KR101262032B1 - ＭＡｄＣＡＭ에 대한 항체 - Google Patents

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엘리자베스 몰로이
지리트-아이메 켈러만
래리 엘 그린
메리 하크-프렌드쇼
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암젠 프레몬트 인코포레이티드
화이자 인크.
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Abstract

본 발명은 MAdCAM, 바람직하게는 인간 MAdCAM에 특이적으로 결합하며 MAdCAM을 억제하는 기능을 하는 인간 항체를 포함하는 항체 및 이의 항원 결합성 부분에 관한 것이다. 본 발명은 또한 인간 항-MAdCAM 항체 및 이의 항원 결합성 부분에 관한 것이다. 본 발명은 또한 키메라 항체, 이중 특이성 항체, 유도체화 항체, 단일쇄 항체 또는 융합 단백질의 일부에 관한 것이다. 본 발명은 또한 인간 항-MAdCAM 항체로부터 유래되는 단리된 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 및 그러한 면역글로불린을 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다. 본 발명은 또한 인간 항-MAdCAM 항체의 제조 방법, 이러한 항체를 함유하는 조성물과 진단 및 치료용의 항체 및 조성물의 사용 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 인간 항-MAdCAM 항체를 포함하는 중쇄 및/또는 경쇄 면역글로불린 분자를 코딩하는 핵산 분자를 이용한 유전자 치료 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 본 발명의 핵산 분자를 포함하는 트랜스제닉 동물 또는 식물에 관한 것이다.

Description

ＭＡｄＣＡＭ에 대한 항체{ANTIBODIES TO MAdCAM}
본 출원은 2004년 1월 9일자로 출원된 미국 가출원 제60/535,490호에 대하여 우선권을 주장한다.
점막 어드레신 세포 유착 분자(mucosal addressin cell adhesion molecule, MAdCAM)는 면역글로불린 수퍼패밀리의 세포 유착 수용체의 구성원이다. 특수 림프 조직 및 위장관의 점막 부위로의 림프구의 회귀(homing)의 선택성은 내피의 MAdCAM의 발현에 의해 결정된다(문헌[Berlin, C. et al., Cell, 80: 413-422 (1994)]; 문헌[Berlin, C. , et al., Cell, 74: 185-195 (1993)]; 및 문헌[Erle, D. J., et al., J. Immunol., 153: 517-528 (1994)]). MAdCAM은 파이어 판(Peyer's patches) 및 장간막 림프절과 같은 조직화된 장 림프 조직의 고 내피 세정맥의 세포 표면 상에서(문헌[Streeter et al., Nature, 331: 41-6 (1988)]; 문헌[Nakache et al., Nature, 337: 179-81 (1989)]; 문헌[Briskin et al., Am. J. Pathol. 151-97-110 (1997)]), 그리고 또한 다른 림프 기관, 예를 들어 췌장, 담낭 및 비장 세정맥과 비장 백색 수질의 변연동에서(문헌[Briskin et al (l997), supra]; 문헌[Kraal et al., Ana. J. Path., 147: 763-771 (1995)]) 특유하게 발현된다.
MAdCAM은 내장의 면역 감시에서 생리학적인 역할을 하지만, 이것은 만성 위 장관 염증 상태 하의 염증성 장질환에서 과도한 림프구 삼출을 촉직하는 것으로 보인다. TNFα 및 기타 향염증성 사이토카인이 내피의 MAdCAM 발현을 증가시키며, 크론병(Crohn's disease) 및 궤양성 대장염에 걸린 환자로부터 취해진 생검체 표본에 있어서 염증 부위에서 MAdCAM 발현이 병소에서 대략 2-3배 증가되어 있다(문헌[Briskin et al. (1997)], 문헌[Souza et al., Gut, 45: 856-63 (1999)]; 문헌[Arihiro et al., Pathol Int., 52: 367-74 (2002)]). 유사한 패턴의 발현 상승이 대장염의 실험 모델에서 관찰되었다(문헌[Hesterbe㎍ et al., Gastroenterology, 111: 1373-1380 (1997)]; 문헌[Picarella et al., J. Immunol., 158: 2099- 2106 (1997)]; 문헌[Connor et al., J Leukoc Biol., 65: 349-55 (1999)]; 문헌[Kato et al., J Pharmacol Exp Ther., 295: 183-9 (2000)]; 문헌[Hokari et al., Clin Exp Immunol., 26: 259-65 (2001)]; 문헌[Shigematsu et al., Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol., 281: G1309-15 (2001)]). 또한, 염증성 질환, 예를 들어 인슐린 의존성 당뇨병(문헌[Yang et al. Diabetes, 46: 1542-7 (1997)]; 문헌[Hanninen et al., Immunol., 160: 6018-25 (1998)]), 이식편 대 숙주 질환(문헌[Fujisaki et al., Scand J Gastroenterol., 38: 437-42 (2003)], 문헌[Murai et al., Nat Immunol., 4: 154-60 (2003)]), 만성 간 질환(문헌[Hillan et al., Liver, 19: 509-18 (1999)]; 문헌[Grant et al., Hepatology, 33: 1065-72 (2001)]), 염증성 뇌병증(문헌[Stalder et al., Am J Pathol., 153: 767-83 (1998)]; 문헌[Kanawar et al., Immunol Cell Biol., 78: 641-5 (2000)]) 및 위염(문헌[Barrett et al., J Leukoc Biol., 67: 169-73 (2000)]; 문 헌[Hatanaka et al., Clin Exp Immunol., 130: 183-9 (2002)])의 다른 전임상 모델에서, 질환의 병인에 있어서 태아 MAdCAM 발현이 다시 일어나고 활성화된 α4β7 + 림프구가 참여한다. 상기 염증 모델과, 합텐-매개(예를 들어 TNBS, DSS 등) 또는 양자 전이(adoptive transfer)(CD4+CD45Rbhigh) 생쥐 대장염 모델에 있어서, MAdCAM에의 α4β7 + 림프구의 결합을 차단하는 쥐 항-생쥐 MAdCAM 모노클로날 항체(mAb), MECA-367이 림프구 동원(recruitment), 조직 삼출, 염증 및 질환의 중증도를 감소시킨다. 인간 MAdCAMdp 대한 생쥐 모노클로날 항체(mAb)도 보고되었다(예를 들어 WO 96/24673 및 WO 99/58573 참조).
염증성 장질환(inflammatory bowel disease, IBD) 및 위장관 또는 기타 조직과 결부된 다른 염증성 질환에 있어서의 MAdCAM의 역할을 감안할 때, α4β7 + 결합 및 MAdCAM에 의해 매개되는 백혈구 동원을 억제하는 수단이 바람직하다. 환자에 있어서 다른 의약과의 원하지 않는 상호 작용의 부재 및 유익한 물리 화학적 특성, 예를 들어 인간에 있어서의 pK/pD 값, 용해도, 안정성, 저장 기간 및 생체내 반감기를 포함하지만 이로 한정되지는 않는 유리한 특성을 갖는 치료 수단을 갖는 것이 또한 바람직하다. 치료용 단백질, 예를 들어 항체에는 원하지 않는 번역후 변형 또는 응집체 형성이 없는 것이 유리하다. 따라서, 치료용 항-MAdCAM 항체가 결정적으로 필요하다.
발명의 개요
본 발명은 MAdCAM에 특이적으로 결합하며 적어도 이 항체의 CDR 서열이 인간 CDR 서열인 단리된 항체, 또는 이 항체의 항원 결합성 부분을 제공한다. 몇몇 실시 형태에 있어서, 항체는 인간 항체, 바람직하게는 MAdCAM 길항제로 작용하는 항체이다. 또한 본 발명은 상기 항체 또는 그 일부분을 함유하는 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 상기 항-MAdCAM 길항체 항체의 중쇄 및/또는 경쇄 또는 이의 가변 영역 또는 기타 항원 결합성 부분 또는 전술한 것 중 임의의 것을 코딩하는 핵산 분자와, 제약적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물은 다른 성분, 예를 들어 치료제 또는 진단제를 추가로 함유할 수도 있다. 진단 및 치료 방법도 본 발명에 의해 제공된다.
본 발명은 또한 상기 항-MAdCAM 항체 또는 이의 항원 결합성 부분을 생산하는 단리된 세포주를 제공한다.
본 발명은 또한 상기 항-MAdCAM 항체의 중쇄 및/또는 경쇄 또는 이의 가변 영역 또는 이의 항원 결합성 부분을 코딩하는 핵산 분자를 제공한다.
본 발명은 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터 및 숙주 세포와, 이 핵산 분자에 의해 코딩되는 폴리펩티드의 재조합적 제조 방법을 제공한다.
상기 항-MAdCAM 항체의 중쇄 및/또는 경쇄, 또는 이의 항원 결합성 부분을 발현하는 인간 이외의 트랜스제닉(transgenic) 동물 또는 식물도 제공된다.
도 1a, 1b는 12종의 인간 항-MAdCAM 모노클로날 항체의 중쇄 및 카파 경쇄의 가변 영역의 예측 아미노산 서열을 상응하는 인간 유전자의 생식 세포(germline)의 아미노산 서열과 정렬시킨 것이다.
도 1A는 항체 1.7.2 및 1.8.2의 중쇄의 예측 아미노산 서열을 인간 생식 세포 VH 3-15 유전자 생성물과 정렬시킨 것을 도시한 것이다.
도 1B는 항체 6.14.2의 중쇄의 예측 아미노산 서열을 인간 생식 세포 VH 3-23 유전자 생성물과 정렬시킨 것을 도시한 것이다.
도 1C는 항체 6.22.2의 중쇄의 예측 아미노산 서열을 인간 생식 세포 VH 3-33 유전자 생성물과 정렬시킨 것을 도시한 것이다.
도 1D는 항체 6.34.2의 중쇄의 예측 아미노산 서열을 인간 생식 세포 VH 3-30 유전자 생성물과 정렬시킨 것을 도시한 것이다.
도 1E는 항체 6.67.1의 중쇄의 예측 아미노산 서열을 인간 생식 세포 VH 4-4 유전자 생성물과 정렬시킨 것을 도시한 것이다.
도 1F는 항체 6.73.2의 중쇄의 예측 아미노산 서열을 인간 생식 세포 VH 3-23 유전자 생성물과 정렬시킨 것을 도시한 것이다.
도 1G는 항체 6.77.1의 중쇄의 예측 아미노산 서열을 인간 생식 세포 VH 3-21 유전자 생성물과 정렬시킨 것을 도시한 것이다.
도 1H는 항체 7.16.6 및 7.26.4의 중쇄의 예측 아미노산 서열을 인간 생식 세포 VH 1-18 유전자 생성물과 정렬시킨 것을 도시한 것이다.
도 1I는 항체 7.20.5의 중쇄의 예측 아미노산 서열을 인간 생식 세포 VH 4-4 유전자 생성물과 정렬시킨 것을 도시한 것이다.
도 1J는 항체 9.8.2의 중쇄의 예측 아미노산 서열을 인간 생식 세포 VH 3-33 유전자 생성물과 정렬시킨 것을 도시한 것이다.
도 1K는 항체 1.7.2 및 1.8.2의 카파 경쇄의 예측 아미노산 서열을 인간 생식 세포 A3 유전자 생성물과 정렬시킨 것을 도시한 것이다.
도 1L은 항체 6.14.2의 카파 경쇄의 예측 아미노산 서열을 인간 생식 세포 012 유전자 생성물과 정렬시킨 것을 도시한 것이다.
도 1M은 항체 6.22.2의 카파 경쇄의 예측 아미노산 서열을 인간 생식 세포 A26 유전자 생성물과 정렬시킨 것을 도시한 것이다.
도 1N은 항체 6.34.2의 카파 경쇄의 예측 아미노산 서열을 인간 생식 세포 012 유전자 생성물과 정렬시킨 것을 도시한 것이다.
도 1O는 항체 6.67.1의 카파 경쇄의 예측 아미노산 서열을 인간 생식 세포 B3 유전자 생성물과 정렬시킨 것을 도시한 것이다.
도 1P는 항체 6.73.2의 카파 경쇄의 예측 아미노산 서열을 인간 생식 세포 012 유전자 생성물과 정렬시킨 것을 도시한 것이다.
도 1Q는 항체 6.77.1의 카파 경쇄의 예측 아미노산 서열을 인간 생식 세포 A2 유전자 생성물과 정렬시킨 것을 도시한 것이다.
도 1R은 항체 7.16. 6 및 7.26.4의 카파 경쇄의 예측 아미노산 서열을 인간 생식 세포 A2 유전자 생성물과 정렬시킨 것을 도시한 것이다.
도 1S는 항체 7.20.5의 카파 경쇄의 예측 아미노산 서열을 인간 생식 세포 A3 유전자 생성물과 정렬시킨 것을 도시한 것이다.
도 1T는 항체 9.8.2의 카파 경쇄의 예측 아미노산 서열을 인간 생식 세포 018 유전자 생성물과 정렬시킨 것을 도시한 것이다.
도 2는 인간 항-MAdCAM 항체의 중쇄 및 경쇄의 예측 아미노산 서열의 CLUSTAL 정렬이다.
도 2A는 항-MAdCAM 항체 카파 경쇄들 사이의 유사성 정도를 도시하는, 카파 경쇄의 예측 아미노산 서열의 CLUSTAL 정렬 및 방사형 트리(radial tree)이다.
도 2B는 항-MAdCAM 항체 중쇄들 사이의 유사성 정도를 도시하는, 중쇄의 예측 아미노산 서열의 CLUSTAL 정렬 및 방사형 트리이다.
도 3은 α4β7 결합 도메인을 형성하는 사이노몰거스 및 인간 MAdCAM의 2개의 N-말단 도메인의 아미노산 서열 CLUSTAL 정렬이다. β-가닥은 문헌[Tan et al., Structure (1998) 6: 793-801]에 따라 정렬되어 있다.
도 4는 냉동된 MAdCAM 발현 인간 간 내피 절편에의 인간 말초 혈액 림프구의 유착에 대한 정제된 비오틴화 1.7.2 및 7.16.6의 용량의 영향을 도시하는 그래프이다.
도 5에는 표 7에 포착되어 있는 데이터를 기초로 한, 항-MAdCAM 항체, 1.7.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2가 결합하는 다양한 MAdCAM 에피토프의 2차원 도표가 도시되어 있다. 동일 원 내의 항-MAdCAM 항체는 동일한 반응성 패턴을 나타내며, 동일 에피토프 빈에 속하고 MAdCAM 상의 동일 에피토프를 인식할 가능성이 있다. 중복되는 원 내의 항-MAdCAM 항체 클 론은 동시에 결합할 수 없으며, 따라서 MAdCAM 상의 중복 에피토프를 인식할 가능성이 있다. 통합되지 않은 원은 에피토프가 공간적으로 특유하게 분리된 항-MAdCAM 항체 클론을 나타낸다.
도 6에는 항-MAdCAM 항체 1.7.2 및 Alexa 488 표지된 7.16.6을 이용한 샌드위치 ELISA 데이터가 도시되어 있는데, 이는 진단 목적에 있어서 MAdCAM 상의 상이한 에피토프를 검출할 수 있는 2종의 항체를 사용하여 가용성 MAdCAM을 검출할 수 있음을 나타낸다.
도 7에는 사이노몰거스 원숭이 모델에 있어서 항-MAdCAM mAb 7.16.6을 사용한, 순환 말초 α4β7 + 림프구의 갯수에 대한 억제성 항-MAdCAM 항체(1 mg/kg)의 영향을 대조 IgG2a mAb 또는 비히클에 비하여 증가된 배수로서 표현한 것이 도시되어 있다.
정의 및 일반적인 기술
본원에서 달리 정의되지 않는 한, 본 발명과 관련하여 사용되는 과학 및 기술 용어는 당업계의 숙련자에 의해 통상적으로 이해되는 의미를 가진다. 또한, 정황에 의해 달리 요구되지 않는 한, 단수형 용어는 복수형을 포함하며 복수형 용어는 단수형을 포함한다. 일반적으로 본원에 기술된 세포 및 조직 배양, 분자 생물학, 면역학, 미생물학, 유전학, 단백질 및 핵산 화학과 하이브리드화와 관련하여 사용되는 학술 용어, 및 그 기술은 당업계에서 잘 알려져 있으며 통상적으로 사용되는 것들이다. 본 발명의 방법 및 기술은 일반적으로 달리 나타내지 않는 한 본 명세서 전반에 걸쳐 인용되고 논의되는 다양한 일반적인 참고 문헌 및 보다 구체적인 참고 문헌에 기술되어 있는 바와 같이 그리고 당업계에 잘 알려져 있는 통상적인 방법에 따라 수행된다. 예를 들어 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989)]과 문헌[Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992)]과, 문헌[Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990)]을 참조하는데, 상기 참고 문헌은 본원에 참고로 포함되어 있다. 효소 반응 및 정제 기술은 당업계에서 통상적으로 이루어지거나 본원에 기술되어 있는 바와 같이, 제조자의 설명서(specification)에 따라 수행된다. 표준 기술이 화학적 합성, 화학적 분석, 제약 제제, 제형 및 전달과, 환자의 치료를 위하여 사용된다.
달리 나타내지 않는 한 하기의 용어는 하기의 의미를 갖는 것으로 이해된다:
"폴리펩티드"라는 용어는 천연 또는 인공 단백질, 단백질 단편 및 단백질 서열의 폴리펩티드 유사체를 포함한다. 폴리펩티드는 단량체 또는 중합체일 수도 있다.
"단리된 단백질" 또는 "단리된 폴리펩티드"라는 용어는 유래된 공급원 또는 기원에 의해서 (1) 천연 상태로는 수반되지 않는 천연 결부 성분들이 결부되어 있지 않거나, (2) 동일한 종 유래의 다른 단백질이 없거나, (3) 상이한 종 유래의 세포에 의해 발현되거나, (4) 자연에서는 나타나지 않는 단백질 또는 폴리펩티드이다. 따라서, 화학적으로 합성되거나 천연적으로 발원하는 세포와는 다른 세포 시스템에서 합성되는 폴리펩티드는 이의 천연적으로 결부된 성분들로부터 "단리"될 것이다. 단백질은 또한 당업계에 잘 알려진 단백질 정제 기술을 사용하여 단리에 의해 천연적으로 결부된 성분들이 실질적으로 없게 할 수 있다.
단백질 또는 폴리펩티드는 샘플 중 적어도 약 60 내지 75%가 단일 종의 폴리펩티드를 나타낼 경우 "실질적으로 순수" "실질적으로 균질" 또는 "실질적으로 정제된" 것이다. 폴리펩티드 또는 단백질은 단량체 또는 다량체일 수 있다. 실질적으로 순수한 폴리펩티드 또는 단백질은 전형적으로 약 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%(W/W)의 단백질 샘플, 더 일반적으로는 약 95%의 단백질 샘플을 포함하며 바람직하게는 99%보다 많이 순수하다. 단백질의 순도 또는 균질성은 당업계에 잘 알려진 다수의 수단, 예를 들어 단백질 샘플의 폴리아크릴아미드 겔 전기영동, 이어서 당업계에 잘 알려진 염색제(stain)를 이용한 겔의 염색 시의 단일 폴리펩티드 밴드의 가시화에 의해 나타내어질 수 있다. 소정 목적에 있어서는, HPLC 또는 당업계에 잘 알려진 다른 수단에 의해 보다 높은 해상도가 제공될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이 "폴리펩티드 단편"이라는 용어는 아미노-말단 및/또는 카르복시-말단이 결실되며, 나머지 아미노산 서열은 자연 발생 서열 중의 상응하는 위치와 동일한 폴리펩티드를 말한다. 몇몇 실시 형태에 있어서, 단편의 길이는 적어도 5, 6, 8 또는 10개의 아미노산이다. 다른 실시 형태에 있어서, 단편의 길이는 14개 이상의 아미노산, 더 바람직하게는 20개 이상의 아미노산, 일반적으로는 50개 이상의 아미노산, 더욱 더 바람직하게는 적어도 70, 80, 90, 100, 150 또는 200개의 아미노산이다.
본원에서 사용되는 바와 같이 "폴리펩티드 유사체"라는 용어는 아미노산 서열의 일부와 실질적으로 동일하며 하기 특성 중 한 가지 이상을 갖는 25개 이상의 아미노산의 절편을 포함하는 폴리펩티드를 말한다: (1) 적합한 결합 조건 하에서의 MAdCAM에의 특이적 결합, (2) α4β7 인테그린 및/또는 L-셀렉틴이 MAdCAM에 결합하는 것을 억제하는 능력, 또는 (3) 시험관내 또는 생체내에서의 MAdCAM의 세포 표면 발현을 감소시키는 능력. 전형적으로, 폴리펩티드 유사체는 자연 발생 서열과 관련하여 보존성 아미노산 치환(또는 삽입 또는 결실)을 포함한다. 유사체는 전형적으로 길이가 20개 이상의 아미노산, 바람직하게는 적어도 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150 또는 200개의 아미노산이거나 그보다 길며, 흔히 전장 자연 발생 폴리펩티드만큼 길 수 있다.
바람직한 아미노산 치환은 (1) 단백질 분해에 대한 감수성을 감소시키거나, (2) 산화에 대한 감수성을 감소시키거나, (3) 단백질 복합체의 형성에 있어서 결합 친화도를 변경시키거나, (4) 결합 친화도를 변경시키거나, (5) 그러한 유사체의 다른 물리 화학적 또는 기능적 특성을 부여 또는 변형하는 것이다. 유사체는 자연 발생 펩티드 서열 이외의 서열의 다양한 돌연변이 단백질(mutein)을 포함할 수 있다. 예를 들어 단일 또는 다수의 아미노산 치환(바람직하게는 보존성 아미노산 치환)이 자연 발생 서열(바람직하게는 도메인(들) 외부의 폴리펩티드의 일부)에서 만들어져 분자간 접촉을 형성할 수 있다. 보존성 아미노산 치환은 모서열의 구조적 특징을 실질적으로 변화시키지 않아야 한다(예를 들어 치환 아미노산은 모서열에서 나타나는 나선형 구조를 붕괴시키거나 모서열에 특징적인 다른 유형의 이차 구조를 파괴하는 경향이 없어야 함). 당업계에서 인지된 폴리펩티드의 이차 및 삼차 구조의 예가 문헌[Proteins, Structures and Molecular Principles(Creighton, Ed., W.H. Freeman and Company, New York (1984)])과; 문헌[Introduction to Protein Structure (C. Branden and J. Tooze,eds., Garland Publishing, New York, N. Y. (1991)])과; 문헌[Thornton et al., Nature, 354: 105 (1991)]에 기술되어 있는데, 상기 문헌 각각은 본원에 참고로 포함된다.
주형 펩티드의 특성과 유사한 특성을 갖는 비-펩티드 유사체가 약물로서 제약업계에서 통상적으로 사용된다. 이러한 유형의 비-펩티드 화합물은 "펩티드 모방체(mimetics)" 또는 "펩티도미메틱(peptidomimetics)"으로 칭해진다. 본원에 참고로 포함된 문헌[Fauchere, J Adv. Drug Res., 15: 29 (1986)]; 문헌[Veber and Freidinger, TINS, p. 392 (1985)]; 및 문헌[Evans et al., J. Med. Chem., 30: 1229 (1987)]을 참조한다. 그러한 화합물은 흔히 컴퓨터를 사용한 분자 모델링의 도움으로 개발된다. 치료용으로 유용한 펩티드와 구조적으로 유사한 펩티드 모방체를 사용하여 등가의 치료 또는 예방 효과를 생성할 수 있다. 일반적으로 펩티도미메틱은 범례의 폴리펩티드(즉, 요망되는 생화학적 특성 또는 약리 활성을 갖는 폴리펩티드), 예를 들어 인간 항체와 구조적으로 유사하지만, 당업계에 잘 알려진 방법에 의해 결합체, 예를 들어 -CH2NH-, -CH2S-, -CH2-CH2-, -CH=CH-(시스 및 트랜스), -COCH2-, -CH(OH)CH2-, 및 -CH2SO-에 의해 선택적으로 치환되는 하나 이상의 펩티드 결합을 가진다. 콘센서스(consensus) 서열의 하나 이상의 아미노산을 동일한 유형의 D-아미노산으로 전체적으로 치환하는 것(예를 들어 L-리신 대신 D-리신)을 또한 사용하여 보다 안정한 펩티드를 생성할 수 있다. 또한, 콘센서스 서열 또는 실질적으로 동일한 콘센서스 서열 변이체를 포함하는 구속형(constrained) 펩티드는 당업계에 공지된 방법에 의해(본원에 참고로 포함된 문헌[Rizo and Gierasch Ann. Rev. Biochem. 61: 387 (1992)]), 예를 들어 펩티드를 환화시키는 분자내 디설파이드 가교를 형성할 수 있는 내부 시스테인 잔기의 첨가에 의해 생성할 수 있다.
"면역글로불린"은 사량체 분자이다. 자연 발생 면역글로불린에 있어서, 각각의 사량체는 2개의 동일한 폴리펩티드 사슬 쌍으로 구성되며 각각의 쌍은 1개의 "경쇄"(약 25 kDa) 및 1개의 "중쇄"(약 50-70 kDa)를 가진다. 각각의 사슬의 아미노-말단 부분은 주로 항원 인식을 담당하는 약 100 내지 110개 또는 그 이상의 아미노산의 가변 영역을 포함한다. 각각의 사슬의 카르복시-말단 부분은 주로 이펙터(effector) 기능을 담당하는 불변 영역을 규정한다. 인간 경쇄는 κ 및 λ 경쇄로 분류된다. 중쇄는 μ, δ, γ, α 또는 ε으로 분류되며 항체의 이소타입을 각각 IgM, IgD, IgG, IgA 및 IgE로서 규정한다. 경쇄 및 중쇄 내에는 가변 영역 및 불변 영역이 약 12개 이상의 아미노산의 "J" 영역에 의해 결합되며, 중쇄는 약 10개 이상의 아미노산의 "D" 영역도 포함한다. 일반적으로 문헌[Fundamental Immunology, Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N. Y. (1989)) (본원에 사실상 이의 전체 내용이 참고로 포함됨)]을 참조한다. 각각의 경쇄/중쇄 쌍의 가변 영역은 온전한 면역글로불린이 2개의 결합 부위를 갖도록 항체 결합 부위를 형성한다.
면역글로불린 사슬은 상보성 결정 영역 또는 CDR(complementarity determining region)로도 불리우는 3개의 과변이(hypervariable) 영역에 의해 결합된 비교적 보존된 골격 영역(framework region, FR)의 동일한 일반 구조를 나타낸다. 각각의 쌍의 2개의 사슬 유래의 CDR은 골격 영역에 의해 정렬되어 에피토프-특이성 결합 부위를 형성한다. 경쇄 및 중쇄 둘 다는 N-말단에서 C-말단으로 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4 도메인들을 포함한다. 각각의 도메인에의 아미노산의 할당은 문헌[Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 and 1991))], 또는 문헌[Chothia & Lesk, J. Mol. Biol., 196: 901-917 (1987)]; 문헌[Chothia et al., Nature, 342: 878-883(1989)]의 정의에 따른 것인데, 상기 문헌 각각은 이의 전체 내용이 본원에 참고로 포함된다.
"항체"는 온전한 면역글로불린 또는 특이적 결합에 대하여 온전한 항체와 경쟁하는 이의 항원 결합성 부분을 말한다. 몇몇 실시 형태에 있어서, 항체는 이의 항원 결합성 부분이다. 항원 결합성 부분은 재조합 DNA 기술 또는 온전한 항체의 효소적 또는 화학적 절단에 의해 생성될 수 있다. 항원 결합성 부분은 특히 폴리펩티드에의 특이적 항원 결합을 부여하기에 충분한 면역글로불린의 적어도 일부를 포함하는 폴리펩티드, 다이아바디(diabody), 키메라 항체, 단일쇄 항체(single-chain antibody, scFv), 상보성 결정 영역(CDR) 단편과, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 및 dAb를 포함한다. Fab 단편은 VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 일가 단편이며; F(ab)2 단편은 경첩 영역에서 디설파이드 가교로 결합된 2개의 Fab 단편을 포함하는 이가 단편이며; Fd 단편은 VH 및 CH1 도메인으로 이루어지며; Fv 단편은 단일 암(arm)의 항체의 VL 및 VH 도메인으로 이루어지며; dAb 단편(문헌[Ward et al., Nature, 341: 544-546 (1989)])은 VH 도메인으로 이루어진다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 예를 들어 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.77.2, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4 또는 9.8.2로 칭해지는 항체는 동일한 명칭의 하이브리도마에 의해 생산되는 모노클로날 항체이다. 예를 들어 항체 1.7.2는 하이브리도마 1.7.2에 의해 생산된다. 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod 또는 7.26.4-mod로 칭해지는 항체는 부위 특이적 돌연변이(site-directed mutagenesis)에 의해 서열이 이의 상응하는 모 항체로부터 변형된 모노클로날 항체이다.
단일쇄 항체(scFv)는 VL 및 VH 영역이 이들을 단일 단백질 사슬로 만들어지게 할 수 있는 합성 링커를 통하여 일가 분자를 형성하도록 쌍을 이룬 항체이다(문헌[Bird et al., Science, 242: 423-426 (1988)] 및 문헌[Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 5879-5883 (1988)]). 다이아바디는 이가의 이중 특이성 항체로서, VH 및 VL 도메인은 단일 폴리펩티드 사슬 상에서 발현되지만 동일한 사슬 상의 2개의 도메인들 사이에 쌍을 이루게 하기에는 너무나 짧은 링커가 사용되며, 그럼으로써 이 도메인들은 다른 사슬의 상보성 도메인과 쌍을 이루도록 강요되어 2개의 항원 결합 부위를 생성한다(예를 들어 문헌[Holliger, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993)] 및 문헌[Poljak, R. J., et al., Structure, 2: 1121-1123 (1994)] 참조). 본 발명의 항체 유래의 하나 이상의 CDR은 공유 결합에 의해 또는 비공유 결합에 의해 분자 내로 포함되어 이 분자가 MAdCAM에 특이적으로 결합하는 면역어드헤신(immunoadhesin)이 되게 할 수 있다. 면역어드헤신은 보다 큰 폴리펩티드 사슬의 일부로서 CDR(들)을 포함할 수 있거나, CDR(들)을 다른 폴리펩티드 사슬에 공유 결합에 의해 결합시킬 수 있거나, CDR(들)을 비공유 결합에 의해 포함할 수 있다. CDR은 면역어드헤신이 목적하는 특정 항원에 특이적으로 결합되게 한다.
항체는 하나 이상의 결합 부위를 가질 수 있다. 하나보다 많은 결합 부위가 존재할 경우, 이 결합 부위는 서로와 동일할 수 있거나 상이할 수 있다. 예를 들어 자연 발생 면역글로불린은 2개의 동일한 결합 부위를 가지며, 단일쇄 항체 또는 Fab 단편은 하나의 결합 부위를 가지는 반면, "이중 특이성" 또는 "이중 기능성" 항체(다이아바디)는 2개의 상이한 결합 부위를 가진다.
"단리된 항체"는 (1) 천연 상태에서 수반되는 다른 자연적으로 결부된 항체를 비롯한 자연적 결부 성분과 결부되지 않거나, (2) 동일한 종 유래의 다른 단백질이 없거나, (3) 상이한 종 유래의 세포에 의해 발현되거나, (4) 자연에서는 나타나지 않는 항체이다. 단리된 항체의 예에는 MAdCAM을 사용하여 친화도에 의해 정제된 항-MAdCAM 항체, 시험관내에서 하이브리도마 또는 다른 세포주에 의해 생산된 항-MAdCAM 항체 및 트랜스제닉 포유류 또는 식물로부터 유래되는 인간 항-MAdCAM 항체가 포함된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "인간 항체"라는 용어는 가변 영역 및 불변 영역의 서열이 인간의 서열인 항체를 의미한다. 이 용어는 인간 유전자로부터 유래되지만 예를 들어 가능한 면역원성의 감소, 친화도의 증가, 바람직하지 못한 폴딩(folding)을 야기할 수 있는 시스테인 또는 글리코실화 부위의 제거 등을 위하여 변화된 서열을 포함하는 항체를 포함한다. 이 용어는 인간 세포에서는 전형적이지 않은 글리코실화를 부여할 수 있는 인간 이외의 세포에서 재조합적 방법으로 생산되는 항체를 포함한다. 이 용어는 인간 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 유전자좌(locus)의 일부 또는 모두를 포함하는 트랜스제닉 생쥐에서 생성한 항체도 포함한다.
일 태양에 있어서, 본 발명은 인간화 항체를 제공한다. 몇몇 실시 형태에 있어서, 인간화 항체는 인간 이외의 종으로부터 유래되는 항체로서, 중쇄 및 경쇄의 불변 도메인과 골격은 인간에서의 면역 반응이 회피되거나 방해되도록 돌연변이되었다. 몇몇 실시 형태에 있어서, 인간화 항체는 인간 항체 유래의 불변 도메인을 인간 이외의 종의 가변 도메인에 융합시킴으로써 제조할 수 있다. 인간화 항체의 제조 방법의 예는 미국 특허 제6,054,297호, 동 제5,886,152호 및 동 제5,877,293호에서 발견할 수 있다. 몇몇 실시 형태에 있어서, 본 발명의 인간화 항-MAdCAM 항체는 본 발명의 하나 이상의 인간 항-MAdCAM 항체의 하나 이상의 골격 영역의 아미노산 서열을 포함한다.
다른 태양에 있어서, 본 발명은 "키메라 항체"를 포함한다. 몇몇 실시 형태에 있어서 키메라 항체는 하나의 항체 유래의 하나 이상의 영역 및 하나 이상의 다른 항체 유래의 하나 이상의 영역을 포함하는 항체를 말한다. 바람직한 실시 형태에 있어서, 하나 이상의 CDR은 본 발명의 인간 항-MAdCAM 항체로부터 유래된다. 더 바람직한 실시 형태에 있어서, 모든 CDR이 본 발명의 인간 항-MAdCAM 항체로부터 유래된다. 다른 바람직한 실시 형태에 있어서, 하나보다 많은 본 발명의 인간 항-MAdCAM 항체 유래의 CDR은 키메라 항체에서 혼합 및 매치된다. 예를 들어 키메라 항체는 제1 인간 항-MAdCAM 항체의 경쇄 유래의 CDR1을 포함할 수 있으며 이는 제2 인간 항-MAdCAM 항체의 경쇄 유래의 CDR2 및 CDR3와 조합될 수 있고, 중쇄 유래의 CDR은 제3 항-MAdCAM 항체로부터 유래될 수 있다. 또한, 골격 영역은 동일한 항-MAdCAM 항체들 중 하나로부터 유래되거나, 하나 이상의 상이한 항체, 예를 들어 인간 항체로부터 유래되거나, 인간화 항체로부터 유래될 수 있다.
"중화 항체", "억제 항체" 또는 길항 항체는 α4β7 또는 α4β7-발현 세포, 또는 임의의 다른 친족(cognate) 리간드 또는 친족 리간드-발현 세포가 MAdCAM에 결합하는 것을 약 20% 이상 억제하는 항체이다. 바람직한 실시 형태에 있어서, 본 항체는 α4β7 인테그린 또는 α4β7-발현 세포가 MAdCAM에 결합하는 것을 적어도 40%, 더 바람직하게는 60%, 더욱 더 바람직하게는 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 감소시킨다. 결합 감소는 예를 들어 시험관내 경쟁 결합 분석에서 측정되는 바와 같이, 당업계의 숙련자에게 공지된 임의의 방법으로 측정될 수 있다. α4β7-발현 세포의 MAdCAM에의 결합에 있어서의 감소의 측정예가 실시예 I에 제시되어 있다.
항체의 단편 또는 유사체는 본 명세서의 교시에 따라 당업계의 숙련자에 의해 손쉽게 제조될 수 있다. 단편 또는 유사체의 바람직한 아미노- 및 카르복시-말단은 기능성 도메인의 경계 가까이에서 나타난다. 구조 도메인 및 기능성 도메인은 뉴클레오티드 및/또는 아미노산 서열 데이터를 공용 또는 독점적 서열 데이터베이스와 비교함으로써 확인할 수 있다. 바람직하게는 컴퓨터를 사용한 비교 방법을 이용하여 공지된 구조(structure) 및/또는 기능의 다른 단백질에 나타나는 서열 모티프 또는 예측된 단백질 배좌(conformation) 도메인을 확인한다. 공지된 3차원 구조로 폴딩되는 단백질 서열의 확인 방법은 공지되어 있다(문헌[Bowie et al., Science, 253: 164 (1991)]).
본원에서 사용되는 바와 같이, "표면 플라즈몬 공명"이라는 용어는 예를 들어 BIAcore 시스템(Pharmacia Biosensor AB, 스웨덴 웁살라 및 미국 뉴저지주 피스카타웨이)을 사용하여 바이오센서 매트릭스 내에서 단백질 농도의 변경을 검출함으로써 실시간 생체특이적 상호 작용의 분석을 가능하게 하는 광학 현상을 말한다. 추가의 설명에 대해서는 문헌[Jonsson, U., et al., Ann. Biol. Clin., 51: 19-26 (1993)]; 문헌[Jonsson, U., et al., Biotechniques, 11: 620-627 (1991)]; 문헌[Johnsson, B., et al., J. Mol. Recognit., 8: 125-131 (1995)]; 및 문헌[Johnnson, B., et al., Anal. Biochem., 198: 268-277 (1991)]을 참조한다.
"koff"라는 용어는 항체/항원 복합체로부터의 항체의 해리에 대한 해리 속도상수(off rate constant)를 말한다.
"Kd"라는 용어는 특정 항체-항원 상호 작용의 해리 상수(dissociation constant)를 말한다. 해리 상수가 ≤1 μM, 바람직하게는 ≤100 nM, 가장 바람직하게는 ≤10 nM일 경우 항체는 항원과 결합한다고 한다.
"에피토프"라는 용어는 면역글로불린 또는 T 세포 수용체에 특이적으로 결합하거나 그렇지 않을 경우 분자와 상호 작용할 수 있는 임의의 단백질 결정 부위(determinant)를 포함한다. 에피토프 결정 부위는 일반적으로 분자의 화학적 활성 표면 기, 예를 들어 아미노산 또는 탄수화물 측쇄로 이루어지며 일반적으로 특이적인 3차원 구조 특징과, 특정 전하 특징을 가진다. 에피토프는 "선형"이거나 "배좌형"일 수 있다. 선형 에피토프에 있어서, 단백질과 상호 작용 분자(예를 들어 항체) 사이의 상호 작용 지점 모두는 이 단백질의 일차 아미노산 서열을 따라 선형으로 나타난다. 배좌형 에피토프에 있어서, 상호 작용 지점은 서로 분리되어 있는 단백질 상의 아미노산 잔기들을 가로질러서 나타난다.
본원에 사용되는 바와 같이, 20종의 통상적인 아미노산 및 이의 약자는 통상적인 관례를 따른다. 본원에 참고로 포함된 문헌[Immunology - A Synthesis (2nd Edition, E.S. Golub and D. R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991))]을 참고한다. 20종의 통상적인 아미노산의 입체 이성체(예를 들어, D-아미노산), 비천연 아미노산, 예를 들어 α-,α-2치환 아미노산, N-알킬 아미노산, 락트산 및 기타 통상적이지 않은 아미노산이 또한 본 발명의 폴리펩티드에 적합한 성분일 수 있다. 통상적이지 않은 아미노산의 예에는 4-히드록시프롤린, γ-카르복시글루타메이트, ε-N,N,N-트리메틸리신, ε-N-아세틸리신, O-포스포세린, N-아세틸세린, N-포르밀메티오닌, 3-메틸히스티딘, 5-히드록시리신, s-N-메틸아르기닌 및 기타 유사 아미노산과 이미노산(예를 들어 4-히드록시프롤린)이 포함된다. 본원에서 사용되는 폴리펩티드 표기법에 있어서, 표준 관례 및 협약에 따르면 좌측 방향은 아미노 말단 방향이며 우측 방향은 카르복시 말단 방향이다.
본원에서 언급되는 바와 같이 "폴리뉴클레오티드"라는 용어는 리보뉴클레오티드 또는 데옥시뉴클레오티드 중 어느 하나 또는 어느 하나의 유형의 뉴클레오티드의 변형 형태이며 길이가 10개 이상의 염기인 중합체 형태의 뉴클레오티드를 의미한다. 이 용어는 단일 가닥 및 이중 가닥 형태의 DNA를 포함한다.
본원에 사용되는 바와 같이, "단리된 폴리뉴클레오티드"라는 용어는 기원에 의해 "단리된 폴리뉴클레오티드"는 (1) 모두의 또는 일부의 폴리뉴클레오티드와 결부되지 않으며 - 여기서, "단리된 폴리뉴클레오티드"는 자연에서 발견됨 - , (2) 자연에서는 결합하지 않는 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 결합되거나, (3) 보다 큰 서열의 일부로서 자연에서는 나타나지 않는 게놈, cDNA, 또는 합성 기원 또는 이의 일부 조합의 폴리뉴클레오티드를 의미한다.
본원에서 언급되는 "올리고뉴클레오티드"라는 용어는 자연 발생 및 자연 비발생 올리고뉴클레오티드 결합에 의해 함께 결합된 변형 뉴클레오티드 및 자연 발생 뉴클레오티드를 포함한다. 올리고뉴클레오티드는 일반적으로 200개 이하의 길이의 염기를 포함하는 폴리뉴클레오티드 서브세트이다. 바람직하게는 올리고뉴클레오티드는 길이가 10 내지 60개의 염기이며 가장 바람직하게는 길이가 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20 내지 40개의 염기이다. 올리고뉴클레오티드는, 예를 들어 유전자 돌연변이체의 제작에서의 사용에 있어서 이중 가닥일 수 있지만 예를 들어 프로브에 있어서는 일반적으로 단일 가닥이다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 센스 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드 중 하나일 수 있다.
본원에서 언급되는 "자연 발생 뉴클레오티드"라는 용어는 데옥시리보뉴클레오티드 및 리보뉴클레오티드를 포함한다. 본원에서 언급되는 "변형 뉴클레오티드"라는 용어는 변형되거나 치환된 당 기 등을 갖는 뉴클레오티드를 포함한다. 본원에서 언급되는 "올리고뉴클레오티드 결합"이라는 용어는 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포로셀레노에이트, 포스포로디셀레노에이트, 포스포로아닐로티오에이트, 포스포라닐라데이트, 포스포로아미데이트 등과 같은 올리고뉴클레오티드 결합을 포함한다. 예를 들어 개시 사항이 본원에 참고로 포함된 문헌[Laplanche et al., Nucl. Acids Res. 14: 9081 (1986)]; 문헌[Stec et al., J. Am. Chem. Soc. 106: 6077 (1984); 문헌[Stein et al., Nucl. Acids Res., 16: 3209 (1988)]; 문헌[Zon et al., Anti-Cancer Drug Design 6: 539 (1991)]; 문헌[Zon et al., Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, pp. 87-108 (F. Eckstein, Ed., Oxford University Press, Oxford England (1991))]; Stec 등의 미국 특허 제5,151,510호; 문헌[Uhlmann and Peyman, Chemical Reviews, 90: 543 (1990)]을 참조한다.
"작동 가능하게 결합된" 서열은 목적 유전자와 인접한 발현 제어 서열 및 트랜스로(in trans) 또는 좀 떨어져서 목적 유전자를 제어하는 작용을 하는 발현 제어 서열 둘 다를 포함한다. 본원에 사용되는 바와 같이 "발현 제어 서열"이라는 용어는 결찰되는 코딩 서열의 발현 및 프로세싱을 행하는 데에 필요한 폴리뉴클레오티드 서열을 말한다. 발현 제어 서열은 적절한 전사 개시 서열, 종결 서열, 프로모터 서열 및 인핸서 서열; 효율적인 RNA 프로세싱 신호, 예를 들어 스플라이싱 및 폴리아데닐화 신호; 세포질 mRNA를 안정화하는 서열; 번역 효율을 증강시키는 서열(즉, Kozak 콘센서스 서열); 단백질 안정성을 증강시키는 서열과; 원할 경우 단백질 분비를 증강시키는 서열을 포함한다. 그러한 제어 서열의 성질은 숙주 유기체에 따라 다르며; 원핵 생물에서는 그러한 제어 서열은 일반적으로 프로모터, 리보좀 결합 부위 및 전사 종결 서열을 포함하고; 진행 색물에서는 일반적으로 그러한 제어 서열은 프로모터 및 전사 종결 서열을 포함한다. "제어 서열"이라는 용어는 최소한도로 성분의 존재가 발현 및 프로세싱에 필수적인 모든 성분을 포함하려는 것이며, 성분의 존재가 유리한 추가의 성분, 예를 들어 리더 서열 및 융합 파트너 서열도 포함할 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, "벡터"라는 용어는 결합된 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 의미한다. 벡터의 한 가지 유형은 "플라스미드"이며, 이는 추가의 DNA 절편이 결찰될 수 있는 원형 이중 가닥 DNA 루프를 말한다. 다른 유형의 벡터로는 바이러스 벡터가 있는데, 추가의 DNA 절편이 바이러스 게놈 내로 결찰될 수 있다. 소정의 벡터는 벡터가 도입된 숙주 세포에서 자율 복제할 수 있다(예를 들어 박테리아의 복제 기원을 갖는 박테리아 벡터 및 에피좀성 포유류 벡터). 다른 벡터(예를 들어 비-에피좀성 포유류 벡터)가 숙주 세포 내로의 도입시 숙주 세포의 게놈 내로 통합될 수 있으며 그럼으로써 숙주 게놈과 함께 복제된다. 또한, 소정 벡터는 작동 가능하게 결합된 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 그러한 벡터는 본원에서 "재조합 발현 벡터"(또는 단순히 "발현 벡터")로 칭해진다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술에서 유용한 발현 벡터는 흔히 플라스미드의 형태로 존재한다. 본 명세서에서, "플라스미드" 및 "벡터"는 서로 바꾸어서 사용될 수 있는데, 이는 플라스미드가 가장 통상적으로 사용되는 벡터의 형태이기 때문이다. 그러나 본 발명은 등가의 기능을 하는 바이러스 벡터(예를 들어 복제 결함성 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-관련(adeno-associated) 바이러스)와 같은 다른 형태의 발현 벡터를 포함하려고 한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "재조합 숙주 세포" (또는 단순히 "숙주 세포")라는 용어는 재조합 발현 벡터가 도입된 세포를 의미한다. 그러한 용어는 특정 대상 세포뿐만 아니라 그러한 세포의 자손도 의미하는 것임을 알아야 한다. 소정 변형이 돌연변이 또는 환경의 영향으로 인하여 다음 세대에서 일어날 수 있기 때문에, 실제 그러한 자손은 모 세포와 동일하지 않을 수도 있지만 본원에서 사용되는 "숙주 세포"라는 용어의 범주 내에 여전히 포함된다.
본원에서 언급되는 "선택적으로 하이브리드화하는"이라는 용어는 검출 가능하게 그리고 특이적으로 결합하는 것을 의미한다. 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드 및 이의 단편은 비특이적 핵산에의 상당한 양의 검출 가능한 결합을 최소화하는 하이브리드화 및 세척 조건 하에서 핵산 가닥에 선택적으로 하이브리드화된다. "높은 엄격도" 또는 "고도로 엄격한" 조건을 사용하여 당업계에 공지되어 있으며 본원에서 논의되는 선택적 하이브리드화 조건을 달성할 수 있다. "높은 엄격도" 또는 "고도로 엄격한" 조건의 예로는 폴리뉴클레오티드를 다른 폴리뉴클레오티드와 함께 항온처리하는 방법으로서, 하나의 폴리뉴클레오티드는 6X SSPE 또는 SSC, 50% 포름아미드, 5X 덴하르트 시약(Denhardt's reagent), 0.5% SDS, 100 ㎍/ml의 변성된 단편화 연어 정자 DNA의 하이브리드화 완충제에서 42℃의 하이브리드화 온도에서 12-16시간 동안 막과 같은 고체 표면에 부착시키고, 이어서 55℃에서 1X SSC, 0.5% SDS의 세척 완충제를 사용하여 2회 세척할 수 있다. 문헌[Sambrook et al., supra, pp. 9.50-9.55]을 또한 참조한다.
뉴클레오티드 서열과 관련하여 "서열 동일성 퍼센트"라는 용어는 최대 대응에 대하여 정렬될 경우 동일한 2개의 서열에서의 잔기들을 말한다. 서열 동일성 비교 길이는 적어도 약 9개의 뉴클레오티드, 일반적으로는 적어도 약 18개의 뉴클레오티드, 더 일반적으로는 적어도 약 24개의 뉴클레오티드, 전형적으로는 적어도 약 28개의 뉴클레오티드, 더 전형적으로는 적어도 약 32개의 뉴클레오티드, 그리고 바람직하게는 적어도 약 36, 48 또는 그 이상의 뉴클레오티드의 스트레치보다 긴 것일 수 있다. 뉴클레오티드 서열의 동일성을 측정하기 위하여 사용될 수 있으며 당업계에 공지된 다수의 상이한 알고리즘이 존재한다. 예를 들어 폴리뉴클레오티드 서열은 FASTA, Gap 또는 Bestfit을 사용하여 비교될 수 있으며, 상기 프로그램은 미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재의 Accelrys의 위스콘신 패키지 버전(Wisconsin Package Version) 10.3의 프로그램이다. 예를 들어 FASTA2 및 FASTA3 프로그램을 포함하는 FASTA는 쿼리(query) 서열과 검색 서열 사이의 가장 우수한 중복 영역의 정렬 및 서열 동일성 퍼센트를 제공한다(문헌[Pearson, Methods Enzymol., 183: 63-98(1990)]; 문헌[Pearson, Methods Mol. Biol., 132: 185-219 (2000)]; 문헌[Pearson, Methods Enzymol., 266: 227-258 (1996)]; 문헌[Pearson, J. Mol. Biol., 276: 71-84 (1998)]; 본원에 참고로 포함됨). 달리 명시되지 않는 한, 특정 프로그램 또는 알고리즘에 있어서 디폴트 파라미터가 사용된다. 예를 들어 뉴클레오티드 서열들 사이의 서열 동일성 퍼센트는, 본원에 참고로 포함된, 디폴트 파라미터(점수 매트릭스에 있어서 NOPAM 요소 및 6의 단어 크기)를 갖는 FASTA를 사용하거나 위스콘신 패키지 버전 10.3에 제공되어 있는 디폴트 파라미터를 갖는 GAP를 사용하여 결정할 수 있다.
뉴클레오티드 서열에 대한 기준체는 달리 명시되지 않는 한 이의 상보체를 포함한다. 따라서, 특정 서열을 갖는 핵산 분자에 대한 기준체는 상보성 서열을 갖는 이의 상보성 가닥을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
분자 생물학 분야에 있어서, 연구원은 "서열 동일성 퍼센트", "서열 유사성 퍼센트" 및 "서열 상동성 퍼센트"라는 용어를 서로 바꾸어서 사용한다. 본 출원에 있어서 이러한 용어는 뉴클레오티드 서열에 대해서만 동일한 의미를 갖는다.
"상당한 유사성" 또는 "상당한 서열 유사성"이라는 용어는, 핵산 또는 이의 단편을 언급하는 경우, 상기에 논의되어 있는 바와 같이, 임의의 잘 알려진 서열 동일성 알고리즘, 예를 들어 FASTA, BLAST 또는 Gap로 측정할 때, 적절한 뉴클레오티드 삽입 또는 결실을 다른 핵산(또는 이의 상보성 가닥)과 최적으로 정렬되는 경우, 적어도 약 85%, 바람직하게는 적어도 약 90%, 더 바람직하게는 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 뉴클레오티드 염기에서 뉴클레오티드 서열 동일성이 존재한다.
폴리펩티드에 적용되는 경우 "상당한 동일성"이라는 용어는 디폴트 갭 가중치를 사용하여 GAP 또는 BESTFIT 프로그램에 의한 것과 같은 것에 의해 최적으로 정렬될 때 2개의 펩티드 서열이 적어도 75% 또는 80%의 서열 동일성, 바람직하게는 적어도 90% 또는 95%의 서열 동일성, 더욱 더 바람직하게는 적어도 98% 또는 99%의 서열 동일성을 공유한다는 것을 의미한다. 바람직하게는 동일하지 않은 잔기 위치는 보존성 아미노산 치환이 다르다. "보존성 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 화학적 특성(예를 들어 전하 또는 소수성)을 갖는 측쇄(R기)를 갖는 다른 아미노산 잔기로 치환된 것이다. 일반적으로 보존성 아미노산 치환은 단백질의 기능적 특성을 실질적으로 변화시키지 않는다. 2개 이상의 아미노산 서열이 보존성 치환에 의해 서로 다른 경우, 서열 동일성 퍼센트 또는 유사성 정도는 이 치환의 보존 성질에 대하여 보정하기 위하여 보다 많이 조정될 수 있다. 이러한 조정을 행하는 수단은 당업계의 숙련자에게 잘 알려져 있다. 예를 들어 본원에 참고로 포함된 문헌[Pearson, Methods Mol. Biol., 24: 307-31 (1994)]을 참고한다. 유사한 화학적 특성을 갖는 측쇄를 갖는 아미노산의 군의 예는 1) 지방족 측쇄: 글리신, 알라닌, 발린, 류신 및 이소류신; 2) 지방족-히드록실 측쇄; 세린 및 트레오닌; 3) 아미드 함유 측쇄; 아스파라긴 및 글루타민; 4) 방향족 측쇄; 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판; 5) 염기성 측쇄; 리신, 아르기닌 및 히스티딘과; 6) 황 함유 측쇄: 시스테인 및 메티오닌을 포함한다. 바람직한 보존성 아미노산 치환 군으로는 발린-류신-이소류신, 페닐알라닌-티로신, 리신-아르기닌, 알라닌-발린, 글루타메이트-아스파르테이트 및 아스파라긴-글루타민이 있다.
대안적으로는, 보존성 치환은 본원에 참고로 포함된 문헌[Gonnet et al., Science, 256: 1443-45 (1992)]에 개시되어 있는 PAM250 로그-가능도 매트릭스에서 양의 값을 갖는 임의의 변화이다. "중간 정도의 보존성" 치환은 PAM250 로그-가능도 매트릭스에서 음이 아닌 값을 갖는 임의의 변화이다.
폴리펩티드의 서열 유사성은 전형적으로 서열 분석 소프트웨어를 사용하여 측정된다. 단백질 분석용 소프트웨어는 보존성 아미노산 치환을 비롯하여 다양한 치환, 결실 및 기타 변형에 할당된 유사성 척도를 이용하여 유사한 서열들을 매치시킨다. 예를 들어 GCG는 "Gap" 및 "Bestfit"과 같은 프로그램을 포함하며, 이 프로그램은 디폴트 파라미터로 사용되어 밀접하게 연관된 폴리펩티드, 예를 들어 상이한 종의 유기체 유래의 상동성 폴리펩티드들 사이에서 또는 야생형 단백질과 그 돌연변이 단백질 사이에서 서열 상동성 또는 서열 동일성을 결정할 수 있다. 예를 들어 위스콘신 패키지 버전 10.3을 참조한다. 폴리펩티드 서열은 또한 위스콘신 패키지 버전 10.3 내의 프로그램이며 디폴트 파라미터 또는 권고되는 파라미터가 사용되는 FASTA를 사용하여 비교될 수 있다. FASTA(예를 들어, FASTA2 및 FASTA3)는 쿼리 서열과 검색 서열 사이의 가장 우수한 중복 영역의 서열 동일성 퍼센트 및 정렬을 제공한다(문헌[Pearson (1990); Pearson (2000)]). 본 발명의 서열을 상이한 유기체 유래의 다수의 서열을 포함하는 데이터베이스와 비교할 경우의 다른 바람직한 알고리즘은 디폴트 파라미터가 사용되는 컴퓨터 프로그램 BLAST, 특히 blastp 또는 tblastn이다. 예를 들어 본원에 참고로 포함된 문헌[AltschμL et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990)]; 문헌[AltschμL et al., Nucleic Acids Res. 25: 3389-402 (1997)]을 참조한다.
상동성에 대하여 비교되는 폴리펩티드 서열의 길이는 일반적으로 적어도 약 16개의 아미노산 잔기, 일반적으로는 적어도 약 20개의 잔기, 더 일반적으로는 적어도 약 24개의 잔기, 전형적으로는 약 28개의 잔기, 바람직하게는 약 35개 초과의 잔기이다. 다수의 상이한 유기체 유래의 서열을 포함하는 데이터베이스를 검색할 경우 아미노산 서열들을 비교하는 것이 바람직하다.
본원에 사용되는 바와 같이, "표지" 또는 "표지된"이라는 용어는 항체에 다른 분자를 혼입하는 것을 말한다. 일 실시 형태에 있어서, 표지는 검출 가능한 마커, 예를 들어 마크가 붙어있는 아비딘(예를 들어 광학적 방법 또는 비색법에 의해 검출될 수 있는 효소 활성 또는 형광성 마커를 포함하는 스트렙타비딘)에 의해 검출될 수 있는 비오틴 부분의 폴리펩티드에의 부착체 또는 방사능 동위 원소 표지 아미노산의 혼입체이다. 다른 실시 형태에 있어서, 표지 또는 마커는 치료용일 수 있는데, 예를 들어 약물 콘쥬게이트(conjugate) 또는 독소일 수 있다. 폴리펩티드 및 당단백질을 표지하는 다양한 방법이 당업계에 공지되어 있으며 사용될 수 있다. 폴리펩티드에 있어서의 표지의 예는 하기: 방사성 동위 원소 또는 방사성 핵종(예를 들어, 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I), 형광성 표지(예를 들어, FITC, 로다민, 란탄족 인광체), 효소 표지(예를 들어, 서양 고추냉이 퍼옥시다제, β-갈락토시다제, 루시퍼라제, 알칼리 포스파타제), 화학 발광성 마커, 비오틴기, 이차 리포터에 의해 인식되는 소정의 폴리펩티드 에피토프(예를 들어 류신 지퍼 쌍 서열, 이차 항체의 결합 부위, 금속 결합 도메인, 에피토프 태그), 자성 물질, 예를 들어 가돌리늄 킬레이트, 독소, 예를 들어 백일해 독소, 탁솔, 사이토칼라신(cytochalasin) B, 그라미시딘(gramicidin) D, 브롬화에티듐, 에메틴, 미토마이신, 에토포시드, 테노포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜히친, 독소루비신, 다우노루비신, 디히드록시 안트라신 디온, 미톡산트론, 미트라마이신, 악티노마이신 D, 1-데히드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀롤 및 퓨로마이신과 이의 유사체 또는 동족체를 포함하지만 이로 한정되는 것은 아니다. 몇몇 실시 형태에 있어서, 표지는 잠재적인 입체 장애의 감소를 위하여 다양한 길이의 스페이서 암에 의해 부착된다.
본원에서 "제제"라는 용어는 화학적 화합물, 화학적 화합물의 혼합물, 생물학적 거대 분자, 또는 생물학적 물질로부터 만들어진 추출물을 나타내기 위하여 사용된다. "본원에서 사용되는 바와 같이, "제약 제제 또는 약물"이라는 용어는 환자에게 적당하게 투여될 경우 원하는 치료 효과를 유발할 수 있는 화학적 화합물 또는 조성물을 말한다. 본원에서 다른 화학 용어는 본원에 참고로 포함된 문헌[The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (Parker, S., Ed., McGraw-Hill, San Francisco (1985))]에 의해 예시되는 바와 같이, 당업계의 통상적인 관례에 따라 사용된다.
본원에서 "소염제" 또는 "면역 조절제"라는 용어는 인간을 포함하는 피험체에서의 염증성 질환을 포함하는 염증을 억제하는 기능적 특성을 갖는 약제를 말하기 위하여 사용된다. 본 발명의 다양한 실시 형태에 있어서, 염증성 질환은 크론병, 궤양성 대장염, 게실증, 위염, 간 질환, 원발성 담즙성 경화증, 경화성 담관염을 포함하는 위장관의 염증성 질환을 포함할 수 있지만 이로 한정되는 것은 아니다. 염증성 질환은 또한 복부 질환(복막염, 충수염, 담도계 질환을 포함함), 급성 횡단성 척수염, 알러지성 피부염(알러지성 피부, 알러지성 습진, 피부 아토피, 아토피성 습진, 아토피성 피부염, 피부 염증, 염증성 습진, 염증성 피부염, 벼룩에 물린 피부(flea skin), 속립성 피부염, 속립성 습진, 집먼지 진드기에 물린 피부(house dust mite skin)를 포함함), 강직성 척추염(라이터 증후군), 천식, 기도 염증, 아테롬성 동맥 경화증, 동맥 경화증, 담도 폐쇄증, 방광 염증, 유방암, 심혈관계 염증(혈관염, 류마티스성 손톱 주름 경색(rheumatoid nail-fold infarct), 다리 궤양, 다발성 근염, 만성 혈관계 염증, 심막염, 만성 폐쇄성 폐질환을 포함함), 만성 췌장염, 신경 주위(perineural) 염증, 대장염(아메바성 대장염, 감염성 대장염, 세균성 대장염, 크론 대장염, 허혈성 대장염, 궤양성 대장염, 특발성 직장결장염, 염증성 장질환, 위막성(pseudomembranous) 대장염을 포함함), 콜라겐 혈관 장애(류마티스 관절염, SLE, 진행성 전신성 경화증, 혼합성 결합 조직 질환, 진성 당뇨병), 크론병(국한성 장염, 육아종 회장염, 회결장염, 소화기계 염증), 탈수초성 질환(척수염, 다발성 경화증, 파종성 경화증, 급성 파종성 뇌척수염, 정맥 주위 탈수초, 비타민 B12 결핍증, 길랑-바레 증후군(Guillain-Barre syndrome), MS-관련 레트로바이러스를 포함함), 피부근염, 게실염, 삼출성 설사, 위염, 육아종성 간염, 육아종성 염증, 담낭염, 인슐린 의존성 진성 당뇨병, 간 염증 질환(간 섬유증 원발성 담즙성 경화증, 간염, 경화성 담관염), 폐 염증(특발성 폐 섬유증, 폐의 호산성 육아종, 폐 조직구증 X, 세기관지 주위 염증, 급성 기관지염), 성병성 림프 육아종, 악성 흑색종, 구강/치아 질환(치은염, 치주 질환을 포함함), 점막염, 근골격계 염증(근염), 비알코올성 지방간염(비알코올성 지방 간 질환), 안구 및 안와 염증(포도막염, 시신경염, 주변 류머티스성 궤양, 주변 각막 염증을 포함함), 골관절염, 골수염, 인두 염증, 다발성 관절염, 직장항문염, 건선, 방사선 손상, 사르코이드증, 겸상 적혈구 괴저(sickle cell necropathy), 표재성 혈전성 정맥염, 전신성 염증 반응 증후군, 갑상선염, 전신성 홍반성 루푸스, 이식편 대 숙주 질환, 급성 화상 손상, 베제트 증후군, 쇼그렌 증후군을 포함할 수 있지만, 이로 한정되는 것은 아니다.
환자 또는 피험체라는 용어는 인간 및 수의학적 피험체를 포함한다.
인간 항- MAdCAM 항체 및 이의 특성화
일 실시 형태에 있어서, 본 발명은 인간 CDR 서열을 포함하는 항-MAdCAM 항체를 제공한다. 바람직한 실시 형태에 있어서, 본 발명은 인간 항-MAdCAM 항체를 제공한다. 몇몇 실시 형태에 있어서, 인간 항-MAdCAM 항체는, 트랜스제닉 동물이 인간 항체를 생산하도록 게놈이 인간 면역글로불린을 포함하는 인간 이외의 트랜스제닉 동물, 예를 들어 설치류를 면역화함으로써 제조한다. 몇몇 실시 형태에 있어서, 본 발명은 보체에 결합하지 않는 항-MAdCAM 항체를 제공한다.
바람직한 실시 형태에 있어서, 본 항-MAdCAM 항체는 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod 또는 7.26.4-mod이다. 다른 바람직한 실시 형태에 있어서, 본 항-MAdCAM 항체는 서열 번호 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 54, 58, 62, 66 또는 68의 서열(신호 서열을 포함하거나 포함하지 않음)로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 또는 상기 아미노산 서열 중 임의의 하나의 서열의 가변 영역, 또는 이러한 아미노산 서열 유래의 하나 이상의 CDR을 포함한다. 다른 바람직한 실시 형태에 있어서, 항-MAdCAM 항체는 서열 번호 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42, 46, 52, 56, 60 또는 64의 서열(신호 서열을 포함하거나 포함하지 않음)로부터 선택되는 아미노산 서열 또는 상기 아미노산 서열 유래의 하나 이상의 CDR 또는 가변 영역의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 또한 본 발명에 포함되는 것은 전술한 서열 중 임의의 하나의 서열의, CDR1의 시작에서부터 CDR3의 말단까지의 아미노산 서열을 포함하는 인간 항-MAdCAM 항체이다. 본 발명은 또한 전술한 서열 중 임의의 서열의 하나 이상의 FR 영역을 포함하는 항-MAdCAM 항체를 제공한다.
본 발명은 또한 하나 이상의 변형이 행해진 전술한 아미노산 서열 중 하나의 서열을 포함하는 항-MAdCAM 항체를 제공한다. 몇몇 실시 형태에 있어서, 화학적으로 반응성을 가질 수 있는 항체 중의 시스테인은 한정됨이 없이, 알라닌 또는 세린과 같은 다른 잔기로 치환된다. 일 실시 형태에 있어서, 이 치환은 비표준적(non-canonical) 시스테인에서 일어난다. 치환은 항체의 불변 도메인에서 또는 가변 도메인의 골격 영역 또는 CDR에서 행해질 수 있다. 몇몇 실시 형태에 있어서, 시스테인은 표준적인 것이다.
몇몇 실시 형태에 있어서, 아미노산 치환을 하여 항체에서 잠재적인 단백질 분해 부위를 제거한다. 그러한 부위는 항체의 불변 도메인에서 또는 가변 도메인의 골격 영역 또는 CDR에서 나타날 수 있다. 시스테인 잔기의 치환 및 단백질 분해 부위의 제거에 의해 항체 생성물에서의 이종성이 감소될 수 있다. 몇몇 실시 형태에 있어서, 잠재적인 탈아미드화 부위를 형성하는 아스파라긴-글리신 쌍은 이 잔기들 중 하나 또는 그들 모두를 변경시킴으로써 제거된다. 몇몇 실시 형태에 있어서, 아미노산 치환을 하여 본 발명의 항체의 가변 부위의 잠재적인 글리코실화 부위를 부가 또는 제거한다.
몇몇 실시 형태에 있어서, 본 발명의 항-MAdCAM 항체의 중쇄의 C-말단 리신이 절단된다. 본 발명의 다양한 실시 형태에 있어서, 본 항-MAdCAM 항체의 중쇄 및 경쇄는 선택적으로 신호 서열을 포함할 수 있다.
일 실시 형태에 있어서, 본 발명은 12종의 억제성 인간 항-MAdCAM 모노클로날 항체 및 이를 생산하는 하이브리도마 세포주를 제공한다. 표 1에는 전장의 중쇄 및 경쇄(신호 서열을 포함함)를 코딩하는 핵산의 서열 식별자(서열 번호)와, 상응하는 전장의 추정 아미노산 서열이 열거되어 있다.
인간 항-MAdCAM 항체
모노클로날 항체 서열 식별자
(서열 번호)
전장
중쇄 경쇄
DNA 단백질 DNA 단백질
1.7.2 1 2 3 4
1.8.2 5 6 7 8
6.14.2 9 10 11 12
6.22.2 13 14 15 16
6.34.2 17 18 19 20
6.67.1 21 22 23 24
6.73.2 25 26 27 28
6.77.1 29 30 31 32
7.16.6 33 34 35 36
7.20.5 37 38 39 40
7.26.4 41 42 43 44
9.8.2 45 46 47 48
다른 태양에 있어서, 본 발명은 소정의 상기 인간 항-MAdCAM 모노클로날 항체의 변형된 형태를 제공한다. 표 2에는 변형된 항체의 DNA 및 단백질 서열에 있어서의 서열 식별자가 열거되어 있다.
인간 항-MAdCAM 항체
변형된
모노클로날 항체		 서열 식별자
(서열 번호)
전장
중쇄 경쇄
DNA 단백질 DNA 단백질
6.22.2-mod 51 52 53 54
6.34.2-mod 55 56 57 58
6.67.1-mod 59 60 61 62
6.77.1-mod 63 64 65 66
7.26.4-mod 41 42 67 68
항- MAdCAM 항체 부류 및 아류
본 항체는 IgG, IgM, IgE, IgA 또는 IgD 분자일 수 있다. 바람직한 실시 형태에 있어서, 본 항체는 IgG 부류이며 IgGl, IgG2, IgG3 또는 IgG4 아류이다. 더 바람직한 실시 형태에 있어서, 본 항-MAdCAM 항체는 IgG2 또는 IgG4 아류이다. 다른 바람직한 실시 형태에 있어서, 본 항-MAdCAM 항체는 IgG2인 항체 1.7.2, 1.8.2, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod 또는 7.26.4-mod, 또는 IgG4인 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1 또는 9.8.2 항체와 동일한 부류 또는 아류이다.
항-MAdCAM 항체 부류 및 아류는 당업계에 공지된 임의의 방법으로 결정할 수 있다. 일반적으로 본 항체 부류 및 아류는 특정 항체 부류 및 아류에 특이적인 항체를 사용하여 결정할 수 있다. 그러한 항체는 구매가능하다. ELISA, 웨스턴 블롯과, 기타 기술로 이 부류 및 아류를 결정할 수 있다. 대안적으로는, 본 부류 및 아류는 본 항체의 중쇄 및/또는 경쇄의 불변 영역 모두를, 또는 그 일부를 서열 결정하는 단계, 이의 아미노산 서열을 다양한 면역글로불린 부류 및 아류의 공지된 아미노산 서열과 비교하는 단계, 및 본 항체 부류 및 아류를 가장 높은 서열 동일성을 나타내는 부류로서 결정하는 단계에 의해 결정할 수 있다.
종 및 분자 선택성
본 발명의 다른 태양에 있어서, 본 항-MAdCAM 항체는 종 및 분자 선택성 둘 다를 보여 준다. 일 실시 형태에 있어서, 본 항-MAdCAM 항체는 인간, 사이노몰거스(cynomolgus) 또는 개의 MAdCAM에 결합한다. 몇몇 실시 형태에 있어서, 본 항-MAdCAM 항체는 신세계 원숭이(New World monkey) 종, 예를 들어 마모셋(marmoset)에는 결합하지 않는다. 본 명세서의 교시에 따라 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 항-MAdCAM 항체에 대한 종의 선택성을 결정할 수 있다. 예를 들어 웨스턴 블롯, FACS, ELISA 또는 면역 조직 화학법을 이용하여 종 선택성을 결정할 수 있다. 바람직한 실시 형태에 있어서, 면역 조직 화학법을 이용하여 종 선택성을 결정할 수 있다.
몇몇 실시 형태에 있어서, MAdCAM에 특이적으로 결합하는 항-MAdCAM 항체는 VCAM, 피브로넥틴 또는 임의의 기타 항원에 비하여 MAdCAM에 대하여 적어도 10배, 바람직하게는 적어도 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 또는 90배, 가장 바람직하게는 적어도 100배인 선택성을 갖는다. 바람직한 실시 형태에 있어서, 항-MAdCAM 항체는 VCAM, 피브로넥틴, 또는 MAdCAM 이외의 임의의 기타 항원에 대하여 상당한 결합을 나타내지 않는다. 본 명세서의 교시에 따라 당업계에 잘 알려진 방법을 이용하여 MAdCAM에 대한 항-MAdCAM 항체의 선택성을 측정할 수 있다. 예를 들어 웨스턴 블롯, FACS, ELISA, 또는 면역 조직 화학법을 이용하여 선택성을 측정할 수 있다.
MAdCAM 에의 항- MAdCAM 항체의 결합 친화도
본 발명의 다른 태양에 있어서, 본 항-MAdCAM 항체는 높은 친화도로 MAdCAM에 특이적으로 결합한다. 일 실시 형태에 있어서, 표면 플라즈몬 공명, 예를 들어 BIAcore로 측정할 때, 본 항-MAdCAM 항체는 3 x 10-8 M 이하의 Kd로 MAdCAM에 특이적으로 결합한다. 더 바람직한 실시 형태에 있어서, 본 항체는 1 x 10-8 M 이하 또는 1 x 10-9 M 이하의 Kd로 MAdCAM에 특이적으로 결합한다. 더욱 더 바람직한 실시 형태에 있어서, 본 항체는 1 x 10-10 M 이하의 Kd로 MAdCAM에 특이적으로 결합한다. 다른 바람직한 실시 형태에 있어서, 본 발명의 항체는 2.66 x 10-10 M 이하, 2.35 x 10-11 M 이하 또는 9 x 10-12 M 이하의 Kd로 MAdCAM에 특이적으로 결합한다. 다른 바람직한 실시 형태에 있어서, 본 항체는 1 x 10-11 M 이하의 Kd로 MAdCAM에 특이적으로 결합한다. 다른 바람직한 실시 형태에 있어서, 본 항체는 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod 또는 7.26.4-mod로부터 선택되는 항체와 실질적으로 동일한 Kd로 MAdCAM에 특이적으로 결합한다. 기준 항체와 "실질적으로 동일한 Kd"를 갖는 항체의 Kd는, 동일한 실험에서 기준 항체의 Kd와 비교하여 ± 100 pM, 바람직하게는 ± 50 pM, 더 바람직하게는 ± 20 pM, 더욱 더 바람직하게는 ± 10 pM, ± 5 pM 또는 ± 2 pM이다. 다른 바람직한 실시 형태에 있어서, 본 항체는 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod 또는 7.26.4-mod로부터 선택되는 항체 유래의 하나 이상의 가변 도메인 또는 하나 이상의 CDR을 포함하는 항체와 실질적으로 동일한 Kd로 MAdCAM에 결합한다. 또다른 바람직한 실시 형태에 있어서, 본 항체는 서열 번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46 48, 52, 54, 56, 58, 62, 64, 66 또는 68의 서열(신호 서열을 포함하거나 포함하지 않음)로부터 선택되는 아미노산 서열 중 하나의 서열을 포함하는 항체, 또는 이의 가변 도메인과 실질적으로 동일한 Kd로 MAdCAM에 결합한다. 다른 바람직한 실시 형태에 있어서, 본 항체는 서열 번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 52, 54, 56, 58, 62, 64, 66 또는 68의 서열로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 항체 유래의 하나 이상의 CDR을 포함하는 항체와 실질적으로 동일한 Kd로 MAdCAM에 결합한다.
항-MAdCAM 항체의 MAdCAM에의 결합 친화도는 당업계에 공지된 임의의 방법으로 측정할 수 있다. 일 실시 형태에 있어서, 결합 친화도는 경쟁 ELISA, RIA 또는 표면 플라즈몬 공명, 예를 들어 BIAcore로 측정할 수 있다. 더 바람직한 실시 형태에 있어서, 결합 친화도는 표면 플라즈몬 공명으로 측정한다. 더욱 더 바람직한 실시 형태에 있어서, 결합 친화도 및 해리 상수는 BIAcore를 이용하여 측정한다. 결합 친화도의 측정 예가 하기 실시예 II에 기술되어 있다.
항- MAdCAM 항체의 반감기
본 발명의 다른 목적에 따르면, 본 항-MAdCAM 항체의 반감기는 시험관내 또는 생체내에서 1일 이상이다. 바람직한 실시 형태에 있어서, 본 항체 또는 이의 일부의 반감기는 3일 이상이다. 더 바람직한 실시 형태에 있어서, 본 항체 또는 이의 일부의 반감기는 4일 이상이다. 다른 실시 형태에 있어서, 본 항체 또는 이의 일부의 반감기는 8일 이상이다. 하기에 논의되어 있는 바와 같이, 다른 실시 형태에 있어서, 본 항체 또는 이의 항원 결합성 부분은 반감기가 보다 길어지도록 유도체화되거나 변형된다. 다른 바람직한 실시 형태에 있어서, 본 항체는 2004년 2월 24일자로 공개된 WO 00/09560와 같이, 혈청 중 반감기의 증가를 위하여 점 돌연변이를 포함할 수 있다.
항체의 반감기는 당업계의 숙련자에게 공지된 임의의 수단으로 측정될 수 있다. 예를 들어 항체의 반감기는 웨스턴 블롯, ELISA 또는 RIA로 적절한 기간에 걸쳐 측정될 수 있다. 항체의 반감기는 임의의 적절한 동물, 예를 들어 영장류, 예를 들어 사이노몰거스 원숭이 또는 인간에서 측정될 수 있다.
항- MAdCAM 항체에 의해 인식되는 MAdCAM 에피토프의 확인
본 발명은 본원에 제공된 인간 항-MAdCAM 항체와 동일한 항원 또는 에피토프에 결합하는 인간 항-MAdCAM 항체도 제공한다. 또한, 본 발명은 인간 항-MAdCAM 항체와 경쟁하거나 교차 경쟁하는 인간 항-MAdCAM 항체를 제공한다. 바람직한 실시 형태에 있어서, 인간 항-MAdCAM 항체는 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2- mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod 또는 7.26.4-mod이다. 다른 바람직한 실시 형태에 있어서, 인간 항-MAdCAM 항체는 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod 또는 7.26.4-mod로부터 선택되는 항체 유래의 하나 이상의 가변 도메인 또는 하나 이상의 CDR을 포함한다. 또다른 바람직한 실시 형태에 있어서, 인간 항-MAdCAM 항체는 서열 번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 52, 54, 56, 58, 62, 64, 66 또는 68의 서열(신호 서열을 포함하거나 포함하지 않음)로부터 선택되는 아미노산 서열 중 하나의 서열, 또는 이의 가변 도메인을 포함한다. 다른 바람직한 실시 형태에 있어서, 인간 항-MAdCAM 항체는 서열 번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 52, 54, 56, 58, 62, 64, 66 또는 68의 서열로부터 선택되는 아미노산 서열 중 하나의 서열을 포함하는 항체 유래의 하나 이상의 CDR을 포함한다. 매우 바람직한 실시 형태에 있어서, 본 항-MAdCAM 항체는 다른 인간 항체이다.
당업계에 공지된 다양한 방법을 이용하여 항-MAdCAM 항체가 다른 항-MAdCAM 항체와 동일한 항원에 결합하는지를 측정할 수 있다. 예를 들어 공지된 항-MAdCAM 항체를 사용하여 항원을 포착하고, 이 항원을 항-MAdCAM 항체로부터 용출시키고, 이어서 시험 항체가 용출된 항원에 결합하는지를 측정할 수 있다. 포화 상태 하에서 항-MAdCAM 항체를 MAdCAM에 결합시키는 단계, 이어서 시험 항체가 MAdCAM에 결합하는 능력을 측정하는 단계에 의해 어느 한 항체가 항-MAdCAM 항체와 경쟁하는지를 측정할 수 있다. 시험 항체가 항-MAdCAM 항체와 동시에 MAdCAM에 결합할 수 있다면, 시험 항체는 항-MAdCAM 항체와는 다른 에피토프에 결합하는 것이다. 그러나, 시험 항체가 동시에 MAdCAM에 결합할 수 없다면, 시험 항체는 인간 항-MAdCAM 항체와 경쟁하는 것이다. 이 실험은 ELISA, 또는 표면 플라즈몬 공명 또는 바람직하게는 BIAcore를 이용하여 수행할 수 있다. 항-MAdCAM 항체가 다른 항-MAdCAM 항체와 교차 경쟁하는지를 시험하기 위하여, 두 방향으로 상기한 경쟁 방법을 이용할 수 있는데, 즉, 공지된 항체가 시험 항체를 차단하는지를 측정하거나 그 역으로 할 수 있다.
경쇄 및 중쇄 유전자의 용도
본 발명은 인간 κ 유전자에 의해 코딩되는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-MAdCAM 항체도 제공한다. 바람직한 실시 형태에 있어서, 경쇄 가변 영역은 인간 Vκ A2, A3, A26, B3, O12 또는 018 유전자 패밀리에 의해 코딩된다. 다양한 실시 형태에 있어서, 생식 세포(germline) 인간 Vκ A2, A3, A26, B3, 012 또는 018 서열 유래의 경쇄는 11개 이하, 6개 이하 또는 3개 이하의 아미노산 치환을 포함한다. 바람직한 실시 형태에 있어서, 이 아미노산 치환은 보존성 치환이다.
서열 번호 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44 및 48의 서열은 12종의 항-MAdCAM 항체 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4 및 9.8.2의 전장 카파 경쇄의 아미노산 서열을 제공한다. 도 1K-1T는 12종의 항-MAdCAM 항체의 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열을, 그가 유래되는 생식 세포의 서열과 정렬시킨 것이다. 도 2A에는 12종의 항-MAdCAM 항체의 카파 경쇄의 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열을 서로에 대하여 정렬시킨 것이 도시되어 있다. 본 명세서의 교시에 따르면, 당업계의 숙련자는 생식 세포의 서열과 추가의 항-MAdCAM 항체의 항체 서열 사이의 차이를 결정할 수 있다. 서열 번호 54, 58, 62, 66 또는 68의 서열은, 각각 모 항-MAdCAM 항체인 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.77.1 또는 7.26.45 유래의, 아미노산 치환에 의해 변형된 5종의 추가의 항-MAdCAM 항체, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod 및 7.26.4-mod의 전장 카파 경쇄의 아미노산 서열을 제공한다.
바람직한 실시 형태에 있어서, 항-MAdCAM 항체의 VL은 생식 세포의 아미노산 서열과 관련하여, 항체 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod 또는 7.26.4-mod의 임의의 하나 이상의 VL과 동일한 돌연변이를 포함한다. 본 발명은 예시된 항체와 동일한 인간 Vκ 및 인간 Jk 유전자가 이용되는 항-MAdCAM 항체를 포함한다. 몇몇 실시 형태에 있어서, 본 항체는 하나 이상의 예시된 항체와 동일한 생식 세포 유래의 돌연변이 중 하나 이상을 포함한다. 몇몇 실시 형태에 있어서, 본 항체는 예시된 하나 이상의 항체와 동일한 위치들 중 하나 이상의 위치에서의 상이한 치환을 포함한다. 예를 들어 항-MAdCAM 항체의 VL은 항체 7.16.에 존재하는 것과 동일한 하나 이상의 아미노산 치환과, 항체 7.26.4와 동일한 다른 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 이러한 방식으로, 예를 들어 MAdCAM에 대한 항체의 친화도 또는 항원으로부터의 이의 해리 속도의 변경을 위하여 상이한 항체 결합 특징들을 혼합 및 매칭시킬 수 있다. 다른 실시 형태에 있어서, 돌연변이는 항체 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod 또는 7.26.4-mod의 VL 중 임의의 하나 이상의 VL에서 발견되는 것과 동일한 위치에서 행해지지만, 보존성 아미노산 치환이 오히려 동일한 아미노산을 사용하여 행해진다. 예를 들어 항체 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod 또는 7.26.4-mod 중 하나에 있어서 생식 세포와 비교하여 아미노산 치환이 글루타메이트일 경우, 아스파르테이트를 보존 치환할 수 있다. 이와 유사하게, 아미노산 치환이 세린일 경우, 트레오닌을 보존 치환할 수 있다.
다른 바람직한 실시 형태에 있어서, 경쇄는 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod 또는 7.26.4-mod의 VL의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 다른 매우 바람직한 실시 형태에 있어서, 경쇄는 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod 또는 7.26.4-mod의 경쇄의 CDR 영역과 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 다른 바람직한 실시 형태에 있어서, 경쇄는 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod 또는 7.26.4-mod의 경쇄의 하나 이상의 CDR 영역을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 다른 바람직한 실시 형태에 있어서, 경쇄는 동일한 Vκ 및 Jκ 유전자가 이용되는 상이한 경쇄 유래의 CDR을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 더 바람직한 실시 형태에 있어서, 상이한 경쇄 유래의 CDR은 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod 또는 7.26.4-mod로부터 얻어진다. 다른 바람직한 실시 형태에 있어서, 경쇄는 신호 서열을 포함하거나 포함하지 않는 서열 번호 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 54, 58, 62, 64, 66 또는 68의 서열로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 다른 실시 형태에 있어서, 경쇄는 서열 번호 3, 7, 11, 15, 19, 23, 27, 31, 35, 39, 43, 47, 53, 57, 61, 65 또는 67의 서열(신호 서열을 포함하거나 포함하지 않음)로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열, 또는 1-11개의 아미노산이 삽입, 결실 또는 치환된 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게는, 아미노산 치환은 보존성 아미노산 치환이다. 다른 바람직한 실시 형태에 있어서, 본 항체 또는 이의 일부는 람다 경쇄를 포함한다.
본 발명은 인간 VH 유전자 서열 또는 인간 VH 유전자로부터 유래되는 서열을 포함하는 항-MAdCAM 항체 또는 이의 일부도 제공한다. 일 실시 형태에 있어서, 중쇄 아미노산 서열은 인간 VH 1-18, 3-15, 3-21, 3-23, 3-30, 3-33 또는 4-4 유전자 패밀리로부터 유래된다. 다양한 실시 형태에 있어서, 중쇄는 인간의 생식 세포의 VH 1-18, 3-15, 3-21, 3-23, 3-30, 3-33 또는 4-4 유전자 서열 유래의, 15개 이하, 6개 이하 또는 3개 이하의 아미노산 변화를 포함한다.
서열 번호 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42 및 46의 서열은 12종의 항-MAdCAM 항체의 전장 중쇄의 아미노산 서열을 제공한다. 도 1A-1J는 12종의 항-MAdCAM 항체의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 그가 유래되는 생식 세포의 서열과 정렬시킨 것이다. 도 2B에는 12종의 항-MAdCAM 항체의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 서로에 대하여 정렬시킨 것이 도시되어 있다. 본 명세서의 교시 및 뉴클레오티드 서열에 따라 당업계의 숙련자는 12종의 항-MAdCAM 중쇄 및 생식 세포의 중쇄의 코딩된 아미노산 서열을 결정하고 생식 세포의 서열과 본 항체의 서열 사이의 차이를 결정할 수 있다. 서열 번호 52, 56, 60 및 64의 서열은, 각각 모 항-MAdCAM 항체인 6.22.2, 6.34.2 및 6.67.1 유래의, 아미노산의 치환에 의해 변형된 항-MAdCAM 항체인 6.22.2-mod, 6.34.2-mod 및 6.67.1-mod의 전장 중쇄의 아미노산 서열을 제공한다. 한 가지의 추가로 변형된 항-MAdCAM 항체인 7.26.4-mod는 서열 번호 42의 서열인 전장 중쇄 아미노산 서열을 갖는다.
바람직한 실시 형태에 있어서, 항-MAdCAM 항체의 VH는 생식 세포의 아미노산 서열과 관련하여, 항체 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod 또는 7.26.4-mod의 VH 중 임의의 하나 이상의 VH와 동일한 돌연변이를 포함한다. 상기에 논의되어 있는 것과 유사하게, 본 항체는 하나 이상의 예시된 항체와 동일한 생식 세포 유래의 돌연변이 중 하나 이상을 포함한다. 몇몇 실시 형태에 있어서, 본 항체는 예시된 항체 중 하나 이상의 항체와 동일한 하나 이상의 위치에서의 상이한 치환을 포함한다. 예를 들어 본 항-MAdCAM 항체의 VH는 항체 7.16.6에 존재하는 것과 동일한 하나 이상의 아미노산 치환과, 항체 7.26.4와 동일한 다른 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 이러한 방식으로, 예를 들어 MAdCAM에 대한 항체의 친화도 또는 항원으로부터의 이의 해리 속도의 변경을 위하여 상이한 항체 결합 특징들을 혼합 및 매칭시킬 수 있다. 다른 실시 형태에 있어서, 생식 세포와 비교되는 아미노산 치환은 기준 항체 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod 또는 7.26.4-mod의 VH 중 임의의 하나 이상의 VH에서 발견되는 것과 동일한 위치에서 생식 세포 유래의 치환으로서 행해지지만, 이 위치는 상이한 잔기로 치환되는데, 이는 기준 항체와 비교하여 보존성 치환이다.
다른 바람직한 실시 형태에 있어서, 중쇄는 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod 또는 7.26.4-mod의 VH의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 다른 매우 바람직한 실시 형태에 있어서, 중쇄는 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod 또는 7.26.4-mod의 중쇄의 CDR 영역과 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 다른 바람직한 실시 형태에 있어서, 중쇄는 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.4, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod 또는 7.26.4-mod의 중쇄의 하나 이상의 CDR 영역 유래의 아미노산 서열을 포함한다. 다른 바람직한 실시 형태에 있어서, 중쇄는 상이한 중쇄 유래의 CDR을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 더 바람직한 실시 형태에 있어서, 상이한 중쇄 유래의 CDR은 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod 또는 7.26.4-mod로부터 얻어진다. 다른 바람직한 실시 형태에 있어서, 중쇄는 신호 서열을 포함하거나 포함하지 않는 서열 번호 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42, 46, 52, 56, 60 또는 64의 서열로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 다른 실시 형태에 있어서, 중쇄는 서열 번호 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 29, 33, 37, 41, 45, 51, 55, 59 또는 63의 서열로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열, 또는 1-15개의 아미노산이 삽입, 결실 또는 치환된 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 포함한다. 다른 실시 형태에 있어서, 치환은 보존성 아미노산 치환이다.
항체 생산 세포주 및 항체의 제조 방법
면역화
본 발명의 일 실시 형태에 있어서, 인간 항체는 인간 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 유전자좌 중 일부 또는 이 유전자좌 모두를 포함하는 인간 이외의 동물을 MAdCAM 항원으로 면역화함으로써 제조한다. 바람직한 실시 형태에 있어서, 인간 이외의 동물은 제노마우스(XENOMOUSE)TM 동물로서, 이 동물은 인간 면역글로불린 유전자좌의 큰 단편을 포함하며 생쥐 항체 생산 결함성인 조작된 생쥐 계통이다. 예를 들어 문헌[Green et al., Nature Genetics 7: 13-21(1994)]과 미국 특허 제5,916,771호, 동 제5,939,598호, 동 제5,985,615호, 동 제5,998,209호, 동 제6,075,181호, 동 제6,091,001호, 동 제6,114,598호 및 동 제6,130,364호를 참조한다. 또한, WO 91/10741, WO 94/02602, WO 96/34096 및 WO 96/33735, WO98/16654, WO98/24893, WO98/50433, WO 99/45031, WO 99/53049, WO 00 09560과 WO 00/037504를 참조한다. 제노마우스TM 동물은 성인과 유사한 인간의 완전 인간형 항체 레퍼토리를 생산하며 항원 특이성 인간 mAb를 생성한다. 제2 세대 제노마우스TM 동물은 메가베이스 크기의 도입을 통한 대략 80%의 인간 항체 V 유전자 레퍼토리, κ 경쇄 유전자좌 및 인간 중쇄 유전자좌의 생식 세포 구성의 YAC 단편을 포함한다. 다른 실시 형태에 있어서, 제노마우스TM 생쥐는 대략 모두의 인간 중쇄 및 λ 경쇄 유전자좌를 포함한다. 문헌[Mendez et al., Nature Genetics 15: 146-156 (1997)], 문헌[Green and Jakobovits, J. Exp. Med. 188: 483-495 (1998)]을 참조하는데, 상기 참고 문헌의 개시 사항은 본원에 참고로 포함된다.
본 발명은 인간 면역글로불린 유전자좌를 포함하는 인간 이외의 트랜스제닉 동물을 면역화하는 단계에 의해 인간 이외, 생쥐 이외의 동물 유래의 항-MAdCAM 항체를 제조하는 방법도 제공한다. 그러한 동물은 바로 상기에 기술한 방법을 이용하여 제조할 수 있다. 이러한 문서에 개시되어 있는 방법은 본원에 참고로 포함된 미국 특허 제5,994,619호("'619 특허")에 개시되어 있는 바와 같이 변형시킬 수 있다. '619 특허에는 돼지 및 소로부터 유래되는 신규한 배양 내배엽 세포군(cultured inner cell mass, CICM) 세포 및 세포주와, 이종성 DNA가 삽입된 트랜스제닉 CICM 세포의 제조 방법이 개시되어 있다. CICM 트랜스제닉 세포를 사용하여 클로닝된 트랜스제닉 배아, 태아 및 자식을 생성할 수 있다. '619 특허에는 이종성 DNA를 이의 자손에게 전할 수 있는 트랜스제닉 동물의 제조 방법도 개시되어 있다. 바람직한 실시 형태에 있어서, 인간 이외의 동물은 쥐, 양, 돼지, 염소, 소 또는 말일 수 있다.
다른 실시 형태에 있어서, 인간 면역글로불린 유전자좌를 포함하는 인간 이외의 동물은 인간 면역글로불린의 미니 유전자좌(minlocus)를 갖는 동물이다. 미니 유전자좌 접근법에 있어서, 외인성 Ig 유전자좌는 이 Ig 유전자좌 유래의 개개의 유전자의 포함을 통하여 모방된다. 따라서, 하나 이상의 VH 유전자, 하나 이상의 DH 유전자, 하나 이상의 JH 유전자, μ 불변 도메인(들) 및 제2 불변 도메인(들)(바람직하게는 감마 불변 도메인(들))이 동물 내로의 삽입용 제작물에 형성된다. 이러한 접근법은 특히 본원에 참고로 포함된 미국 특허 제5,545,807호, 동 제5,545,806호, 동 제5,625,126호, 동 제5,633,425호, 동 제5,661,016호, 동 제5,770,429호, 동 제5,789,650호, 동 제5,814,318호, 동 제5,591,669호, 동 제5,612,205호, 동 제5,721,367호, 동 제5,789,215호, 및 동 제5,643,763호에 개시되어 있다.
미니 유전자좌 접근법의 이점은 신속하게 Ig 유전자좌의 일부를 포함하는 제작물이 생성되고 동물 내로 도입될 수 있다는 것이다. 그러나 미니 유전자좌 접근법의 잠재적인 약점은, 완전한 B-세포 발달의 지지를 위한 면역글로불린의 다양성이 충분하지 못할 수 있어서, 항체가 보다 적게 생산될 수 있다는 것이다.
인간 항-MAdCAM 항체의 제조를 위하여, 인간 면역글로불린 유전자좌 중 일부 또는 이들 모두를 포함하는 인간 이외의 동물을 MAdCAM 항원으로 면역화하고 항체 또는 항체 생산주를 이 동물로부터 단리한다. MAdCAM 항원은 단리되고/되거나 정제된 MAdCAM일 수 있으며 바람직하게는 인간 MAdCAM이다. 다른 실시 형태에 있어서, MAdCAM 항원은 MAdCAM의 단편, 바람직하게는 MAdCAM의 세포외 도메인이다. 다른 실시 형태에 있어서, MAdCAM 항원은 MAdCAM의 하나 이상의 에피토프를 포함하는 단편이다. 다른 실시 형태에 있어서, MAdCAM 항원은 MAdCAM을 세포 표면 상에서 발현하는 세포, 바람직하게는 MAdCAM을 세포 표면 상에서 과다 발현하는 세포이다.
동물의 면역화는 당업계에 공지된 임의의 방법으로 행할 수 있다. 예를 들어 문헌[Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press (1990)]을 참조한다. 인간 이외의 동물, 예를 들어 생쥐, 쥐, 양, 염소, 돼지, 소 및 말의 면역화 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어 문헌[Harlow and Lane] 및 미국 특허 제5,994,619호를 참조한다. 바람직한 실시 형태에 있어서, MAdCAM 항원은 면역 반응의 촉진을 위하여 아쥬반트와 함께 투여된다. 그러한 아쥬반트는 완전 또는 불완전 프로인트(Freund) 아쥬반트, RIBI(뮤라밀 디펩티드) 또는 ISCOM(면역자극 복합체)을 포함한다. 그러한 아쥬반트는 폴리펩티드를 국소적 침전물 중에 봉쇄시킴으로써 폴리펩티드가 급속하게 분산되지 않도록 할 수 있거나, 아쥬반트는 숙주를 자극하여 면역계의 대식세포 및 기타 성분에 대하여 주화성인 인자를 분비하게 하는 물질을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 폴리펩티드가 투여되는 경우, 면역화 일정은 수주에 걸쳐 전개되는 2회 이상의 폴리펩티드 투여를 포함한다.
실시예 I에는 제노마우스TM 동물을 포스페이트 완충 염수 중의 전장 인간 MAdCAM으로 면역화하는 프로토콜이 제공되어 있다.
항체 및 항체 생산 세포주의 제조
동물을 MAdCAM으로 면역화한 후, 항체 및/또는 항체 생산 세포를 이 동물로부터 수득할 수 있다. 항-MAdCAM 항체 함유 혈청은, 이 동물을 채혈하거나 희생시킴으로써 이 동물로부터 수득된다. 혈청은 동물로부터 수득되는 그대로 사용될 수 있거나, 면역글로불린 분획이 혈청으로부터 수득될 수 있거나, 항-MAdCAM 항체가 혈청으로부터 정제될 수 있다.
다른 실시 형태에 있어서, 불멸화된 항체 생산 세포주가 면역화된 동물로부터 제조될 수 있다. 면역화 후, 동물을 희생시키고 B 세포를 당업계에 잘 알려진 방법을 이용하여 불멸화한다. 세포의 불멸화 방법은, 세포를 발암 유전자로 트랜스펙션시키는 방법, 세포를 발암성 바이러스로 감염시키고 불멸화 세포를 선발하는 조건 하에 이들을 배양하는 방법, 세포를 발암성 화합물 또는 돌연변이화 화합물에 적용하는 방법, 세포를 불멸화 세포, 예를 들어 골수종 세포와 융합시키는 방법 및 종양 억제 유전자를 불활성화시키는 방법을 포함하지만, 이로 한정되는 것은 아니다. 예를 들어 상기 문헌[Harlow and Lane]을 참조한다. 골수종 세포를 포함하는 실시 형태에 있어서, 골수종 세포는 면역글로불린 폴리펩티드를 분비하지 않는다(비-분비 세포주). 불멸화 및 항생제 선발 후, 불멸화 세포 또는 이의 배양 상청액은 MAdCAM, 이의 일부, 또는 MAdCAM를 발현하는 세포를 사용하여 스크리닝된다. 바람직한 실시 형태에 있어서, 초기 스크리닝은 효소 결합 면역분석법(enzyme-linked immunoassay, ELISA) 또는 방사성 면역분석법(radioimmunoassay, RIA), 바람직하게는 ELISA를 이용하여 수행된다. ELISA 스크리닝의 예가 본원에 참고로 포함된 국제 공보 제WO 00/37504호에 제공되어 있다.
다른 실시 형태에 있어서, 항체 생산 세포는 자가면역 질병에 걸린 인간 또는 항-MAdCAM 항체를 발현하는 인간으로부터 제조될 수 있다. 항-MAdCAM 항체를 발현하는 세포는 백혈구 세포를 단리하고 이들을 형광 활성화 세포 분류(fluorescence-activated cell sorting, FACS)에 처함으로써, 또는 MAdCAM 또는 이의 일부로 코팅된 플레이트 상에서 가려냄으로써(panning) 단리할 수 있다. 이러한 세포는 인간 비분비성 골수종 세포와 융합되어 인간 항-MAdCAM 항체를 발현하는 인간 하이브리도마를 생성할 수 있다. 일반적으로, 이것은 덜 바람직한 실시 형태인데, 이는 항-MAdCAM 항체가 MAdCAM에 대하여 낮은 친화도를 가질 가능성이 있기 때문이다.
하기에서 추가로 논의되어 있는 바와 같이, 항-MAdCAM 항체 생산 세포, 예를 들어 하이브리도마는, 선발되고 클로닝되며 강건한 세포 성장, 높은 항체 생산성 및 바람직한 항체 특징들을 포함하는 바람직한 특징들에 대하여 추가로 스크리닝된다. 하이브리도마는 동계 동물, 면역계가 결여되어 있는 동물, 예를 들어 무모(nude) 생쥐에서 생체내에서, 또는 세포 배양물에서 시험관내에서 배양 및 확장될 수 있다. 하이브리도마를 선발, 클로닝 및 확장하는 방법은 당업계의 숙련자에게 잘 알려져 있다.
바람직하게는 면역화 동물은 인간 면역글로불린 유전자를 발현하는 인간 이외의 동물이며 비장 B 세포는 인간 이외의 동물과 동일한 종으로부터 유래되는 골수종 세포에 융합된다. 더 바람직하게는 면역화 동물은 제노마우스TM 동물이며 골수종 세포주는 비분비성 생쥐 골수종 세포주이며, 예를 들어 골수종 세포주는 P3-X63-AG8-653(ATCC)이다. 예를 들어 실시예 I을 참조한다.
이와 같이, 일 실시 형태에 있어서, 본 발명은 (a) 본원에 기술된 인간 이외의 트랜스제닉 동물을 MAdCAM, MAdCAM의 일부 또는 MAdCAM을 발현하는 세포 또는 조직으로 면역화하는 단계; (b) 상기 트랜스제닉 동물이 MAdCAM에 대한 면역 반응을 유발하도록 하는 단계; (c) 항체 생산 세포를 트랜스제닉 동물로부터 단리하는 단계; (d) 항체 생산 세포를 불멸화하는 단계; (e) 불멸화 항체 생산 세포의 개개의 모노클로날 집단을 생성하는 단계; 및 (f) 불멸화 항체 생산 세포 또는 이의 배양 상청액을 스크리닝하여 MAdCAM에 대한 항체를 동정하는 단계를 포함하는, MAdCAM에 대한 인간 모노클로날 항체 또는 이의 단편을 생산하는 세포주의 제조 방법을 제공한다.
일 태양에 있어서, 본 발명은 인간 항-MAdCAM 항체를 생산하는 하이브리도마를 제공한다. 상기한 바와 같이, 바람직한 실시 형태에 있어서 하이브리도마는 생쥐 하이브리도마이다. 다른 실시 형태에 있어서, 하이브리도마는 인간 이외, 생쥐 이외의 종, 예를 들어 쥐, 양, 돼지, 염소, 소 또는 말에서 생산된다. 다른 실시 형태에 있어서, 하이브리도마는 인간 하이브리도마인데, 여기서, 인간 비분비성 골수종 세포는 항-MAdCAM 항체를 발현하는 인간 세포와 융합된다.
핵산, 벡터, 숙주 세포 및 항체의 재조합적 제조 방법
핵산
본 발명의 항-MAdCAM 항체를 코딩하는 핵산 분자가 제공된다. 일 실시 형태에 있어서, 핵산 분자는 항-MAdCAM 면역글로불린의 중쇄 및/또는 경쇄를 코딩한다. 바람직한 실시 형태에 있어서, 하나의 핵산 분자는 항-MAdCAM 면역글로불린의 중쇄를 코딩하며 다른 핵산 분자는 항-MAdCAM 면역글로불린의 경쇄를 코딩한다. 더 바람직한 실시 형태에 있어서, 코딩된 면역글로불린은 인간 면역글로불린, 바람직하게는 인간 IgG이다. 코딩된 경쇄는 λ쇄 또는 κ쇄, 바람직하게는 κ쇄일 수 있다.
바람직한 실시 형태에 있어서 경쇄의 가변 영역을 코딩하는 핵산 분자는 인간 Vκ인 A2, A3, A26, B3,012 또는 018 유전자의 생식 세포 서열 또는 이 서열의 변이체를 포함한다. 바람직한 실시 형태에 있어서, 경쇄를 코딩하는 핵산 분자는 인간 Jκ1, Jκ2, Jκ3, Jκ4 또는 Jκ5 유전자로부터 유래되는 서열을 포함한다. 바람직한 실시 형태에 있어서, 경쇄를 코딩하는 핵산 분자는 생식 세포 A2, A3, A26, B3, 012 또는 018 Vκ 유전자 유래의 11개 이하의 아미노산 변화, 바람직하게는 6개 이하의 아미노산 변화, 더욱 더 바람직하게는 3개 이하의 아미노산 변화를 코딩한다. 더 바람직한 실시 형태에 있어서, 경쇄를 코딩하는 핵산은 생식 세포의 서열이다.
본 발명은 생식 세포의 서열과 비교하여 최대 11개의 아미노산 변화를 포함하는 경쇄의 가변 영역(VL)을 코딩하는 핵산 분자를 제공하는데, 여기서, 아미노산 변화는 항체 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod 또는 7.26.4-mod 중 하나의 항체의 VL 유래의 생식 세포의 서열 유래의 아미노산 변화와 동일하다. 본 발명은 또한 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod 또는 7.26.4-mod의 경쇄의 가변 영역의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 제공한다. 본 발명은 또한 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod 또는 7.26.4-mod의 경쇄 중 임의의 하나의 경쇄의 CDR 중 하나 이상의 CDR의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 제공한다. 바람직한 실시 형태에 있어서, 본 핵산 분자는 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod 또는 7.26.4-mod의 경쇄 중 임의의 하나의 경쇄의 CDR 모두의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 다른 실시 형태에 있어서, 본 핵산 분자는 서열 번호 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 54, 58, 62, 66, 68 중 하나의 서열 번호의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 서열 번호 3, 7, 11, 15, 19, 23, 27, 31, 35, 39, 43, 47, 53, 57, 61, 65 또는 67 중 하나의 서열 번호의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 다른 바람직한 실시 형태에 있어서, 본 핵산 분자는 서열 번호 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 54, 58, 62, 66, 68의 서열 중 임의의 하나의 서열의 CDR 중 하나 이상의 CDR의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 서열 번호 3, 7, 11, 15, 19, 23, 27, 31, 35, 39, 43, 47, 53, 57, 61, 65 또는 67의 서열 중 임의의 하나의 서열의 CDR 중 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 더 바람직한 실시 형태에 있어서, 본 핵산 분자는 서열 번호 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 54, 58, 62, 66, 68의 서열 중 임의의 하나의 서열의 CDR 모두의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 서열 번호 3, 7, 11, 15, 19, 23, 27, 31, 35, 39, 43, 47, 53, 57, 61, 65 또는 67의 서열 중 임의의 하나의 모든 CDR의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
본 발명은 또한 상기에 기술되어 있는 VL, 특히 서열 번호 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 54, 58, 62, 66 또는 68 중 하나의 서열 번호의 아미노산 서열을 포함하는 VL에 대한 동일성이 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%인 아미노산 서열을 갖는 VL의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 분자를 제공한다. 본 발명은 또한 서열 번호 3, 7, 11, 15, 19, 23, 27, 31, 35, 39, 43, 47, 53, 57, 61, 65 또는 67 중 하나의 서열 번호의 뉴클레오티드 서열에 대한 동일성이 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%인 뉴클레오티드 서열을 제공한다.
다른 실시 형태에 있어서, 본 발명은 매우 엄격한 조건 하에서 상기에 기술되어 있는 VL을 코딩하는 핵산 분자, 특히 서열 번호 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 54, 58, 62, 66 또는 68의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자에 하이브리드화하는 핵산 분자를 제공한다. 본 발명은 또한 매우 엄격한 조건 하에서 서열 번호 3, 7, 11, 15, 19, 23, 27, 31, 35, 39, 43, 47, 53, 57, 61, 65 또는 67 중 하나의 서열 번호의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자에 하이브리드화하는 핵산 분자를 제공한다.
본 발명은 또한 인간 VH 1-18, 3-15, 3-21, 3-23, 3-30, 3-33 또는 4-4 VH 유전자가 이용되는 중쇄 가변 영역(VH)을 코딩하는 핵산 분자를 제공한다. 몇몇 실시 형태에 있어서, VH 유전자를 코딩하는 핵산 분자에서는 인간 JH4 또는 JH6 패밀리 유전자가 또한 이용된다. 몇몇 실시 형태에 있어서, VH 유전자를 코딩하는 핵산 분자에서는 인간 JH4b 또는 JH6b 유전자가 이용된다. 다른 실시 형태에 있어서, 본 핵산 분자는 인간 D 3-10, 4-23, 5-5, 6-6 또는 6-19 유전자로부터 유래되는 서열을 포함한다. 더욱 더 바람직한 실시 형태에 있어서, VH를 코딩하는 핵산 분자는 생식 세포 VH 1-18, 3-15, 3-21, 3-23, 3-30, 3-33 또는 4-4 유전자 유래의 15개 이하의 아미노산 변화, 바람직하게는 6개 이하의 아미노산 변화, 더욱 더 바람직하게는 3개 이하의 아미노산 변화를 포함한다. 매우 바람직한 실시 형태에 있어서, VH를 코딩하는 핵산 분자는 생식 세포의 서열과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 변화를 포함하는데, 여기서, 아미노산 변화는 항체 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod 또는 7.26.4-mod 중 하나의 항체의 중쇄로부터의 생식 세포의 서열 유래의 아미노산 변화와 동일하다. 더욱 더 바람직한 실시 형태에 있어서, VH는 생식 세포의 서열과 비교하여 15개 이하의 아미노산 변화를 포함하는데, 여기서, 이 변화는 항체 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod 또는 7.26.4-mod 중 하나의 항체의 VH로부터의 생식 세포의 서열 유래의 변화와 동일하다.
일 실시 형태에 있어서, 본 핵산 분자는 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod 또는 7.26.4-mod의 VH의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 다른 실시 형태에 있어서, 본 핵산 분자는 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod 또는 7.26.4-mod의 중쇄의 CDR 중 하나 이상의 CDR의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 바람직한 실시 형태에 있어서, 본 핵산 분자는 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod 또는 7.26.4-mod의 중쇄의 모든 CDR의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 다른 바람직한 실시 형태에 있어서, 본 핵산 분자는 서열 번호 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42, 46, 52, 56, 60 또는 64 중 하나의 서열 번호의 아미노산 서열을 코딩하거나 서열 번호 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 29, 33, 37, 41, 45, 51, 55, 59 또는 63 중 하나의 서열 번호의 서열의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 다른 바람직한 실시 형태에 있어서, 본 핵산 분자는 서열 번호 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42, 46, 52, 56, 60 또는 64의 서열 중 임의의 하나의 서열의 CDR 중 하나 이상의 CDR의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 서열 번호 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 29, 33, 37, 41, 45, 51, 55, 59 또는 63의 서열 중 임의의 하나의 서열의 CDR 중 하나 이상의 CDR의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 바람직한 실시 형태에 있어서, 본 핵산 분자는 서열 번호 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42, 46, 52, 56, 60 또는 64의 서열 중 임의의 하나의 서열의 모든 CDR의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 서열 번호 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 29, 33, 37, 41, 45, 51, 55, 59 또는 63의 서열 중 임의의 하나의 서열의 모든 CDR의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 몇몇 실시 형태에 있어서 본 핵산 분자는 전술한 항-MAdCAM 항체 중 임의의 항체의 중쇄 또는 경쇄의 CDR1의 시작 부분부터 CDR3의 끝 부분까지의 인접 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
다른 실시 형태에 있어서, 본 핵산 분자는 바로 위에 기술된 VH를 코딩하는 아미노산 서열 중 하나의 서열, 특히 서열 번호 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42, 46, 52, 56, 60 또는 64 중 하나의 서열 번호의 아미노산 서열을 포함하는 VH와의 동일성이 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%인 VH의 아미노산 서열을 코딩한다. 본 발명은 또한 서열 번호 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 29, 33, 37, 41, 45, 51, 55, 59 또는 63 중 하나의 서열 번호의 뉴클레오티드 서열과의 동일성이 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%인 뉴클레오티드 서열을 제공한다.
다른 실시 형태에 있어서, VH를 코딩하는 핵산 분자는 매우 엄격한 조건 하에서 상기에 기술한 VH를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 특히 서열 번호 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42, 46, 52, 56, 60 또는 64 중 하나의 서열 번호의 아미노산 서열을 포함하는 VH에 하이브리드화하는 것이다. 본 발명은 또한 매우 엄격한 조건 하에서 서열 번호 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 29, 33, 37, 41, 45, 51, 55, 59 또는 63 중 하나의 서열 번호의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자에 하이브리드화하는 VH를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 제공한다.
항-MAdCAM 항체의 전체 중쇄 및 경쇄 또는 이의 가변 영역 중 어느 하나 또는 이들 둘 다를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 항-MAdCAM 항체를 생산하는 임의의 공급원으로부터 수득될 수 있다. 항체를 코딩하는 mRNA의 단리 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)]을 참조한다. mRNA를 사용하여 폴리머라제 연쇄 반응(polymerase chain reaction, PCR) 또는 항체 유전자의 cDNA 클로닝에서 사용하기 위한 cDNA를 생성할 수 있다. 본 발명의 일 실시 형태에 있어서, 핵산 분자는 상기한 바와 같이, 항-MAdCAM 항체를 발현하는 하이브리도마, 바람직하게는 인간 면역글로불린 유전자를 발현하는 트랜스제닉 동물 세포, 예를 들어 제노마우스TM 동물, 인간외 생쥐 트랜스제닉 동물 또는 인간외 생쥐외 트랜스제닉 동물을 융합 상대 중 하나로서 갖는 하이브리도마로부터 수득될 수 있다. 다른 실시 형태에 있어서, 하이브리도마는 인간 이외의 비-트랜스제닉 동물로부터 유래되며, 이는 예를 들어 인간화 항체를 위하여 사용될 수 있다.
항-MAdCAM 항체의 전체 중쇄를 코딩하는 핵산 분자는 중쇄의 전체 가변 도메인 또는 이의 항원 결합 도메인을 코딩하는 핵산 분자를 중쇄의 불변 도메인과 융합시킴으로써 제작할 수 있다. 이와 유사하게, 항-MAdCAM 항체의 경쇄를 코딩하는 핵산 분자는 경쇄의 가변 도메인 또는 이의 항원 결합 도메인을 코딩하는 핵산 분자를 경쇄의 불변 도메인과 융합시킴으로써 제작할 수 있다. VH 및 VL 영역을 코딩하는 핵산 분자는 각각 중쇄 불변 영역 및 경쇄 불변 영역을 이미 코딩하고 있는 발현 벡터 내로 이 핵산 분자들을 삽입하여서, VH 절편이 벡터 내의 중쇄 불변 영역(CH) 절편(들)에 작동되게 결합되고 VL 절편이 벡터 내의 경쇄 불변 영역(CL) 절편에 작동되게 결합되도록 함으로써 전장 항체 유전자로 변환시킬 수 있다. 대안적으로는, VH 또는 VL 사슬을 코딩하는 핵산 분자는, 표준 분자 생물학 기술을 이용하여 VH 사슬을 코딩하는 핵산 분자를 CH 사슬을 코딩하는 핵산 분자에 결합시킴으로써, 예를 들어 결찰함으로써 전장 항체 유전자로 변환시킨다. VL 및 CL 사슬을 코딩하는 핵산 분자를 사용하여 동일한 것이 달성될 수도 있다. 인간 중쇄 및 경쇄 불변 영역 유전자의 서열은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어 문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., NIH Publ. No. 91-3242 (1991)]을 참조한다. 이어서 전장 중쇄 및/또는 경쇄를 코딩하는 핵산 분자는 그들이 도입된 세포로부터 발현될 수 있으며 항-MAdCAM 항체가 단리될 수 있다.
바람직한 실시 형태에 있어서, 중쇄의 가변 영역을 코딩하는 핵산은 서열 번호 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42, 46, 52, 56, 60 또는 64의 아미노산 서열의 가변 영역을 코딩하며, 경쇄의 가변 영역을 코딩하는 핵산 분자는 서열 번호 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 54, 58, 62, 66 또는 68의 아미노산 서열의 가변 영역을 코딩한다.
일 실시 형태에 있어서, 항-MAdCAM 항체의 중쇄 또는 이의 항원 결합성 부분, 또는 항-MAdCAM 항체의 경쇄 또는 이의 항원 결합성 부분 중 어느 하나를 코딩하는 핵산은 인간 면역글로불린 유전자를 발현하며 MAdCAM 항원으로 면역화된 인간외, 생쥐외 동물로부터 단리될 수 있다. 다른 실시 형태에 있어서, 핵산 분자는 항-MAdCAM 항체를 생산하는 비-트랜스제닉 동물 또는 인간 환자로부터 유래되는 항-MAdCAM 항체 생산 세포로부터 단리될 수 있다. 항-MAdCAM 항체 생산 세포 유래의 mRNA는 표준 기술로 단리되고, PCR 및 라이브러리 제작 기술을 이용하여 클로닝 및/또는 증폭되고, 표준 프로토콜을 이용하여 스크리닝되어 항-MAdCAM 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 핵산 분자를 수득할 수 있다.
하기에 기술되어 있는 바와 같이, 본 핵산 분자를 사용하여 다량의 항-MAdCAM 항체를 재조합적으로 발현시킬 수 있다. 하기에 추가로 기술되어 있는 바와 같이, 본 핵산 분자는 또한 키메라 항체, 단일쇄 항체, 면역어드헤신, 다이아바디, 돌연변이 항체 및 항체 유도체의 제조를 위하여 사용될 수 있다. 또한 하기에 기술되어 있는 바와 같이, 핵산 분자가 인간 이외의 비-트랜스제닉 동물로부터 유래되는 경우, 핵산 분자는 항체의 인간화에 사용될 수 있다.
다른 실시 형태에 있어서, 본 발명의 핵산 분자는 특정 항체 서열을 위한 프로브 또는 PCR 프라이머로 사용될 수 있다. 예를 들어 핵산 분자 프로브는 진단 방법에서 사용될 수 있거나, 핵산 분자 PCR 프라이머는 사용될 수 있는 DNA의 영역의 증폭, 특히 항-MAdCAM 항체의 가변 영역의 제조에서 사용하기 위한 뉴클레오티드 서열의 단리를 위하여 사용될 수 있다. 바람직한 실시 형태에 있어서, 본 핵산 분자는 올리고뉴클레오티드이다. 더 바람직한 실시 형태에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 목적 항체의 중쇄 및 경쇄의 매우 가변성인 영역으로부터 유래된다. 더욱 더 바람직한 실시 형태에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 CDR의 모두 또는 일부를 코딩한다.
벡터
본 발명은 중쇄 또는 이의 항원 결합성 부분을 코딩하는 본 발명의 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공한다. 본 발명은 또한 경쇄 또는 이의 항원 결합성 부분을 코딩하는 본 발명의 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공한다. 본 발명은 또한 융합 단백질, 변형 항체, 항체 단편 및 이의 프로브를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공한다.
본 발명의 항체 또는 항체의 일부의 발현을 위하여, 상기와 같이 수득되는 부분적 또는 전장의 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 DNA는 발현 벡터 내로 삽입되어 이 유전자가 전사 및 번역 제어 서열에 작동되도록 결합되게 한다. 발현 벡터는 플라스미드, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스(AAV), 식물 바이러스, 예를 들어 콜리플라워 모자이크 바이러스, 담배 모자이크 바이러스, 코스미드, YAC, EBV 유래 에피좀 등을 포함한다. 항체의 유전자는 벡터 내의 전사 및 번역 제어 서열이 항체 유전자의 전사 및 번역을 조절하는 이의 의도된 기능을 하도록 벡터 내로 결찰된다. 발현 벡터 및 발현 제어 서열은 사용되는 발현용 숙주 세포와 상용성이도록 선택된다. 항체 경쇄 유전자 및 항체 중쇄 유전자는 개별적인 벡터 내로 삽입될 수 있다. 바람직한 실시 형태에 있어서, 이 유전자 둘 다는 동일한 발현 벡터 내로 삽입된다. 항체 유전자는 표준 방법(예를 들어, 항체 유전자의 단편 및 벡터 상에서의 상보성 제한 효소 부위의 결찰, 또는 제한 효소 부위가 전혀 존재하지 않을 경우 평활(blunt) 말단 결찰)에 의해 발현 벡터 내로 삽입된다.
편리한 벡터로는, 기능적으로 완전한 인간 CH 또는 CL 면역글로불린 서열을 코딩하며, 상기한 바와 같이 임의의 VH 또는 VL 서열이 용이하게 삽입 및 발현될 수 있도록 적절한 제한 효소 부위가 조작된 것이 있다. 그러한 벡터에 있어서, 스플라이싱은 일반적으로 삽입된 J 영역 중의 스플라이스 공여 부위와 인간 C 영역 앞의 스플라이스 수용 부위 사이에서, 그리고 또한 인간 CH 엑손 내에 나타나는 스플라이스 영역에서 일어난다. 폴리아데닐화 및 전사 종결은 코딩 영역의 하류의 천연 염색체 부위에서 일어난다. 재조합 발현 벡터는 숙주 세포로부터의 항체 사슬의 분비를 용이하게 하는 신호 펩티드도 코딩할 수 있다. 항체 사슬 유전자는 신호 펩티드가 항체 사슬 유전자의 아미노 말단에 프레임에 맞게(in-frame) 결합되도록 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 신호 펩티드는 면역글로불린 신호 펩티드 또는 이종성 신호 펩티드(즉, 비-면역글로불린 단백질 유래의 신호 펩티드)일 수 있다.
항체 사슬 유전자 외에도, 본 발명의 재조합 발현 벡터는 숙주 세포에서의 항체 사슬 유전자의 발현을 제어하는 조절 서열을 지닌다. 당업계의 숙련자라면 조절 서열의 선택을 포함하는 발현 벡터의 고안이 형절전환시킬 숙주 세포, 원하는 단백질의 발현 수준 등과 같은 인자에 따라 달라질 수 있음을 알 것이다. 포유류 숙주 세포 발현에 바람직한 조절 서열은 포유류 세포에서의 고수준의 단백질 발현을 지시하는 바이러스 요소, 예를 들어 레트로바이러스 LTR로부터 유래되는 프로모터 및/또는 인핸서, 사이토메갈로바이러스(CMV)(예를 들어 CMV 프로모터/인핸서), 시미안(Simian) 바이러스 40(SV40)(예를 들어 SV40 프로모터/인핸서), 아데노바이러스(예를 들어 아데노바이러스 주요 후기 프로모터(AdMLP)), 폴리오마(polyoma) 및 강력 포유류 프로모터, 예를 들어 천연 면역글로불린 프로모터 및 액틴 프로모터를 포함한다. 바이러스 조절 요소 및 이의 서열에 대한 추가의 설명에 대해서는 예를 들어 미국 특허 제5,168,062호, 동 제4,510,245호 및 동 제4,968,615호를 참조하는데, 상기 특허 각각은 본원에 참고로 포함된다. 프로모터 및 벡터에 대한 설명을 포함하는 식물에서의 항체의 발현 방법과, 식물의 형질 전환 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어 미국 특허 제6,517,529호를 참조한다. 박테리아 세포 또는 진균류 세포, 예를 들어 효모 세포에서의 폴리펩티드의 발현 방법도 당업계에 잘 알려져 있다.
항체 사슬 유전자 및 조절 서열 외에도, 본 발명의 재조합 발현 벡터는 추가의 서열, 예를 들어 숙주 세포에서의 벡터의 복제를 조절하는 서열(예를 들어 복제 원점) 및 선별 마커 유전자를 지닐 수 있다. 선별 마커의 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포의 선별을 용이하게 한다(예를 들어 미국 특허 제4,399,216호, 동 제4,634,665호 및 동 제5,179,017호 참조). 예를 들어, 전형적으로 선별 마커 유전자는 약물, 예를 들어 G418, 하이그로마이신 또는 메토트렉세이트에 대한 내성을 벡터가 도입된 숙주 세포에 부여한다. 바람직한 선별 마커 유전자는 디히드로폴레이트 리덕타제(DHFR) 유전자(메토트렉세이트 선발/증폭을 이용하여 dhfr- 숙주 세포에서 사용하기 위한 것임) 및 neo 유전자(G418 선발용)와, 글루타메이트 신테타제 유전자를 포함한다.
하이브리도마 외(non- hybridoma ) 숙주 세포 및 단백질의 재조합적 제조 방법
항-MAdCAM 항체의 중쇄 또는 이의 항원 결합성 부분 및/또는 경쇄 또는 이의 항원 결합성 부분을 코딩하는 핵산 분자와, 이 핵산 분자를 포함하는 벡터는 적합한 포유류 식물, 박테리아 또는 효모 숙주 세포의 형질 전환에 사용할 수 있다. 형질 전환은 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포 내로 도입하는 임의의 공지된 방법에 의한 것일 수 있다. 이종성 폴리뉴클레오티드의 포유류 세포 내로의 도입 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 덱스트란-매개 트랜스펙션, 인산칼슘 침전법, 폴리브렌-매개 트랜스펙션, 원형질체 융합법, 전기 천공법, 리포좀 중의 폴리뉴클레오티드(들)의 캡슐화법, 생탄도(biolistic) 주입법 및 DNA의 핵 내로의 직접적 미세 주입법을 포함한다. 또한, 핵산 분자는 바이러스 벡터에 의해 포유류 세포 내로 도입될 수 있다. 세포의 형질 전환 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어 미국 특허 제4,399,216호, 동 제4,912,040호, 동 제4,740,461호, 및 동 제4,959,455호(상기 특허는 본원에 참고로 포함됨)를 참조한다. 식물 세포의 형질 전환 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 이는 예를 들어 아그로박테리움(Agrobacterium)-매개 형질 전환, 생탄도 형질 전환, 직접 주입, 전기 천공 및 바이러스 형질 전환을 포함한다. 박테리아 및 효모 세포의 형질 전환 방법도 당업계에 잘 알려져 있다.
발현에 있어서 숙주로서 이용가능한 포유류 세포주는 당업계에 잘 알려져 있으며, 미국 표준 균주 보존 기관(American Type CμLture Collection, ATCC)으로부터 입수 가능한 다수의 불멸화 세포주를 포함한다. 이들은 특히 중국 햄스터 난소(Chinese hamster ovary, CHO) 세포, NSO, SP2 세포, HEK-293T 세포, NIH-3T3 세포, HeLa 세포, 새끼 햄스터 신장(baby hamster kidney, BHK) 세포, 원숭이 신장 세포(COS), 인간 간세포 암종 세포(예를 들어 Hep G2), A549 세포, 3T3 세포 및 다수의 기타 세포주를 포함한다. 포유류 숙주 세포는 인간, 생쥐, 쥐, 개, 원숭이, 돼지, 염소, 소과, 말 및 햄스터의 세포를 포함한다. 특히 바람직한 세포주는 어느 세포주가 높은 발현 수준을 갖는지를 결정하는 것을 통하여 선택된다. 사용될 수 있는 다른 세포주로는 곤충 세포주, 예를 들어 Sf9 세포, 양서류 세포, 박테리아 세포, 식물 세포 및 진균류 세포가 있다. 본 중쇄 또는 이의 항원 결합성 부분, 경쇄 및/또는 이의 항원 결합성 부분을 코딩하는 재조합 발현 벡터가 포유류 숙주 세포 내로 도입될 경우, 항체는 숙주 세포를 숙주 세포에서 항체가 발현되게 하기에 충분한 기간 동안, 또는 바람직하게는 숙주 세포가 배양되는 배양 배지 내로 항체가 분비되게 하기에 충분한 기간 동안 숙주 세포를 배양함으로써 제조된다. 항체는 표준 단백질 정제 방법을 사용하여 배양 배지로부터 회수될 수 있다. 식물 숙주 세포는 예를 들어 니코티아나(Nicotiana), 아라비돕시스(Arabidopsis), 좀개구리밥속의 수초(duckweed), 옥수수, 밀, 감자 등을 포함한다. 박테리아 숙주 세포는 이. 콜라이(E. coli) 및 스트렙토마이세스(Streptomyces) 종을 포함한다. 효모 숙주 세포는 시조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae) 및 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)를 포함한다.
또한, 생산용 세포주로부터의 본 발명의 항체(또는 그로부터 유래된 다른 부분)의 발현은 다수의 공지된 기술을 사용하여 증강시킬 수 있다. 예를 들어 글루타민 신테타제 유전자 발현 시스템(GS 시스템)이 소정 조건 하에서의 발현 증강에 있어서의 통상적인 접근법이다. GS 시스템은 유럽 특허 제0 216 846호, 동 제0 256 055호, 동 제0 338 841호 및 동 제0 323 997호와 관련하여 전체적으로 또는 부분적으로 논의된다.
상이한 세포주에 의해 또는 트랜스제닉 동물에서 발현되는 항체는 서로 다른 글리코실화를 가질 가능성이 있다. 그러나, 본원에 제공된 핵산 분자에 의해 코딩되거나, 본원에 제공된 아미노산 서열을 포함하는 모든 항체는 항체의 글리코실화와 상관 없이 본 발명의 일부이다.
트랜스제닉 동물 및 식물
본 발명은 본 발명의 항체의 생산을 위하여 사용될 수 있는 본 발명의 하나 이상의 핵산 분자를 포함하는 인간 이외의 트랜스제닉 동물 및 트랜스제닉 식물도 제공한다. 항체는 양, 소, 말, 돼지, 쥐, 생쥐, 토끼, 햄스터 또는 기타 포유류의 밀크, 혈액 또는 소변과 같은 체액 또는 조직에서 생산되며 이 조직 또는 체액으로부터 회수될 수 있다. 예를 들어 미국 특허 제5,827,690호, 동 제5,756,687호, 동 제5,750,172호, 및 동 제5,741,957호를 참조한다. 상기에 기술되어 있는 바와 같이, 인간 면역글로불린 유전자좌를 포함하는 인간 이외의 트랜스제닉 동물은 MAdCAM 또는 이의 일부로 면역화될 수 있다. 식물에서의 항체의 제조 방법은 예를 들어 본원에 참고로 포함된 미국 특허 제6,046,037호 및 동 제5,959,177호에 개시되어 있다.
다른 실시 형태에 있어서, 인간 이외의 트랜스제닉 동물과 트랜스제닉 식물은 표준 트랜스제닉 기술에 의해 본 발명의 하나 이상의 핵산 분자를 동물 또는 식물 내로 도입함으로써 제조된다. 문헌[Hogan, supra]을 참조한다. 트랜스제닉 동물의 제조에 사용되는 트랜스제닉 세포는 배아 줄기 세포, 체세포 또는 수정란 세포일 수 있다. 인간 이외의 트랜스제닉 유기체는 키메라, 비키메라 헤테로 접합체 및 비키메라 호모 집합체일 수 있다. 예를 들어 문헌[Hogan et al. "Manipulating the Mouse Eynbryo: A Laboratory Manual 2ed., Cold Spring Harbor Press (1999)]; 문헌[Jackson et al., Mouse Genetics and Transgenics: A Practical Approach, Oxford University Press (2000)]; 및 문헌[Pinkert, Transgenic Animal Technology: A Laboratory Handbook, Academic Press (1999)]을 참조한다. 다른 실시 형태에 있어서, 인간 이외의 트랜스제닉 유기체는 목적으로 하는 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 표적화된 파괴 및 치환을 가질 수 있다. 바람직한 실시 형태에 있어서, 트랜스제닉 동물 또는 식물은 조합되어 MAdCAM, 바람직하게는 인간 MAdCAM에 특이적으로 결합하는 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 핵산 분자를 포함하고 발현한다. 다른 실시 형태에 있어서, 트랜스제닉 동물 또는 식물은 단일쇄 항체, 키메라 항체 또는 인간화 항체와 같은 변형된 항체를 코딩하는 핵산 분자를 포함한다. 항-MAdCAM 항체는 임의의 트랜스제닉 동물에서 제조될 수 있다. 바람직한 실시 형태에 있어서, 인간 이외의 동물로는 생쥐, 쥐, 양, 돼지, 염소, 소 또는 말이 있다. 인간 이외의 트랜스제닉 동물은 상기 코딩된 폴리펩티드를 혈액, 밀크, 소변, 타액, 눈물, 점액 및 기타 체액에서 발현한다.
파지 디스플레이 라이브러리
본 발명은 인간 항체 라이브러리를 파지 상에서 합성하는 단계, MAdCAM 또는 이의 일부를 포함하는 라이브러리를 스크리닝하는 단계, MAdCAM에 결합하는 파지를 단리하는 단계 및 항체를 파지로부터 수득하는 단계를 포함하는 항-MAdCAM 항체 또는 이의 항원 결합성 부분의 제조 방법을 제공한다. 항체 라이브러리를 제조하는 한 가지 방법은 인간 면역글로불린 유전자좌를 포함하는 인간 이외의 숙주 동물을 MAdCAM 또는 이의 항원성 부분으로 면역화하여 면역 반응을 생성하는 단계, 항체 생산에 책임이 있는 세포를 숙주 동물로부터 추출하는 단계, RNA를 추출된 세포로부터 단리하는 단계, RNA를 역전사하여 cDNA를 생성하는 단계, 이 cDNA를 프라이머를 사용하여 증폭시키는 단계, 및 항체가 파지 상에서 발현되도록 cDNA를 파지 디스플레이 벡터 내로 삽입하는 단계를 포함한다. 본 발명의 재조합 항-MAdCAM 항체는 이러한 방식으로 수득될 수 있다.
본원에 개시되어 있는 항-MAdCAM 항체 외에도 본 발명의 재조합 항-MAdCAM 인간 항체는 인간 림프구로부터 단리되는 mRNA로부터 제조되는 인간 VL 및 VH cDNA를 사용하여 제조되는 재조합적 조합(combinatorial) 항체 라이브러리, 바람직하게는 scFv 파지 디스플레이 라이브러리의 스크리닝에 의해 단리될 수 있다. 그러한 라이브러리의 제조 및 스크리닝 방법은 당업계에 공지되어 있다. 파지 디스플레이 라이브러리를 생성하기 위한 구매가능한 키트가 존재한다(예를 들어 Pharmacia 재조합 파지 항체 시스템, 카탈로그 번호 27-9400-01; 및 Stratagene SurfZAPTM 파지 디스플레이 키트, 카탈로그 번호 240612). 항체 디스플레이 라이브러리의 생성 및 스크리닝에 사용될 수 있는 기타 방법 및 시약도 존재한다(예를 들어 미국 특허 제5,223,409호; 국제 공보 제WO 92/18619호; 국제 공보 제WO91/17271호; 국제 공보 제WO 92/20791호; 국제 공보 제WO 92/15679호; 국제 공보 제WO93/01288호; 국제 공보 제WO 92/01047호; 국제 공보 제WO 92/09690호; 문헌[Fuchs et al. (1991), Biotechnology, 9: 1369-1372]; 문헌[Hay et al., Hum. Antibod. Hybridomas, 3: 81-85 (1992)]; 문헌[Huse et al., Science, 246: 1275-1281 (1989)]; 문헌[McCafferty et al., Nature, 348: 552-554 (1990)]; 문헌[Griffiths et al., EMBOJ, 12: 725-734 (1993)]; 문헌[Hawkins et al., J. Mol. Biol., 226: 889-896 (1992)]; 문헌[Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991)]; 문헌[Gram et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 3576-3580 (1992)]; 문헌[Garrad et al., Biotechnology, 9: 1373-1377 (1991)]; 문헌[Hoogenboom et al., Nuc Acid Res, 19: 4133-4137 (1991)]; 및 문헌[Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 7978-7982 (1991)]을 참조).
바람직한 실시 형태에 있어서, 원하는 특징을 갖는 인간 항-MAdCAM 항체의 단리를 위하여, 먼저 Hoogenboom 등의 국제 공보 제WO 93/06213호에 개시되어 있는 에피토프 각인(imprinting) 방법을 이용하여 본원에 기술된 인간 항-MAdCAM 항체를 사용하여 MAdCAM에 대한 결합 활성이 유사한 인간 중쇄 및 경쇄 서열들을 선발한다. 이 방법에서 사용되는 항체 라이브러리는 McCafferty 등의 국제 공보 제WO 92/01047호, 문헌[McCafferty et al., Nature, 348: 552-554 (1990)]; 및 문헌[Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993)]에 기술되어 있는 바와 같이 제조 및 스크리닝되는 scFv 라이브러리인 것이 바람직하다. scFv 항체 라이브러리는 바람직하게는 인간 MAdCAM을 항원으로 사용하여 스크리닝된다.
일단 처음의 인간 VL 및 VH 절편이 선발되면, 처음으로 선발된 VL 및 VH 절편의 상이한 쌍들이 MAdCAM 결합에 대하여 스크리닝되는 "혼합 및 매치" 실험을 수행하여 바람직한 VL/VH 쌍 조합을 선발한다. 추가로, 항체의 품질의 추가의 개선을 위하여, 바람직한 VL/VH 쌍(들)의 VL 및 VH 절편을 바람직하게는 VH 및/또는 VL의 CDR3 영역 내에서, 천연 면역 반응 동안 항체의 친화성 성숙에 책임이 있는 생체내 체세포 돌연변이 과정과 유사한 공정으로 무작위로 돌연변이시킬 수 있다. 이러한 시험관내 친화성 성숙은 각각 VH CDR3 또는 VL CDR3에 상보성인 PCR 프라이머를 사용하여 VH 및 VL 영역을 증폭시킴으로써 성취될 수 있는데, 상기 프라이머는 소정 위치에서 4개의 뉴클레오티드 염기의 랜덤 혼합물로 "스파이크되어(spiked)" 생성되는 PCR 생성물이 랜덤 돌연변이가 VH 및/또는 VL CDR3 영역 내로 도입된 VH 및 VL 절편을 코딩하도록 한다. 이러한 랜덤 돌연변이된 VH 및 VL 절편은 MAdCAM에의 결합에 대하여 재스크리닝될 수 있다.
재조합 면역글로불린 디스플레이 라이브러리로부터의 본 발명의 항-MAdCAM 항체의 스크리닝 및 단리에 이어, 선발된 항체를 코딩하는 핵산이 디스플레이 패키지(예를 들어 파지 게놈 유래의 것)로부터 회수되고 표준 재조합 DNA 기술에 의해 다른 발현 벡터 내로 서브클로닝될 수 있다. 하기에 기술되어 있는 바와 같이, 원할 경우, 핵산은 본 발명의 다른 항체 형태의 생성을 위하여 추가로 조작될 수 있다. 상기에 기술되어 있는 바와 같이, 조합 라이브러리의 스크리닝에 의해 단리되는 재조합 인간 항체의 발현을 위하여, 항체를 코딩하는 DNA는 재조합 발현 벡터 내로 클로닝되고 포유류 숙주 세포 내로 도입된다.
클래스 스위칭(class switching)
본 발명의 다른 태양은 항-MAdCAM 항체 클래스가 다른 것으로 스위칭될 수 있는 기전을 제공하는 것이다. 본 발명의 일 태양에 있어서, VL 또는 VH를 코딩하는 핵산 분자는 CL 또는 CH를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하지 않도록 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 단리된다. 이어서 VL 또는 VH를 코딩하는 핵산 분자는 상이한 면역글로불린 분자 클래스 유래의 CL 또는 CH를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동되게 결합된다. 이는, 상기에 기술되어 있는 바와 같이 CL 또는 CH 코딩 서열을 포함하는 벡터 또는 핵산 분자를 사용하여 성취될 수 있다. 예를 들어 원래 IgM이었던 항-MAdCAM 항체는 IgG로 클래스 스위칭될 수 있다. 또한, 클래스 스위칭을 이용하여 하나의 IgG 아류를 다른 것으로, 예를 들어 IgG4에서 IgG2로 변환시킬 수 있다. 원하는 이소타입 또는 항체 아류를 포함하는 본 발명의 항체의 바람직한 제조 방법은 항-MAdCAM 항체의 중쇄를 코딩하는 핵산 및 항-MAdCAM 항체의 경쇄를 코딩하는 핵산을 단리하는 단계, 중쇄 가변 영역을 수득하는 단계, 중쇄 가변 영역을 원하는 이소타입의 중쇄 불변 도메인과 결찰시키는 단계, 경쇄 및 결찰된 중쇄를 세포에서 발현시키는 단계, 및 원하는 이소타입을 갖는 항-MAdCAM 항체를 수집하는 단계를 포함한다.
항체 유도체
당업계의 숙련자에게 공지된 기술 및 방법을 이용하여 상기에 기술된 핵산 분자를 사용하여 항체 유도체를 생성할 수 있다.
인간화 항체
비-인간 항체의 면역원성은 인간화 기술을 사용하여, 잠재적으로는 적절한 라이브러리를 사용한 디스플레이 기술을 이용하여 어느 정도 감소시킬 수 있다. 쥐과 항체 또는 다른 종 유래의 항체는 당업계에 잘 알려진 기술을 사용하여 인간화하거나 영장류화할 수 있다는 것을 알 것이다. 예를 들어 문헌[Winter and Harris, Immunol Today, 14: 43-46 (1993)] 및 문헌[Wright et al., Crit. Reviews in Immunol., 12125-168 (1992)]을 참조한다. 목적 항체는 재조합 DNA 기술로 조작하여 CH1, CH2, CH3, 경첩 도메인 및/또는 골격 도메인을 상응하는 인간 서열로 치환할 수 있다(WO 92/02190 및 미국 특허 제5,530,101호, 동 제5,585,089호, 동 제5,693,761호, 동 제5,693,792호, 동 제5,714,350호 및 동 제5,777,085호 참조). 다른 실시 형태에 있어서, 비-인간 항-MAdCAM 항체는 CH1, 경첩 도메인, CH2, CH3, 및/또는 골격 도메인을 본 발명의 항-MAdCAM 항체의 상응하는 인간 서열로 치환함으로써 인간화할 수 있다.
돌연변이된 항체
다른 실시 형태에 있어서, 본 핵산 분자, 벡터 및 숙주 세포를 사용하여 돌연변이된 항-MAdCAM 항체를 제조할 수 있다. 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 가변 도메인에서 돌연변이되어 항체의 결합 특성이 변경될 수 있다. 예를 들어 돌연변이는 CDR 영역들 중 하나 이상의 영역에서 행해져 MAdCAM에 대한 항체의 Kd가 증가 또는 감소될 수 있다. 특정 부위 돌연변이 유발 기술은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어 Sambrook 등의 상기 문헌과 Ausubel 등의 상기 문헌을 참조한다. 바람직한 실시 형태에 있어서, 돌연변이는 항-MAdCAM 항체의 가변 영역에 있어서 생식 세포에 비하여 변화되는 것으로 공지되어 있는 아미노산 잔기에서 행해진다. 더 바람직한 실시 형태에 있어서, 하나 이상의 돌연변이가 항-MAdCAM 항체 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod 또는 7.26.4-mod 중 하나의 항체의 가변 영역 또는 CDR 영역에 있어서 생식 세포에 비하여 변화되는 것으로 공지된 아미노산 잔기에서 행해진다. 다른 실시 형태에 있어서, 하나 이상의 돌연변이는 아미노산 서열이 서열 번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 52, 54, 56, 58, 62, 64, 66 또는 68에 나타내어져 있거나, 뉴클레오티드 서열이 서열 번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 51, 53, 55, 57, 61, 63, 65 또는 67에 제시된 CDR 영역 또는 가변 영역에 있어서 생식 세포에 비하여 변화되는 것으로 공지된 아미노산 잔기에서 행해진다. 다른 실시 형태에 있어서, 핵산 분자는 하나 이상의 골격 영역에서 돌연변이된다. 돌연변이는 골격 영역 또는 불변 도메인에서 행해져 항-MAdCAM 항체의 반감기를 증가시킬 수 있다. 예를 들어 본원에 참고로 포함되어 있으며 2000년 2월 24일자로 공개된 국제 공보 제WO 00/09560호를 참조한다. 일 실시 형태에 있어서, 1개, 3개 또는 5개 또는 10개의 점 돌연변이 및 15개 이하의 점 돌연변이가 존재할 수 있다. 골격 영역 또는 불변 도메인 중의 돌연변이가 또한 행해져 항체의 면역원성을 변경시켜 다른 분자에의 공유 결합 또는 비공유 결합 부위를 제공하거나 보체 고정과 같은 특성을 변경시킬 수 있다. 돌연변이는 단일 돌연변이 항체에서 골격 영역, 불변 도메인 및 가변 영역 각각에서 행해질 수 있다. 대안적으로는, 단일 돌연변이 항체에서 골격 영역, 가변 영역 또는 불변 도메인 중 하나에서만 행해질 수 있다.
일 실시 형태에 있어서, 돌연변이 이전의 항-MAdCAM 항체에 비하여 돌연변이된 항-MAdCAM 항체의 VH 또는 VL 영역 중 하나에서 15개 이하의 아미노산의 변화가 존재한다. 더 바람직한 실시 형태에 있어서, 돌연변이된 항-MAdCAM 항체의 VH 또는 VL 영역 중 하나에서 10개 이하의 아미노산의 변화, 더 바람직하게는 5개 이하의 아미노산의 변화, 또는 더욱 더 바람직하게는 3개 이하의 아미노산의 변화가 존재한다. 다른 실시 형태에 있어서, 불변 도메인에는 15개 이하의 아미노산의 변화, 더 바람직하게는 10개 이하의 아미노산 변화, 더욱 더 바람직하게는 5개 이하의 아미노산 변화가 존재한다.
변형된 항체
다른 실시 형태에 있어서, 다른 폴리펩티드에 결합된 모두 또는 일부의 항-MAdCAM 항체를 포함하는 융합 항체 또는 면역어드헤신이 제조될 수 있다. 바람직한 실시 형태에 있어서, 항-MAdCAM 항체의 가변 영역만이 폴리펩티드에 결합된다. 다른 바람직한 실시 형태에 있어서, 항-MAdCAM 항체의 VH 도메인은 제1 폴리펩티드에 결합되는 반면, 항-MAdCAM 항체의 VL 도메인은 VH 및 VL 도메인이 서로 상호 작용하여 항체 결합 부위를 형성할 수 있는 방식으로 제1 폴리펩티드와 결부되는 제2 폴리펩티드에 결합된다. 다른 바람직한 실시 형태에 있어서, VH 도메인은 VH 및 VL 도메인이 서로 상호 작용할 수 있도록 링커에 의해 VL 도메인으로부터 분리된다(하기의 단일쇄 항체 표제 하의 것을 참조). 이어서 VH-링커-VL 항체는 목적 폴리펩티드에 결합된다. 융합 항체는 MAdCAM-발현 세포 또는 조직으로 폴리펩티드를 인도하는 데에 유용하다. 폴리펩티드는 치료제, 예를 들어 독소, 성장 인자 또는 기타 조절 단백질일 수 있거나, 진단제, 예를 들어 용이하게 가시화될 수 있는 효소, 예를 들어 서양 고추냉이 퍼옥시다제일 수 있다. 또한, 2종(또는 그 이상)의 단일쇄 항체가 서로에게 결합된 융합 단백질이 생성될 수 있다. 이는, 단일 폴리펩티드 사슬 상에서의 이가 또는 다가 항체의 생성을 원할 경우나, 이중 특이성 항체를 생성하기를 원할 경우 유용하다.
단일쇄 항체(scFv)의 생성을 위해서는, VH-코딩 및 VL-코딩 DNA 단편을 가요성 링커를 코딩하는, 예를 들어 아미노산 서열(Gly4-Ser)3을 코딩하는 다른 단편에 작동되게 결합시켜서, VH 및 VL 서열이 인접 단일쇄 단백질로서 발현될 수 있게 하는데, VL 및 VH 영역은 가요성 링커에 의해 결합된다(예를 들어 문헌[Bird et al., Science, 242: 423-426 (1988)]; 문헌[Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 5879-5883 (1988)]; 문헌[McCafferty et al., Nature, 348: 552-554 (1990)] 참조). 단일쇄 항체는, 단일한 VH 및 VL만이 사용될 경우 일가, 2개의 VH 및 VL이 사용될 경우 이가, 또는 2개보다 많은 VH 및 VL이 사용될 경우 다가일 수 있다.
다른 실시 형태에 있어서, 다른 변형된 항체가 항-MAdCAM-코딩 핵산 분자를 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어 "카파체(Kappa bodies)"(문헌[Ill et al., Protein Eng, 10: 949-57 (1997)]), "미니바디(Minibodies)"(문헌[Martin et al., EMBO J, 13: 5303-9 (1994)]), "다이아바디"(문헌[Holliger et al., PNAS USA, 90: 6444-6448 (1993)]), 또는 "야누신(Janusins)"(문헌[Traunecker et al., EMBO J, 10: 3655-3659 (1991)] 및 문헌[Traunecker et al. ,"Janusin: new molecular design for bispecific reagents," Int J Cancer Suppl, 7: 51-52 (1992)])은 표준 분자 생물학 기술을 이용하여 본 명세서의 교시에 따라 제조될 수 있다.
다른 태양에 있어서, 키메라 항체 및 이중 특이성 항체가 제조될 수 있다. 상이한 항체 유래의 골격 영역 및 CDR을 포함하는 키메라 항체가 제조될 수 있다. 바람직한 실시 형태에 있어서, 키메라 항체의 CDR은 인간 항-MAdCAM 항체의 경쇄 또는 중쇄의 가변 영역의 모든 CDR을 포함하는 반면, 골격 영역은 하나 이상의 상이한 항체로부터 유래된다. 더 바람직한 실시 형태에 있어서, 키메라 항체의 CDR은 인간 항-MAdCAM 항체의 경쇄 및 중쇄의 가변 영역의 모든 CDR을 포함한다. 골격 영역은 다른 종 유래의 것일 수 있으며, 바람직한 실시 형태에 있어서 인간화될 수 있다. 대안적으로는, 골격 영역은 다른 인간 항체 유래의 것일 수 있다.
하나의 결합 도메인을 통하여 MAdCAM에, 그리고 제2 결합 도메인을 통하여 제2 분자에 특이적으로 결합하는 이중 특이성 항체가 생성될 수 있다. 이중 특이성 항체는 재조합 분자 생물학 기술을 통하여 제조될 수 있거나, 물리적으로 함께 콘쥬게이션될 수도 있다. 또한, MAdCAM 및 다른 분자에 특이적으로 결합하며 하나보다 많은 VH 및 VL을 포함하는 단일쇄 항체가 생성될 수 있다. 그러한 이중 특이성 항체는 잘 알려진 기술을 사용하여 생성될 수 있는데, (i) 및 (ii)와 관련해서는 예를 들어 문헌[Fanger et al., Immunol Methods 4: 72-81 (1994)] 및 문헌[Wright and Harris, supra.]을 참조하며 (iii)과 관련해서는 예를 들어 문헌[Traunecker et al., Int. J. Cancer (Suppl.) 7: 51-52 (1992)]을 참조한다. 바람직한 실시 형태에 있어서, 이중 특이성 항체는 MAdCAM 및 내피 세포 상에서 고수준으로 발현되는 다른 분자에 결합한다. 더 바람직한 실시 형태에 있어서, 이 다른 분자는 VCAM, ICAM 또는 L-셀렉틴이다.
다양한 실시 형태에 있어서, 상기의 변형 항체는 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod 또는 7.26.4-mod로부터 선택되는 항체 중 하나의 항체 유래의 하나 이상의 CDR 영역 또는 가변 영역 중 하나 이상의 영역을 사용하여 제조된다. 다른 실시 형태에 있어서, 변형 항체는 아미노산 서열이 서열 번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 52, 54, 56, 58, 62, 64, 66 또는 68에 나타내어져 있거나 뉴클레오티드 서열이 서열 번호 1,3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 51, 53, 55, 57, 61, 63, 65 또는 67에 제시된 하나 이상의 CDR 영역 또는 가변 영역 중 하나 이상의 영역을 사용하여 제조된다.
유도체화 및 표지된 항체
본 발명의 항체 또는 항체의 일부는 유도체화되거나 다른 분자(예를 들어 다른 펩티드 또는 단백질)에 결합된다. 일반적으로 항체 또는 이의 일부는 MAdCAM 결합이 유도체화 또는 표지에 의해 악영향을 받지 않도록 유도체화된다. 따라서, 본 발명의 항체 또는 항체의 일부는 본원에 기술된 인간 항-MAdCAM 항체의 완전한 형태 및 변형된 형태 둘 다를 포함하려는 것이다. 예를 들어 본 발명의 항체 또는 항체의 일부는 하나 이상의 다른 분자적 실체, 예를 들어 다른 항체(예를 들어 이중 특이성 항체 또는 다이아바디), 검출제, 세포 독성제, 제약 제제, 및/또는 항체 또는 항체의 일부의 다른 분자(예를 들어 스트렙타비딘 코어 영역 또는 폴리히스티딘 태그)와의 결부를 매개할 수 있는 단백질 또는 펩티드에 화학적 커플링, 유전자 융합, 비공유 결합에 의한 결부 또는 다른 것에 의해) 기능적으로 결합될 수 있다.
유도체화 항체의 한 가지 유형은(예를 들어 이중 특이성 항체의 생성을 위하여 동일 유형 또는 상이한 유형의) 2종 이상의 항체를 가교 결합시킴으로써 제조된다. 적합한 가교 결합제는 적절한 스페이서에 의해 분리되는 2개의 특유한 반응성 기를 갖는 헤테로2작용성(예를 들어 m-말레이미도벤조일-N-히드록시숙신이미드 에스테르) 또는 호모2작용성(예를 들어 디숙신이미딜 수버레이트)인 것을 포함한다. 그러한 링커는 미국 일리노이주 록포드 소재의 Pierce Chemical Company로부터 입수가능하다.
다른 유형의 유도체화 항체로는 표지된 항체가 있다. 본 발명의 항체 또는 항체의 일부를 유도체화할 수 있는 유용한 검출제는 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 5-디메틸아민-1-나프탈렌술포닐 클로라이드, 피코에리트린, 란탄족 인광체 등을 비롯한 형광 화합물을 포함한다. 항체는 또한 검출에 유용한 효소, 예를 들어 서양 고추냉이 퍼옥시다제, β-갈락토시다제, 루시퍼라제, 알칼리 포스파타제, 글루코스 옥시다제 등으로 표지될 수 있다. 항체가 검출 가능한 효소로 표지될 경우, 항체는 식별될 수 있는 반응 생성물의 생성을 위하여 효소가 이용하는 추가의 시약을 첨가함으로써 검출된다. 예를 들어 서양 고추냉이 퍼옥시다제 제제가 존재할 경우, 과산화수소 및 디아미노벤지딘의 첨가에 의해 착색된 반응 생성물이 생성되는데, 이는 검출 가능하다. 항체는 또한 비오틴으로 표지되고 아비딘 또는 스트렙타비딘 결합의 간접 측정을 통하여 검출될 수 있다. 항체는 자성 제제, 예를 들어 가돌리늄으로 표지될 수도 있다. 항체는 또한 이차 리포터에 의해 인식되는 소정의 폴리펩티드 에피토프(예를 들어 류신 지퍼 쌍 서열, 이차 항체의 결합 부위, 금속 결합 도메인, 에피토프 태그)로 표지될 수도 있다. 몇몇 실시 형태에 있어서, 표지는 잠재적인 입체 장애의 감소를 위하여 다양한 길이의 스페이서 암에 의해 부착된다.
항-MAdCAM 항체는 또한 방사성 동위 원소로 표지된 아미노산으로 표지될 수도 있다. 식별용 방사성 동위 원소는 진단 목적 및 치료 목적 둘 다에 사용될 수 있다. 예를 들어 식별용 방사성 동위 원소는 x선 또는 기타 진단 기술에 의해 MAdCAM-발현 조직을 검출하기 위하여 사용될 수 있다. 또한, 식별용 방사성 동위 원소는 질환에 걸린 조직 또는 MAdCAM 발현 종양에 있어서 독소로서 치료용으로 사용될 수 있다. 폴리펩티드용 표지의 예는 하기의 방사능 동위 원소 또는 방사성 핵종을 포함하지만, 이로 한정되는 것은 아니다 -- 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I.
항-MAdCAM 항체는 또한 화학 기, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 메틸 또는 에틸기, 또는 탄수화물 기로 유도체화될 수 있다. 상기 기들은 항체의 생물학적 특징들을 개선시켜 예를 들어 혈청 중 반감기를 증가시키거나 조직 결합을 증가시키는 데에 유용할 수 있다. 이 방법은 항-MAdCAM 항체의 버전 또는 항원-결합 단편에도 적용된다.
제약 조성물 및 키트
추가의 태양에 있어서, 본 발명은 억제성 인간 항-MAdCAM 항체를 함유하는 조성물 및 그러한 조성물로 피험체를 치료하는 방법을 제공한다. 몇몇 실시 형태에 있어서, 치료 대상은 인간이다. 다른 실시 형태에 있어서, 피험체는 수의학적 대상이다. 몇몇 실시 형태에 있어서, 수의학적 피험체는 개 또는 인간 이외의 영장류이다.
치료는 본 발명의 1종 이상의 억제성 항-MAdCAM 항체, 또는 이의 항원 결합 단편을 단독으로, 또는 제약적으로 허용 가능한 담체와 함께 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 본 발명의 억제성 항-MAdCAM 항체 및 그를 함유하는 조성물은 하나 이상의 다른 치료제, 진단제 또는 예방제와 조합되어 투여될 수 있다. 추가의 치료제는 소염제 또는 면역 조절제를 포함한다. 이러한 약제는 국소용 및 경구용 코르티코스테로이드, 예를 들어 프레드니솔론, 메틸프레드니솔론, NCX-1015 또는 부데소니드; 아미노살리실레이트, 예를 들어 메살라진, 올살라진, 발살라지드 또는 NCX-456; 면역 조절제류, 예를 들어 아자티오프린, 6-메르캅토퓨린, 메토트렉세이트, 사이클로스포린, FK506, IL-10(일로데카킨(Ilodecakin)), IL-11(오프렐레브킨(Oprelevkin)), IL-12, MIF/CD74 길항제, CD40 길항제, 예를 들어 TNX-100/5-D12, OX40L 길항제, GM-CSF, 피메크롤리무스(pimecrolimus) 또는 라파마이신; 항-TNFα제류, 예를 들어 인플릭시마브, 아달리무마브, CDP-870, 오네르셉트, 에타네르셉트; 소염제류, 예를 들어 PDE-4 억제제(로플루밀라스트 등), TACE 억제제(DPC-333, RDP-58 등) 및 ICE 억제제(VX-740 등)과, IL-2 수용체 길항제, 예를 들어 다클리주마브, 선택성 유착 분자 길항제류, 예를 들어 나탈리주마브, MLN-02, 또는 알리카포르센, 진통제류, 예를 들어 한정됨이 없이 COX-2 억제제, 예를 들어 로페콕시브, 발데콕시브, 셀레콕시브, P/Q-형 전압 감작 채널(volatge senstize channel)(α2δ) 조절제, 예를 들어 가바펜틴 및 프레가발린, NK-1 수용체 길항제, 카나비노이드 수용체 조정제, 및 델타 오피오이드 수용체 작동제와, 항신생물제(anti-neoplastic agent), 항종양제, 항혈관형성제(anti-angiogenic agent) 또는 화학 치료제를 포함하지만, 이로 한정되는 것은 아니다. 그러한 추가의 약제는 동일 조성물 중에 함유되거나 개별적으로 투여될 수 있다. 몇몇 실시 형태에 있어서, 본 발명의 하나 이상의 억제성 항-MAdCAM 항체는 백신으로서, 또는 백신에 대한 아쥬반트로서 사용될 수 있다. 특히, MAdCAM은 림프 조직에서 발현되기 때문에, 백신 항원은 이 항원을 본 발명의 항-MAdCAM 항체에 콘쥬게이션시킴으로써 림프 조직으로 표적화하는 것이 유리할 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, "제약적으로 허용 가능한 담체"는 생리학적으로 상용성인 임의의, 또는 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 항균 및 항진균제, 등장성이며 흡수를 증강시키거나 지연시키는 제제 등을 의미한다. 제약적으로 허용 가능한 담체의 몇몇 예로는 염화나트륨, 덱스트로스, 글리세롤, 폴리에틸렌 글리콜, 에탄올 등을 포함하는 아세트산염 완충제, 인산염 완충 염수, 염수, 물과, 이의 조합이 있다. 다수의 경우에 있어서, 등장제, 예를 들어 당, 폴리알코올, 예를 들어 만니톨, 소르비톨 또는 염화나트륨이 조성물 중에 함유되는 것이 바람직하다. 제약적으로 허용 가능한 물질의 추가의 예로는 계면활성제, 습윤제 또는 소량의 보조 물질, 예를 들어 습윤 또는 유화제, 방부제 또는 완충제가 있는데, 이들은 항체의 저장 수명 또는 유효성을 증강시킨다.
본 발명의 조성물은 다양한 형태, 예를 들어 액체, 반고체 및 고체 투여 형태, 예를 들어 액체 용액(예를 들어 주사 가능한 용액 및 주입 가능한 용액), 분산액 또는 현탁액, 정제, 알약, 동결 건조 케이크, 건조 분말, 리포좀 및 좌약의 형태로 존재할 수 있다. 바람직한 형태는 의도되는 투여 양식 및 치료 용도에 따라 달라진다. 전형적인 바람직한 조성물은 주사 가능하거나 주입 가능한 용액의 형태, 예를 들어 인간의 수동 면역에 사용되는 것과 유사한 조성물이다. 바람직한 투여 양식은 비경구 투여(예를 들어 정맥내, 피하, 복강내, 근육내, 피내)이다. 바람직한 실시 형태에 있어서, 항체는 정맥내 주입 또는 주사에 의해 투여된다. 다른 바람직한 실시 형태에 있어서, 항체는 근육내, 피내 또는 피하 주사에 의해 투여된다.
치료 조성물은 전형적으로 제조 및 보관 조건 하에서 안정하고 살균성이어야 한다. 조성물은 용액, 동결 건조 케이크, 건조 분말, 마이크로에멀젼, 분산액, 리포좀, 또는 높은 약물 농도에 적합한 다른 조직화된 구조로 제형화될 수 있다. 주사가능한 살균 용액은 항-MAdCAM 항체를 필요량으로 적절한 용매 중에 상기에 열거된 성분들 중 하나의 성분 또는 그 조합물과 함께 혼입시키고, 필요할 경우, 그 후 살균함으로써 제조될 수 있다. 주사가능한 살균 용액 제조용 살균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 진공 건조 및 냉동 건조법이 있으며 이는 이전의 살균 용액으로부터의 활성 성분 + 임의의 추가의 원하는 성분의 분말을 생성한다. 일반적으로, 분산액은 상기에 열거된 것으로부터의 필요한 기타 성분 및 기본적인 분산 매질을 포함하는 살균 비히클 내로 활성 화합물을 혼입시킴으로써 제조된다. 원하는 용액 특징은 예를 들어 계면활성제의 사용에 의해, 그리고 분산액의 경우 원하는 입자 크기는 계면활성제, 인지질 및 중합체의 사용에 의해 유지될 수 있다. 주사가능한 조성물의 흡수 연장은 조성물 중에 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들어 모노스테아레이트 염, 중합체성 물질, 오일 및 젤라틴을 함유시킴으로써 초래할 수 있다.
본 발명의 항체는, 다수의 치료 용도에 있어서 바람직한 투여 경로/양식이 피하, 근육내, 피내, 또는 정맥내 주입이지만, 당업계에 공지된 다양한 방법으로 투여될 수 있다. 당업계의 숙련자라면 알 수 있듯이, 투여 경로 및/또는 양식은 원하는 결과에 따라 달라질 것이다.
소정 실시 형태에 있어서, 이식체, 경피 패치, 및 마이크로캡슐화 전달 시스템을 비롯하여 방출 조절형 제형과 같이, 항체가 급속하게 방출되지 않도록 하는 담체로 항체 조성물을 제조할 수도 있다. 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리언하이드라이드, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르 및 폴리악틱산과 같이, 생분해성, 생체 적합성 중합체가 사용될 수 있다. 그러한 제형의 다수의 제조 방법이 특허되어 있거나 일반적으로 당업계의 숙련자에게 공지되어 있다. 예를 들어 문헌[Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems (J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York (1978))]을 참조한다.
소정 실시 형태에 있어서, 본 발명의 항-MAdCAM 항체는 예를 들어 불활성 희석제 또는 동화가능한 식용 담체와 함께 경구 투여될 수 있다. 화합물 (및 원할 경우 기타 성분)은 또한 경질 또는 연질 쉘(shell) 젤라틴 캡슐에 봉입되거나, 정제로 압축되거나, 피험체의 규정식(diet) 내로 직접 혼입될 수 있다. 치료적 경구 투여에 있어서, 항-MAdCAM 항체는 부형제와 함께 혼입되고 복약 가능한(ingestible) 정제, 협측용 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭시르, 현탁액, 시럽, 웨이퍼(wafer) 등의 형태로 사용될 수 있다. 비경구 투여 이외의 방법으로 본 발명의 화합물을 투여하기 위하여, 화합물을 이의 불활성화 방지를 위한 물질로 코팅하거나 본 화합물을 이 물질과 함께 공동 투여하는 것이 필요할 수 있다.
본 발명의 조성물은 "치료적 유효량" 또는 "예방적 유효량"의 본 발명의 항체 또는 항원 결합성 부분을 함유할 수 있다. "치료적 유효량"은, 필요한 기간 동안 그리고 투여량에서, 원하는 치료 결과를 성취하는 데에 유효한 양을 말한다. 본 항체 또는 항체의 일부의 치료적 유효량은 질환 상태, 개체의 연령, 성별 및 체중과, 항체 또는 항체의 일부가 개체에서 원하는 반응을 이끌어내는 능력과 같은 인자에 따라 달라질 수 있다. 또한 치료적 유효량은 치료적으로 유익한 효과가 본 항체 또는 항체의 일부의 모든 유독하거나 해로운 효과보다 커지게 하는 것이다. "예방적 유효량"은 필요한 기간 동안 그리고 투여량에서, 원하는 예방 결과를 성취하는 데에 유효한 양을 말한다. 전형적으로, 예방 용량이 질환 이전에 또는 질환의 초기 단계에 피험체에서 사용되기 때문에, 예방적 유효량은 치료적 유효량보다 적을 수 있다.
투여 섭생을 조정하여 최적의 원하는 반응(예를 들어 치료 또는 예방 반응)을 제공할 수 있다. 예를 들어 단일 볼루스(bolus)가 투여될 수 있거나, 나뉘어진 여러 용량이 시간이 지남에 따라 투여될 수 있거나, 용량이 치료 상황의 위급성에 의해 나타내어지듯이 비례적으로 감소 또는 증가될 수 있다. 투여의 용이성 및 투여량의 균일성을 위하여 단위 투여 형태의 비경구용 조성물을 제형화하는 것이 특히 유리하다. 본원에 사용되는 바와 같이 단위 투여 형태는 치료할 포유류 피험체용의 단일 투여량으로서 적합화된 물리적으로 별개인 단위를 말하며, 각각의 단위는 원하는 치료 효과의 생성을 위하여 계산된 소정량의 활성 화합물이 필요한 제약 담체와 결부된 것을 포함한다. 본 발명의 단위 투여 형태에 대한 명세 사항은 (a) 항-MAdCAM 항체 또는 이의 일부의 특유한 특징 및 성취할 특정의 치료 또는 예방 효과와, (b) 개체에 있어서 치료의 민감성에 대한 그러한 항체의 혼합 분야에 내재된 제한 사항에 의해, 그리고 이들에 직접 의존하여 기술된다.
본 발명의 항체 또는 항체의 일부의 치료적 또는 예방적 유효량의 예시적인 비제한적 범위는 0.025 내지 50 mg/kg, 더 바람직하게는 0.1 내지 50 mg/kg, 더 바람직하게는 0.1-25, 0.1 내지 10 또는 0.1 내지 3 mg/kg이다. 몇몇 실시 형태에 있어서, 제형은 20 mM 아세트산나트륨, pH 5.5, 140 mM NaCl, 및 0.2 mg/mL의 폴리소르베이트 80의 완충제 중 5 mg/mL의 항체를 함유한다. 투여량 값은 완화시킬 질병의 유형 및 중증도에 따라 달라질 수 있다는 것을 알아야 한다. 또한, 특정 피험체에 있어서, 특정 투여 섭생은 개체의 필요성 및 조성물의 투여를 관리 또는 감독하는 인간의 전문적 판단에 따라 시간이 지남에 따라 조정하여야 하고, 본원에 나타내어진 투여량 범위는 단지 예시적인 것일 뿐이며 청구된 조성물의 범주 또는 실행을 한정하려는 것이 아님을 알아야 한다.
본 발명의 다른 태양은 본 발명의 항-MAdCAM 항체 또는 항체의 일부 또는 그러한 항체를 함유하는 조성물을 포함하는 키트를 제공한다. 키트는 항체 또는 조성물 외에도 진단제 또는 치료제를 포함할 수 있다. 키트는 또한 진단 또는 치료 방법에 있어서의 사용 설명서를 포함할 수 있다. 바람직한 실시 형태에 있어서, 키트는 항체 또는 그를 함유하는 조성물과 하기에 기술된 방법에서 사용될 수 있는 진단제를 포함한다. 다른 바람직한 실시 형태에 있어서, 키트는 항체 또는 그를 함유하는 조성물과 하기에 기술된 방법에서 사용될 수 있는 하나 이상의 치료제를 포함한다.
유전자 치료 요법
본 발명의 핵산 분자를 유전자 치료 요법을 통하여 그를 필요로 하는 환자에게 투여할 수 있다. 이 치료 요법은 생체내 또는 생체외 요법일 수 있다. 바람직한 실시 형태에 있어서, 중쇄 및 경쇄 둘 다를 코딩하는 핵산 분자가 환자에게 투여된다. 더 바람직한 실시 형태에 있어서, 본 핵산 분자는 B 세포가 항체 생산용으로 특수화되기 때문에 핵산 분자가 B 세포의 염색체 내로 안정하게 통합되도록 투여된다. 바람직한 실시 형태에 있어서, 전구체 B 세포는 생체외에서 트랜스펙션되거나 감염되며 그를 필요로 하는 환자 내로 재이식된다. 다른 실시 형태에 있어서, 전구체 B 세포 또는 기타 세포는 목적 세포 유형을 감염시키는 것으로 공지된 재조합 바이러스를 사용하여 생체내에서 감염시킨다. 유전자 치료 요법용으로 사용되는 전형적인 벡터는 리포좀, 플라스미드 및 바이러스 벡터를 포함한다. 예시적인 바이러스 벡터로는 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-관련 바이러스가 있다. 생체내 또는 생체외 감염 후, 항체의 발현 수준은 처리된 환자로부터 샘플을 취하고 당업계에 공지되거나 본원에 논의되어 있는 임의의 면역 분석법을 사용함으로써 모니터링할 수 있다.
바람직한 실시 형태에 있어서, 본 유전자 치료 방법은 항-MAdCAM 항체의 중쇄 또는 이의 항원 결합성 부분을 코딩하는 단리된 핵산 분자를 투여하는 단계 및 이 핵산 분자를 발현시키는 단계를 포함한다. 다른 실시 형태에 있어서, 본 유전자 치료 방법은 항-MAdCAM 항체의 경쇄 또는 이의 항원 결합성 부분을 코딩하는 단리된 핵산 분자를 투여하는 단계 및 이 핵산 분자를 발현시키는 단계를 포함한다. 더 바람직한 방법에 있어서, 본 유전자 치료 방법은 본 발명의 항-MAdCAM 항체의 경쇄 또는 이의 항원 결합성 부분을 코딩하는 단리된 핵산 분자 및 중쇄 또는 이의 항원 결합성 부분을 코딩하는 단리된 핵산 분자를 투여하는 단계와, 이 핵산 분자를 발현시키는 단계를 포함한다. 본 유전자 치료 방법은 다른 소염제 또는 면역 조절제를 투여하는 단계를 또한 포함할 수 있다.
진단적 사용 방법
본 항-MAdCAM 항체는 시험관내 또는 생체내에서 생물학적 샘플 중의 MAdCAM의 검출을 위하여 사용될 수 있다. 본 항-MAdCAM 항체는, 한정됨이 없이, ELISA, RIA, FACS, 조직 면역 조직 화학, 웨스턴 블롯 또는 면역 침전을 비롯하여 통상적인 면역 분석법에서 사용될 수 있다. 본 발명의 항-MAdCAM 항체는 인간 유래의 MAdCAM의 검출을 위하여 사용될 수 있다. 다른 실시 형태에 있어서, 본 항-MAdCAM 항체는 구세계 영장류, 예를 들어 사이노몰거스 원숭이 및 붉은털 원숭이, 침팬지 및 유인원 유래의 MAdCAM의 검출을 위하여 사용될 수 있다. 본 발명은 생물학적 샘플을 본 발명의 항-MAdCAM 항체와 접촉시키는 단계 및 MAdCAM에 결합된 항체를 검출하는 단계를 포함하는, 생물학적 샘플 중의 MAdCAM의 검출 방법을 제공한다. 일 실시 형태에 있어서, 본 항-MAdCAM 항체는 검출 가능한 표지로 직접 유도체화된다. 다른 실시 형태에 있어서, 본 항-MAdCAM 항체(제1 항체)는 미표지되며 항-MAdCAM 항체에 결합할 수 있는 다른 분자 또는 제2 항체는 표지된다. 당업계의 숙련자에게 잘 알려져 있는 바와 같이, 특정 종 및 제1 항체류에 특이적으로 결합할 수 있는 제2 항체가 선택된다. 예를 들어, 항-MAdCAM 항체가 인간 IgG이면, 제2 항체는 항-인간-IgG일 수 있다. 항체에 결합할 수 있는 다른 분자는, 한정됨이 없이, 단백질 A 및 단백질 G를 포함하며, 이들 둘 다는 예를 들어 Pierce Chemical Co.로부터 구매가능하다.
본 항체 또는 이차 항체에 적합한 표지는 상기에 개시되었으며, 다양한 효소, 보결 분자단(prosthetic group), 형광 물질, 발광 물질, 자성 제제 및 방사능 물질을 포함한다. 적합한 효소의 예에는 서양 고추냉이 퍼옥시다제, 알칼리 포스파타제, β-갈락토시다제, 또는 아세틸콜린에스테라제가 포함되며, 적합한 보결 분자단 복합체의 예에는 스트렙타비딘/비오틴 및 아비딘/비오틴이 포함되며, 적합한 형광 물질의 예에는 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 단실 클로라이드 또는 피코에리트린이 포함되며, 발광 물질의 예에는 루미놀이 포함되며, 자성 제제의 예에는 갈돌리늄이 포함되며, 적합한 방사능 물질의 예에는 125I, 131I, 35S 또는 3H가 포함된다.
대안적인 실시 형태에 있어서, MAdCAM은 검출 가능한 물질로 표지된 MAdCAM 표준물 및 미표지 항-MAdCAM 항체를 이용하여 경쟁 면역 분석법에 의해 생물학적 샘플에서 분석될 수 있다. 이 분석에 있어서, 생물학적 샘플, 표지된 MAdCAM 표준물 및 항-MAdCAM 항체는 합해지며 미표지 항체에 결합된 표지된 MAdCAM 표준물의 양이 측정된다. 생물학적 샘플 중의 MAdCAM의 양은 항-MAdCAM 항체에 결합된 표지된 MAdCAM 표준물의 양에 반비례한다.
다수의 목적에 있어서 상기에 개시된 면역 분석법이 사용될 수 있다. 일 실시 형태에 있어서, 본 항-MAdCAM 항체는 세포 배양물 중의 세포에서 MAdCAM을 검출하기 위하여 사용될 수 있다. 바람직한 실시 형태에 있어서, 본 항-MAdCAM 항체는 세포를 다양한 화합물로 처리한 후의 세포 표면의 MAdCAM의 발현 수준의 측정을 위하여 사용될 수 있다. 이 방법은 MAdCAM의 활성화 또는 억제를 위하여 사용될 수 있는 화합물을 시험하기 위하여 사용될 수 있다. 이 방법에 있어서, 하나의 세포 샘플은 다른 샘플을 처리하지 않은 채 남겨두면서 일정 기간 동안 시험 화합물로 처리하고, 이어서 세포 표면의 발현을 유세포 분석법, 면역 조직 화학적 방법, 웨스턴 블롯, ELISA 또는 RIA로 측정할 수 있다. 또한, 면역 분석은 MAdCAM의 활성화 또는 억제 중 어느 하나에 대한 다수의 화합물의 시험을 위하여 높은 처리량의 스크리닝을 위하여 확대될 수 있다.
또한 본 발명의 항-MAdCAM 항체는 조직 또는 조직으로부터 유래되는 세포 중의 MAdCAM의 수준의 측정을 위하여 사용될 수 있다. 바람직한 실시 형태에 있어서, 조직은 질환에 걸린 조직이다. 더 바람직한 실시 형태에 있어서, 조직은 염증을 일으킨 위장관 또는 이의 생검체이다. 본 방법의 바람직한 실시 형태에 있어서, 조직 또는 이의 생검체는 환자로부터 절제된다. 이어서 조직 또는 생검체를 면역 분석에서 사용하여 예를 들어 MAdCAM의 수준, 세포 표면 상의 MAdCAM의 수준, 또는 MAdCAM의 국소화를 상기에 논의된 방법으로 측정한다. 본 방법을 사용하여 염증을 일으킨 조직이 MAdCAM을 고수준으로 발현하는지를 측정할 수 있다.
상기에 기술된 진단 방법을 사용하여 조직이 고수준의 MAdCAM을 발현하는지를 측정할 수 있는데, 이는 조직이 항-MAdCAM 항체를 이용한 치료에 잘 반응하는지를 나타낼 수 있다. 또한, 본 진단 방법을 또한 사용하여 항-MAdCAM 항체(하기 참조)에 의해 조직이 보다 낮은 수준의 MAdCAM을 발현하게 되는지를 측정할 수 있으며 따라서 이를 사용하여 치료가 성공적인지를 결정할 수 있다.
본 발명의 항체는 또한 MAdCAM을 발현하는 조직 및 기관을 국소화하기 위하여 생체내에서 사용될 수 있다. 바람직한 실시 형태에 있어서, 항-MAdCAM 항체는 염증을 일으킨 조직의 국소화를 위하여 사용될 수 있다. 본 발명의 항-MAdCAM 항체의 이점은 본 항체가 투여시에 면역 반응을 생성하지 않는다는 것이다. 본 방법은 항-MAdCAM 항체 또는 이의 제약 조성물을, 그러한 진단 시험을 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계 및 환자를 대상으로 영상화 분석을 실시하여 MAdCAM 발현 조직의 위치를 결정하는 단계를 포함한다. 영상화 분석은 의학 분야에서 잘 알려져 있으며, 한정됨이 없이, x선 분석, 감마 신티오그라피(scintigraphy), 자기 공명 영상(magnetic resonance imaging, MRI), 양전자 방출 단층 촬영(positron emission tomography) 또는 컴퓨터 단층 촬영(computed tomography, CT)을 포함한다. 본 방법의 다른 실시 형태에 있어서, 생검체는 환자를 대상으로 영상 분석을 실시하기보다는 목적 조직이 MAdCAM을 발현하는지를 측정하기 위하여 환자로부터 수득한다. 바람직한 실시 형태에 있어서, 항-MAdCAM 항체는 환자에서 영상화될 수 있는 검출 가능한 제제로 표지될 수 있다. 예를 들어 항체는 x선 분석에 사용될 수 있는 바륨과 같은 조영제, 또는 MRI 또는 CT에 사용될 수 있는 가돌리늄 킬레이트와 같은 자성 조영제로 표지될 수 있다. 다른 표지제는 한정됨이 없이 방사능 동위 원소, 예를 들어 99Tc를 포함한다. 다른 실시 형태에 있어서 본 항-MAdCAM 항체는 미표지되며, 검출 가능하고 항-MAdCAM 항체에 결합할 수 있는 다른 분자 또는 제2 항체를 투여함으로써 영상화된다.
본 발명의 항-MAdCAM 항체는 또한 공여체의 혈액, 혈청, 혈장, 또는 한정됨이 없이 대변, 소변, 담 또는 생검체 샘플을 포함하는 다른 생체 유체에 존재하는 가용성 MAdCAM의 수준을 측정하기 위하여 사용될 수 있다. 바람직한 실시 형태에 있어서, 생체 유체는 혈장이다. 이어서 생체 유체를 면역 분석에서 사용하여 가용성 MAdCAM의 수준을 측정한다. 가용성 MAdCAM은 진행중인 위장 염증의 대용 마커일 수 있으며 본 검출 방법을 진단 마커로 사용하여 질환의 중증도를 측정할 수 있다.
상기에 기술된 진단 방법을 사용하여 개체가 고수준의 가용성 MAdCAM을 발현하는지를 측정할 수 있는데, 이는 개체가 항-MAdCAM 항체를 이용한 치료에 잘 반응한다는 것을 나타낼 수 있다. 또한, 본 진단 방법을 사용하여 항-MAdCAM 항체(하기 참조) 또는 질환의 기타 제약적 약제를 이용한 치료에 의해 개체가 보다 낮은 수준의 MAdCAM을 발현하게 되는지를 또한 측정할 수 있으며 따라서 이를 사용하여 치료가 성공적인지를 결정할 수 있다.
항- MAdCAM 항체에 의한 α 4 β 7 / MAdCAM -의존성 유착의 억제
다른 실시 형태에 있어서, 본 발명은 MAdCAM에 결합하며 α4β7-인테그린 보유 세포의 MAdCAM에의 결합 및 유착 또는 다른 친족 리간드, 예를 들어 L-셀렉틴의 MAdCAM에의 결합 및 유착을 억제하는 항-MAdCAM 항체를 제공한다. 바람직한 실시 형태에 있어서, 본 MAdCAM은 인간 MAdCAM이며 가용성 형태이거나 세포의 표면 상에서 발현된다. 다른 바람직한 실시 형태에 있어서, 본 항-MAdCAM 항체는 인간 항체이다. 다른 실시 형태에 있어서, 본 항체 또는 이의 일부는 α4β7과 MAdCAM 사이의 결합을 50 nM 이하의 IC50 값으로 억제한다. 바람직한 실시 형태에 있어서, 이 IC50 값은 5 nM 이하이다. 더 바람직한 실시 형태에 있어서, IC50 값은 5 nM 미만이다. 더 바람직한 실시 형태에 있어서, IC50 값은 0.05 ㎍/mL, 0.04 ㎍/mL, 또는 0.03 ㎍/mL 미만이다. 다른 바람직한 실시 형태에 있어서, IC50 값은 0.5 ㎍/mL, 0.4 ㎍/mL, 또는 0.3 ㎍/mL 미만이다. IC50 값은 당업계에 공지된 임의의 방법으로 측정될 수 있다. 전형적으로 IC50 값은 ELISA 또는 유착 분석으로 측정될 수 있다. 바람직한 실시 형태에 있어서, IC50 값은 MAdCAM을 천연적으로 발현하는 세포 또는 조직, 또는 MAdCAM을 발현하도록 조작된 세포 또는 조직 중 어느 하나를 사용하여 유착 분석으로 측정된다.
항- MAdCAM 에 의한 장 결부 림프 조직에의 림프구의 동원의 억제
다른 실시 형태에 있어서, 본 발명은 천연적으로 발현되는 MAdCAM에 결합하며 림프구의 특수화된 위장 림프 조직에의 결합을 억제하는 항-MAdCAM 항체를 제공한다. 바람직한 실시 형태에 있어서, 천연적으로 발현되는 MAdCAM은 인간 또는 영장류 MAdCAM이며 가용성 형태이거나 세포의 표면 상에서 발현되는 것이다. 다른 바람직한 실시 형태에 있어서, 본 항-MAdCAM 항체는 인간 항체이다. 다른 실시 형태에 있어서, 본 항체 또는 이의 일부는 장 영양성(gut-trophic) α4β7 + 림프구가 MAdCAM 발현 조직으로 동원되는 것을 5 mg/kg 이하의 IC50 값으로 억제한다. 바람직한 실시 형태에 있어서, 이 IC50 값은 1 mg/kg 이하이다. 더 바람직한 실시 형태에 있어서, IC50 값은 0.1 mg/kg 미만이다. 일 실시 형태에 있어서, IC50 값은, 감마 신티오그라피 또는 단일 광자 발산 컴퓨터 단층 촬영을 사용하여 테크네튬 표지된 말초 혈액 림프구의 위장관으로의 동원의 용량 효과의 관계를 측정함으로써 측정할 수 있다. 다른 실시 형태에 있어서, IC50 값은, 항-MAdCAM 항체의 용량의 함수로서, 유세포 분석법을 사용하여, 말초 순환에서 장영양성 α4β7 + 림프구, 예를 들어 한정됨이 없이 CD4+ α4β7 + 기억 T-세포의 증가를 측정함으로써 측정할 수 있다.
본 발명이 더욱 잘 이해될 수 있게 하기 위하여 하기 실시예를 나타낸다. 본 실시예는 단지 예시를 위한 것이며 어떠한 방식으로든 본 발명의 범주를 한정하는 것으로 파악되어서는 아니된다.
실시예 1:
항- MAdCAM 생산 하이브리도마의 생성
본 발명의 항체를 본 실시예에 따라 제조, 분석 및 선발하였다.
일차 면역원의 제조:
하기의 2종의 면역원을 제노마우스TM의 면역화를 위하여 제조하였다: (i) MAdCAM-IgG1 Fc 융합 단백질 및 (ii) MAdCAM으로 안정하게 트랜스펙션된 세포로부터 제조되는 세포 막.
(i) MAdCAM - IgG 1 Fc 융합 단백질
발현 벡터의 제작:
MAdCAM의 성숙한 세포외 면역글로불린 유사 도메인을 코딩하는 EcoRI/BglII cDNA 단편을 pINCY Incyte 클론(3279276)으로부터 잘라내고 pIG1 벡터의 EcoRI/BamHI 부위 내로 클로닝하여(문헌[Simmons, D. L. (1993) in CellμLar Interactions in Development: A Practical Approach, ed. Hartley, D. A. (Oxford Univ. Press, Oxford), pp. 93-127.)) 프레임에 맞는(in frame) IgG1 Fc 융합물을 생성하였다. 생성된 삽입체를 EcoRI/NotI으로 잘라내고 pCDNA3.1+(Invitrogen) 내로 클로닝하였다. 벡터 중의 MAdCAM-IgG1 Fc cDNA를 서열로 확인하였다. MAdCAM-IgG1 Fc 융합 단백질의 아미노산 서열을 하기에 예시한다:
MAdCAM-IgG1 Fc 융합 단백질:
Figure 112006056960219-pct00001
밑줄: 신호 펩티드
볼드체: MAdCAM의 세포외 도메인
재조합 단백질의 발현/정제:
CHO-DHFR 세포를 MAdCAM-IgG1 Fc 융합 단백질 cDNA를 포함하는 pCDNA3.1+ 벡터로 트랜스펙션시키고 MAdCAM-IgG1 Fc 융합 단백질을 발현하는 안정한 클론을 600 ㎍/mL의 G418 및 100 ng/mL의 메토트렉세이트를 함유하는 이스코브(Iscove) 배지에서 선발하였다. 단백질 발현에 있어서, 중공 섬유 생물 반응기에 10%의 저함량 IgG 소 태아 혈청(Gibco), 비필수 아미노산(Gibco), 2 mM의 글루타민(Gibco), 피루브산나트륨(Gibco), 100 ㎍/mL의 G418 및 100 ng/mL의 메토트렉세이트를 함유하는 이스코브 배지 중의 MAdCAM-IgG1 Fc를 안정하게 발현하는 CHO 세포를 접종하고 이를 사용하여 농축된 배지 상청액을 생성하였다. MAdCAM-IgG1 Fc 융합 단백질을 친화성 크로마토그래피로 수확 상청액으로부터 정제하였다. 간략하게는, 상청액을 HiTrap 단백질 G 세파로스(5 mL, Pharmacia) 컬럼에 적용하고(2 mL/분), 25 mM 트리스 - pH 8 - , 150 mM NaCl(5배의 컬럼 부피)로 세척하고 100 mM 글리신 - pH 2.5 - 으로 용출시키고(1 mL/분), 분획물을 pH 8의 1 M 트리스로 pH 7.5로 즉시 중화시켰다. MAdCAM-IgG1 Fc 융합 단백질을 포함하는 분획을 SDS-PAGE로 확인하고, 함께 모으고 35 mM의 비스트리스 - pH 6.5 - , 150 mM NaCl로 사전 평형화한 세파크릴(Sephacryl) S 100 컬럼(Pharmacia)에 적용하였다. 겔 여과를 0.35 mL/분에서 수행하여, 대략 3 x 5 mL 분획물 중의 MAdCAM-IgG1 Fc 융합 단백질의 피크를 수집하였다. 이 샘플을 모으고 35 mM의 비스트리스 - pH 6.5 -로 사전 평형화한 리소 스(Resource) Q(6 mL, Pharmacia) 컬럼에 적용하였다. 컬럼을 5배의 컬럼 부피의 35 mM 비스 트리스 - pH 6.5 - , 150 mM NaCl로 세척하고(6 mL/분) MAdCAM-IgG1 Fc 융합 단백질을 35 mM 비스 트리스 - pH 6.5 - , 400 mM NaCl로 4-6 mL 분획물 내로 용출시켰다. 이 단계에서, 단백질의 순도는 90%였으며, 단백질은 SDS-PAGE에 의해 대략 68 kD에서의 단일 밴드로서 이동하였다. 면역원으로서, 그리고 모든 후속 분석에서 사용하기 위하여, 이 물질은 25 mM HEPES - pH 7.5 - , 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 100 mM NaCl, 50% 글리세롤로 완충제를 교환하고 분취물로서 -80℃에서 보관하였다.
(ii) MAdCAM 을 안정하게 발현하는 세포 막
공개된 MAdCAM 서열의 뉴클레오티드 645-1222를 포함하는 SacI/NotI 단편(문헌[Shyjan AM, et al., Immunol., 156, 2851-7 (1996)])을 결장 cDNA 라이브러리로부터 PCR 증폭시키고 pIND-Hygro 벡터(Invitrogen)의 SacI/NotI 부위 내로 클로닝하였다. 추가의 5' 코딩 서열을 포함하는 SacI 단편을 pCDNA3.1 MAdCAM- IgG1 Fc로부터 이 제작물 내로 서브클로닝하여 전장 MAdCAM cDNA를 생성하였다. 이어서 이 MAdCAM cDNA를 포함하는 KpnI/NotI 단편을 pEF5FRTV5GWCAT 벡터(Invitrogen)의 상응하는 부위 내로 클로닝하고 CAT 코딩 서열을 대체하였다. cDNA 삽입체의 서열을 검증하고 트랜스펙션에서 사용하여 제조자의 지시에 따라, Flp 리콤비나제 기술에 의해 FlpIn NIH 3T3 세포(Invitrogen)에서 안정하게 발현하는 단일 클론을 생성하였다. 하기에 약술되어 있는 바와 같이, 안정하게 발현하는 클론은 α4β7 JY 인간 B 림프아형(lymphoblastoid) 세포주의 결합을 지지하는 이의 능력으로 선발하였다(문헌[Chan BM, et al, J. Biol. Chem., 267: 8366-70 (1992)]). MAdCAM을 발현하는 CHO 세포의 안정한 클론은 FlpIn CHO 세포(Invitrogen)를 사용하여 동일한 방식으로 제조하였다.
MAdCAM-발현 FlpIn NIH-3T3 세포를 2 mM L-글루타민, 10%의 송아지 공여체 혈청(Gibco) 및 200 ㎍/mL의 하이그로마이신 B(Invitrogen)를 포함하는 둘베코 변형 이글 배지(DμLbecco's modified Eagles Medium)(Gibco)에서 배양하고 롤러 병에서 확장시켰다. MAdCAM-발현 FlpIn CHO 세포를 2 mM L-글루타민, 10%의 송아지 공여체 혈청(Gibco) 및 350 ㎍/mL의 하이그로마이신 B(Invitrogen)를 함유하는 햄 F12(Ham's F12)/둘베코 변형 이글 배지(Gibco)에서 배양하고 롤러 병에서 확장시켰다. 세포는 비효소적 세포 해리 용액(Sigma)을 사용하여 긁어 내고, 원심분리에 의해 인산염 완충 염수에서 세척함으로써 수확하였다. 세포 막은 25 mM의 비스 트리스 - pH 8 - , 10 mM의 MgCl2, 0.015%(w/v)의 아프로티닌, 100 ㎍/mL의 바시트라신에서의 2라운드의 폴리트론 균질화 및 원심분리에 의해 세포 펠렛으로부터 제조하였다. 최종 펠렛을 동일한 완충제에 재현탁시키고, 50 x 106개의 세포 등가물을 두꺼운 벽의 에펜도르프 내로 분취하고 > 100,000 g에서 스핀하여 제노마우스 생쥐 면역화용 세포 막 펠렛을 생성하였다. 상청액을 가만히 따르고 막을 필요할 때까지 에펜도르프에서 -80℃에서 보관하였다. 세포 막에서의 단백질 발현의 확인은 SDS-PAGE 및 MAdCAM의 N-말단 잔기([C]-KPLQVEPPEP)에 대하여 생성된 토끼 항-펩티드 항체를 이용한 웨스턴 블로팅으로 결정하였다.
면역화 및 하이브리도마 생성:
8 내지 10주령의 제노마우스TM 생쥐를 정제된 재조합 MAdCAM-IgG1 Fc 융합 단백질(10 ㎍/투여/생쥐), 또는 안정하게 발현하는 MAdCAM-CHO 또는 NIH 3T3 세포(10 x 106개의 세포/투여/생쥐)로부터 제조된 세포 막 중 어느 하나로 복강내로 면역화하거나 이의 뒤쪽 발바닥에서 면역화하였다. 이 투여는 3주 내지 8주간의 기간에 걸쳐 5회 내지 7회 반복하였다. 융합 4일 전에, 생쥐에게 PBS 중 인간 MAdCAM의 세포외 도메인을 최종 주사하였다. 면역화 생쥐 유래의 비장 및 림프절 림프구를 비분비성 골수종 P3-X63-Ag8.653 세포주와 융합시키고 이전에 기술한 바와 같이 HAT 선발을 실시하였다(문헌[Galfre and Milstein, Methods Enzymol. 73: 3-46(1981)]). 모두가 MAdCAM 특이성 인간 IgG2κ 및 IgG4κ 항체를 분비하는 하이브리도마 패널을 회수하고 서브클로닝하였다. MAdCAM에 특이적인 모노클로날 항체를 생산하는 12종의 하이브리도마 서브클론, 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4 및 9.8.2를 회수하고 하기에 기술된 분석으로 검출하였다. 서브클론 하이브리도마 주, 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4 및 9.8.2가 유래되는 어버이 주 1.7, 1.8, 6.14, 6.22, 6.34, 6.67, 6.73, 6.77, 7.16, 7.20, 7.26 및 9.8은 모두 항-MAdCAM 활성을 가진다.
ELISA 분석:
생쥐 혈청 및 하이브리도마 상청액에서의 항원 특이성 항체의 검출을 MAdCAM-IgG1 Fc 융합 단백질을 사용하여 기술되어 있는 ELISA로 결정하여(문헌[Coligan et al., Unit 2.1 "Enzyme-linkedimmunosorbent assays", Current ProtocolsIinlmmunology (1994)]) 항체를 포착하였다. MAdCAM-IgG1 Fc 융합 단백질로 면역화한 동물에 있어서, 항체는 유세포 분석법에 의해 FlpIn CHO MAdCAM 세포에 결합하는 능력 및 인간 IgG1에 대한 비특이적 반응성에 대하여 스크리닝하였다.
바람직한 ELISA 분석에서, 하기 기술이 사용된다:
ELISA 플레이트는, 완충제(100 mM의 탄산나트륨/중탄산나트륨 완충제, pH 9.6)를 포함하는 플레이트 중 100 μL/웰의 MAdCAM-IgG1 Fc 융합물(4.5 ㎍/mL)로 4℃에서 하룻밤 코팅하였다. 항온처리 후, 코팅 완충제를 제거하고 플레이트를 200 μL/웰의 차단 완충제(인산염 완충 염수 중, 5% BSA, 0.1% 트윈 20)로 차단하고 실온에서 1시간 동안 항온처리하였다. 차단 완충제를 제거하고 50 μL/웰의 하이브리도마 상청액 또는 기타 혈청 또는 상청액(예를 들어 양성 대조군)을 실온에서 2시간 동안 첨가하였다. 항온처리 후 플레이트를 PBS(3 x 100 μL/웰)로 세척하고 하이브리도마 mAb의의 결합을 PBS 중에 희석시킨 HRP-콘쥬게이션 이차 항체(즉, IgG2 항체의 경우 1:1000의 생쥐 항-인간 IgG2-HRP(SB 카탈로그 번호 9060-05) 또는 IgG4 항체의 경우 1:1000의 생쥐 항-인간 IgG4-HRP(Zymed 카탈로그 번호 3840)로 검출하 였다. 플레이트를 실온에서 1시간 동안 항온처리하고, PBS(3 x 100 μL/웰)에서 세척하고 최종적으로 100 μL의 OPD(o-페닐렌디아민 (DAKOS2405) + 5 μL의 30% H202/12 mL)로 발색시켰다. 플레이트를 10-20분간 발색되게 한 후, 반응을 100 μL의 2M H2SO4로 중지시켰다. 플레이트를 490 nm에서 판독하였다.
유착 분석:
ELISA에 의해 MAdCAM-IgG1 Fc 융합 단백질에 결합하는 것으로 입증된 항체를 α4β7 + JY 세포와, (i) MAdCAM-IgG1 Fc 융합 단백질 또는 (ii) MAdCAM-CHO 세포 중 어느 하나를 이용한 유착 분석에서 길항제 활성에 대하여 평가하였다.
(i) MAdCAM - IgG 1 Fc 융합물 분석
둘베코 PBS 중 4.5 μg/mL의 정제 MAdCAM-IgG1 Fc 융합 단백질의 용액 100 μL를 4℃에서 하룻밤 96웰의 Black Microfluor "B" u자형 바닥(Dynex # 7805) 플레이트에 흡착시켰다. 이어서 MAdCAM 코팅 플레이트를 거꾸로 하고 여분의 액체를 블로팅 제거한 후 37℃에서 1시간 이상 동안 10% BSA/PBS에서 차단하였다. 이 시간 동안 배양 JY 세포를 트립판 블루 배제법을 사용하여 계수하고(대략 8 x 105개의 세포/mL이어야 함) 20 x 106개의 세포/분석 플레이트를 50 mL 원심분리용 튜브 내로 피펫팅하였다. JY 세포를 2 mM L-글루타민 및 10%의 가열 불활성화 소 태아 혈청(Life Technologies # 10108-165)을 포함하는 RPMI1640 배지(Gibco)에서 배양하 고 1-2 x lO5/mL로 매 2-3일마다 접종하여 배양물이 분화되지 못하게 하였다. 세포를 원심분리(240 g)에 의해 2 mM L-글루타민(Gibco)을 함유하는 RPMI 1640 배지(Gibco)로 2회 세척하고, 최종 세포 펠렛을 칼세인(Calcein) AM 로딩을 위하여 RPMI 1640 중에 2 x 106개의 세포/mL로 재현탁하였다. 칼세인 AM(Molecular Probes # C-3099)을 DMSO 중의 1:200 희석물(대략적인 최종 농도: 5 μM)로 세포에 첨가하고, 항온처리(37℃, 30분) 동안 세포를 광선으로부터 보호하였다. 이 세포 항온처리 단계 동안, 시험할 항체를 하기와 같이 희석하였다: 단일 투여 시험의 경우, 항체를 PBS 중 0.1 mg/mL의 BSA(Sigma #A3059) 중 최대 3 ㎍/mL(최종: 1 ㎍/mL)로 제조하고; 완전한 IC50 곡선의 경우, 항체를 0.1 mg/mL의 BSA/PBS 중에 희석시키는데, 3 ㎍/mL(최종: 1 ㎍/mL)이 최고 농도가 되게 하고, 이어서 플레이트에 걸쳐서 2배 희석하였다(1:2의 비). 최종 웰의 중을 총 결합력의 측정에 사용하였으며, 따라서 PBS 중 0.1 mg/mL의 BSA가 사용되었다.
차단 후 플레이트의 내용물을 털어 내고 50 μL의 항체/대조군 각각의 웰에 첨가하고 플레이트를 37℃에서 20분 동안 항온처리하였다. 이 시간 동안, 칼세인-로딩된 JY 세포를 원심 분리에 의해 10% 소 태아 혈청을 포함하는 RPMI 1640 배지로 1회, 그리고 1 mg/mL의 BSA/PBS로 1회 세척하고, 최종 세포 펠렛을 1 x 106/mL로 1 mg/mL의 BSA/PBS에 재현탁시킨다. 100 μL의 세포를 U자형 바닥의 플레이트의 각각의 웰에 첨가하고, 플레이트를 밀봉하고, 짧게 원심분리하고(1000 rpm, 2분) 이 어서 플레이트를 37℃에서 45분 동안 항온처리하였다. 이 시간의 마지막에 플레이트를 Skatron 플레이트 세척기로 세척하고 형광을 Wallac Victor2 1420 Multilabel 판독기(여기 λ 485nm, 방출 λ 535nm, 플레이트의 기저부로부터의 상부, 8 mm로부터의 카운트, 보통의 방출 구경으로 0.1초)를 사용하여 측정하였다. 각각의 항체 농도에 있어서, 유착 퍼센트는 임의의 항체의 부재 하에서의 최대 형광 반응에서 비특이성 결합과 결부된 형광 반응을 제한 것의 백분율로 표현하였다. IC50 값은 유착 반응이 항-MAdCAM 항체의 부재 하에서 이 반응의 50%로 감소되는 항-MAdCAM 항체의 농도로 정의된다. JY 세포가 MAdCAM-IgG1 Fc 융합물에 결합하는 것을 < 0.1 ㎍/mL의 IC50 값으로 억제할 수 있는 항체는 강력한 길항제 활성을 갖는 것으로 간주되며 MAdCAM-CHO 유착 분석을 진행시켰다. 모든 12종의 시험한 Ab는 강력한 길항제 활성을 나타내었다(표 3). 모노클로날 항체 1.7.2, 1.8.2, 7.16.6, 7.20.5 및 7.26.4는 IgG2κ 계로부터 유래되며, 모노클로날 항체 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1 및 9.8.2는 IgG4κ 계로부터 유래되었다.
(ii) MAdCAM - CHO 세포 유착 분석
JY 세포를 상기와 같이 배양하였다. MAdCAM-발현 CHO 세포를 pEF5FRT MAdCAM cDNA 제작물로, 그리고 상기한 바와 같이 Flp 리콤비나제 기술(Invitrogen)을 사용하여 생성하였다. 하나의 안정한 MAdCAM-발현 CHO 세포 클론은 JY 세포의 유착과, 유세포 분석법에 의해 MAdCAM의 N-말단에 대하여 그리고 상기한 바와 같이 생성된 토끼 항-펩티드 항체의 결합을 지지하는 능력을 기초로 하여 선발하였다. MAdCAM-발현 CHO 세포를 2 mM L-글루타민, 10%의 소 태아 혈청(Gibco) 및 350 ㎍/mL의 하이그로마이신 B(Invitrogen)을 포함하는 DMEM/F12 배지(Gibco # 21331-020)에서 배양하고 매 2/3일마다 1:5로 나누었다. 유착 분석에 있어서, MAdCAM-발현 CHO 세포는 96웰의 투명 바닥의 블랙(black) 플레이트((Costar # 3904)에 200 μL의 배양 배지 중에 4 x 104개의 세포/웰로 접종하고 37℃/5% C02에서 하룻밤 배양하였다.
다음날, 상기한 바와 같이 하이브리도마 상청액 또는 정제 모노클로날 항체를 1 mg/mL의 BSA/PBS 중에 30 ㎍/mL(10 ㎍/mL의 최종 농도와 등가임)의 출발 농도로부터 희석시켰다. MAdCAM CHO 플레이트에 있어서, 플레이트 내용물을 털어내고 50 μL의 항체/대조군 각각의 웰에 첨가하고 플레이트를 37℃에서 20분 동안 항온처리하였다. 최종 웰의 줄을 총 결합력의 측정에 사용하였으며, 따라서 PBS 중 0.1 mg/mL의 BSA가 사용되었다. 상기와 같이 칼세인 AM-로딩 JY 세포를 1 mg/mL의 BSA/PBS 중에 1 x 106/mL의 농도로 제조하고, 이어서 항체와 함께 20분간 항온처리 한 후 100 μL를 플레이트에 첨가하였다. 이어서 플레이트를 37℃에서 45분 동안 항온처리하고, 이어서 Tecan 플레이트 세척기(PW 384) 상에서 세척하고 상기한 바와 같이 Wallac 플레이트 판독기를 사용하여 형광을 측정하였다. 각각의 항체 농도에 있어서, 유착 퍼센트는 임의의 항체의 부재 하에서의 최대 형광 반응에서 비특이성 결합과 결부된 형광 반응을 제한 것의 백분율로 표현하였다. JY 세포가 MAdCAM CHO 세포에 결합하는 것을 < 1 ㎍/mL의 IC50 값으로 억제할 수 있는 항체는 강력한 길항제 활성을 갖는 것으로 간주하였다. 이전과 같이, IC50 값은 유착 반응이 항-MAdCAM 항체의 부재 하에서 이 반응의 50%로 감소되는 항-MAdCAM 항체의 농도로 정의된다. 본 분석에서 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4 및 9.8.2의 잠재적인 IC50이 하기 표 3에 기술되어 있다.
Figure 112006056960219-pct00002
장과 결부된 림프 조직에 쓸모가 있는 고 내피 세정맥 상의 미세 혈관을 모방하도록 고안된 전단 응력 하에서, 유동 기반의 분석에서 항-MAdCAM MmAb의 길항제 효험을 측정하기 위하여, MAdCAM을 발현하는 CHO 세포를 유리 마이크로슬라이드(50 x 4 mm)에 도말하고 유착되게 하여 합류성(confluent) 단일층(대략 2.5 x 105개의 세포)을 형성하였다. 이어서 세포를 일련의 범위에 걸쳐(0.1-10 ㎍/mL) 37℃에서 20분 동안 친화성 정제된 mAb와 함께 항온처리한 후, 유동 분석 시스템에 연결하였다. 이소타입 매치되는 IgG2 또는 IgG4 mAb(10 ㎍/mL)를 음성 대조군으로 사용하였다. 보통의 공여체 말초 혈액 림프구(PBL)을 0.05 Pa의 일정 전단 응력으로 이 세포 단일층 위에 관류시켰다. 실험을 비디오로 녹화하고 림프구의 총 유착율(회전 + 고정 유착)을 계산하였다. 시험한 모노클로날 항체 모두는 상기 조건 하에서 강력한 길항제인 것으로 밝혀졌다.
(iii) Stamper-Woodruff 분석
MAdCAM+ 맥관을 가시화하기 위하여, 제조자의 지시에 따라 인산염 완충 염수 중의 20배 몰 과량의 비오틴-NHS(Pierce)를 사용하여 비오틴화 항-MAdCAM mAb를 1-2 mg의 친화성-정제된 단백질에 대하여 생성하였다. 반응물을 실온에 두고(30분), PD-10(Pharmacia) 컬럼으로 탈염시키고 단백질의 농도를 측정하였다.
정상 간 림프절을 공여체 기관으로부터 제거하고, 액체 질소에서 급속 냉동시키고 사용할 때까지 -70℃에 보관하였다. 10 ㎛의 저온 유지(cryostat) 절편을 절단하고, 폴리-L 리신 코팅 슬라이드 상에서 공기 건조시키고, 아세톤에서 고정한 후 분석하였다. 절편을 아비딘-비오틴 차단 시스템(DAKO)을 사용하여 차단시키고, 이어서 일련의 농도(1-50 ㎍/mL)에 걸쳐 실온에서(2시간) 비오틴화 항-MAdCAM mAb와 함께 항온처리하였다. 이소타입 매치되는 IgG2 또는 IgG4 mAb(50 ㎍/mL)를 음성 대조군으로, 그리고 차단 항-β7 항체(50 ㎍/mL)를 양성 대조군으로 사용하였다.
정상 공여체로부터 취해진 말초 혈액 림프구를 생쥐 항-인간 CD2 mAb(DAKO)로 표지하여 후속적인 유착성 세포의 가시화를 가능하게 하였다. 5 x 105개의 PBL을 각각의 림프절 절편에 첨가하고 30분 동안 항온처리한 후 온화하게 헹구어 유착성 세포가 박리되지 않게 하였다.
이어서 절편을 아세톤에 재고정시키고, 비오틴화 항-MAdCAM mAb(10 ㎍/mL), 이어서 비오틴화 염소-항-생쥐 mAb(CD2 표지된 PBL 및 미염색 MAdCAM+ 맥관의 인식을 위하여), 그리고 이어서 streptABcomplex/HRP(DAKO)와 함께 재항온처리하였다. 최종적으로 MAdCAM+ 맥관 및 CD2 표지 PBL는 DAB 기질(DAKO)을 절편에 첨가함으로써 가시화하였는데, 갈색 반응 생성물은 양성 염색 지역을 나타낸다. 림프구 유착은 간문맥관, 정맥 또는 동(sinusoid)의 50개의 MAdCAM-1+ 맥관에 유착하는 림프구의 갯수를 계수함으로써 정량화하였다. 이어서 평균 값으로 표현되는 데이터는 항체의 부재 하에서의 PBL의 유착을 100%로 하여, 유착 퍼센트로 정상화하였다. 데이터는 n=3의 상이한 PBL 공여체를 기준으로, 그리고 상이한 간 림프절 공여체에 대하여 집계하였다. 비오틴화 정제 모노클로날 항체 1.7.2 및 7.16.6에 대한 대표적인 데이터를 차단 항-β7 항체 대조군과 비교하여 도 4에 도시하였다.
선택성 분석:
VCAM 및 피브로넥틴은 MAdCAMDP 대하여 친밀한 구조 및 서열 상동체이다. 친화성-정제된 항-MAdCAM mAb는 α4β1 +/α5β1 + Jurkat T-세포(ATCC)가 이의 친족 세포 유착 분자에 결합하는 것을 차단하는 능력을 측정함으로써 MAdCAM-특이성에 대하여 평가하였다. 둘베코 PBS 중 4.5 ㎍/mL의 피브로넥틴 세포 결합 단편(110 Kd, Europa Bioproducts Ltd, 카탈로그 번호 UBF4215-18) 또는 VCAM(Panvera)의 용액 100 μL를 4℃에서 하룻밤 동안 96웰의 Black Microfluor "B" u자형 바닥(Dynex # 7805) 플레이트에 흡착시켰다. 이어서 코팅된 플레이트를 반대로 하고 여분의 액체를 블로팅 제거한 후, 10% BSA/PBS에서 1시간 이상 동안 37℃에서 차단하였다. 이 시간 동안 배양 Jurkat T 세포는 트립판 블루 배제법을 사용하여 계수하고 상기 JY 세포에 대하여 이전에 기술한 바와 같이 칼세인 AM 염료를 로딩하였다. 시험할 항체를 PBS 중 0.1 mg/ml의 BSA 중에 10 ㎍/mL의 최고 농도로부터 희석시켰다. 최종 웰의 줄을 총 결합력의 측정에 사용하였는데, 따라서 PBS 중 O.1 mg/mL의 BSA를 사용하였다. PBS 중에 제조한 에키스타틴(Echistatin)(Bachem, 카탈로그 번호 H-9010)을 100 nM의 최고 농도로 사용하여 α5β1/피브로넥틴 상호 작용을 차단하였다. 1 ㎍/mL의 최고 농도의 항-CD106 mAb(클론 51-lOC9, BD Pharmingen 카탈로그 번호 555645)를 사용하여 α4β1/VCAM 상호 작용을 차단하였다.
차단 후, 플레이트 내용물을 털어 내고 50 μL의 항체/대조군 각각의 웰에 첨가하고 플레이트를 37℃에서 20분 동안 항온처리하였다. 이 시간 동안, 칼세인-로딩된 Jurkat T 세포를 이전과 같이 1회 세척하고, 최종 세포 펠렛을 1 x 106/mL로 1 mg/mL의 BSA/PBS에 재현탁시킨다. 100 μL의 세포를 U자형 바닥의 플레이트의 각각의 웰에 첨가하고, 플레이트를 밀봉하고, 짧게 원심분리하고(1000 rpm, 2분) 이어서 플레이트를 37℃에서 45분 동안 항온처리하였다. 이 시간의 마지막에 플레이트를 Skatron 플레이트 세척기로 세척하고 형광을 Wallac Victor2 1420 Multilabel 판독기(여기 λ 485nm, 방출 λ 535nm, 플레이트의 기저부로부터의 상부, 8 mm로부터의 카운트, 보통의 방출 구경으로 0.1초)를 사용하여 측정하였다. 각각의 항체에 있어서, 억제 정도는 하기 표 4에 그림으로 표현하였다(- : 무시할 수 있는 유착 억제, ***: 완전한 유착 억제). 예시된 모든 mAb는 강력한 그리고 선택성을 갖는 항-MAdCAM 길항제인데, 이는 VCAM 및 피브로넥틴에 비하여 MAdCAM에 대한 선택성이 실질적으로 100배보다 크다는 것을 입증하는 것이다.
Figure 112006056960219-pct00003
하이브리도마는 하기의 기탁 번호로 2003년 9월 9일자로 영국 윌트셔 에스피4 0제이쥐 살리스버리 포튼 다운 CAMR의 H.P.A 소재의 유럽 세포 배양물 보존 기관(European Collection of Cell Cultures, ECACC)에 기탁되었다.
하이브리도마 기탁 번호
1.7.2 03090901
1.8.2 03090902
6.14.2 03090903
6.22.2 03090904
6.34.2 03090905
6.67.1 03090906
6.73.2 03090907
6.77.1 03090908
7.16.6 03090909
7.20.5 03090910
7.26.4 03090911
9.8.2 03090912
실시예 II:
BIAcore 에 의한 완전한 인간형 항- MAdCAM 모노클로날 항체의 친화도 상수 (K d )의측정
본 발명자들은 제조자의 프로토콜에 따라 BIAcore 3000 기기를 사용하여 표면 플라즈몬 공명에 의해 정제 항체의 친화도 측정을 수행하였다.
프로토콜 1
동력학적 분석을 수행하기 위하여, 일상적인 아민 커플링을 이용하여 CM5 BIAcore 센서칩 위에 고밀도 생쥐 항-인간(IgG2 및 IgG4) 항체 표면을 준비하였다. 하이브리도마 상청액은 100 ㎍/mL의 BSA 및 10 mg/mL 카르복시메틸덱스트란을 포함하는 HBS-P(10 mM HEPES, pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.005%의 계면활성제 P20) 러닝(running) 완충제 중에 10배, 5배, 2배 희석시키거나 희석시키지 않고 사용하였다. 각각의 mAb를 mAb 기준선의 안정화를 위하여 1분간의 접촉 시간 및 5분 간의 세척 시간을 이용하여 개별적인 표면 상으로 포착시켰다. 이어서 MAdCAM-IgG1 Fc(141 nM) 융합 단백질을 모든 표면 위에 1분 동안 주입하고 이어서 3분 동안 해리시켰다. BIAcore에 의해 제공되는 BIAevaluation 소프트웨어 상에서 이용가능한 기준선 드리프트(drift) 모델을 사용하여, 데이터를 각각의 표면 상에 포착되는 항체의 양에 대하여 정상화하고, 1:1의 범용 피트(fit) 랭뮤어(Langmuir)로 평가하였다.
프로토콜 2
친화성-정제된 mAb를 아민 커플링을 사용하여 CM5 바이오센서 칩의 덱스트란 층 상으로 고정화하였다. 칩은 pH 4.5의 아세트산염 완충제를 고정화 완충제로 사용하여 준비하였으며 2.5-5.5 kRU의 단백질 단위를 달성하였다. 러닝 완충제 중의 MAdCAM-IgG1 Fc 융합 단백질 샘플은 0.2-55 nM 범위의 농도로 제조하였다(러닝 완충제만을 포함하는 0 nM 용액을 0의 참조 용액으로 포함시킴). 샘플을 무작위화하고 HBS-EP(10 mM HEPES, pH 7.4, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0.005%의 계면활성제 P20)를 러닝 완충제로 사용하여 4개의 유동 세포에 걸쳐 각각 3분 동안 이중으로 주입하였다. 100 μL/분의 유속을 사용하여 매스(mass) 수송 시의 한정 사항을 최소화하였다. MAdCAM-IgG1 Fc 융합 단백질의 해리를 180분 동안 모니터링하고, 표면을 25 mM H3PO4(50 μL/분), 또는 10 mM(6.22.2), 20 mM(6.67.1, 6.73.2, 6.77.1) 내지 25 mM(6.34.2) 및 45 mM NaOH(6.14.2)의 6초 주입에 의해 재생하고 데이터를 BIAevaluation(v3.1) 소프트웨어 패키지를 사용하여 분석하였다.
표 5에는 본 발명의 대표적인 항-MAdCAM 항체의 친화도 측정치가 열거되어 있다.
Figure 112006056960219-pct00004
동력학적 분석에 의하면 본 발명에 따라 제조된 항체가 MAdCAM의 세포외 도메인에 대하여 강력한 결합 상수 및 높은 친화도를 보유한다는 것이 나타났다.
실시예 III
항- MAdCAM mAb 의 종 교차 반응성 및 에피토프 선택성의 확인
항체는 선형(일차) 서열 또는 구조(이차) 서열의 영역으로서 항원 상의 표면 노출된 에피토프를 인식한다. 항-MAdCAM 항체의 기능성 에피토프 풍경(landscape)를 정의하기 위하여, 루미넥스(Luminex) 에피토프 계급화(binning), BIAcore 계급화 및 종의 면역 조직 화학적 분석법을 함께 사용하였다.
루미넥스 -기반의 에피토프 계급화:
MxhlgG 2,3.4-콘쥬게이션된 비드(Calbiochem Ml 1427)를 미공지 일차 항-MAdCAM 항체에 커플링시켰다. 150 μL의 미공지 일차 항체 희석물(하이브리도마용 배지 중에 희석시킨 0.1 ㎍/mL)을 96웰의 조직 배양 플레이트의 웰에 첨가하였다. 비드 원액을 온화하게 와동시키고 상청액 중에 0.5 x 105개의 비드/mL의 농도로 희석시켰다. 비드를 암소에서 4℃에서 하룻밤 진탕기 상에서 상청액에서 항온처리하였다.
96-웰 마이크로타이터 필터 플레이트(Millipore # MABVN1250)의 각각의 웰을 200 μL의 세척 완충제(0.05%의 트윈 20을 포함하는 PBS)의 첨가로 사전 습윤시키고 흡인으로 제거하였다. 다음, 50 μL/웰의 0.5 x 105개의 비드/mL의 원액을 필터 플레이트에 첨가하고, 웰을 세척 완충제(2 x 100 μL/웰)로 세척하였다. 하이브리도마용 배지 중에 희석시킨 60 μL/웰의 MAdCAM-IgG1 Fc 항원(0.1 ㎍/mL)을 첨가하였다. 플레이트의 뚜껑을 덮고, 이 플레이트를 실온에서 1시간 동안 온화하게 진탕시키면서 항온처리하였다. 웰을 100 μL/웰의 세척 완충제의 첨가, 이어서 흡인에 의해 2회 세척하였다. 다음, 하이브리도마용 배지 중에 희석시킨 60 μL/웰의 미공지 이차 항-MAdCAM 항체(0.1 ㎍/mL)를 첨가하였다. 플레이트를 암소에서 2시간 동안 실온에서 진탕시켰다. 다음, 웰을 100 μL/웰의 세척 완충제의 첨가, 이어서 흡인에 의해 2회 세척하였다. 다음, 60 μL/웰의 비오틴화 MxhIgG 2,3,4(0.5 ㎍/mL)를 첨가하였다. 플레이트를 암소에서 1시간 동안 실온에서 진탕시켰다. 웰을 100 μL/웰의 세척 완충제의 첨가, 이어서 흡인에 의해 2회 세척하였다. 각각의 웰에 하이브리도마용 배지 중에 희석시킨 60 μL의 1 ㎍/mL MxhIgG 2,3,4 스트렙타비딘-PE(Pharmacia # 554061)를 첨가하였다. 플레이트를 암소에서 20분 동안 실온에서 진탕시켰다. 웰을 100 μL/웰의 세척 완충제의 첨가, 이어서 흡인에 의해 2회 세척하였다. 다음, 각각의 웰은 80 μL의 차단 완충제(0.5%의 소 혈청 알부민, 0.1%의 트윈 및 0.01%의 티메로살을 포함하는 PBS)에 재현탁시키고 조심스럽게 아래 위로 피펫팅하여 비드를 재현탁시켰다.
루미넥스 100 및 이의 수반 소프트웨어(Luminex(등록상표) Corporation)를 사용하여 플레이트를 판독하여 발광 판독치를 결정하였다. 다양한 시험 항-MAdCAM 항체에 대하여 얻어진 발광 데이터에 기초하여, 항-MAdCAM 항체를 이의 결합 특이성에 따라 분류하였다. 시험한 항-MAdCAM 항체는 표 8에 제시된 일련의 에피토프 빈(bin)으로 분할한다.`
BIAcore 계급화:
상기한 것과 유사한 방법에 있어서, BIAcore를 사용하여 본 발명에 의해 예시되는 항-MAdCAM 항체의 에피토프 배타성(exclusivity)을 또한 측정할 수 있다. 9종의 항-MAdCAM 항체 클론, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.77.1, 7.20.5, 9.8.2, 1.7.2, 7.26.4 및 7.16.6을 아민 커플링을 사용하여 CM5 바이오센서 칩의 개별적인 유동 세포의 덱스트란 층 상으로 고정화하였다. 고정화 완충제는 pH 4.5의 10 mM 아세트산염 완충제(클론 6.22.2, 6.34.2, 7.20.5, 9.8.2, 1.7.2, 7.26.4 및 7.16.6) 또는 pH 5.5의 10 mM 아세트산염 완충제(클론 6.67.1 및 6.77.1)이었다. 대략 3750 RU의 단백질 밀도를 모든 경우에서 성취하였다. 미반응 N-히드록시숙신이미드 에스테르의 불활성화는 pH 8.5의 1 M 에탄올아민 염산염을 사용하여 수행하였다.
MAdCAM-IgG1 Fc 융합 단백질은 HBS-EP 러닝 완충제(0.01 M HEPES, pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.005%의 폴리소르베이트 20) 중에 1.5 ㎍/mL(대략 25 nM)의 농도로 희석시켰다. 이어서 제1 유동 셀을 가로질러 50 μL의 부피로, 5 μL/분의 유속으로 이것을 주입하였다. 주입을 완료한 후, 제1 항체 프로브를 동일 유동 셀에 첨가하였다. 모든 시험 항체는 HBS-EP 중에 대략 20 ㎍/mL의 농도로 희석시키고, 또한 50 μL의 부피로 5 μL/분의 유속으로 주입하였다. 시험 항체가 결합하지 않는다는 것이 관찰될 경우, 다음 시험 클론을 그 직후에 주입하였다. 결합이 일어났을 경우, 센서 표면을 재생하여 MAdCAM-IgG1 Fc 융합 단백질 및 시험 항체 둘 다를 제거하였다. 다양한 재생 용액을 고정화 항체 및 존재하는 시험 항체에 따라 사용하였다. 사용한 재생 조건에 대한 개요가 표 6에 예시되어 있다.
Figure 112006056960219-pct00005
재생 후, MAdCAM-IgG1 Fc 융합 단백질을 다시 결합시키고 추가의 시험 항체를 주입하였다. 이 절차는 MAdCAM-IgG1 Fc 융합 단백질이 결합된 고정화 항체의 표면 위에 전체 클론 패널이 주입될 때까지 실시하였다. 이어서 상이한 고정화 항체 및 결합 MAdCAM을 포함하는 새로운 유동 셀을 9종의 시험 클론을 이용한 프로빙에 사용하였다. 항-MAdCAM 항체 1.7.2 및 1.8.2는 각각 서열 번호 2, 4, 6, 8의 서열의 중쇄 및 카파 경쇄의 친밀한 일차 아미노산 서열 상동성에 기초하면, 동일한 MAdCAM 에피토프를 인식할 것으로 기대되었다. 따라서, 1.7.2만을 BIAcore 반응 매트릭스를 통하여 평가하였다. 항체 6.14.2 및 6.73.2는 이 분석에서 누락시켰지만, 항-MAdCAM 항체 쌍의 모든 다른 조합은 이러한 방식으로 시험하였다. 결합/비결합 사이의 역치로서 100 RU의 임의의 수준을 선택하였으며, 반응 매트릭스(표 7)는 결합이 관찰되는지에 기초하여 생성하였다.
Figure 112006056960219-pct00006
표 7에 있어서의 매트릭스의 대각선 부분(흐리게 한 회색)에는 동일한 프로브 쌍의 결합 데이터가 포함되어 있다. 2종의 클론 7.16.6 및 9.8.2를 제외한 모든 경우에, 항체는 자가 차단되었다. 항체 7.16.6 및 9.8.2는 교차 경쟁하지 않는다. 자가 차단의 결여는, mAb가 MAdCAM-IgFc 상의 제2 부위에 추가로 결합되게 하는 융합 단백질에서의 mAb-유발 배좌 변화로 인한 것일 수 있다.
도 5의 도표에 도시되어 있는 바와 같이, 동일한 반응성 패턴을 나타내는 클론의 분류에 의해 6개 이상의 상이한 에피토프 빈이 생성된다.
항-MAdCAM 항체가 상호 작용하는 MAdCAM 에피토프 서열의 추가의 정확환 확인은, 스포팅된 펩티드 라이브러리 어레이의 웨스턴 분석(문헌[Reineke et al., Curr. Topics in Microbiol. and Immunol 243: 23-36(1999), M. Famulok, E-L Winnacker, C-H Wong eds., Springer-Verlag, Berlin]), 파지 또는 박테리아 플라겔린(flagellin)/fliC 발현 라이브러리 디스플레이, 또는 단백질 분해 제한에 따른 결합된 단백질 단편의 단순 MALDI-TOF 분석을 포함하지만 이로 한정되지는 않는 임의의 다수의 방법으로 결정할 수 있다.
면역 조직 화학적 분석:
회장(파이어 판), 장간막 림프절, 비장, 위, 십이지장, 공장 및 결장의 OCT 또는 수크로스에 포매된 냉동 조직 생검체를 항-MAdCAM mAb의 양성 염색 대조군으로 사용하였다. 인간 절편을 인간 IgG2 mAb로 염색하기 위하여, 항-MAdCAM mAb의 비오틴화 유도체를 생성하였다. 10 ㎛의 냉동 조직 절편을 폴리 L-리신 코팅된 슬라이드 상으로 절단하고, 4℃의 100% 아세톤(10분), 이어서 메탄올 중 3% 과산화수소(10분) 내에 직접 두고, 단계들 사이에 PBS로 세척하였다. 이 슬라이드를 비오틴 차단 시스템(DAKO 카탈로그 번호 X0590)으로 차단한 후, PBS 중 일차 항체(1:100 - 1:1000)와 함께 항온처리하고(1시간), PBS-트윈 20(0.05%)으로 세척하고 이어서 결합물을 HRP-스트렙타비딘(BD Bioscience 카탈로그 번호 550946, 30분) 및 DAB 기질(Sigma 카탈로그 번호 D5905)로 발색시켰다. IgG4 mAb의 경우, HRP-콘쥬게이션된 이차 생쥐 항-인간 IgG4(Zymed 카탈로그 번호 3840)를 사용하였다. 슬라이드를 마이어 하에말룸(Mayer's Haemalum)으로 대조 염색하고(1분), 세척하고 이어서 DPX에 적재하였다.
결합 친화도를 다수의 종(생쥐, 쥐, 토끼, 개, 돼지, 사이노몰거스 및 인간의 조직)에 대하여 비교하였다. 면역 조직 화학적 방법에 의하면 쥐, 토끼 및 돼지 조직에 대한 반응성은 전혀 없었으며 ELISA로 분석할 경우 재조합 생쥐 MAdCAM에 대한 항-MAdCAM 항체의 교차 반응성은 전혀 없었다. 인간, 사이노몰거스 및 개의 조직에 대한 데이터를 표의 형태의 하기 표 8에 제시하였다.
Figure 112006056960219-pct00007
분화된 내피 구조 및 림프 조직에의 항-MAdCAM의 결합은 색조(key)에 따른 흐림에 의해 나타내어져 있다. MAdCAM 교차 반응성의 패턴 및 루미넥스 에피토프 분석에 기초한 에피토프의 빈이 각각의 항체에 대하여 나타내어져 있다. 문자 폰트에 있어서의 상이성에 의해 나타내어지는 바와 같이, 항-MAdCAM 항체 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.3 및 6.77.1(이탤릭체)에 대한 루미넥스 에피토프 계급화 데이터는 1.7.2, 1.8.2, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4 및 9.8.2(볼드체 유형)에 대한 것과 별개인 실험으로부터 유도되었다.
시험한 모든 항-MAdCAM 항체는 위장관의 혈관 내피 구획 상에서 발현되는 인간 MAdCAM 에피토프를 인식하는 능력이 있다. 1.7.2 및 1.8.2 이외에, 시험한 모든 다른 항-MAdCAM 항체는 사이노몰거스의 위장관의 혈관 내피 구획에 특이적으로 결합할 수 있었다. 소정의 다른 항-MAdCAM 항체, 즉, 6.14.2 및 6.67.1도 개 MAdCAM 오르토로그와, 사이노몰거스 MAdCAM을 특이적으로 인식하는 능력이 있었다.
기능적 활성 키메라 사이노몰거스/인간 MAdCAM -발현 CHO 세포주의 생성:
인간 및 사이노몰거스 MAdCAM에 대한 소정 항-MAdCAM 항체의 결합 친화도에 있어서의 상이성으로 인하여 이 관찰의 구조적 기반이 만들어질 수 있는지를 결정하게 되었다.
머카크(Macaque) MAdCAM의 공지된 아미노산 서열에 기초하여(문헌[Shyjan AM, et al., Immunol., 156, 2851-7(1996)]), 프라이머를 고안하여 사이노몰거스 MAdCAM α4β7 결합 도메인 서열을 PCR 증폭시켰다. 전 RNA를 제조자의 지시에 따라 트리졸(Trizol) 방법(Invitrogen)을 사용하여 냉동된 잘라낸 사이노몰거스 장간막 림프절(대략 200 mg)로부터 제조하였다. 1-2 ㎍을 올리고-dT로 프라이밍하고 AMV 역전사효소(Promega)로 역전사하였다. 역전사된 생성물의 일부를 정방향(forward) 5'-AGC ATG GAT CGG GGC CTG GCC-3'(서열 번호 67) 및 역방향 5'- GTG CAG GAC CGG GAT GGC CTG-3'(서열 번호 68) 프라이머를 이용하여 1 M GC 용융물 중 GC-2 폴리머라제(Clontech)를 이용하여 62℃의 어닐링 온도에서 PCR을 실시하였다. 적절한 크기의 RT-PCR 생성물을 전기 영동 후 1% 아가로스 겔로부터 잘라내며 정제하고, 이어서 pCR2.1의 EcoRI 부위들 사이에 TOPO-TA 클로닝하였다(Invitrogen). 삽입체의 서열을 확인하였다. 뉴클레오티드 및 예측되는 번역 아미노산의 서열이 각각 서열 번호 49 및 50에 예시되어 있다.
α4β7 결합 도메인에 있어서의 예측되는 인간 및 사이노몰거스 MAdCAM의 아미노산 서열은 정렬될 경우 높은 서열 동일성 정도(90.8%)를 나타낸다(도 3에 이 서열 정렬이 제공되어 있음). 표 8에 제시된 항-MAdCAM 결합 패턴을 모방하는 기능적 활성 사이노몰거스 MAdCAM-발현 세포주의 생성을 위하여, pCR2.1 중의 사이노몰거스 α4β7 결합 도메인 서열에 상응하는 SacI 단편을, 상기의 카르복실-말단 뮤신 줄기(stalk) 및 막통과 도메인을 포함하는 C-말단 인간 MAdCAM pIND-Hygro 제작물 내로 직접 서브클로닝하였다. 제조자의 지시에 따라, 서열 및 배향을 확인하고, 이어서 KpnI/NotI 단편을 pEF5FRTV5GWCAT 벡터(Invitrogen) 내로 클로닝하여, CAT 코딩 서열을 대체하고 이를 트랜스펙션에서 이용하여 Flp In CHO 세포(Invitrogen)에서 안정하게 발현되는 단일한 클론을 생성하였다.
사이노몰거스/인간 MAdCAM 키메라를 발현하는 CHO 세포에의 항-MAdCAM 항체 클론의 결합을 유세포 분석법으로 평가하고, 상기한 것과 매우 유사한 JY 세포 유착 분석을 이용하여 항-MAdCAM 항체의 기능적 활성을 측정하였다. 항-MAdCAM 항체의 결합 및 기능적 활성이 표 9에 표현되어 있다.
Figure 112006056960219-pct00008
이를 종합해 볼 때, 면역 조직 화학적 방법에 의해 검출되는 바와 같이(표 8) 주어진 항-MAdCAM 항체가 인간 또는 사이노몰거스 MAdCAM에 결합하는 능력과, 재조합 세포 기반의 결합 및 기능적 활성(표 9) 사이에는 우수한 상관 관계가 존재한다. 예를 들어 항-MAdCAM 항체 1.7.2, 1.8.2 및 6.73.2에서는 사이노몰거스 조직 및 키메라형 사이노몰거스/인간 MAdCAM 단백질을 발현하는 세포에의 결합이 일관되게 결여됨이 입증되었다. 또한 항-MAdCAM 항체 1.7.2, 1.8.2 및 6.73.2는 사이노몰거스/인간 MAdCAM/JY 유착 분석에 있어서 기능적 차단 활성의 검출 능력이 없었다.
유사한 접근법을 이용하여 개의 MAdCAM을 인식하는 항-MAdCAM 항체 6.14.2 및 6.67.1의 에피토프를 정의할 수 있었다.
실시예 IV:
질환 진단 방법으로서 순환하는 가용성 MAdCAM의 검출에 있어서의
항-MAdCAM mAb의 사용
항-MAdCAM 항체를 순환하는 가용성 MAdCAM(sMAdCAM)의 검출에 사용할 수 있다. 임상적 혈장, 혈청 샘플 또는 기타 생체 유체, 예를 들어 한정됨이 없이, 대변, 소변, 담에서의 sMAdCAM의 검출은 염증성 장질환을 포함하지만 이로 한정되지는 않는 근원적 질환에 있어서의 유용한 대용 질환 생체 마커일 가능성이 있다.
에피토프 계급화 데이터(표 7 및 8)에 기초하면, 항-MAdCAM 항체 1.7.2 및 7.16.6은 인간 MAdCAM 상의 상이한 에피토프를 인식하는 것으로 나타났다. ELISA 플레이트를 4℃에서 하룻밤 100 μL/웰의 50 ㎍/mL의 인산염 완충 염수(PBS) 중의 1.7.2의 용액으로 코팅하였다. 항온처리 후 플레이트를 10% 밀크를 포함하는 PBS 차단 완충제(200 μL/웰)로 1.5시간 동안 차단하였다. 항온처리 후 플레이트를 PBS(2 x 100 μL/웰)로 세척하고, 최고 농도 50 ㎍/mL에서 아래로 대략 5 ng/mL의 PBS 중의 MAdCAM-IgG1-Fc 융합 단백질을 100 μL의 최종 부피로 연속적으로 희석시킨 것을 플레이트에 첨가하여 실온에서 2시간 동안 항온처리하였다. 유사한 접근법으로, 하기에 기술되어 있는 바와 같이 MAdCAM-IgG1-Fc 단백질을 혈장 또는 혈청, 또는 기타 몇몇의 그러한 관련 생체 유체 중에 희석시키고 이를 사용하여 임상 샘플에서의 가용성 MAdCAM의 발현을 측정할 수 있다. 음성 대조군으로서, 일차 항-MAdCAM 항체를 포함하는 웰에 완충제만을 첨가하였다. 이 시간 후, 플레이트를 PBS로 세척하고(3 x 100 μL/웰) 이어서 플레이트를 암소에서 Alexa488 표지된 7.16.6(100 μL, 5 ㎍/mL)과 함께 항온처리하였다. Alexa488 표지된 7.16.6은 제조자의 프로토콜에 따라 구매 가능한 키트(Molecular Probes, A-20181)를 사용하여 생성하였다.
플레이트를 0.05% 트윈-20을 포함하는 PBS로 세척하고, 포착된 가용성 MAdCAM에 대한 표지된 7.16.6의 결합을 형광 측정(Wallac Victor2 1420 Multilabel 판독기, 여기 λ 485nm, 방출 λ 535nm, 플레이트의 기저부로부터의 상부, 3 mm로부터의 카운트, 보통의 방출 구경으로 0.1초)에 의해 측정하였다. 형광성을 도 6에서와 같이 MAdCAM-IgG1-Fc 융합 단백질의 농도의 함수로서 도시할 경우, 1.7.2 및 표지된 7.16.6을 진단 목적용으로 사용하여 생체 유체 또는 임상 샘플에서 발현되는 순환하는 가용성 MAdCAM의 수준을 측정할 수 있음이 나타났다. 표 7 및 도 5의 데이터 및 해석에 의해 약술되는 바와 같이, 이러한 샌드위치 ELISA 접근법은 1.7.2 및 7.16.6의 사용에뿐만 아니라 MAdCAM 상의 상이한 에피토프를 인식하는 임의의 조합의 항-MAdCAM 항체에 대해서도 제한되지 않는다. 상이한 상대, 변이체, 표지 등을 사용하여, 기술된 다른 항-MAdCAM 항체를 이용하여, 면역 조직 화학적 방법 및 웨스턴 블롯과 같은 유사한 분석의 개발에 유사한 전략을 적용할 수 있다.
실시예 V:
본 발명에 따라 제조한 항- MAdCAM mAb 의 아미노산의 구조
하기의 논의에 있어서, 본 발명에 따라 제조한 항-MAdCAM mAb와 관련한 구조에 대한 정보가 제공되어 있다.
본 발명에 따라 제조되는 mAb의 구조를 분석하기 위하여, 특정 하이브리도마 클론으로부터 중쇄 및 경쇄 단편을 코딩하는 유전자를 클로닝하였다. 유전자 클로닝 및 서열 결정은 하기와 같이 하였다:
Fast-Track 키트(Invitrogen)를 사용하여 면역화 제노마우스 생쥐로부터 유래되는 대략 2 x 105개의 하이브리도마 세포로부터 폴리(A)+ mRNA를 단리하였다. 그 후 PCR로 랜덤 프라이밍된 cDNA를 생성하였다. 인간 VH 또는 Vκ 패밀리 특이성 프라이머(문헌[Marks et al., 'Oligonucleotide primers for polymerase chain reaction amplification of human immunoglobulin variable genese and design of family-specific oligonucleotide probes'; Eur. J. Immunol., 21, 985-991 (1991)]) 또는 보편적 인간 VH 프라이머, MG-30(5'-CAG GTG CAG CTG GAG CAG TCI GG-3(서열 번호 108)을 인간 Cγ2에 특이적인 프라이머, MG40-d(5'-GCT GAG GGA GTA GAG TCC TGA GGA-3)(서열 번호 109) 또는 Cγ4 불변 영역에 특이적인 프라이머, MG-40d (5'GCT GAG GGA GTA GAG TCC TGA GGA CTG T -3)(서열 번호 110), 또는 Cκ 불변 영역에 특이적인 프라이머 (hκP2; 문헌[Green et al., 1994]에 이전에 기술되어 있는 바와 같음)와 함께 사용하였다. 하이브리도마로부터의 인간 mAb 유래의 중쇄 및 카파쇄 전사체의 서열은 상기 프라이머를 사용하여 폴리 (A+) RNA로부터 생성된 PCR 생성물의 직접적인 서열 결정에 의해 얻었다. PCR 생성물은 TOPO-TA 클로닝 키트(Invitrogen)을 사용하여 pCR2.1 내로 클로닝하고, 두 개의 가닥 모두를 Prism 염료 종결자 서열 결정 키트 및 ABI 377 서열 결정 기계를 사용하여 서열 결정하였다. 모든 서열은 'V BASE 서열 디렉토리'에 대한 정렬로 분석하였다(문헌[Tomlinson, et al, J. Mol. Biol., 227, 776-798 (1992)]; 문헌[Hum. Mol. Genet., 3, 853-860 (1994)]; 문헌[EMBO J., 14, 4628-4638 (1995)])
또한 각각의 항체, 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod 및 7.26.4-mod에 대하여 전장 DNA의 서열 결정을 실시하였다. 이를 위하여 전 RNA를 RNeasy 키트(Qiagen)를 사용하여 대략 3-6 x 106개의 하이브리도마 세포로부터 단리하였다. 이 mRNA를 올리고-dT 및 AMV-기반의 역전사효소 시스템 (Promega)을 사용하여 역전사시켰다. 표 10a 및 10b에 제시된 바와 같이 V BASE를 사용하여 최적 Kozak 서열 및 ATG 출발 코돈을 포함하는 5' 특이성 증폭용 프라이머와, 특정 중쇄 및 카파쇄를 위한 3' 역방향 프라이머를 고안하였다.
Figure 112006056960219-pct00009
Figure 112006056960219-pct00010
Expand High Fidelity Taq 폴리머라제(Roche)를 사용하여 프라이머 쌍을 이용하여 cDNA를 증폭시키고, 이 PCR 생성물을 후속적 서열 결정을 위하여 pCR2.1 TOPO-TA(Invitrogen) 내로 클로닝하였다. 이어서 중쇄 및 카파 경쇄의 서열이 확인된 클론을 각각 XbaI/EcoRI 및 HindIII/EcoRI 부위를 사용하여 pEE6.1 및 pEE12.1 벡터(LONZA) 내로 클로닝하였다.
유전자 이용성 분석
표 11은 본 발명에서 약술된 각각의 하이브리도마에 있어서의 중쇄 및 카파 경쇄 유전자의 이용성을 나타낸다.
Figure 112006056960219-pct00011
서열 분석
항체의 구조를 추가로 조사하기 위하여 항체의 예측 아미노산 서열을 클론으로부터 수득한 cDNA로부터 얻었다.
서열 식별 번호(서열 번호) 1-48 및 51-68은 항-MAdCAM 항체 1.7.2(서열 번호 1-4), 1.8.2(서열 번호 5-8), 6.14.2(서열 번호 9-12), 6.22.2(서열 번호 13-16), 6.34.2(서열 번호 17-20), 6.67.1(서열 번호 21-24), 6.73.2(서열 번호 25-28), 6.77.1(서열 번호 29-32), 7.16.6(서열 번호 33-36), 7.20.5(서열 번호 37-40), 7.26.4(서열 번호 41-44), 9.8.2(서열 번호 45-48)와 변형 항-MAdCAM 항체 6.22.2-mod(서열 번호 51-54), 6.34.2-mod(서열 번호 55-58), 6.67.1-mod(서열 번호 59-62) 및 6.77.1-mod(서열 번호 63-66) 및 7.26.4-mod(서열 번호 41-42, 67-68)의 중쇄 및 카파 경쇄의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 제공한다. 클로닝된 각각의 항-MAdCAM 항체의 서열에 있어서, 신호 펩티드 서열의 서열(또는 그를 코딩하는 염기)이 보다 하부의 케이스에 나타내어져 있으며 밑줄이 그어져 있다.
도 1A-1J는 항체 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4 및 9.8.2의 중쇄의 예측 아미노산 서열과, 개개의 생식 세포의 유전자 생성물의 아미노산 서열 사이의 서열 정렬을 제공한다. 항체의 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열의 위치는 밑줄이 그어져 있으며, 발현 서열과, 상응하는 생식 세포의 서열 사이의 상이성은 볼드체로 나타내어져 있고, 생식 세포와 비교하여 발현된 서열에서 부가가 존재할 경우 이는 생식 세포의 서열에서(-)로 나타내어져 있다.
도 1K-1T는 항체 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4 및 9.8.2의 카파 경쇄의 예측 아미노산 서열과, 개개의 생식 세포의 유전자 생성물의 아미노산 사이의 서열 정렬을 제공한다. 항체의 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열의 위치는 밑줄이 그어져 있으며, 발현 서열과, 상응하는 생식 세포의 서열 사이의 상이성은 볼드체로 나타내어져 있고, 생식 세포와 비교하여 발현된 서열에서 부가가 존재할 경우 이는 생식 세포의 서열에서 (-)로 나타내어져 있다.
번역후 변형의 존재: 글리코실화 및 탈아미드화
유래된 생식 세포의 서열과 비교하여, 발현된 항-MAdCAM 항체의 서열에서의 변화들 중 몇몇 변화의 효과는 잠재적으로 N-결합 글리코실화(Asn-X-Ser/Thr) 및/또는 탈아미드화(Asn-Gly)에 처해질 수 있는 잔기를 도입하는 것이다(표 12 참조). 항-MAdCAM 항체 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.26.4 및 9.8.2의 카파 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열(서열 번호: 16, 20, 24, 28, 32, 44 및 48)과 항체 6.14.2의 중쇄 가변 도메인의 아미노산 서열(서열 번호 10)을 코딩하는 핵산 서열에 의해 N-결합 글리코실화의 존재가 예측된다. 이러한 번역 후 변형의 존재는 SDS-PAGE 및 Pro-Q(등록상표) Emerald 488 당단백질(Molecular Probes) 염색과, mAb인 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.26.4 및 9.8.2의 조합을 사용하여 조사하였다.
간략하게는, 대략 2 ㎍의 환원 항-MAdCAM 항체를 MOPS 완충제를 사용하여 4-12%의 SDS-폴리아크릴아미드 상으로 로딩하였다. 전기영동 후, 겔을 50% MeOH, 5% 아세트산에서 고정시키고 3% 아세트산에서 세척하였다. 이어서 겔 상의 모든 탄수화물을 과요오드산으로 산화시키고 Pro-Q(등록상표) Emerald 488 당단백질 염색 키트(Molecular Probes)를 사용하여 염색하였다. 최종 세척 단계 후, 당단백질 염색물을 473 nm의 파장으로 설정한 형광 스캐너를 사용하여 가시화하였다.
당단백질 염색 후, 겔을 SYPRO Ruby 단백질 겔 염색제를 사용하여 전체 단백질에 대하여 염색하고 473 nm의 파장으로 설정한 형광 스캐너를 사용하여 가시화하였다. 항-MAdCAM 항체, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.26.4 및 9.8.2의 카파 경쇄는 글리코실화의 존재에 대하여 모두 양성으로 염색되었다. 추가의 확인으로서, 항-MAdCAM 항체 7.26.4에 대하여 트립신/키모트립신 소화를 실시하고, LC-MS/MS 분석에 의해 변형된 트립신 펩티드의 존재를 확인하고 카파 경쇄 글리코실화에 대한 추가의 확인을 제공하였다.
항-MAdCAM 항체, 1.7.2, 1.8.2, 6.22.2 및 7.20.5의 CDR1 영역 중의 특이적 Asn-Gly 서열에 의해 이 영역은 탈아미드화에 대하여 민감하게 된다. 중성 pH에서의 탈아미드화에 의해 음전하가 도입되며 β-이성질체화도 될 수 있는데, 이는 항체의 특성에 영향을 미칠 수 있다. 항-MAdCAM 항체 1.7.2, 1.8.2 및 7.20.5에 있어서, 탈아미드화 Asn-이소아스파르테이트 잔기의 존재는 이소아스파르테이트 측쇄를 MeOH로 트랩핑한 후 질량 분광법으로 평가하였다.
간략하게는, 항-MAdCAM 항체 1.7.2에 있어서, 트립신/Asp-N 펩티드 SSQSLLQSNGYNYL(서열 번호 69)(1573.7 Da)의 상태를 LC-MS/MS에 의한 모니터링을 위하여 선발하였다. 항-MAdCAM 항체 1.7.2를 10 mM DTT에서 환원시키고, 5 mM Na 요오도아세테이트에서 알킬화하고 그 후 트립신 소화 완충제(50 mM 트리스-HCl, 1mM CaCl2, pH 7.6)로 완충제를 교환하였다. 이어서 항체를 서열 결정 등급의 변형 트립신(Promega)와 1:20의 프로테아제:단백질의 비로 혼합하였다. 단백질을 트립신에서 30℃에서 15시간 동안 소화시키고, 생성된 펩티드를 Ettan LC 시스템 상에서 C-18 RPC를 사용하여 HPLC로 분리하였다. 33Asn-함유 펩티드(4032 Da)를 컬럼으로부터 수집하고 Asp-N 소화 완충제(50 mM의 인산나트륨 완충제, pH 8.0)에 희석시켰다. 이어서 대략 10:1의 펩티드:효소의 비로 엔도프로티나제 Asp-N(Roche)을 첨가하였다.
아세틸 클로라이드(100 μL)를 메탄올 샘플(1 mL, -20℃)에 첨가하고, 이 혼합물을 실온으로 가온하였다. 트립신+Asp-N 소화물을 Speed-Vac에서 건조시키고 이어서 5 μL의 메탄올/아세틸 클로라이드를 첨가하고(45분, 실온), 이어서 Speed-Vac에서 다시 건조시켰다. 생성된 잔류물을 0.1% TFA에서 재구성하고 펩티드를 니트로셀룰로오스 박층 샘플 제조 방법 또는 C18 ZipTips(Millipore)를 사용한 역상 정제법 중 어느 하나를 사용하여 Voyager-DE STR MALDI-TOF 질량 분광계 상에서 처음으로 분석하고 이어서 α-시아노 매트릭스와 점적 혼합하였다. 메틸화 펩티드 혼합물은 또한 상기한 바와 같이 Deca XP Plus Ion Trap 질량 분광계 상에서 LC-MS/MS를 사용하여 분석하였다. 용출물은 Ion Trap MS 내로 직접 떨어지게 하고 그 후 펩티드를 MS 및 MS/MS로 분석하였다. MS는 300 내지 2000 Da 사이의 모든 이온을 분석하도록 설정하였다. 이어서 임의의 특정 스캔에 있어서의 가장 강한 이온을 MS/MS 분석하였다.
Figure 112006056960219-pct00012
돌연변이 유발 연구
본 발명에 예시되어 있는 항-MAdCAM 항체의 일차 아미노산 서열은 특정 부위 돌연변이 유발에 의해 변형되어 번역 후 변형(예를 들어 글리코실화, 탈아미드화)의 잠재적인 부위를 제거하거나 이소타입 배경을 변경하거나, 또는 치료적 이용성을 개선시킬 수 있는 다른 변화를 조작할 수 있다. 예로서, PCR을 사용하여 항-MAdCAM 항체 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.77.1 및 7.26.4에 대한 변화를 조작하여 소정 골격 서열을 생식 세포의 서열로 복귀시키고, 잠재적인 글리코실화 부위를 제거하고/하거나, 이소타입 배경을 인간 IgG2로 변화시켰다. 중쇄 뉴클레오티드 서열 번호 13, 17, 21 및 29와, 카파 경쇄 뉴클레오티드 서열 번호 15, 19, 23, 31 및 43에 상응하는, pCR2.1 TOPO-TA 클로닝된 cDNAs(100 ng)를, 표 10a 및 10b에 기술되어 있는 프라이머 세트의 패널 및 중복-연장을 사용하는 일련의 PCR에서 주형으로 사용하였다.
6.22.2 중쇄: Expand Taq 폴리머라제 및 뉴클레오티드 서열 번호 13에 의해 나타내어지는 pCR2.1 TOPO-TA cDNA 주형(100 ng)을 사용하여, PCR 프라이머 세트 6.22.2_VH_F1 및 6.22.2VH_CS* (1) 및 VH3-33 및 6.22.2_VH_R1 (2)을 사용하여 개별적인 PCR 생성물 (1) 및 (2)를 생성하였다. 생성물 (1) 및 (2)를 정제하고 제3 PCR 단계에서 (각각 대략 50 ng) VH3-33 및 VK6.22.2_CS* 프라이머와 함께 조합하여 변형된 6.22.2 중쇄 V-도메인을 생성하였다. 이 변형된 형태는 FR1 중에 His/Phe 돌연변이를 포함하며 XbaI 제한 효소 부위가 도입되어 pEE6.1CH로 칭해지는 pEE6.1 유래 벡터 내로의 프레임에 맞는 클로닝을 가능하게 하는데, 상기 벡터는 상응하는 인간 IgG2 불변 도메인을 포함한다. 최종 PCR 단편을 pEE6.1CH의 XbaI 부위 내로 클로닝하고, 배향에 대하여 점검하고 삽입체의 전체 서열을 확인하였다. 변형 6.22.2의 중쇄의 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 51에서 발견되며 상응하는 아미노산 서열은 서열 번호 52에서 발견된다. 뉴클레오티드 및 아미노산 서열에 있어서의 변화를 모 서열과 비교하여 나타낸다.
6.22.2 카파 경쇄: Expand Taq 폴리머라제 및 뉴클레오티드 서열 번호 15에 의해 나타내어지는 pCR2.1 TOPO-TA cDNA 주형(100 ng)을 사용하여, PCR 프라이머 세트 6.22.2_VK_F1 및 revKappa (1), 및 A26 및 6.22.2_VK_R1 (2)을 사용하여 개별적인 PCR 생성물 (1) 및 (2)를 생성하였다. 생성물 (1) 및 (2)를 정제하고 제3 PCR 단계에서 (각각 대략 50 ng) A26 및 revKappa 프라이머와 함께 조합하여 변형된 6.22.2 카파 경쇄 V-도메인을 생성하였다. 이 변형된 형태는 FR3 서열에 대한 Asn/Asp 및 Gly/Ser 변화를 포함한다. 생성된 PCR 생성물은 HindIII/EcoR1 부위를 사용하여 pEE12.1 내로 클로닝하고 완전한 서열을 확인하였다. 변형 6.22.2 카파 경쇄의 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 53에서 발견되며 상응하는 아미노산 서열은 서열 번호 54에서 발견된다. 뉴클레오티드 및 아미노산 서열에 있어서의 변화를 모 서열과 비교하여 나타낸다.
6.34.2 중쇄: Expand Taq 폴리머라제 및 뉴클레오티드 서열 번호 17에 의해 나타내어지는 pCR2.1 TOPO-TA cDNA 주형(100 ng)을 사용하여, PCR 프라이머 세트 6.34.2_VH_F1 및 6.22.2 VH_CS* (1) 및 VH3-30 및 6.34.2_VH_R1 (2)을 사용하여 개별적인 PCR 생성물 (1) 및 (2)를 생성하였다. 생성물 (1) 및 (2)를 정제하고 제3 PCR 단계에서 (각각 대략 50 ng) VH3-30 및 VK6.22.2_CS* 프라이머와 함께 조합하여 변형된 6.34.2 중쇄 V-도메인을 생성하였다. 이 변형된 형태는 FR3 중에 Ser/Arg 돌연변이를 포함하며, XbaI 제한 효소 부위가 도입되어 pEE6.1CH로 칭해지는 pEE6.1 유래 벡터 내로의 프레임에 맞는 클로닝을 가능하게 하는데, 상기 벡터는 상응하는 인간 IgG2 불변 도메인을 포함한다. 최종 PCR 단편을 pEE6.1CH의 XbaI 부위 내로 클로닝하고, 배향에 대하여 점검하고 삽입체의 전체 서열을 확인하였다. 변형 6.34.2의 중쇄의 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 55에서 발견되며 상응하는 아미노산 서열은 서열 번호 56에서 발견된다. 뉴클레오티드 및 아미노산 서열에 있어서의 변화를 모 서열과 비교하여 나타낸다.
6.34.2 카파 경쇄: Expand Taq 폴리머라제 및 뉴클레오티드 서열 번호 19에 의해 나타내어지는 pCR2.1 TOPO-TA cDNA 주형(100 ng)을 사용하여, PCR 프라이머 세트 012 및 6.34.2_VK_R1 (1), 6.34.2_VK_F1 및 6.34.2 VK_R2 (2)와, 6.34.2_VK_F2 및 revKappa (3)을 사용하여 개별적인 PCR 생성물 (1), (2) 및 (3)을 생성하였다. 생성물 (1), (2) 및 (3)을 정제하고 제3 PCR 단계에서 (각각 대략 50 ng) 012 및 6.34.2 VK_R2 프라이머와 함께 조합하여 변형된 6.34.2 카파 경쇄 V-도메인을 생성하였다. 이 변형된 형태는 CDR1에서 Asn/Ser 변화, FR2에서 Phe/Tyr 변화, 및 FR3 서열에 대한 Arg-Thr/Ser-Ser, Asp/Glu 및 Ser/Tyr 변화를 포함한다. 생성된 PCR 생성물은 HindIII/EcoR1 부위를 사용하여 pEE12.1 내로 클로닝하고 완전한 서열을 확인하였다. 변형 6.34.2 카파 경쇄의 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 57에서 발견되며 상응하는 아미노산 서열은 서열 번호 58에서 발견된다. 뉴클레오티드 및 아미노산 서열에 있어서의 변화를 모 서열과 비교하여 나타낸다.
6.67.1 중쇄 : Expand Taq 폴리머라제 및 뉴클레오티드 서열 번호 21에 의해 나타내어지는 pCR2.1 TOPO-TA cDNA 주형(100 ng)을 사용하여, PCR 프라이머 세트 6.67.1 VH_F1 및 6.67.1 VH_CS* (1) 및 VH4-4 및 6.67.1_VH_R1 (2)을 사용하여 개별적인 PCR 생성물 (1) 및 (2)를 생성하였다. 생성물 (1) 및 (2)를 정제하고 제3 PCR 단계에서 (각각 대략 50 ng) VH4-4 및 VK6.67.1_CS* 프라이머와 함께 조합하여 변형된 6.67.1 중쇄 V-도메인을 생성하였다. 이 변형된 형태는 FR3 중에 Ile-Leu-Ala/Met-Ser-Val 변환을 포함하며, XbaI 제한 효소 부위가 도입되어 pEE6.1CH로 칭해지는 pEE6.1 유래 벡터 내로의 프레임에 맞는 클로닝을 가능하게 하는데, 상기 벡터는 상응하는 인간 IgG2 불변 도메인을 포함한다. 최종 PCR 단편을 pEE6.1CH의 XbaI 부위 내로 클로닝하고, 배향에 대하여 점검하고 삽입체의 전체 서열을 확인하였다. 변형 6.67.1의 중쇄의 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 59에서 발견되며 상응하는 아미노산 서열은 서열 번호 60에서 발견된다. 뉴클레오티드 및 아미노산 서열에 있어서의 변화를 모 서열과 비교하여 나타낸다.
6.67.1 카파 경쇄: Expand Taq 폴리머라제 및 뉴클레오티드 서열 번호 23에 의해 나타내어지는 pCR2.1 TOPO-TA cDNA 주형(100 ng)을 사용하여, PCR 프라이머 세트 6.67.1 VK_F1 및 revKappa (1), 및 B3 및 6.67.1 VK_R1 (2)을 사용하여 개별적인 PCR 생성물 (1) 및 (2)를 생성하였다. 생성물 (1) 및 (2)를 정제하고 제3 PCR 단계에서 (각각 대략 50 ng) B3 및 revKappa 프라이머와 함께 조합하여 변형된 6.67.1 카파 경쇄 V-도메인을 생성하였다. 이 변형된 형태는 CDR1에서 Thr/Asn 변화 및 FR2에서 Arg/Gly 변화를 포함한다. 생성된 PCR 생성물은 HindIII/EcoR1 부위를 사용하여 pEE12.1 내로 클로닝하고 완전한 서열을 확인하였다. 변형 6.67.1 카파 경쇄의 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 61에서 발견되며 상응하는 아미노산 서열은 서열 번호 62에서 발견된다. 뉴클레오티드 및 아미노산 서열에 있어서의 변화를 모 서열과 비교하여 나타낸다.
6.77.1 중쇄 : Expand Taq 폴리머라제 및 뉴클레오티드 서열 번호 29에 의해 나타내어지는 pCR2.1 TOPO-TA cDNA 주형(100 ng)을 사용하여, PCR 프라이머 세트VH 3-21 및 6.22.2 VH_CS*를 사용하여 단일 PCR 생성물을 생성하였다. 이 PCR 생성물을 XbaI으로 절단하고, 겔 정제하고 pEE6.1CH의 XbaI 부위 내로 클로닝하여, 배향에 대하여 점검하였다. 삽입체를 완전히 서열로 확인하였다. 변형 6.77.1의 중쇄의 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 63에서 발견되며 상응하는 아미노산 서열은 서열 번호 64에서 발견된다. 뉴클레오티드 및 아미노산 서열에 있어서의 변화를 모 서열과 비교하여 나타낸다.
6.77.1 카파 경쇄: Expand Taq 폴리머라제 및 뉴클레오티드 서열 번호 31에 의해 나타내어지는 pCR2.1 TOPO-TA cDNA 주형(100 ng)을 사용하여, PCR 프라이머 세트 A2 및 6.77.1_VK_R1 (1), 6.77.1_VK_VK_F1 및 6.77.1_R2 (2)와, 6.77.1_VK_F2 및 revKappa (3)을 사용하여 개별적인 PCR 생성물 (1), (2) 및 (3)을 생성하였다. 생성물 (1), (2) 및 (3)을 정제하고 제3 PCR 단계에서 (각각 대략 50 ng) A2 및 6.77.1_VK_R2 프라이머와 함께 조합하여 PCR 생성물 (4)를 생성하였다. PCR 생성물 (2) 및 (3)을 제4 PCR 단계에서 (각각 대략 50 ng) 6.77.1_VK_F1 및 revKappa 프라이머와 함께 조합하여 PCR 생성물 (5)를 생성하였다. PCR 생성물 (4) 및 (5)를 정제하고 프라이머 A2 및 JK2와 함께 조합하여 (각각 대략 50 ng) 변형된 6.77.1 카파 경쇄 V-도메인을 생성하였다. 이 변형된 형태는 CDR1에서 Asn/Lys 변화, FR3에서 Ser/Tyr 변화, 및 CDR3 서열에서 Cys/Ser 잔기 변화를 포함한다. 생성된 PCR 생성물은 HindIII/EcoR1 부위를 사용하여 pEE12.1 내로 클로닝하고 완전히 서열로 확인하였다. 변형 6.77.1 카파 경쇄의 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 65에서 발견되며 상응하는 아미노산 서열은 서열 번호 66에서 발견된다. 뉴클레오티드 및 아미노산 서열에 있어서의 변화를 모 서열과 비교하여 나타낸다.
7.26.4 카파 경쇄 : Expand Taq 폴리머라제 및 뉴클레오티드 서열 번호 43에 의해 나타내어지는 pCR2.1 TOPO-TA cDNA 주형(100 ng)을 사용하여, PCR 프라이머 세트 7.26.4_VK_F1 및 revKappa (1), 및 A2 및 7.26.4_VK_R1 (2)를 사용하여 개별적인 PCR 생성물 (1) 및 (2)를 생성하였다. 생성물 (1) 및 (2)를 정제하고 제3 PCR 단계에서 (각각 대략 50 ng) A2 및 revKappa 프라이머와 함께 조합하여 변형된 7.26.4 카파 경쇄 V-도메인을 생성하였다. 이 변형된 형태는 CDR1에서 Asn/Ser 변화를 포함한다. 생성된 PCR 생성물은 HindIII/EcoR1 부위를 사용하여 pEE12.1 내로 클로닝하고 완전히 서열로 확인하였다. 변형 7.26.4 카파 경쇄의 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 67에서 발견되며 상응하는 아미노산 서열은 서열 번호 68에서 발견된다. 뉴클레오티드 및 아미노산 서열에 있어서의 변화를 모 서열과 비교하여 나타낸다.
각각 중쇄 뉴클레오티드 서열인 서열 번호 51, 55, 59, 63 및 41의 서열, 및 상응하는 아미노산 서열인 서열 번호 52, 56, 60, 64 및 42의 서열과, 카파 경쇄 뉴클레오티드 서열인 서열 번호 53, 57, 61, 65 및 67의 서열, 및 상응하는 아미노산 서열인 서열 번호: 54, 58, 62, 66 및 68의 서열을 나타내며, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod 및 7.26.4-mod로 불리는 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.77.1 및 7.26.4의 변형된 형태늬 각각을 위한 기능성 진핵 발현 벡터를 하기와 같이 조립하였다: 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod 및 6.77.1-mod에 상응하는 중쇄 cDNA 삽입체를 NotI/SalI을 이용하여 pEE6.1CH 벡터로부터 잘라내고, 7.26.4의 중쇄의 모 형태를 NotI/SalI을 이용하여 pEE6.1 벡터로부터 잘라내고, 정제된 단편을 카파 경쇄 서열의 변형된 형태인 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod 및 7.26.4-mod를 포함하는 상응하는 pEE12.1 벡터내의 동일한 부위로 클로닝하였다. 벡터의 서열을 확인하고, 정제된 양을 HEK 293T 세포를 이용한 일시적 트랜스펙션에 이용하였다. 간략하게는, 트랜스펙션 전날에 T165 플라스크에 접종되고 옵티멤(Optimem) 내로 세척한 9x106개의 HEK 293T 세포를, 제조자의 지시에 따라 리포펙타민 플러스(Invitrogen)를 이용하여 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod 및 7.26.4-mod(40 ㎍)에 상응하는 벡터 cDNA로 일시적 트랜스펙션시켰다. 이 세포를 3시간 동안 항온처리하고, 이어서 트랜스펙션 배지를 10% 초저함량 IgG 소 태아 혈청(Invitrogen 16250-078) 및 L-글루타민(50 mL)을 함유하는 DMEM(Invitrogen 21969-035)로 대체하였다. 배지 상청액을 5일 후에 수집하여, 필터 살균하고, 상기한 바와 유사한 방식으로 단백질 G 세파로스 친화성 크로마토그래피를 이용하여 항-MAdCAM 항체를 정제하였다. 회수된 항체의 양(20-100 ㎍)을 브래드포드(Bradford)분석에 의해 정량화하였다.
6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod 및 7.26.4-mod에 상응하는 친화성 정제된 항체의 항-MAdCAM 활성을 전술한 MAdCAM-IgG1-Fc 융합물 분석으로 평가하였다. 이들 항-MADCAM 항체의 IC50 값은 이들 항체가 유래된 모 항-MAdCAM 항체와 비교하여 표 13에 제시한다. 변형된 항-MAdCAM 항체의 활성에 대한 상기 아미노산 치환의 영향은 그들의 모 항체와 비교하여 최소였다.
이 항체는 또한 재조합 인간 재조합 인간 MAdCAM 또는 사이노몰거스/인간 MAdCAM 키메라를 발현하는 CHO 세포에 대한 그들의 결합성을 유지하였다.
Figure 112006056960219-pct00013
실시예 VI
항- MAdCAM 항체의 차단에 의한 말초 순환에서의 β 7 + 림프구의 증가
항-MAdCAM 항체의 기계적 효과와 혈중 이의 순환 수준을 확인하고 상관짓기 위한 분석법이 개발되었다. 억제성 항-MAdCAM 항체는 α4β7 인테그린을 발현하는 백혈구가 위장관에 동원되는 것을 억제하는 효과를 가져야 한다. 따라서, α4β7 인테그린-보유 백혈구 부류는 말초 순환에 제한되어야 한다. 이것은 사이노몰거스에서 완전한 인간형 항-인간 MAdCAM mAb 7.16.6에서 입증되었다.
정제된 항-인간 MAdCAM mAb 7.16.6(1 mg/kg) 또는 비히클(20 mM 아세트산나트륨, 0.2 mg/mL 폴리소르베이트 80, 45 mg/mL 만니톨 및 0.02 mg/mL EDTA(pH 5.5))을 두 군의 사이노몰거스 원숭이(n=4/군)에게 복재 정맥을 통해 정맥 투여하여 유사한 방식으로 평가하였다. 투여 후 3일째에 혈액 샘플을 대퇴골 정맥주사에 의해 EDTA 튜브에 수집하였다. 사이노몰거스 α4β7 인테그린과 교차 반응하는 LPAM 특이성 항체는 구매가능하지 않으므로, 대신에 항-β7 항체(α4β7 및 αΕβ7 인테그린을 인식)를 이용하였다. 하기 표 15에 따라, 항체(30 μL)를 사이노몰거스 혈액 100 μL를 포함하는 튜브에 첨가하고, 온화한 와동에 의해 혼합하고 4℃에서 20-30분동안 항온처리하였다.
Figure 112006056960219-pct00014
각 튜브에, 1:10의 FACSlyse 용액(BD # 349202) 1 mL를 첨가하고, 약하게 와동시켜 혼합하고, 적혈구 용해가 완료될 때까지 암소에서 대략 12분 동안 실온에서 항온처리하였다. 이어서 2 mL의 BD 염색제 완충액(# 554656)을 각각의 튜브에 첨가하고, 혼합하고 실온에서 6-7 분 동안 250 x g에서 원심분리하였다. 상청액을 가만히 따르고 펠렛을 3 mL의 염색제 완충액에 재현탁시키고, 다시 혼합하고 실온에서 6-7분 동안 250 x g에서 원심분리하였다. w/v 파라포름알데히드(100 μL)를 함유하는 Cytofix 완충제(# 554655)를 원숭이 말초 혈액으로부터의 세포 펠렛에 첨가하고 저속/중속의 와동기에 의해 완전히 혼합하였다. FACSCalibur 상에 포착될 때까지 샘플을 암소에서 4℃에서 유지하였다. 포착되기 전에, PBS(100 μL)를 포착 직전에 모든 튜브에 첨가하였다. CD4+β7 +CD95loCD28+(나이브(naive)), CD4+β7 +CD95hiCD28+(중앙 기억), CD4+β7-CD95hiCD28+(중앙 기억), CD4+β7 +CD95hiCD28-(이펙터(effector) 기억)의 절대 세포수를 적절한 게이팅(gating) 및 4배체(quandrant) 분석에 의해 얻었다. 다른 T 세포 서브세트, 예를 들어, CD8+ T 중앙 기억 세포(β7 +CD8+CD28+CD95+) 및 MAdCAM 리간드를 보유한 임의의 다른 백혈구를 또한 적절한 항체를 이용하여 이 방법에 의해 분석할 수 있다. 비히클 대조군과 비교할 때, 항-MAdCAM mAb 7.16.6은 도 7에 도시되어 있는 바와 같이 순환하는 CD4+β7 +CD95hiCD28+ 중앙 기억 T 세포의 수준이 대략 3배 증가되게 하였다. 순환하는 CD4+β7-CD95hiCD28+ 중앙 기억 T 세포의 집단에 대한 영향은 전혀 없었는데, 이는 항-MAdCAM mAb 7.16.6의 영향이 장 회귀성 T 세포에 특이적임을 나타낸다. 사이노몰거스에서, 순환하는 (α4)β7 + 림프구의 집단에 대한 항-MAdCAM mAb 7.16.6의 영향은 이것이 특히 임상 세팅에서의 실제 적용면에서 기전의 생체 마커의 확실한 대용 증거임을 나타낸다.
서열
서열 번호 1-48 및 51-68은 12종의 인간 항-MAdCAM 항체의 중쇄 및 카파 경쇄의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열, 사이노몰거스 MAdCAM α4β7 결합 도메인 서열의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열, 및 5종의 변형된 인간 항-MAdCAM 항체의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 제공한다.
서열 번호 1-48은 12종의 인간 모노클로날 항-MAdCAM 항체의 중쇄 및 카파 경쇄 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 제공한다: 1.7.2(서열 번호 1-4), 1.8.2(서열 번호 5-8), 6.14.2(서열 번호 9-12), 6.22.2(서열 번호 13-16), 6.34.2(서열 번호 17-20), 6.67.1(서열 번호 21-24), 6.73.2(서열 번호 25-28), 6.77.1(서열 번호 29-32), 7.16.6(서열 번호 33-36), 7.20.5(서열 번호 37-40), 7.26.4(서열 번호 41-44), 및 9.8.2(서열 번호 45-48).
서열 번호 49-50은 사이노몰거스 MAdCAM α4β7 결합 도메인의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 제공한다.
서열 번호 51-68은 변형된 모노클로날 항-MAdCAM 항체의 중쇄 및 카파 경쇄 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 제공하며: 6.22.2(서열 번호 51-54), 변형 6.34.2(서열 번호 55-58), 변형 6.67.1(서열 번호 59-62), 변형 6.77.1(서열 번호 63-66); 그리고 변형된 모노클로날 항-MAdCAM 항체의 카파 경쇄 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 제공한다: 변형 7.26.4(서열 번호 67-68). 서열 번호: 70-106 및 108-110은 다양한 프라이머 서열을 제공한다.
Figure 112006056960219-pct00015
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SEQUENCE LISTING <110> PFIZER INC. ABGENIX, INC. PFIZER LIMITED <120> ANTIBODIES TO MAdCAM <130> ABX-PF6 PCT <140> PCT/US05/000370 <141> 2005-01-07 <150> 60/535,490 <151> 2004-01-09 <160> 147 <170> PatentIn Ver. 3.3 <210> 1 <211> 1392 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 atggagtttg ggctgagctg gattttcctt gctgctattt taaaaggtgt ccagtgtgag 60 gtgcagctgg tggagtctgg gggaggcttg gtgaagcctg gggggtccct tagactctcc 120 tgtgtagcct ctggattcac tttcactaac gcctggatga tctgggtccg ccaggctcca 180 gggaaggggc tggagtgggt tggccgtatt aaaaggaaaa ctgatggtgg gacaacagac 240 tacgctgcac ccgtgaaagg cagattcacc atctcaagag atgattcaaa aaacacgctg 300 tatctgcaaa tgaacagcct gaaaaccgag gacacagccg tgtattactg taccacaggg 360 ggagtggctg aggactactg gggccaggga accctggtca ccgtctcctc agcctccacc 420 aagggcccat cggtcttccc cctggcgccc tgctccagga gcacctccga gagcacagcg 480 gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 540 ggcgctctga ccagcggcgt gcacaccttc ccagctgtcc tacagtcctc aggactctac 600 tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcaacttcg gcacccagac ctacacctgc 660 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catactgatg gaacgaccta tttgtattgg 180 tacctgcaga agccaggcca gcctccacag ctcctgatct atgaagtttc caaccggttc 240 tctggagtgc cagataggtt cagtggcagc gggtcaggga cagatttcac actgaaaatc 300 agccgggtgg aggctgagga tgttgggatt tattactgca tgcaaaatat acagcttccg 360 tggacgttcg gccaagggac caaggtggaa atcaaacgaa ctgtggctgc accatctgtc 420 ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg 480 ctgaataact tctatcccag agaggccaaa gtacagtgga aggtggataa cgccctccaa 540 tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag caggacagca aggacagcac ctacagcctc 600 agcagcaccc tgacgctgag caaagcagac tacgagaaac acaaagtcta cgcctgcgaa 660 gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc acaaagagct tcaacagggg agagtgttag 720 tga 723 <210> 36 <211> 239 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 36 Met Arg Leu Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Met Leu Trp Ile Pro 1 5 10 15 Gly Ser Ser Ala Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser 20 25 30 Val Thr Pro Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser 35 40 45 Leu Leu His Thr Asp Gly Thr Thr Tyr Leu Tyr Trp 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<400> 50 Met Asp Arg Gly Leu Ala Leu Leu Leu Ala Gly Leu Leu Gly Leu Leu 1 5 10 15 Gln Pro Gly Cys Gly Gln Ser Leu Gln Val Lys Pro Leu Gln Val Glu 20 25 30 Pro Pro Glu Pro Val Val Ala Val Ala Leu Gly Ala Ser Arg Gln Leu 35 40 45 Thr Cys Arg Leu Asp Cys Ala Asp Gly Gly Ala Thr Val Gln Trp Arg 50 55 60 Gly Leu Asp Thr Ser Leu Gly Ala Val Gln Ser Asp Ala Gly Arg Ser 65 70 75 80 Val Leu Thr Val Arg Asn Ala Ser Leu Ser Ala Ala Gly Thr Arg Val 85 90 95 Cys Val Gly Ser Cys Gly Gly Arg Thr Phe Gln His Thr Val Arg Leu 100 105 110 Leu Val Tyr Ala Phe Pro Asp Gln Leu Thr Ile Ser Pro Ala Ala Leu 115 120 125 Val Pro Gly Asp Pro Glu Val Ala Cys Thr Ala His Lys Val Thr Pro 130 135 140 Val Asp Pro Asn Ala Leu Ser Phe Ser Leu Leu Leu Gly Asp Gln Glu 145 150 155 160 Leu Glu Gly Ala Gln Ala Leu Gly Pro Glu Val Glu Glu Glu Glu Glu 165 170 175 Pro Gln Glu Glu Glu Asp Val Leu Phe Arg Val Thr Glu Arg Trp Arg 180 185 190 Leu Pro Thr Leu Ala Thr Pro Val Leu Pro Ala Leu Tyr Cys Gln Ala 195 200 205 Thr Met Arg 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caggacagca aggacagcac ctacagcctc 600 agcagcaccc tgacgctgag caaagcagac tacgagaaac acaaagtcta cgcctgcgaa 660 gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc acaaagagct tcaacagggg agagtgttag 720 tga 723 <210> 66 <211> 239 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 66 Met Arg Leu Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Met Leu Trp Ile Pro 1 5 10 15 Gly Ser Ser Ala Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser 20 25 30 Val Thr Pro Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser 35 40 45 Leu Leu Leu Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu Gln Lys 50 55 60 Pro Gly Gln Pro Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Glu Val Ser Asn Arg Phe 65 70 75 80 Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 85 90 95 Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Ser 100 105 110 Cys Met Gln Ser Ile Gln Leu Met Ser Ser Phe Gly Gln Gly Thr Lys 115 120 125 Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro 130 135 140 Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu 145 150 155 160 Leu Asn 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agcgccacca tggagtttgg gctgagctgg att 53 <210> 72 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 72 tatctaagct tctagactcg agcgccacca tggaactggg gctccgctgg gtt 53 <210> 73 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 73 tatctaagct tctagactcg agcgccacca tggagtttgg gctgagctgg ctt 53 <210> 74 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 74 tatctaagct tctagactcg agcgccacca tggagtttgg gctgagctgg gtt 53 <210> 75 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 75 tatctaagct tctagactcg agcgccacca tggagtttgg gctgagctgg gtt 53 <210> 76 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 76 tatctaagct tctagactcg agcgccacca tgaaacacct gtggttcttc ctc 53 <210> 77 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 77 tatctaagct tctagacccg ggcgccacca tgaggctccc tgctcagctc ctg 53 <210> 78 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 78 tatctaagct tctagacccg ggcgccacca tgttgccatc acaactcatt ggg 53 <210> 79 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 79 tatctaagct tctagacccg ggcgccacca tggtgttgca gacccaggtc ttc 53 <210> 80 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 80 tatctaagct tctagacccg ggcgccacca tggacatgag ggtccccgct cag 53 <210> 81 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 81 tatctaagct tctagacccg ggcgccacca tggacatgag ggtccctgct cag 53 <210> 82 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 82 ttctctgatc agaattccta tcatttaccc ggagacaggg agag 44 <210> 83 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 83 ttctttgatc agaattctca ctaacactct cccctgttga agc 43 <210> 84 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 84 ttctctgatc agaattccta tcatttaccc agagacaggg agag 44 <210> 85 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 85 ggatctggga cagatttcac cctcaccatc aatagcctgg aagc 44 <210> 86 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 86 gcttccaggc tattgatggt gagggtgaaa tctgtcccag atcc 44 <210> 87 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 87 gcagcgtctg gattcacctt cagtagc 27 <210> 88 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 88 gctactgaag gtgaatccag acgctgc 27 <210> 89 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 89 cggaggtgct tctagagcag ggcg 24 <210> 90 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 90 gcaagtcaga gtattagtag ctatttaaat tggtatcagc agaaacc 47 <210> 91 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 91 ggtttctgct gataccaatt taaatagcta ctaatactct gacttgc 47 <210> 92 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 92 ccatcagttc tctgcaacct gaggattttg caacttacta ctgtcacc 48 <210> 93 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 93 ggtgacagta gtaagttgca aaatcctcag gttgcagaga actgatgg 48 <210> 94 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 94 gcaaatgaac agcctgcgcg ctgaggacac g 31 <210> 95 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 95 cgtgtcctca gcgcgcaggc tgttcatttg c 31 <210> 96 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 96 caataagaac tacttagctt ggtaccaaca gaaaccagga cagcc 45 <210> 97 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 97 ggctgtcctg gtttctgttg gtaccaagct aagtagttct tattg 45 <210> 98 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 98 ccctcagggg tcgagtcacc atgtcagtag acacgtccaa gaacc 45 <210> 99 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 99 ggttcttgga cgtgtctact gacatggtga ctcgacccct gaggg 45 <210> 100 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 100 attctagagc agggcgccag g 21 <210> 101 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 101 ccatctcctg caagtctagt cagagcctcc 30 <210> 102 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 102 ggaggctctg actagacttg caggagatgg 30 <210> 103 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 103 ggtttattac tgcatgcaaa gtatacagct tatgtccagt tttggcc 47 <210> 104 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 104 ggccaaaact ggacataagc tgtatacttt gcatgcagta ataaacc 47 <210> 105 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 105 cctgcaagtc tagtcagagc ctcc 24 <210> 106 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 106 ggaggctctg actagacttg cagg 24 <210> 107 <211> 543 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 107 Met Asp Phe Gly Leu Ala Leu Leu Leu Ala Gly Leu Leu Gly Leu Leu 1 5 10 15 Leu Gly Gln Ser Leu Gln Val Lys Pro Leu Gln Val Glu Pro Pro Glu 20 25 30 Pro Val Val Ala Val Ala Leu Gly Ala Ser Arg Gln Leu Thr Cys Arg 35 40 45 Leu Ala Cys Ala Asp Arg Gly Ala Ser Val Gln Trp Arg Gly Leu Asp 50 55 60 Thr Ser Leu Gly Ala Val Gln Ser Asp Thr Gly Arg Ser Val Leu Thr 65 70 75 80 Val Arg Asn Ala Ser Leu Ser Ala Ala Gly Thr Arg Val Cys Val Gly 85 90 95 Ser Cys Gly Gly Arg Thr Phe Gln His Thr Val Gln Leu Leu Val Tyr 100 105 110 Ala Phe Pro Asp Gln Leu Thr Val Ser Pro Ala Ala Leu Val Pro Gly 115 120 125 Asp Pro Glu Val Ala Cys Thr Ala His Lys Val Thr Pro 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Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Arg 100 105 <210> 127 <211> 114 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 127 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser 20 25 30 Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Tyr Tyr Ser Thr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile 100 105 110 Lys Arg <210> 128 <211> 106 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 128 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Phe 85 90 95 Gly Gln Gly Thr Thr Leu Asp Ile Lys Arg 100 105 <210> 129 <211> 110 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 129 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser 20 25 30 Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Pro 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Glu Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ser 85 90 95 Ile Gln Leu Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 110 <210> 130 <211> 113 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 130 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser 20 25 30 Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Pro 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Glu Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ser 85 90 95 Ile Gln Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 Arg <210> 131 <211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 131 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Gly 20 25 30 Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala 85 90 95 Leu Gln Thr Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 110 <210> 132 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 132 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Asn Leu Ile Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 133 <211> 125 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 133 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Glu Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Gly Ile Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Ser Val Tyr Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Ser Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Phe 65 70 75 80 Phe Leu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Gly Ser Ser Ser Ser Gly Asp Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp 100 105 110 Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala 115 120 125 <210> 134 <211> 10 <212> PRT <213> Macaca fascicularis <400> 134 Lys Pro Leu Gln Val Glu Pro Pro Glu Pro 1 5 10 <210> 135 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 135 Thr Phe Asn Asn Ser Ala Met Thr 1 5 <210> 136 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 136 Cys Lys Ser Asn Gln Ser Leu Leu Tyr 1 5 <210> 137 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 137 Ser Gly Thr Asn Phe Thr Leu Thr Ile 1 5 <210> 138 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 138 Ala Ser Gln Asn Ile Ser Ser Tyr Leu 1 5 <210> 139 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 139 Ser Ser Asn Asn Lys Thr Tyr Leu Ala 1 5 <210> 140 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 140 Arg Ala Ser Gln Asn Ile Thr Asn 1 5 <210> 141 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 141 Ser Cys Asn Ser Ser Gln Ser Leu 1 5 <210> 142 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 142 His Ser Asp Asn Leu Ser Ile Thr 1 5 <210> 143 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 143 Leu Gln Ser Asn Gly Tyr Asn 1 5 <210> 144 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 144 Leu Gln Ser Asn Gly Tyr Asn 1 5 <210> 145 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 145 His Gly Asn Gly Tyr Asn Tyr 1 5 <210> 146 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 146 Leu Thr Ile Asn Gly Leu Glu Ala 1 5 <210> 147 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic linker peptide <400> 147 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15

Claims (53)

  1. 하이브리도마 세포주 7.16.6 (ECACC 수탁 번호 03090909).
  2. 제1항의 하이브리도마 세포주가 생산하는 항체와 동일한 아미노산 서열을 갖는 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 부분.
  3. 점막 어드레신 세포 유착 분자(Mucosal Addressin Cell Adhesion Molecule; MAdCAM)에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 부분으로서, 상기 항체는
    (a) 하이브리도마 세포주 7.16.6 (ECACC 수탁 번호 03090909)가 생산하는 항체의 경쇄의 가변 도메인; 및
    (b) 서열번호 36의 경쇄의 가변 도메인
    으로 구성되는 군에서 선택된 경쇄 가변 도메인의 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 포함하는 것인 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 부분.
  4. MAdCAM에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 부분으로서, 상기 항체는
    (a) 하이브리도마 세포주 7.16.6 (ECACC 수탁 번호 03090909)가 생산하는 항체의 중쇄의 가변 도메인; 및
    (b) 서열번호 34의 중쇄의 가변 도메인
    으로 구성되는 군에서 선택된 중쇄 가변 도메인의 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 포함하는 것인 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 부분.
  5. MAdCAM에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 부분으로서, 상기 항체는
    (a) 하이브리도마 세포주 7.16.6 (ECACC 수탁 번호 03090909)가 생산하는 항체의 각 경쇄 및 중쇄의 가변 도메인; 및
    (b) 각 서열번호 36 및 34의 가변 도메인
    으로 구성되는 군에서 선택된 경쇄 및 중쇄 가변 도메인의 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 포함하는 것인 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 부분.
  6. 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 CDR과 동일한 가변 도메인으로부터 선택된 골격 영역 1, 골격 영역 2, 골격 영역 3 및 골격 영역 4 아미노산 서열 중 하나 이상을 포함하는 것인 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 부분.
  7. 제3항에 있어서, 상기 항체는
    (a) 하이브리도마 세포주 7.16.6 (ECACC 수탁 번호 03090909)가 생산하는 항체의 경쇄의 가변 도메인; 및
    (b) 서열번호 36의 경쇄의 가변 도메인
    으로 구성되는 군에서 선택된 경쇄 가변 도메인의 CDR1의 시작부터 CDR3의 마지막까지의 아미노산 서열을 포함하는 것인 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 부분.
  8. 제4항에 있어서, 상기 항체는
    (a) 하이브리도마 세포주 7.16.6 (ECACC 수탁 번호 03090909)가 생산하는 항체의 중쇄의 가변 도메인; 및
    (b) 서열번호 34의 중쇄의 가변 도메인
    으로 구성되는 군에서 선택된 중쇄 가변 도메인의 CDR1의 시작부터 CDR3의 마지막까지의 아미노산 서열을 포함하는 것인 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 부분.
  9. 제5항에 있어서, 상기 항체는
    (a) 하이브리도마 세포주 7.16.6 (ECACC 수탁 번호 03090909)가 생산하는 항체의 각 경쇄 및 중쇄의 가변 도메인; 및
    (b) 각 서열번호 36 및 34의 가변 도메인
    으로 구성되는 군에서 선택된 경쇄 및 중쇄 가변 도메인의 CDR1의 시작부터 CDR3의 마지막까지의 아미노산 서열을 포함하는 것인 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 부분.
  10. 제3항에 있어서, 상기 항체는
    (a) 하이브리도마 세포주 7.16.6 (ECACC 수탁 번호 03090909)가 생산하는 항체의 경쇄의 가변 도메인; 및
    (b) 서열번호 36의 경쇄의 가변 도메인
    으로 구성되는 군에서 선택된 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열을 포함하는 것인 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 부분.
  11. 제4항에 있어서, 상기 항체는
    (a) 하이브리도마 세포주 7.16.6 (ECACC 수탁 번호 03090909)가 생산하는 항체의 중쇄의 가변 도메인; 및
    (b) 서열번호 34의 중쇄의 가변 도메인
    으로 구성되는 군에서 선택된 중쇄 가변 도메인의 아미노산 서열을 포함하는 것인 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 부분.
  12. 제5항에 있어서, 상기 항체는
    (a) 하이브리도마 세포주 7.16.6 (ECACC 수탁 번호 03090909)가 생산하는 항체의 각 경쇄 및 중쇄의 가변 도메인; 및
    (b) 각 서열번호 36 및 34의 가변 도메인
    으로 구성되는 군에서 선택된 경쇄 및 중쇄 가변 도메인의 아미노산 서열을 포함하는 것인 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 부분.
  13. 제3항에 있어서, 상기 항체는
    (a) 하이브리도마 세포주 7.16.6 (ECACC 수탁 번호 03090909)가 생산하는 항체의 경쇄; 및
    (b) 시그날 서열을 제외한 서열번호 36의 경쇄
    로 구성되는 군에서 선택된 경쇄의 아미노산 서열을 포함하는 것인 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 부분.
  14. 제4항에 있어서, 상기 항체는
    (a) 하이브리도마 세포주 7.16.6 (ECACC 수탁 번호 03090909)가 생산하는 항체의 중쇄; 및
    (b) 시그날 서열을 제외한 서열번호 34의 중쇄
    로 구성되는 군에서 선택된 중쇄의 아미노산 서열을 포함하는 것인 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 부분.
  15. 경쇄 아미노산 서열이 시그날 서열을 제외한 서열번호 36이고, 중쇄 아미노산 서열이 시그날 서열을 제외한 서열번호 34인 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 부분.
  16. 제2항, 제14항 및 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄 C-말단 라이신이 제거된 것인 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 부분.
  17. 제3항, 제5항, 제7항, 제9항, 제10항 및 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 인간 VK A2 유전자를 이용하는 경쇄를 포함하는 것인 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 부분.
  18. 제4항, 제5항, 제8항, 제9항, 제11항 및 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 인간 VH 1-18 유전자를 이용하는 중쇄를 포함하는 것인 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 부분.
  19. 제3항 내지 제5항 및 제7항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, IgG, IgM, IgE, IgA, 또는 IgD 분자인 것인 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 부분.
  20. 제3항 내지 제5항 및 제7항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 키메라 항체 또는 이중특이성(bispecific) 항체인 것인 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 부분.
  21. 제3항 내지 제5항 및 제7항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, FV 단편 또는 단쇄 항체인 것인 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 부분.
  22. 제2항 내지 제5항 및 제7항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 부분은
    (a) 인간 세포에 결합하는 특성;
    (b) VCAM 또는 피브로넥틴에 비하여 인간 MAdCAM에 대한 선택성이 100배 이상인 특성; 또는
    (c) 인간 MAdCAM에 3 x 10-10 M 이하의 Kd로 결합하는 특성;
    (d) α4β7를 발현하는 세포의 인간 MAdCAM에 대한 결합을 억제하는 특성; 및
    (e) 위장관과 관련된 림프 조직으로 림프구의 동원을 억제하는 특성
    중 하나 이상의 특성을 보유하는 것인 인간 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 부분.
  23. 제2항 내지 제5항 및 제7항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 부분은
    (a) MAdCAM에 대한 결합에 대하여 하이브리도마 세포주 7.16.6 (ECACC 수탁 번호 03090909)가 생산하는 항체와 교차 경쟁하는 특성;
    (b) MAdCAM에 대한 결합에 대하여 하이브리도마 세포주 7.16.6 (ECACC 수탁 번호 03090909)가 생산하는 항체와 경쟁하는 특성;
    (c) 하이브리도마 세포주 7.16.6 (ECACC 수탁 번호 03090909)가 생산하는 항체와 동일한 MAdCAM 에피토프에 결합하는 특성;
    (d) 하이브리도마 세포주 7.16.6 (ECACC 수탁 번호 03090909)가 생산하는 항체와 동일한 Kd로 MAdCAM에 결합하는 특성; 및
    (e) 하이브리도마 세포주 7.16.6 (ECACC 수탁 번호 03090909)가 생산하는 항체와 동일한 해리 속도(off rate)로 MAdCAM에 결합하는 특성
    중 하나 이상의 특성을 보유하는 것인 인간 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 부분.
  24. 제2항 내지 제5항 및 제7항 내지 제15항 중 어느 한 항의 항체의 중쇄 또는 이의 항원 결합 부분; 또는 이 항체의 경쇄 또는 이의 항원 결합 부분; 또는 이 항체의 중쇄 및 경쇄 모두 또는 이의 항원 결합 부분을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자.
  25. 제24항의 핵산 분자를 포함하는 벡터로서, 상기 벡터는 상기 핵산 분자에 작동가능하게 연결된 발현 조절 서열을 임의적으로 포함하는 것인 벡터.
  26. MAdCAM에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 제조하는 방법으로서,
    (a) 제24항의 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포; 또는 (b) 하이브리도마 세포주 7.16.6 (ECACC 수탁 번호 03090909)를 적절한 조건하에 배양하는 단계; 및
    상기 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 회수하는 단계를 포함하는 방법.
  27. 제2항 내지 제5항 및 제7항 내지 제15항 중 어느 한 항의 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 부분의 유효량, 및 약학적 허용 담체를 포함하는, 위장관의 염증성 질환 치료용 약학 조성물.
  28. 제27항에 있어서, 하나 이상의 추가적인 소염제 또는 면역조절제를 더 포함하는 약학 조성물.
  29. 제28항에 있어서, 하나 이상의 추가적인 소염제 또는 면역조절제는 코르티코스테로이드, 아미노살리실레이트, 아자티오프린, 메토트렉세이트, 사이클로스포린, FK506, IL-10, GM-CSF, 라파마이신, 항-TNFα 제제 및 유착 분자 길항제로 구성되는 군에서 선택된 것인 약학 조성물.
  30. 제27항에 있어서, 위장관의 염증성 질환은 염증성 장 질환, 크론병, 궤양성 대장염, 게실증, 위염, 간 질환, 원발성 담즙성 경화증 및 경화성 담관염으로 구성되는 군에서 선택된 것인 약학 조성물.
  31. 제27항에 있어서, 위장관의 염증성 질환은 염증성 장 질환, 크론병 또는 궤양성 대장염인 것인 약학 조성물.
  32. 제27항에 있어서, 염증성 질환은 인슐린 의존성 당뇨병 또는 이식편 대 숙주 질환인 것인 약학 조성물.
  33. 제27항에 있어서, 인간 MAdCAM를 발현하는 세포에 대한 α4β7의 결합을 억제하는 것인 약학 조성물.
  34. 제27항에 있어서, MAdCAM 매개성 림프구-내피 세포 유착을 억제하는 것인 약학 조성물.
  35. 제27항에 있어서, 조직으로의 백혈구 유착, 이동 및 침투를 억제하는 것인 약학 조성물.
  36. 제27항에 있어서, α4β7/MAdCAM 의존적 세포 유착을 억제하는 것인 약학 조성물.
  37. 제27항에 있어서, 위장관 림프 조직으로 림프구의 MAdCAM 매개성 동원을 억제하는 것인 약학 조성물.
  38. 제2항 내지 제5항 및 제7항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 가용성 인간 MAdCAM의 순환을 특징으로 하는 질환을 진단하기 위한 것인 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 부분.
  39. 제2항 내지 제5항 및 제7항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 염증 검출을 위해 검출가능하게 라벨링되는 것인 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 부분.
  40. 제2항 내지 제5항 및 제7항 내지 제15항 중 어느 한 항의 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하는 위장관의 염증성 질환의 진단을 위한 진단 키트.
  41. 제2항 내지 제5항 및 제7항 내지 제15항 중 어느 한 항의 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 부분의 유효량 및 약학적 허용 담체를 포함하는 위장관의 염증성 질환 예방용 백신.
  42. 제41항에 있어서, 점막 백신인 백신.
  43. 삭제
  44. 삭제
  45. 삭제
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