NO342054B1 - Antistoffer til madcam, farmasøytisk sammensetning inneholdende et slikt antistoff samt anvendelse derav. - Google Patents

Abstract

Foreliggende oppfinnelse vedrører antistoffer inklusive humane antistoffer og antigenbindende deler derav som spesifikt bindes til MAdCAM, fortrinnsvis humant MAdCAM, og som virker ved å hemme MAdCAM. Oppfinnelsen vedrører også humane anti-MAdCAM-antistoffer og antigenbindende deler derav. Oppfinnelsen vedrører også antistoffer som er kimære, bispesifikke, derivatisert, enkeltkjedede antistoffer eller deler av fusjonsproteiner. Oppfinnelsen vedrører også isolerte tung- og lettkjedede immunoglobuliner avledet fra humane anti-MAdCAM-antistoffer og nukleinsyremolekyler som koder slike immunoglobuliner. Foreliggende oppfinnelse vedrører også metoder for å fremstille humane anti-MAdCAM-antistoffer, sammensetninger omfattende disse antistoffer og metoder for å anvende antistoffene og sammensetningene for diagnose og behandling. Oppfinnelsen tilveiebringer også genterapeutiske metoder ved å anvende nukleinsyremolekyler som koder de tunge og/eller lette immunoglobulinmolekyler som utgjør de humane anti-MAdCAM-antistoffer. Oppfinnelsen vedrører også transgene dyr eller planter omfattende nukleinsyremolekyler ifølge oppfinnelsen.

Description

BAKGRUNNEN FOR OPPFINNELSEN

Det mukosale addressin-celleadhesjonsmolekyl (MAdCAM) er etmedlem av immunoglobulinsuperfamilien av celleadhesjonsreseptorer. Selektiviteten av lymfocyttmålsøking overfor spesialisert lymfoid vev og mukosale seter av det gastrointestinale system bestemmes av den endotele ekspresjon av MAdCAM (Berlin, C. et al., Cell, 80:413-422(1994); Berlin,C. et al., Cell, 74:185-195 (1993); og Erle, D.J. et al.,J. Immunol., 153: 517-528 (1994)). MAdCAM er entydigdefinert på celleoverflaten av høy-endotele venuler avorganisk intestinalt lymfevev, så som Peyers lapper og mesenteriske lymfeknuter (Streeter et al., Nature, 331:41-6(1988); Nakache et al., Nature, 337:179-81 (1989); Briskinet al.. Am. J. Pathol. 151-97-110 (1997)), men også i andrelymfoide organer, så som pankreas, galleblæren og miltvenulene og den marginale sinus av miltens hvite pulpa (Briskin et al. (1997), supra; Kraal et al.. Am. J. Path., 147: 763-771 (1995)).

Mens MAdCAM spiller en fysiologisk rolle i tarmenes immunovervåkning, synes det å gi usedvanlig stor lymfocyttutskillelse ved inflammatorisk tarmsykdom under tilstander av kronisk betennelse i det gastrointestinale system. TNFa og andre pro-inflammatoriske cytokiner øker endotel MAdCAMekspresjon, og i biopsi-prøver tatt fra pasienter medCrohns sykdom og ulcerøs kolitt er der en tilnærmet 2-3ganger fokal økning i MAdCAM-ekspresjonen ved seter medinflammasjon (Briskin et al. (1997), Souza et al.. Gut, _45_:856-63 (1999); Arihiro et al., Pathol Int., 52:367-74(2002)). Lignende mønster med forhøyet ekspresjon er blitt iakttatt i eksperimentelle modeller for kolitt (Hesterberg et al., Gastroenterology, 111:1373-1380 (1997); Picarellaet al., J. Immunol., 158: 2099-2106 (1997); Connor et al.,J Leukoc Biol., 65:349-55 (1999); Kato et al., J PharmacolExp Ther., 295:183-9 (2000); Hokari et al., Clin ExpImmunol., 26:259-65 (2001); Shigematsu et al.. Am J PhysiolGastrointest Liver Physiol., 281:G1309-15 (2001)). I andre

pre-kliniske modeller for inflammatoriske tilstander, såsom insulin-avhengig diabetes (Yang et al. Diabetes,46:1542-7 (1997); Hånninen et al., J Immunol., 160:6018-25(1998)), immunologisk reaksjon fra et transplantat mot vertsorganismen (Fujisaki et al., Scog J Gastroenterol., 38:437-42 (2003), Murai et al.. Nat Immunol., 4:154-60(2003)), kronisk leversykdom (Hillan et al.. Liver, 19:50918 (1999); Grant et al., Hepatology, 33:1065-72 (2001)),inflammatorisk encefalopati (Stalder et al.. Am J Pathol., 153:767-83 (1998); Kanawar et al., Immunol Cell Biol.,78:641-5 (2000)), og gastritt (Barrett et al., J LeukocBiol., 67:169-73 (2000); Hatanaka et al., Clin ExpImmunol., 130:183-9 (2002)), det er også gjenoppvekking avføtal MAdCAM-ekspresjon og deltakelse av aktivertecljP?"1" lymfocytter i sykdomsspatogenese. I disse inflammatoriske modeller samt hapten-mediert (f.eks. TNBS,DSS, etc.) eller adoptivt overførte (CD4+CD45Rbhigh) musekolittiske modeller, reduserer rottens anti-murine MAdCAMmonoklonale antistoff (mAb), MECA-367, som blokkererbindingen av O(.4P7+ lymfocytter til MAdCAM, lymfocyttrekrutteringen, vev-ekstravasjonen, inflammasjonen ogsykdommens alvor. Murine monoklonale antistoffer (mAbs) mot humant MAdCAM er også blitt rapportert (se f.eks. WO 96/24673 og WO 99/58573). Fra US 6551593 Bl og WO 0178779 A2 er det kjent bruk av MAdCAM til behandling av sykdommer i mage-tarm-kanalen.

Under de gitte omstendigheter med MAdCAMs rolle i inflammatorisk tarmsykdom (IBD) og andre inflammatoriske sykdommer forbundet med det gastrointestinale system eller andre vev, er et middel for å hemme «ufhbinding og MAdCAMmediert leukocyttrekruttering ønskelig. Videre ville det være ønskelig å ha et slikt terapeutisk middel med fordelaktige egenskaper inklusive fravær av uønskede vekselvirkningen med andre medisineringen i pasienter og gunstige fysiko-kjemiske egenskaper så som pK/pD-verdier imennesker, oppløselighet, stabilitet, holdbarhet og halveringstid in vivo. Et terapeutisk protein, så som et

antistoff, ville med fordel være fritt for posttranslasjonsmodifikasjoner eller aggregatdannelse. Følgelig foreligger et meget stort behov for terapeutiske antiMAdCAM-antistoffer.

OPPSUMMERING AV OPPFINNELSEN

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer et isolert monoklonalt antistoff eller antigen-bindende del derav somspesifikt binder MAdCAM og hemmer MAdCAM-binding til «4(37som angitt i krav 1, hvori i det minste CDR-sekvensene avnevnte antistoff er humane CDR-sekvenser. I noen utførelserer antistoffet et humant antistoff, fortrinnsvis et antistoff som virker som en MAdCAM-antagonist. Ogsåtilveiebringes sammensetninger omfattende nevnte antistoffer eller deler.

Oppfinnelsen tilveiebringer også en sammensetning omfattende den tunge og/eller lette kjede av nevnte antiMAdCAM-antagonist-antistoff eller den variable region ellerannen antigen-bindende del derav som angitt i krav 9 ellernukleinsyremolekyler som angitt i krav 14 som koder enhver av de ovennevnte antistoffer. Sammensetningene ifølge oppfinnelsen kan videre omfatte en annen komponent, så som et terapeutisk middel eller et diagnostisk middel.

Oppfinnelsen tilveiebringer videre en isolert cellelinje, som frembringer nevnte anti-MAdCAM-antistoff eller antigenbindende del derav.

Oppfinnelsen tilveiebringer også nukleinsyremolekyler som koder den tunge og/eller lette kjede av nevnte anti-MAdCAMantistoff eller den variable region derav eller antigenbindende del derav.

Oppfinnelsen tilveiebringer vektorer og vertsceller omfattende nevnte nukleinsyremolekyler, samt metoder for rekombinant å frembringe polypeptidene kodet av nuklein

syremolekylene ved dyrking av slike celler som angitt i krav 17 .

Ikke-humane transgene dyr eller planter som uttrykker dentunge og/eller lette kjede av nevnte anti-MAdCAM-antistoffeller antigen-bindende del derav, tilveiebringes også.

KORT BESKRIVELSE AV TEGNINGENE

Figur 1 er en linjestilling av de predikerte aminosyresekvenser av de tunge og kappa-lette kjedede variableregioner av tolv humane anti-MAdCAM-monoklonale antistoffermed kimlinje-aminosyresekvensene av de tilsvarende humanegener.

Figur IA viser en linjestilling av den predikerte aminosyresekvens av den tunge kjede for antistoffene 1.7.2 og 1.8.2 med kimlinjens humane VH 3-15-genprodukt.

Figur IB viser en linjestilling av den predikerte aminosyresekvens av den tunge kjede for antistoff 6.14.2 med kimlinjens humane VH 3-23-genprodukt.

Figur 1C viser en linjestilling av den predikerte aminosyresekvens av den tunge kjede for antistoff 6.22.2 med kimlinjens humane VH 3-33-genprodukt.

Figur ID viser en linjestilling av den predikerte aminosyresekvens av den tunge kjede for antistoff 6.34.2 med kimlinjens humane VH 3-30-genprodukt

Figur 1E viser en linjestilling av den predikerte aminosyresekvens av den tunge kjede for antistoff 6.67.1 med kimlinjens humane VH 4-4-genprodukt.

Figur 1F viser en linjestilling av den predikerte aminosyresekvens av den tunge kjede for antistoff 6.73.2 med kimlinjens humane VH 3-23-genprodukt.

Figur 1G viser en linjestilling av den predikerte aminosyresekvens av den tunge kjede for antistoff 6.77.1 med kimlinjens humane VH 3-21-genprodukt.

Figur 1H viser en linjestilling av den predikerte aminosyresekvens av den tunge kjede for antistoffene 7.16.6 og 7.26.4 med kimlinjens humane VH 1-18-genprodukt.

Figur II viser en linjestilling av den predikerte aminosyresekvens av den tunge kjede for antistoff 7.20.5 med kimlinjens humane VH 4-4-genprodukt.

Figur 1J viser en linjestilling av den predikerte aminosyresekvens av den tunge kjede for antistoff 9.8.2 med kimlinjens humane VH 3-33-genprodukt.

Figur 1K viser en linjestilling av den predikerte aminosyresekvens av den lette kappa-kjede for antistoffene 1.7.2og 1.8.2 med kimlinjens humane A3-genprodukt.

Figur IL viser en linjestilling av den predikerte aminosyresekvens av den lette kappa-kjede for antistoff 6.14.2med kimlinjens humane 012-genprodukt.

Figur 1M viser en linjestilling av den predikerte aminosyresekvens av den lette kappa-kjede for antistoff6.22.2 med kimlinjens humane A26-genprodukt.

Figur IN viser en linjestilling av den predikerte aminosyresekvens av den lette kappa-kjede for antistoff 6.34.2med kimlinjens humane 012-genprodukt.

Figur 10 viser en linjestilling av den predikerte aminosyresekvens av den lette kappa-kjede for antistoff 6.67.1med kimlinjens humane B3-genprodukt.

Figur 1P viser en linjestilling av den predikerte aminosyresekvens av den lette kappa-kjede for antistoff 6.73.2med kimlinjens humane 012-genprodukt.

Figur IQ viser en linjestilling av den predikerte aminosyresekvens av den lette kappa-kjede for antistoff 6.77.1med kimlinjens humane A2-genprodukt.

Figur IR viser en linjestilling av den predikerte aminosyresekvens av den lette kappa-kjede for antistoffene7.16.6 og 7.26.4 med kimlinjens humane A2-genprodukt.

Figur IS viser en linjestilling av den predikerte aminosyresekvens av den lette kappa-kjede for antistoff 7.20.5med kimlinjens humane A3-genprodukt.

Figur IT viser en linjestilling av den predikerte aminosyresekvens av den lette kappa-kjede for antistoff 9.8.2med kimlinjens humane 018-genprodukt.

Figur 2 er CLUSTAL-linjestillinger av de predikerte tungog kappa-lett-kjedede aminosyresekvenser av humane antiMAdCAM-antistoffer.

Figur 2A er en CLUSTAL-linjestilling og radialtre av depredikerte kappa-lettkjedede aminosyresekvenser, som visergraden av likhet mellom anti-MAdCAM-antistoffets kappalette kjeder.

Figur 2B er en CLUSTAL-linjestilling og radialtre av depredikerte tunge aminosyresekvenser, som viser graden av likhet mellom anti-MAdCAM-antistoffets tunge kjeder.

Figur 3 er en aminosyresekvensisk CLUSTAL-linjestilling avde 2 N-terminale domener av cynomolgus- og human-MAdCAM somdanner det ogfh-bindende domene. Ø-strengene er linjestilti henhold til Tan et al., Structure (1998) 6:793-801.

Figur 4 er et diagram som representerer dosevirkningene av renset biotinylert 1.7.2 og 7.16.6 på adhesjonen av humane perifere blodlymfocytter til seksjoner av MAdCAMuttrykkende frossent humant leverendotelium.

Figur 5 viser en to-dimensjonal grafisk fremstilling basertpå dataene opptatt i Tabell 7 av mangfoldet av MAdCAMepitoper som anti-MAdCAM-antistoffene 1.7.2, 6.22.2,6.34.2, 6.67.1, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2 binder. Anti-MAdCAM-antistoffer innenfor den samme sirkelviser det samme reaktivitetsmønster, hører til i samme epitopklasse og vil sannsynligvis gjenkjenne den samme epitop på MAdCAM. Anti-MAdCAM-antistoffkloner innenforoverlappende sirkler er ute av stand til å bindes simultant og vil derfor sannsynligvis gjenkjenne en overlappende epitop på MAdCAM. Ikke-integrerende sirkler representereranti-MAdCAM-antistoffkloner med tydelig romlig epitopseparasj on.

Figur 6 viser sandwich-ELISA-data med anti-MAdCAM-antistoff1.7.2 og Alexa 488-merket 7.16.6, som viser at to antistoffer som er i stand til å påvise forskjellige epitoper på MAdCAM, vil kunne anvendes til å påvise løselig MAdCAM for diagnostiske formål.

Figur 7 viser virkningen av et hemmende anti-MAdCAMantistoff (1 mg/kg) på antallet av sirkulerende perifere O(.4P7+-lymfocytter, uttrykt som en fold-økning i forhold tilkontroll-IgG2a mAb eller vehikkel, under anvendelse avanti-MAdCAM mAb 7.16.6 i en cynomolgus-apemodell.

DETALJERT BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN

Definisjoner og generelle teknikker

Hvis intet annet er definert heri, skal vitenskapelige og tekniske uttrykk anvendt i forbindelse med foreliggende oppfinnelse ha betydningene som vanligvis forstås av

personer med ordinære kunnskaper i faget. Videre, hvis intet annet kreves i sammenhengen, skal entallsuttrykk omfatte flertall, og flertallsuttrykk skal omfatte entall. Generelt er nomenklaturer anvendt i forbindelse med, og teknikker i, celle- og vevkultur, molekylbiologi, immunologi, mikrobiologi, genetikk, protein- og nukleinsyrekjemiog hybridisering beskrevet heri, de nomenklaturer som er velkjent og vanlige å anvende i faget. Metodene og teknikkene i foreliggende oppfinnelse utføres generelt i henhold til konvensjonelle metoder som er velkjent i faget, og som er beskrevet i forskjellige generelle og mer spesifikke referanser som er angitt og omtalt gjennom hele foreliggende beskrivelse, hvis intet annet er sagt. Se f.eks. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed.. Gold Spring Harbor Laboratory Press, Gold Spring Harbor, N.Y. (1989) og Ausubel et al., Current Protocols i Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992), og Harlow og Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Gold Spring Harbor Laboratory Press, Gold Spring Harbor, N.Y. (1990). Enzymatiske reaksjoner og renseteknikker er utført i henhold til fabrikantens beskrivelse, som vanligvis oppnådd i faget eller som beskrevet heri. Standardteknikker er anvendt for kjemiske synteser, kjemiske analyser, farmasøytisk fremstilling, formulering og leveranse og behandling av pasienter.

Følgende uttrykk skal, hvis intet annet er sagt, forstås å ha følgende betydningen:

Uttrykket "polypeptid" omfatter naturlige eller kunstige proteiner, proteinfragmenter og polypeptidanaloger av en proteinsekvens. Et polypeptid kan være av monomer- ellerpolymertype.

Uttrykket "isolert protein" eller "isolert polypeptid" er et protein eller polypeptid som i kraft av sin opprinnelse eller opprinnelseskilde (1) ikke er forbundet med naturlig forbundne komponenter som følger med i sin naturlige

tilstand, (2) er fritt for andre proteiner fra den samme art (3) er uttrykt av en celle fra en forskjellig art, eller (4) opptrer ikke i naturen. Således vil et polypeptid som er kjemisk syntetisert eller syntetisert i et cellesystem som er forskjellig fra cellen som det naturlig skriver seg fra, være "isolert" fra sine naturlig forbundne komponenter. Et protein kan også være gjort hovedsakelig fritt for naturlig forbundne komponenter ved isolering, under anvendelse av proteinrenseteknikker som er velkjent i faget.

Et protein eller polypeptid er "hovedsakelig rent," "hovedsakelig homogent" eller "hovedsakelig renset" når minst omkring 60 til 75% av en prøve utviser en eneste art av polypeptid. Polypeptidet eller proteinet kan være monomert eller multimert. Et hovedsakelig rent polypeptid eller protein vil normalt omfatte omkring 50%, 60%, 70%, 80% eller 90% W/W av en proteinprøve, mer vanlig omkring 95%, og fortrinnsvis vil det være over 99% rent. Proteinrenhet eller homogenitet kan angis på flere måter som er velkjent i faget, så som polyakrylamidgel-elektroforese aven proteinprøve, etterfulgt av visualisering av et enkelt polypeptidbånd etter farving av gelen med et farvestoff som er velkjent i faget. For visse formål kan høyere resolusjon tilveiebringes ved å anvende HPLC eller andre midler som er velkjent i faget for rensing.

Uttrykket "polypeptid-fragment" som anvendt heri, refererertil et polypeptid som har en amino-terminal og/ellerkarboksy-terminal sletting, men hvor den gjenværende aminosyresekvens er identisk med de tilsvarende stillinger i den naturlig forekommende sekvens. I noen utførelser er fragmentene minst 5, 6, 8 eller 10 aminosyrer lange. I andre utførelser er fragmentene minst 14 aminosyrer lange, mer foretrukket minst 20 aminosyrer lange, vanligvis minst 50 aminosyrer lange, enda mer foretrukket minst 70, 80, 90, 100, 150 eller 200 aminosyrer lange.

Uttrykket "polypeptid-analog" som er anvendt heri,refererer til et polypeptid som omfatter et segment på minst 25 aminosyrer som har betydelig identitet med en andel av en aminosyresekvens, og som har minst én av følgende egenskaper: (1) spesifikk binding til MAdCAM under passende bindingsbetingelser, (2) evne til å hemme ogØ?integrin- og/eller L-selektin-binding til MAdCAM, eller (3)evne til å redusere MAdCAM-celleoverflate-ekspresjon invitro eller in vivo. Normalt omfatter polypeptidanaloger en konservativ aminosyresubstitusjon (eller innsetting eller sletting) med hensyn til den naturlig forekommende sekvens. Analogene er normalt minst 20 aminosyrer lange, fortrinnsvis minst 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150 eller 200 aminosyrer lange eller lenger, og kan ofte være så lange som et fulllengdet naturlig forekommende polypeptid.

Foretrukne aminosyresubstitusjoner er de som: (1) reduserer mottageligheten for proteolyse, (2) reduserer mottageligheten for oksidasjon, (3) endrer bindingsaffiniteten for å danne proteinkomplekser, (4) endrer bindingsaffinitetene, eller (5) gir eller modifiserer andre fysikokjemiske eller funksjonelle egenskaper hos slike analoger. Analogene kan omfatte forskjellige muteiner av en sekvens som ikke er den naturlig forekommende peptidsekvens. For eksempel kan enkle eller multiple aminosyresubstitusjoner (fortrinnsvis konservative aminosyresubstitusjoner) være gjort i den naturlig forekommende sekvens (fortrinnsvis i andelen av polypeptidet utenfor domenet(domenene) som danner intermolekylære kontakter. En konservativ aminosyresubstitusjon bør hovedsakelig ikke endre de strukturelle karakteristikker hos opphavssekvensen (f.eks. en erstatningsaminosyre bør ikke ha en tendens til å bryte en spiral som opptrer i opphavssekvensen, eller splitte andre typer av sekundærstruktur som karakteriserer opphavssekvensen). Eksempler på art-gjenkjente polypeptidiske sekundære ogtertiære strukturer er beskrevet i Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed., W. H. Freeman and Company, New York (1984)); Introduction to Protein

Structure (C. Brogen og J. Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N.Y. (1991)); og Thornton et al., Nature, 354:105 (1991).

Ikke-peptidiske analoger anvendes vanligvis i den farmasøytiske industri som medisiner med egenskaper som er analoge med egenskapene hos modellpeptidet. Disse typer av ikke-peptidisk forbindelse kalles "peptidmimetika" eller"peptidomimetika". Fauchere, J. Adv. Drug Res., 15:29(1986); Veber and Freidinger, TINS, s. 392(1985); og Evans et al., J. Med. Chem., 30:1229(1987). Slike forbindelser er ofte utviklet ved hjelp av databehandlet molekylmodellering. Peptidmimetika som strukturelt ligner terapeutisk nyttige peptider, kan anvendes til fremkalle en ekvivalent terapeutisk eller profylaktisk virkning. Generelt ligner peptidomimetika strukturelt et paradigmapolypeptid (dvs. et polypeptid som har en ønsket biokjemisk egenskap eller farmakologisk aktivitet), så som et humant antistoff, men har en eller flere peptidbindinger valgfritt erstattet av en binding så som: -CH2NH-, -CH2S-, -CH2-CH2-,-CH=CH- (cis og trans), -COCH2-, -CH(OH)CH2-, og -CH2SO-,ved metoder som er velkjent i faget. Systematisk substitusjon av én eller flere aminosyrer av en konsensussekvens med en D-aminosyre av den samme type(f.eks. D-lysin istedenfor L-lysin) kan også anvendes til ågenerere mer stabile peptider. I tillegg kan fremtvungne peptider omfattende en konsensussekvens eller en hovedsakelig identisk konsensussekvensvariasjon være generert ved hjelp av metoder som er kjent i faget (Rizo og Gierasch Ann. Rev. Biochem. 61:387 (1992)); f.eks. ved å tilsette indre cysteinrester som er i stand til å danne intramolekylære disulfidbroer som cykliserer peptidet.

Et "immunoglobulin" er et tetramert molekyl. I et naturlig forekommende immunoglobulin er hver tetramer sammensatt av to identiske par av polypeptidkjeder, hvert par har en "lett" (omkring 25 kDa) og en "tung" kjede (omkring 50-70kDa). Den amino-terminale del av hver kjede omfatter en

variabel region på omkring 100 til 110 eller flere aminosyrer som primært er ansvarlig for antigengjenkjenning. Den karboksy-terminale del av hver kjede utgjør en konstantregion primært ansvarlig for effektorfunksjon. Humane lette kjeder er klassifisert som k- og Å-lette kjeder. Tungekjeder er klassifisert som p, 5, y, a, eller s, og utgjør antistoffets isotype som IgM, IgD, IgG, IgA, og IgE, respektive. Innenfor lette og tunge kjeder er de variable og konstante regioner bundet av en "J"-region på omkring 12eller flere aminosyrer, hvor den tunge kjede også omfatter en "D"-region på omkring 10 eller flere aminosyrer. Segenerelt Fundamental Immunologi, kapittel 7 (Paul, W., ed., 2. utgave. Raven Press, N.Y. (1989)). De variable regioner av hvert lette/tunge kjedepar danner det antistoffbindende sete slik at et intakt immunoglobulin har to bindingsseter.

Immunoglobulinkjeder oppviser den samme generelle struktur med relativt konserverte rammeverksregioner (FR) forent av tre hypervariable regioner, også kalt komplementaritetsbestemmende regioner eller CDR'er. CDR'ene fra de to kjeder av hvert par linjestilles av rammeverksregionene for å danne et epitop-spesifikt bindingssete. Fra N-terminus tilC-terminus omfatter både lette og tunge kjeder domeneneFRI, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 og FR4. Utpekingen av aminosyrer til hvert domene er i samsvar med definisjonene av Kabat, Seguences of Proteina of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 og 1991)), eller Chothia & Lesk, J. Mol. Biol., 196:901917(1987); Chothia et al., Nature, 342:878-883(1989).

Et "antistoff" refererer til et intakt immunoglobulin eller til en antigen-bindende del derav som konkurrerer med detintakte antistoff vedrørende spesifikk binding. I noen utførelser er et antistoff en antigen-bindende del derav.Antigen-bindende deler kan være produsert ved rekombinanteDNA-teknikker eller ved enzymatisk eller kjemisk spaltningav intakte antistoffer. Antigen-bindende deler omfatter,inter alia, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, dAb, og komplementari

tets bestemmende regionfragmenter (CDR), enkelt-kjededeantistoffer (scFv), chimæriske antistoffer, diastoffer og polypeptider som inneholder minst én andel av et immunoglobulin som er tilstrekkelig for å gi spesifikk antigenbinding til polypeptidet. Et Fab-fragment er et monovalentfragment bestående av VL-, VH-, CL- og CHl-domenene; etF (ab) 2 —fragment er et bivalent fragment omfattende to Fabfragmenter bundet av en disulfidbro ved hengselregionen; et Fd-fragment består av VH- og CHl-domenene; et Fv-fragmentbestår av VL- og VH-domenene av en enkelt arm av etantistoff; og et dAb-fragment (Ward et al., Nature,341:544-546(1989)) består av et VH-domene.

Anvendt heri er et antistoff som omtales som f.eks. 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.77.2, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4 eller 9.8.2, et monoklonalt antistoff som er fremstilt av hybridomet med det samme navn. For eksempel er antistoff 1.7.2 fremstilt av hybridom 1.7.2. Et antistoff som omtales som 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1mod eller 7.26.4-mod er et monoklonalt antistoff hvissekvens er blitt modifisert fra sitt tilsvarende opphav ved seterettet mutagenese.

Et enkeltkjedet antistoff (scFv) er et antistoff hvori VLog VH-regioner er ordnet parvis og danner et monovalentmolekyl via en syntetisk linker som gjør dem i stand til å lages som en enkelt proteinkjede (Bird et al., Science, 242:423-426 (1988) og Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 85:5879-5883 (1988)). Diastoffer er bivalente, bispesifikke antistoffer hvori VH- og VL-domener er uttryktpå en enkelt polypeptidkjede, men under anvendelse av en linker som er altfor kort til å muliggjøre pardannelse mellom de to domener på den samme kjede, og tvinger derved domenene til pardannelse med komplementære domener av en annen kjede og skape to antigene bindingsseter (se f.eks. Holliger, P., et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 64446448 (1993) og Poljak, R. J., et al., Structure, 2:11211123 (1994)). En eller flere CDR-stoffer fra et antistoff

ifølge oppfinnelsen kan være innlemmet i et molekyl enten kovalent eller ikke-kovalent for å gjøre det til et immunoadhesin som spesifikt binder til MAdCAM. Et immunoadhesin kan innlemme CDR'ene som en del av en større polypeptidkjede, kan kovalent binde CDR'ene til en annen polypeptidkjede, eller kan innlemme CDR'ene ikke-kovalent. CDR'enegjør det mulig for immunoadhesinet å spesifikt bindes til et spesielt antigen av interesse.

Et antistoff kan ha et eller flere bindingsseter. Hvis det er mer enn ett bindingssete, kan bindingssetene være identiske med hverandre eller kan være forskjellige. For eksempel har et naturlig forekommende immunoglobulin to identiske bindingsseter, et enkeltkjedet antistoff eller Fab-fragment har ett bindingssete, mens et "bispesifikt"eller "bifunksjonelt" antistoff (diastoff) har to forskjellige bindingsseter.

Et "isolert antistoff" er et antistoff som (1) ikke er forbundet med naturlig forbundne komponenter, inklusive andre naturlig forbundnet antistoffer, som følger det i dets naturlige tilstand, (2) er fritt for andre proteiner fra den samme art, (3) uttrykkes av en celle fra en forskjellig art, eller (4) opptrer ikke i naturen. Eksempler på isolerte antistoffer omfatter et anti-MAdCAM-antistoffsom er blitt affinitetsrenset under anvendelse av MAdCAM, et anti-MAdCAM-antistoff som er blitt fremstilt av ethybridom eller en annen cellelinje in vitro, og et humant anti-MAdCAM-antistoff avledet fra et transgent pattedyreller plante.

Anvendt heri betyr uttrykket "humant antistoff" et antistoff hvori de variable og konstante regionsekvenser er humane sekvenser. Uttrykket omfatter antistoffer med sekvenser avledet fra humane gener, men som er blitt endret, f.eks. for å minske mulig immunogenisitet, øke affiniteten, eliminere cysteiner eller glykosyleringsseter som vil kunne forårsake uønsket folding, etc. Uttrykket

omfatter slike antistoffer som er produsert rekombinant i ikke-humane celler som vil kunne gi glykosylering som ikkeer typisk for humane celler. Uttrykket omfatter også antistoffer som er blitt alet opp i en transgen mus som omfatter noen eller alle det humane immunoglobulinets tunge og lette kjeders loci.

I ett aspekt tilveiebringer oppfinnelsen et humanisert antistoff. I noen utførelser er det humaniserte antistoff et antistoff som er avledet fra en ikke-human art, hvorivisse aminosyrer i rammeverket og de konstante domener av de tunge og lette kjeder er blitt mutert slik at de unngår eller opphever en immunrespons i mennesker. I noen utførelser kan et humanisert antistoff være fremstilt ved å kondensere de konstante domener fra et humant antistoff til de variable domener av en ikke-human art. Eksempler påhvordan man kan fremstille humaniserte antistoffer er å finne i United States patentnr. 6,054,297, 5,886,152 og 5,877,293. I noen utførelser omfatter et humanisert antiMAdCAM-antistoff ifølge oppfinnelsen aminosyresekvensen aven eller flere rammeverksregioner av en eller flere humane anti-MAdCAM-antistoffer ifølge oppfinnelsen.

I et annet aspekt omfatter oppfinnelsen et "chimærisk antistoff". I noen utførelser refererer det chimæriske antistoff til et antistoff som inneholder en eller flere regioner fra ett antistoff og en eller flere regioner fra ett eller flere andre antistoffer. I en foretrukken utførelse er et eller flere av CDR-stoffene avledet fra ethumant anti-MAdCAM-antistoff ifølge oppfinnelsen. I en merforetrukken utførelse er alle CDR-stoffene avledet fra ethumant anti-MAdCAM-antistoff ifølge oppfinnelsen. I enannen foretrukken utførelse blandes CDR-stoffene fra merenn ett humant anti-MAdCAM-antistoff ifølge oppfinnelsen ogtilpasses i et chimærisk antistoff. For eksempel kan et chimærisk antistoff omfatte et CDR1 fra den lette kjede av et første humant anti-MAdCAM-antistoff som kan værekombinert med CDR2 og CDR3 fra den lette kjede av et andre

humant anti-MAdCAM-antistoff, og CDR-stoffene fra den tungekjede kan være avledet fra et tredje anti-MAdCAM-antistoff.Videre kan rammeverksregionene være avledet fra ett av de samme anti-MAdCAM-antistoffer, fra ett eller flereforskjellige antistoffer, så som et humant antistoff, eller fra et humanisert antistoff.

Et "nøytraliserende antistoff," "et hemmende antistoff" eller antagonist-antistoff er et antistoff som hemmerbindingen av ogØ? - eller ouPv-uttrykkende celler, ellerenhver annen kognatligand eller kognatligand-uttrykkendecelle, til MAdCAM med minst omkring 20%. I en foretrukken utførelse reduserer antistoffet bindingen av integrin eller ogØv-uttrykkende celler til MAdCAM med minst 40%, merforetrukket med 60%, enda mer foretrukket med 80%, 85%, 90%, 95% eller 100%. Bindingsreduksjon kan måles ved hjelp av ethvert middel som er kjent for en person med kunnskaper i faget, f.eks. som målt i en in vitro kompetitiv bindingsundersøkelse. Et eksempel på å måle reduksjonen i binding av ogPv-uttrykkende celler til MAdCAM er angitt iEksempel I.

Fragmenter eller analoger av antistoffer kan lett fremstilles av personer med ordinære kunnskaper i faget ved å følge lærdommene i denne beskrivelse. Foretrukne amino- ogkarboksy-termini av fragmenter eller analoger opptrer nærgrenseområdene for funksjonelle domener. Strukturelle og funksjonelle domener kan identifiseres ved sammenligning av nukleotidene og/eller aminosyresekvensdataene med offentlige eller beskyttede sekvensdatabaser. Fortrinnsvis anvendes databehandlede sammenligningsmetoder for å identifisere sekvensmotiver eller predikerte proteinkonformasjonsdomener som opptrer i andre proteiner med kjent struktur og/eller funksjon. Metoder for å identifisere proteinsekvenser som foldes til en kjent tredimensjonal struktur er kjent (Bowie et al.. Science, 253:164 (1991)).

Uttrykket "overflateplasmonresonans", anvendt heri, refererer til et optisk fenomen som muliggjør analyse av biospesifikke sanntidsinteraksjoner ved påvisning av endringer i proteinkonsentrasjoner innen en biosensormatriks, f.eks. ved å anvende BIAcore-systemet (PharmaciaBiosensor AB, Uppsala, Sverige og Piscataway, N.J.). For ytterligere beskrivelser se Jonsson, U. et al., Ann. Biol. Clin., 51:19-26 (1993); Jonsson, U. et al., Biotechniques,11:620-627 (1991); Johnsson, B. et al., J. Mol. Recognit.,8:125-131 (1995); og Johnnson, B. et al.. Anal. Biochem.,198:268-277 (1991).

Uttrykket "koff" refererer til "off rate"-konstanten fordissosiasjonen av et antistoff fra antistoff/antigenkomplekset.

Uttrykket "Kd" refererer til dissosiasjonskonstanten av en spesiell antistoff-antigeninteraksjon. Et antistoff sies åbinde et antigen når dissosiasjonskonstanten er < 1 pM, fortrinnsvis d 100 nM og mest foretrukket d 10 nM.

Uttrykket "epitop" omfatter enhver proteindeterminant som er i stand til å spesifikt bindes til et immunoglobulin eller T-cellereseptor eller på annen måte samhandle med etmolekyl. Epitope determinanter består vanligvis av kjemisk aktive overflategrupperinger av molekyler så som aminosyrer eller karbohydratsidekjeder og har vanligvis spesifikke tre-dimensjonale strukturkarakteristikker, samt spesifikkeladningskarakteristikker. En epitop kan være "lineær" eller "konformasjonal." I en lineær epitop opptrer alle interaksjonspunkter mellom proteinet og det samhandlende molekyl (så som et antistoff) linært langs den primære aminosyresekvens av proteinet. I en konformasjonal epitop, opptrer interaksjonspunktene tvers over aminosyrerester på proteinet som er adskilt fra hverandre.

Anvendt heri følger de tyve konvensjonelle aminosyrer og deres forkortelser konvensjonell bruk. Se Immunology - A

Synthesis (2nd Edition, E.S. Golub and D.R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991)). Stereoisomerer (f.eks. D-aminosyrer) av de tyvekonvensjonelle aminosyrer, unaturlige aminosyrer så som a-,a-disubstituerte aminosyrer, N-alkylaminosyrer, melkesyreog andre ukonvensjonelle aminosyrer kan også være passende komponenter for polypeptider i foreliggende oppfinnelse. Eksempler på ukonvensjonelle aminosyrer omfatter: 4hydroksyprolin, y-karboksyglutamat, s-N,N,N-trimetyllysin,s-N-acetyllysin, O-fosfoserin, N-acetylserin, Nformylmetionin, 3-metylhistidin, 5-hydroksylysin, s-Nmetylarginin og andre lignende aminosyrer og iminosyrer

(f.eks. 4-hydroksyprolin). I polypeptidbetegnelsen anvendtheri er venstreretningen den aminoterminale retning, og høyreretningen er den karboksyterminale retning, i samsvar med standardisert bruk og konvensjon.

Uttrykket "polynukleotid" som det referereres til heri, betyr en polymer form av nukleotider med minst 10 baser i lengde, enten ribonukleotider eller deoksynukleotider eller en modifisert form av hver type nukleotid. Uttrykket omfatter enkelt- og dobbeltstrengede former av DNA.

Uttrykket "isolert polynukleotid" anvendt heri skal bety et polynukleotid av genomisk cDNA, eller av syntetisk opprinnelse eller en kombinasjon derav, hvor i kraft av sin opprinnelse det "isolerte polynukleotid" (1) ikke er forbundet med alle eller en andel av et polynukleotid hvori det "isolerte polynukleotid" forekommer i naturen, (2) er operativt bundet til et polynukleotid som det ikke er bundet til i naturen, eller (3) ikke opptrer i naturen som en del av en større sekvens.

Uttrykket "oligonukleotid" omtalt heri omfatter naturlig forekommende og modifiserte nukleotider bundet sammen av naturlig forekommende og ikke-naturlig forekommende oligonukleotidbindinger. Oligonukleotider er et polynukleotiddelsett generelt omfattende en lengde på 200 baser eller

færre. Fortrinnsvis er oligonukleotider 10 til 60 baser lange og mest foretrukket 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, eller 20 til 40 baser lange. Oligonukleotider er vanligvis enkeltstrenget, f.eks. for prober; skjønt oligonukleotider kan være dobbeltstrenget, f.eks. for anvendelse i konstruksjonen av en genmutant. Oligonukleotidene ifølge oppfinnelsen kan være enten sense- eller antisenseoligonukleotider.

Uttrykket "naturlig forekommende nukleotider" omtalt heri omfatter deoksyribonukleotider og ribonukleotider. Uttrykket "modifiserte nukleotider" omtalt heri omfatter nukleotider med modifiserte eller substituerte sukkergrupper og lignende. Uttrykket "oligonukleotidbindinger" omtalt heri omfatter oligonukleotidbindinger så som fosfortionat, fosforditionat, fosforselenoat, fosfordiselenoat, fosforanilotionat, fosforaniladat, fosforamidat og lignende. Se f.eks. LaPlanche et al., Nucl. Acids Res. 14:9081 (1986); Stec et al., J. Am. Chem. Soc. 106:6077 (1984); Stein et al., Nucl. Acids Res., 16:3209(1988); Zon et al., Anti-Cancer Drug Design 6:539(1991); Zon et al.,Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, pp. 87-108 (F. Eckstein, Ed., Oxford University Press,Oxford Englog(1991)); Stec et al., U.S. patentnr. 5,151,510; Uhlmann og Peyman, Chemical Reviews, 90:543 (1990). Et oligonukleotid kan omfatte en markør for påvisning, hvis ønsket.

"Operativt bundne" sekvenser omfatter både ekspresjonskontrollsekvenser som er tilgrensende til genet av interesse og ekspresjonskontrollsekvenser som virker i trans eller i en avstand til kontrollgenet av interesse. Uttrykket "ekspresjonskontrollsekvens" anvendt heri refererer til polynukleotidsekvenser som er nødvendig for å bevirke ekspresjonen og prosesseringen av kodende sekvenser som de er ligert til. Ekspresjonskontrollsekvenser omfatter passende transkripsjonsinitiering, terminering, promoterog forsterkersekvenser; effektive RNA-prosesseringssignaler

så som spleising- og polyadenyleringssignaler; sekvensersom stabiliserer cytoplasmisk mRNA; sekvenser som forsterker translasjonseffektiviteten (dvs. Kozaks konsensussekvens); sekvenser som forsterker proteinstabiliteten; og når ønsket, sekvenser som forsterker proteinsekresjonen. Slike kontrollsekvensers natur varierer avhengig av vertsorganismen; i prokaryoter omfatter slike kontrollsekvenser generelt promotere, ribosomalt bindingssete og transkripsjonsterminasjonssekvens; i eukaryoter omfatter generelt slike kontrollsekvenser promotere og transkripsjonsterminasjonssekvens. Uttrykket "kontrollsekvenser" er ment å skulle omfatte, i det minste, alle komponenter hvis nærvær er vesentlig for ekspresjon og prosessering, og kan også omfatte ytterligere komponenter hvis nærvær er fordelaktig, f.eks. ledersekvenser og fusjonspartnersekvenser.

Uttrykket "vektor" anvendt heri, er ment å referere til et nukleinsyremolekyl som er i stand til å transportere en annen nukleinsyre som den er blitt bundet til. En type av vektor er et "plasmid", som refererer til en sirkelformet dobbeltstrenget DNA-sløyfe i hvilken ytterligere DNAsegmenter kan være ligert. En annen type av vektor er en viral vektor, hvori ytterligere DNA-segmenter kan væreligert inn i det virale genom. Visse vektorer er i stand til autonom reproduksjon i en vertscelle, i hvilken de er innført (f.eks. bacterievektorer av bakteriell opprinnelig reproduksjon og episomale pattedyrsvektorer). Andre vektorer (f.eks. ikke-episomale pattedyrsvektorer) kan væreintegrert i genomet i en vertscelle etter innføring inn i vertscellen, og reproduseres derved sammen med vertsgenomet. Dessuten er visse vektorer i stand til å rette ekspresjonen av gener som de er operativt bundet til. Slike vektorer omtales heri som "rekombinante ekspresjonsvektorer" (eller helt enkelt "ekspresjonsvektorer"). Generelt er ekspresjonsvektorer som kan brukes i rekombinante DNA-teknikker, ofte i form av plasmider. Iforeliggende beskrivelse kan "plasmid" og "vektor" anvendes om hverandre idet plasmidet vanligvis er den mest anvendte

form for vektor. Imidlertid er oppfinnelsen ment å skulle omfatte slike andre former av ekspresjonsvektorer, så som virale vektorer (f.eks. reproduksjonsdefektive retroviruser, adenoviruser og adeno-forbundne viruser), somtjener likeverdige funksjoner.

Uttrykket "rekombinant vertscelle" (eller helt enkelt "vertscelle") anvendt heri er ment å referere til en celle i hvilken en rekombinant ekspresjonsvektor er blitt innført. Det bør være underforstått at slike uttrykk er ment å referere ikke bare til den spesielle aktuelle celle, men til avkommet av en slik celle. Fordi visse modifikasjoner kan opptre i etterfølgende generasjoner på grunn av enten mutasjon eller innflytelse fra omgivelsene, kan slike avkom faktisk ikke være identiske med opphavscellen, men de er likevel innbefattet innenfor omfanget av uttrykket "vertscelle" anvendt heri.

Uttrykket "selektivt hybridisere" omtalt heri betyr å bindes identifiserbart og spesifikt. Polynukleotider, oligonukleotider og fragmenter derav hybridiserer i samsvar med oppfinnelsen selektivt til nukleinsyrestrenger under hybridiserings- og vaskebetingelser som minimererbetydelige mengder av identifiserbar binding til ikkespesifikke nukleinsyrer. "Høy-stringens" eller "høystringente" betingelser kan anvendes for å oppnå selektive hybridiseringsbetingelser som er kjent i faget og omtalt heri. Et eksempel på "høy-stringens" eller "høy-stringente"betingelser er en metode for å inkubere et polynukleotid med et annet polynukleotid, hvori ett polynukleotid kan være festet til en fast overflate så som en membran, i en hybridiseringsbuffer av 6X SSPE eller SSC, 50% formamid, 5X Denhardts reagens, 0,5% SDS, 100 pg/ml denaturert, fragmentert laksesperma-DNA ved en hybridiseringstemperatur på42°C i 12-16 timer, etterfulgt av to vaskinger ved 55°Cunder anvendelse av en vaskebuffer av IX SSC, 0,5% SDS. Se også Sambrook et al., supra, s. 9,50-9,55.

Uttrykket "prosent sekvensidentitet" i forbindelse med nukleotidsekvenser refererer til restene i to sekvenser som er de samme når de linjestilles for maksimal overensstemmelse. Lengden av sekvensidentitetssammenligning kan være over en strekning på minst omkring ni nukleotider, vanligvis minst omkring 18 nukleotider, mer vanlig minst omkring 24 nukleotider, normalt minst omkring 28 nukleotider, mer normalt minst omkring 32 nukleotider, og fortrinnsvis minst omkring 36, 48 eller flere nukleotider. Det fins et antall forskjellige algoritmer som er kjent i faget, og som kan anvendes til å måle nukleotidsekvensidentitet. For eksempel kan polynukleotidsekvenser sammenlignes under anvendelse av FASTA, Gap eller Bestfit, som er programmer i Wisconsin Package Version 10.3, Accelrys, San Diego, CA. FASTA, som omfatter f.eks. programmene FASTA2 og FASTA3, tilveiebringer linjestillinger og prosent sekvensidentitet av regionene med den beste overlapping mellom de forespurte og søkte sekvenser (Pearson, Methods Enzymol., 183: 63-98 (1990); Pearson, Methods Mol. Biol., 132: 185219 (2000); Pearson, Methods Enzymol., 266: 227-258 (1996);Pearson, J. Mol. Biol., 276: 71-84 (1998)). Hvis intetannet er spesifisert, anvendes standardiserte parametere for et spesielt program eller algoritme. For eksempel kan prosent sekvensidentitet mellom nukleotidsekvenser bestemmes under anvendelse av FASTA med dens standardparametere (en ordstørrelse på 6 og NOPAM-faktorenfor poengberegningsmatriksen) eller under anvendelse av Gap med dens standardparametere som angitt i Wisconsin Package Version 10.3.

En henvisning til en nukleotidsekvens omfatter dens komplement, hvis intet annet er spesifisert. Således bør en henvisning til et nukleinsyremolekyl med en spesiell sekvens forstås å omfatte dets komplementære streng, med dens komplementære sekvens.

I faget molekylbiologi bruker forskere uttrykket "prosent sekvensidentitet", "prosent sekvenslikhet" og "prosent

sekvenshomologi" om hverandre. I denne søknad skal disse uttrykk ha den samme betydning bare med hensyn til nukleotidsekvenser.

Uttrykket "vesentlig likhet" eller "vesentlig sekvenslikhet," når det refereres til en nukleinsyre eller et fragment derav, indikerer at når optimalt linjestilt med passende nukleotidinnsettinger eller slettinger med en annen nukleinsyre (eller dens komplementære streng), er det nukleotidsekvensidentitet i minst omkring 85%, fortrinnsvis minst omkring 90%, og mer foretrukket minst omkring 95%, 96%, 97%, 98% eller 99% av nukleotidbasisene, målt ved hjelp av enhver velkjent algoritme for sekvensidentitet, så som FASTA, BLAST eller Gap, som omtalt ovenfor.

Anvendt på polypeptider betyr uttrykket "vesentlig identitet" at to peptidsekvenser, når de er optimalt linjestilt, så som ved hjelp av programmene GAP eller BESTFIT under anvendelse av standard gap-vekt, deler minst75% eller 80% sekvensidentitet, fortrinnsvis minst 90% eller 95% sekvensidentitet, enda mer foretrukket minst 98% eller 99% sekvensidentitet. Fortrinnsvis avviker reststillingene som ikke er dentiske ved konservative aminosyresubstitusjoner. En "konservativ aminosyresubstitusjon" er en substitusjon hvori en aminosyrerest er substituert med en annen aminosyrerest med en sidekjede (Rgruppe) med lignende kjemiske egenskaper (f.eks. ladning eller hydrofobisitet). Generelt vil en konservativ aminosyresubstitus j on ikke hovedsakelig endre de funksjonelle egenskaper hos et protein. I tilfeller hvor to eller flere aminosyresekvenser avviker fra hverandre ved konservative substitusjoner, kan den prosentuelle sekvensidentitet eller grad av likhet justeres oppover for å korrigere for den konservative natur av substitusjonen. Midler for å gjøre denne justering er velkjent for personer med kunnskaper i faget. Se f.eks. Pearson, Methodes Mol. Biol., 24: 307-31(1994). Eksempler på grupper av aminosyrer som har sidekjeder med lignende kjemiske egenskaper, omfatter 1)

alifatiske sidekjeder: glysin, alanin, valin, leusin og isoleusin; 2) alifatiske hydroksylsidekjeder: serin og treonin; 3) amid-inneholdende sidekjeder: asparagin ogglutamin; 4) aromatiske sidekjeder: fenylalanin, tyrosin og tryptofan; 5) basiske sidekjeder: lysin, arginin og histidin; og 6) svovel-inneholdende sidekjeder er cysteinog metionin. Foretrukne konservative aminosyresubstitusjonsgrupper er: valin-leusin-isoleusin, fenylalanintyrosin, lysin-arginin, alanin-valin, glutamat-aspartat ogasparagin-glutamin.

Alternativt er en konservativ erstatning enhver endring med en positiv verdi i PAM250 log-sannsynlighetsmatriksenbeskrevet i Gonnet et al., Science, 256: 1443-45 (1992). En"moderat konservativ" erstatning er enhver endring med en ikke-negativ verdi i PAM250 log-sannsynlighetsmatriksen.

Sekvenslikhet for polypeptider måles normalt under anvendelse av sekvensanalyse-programvare. Proteinanalyseprogramvare sammenligner lignende sekvenser under anvendelse av mål på likhet tildelt forskjellige substitusjoner, slettinger og andre modifikasjoner, inklusive konservative aminosyresubstitusjoner. For eksempel inneholder GCG programmer så som "Gap" og "Bestfit" som kan anvendes med standard-parametre for åbestemme sekvenshomologi eller sekvensidentitet mellom nært beslektede polypeptider, så som homologe polypeptider fra forskjellige arter av organismer eller mellom et villtypeprotein og et mutein derav. Se f.eks. Wisconsin Package Version 10.3. Polypeptidsekvenser også kan sammenlignes under anvendelse av FASTA under anvendelse av standardiserte eller anbefalte parametre, et program i Wisconsin Package Version 10.3. FASTA (f.eks. FASTA2 og FASTA3) tilveiebringer linjestillinger og prosentuell sekvensidentitet av regionene for den beste overlapping mellom de forespurte og søkte sekvenser (Pearson (1990); Pearson (2000)) . En annen foretrukken algoritme når man sammenligner en sekvens ifølge oppfinnelsen med en database

inneholdende et stort antall av sekvenser fra forskjellige organismer, er dataprogrammet BLAST, spesielt blastp eller tblastn, under anvendelse av standard-parametre. Se f.eks.Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990);Altschul et al., Nukleic Acids Res. 25:3389-402 (1997).

Lengden av polypeptidsekvenser sammenlignet med hensyn til homologi vil generelt være minst omkring 16 aminosyrerester, vanligvis minst omkring 20 rester, mer vanlig minst omkring 24 rester, normalt minst omkring 28 rester og fortrinnsvis mer enn omkring 35 rester. Når man søker i en database inneholdende sekvenser fra et stort antall av forskjellige organismer, er det fordelaktig å sammenligne aminosyresekvenser.

Anvendt heri refererer uttrykket "markør" eller "merke" til innlemmelse av et annet molekyl i antistoffet. I en utførelse er markøren en påviselig markør, f.eks. innlemmelse av en radiomerket aminosyre eller tilslutning til et polypeptid av biotinylgrupper som kan påvises med merket avidin (f.eks. streptavidin inneholdende en fluorescerende gruppe eller enzymatisk aktivitet som kan påvises ved optiske eller kolorimetriske metoder). I en annen utførelse kan markøren eller merket være terapeutisk, f.eks. et medisinkonjugat eller toksin. Forskjellige metoder for å merke polypeptider og glykoproteiner er kjent

i faget og kan anvendes. Eksempler på markører for polypeptider omfatter følgende: radioisotoper eller radionuklider (f.eks. 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I,

j 3 j

I), fluorescerende markører (f.eks. FITC, rodamrn, lantanid-fosfor), enzymatiske markører (f.eks. pepperrotperoksidase, [3-galaktosidase, luciferase, alkaliskfosfatase), kjemiluminiserende markeringer, biotinylgrupper, forutbestemte polypeptidepitoper gjenkjent av en sekundær reporter (f.eks. leusin-glidelåsparsekvenser,bindingsseter for sekundære antistoffer, metallbindende domener, epitop-markører), magnetiske midler, så somgadoliniumchelater, toksiner så som pertussis-toksin.

taxol, cytochalasin B, gramicidin D, ethidium-bromid,emetin, mitomycin, etoposid, tenoposid, vincristin, vinblastin, colchicin, doxorubicin, daunorubicin, dihydroksyantracindion, mitoxantron, mithramycin, aktinomycin D, 1-dehydrotestosteron, glukokortikoider,prokain, tetrakain, lidokain, propranolol og puromycin og analoger eller homologer derav. I noen utførelser er markørene festet ved hjelp av avstandsarmer av forskjellige lengder for å redusere potensiell sterisk hindring.

Uttrykket "middel" anvendes heri for å betegne en kjemisk forbindelse, en blanding av kjemiske forbindelser, et biologisk makromolekyl eller et ekstrakt fremstilt fra biologiske materialer. Uttrykket "farmasøytisk middel eller medisin" anvendt heri refererer til en kjemisk forbindelse eller sammensetning som er i stand til å gi en ønsket terapeutisk virkning når den administreres til en pasient. Andre kjemiuttrykk heri er anvendt i henhold til konvensjonell bruk i faget, som eksemplifisert i The McGraw-Hill Dictionary of Chemical terms (Parker, S., Ed.,McGraw-Hill, San Francisco (1985))).

Uttrykket "anti-inflammatorisk" eller "immuno-modulatorisk"middel anvendes heri for å henvise til midler som har den funksjonelle egenskap at de hemmer inflammasjon, inklusive inflammatorisk sykdom i et individ, inklusive i et menneske. I forskjellige utførelser av denne oppfinnelse kan den inflammatoriske sykdom være inflammatoriske sykdommer i det gastrointestinale system inklusive Crohns sykdom, ulcerøs kolitt, tykktarmsbetennelse, gastritt, leversykdom, primær gallesklerose, skleroserende kolangitt. Inflammatoriske sykdommer omfatter også abdominal sykdom (inklusive peritonitt, blindtarmsbetennelse, gallesystemsykdom), akutt transversal myelitt, allergisk dermatitt (inklusive allergisk hud, allergisk eksem, hudatopi, atopisk eksem, atopisk dermatitt, kutan inflammasjon, inflammatorisk eksem, inflammatorisk dermatitt, loppehud, miliær dermatitt, miliært eksem, husstøv-middhud),

ankyloserende spondylitt (Reiters syndrom), astma, luftveisinflammasjon, aterosklerose, arteriosklerose, galleatresi, blæreinflammasjon, brystkreft, hjerte-karinflammasjon (inklusive vasculitt, rheumatoid "nail-fold"infark, legg-ulcus, polymyositt, kronisk vaskulærinflammasjon, perikarditt, kronisk obstruktiv pulmonar sykdom), kronisk pankreatitt, perineural inflammasjon, kolitt (inklusive amøbekolitt, smittsom kolitt, bakteriell kolitt, Crohns kolitt, iskemisk kolitt, ulcerøs kolitt, idiopatisk proktokolitt, inflammatorisk tarmsykdom, pseudomembranøs kolitt), kollagene vaskulære forstyrrelser (revmatoid artritt, SLE, progressiv systemisk sklerose, blandet bindevevsykdom, diabetes mellitus), Crohns sykdom (regional enteritt, granulomatøs ileititt, ileokolitt, fordøyelsesesysteminflammasjon), demyelinerende sykdom (inklusive myelitt, multippel sklerose, disseminert sklerose, akutt disseminert encefalomyelitt, perivenøs demyelinasjon, vitamin B12-mangel, Guillain-Barre-syndrom,MS-forbundet retrovirus), dermatomyositt, divertikulitt,eksuderende diaré, gastritt, granulomatøs hepatitt, granulomatøs inflammasjon, cholecystitt, insulin-avhengigdiabetes mellitus, inflammatoriske leversykdommer

(leverfibrose primær gallecirrhose, hepatitt, skleroserende kolangitt), lungeinflammasjon (idiopatisk pulmonar fibrose, eosinofil granulom i lungene, pulmonar histiocytose X, peribronkittisk inflammasjon, akutt bronkitt), lymphogranuloma venereum, ondartet melanom, munn/tannsykdom (inklusive gingivitt, periodontal sykdom), mucositis, muskelskjelettsystem-inflammasjon (myositt), ikkealkoholisk steatohepatitt (ikke-alkoholisk fettleversykdom), okular & orbital inflammasjon (inklusive uveitis, optisk nevritt, perifer revmatoid ulcerasjon, perifer hornhinneinflammasjon,), osteoartritt,osteomyelitt, faryngal inflammasjon, polyartritt, proktitt, psoriasis, strålingsskade, sarkoidose, sigdcellenekropati, overflatetromboflebitt, systemisk inflammatorisk responssyndrom, tyreoditt, systemisk lupus erythematosus, immunologisk

reaksjon fra et transplantat mot vertsorganismen, akutt forbrenningsskade, Behgets syndrom, Sjbgrens syndrom.

Uttrykket pasient og individ omfatter mennesker og dyr. Humane Anti-MAdCAM-antistoffer og karakterisering derav

I en utførelse tilveiebringer oppfinnelsen monoklonale anti-MAdCAM-antistoffer omfattende humane CDR-sekvenser somangitt i krav 1. I en foretrukken utførelse tilveiebringer oppfinnelsen slike monoklonale humane anti-MAdCAMantistoffer. I noen utførelser fremstilles slike humane anti-MAdCAM-antistoffer ved å immunisere et ikke-humanttransgent dyr, f.eks. en gnager, hvis genom omfatter humane immunoglobulingener slik at det transgene dyr produserer humane antistoffer. I noen utførelser tilveiebringer oppfinnelsen et slikt anti-MAdCAM-antistoff som ikke binderkomplement.

I en foretrukken utførelse er anti-MAdCAM-antistoffet1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod eller 7.26.4-mod. I en annenforetrukken utførelse omfatter anti-MAdCAM-antistoffet enlett kjede omfattende en aminosyresekvens valgt fra SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 54, 58, 62, 66 eller 68 (med eller uten signalsekvensen) eller den variable region av enhver av nevnte aminosyresekvenser, eller ett eller flere CDR-stoffer fra disse aminosyresekvenser. I en annen foretrukken utførelse omfatter antiMAdCAM-antistof f et en tung kjede omfattende en aminosyresekvens valgt fra SEQ ID NO: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42, 46, 52, 56, 60 eller 64 (med eller uten signalsekvensen) eller aminosyresekvensen av den variable region, eller av et eller flere CDR-stoffer fra nevnteaminosyresekvenser. Også innbefattet i oppfinnelsen er humane anti-MAdCAM-antistoffer omfattende aminosyresekvensen fra begynnelsen av CDR1 til enden av CDR3 av

enhver av ovennevnte sekvenser. Oppfinnelsen tilveiebringer videre et anti-MAdCAM-antistoff omfattende en eller flereFR-regioner av enhver av ovennevnte sekvenser.

Oppfinnelsen tilveiebringer videre et anti-MAdCAM-antistoffomfattende én av de tidligere nevnte aminosyresekvenser hvori én eller flere modifikasjoner er blitt gjort. I noen utførelser er cysteiner i antistoffet, som kan være kjemisk reaktive, substituert med en annen rest, så som alanin eller serin. I en utførelse er substitusjonen ved et ikkekanonisk cystein. Substitusjonen kan være gjort i et CDR eller en rammeverksregion av et variabelt domene eller i det konstante domene av et antistoff. I noen utførelser er cysteinet kanonisk.

I noen utførelser utføres en aminosyresubstitusjon for å eliminere potensielle proteolytiske seter i antistoffet. Slike seter kan opptre i et CDR eller en rammeverksregion av et variabelt domene eller i det konstante domene av et antistoff. Substitusjon av cysteinrester og fjerning av proteolytiske seter kan minske heterogeniteten i antistoffproduktet. I noen utførelser elimineres asparagin-glysinpar, som danner potensielle deamideringsseter, ved å endre én eller begge rester. I noen utførelser gjøres en aminosyresubstitus j on for å tillegge eller fjerne potensielle glykosyleringsseter i den variable region av et antistoff ifølge oppfinnelsen.

I noen utførelser spaltes det C-terminale lysin i den tungekjede av anti-MAdCAM-antistoffet ifølge oppfinnelsen. Iforskjellige utførelser av oppfinnelsen kan de tunge og lette kjeder av anti-MAdCAM-antistoffene valgfritt omfatteen signalsekvens.

I ett aspekt tilveiebringer oppfinnelsen tolv hemmende humane anti-MAdCAM monoklonale antistoffer, og hybridomacellelinjene som produserer dem. Tabell 1 angir sekvensidentitetsnumrene (SEQ ID NO:) for nukleinsyrene som koder

de full-lengdede tunge og lette kjeder (inklusive signalsekvensen), og de tilsvarende full-lengdede avlededeaminosyresekvenser.

Tabell 1

llllllliiiiBBBBBIj

lliilll

liill

1.7.2

i

1.8.2

6.14.2

6.22.2

6.34.2

6.67.1

6.73.2

6.77.1

7.16.6

7.20.5

7.26.4

9.8.2

I et annet aspekt tilveiebringer oppfinnelsen en modifisert versjon av visse av de ovenfor-identifiserte humane antiMAdCAM-monoklonale antistoffer. Tabell 2 angir sekvensidentitetsnumrene for DNAet og proteinsekvensene i de modifiserte antistoffer.

Tabell 2

Modifisert

iiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiii

iiiiiiiiiiiiiii

Hill

Hill

6.22.2-mod

6.34.2-mod

6.67.1-mod

6.77.1-mod

7.26.4-mod

Klasse og underklasse av anti-MAdCAM-antistoffer

Antistoffet kan være et IgG-, et IgM-, et IgE-, et IgAeller et IgD-molekyl. I en foretrukken utførelse erantistoffet en IgG-klasse og er en IgGi-, IgG2-, IgGs- ellerIgG4-underklasse. I en mer foretrukken utførelse er antiMAdCAM-antistoffet underklasse IgG2eller IgG4. I en annenforetrukken utførelse er anti-MAdCAM-antistoffet den sammeklasse og underklasse som antistoff 1.7.2, 1.8.2, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1mod eller 7.26.4-mod som er IgG2, eller 6.14.2, 6.22.2,6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1 eller 9.8.2, som er IgG4.

Klassen og underklassen av anti-MAdCAM-antistoffer kanbestemmes ved hjelp av enhver metode som er kjent i faget. Generelt kan klassen og underklassen av et antistoff bestemmes under anvendelse av antistoffer som er spesifikke for en spesiell klasse og underklasse av antistoff. Slike antistoffer er kommersielt tilgjengelige. ELISA, Western Blot samt andre teknikker kan bestemme klassen og underklassen. Alternativt kan klassen og underklassen bestemmes ved å sekvensere alle eller en andel av de konstante domener av de tunge og/eller lette kjeder av antistoffene.

ved å sammenligne deres aminosyresekvenser med de kjente aminosyresekvenser av forskjellige klasser og underklasser av immunoglobuliner og bestemme klassen og underklassen av antistoffene som klassen som viser den høyeste sekvensidentitet.

Art og molekylselektivitet

I et annet aspekt av oppfinnelsen demonstrerer anti-MAdCAMantistoffet både art- og molekylselektivitet. I enutførelse bindes anti-MAdCAM-antistoffet til humant,cynomolgus- eller hunde-MAdCAM. I noen utførelser bindesanti-MAdCAM-antistoffet ikke til en New World ape-art såsom en silkeape. Ifølge lærdommene i beskrivelsen kan man bestemme artsselektiviteten for anti-MAdCAM-antistoffet vedå anvende metoder som er velkjent i faget. For eksempel kan man bestemme artsselektivitet under anvendelse av Western blot, FACS, ELISA eller immunohistokjemi. I en foretrukken utførelse kan man bestemme artsselektiviteten under anvendelse av immunohistochemistry.

I noen utførelser har et anti-MAdCAM-antistoff, somspesifikt binder MAdCAM, selektivitet for MAdCAM i forhold til VCAM, fibronektin eller ethvert annet antigen, hvilken er minst 10 ganger, fortrinnsvis minst 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 eller 90 ganger, mest foretrukket minst 100 ganger. I en foretrukken utførelse viser anti-MAdCAM-antistoffetikke noen vesentlig binding til VCAM, fibronektin eller ethvert annet antigen som ikke er MAdCAM. Man kan bestemme selektiviteten av anti-MAdCAM-antistoffet i forhold tilMAdCAM under anvendelse av metoder som er velkjent i faget idet man følger lærdommene i beskrivelsen. For eksempel kan man bestemme selektiviteten ved å anvende Western blot, FACS, ELISA eller immunohistokjemi.

Bindingsaffinitet av anti-MAdCAM-antistoffer til MAdCAM

I et annet aspekt av oppfinnelsen bindes anti-MAdCAMantistoffene spesifikt til MAdCAM med høy affinitet. I en utførelse bindes anti-MAdCAM-antistoffet spesifikt tilMAdCAM med en Kj på 3 x 10~8 M eller mindre, målt ved hjelp av overflateplasmonresonans, så som BIAcore. I mer foretrukne utførelser bindes antistoffet spesifikt til MAdCAM med en Kj på 1 x 10~8 eller mindre eller 1 x 10~9 M eller mindre. I en enda mer foretrukken utførelse bindes antistoffet spesifikt til MAdCAM med en Kj på 1 x 1O~10 M eller mindre. I andre foretrukne utførelser bindes et antistoff ifølge oppfinnelsen spesifikt til MAdCAM med en Kd på 2,66 x 1CC1OM eller mindre, 2,35 x 10-11M eller mindreeller 9 x 10 M eller mrndre. I en annen foretrukken utførelse bindes antistoffet spesifikt til MAdCAM med en Kd på 1 x 10"11 M eller mindre. I en annen foretrukken utførelse bindes antistoffet spesifikt til MAdCAM med hovedsakelig den samme Kd som et antistoff valgt fra 1.7.2,

1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod,6.67.1-mod, 6.77.1-mod eller 7.26.4-mod. Et antistoff med"hovedsakelig den samme Kd" som referanseantistoffet har en Kd som er ± 100 pM, fortrinnsvis ± 50 pM, mer foretrukket ± 20 pM, enda mer foretrukket ± 10 pM, ± 5 pM eller ± 2 pM, sammenlignet med Kd-verdien for referanseantistoffet i detsamme eksperiment. I en annen foretrukken utførelse bindes antistoffet til MAdCAM med hovedsakelig den samme Kd som et antistoff som omfatter et eller flere variable domener eller et eller flere CDR-stoffer fra et antistoff valgt fra

1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod eller 7.26.4-mod. I enda enannen foretrukken utførelse bindes antistoffet til MAdCAM med hovedsakelig den samme Kd som et antistoff som omfatter en av aminosyresekvensene valgt fra SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46 48, 52, 54, 56, 58, 62, 64, 66 eller 68 (med

eller uten signalsekvensen), eller det variable domene derav. I en annen foretrukken utførelse bindes antistoffet til MAdCAM med hovedsakelig den samme Kj som et antistoff som omfatter ett eller flere CDR-stoffer fra et antistoffsom omfatter en aminosyresekvens valgt fra SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46 48, 52, 54, 56, 58, 62, 64, 66 eller 68.

Bindingsaffiniteten av et anti-MAdCAM-antistoff til MAdCAMkan bestemmes ved hjelp av enhver metode som er kjent i faget. I en utførelse kan bindingsaffiniteten måles ved kompetitiv ELISA, RIA eller overflateplasmonresonans, så som BIAcore. I en mer foretrukken utførelse måles bindingsaffiniteten ved hjelp av overflateplasmonresonans. I en enda mer foretrukken utførelse måles bindingsaffiniteten og dissosiasjonshastigheten under anvendelse av BIAcore. Et eksempel på å bestemme bindingsaffinitet er beskrevet nedenfor i Eksempel II.

Halveringstiden for anti-MAdCAM-antistoffer

I henhold til et annet mål for oppfinnelsen har antiMAdCAM-antistof f et en halveringstid på minst én dag invitro eller in vivo. I en foretrukken utførelse har antistoffet eller del derav en halveringstid på minst tre dager. I en mer foretrukken utførelse har antistoffet eller del derav en halveringstid på fire dager eller lenger. I en annen utførelse har antistoffet eller del derav en halveringstid på åtte dager eller lenger. I en annen utførelse er antistoffet eller den antigen-bindende delderav derivatisert eller modifisert slik at det har en lenger halveringstid, som omtalt nedenfor. I en annen foretrukken utførelse kan antistoffet inneholde punktmutasjoner for å øke serumhalveringstiden, så som beskrevet WO 00/09560, publisert 24. februar 2000.

Antistoffhalveringstiden kan måles ved hjelp av ethvert middel kjent for en person med kunnskaper i faget. For eksempel kan antistoffhalveringstiden måles ved hjelp av Western blot, ELISA eller RIA under en passende tidsperiode. Antistoffets halveringstid kan måles i ethvert egnet dyr, så som en primat, f.eks. en cynomolgus-ape elleret menneske.

Identifikasjon av MAdCAM-epitoper gjenkjent av anti-MAdCAMantistoff

Oppfinnelsen tilveiebringer også et humant anti-MAdCAMantistoff som binder det samme antigen eller epitop som et humant anti-MAdCAM-antistoff som tilveiebringes heri.Videre tilveiebringer oppfinnelsen et humant anti-MAdCAMantistoff som konkurrerer eller kryss-konkurrerer med ethumant anti-MAdCAM-antistoff. I en foretrukken utførelse erdet humane anti-MAdCAM-antistoff 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2,6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1mod eller 7.26.4-mod. I en annen foretrukken utførelseomfatter det humane anti-MAdCAM-antistoff en eller flerevariable domener eller et eller flere CDR-stoffer fra etantistoff valgt fra 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod eller7.26.4-mod. I enda en annen foretrukken utførelse omfatterdet humane anti-MAdCAM-antistoff en av aminosyresekvensenevalgt fra SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46 48, 52, 54, 56, 58, 62, 64, 66 eller 68 (med eller uten signalsekvensen), eller et variabelt domene derav. I en annen foretrukken utførelse omfatter det humane anti-MAdCAMantistoff et eller flere CDR-stoffer fra et antistoff somomfatter én av aminosyresekvensene valgt fra SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46 48, 52, 54, 56, 58, 62, 64, 66

eller 68. I en høyst foretrukken utførelse er anti-MAdCAMantistoffet et annet humant antistoff.

Man kan bestemme hvorvidt et anti-MAdCAM-antistoff bindestil det samme antigen som et annet anti-MAdCAM-antistoffunder anvendelse av mange forskjellige metoder kjent i faget. For eksempel kan man anvende et kjent anti-MAdCAMantistoff for å fange antigenet, eluere antigenet fra antiMAdCAM-antistof fet , og deretter bestemme hvorvidt testantistoffet vil bindes til det eluerte antigen. Man kan bestemme hvorvidt et antistoff konkurrerer med et antiMAdCAM-antistof f ved å binde anti-MAdCAM-antistoffet tilMAdCAM under mettede betingelser, og deretter måle evnen hos testantistoffet til å bindes til MAdCAM. Hvis testantistoffet er i stand til å bindes til MAdCAM ved samme tid som anti-MAdCAM-antistoffet, da bindes testantistoffettil en forskjellig epitop enn anti-MAdCAM-antistoffet.Imidlertid, hvis testantistoffet ikke er i stand til å bindes til MAdCAM ved samme tid, da konkurrerer testantistof fet med det humane anti-MAdCAM-antistoff. Detteeksperiment kan utføres under anvendelse av ELISA eller overflateplasmonresonans eller fortrinnsvis BIAcore. For å teste hvor vidt et anti-MAdCAM-antistoff kryss-konkurrerermed et annet anti-MAdCAM-antistoff, kan man anvendekompetisjonsmetoden beskrevet ovenfor i to retninger, dvs. bestemme om det kjente antistoff blokkerer testantistoffet og vice versa.

Bruk av lett- og tungkjedegener

Oppfinnelsen tilveiebringer også et anti-MAdCAM-antistoffsom omfatter en lettkjedet variabel region kodet av et humant K-gen. I en foretrukken utførelse er den lettkjedede variable region kodet av en human Vk A2-, A3-,A26-, B3-, 012- eller 018-genfamilie. I forskjelligeutførelser omfatter den lette kjede ikke mer enn elleve, ikke mer enn seks eller ikke mer enn tre aminosyresubstitusjoner fra kimlinjens humane Vk A2-, A3-, A26-,

B3-, 012- eller 018-sekvens. I en foretrukken utførelse eraminosyresubstitusjonene konservative substitusjoner.

SEQ ID NOS: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44 og 48 tilveiebringer aminosyresekvensene av de full-lengdedekappa-lette kjeder av tolv anti-MAdCAM-antistoffer, 1.7.2,

1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4 og 9.8.2. Figurene 1K-1T erlinjestillinger av aminosyresekvensene av lettkjedede variable domener i tolv anti-MAdCAM-antistoffer medkimlinjesekvensene som de er avledet fra. Figur 2A viser en linjestilling av aminosyresekvensene av lettkjedede variable domener av kappe-lettkjedene av tolv anti-MAdCAMantistof fer til hverandre. Ifølge lærdommene i denne beskrivelse vil en person med ordinære kunnskaper i faget kunne avgjøre forskjellene mellom kimlinjesekvensene og antistoffsekvensene i ytterligere anti-MAdCAM-antistoffer.SEQ ID NOS: 54, 58, 62, 66 eller 68 tilveiebringer aminosyresekvensene av de full-lengdede kappa-lettkjeder i femytterligere anti-MAdCAM-antistoffer, 6.22.2-mod, 6.34.2mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod og 7.26.4-mod, modifisert vedaminosyresubstitusjon fra deres opphavsanti-MAdCAMantistoffer, respektive 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.77.1 eller 7.26.4.

I en foretrukken utførelse inneholder VL av anti-MAdCAMantistoffet de samme mutasjoner, i forhold til kimlinjeaminosyresekvensen, som én eller flere av VL'ene av antistoffene 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1,

6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod,6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod eller 7.26.4-mod.Oppfinnelsen omfatter et anti-MAdCAM-antistoff som benytterde samme humane SOMk- og humane Jk-gener som eteksemplifisert antistoff. I noen utførelser omfatter antistoffet én eller flere av de samme mutasjoner fra kimlinje som én eller flere eksemplifiserte antistoffer. I noen utførelser omfatter antistoffet forskjellige substitusjoner ved én eller flere av de samme stillinger

som én eller flere av de eksemplifiserte antistoffer. For eksempel kan VL'et av anti-MAdCAM-antistoffet inneholde éneller flere aminosyresubstitusjoner som er de samme som de som fins i antistoff 7.16.6, og en annen aminosyresubstitusjon som er den samme som antistoff 7.26.4. På denne måte kan man blande og tilpasse forskjellige trekk i antistoffbinding for å endre f.eks. affiniteten av antistoffet for MAdCAM eller dets dissosiasjonshastighet fra antigenet. I en annen utførelse gjøres mutasjonene i den samme stilling som fins i ett eller flere av VL'et i antistoffene 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1,

6.73.2,6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod,

6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod eller 7.26.4-mod, menkonservative aminosyresubstitusjoner gjøres heller enn å bruke den samme aminosyre. For eksempel, hvis aminosyresubstitus j onen sammenlignet med kimlinjen i et av antistoffene 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1,

6.73.2,6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod,

6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod eller 7.26.4-mod erglutamat, kan man konservativt erstatte aspartat. På lignende måte kan man, hvis aminosyresubstitusjonen er serin, bytte ut treonin konservativt.

I en annen foretrukken utførelse omfatter den lette kjede en aminosyresekvens som er den samme som aminosyresekvensen av VL'et i 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1,

6.73.2,6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod,

6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod eller 7.26.4-mod. I enannen sterkt foretrukken utførelse omfatter de lette kjeder aminosyresekvenser som er de samme som CDR-regionene av denlette kjede i 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1,

6.73.2,6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod,

6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod eller 7.26.4-mod. I enannen foretrukken utførelse omfatter den lette kjede en aminosyresekvens med minst én CDR-region av den lette kjedei 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod eller 7.26.4-mod. I en annen

foretrukken utførelse omfatter den lette kjede aminosyresekvenser med CDRstoffer fra forskjellige lette kjeder som anvender de samme Vk- og Jx-gener. I en mer foretrukkenutførelse oppnås CDR-stoffene fra forskjellige lette kjederfra 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod eller 7.26.4-mod. I en annenforetrukken utførelse omfatter den lette kjede en aminosyresekvens valgt fra SEQ ID NOS: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 54, 58, 62, 64, 66 eller 68 med eller uten signalsekvensen. I en annen utførelse omfatter den lette kjede en aminosyresekvens kodet av en nukleotidsekvens valgt fra SEQ ID NOS: 3, 7, 11, 15, 19, 23, 27, 31, 35, 39, 43, 47, 53, 57, 61, 65 eller 67 (med eller uten signalsekvensen), eller en nukleotidsekvens som koder en aminosyresekvens med 1-11 aminosyre-innsettinger,slettinger eller substitusjoner derfra. Fortrinnsvis er aminosyresubstitusjonene konservative aminosyresubstitusjoner. I en annen utførelse omfatter antistoffet eller del derav en lambda-lettkjede.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også et antiMAdCAM-antistoff eller en del derav som omfatter en humanVH-gensekvens eller en sekvens avledet fra et humant VHgen. I en utførelse er den tungkjedede aminosyresekvens avledet fra en human VH 1-18-, 3-15-, 3-21-, 3-23-, 3-30-,3-33- eller 4-4-genfamilie. I forskjellige utførelseromfatter den tunge kjede ikke mer enn femten, ikke mer enn seks eller ikke mer enn tre aminosyreendringer fra kimlinjens humane VH 1-18-, 3-15-, 3-21-, 3-23-, 3-30-, 333- eller 4-4-gensekvens.

SEQ ID NOS: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42 og 46 tilveiebringer aminosyresekvensene av de full-lengdedetunge kjeder av tolv anti-MAdCAM-antistoffer. Figurene 1A1J er linjestillinger av aminosyresekvensene av de tungkjedede variable regioner av tolv anti-MAdCAM-antistoffermed kimlinjesekvensene som de er avledet fra. Figur 2B

viser linjestillingene av aminosyresekvensene av de tungkjedede variable regioner av tolv anti-MAdCAM-antistoffer iforhold til hverandre. Ifølge lærdommene i denne beskrivelse og nukleotidsekvensene ifølge oppfinnelsen vil en person med ordinære kunnskaper i faget kunne avgjøre den kodede aminosyresekvens av de tolv anti-MAdCAM-tungkjederog kimlinjens tungkjeder og bestemme forskjellene mellom kimlinjesekvensene og antistoffsekvensene. SEQ ID NOS: 52, 56, 60 og 64 tilveiebringer aminosyresekvensene av de fulllengdede tunge kjeder av anti-MAdCAM-antistoffene 6.22.2mod, 6.34.2-mod og 6.67.1-mod, modifisert ved aminosyresubstitusjon fra deres opphavsanti-MAdCAM-antistoffer,

6.22.2, 6.34.2 og 6.67.1 respektive. Et ytterligere modifisert anti-MAdCAM-antistoff, 7.26.4-mod, har en fulllengdet tungkjede-aminosyresekvens som er SEQ ID NO: 42.

I en foretrukken utførelse inneholder VH'et av anti-MAdCAMantistoffet de samme mutasjoner, i forhold til kimlinjeaminosyresekvensen, som et eller flere av VH'ene i antistoffene 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1,

6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod,6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod eller 7.26.4-mod. Påsamme måte som omtalt ovenfor omfatter antistoffet en eller flere av de samme mutasjoner fra en kimlinje som ett eller flere eksemplifiserte antistoffer. I noen utførelser omfatter antistoffet forskjellige substitusjoner ved én eller flere av de samme stillinger som en eller flere av de eksemplifiserte antistoffer. For eksempel kan VH'et av anti-MAdCAM-antistoffet inneholde én eller flere aminosyresubstitusjoner som er de samme som de som fins i antistoff 7.16.6, og en annen aminosyresubstitusjon som er den samme som antistoff 7.26.4. På denne måte kan man blande og tilpasse forskjellige trekk av antistoffbinding for å endre

f.eks. affiniteten av antistoffet for MAdCAM eller dets dissosiasjonshastighet fra antigenet. I en annen utførelse gjøres en aminosyresubstitusjon sammenlignet med kimlinje ved den samme stilling som en substitusjon fra kimlinje som forekommer i ett eller flere av VH'ene av

referanseantistoff 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2,

6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2,

6.22.2- mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod eller

7.26.4- mod, men stillingen er substituert med enforskjellig rest, som er en konservativ substitusjon sammenlignet med referanseantistoffet.

I en annen foretrukken utførelse omfatter den tunge kjede en aminosyresekvens som er den samme som aminosyresekvensen av VH'et i 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1,

6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod,

6.34.2- mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod eller 7.26.4-mod. I enannen sterkt foretrukken utførelse omfatter den tunge kjede aminosyresekvensen som er de samme som CDR-regionene av dentunge kjede i 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1,

6.73.2,6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod,

6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod eller 7.26.4-mod. I enannen foretrukken utførelse omfatter den tunge kjede en aminosyresekvens fra minst én CDR-region av den tunge kjedei 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2,

6.77.1, 7.16.6, 7.20.4, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod eller 7.26.4-mod. I en annenforetrukken utførelse omfatter den tunge kjede aminosyresekvenser med CDRstoffer fra forskjellige tunge kjeder. I en mer foretrukken utførelse oppnås CDR-stoffene fra forskjellige tunge kjeder fra 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2,

6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4,

9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod eller

7.26.4- mod. I en annen foretrukken utførelse omfatter dentunge kjede en aminosyresekvens valgt fra SEQ ID NOS: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42, 46, 52, 56, 60 eller 64 med eller uten signalsekvensen. I en annen utførelse omfatter den tunge kjede en aminosyresekvens kodet av en nukleotidsekvens valgt fra SEQ ID NOS: 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 29, 33, 37, 41, 45, 51, 55, 59 eller 63, eller en nukleotidsekvens som koder en aminosyresekvens med 1-15aminosyre-innsettinger, slettinger eller substitusjoner

derfra. I en annen utførelse er substitusjonene konservative aminosyresubstitusjoner.

Metoder for å produsere antistoffer og antistoffproduserende cellelinjer

Immun i sering

I en utførelse av foreliggende oppfinnelse fremstilles humane antistoffer ved å immunisere et ikke-humant dyromfattende noen eller alle av de humane immunoglobuliniske tung- og lettkjede-loci med et MAdCAM-antigen. I en foretrukken utførelse er det ikke-humane dyr et XENOMOUSE™-dyr,som er en konstruert musestamme som omfatter store fragmenter av de humane immunoglobulin-loci og ermangelfull i museantistoff-produksjon. Se f.eks. Green etal., Nature Genetics 7:13-21 (1994) og United Statespatentnr. 5, 916, 771, 5, 939, 598, 5, 985, 615, 5, 998,209, 6,075,181, 6,091,001, 6,114,598 og 6,130,364. Se også WO 91/10741, WO 94/02602, WO 96/34096 og WO 96/33735, WO 98/16654, WO 98/24893, WO 98/50433, WO 99/45031, WO 99/53049, WO 00 09560 og WO 00/037504. XENOMOUSE ™-dyretproduserer et voksen-lignende humant repertoar av helt uthumane antistoffer og genererer antigen-spesifikke humanemAbs. En andre generasjon XENOMOUSE ™-dyr inneholdertilnærmelsesvis 80% av det humane antistoff V-genrepertoarved innføring av megabase-store, kimlinjekonfigurasjon YACfragmenter av de humane tungkjede-loci og K-lettkjede-loci.I andre utførelser inneholder XENOMOUSE "-mus tilnærmelsesvis hele den humane tungkjede- og Å-lettkjede-locus. SeMendez et al., Nature Genetics 15:146-156 (1997), Green andJakobovits, J. Exp. Med. 188:483-495 (1998).

Oppfinnelsen tilveiebringer også en metode for å fremstille anti-MAdCAM-antistoffer fra ikke-humane, ikke-murine dyrved å immunisere ikke-humane transgene dyr som omfatterhumane immunoglobulin-loci. Man kan produsere slike dyr vedå anvende metodene beskrevet umiddelbart ovenfor. Metodene

beskrevet i disse dokumenter kan modifiseres som beskrevet i U.S. patent 5, 994, 619 ( " ' 619-patentet") . ' 619-patentetbeskriver metoder for å fremstille nye dyrkede indre cellemasse-celler (CICM) og cellelinjer, avledet fra svinog kyr, og transgene CICM-celler i hvilke heterologt DNA erblitt innsatt. CICM-transgene celler kan anvendes til åfremstille klonede transgene embryoner, foster og avkom. ' 619-patentet beskriver også metoder for å fremstilletransgene dyr som er i stand til å overføre det heterologe DNA til sitt avkom. I en foretrukken utførelse kan det ikke-humane dyr være rotter, får, svin, gjeter, kveg ellerhester.

I en annen utførelse er det ikke-humane dyr omfattendehumane immunoglobulin-loci dyr som har en "minilocus" avhumane immunoglobuliner. I minilocus-tilfellet mimes eneksogen Ig-locus ved at det inkluderes individuelle generfra Ig-locusen. Således dannes et eller flere VH-gener, eteller flere DH-gener, et eller flere JH-gener, et p,konstant domene(domener), og et andre konstant domene (domener) (fortrinnsvis et gamma-konstant domene(domener)til et konstrukt for innsetting i et dyr. Denne løsning er beskrevet, inter alia, i U.S. patentnr. 5,545,807, 5,545, 806, 5, 625, 126, 5, 633,425, 5, 661, 016, 5,770,429, 5,789,650, 5,814,318, 5,591,669, 5,612,205, 5,721,367, 5,789,215, og 5,643,763.

En fordel med minilocus-løsningen er hurtigheten medhvilken konstruktinnlemmende deler av Ig-locusen kangenereres og innføres i dyr. Imidlertid er en potensiell ulempe ved minilocus-løsningen at det kanskje ikke ertilstrekkelig immunoglobulin-ulikhet til å understøtte fullB-celle-utvikling, slik at det kan bli lavere antistoffproduksj on.

For å fremstille et humant anti-MAdCAM-antistoff immuniseres et ikke-humant dyr omfattende noen eller alle humaneimmunoglobulin-loci med et MAdCAM-antigen og et antistoff.

eller den antistoff-produserende celle isoleres fra dyret.MAdCAM-antigenet kan være isolert og/eller renset MAdCAM oger fortrinnsvis et humant MAdCAM. I en annen utførelse er MAdCAM-antigenet et fragment av MAdCAM, fortrinnsvis detekstracellulære domene av MAdCAM. I en annen utførelse er MAdCAM-antigenet et fragment som omfatter minst én epitopav MAdCAM. I en annen utførelse er MAdCAM-antigenet encelle som uttrykker MAdCAM på sin celleoverflate, fortrinnsvis en celle som overuttrykker MAdCAM på sin celleoverflate.

Immunisering av dyr kan gjøres ved hjelp av enhver metode som er kjent i faget. Se f.eks. Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press (1990). Metoder for å immunisere ikke-humanedyr så som mus, rotter, får, gjeter, svin, kveg og hester er velkjent i faget. Se f.eks. Harlow and Lane og United States patent 5,994,619. I en foretrukken utførelse administreres MAdCAM-antigenet med en adjuvant for åstimulere immunresponsen. Slike adjuvanter omfatter fullstendig eller ufullstendig Freunds adjuvant, RIBI (muramyldipeptider) eller ISCOM (immunostimulerende komplekser). Slike adjuvanter kan beskytte polypeptidet fra hurtig spredning ved chelatdannelse av det i en lokal deponering, eller de kan inneholde substanser som stimulerer verten til å utskille faktorer som er kjemotaktiske for makrofager og andre komponenter av immunsystemet. Fortrinnsvis vil, hvis et polypeptid administreres, immuniseringsprogrammet medføre to eller flere administrasjoner av polypeptidet, spredd ut over flere uker.

Eksempel I tilveiebringer en protokoll for immunisering av et XENOMOUSE ™-dyr med full-lengdet humant MAdCAM i fosfatbufret saltløsning.

Produksjon av antistoffer og antistoffproduserende cellelinjer

Etter immunisering av et dyr med et MAdCAM-antigen kanantistoffer og/eller antistoff-produserende celler oppnåsfra dyret. Et anti-MAdCAM-antistoff-inneholdende serumoppnås fra dyret ved blødning eller avliving av dyret. Serumet kan anvendes som det er fra dyret, en immunoglobulinfraksjon kan oppnås fra serumet, eller anti-MAdCAMantistoffene kan renses fra serumet.

I en annen utførelse kan antistoff-produserende immortaliserte cellelinjer fremstilles fra det immuniserte dyr. Etter immuniseringen avlives dyret og B-celler immortaliseres under anvendelse av metoder som er velkjent i faget. Metoder for å immortalisere celler omfatter å transfisere dem med onkogener, infisere dem med et onkogenisk virus og dyrke dem under betingelser som velger ut immortaliserte celler, utsette dem for kreftfremkallende eller muterende forbindelser, kombinere dem sammen med en immortalisert celle, f.eks. en myelomcelle, og inaktivere et tumorundertrykkende gen. Se f.eks. Harlow and Lane, supra. I utførelser som involverer myelomcellene, utsondrer myelomcellene ikke immunoglobulinpolypeptider (en ikkesekretorisk cellelinje). Etter immortalisering og antibiotisk utvelgelse utvelges de immortaliserte celler, eller kultursupernatanter derav, under anvendelse av MAdCAM, en del derav eller en celle uttrykkende MAdCAM. I en foretrukken utførelse utføres den initielle utvelgelsen under anvendelse av en enzyme-bundet immunoanalyse (ELISA)eller en radioimmunoanalyse (RIA), fortrinnsvis et ELISA. Et eksempel på ELISA-utvelgelse er gitt i PCT PublicationNo. WO 00/37504.

I en annen utførelse kan antistoff-produserende cellerfremstilles in vitro fra et menneske som har en autoimmun forstyrrelse, og som uttrykker anti-MAdCAM-antistoffer.Celler uttrykkende anti-MAdCAM-antistoffene kan isoleres

ved å isolere hvite blodceller og utsette dem for fluorescens-aktivert cellesortering (FACS) eller ved å spredem ut på plater belagt med MAdCAM eller en del derav. Disse celler kan kombineres med et humant ikke-sekretoriskmyelom for å fremstille humane hybridomer uttrykkende humane anti-MAdCAM-antistoffer. Generelt er dette en mindreforetrukken utførelse, fordi det er sannsynlig at antiMAdCAM-antistoffene vil ha en lav affinitet for MAdCAM.

Anti-MAdCAM-antistoff-produserende celler, f.eks.hybridomer velges, klones og videre sorteres med hensyn til ønskelige karakteristikker, inklusive robust cellevekst, høy antistoffproduksjon og ønskelige antistoffkarakteristikker, som omtalt videre nedenfor. Hybridomer kan dyrkes og utvides in vivo i syngeniske dyr, i dyr som mangler et immunsystem, f.eks. nakne mus, eller i cellekultur in vitro. Metoder for utvelgelse, kloning og utvidelse av hybridomer er velkjent for personer med vanlige kunnskaper i faget.

Fortrinnsvis er det immuniserte dyr et ikke-humant dyr somuttrykker humane immunoglobulingener, og miltens B-cellerkombineres med et myelom avledet fra den samme art som det ikke-humane dyr. Mer foretrukket er det immuniserte dyr etXENOMOUSE™-dyr, og myelomcellelinjen er et ikke-sekretoriskmusemyelom, så som myelomcellelinjen P3-X63-AG8-653 (ATCC).Se f.eks. Eksempel I.

Således kan det for å danne aktuelle cellelinjer som produserer antistoffene, benyttes metoder for å fremstille en cellelinje som produserer et humant monoklonalt antistoff eller et fragment derav rettet mot MAdCAM omfattende (a) å immunisere et ikke-humant transgent dyrbeskrevet heri med MAdCAM, en andel av MAdCAM eller en celle eller vev uttrykkende MAdCAM; (b) gjøre det mulig for det transgene dyr å bygge opp en immunrespons til MAdCAM;

(c) isolere antistoffproduserende celler fra transgene dyr;

(d) immortalisere de antistoffproduserende celler; (e)

opprette individuelle monoklonale populasjoner av de immortaliserte antistoffproduserende celler; og (f) skille ut de immortaliserte antistoff-produserende celler ellerkultursupernatanter derav for å identifisere et antistoff rettet mot MAdCAM.

I ett aspekt tilveiebringer oppfinnelsen hybridomer som produserer humane anti-MAdCAM-antistoffer. I en foretrukkenutførelse er hybridomene musehybridomer, som beskrevet ovenfor. I en annen utførelse produseres hybridomene i en ikke-human, ikke-murin art så som rotter, får, svin,gjeter, kveg eller hester. I en annen utførelse er hybridomene humane hybridomer, hvori et humant ikke-sekretoriskmyelom er kombinert med en human celle uttrykkende et antiMAdCAM-antistoff.

Nukleinsyrer, vektorer, vertsceller og rekombinante metoder for å fremstille antistoffer

Nukleinsyrer

Nukleinsyremolekyler som koder anti-MAdCAM-antistofferifølge oppfinnelsen, tilveiebringes. I en utførelse koder nukleinsyremolekylet en tung og/eller lett kjede av et anti-MAdCAM immunoglobulin som angitt i krav 1. I enforetrukken utførelse koder et enkelt nukleinsyremolekyl en slik tung kjede av et anti-MAdCAM immunoglobulin, og etannet nukleinsyremolekyl koder den aktuelle lette kjede av et anti-MAdCAM-immunoglobulin. I en mer foretrukkenutførelse er det kodede immunoglobulin et humant immunoglobulin, fortrinnsvis et humant IgG. Den kodede lette kjede kan være en Å-kjede eller en K-kjede,fortrinnsvis en K-kjede.

I en foretrukken utførelse omfatter nukleinsyremolekylet som koder den variable region av den lette kjede, kimlinjesekvensen av et humant Vk A2-, A3-, A26-, B3-, 012- eller018-gen eller en variant av nevnte sekvens. I en fore

trukken utførelse omfatter nukleinsyremolekylet som koder den lette kjede, en sekvens avledet fra et humant JkI-,Jk2-, Jk3-, Jk4- eller JuS-gen. I en foretrukken utførelsekoder nukleinsyremolekylet som koder den lette kjede, ikke mer enn elleve aminosyreendringer fra kimlinje A2-, A3-,A26-, B3-, 012- eller 018 Vn-genet, fortrinnsvis ikke merenn seks aminosyreendringer, og enda mer foretrukket ikke mer enn tre aminosyreendringer. I en mer foretrukken utførelse er nukleinsyren som koder den lette kjede, kimlinj esekvensen.

Oppfinnelsen tilveiebringer et nukleinsyremolekyl som koder for slike antistoffer og som har en variabel region av den lette kjede (VL) inneholdende opp til elleve aminosyreendringer sammenlignet med kimlinjesekvensen, hvori aminosyre-endringene er identiske med aminosyre-endringerfra kimlinjesekvensen fra VL'et i ett av antistoffene

1.7.2,1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2,

6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod eller 7.26.4-mod. Oppfinnelsentilveiebringer også et slikt nukleinsyremolekyl omfattende en nukleotidsekvens som koder aminosyresekvensen av den variable region av den lette kjede i 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2,

6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1mod eller 7.26.4-mod. Oppfinnelsen tilveiebringer også etslikt nukleinsyremolekyl omfattende en nukleotidsekvens som koder aminosyresekvensen av et eller flere av CDR-stoffeneav enhver av de lette kjeder i 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2,

6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1mod eller 7.26.4-mod. I en foretrukken utførelse omfatternukleinsyremolekylet en nukleotidsekvens som koder aminosyresekvensen i alle CDR-stoffene i enhver av de lettekjeder i 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1,

6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod,6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod eller 7.26.4-mod. I enannen utførelse omfatter nukleinsyremolekylet en

nukleotidsekvens som koder aminosyresekvensen i et av SEQ ID NOS: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 54,

58, 62, 66, 68 eller omfatter en nukleotidsekvens i et av

SEQ ID NOS: 3, 7, 11, 15, 19, 23, 27, 31, 35, 39, 43, 47,

53, 57, 61, 65 eller 67. I en annen foretrukken utførelse

omfatter nukleinsyremolekylet en nukleotidsekvens som koder aminosyresekvensen i et eller flere av CDR-stoffene ienhver av SEQ ID NOS: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 54, 58, 62, 66, 68 eller omfatter en nukleotidsekvens av en eller flere av CDR-stoffene i enhver av SEQID NOS: 3, 7, 11, 15, 19, 23, 27, 31, 35, 39, 43, 47, 53, 57, 61, 65, eller 67. I en mer foretrukken utførelse omfatter nukleinsyremolekylet en nukleotidsekvens som koder aminosyresekvensen i alle CDR-stoffer i enhver av SEQ IDNOS: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 54, 58, 62, 66, 68 eller omfatter nukleotidsekvensen av alle CDRstoffene i enhver av SEQ ID NOS: 3, 7, 11, 15, 19, 23, 27, 31, 35, 39, 43, 47, 53, 57, 61, 65, eller 67.

Oppfinnelsen tilveiebringer også et slikt nukleinsyremolekyl som koder en aminosyresekvens av et VL som har en aminosyresekvens som er minst 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% eller 99% identisk med et VL beskrevet ovenfor, spesielt et VL som omfatter en aminosyresekvens av ett av SEQ ID NOS: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 54, 58, 62, 66 eller 68. Oppfinnelsen tilveiebringer også en nukleotidsekvens som er minst 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% eller 99% identisk med en nukleotidsekvens av et av SEQ ID NOS: 3, 7, 11, 15, 19, 23, 27, 31, 35, 39, 43, 47, 53, 57, 61, 65 eller 67.

I en annen utførelse tilveiebringer oppfinnelsen et slikt nukleinsyremolekyl som hybridiseres under høy-stringentebetingelser til et nukleinsyremolekyl som koder et VL som beskrevet ovenfor, spesielt et nukleinsyremolekyl som omfatter en nukleotidsekvens som koder en aminosyresekvens av SEQ ID NOS: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 54, 58, 62, 66 eller 68. Oppfinnelsen tilveiebringer

også et slikt nukleinsyremolekyl som hybridiseres under høy-stringente betingelser til et nukleinsyremolekylomfattende en nukleotidsekvens av et av SEQ ID NOS: 3, 7, 11, 15, 19, 23, 27, 31, 35, 39, 43, 47, 53, 57, 61, 65 eller 67.

Oppfinnelsen tilveiebringer også et slikt nukleinsyremolekyl som koder en tungkjedet variabel region (VH) som benytter et humant VH 1-18-, 3-15-, 3-21-, 3-23-, 3-30-, 333- eller 4-4 VH-gen. I noen utførelser benytternukleinsyremolekylet som koder VH-genet, videre et humantJH4- eller JH6-familie-gen. I noen utførelser benytternukleinsyremolekylet som koder VH-genet, det humane JH4beller JH6b-gen. I en annen utførelse omfatternukleinsyremolekylet en sekvens avledet fra et humant D 310-, 4-23-, 5-5-, 6-6-eller 6-19-gen. I en enda merforetrukken utførelse inneholder nukleinsyremolekylet som koder VH'et, ikke mer enn femten aminosyre-endringer frakimlinjens VH 1-18-, 3-15-, 3-21-, 3-23-, 3-30-, 3-33eller 4-4-gener, fortrinnsvis ikke mer enn seksaminosyreendringer, og enda mer foretrukket ikke mer enn tre aminosyre-endringer. I en høyst foretrukken utførelseinneholder nukleinsyremolekylet som koder VH'et, minst én aminosyreendring sammenlignet med kimlinjesekvensen, hvori aminosyreendringen er identisk med en aminosyreendring fra kimlinjesekvensen fra den tunge kjede av et av antistoffene

1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod eller 7.26.4-mod. I en enda merforetrukken utførelse inneholder VH'et ikke mer enn femten aminosyreendringer sammenlignet med kimlinjesekvensene, hvori endringene er identiske med endringene fra

kimlinjesekvensen fra VH'et i et av antistoffene 1.7.2,

1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod,6.67.1-mod, 6.77.1-mod eller 7.26.4-mod.

I en utførelse omfatter nukleinsyremolekylet en nukleotidsekvens som koder aminosyresekvensen i VH'et av 1.7.2,

1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod,6.67.1-mod, 6.77.1-mod eller 7.26.4-mod. I en annenutførelse omfatter nukleinsyremolekylet en nukleotidsekvens som koder aminosyresekvensen i én eller flere av CDRstoffene av den tunge kjede i 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2,

6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4,

9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod eller7.26.4-mod. I en foretrukken utførelse omfatter nukleinsyremolekylet nukleotidsekvenser som koder aminosyresekvensene av alle CDR-stoffene i den tunge kjede i 1.7.2,

1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod,6.67.1-mod, 6.77.1-mod eller 7.26.4-mod. I en annenforetrukken utførelse omfatter nukleinsyremolekylet en nukleotidsekvens som koder aminosyresekvensen i ett av SEQ ID NOS: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42, 46, 52, 56, 60 eller 64 eller som omfatter en nukleotidsekvens i et av SEQ ID NOS: 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 29, 33, 37, 41, 45, 51, 55, 59 eller 63. I en annen foretrukken utførelse omfatter nukleinsyremolekylet en nukleotidsekvens som koder aminosyresekvensen av ett eller flere av CDR-stoffene avethvert av SEQ ID NOS: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42, 46, 52, 56, 60 eller 64 eller omfatter en nukleotidsekvens av ett eller flere av CDR-stoffene avethvert av SEQ ID NOS: 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 29, 33, 37, 41, 45, 51, 55, 59 eller 63. I en foretrukken utførelse omfatter nukleinsyremolekylet en nukleotidsekvens som koder aminosyresekvensene av alle CDR-stoffene av ethvert av SEQID NOS: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42, 46, 52, 56, 60 eller 64 eller omfatter en nukleotidsekvens av alle CDR-stoffene av ethvert av SEQ ID NOS: 1, 5, 9, 13, 17, 21,25, 29, 33, 37, 41 45, 51, 55, 59 eller 63. I noen utførelser omfatter nukleinsyremolekylet en nukleotidsekvens som koder en tilgrensende region fra begynnelsen av

CDR1 til enden av CDR3 av en tung eller lett kjede i enhver av ovennevnte anti-MAdCAM-antistoffer.

I en annen utførelse koder nukleinsyremolekylet en aminosyresekvens av et VH som er minst 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% eller 99% identisk med én av aminosyresekvensene som koder et VH som beskrevet umiddelbart ovenfor, spesielt til et VH som omfatter en aminosyresekvens i ett av SEQ ID NOS: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42, 46, 52, 56, 60 eller 64. Oppfinnelsen tilveiebringer også en nukleotidsekvens som er minst 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% eller 99% identisk med en nukleotidsekvens i ett av SEQ ID NOS: 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 29, 33, 37, 41, 45, 51, 55, 59 eller 63.

I en annen utførelse er nukleinsyremolekylet som koder et VH, et molekyl som hybridiseres under høy-stringentebetingelser til en nukleotidsekvens som koder et VH som beskrevet ovenfor, spesielt til et VH som omfatter en aminosyresekvens i ett av SEQ ID NOS: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42, 46, 52, 56, 60 eller 64. Oppfinnelsen tilveiebringer også en nukleotidsekvens som koder et VH som hybridiseres under høy-stringente betingelser til etnukleinsyremolekyl omfattende en nukleotidsekvens i ett av SEQ ID NOS: 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 29, 33, 37, 41, 45, 51, 55, 59 eller 63.

Nukleotidsekvensen som koder enten en eller begge av hele de tunge og lette kjeder av et anti-MAdCAM-antistoff ellerde variable regioner derav, kan oppnås fra enhver kilde som produserer et anti-MAdCAM-antistoff. Metoder for å isoleremRNA som koder et antistoff, er velkjent i faget. Se f.eks. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989). mRNA kan anvendes til å fremstille cDNA for anvendelse i polymerasekjedereaksjonen (PCR) eller cDNA-kloning av antistoffgener. I en utførelse av oppfinnelsen kan nukleinsyremolekylene oppnås fra et hybridom som

uttrykker et anti-MAdCAM-antistoff, som beskrevet ovenfor,fortrinnsvis et hybridom som har som en av sine fusjonspartnere en transgen dyrecelle som uttrykker humane immunoglobulingener, så som et XENOMOUSE ™-dyr, et ikke-humantmurint transgent dyr eller et ikke-human, ikke-murinttransgent dyr. I en annen utførelse er hybridomet avledet fra et ikke-humant, ikke-transgent dyr, som kan anvendes,f.eks. for humaniserte antistoffer.

Et nukleinsyremolekyl som koder hele den tunge kjede av et anti-MAdCAM-antistoff kan konstrueres ved å kombinere etnukleinsyremolekyl som koder hele det variable domene av en tung kjede eller et antigen-bindende domene derav med etkonstant domene av en tung kjede. På lignende måte kan et nukleinsyremolekyl som koder den lette kjede av et antiMAdCAM-antistof f, konstrueres ved å kombinere etnukleinsyremolekyl som koder det variable domene av en lett kjede eller et antigen-bindende domene derav med etkonstant domene av en lett kjede. Nukleinsyremolekyler som koder VH- og VL-regioner, kan omdannes til full-lengdedeantistoffgener ved å sette dem inn i ekspresjonsvektorer som allerede koder respektive tungkjedekonstante og lettkjedekonstante regioner, slik at VH-segmentet eroperativt bundet til det(de) tungkjedede konstante regionsegment(segmenter) (CH) innen vektoren, og VL-segmentet eroperativt bundet til det lettkjedede konstante regionsegment (CL) innen vektoren. Alternativt omdannes nukleinsyremolekylene som koder VH- eller VL-kjedene til fulllengdede antistoffgener ved binding, f.eks. ligering, av nukleinsyremolekylet som koder en VH-kjede til et nukleinsyremolekyl som koder en CH-kjede under anvendelse avstandard molekylbiologiske teknikker. Det samme kan oppnås under anvendelse av nukleinsyremolekyler som koder VL- ogCL-kjeder. Sekvensene av humane tung- og lettkjededekonstante regiongener er kjent i faget. Se f.eks. Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., NIH Publ. No. 91-3242 (1991). Nukleinsyremolekyler somkoder de full-lengdede tunge og/eller lette kjeder, kan

deretter uttrykkes fra en celle i hvilken de er blitt innført og anti-MAdCAM-antistoffet isoleres.

I en foretrukken utførelse koder nukleinsyren som koder den variable region av den tungkjedede variable region av aminosyresekvenser av SEQ ID NOS: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42, 46, 52, 56, 60 eller 64, og nukleinsyremolekylet som koder den variable region av de lette kjeder, koder den variable region av aminosyresekvenser av SEQ ID NOS: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 54, 58, 62, 66 eller 68.

I en utførelse kan et nukleinsyremolekyl som koder enten den tunge kjede i et anti-MAdCAM-antistoff eller enantigen-bindende del derav, eller den lette kjede i etanti-MAdCAM-antistoff eller en antigen-bindende del deravisoleres fra et ikke-humant, ikke-murint dyr som uttrykkerhumane immunoglobulingener og er blitt immunisert med et MAdCAM-antigen. I en annen utførelse kan nukleinsyremolekylet isoleres fra en anti-MAdCAM-antistoffproduserende celle avledet fra et ikke-transgent dyr somproduserer anti-MAdCAM-antistoffer. mRNA fra de antiMAdCAM-antistof f-produserende celler kan isoleres ved hjelpav standardiserte teknikker, klones og/eller amplifiseres under anvendelse av PCR og bibliotekskonstruksjonsteknikker, og utsepareres under anvendelse av standardprotokoller for å oppnå nukleinsyremolekyler som koder anti-MAdCAM-tung- og lettkjeder.

Nukleinsyremolekylene kan anvendes til rekombinant å uttrykke store mengder av anti-MAdCAM-antistoffer, sombeskrevet nedenfor. Nukleinsyremolekylene kan også anvendes til å fremstille chimæriske antistoffer, enkeltkjedede antistoffer, immunoadhesiner, diastoffer, muterte antistoffer og antistoffderivater, som beskrevet ytterligere nedenfor. Hvis nukleinsyremolekylene er avledet fra et ikke-humant, ikke-transgent dyr, kan nukleinsyre

molekylene anvendes for antistoffhumanisering, også som beskrevet nedenfor.

I en annen utførelse kan nukleinsyremolekylene ifølge oppfinnelsen anvendes som prober eller PCR-primere forspesifikke antistoffsekvenser. For eksempel kan en nukleinsyremolekylprobe anvendes i diagnostiske metoder eller en nukleinsyremolekyl-PCR-primer kan anvendes til åamplifisere regioner av DNA som vil kunne anvendes inter alia til å isolere nukleotidsekvenser for anvendelse i produserende variable domener i anti-MAdCAM-antistoffer. Ien foretrukken utførelse er nukleinsyremolekylene oligonukleotider. I en mer foretrukken utførelse er oligonukleotidene fra sterkt variable regioner av de tunge og lette kjeder av antistoffet av interesse. I en enda mer foretrukken utførelse koder oligonukleotidene hele eller en del av ett eller flere av CDR-stoffene.

Vektorer

Oppfinnelsen tilveiebringer vektorer omfattende nukleinsyremolekylene ifølge oppfinnelsen som koder den tunge kjede eller den antigen-bindende del derav som angitt ikrav 15. Oppfinnelsen tilveiebringer også vektorer omfattende nukleinsyremolekylene ifølge oppfinnelsen som koder den lette kjede eller antigen-bindende del derav.Oppfinnelsen tilveiebringer også vektorer omfattende nukleinsyremolekyler som koder fusjonsproteiner, modifiserte antistoffer, antistoff-fragmenter og proberderav.

For å uttrykke antistoffene, eller antistoffdeler ifølge oppfinnelsen, innsettes DNAer som koder partielle eller full-lengdede lette og tunge kjeder, oppnådd som beskrevetovenfor, inn i ekspresjonsvektorer slik at genene er operativt bundet til transkripsjonale og translasjonale kontrollsekvenser. Ekspresjonsvektorer omfatter plasmider, retroviruser, adenoviruser, adeno-forbundne viruser (AAV),

planteviruser så som blomkålmosaikkvirus, tobakkmosaikkvirus, kosmider, YAC-stoffer, EBV-avledede episomer oglignende. Antistoffgenet ligeres inn i en vektor slik at transkripsjonale og translasjonale kontrollsekvenser innen vektoren tjener sin tiltenkte funksjon å regulere transkripsjonen og translasjonen av antistoffgenet.

Ekspresjonssvektoren og ekspresjonkontrollsekvensene velges slik at de er kompatible med ekspresjonsvertscellen som er anvendt. Antistoffets lettkjedegen og antistoffets tungkjedegen kan innsettes i en separat vektor. I en foretrukken utførelse innsettes begge gener i den samme ekspresjonsvektor. Antistoffgenene innsettes i ekspresjonsvektoren ved hjelp av vanlige metoder (f.eks. ligasjon av komplementære restriksjonsseter på antistoffgenfragmentet og vektoren, eller buttende-ligasjon hvis ingenrestriksjonsseter er nærværende).

En bekvem vektor er en vektor som koder en funksjonelt fullstendig human CH- eller CL-immunoglobulinsekvens, medpassende restriksjonsseter konstruert slik at enhver VHeller VL-sekvens lett kan innsettes og uttrykkes, sombeskrevet ovenfor. I slike vektorer opptrer spleising vanligvis mellom spleisedonorsetet i den innsatte J-regionog spleiseakseptorsetet foran den humane C-region, og ogsåved spleisregionene som opptrer innenfor de humane CHexoner. Polyadenylering og transkripsjonsterminering opptrer ved naturlige kromosomseter nedstrøms for de kodende regioner. Den rekombinante ekspresjonsvektor kan også kode et signalpeptid som underletter sekresjon av antistoffkjeden fra en vertscelle. Antistoffkjedegenet kan klones inn i vektoren slik at signalpeptidet er bundet i leserammen i forhold til aminoterminusen av antistoffkjedegenet. Signalpeptidet kan være et immunoglobulinsignalpeptid eller et heterologt signalpeptid (dvs. et signalpeptid fra et ikke-immunoglobulinprotein).

I tillegg til antistoffkjedegenene bærer de rekombinante ekspresjonsvektorer ifølge oppfinnelsen regulatoriske

sekvenser som kontrollerer ekspresjonen av antistoffkjedegenene i en vertscelle. Det vil være underforstått av personer med kunnskaper i faget at utformingen av ekspresjonsvektoren, inklusive valget av regulatoriske sekvenser kan avhenge av slike faktorer som valget av vertscellen som skal transformeres, nivået av ekspresjon av ønsket protein, etc. Foretrukne regulatoriske sekvenser for pattedyrs vertscelleekspresjon omfatter virale elementer som leder til høye nivåer av proteinekspresjon i pattedyrceller, så som promotere og/eller forsterkere avledet fra retrovirale LTRstoffer, cytomegalovirus (CMV) (så som CMVpromoteren/ forsterkeren), Simian Virus 40 (SV40) (så som SV40-promoteren/forsterkeren), adenovirus, (f.eks. denadenovirus-vesentlige sene promoter (AdMLP)), polyom ogsterke pattedyrpromotere så som naturlige immunoglobulinog aktinpromotere. For videre beskrivelse av virale regulatoriske elementer og sekvenser derav, se f.eks. U.S. patentnr. 5,168,062, 4,510,245 og 4,968,615. Metoder for å uttrykke antistoffer i planter, inklusive en beskrivelse av promotere og vektorer, samt transformasjon av planter er kjent i faget. Se f.eks. United States patent 6,517,529. Metoder for å uttrykke polypeptider i bakterielle celler eller fungale celler, f.eks. gjærceller, er også velkjent i faget.

I tillegg til antistoffkjedegenene og regulatoriske sekvenser kan de rekombinante ekspresjonsvektorer ifølge oppfinnelsen bære ytterligere sekvenser, så som sekvenser som regulerer reproduksjonen av vektoren i vertceller (f.eks. reproduksjonsopphavet) og valgbare markeringsgener. Det valgbare markeringsgen underletter valget av vertceller i hvilken vektoren er blitt innført (se f.eks. U.S. patentnr. 4,399,216, 4,634,665 og 5,179,017). For eksempel gir normalt det valgbare markeringsgen resistens mot medisiner, så som G418, hygromycin eller metotreksat, på en vertscelle i hvilken vektoren er blitt innført. Foretrukne valgbare markeringsgener omfatter dihydrofolatreduktasegenet (DHFR) (for anvendelse i dhfr-vertsceller med

metotreksat-utvelgelse/amplifikasjon) og neo-genet (forG418-utvelgelse), og glutamatsyntetase-genet

Ikke-hybridomvertsceller og metoder for rekombinant åprodusere protein

Nukleinsyremolekyler som koder den tunge kjede eller en antigen-bindende del derav og/eller den lette kjede elleren antigen-bindende del derav av et anti-MAdCAM-antistoff,og vektorer omfattende disse nukleinsyremolekyler, kan anvendes for transformasjon av en passende plante-,bakterie- eller gjærvertscelle. Transformasjonen kan foregåved enhver kjent metode for å innføre polynukleotider i en vertscelle. Metoder for innføring av heterologe polynukleotider inn i pattedyrceller er velkjent i faget og omfatter dekstran-mediert transfeksjon, kalsiumfosfat-utfelling,polybren-mediert transfeksjon, protoplast-fusjon, elektroporasjon, innkapsling av polynukleotidet(ene) i liposomer, biolistisk injeksjon og direkte mikroinjeksjon av DNA'et inn i kjernene. I tillegg kan nukleinsyremolekyler innføres i pattedyrceller av virale vektorer. Metoder for å transformere celler er velkjent i faget. Se f.eks. U.S. patentnr. 4,399,216, 4,912,040, 4,740,461 og 4,959,455. Metoder for å transformere planteceller er velkjent i faget, inklusive f.eks. agrobacterium-mediert transformasjon, biolistisk transformasjon, direkte injeksjon, elektroporasjon og viral transformasjon. Metoder for å transformere bakterie- og gjærceller er også vekjent ifaget.

Pattedyrcellelinjer som er tilgjengelige som verter for ekspresjon, er velkjent i faget og omfatter mange immortaliserte cellelinjer som er tilgjengelige fra the American Type Culture Collection (ATCC). Disse omfatter, inter alia, kinesiske hamsterovarieceller (CHO), NS0, SP2-celler, HEK293T-celler, NIH-3T3-celler, HeLa-celler, babyhamsternyreceller (BHK), apenyreceller (COS), humane hepatocellulære karsinomceller (f.eks. Hep G2), A549-celler, 3T3

celler, og et antall andre cellelinjer. Pattedyrvertceller omfatter humane, murine celler, rotte-, hunde-, ape-,svine-, gjet-, okse-, hest- og hamster-celler. Cellelinjerav spesiell preferanse velges ved å bestemme hvilke cellelinjer som har høye ekspresjonsnivåer. Andre cellelinjer som kan anvendes, er insekt-cellelinjer, så som Sf9-celler,amfibieceller, bakterieceller, planteceller og soppceller. Når rekombinante ekspresjonsvektorer som koder den tunge kjede eller den antigen-bindende del derav, den lette kjedeog/eller den antigen-bindende del derav, innføres ipattedyrvertsceller, fremstilles antistoffene ved å dyrke vertscellene i en tidsperiode som er tilstrekkelig for å muliggjøre ekspresjon av antistoffet i vertscellene eller, mer foretrukket, sekresjon av antistoffet inn i kulturmediet hvori vertscellene dyrkes. Antistoffene kan utvinnes fra kulturmediet under anvendelse av standardiserte proteinrensemetoder. Plantevertsceller omfatter f.eks. Nicotiana, Arabidopsis, andemat, mais, hvete, potet etc. Bakterievertsceller omfatter E. Coli- og Streptomycesstammer. Gjærvertsceller omfatter Schizosaccharomyces pombe, Saccharomyces cerevisiae og Pichia pastoris.

Videre kan ekspresjon av antistoffer ifølge oppfinnelsen (eller andre grupper derfra) fra produksjonscellelinjer forsterkes under anvendelse av et antall kjente teknikker. For eksempel er glutaminsyntetase-genekspresjonssystemet(GS-systemet) en vanlig måte å forsterke ekspresjonen påunder visse betingelser. GS-systemet er omtalt i i sinhelhet eller delvis i forbindelse med Europeisk patentnr. 0 216 846, 0 256 055, 0 338 841 og 0 323 997.

Det er sannsynlig at antistoff uttrykt av forskjellige cellelinjer eller i transgene dyr vil ha forskjellig glykosylering fra hverandre. Imidlertid er alle antistoffer kodet av nukleinsyremolekylene som tilveiebringes heri, eller omfattende aminosyresekvensene som tilveiebringes heri, en del av foreliggende oppfinnelse, uten hensyn til glykosyleringen av antistoffene.

Transgene dyr og planter

Oppfinnelsen tilveiebringer også transgene ikke-humane dyrog transgene planter omfattende et eller flere nukleinsyremolekyler ifølge oppfinnelsen, hvilke kan anvendes til å fremstille antistoffer ifølge oppfinnelsen. Antistoffer kan produseres i og utvinnes fra vev eller kroppsvæsker, så som melk, blod eller urin, fra gjeter, kyr, hester, svin, rotter, mus, kaniner, hamstere eller andre pattedyr. Se f.eks. U.S. patentnr. 5,827,690, 5,756,687, 5,750,172 og 5,741,957. Som beskrevet ovenfor kan ikke-humane transgenedyr som omfatter humane immunoglobulin-loci immuniseres medMAdCAM eller en del derav. Metoder for å fremstille antistoffer i planter er beskrevet, f.eks. i U.S. patentene 6,046,037 og 5,959,177.

I en annen utførelse fremstilles ikke-humane transgene dyrog transgene planter ved å innføre et eller flere nukleinsyremolekyler ifølge oppfinnelsen inn i dyret eller planten ved standardiserte transgeniske teknikker. Se Hogan supra. De transgene celler som anvendes for å fremstille det transgene dyr, kan være embryoniske stamceller, somatiske celler eller befruktede eggceller. De transgene ikke-humaneorganismer kan være chimæriske, ikke-chimæriskeheterozygoter og ikke-chimæriske homozygoter. Se f.eks.Hogan et al., Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual 2ed., Cold Spring Harbor Press (1999); Jackson et al., Mouse Genetics and Transgenics: A Practical Approach, Oxford University Press (2000); og Pinkert, Transgenic Animal Technology: A Laboratory Handbook, Academic Press (1999). I en annen utførelse kan de transgene ikke-humaneorganismer ha en tilsiktet splittelse og erstatning som koder en tung kjede og/eller en lett kjede av interesse. I en foretrukken utførelse omfatter og uttrykker de transgene dyr eller planter nukleinsyremolekyler som koder tunge og lette kjeder som kombineres og bindes spesifikt til MAdCAM, fortrinnsvis humant MAdCAM. I en annen utførelse omfatter de transgene dyr eller planter nukleinsyremolekyler som

koder et modifisert antistoff så som et enkeltkjedet antistoff, et chimærisk antistoff eller et humanisert antistoff. Anti-MAdCAM-antistoffene kan være fremstilt iethvert transgent dyr. I en foretrukken utførelse er det ikke-humane dyr mus, rotter, får, svin, gjeter, kveg ellerhester. Det ikke-humane transgene dyr uttrykker nevntekodede polypeptider i blod, melk, urin, saliva, tårer, slim og andre kroppsvæsker.

Bakte riofagi ske display-samlinger

Oppfinnelsen tilveiebringer en metode for å fremstille et anti-MAdCAM-antistoff eller en antigen-bindende del deravomfattende trinnene å syntetisere en samling av humane antistoffer på bakteriofag, undersøke samlingen med en MAdCAM eller en del derav, isolere bakteriofag som binder MAdCAM, og oppnå antistoffet fra bakteriofagen. En metode for å fremstille samlingen av antistoffer omfatter trinnene å immunisere et ikke-humant vertsdyr omfattende et humantimmunoglobulin-locus med MAdCAM eller en antigen del deravfor å fremkalle en immunrespons, ekstrahere celler fra vertsdyrcellene som er ansvarlige for produksjon av antistoffer; isolere RNA fra de ekstraherte celler, reverstranskribere RNA'et for å fremstille cDNA, amplifisere cDNA'et under anvendelse av en primer, og innsette cDNA'et i en bakteriofagdisplay-vektor slik at antistofferuttrykkes på bakteriofagen. Rekombinante anti-MAdCAMantistof fer ifølge oppfinnelsen kan oppnås på denne måte.

Rekombinante anti-MAdCAM humane antistoffer ifølgeoppfinnelsen kan i tillegg til anti-MAdCAM-antistoffenebeskrevet heri isoleres ved utvelgelse fra en rekombinant kombinatorisk antistoffsamling, fortrinnsvis en scFvbakteriofagdisplay-samling, fremstilt under anvendelse avhumane VL og VH cDNA'er fremstilt fra mRNA isolert fra humane lymfocytter. Metodologier for å fremstille og undersøke slike samlinger er kjent i faget. Det fins kommersielt tilgjengelige sett for å generere

bakteriofagdisplay-samlinger (f.eks. the PharmaciaRecombinant Phage Antibody System, catalog no. 27-9400-01;og Stratagene SurfZAP™-phage display kit, catalog no.240612). Det fins også andre metoder og reagenser som kan anvendes for å generere og undersøke antistoffdisplaysamlinger (se f.eks. U.S. patentnr. 5,223,409; PCT publikasjonsnr. WO 92/18619; PCT publikasjonsnr. WO 91/17271; PCT publikasjonsnr. WO 92/20791; PCT publikasjonsnr. WO 92/15679; PCT publikasjonsnr. WO 93/01288; PCT publikasjonsnr. WO 92/01047; PCT publikasjonsnr. WO 92/09690; Fuchs et al. (1991), Biotechnology, 9:1369-1372; Hay et al.. Hum. Antibod.Hybridomas, 3:81-85 (1992); Huse et al., Science,246:1275-1281 (1989); McCafferty et al., Nature,348:552-554 (1990); Griffiths et al., EMBO J, 12:725-734(1993); Hawkins et al., J. Mol. Biol., 226:889-896 (1992);Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991); Gram et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:3576-3580 (1992); Garrad etal., Biotechnology, 9:1373-1377 (1991); Hoogenboom et al.,Nuc Acid Res, 19:4133-4137 (1991); og Barbas et al., Proc.Natl. Acad. Sci. USA, 88:7978-7982 (1991).

I en foretrukken utførelse anvendes for å isolere humane anti-MAdCAM-antistoffer med de ønskede karakteristikker,først et humant anti-MAdCAM-antistoff som beskrevet herifor å velge humane tung- og lettkjedede sekvenser med lignende bindingsaktivitet overfor MAdCAM, idet man anvender de epitope påtrykkingsmetoder beskrevet i Hoogenboom et al., PCT publikasjonsnr.. WO 93/06213. Antistoffsamlingene anvendt i denne metode er fortrinnsvis scFv-samlingerfremstilt og utvalgt som beskrevet i McCafferty et al., PCT publikasjonsnr. WO 92/01047, McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990); og Griffiths et al., EMBO J, 12:725-734(1993). scFv-antistoffsamlingene undersøkes fortrinnsvisved å anvende humant MAdCAM som antigen.

Straks initielle humane VL- og VH-segmenter er valgt,utføres "blande og tilpasse"-eksperimenter, hvori

forskjellige par av de initielt valgte VL- og VH-segmenterundersøkes og velges med hensyn til MAdCAM-binding, for åvelge foretrukne VL/VH-parkombinasjoner. Dessuten, forytterligere å forbedre kvaliteten av antistoffet, kan VLog VH-segmenter av det/de foretrukne VL/VH-par værevillkårlig mutert, fortrinnsvis innen CDR3-regionen av VHog/eller VL, i en prosess som er analog med den in vivo somatiske mutasjonsprosess som er ansvarlig for affinitetsmodningen av antistoffer under en naturlig immunrespons. Denne in vitro affinitetsmodning kan oppnås ved å amplifisere VH- og VL-regioner under anvendelse av PCRprimere som er komplimenterende med respektive VH CDR3 eller VL CDR3, hvilke primere er blitt "tilsatt" med en villkårlig blanding av de fire nukleotid-baser i vissestillinger slik at de resulterende PCR-produkter koder VHog VL-segmenter i hvilke villkårlige mutasjoner er blittinnført i VH og/eller VL CDR3-regionene. Disse villkårligmuterte VH- og VL-segmenter kan undersøkes og velges pånytt med hensyn til binding til MAdCAM.

Etter utvelgelse og isolering av et anti-MAdCAM-antistoffifølge oppfinnelsen fra en rekombinant immunoglobulindisplay-samling, kan nukleinsyre som koder det valgteantistoff gjenvinnes fra display-pakken (f.eks. frabakteriofaggenomet) og sub-klones inn i andre ekspresjonsvektorer ved standardiserte rekombinante DNA-teknikker.Hvis ønsket, kan nukleinsyren ytterligere manipuleres for å lage andre antistoff-former av oppfinnelsen, som beskrevetnedenfor. For å uttrykke et rekombinant humant antistoff som er isolert ved utvelgelse fra en kombinatorisk samling, klones DNA'et som koder antistoffet, inn i en rekombinant ekspresjonsvektor og innføres inn i et pattedyrs vertsceller, som beskrevet ovenfor.

Klassebytte

Et annet aspekt av foreliggende oppfinnelse er å tilveiebringe en mekanisme hvorved klassen av et anti-MAdCAM

antistoff kan byttes med en annen. I ett aspekt av oppfinnelsen isoleres et nukleinsyremolekyl som koder VL eller VH under anvendelse av metoder som er velkjent i faget slik at det ikke omfatter noen nukleotidsekvenser som koder CL eller CH. Nukleinsyremolekylet som koder VL eller VH, bindes deretter operativt til en nukleotidsekvens som koder et CL eller CH fra en forskjellig klasse av immunoglobulinmolekyler. Dette kan oppnås under anvendelse av en vektor eller et nukleinsyremolekyl som omfatter en CLeller CH-kodende sekvens, som beskrevet ovenfor. Foreksempel kan et anti-MAdCAM-antistoff som opprinnelig varIgM, klassebyttes til et IgG. Videre kan klassebytte anvendes til å omdanne en IgG-underklasse til en annen,f.eks. fra IgG4 til IgG2- En foretrukken metode for åfremstille et antistoff ifølge oppfinnelsen omfattende en ønsket isotype eller antistoff-underklasse omfattertrinnene å isolere en nukleinsyre som koder den tunge kjede i et anti-MAdCAM-antistoff og en nukleinsyre som koder denlette kjede av et anti-MAdCAM-antistoff, å oppnå denvariable region av den tunge kjede, å ligere den variable region av den tunge kjede med det konstante domene av en tung kjede av den ønskede isotype, å uttrykke den lette kjede og den ligerte tunge kjede i en celle, og å samle anti-MAdCAM-antistoffet med den ønskede isotype.

Antistoffderivater

Man kan anvende nukleinsyremolekylene beskrevet ovenfor til å generere antistoffderivater ved å anvende teknikker og metoder som er kjent for en person med kunnskaper i faget.

Humaniserte antistoffer

Immunogenisiteten av ikke-humane antistoffer kan reduserestil en viss grad ved å anvende teknikker for humanisering, potensielt anvende display-teknikker under anvendelse avpassende samlinger. Det vil være underforstått at murine antistoffer eller antistoffer fra andre arter kan humani

seres eller primatiseres ved å anvende teknikker som er velkjent i faget. Se f.eks. Winter and Harris, Immunol Today, 14:43-46 (1993) og Wright et al., Crit. Reviews inImmunol., 12125-168 (1992). Antistoffet av interesse kankonstrueres ved rekombinante DNA-teknikker til å erstatteCH1, Ch2, Ch3, hengselsdomenene og/eller rammeverksdomenene med den tilsvarende humane sekvens (se WO 92/02190 og U.S. patentnr. 5,530,101, 5,585,089, 5,693,761, 5,693,792, 5,714,350, og 5,777,085). I en annen utførelse kan et ikkehumant anti-MAdCAM-antistoff humaniseres ved å erstatteCH1, hengseldomenet, CH2, CH3, og/eller rammeverk-domenenemed den tilsvarende humane sekvens i et anti-MAdCAMantistoff ifølge oppfinnelsen.

Muterte antistoffer

I en annen utførelse kan nukleinsyremolekylene, vektorene og vertscellene anvendes til å fremstille muterte antiMAdCAM-antistoffer. Antistoffene kan være mutert i detvariable domener av de tunge og/eller lette kjeder for å endre en bindingsegenskap hos antistoffet. For eksempel kan en mutasjon være gjort i en eller flere av CDR-regionenefor å øke eller minske Kd-verdien av antistoffet forMAdCAM. Teknikker i sete-rettet mutagenese er velkjent ifaget. Se f.eks. Sambrook et al., og Ausubel et al., supra. I en foretrukken utførelse gjøres mutasjoner ved en aminosyrerest som er kjent for å endres sammenlignet med kimlinjen i en variabel region av et anti-MAdCAM-antistoff. Ien mer foretrukken utførelse gjøres en eller flere mutasjoner ved en aminosyrerest som er kjent for å endres sammenlignet med kimlinjen i en variabel region eller CDRregionen av et av anti-MAdCAM-antistoffene 1.7.2, 1.8.2,6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod,6.77.1-mod eller 7.26.4-mod. I en annen utførelse gjøres eneller flere mutasjoner ved en aminosyrerest som er kjent for å endres sammenlignet med kimlinjen i en variabel region eller CDR-region hvis aminosyresekvens er angitt i

SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 52, 54, 56, 58, 62, 64, 66 eller 68, eller hvis nukleotidsekvens er angitt i SEQ ID NOS: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 51, 53, 55, 57, 61, 63, 65 eller 67. I en annen utførelse muteres nukleinsyremolekylene i en eller flere av rammeverksregionene. En mutasjon kan gjøres i en rammeverkregion eller et konstant domene for å øke halveringstiden av antiMAdCAM-antistoffet. Se f.eks. WO 00/09560, publisert 24.februar 2000. I en utførelse, kan det være en, tre eller fem eller ti punktmutasjoner og ikke mer enn femten punktmutasjoner. En mutasjon i en rammeverkregion eller konstant domene kan også gjøres for å endre immunogenisiteten av antistoffet, for å tilveiebringe et sete for kovalent eller ikke-kovalent binding til et annetmolekyl, eller for å endre slike egenskaper som komplementfiksering. Mutasjoner kan gjøres i hver av rammeverksregionene, det konstante domene og de variable regioner i et enkelt mutert antistoff. Alternativt kan mutasjoner gjøres i bare én av rammeverksregionene, de variable regioner eller det konstante domene i et enkelt mutert antistoff.

I en utførelse er det ikke mer enn femten aminosyreendringer i enten VH- eller VL-regionene i det muterteanti-MAdCAM-antistoff sammenlignet med anti-MAdCAMantistoffet før mutasjon. I en mer foretrukken utførelse er det ikke mer enn ti aminosyreendringer i enten VH- ellerVL-regionene av det muterte anti-MAdCAM-antistoff, merforetrukket ikke mer enn fem aminosyreendringer, eller enda mer foretrukket ikke mer enn tre aminosyreendringer. I en annen utførelse er det ikke mer enn femten aminosyreendringer i de konstante domener, mer foretrukket ikke mer enn ti aminosyreendringer, enda mer foretrukket ikke mer enn fem aminosyreendringer.

Modifiserte antistoffer

I en annen utførelse kan et fusjonsantistoff eller immunoadhesin lages, hvilket omfatter alle eller en andel av et anti-MAdCAM-antistoff bundet til et annet polypeptid. I enforetrukken utførelse er bare de variable regioner av antiMAdCAM-antistoffet bundet til polypeptidet. I en annenforetrukken utførelse er VH-domenet av et anti-MAdCAMantistoff bundet til et første polypeptid, mens VL-domenetav et anti-MAdCAM-antistoff er bundet til et andre polypeptid som forbindes med det første polypeptid på en måte hvori VH- og VL-domenene kan samhandle med hverandre ogdanne et antistoffbindingssete. I en annen foretrukken utførelse er VH-domenet separert fra VL-domenet av enlinker slik at VH- og VL-domenene kan samhandle medhverandre (se nedenfor under enkeltkjedede antistoffer). VH-linker-VL-antistoffet bindes deretter til polypeptidetav interesse. Fusjonsantistoff er nyttig ved at det leder et polypeptid til en MAdCAM-uttrykkende celle eller et vev.Polypeptidet kan være et terapeutisk middel, så som et toksin, vekstfaktor eller et annet regulatorisk protein, eller kan være et diagnostisk middel, så som et enzym som kan lett visualiseres, så som pepperrotperoksidase. I tillegg kan fusjonsantistoffer fremkalles hvori to (eller flere) enkeltkjedede antistoffer er bundet til hverandre. Dette er nyttig hvis man ønsker å skape et divalent eller polyvalent antistoff på en enkelt polypeptidkjede, eller hvis man ønsker å skape et bispesifikt antistoff.

For å skape et enkeltkjedet antistoff (scFv) bindes de VHog VL-kodende DNA-fragmenter operativt til et annetfragment som koder en fleksibel linker, f.eks. som koder aminosyresekvensen (Gly4 -Ser)3, slik at VH- og VLsekvensene kan uttrykkes som et tilgrensende enkeltkjedet protein, med VL- og VH-regionene bundet av den fleksiblelinker (se f.eks. Bird et al.. Science, 242:423-426 (1988);Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:5879-5883(1988); McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990)). Det

enkeltkjedede antistoff kan være monovalent, hvis bare et enkelt VH og VL anvendes, bivalent, hvis to VH og VL anvendes, eller polyvalent, hvis mer enn to VH og VL anvendes.

I en annen utførelse kan andre modifiserte antistoffer fremstilles under anvendelse av anti-MAdCAM-kodendenukleinsyremolekyler. For eksempel kan "Kappa-bodies" (Illet al.. Protein Eng, 10: 949-57(1997)), "Minibodies"(Martin et al., EMBO J, 13: 5303-9(1994)), "Diabodies"(Holliger et al., PNAS USA, 90: 6444-6448(1993)), eller"Janusins" (Traunecker et al., EMBO J, 10:3655-3659 (1991)og Traunecker et al., "Janusin: new molecular design for bispesific reagents," Int J Cancer Suppl, 7:51-52 (1992))fremstilles under anvendelse av standardiserte molekylbiologiske teknikker ifølge lærdommene i beskrivelsen.

I et annet aspekt kan chimæriske og bispesifikke antistoffer genereres. Et chimærisk antistoff kan fremstilles, hvilket omfatter CDR-stoffer ogrammeverkregioner fra forskjellige antistoffer. I en foretrukken utførelse omfatter CDR-stoffene av detchimæriske antistoff alle CDR-stoffene i den variableregion i en lett kjede eller tung kjede av et humant antiMAdCAM-antistoff, mens rammeverksregionene er avledet fraet eller flere forskjellige antistoffer. I en mer foretrukken utførelse omfatter CDR-stoffene i det chimæriskeantistoff alle CDR-stoffene av de variable regioner i denlette kjede og den tunge kjede i et humant anti-MAdCAMantistoff. Rammeverksregionene kan være fra en annen art og kan i en foretrukken utførelse humaniseres. Alternativt kan rammeverksregionene være fra et annet humant antistoff.

Et bispesifikt antistoff kan genereres hvilket bindes spesifikt til MAdCAM via et bindingsdomene og til et andre molekyl via et andre bindingsdomene. Det bispesifikke antistoff kan produseres ved rekombinante molekylbiologiske teknikker, eller kan være fysisk konjugert sammen. I

tillegg kan et enkeltkjedet antistoff inneholdende mer enn ett VH og VL genereres, hvilket bindes spesifikt til MAdCAM og til et annet molekyl. Slike bispesifikke antistoffer kan genereres ved å anvende teknikker som er velkjent f.eks. i forbindelse med (i) og (ii) se f.eks. Fanger et al., Immunol Methods 4: 72-81 (1994) og Wright and Harris,supra. og i forbindelse med (iii) se f.eks. Traunecker et al., Int. J. Cancer (Suppl.) 7: 51-52 (1992). I en foretrukken utførelse bindes det bispesifikke antistoff til MAdCAM og til et annet molekyl uttrykt ved høyt nivå på endotele celler. I en mer foretrukken utførelse er det andre molekyl VCAM, ICAM eller L-selektin.

I forskjellige utførelser fremstilles de modifiserte antistoffer beskrevet ovenfor under anvendelse av en eller flere av de variable regioner eller en eller flere CDRregioner fra et av antistoffene valgt fra 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod,6.77.1-mod eller 7.26.4-mod. I en annen utførelse fremstilles de modifiserte antistoffer under anvendelse av en eller flere av de variable regioner eller en eller flere CDR-regioner hvis aminosyresekvens er angitt i SEQ ID NOS:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32,

34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 52, 54, 56, 58, 62, 64, 66

eller 68 eller hvis nukleotidsekvens er angitt i SEQ ID NOS: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29,

31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 51, 53, 55, 57, 61, 63,

65 eller 67.

Derivatiserte og merkede antistoffer

Et antistoff eller en antistoffdel ifølge oppfinnelsen kan derivatiseres eller bindes til et annet molekyl (f.eks. et annet peptid eller protein). Generelt derivatiseres antistoffene eller deler derav slik at MAdCAM-bindingen ikkepåvirkes på skadelig måte ved derivatiseringen eller merkingen. Følgelig er antistoffene og antistoffdelene

ifølge oppfinnelsen ment å skulle omfatte både intakte og modifiserte former av de humane anti-MAdCAM-antistofferbeskrevet heri. For eksempel kan et antistoff eller en antistoffdel ifølge oppfinnelsen være funksjonelt bundet (ved kjemisk kobling, genetisk fusjon, ikke-kovalentforening eller på annen måte) til en eller flere andre molekylgrupper, så som et annet antistoff (f.eks. et bispesifikt antistoff eller et diastoff), et påvisningsmiddel, et cytotoksisk middel, et farmasøytisk middel, og/eller et protein eller peptid som kan mediere forening av antistoffet eller antistoffdelen med et annet molekyl (så som en streptavidin-kjerneregion eller en polyhistidinmerkelapp).

En type av derivatisert antistoff fremstilles ved kryssbinding av to eller flere antistoffer (av den samme type eller av forskjellige typer, f.eks. for å frembringe bispesifikke antistoffer). Passende kryssbindere omfatter de som er heterobifunksjonelle, med to tydelig reaktive grupper separert av et passende avstandsstykke (f.eks. m-maleimidobenzoyl-N-hydroksysuksinimidester) ellerhomobifunksjonell (f.eks. disuksinimidyl-suberat). Slikelinkere er tilgjengelige fra Pierce Chemical Company, Rockford, Ill.

En annen type av derivatisert antistoff er et merket antistoff. Nyttige påvisningsmidler med hvilke et antistoff eller en antistoffdel ifølge oppfinnelsen kan derivatiseres, omfatter fluorescerende forbindelser, inklusive fluorescein, fluorescein-isotiocyanat, rodamin, 5-dimetylamin-l-naftalensulfonylklorid, fykoerytrin, lantanidfosforog lignende. Et antistoff kan også være merket med enzymer som er nyttige for påvisning, så som pepperrotperoksidase, [3-galaktosidase, luciferase, alkalisk fosfatase, glukoseoksidase og lignende. Når et antistoff er merket med et påviselig enzym, påvises det ved å tilsette ytterligere reagenser som enzymet bruker til å fremstille et reaksjonsprodukt som kan iakttas. For eksempel, når middelet

pepperrotperoksidase er nærværende, fører tilsetning av hydrogenperoksid og diaminobenzidin til et farvet reaksjonsprodukt, som er påviselig. Et antistoff kan også være merket med biotin, og påvises ved indirekte måling av avidin- eller streptavidinbinding. Et antistoff kan væremerket med et magnetisk middel, så som gadolinium. Et antistoff kan også være merket med en forutbestemt polypeptidepitop gjenkjent av en sekundær reporter (f.eks. leusinglidelås-parsekvenser, bindingsseter for sekundæreantistoffer, metallbindende domener, epitopmarkører). I noen utførelser er markørene bundet av avstandsstykkearmer av forskjellige lengder for å redusere potensiell sterisk hindring.

Et anti-MAdCAM-antistoff kan også være merket med enradiomerket aminosyre. Radiomarkøren kan anvendes for både diagnostiske og terapeutiske formål. For eksempel kan radiomarkøren anvendes til å påvise MAdCAM-uttrykkende vevved røntgenologiske eller andre diagnostiske teknikker. Videre kan radiomarkøren anvendes terapeutisk som et toksin for sykt vev eller MAdCAM-uttrykkende tumorer. Eksempler påmerkelapper for polypeptider omfatter følgende radioisotoper eller radionuklider - 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y,"Tc, 111ln, 125I, 131I.

Et anti-MAdCAM-antistoff kan også derivatiseres med enkjemisk gruppe så som polyetylenglykol (PEG), en metyleller etylgruppe, eller en karbohydratgruppe. Disse grupper kan være nyttige for å forbedre de biologiske karakteristikker av antistoffet, f.eks. for å øke serumhalveringstiden eller for å øke vevbindingen. Denne metodologi ville også gjelde ethvert antigen-bindende fragment eller enhverversjon av anti-MAdCAM-antistoffer.

Farmasøytiske sammensetninger og sett

I et videre aspekt tilveiebringer oppfinnelsen sammensetninger omfattende et hemmende humant anti-MAdCAM

antistoff for å behandle individer med slike sammensetninger. I noen utførelser er individet et dyr. I noen utførelser er dyret en hund eller en ikke-humanprimat.

Behandling kan innebære administrasjon av et eller flere hemmende anti-MAdCAM-monoklonale antistoffer ifølgeoppfinnelsen eller antigen-bindende fragmenter derav, aleneeller med en farmasøytisk akseptabel bærer. Hemmende antiMAdCAM-antistoffer ifølge oppfinnelsen og sammensetningeromfattende dem kan administreres i kombinasjon med en eller flere andre terapeutiske, diagnostiske eller profylaktiske midler. Ytterligere terapeutiske midler omfatter antiinflammatoriske eller immunomodulatoriske midler. Disse midler omfatter topiske og orale kortikosteroider så som prednisolon, metylprednisolon, NCX-1015 eller budesonid;aminosalicylater så som mesalazin, olsalazin, balsalazid eller NCX-456; klassen av immunomodulatorer så somazatioprin, 6-merkaptopurin, metotreksat, cyclosporin,FK506, IL-10 (Ilodecakin), IL-11 (Oprelevkin), IL-12,MIF/CD74-antagonister, CD40-antagonister, så som TNX-100/5D12, 0X4OL-antagonister, GM-CSF, pimecrolimus ellerrapamycin; klassen av anti-TNFa-midler så som infliximab,adalimumab, CDP-870, onercept, etanercept; klassen av antiinflammatorisk midler, så som PDE-4-inhibitorer

(roflumilast, etc), TACE-inhibitorer (DPC-333, RDP-58, etc)og ICE-inhibitorer (VX-740, etc) samt IL-2-reseptorantagonister, så som daclizumab, klassen av selektive adhesjonsmolekyl-antagonister, så som natalizumab, MLN-02,eller alicaforsen, klasser av analgesiske midler så som COX-2-inhibitorer, så som rofecoxib, valdecoxib, celecoxib,P/Q-type "volatge senstize" kanal-modulatorer(a25) , så somgabapentin og pregabalin, NK-l-reseptorantagonister,kannabinoide reseptormodulatorer, og delta-opioidereseptoragonister, samt anti-neoplastiske, anti-tumor,anti-angiogene eller kjemoterapeutiske midler. Slikeytterligere midler kan være innbefattet i den samme sammensetning eller administreres separat. I noen ut

førelser kan et eller flere hemmende anti-MAdCAM-antistoffer ifølge oppfinnelsen anvendes som vaksine eller som adjuvanter til en vaksine. Spesielt, fordi MAdCAM uttrykkes i lymfoide vev, kan vaksine-antigener med fordel væreinnsiktet på lymfoid vev ved å konjugere antigenet til et anti-MAdCAM-antistoff ifølge oppfinnelsen.

Anvendt heri betyr "farmasøytisk akseptabel bærer" ethvert og alle løsningsmidler, dispersjonsmedier, belegg, antibakterielle og antifungale midler, isotoniske og absorpsjonsforsterkende eller forsinkende midler, og lignende som er fysiologisk kompatible. Noen eksempler på farmasøytisk akseptable bærere er vann, saltløsning, fosfatbufret saltløsning, acetatbuffer med natriumklorid, dekstrose, glyserol, polyetylenglykol, etanol og lignende, samt kombinasjoner derav. I mange tilfeller vil det være fordelaktig å medta isotoniske midler, f.eks. sukkerarter, polyalkoholer så som mannitol, sorbitol eller natriumklorid i sammensetningen. Ytterligere eksempler på farmasøytisk akseptable substanser er surfektanter, fuktemidler eller mindre mengder av hjelpesubstanser så som fukte- elleremulgeringsmidler, konserveringsmidler eller buffere, som forlenger holdbarheten eller effektiviteten av antistoffet.

Sammensetningene ifølge denne oppfinnelse kan være i mange forskjellige former, f.eks., flytende, halvfaste og faste doseringsformer, så som flytende løsninger (f.eks. injiserbare og infuserbare løsninger), dispersjoner eller suspensjoner, tabletter, piller, lyofilisert kake, tørre pulere, liposomer og suppositorier. Den foretrukne form avhenger av den tiltenkte administrasjonsmåte og terapeutiske anvendelighet. Typiske foretrukne sammensetninger er i form av injiserbare eller infuserbare løsninger, så som sammensetninger lignende de som anvendes for passiv immunisering av mennesker. Den foretrukne administrasjonsmåte er parenteral (f.eks. intravenøs, subkutan, intraperitoneal, intramuskulær, intradermal). I en foretrukken utførelse foreligger antistoffet i en sammensetning som kan

administreres ved intravenøs infusjon eller injeksjon. I en annen foretrukken utførelse foreligger antistoffet i en sammensetning som kan administreres ved intramuskulær, intradermal eller subkutan injeksjon.

Terapeutiske sammensetninger må normalt være sterile og stabile under betingelsene for fremstilling og lagring. Sammensetningen kan formuleres som en løsning, lyofilisert kake, tørt pulver, mikroemulsjon, dispersjon, liposom, eller annen struktur passende til høy medisinkonsentrasjon. Sterile injiserbare løsninger kan fremstilles ved å innlemme anti-MAdCAM-antistoffet i den nødvendige mengde i etpassende løsningsmiddel med en eller en kombinasjon av ingredienser spesifisert ovenfor, etter behov, etterfulgt av sterilisering. Vedrørende sterile pulvere for fremstilling av sterile injiserbare løsninger, er de foretrukne fremstillingsmetoder vakuumtørking og frysetørking, hvilket gir et pulver med den aktive ingrediens pluss enhver ytterligere ønsket ingrediens fra en tidligere steril løsning derav. Generelt fremstilles dispersjoner ved å innlemme den aktive forbindelse i en steril vehikkel som inneholder et basisk dispersjonsmedium og de nødvendige andre ingredienser fra de som er spesifisert ovenfor. De ønskede karakteristikker for en løsning kan opprettholdes f.eks. ved å anvende surfaktanter og den nødbendige partikkelstørrelse vedrørende dispersjon ved å anvende surfaktanter, fosfolipider og polymerer. Forlenget absorpsjon av injiserbare sammensetninger kan oppnås ved å innlemme i sammensetningen et middel som forsinker absorpsjonen, f.eks. monostearatsalter, polymere materialer, oljer og gelatin.

Antistoffene ifølge foreliggende oppfinnelse kan administreres ved hjelp av mange forskjellige metoder som er kjent i faget, skjønt for mange terapeutisk anvendelser er den foretrukne rute/modus for administrasjonen subkutan, intramuskulær, intradermal eller intravenøs infusjon. Som vil være underforstått av fagmannen, vil ruten og/eller

modusen for administrasjone variere avhengig av de ønskede resultater.

I visse utførelser kan antistoffsammensetningene fremstilles med en bærer som vil beskytte antistoffet mot hurtig frigivelse, så som en kontrollert frigivelsesformulering, inklusive implantater, transdermale puter og mikroinnkapslede leveansesystemer. Bionedbrytbare, biokompatible polymerer kan anvendes, så som etylenvinylacetat, polyanhydrid, polyglykolsyre, kollagen, polyortoestere og polymelkesyre. Mange metoder for fremstilling av slike formuleringer er patentert eller generelt kjent for personer med kunnskaper i faget. Se f.eks. Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems (J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York (1978)).

I visse utførelser kan et anti-MAdCAM-antistoff ifølgeoppfinnelsen administreres oralt, f.eks. med et inert fortynningsmiddel eller en assimilerbar spiselig bærer. Forbindelsen (og andre ingredienser, hvis ønsket) kan også være innelukket i en hard eller bløt gelatinkapsel, presset til tabletter eller innlemmet direkte i individets diett. For oral terapeutisk administrasjon kan anti-MAdCAMantistoffene være innlemmet med eksipienser og anvendes i form av fordøyelige tabletter, bukkale tabletter, pastiller, kapsler, eliksirer, suspensjoner, siruper, kjeks og lignende. For å administrere en forbindelse ifølge oppfinnelsen ved hjelp av noe annet enn parenteral administrasjon, kan det være nødvendig å belegge forbindelsen med, eller ko-administrere forbindelsen med, et material for åforhindre at det inaktiveres.

Sammensetningene ifølge oppfinnelsen kan omfatte en "terapeutisk effektiv mengde" eller en "profylaktisk effektiv mengde" av et antistoff eller en antigen-bindendedel ifølge oppfinnelsen. En "terapeutisk effektiv mengde" refererer til en mengde som er effektiv, ved nødvendige doseringer og tidsperioder, for å oppnå det ønskede

terapeutiske resultat. En terapeutisk effektiv mengde av antistoffet eller antistoffdelen kan variere i henhold til faktorer så som sykdomtilstanden, alderen, kjønnet og individets vekt, og evnen hos antistoffet eller antistoffdelen til å fremkalle en ønsket respons i individet. En terapeutisk effektiv mengde er også den mengde hvori enhver toksisk eller skadelig virkning av antistoffet eller antistoffdelen oppveies av den fordelaktige terapeutiske virkning. En "profylaktisk effektiv mengde" refererer til en mengde som er effektiv, ved nødvendige doseringer og tidsperioder, for å oppnå det ønskede profylaktiske resultat. Normalt, siden en profylaktisk dose anvendes i individer før eller ved et tidligere stadium av sykdommen, kan den profylaktisk effektive mengde være mindre enn den terapeutisk effektive mengde.

Doseringskurer kan justeres til å fremkalle den optimale ønskede respons (f.eks. en terapeutisk eller profylaktisk respons). For eksempel kan en enkelt bolus administreres, flere oppdelte doser kan administreres over tid, eller dosen kan reduseres proporsjonelt eller økes alt etter omstendighetene i den terapeutiske situasjon. Det er spesielt fordelaktige å formulere parenterale sammensetninger i doseenhetsform for lett administrasjon og enhetlighet i doseringen. Doseenhetsform anvendt heri refererer til fysisk avdelte enheter som egner seg som enhetlige doseringer for et pattedyr som skal behandles; hver enhet inneholder en forutbestemt mengde av den aktive forbindelse beregnet til å fremkalle den ønskede terapeutiske virkning i forening med den nødvendige farmasøytiske bærer. Beskrivelsen for doseenhetsformer ifølge oppfinnelsen er diktert av og direkte avhengig av (a) de entydige karakteristikker hos anti-MAdCAM-antistoffet eller en del derav og den spesielle terapeutiske eller profylaktiske virkning som skal oppnås, og (b) begrensningene iboende i faget å fremstille et antistoff for behandling av sensitivitet i enkeltindivider.

Et typisk, ikke-begrensende område for en terapeutisk ellerprofylaktisk effektiv mengde av et antistoff eller antistoffdel ifølge oppfinnelsen er 0,025 til 50 mg/kg, mer foretrukket 0,1 til 50 mg/kg, mer foretrukket 0,1-25, 0,1til 10 eller 0,1 til 3 mg/kg. I noen utførelser inneholder en formulering 5 mg/ml antistoff i en buffer på 20 mM natriumacetat, pH 5,5, 140 mM NaCl og 0,2 mg/ml polysorbat 80. Det bør bemerkes at doseringsverdiene kan variere med typen og alvoret av tilstanden som skal lindres. Det er videre underforstått at for hvert enkelt individ bør spesifikke doseringskurer justeres over tid i henhold til individets behov og det fagmessige omdømme hos personen som administrerer eller overvåker administrasjonen av sammensetningene .

Et annet aspekt av foreliggende oppfinnelse tilveiebringer sett omfattende et anti-MAdCAM-antistoff eller en antistoffdel ifølge oppfinnelsen eller en sammensetning omfattende et slikt antistoff. Et sett kan omfatte, i tillegg til antistoffet eller sammensetningen, diagnostiske eller terapeutiske midler. Et sett kan også omfatte instruksjoner for anvendelse i en diagnostisk eller terapeutisk metode. I en foretrukken utførelse omfatter settet antistoffet eller en sammensetning omfattende det og et diagnostisk middel som kan anvendes i en metode beskrevet nedenfor. I en annen foretrukken utførelse omfatter settet antistoffet eller en sammensetning omfattende det og en eller flere terapeutiske midler som kan anvendes i en metode beskrevet nedenfor.

Genterapi

Nukleinsyremolekylene ifølge foreliggende oppfinnelse kan administreres til en pasient i behov derav via genterapi. Terapien kan være enten in vivo eller ex vivo. I en foretrukken utførelse administreres nukleinsyremolekyler som koder både en tung kjede og en lett kjede, til en pasient. I en mer foretrukken utførelse administreres

nukleinsyremolekylene slik at de er stabilt integrert i kromosomer av B-celler, fordi disse celler er spesialisertfor å fremstille antistoffer. I en foretrukken utførelse transfiseres eller infiseres forløper B-celler ex vivo ogre-transplanteres inn i en pasient i behov derav. I enannen utførelse infiseres forløper B-celler eller andreceller in vivo under anvendelse av et rekombinant virus som er kjent for å infisere celletypen av interesse. Typiske vektorer som anvendes for genterapi, omfatter liposomer, plasmider og virale vektorer. Eksempler på virale vektorer er retroviruser, adenoviruser og adenoforbundne viruser. Etter infeksjon enten in vivo eller ex vivo kan nivåene av antistoffekspresjon overvåkes ved å ta en prøve fra den behandlede pasient og anvende enhver immunoanalyse som er kjent i faget eller omtalt heri.

I en foretrukken utførelse omfatter genterapimetoden trinnene å administrere et isolert nukleinsyremolekyl som koder den tunge kjede eller en antigen-bindende del deravav et anti-MAdCAM-antistoff og uttrykke nukleinsyremolekylet. I en annen utførelse omfatter genterapimetoden trinnene å administrere et isolert nukleinsyremolekyl som koder den lette kjede eller en antigen-bindende del deravav et anti-MAdCAM-antistoff og uttrykke nukleinsyremolekylet. I en mer foretrukken metode omfatter genterapimetoden trinnene å administrere et isolert nukleinsyremolekyl som koder den tunge kjede eller en antigen-bindendedel derav og et isolert nukleinsyremolekyl som koder den lette kjede eller den antigen-bindende del derav av etanti-MAdCAM-antistoff ifølge oppfinnelsen og uttrykkenukleinsyremolekylene. Genterapimetoden kan også omfatte trinnet å administrere et annet anti-inflammatorisk ellerimmunomodulatorisk middel.

Diagnostiske metoder av nytte

Anti-MAdCAM-antistoffene kan anvendes til å påvise MAdCAM ien biologisk prøve in vitro eller in vivo. Anti-MAdCAM

antistoffene kan anvendes i et konvensjonelt immunoassay, inklusive et ELISA, et RIA, FACS, vev-immunohistokjemi,Western blot eller immunopresipitering. Anti-MAdCAMantistoffene ifølge oppfinnelsen kan anvendes til å påvise MAdCAM fra mennesker. I en annen utførelse kan anti-MAdCAMantistoffene anvendes til å påvise MAdCAM fra den gamle verdens primater så som cynomolgus- og rhesus-aper,sjimpanser og aper. Oppfinnelsen tilveiebringer en metode for å påvise MAdCAM i en biologisk prøve omfattende å bringe en biologisk prøve i kontakt med et anti-MAdCAMantistoff ifølge oppfinnelsen og påvise antistoffet som er bundet til MAdCAM. I en utførelse derivatiseres antiMAdCAM-antistoffet direkte med en påviselig markør. I enannen utførelse merkes anti-MAdCAM-antistoffet (det førsteantistoff), og et andre antistoff eller andre molekyl som kan binde anti-MAdCAM-antistoffet, merkes. Som velkjent foren person med kunnskaper i faget, velges et andre antistoff som er i stand til spesifikt å binde den spesifikke art og klasse av det første antistoff. For eksempel, hvis antiMAdCAM-antistof f et er et humant IgG, da kan det sekundæreantistoff være et anti-human-IgG. Andre molekyler som kanbindes til antistoffer, omfatter Protein A og Protein G, som begge er kommersielt tilgjengelige, f.eks. fra Pierce Chemical Co.

Passende markører for antistoffet eller det sekundære er blitt beskrevet supra, og omfatter forskjellige enzymer, profetiske grupper, fluorescerende materialer, luminescerende materialer, magnetiske midler og radioaktive materialer. Eksempler på passende enzymer omfatter pepperrotperoksidase, alkalisk fosfatase, [3-galaktosidase, elleracetylcholinesterase; eksempler på passende profetiske gruppe-komplekser omfatter streptavidin/biotin ogavidin/biotin; eksempler på passende fluorescerende materialer omfatter umbelliferon, fluorescein, fluoresceinisotiocyanat, rodamin, diklortriazinylaminfluorescein, dansylklorid eller fykoerytrin; et eksempel på et luminescerende materiale omfatter luminol; et eksempel på

et magnetisk middel omfatter gadolinium; og eksempler på

-i p c 131 33

passende radroaktrve materraler omfatter I, I, S eller 3H.

I en alternativ utførelse kan MAdCAM analyseres i en biologisk prøve ved hjelp av et kompetisjonsimmunoassay idet man anvender MAdCAM-standarder merket med en påviseligsubstans og et umerket anti-MAdCAM-antistoff. I denneanalyse kombineres den biologiske prøve, de merkede MAdCAMstandarder og anti-MAdCAM-antistoffet, og mengden av merketMAdCAM-standard bundet til det umerkede antistoffbestemmes. Mengden av MAdCAM i den biologiske prøve er omvendt proporsjonal med mengden av merket MAdCAM-standardbundet til anti-MAdCAM-antistoffet.

Man kan anvende immunoassayene beskrevet ovenfor for et antall formål. I en utførelse kan anti-MAdCAM-antistoffeneanvendes til å påvise MAdCAM i celler i en cellekultur. I en foretrukken utførelse kan anti-MAdCAM-antistoffeneanvendes for å bestemme nivået av celleoverflate-MAdCAMekspresjon etter behandling av cellene med forskjellige forbindelser. Denne metode kan anvendes for å teste forbindelser som kan anvendes til å aktivere eller hemme MAdCAM. I denne metode behandles en prøve av celler med en testforbindelse i en tidsperiode mens en annen prøve forblir ubehandlet, celleoverflatisk ekspresjon vil deretter kunne bestemmes ved hjelp av strømningscytometri, immunohistokjemi, Western blot, ELISA eller RIA. I tillegg kan immunoassayene oppskaleres for høy gjennomløpsavskjerming for å teste et stort antall av forbindelser med hensyn til enten aktivering eller hemming av MAdCAM.

Anti-MAdCAM-antistoffene ifølge oppfinnelsen kan ogsåanvendes for å bestemme nivåene av MAdCAM på et vev eller i celler avledet fra vevet. I en foretrukken utførelse er vevet sykt vev. I en mer foretrukken utførelse er vevet et betent gastrointestinalt organ eller en biopsiprøve derav. I en foretrukken utførelse av metoden skjæres et vev eller

en biopsiprøve derav ut fra en pasient. Vevet eller biopsiprøven anvendes deretter i et immunoassay for å bestemme f.eks. MAdCAM-nivåer, celleoverflatenivåer avMAdCAM eller lokalisering av MAdCAM ved hjelp av metodene omtalt ovenfor. Metoden kan anvendes for å bestemme om et betent vev uttrykker MAdCAM i et høyt nivå.

Den ovenfor beskrevne diagnostiske metode kan anvendes for å bestemme hvorvidt et vev uttrykker høye nivåer av MAdCAM, hvilket kan være indikativisk på at vevet vil reagere godt på behandling med anti-MAdCAM-antistoff. Videre kan dendiagnostiske metode også anvendes for å bestemme hvorvidt behandling med anti-MAdCAM-antistoff (se nedenfor) får etvev til å uttrykke lavere nivåer av MAdCAM og således kan anvendes for å bestemme hvorvidt behandlingen er fremgangsrik.

Antistoffene ifølge foreliggende oppfinnelse kan også anvendes til å lokalisere vev og organer som uttrykker MAdCAM. I en foretrukken utførelse kan anti-MAdCAMantistoffene anvendes til å lokalisere betent vev. Fordelen med anti-MAdCAM-antistoffene ifølge foreliggendeoppfinnelse er at de vil ikke generere en immunrespons etter administrasjon. Således kan et anti-MAdCAM-antistoffeller en farmasøytisk sammensetning derav administreres til en pasient i behov av en slik diagnostisk test og utsette pasienten for forestillingsanalyse for å bestemme lokaliseringen av det MAdCAM-uttrykkende vev.Forestillingsanalyse er velkjent i det medisinske fag, og omfatter røntgenanalyse, gamma-scintigrafi, magnetiskresonansimaginering (MRI), positronemisjonstomografi eller computertomografi (CT). I en annen utførelse tas en biopsiprøve fra pasienten for å bestemme hvorvidt vevet av interesse uttrykker MAdCAM heller enn å utsette pasienten for imagineringsanalyse. I en foretrukken utførelse kan anti-MAdCAM-antistoffene være merket med et påviseligmiddel som kan bli avbildet i en pasient. For eksempel kan antistoffet være merket med et kontrastmiddel, så som

barium, som kan anvendes for røntgenanalyse, eller et magnetisk kontrastmiddel, så som et gadoliniumchelat, som kan anvendes for MRI eller CT. Andre merkingsmidler omfatter radioisotoper, så som 99Tc. I en annen utførelse vil anti-MAdCAM-antistoffet være umerket og vil avbildesved å administrere et andre antistoff eller andre molekyl som er påviselig, og som kan binde anti-MAdCAM-antistoffet.

Anti-MAdCAM-antistoffene ifølge oppfinnelsen kan ogsåanvendes for å bestemme nivåene av løselig MAdCAM som er nærværende i donorblod, serum, plasma eller andre biovæsker, inklusive avføring, urin, spytt eller en biopsiprøve. I en foretrukken utførelse er biovæsken plasma. Biovæsken anvendes deretter i et immunoassay for å bestemme nivåene av løselig MAdCAM. Løselig MAdCAM vil kunne være en surrogatmarkering for pågående gastrointestinal inflammasjon, og metoden for påvisning vil kunne anvendes som et diagnostisk middel for å vurdere sykdommens alvor.

Den ovenfor beskrevne diagnostiske metode kan anvendes for å bestemme hvorvidt et individ uttrykker høye nivåer av løselig MAdCAM, hvilket kan være indikativt på om individet vil reaere godt på behandling med et anti-MAdCAM-antistoff.Videre kan den diagnostiske metode også anvendes for å bestemme hvorvidt behandling med anti-MAdCAM-antistoff (senedenfor) eller et annet farmasøytisk middel av sykdommen får et individ til å uttrykke lavere nivåer av MAdCAM og kan således anvendes for å bestemme hvorvidt behandlingen er fremgangsrik

Hemming av g^/MAdCAM-avhengig adhesjon ved anti-MAdCAMantistof f :

I en annen utførelse tilveiebringer oppfinnelsen et antiMAdCAM-antistof f som binder MAdCAM og hemmer bindingen ogadhesjon av a4P7-integrinbærende celler til MAdCAM ellerandre beslektede ligander, så som L-selektin, til MAdCAM. I

en foretrukken utførelse er MAdCAM fra mennesker og er enten i løselig form, eller uttrykkes på overflaten av en celle. I en annen foretrukken utførelse er anti-MAdCAMantistoffet et humant antistoff. I en annen utførelse hemmer antistoffet eller en del derav binding mellom «uØ? og MAdCAM med en ICso-verdi på ikke mer enn 50 nM. I enforetrukken utførelse er ICso-verdien ikke mer enn 5 nM. Ien mer foretrukken utførelse er IC50 verdi mindre enn 5 nM. I en mer foretrukken utførelse er ICso-verdien mindre enn0,05 pg/ml, 0,04 pg/ml eller 0,03 pg/ml. I en annen foretrukken utførelse er ICso-verdien mindre enn 0,5 pg/ml,0,4 pg/ml eller 0,3 pg/ml. ICso-verdien kan måles ved hjelpav enhver metode som er kjent i faget. Normalt kan en ICsoverdi måles ved hjelp av ELISA eller adhesjonsanalyse. I en foretrukken utførelse måles ICso-verdi ved hjelp avadhesjonsanalyse under anvendelse av enten celler eller vev som naturlig uttrykker MAdCAM eller celler eller vev som er blitt konstruert for å uttrykke MAdCAM.

Hemming av lymfocytt-rekruttering til tarm-forbundetlymfoidvev ved hjelp av anti-MAdCAM-antistoffer

I en annen utførelse tilveiebringer oppfinnelsen et antiMAdCAM-antistoff som binder naturlig uttrykt MAdCAM oghemmer bindingen av lymfocytter til spesialisert gastrointestinalt lymfevev. I en foretrukken utførelse er det naturlig uttrykte MAdCAM humant eller primat-MAdCAM og erenten i løselige form, eller uttrykkes på overflaten av en celle. I en annen foretrukken utførelse er anti-MAdCAMantistoffet et humant antistoff. I en annen utførelse hemmer antistoffet eller en del derav rekrutteringen av tarm-trofiske O(.4P7+ lymfocytter til vev uttrykkende MAdCAMmed en ICso-verdi på ikke mer enn 5 mg/kg. I en foretrukkenutførelse er ICso-verdien ikke mer enn 1 mg/kg. I en merforetrukken utførelse er ICso-verdien mindre enn 0,1 mg/kg.I en utførelse kan ICso-verdien bestemmes ved å måle dosevirkningens forhold mellom rekruttering av teknetiummerkede perifere blodlymfocytter og det gastrointestinale

system ved å anvende gamma- scintigrafi eller enkeltfotonemisjons computertomografi. I en annen utførelse kan IC50verdien bestemmes ved å måle økningen i tarm-trofiskeO(.4P7+ lymfocytter, så som CD4+ O(.4P7+ minne-T-celler, i denperifere sirkulasjon under anvendelse av strømningscytometri som en funksjon av dosen av anti-MAdCAMantistoff.

For at denne oppfinnelse kan bedre forstås, er følgende eksempler angitt. Disse eksempler er bare for illustrasjonens skyld.

EKSEMPEL 1:

Generering av anti-MAdCAM-produserende hybridomer

Antistoffer ifølge oppfinnelsen ble fremstilt, analysert og valgt i samsvar med foreliggende eksempel

Primær immunogenfremstilling:

To immunogener ble fremstilt for immunisering av XenoMouse™-musen: (i) et MAdCAM-IgGi Fc-fus j onsprotein og(ii) cellemembraner fremstilt fra celler stabilt transfisert med MAdCAM.

(i) MAdCAM-IgGi Fc-fusjonsprotein

Ekspresjonsvektorkonstruksjon:

Et EcoRI/Bglll cDNA-fragment som koder det modne ekstracellulære, immunoglobulin-lignende domene av MAdCAM, blefjernet ut fra en pINCY Incyte-klon (3279276) og klonet inni EcoRI/BamHI-seter av pIGl-vektoren (Simmons, D. L. (1993)i Cellular Interactions in Development: A Practical Approach, ed. Hartley, D. A. (Oxford Univ. Press, Oxford), pp. 93-127.)) for å generere en i leseramme IgGi Fc-fusjon.Den resulterende innsetting ble fjernet med EcoRI/NotI og klonet inn i pCDNA3.1+ (Invitrogen). MAdCAM-IgGi Fc cDNA'et

i vektoren ble sekvensbekreftet. Aminosyresekvensen av MAdCAM-IgGi Fc-fusjonsproteinet er vist nedenfor:

MAdCAM-IgGi Fc-fusjonsprotein:

MDFGLALLLAGLLGLLLGQSLQVKPLQVEPPEPWAVALGASRQLTCRLACADRGASVQ WRGLDTSLGAVQSDTGRSVLTVRNASLSAAGTRVCVGSCGGRTFQHTVQLLVYAFPDQL TVSPAALVPGDPEVACTAHKVTPVDPNALSFSLLVGGQELEGAQALGPEVQEEEEEPQG DEDVLFRVTERWRLPPLGTPVPPALYCQATMRLPGLELSHRQAIPVLHSPTSPEPPDTT SPESPDTTSPESPDTTSQEPPDTTSQEPPDTTSQEPPDTTSPEPPDKTSPEPAPQQGST HTPRSPGSTRTRRPEIQPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPE VTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGK EYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSD IAVEWESNGQPENNYKATPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNH YTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 107)

Understreket: signalpeptid Uthevet trykk: MAdCAM-ekstracellulært domene

Rekombinant proteinekspresjon/rensing:

CHO-DHFR-celler ble transfisert med pCDNA3.l+-vektorinneholdende MAdCAM-IgGi Fc-fusjonsprotein cDNA og stabilekloner uttrykkende MAdCAM-IgGi Fc-fusjonsprotein valgt iIscoves medier inneholdende 600 p,g/ml G418 og 100 ng/ml metotreksat. For proteinekspresjon ble en hul fiberbioreaktor kimsatt med stabilt uttrykkende MAdCAM-IgGi FcCHO-celler i Iscoves medier inneholdende 10% lavt IgGføtalt okseserum (Gibco), ikke-essensielle aminosyrer(Gibco), 2 mM glutamin (Gibco), natriumpyruvat (Gibco), 100 jig/ml G418 og 100 ng/ml metotreksat, og anvendt til å generere konsentrert medie-supernatant. MAdCAM-IgGi Fcfus j onsproteinet ble renset fra den høstede supernatant ved affinitetskromatografi. I korthet går det ut på at supernatant ble påført på en HiTrap Protein G Sepharose-kolonne(5 ml, Pharmacia) (2 ml/min), vasket med 25 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl (5 kolonnevolumer) og eluert med 100 mM glysin pH 2,5 (1 ml/min), idet man umiddelbart nøytraliserte

fraksjonene til pH 7,5 med 1M Tris pH 8. Fraksjoner inneholdende MAdCAM-IgGi Fc-fusjonsprotein ble identifisert medSDS-PAGE, slått sammen og påført på en Sephacryl S100kolonne (Pharmacia), på forhånd ekvilibrert med 35 mM BisTris pH 6,5, 150 mM NaCl. Gelfiltrasjonen ble utført ved 0,35 ml/min, idet man samlet en topp av MAdCAM-IgGi Fcfus j onsprotein i ca. 3 x 5 ml fraksjoner. Disse prøver ble slått sammen og overført til en Resource Q-kolonne (6 ml,Pharmacia), på forhånd ekvilibrert i 35 mM BisTris pH6,5. Kolonnen ble vasket med 5 kolonnevolumer av 35 mM Bis Tris pH 6,5, 150 mM NaCl (6 ml/min) og MAdCAM-IgGi Fc-fusjonsprotein eluert inn i en 4-6 ml fraksjon med 35 mM Bis TrispH 6,5, 400 mM NaCl. Ved dette stadium var proteinet 90% rent og migrerte som et enkelt bånd ved tilnærmelsesvis 68 kD i SDS-PAGE. For anvendelse som et immunogen i allepåfølgende analyser ble materialet bufferutbyttet i 25 mM HEPES pH 7,5, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 100 mM NaCl, 50% glyserol og lagret som alikvoter ved -80°C.

(ii) Cellemembraner som stabilt uttrykker MAdCAM

Et SacI/Notl-fragment omfattende nukleotidene 645-1222 avden publiserte MAdCAM-sekvens (Shyjan AM, et al., JImmunol., 156, 2851-7 (1996)) ble PCR-amplifisert fra encolon-cDNAsamling og klonet inn i SacI/Notl-seter av enpIND-Hygro-vektor (Invitrogen). Et SacI-fragment omfattendeden ytterligere 5'-kodende sekvens ble sub-klonet inn idette konstrukt fra pCDNA3.1 MAdCAM-IgGi Fc, for å genereredet full-lengdede MAdCAM cDNA. Et KpnI/Notl-fragment inneholdende MAdCAM cDNA'et ble deretter klonet inn i tilsvarende seter i en pEF5FRTV5GWCAT-vektor (Invitrogen) ogerstattet den CAT-kodende sekvens. cDNA-innføyningen blesekvens-bekreftet og anvendt i transfeksjoner for ågenerere enkeltvise stabilt uttrykkende kloner i Flpln NIH 3T3-celler (Invitrogen) ved hjelp av Flp-recombinaseteknologi, i henhold til fabrikantens instruksjoner. Stabilt uttrykkende kloner ble valgt i henhold til deres evne til å understøtte bindingen av en OGØ?4 JY human B

lymfoblastoid cellelinje (Chan BM, et al., J. Biol. Chem., 267:8366-70 (1992)), skissert nedenfor. Stabile kloner avCHO-celler uttrykkende MAdCAM ble fremstilt på samme måte,under anvendelse av Flpln CHO-celler (Invitrogen).

MAdCAM-uttrykkende Flpln NIH-3T3-celler ble dyrket iDulbecco's modified Eagles Medium (Gibco), inneholdende 2 mM L-glutamin, 10% Donor-kalveserum (Gibco) og 200 p,g/mlHygromycin B (Invitrogen) og ekspandert i rulleflasker. MAdCAM-uttrykkende Flpln CHO-celler ble dyrket i HamsF12/Dulbeccos modified Eagles Medium (Gibco), inneholdende 2 mM L-glutamin, 10% Donor-kalveserum (Gibco) og 350 p,g/mlHygromycin B (Invitrogen) og ekspandert i rulleflasker. Cellene ble høstet ved å anvende en ikke-enzymatisk celledissosiasjonsløsning (Sigma) og skraping, idet man vasket i fosfatbufret saltløsning ved sentrifugering. Cellemembraner ble fremstilt fra cellebunnfallet ved to runder av polytronhomogenisering i 25 mM Bis Tris pH 8, 10 mM MgC12, 0,015% (w/v) aprotinin, 100 U/ml bacitracin og sentrifugering. Det endelige bunnfall ble suspendert på nytt i den samme buffer, og 50xl0s celleekvivalenter delt i like deler i tykkveggede eppendorfere og sentrifugert ved >100000g for å generere cellemembranpelleter for XenoMousemuseimmuniseringer. Supernatanten ble dekantert og membranene ble lagret i eppendorfere ved -80°C inntil bruk.Bekreftelse på proteinekspresjon i cellemembranene ble bestemt ved SDS-PAGE og Western blotting med et kanin-antipeptid-antistoff opprettet mot de N-terminale rester avMAdCAM ([C]-KPLQVEPPEP).

Immunisering og hybridomgenerering:

Åtte til ti uker gamle XENOMOUSE™-mus ble immunisertintraperitonealt eller i deres bakre fotpute med enten det rensede rekombinante MAdCAM-IgGi Fc-fusjonsprotein (10pg/dose/mus), eller cellemembraner fremstilt fra enten stabilt uttrykkende MAdCAM-CHO eller NIH 3T3-celler (10xl0sceller/dose/mus). Denne dose ble gjentatt fem til syv

ganger over en tre til åtte ukers periode. Fire dager før fusjon fikk musen en sluttinjeksjon av det ekstracellulære domene av humant MAdCAM i PBS. Milt- og lymfeknutelymfocytter fra immuniserte mus ble fusert med den ikkesekretoriske myelomiske P3-X63-Ag8.653-cellelinje og bleutsatt for HAT-seleksjon som tidligere beskrevet (Galfre ogMilstein, Methods Enzymol. 73:3-46 (1981)). Et panel avhybridomer som alle utskilte MAdCAM-spesifikke humaneIgG2K- og IgG4K-antistoffer ble utvunnet og sub-klonet.Tolv hybridom-sub-kloner, 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2,

6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4 og

9.8.2, som produserer monoklonale antistoffer som er spesifikke for MAdCAM, ble utvunnet og påvist med analysene beskrevet nedenfor. Opphavslinjene 1.7, 1.8, 6.14, 6.22, 6.34, 6.67, 6.73, 6.77, 7.16, 7.20, 7.26 og 9.8, som de sub-kloniske hybridomlinjer 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2,

6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4 og 9.8.2 ble avledet fra, hadde alle anti-MAdCAM-aktivitet.

ELISA-analyser:

Påvisning av antigen-spesifikke antistoffer i museserum oghybridomsupernatant ble bestemt ved hjelp av ELISA som beskrevet (Coligan et al.. Unit 2.1 "Enzyme-linkedimmunosorbent assays," i Current Protocols in Immunologi (1994)) under anvendelse av MAdCAM-IgGi Fc-fusjonsproteinfor å fange antistoffene. For dyr som var immunisert med MAdCAM-IgGi Fc-fusjonsprotein, ble antistoffer avskjermetmed hensyn til ikke-spesifikk reaktivitet mot humant IgGiog med hensyn til evnen til å bindes til Flpln CHO MAdCAMceller ved strømningscytometri.

I en foretrukken ELISA-analyse anvendes følgende teknikker:

ELISA-plater ble belagt over natten ved 4°C med 100p,l/brønn av MAdCAM-IgGi Fc-fusjon (4,5 p,g/ml) i en plateinneholdende buffer (100 mM natriumkarbonat/bikarbonatbuffer pH 9,6). Etter inkubasjon ble belegningsbufferen

fjernet, og platen ble blokkert med 200 pd/brønn blokkeringsbuffer (5% BSA, 0,1% Tween 20, i fosfatbufret saltløsning) og inkubert ved romstemperatur i 1 time. Blokkeringsbufferen ble fjernet, og 50 pl/brønn av hybridomsupernatant eller annet serum eller supernatant (f.eks. positiv kontroll) tilsatt i 2 timer ved romstemperatur. Etter inkubasjon ble platen vasket med PBS (3 x 100 pl/brønn), og bindingen av hybridomet mAb påvist med HRP-konjugerte sekundære antistoffer (dvs. 1:1000 murintanti-human IgG2-HRP (SB Cat. No. 9060-05) for IgG2-antistoffer eller 1:1000 murint anti-humant IgG4-HRP (ZymedCat. No. 3840) for IgG4-antistoffer) fortynnet i PBS.Platene ble inkubert ved romstemperatur i 1 time, vasket i PBS (3 x 100 pl/brønn) og til slutt utviklet med 100 pl OPD (o-fenylendiamin (DAKO S2405) + 5 pl 30% H2O2/I2 ml).Platene fikk fremkalles 10-20 minutter, og reaksjonen blestoppet med 100 pl 2M H2SO4. Platene ble avlest ved 490 nm.

Adhesj onsanalyse:

Antistoffer som viste binding til MAdCAM-IgGl Fcfusjonsprotein ved hjelp av ELISA, ble vurdert med hensyn til antagonistaktivitet i en adhesjonsanalyse med JYceller og enten (i) MAdCAM-IgGi Fc-fusjonsprotein eller(ii) MAdCAM-CHO-celler.

(i) MAdCAM-IgGi Fc-fusjonsanalyse

100pl av en 4,5pg/ml løsning av renset MAdCAM-IgGi Fcfusj onsprotein i Dulbeccos PBS ble adsorbert til 96 brønners Black Microfluor "B" u-bunnede (Dynex #7805)plater over natten ved 4°C. De MAdCAM-belagte plater blederetter snudd oppned, og overskuddet av væske ble fjernet, før blokkering ved 37°C i minst 1 time i 10% BSA/PBS. Under denne tid ble dyrkede JY-celler talt under anvendelse avtryptanblått-eksklusjon (bør være tilnærmelsesvis 8xl05celler/ml), og 20xl0s celler/analyseplate ble pipettert inn i et 50 ml sentrifugerør. JY-celler ble dyrket i RPMI1640

medier (Gibco), inneholdende 2 mM L-glutamin og 10% varmeinaktiverte føtalt okseserum (Life Technologies #10108-165)og kimsatt ved l-2xl05/ml hver 2-3 dager for å hindrekulturen i å differensiere. Cellene ble vasket to ganger med RPMI 1640-media (Gibco) inneholdende 2 mM L-glutamin(Gibco) ved sentrifugering (240g), idet man suspenderte på nytt den endelige cellepellet ved 2xl0s celler/ml i RPMI 1640 for Calcein AM-lasting. Calcein AM (Molecular Probes#C-3099) ble tilsatt til cellene som en 1:200 fortynning iDMSO (ca. sluttkonsentrasjon 5 pM), og cellene ble beskyttet for lys under inkubasjonen (37°C i 30 min). Under dette celleinkubasjonstrinn ble antistoffene som skulle testes, fortynnet som følger: for enkeltdosetesting ble antistoffene fremstilt til 3 pg/ml (1 pg/ml sluttlig) i 0,1 mg/ml BSA (Sigma#A3059) i PBS; for fulle ICsø-kurver bleantistoffene fortynnet i 0,1 mg/ml BSA/PBS, og 3 pg/ml (1 pg/ml sluttlig) var toppkonsentrasjonen, deretter ved å doble fortynningene (1:2-forhold) over hele platen. Densiste brønn i raden ble anvendt for bestemmelse av total binding, derfor ble 0,lmg/ml BSA i PBS anvendt.

Etter blokkering ble platens innhold slått vekk, og 50 pl av antistoffer/kontroller ble tilsatt til hver brønn, og platen ble inkubert ved 37°C i 20 min. Under denne tid ble Calcein-ladede JY-celler vasket en gang med RPMI 1640-mediainneholdende 10% føtalt okseserum og en gang med 1 mg/ml BSA/PBS ved sentrifugering, idet man suspenderte på nytt sluttpelleten til lxl0s/ml i 1 mg/ml BSA/PBS. 100 pl celler ble tilsatt til hver brønn i den U-bunnede plate, platenble forseglet, kort sentrifugert (1000 rpm i 2 min), og platen ble deretter inkubert ved 37°C i 45 min. Etter denne tid ble platene vasket med en Skatron platevasker, og fluorescensen ble målt under anvendelse av en Wallac Victor2 1420 Multilabel Reader (eksitasjon Å,485nm, emisjon Å, 535nm hellinger fra toppen, 8 mm fra bunnen av platen, i 0,1 sec med normal emisjonsåpning). For hver antistoffkonsentrasjon ble prosentuell adhesjon uttrykt som prosentdel av maksimal fluorescensrespons i fravær av

ethvert antistoff minus fluorescens forbundet med ikkespesifikk binding. ICso-verdien er definert som antiMAdCAM-antistoffkonsentrasjonen ved hvilken adhesjonsresponsen minskes til 50% av responsen i fravær av antiMAdCAM-antistoff. Antistoffer som var i stand til å hemmebindingen av JY-celler til MAdCAM-IgGi Fc-fusjon med enICso-verdi <0,1 p,g/ml, ble ansett å ha potentantagonistaktivitet og ble ført videre til MAdCAM-CHOadhesjonsanalysen. Alle tolv av de undersøkte Abs viste kraftig antagonistaktivitet (Tabell 3). De monoklonale antistoffer 1.7.2, 1.8.2, 7.16.6, 7.20.5 og 7.26.4 var avledet fra IgG2K-avstamninger, og monoklonale antistoffer6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1 og 9.8.2 var avledet fra IgG4K-avstamninger.

(ii) MAdCAM-CHQ-celleadhesj onsanalyse

JY-celler ble dyrket som ovenfor. MAdCAM-uttrykkende CHOceller ble generert med pEFSFRT MAdCAM cDNA-konstruktet ogunder anvendelse av Flp-rekombinaseteknologien (Invitrogen)som beskrevet ovenfor. Enkle stabile kloner av MAdCAMuttrykkende CHO-celler ble valgt basert på deres evne til åunderstøtte adhesjonen av JY-celler og bindingen, vedstrømningscytometri, av kanin-anti-peptidantistoffet,opprettet mot N-terminusen av MAdCAM og beskrevet ovenfor.MAdCAM-uttrykkende CHO-celler ble dyrket i et DMEM/F12media (Gibco # 21331-020) inneholdende 2 mM L-glutamin, 10%føtalt okseserum (Gibco) og 350 p,g/ml Hygromycin B (Invitrogen), idet man splittet dem 1:5 hver 2/3 dager. For adhesjonsanalysen ble MAdCAM-uttrykkende CHO-celler utsåddved 4xl04 celler/brønn i 96 brønners sorte plater, klarbunnet (Costar # 3904) i 200 p.1 kulturmedium og dyrket over natten ved 37°C/5% CO2.

Følgende dag ble hybridomsupernatanten eller renset monoklonalt antistoff fortynnet fra en utgangskonsentrasjon på 30 p,g/ml (ekvivalent med en sluttkonsentras j on på 10 p,g/ml) i 1 mg/ml BSA/PBS, som beskrevet ovenfor. For MAdCAM CHO

platene ble plateinnholdet tømt ut, og 50 p.1 av antistoff/ kontrollene ble tilsatt til hver brønn, og platen ble inkubert ved 37°C i 20 min. Den siste brønnen i raden ble anvendt for bestemmelse av total binding, slik at 0,1 mg/ml BSA i PBS ble anvendt. Calcein AM-ladede JY-celler, til ensluttkonsentrasjon av lxl0s/ml i 1 mg/ml BSA/PBS, ble fremstilt som ovenfor, deretter ble 100 p.1 tilsatt til platen etter en 20 min inkubasjonsperiode med antistoffet. Platen ble deretter inkubert ved 37°C i 45 min, deretter vasket på en Tecan-platevasker (PW 384), og fluorescensen ble måltunder anvendelse av Wallac-plateavleseren som beskrevetovenfor. For hver antistoffkonsentrasjon ble prosent adhesjon uttrykt som prosentandel av maksimal fluorescensrespons i fravær av ethvert antistoff minus fluorescensen forbundet med ikke-spesifikk binding. Antistoffer som var istand til å hemme bindingen av JY-celler til MAdCAM CHOceller med en ICso-verdi <1 p,g/ml ble ansett å ha kraftigantagonistaktivitet. Som før er ICsø-verdien definert somanti-MAdCAM-antistoffkonsentrasjonen ved hvilken adhesjonsresponsen hadde minsket til 50% av responsen i fravær av anti-MAdCAM-antistoff. ICsø-potensen for 1.7.2, 1.8.2,6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4 og 9.8.2 i denne analyse er beskrevet nedenfor i Tabell 3.

Tabell 3. ICsp-verdier av eksemplifiserte anti-MAdCAM

antistoffer

Klon

MAdCAM IgG Fc-fusjon

MAdCAM Flpln CHO Assay

Gjennomsnittlig IC50 (pig/ml)

n

Gjennomsnittlig IC50 (pig/ml)

n

1.7.2

0,030

± 0,011

0,502

±

0,280

1.8.2

0, 027

± 0,011

0,424

±

0, 107

7.16.6

0,019

± 0,009

0,389

±

0,093

7.20.5

0,025

± 0,027

0,387

±

0,202

7.26.4

0, 021

± 0,040

0,574

±

0,099

6.14.2

0, 011

± 0,005

0,291

±

0,096

6.22.2

0,018

± 0,011

0,573

±

0,168

6.34.2

0,013

± 0,008

0,285

±

0,073

6.67.1

0,013

±0,070

0,298

±

0,115

6.73.2

0,020

± 0,010

0,369

±

0,103

6.77.1

0, 022

± 0,004

0,520

±

0,100

9.8.2

0,020

± 0,050

0,440

±

0,342

IgG2

IgG4

For å måle antagonistpotensialet av anti-MAdCAM mAbs is strømningsbaserte analyser, under skjærbelastningsbetingelser utformet for å imitere de mikrovaskulære omgivelser på de høy-endotele venuler som tjener tarmforbundne lymfoide vev, ble CHO-celler uttrykkende MAdCAMutsådd i glassmikroplater (50 x 4 mm) og fikk feste seg for io å danne et sammenflytende monolag (ca. 2,5 x 105 celler).

Cellene ble deretter inkubert med affinitetsrenset mAb over et område av konsentrasjoner (0,1-10 p,g/ml) i 20 minutterved 37°C, før de ble forbundet med strømningsanalysesystemet. Et isotype-tilpasset IgG2 eller IgG4 mAb (10is jig/ml) ble anvendt som negativ kontroll. Normale perifere donor-blodlymfocytter (PBLs) ble dynket over cellemonolagetved en konstant skjærbelastning av 0,05 Pa. Eksperimentene

ble tatt opp på video, og total adhesjon av lymfocytter (rulling + fast adhesjon) ble beregnet. Alle de testede monoklonale antistoffer viste seg å være kraftige antagonister under de beskrevne betingelser.

(i i i) Stamper-Woodruff-analyser

For å anskueliggjøring MAdCAM+-kar ble biotinylert antiMAdCAM mAb generert på 1-2 mg av affinitetsrenset protein,under anvendelse av et 20 molar overskudd av biotin-NHS(Pierce) i fosfatbuffersaltløsning, i henhold til fabrikantens instruksjoner. Reaksjonen fikk forbli ved romstemperatur (30 min), og ble avsaltet med en PD-10kolonne (Pharmacia), og proteinkonsentrasjonen ble bestemt.

En normal leverlymfeknute ble fjernet fra et donororgan, hurtig-frosset i flytende nitrogen og lagret ved -70°Cinntil bruk. 10 pm cryostatsnitt ble skåret ut, lufttørket på poly-L-lysinbelagte plater, og fiksert i aceton føranalysen. Snittene ble blokkert under anvendelse av et avidin-biotinblokkerende system (DAKO), og deretterinkubert med biotinylert anti-MAdCAM mAb over et område avkonsentrasjoner (1-50 pg/ml) ved romstemperatur (2 timer).En isotype-tilpasset IgG2 eller IgG4 mAb (50 pg/ml) bleanvendt som negativ kontroll og et blokkerende anti-p?antistoff (50 pg/ml) som positiv kontroll.

Perifere blodlymfocytter, tatt fra normale donorer ble merket med et murint anti-human CD2 mAb (DAKO) for åmuliggjøre påfølgende visualisering av klebende celler. 5xl05 PBL'er ble tilsatt til hvert lymfeknutesnitt og inkubert i 30 minutter før de ble forsiktig skylt vekk for å hindre løsgjøring av klebende celler. Snittene ble deretter fiksert på nytt i aceton, og innkubert på nytt med biotinylert anti-MAdCAM mAb (10 pg/ml), etterfulgt avbiotinylert gjet-anti-mus-mAb (for å gjenkjenne CD2-merkedePBL-stoffer og ufarvede MAdCAM+-kar) og deretterstreptABcomplex/HRP (DAKO). Til slutt ble MAdCAM+-kar &

CD2-merkede PBL-stoffer anskueliggjort ved tilsetning avDAB-substrat (DAKO) til snittene, med et brunt reaksjonsprodukt som viser områder av positiv farving. Lymfocyttadhesjon ble kvantifisert ved å telle antallet av lymfocytter som klebet til 50 MAdCAM-l+-kar av portalorganene,årene eller sinusoidene. Dataene, uttrykt som gjennomsnittsverdier, ble deretter normalisert til prosent adhesjon, under anvendelse av adhesjonen av PBL-stoffer ifravær av antistoff satt som 100%. Dataene ble kompilert på basis av n=3 forskjellige PBL-donorer og for forskjelligeleverlymfeknutedonorer. Representative data for de biotinylerte rensede monoklonale antistoffer 1.7.2 og 7.16.6 er gjengitt i Figur 4 sammenlignet med en blokkerende anti-p7-antistoffkontroll.

Selektivitetsanalyser:

VCAM og fibronektin er nære struktur- og sekvens-homologertil MAdCAM. Affinitet-rensede anti-MAdCAM mAbs bleanalysert med hensyn til MAdCAM-spaesifisitet ved åbestemme deres evne til å blokkere bindingen av Jurkat T-celler (ATCC) til deres beslektede celleadhes j onsmolekyl. 100p.l av en 4,5p,g/ml løsning av Fibronektin-cellebindende fragment (110 Kd, Europa BioproductsLtd, Cat. No. UBF4215-18) eller VCAM (Panvera) i DulbeccosPBS ble adsorbert til 96 brønners Black Microfluor "B" ubunnede (Dynex #7805) plater over natten ved 4°C. De belagte plater ble deretter snudd, og overskuddet av væske ble tørket vekk, før blokkering ved 37°C i minst 1 time i 10% BSA/ PBS. Under denne tid ble dyrkede Jurkat T-cellertalt under anvendelse av tryptan-blått-eksklusjon og ladetmed Calcein AM-farvestoff som tidligere beskrevet for JYceller ovenfor. Antistoffene som skulle testes, ble fortynnet fra en toppkonsentrasjon på 10 p,g/ml i 0,1 mg/ml BSA i PBS. Den siste brønn i raden ble anvendt for bestemmelse av total binding, således ble 0,lmg/ml BSA i PBS anvendt. Echistatin (Bachem, Cat. No. H-9010) fremstilt iPBS ble anvendt i en toppkonsentrasjon av 100 nM for å

blokkere asPi/Fibronektin-interaksjon. ET anti-CD106 mAb(Klon 51-10C9, BD Pharmingen Cat. No. 555645) i entoppkonsentrasjon av 1 jig/ml ble anvendt for å blokkere ouPi/VCAM-interaks j onen.

Etter blokkering ble platenes innhold tømt ut, og 50 p.1 av antistoffer/kontroller ble tilsatt til hver brønn, og platen ble inkubert ved 37°C i 20 min. Calcein-ladedeJurkat T-celler ble vasket en gang som før, idet mansuspenderte på nytt den endelige cellepellet til lxl0s/ml i 1 mg/ml BSA/PBS. 100 p, 1 av cellene ble tilsatt til hver brønn av den U-bunnede plate, platen ble forseglet, kortsentrifugert (1000 rpm i 2 min) og platen ble deretter inkubert ved 37°C i 45 min. Ved slutten av denne tid ble platene vasket med en Skatron-platevasker, og fluorescensenble malt under anvendelse av en Wallac Vrctor 1420 Multilabel Reader (eksitasjon Å,485nm, emisjon Å,535nm telling fra toppen, 8 mm fra bunnen av platen, i 0,1 sec med normal emisjonsåpning). For hvert antistoff uttrykkes graden av hemming nedenfor figurlig, i Tabell 4 (-uvesentlig hemming av adhesjon, *** fullstendig hemmingav adhesjon). Alle eksemplifiserte mAb-stoffer er kraftigeog selektive anti-MAdCAM-antagonister, og viser hovedsakelig mer enn 100 ganger selektivitet for MAdCAM i forhold til VCAM og fibronektin.

Tabell 4. Sammenlignende selektivitet av anti-MAdCAMantistoff for MAdCAM i forhold til andre celleadhesjonsmolekyler, fibronektin og VCAM

Klon

Hemming i a5bl/fibronektinanalyse (10 mg/ml)

Hemming i a4bl/VCAManalyse (10 mg/ml)

Hemming i a4b7/MAdCAManalyse (0,1 mg/ml)

1.7.2

■A" ■A’ ■A’

1.8.2

■A" ■A’ ■A’

7.16.6

■A" ■A’ ■A’

7.20.5

■A" ■A’ ■A’

7.26.4

■A" ■A’ ■A’

6.14.2

■A" ■A’ ■A’

6.22.2

■A" ■A’ ■A’

6.34.2

■A" ■A’ ■A’

6.67.1

■A" ■A’ ■A’

lllllllll

■A" ■A’ ■A’

6.77.1

■A" ■A’ ■A’

9.8.2

■A" ■A’ ■A’

IgG2

IgG4

s Hybridomer ble deponert i den europeiske samling av cellekulturer (ECACC), H.P.A i CAMR, Porton Down, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG 9. september 2003 med følgende deponeringsnumre:

Hybridom

Deponeringsnummer

1.7.2

03090901

1.8.2

03090902

6.14.2

03090903

6.22.2

03090904

6.34.2

03090905

6.67.1

03090906

6.73.2

03090907

6.77.1

03090908

7.16.6

03090909

7.20.5

03090910

7.26.4

03090911

9.8.2

03090912

EKSEMPEL II:

Bestemmelse av affinitetskonstanter (Kd) av fullt ut humane anti-MAdCAM-monoklonale antistoffer ved hjelp avBIAcore

Vi utførte affinitetsmålinger av rensede antistoffer ved overflateplasmonresonans under anvendelse av BIAcore 3000instrumentet, idet fabrikantens protokoller ble fulgt.

Protokoll 1

For å utføre kinetiske analyser ble en høydensitets musanti-human (IgG2 og IgG4) antistoffoverflate over en CM5BIAcore-sensor-chip fremstilt under anvendelse av rutinemessig aminkobling. Hybridomsupernatanter ble fortynnet 10, 5, 2 ganger i HBS-P (10 mM HEPES pH 7,4, 150 mM NaCl,0,005% Surfactant P20) løpende buffer inneholdende 100 jig/ml BSA og 10 mg/ml karboksymetyldekstran ellar anvendt ufortynnet. Hvert mAb ble oppfanget på en separat overflate under anvendelse av en 1 min kontakttid og en 5 min vask for stabilisering av mAb-basislinjen. MAdCAM-IgGi Fcfusjonsprotein (141 nM) ble deretter injisert over alle overflater i et minutt, etterfulgt av en 3 min dissosiasjon. Dataene ble normalisert med hensyn til

mengden av antistoff oppfanget på hver overflate og evaluert med "global fit Langmuir" 1:1, under anvendelse av basislinjedriftmodeller tilgjengelig på BIAevaluationprogramvaren anskaffet fra BIAcore.

Protokoll 2

Affinitetsrenset mAb ble immobilisert på dekstranlaget av en CM5 biosensor-chip under anvendelse av aminkobling.

Chips ble fremstilt under anvendelse av pH 4,5 acetatbuffer som immobiliseringsbuffer, og proteindensiteter på 2,5-5,5kRU ble oppnådd. Prøver av MAdCAM-IgGi Fc-fusjonsprotein iløpende buffer ble fremstilt ved konsentrasjoner varierende fra 0,2-55 nM (en 0 nM løsning omfattende løpende bufferalene ble innbefattet som en nullreferanse). Prøver ble randomisert og injisert i duplikat i 3 min hver over 4 flytceller under anvendelse av HBS-EP (10 mM HEPES pH 7,4,150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0,005% Surfactant P20) som løpende buffer. En gjennomstrømningsmengde på 100 p,l/min ble anvendt for å minimere massetransportbegresninger. Dissosiasjonen av MAdCAM-IgGi Fc-fusjonsprotein bleovervåket i 180 minutter, overflaten ble regenerert med en 6 sekunders injeksjon av 25 mM H3PO4 (50 p,l/min) , eller 10 mM (6.22.2), 20 mM (6.67.1, 6.73.2, 6.77.1) til 25 mM

(6.34.2) og 45 mM NaOH (6.14.2), og dataene ble analysert under anvendelse av BIAevaluation-programvarepakken(v3.1).

Tabell 5 angir affinitetsmålinger for representative antiMAdCAM-antistoffer ifølge foreliggende oppfinnelse:

Tabell 5. Bestemmelse av affinitetskonstant, Kj, ved overflateplasmonresonans (BIAcore)

KLON

Protokoll 1

Protokoll 2

kon (1/Ms)

koff(l/s)

Kd (pM)

kon (1/Ms)

koff(l/s)

Kd (pm)

1.7.2

2.4 x

1 x 10"

5.5 x 103

1.3 x

23, 6

10"7

1.8.2

2.9 x

1 x 10"

1.8 x 105

2.3 x

10"5

7.16.6

1.5 x

2.2 x

1,5

2.9 x 105

1.4 x

4,8

10"6

10"6

7.20.5

4.5 x

1.9 x

42,2

1.6 x 105

1.2 x

10"5

10"5

7.26.4

9.6 x

2.6 x

1.5 x 105

1.2 x

10"4

10"5

6.14.2

1.3 x

1 x 10"

7,7

5 x 105

< 5 x

< 10

10"6

6.22.2

1.5 x

1.4 x

9,3

2.3 x 105

8.7 x

3,8

10"5

10"7

6.34.2

1.2 x

1.9x

15, 8

3.3 x 105

< 5 x

<15

10"5

10"6

6.67.1

5.9 x

1 x 10"

2.4 x 105

< 5 x

<20

10"6

6.73.2

1.4 x

1.3 x

10"4

6.77.1

1.5 x

1 x 10"

6,7

<0 00

2.3 x

2.3 x

4.4 x 105

1.4 x

32,5

10"4

10"5

IgG2

IgG4

De kinetiske analyser indikerer at antistoffene fremstilt i samsvar med oppfinnelsen har høye affiniteter og sterke bindingskonstanter for det ekstracellulære domene av MAdCAM.

EKSEMPEL III:

Identifikasjon av epitopselektivitet og arts-kryssreaktivitet av anti-MAdCAM mAbs

Antistoffer gjenkjenner overflate-eksponerte epitoper påantigener som regioner av lineær (primær) sekvens eller strukturell (sekundær) sekvens. Luminex-epitopkategorisering, BIAcore-kategorisering og artsimmunohistokjemisk analyse ble anvendt i samklang for å definere det funksjonelle epitoplandskap av anti-MAdCAM-antistoffene.

Luminex-basert epitop-kategorisering:

MxhlgG 2,3.4-konjugerte kuler (Calbiochem Ml 1427) blekoblet til det primære ukjente anti-MAdCAM-antistoff. Vitilsatte 150 p.1 av primær ukjent antistoff-fortynning (0,1jig/ml fortynnet i hybridommedium) til brønnen i en 96brønners vevskulturplate. Kulematerialet ble forsiktig hvirvlet og fortynnet i supernatant til en konsentrasjon av

o, 5 x 105 kuler/ml. Kulene ble inkubert i supernatanten på et risteapparat over natten i mørke ved 4°C.

Hver brønn i en 96-brønners mikrotiter-filterplate(Millipore # MABVN1250) ble på forhånd fuktet ved å tilsette 200 p.1 vaskebuffer (PBS inneholdende 0,05% Tween20) og fjernet ved innsugning. Deretter ble 50

p, l/brønn av 0,5 x 105 kuler/ml standard tilsatt til

filterplaten, og brønnene ble vasket med vaskebuffer (2 xl00 p,l/brønn) . 60 p,l/brønn av MAdCAM-IgGi Fc-antigenfortynnet i hybridommedium (0,1 p,g/ml) ble tilsatt. Platene ble tildekket og inkubert ved romstemperatur med forsiktig risting i en time. Brønnene ble vasket to ganger ved tilsetning av 100 p,l/brønn vaskebuffer etterfulgt av innsuging. Deretter tilsatte vi 60 p,l/brønn av sekundært ukjent anti-MAdCAM-antistoff fortynnet i hybridommedium(0,1 p,g/ml) . Platene ble rystet ved romstemperatur i mørke i to timer. Deretter ble brønnene vasket to ganger ved tilsetning av 100 p,l/brønn vaskebuffer etterfulgt av

innsuging. Deretter ble 60 p,l/brønn av biotinylert MxhlgG 2,3,4 (0,5 p,g/ml) tilsatt. Platene ble rystet ved romstemperatur i mørke i en time. Brønnene ble vasket to ganger ved tilsetning av 100 pd/brønn vaskebuffer etterfulgt av innsuging. Til hver brønn ble 60 pl av 1 pg/ml MxhlgG 2,3,4 Streptavidin-PE (Pharmacia #554061) fortynnet i hydridommedium tilsatt. Platene ble rystet ved romstemperatur i mørke i 20 minutter. Brønnene ble vasket to ganger ved tilsetning av 100 pl/brønn vaskebuffer etterfulgt av innsuging. Deretter ble hver brønn suspendert på nytt i 80 pl blokkeringsbuffer (PBS med 0,5% okseserum-albumin, 0,1%TWEEN og 0,01% Thimerosal) forsiktig pipettert opp og ned for å suspendere kulene på nytt.

Under anvendelse av Luminex 100 og dets medfølgende programvare (Luminex® Corporation) ble platene avlest for å bestemme luminescensavlesningene. Basert på luminescensdataene oppnådd for de forskjellige anti-MAdCAM-antistoffersom ble testet, ble anti-MAdCAM-antistoffene gruppert ihenhold til sine bindingsspesifisiteter. Anti-MAdCAMantistoffene som ble testet, faller inn i en serie av epitop-kategorier, representert i Tabell 8.

BIAcore-kategorisering:

I en lignende metode som beskrevet ovenfor kan BIAcore også anvendes for å bestemme epitop-ekslusiviteten av antiMAdCAM-antistoffene eksemplifisert ved denne oppfinnelse.Ni anti-MAdCAM-antistoffkloner, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1,6.77.1, 7.20.5, 9.8.2, 1.7.2, 7.26.4 og 7.16.6, ble immobilisert på dekstranlaget av separate flytceller av en CM5-biosensorchip under anvendelse av aminkobling.

Immobiliseringsbufferen var enten 10 mM acetatbuffer pH 4,5 (klonene 6.22.2, 6.34.2, 7.20.5, 9.8.2, 1.7.2, 7.26.4 og 7.16.6) eller 10 mM acetatbuffer pH 5,5 (klonene 6.67.1 og 6.77.1). En proteintetthet på tilnærmelsesvis 3750 RU ble oppnådd i alle tilfeller. Deaktivering av uomsatte N

hydroksysuksinimidestere ble utført under anvendelse av 1 M etanolaminhydroklorid, pH 8,5.

MAdCAM-IgGi Fc-fusjonsprotein ble fortynnet til enkonsentrasjon av 1,5 pg/ml (tilnærmelsesvis 25 nM) i HBS-EPløpende buffer (0,01 M HEPES pH 7,4, 0,15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0,005% Polysorbate 20). Det ble deretter injisert over den første flytcelle, i et volum av 50 pl med en hastighet på 5 pl/min. Etter at injeksjonen var fullstendig, ble den første antistoffprobe tilsatt til den samme flytcelle. Alle testantistoffer ble fortynnet til en konsentrasjon på tilnærmelsesvis 20 pg/ml i HBS-EP, og ogsåinjisert i et volum på 50 pl med en gjennomstrømningsmengde av 5 pl/min. Når ingen binding av testantistoffet ble iakttatt, ble den neste testklon injisert umiddelbart etterpå. Når binding opptrådte, ble sensoroverflaten regenerert for å fjerne både MAdCAM-IgGi Fc-fusjonsproteinet og testantistoffet. Mange forskjellige regenerasjonsløsninger ble anvendt avhengig av det immobiliserte antistoff og testantistoffet som var nærværende. En oppsummering av regenerasjonsbetingelsene er gjengitt i Tabell 6.

Tabell 6. Oppsummering av regenerasjonsbetingelsene for å utføre BIAcore-epiopkartlegging

Immobilisert antistoff

Antistoffprobe som skal fjernes

Regenerasj onsløsning

Injeksjonsvolum

7.16.6

6.22.2

40 mM Fosforsyre

20 pl

6.34.2

40 mM Fosforsyre

40 pl

7.20.5

40 mM Fosforsyre

20 pl

6.77.1

9.8.2

40 mM Fosforsyre

10 pl

1.7.2

40 mM Fosforsyre

5 pl

7.16.6

40 mM Fosforsyre

10 pl

1.7.2

6.77.1

25 mM Fosforsyre

5 pl

9.8.2

25 mM Fosforsyre

5 pl

7.20.5

25 mM Fosforsyre

5 pl

6.22.2

25 mM Fosforsyre

5 pil

6.34.2

25 mM

Natriumhydroksid

5 pil

6.67.1

25 mM

Natriumhydroksid

5 pil

6.22.2

9.8.2

25 mM

Natriumhydroksid

20 pil

7.26.4

25 mM

Natriumhydroksid

5 pil

6.34.2

9.8.2

25 mM

Natriumhydroksid

70 pil

1.7.2

4 0 mM

Natriumhydroksid

5 pil

7.26.4

4 0 mM

Natriumhydroksid

5 pil

6.67.1

9.8.2

4 0 mM

Natriumhydroksid

5 pil

1.7.2

4 0 mM

Natriumhydroksid

5 pil

7.20.5

9.8.2

25 mM Fosforsyre

5 pil

1.7.2

25 mM Fosforsyre

5 pil

7.26.4

25 mM Fosforsyre

5 pil

7.26.4

9.8.2

4 0 mM

Natriumhydroksid

20 pil

6.22.2

75 mM Fosforsyre

20 pil

7.20.5

75 mM Fosforsyre

20 pil

7.16.6

75 mM Fosforsyre

20 pil

9.8.2

9.8.2

25 mM Fosforsyre

15 pil

6.22.2

25 mM Fosforsyre

10 pil

7.20.5

25 mM Fosforsyre

20 pil

7.16.6

25 mM Fosforsyre

10 pil

(gjennomstrømningsmengden var 50 gl/min under alle regenerasj onsprosedyrer)

Etter regenerasjonen ble MAdCAM-IgGi Fc-fusjonsproteinbundet igjen og ytterligere testantistoffer ble injisert.

5 Disse prosedyrer ble utført inntil hele panelet av kloner var blitt injisert over overflaten av det immobiliserte antistoff, med bundet MAdCAM-IgGi Fc-fusjonsprotein. En nyflytcelle med et forskjellig immobilisert antistoff og

bundet MAdCAM ble deretter anvendt for testing med de ni testkloner. Anti-MAdCAM-antistoffene 1.7.2 og 1.8.2 varforventet å gjenkjenne den samme MAdCAM-epitop, basert påden nære primære aminosyresekvenshomologi av deres tunge og kappa-lette kjeder, SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 8 respektive.Følgelig ble bare 1.7.2 bedømt via BIAcore-responsmatriksen. Antistoffene 6.14.2 og 6.73.2 ble utelatt fra denne analyse, men alle andre kombinasjoner av anti-MAdCAMantistoffpar ble testet på denne måte. Et villkårlig nivå på 100 RU ble valgt som terskelen mellom binding/ikkebinding, og en responsmatriks (Tabell 7) ble utarbeidet basert på om binding ble iakttatt.

Tabell 7. BIAcore-epitopkategoriserende responsmatriks

Immobilisert antistoff

Sekundært antistoff

6.22.2

6.34.2

6.67.1

6.77.1

7.20.5

9.8.2

1.7.2

7.26.4

7.16.6

6.22.2

x

x

x

x

6.34.2

■

X

x

x

x

6.67.1

•

X

X

6.77.1

X

X

X

7.20.5

■

X

X

X

iiiiiiiiiiiii

X

X

X

X

X

X

1.7.2

X

X

X

X

X

X

7.26.4

X

X

X

X

iW

X

7.16.6

X

X

X

Responsmatriks for alle kombinasjoner av antistoffpar.

- angir ingen binding av antistoffproben, x angir bindingble iakttatt (ovenfor et valgt terskelnivå på 100 RU).

Matriksdiagonalen i Tabell 7 (skravert grått) inneholder bindingsdataene for identiske probepar. I alle tilfeller, unntatt for de to klonene 7.16.6 og 9.8.2 var antistoffene selvblokkerende. Antistoffene 7.16.6 og 9.8.2 krysskonkurrerer ikke. Mangelen på selvblokkering kunne være på grunn av en mAb-indusert konformasjonal endring i fusjonsproteinet som tillater ytterligere binding av mAb til et andre sete på MAdCAM-IgFc.

Gruppering av kloner som viser det samme reaktivitetsmønster forårsaker minst seks forskjellige epitopkategorier, som vist i den grafiske fremstilling. Figur 5).

Ytterligere presis identifikasjon av MAdCAM-epitopsekvensene med hvilke et anti-MAdCAM-antistoff samhandler,kan bestemmes ved hjelp av en hvilken som helst av flere metoder, inklusive, men ikke begrenset til, Western-analyseav flekkete peptidrader fra samlinger (Reineke et al., Curr. Topics in Mikrobiol. og Immunol 243: 23-36 (1999), M.Famulok, E-L Winnacker, C-H Wong eds., Springer-Verlag,Berlin), bakteriofag eller bakteriell flagellin/biiCekspresjonsvisninger fra samlinger, eller enkel MALDI-TOFanalyse av bundne proteinfragmenter etter begrenset proteolyse.

Immunohistokjemiske analyser:

OCT eller sukrose-innkapslede frosne vevprøver av ileum(Peyers lapper), mesenterisk lymfeknute, milt, magesekk, duodenum, jejunum og colon ble anvendt som en positiv farvingskontroll for anti-MAdCAM mAbs. For farving av snittfra mennesker med humane IgG2 mAbs ble biotinylerte derivater av anti-MAdCAM mAbs generert. 10 pm frosnevevsnitt ble skåret opp på poly L-lysinbelagte objektglass,plassert direkte i 100% aceton 4°C (10 min), deretter 3% hydrogenperoksid i metanol (10 min), idet man vasket mellom trinnene med PBS. Objektglasset ble blokkert med Biotin Blocking System (DAKO Cat. No. X0590), før inkubasjon med det primære antistoff (1:100 - 1:1000) i PBS (1 time),vasket med PBS-Tween 20 (0.05%) og deretter bindingsutviklet med HRP-Streptavidin (BD Bioscience Cat. No.550946, 30 min) og DAB-substrat (Sigma Cat. No. D5905). ForIgG4 mAbs ble et HRP-konjugert, murint anti-humant IgG4(Zymed Cat. No. 3840) sekundært anvendt. Objektglasset ble motfarvet med Mayers Haemalum (1 min), vasket og deretter satt i DPX.

Bindingsaffiniteten ble sammenlignet for et antall arter (mus, rotte, kanin, hund, svin, cynomolgus og mennesker). Det var ingen reaktivitet for rotte-, kanin- og svinevevved immunohistokjemi og ingen kryss-reaktivitet av anti

5 MAdCAM-antistoffene for rekombinant murint MAdCAM, når detble analysert ved hjelp av ELISA. Dataene for menneske-,cynomolgus- og hundevev er angitt i tabellform. Tabell 8nedenfor:

Tabell 8. Mønster av kryssreaktivitet for anti-MAdCAM

io antistoffer overfor MAdCAM-artsortologer

KLON

Luminexkategori

IHC kryss-reaktivitet

Menneskeileum

Cynoileum

Marmosetileum

Hundeileum

1.7.2

3a

1.8.2

3a

7.16.6

3b

7.20.5

2b

n.d

7.26.4

3b

n.d

6.14.2

n.d

6.22.2

n.d

6.34.2

n.d

6.67.1

n.d

6.73.2

n.d

n.d

6.77.1

n.d

9.8.2

3a

n x d

IgG2

IgG4

Ingen binding

Binding

n.d: ikke bestemt

Anti-MAdCAM-binding til spesialiserte endotele strukturerog lymfoid vev er indikert med skraveringen, i henhold til nøkkelen. Epitop-kategorien basert på Luminex-epitopanalyseis og mønsteret for MAdCAM kryss-reaktivitet er indikert forhvert antistoff. Luminex-epitopkategoriseringsdataene for

anti-MAdCAM-antistoffene 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1,6.73.3 og 6.77.1 (kursiv) ble avledet fra separate eksperimenter enn for 1.7.2, 1.8.2, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4 og 9.8.2 (uthevet trykk), som indikert ved forskjellen i skrifttype.

Alle anti-MAdCAM-antistoffer som ble testet, hadde evne tilå gjenkjenne en human MadCA-epitop uttrykt på vaskulæreendotele seksjoner av det gastrointestinale system. Bortsett fra 1.7.2 og 1.8.2 var alle andre anti-MAdCAMantistoffer som ble testet, i stand til spesifikt å binde de vaskulære endotele seksjoner av det gastrointestinale system fra cynomolgus. Visse andre anti-MAdCAM-antistoffer,nemlig 6.14.2 og 6.67.1 hadde også evne til spesifikt å gjenkjenne MAdCAM-ortologen fra hund samt MAdCAM fracynomolgus.

Generering av en funksjonelt aktiv kimær cynomolgus/humanMAdCAM-uttrykkende CHQ-cellelinje:

Forskjellene i bindingsaffinitet hos visse anti-MAdCAMantistoffer for human- og cynomolgus-MAdCAM førte oss til åbestemme hvorvidt en strukturell basis for denne iakttagelse kunne lages.

Basert på den publiserte aminosyresekvens for makak-MAdCAM(Shyjan AM, et al., J Immunol., 156, 2851-7 (1996)) bleprimere utformet for å PCR-amplifisere den cynomolgusMAdCAM ouP?-bindende domenesekvens. Totalt RNA ble fremstilt fra frossen utskåret mesenterisk cynomolgus-lymfeknute (ca. 200 mg) under anvendelse av Trizol-metoden(Invitrogen) i henhold til fabrikantens instruksjoner. 1-2p.g ble oligo-dT-preparert og reverstranskribert med AMVreverstranskriptase (Promega). En andel av det reverstranskriberte produkt ble utsatt for PCR med forover-5'-AGCATG GAT CGG GGC CTG GCC-3'- (SEQ ID NO: 67) og reverse-5'GTG CAG GAC CGG GAT GGC CTG-3'-primere (SEQ ID NO: 68) medGC-2 polymerase i 1M GC-smelte (Clontech) og ved en

herdetemperatur på 62°C. Et RT-PCR-produkt av passendestørrelse ble skåret ut og renset fra en 1% agarose-geletter elektroforese, deretter TOPO-TA-klonet (Invitrogen)mellom EcoRI-setene i pCR2.1. Innføyningen ble sekvensbekreftet. Nukleotidet og predikerte translaterte aminosyresekvenser er vist i SEQ ID NOS 49 og 50, respektive.

De predikerte human- og cynomolgus-MAdCAM-aminosyresekvenser for det ogØ?-bindende domene viser en høy grad avsekvensidentitet (90,8%) når de linjestilles (Figur 3 tilveiebringer denne sekvenslinjestilling). For å generere en funksjonell aktiv cynomolgus-MAdCAM-uttrykkende cellelinje, som imiterte det anti-MAdCAM-bindende mønsterrepresentert ved Tabell 8, ble et SacI-fragment tilsvarendeden cynomolgus-ogØv-bindende domenesekvens i pCR2.1subklonet direkte i det C-terminale humane MAdCAM pINDHygro-konstrukt inneholdende den karboksylterminale mucinstengel og transmembrandomenet beskrevet ovenfor. Sekvensen og orienteringen ble bekreftet, deretter ble et Kpnl/Notlfragment klonet inn i pEF5FRTV5GWCAT-vektor (Invitrogen),erstattende den CAT-kodende sekvens og anvendt i transfeksjoner til å generere enkelvise stabilt uttrykkende kloner i Flp In CHO-celler (Invitrogen), i henhold tilfabrikantens instruksjoner.

Bindingen av anti-MAdCAM-antistoffkloner til CHO-celleneuttrykkende cynomolgus/humane MAdCAM- kimærer ble analysertved strømningscytometri, og den funksjonelle aktivitet av anti-MAdCAM-antistoffer ble bestemt under anvendelse av enmeget lik JY-celleadhesjonsanalyse som beskrevet ovenfor.Bindingen og den funksjonelle aktivitet av anti-MAdCAMantistoffer er uttrykt i Tabell 9.

Tabell 9. Korrelasjon mellom den funksjonelle aktivitet i den cynomolgus/humane MAdCAM-CHO/JY-adhesjonsanalyse oghuman- og cynomolgus/human-MAdCAM CHO-cellebinding, måltved hjelp av FACS, over et område av anti-MAdCAM

s antistoffer.

KLON

Funksjonell IC50 (mg/ml)

1.7.2

inaktiv

1.8.2

inaktiv

7.16.6

0,72

7.20.5

0,62

7.26.4

0,96

6.14.2

0,53

6.22.2

0,83

6.34.2

0,47

6.67.1

0,75

6.73.2

inaktiv

6.77.1

0,64

rø co

0,83

FACS-binding

human

cyno/ human

IgG2

IgG4

Ingen binding

Binding

Tatt sammen er der god korrelasjon mellom evnen hos et gitt anti-MAdCAM-antistoff til å binde human- eller cynomolgusMAdCAM, som påvist ved immunohistokjemi (Tabell 8), med io rekombinant celle-basert bindende og funksjonell aktivitet(Tabell 9). Anti-MAdCAM-antistoffene 1.7.2, 1.8.2 og 6.73.2viste f.eks. en overensstemmende mangel på binding til cynomolgus-vev og celler uttrykkende et kimærtcynomolgus/human-MAdCAM-protein. Anti-MAdCAM-antistoffeneis 1.7.2, 1.8.2 og 6.73.2 hadde heller ikke evne til å påvise funksjonell blokkerende aktivitet i cynomolgus/humanMAdCAM/JY-adhesj onsanalysen.

Lignende løsninger vil kunne anvendes for å definere epitopen av anti-MAdCAM-antistoffene 6.14.2 og 6.67.1 somgjenkjenner hunde-MAdCAM.

EKSEMPEL IV:

Anvendelse av anti-MAdCAM mAbs i påvisningen avsirkulerende løselig MAdCAM som en metode for sykdomsdiagnose

Anti-MAdCAM-antistoffer kan anvendes for påvisning avsirkulerende løselig MAdCAM (sMAdCAM). Påvisning av sMAdCAM i klinisk plasma, serumprøver eller andre biovæsker, så som, men ikke begrenset til, avføring, urin, spytt, vil sannsynligvis være en nyttig surrogatsykdomsbiomarkering for underliggende sykdom, inklusive, men ikke begrenset til, inflammatorisk tarmsykdom.

Basert på epitopkategoriseringsdata (Tabellene 7 og 8), synes anti-MAdCAM-antistoffene 1.7.2 og 7.16.6 å gjenkjenneforskjellige epitoper på human-MAdCAM. ELISA-plater blebelagt over natten ved 4°C med 100 pd/brønn av en 50 pg/ml løsning av 1.7.2 i fosfatbufret saltløsning (PBS). Etter inkubasjon ble platen blokkert i 1,5 timer med en PBSblokkeringsbuffer inneholdende 10% melk (200 pl/brønn). Etter inkubasjon ble platen vasket med PBS (2 x 100 pl/brønn) og seriefortynninger av MAdCAM-IgGl-Fc fusjonsprotein, fra en toppkonsentrasjon på 50 pg/ml ned til tilnærmelsesvis 5 ng/ml i PBS, til et sluttvolum på 100 pl, ble tilsatt til platen for inkubasjon i 2 timer ved romstemperatur. I en lignende løsningsmåte kan MAdCAM-IgGlFc-proteinet fortynnes i plasma eller serum, eller noenandre slike relevante biovæsker og anvendes for å bestemme ekspresjonen av løselig MAdCAM i en klinisk prøve, som beskrevet nedenfor. Som negativ kontroll ble bare buffer tilsatt til brønnene inneholdende det primære anti-MAdCAMantistoff. Etter denne tid ble platen vasket med PBS (3 x 100 pl/brønn), og platen ble deretter inkubert i mørke med et Alexa488-merket 7.16.6 (100 pÅ, 5 pg/ml). Det Alexa488

merkede 7.16.6 ble generert under anvendelse av et kommersielt tilgjengelig sett (Molecular Probes, A-20181),ifølge fabrikantens protokoller.

Platen ble vasket med PBS inneholdende 0,05% Tween-20, ogbinding av merket 7.16.6 for å oppfange løselig MAdCAM ble bestemt ved a male fluorescensen (Wallac Vrctor 1420 Multilabel Reader, eksitasjon Å,485nm, emisjon Å,535nm telling fra toppen, 3 mm fra bunnen av platen, i 0,1 sec med normal emisjonsåpning). Når fluorescensen fremstilles grafisk som en funksjon av konsentrasjonen av MAdCAM-IgGlFc-fusjonsprotein. Figur 6, indikerer det at 1.7.2 og etmerket 7.16.6 kan anvendes for diagnostiske formål for å bestemme nivået av sirkulerende løselig MAdCAM uttrykt i en biovæske eller klinisk prøve. Denne sandwich-ELISA-metodeer ikke begrenset til anvendelsen av 1.7.2 og 7.16.6, men enhver kombinasjon av anti-MAdCAM-antistoffer som gjenkjenner forskjellige epitoper på MAdCAM, som skissert ved dataene og tolkningen av tabell 7 og Figur 5. Lignende strategier vil kunne anvendes til utviklingen av lignende analyser, så som immunohistokjemi og Western Blot, med de andre anti-MAdCAM-antistoffer som er beskrevet, underanvendelse av forskjellige partnere, varianter, merkelapper, etc.

EKSEMPEL V: Aminosyrestruktur av anti-MAdCAM mAbs fremstilt i samsvarmed oppfinnelsen

I følgende omtale tilveiebringes strukturell informasjon relatert til anti-MAdCAM mAbs fremstilt i samsvar medoppfinnelsen.

For å analysere strukturer av mAbs fremstilt i samsvar med oppfinnelsen, klonet vi genene som koder tung- og lettkjedede fragmenter ut av den spesifikke hybridomklon. Genkloning og sekvensering ble oppnådd som følger:

Poly(A)+ mRNA ble isolert fra tilnærmelsesvis 2xl05 hybridomceller avledet fra immuniserte XenoMouse-mus underanvendelse av Fast-Track-kit (Invitrogen). Genereringen avvillkårlig primet cDNA ble etterfulgt av PCR. Humant VH eller VK-familiespesifikke primere (Marks et al.,'Oligonukleotid primers for polymerase chain reaction amplification of human immunoglobulin variable genese and design of family-specific oligonucleotide probes'; Eur. J.Immunol., 985-991 (1991)) eller en universell human VH

primer, MG-30 (5'-GAG GTG GAG CTG GAG GAG TCI GG-3 (SEQ IDNO: 108) ble anvendt i forbindelse med primere som var spesifikke for den humane Cy2, MG40-d (5'-GCT GAG GGA GTAGAG TOG TGA GGA-3 (SEQ ID NO: 109) eller den Cy4-konstanteregion, MG-40d (5'GOT GAG GGA GTA GAG TOG TGA GGA CTG T -3(SEQ ID NO: 110), eller den CK-konstante region (hKP2; somtidligere beskrevet i Green et al., 1994). Sekvenser av de humane mAb-avledede tung- og kappa-kjedede transkripter frahybridomer ble oppnådd ved direkte sekvensering av PCRprodukter generert fra poly (A+) RNA under anvendelse av primerne beskrevet ovenfor. PCR-produkter ble klonet inn ipCR2.1 under anvendelse av et TOPO-TA-kloningssett(Invitrogen), og begge strenger ble sekvensert under anvendelse av Prism-farvestoffterminator-sekvenserende settog en ABI 377-sekvenserende maskin. Alle sekvenser bleanalysert ved linjestillinger til 'V BASE sequence directory' (Tomlinson, et al, J. Mol. Biol., 227, 776-798(1992); Hum. Mol. Genet., 3, 853-860 (1994); EMBO J., 14,4628-4638 (1995)).

Videre ble hvert av antistoffene 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1mod og 7.26.4-mod utsatt for full-lengde-DNA-sekvensering.For dette ble totalt RNA isolert fra tilnærmelsesvis 36xlOs hybridomceller under anvendelse av en Rneasy-kit(Qiagen). mRNA'et ble reverstranskribert under anvendelse av oligo-dT og et AMV-basert reverstranskriptasesystem(Promega). V BASE ble anvendt for å utforme 5'-spesifikke

amplifikasjonsprimere, inneholdende en optimal Kozaksekvens og ATG-start-kodon (understreket) og 3'-reversprimere for de spesifikk tunge kjeder og kappa-kjeder somgjengitt i Tabell 10.

s Tabell 10: PCR-primer-par for cDNA-amplifikasjon fra antiMAdCAM mAb-uttrykkende hybridomer og primere anvendt ikonstruksjonen av modifiserte versjoner av anti-MAdCAMantistoffer

Oligo-sekvens

VHl-18

5' TATCTAAGCTTCTAGACTCGAGCGCCACCATGGACTGGACCTGGAGCATCCTT 3' (SEQ ID NO: 70)

VH3-15

5' TATCTAAGCTTCTAGACTCGAGCGCCACCATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGATT 3' (SEQ ID NO: 71)

VH3-21

5' TATCTAAGCTTCTAGACTCGAGCGCCACCATGGAACTGGGGCTCCGCTGGGTT 3' (SEQ ID NO: 72)

VH3-23

5' TATCTAAGCTTCTAGACTCGAGCGCCACCATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGCTT 3' (SEQ ID NO: 73)

VH3-30

5' TATCTAAGCTTCTAGACTCGAGCGCCACCATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGGTT 3' (SEQ ID NO: 74)

VH3-33

5' TATCTAAGCTTCTAGACTCGAGCGCCACCATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGGTT 3' (SEQ ID NO: 75)

VH4-4

5' TATCTAAGCTTCTAGACTCGAGCGCCACCATGAAACACCTGTGGTTCTTCCTC 3' (SEQ ID NO: 76)

A2/A3

5' TATCTAAGCTTCTAGACCCGGGCGCCACCATGAGGCTCCCTGCTCAGCTCCTG 3' (SEQ ID NO: 77)

A2 6

5' TATCTAAGCTTCTAGACCCGGGCGCCACCATGTTGCCATCACAACTCATTGGG 3' (SEQ ID NO: 78)

B3

5' TATCTAAGCTTCTAGACCCGGGCGCCACCATGGTGTTGCAGACCCAGGTCTTC 3' (SEQ ID NO: 79)

5' TATCTAAGCTTCTAGACCCGGGCGCCACCATGGACATGAGGGTCCCCGCTCAG 3' (SEQ ID NO: 80)

5' TATCTAAGCTTCTAGACCCGGGCGCCACCATGGACATGAGGGTCCCTGCTCAG 3' (SEQ ID NO: 81)

RevIgG2

5' TTCTCTGATCAGAATTCCTATCATTTACCCGGAGACAGGGAGAG 3' (SEQ ID NO: 82)

RevIgG4

5' TTCTTTGATCAGAATTCTCACTAACACTCTCCCCTGTTGAAGC 3' (SEQ ID NO: 83)

RevKappa

5' TTCTCTGATCAGAATTCCTATCATTTACCCAGAGACAGGGAGAG 3' (SEQ ID NO: 84)

6.22.2VK Fl

5'-GGA TCT GGG AGA GAT TTC AGG CTC AGG ATC AAT AGG CTG GAA GC-3'(SEQ ID NO: 85)

6.22.2VK RI

5'-GCT TCC AGG CTA TTG ATG GTG AGG GTG AAA TCT GTC CCA GAT CC-3'(SEQ ID NO: 86)

6.22.2VH Fl

5'-GCA GGG TCT GGA TTC ACC TTC AGT AGC-3'(SEQ ID NO: 87)

6.22.2VH RI

5'-GCT ACT GAA GGT GAA TCC AGA GGG TGC-3'(SEQ ID NO: 88)

6.22.2VH CS*

5'-CGG AGG TGC TTC TAG AGG AGG GCG-3'(SEQ ID NO: 89)

6.34.2VK Fl

5'-GCA AGT GAG AGT ATT AGT AGG TAT TTA AAT TGG TAT GAG GAG AAA CC-3'(SEQ ID NO: 90)

6.34.2VK RI

5'-GGT TTC TGC TGA TAC CAA TTT AAA TAG CTA CTA ATA CTC TGA CTT GC-3'(SEQ ID NO: 91)

6.34.2VK F2

5'-CCA TCA GTT CTC TGC AAC CTG AGG ATT TTG CAA CTT ACT ACT GTC ACC-3'(SEQ ID NO: 92)

6.34.2VK R3

5'-GGT GAG AGT AGT AAG TTG CAA AAT CCT CAG GTT GGA GAG AAC TGA TGG-3'(SEQ ID NO: 93)

6.34.2VH Fl 6

5'-GCA AAT GAA CAG CCT GCG CGC TGA GGA GAG G-3'(SEQ ID NO: 94)

.34.2VH RI

5'-GGT GTC CTC AGC GCG CAG GGT GTT GAT TTG C-3'(SEQ ID NO: 95)

6.67.1VK Fl

5'-CAA TAA GAA CTA CTT AGC TTG GTA CCA ACA GAA ACC AGG AGA GCC-3'(SEQ ID NO: 96)

6.67.1VK RI

5'-GGC TGT CCT GGT TTC TGT TGG TAC CAA GCT AAG TAG TTC TTA TTG-3'(SEQ ID NO: 97)

6.67.1VH Fl

5'-CCC TCA GGG GTC GAG TCA CCA TGT CAG TAG ACA CGT CCA AGA ACC-3'(SEQ ID NO: 98)

6.67.1VH RI

5'-GGT TCT TGG AGG TGT CTA CTG ACA TGG TGA CTC GAC CCC TGA GGG-3'(SEQ ID NO: 99)

6.67.1VH CS*

5'-ATT CTA GAG CAG GGG GCG AGG-3'(SEQ ID NO: 100)

6.77.1VK Fl

5'-CCA TCT CCT GCA AGT CTA GTC AGA GCG TCC-3'(SEQ ID NO: 101)

6.77.1VK RI

5'-GGA GGG TCT GAC TAG ACT TGC AGG AGA TGG-3'(SEQ ID NO: 102)

6.77.1VK F2

5'-GGT TTA TTA CTG GAT GCA AAG TAT ACA GCT TAT GTC CAG TTT TGG CG -3'(SEQ ID NO: 103)

6.77.1VK R2

5'-GGC CAA AAC TGG ACA TAA GCT GTA TAC TTT GCA TGC AGT AAT AAA CG -3'(SEQ ID NO: 104)

7.26.4K Fl

5'-CCT GCA AGT CTA GTC AGA GCG TCC-3'(SEQ ID NO: 105)

7.26.4K RI

5'-GGA GGC TCT GAC TAG ACT TGC AGG-3'(SEQ ID NO: 106)

io Primerparene ble anvendt for å amplifisere cDNA'ene under anvendelse av Expand High Fidelity Taq polymerase (Roche), og PCR-produktene ble klonet inn i pCR2.1 TOPO-TA(Invitrogen) for påfølgende sekvensering. Tung- og kappalettkjedet sekvensbekreftede kloner ble deretter klonet inn

is i pEE6.1- og pEE12.1-vektorer (LONZA) under anvendelse avXbal/EcoRI og Hindlll/EcoRI-seter respektive.

Genutnyttelsesanalyse

Tabell 11 viser det tung- og kappa-lettkjedede gensutnyttelse for hvert hybridom omtalt i oppfinnelsen.

Tabell 11: Tung- og kappa-lettkjedet genutnyttelse

KLON

Tung kjede

Kappa-lett kjede

VH

D

JH

DIREKTEk

Jk

1.7.2

VH3-15

D6-19

JH4b

A3

JK5

1.8.2

VH3-15

D6-19

JH4b

A3

JK5

7.16.6

VH1-18

D6-6

JH6b

A2

JK1

7.20.5

VH4-4

D3-10

JH6b

A3

JK4

7.26.4

VH1-18

D6-6

JH6b

A2

JK1

6.14.2

VH3-23

D5-5

JH4b

JK5

6.22.2

VH3-33

D5-12

JH6b

A26

JK4

6.34.2

VH3-30

D4-23

JH6b

JK3

6.67.1

VH4-4

D3-10

JH4b

B3

JK4

6.73.2

VH3-23

D6-19

JH6b

JK2

6.77.1

VH3-21

D6-19

JH6b

A2

JK2

9.8.2

VH3-33

D3-10 eller D3-16

JH4b

JK5

igG2 lgG4

Sekvensanalyse

For videre å undersøke antistoffstruktur ble predikerte aminosyresekvenser av antistoffene oppnådd fra cDNA'ene oppnådd fra klonene.

SEKVENSIDENTITETSNUMMER (SEQ ID NO:) 1-48 og 51-68tilveiebringer nukleotidet og aminosyresekvensene av de tunge og kappa-lette kjeder av anti-MAdCAM-antistoffene1.7.2 (SEQ ID NOS 1-4), 1.8.2 (SEQ ID NOS 5-8), 6.14.2 (SEQID NOS 9-12), 6.22.2 (SEQ ID NOS 13-16), 6.34.2 (SEQ ID NOS17-20), 6.67.1 (SEQ ID NOS 21-24), 6.73.2 (SEQ ID NOS 2528), 6.77.1 (SEQ ID NOS 29-32), 7.16.6 (SEQ ID NOS 33-36),7.20.5 (SEQ ID NOS 37-40), 7.26.4 (SEQ ID NOS 41-44), 9.8.2(SEQ ID NOS 45-48) og de modifiserte anti-MAdCAM-antistoffer 6.22.2-mod (SEQ ID NOS 51-54), 6.34.2-mod (SEQ IDNOS 55-58), 6.67.1-mod (SEQ ID NOS 59-62) og 6.77.1-mod

(SEQ ID NOS 63-66) og 7.26.4-mod (SEQ ID NOS 41-42, 67-68).For hver anti-MAdCAM-antistoffsekvens som ble klonet, ersekvensene av signalpeptidsekvensen (eller basisene som koder den) indikert med små bokstaver og understreket.

Figurene 1A-1J tilveiebringer sekvenslinjestillinger mellomde predikerte tung-kjedede aminosyresekvenser av antistoffene 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4 og 9.8.2 og aminosyresekvensen av de respektive kimlinje-genprodukter.Stillingene i CDR1-, CDR2- og CDR3-sekvensene av antistoffene er understreket, differenser mellom den uttrykte sekvens er den tilsvarende kimlinjesekvens indikert i uthevet trykk, og hvor det er addisjoner i den uttrykte sekvens sammenlignet med kimlinjen, er disse indikert som (-) i kimlinjesekvensen.

Figurene 1K-1T tilveiebringer sekvenslinjestillinger mellomde predikerte kappa-lettkjedede aminosyresekvenser av antistoffene 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4 og 9.8.2 og aminosyresekvensen av de respektive kimlinje-genprodukter.Stillingene av CDR1-, CDR2- og CDR3-sekvensene av antistoffene er understreket, differensene mellom den uttrykte sekvens og den tilsvarende kimlinje er indikert i uthevet trykk, og hvor det er addisjoner i den uttrykte sekvens sammenlignet med kimlinjen, er disse indikert som (-) ikimlinj esekvensen.

Nærvær av post-translasjonal modifikasjon: glykosylering ogdeamidering:

Virkningen av noen av endringene i den uttrykte antiMAdCAM-antistoffsekvens, sammenlignet med den avlededekimlinjesekvens, er å innføre rester som potensielt ville kunne være underlagt N-bundet glykosylering (Asn-X-Ser/Thr)og/eller deamidering (Asn-Gly) (se Tabell 12). Nukleinsyresekvensene som koder aminosyresekvensene av det lette

kappa-kjedede variable domene i anti-MAdCAM-antistoffene6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.26.4 og 9.8.2, (SEQ ID NOS: 16, 20, 24, 28, 32, 44 og 48) og det tungkjedede variable domene av antistoff 6.14.2, (SEQ ID NO: 10), forutsier nærvær av N-bundet glykosylering. Nærvær avdenne post-translasjonale modifikasjon ble undersøkt underanvendelse av en kombinasjon av SDS-PAGE og Pro-Q® Emerald488 Glycoprotein-farving (Molecular probes) med mAbs6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.26.4 og 9.8.2.

I korthet går det ut på at tilnærmelsesvis 2 pg av redusert anti-MAdCAM-antistoff ble påsatt på en 4-12% SDS-polyakrylamidgel under anvendelse av en MOPS-buffer. Etter elektroforese ble gelen fiksert i 50% MeOH, 5% eddiksyre og vasket i 3% eddiksyre. Alle karbohydrater på gelen ble deretter oksidert med perjodsyre og farvet under anvendelse av ProQ® Emerald 488 Glycoprotein Stain Kit (Molecular Probes). Etter et avsluttende vasketrinn ble glykoproteinfarving anskueliggjort under anvendelse av en fluorescens-scannerinnstilt på en bølgelengde på 473 nm.

Etter glycoproteinfarving ble gelen farvet med hensyn til totalt protein under anvendelse av SYPRO Ruby-proteingelfarvestoff og analysert under anvendelse av en fluorescensscanner innstilt på en bølgelengde på 473 nm. Kappelettkjedene av anti-MAdCAM-antistoffene 6.22.2, 6.34.2,6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.26.4 og 9.8.2 farvet alle positivt med hensyn til nærvær av glykosylering. Som en ytterligere bekreftelse ble anti-MAdCAM-antistoff 7.26.4utsatt for tryptisk/chymotrypisk digestion, LC-MS/MSanalysen bekreftet nærvær av et modifisert tryptisk peptid og gav ytterligere bekreftelse på kappa-lettkjedetglykosylering.

Spesifikke Asn-Gly-sekvenser i CDRl-regionene av antiMAdCAM-antistof f ene 1.7.2, 1.8.2, 6.22.2 og 7.20.5 gjørdisse regioner følsomme overfor deamidering. Deamidering ved nøytral pH innfører en negativ ladning og kan også føre

til Ø-isomerisering, som vil kunne påvirke egenskapene hoset antistoff. For anti-MAdCAM-antistoffene 1.7.2, 1.8.2 og7.20.5 ble nærvær av deamidert Asn-isoaspartatresteranslått ved massespektroskopi etter innfangning av isoaspartatsidekjeden med MeOH.

I korthet går det ut på at for anti-MAdCAM-antistoffet1.7.2 ble statusen for det tryptiske/Asp-N-peptidSSQSLLQSNGYNYL (SEQ ID NO: 69) (1573.7 Da) valgt for overvåking med LC-MS/MS. Anti-MAdCAM-antistoff 1.7.2 bleredusert i 10 mM DTT, alkylert i 5 mM Na-jodacetat ogderetter bufferutbyttet i trypsindigestionsbuffer (50mM Tris-HCl, ImM CaC12, pH 7.6) . Antistoffet ble deretterblandet med sekvenseringsgradert modifisert trypsin (Promega) i et protease:protein-forhold på 1:20. Proteinble oppløst i trypsin i 15 timer ved 30°C, og de resulterende peptider ble separert ved HPLC under anvendelse av et C-18 RPC på et Ettan LC-system. Det 33Asninneholdende peptid (4032 Da) ble oppsamlet fra kolonnen og fortynnet i Asp-N-digestionsbuffer (50 mM natriumfosfatbuffer, pH 8,0). Endoproteinase Asp-N (Roche) ble derettertilsatt i et tilnærmet peptid:enzymforhold på 10:1.

Acetylklorid (100 p.1) ble tilsatt til en prøve av metanol (1 ml, -20°C) , og blandingen ble oppvarmet til romstemperatur. Den tryptiske+Asp-N-oppløsning ble tørket i enSpeed-Vac, og deretter ble 5 pl av metanol/acetylkloridettilsatt (45 min, romstemp), deretter tørket igjen i en Speed-Vac. Den resulterende rest ble rekonstituert i 0,1%TFA, og peptidene ble analysert initielt på Voyager-DE STRMALDI-TOF-massespektrometer under anvendelse av entennitrocellulose-tynnskiktsprepareringsmetoden eller reversfaserensing under anvendelse av C18 ZipTips (Millipore) etterfulgt av dråpeblanding med a-cyanomatriks. Denmetylerte peptidblanding ble også analysert under anvendelse av LC-MS/MS på et Deca XP Plus Ion Trapmassespektrometer som ovenfor. Elueringen ble plombert rett inn i Ion Trap MS, og peptidene ble deretter analysert ved

hjelp av MS og MS/MS. MS ble innstilt på å analysere alle ioner mellom 300 og 2000 Da. Det sterkeste ion i hver spesiell avsøkning ble deretter utsatt for MS/MS-analyse.

Tabell 12. Post-translasjonal modifikasjon av anti-MAdCAMantistoffer

KLON

Tung kjede

Kappa-lett kjede

Glykosylering (NXS/T)

Bekreftet

Glykosylering (NXS/T)

Bekreftet

Deamidering (NG)

Bekreftet

1.7.2

LQSNGYN

MS

1.8.2

LQSNGYN

MS

7.16.6

7.20.5

HGNGYNY

MS

7.26.4

CKSNQSLLY

MS/PAGE

6.14.2

TFNNSAMT

N. D

6.22.2

SGTNFTLTI

PAGE

LTINGLEA

N. D

6.34.2

ASQNISSYL

PAGE

liiill

SSNNKTYLA

PAGE

liiiii

RASQNITN

PAGE

liiiiii

SCNSSQSL

PAGE

9.8.2

HSDNLSIT

PAGE

igG2 lgG4

Mutagenesestudier:

Den primære aminosyresekvens av anti-MAdCAM-antistoffeneeksemplifisert i denne oppfinnelse kan modifiseres, ved seterettet mutagenese, for å fjerne potensielle seter av post-translasjonal modifikasjon (f.eks. glykosylering, deamidering) eller for å endre isotype-bakgrunnen, eller forå utvikle andre endringer som kan forbedre den terapeutiske utnyttelse. Som et eksempel ble PCR anvendt for å utvikle endringer i anti-MAdCAM-antistoffene 6.22.2, 6.34.2,6.67.1, 6.77.1 og 7.26.4, for å snu visse rammeverksekvenser til kimlinje, for å fjerne potensielle glykosyleringsseter og/eller for å endre isotypebakgrunnen til et humant IgG2- pCR2.1 TOPO-TA-klonede cDNA'er (100 ng),tilsvarende til de tungkjedede nukleotid SEQ ID NOS: 13,

17, 21 og 29, og kappa-lett-nukleotid SEQ ID NOS: 15, 19,23, 31 og 43, ble anvendt som templat i en serie PCR'er under anvendelse av overlapningsekstensjon og et panel av primersett beskrevet i Tabell 10.

6.22.2 Tungkjede: PCR-primersettene 6.22.2_VH_F1 og6.22.2VH_CS* (1) og VH3-33 og 6.22.2_VH_R1 (2) ble anvendtfor å generere separate PCR-produkter (1) og (2), underanvendelse av en Expog Taq-polymerase og et pCR2.1 TOPO-TAcDNA-templat (100 ng) representert ved nukleotidsekvens SEQID NO: 13. Produktene (1) og (2) ble renset og kombinert i et tredje PCR-trinn (ca. 50 ng hver) sammen med VH3-33 ogVK6.22.2_CS* primere, for å generere det modifiserte 6.22.2 tungkjedede V-domene. Denne modifiserte versjon inneholderen His/Phe-mutasjon i FRI og innfører et Xbal-restriksjonssete for å muliggjøre i rammen-kloning inn i en pEE6.1-avledet vektor, kalt pEE6.1CH, som inneholder det tilsvarende humane IgG2 konstante domene. Det endelige PCR-fragment bleklonet inn i Xbal-setet av pEE6.1CH, kontrollert med hensyntil orientering, og innføyningen ble fullsekvensbekreftet. Nukleotidsekvensen for den modifiserte 6.22.2 tunge kjede er fins i SEQ ID NO: 51 og den tilsvarende aminosyresekvens i SEQ ID NO: 52. Endringene i nukleotidet og aminosyresekvensene sammenlignet med opphavet er indikert.

6.22.2 kappa-lettkjede: PCR-primer-settene 6.22.2_VK_F1 ogrevKappa (1) og A26 og 6.22.2_VK_R1 (2) ble anvendt til å generere de separate PCR-produkter (1) og (2), underanvendelse av en Expog Taq-polymerase og et pCR2.1 TOPO-TAcDNA-templat (100 ng) representert ved nukleotidsekvens SEQID NO: 15. Produktene (1) og (2) ble renset og kombinert i et tredje PCR-trinn (ca. 50 ng hver) sammen med A26 ogrevKappa-primere, for å generere det modifiserte 6.22.2kappa-lettkjedede V-domene. Denne modifiserte versjoninneholder Asn/Asp- og Gly/Ser-endringer i FR3-sekvensen.Det resulterende PCR-produkt ble klonet inn i pEE12.1 underanvendelse av Hindlll/EcoRl-seter og full ut sekvensbekreftet. Nukleotidsekvensen for den modifiserte 6.22.2

kappa-lettkjede fins i SEQ ID NO: 53 og den tilsvarendeaminosyresekvens i SEQ ID NO: 54. Endringene i nukleotidet og aminosyresekvensene sammenlignet med opphavet er indikert.

6.34.2 Tungkjede: PCR-primersettene 6.34.2_VH_F1 og6.22.2VH_CS* (1) og VH3-30 og 6.34.2_VH_R1 (2) ble anvendttil å generere de separate PCR-produkter (1) og (2), underanvendelse av en Expog Taq-polymerase og et pCR2.1 TOPO-TAcDNA-templat (100 ng) representert ved nukleotidsekvens SEQID NO: 17. Produktene (1) og (2) ble renset og kombinert i et tredje PCR-trinn (ca. 50 ng hver) sammen med VH3-30 ogVK6.22.2_CS*-primere, for å generere det modifiserte

6.34.2- tungkjedede V-domene. Denne modifiserte versjoninneholder en Ser/Arg-mutasjon i FR3 og innfører et Xbalrestriksjonssete for å muliggjøre i rammen-kloning inn i enpEE6.1-avledet vektor, kalt pEE6.1CH, som inneholder dettilsvarende humane IgG2-konstante domene. Det endelige PCRfragment ble klonet inn i Xbal-setet av pEE6.1CH, kontrollert med hensyn til orientering, og innføyningen ble fullt ut sekvensbekreftet. Nukleotidsekvensen for den modifiserte

6.34.2- tunge kjede fins i SEQ ID NO: 55 og den tilsvarendeaminosyresekvens i SEQ ID NO: 56. Endringene i nukleotidet og aminosyresekvensene sammenlignet med opphavet er indikert.

6.34.2- kappa-lettkjede: PCR-primersettene 012 og6.34.2_VK_R1 (1), 6.34.2_VK_F1 og 6.34.2_VK_R2 (2), samt 6.34.2_VK_F2 og revKappa (3) ble anvendt til å generere de separate PCR-produkter (1), (2) og (3), under anvendelse aven Expog Faq-polymerase og et pCR2.1 TOPO-TA cDNA-templat(100 ng) representert ved nukleotidsekvens SEQ ID NO: 19. Produktene (1), (2) og (3) ble renset, og (1) og (2) ble kombinert i et tredje PCR-trinn (ca. 50 ng hver), sammenmed 012 og 6.34.2_VK_R2-primere, for å generere PCRproduktet (4). PCR-produktene (2) og (3) ble kombinert i etfjerde PCR-trinn (ca. 50 ng hver), sammen med 6.34.2_VK_F1og revKappa, for å generere PCR-produktet (5). PCR

produktene (4) og (5) ble renset og kombinert sammen (ca. 50 ng hver) med primerne 012 og revKappa for å generere det modifiserte 6.34.2 kappa-lettkjedede V-domene. Dennemodifiserte versjon inneholder en Asn/Ser-endring i CDR1,en Phe/Tyr-endring i FR2 og Arg-Thr/Ser-Ser, Asp/Glu ogSer/Tyr-endringer til FR3-sekvensen. Det resulterende PCRprodukt ble klonet inn i pEE12.1 under anvendelse av Hindlll/EcoRl-seter og fullt ut sekvensbekreftet.Nukleotidsekvensen for den modifiserte 6.34.2 kappalettkjede er å finne i SEQ ID NO: 57 og den tilsvarende aminosyresekvens i SEQ ID NO: 58. Endringene i nukleotidet og aminosyresekvensene sammenlignet med opphavet er indikert.

6.67.1 Tungkjede: PCR-primersettene 6.67.1_VH_F1 og6.67.1VH_CS* (1) og VH4-4 og 6.67.1_VH_R1 (2) ble anvendtfor å generere de separate PCR-produktene (1) og (2), underanvendelse av en Expog Faq-polymerase og et pCR2.1 TOPO-TAcDNA-templat (100 ng) representert ved nukleotidsekvens SEQID NO: 21. Produktene (1) og (2) ble renset og kombinert i et tredje PCR-trinn (ca. 50 ng hver) sammen med VH4-4 ogVK6.67.l_CS*-primere, for å generere det modifiserte6.67.1-tungkjedede V-domene. Denne modifiserte versjoninneholder en Ile-Leu-Ala/Met-Ser-Val-omdannelse i FR3 oginnfører et Xbal-restriksjonssete for å muliggjøre irammen-kloning inn i en pEE6.1-avledet vektor, kaltpEE6.1CH, som inneholder det tilsvarende humane IgG2konstante domene. Der endelige PCR-fragment ble klonet inni Xbal-setet av pEE6.1CH, kontrollert med hensyn tilorientering, og innføyningen ble fullt ut sekvensbekreftet. Nukleotidsekvensen for den modifiserte 6.67.1-tunge kjedeer å finne i SEQ ID NO: 59 og den tilsvarende aminosyresekvens i SEQ ID NO: 60. Endringene i nukleotidet og aminosyresekvensene sammenlignet med opphavet er indikert.

6.67.1 kappa-lettkjede: PCR-primersettene 6.67.1_VK_F1 ogrevKappa (1) og B3 og 6.67.1_VK_R1 (2) ble anvendt for å generere de separate PCR-produktene (1) og (2), under

anvendelse av en Expog Taq-polymerase og et pCR2.1 TOPO-TAcDNA-templat (100 ng) representert ved nukleotidsekvens SEQID NO: 23. Produktene (1) og (2) ble renset og kombinert i et tredje PCR-trinn (ca. 50 ng hver) sammen med B3 ogrevKappa-primere, for å generere det modifiserte 6.67.1kappa-lettkjedede V-domene. Denne modifiserte versjoninneholder en Thr/Asn-endring i CDR1 og en Arg/Gly-endringi FR2. Det resulterende PCR-produkt ble klonet inn ipEE12.1 under anvendelse av Hindlll/EcoRl-seter og fullt utsekvensbekreftet. Nukleotidsekvensen for den modifiserte

6.67.1- kappa-lettkjede er å finne i SEQ ID NO: 61 og dentilsvarende aminosyresekvens i SEQ ID NO: 62. Endringene i nukleotidet og aminosyresekvensene sammenlignet med opphavet er indikert.

6.77.1 Tungkjede: PCR-primersettene VH 3-21 og 6.22.2VH_CS*ble anvendt for å generere et enkelt PCR-produkt underanvendelse av en Expog Taq-polymerase og et pCR2.1 TOPO-TAcDNA-templat (100 ng) representert ved nukleotidsekvens SEQID NO: 29. PCR-produktene ble oppløst med Xbal, gelrensetog klonet inn i Xbal-setet av pEE6.1CH, idet man kontrollerte med hensyn til orientering. Innføyningen ble fullt ut sekvensbekreftet. Nukleotidsekvensen for den modifiserte

6.77.1- tunge kjede er å finne i SEQ ID NO: 63 og dentilsvarende aminosyresekvens i SEQ ID NO: 64. Endringene i nukleotidet og aminosyresekvensene sammenlignet med opphavet er indikert.

6.77.1 kappa-lettkjede: PCR-primersettene A2 og6.77.1_VK_R1 (1), 6.77.1_VK_VK_F1 og 6.77.1_R2 (2), samt 6.77.1_VK_F2 og revKappa (3) ble anvendt for å generere de separate PCR-produkter (1), (2) og (3), under anvendelse aven Expog Taq-polymerase og et pCR2.1 TOPO-TA cDNA-templat(100 ng) representert ved nukleotidsekvens SEQ ID NO: 31. Produktene (1), (2) og (3) ble renset, og (1) og (2) ble kombinert i et tredje PCR-trinn (ca. 50 ng hver) sammen medA2 og 6.77.l_VK_R2-primere, for å generere PCR-produktet(4). PCR-produktene (2) og (3) ble kombinert i et fjerde

PCR-trinn (ca. 50 ng hver) sammen med 6.77.1_VK_F1 ogrevKappa-primere, for å generere PCR-produkt (5). PCRproduktene (4) og (5) ble renset og kombinert sammen (ca.50 ng hver) med primerne A2 og JK2 for å generere det modifiserte 6.77.1 kappa-lettkjedede V-domene. Dennemodifiserte versjon inneholder en Asn/Lys-endring i CDR1,en Ser/Tyr-endring i FR3 og en Cys/Ser rest-endring i CDR3sekvensen. Det resulterende PCR-produkt ble klonet inn ipEE12.1 under anvendelse av Hindlll/EcoRl-seter og fullt utsekvensbekreftet. Nukleotidsekvensen for den modifiserte 6.77.1-kappa-lettkjede er å finne i SEQ ID NO: 65 og dentilsvarende aminosyresekvens i SEQ ID NO: 66. Endringene i nukleotidet og aminosyresekvensene sammenlignet med opphavet er indikert.

7.26.4 kappa-lettkjede: PCR-primersettene 7.26.4_VK_F1 ogrevKappa (1), og A2 og 7.26.4_VK_R1 (2) ble anvendt for å generere de separate PCR-produktene (1) og (2), underanvendelse av en Expog Faq-polymerase og et pCR2.1 TOPO-TAcDNA-templat (100 ng) representert ved nukleotidsekvens SEQID NO: 43. Produktene (1) og (2) ble renset og kombinert i et tredje PCR-trinn (ca. 50 ng hver) sammen med A2 ogrevKappa-primere, for å generere det modifiserte 7.26.4kappa-lettkjedede V-domene. Denne modifiserte versjoninneholder en Asn/Ser-endring i CDR1. Det resulterende PCRprodukt ble klonet inn i pEE12.1 under anvendelse av Hindlll/EcoRl-seter og fullt ut sekvensbekreftet.Nukleotidsekvensen for den modifiserte 7.26.4-kappalettkjede er å finne i SEQ ID NO: 67 og den tilsvarende aminosyresekvens i SEQ ID NO: 68. Endringene i nukleotidet og aminosyresekvensene sammenlignet med opphavet er indikert.

En funksjonell eukaryotisk ekspresjonsvektor for hver av de modifiserte versjoner av 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.77.1 og 7.26.4, omtalt som 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod,6.77.1-mod og 7.26.4-mod, og representerende henholdsvisden tungkjedede nukleotidsekvensen SEQ ID NOS: 51, 55, 59,

63 og 41, og de tilsvarende aminosyresekvenser SEQ ID NOS: 52, 56, 60, 64 og 42, samt de lette kappa-kjededenukleotidsekvenser SEQ ID NOS: 53, 57, 61, 65 og 67, og de tilsvarende aminosyresekvenser SEQ ID NOS: 54, 58, 62, 66 og 68 ble satt sammen som følger: De tungkjedede cDNAinnsttinger tilsvarende 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-modog 6.77.1-mod ble skåret ut fra pEE6.ICH-vektoren medNotl/Sall, opphavsversjonen av de tunge kjeder av 7.26.4 ble skåret ut fra pEE6.1-vektoren med Notl/Sall, og derensede fragmenter ble klonet inn i identiske seter den tilsvarende pEE12.1-vektor inneholdende de modifiserteversjoner av de lette kappa-kjedesekvenser 6.22.2-mod,6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod og 7.26.4-mod.Sekvensene i vektorene ble bekreftet, og rensede mengder ble anvendt i transiente transfeksjoner med HEK 2931celler. I korthet går det ut på at 9xlOs HEK 293T-celler,utsådd i en 1165-kolbe dagen før transfeksjon og vasket iOptimem, ble transient transfisert med vektor-cDNA'ertilsvarende 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-modog 7.26.4-mod (40 p,g) under anvendelse av Lipofectamin PLUS(Invitrogen) i henhold til fabrikantens instruksjoner.

Cellene ble inkubert i 3 timer, deretter ble transfeksjonsmediet erstattet med DMEM-medium (Invitrogen 21969-035)inneholdende 10% ultra-lavt IgG føtalt kalveserum(Invitrogen 16250-078) og L-Glutamin (50 ml). Mediesupernatanten ble høstet 5 dager senere, filtersterilisert, og anti-MAdCAM-antistoffet ble renset under anvendelse avprotein G-sefaroseaffinitetskromatografi, på lignende måtesom beskrevet ovenfor. Mengden av antistoff utvunnet (20100 p,g) ble kvantifisert ved en Bradford-analyse.

Anti-MAdCAM-aktiviteten av affinitetsrenset antistofftilsvarende 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-modog 7.26.4-mod ble analysert i MAdCAM-IgGl-Fc-fusjonsanalysen som beskrevet tidligere. ICso-verdiene av disseanti-MAdCAM-antistoffer sammenlignet med opphavets antiMAdCAM-antistoffer som de var avledet fra, er angitt iTabell 13. Det var minimal virkning av aminosyre

substitusjonene beskrevet ovenfor på aktiviteten av de modifiserte anti-MAdCAM-antistoffer sammenlignet med deresopphav. Antistoffene opprettholdt også sin binding til CHOceller uttrykkende rekombinant humant MAdCAM eller de cynomolgus/humane MAdCAM/kimærer.

Tabell 13. Aktivitet av modifiserte versjoner av antiMAdCAM-antistoffene 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod,6.77.1-mod og 7.26.4-mod sammenlignet med deres opphav.

KLON

MAdCAM IgGl Fc-fusjonsanalyseGjennomsnittlig IC50 (pg/ml)

Opphav

Modifisert

6.22.2

0,018

0,058

6.34.2

0,013

0,049

6.67.1

0,013

0,037

6.77.1

0,022

0, 077

7.26.4

0,021

0,033

EKSEMPEL VI

Økning i P7+-lymfocytter i den perifere sirkulasjon vedblokkering av anti-MAdCAM-antistoffer

En analyse ble utviklet for å identifisere og korrelere en mekanistisk virkning av et anti-MAdCAM-antistoff og detsirkulasjonsnivå i blod. Et hemmende anti-MAdCAM-antistoffbør ha den virkning at det hemmer rekrutteringen av leukocytter uttrykkende o^Pv-integrinet til det gastrointestinale system. Klassene av o^fh-integrin-bærendeleukocytter bør derfor være begrenset til den perifere sirkulasj on.

Dette ble vist med et fullt ut humant anti-humant MAdCAMmAb 7.16.6, i cynomolgus.

Renset anti-human MAdCAM mAb 7.16.6 (1 mg/kg) ellervehikkel (20 mM Na-acetat, 0,2 mg/ml polysorbat 80, 45mg/ml mannitol og 0,02 mg/ml EDTA ved pH 5,5) ble anslått

på lignende måte ved intravenøs administrasjon via safenåren til to grupper av cynomolgus-aper (n=4/gruppe).På dag 3 ble før-doserings blodprøver oppsamlet i EDTA-rørved femoral venepunktur. LPAM-spesifikke antistoffer, somkryssreagerer med cynomolgus-aufh-integrinet, er ikkekommersielt tilgjengelig, derfor ble et anti-Øv-antistoff(som gjenkjenner omØ?- og aEp7-integrin) anvendt i stedet.Antistoffer (30 p.1) ble i henhold til følgende tabell, tabell 15, tilsatt til rør inneholdende 100 pl cynomolgusblod, blandet ved forsiktig hvirvling og inkubert i 20-30minutter ved 4°C.

Tabell 15. Antistoffer (BD Pharmingen) anvendt i immunofenosortering av cynomologus-blod

Katalognununer

Antistoff eller Isotype

555748

mlgGl, k-FITC

555844

m!gG2a, k-PE

559425

mlgGl - PerCP

555751

mlgGl, k-APC

555728

CD 28-FITC

555945

P7-PE

558814

CD 95-APC

550631

CD 4-PerCP

Til hvert rør ble 1 ml av 1:10 FACSlyse-løsning (BD #349202) tilsatt, blandet ved forsiktig hvirvling og inkubert ved romstemperatur i tilnærmelsesvis 12 minutter i mørke inntil rød blodcellelyse var fullstendig. Deretter ble 2 ml av BD farvebuffer (# 554656) tilsatt til hvert rør, blandet og sentrifugert ved 250 x g i 6-7 minutter vedromstemperatur. Supernatanten ble dekantert, og bunnfallet suspendert på nytt i 3 ml farvebuffer, blandet igjen og sentrifugert ved 250 x g i 6-7 minutter ved romstemperatur.Cytofix buffer (BD # 554655) inneholdende w/v paraformaldehyd (100 pl) ble tilsatt til cellebunnfallet fra perifert blod fra ape og blandet grundig ved lav/moderat

hastighet av hvirvling. Prøvene ble holdt ved 4°C i mørke inntil oppsamlet på FACSCalibur. Like før oppsamlingen ble PBS (100 p.1) tilsatt til alle rør umiddelbart før ervervelse. Det absolutte celletall for CD4+p7+CD951oCD28+ (naturlig), CD4+p7+CD95hiCD28+ (hovedlager), CD4+07CD95hiCD28+ (hovedlager), CD4+p7+CD95hiCD28- (effektorminne) ble oppnådd ved passende signalutvelging og kvandrantanalyser. Andre T-celle-undersett f.eks. CD8+ Thovedlager-celle (P7+CD8+CD28+CD95+) og enhver annenleukocytt som bærer en MAdCAM-ligand, kan også analyseresved denne metode med passende antistoffer. Sammenlignet med vehikkelkontrollen forårsaket anti-MAdCAM mAb 7.16.6 entilnærmet 3 ganger økning i nivåene av sirkulerende CD4+p7+CD95hiCD28+-hovedlager-T-celler, som vist i Figur 7.Det var ingen virkninger på populasjonen av sirkulerende CD4+p7-CD95hiCD28+hovedlager-T-celler, hvilket indikerte atvirkningen av anti-MAdCAM mAb 7.16.6 er spesifikk for tarmmålsøkende T-celler. Virkningene av anti-MAdCAM mAb 7.16.6,i cynomolgus, på populasjoner av sirkulerende (0.4) 07+lymfocytter indikerer at dette er et robust surrogatbevis på mekanismebiomarkering, spesielt i forbindelse med praktisk anvendelse i kliniske situasjoner.

Sekvenser

SEQ ID NO: 1-48 og 51-68 tilveiebringer nukleotid- ogaminosyresekvenser av tung- og kappa-lettkjedene for tolvhumane anti-MAdCAM-antistoffer, nukleotid- og aminosyresekvensene av cynomolgus-MAdCAM ogfh-bindende domenesekvenser og nukleotid- og aminosyresekvenser av femmodifiserte humane anti-MAdCAM-antistoffer.

SEQ ID NO: 1-48 tilveiebringer de tung- og kappa-lettkjedede nukleotid- og aminosyresekvenser av tolv humanemonoklonale anti-MAdCAM-antistoffer: 1.7.2 (SEQ ID NO: 14), 1.8.2 (SEQ ID NO: 5-8), 6.14.2 (SEQ ID NO: 9-12),6.22.2 (SEQ ID NO: 13-16), 6.34.2 (SEQ ID NO: 17-20),6.67.1 (SEQ ID NO: 21-24), 6.73.2 (SEQ ID NO: 25-28),

6.77.1 (SEQ ID NO: 29-32), 7.16.6 (SEQ ID NO: 33-36),7.20.5 (SEQ ID NO: 37-40), 7.26.4 (SEQ ID NO: 41-44), og9.8.2 (SEQ ID NO: 45-48) .

SEQ ID NO: 49-50 tilveiebringer nukleotid- og aminosyres sekvensene av et cynomolgus MAdCAM ogfbbindende domene.

SEQ ID NO: 51-68 tilveiebringer de tung- og kappa-lettkjedede nukleotid- og aminosyresekvenser for de modifisertemonoklonale anti-MAdCAM-antistoffer: 6.22.2 (SEQ ID NO: 5154), modifisert 6.34.2 (SEQ ID NO: 55-58), modifisert

io 6.67.1 (SEQ ID NO: 59-62), modifisert 6.77.1 (SEQ ID NO:63-66) og de lette kappa-kjedede nukleotid- og aminosyresekvenser av modifisert monoklonalt anti-MAdCAM-antistoff:modifisert 7.26.4 (SEQ ID NO: 67-68).

SEQ ID NOS: 70-106 og 108-110 tilveiebringer forskjelligeis primersekvenser.