＴＢの使用と相対的に過剰なＡｋｋの間の関連性を確立する試みとして、ＡＴＢを使用したＮＳＣＬＣ患者におけるＡｋｋ^高糞便の割合をＡＴＢなしのＮＳＣＬＣ患者と比較し（図２Ｇ）、ＩＣＩを初めて投与する前にＡＴＢ曝露による２つのサブグループにおける三分法分類（Ａｋｋ^－、Ａｋｋ^低、およびＡｋｋ^高）を用いてカプラン・マイヤーＯＳ曲線を作成した（図２Ｈ）。ＡＴＢの使用者と非使用者の間でＡｋｋ^高患者の割合の劇的な増加が見いだされた（４０％対１９％、ｐ＝０．０２３、図２Ｇ）。ＡＴＢに曝露された患者における診断時の糞便Ａｋｋの過剰な存在は、ＩＣＩ療法にもかかわらずより低い全生存と関係していると結論された（図８、図２Ｈの下のグラフ）。ＡＴＢなしの対象では、Ａｋｋ^高の患者は、Ａｋｋ^低の個人と比べてＩＣＩの利益が少なかったが、Ａｋｋ^－サブグループより悪くはなかった（図２Ｈの上のグラフ）。

合わせると、これらの結果は、ＡＴＢ曝露がＩＣＩに対する生存の負の予測因子であり、Ａｋｋの過剰な存在（Ａｋｋ^高）およびクロストリジウム属の種（Ｃ．ボルテアエ、ラクノクロストリジウム）の相対的優勢と関係していることを実証している。

Ａｋｋ関連エコシステムの他の構成要素に関する転帰の層化

さまざまな統計的方法（線形判別分析効果サイズ（図６）、ＡＮＯＶＡモデルからのボルケーノプロット（図３Ａ）、およびＭａＡｓＬｉｎ多変量統計の枠組み（表８）など）を利用してＡｋｋ^＋糞便とＡｋｋ^－糞便の間の分類学的組成の変動を比較し、１６種の細菌種を同定した。そのうちの１４種は、他の交絡因子（年齢、性別、ＢＭＩ、治療ラインなど）とは独立にＡｋｋ糞便占有と正の関係があり、２種は負の関係があった（図３Ａ、表８）。次に、コックスロジスティック回帰多変量解析を実施し、患者の臨床転帰に対する各細菌の影響を、そのそれぞれの相対量の三分法分布（上に定義したカットオフに従う）を利用して明らかにした。Ａｋｋは別にして、ごく少数の細菌（免疫調節機能を媒介することがすでに記載されているユーバクテリウム・ハリイ、ビフィドバクテリウム・アドレセンティス、パラステレラ・エクスクレメンティホミニス、インテスティニモナス・ブチリシプロドゥセンス、またはＣ．イノキューム（Ｅｌｋｒｉｅｆ ｅｔ ａｌ， ２０１９；Ｓｅｏ ｅｔ ａｌ， ２０１５；Ａｔａｒａｓｈｉ ｅｔ ａｌ， ２０１１）は除くも、Ａｋｋで観察されたこととは異なり、ＩＣＩ療法の後の生存の延長（図３Ｂ、図３Ｄ）または短縮（図３Ｆ、表８）と関係しており、「線形用量」応答であった。３３８人のＮＳＣＬＣ患者のこのコホートにおいてＯＲＲおよび／またはｍＯＳを正確に予測するためには、両者、すなわちＡｋｋのほかＥ．ハリイまたはＢ．アドレセンティスのバランスのとれた存在を考慮することに追加の価値が存在していた（図３Ｃ、Ｅ）。したがってこれらの知見は、Ａｋｋとその付随片利共生細菌が、ＩＣＩを媒介とした患者の臨床的利点に関与している可能性があることを示唆する。

ＡｋｋはマイクロバイオームをシフトさせることによりＰＤ－１阻害に対する応答を救った

Ａｋｋおよび／またはその付随エコシステムと患者の臨床転帰の間の結びつきを確立するため、上述のわれわれの微生物叢ヒト化アバター腫瘍担持マウスモデルに移った。上に示してコメントしたように（図５Ｃ～Ｅ）、ＰＤ－１抗体に対するマウスの耐性は、ＡｋｋなしのＦＭＴと関係していた。次に、Ａｋｋ^＋ ＦＭＴとＡｋｋ^－ ＦＭＴを投与された両方の群の動物において、アッカーマンシアｐ２２６１と呼ぶアッカーマンシアの免疫原性株を経口で補充することによって育てた補償効果を分析した（Ｒｏｕｔｙ， Ｌｅ Ｃｈａｔｅｌｉｅｒ， ｅｔ ａｌ． ２０１８）。図９Ａ～ＢにＦＭＴとして示されているように）特定の病原体がない条件（ＳＰＦ）で育てられて同じ腫瘍細胞系を接種されたマウスを「マウスユーバイオシス」の対照として使用した。実際、Ａｋｋ^－ ＦＭＴの設定においてだけ、ＰＤ－１阻害に対する応答性を回復させることができた（図９Ｂ～Ｃ）。次に、目的は、アッカーマンシアｐ２２６１の経口補充がレシピエントマウスの宿主マイクロバイオームを変化させるかどうかと、宿主エコシステムのリモデリングが、外来性アッカーマンシアｐ２２６１に対する前臨床上の利点と相関しているかどうかを分析することであった。この目的のため、２９人の個別のＮＳＣＬＣ患者からの糞便を最初に移植し（Ｔａｂｌｅｘ Ｓ３）、次いで抗ＰＤ－１抗体で治療し（図９Ａ）、アッカーマンシアｐ２２６１を経口で摂取させる前と後にレシピエントの糞便を回収したＢＡＬＢ／ｃマウス（ＣＴ２６、４Ｔ１）とＣ５７ＢＬ／６マウス（Ｂ１６Ｆ１０、ＭＣＡ－２０５、ＭＣ３８）のあらゆる同系腫瘍モデルを連結した。外来性アッカーマンシアｐ２２６１あり、またはなしで抗ＰＤ－１抗体を用いた腫瘍増殖動態の間の比（ユーバイオティック条件でのＰＤ－１阻害の効果に関して規格化（ＳＰＦ対ＦＭＴ））の教師なし階層的クラスタリングから、外来性アッカーマンシアｐ２２６１が約５０％のケースで有効であることが明らかになった（図９Ｄ、図９Ｅ左図）。外来性アッカーマンシアｐ２２６１に対するレスポンダー（Ｒ）と非レスポンダー（ＮＲ）において、レシピエントの微生物叢の分類学的違いが検出された（図９Ｅ右図）。Ｒマウスには、Ａｋｋ^＋糞便を持つヒトの中にあって図３Ａに注釈されているメタゲノミクス種、すなわちインテスティニモナス・ブチリシプロドゥセンス、パラステレラ・エクスクレメンティホミニスが相対的に過剰な量で棲息していたのと比べ、ＮＲマウスでは逆に、バクテロイデス属の種が豊富である傾向があった（図９Ｅ右図）。

合わせると、Ａｋｋ^－ヒト糞便材料を移植したアバターマウスはＰＤ－１阻害に対する腫瘍耐性の表現型を示したが、アッカーマンシアｐ２２６１がマイクロバイオームを好ましいＡｋｋに関連した付随エコシステムへとシフトさせることができたときにはアッカーマンシアｐ２２６１によって救われた。

考察

ここに、ＰＤ－１阻害を用いて治療した進行したＮＳＣＬＣを持つ患者の腸内微生物叢のプロファイリングに基づく前向き多施設研究の結果を報告する。Ａｋｋの相対量は、主要な微生物叢関連交絡因子（年齢、性別、ＢＭＩ、治療ライン）を考慮すると、ＯＲＲと生存の増加によって定義される臨床的利点と関連していた。この腸内細菌の予後予測が有意であることを多変量解析と相互作用研究によって検証し、Ａｋｋが、年齢、性別、ＥＣＯＧ ＰＳ、ＡＴＢ使用、およびＰＤ－Ｌ１とは独立に、ＩＣＩで治療した進行したＮＳＣＬＣの予後と顕著に関連していることを示した。Ａｋｋが腸内に棲息することは、７７パーセンタイル以内の相対量のＡｋｋ（Ａｋｋ^低＜４．７９９％）と糞便アルファ多様性（シャノン多様性指数）の関連性によって示されるように、腸エコシステムの豊かさの代替指標であった。これらの結果は、ＮＳＣＬＣを持つ患者のより小さなコホート（Ｒｏｕｔｙ， Ｌｅ Ｃｈａｔｅｌｉｅｒ， ｅｔ ａｌ． ２０１８；Ｈａｋｏｚａｋｉ ｅｔ ａｌ． ２０２０）でなされた以前の観察を拡張しており、腸内マイクロバイオームの多様性と組成（特にＡｋｋ，の相対量）が、ＩＣＩに適したＮＳＣＬＣを持つ患者の生存を予測するための関連情報を提供することの証拠を提示する。

われわれの研究は、ＩＣＩに関する新たな予後因子としてのＡｋｋを検証するために試みた最大のメタゲノミクス前向き分析である。われわれの研究は、統計的有意性に関し、あらかじめ決めた基準（全（大半は２Ｌ）３３８人のＮＳＣＬＣ患者を考慮したときにＡｋｋ^－患者とＡｋｋ^＋患者の間でＯＲＲの１０％増加に設定）に合致する（ＯＲＲが１８．２％から２８．２％になった、図１Ａ）。さらに、１ＬのＮＳＣＬＣ患者ではＡｋｋ^－とＡｋｋ^＋の間で１０％超のＯＲＲ増加も観察され（ＯＲＲが１９％から４１％になった、図１Ｂ）、ｍＯＳの利益があった（図１Ｅ）。さらに、われわれの研究は、腸内微生物叢組成を腫瘍微小環境ランドスケープと結びつけ、適応免疫とＩＦＮフィンガープリントの遺伝子産物の転写産物が増加することに光を当てた。最後に、マウスにおいて、Ａｋｋ^－糞便がＰＤ－１阻害に対する耐性を与えることを検証した。

われわれは、より大きくて均一なコホートで仮説を前向きに検証することに加え、Ａｋｋが、アルファ多様性の増大に関係しているだけでなく、ルミノコッカス科（フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィ、Ｒ．ラクタリス）とラクノスピラ科（ドレア・フォルミシゲネランスとＤ．ロンジカテナ、ユーバクテリウム・レクターレとＥ．ハリイ、ロゼブリア・フェシスとＲ．インテスティナリス）のメンバーのほか、ビフィドバクテリウム・アドレセンティス、インテスティニモナス・ブチリシプロドゥセンスなどによって代表される健康状態または免疫原性状態と関係する明確な細菌コミュニティに関係していることを報告する。これらの知見は、いくつかの研究、地理的分布、およびシークエンシング技術の間の結果を調和させる。なぜならフィーカリバクテリウム、ルミノコッカス、およびビフィドバクテリウムは、黒色腫とＮＳＣＬＣがんを持つ北アメリカ、日本、および韓国の患者で豊富であることが以前に報告されており、好ましい転帰を持つからである（Ｒｏｕｔｙ， Ｇｏｐａｌａｋｒｉｓｈｎａｎ， ｅｔ ａｌ． ２０１８；Ｇｏｐａｌａｋｒｉｓｈｎａｎ ｅｔ ａｌ． ２０１８；Ｈａｋｏｚａｋｉ ｅｔ ａｌ． ２０２０）（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ． ２０２１）。さらに、アバター腸ヒト化マウスモデルにおいてさえ、外来性アッカーマンシアｐ２２６１に対するレスポンダーは、自らのマイクロバイオームを、Ａｋｋ^＋エコシステムに属する上記の種のいくつかが過剰に存在する方向にシフトさせた。

応答に関係する細菌の多様性と片利共生の臨床での重要性の確認として、われわれの結果は、ＡＴＢ使用と悪い臨床転帰を結びつける増加しつつある証拠の検証となっている （Ｅｌｋｒｉｅｆ ｅｔ ａｌ． ２０１９）。生存に関係する好ましい属（ルミノコッカスなど）の枯渇（Ｈａｋｏｚａｋｉ ｅｔ ａｌ． ２０２０）に加え、ＡＴＢの使用は、腸内マイクロバイオームの組成を、以前に炎症促進経路または免疫調節経路と関係づけられた有害な細菌（大腸菌やクロストリジウム・ボルテアエなど）へとずらす傾向があり（Ｓｅｏ ｅｔ ａｌ． ２０１５）、これは、ＩＣＩに適した腎細胞癌における以前の知見を裏づけている（Ｌｉｓａ Ｄｅｒｏｓａ ｅｔ ａｌ． ２０２０）。驚くべきことに、ＡＴＢは、独立な負の予後因子として機能することに加え、悪い予後に関係する７７パーセンタイル超のレベルのＡｋｋの過剰な存在（Ａｋｋ^高）を促進した。実際、ＡＴＢの使用により、糞便がＡｋｋ^高表現型を示す個人の割合が２倍になった。４．７９９超というＡｋｋの過剰な存在のこの表現型形質は、結腸粘膜固有層におけるＩＬ－１０産生Ｔｒｅｇを維持することが知られているクロストリジウム属のクラスターＩＶとＸＩＶａに属するクロストリジウム属の種（Ｃ．ボルテアエ、Ｃ．イノキューム、Ｃ．アスパラジフォルメ、Ｃ．シンデンス、Ｃ．シンボジウム）（Ａｔａｒａｓｈｉ ｅｔ ａｌ． ２０１１）が優勢であることと関係していた。

ＡＴＢの使用は別にして、４．７９９超というＡｋｋの過剰な存在（Ａｋｋ^高）は、おそらく根底にあるこれら進行したがん患者における腸障壁の病理生理学的障害を反映して、４．７９９未満というＡｋｋの「正常な」相対量よりも短い全生存と関係していた。エコシステムにおいてＡ．ムシニフィラが相対的に大きな割合であること、または優勢であることは、病理生理学的不全（アノレキシア・ネルボーザ（Ｒｕｕｓｕｎｅｎ ｅｔ ａｌ． ２０１９）、ＧＶＨＤ（Ｓｈｏｎｏ ｅｔ ａｌ． ２０１６）、加齢（ｖａｎ ｄｅｒ Ｌｕｇｔ ｅｔ ａｌ． ２０１９）、代謝異常（Ｄｅｐｏｍｍｉｅｒ ｅｔ ａｌ． ２０１９ｂ）、ＨＩＶ感染（Ｏｕｙａｎｇ ｅｔ ａｌ． ２０２０）、病原性細菌（Ｈｕｃｋ ｅｔ ａｌ． ２０２０）、または肝臓損傷（Ｗｕ ｅｔ ａｌ． ２０１７）など）と関係づけられてきた。したがってＡＴＢ使用によるかＡＴＢ使用につながる腸損傷の文脈では、Ａｋｋは、進行中だが不完全な腸修復のバイオマーカーとなる可能性があろう。注目すべきことに、他の細菌を調べて逆の臨床転帰と相関する似た三分法分布は観察されなかった（図３）。

したがって、Ａｋｋの相対量は、ＰＤ－１阻害を用いた免疫療法患者の好ましい予後または悪い予後の信頼性のあるバイオマーカーになりうると結論する。それは、最適なバイオマーカーを発見するために設計されたＮＳＣＬＣ患者を含む前向き試験において、ＡＴＢの使用とＰＤ－Ｌ１発現に加えてＡｋｋの相対量を正確に定量するための（１６Ｓ ｒＲＮＡによるよりは）ショット－ガンメタゲノミクスシークエンシングに基づいてリスクで層化されたＩ－Ｏ患者にとって最も重要である可能性がある。

マイクロバイオームを変化させる治療戦略（ＦＭＴまたは片利共生細菌など）が、ＩＣＩに対する応答を強化する、またはＩＣＩに対する一次耐性を回避するために現在評価されているところだが、患者を彼らのディスバイオシスの程度に基づいて層化することはなされていない（Ｂａｒｕｃｈ ｅｔ ａｌ． ２０２０）。ここに、内在性Ａｋｋを欠くＦＭＴによって与えられる抗ＰＤ－１阻害に対する耐性を治療で回避できることを示唆する前臨床データを提示する（図９と（Ｒｏｕｔｙ， Ｇｏｐａｌａｋｒｉｓｈｎａｎ， ｅｔ ａｌ． ２０１８；Ｒｏｕｔｙ， Ｌｅ Ｃｈａｔｅｌｉｅｒ， ｅｔ ａｌ． ２０１８））。外来性アッカーマンシア（アッカーマンシアｐ２２６１）の経口補充は、レシピエントのマイクロバイオームを健康状態に向けてシフトさせたときに特に有効であった（図９Ｄ～Ｅ）。最近の１つの前臨床研究は、組み換えインターロイキン－２の抗がん効果がＡｋｋによってＴｏｌｌ様受容体２に依存したやり方で改善される可能性があることを示している（Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ． ２０２０）。患者では、Ａｋｋを食品で補充することが安全であり、前糖尿病状態の文脈ではインスリン抵抗性と脂質異常症を減らす（Ｄｅｐｏｍｍｉｅｒ ｅｔ ａｌ． ２０１９ａ）。合わせると、凍結乾燥されてカプセルに入れられたアッカーマンシアの治療用補充は、ＡＴＢに曝露されていなくて内在性Ａｋｋが欠如している患者のサブグループの利益になると推測される。逆に、複合多微生物共同体または糞便微生物移植は、以前にＡＴＢに曝露された患者にとって最適である可能性がある。

したがってわれわれの研究は、定型的な腫瘍管理のため腸内ディスバイオシスを評価する診断ツールのほか、ＮＳＣＬＣを持つ患者におけるＩＣＩに対する一次耐性を回避することを目的として微生物叢を中心とする介入を設計するための枠組みを開発するための１つの強力な根拠を提供する。

実施例２：腸内アッカーマンシアＳＧＢ９２２８は、進行した非小細胞肺がん患者においてＰＤ１阻害に対する臨床応答を予測し、前臨床モデルにおいてＰＤ－１阻害の有効性を強化する

背景：

いくつかのグループによって発表された最近の研究は、アッカーマンシアのいくつかの分岐群（Ｂｅｃｋｅｎ ｅｔ ａｌ．， ｍＢｉｏ ２０２１）または種レベル（Ｋａｒｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ． ２０２１；Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ．， ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ２０１７）の存在を示唆している。実際に、そしてＫａｒｃｈｅｒらによって示唆されたように、アッカーマンシア・ムシニフィラを含む合計で５つのアッカーマンシア候補種がヒト、マウス、および非ヒト霊長類の腸内マイクロバイオームに存在し、そのうちの４つ（アッカーマンシアＳＧＢ９２２３、ＳＧＢ９２２４、ＳＧＢ９２２７、およびＳＧＢ９２２８）は、まだ十分に調べられていないか、特徴づけられていない。注目すべきことに、これらの株は、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列により、異なる候補種の中の株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列と大きな類似性を示し、違いが２％を超えることはなかった。アッカーマンシア候補種は宿主間で占有率が大きく異なっていた。Ａ．ムシニフィラが、全宿主で圧倒的に最も優勢な候補種であり、成人の３４％で検出され、実験室で育てたマウスでは最大占有率が５４％に達する。他の候補種は全宿主でより低い占有率（２５％未満）で検出された。

がん患者におけるＰＤ１阻害の臨床での有効性の推進におけるアッカーマンシアＳＧＢ９２２８種の重要性：

ゲノムマーカーを取り出し、われわれのコホートの中のこれら５つのＳＧＢのうちの４つのプロファイルを明らかにすること、したがってアッカーマンシアゲノムの多様性を以下のようによりよく再現することができた。実施例１（３３８人のＮＳＣＬＣがん患者のコホートにおけるアッカーマンシアのさまざまな亜種の占有率を示す表２）に概略を示したように、ＳＧＢ９２２６（アッカーマンシア・ムシニフィラＭｕｃＴ）はわれわれのコホートにおける最も優勢な種である（アッカーマンシア陽性サブセットの８０％超）。

注目すべきことに、分岐群ＳＧＢ９２２６（Ａ．ムシニフィラの代替物）とＳＧＢ９２２８に関して報告された占有率は、一般的なヒト集団においてＫａｒｃｈｅｒらによって報告されたのとは異なっているため、特定の分岐群の存在はＮＳＣＬＣの病理プロセスに関与しないことの証拠になっている（Ｋａｒｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ． ２０２１）。最後に、ＮＳＣＬＣがん患者で臨床においてＩＣＩが有効であるようにする分岐群ＳＧＢ９２２６とＳＧＢ９２２８の存在の予測値を比較した。患者を三分法で層化してＡ．ムシニフィラ^－の個人、Ａ．ムシニフィラ^低の個人、またはＡ．ムシニフィラ^高の個人にすることが、二分法（Ａ．ムシニフィラ^－対Ａ．ムシニフィラ^＋）の分別よりも全生存のより正確な独立な予後因子になる可能性があることを考慮し、ＳＧＢ９２２８を用いて同じ分析を実施した。図１０に示されているように、アッカーマンシアＳＧＢ９２２８はアッカーマンシア・ムシニフィラと同様の挙動を示すが、この分析に含まれるＳＧＢ９２２８^＋患者の数は有意に少なかった。合わせると、腸内の「正常レベル」のＡ．ムシニフィラ（Ａ．ムシニフィラ^低）またはアッカーマンシアＳＧＢ９２２８^低の存在は、宿主腸の健康度の代替指標と見なすことができる（図１０）。

アッカーマンシアｐ２２６１は、アッカーマンシアＳＧＢ９２２８に属するアッカーマンシアの株である：

したがってアッカーマンシアｐ２２６１の深い特徴づけを実施してアッカーマンシアｐ２２６１の系統群とそれぞれの表現型形質を明らかにした。メタゲノムアセンブルゲノムの全ゲノム系統推定を実施すると、アッカーマンシアｐ２２６１は、アッカーマンシア・ムシニフィラとは明確に異なる種アッカーマンシアＳＧＢ９２２８に属することが明らかになった。

Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から提供されたアッカーマンシア・ムシニフィラ基準株ゲノムをアッカーマンシアｐ２２６１ゲノムと比較した。再構築された単離体の完全性をＣｈｅｃｋＭのｌｉｎｅａｇｅ＿ｗｆ機能（Ｐａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ． ２０１５）を用いて評価した。次に、再構築されたコンティグを処理し、Ｐａｒｓｎｐをコアゲノムアライナーとして用いて多数の微生物のゲノムのコアゲノムをアラインメントさせた。単離体の間の平均ヌクレオチド同一性（ＡＮＩｍ）をＭＵＭｍｅｒ（Ｋｕｒｔｚ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ． ２００４）を用いて評価した。表９に示されているように、これらの株は１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列とのより高い類似性を示したが、ゲノムワイドの平均は、アッカーマンシアｐ２２６１（ゲノムＧ１２８４）とアッカーマンシア・ムシニフィラＡＴＣＣの間のヌクレオチド一致が９０％未満であると推定されたため、アッカーマンシア株ｐ２２６１とアッカーマンシア・ムシニフィラは遺伝的に異なることが証明される。

アッカーマンシアＳＧＢ０２２８株ｐ２２６１と４５３１は前臨床モデルにおいてＰＤ－１阻害の有効性を安全に強化する：

アッカーマンシアの株（株３２８４、５１２６、５８０１、４５３１、および２２６１が含まれる）が、免疫チェックポイント阻害剤の前臨床有効性を安全性強化する能力の詳細な評価を実施した。アッカーマンシア株が、ＮＲ ＮＳＣＬＣがん患者の糞便材料を移植したＭＣＡ２０５腫瘍担持マウスにおけるＰＤ１阻害の有効性を安全に改善する能力を調べた（図１１）。アッカーマンシア株２２６１と４５３１は、ＰＤ－１阻害の抗腫瘍有効性を強力に強化した。

アッカーマンシアの異なる株（株３２８４、５１２６、５８０１、４５３１、およびｐ２２６１が含まれる）を以前に適用された骨髄由来の樹状細胞（ＢＭＤＣ）によるサイトカインＩＬ－１２の分泌もモニタした（図１２）。アッカーマンシア株２２６１と４５３１はＢＭＤＣによるＩＬ－１２の分泌を強力に強化した。

アッカーマンシア種を認識する特異的プライマーの設計：

アッカーマンシア・ムシニフィラ（ＳＧＢ９２２６）とアッカーマンシアＳＧＢ９２２８種を特異的に同定するためのプライマーを設計した（図１３）。これらのプライマーはＰｒｉｍｅｒ－ＢＬＡＳＴを用いて設計し（Ｙｅ ｅｔ ａｌ．， ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ， ２０１２）、特異性はＲｅｆＳｅｑに寄託された代表的なゲノムを用いてチェックした。

アッカーマンシア・ムシニフィラおよび／またはアッカーマンシアＳＧＢ９２２８の相対量は、以下のプライマーを用いた定量ＰＣＲによって測定することができる：

参考文献
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Ｂｅｇｈｉｎｉ， Ｆｒａｎｃｅｓｃｏ， Ｌａｕｒｅｎ Ｊ． ＭｃＩｖｅｒ， Ａｉｔｏｒ Ｂｌａｎｃｏ－Ｍｉｇｕｅｚ， Ｌｅｏｎａｒｄ Ｄｕｂｏｉｓ， Ｆｒａｎｃｅｓｃｏ Ａｓｎｉｃａｒ， Ｓａｇｕｎ Ｍａｈａｒｊａｎ， Ａｎａ Ｍａｉｌｙａｎ， ｅｔ ａｌ． ２０２０． <<Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｎｇ Ｔａｘｏｎｏｍｉｃ， Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ， ａｎｄ Ｓｔｒａｉｎ－Ｌｅｖｅｌ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ Ｄｉｖｅｒｓｅ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ ｗｉｔｈ ＢｉｏＢａｋｅｒｙ ３>>． ＢｉｏＲｘｉｖ， ｎｏｖｅｍｂｒｅ， ２０２０．１１．１９．３８８２２３． ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／２０２０．１１．１９．３８８２２３．
Ｂｅｎｅｖｉｄｅｓ， Ｌｅａｎｄｒｏ， Ｓｒｉｔｉ Ｂｕｒｍａｎ， Ｒｅｂｅｃａ Ｍａｒｔｉｎ， Ｖｅｒｏｎｉｑｕｅ Ｒｏｂｅｒｔ， Ｍｕｒｉｅｌ Ｔｈｏｍａｓ， Ｓｙｌｖｉｅ Ｍｉｑｕｅｌ， Ｆｌｏｒｉａｎ Ｃｈａｉｎ， ｅｔ ａｌ． ２０１７． <<Ｎｅｗ Ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ ｔｈｅ Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｕｓ Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ>>． Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ８： １７９０． ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．３３８９／ｆｍｉｃｂ．２０１７．０１７９０．
Ｂｌａｃｈｅｒ， Ｅｒａｎ， Ｓｔａｖｒｏｓ Ｂａｓｈｉａｒｄｅｓ， Ｈａｇｉｔ Ｓｈａｐｉｒｏ， Ｄａｐｈｎａ Ｒｏｔｈｓｃｈｉｌｄ， Ｕｒｉａ Ｍｏｒ， Ｍａｌｌｙ Ｄｏｒｉ－Ｂａｃｈａｓｈ， Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ Ｋｌｅｉｍｅｙｅｒ， ｅｔ ａｌ． ２０１９． <<Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ｒｏｌｅｓ ｏｆ Ｇｕｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ ｉｎ Ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ ＡＬＳ ｉｎ Ｍｉｃｅ>>． Ｎａｔｕｒｅ ５７２ （７７７０）： ４７４－８０． ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｓ４１５８６－０１９－１４４３－５．
Ｂｏｒｇｈａｅｉ， Ｈｏｓｓｅｉｎ， Ｌｕｉｓ Ｐａｚ－Ａｒｅｓ， Ｌｅｏｒａ Ｈｏｒｎ， Ｄａｖｉｄ Ｒ． Ｓｐｉｇｅｌ， Ｍａｒｔｉｎ Ｓｔｅｉｎｓ， Ｎｅａｌ Ｅ． Ｒｅａｄｙ， Ｌａｕｒａ Ｑ． Ｃｈｏｗ， ｅｔ ａｌ． ２０１５． <<Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ ｖｅｒｓｕｓ Ｄｏｃｅｔａｘｅｌ ｉｎ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｎｏｎｓｑｕａｍｏｕｓ Ｎｏｎ-Ｓｍａｌｌ－Ｃｅｌｌ Ｌｕｎｇ Ｃａｎｃｅｒ>>． Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３７３ （１７）： １６２７－３９． ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０５６／ＮＥＪＭｏａ１５０７６４３．
Ｂｒａｈｍｅｒ， Ｊｕｌｉｅ， Ｋａｒｅｎ Ｌ． Ｒｅｃｋａｍｐ， Ｐａｕｌ Ｂａａｓ， Ｌｕｃｉｏ Ｃｒｉｎｏ， Ｗｉｌｆｒｉｅｄ Ｅ．Ｅ． Ｅｂｅｒｈａｒｄｔ， Ｅｌｅｎａ Ｐｏｄｄｕｂｓｋａｙａ， Ｓｃｏｔｔ Ａｎｔｏｎｉａ， ｅｔ ａｌ． ２０１５． <<Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ ｖｅｒｓｕｓ Ｄｏｃｅｔａｘｅｌ ｉｎ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｓｑｕａｍｏｕｓ－Ｃｅｌｌ Ｎｏｎ-Ｓｍａｌｌ－Ｃｅｌｌ Ｌｕｎｇ Ｃａｎｃｅｒ>>． Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３７３ （２）： １２３－３５． ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０５６／ＮＥＪＭｏａ１５０４６２７．
Ｂｒａｙ， Ｎｉｃｏｌａｓ Ｌ．， Ｈａｒｏｌｄ Ｐｉｍｅｎｔｅｌ， Ｐａｌｌ Ｍｅｌｓｔｅｄ， ｅｔ Ｌｉｏｒ Ｐａｃｈｔｅｒ． ２０１６． <<Ｎｅａｒ－Ｏｐｔｉｍａｌ Ｐｒｏｂａｂｉｌｉｓｔｉｃ ＲＮＡ－Ｓｅｑ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ>>． Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３４ （５）： ５２５－２７． ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｎｂｔ．３５１９．
Ｃａｎｉ， Ｐａｔｒｉｃｅ Ｄ．， ｅｔ Ｗｉｌｌｅｍ Ｍ． ｄｅ Ｖｏｓ． ２０１７． <<Ｎｅｘｔ－Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｂｅｎｅｆｉｃｉａｌ Ｍｉｃｒｏｂｅｓ： Ｔｈｅ Ｃａｓｅ ｏｆ Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ Ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ>>． Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ８． ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．３３８９／ｆｍｉｃｂ．２０１７．０１７６５．
Ｃｈｅｎ， Ｄａｎｉｅｌ Ｓ．， ｅｔ Ｉｒａ Ｍｅｌｌｍａｎ． ２０１７． <<Ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ａｎｄ ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ-Ｉｍｍｕｎｅ Ｓｅｔ Ｐｏｉｎｔ>>． Ｎａｔｕｒｅ ５４１ （７６３７）： ３２１－３０． ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ２１３４９．
Ｄａｉｓｌｅｙ， Ｂｒｅｎｄａｎ Ａ．， Ｒｙａｎ Ｍ． Ｃｈａｎｙｉ， Ｋａｍｉｌａｈ Ａｂｄｕｒ－Ｒａｓｈｉｄ， Ｋａｉｔ Ｆ． Ａｌ， Ｓｈａｅｌｅｙ Ｇｉｂｂｏｎｓ， Ｊｏｈｎ Ａ． Ｃｈｍｉｅｌ， Ｈａｎｎａｈ Ｗｉｌｃｏｘ， ｅｔ ａｌ． ２０２０． <<Ａｂｉｒａｔｅｒｏｎｅ Ａｃｅｔａｔｅ Ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ Ｅｎｒｉｃｈｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｇｕｔ Ｃｏｍｍｅｎｓａｌ Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ Ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ ｉｎ Ｃａｓｔｒａｔｅ－Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｐｒｏｓｔａｔｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｐａｔｉｅｎｔｓ>>． Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ １１ （１）： ４８２２． ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｓ４１４６７－０２０－１８６４９－５．
Ｄｅｐｏｍｍｉｅｒ， Ｃｌａｒａ， Ａｍａｎｄｉｎｅ Ｅｖｅｒａｒｄ， Ｃｅｌｉｎｅ Ｄｒｕａｒｔ， Ｈｕｂｅｒｔ Ｐｌｏｖｉｅｒ， Ｍａｔｔｈｉａｓ Ｖａｎ Ｈｕｌ， Ｓａｒａ Ｖｉｅｉｒａ－Ｓｉｌｖａ， Ｇｗｅｎ Ｆａｌｏｎｙ， ｅｔ ａｌ． ２０１９ａ． <<Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ Ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ ｉｎ Ｏｖｅｒｗｅｉｇｈｔ ａｎｄ Ｏｂｅｓｅ Ｈｕｍａｎ Ｖｏｌｕｎｔｅｅｒｓ： Ａ Ｐｒｏｏｆ－ｏｆ－Ｃｏｎｃｅｐｔ Ｅｘｐｌｏｒａｔｏｒｙ Ｓｔｕｄｙ>>． Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２５ （７）： １０９６－１１０３． ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｓ４１５９１－０１９－０４９５－２．
－－－． ２０１９ｂ． <<Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ Ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ ｉｎ Ｏｖｅｒｗｅｉｇｈｔ ａｎｄ Ｏｂｅｓｅ Ｈｕｍａｎ Ｖｏｌｕｎｔｅｅｒｓ： Ａ Ｐｒｏｏｆ－ｏｆ－Ｃｏｎｃｅｐｔ Ｅｘｐｌｏｒａｔｏｒｙ Ｓｔｕｄｙ>>． Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２５ （７）： １０９６－１１０３． ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｓ４１５９１－０１９－０４９５－２．
Ｄｅｒｏｓａ， Ｌ．， Ｍ． Ｄ． Ｈｅｌｌｍａｎｎ， Ｍ． Ｓｐａｚｉａｎｏ， Ｄ． Ｈａｌｐｅｎｎｙ， Ｍ． Ｆｉｄｅｌｌｅ， Ｈ． Ｒｉｚｖｉ， Ｎ． Ｌｏｎｇ， ｅｔ ａｌ． ２０１８． <<Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ｏｎ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｉｎ Ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｒｅｎａｌ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｎｏｎ－Ｓｍａｌｌ－Ｃｅｌｌ Ｌｕｎｇ Ｃａｎｃｅｒ>>． Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ： Ｏｆｆｉｃｉａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ２９ （６）： １４３７－４４． ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０９３／ａｎｎｏｎｃ／ｍｄｙ１０３．
Ｄｅｒｏｓａ， Ｌｉｓａ， Ｂｅｒｔｒａｎｄ Ｒｏｕｔｙ， Ａｎｔｏｉｎｅ Ｄｅｓｉｌｅｔｓ， Ｒｏｍａｉｎ Ｄａｉｌｌｅｒｅ， Ｓａｆａｅ Ｔｅｒｒｉｓｓｅ， Ｇｕｉｄｏ Ｋｒｏｅｍｅｒ， ｅｔ Ｌａｕｒｅｎｃｅ Ｚｉｔｖｏｇｅｌ． ２０２１． <<Ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ－Ｃｅｎｔｅｒｅｄ Ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎｓ： Ｔｈｅ Ｎｅｘｔ Ｂｒｅａｋｔｈｒｏｕｇｈ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏ－Ｏｎｃｏｌｏｇｙ？>> Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ １１ （１０）： ２３９６－２４１２． ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１５８／２１５９－８２９０．ＣＤ－２１－０２３６．
Ｄｅｒｏｓａ， Ｌｉｓａ， Ｂｅｒｔｒａｎｄ Ｒｏｕｔｙ， Ｍａｒｉｎｅ Ｆｉｄｅｌｌｅ， Ｖａｌｅｒｉｏ Ｉｅｂｂａ， Ｌａｕｒｉｅ Ａｌｌａ， Ｅｄｏａｒｄｏ Ｐａｓｏｌｌｉ， Ｎｉｃｏｌａ Ｓｅｇａｔａ， ｅｔ ａｌ． ２０２０． <<Ｇｕｔ Ｂａｃｔｅｒｉａ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ Ｄｒｉｖｅｓ Ｐｒｉｍａｒｙ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ Ｒｅｎａｌ Ｃｅｌｌ Ｃａｒｃｉｎｏｍａ Ｐａｔｉｅｎｔｓ>>． Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｕｒｏｌｏｇｙ ７８ （２）： １９５－２０６． ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｅｕｒｕｒｏ．２０２０．０４．０４４．
Ｄｅｒｏｓａ， Ｌｉｓａ， ｅｔ Ｌａｕｒｅｎｃｅ Ｚｉｔｖｏｇｅｌ． ２０２０． <<Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ Ｉｍｐａｉｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ Ｕｒｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃａｎｃｅｒ>>． Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ． Ｕｒｏｌｏｇｙ １７ （１１）： ６０５－６． ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｓ４１５８５－０２０－０３７３－１．
Ｄｅｓａｉ， Ｍａｈｅｓｈ Ｓ．， Ａｎｎａ Ｍ． Ｓｅｅｋａｔｚ， Ｎｉｃｏｌｅ Ｍ． Ｋｏｒｏｐａｔｋｉｎ， Ｎｏｂｕｈｉｋｏ Ｋａｍａｄａ， Ｃｈｒｉｓｔｉｎａ Ａ． Ｈｉｃｋｅｙ， Ｍａｔｈｉｓ Ｗｏｌｔｅｒ， Ｎｉｃｈｏｌａｓ Ａ． Ｐｕｄｌｏ， ｅｔ ａｌ． ２０１６． <<Ａ Ｄｉｅｔａｒｙ Ｆｉｂｅｒ－Ｄｅｐｒｉｖｅｄ Ｇｕｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ Ｄｅｇｒａｄｅｓ ｔｈｅ Ｃｏｌｏｎｉｃ Ｍｕｃｕｓ Ｂａｒｒｉｅｒ ａｎｄ Ｅｎｈａｎｃｅｓ Ｐａｔｈｏｇｅｎ Ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ>>． Ｃｅｌｌ １６７ （５）： １３３９－１３５３．ｅ２１． ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１６．１０．０４３．
Ｅｉｓｅｎｈａｕｅｒ， Ｅ． Ａ．， Ｐ． Ｔｈｅｒａｓｓｅ， Ｊ． Ｂｏｇａｅｒｔｓ， Ｌ． Ｈ． Ｓｃｈｗａｒｔｚ， Ｄ． Ｓａｒｇｅｎｔ， Ｒ． Ｆｏｒｄ， Ｊ． Ｄａｎｃｅｙ， ｅｔ ａｌ． ２００９． <<Ｎｅｗ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｃｒｉｔｅｒｉａ ｉｎ Ｓｏｌｉｄ Ｔｕｍｏｕｒｓ： Ｒｅｖｉｓｅｄ ＲＥＣＩＳＴ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ （Ｖｅｒｓｉｏｎ １．１）>>． Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ （Ｏｘｆｏｒｄ， Ｅｎｇｌａｎｄ： １９９０） ４５ （２）： ２２８－４７． ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｅｊｃａ．２００８．１０．０２６．
Ｅｌｋｒｉｅｆ， Ａ．， Ｌ． Ｄｅｒｏｓａ， Ｇ． Ｋｒｏｅｍｅｒ， Ｌ． Ｚｉｔｖｏｇｅｌ， ｅｔ Ｂ． Ｒｏｕｔｙ． ２０１９． <<Ｔｈｅ Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｉｍｐａｃｔ ｏｆ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ｏｎ Ｏｕｔｃｏｍｅｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｐａｔｉｅｎｔｓ Ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ： Ａ Ｎｅｗ Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ Ｆａｃｔｏｒ？>> Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ： Ｏｆｆｉｃｉａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ３０ （１０）： １５７２－７９． ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０９３／ａｎｎｏｎｃ／ｍｄｚ２０６．
Ｆｅｒｒａｒａ， Ｒｏｂｅｒｔｏ， Ｌａｕｒａ Ｍｅｚｑｕｉｔａ， Ｍａｔｔｈｉｅｕ Ｔｅｘｉｅｒ， Ｊｉｈｅｎｅ Ｌａｈｍａｒ， Ｃｌａｒｉｓｓｅ Ａｕｄｉｇｉｅｒ－Ｖａｌｅｔｔｅ， Ｌａｕｒｅｎｔ Ｔｅｓｓｏｎｎｉｅｒ， Ｊｕｌｉｅｎ Ｍａｚｉｅｒｅｓ， ｅｔ ａｌ． ２０１８． <<Ｈｙｐｅｒｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ Ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎ Ｐａｔｉｅｎｔｓ Ｗｉｔｈ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｎｏｎ－Ｓｍａｌｌ Ｃｅｌｌ Ｌｕｎｇ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｅａｔｅｄ Ｗｉｔｈ ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｒ Ｗｉｔｈ Ｓｉｎｇｌｅ－Ａｇｅｎｔ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ>>． ＪＡＭＡ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ４ （１１）： １５４３－５２． ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００１／ｊａｍａｏｎｃｏｌ．２０１８．３６７６．
Ｆｕｍｅｔ， Ｊｅａｎ－Ｄａｖｉｄ， Ｃｏｒｅｎｔｉｎ Ｒｉｃｈａｒｄ， Ｆａｎｎｙ Ｌｅｄｙｓ， Ｑｕｅｎｔｉｎ Ｋｌｏｐｆｅｎｓｔｅｉｎ， Ｐｈｉｌｉｐｐｅ Ｊｏｕｂｅｒｔ， Ｂｅｒｔｒａｎｄ Ｒｏｕｔｙ， Ｃａｒｏｌｉｎｅ Ｔｒｕｎｔｚｅｒ， ｅｔ ａｌ． ２０１８． <<Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ ａｎｄ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ Ｒｏｌｅ ｏｆ ＣＤ８ ａｎｄ ＰＤ－Ｌ１ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｉｎ Ｌｕｎｇ Ｔｕｍｏｒ Ｔｉｓｓｕｅ ｏｆ Ｐａｔｉｅｎｔｓ ｕｎｄｅｒ Ａｎｔｉ－ＰＤ－１ Ｔｈｅｒａｐｙ>>． Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ １１９ （８）： ９５０－６０． ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｓ４１４１６－０１８－０２２０－９．
Ｇａｄｇｅｅｌ， Ｓｈｉｒｉｓｈ， Ｄｅｌｖｙｓ Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ－Ａｂｒｅｕ， Ｇｉｏｖａｎｎａ Ｓｐｅｒａｎｚａ， Ｅｍｉｌｉｏ Ｅｓｔｅｂａｎ， Ｅｎｒｉｑｕｅｔａ Ｆｅｌｉｐ， Ｍａｎｕｅｌ Ｄｏｍｉｎｅ， Ｒｉｎａ Ｈｕｉ， ｅｔ ａｌ． ２０２０． <<Ｕｐｄａｔｅｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｆｒｏｍ ＫＥＹＮＯＴＥ－１８９： Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ ｏｒ Ｐｌａｃｅｂｏ Ｐｌｕｓ Ｐｅｍｅｔｒｅｘｅｄ ａｎｄ Ｐｌａｔｉｎｕｍ ｆｏｒ Ｐｒｅｖｉｏｕｓｌｙ Ｕｎｔｒｅａｔｅｄ Ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ Ｎｏｎｓｑｕａｍｏｕｓ Ｎｏｎ－Ｓｍａｌｌ－Ｃｅｌｌ Ｌｕｎｇ Ｃａｎｃｅｒ>>． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ： Ｏｆｆｉｃｉａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ３８ （１４）： １５０５－１７． ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１２００／ＪＣＯ．１９．０３１３６．
Ｇａｎｄｈｉ， Ｌ．， Ｄ． Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ－Ａｂｒｅｕ， Ｓ． Ｇａｄｇｅｅｌ， Ｅ． Ｅｓｔｅｂａｎ， Ｅ． Ｆｅｌｉｐ， Ｆ． Ｄｅ Ａｎｇｅｌｉｓ， Ｍ． Ｄｏｍｉｎｅ， ｅｔ ａｌ． ２０１８． <<Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ ｐｌｕｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ Ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ Ｎｏｎ－Ｓｍａｌｌ－Ｃｅｌｌ Ｌｕｎｇ Ｃａｎｃｅｒ>>． Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３７８ （２２）： ２０７８－９２． ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０５６／ＮＥＪＭｏａ１８０１００５．
Ｇｏｐａｌａｋｒｉｓｈｎａｎ， Ｖ．， Ｃ． Ｎ． Ｓｐｅｎｃｅｒ， Ｌ． Ｎｅｚｉ， Ａ． Ｒｅｕｂｅｎ， Ｍ． Ｃ． Ａｎｄｒｅｗｓ， Ｔ． Ｖ． Ｋａｒｐｉｎｅｔｓ， Ｐ． Ａ． Ｐｒｉｅｔｏ， ｅｔ ａｌ． ２０１８． <<Ｇｕｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ Ｍｏｄｕｌａｔｅｓ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ Ａｎｔｉ－ＰＤ－１ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ Ｍｅｌａｎｏｍａ Ｐａｔｉｅｎｔｓ>>． Ｓｃｉｅｎｃｅ （Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．） ３５９ （６３７１）： ９７－１０３． ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａａｎ４２３６．
Ｇｕｏ， Ｘ． ｅｔ ａｌ． Ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｏｆ ３９ Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｒｅｖｅａｌｓ ｉｔｓ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， ｇｅｎｏｍｉｃ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｄｉｖｅｒｉｓｉｔｙ， ａｎｄ ｇｌｏｂａｌ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｇｕｔ ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａｓ． ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １８， ８００ （２０１７）．
Ｈａｋｏｚａｋｉ， Ｔａｉｋｉ， Ｃｏｒｅｎｔｉｎ Ｒｉｃｈａｒｄ， Ａｒｉｅｌｌｅ Ｅｌｋｒｉｅｆ， Ｙｕｋｉｏ Ｈｏｓｏｍｉ， Ｍｙｒｉａｍ Ｂｅｎｌａｉｆａｏｕｉ， Ｉｒｉｓ Ｍｉｍｐｅｎ， Ｓａｆａｅ Ｔｅｒｒｉｓｓｅ， ｅｔ ａｌ． ２０２０． <<Ｔｈｅ Ｇｕｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ｗｉｔｈ Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ Ｏｕｔｃｏｍｅｓ ｉｎ Ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｎｏｎ－Ｓｍａｌｌ Ｃｅｌｌ Ｌｕｎｇ Ｃａｎｃｅｒ>>． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ８ （１０）： １２４３－５０． ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１５８／２３２６－６０６６．ＣＩＲ－２０－０１９６．
Ｈｅｒｂｓｔ， Ｒｏｙ Ｓ．， Ｐａｕｌ Ｂａａｓ， Ｄｏｎｇ－Ｗａｎ Ｋｉｍ， Ｅｎｒｉｑｕｅｔａ Ｆｅｌｉｐ， Ｊｏｓｅ Ｌ． Ｐｅｒｅｚ－Ｇｒａｃｉａ， Ｊｉ－Ｙｏｕｎ Ｈａｎ， Ｊｕｌｉａｎ Ｍｏｌｉｎａ， ｅｔ ａｌ． ２０１６． <<Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ ｖｅｒｓｕｓ Ｄｏｃｅｔａｘｅｌ ｆｏｒ Ｐｒｅｖｉｏｕｓｌｙ Ｔｒｅａｔｅｄ， ＰＤ－Ｌ１－Ｐｏｓｉｔｉｖｅ， Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｎｏｎ－Ｓｍａｌｌ－Ｃｅｌｌ Ｌｕｎｇ Ｃａｎｃｅｒ （ＫＥＹＮＯＴＥ－０１０）： Ａ Ｒａｎｄｏｍｉｓｅｄ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｔｒｉａｌ>>． Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ ３８７ （１００２７）： １５４０－５０． ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／Ｓ０１４０－６７３６（１５）０１２８１－７．
Ｈｕｃｋ， Ｏｌｉｖｉｅｒ， Ｈａｎｎａｈ Ｍｕｌｈａｌｌ， Ｇｅｏｒｇｅ Ｒｕｂｉｎ， Ｚｅｖ Ｋｉｚｅｌｎｉｋ， Ｒａｄｈａ Ｉｙｅｒ， Ｊｏｈｎ Ｄ． Ｐｅｒｐｉｃｈ， Ｎａｓｒｅｅｎ Ｈａｑｕｅ， Ｐａｔｒｉｃｅ Ｄ． Ｃａｎｉ， Ｗｉｌｌｅｍ Ｍ． ｄｅ Ｖｏｓ， ｅｔ Ｓａｌｏｍｏｎ Ａｍａｒ． ２０２０． <<Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ Ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ Ｒｅｄｕｃｅｓ Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ Ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ－Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌ Ｂｏｎｅ Ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎ>>． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｏｌｏｇｙ ４７ （２）： ２０２－１２． ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１１１／ｊｃｐｅ．１３２１４．
Ｈｗａｎｇ， Ｓｏｈｙｕｎ， Ａｈ－Ｙｏｕｎｇ Ｋｗｏｎ， Ｊｕ－Ｙｅｏｎ Ｊｅｏｎｇ， Ｓｅｗｈａ Ｋｉｍ， Ｈａｅｙｏｕｎ Ｋａｎｇ， Ｊｏｏｎｓｕｋ Ｐａｒｋ， Ｊｏｏ－Ｈａｎｇ Ｋｉｍ， Ｏｋ Ｊｉｎ Ｈａｎ， Ｓｕｎ Ｍｉｎ Ｌｉｍ， ｅｔ Ｈｅｅ Ｊｕｎｇ Ａｎ． ２０２０． <<Ｉｍｍｕｎｅ Ｇｅｎｅ Ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ Ｄｕｒａｂｌｅ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｂｅｎｅｆｉｔ ｏｆ Ａｎｔｉ－ＰＤ－１ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ Ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｎｏｎ－Ｓｍａｌｌ Ｃｅｌｌ Ｌｕｎｇ Ｃａｎｃｅｒ>>． Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ １０ （１）： ６４３． ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｓ４１５９８－０１９－５７２１８－９．
Ｊｉｎ， Ｙｕｅｐｉｎｇ， Ｈｕｉ Ｄｏｎｇ， Ｌｉｌｉａｎｇ Ｘｉａ， Ｙｉ Ｙａｎｇ， Ｙｏｎｇｑｉａｎｇ Ｚｈｕ， Ｙａｎ Ｓｈｅｎ， Ｈｕａｊｕｎ Ｚｈｅｎｇ， Ｃｈｅｎｇｃｈｅｎｇ Ｙａｏ， Ｙｉｎｇ Ｗａｎｇ， ｅｔ Ｓｈｕｎ Ｌｕ． ２０１９． <<Ｔｈｅ Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｇｕｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ Ｉｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｗｉｔｈ Ｆａｖｏｒａｂｌｅ Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｏ Ａｎｔｉ－Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ Ｄｅａｔｈ １ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｐａｔｉｅｎｔｓ Ｗｉｔｈ ＮＳＣＬＣ>>． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｔｈｏｒａｃｉｃ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ： Ｏｆｆｉｃｉａｌ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｓｔｕｄｙ ｏｆ Ｌｕｎｇ Ｃａｎｃｅｒ １４ （８）： １３７８－８９． ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｊｔｈｏ．２０１９．０４．００７．
Ｋａｒｃｈｅｒ， Ｎｉｃｏｌａｉ， Ｅｌｅｏｎｏｒａ Ｎｉｇｒｏ， Ｍｉｃｈａｌ Ｐｕｎｃｏｃｈａｒ， Ａｉｔｏｒ Ｂｌａｎｃｏ－Ｍｉｇｕｅｚ， Ｍａｔｔｅｏ Ｃｉｃｉａｎｉ， Ｐａｏｌｏ Ｍａｎｇｈｉ， Ｍｏｒｅｎｏ Ｚｏｌｆｏ， ｅｔ ａｌ． ２０２１． <<Ｇｅｎｏｍｉｃ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ａｎｄ ｅｃｏｌｏｇｙ ｏｆ ｈｕｍａｎ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｓｐｅｃｉｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｇｕｔ ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｂｙ ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ ｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃ ａｓｓｅｍｂｌｙ>>． Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２２ （１）： ２０９． ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１８６／ｓ１３０５９－０２１－０２４２７－７．
Ｋｏｙａｍａ， Ｓｈｏｈｅｉ， Ｅｓｒａ Ａ． Ａｋｂａｙ， Ｙｖｏｎｎｅ Ｙ． Ｌｉ， Ｇｒｉｔ Ｓ． Ｈｅｒｔｅｒ－Ｓｐｒｉｅ， Ｋｅｖｉｎ Ａ． Ｂｕｃｚｋｏｗｓｋｉ， Ｗｉｌｌｉａｍ Ｇ． Ｒｉｃｈａｒｄｓ， Ｌｅｅｎａ Ｇａｎｄｈｉ， ｅｔ ａｌ． ２０１６． <<Ａｄａｐｔｉｖｅ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ＰＤ－１ Ｂｌｏｃｋａｄｅ Ｉｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｕｐｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔｓ>>． Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ７ （ｆｅｖｒｉｅｒ）： １０５０１． ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ１０５０１．
Ｋｕｒｔｚ， Ｓ． ｅｔ ａｌ． Ｖｅｒｓａｔｉｌｅ ａｎｄ ｏｐｅｎ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｆｏｒ ｃｏｍｐａｒｉｎｇ ｌａｒｇｅ ｇｅｎｏｍｅｓ． Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ ５， Ｒ１２ （２００４）．
Ｌｅ Ｃｈａｔｅｌｉｅｒ， Ｅｍｍａｎｕｅｌｌｅ， Ｔｒｉｎｅ Ｎｉｅｌｓｅｎ， Ｊｕｎｊｉｅ Ｑｉｎ， Ｅｄｉ Ｐｒｉｆｔｉ， Ｆａｌｋ Ｈｉｌｄｅｂｒａｎｄ， Ｇｗｅｎ Ｆａｌｏｎｙ， Ｍａｔｈｉｅｕ Ａｌｍｅｉｄａ， ｅｔ ａｌ． ２０１３． <<Ｒｉｃｈｎｅｓｓ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｇｕｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ Ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ ｗｉｔｈ Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｍａｒｋｅｒｓ>>． Ｎａｔｕｒｅ ５００ （７４６４）： ５４１－４６． ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１２５０６．
Ｌｅｅ， Ｓｅ－Ｈｏｏｎ， Ｓｕｎｇ－Ｙｕｐ Ｃｈｏ， Ｙｏｕｎｇｍｉｎ Ｙｏｏｎ， Ｃｈａｎｇｈｏ Ｐａｒｋ， Ｊｉｎｙｏｕｎｇ Ｓｏｈｎ， Ｊｉｎ－Ｊｕ Ｊｅｏｎｇ， Ｂｕ－Ｎａｍ Ｊｅｏｎ， ｅｔ ａｌ． ２０２１． <<Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｂｉｆｉｄｕｍ Ｓｔｒａｉｎｓ Ｓｙｎｅｒｇｉｚｅ ｗｉｔｈ Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｔｏ Ｒｅｄｕｃｅ Ｔｕｍｏｕｒ Ｂｕｒｄｅｎ ｉｎ Ｍｉｃｅ>>． Ｎａｔｕｒｅ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ６ （３）： ２７７－８８． ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｓ４１５６４－０２０－００８３１－６．
Ｌｉ， Ｊｕｎｈｕａ， Ｈｕｉｊｕｅ Ｊｉａ， Ｘｉａｎｇｈａｎｇ Ｃａｉ， Ｈｕａｎｚｉ Ｚｈｏｎｇ， Ｑｉａｎｇ Ｆｅｎｇ， Ｓｈｉｎｉｃｈｉ Ｓｕｎａｇａｗａ， Ｍａｎｉｍｏｚｈｉｙａｎ Ａｒｕｍｕｇａｍ， ｅｔ ａｌ． ２０１４． <<Ａｎ Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｃａｔａｌｏｇ ｏｆ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｇｕｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ>>． Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３２ （８）： ８３４－４１． ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｎｂｔ．２９４２．
Ｌｉｎ， Ｈｕａｎｇ， ｅｔ Ｓｈｙａｍａｌ Ｄａｓ Ｐｅｄｄａｄａ． ２０２０． <<Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅｓ ｗｉｔｈ Ｂｉａｓ Ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ>>． Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ １１ （１）： ３５１４． ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｓ４１４６７－０２０－１７０４１－７．
Ｌｕｇｔ， Ｂｅｎｔｈｅ ｖａｎ ｄｅｒ， Ａｄｒｉａａｎ Ａ． ｖａｎ Ｂｅｅｋ， Ｓｔｅｖｅｎ Ａａｌｖｉｎｋ， Ｂｅｎ Ｍｅｉｊｅｒ， Ｂｒｕｎｏ Ｓｏｖｒａｎ， Ｗｉｌｂｅｒｔ Ｐ． Ｖｅｒｍｅｉｊ， Ｒｅｎａｔａ Ｍ． Ｃ． Ｂｒａｎｄｔ， ｅｔ ａｌ． ２０１９． <<Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ ａｍｅｌｉｏｒａｔｅｓ ｔｈｅ ａｇｅ－ｒｅｌａｔｅｄ ｄｅｃｌｉｎｅ ｉｎ ｃｏｌｏｎｉｃ ｍｕｃｕｓ ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ ａｎｄ ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ ｉｍｍｕｎｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｉｎ ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ ａｇｉｎｇ Ｅｒｃｃ１－／Δ７ ｍｉｃｅ>>． Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ＆ Ａｇｅｉｎｇ １６ （１）： ６． ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１８６／ｓ１２９７９－０１９－０１４５－ｚ．
Ｍａｌｌｉｃｋ， Ｒｉｓｈａｖ， Ｊｕｄｉｔｈ Ａ． Ｈｕｂｂａｒｄ， Ｅｒｉｃ Ｏ． Ｌｉｎｄｓｅｙ， Ｋｙｌｅ Ｅ． Ｂｒａｄｌｅｙ， Ｊａｍｅｓ Ｄ． Ｐ． Ｍｏｏｒｅ， Ａｋｔａｒｕｌ Ａｈｓａｎ， Ａ． Ｋ． Ｍ． Ｋｈｏｒｓｈｅｄ Ａｌａｍ， ｅｔ Ｅｍｍａ Ｍ． Ｈｉｌｌ． ２０２０． <<Ｓｕｂｄｕｃｔｉｏｎ Ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ Ｒｉｓｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｈｉｌｌｏｎｇ Ｐｌａｔｅａｕ>>． Ｅａｒｔｈ ａｎｄ Ｐｌａｎｅｔａｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｅｔｔｅｒｓ ５４３ （ａｏｕｔ）： １１６３５１． ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｅｐｓｌ．２０２０．１１６３５１．
Ｍａｔｓｏｎ， Ｖｙａｒａ， Ｊｅｓｓｉｃａ Ｆｅｓｓｌｅｒ， Ｒｉｙｕｅ Ｂａｏ， Ｔａｒａ Ｃｈｏｎｇｓｕｗａｔ， Ｙｕａｎｙｕａｎ Ｚｈａ， Ｍａｒｉａ－Ｌｕｉｓａ Ａｌｅｇｒｅ， Ｊａｓｏｎ Ｊ． Ｌｕｋｅ， ｅｔ Ｔｈｏｍａｓ Ｆ． Ｇａｊｅｗｓｋｉ． ２０１８． <<Ｔｈｅ Ｃｏｍｍｅｎｓａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ Ｉｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ａｎｔｉ－ＰＤ－１ Ｅｆｆｉｃａｃｙ ｉｎ Ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ Ｍｅｌａｎｏｍａ Ｐａｔｉｅｎｔｓ>>． Ｓｃｉｅｎｃｅ （Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．） ３５９ （６３７１）： １０４－８． ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａａｏ３２９０．
Ｍｅｎｇ， Ｘｉａｎｇｊｉａｏ， Ｙｏｎｇｓｈｅｎｇ Ｇａｏ， Ｌｉａｎ Ｙａｎｇ， Ｈａｉｙａｎ Ｊｉｎｇ， Ｆｅｉｆｅｉ Ｔｅｎｇ， Ｚｈａｏｑｉｎ Ｈｕａｎｇ， ｅｔ Ｌｉｇａｎｇ Ｘｉｎｇ． ２０１９． <<Ｉｍｍｕｎｅ Ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ Ｂｅｔｗｅｅｎ Ｓｑｕａｍｏｕｓ ａｎｄ Ｎｏｎ－Ｓｑｕａｍｏｕｓ Ｎｏｎ－Ｓｍａｌｌ－Ｃｅｌｌ Ｌｕｎｇ Ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｎ ｔｈｅ Ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ>>． Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｌｕｎｇ Ｃａｎｃｅｒ ２０ （１）： ４８－５８． ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｃｌｌｃ．２０１８．０９．０１２．
Ｎａｋａｊｉｍａ， Ｋｏｓｅｉ， Ｙｏｓｈｉｎｏｒｉ Ｉｎｏ， Ｒｉｅ Ｙａｍａｚａｋｉ－Ｉｔｏｈ， Ｃｈｉｅ Ｎａｉｔｏ， Ｍａｒｉ Ｓｈｉｍａｓａｋｉ， Ｍａｍｉ Ｔａｋａｈａｓｈｉ， Ｍｉｎｏｒｕ Ｅｓａｋｉ， ｅｔ ａｌ． ｓ． ｄ． <<ＩＡＰ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ， Ｅｍｂｅｌｉｎ ｉｎｃｒｅａｓｅｓ ＶＣＡＭ－１ ｌｅｖｅｌｓ ｏｎ ｔｈｅ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ， ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ｉｍｍｕｎｉｔｙ>>． Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ９ （１）． Ｃｏｎｓｕｌｔｅ ｌｅ １２ ｄｅｃｅｍｂｒｅ ２０２０． ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０８０／２１６２４０２Ｘ．２０２０．１８３８８１２．
Ｎｉｅｌｓｅｎ， Ｈ． Ｂｊｏｒｎ， Ｍａｔｈｉｅｕ Ａｌｍｅｉｄａ， Ａｇｎｉｅｓｚｋａ Ｓｉｅｒａｋｏｗｓｋａ Ｊｕｎｃｋｅｒ， Ｓｉｍｏｎ Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ， Ｊｕｎｈｕａ Ｌｉ， Ｓｈｉｎｉｃｈｉ Ｓｕｎａｇａｗａ， Ｄａｍｉａｎ Ｒ． Ｐｌｉｃｈｔａ， ｅｔ ａｌ． ２０１４． <<Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ Ｇｅｎｏｍｅｓ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｃｏｍｐｌｅｘ Ｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃ Ｓａｍｐｌｅｓ ｗｉｔｈｏｕｔ Ｕｓｉｎｇ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｇｅｎｏｍｅｓ>>． Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３２ （８）： ８２２－２８． ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｎｂｔ．２９３９．
Ｏｕｙａｎｇ， Ｊｉｎｇ， Ｊｏｈｎ Ｌｉｎ， Ｓｔｅｐｈａｎｅ Ｉｓｎａｒｄ， Ｂｒａｎｄｏｎ Ｆｏｍｂｕｅｎａ， Ｘｉａｏｒｏｎｇ Ｐｅｎｇ， Ａｎｄｒｅ Ｍａｒｅｔｔｅ， Ｂｅｒｔｒａｎｄ Ｒｏｕｔｙ， Ｍｅｒｉｅｍ Ｍｅｓｓａｏｕｄｅｎｅ， Ｙａｏｋａｉ Ｃｈｅｎ， ｅｔ Ｊｅａｎ－Ｐｉｅｒｒｅ Ｒｏｕｔｙ． ２０２０． <<Ｔｈｅ Ｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ Ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ： Ａ Ｓｅｎｔｉｎｅｌ ｆｏｒ Ｇｕｔ Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ Ｉｔｓ Ｒｅｌｅｖａｎｃｅ ｔｏ ＨＩＶ－Ｒｅｌａｔｅｄ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ>>． Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １１： ６４５． ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．３３８９／ｆｉｍｍｕ．２０２０．００６４５．
Ｐａｒｋｓ， Ｄ． Ｈ．， Ｉｍｅｌｆｏｒｔ， Ｍ．， Ｓｋｅｎｎｅｒｔｏｎ， Ｃ． Ｔ．， Ｈｕｇｅｎｈｏｌｔｚ， Ｐ． ＆ Ｔｙｓｏｎ， Ｇ． Ｗ． ＣｈｅｃｋＭ： ａｓｓｅｓｓｉｎｇ ｔｈｅ ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｇｅｎｏｍｅｓ ｒｅｃｏｖｅｒｅｄ ｆｒｏｍ ｉｓｏｌａｔｅｓ， ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌｓ， ａｎｄ ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅｓ． Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ ２５， １０４３-１０５５ （２０１５）．
Ｐａｚ－Ａｒｅｓ， Ｌｕｉｓ， Ａｌｅｘａｎｄｅｒ Ｌｕｆｔ， Ｄａｖｉｄ Ｖｉｃｅｎｔｅ， Ａｌｉ Ｔａｆｒｅｓｈｉ， Ｍａｈｍｕｔ Ｇｕｅｍｕｅｓ， Ｊｕｌｉｅｎ Ｍａｚｉｅｒｅｓ， Ｂａｒｂａｒａ Ｈｅｒｍｅｓ， ｅｔ ａｌ． ２０１８． <<Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ ｐｌｕｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ Ｓｑｕａｍｏｕｓ Ｎｏｎ-Ｓｍａｌｌ－Ｃｅｌｌ Ｌｕｎｇ Ｃａｎｃｅｒ>>． Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３７９ （２１）： ２０４０－５１． ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０５６／ＮＥＪＭｏａ１８１０８６５．
Ｒｅｃｋ， Ｍａｒｔｉｎ， Ｄｅｌｖｙｓ Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ－Ａｂｒｅｕ， Ａｎｄｒｅｗ Ｇ． Ｒｏｂｉｎｓｏｎ， Ｒｉｎａ Ｈｕｉ， Ｔｉｂｏｒ Ｃｓｏｅｓｚｉ， Ａｎｄｒｅａ Ｆｕｅｌｏｅｐ， Ｍａｙａ Ｇｏｔｔｆｒｉｅｄ， ｅｔ ａｌ． ２０１６． <<Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ ｖｅｒｓｕｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ＰＤ－Ｌ１-Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｎｏｎ-Ｓｍａｌｌ－Ｃｅｌｌ Ｌｕｎｇ Ｃａｎｃｅｒ>>． Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３７５ （１９）： １８２３－３３． ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０５６／ＮＥＪＭｏａ１６０６７７４．
Ｒｉａｚ， Ｎａｄｅｅｍ， Ｊｏｎａｔｈａｎ Ｊ． Ｈａｖｅｌ， Ｖｌａｄｉｍｉｒ Ｍａｋａｒｏｖ， Ａｌｅｘｉｓ Ｄｅｓｒｉｃｈａｒｄ， Ｗａｌｔｅｒ Ｊ． Ｕｒｂａ， Ｊｅｎｎｉｆｅｒ Ｓ． Ｓｉｍｓ， Ｆ． Ｓｔｅｐｈｅｎ Ｈｏｄｉ， ｅｔ ａｌ． ２０１７． <<Ｔｕｍｏｒ ａｎｄ Ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｄｕｒｉｎｇ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｗｉｔｈ Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ>>． Ｃｅｌｌ １７１ （４）： ９３４－９４９．ｅ１６． ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１７．０９．０２８．
Ｒｉｚｖｉ， Ｎａｉｙｅｒ Ａ．， Ｍａｔｔｈｅｗ Ｄ． Ｈｅｌｌｍａｎｎ， Ａｌｅｘａｎｄｒａ Ｓｎｙｄｅｒ， Ｐｉａ Ｋｖｉｓｔｂｏｒｇ， Ｖｌａｄｉｍｉｒ Ｍａｋａｒｏｖ， Ｊｏｎａｔｈａｎ Ｊ． Ｈａｖｅｌ， Ｗｉｌｌｉａｍ Ｌｅｅ， ｅｔ ａｌ． ２０１５． <<Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ． Ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｌａｎｄｓｃａｐｅ Ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｔｏ ＰＤ－１ Ｂｌｏｃｋａｄｅ ｉｎ Ｎｏｎ－Ｓｍａｌｌ Ｃｅｌｌ Ｌｕｎｇ Ｃａｎｃｅｒ>>． Ｓｃｉｅｎｃｅ （Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．） ３４８ （６２３０）： １２４－２８． ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａａａ１３４８．
Ｒｏｍａｎｏ， Ｓｔｅｆａｎｏ， Ｇｅｏｒｇｅ Ｍ． Ｓａｖｖａ， Ｊａｎｉｓ Ｒ． Ｂｅｄａｒｆ， Ｉａｎ Ｇ． Ｃｈａｒｌｅｓ， Ｆａｌｋ Ｈｉｌｄｅｂｒａｎｄ， ｅｔ Ａｒｊａｎ Ｎａｒｂａｄ． ２０２１． <<Ｍｅｔａ－Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｇｕｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ Ｓｕｇｇｅｓｔｓ Ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ Ｌｉｎｋｅｄ ｔｏ Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ>>． Ｎｐｊ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ７ （１）： １－１３． ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｓ４１５３１－０２１－００１５６－ｚ．
Ｒｏｕｔｙ， Ｂｅｒｔｒａｎｄ， Ｖａｎｃｈｅｓｗａｒａｎ Ｇｏｐａｌａｋｒｉｓｈｎａｎ， Ｒｏｍａｉｎ Ｄａｉｌｌｅｒｅ， Ｌａｕｒｅｎｃｅ Ｚｉｔｖｏｇｅｌ， Ｊｅｎｎｉｆｅｒ Ａ． Ｗａｒｇｏ， ｅｔ Ｇｕｉｄｏ Ｋｒｏｅｍｅｒ． ２０１８． <<Ｔｈｅ Ｇｕｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ ａｎｄ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｈｅａｌｔｈ>>． Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ． Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ １５ （６）： ３８２－９６． ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｓ４１５７１－０１８－０００６－２．
Ｒｏｕｔｙ， Ｂｅｒｔｒａｎｄ， Ｅｍｍａｎｕｅｌｌｅ Ｌｅ Ｃｈａｔｅｌｉｅｒ， Ｌｉｓａ Ｄｅｒｏｓａ， Ｃｏｎｎｉｅ Ｐ． Ｍ． Ｄｕｏｎｇ， Ｍａｒｙａｍ Ｔｉｄｊａｎｉ Ａｌｏｕ， Ｒｏｍａｉｎ Ｄａｉｌｌｅｒｅ， Ａｕｒｅｌｉｅ Ｆｌｕｃｋｉｇｅｒ， ｅｔ ａｌ． ２０１８． <<Ｇｕｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ Ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ＰＤ－１－Ｂａｓｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ａｇａｉｎｓｔ Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ Ｔｕｍｏｒｓ>>． Ｓｃｉｅｎｃｅ （Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．） ３５９ （６３７１）： ９１－９７． ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａａｎ３７０６．
Ｒｕｕｓｕｎｅｎ， Ａｎｕ， Ｔｅｔｙａｎａ Ｒｏｃｋｓ， Ｆｅｌｉｃｅ Ｊａｃｋａ， ｅｔ Ａｍｙ Ｌｏｕｇｈｍａｎ． ２０１９． <<Ｔｈｅ ｇｕｔ ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ ｉｎ ａｎｏｒｅｘｉａ ｎｅｒｖｏｓａ： ｒｅｌｅｖａｎｃｅ ｆｏｒ ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ ｒｅｈａｂｉｌｉｔａｔｉｏｎ>>． Ｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ２３６ （５）： １５４５－５８． ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００７／ｓ００２１３－０１８－５１５９－２．
Ｓａｎｔｏｒｏ， Ａｕｒｅｌｉａ， Ｒｉｔａ Ｏｓｔａｎ， Ｍａｒｃｏ Ｃａｎｄｅｌａ， Ｅｌｅｎａ Ｂｉａｇｉ， Ｐａｔｒｉｚｉａ Ｂｒｉｇｉｄｉ， Ｍｉｒｉａｍ Ｃａｐｒｉ， ｅｔ Ｃｌａｕｄｉｏ Ｆｒａｎｃｅｓｃｈｉ． ２０１８． <<Ｇｕｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ Ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｅｘｔｒｅｍｅ Ｄｅｃａｄｅｓ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｌｉｆｅ： Ａ Ｆｏｃｕｓ ｏｎ Ｃｅｎｔｅｎａｒｉａｎｓ>>． Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ： ＣＭＬＳ ７５ （１）： １２９－４８． ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００７／ｓ０００１８－０１７－２６７４－ｙ．
Ｓｅｇａｔａ， Ｎｉｃｏｌａ， Ｊａｃｑｕｅｓ Ｉｚａｒｄ， Ｌｅｖｉ Ｗａｌｄｒｏｎ， Ｄｉｒｋ Ｇｅｖｅｒｓ， Ｌａｒｉｓａ Ｍｉｒｏｐｏｌｓｋｙ， Ｗｅｎｄｙ Ｓ． Ｇａｒｒｅｔｔ， ｅｔ Ｃｕｒｔｉｓ Ｈｕｔｔｅｎｈｏｗｅｒ． ２０１１． <<Ｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ａｎｄ Ｅｘｐｌａｎａｔｉｏｎ>>． Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ １２ （６）： Ｒ６０． ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１８６／ｇｂ－２０１１－１２－６－ｒ６０．
Ｓｅｏ， Ｓａｎｇ Ｗｏｏ， Ｄｏｎｇｈｙｕｋ Ｋｉｍ， Ｒｉｃｈａｒｄ Ｓｚｕｂｉｎ， ｅｔ Ｂｅｒｎｈａｒｄ Ｏ． Ｐａｌｓｓｏｎ． ２０１５． <<Ｇｅｎｏｍｅ－Ｗｉｄｅ Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＯｘｙＲ ａｎｄ ＳｏｘＲＳ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｎｅｔｗｏｒｋｓ ｕｎｄｅｒ Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ Ｓｔｒｅｓｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ Ｃｏｌｉ Ｋ－１２ ＭＧ１６５５>>． Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ １２ （８）： １２８９－９９． ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｒｅｐ．２０１５．０７．０４３．
Ｓｈｉ， Ｌｉｎｌｉｎ， Ｊｉａｎｙｏｎｇ Ｓｈｅｎｇ， Ｇｕｏｚｈｏｎｇ Ｃｈｅｎ， Ｐｅｎｇ Ｚｈｕ， Ｃｈａｎｇｐｉｎｇ Ｓｈｉ， Ｂｅｉ Ｌｉ， Ｃｈａｉｗｏｏ Ｐａｒｋ， ｅｔ ａｌ． ２０２０． <<Ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ ＩＬ－２－Ｂａｓｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｗｉｔｈ Ｃｏｍｍｅｎｓａｌ Ｐｒｏｂｉｏｔｉｃｓ Ｐｒｏｄｕｃｅｓ Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ Ｉｍｍｕｎｅ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ ａｎｄ Ｔｕｍｏｒ Ｃｌｅａｒａｎｃｅ>>． Ｊｏｕｒｎａｌ ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ ８ （２）． ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１３６／ｊｉｔｃ－２０２０－０００９７３．
Ｓｈｏｎｏ， Ｙｕｓｕｋｅ， Ｍｅｌｉｓｓａ Ｄ． Ｄｏｃａｍｐｏ， Ｊｏｎａｔｈａｎ Ｕ． Ｐｅｌｅｄ， Ｓｕｅｌｅｎ Ｍ． Ｐｅｒｏｂｅｌｌｉ， Ｅｎｒｉｃｏ Ｖｅｌａｒｄｉ， Ｊｅｎｎｉｆｅｒ Ｊ． Ｔｓａｉ， Ａｎｎ Ｅ． Ｓｌｉｎｇｅｒｌａｎｄ， ｅｔ ａｌ． ２０１６． <<Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ＧＶＨＤ－Ｒｅｌａｔｅｄ Ｍｏｒｔａｌｉｔｙ ｗｉｔｈ Ｂｒｏａｄ－Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ Ｕｓｅ ａｆｔｅｒ Ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｐａｔｉｅｎｔｓ ａｎｄ Ｍｉｃｅ>>． Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ８ （３３９）： ３３９ｒａ７１． ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１２６／ｓｃｉｔｒａｎｓｌｍｅｄ．ａａｆ２３１１．
Ｓｍｙｔｈ， Ｍａｒｋ Ｊ．， Ｓｈｉｎ Ｆｏｏｎｇ Ｎｇｉｏｗ， Ａｎｔｏｎｉ Ｒｉｂａｓ， ｅｔ Ｍｉｃｈｅｌｅ Ｗ． Ｌ． Ｔｅｎｇ． ２０１６． <<Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｉｅｓ Ｔａｉｌｏｒｅｄ ｔｏ ｔｈｅ Ｔｕｍｏｕｒ Ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ>>． Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ． Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ １３ （３）： １４３－５８． ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｎｒｃｌｉｎｏｎｃ．２０１５．２０９．
Ｓｐｒａｎｇｅｒ， Ｓｔｅｆａｎｉ， Ｒｉｙｕｅ Ｂａｏ， ｅｔ Ｔｈｏｍａｓ Ｆ． Ｇａｊｅｗｓｋｉ． ２０１５． <<Ｍｅｌａｎｏｍａ－Ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ β－Ｃａｔｅｎｉｎ Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ Ｐｒｅｖｅｎｔｓ Ａｎｔｉ－Ｔｕｍｏｕｒ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ>>． Ｎａｔｕｒｅ ５２３ （７５５９）： ２３１－３５． ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１４４０４．
Ｔｓａｙ， Ｊｕｎ－Ｃｈｉｅｈ Ｊ．， Ｂｅｎｊａｍｉｎ Ｇ． Ｗｕ， Ｉｍｒａｎ Ｓｕｌａｉｍａｎ， Ｋａｔｈｅｒｉｎｅ Ｇｅｒｓｈｎｅｒ， Ｒｏｓｅｍａｒｙ Ｓｃｈｌｕｇｅｒ， Ｙｏｎｇｈｕａ Ｌｉ， Ｔｉｎｇ－Ａｎ Ｙｉｅ， ｅｔ ａｌ． ２０２０． <<Ｌｏｗｅｒ Ａｉｒｗａｙ Ｄｙｓｂｉｏｓｉｓ Ａｆｆｅｃｔｓ Ｌｕｎｇ Ｃａｎｃｅｒ Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ>>． Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ， ｎｏｖｅｍｂｒｅ． ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１５８／２１５９－８２９０．ＣＤ－２０－０２６３．
Ｖｅｔｉｚｏｕ， Ｍａｒｉｅ， Ｊｏｎａｔｈａｎ Ｍ． Ｐｉｔｔ， Ｒｏｍａｉｎ Ｄａｉｌｌｅｒｅ， Ｐａｔｒｉｃｉａ Ｌｅｐａｇｅ， Ｎａｄｉｎｅ Ｗａｌｄｓｃｈｍｉｔｔ， Ｃａｒｏｌｉｎｅ Ｆｌａｍｅｎｔ， Ｓｙｌｖｉｅ Ｒｕｓａｋｉｅｗｉｃｚ， ｅｔ ａｌ． ２０１５． <<Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｂｙ ＣＴＬＡ－４ Ｂｌｏｃｋａｄｅ Ｒｅｌｉｅｓ ｏｎ ｔｈｅ Ｇｕｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ>>． Ｓｃｉｅｎｃｅ （Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．） ３５０ （６２６４）： １０７９－８４． ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａａｄ１３２９．
Ｗｕ， Ｗｅｎｒｕｉ， Ｌｏｎｇｘｉａｎ Ｌｖ， Ｄｉｎｇ Ｓｈｉ， Ｊｉａｎｚｈｏｎｇ Ｙｅ， Ｄａｉｑｉｏｎｇ Ｆａｎｇ， Ｆｅｉｆｅｉ Ｇｕｏ， Ｙａｔｉｎｇ Ｌｉ， Ｘｉｎｇｋａｎｇ Ｈｅ， ｅｔ Ｌａｎｊｕａｎ Ｌｉ． ２０１７． <<Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ Ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ ａｇａｉｎｓｔ Ｉｍｍｕｎｅ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｌｉｖｅｒ Ｉｎｊｕｒｙ ｉｎ ａ Ｍｏｕｓｅ Ｍｏｄｅｌ>>． Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ８： １８０４． ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．３３８９／ｆｍｉｃｂ．２０１７．０１８０４．
Ｙｅ， Ｊ． ｅｔ ａｌ． Ｐｒｉｍｅｒ－ＢＬＡＳＴ： ａ ｔｏｏｌ ｔｏ ｄｅｓｉｇｎ ｔａｒｇｅｔ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｉｍｅｒｓ ｆｏｒ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ． ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ １３， １３４ （２０１２）．
Ｙｏｕｎｇ， Ａｒａｂｅｌｌａ， Ｓｈｉｎ Ｆｏｏｎｇ Ｎｇｉｏｗ， Ｄｅｂｏｒａｈ Ｓ． Ｂａｒｋａｕｓｋａｓ， Ｅｒｉｎ Ｓｕｌｔ， Ｃａｒｌ Ｈａｙ， Ｓｔｅｐｈｅｎ Ｊ． Ｂｌａｋｅ， Ｑｉｈｕｉ Ｈｕａｎｇ， ｅｔ ａｌ． ２０１６． <<Ｃｏ－Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ＣＤ７３ ａｎｄ Ａ２ＡＲ Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｉｍｐｒｏｖｅｓ Ａｎｔｉ－Ｔｕｍｏｒ Ｉｍｍｕｎｅ Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ>>． Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ３０ （３）： ３９１－４０３． ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｃｃｅｌｌ．２０１６．０６．０２５．
Ｚｈｏｕ， Ｑｉ， Ｙａｎｆｅｎｇ Ｚｈａｎｇ， Ｘｉａｏｘｉａ Ｗａｎｇ， Ｒｕｉｙｕｅ Ｙａｎｇ， Ｘｉａｏｑｕａｎ Ｚｈｕ， Ｙｉｎｇ Ｚｈａｎｇ， Ｃｈｅｎ Ｃｈｅｎ， Ｈｕｉｐｉｎｇ Ｙｕａｎ， Ｚｅ Ｙａｎｇ， ｅｔ Ｌｉａｎｇ Ｓｕｎ． ２０２０． <<Ｇｕｔ ｂａｃｔｅｒｉａ Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｒｅｄｕｃｅｄ ｒｉｓｋ ｏｆ ｏｂｅｓｉｔｙ： ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｇｕｔ Ｐｒｏｊｅｃｔ>>． Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ ＆ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ １７ （１）： ９０． ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１８６／ｓ１２９８６－０２０－００５１６－１．

Claims (17)

1. がん患者が免疫チェックポイント阻害剤（ＩＣＩ）に基づく療法に対する良いレスポンダーであるかどうかを判断するインビトロセラノスティクス法であって、前記患者からのサンプル中でアッカーマンシア属の細菌の相対量を測定することを含み、アッカーマンシア属の前記細菌が所定の閾値未満で存在することが、前記患者がＩＣＩに基づく前記療法に対する良いレスポンダーである可能性が大きいことを示している方法。
2. 所定の閾値を超えるアッカーマンシア属の細菌の存在が、ＩＣＩに基づく療法にもかかわらず悪い予後であることを示している、請求項１に記載の方法。
3. あるがん患者がＩＣＩに基づく療法の投与前に細菌補償を必要とするかどうかを判断する方法であって、前記患者からのサンプル中でアッカーマンシア属の細菌の相対量を測定することを含み、
   （ｉ）アッカーマンシアが前記サンプル中に存在しない場合には、前記患者は、ＩＣＩ投与の前に少なくともアッカーマンシア属の細菌を用いた細菌補償を必要とし；
   （ｉｉ）アッカーマンシア属の細菌が所定の閾値未満で前記サンプル中に存在する場合には、前記患者はＩＣＩ投与の前にいかなる細菌補償も必要とせず；
   （ｉｉｉ）アッカーマンシア属の細菌が所定の閾値を超えて前記サンプル中に存在する場合、特にこの過剰な存在が、抗生物質曝露の結果である、および／またはガンマプロテオバクテリア綱および／またはデスルホビブリオ科に属する種の過剰な存在に関係する場合には、前記患者は、多微生物共同体を用いた細菌補償、および／または健康な個人からの、またはＩＣＩに基づく前記療法にうまく応答したがん患者からの糞便微生物移植（ＦＭＴ）を通じた細菌補償を必要とする、方法。
4. ある個人が腸内微生物叢ディスバイオシスを持つかどうかを判断する方法であって、前記個人からのサンプル中でアッカーマンシア属の細菌の相対量を測定することを含み、アッカーマンシア属の前記細菌の存在が所定の閾値未満であることが、腸内微生物叢ディスバイオシスが存在していないことを示している方法。
5. アッカーマンシア・ムシニフィラ（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）および／またはアッカーマンシアＳＧＢ９２２８の相対量を測定して少なくとも１つの所定の閾値と比較する、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
6. 前記所定の閾値が１と１０％の間の相対量に対応する、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
7. 前記所定の閾値が３と６．５％の間の相対量に対応する、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
8. ＩＣＩに基づく前記療法が、抗ＰＤ１／ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２ Ａｂに基づく療法である、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
9. 前記患者が非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）または腎臓がんを患っている、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。
10. 前記患者が非扁平上皮ＮＳＣＬＣを患っている、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。
11. ＩＣＩに基づく前記療法が第１選択療法または第２選択療法として投与される、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。
12. 前記患者または個人からのサンプルが、糞便サンプル、前記患者または個人からの大腸または回腸管腔の内容物からのサンプル、または前記患者または個人からの粘膜生検である、請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法。
13. 自らの腸内微生物叢にアッカーマンシアが過剰に存在するがん患者の治療用であり、ＩＣＩに基づく療法と組み合わせて使用される糞便微生物組成物。
14. 自らの腸内微生物叢にアッカーマンシアを持たないがん患者の治療用であり、ＩＣＩに基づく療法と組み合わせて使用される、アッカーマンシア属の細菌を含む細菌組成物。
15. アッカーマンシア属の前記細菌がアッカーマンシアＳＧＢ９２２８である、請求項１３または１４に記載の利用のための請求項１３または１４に記載の糞便微生物組成物または細菌組成物。
16. 前記患者が非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）または腎臓がんを患っている、請求項１３または１４に記載の利用のための請求項１３～１５のいずれか１項に記載の糞便微生物組成物または細菌組成物。
17. 前記患者が非扁平上皮ＮＳＣＬＣを患っている、請求項１３に記載の利用のための請求項１３～１５のいずれか１項に記載の糞便微生物組成物または細菌組成物。