BR122021007893B1 - Anticorpo monoclonal, ou fração de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente a madcam, composição farmacêutica, vacina e kit de diagnostico - Google Patents

Anticorpo monoclonal, ou fração de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente a madcam, composição farmacêutica, vacina e kit de diagnostico Download PDF

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Sirid-Aimee Kellermann
Larry L. Green
Mary Haakfrendscho
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Abstract

A presente invenção refere-se a anticorpos incluindo anticorpos humanos e porções de ligação ao antígeno destes que especificamente se ligam à MAdCAM, preferivelmente à MAdCAM humana e que funcionam para inibir a MAdCAM. A invenção também diz respeito aos anticorpos anti-MAdCAM humanos e porções de ligação ao antígeno destes. A invenção também diz respeito aos anticorpos que são anticorpos quiméricos, biespecíficos, derivados, de cadeia única ou partes das proteínas de fusão. A invenção também diz respeito às imunoglobulinas de cadeia pesada e leve isoladas derivads de anticorpos anti-MAdCAM humanos e moléculas de ácido nucléico que codificam tais imunoglobulinas. A presente invenção também diz respeito aos métodos de produção de anticorpos antiMAdCAM humanos, composições compreendendo estes anticorpos e métodos de uso dos anticorpos e composições para diagnóstico e tratamento. A invenção também fornece métodos de terapia genética usando moléculas de ácido nucléico que codificam as moléculas de imunoglobulinapesadas e/ou leves que compreendem os anticorpos anti-MAdCAM humanos. A invenção também diz respeito aos animais transgênicos ou plantas compreendendo moléculas de ácido nucléico da invenção.

Description

[001] Este pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório dos Estados Unidos 60/535.490, depositado em 9 de janeiro de 2004.
Antecedentes da Invenção
[002] A molécula de adesão celular de adressina mucósica (MAdCAM) é um membro da superfamília de imunoglobulina de receptores de adesão celular. O encaminhamento da seletividade de linfóci- to ao tecido linfóide especializado e sítios mucósicos do trato gastrointestinal é determinado pela expressão endotelial de MAdCAM (Berlin, C. et al., Cell, 80: 413-422 (1994); Berlin, C., et al., Cell, 74: 185-195 (1993); e Erle, D. J., et al., J. Immunol., 153: 517-528 (1994)). A MAd- CAM é únicamente expressa na superfície celular de vênulas endoteli- ais altas de tecido linfóide intestinal organizado, tal como as placas de Peyer e linfonodos mesentéricos (Streeter et al., Nature, 331: 41-6 (1988); Nakache et al., Nature, 337: 179-81 (1989); Briskin et al., Am. J. Pathol. 151-97-110 (1997)), mas também em outros órgãos linfói- des, tais como o pâncreas, vesícula biliar e vênulas esplênicas e sino marginal da polpa branca esplênica (Briskin et al (1997), supra; Kraal et al., Am. J. Path., 147: 763-771 (1995)).
[003] Embora a MAdCAM desempenhe um papel fisiológico na fiscalização imune do intestino, ela parece facilitar a extravasação lin- focítica excessiva nas doenças do intestino inflamatório sob condições de inflamação do trato gastrointestinal crônica. TNFα e outras citocinas pró-inflamatórias aumentam a expressão de MAdCAM endotelial e, em espécimes de biópsia tirados de pacientes com doença de Crohn e colite ulcerativa, existe um aumento focal de 2 a 3 vezes aproximada- mente na expressão da MAdCAM em sítios de inflamação (Briskin et al. (1997), Souza et al., Gut, 45: 856-63 (1999); Arihiro et al., Pathol Int., 52: 367-74 (2002)). Padrões similares de expressão elevada foram observados em modelos experimentais de colite (Hesterberg et al., Gastroenterology, 111: 1373-1380 (1997); Picarella et al., J. Immunol., 158: 2099-2106 (1997); Connor et al., J Leukoc Biol., 65: 349-55 (1999); Kato et al., J Pharmacol Exp Ther., 295: 183-9 (2000); Hokari et al., Clin Exp Immunol., 26: 259-65 (2001); Shigematsu et al., Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol., 281: G1309-15 (2001)). Em outros modelos pré-clínicos para condições inflamatórias, tais como a diabete dependente de insulina (Yang et al. Diabetes, 46: 1542-7 (1997); Han- ninen et al., J Immunol., 160: 6018-25 (1998)), doença do enxerto versus hospedeiro (Fujisaki et al., Scand J Gastroenterol., 38: 437-42 (2003), Murai et al., Nat Immunol., 4: 154-60 (2003)), doença hepática crônica (Hillan et al., Liver, 19: 509-18 (1999); Grant et al., Hepatology, 33: 1065-72 (2001)), encefalopatia inflamatória (Stalder et al., Am J Pathol., 153: 767-83 (1998); Kanawar et al., Immunol Cell Biol., 78: 6415 (2000)) e gastrite (Barrett et al., J Leukoc Biol., 67: 169-73 (2000); Ha- tanaka et al., Clin Exp Immunol., 130: 183-9 (2002)), existe também re- estimulação da expressão de MAdCAM fetal e a participação de linfóci- tos α4β?+ ativados na patogênese da doença. Nestes modelos inflamatórios assim como mediados por hapteno (por exemplo, TNBS, DSS, etc.) ou modelos colíticos de camundongo de transferência adotiva (CD4+CD45Rbalto), o anticorpo monoclonal MAdCAM anticamundongo de rato (mAb), MECA-367, que bloqueia a ligação de linfócitos α4β?+ à MAdCAM, reduz o recrutamento de linfócito, a extravasação de tecido, inflamação e severidade de doença. Os anticorpos monoclonais de camundongo (mAbs) contra MAdCAM humana também foram reportados (ver, por exemplo, a WO 96/24673 e WO 99/58573).
[004] Dado o papel de MAdCAM na doença do intestino inflama- tório (IBD) e outras doenças inflamatórias associadas com o trato gastrointestinal ou outros tecidos, um meio para inibir a ligação de α4β7+ e o recrutamento de leucócito mediado por MAdCAM é desejável. Seria ainda desejável ter tais meios terapêuticos com propriedades vantajosas incluindo mas não limitado à ausência de interações indesejadas com outras medicações em pacientes e propriedades físico-químicas favoráveis, tais como valores pK/pD em seres humanos, solubilidade, estabilidade, vida de prateleira e meia vida in vivo. Uma proteína terapêutica, tal como um anticorpo, seria vantajosamente livre de modificações pós-traducional ou de formação de agregado não desejadas. Consequentemente, existe uma necessidade crítica quanto aos anticorpos anti-MAdCAM terapêuticos.
Sumário da Invenção
[005] A presente invenção fornece um anticorpo isolado que es pecificamente liga MAdCAM, em que pelo menos as seqüências de CDR do dito anticorpo são seqüências de CDR humanas ou uma porção de ligação de antígeno do dito anticorpo. Em algumas modalidades o anticorpo é um anticorpo humano, preferivelmente um anticorpo que atue como um antagonista de MAdCAM. Também são fornecidas composições que compreendem os ditos anticorpos ou porções.
[006] A invenção também fornece uma composição que compre ende a cadeia pesada e/ou leve do dito anticorpo antagonista anti- MAdCAM ou a região variável ou outra porção de ligação de antígeno deste ou moléculas de ácido nucléico que codificam qualquer um dos precedentes e um veículo farmaceuticamente aceitável. As composições da invenção podem ainda compreender um outro componente, tal como um agente terapêutico ou um agente de diagnóstico. Os métodos de diagnóstico e terapêuticos também são fornecidos pela invenção.
[007] A invenção ainda fornece uma linhagem celular isolada, que produz o dito anticorpo anti-MAdCAM ou porção de ligação de an- tígeno deste.
[008] A invenção também fornece moléculas de ácido nucléico que codificam a cadeia pesada e/ou leve do dito anticorpo anti- MAdCAM ou da sua região variável ou porção de ligação de antígeno deste.
[009] A invenção fornece vetores e células hospedeiras que compreendem as ditas moléculas de ácido nucléico, assim como métodos de produzir recombinantemente os polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucléico.
[010] Os animais transgênicos não humanos ou plantas que ex pressam a cadeia pesada e/ou leve do dito anticorpo anti-MAdCAM ou porção de ligação de antígeno deste, também são fornecidos.
Breve Descrição dos Desenhos
[011] A Figura 1 é um alinhamento das seqüências de aminoáci- do prognosticadas das regiões variáveis de cadeia pesada e leve capa de doze anticorpos monoclonais anti-MAdCAM humanos com as se- qüências de aminoácido da linhagem germinativa dos genes humanos correspondentes.
[012] A Figura 1A mostra um alinhamento da seqüência de ami- noácido prognosticada da cadeia pesada para anticorpos 1.7.2 e 1.8.2 com o produto de gene VH 3-15 humano da linhagem germinativa.
[013] A Figura 1B mostra um alinhamento da seqüência de ami- noácido prognosticada da cadeia pesada para anticorpo 6.14.2 com o produto de gene VH 3-23 humano da linhagem germinativa.
[014] A Figura 1C mostra um alinhamento da seqüência de ami- noácido prognosticada da cadeia pesada para anticorpo 6.22.2 com o produto de gene VH 3-33 humano da linhagem germinativa.
[015] A Figura 1D mostra um alinhamento da seqüência de ami- noácido prognosticada da cadeia pesada para o anticorpo 6.34.2 com o produto de gene VH 3-30 humano da linhagem germinativa.
[016] A Figura 1E mostra um alinhamento da seqüência de ami- noácido prognosticada da cadeia pesada para anticorpo 6.67.1 com o produto de gene VH 4-4 humano da linhagem germinativa.
[017] A Figura 1F mostra um alinhamento da seqüência de ami- noácido prognosticada da cadeia pesada para o anticorpo 6.73.2 com o produto de gene VH 3-23 humano da linhagem germinativa.
[018] A Figura 1G mostra um alinhamento da seqüência de ami- noácido prognosticada da cadeia pesada para anticorpo 6.77.1 com o produto de gene VH 3-21 humano da linhagem germinativa.
[019] A Figura 1H mostra um alinhamento da seqüência de ami- noácido prognosticada da cadeia pesada para anticorpos 7.16.6 e 7.26.4 com o produto de gene VH 1-18 humano da linhagem germina- tiva.
[020] A Figura 1I mostra um alinhamento da seqüência de ami- noácido prognosticada da cadeia pesada para o anticorpo 7.20.5 com o produto de gene VH 4-4 humano da linhagem germinativa.
[021] A Figura 1J mostra um alinhamento da seqüência de ami- noácido prognosticada da cadeia pesada para o anticorpo 9.8.2 com o produto de gene VH 3-33 humano da linhagem germinativa.
[022] A Figura 1K mostra um alinhamento da seqüência de ami- noácido prognosticada da cadeia capa leve para os anticorpos 1.7.2 e 1.8.2 com o produto de gene A3 humano da linhagem germinativa.
[023] A Figura 1L mostra um alinhamento da seqüência de ami- noácido prognosticada da cadeia leve capa para o anticorpo 6.14.2 com o produto de gene O12 humano da linhagem germinativa.
[024] A Figura 1M mostra um alinhamento da seqüência de ami- noácido prognosticada da cadeia leve capa para o anticorpo 6.22.2 com o produto de gene A26 humano da linhagem germinativa.
[025] A Figura 1N mostra um alinhamento da seqüência de ami- noácido prognosticada da cadeia leve capa para o anticorpo 6.34.2 com o produto de gene O12 humano da linhagem germinativa.
[026] A Figura 1O mostra um alinhamento da seqüência de ami- noácido prognosticada da cadeia leve capa para o anticorpo 6.67.1 com o produto de gene B3 humano da linhagem germinativa.
[027] A Figura 1P mostra um alinhamento da seqüência de ami- noácido prognosticada da cadeia leve capa para o anticorpo 6.73.2 com o produto de gene O12 humano da linhagem germinativa.
[028] A Figura 1Q mostra um alinhamento da seqüência de ami- noácido prognosticada da cadeia leve capa para o anticorpo 6.77.1 com o produto de gene A2 humano da linhagem germinativa.
[029] A Figura 1R mostra um alinhamento da seqüência de ami- noácido prognosticada da cadeia leve capa para os anticorpos 7.16.6 e 7.26.4 com o produto de gene A2 humano da linhagem germinativa.
[030] A Figura 1S mostra um alinhamento da seqüência de ami- noácido prognosticada da cadeia leve capa para os anticorpo 7.20.5 com o produto de gene A3 humano da linhagem germinativa.
[031] A Figura 1T mostra um alinhamento da seqüência de ami- noácido prognosticada da cadeia leve capa para o anticorpo 9.8.2 com o produto de gene O18 humano da linhagem germinativa.
[032] A Figura 2 são alinhamentos CLUSTAL das seqüências de aminoácido de cadeia pesada e leve capa prognosticada de anticorpos anti-MAdCAM humanos.
[033] A Figura 2A é um alinhamento CLUSTAL e árvore radial das seqüências de aminoácido de cadeia leve capa prognosticada, mostrando o grau de similaridade entre as cadeias leve capa de anticorpo anti-MAdCAM.
[034] A Figura 2B é um alinhamento CLUSTAL e árvore radial das seqüências de aminoácido pesada prognosticada, mostrando o grau de similaridade entre as cadeias pesadas de anticorpo anti- MAdCAM.
[035] A Figura 3 é uma seqüência de aminoácido do alinhamento CLUSTAL dos 2 domínios do terminal N de MAdCAM cinomolgo e humano que formam o domínio de ligação α4β7. Os filamentos β são alinhados de acordo com Tan et al., Structure (1998) 6: 793-801.
[036] A Figura 4 é um gráfico que representa os efeitos de dose de 1.7.2 e 7.16.6 biotinilados purificados na adesão de linfócitos de sangue periférico humano para as seções de endotélio hepático humano congelado que expressam MAdCAM.
[037] A Figura 5 mostra uma representação gráfica bidimensional com base nos dados capturados na Tabela 7 da diversidade de epíto- pos MAdCAM aos quais os anticorpos anti-MAdCAM, 1.7.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2 se ligam. Os anticorpos anti-MAdCAM dentro do mesmo círculo mostram o mesmo padrão de reatividade, pertencem ao mesmo compartimento de epítopo e são prováveis de reconhecer o mesmo epítopo em MAdCAM. Os clones de anticorpo anti-MAdCAM dentro dos círculos de sobreposição são incapazes de ligar simultaneamente e são, portanto, prováveis de reconhecer um epítopo de sobreposição em MAdCAM. Os círculos não integrantes representam clones de anticorpo anti-MAdCAM com separação epitópica espacial distinta.
[038] A Figura 6 mostra dados de ELISA intercalados com anti corpos anti-MAdCAM 1.7.2 e um 7.16.6 rotulado com Alexa 488, mostrando que dois anticorpos que são capazes de detectar epítopos diferentes em MAdCAM poderiam ser usados para detectar MAdCAM solúvel com propósitos de diagnóstico.
[039] A Figura 7 mostra o efeito de um anticorpo inibidor anti- MAdCAM (1 mg/kg) sobre o número de linfócitos α4β7+ periféricos circulantes, expressados como um aumento dobrado em relação ao IgG2a mAb de controle ou veículo, usando mAb anti-MAdCAM 7.16.6 em um modelo de macaco cinomolgo.
Descrição Detalhada da Invenção Definições e Técnicas Gerais
[040] A menos que de outro modo aqui definido, os termos cientí ficos e técnicos usados em conexão com a presente invenção devem ter os significados que são habitualmente entendidos por aqueles versados na técnica. Além disso, a menos que de outro modo requerido pelo contexto, os termos singulares devem incluir pluralidades e os termos plurais devem incluir o singular. No geral, as nomenclaturas usadas em conexão com e técnicas de, cultura de célula e tecido, biologia molecular, imunologia, microbiologia, genéticas, química de proteína e de ácido nucléico e hibridização aqui descrita são aquelas bem conhecidas e habitualmente usadas na técnica. Os métodos e técnicas da presente invenção são no geral realizadas de acordo com métodos convencionais bem conhecidos na técnica e como descrito em várias referências gerais e mais específicas que são citadas e debatidas por todo o relatório descritivo a menos que de outro modo indicado. Ver, por exemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989) e Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992) e Harlow e Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990), que são aqui incorporados por referência. As reações enzimáticas e as técnicas de purificação são realizadas de acordo com as especificações do fabricante, como habitualmente realizada na técnica ou como aqui descrito. As técnicas padrão são usadas para as sínteses químicas, análises químicas, preparação farmacêutica, formulação e liberação e tratamento de pacientes.
[041] Os seguintes termos, a menos que de outro modo indicado, devem ser entendidos ter os seguintes significados:
[042] O termo "polipeptídeo" abrange proteínas nativas ou artifi ciais, fragmentos de proteína e análogos de polipeptídeo de uma se- qüência de proteína. Um polipeptídeo pode ser monomérico ou polimé- rico.
[043] O termo "proteína isolada" ou "polipeptídeo isolado" é uma proteína ou polipeptídeo que em virtude da sua origem ou fonte de derivação (1) não estão associados com componentes naturalmente associados que os acompanham no seu estado nativo, (2) são isentos de outras proteínas da mesma espécie (3) são expressados por uma célula de uma espécie diferente ou (4) não ocorrem na natureza. Assim, um polipeptídeo que seja quimicamente sintetizado ou sintetizado em um sistema celular diferente da célula a partir da qual ele naturalmente origina será "isolado" dos seus componentes naturalmente associados. Uma proteína também pode ser tornada substancialmente livre de componentes naturalmente associados pela isolação, usando técnicas de purificação de proteína bem conhecidas na técnica.
[044] Uma proteína ou polipeptídeo são "substancialmente pu ros," "substancialmente homogêneos" ou "substancialmente purificados" quando pelo menos cerca de 60 a 75 % de uma amostra exibe uma única espécie de polipeptídeo. O polipeptídeo ou proteína podem ser monoméricos ou multiméricos. Um polipeptídeo ou proteína substancialmente puros tipicamente compreendem cerca de 50 %, 60 %, 70 %, 80 % ou 90 % P/P de uma amostra de proteína, mais usualmente de cerca de 95 % e preferivelmente serão acima de 99 % puros. A pureza ou homogeneidade da proteína podem ser indicadas por vários meios bem conhecidos na técnica, tais como a eletroforese em gel de poliacrilamida de uma amostra de proteína, seguida pela visualização de uma única faixa de polipeptídeo no tingimento do gel com um corante bem conhecido na técnica. Para certos propósitos, resolução mais alta pode ser fornecida usando-se a HPLC ou outros meios bem conhecidos na técnica para a purificação.
[045] O termo "fragmento de polipeptídeo" como aqui usado refe re-se a um polipeptídeo que tem uma deleção no terminal amino e/ou terminal carbóxi, mas onde a seqüência de aminoácido remanescente é idêntica às posições correspondentes na seqüência que ocorre naturalmente. Em algumas modalidades, os fragmentos têm pelo menos 5, 6, 8 ou 10 aminoácidos no comprimento. Em outras modalidades, os fragmentos têm pelo menos 14 aminoácidos de comprimento, mais preferivelmente pelo menos 20 aminoácidos de comprimento, usualmente pelo menos 50 aminoácidos de comprimento, ainda mais preferivelmente pelo menos 70, 80, 90, 100, 150 ou 200 aminoácidos de comprimento.
[046] O termo "análogo de polipeptídeo" como aqui usado refere- se a um polipeptídeo que compreende um segmento de pelo menos 25 aminoácidos que tem identidade substancial a uma porção de uma seqüência de aminoácido e que têm pelo menos uma das seguintes propriedades: (1) ligação específica a MAdCAM sob condições de ligação adequadas, (2) capacidade para inibir a ligação da integrina α4β7 e/ou L-selectina a MAdCAM ou (3) a capacidade para reduzir a expressão de superfície celular de MAdCAM in vitro ou in vivo. Tipicamente, análogos de polipeptídeo compreendem uma substituição de aminoácido conservativa (ou inserção ou deleção) com respeito à se- qüência que ocorre naturalmente. Os análogos tipicamente têm pelo menos 20 aminoácidos de comprimento, preferivelmente pelo menos 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150 ou 200 aminoácidos de comprimento ou mais longo e pode ser freqüentemente tão longo quanto um polipeptí- deo de tamanho natural que ocorre naturalmente.
[047] As substituições de aminoácido preferidas são aquelas que: (1) reduz a suscetibilidade à proteólise, (2) reduz a suscetibilidade à oxidação, (3) alterar a afinidade de ligação para formar complexos de proteína, (4) alterar as afinidades de ligação ou (5) conferir ou modificar outras propriedades físico-químicas ou funcionais de tais análogos. Os análogos podem incluir várias muteínas de uma seqüência outra que não a seqüência de peptídeo que ocorre naturalmente. Por exemplo, substituições de aminoácido únicas ou múltiplas (preferivelmente substituições de aminoácido conservativas) podem ser feitas na se- qüência que ocorre naturalmente (preferivelmente na porção do poli- peptídeo fora do(s) domínio(s) formando contatos intermoleculares. Uma substituição de aminoácido conservativa não deve substancialmente mudar as características estruturais da seqüência precursora (por exemplo, um aminoácido de substituição não deve tender a quebrar uma hélice que ocorre na seqüência precursora ou romper outros tipos de estrutura secundária que caracteriza a seqüência precursora). Os exemplos de estruturas secundárias e terciárias de polipeptídeo reconhecidos na técnica são descritos em Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed., W. H. Freeman e Company, Nova Iorque (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden e J. Too- ze, eds., Garland Publishing, Nova Iorque, N.Y. (1991)); e Thornton et al., Nature, 354: 105 (1991), que são cada uma aqui incorporadas por referência.
[048] Os análogos não peptídicos são habitualmente usados na indústria farmacêutica como fármacos com propriedades análogas àquelas do peptídeo padrão. Estes tipos de compostos não peptídicos são chamados de "miméticos de peptídeo" ou "peptidomiméticos". Fauchere, J. Adv. Drug Res., 15: 29 (1986); Veber e Freidinger, TINS, p. 392 (1985); e Evans et al., J. Med. Chem., 30: 1229 (1987), que são aqui incorporadas por referência. Tais compostos são freqüentemente desenvolvidos com a ajuda da modelagem molecular computadorizada. Os miméticos de peptídeo que são estruturalmente similares aos peptídeos terapeuticamente úteis podem ser usados para produzir um efeito terapêutico ou profilático equivalente. No geral, peptidomiméti- cos são estruturalmente similares a um polipeptídeo paradigma (isto é, um polipeptídeo que tem uma propriedade bioquímica ou atividade farmacológica desejadas), tais como um anticorpo humano, mas têm uma ou mais ligações peptídicas opcionalmente substituídas por uma ligação, tal como: -CH2NH-, -CH2S-, -CH2-CH2-, -CH=CH- (cis e trans), -COCH2-, -CH(OH)CH2- e -CH2SO-, pelos métodos bem conhecidos na técnica. A substituição sistemática de um ou mais aminoácidos de uma seqüência de consenso com um D-aminoácido do mesmo tipo (por exemplo, D-lisina no lugar de L-lisina) também podem ser usados para gerar peptídeos mais estáveis. Além disso, peptídeos constrangi-dos que compreendem uma seqüência de consenso ou uma variação de seqüência de consenso substancialmente idêntica podem ser gerados pelos métodos conhecidos na técnica (Rizo e Gierasch Ann. Rev. Biochem. 61: 387 (1992), aqui incorporada por referência); por exemplo, pela adição de resíduos de cisteína internos capazes de formar pontes de dissulfeto intramoleculares que ciclizam o peptídeo.
[049] Uma "imunoglobulina" é uma molécula tetramérica. Em uma imunoglobulina que ocorre naturalmente, cada tetrâmero é composto de dois pares idênticos de cadeias de polipeptídeo, cada par tendo uma cadeia "leve" (cerca de 25 kDa) e uma "pesada" (cerca de 50 a 70 kDa). A porção de terminal amino de cada cadeia inclui uma região variável de cerca de 100 a 110 ou mais aminoácidos primariamente responsáveis pelo reconhecimento de antígeno. A porção de terminal carbóxi de cada cadeia define uma região constante primária responsável pela função efetora. As cadeias leves humanas são classificadas como cadeias leve K e À. As cadeias pesadas são classificadas como μ, δ, Y, α ou ε e definem o isótipo do anticorpo como IgM, IgD, IgG, IgA e IgE, respectivamente. Dentro das cadeias leve e pesada, as regiões variável e constante são unidas por uma região "J" de cerca de 12 ou mais aminoácidos, com a cadeia pesada também incluindo uma região "D" de cerca de 10 ou mais aminoácidos. Ver no geral, Fundamental Imunology, Ch. 7 (Paul, W., ed., 2a ed. Raven Press, N.Y. (1989)) (incorporada por referência em sua totalidade para todos os propósitos). As regiões variáveis de cada par de cadeia le- ve/pesada formam o sítio de ligação de anticorpo tal que uma imuno- globulina intacta tenha dois sítios de ligação.
[050] As cadeias de imunoglobulina exibem a mesma estrutura geral de regiões de matriz relativamente conservadas (FR) unidas pelas três regiões hipervariáveis, também chamada de regiões determinadoras de complementaridade ou CDRs. As CDRs das duas cadeias de cada par são alinhadas pelas regiões de matriz para formar um sítio de ligação específica de epítopo. Do término N ao término C, as cadeias tanto leve quanto pesada compreendem os domínios FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 e FR4. A designação de aminoácidos a cada domínio está de acordo com as definições de Kabat, Sequences of Proteins of Imunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 e 1991)) ou Chothia & Lesk, J. Mol. Biol., 196: 901-917 (1987); Chothia et al., Nature, 342: 878-883 (1989), cada uma das quais é aqui incorporada por referência em sua totalidade.
[051] Um "anticorpo" refere-se a uma imunoglobulina intacta ou a uma porção de ligação de antígeno desta que compete com o anticorpo intacto quanto a ligação específica. Em algumas modalidades, um anticorpo é uma porção de ligação de antígeno desta. As porções de ligação de antígeno podem ser produzidas pelas técnicas de DNA re- combinante ou pela clivagem enzimática ou química de anticorpos intactos. As porções de ligação de antígeno incluem, inter alia, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, dAb e fragmentos da região determinadora de complementaridade (CDR), anticorpos de cadeia única (scFv), anticorpos quiméricos, diacorpos e polipeptídeos que contém pelo menos uma porção de uma imunoglobulina que seja suficiente para conferir ligação de antígeno específica ao polipeptídeo. Um fragmento Fab é um fragmento monovalente que consiste em domínios VL, VH, CL e CH1; um fragmento F(ab)2 é um fragmento bivalente que compreende dois fragmentos Fab ligados por uma ponte de dissulfeto na região de fechadura; um fragmento Fd consiste em domínios VH e CH1; um fragmento Fv consiste em domínios VL e VH de uma ramificação única de um anticorpo; e um fragmento dAb (Ward et al., Nature, 341: 544-546 (1989)) consiste em um domínio VH.
[052] Como aqui usado, um anticorpo que é aludido como, por exemplo, 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.77.2, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4 ou 9.8.2, é um anticorpo monoclonal que é produzido pelo hibri- doma do mesmo nome. Por exemplo, o anticorpo 1.7.2 é produzido pelo hibridoma 1.7.2. Um anticorpo que é aludido como 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod ou 7.26.4-mod é um anticorpo monoclonal cuja seqüência foi modificada a partir do seu precursor correspondente pela mutagênese direcionada ao sítio.
[053] Um anticorpo de cadeia única (scFv) é um anticorpo em que as regiões VL e VH são emparelhadas para formar uma molécula monovalente por intermédio de um ligador sintético que permite que elas sejam fabricadas como uma cadeia de proteína única (Bird et al., Science, 242: 423-426 (1988) e Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 5879-5883 (1988)). Diacorpos são anticorpos bivalentes, bi- específicos em que os domínios VH e VL são expressados em uma cadeia de polipeptídeo única, mas usando um ligador que é muito curto para permitir o emparelhamento entre os dois domínios na mesma cadeia, forçando deste modo os domínios a formarem par com domínios complementares de uma outra cadeia e criando dois sítios de ligação de antígeno (ver, por exemplo, Holliger, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993) e Poljak, R. J., et al., Structure, 2: 1121-1123 (1994)). Uma ou mais CDRs de um anticorpo da invenção podem ser incorporadas em uma molécula covalente ou não cova- lentemente para torná-la uma imunoadesina que especificamente se liga a MAdCAM. Uma imunoadesina pode incorporar a(s) CDR(s) como parte de uma cadeia de polipeptídeo maior, pode ligar covalente- mente a(s) CDR(s) a uma outra cadeia de polipeptídeo ou pode incorporar a(s) CDR(s) de modo não covalente. As CDRs permitem que as imunoadesina especificamente se liguem a um antígeno particular de interesse.
[054] Um anticorpo pode ter um ou mais sítios de ligação. Se existe mais do que um sítio de ligação, os sítios de ligação podem ser idênticos entre si ou podem ser diferentes. Por exemplo, uma imuno- globulina que ocorre naturalmente tem dois sítios de ligação idênticos, um anticorpo de cadeia única ou fragmento Fab tem um sítio de ligação, enquanto um anticorpo "biespecífico" ou "bifuncional" (diacorpo) tem dois sítios de ligação diferentes.
[055] Um "anticorpo isolado" é um anticorpo que (1) não está as sociado com componentes naturalmente associados, incluindo outros anticorpos naturalmente associados, que o acompanham no seu estado nativo, (2) é livre de outras proteínas da mesma espécie, (3) é expressado por uma célula de uma espécie diferente ou (4) não ocorre na natureza. Os exemplos de anticorpos isolados incluem um anticorpo anti-MAdCAM que foi purificado por afinidade usando MAdCAM, um anticorpo anti-MAdCAM que foi produzido por um hibridoma ou outra linhagem celular in vitro e um anticorpo anti-MAdCAM humano derivado de um mamífero ou planta transgênica.
[056] Como aqui usado, o termo "anticorpo humano" significa um anticorpo em que as seqüências da região variável e constante são seqüências humanas. O termo abrange anticorpos com seqüências derivadas de genes humanos, mas que foram mudados, por exemplo, para diminuir a imunogenicidade possível, aumentar a afinidade, eliminar cisteínas ou sítios de glicosilação que poderiam causar a dobra indesejável, etc. O termo abrange tais anticorpos produzidos recombi- nantemente em células não humanas que poderiam comunicar glicosi- lação não típica de células humanas. O termo também abrange anticorpos que foram incitados em um camundongo transgênico que compreende alguns ou todos os locais das cadeias pesada e leve da imu- noglobulina humana.
[057] Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo humani zado. Em algumas modalidades, o anticorpo humanizado é um anticorpo que é derivado de uma espécie não humana, em que certos aminoácidos na matriz e domínios constantes das cadeias pesada e leve foram mutados de modo a evitar ou anular uma resposta imune em seres humanos. Em algumas modalidades, um anticorpo humanizado pode ser produzido fundindo-se os domínios constantes de um anticorpo humano aos domínios variáveis de uma espécie não humana. Os exemplos de como fabricar anticorpos humanizados podem ser encontrados na Patente U.S. N°s 6.054.297, 5.886.152 e 5;877.293. Em algumas modalidades, um anticorpo humanizado anti-MAdCAM da invenção compreende a seqüência de aminoácido de uma ou mais regiões de matriz de um ou mais anticorpo anti-MAdCAM humanos da invenção.
[058] Em um outro aspecto, a invenção inclui um "anticorpo qui mérico". Em algumas modalidades o anticorpo quimérico refere-se a um anticorpo que contém uma ou mais regiões de um anticorpo e uma ou mais regiões de um ou mais outros anticorpos. Em uma modalidade preferida, uma ou mais das CDRs são derivadas de um anticorpo anti- MAdCAM humano da invenção. Em uma modalidade mais preferida, todas as CDRs são derivadas de um anticorpo anti-MAdCAM humano da invenção. Em uma outra modalidade preferida, as CDRs de mais do que um anticorpo anti-MAdCAM humano da invenção são misturados e emparelhados em um anticorpo quimérico. Por exemplo, um anticorpo quimérico pode compreender uma CDR1 da cadeia leve de um primeiro anticorpo anti-MAdCAM humano pode ser combinado com CDR2 e CDR3 da cadeia leve de um segundo anticorpo anti-MAdCAM humano e as CDRs da cadeia pesada podem ser derivadas a partir de um terceiro anticorpo anti-MAdCAM. Além disso, as regiões de matriz podem ser derivadas de um dos mesmos anticorpos anti-MAdCAM, de um ou mais anticorpos diferentes, tais como um anticorpo humano ou de um anticorpo humanizado.
[059] Um "anticorpo neutralizante," "um anticorpo inibidor" ou an ticorpo antagonista é um anticorpo que inibe a ligação de «437 Dou células que expressam «437 ou qualquer outros ligandos cognatos ou células que expressam ligando cognato, a MAdCAM em pelo menos cerca de 20 %. Em uma modalidade preferida, o anticorpo reduz e inibe a ligação da integrina «437 ou células que expressam «437 para MAdCAM em pelo menos 40 %, mais preferivelmente em 60 %, ainda mais preferivelmente em 80 %, 85 %, 90 %, 95 % ou 100 %. A redução na ligação pode ser medida por qualquer meio conhecido por uma pessoa versada na técnica, por exemplo, como medido em um ensaio de ligação competitiva in vitro. Um exemplo de medir a redução na ligação de células que expressam «437 a MAdCAM é apresentado no Exemplo I.
[060] Os fragmentos ou análogos de anticorpos podem ser facil mente preparados por aqueles versados na técnica seguindo as divulgações deste relatório descritivo. Os terminais amino e carbóxi preferidos de fragmentos ou análogos ocorrem próximo às limites de domínios funcionais. Os domínios estruturais e funcionais podem ser identificados pela comparação dos dados de seqüência de nucleotídeo e/ou aminoácido com as bases de dados de seqüência públicas ou patenteado. Preferivelmente, métodos de comparação computadorizados são usados para identificar motivos de seqüência ou domínios de conformação de proteína prognosticada que ocorrem em outras proteínas de estrutura e/ou função conhecidas. Métodos para identificar seqüên- cias de proteína que se dobram em uma estrutura tridimensional conhecida são conhecidos (Bowie et al., Science, 253: 164 (1991)).
[061] O termo "ressonância de plasma de superfície", como aqui usado, refere-se a um fenômeno ótico que permite a análise de interações bioespecíficas em tempo real pela detecção de alterações em concentrações de proteína dentro de uma matriz biossensora, por exemplo usando o sistema BIAcore (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Suécia e Piscataway, N.J.). Para descrições adicionais, ver Jonsson, U., et al., Ann. Biol. Clin., 51: 19-26 (1993); Jonsson, U., et al., Biotechniques, 11: 620-627 (1991); Johnsson, B., et al., J. Mol. Recognit., 8: 125-131 (1995); e Johnnson, B., et al., Anal. Biochem., 198: 268-277 (1991).
[062] O termo "koff" refere-se à constante dissociação para a dis sociação de um anticorpo do complexo anticorpo/antígeno.
[063] O termo "Kd" refere-se à constante de dissociação de uma interação de anticorpo-antígeno particular. Um anticorpo é dito ligar-se a um antígeno quando a constante de dissociação é < 1 μM, preferivelmente < 100 nM e o mais preferivelmente < 10 nM.
[064] O termo "epítopo" inclui qualquer proteína determinante ca paz de ligação específica a um receptor de imunoglobulina ou célula T ou de outro modo interagindo com uma molécula. Os determinantes epitópicos usualmente consistem em agrupamentos de superfície quimicamente ativos de moléculas, tais como cadeias laterais de aminoá- cidos ou carboidrato e usualmente têm características estruturais tridimensionais específicas, assim como características de carga específicas. Um epítopo pode ser "linear" ou "conformacional." Em um epítopo linear, todos os pontos de interação entre a proteína e a molécula in- fluenciadora (tal como, um anticorpo) ocorre linearmente ao longo da seqüência de aminoácido primária da proteína. Em um epítopo con- formacional, os pontos de interação ocorre através dos resíduos de aminoácido na proteína que são separados um do outro.
[065] Como aqui usado, os vinte aminoácidos convencionais e as suas abreviações seguem o uso convencional. Ver Immunology - A Synthesis (2a Edição, E.S. Golub e D.R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991)), que é aqui incorporada por referência. Os estereoisômeros (por exemplo, D-aminoácidos) dos vinte aminoá- cidos convencionais, aminoácidos não naturais, tais como α-, α- dissubstituídos, aminoácidos N-alquila, ácido lático e outros aminoáci- dos não convencionais também podem ser componentes adequados para polipeptídeos da presente invenção. Os exemplos de aminoáci- dos não convencionais incluem: 4-hidroxiprolina, Y—carboxiglutamato, ε-N,N,N-trimetillisina, ε-N-acetillisina, O-fosfoserina, N-acetilserina, N- formil-metionina, 3-metilistidina, 5-hidroxilisina, s-N-metilarginina e outros aminoácidos similares e imino ácidos (por exemplo, 4- hidroxiprolina). Na notação de polipeptídeo aqui usada, a direção à esquerda é a direção do terminal amino e a direção à direita é a direção de terminal carbóxi, de acordo com o uso e convenção padrão.
[066] O termo "polinucleotídeo" como aqui aludido significa uma forma polimérica de nucleotídeos de pelo menos 10 bases no comprimento, ribonucleotídeos ou desoxinucleotídeos ou uma forma modificada de cada tipo de nucleotídeo. O termo inclui formas de filamento único e duplo de DNA.
[067] O termo "polinucleotídeo isolado" como aqui usado deve significar um polinucleotídeo de origem genômica, cDNA ou sintética ou alguma combinação deste, que em virtude da sua origem o "polinu- cleotídeo isolado" (1) não está associado com todo ou uma porção de um polinucleotídeo em que o "polinucleotídeo isolado" é encontrado na natureza, (2) é operavelmente ligado a um polinucleotídeo que não está ligado na natureza ou (3) não ocorre na natureza como parte de uma seqüência maior.
[068] O termo "oligonucleotídeo" aqui aludido inclui nucleotídeos que ocorrem naturalmente e modificados ligados entre si pela ligação de oligonucleotídeo que ocorre naturalmente e que não ocorre naturalmente. Os oligonucleotídeos são um subconjunto de polinucleotídeo que no geral compreendem um comprimento de 200 bases ou menos. Preferivelmente oligonucleotídeos são 10 a 60 bases no comprimento e o mais preferivelmente 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 a 40 bases no comprimento. Os oligonucleotídeos são usualmente de filamento único, por exemplo, para sondas; embora os oligonucleotídeos possam ser de filamento duplo, por exemplo, para o uso na construção de um gene mutante. Os oligonucleotídeos da invenção podem ser oligo- nucleotídeos de sentido ou de anti-sentido.
[069] O termo "nucleotídeos que ocorrem naturalmente" aqui alu dido inclui desoxirribonucleotídeos e ribonucleotídeos. O termo "nucle- otídeos modificados" aqui aludido inclui nucleotídeos com grupos de açúcar modificados ou substituídos e outros. O termo "ligações de oli- gonucleotídeo" aqui aludido inclui ligações de oligonucleotídeos tais como fosforotioato, fosforoditioato, fosforosselenoato, fosforodissele- noato, fosforoanilotioato, fosforaniladato, fosforoamidato e outros. Ver, por exemplo, LaPlanche et al., Nucl. Acids Res. 14: 9081 (1986); Stec et al., J. Am. Chem. Soc. 106: 6077 (1984); Stein et al., Nucl. Acids Res., 16: 3209 (1988); Zon et al., Anti-Cancer Drug Design 6: 539 (1991); Zon et al., Oligonucleotideos and Analogues: A Practical Approach, pp. 87-108 (F. Eckstein, Ed., Oxford University Press, Oxford Inglaterra (1991)); Stec et al., Patente U.S. No 5.151.510; Uhlmann e Peyman, Chemical Reviews, 90: 543 (1990), as divulgações dos quais são aqui incorporadas por referência. Um oligonucleotídeo pode incluir um rótulo para detecção, se desejado.
[070] As seqüências "operavelmente ligadas" incluem tanto as seqüências de controle de expressão que são contíguas com o gene de interesse e as seqüências de controle da expressão que atua em trans ou em uma distância para controlar o gene de interesse. O termo "seqüência de controle da expressão" como aqui usado refere-se às seqüências de polinucleotídeo que são necessárias para efetuar a expressão e processamento de seqüências codificadoras às quais elas estão ligadas. As seqüências de controle da expressão incluem as se- qüências de iniciação, terminação, promotora e realçadora de transcrição apropriadas; sinais de processamento de RNA eficiente, tais como os sinais de junção e poliadenilação; as seqüências que estabilizam o mRNA citoplasmático; as seqüências que realçam a eficiência de tradução (isto é, a seqüência de consenso Kozak); seqüências que realçam a estabilidade da proteína; e quando desejado, seqüências que realçam a secreção da proteína. A natureza de tais seqüências de controle difere dependendo do organismo hospedeiro; em procariotas, tais seqüências de controle no geral incluem promotor, sítio de ligação de ribossoma e seqüência de terminação de transcrição; em eucario- tas, no geral, tais seqüências de controle incluem promotores e se- qüência de terminação de transcrição. O termo "seqüências de controle" é intencionado incluir, em um mínimo, todos os componentes cuja presença é essencial para a expressão e processamento e também pode incluir componentes adicionais cuja presença é vantajosa, por exemplo, seqüências líder e seqüências parceiras de fusão.
[071] O termo "vetor", como aqui usado, é intencionado a se refe rir a uma molécula de ácido nucléico capaz de transportar um outro ácido nucléico ao qual o mesmo foi ligado. Um tipo de vetor é um "plasmídeo", que se refere a uma alça de DNA de filamento duplo circular na qual segmentos de DNA adicionais podem ser ligados. Um outro tipo de vetor é um vetor viral, em que segmentos de DNA adicionais podem ser ligados no genoma viral. Certos vetores são capazes de replicação autônoma em uma célula hospedeira na qual eles são introduzidos (por exemplo, vetores bacterianos tendo uma origem bac- teriana de replicação e vetores mamíferos epissômicos). Outros vetores (por exemplo, vetores mamíferos não epissômicos) pode ser integrado no genoma de uma célula hospedeira na introdução na célula hospedeira e deste modo são replicados junto com o genoma hospedeiro. Além disso, certos vetores são capazes de direcionar a expressão de genes ao quais eles são operativamente ligados. Tais vetores são aqui aludidos como "vetores de expressão recombinante" (ou simplesmente, "vetores de expressão"). No geral, vetores de expressão de utilidade nas técnicas de DNA recombinante estão freqüentemente na forma de plasmídeos. No presente relatório descritivo, "plasmídeo" e "vetor" podem ser usados intercambiavelmente visto que o plasmídeo é a forma mais habitualmente usada de vetor. Entretanto, a invenção é intencionada a incluir outras tais formas de vetores de expressão, tais como vetores virais (por exemplo, retrovírus defeituosos na replicação, adenovírus e vírus adeno-associados), que servem para funções equivalentes.
[072] O termo "célula hospedeira recombinante" (ou simplesmen te "célula hospedeira"), como aqui usado, é intencionado a referir-se a uma célula na qual um vetor de expressão recombinante foi introduzido. Deve ser entendido que tais termos são intencionados a se referir não apenas à célula objeto particular mas à progênie de uma tal célula. Porque certas modificações podem ocorrer nas gerações que se sucedem devido à mutação ou influências ambientais, tal progênie não pode, de fato, ser idêntica à célula precursora, mas são ainda incluídas dentro do escopo do termo "célula hospedeira" como aqui usado.
[073] O termo "hibridiza seletivamente" aqui aludido significa ligar detectável e especificamente. Os polinucleotídeos, oligonucleotídeos e fragmentos destes de acordo com a invenção seletivamente hibridiza com os filamentos de ácido nucléico sob hibridização e condições de lavagem que minimizam quantidades apreciáveis de ligação detectável aos ácidos nucléicos não específicos. "Alta severidade" ou condições "altamente severas" podem ser usadas para se obter condições de hi- bridização seletivas como conhecido na técnica e aqui debatido. Um exemplo de "severidade alta" ou condições "altamente severas" é um método de incubar um polinucleotídeo com um outro polinucleotídeo, em que um polinucleotídeo pode ser fixado a uma superfície sólida, tal como uma membrana, em um tampão de hibridização de 6X SSPE ou SSC, 50 % de formamida, 5X reagente de Denhardt, 0,5 % de SDS, 100 μg/ml de DNA de esperma de salmão desnaturado, fragmentado em uma temperatura de hibridização de 42°C por 12 a 16 horas, seguido por duas lavagens a 55°C usando um tampão de lavagem de 1X SSC, 0,5% de SDS. Ver também Sambrook et al., supra, pp. 9.509.55.
[074] O termo "identidade de seqüência percentual" no contexto das seqüências de nucleotídeo refere-se aos resíduos em duas se- qüências que são os mesmos quando alinhados para correspondência máxima. O comprimento da comparação da identidade de seqüência pode ser em relação a um trecho de pelo menos cerca de nove nu- cleotídeos, usualmente pelo menos cerca de 18 nucleotídeos, mais usualmente pelo menos cerca de 24 nucleotídeos, tipicamente pelo menos cerca de 28 nucleotídeos, mais tipicamente pelo menos cerca de 32 nucleotídeos e preferivelmente pelo menos cerca de 36, 48 ou mais nucleotídeos. Existem vários algoritmos diferentes conhecidos na técnica que podem ser usados para medir a identidade de seqüência de nucleotídeo. Por exemplo, as seqüências de polinucleotídeo podem ser comparadas usando FASTA, Gap ou Bestfit, que são programas em Pacote Wisconsin Versão 10.3, Accelrys, San Diego, CA. FASTA, que inclui, por exemplo, os programas FASTA2 e FASTA3, fornecem alinhamentos e identidade de seqüência percentual das regiões da melhor sobreposição entre as seqüências dúvida e procura (Pearson, Methods Enzymol., 183: 63-98 (1990); Pearson, Methods Mol. Biol., 132: 185-219 (2000); Pearson, Methods Enzymol., 266: 227-258 (1996); Pearson, J. Mol. Biol., 276: 71-84 (1998); aqui incorporadas por referência). A menos que de outro modo especificado, os parâmetros de default para um programa ou algoritmo particulares são usados. Por exemplo, a identidade de seqüência percentual entre seqüên- cias de nucleotídeo pode ser determinada usando FASTA com os seus parâmetros de default (um tamanho de palavra de 6 e o fator NOPAM para a matriz de pontuação) ou usando Gap com seus parâmetros de default como fornecidos no Pacote Wisconsin Versão 10.3, aqui incorporado por referência.
[075] Uma referência a uma seqüência de nucleotídeo abrange o seu complemento a menos que de outro modo especificado. Assim, uma referência a uma molécula de ácido nucléico tendo uma seqüên- cia particular deve ser entendido para abranger o seu filamento complementar, com a sua seqüência complementar.
[076] Na técnica da biologia molecular, os pesquisadores usam os termos "identidade de seqüência percentual", "similaridade de se- qüência percentual" e "homologia de seqüência percentual" intercam- biavelmente. Neste pedido, estes termos devem ter o mesmo significado com respeito apenas às seqüências de nucleotídeo.
[077] O termo "similaridade substancial" ou "similaridade de se- qüência substancial," quando da referência a um ácido nucléico ou fragmento deste, indica que, quando otimamente alinhadas com inserções ou deleções de nucleotídeo apropriadas com um outro ácido nu- cléico (ou seu filamento complementar), existe identidade de seqüên- cia de nucleotídeo em pelo menos cerca de 85 %, preferivelmente pelo menos cerca de 90 % e mais preferivelmente pelo menos cerca de 95%, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % das bases de nucleotídeo, como medido por qualquer algoritmo bem conhecido de identidade de seqüên- cia, tal como FASTA, BLAST ou Gap, como debatido acima.
[078] Como aplicado aos polipeptídeos, o termo "identidade subs tancial" significa que duas seqüências de peptídeo, quando otimamente alinhadas, tais como pelos programas GAP ou BESTFIT usando valores de intervalo de default, compartilham pelo menos 75 % ou 80 % de identidade de seqüência, preferivelmente pelo menos 90 % ou 95 % de identidade de seqüência, ainda mais preferivelmente pelo menos 98 % ou 99 % de identidade de seqüência. Preferivelmente, posições de resíduo que não são idênticas diferem pelas substituições de aminoácido conservativas. Uma "substituição de aminoácido conservativa" é uma em que um resíduo de aminoácido é substituído por um outro resíduo de aminoácido tendo uma cadeia lateral (grupo R) com similar propriedades químicas (por exemplo, carga ou hidrofobicidade). No geral, uma substituição de aminoácido conservativa não mudará substancialmente as propriedades funcionais de uma proteína. Nos casos onde duas ou mais seqüências de aminoácido diferem entre si pelas substituições conservativas, a identidade de seqüência percentual ou grau de similaridade podem ser ajustados para cima para corrigir quanto a natureza conservativa da substituição. Meios para fabricar este ajuste são bem conhecidos por aqueles versados na técnica. Ver, por exemplo, Pearson, Methods Mol. Biol., 24: 307-31 (1994), aqui incorporadas por referência. Os exemplos de grupos de aminoácidos que têm cadeias late-rais com propriedades químicas similares incluem 1) cadeias laterais alifáticas: glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; 2) cadeias laterais hidroxílicas alifáticas: serina e treonina; 3) cadeias laterais contendo amida: asparagina e glutamina; 4) cadeias laterais aromáticas: fenilala- nina, tirosina e triptofano; 5) cadeias laterais básicas: lisina, arginina e histidina; e 6) cadeias laterais contendo enxofre são cisteína e metioni- na. Os grupos de substituição de aminoácidos conservativos preferidos são: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alani- na-valina, glutamato-aspartato e asparagina-glutamina.
[079] Alternativamente, uma substituição conservativa é qualquer mudança tendo um valor positivo na matriz de probabilidade log PAM250 divulgada em Gonnet et al., Science, 256: 1443-45 (1992), aqui incorporadas por referência. Uma substituição "moderadamente conservativa" é qualquer mudança tendo um valor não negativo na matriz de probabilidade log PAM250.
[080] A similaridade de seqüência para polipeptídeos é tipicamen te medida usando o software de análise de seqüência. O software de análise de proteína equipara seqüências similares usando as medidas de similaridade designadas às várias substituições, deleções e outras modificações, incluindo as substituições de aminoácido conservativas. Por exemplo, os programas contêm GCG tal como "Gap" e "Bestfit" que podem ser usados com parâmetros de default para determinar a homo- logia ou identidade de seqüência entre polipeptídeos intimamente relacionados, tais como polipeptídeos homólogos de espécie diferente de organismos ou entre uma proteína do tipo selvagem e uma muteína deste. Ver, por exemplo, o pacote Wisconsin Versão 10.3. As polisse- qüências de peptídeo também podem ser comparadas usando FASTA usando default ou parâmetros recomendados, um programa no Pacote Wisconsin Versão 10.3. FASTA (por exemplo, FASTA2 e FASTA3) fornece alinhamentos e identidade de seqüência percentual das regiões da melhor sobreposição entre as seqüências de dúvida e procura (Pearson (1990); Pearson (2000)). Um outro algoritmo preferido quando da comparação de uma seqüência da invenção a uma base de dados contendo um número grande de seqüências de organismos diferentes é o pro- grama de computador BLAST, especialmente blastp ou tblastn, usando parâmetros de default. Ver, por exemplo, Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990); Altschul et al., Nucleic Acid Res. 25: 3389-402 (1997); aqui incorporadas por referência.
[081] O comprimento das seqüências de polipeptídeo compara das quanto a homologia no geral serão de pelo menos cerca de 16 resíduos de aminoácido, usualmente pelo menos cerca de 20 resíduos, mais usualmente pelo menos cerca de 24 resíduos, tipicamente pelo menos cerca de 28 resíduos e preferivelmente mais do que cerca de 35 resíduos. Quando da pesquisa em uma base de dados contendo seqüências de um número grande de organismos diferentes, é preferível comparar as seqüências de aminoácido.
[082] Como aqui usado, os termos "rótulo" ou "rotulado" referem- se à incorporação de um outra molécula no anticorpo. Em uma modalidade, o rótulo é um marcador detectável, por exemplo, a incorporação de um aminoácido radiorrotulado ou ligação a um polipeptídeo de porções de biotinila que podem ser detectadas pela avidina marcada (por exemplo, estreptavidina contendo um marcador fluorescente ou atividade enzimática que podem ser detectados pelos métodos óticos ou colorimétrico). Em uma outra modalidade, o rótulo ou marcador pode ser terapêutico, por exemplo, um conjugado medicamentoso ou toxina. Vários métodos de rotular polipeptídeos e glicoproteínas são conhecidos na técnica e podem ser usados. Os exemplos de rótulos para polipeptídeos incluem, mas não são limitados aos seguintes: radioisó- topos ou radionuclídeos (por exemplo, 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I), rótulos fluorescentes (por exemplo, FITC, rodamina, fósforo lantanídeo), rótulos enzimáticos (por exemplo, rábano peroxidase, β- galactosidase, luciferase, fosfatase alcalina), marcadores quimiolumi- nescentes, grupos de biotinila, epítopos de polipeptídeo pré determinados reconhecidos por um repórter secundário (por exemplo, se- qüências de par de zíper de leucina, sítios de ligação para anticorpos secundários, domínios de ligação de metal, rótulos de epítopo), agentes magnéticos, tais como quelatos de gadolínio, toxinas, tais como toxina da coqueluche, taxol, citochalasin B, gramicidin D, brometo de etídio, emetina, mitomicina, etoposida, tenoposida, vincristina, vinblas- tina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, diidróxi antracin diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-desidrotestosterona, gli- cocorticóides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol e puromicina e análogos ou homólogos destes. Em algumas modalidades, rótulos são ligados pelas ramificações espaçadoras de vários comprimentos para reduzir o impedimento estérico potencial.
[083] O termo "agente" é aqui usado para denotar um composto químico, uma mistura de compostos químicos, uma macromolécula biológica ou um extrato fabricado a partir de materiais biológicos. O termo "agente ou fármaco farmacêutico" como aqui usado refere-se a um composto químico ou composição capaz de induzir um efeito terapêutico desejado quando apropriadamente administrado a um paciente. Outros termos químicos aqui são usados de acordo com o uso convencional na técnica, como exemplificado por The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (Parker, S., Ed., McGraw-Hill, San Francisco (1985)), aqui incorporada por referência).
[084] O termo agente "antiinflamatório" ou "imunomodulatório" é aqui usado para se referir aos agentes que têm a propriedade funcional de inibir a inflamação, incluindo a doença inflamatória em um paciente, incluindo um ser humano. Em várias modalidades desta invenção, a doença inflamatória pode ser, mas não está limitada às doenças inflamatórias do trato gastrointestinal incluindo a doença de Crohn, colite ulcerativa, doença diverticular, gastrite, doença hepática, esclerose biliar primária, colangite esclerosante. As doenças inflamatórias também incluem mas não são limitadas à doença abdominal (incluindo peritonite, apendicite, doença do trato biliar), mielite transversal aguda, dermatite alérgica (incluindo pele alérgica, eczema alérgico, atopia de pele, eczema atópico, dermatite atópica, inflamação cutânea, eczema inflamatório, dermatite inflamatória, pele de pulga, dermatite miliar, eczema miliar, pele de ácaro da poeira doméstica), espondilite ancilo- sante (síndrome de Reiters), asma, inflamação das vias aéreas, ate- rosclerose, arteriosclerose, atresia biliar, inflamação da bexiga, câncer de mama, inflamação cardiovascular (incluindo vasculite, infartos nailfold reumatóides, úlceras das pernas, polimiosite, inflamação vascular crônica, pericardite, doença pulmonar obstrutiva crônica), pancreatite crônica, inflamação perineural, colite (incluindo colite amébica, colite infecciosa, colite bacteriana, colite de Crohn, colite isquêmica, colite ulcerativa, proctocolite idiopática, doença do intestino inflamatório, colite pseudomembranosa), distúrbios vasculares de colágeno (artrite reumatóide, SLE, esclerose sistêmica progressiva, doença do tecido conectivo misto, diabete melito), doença de Crohn (enterite regional, ileíte granulomatosa, ileocolite, inflamação do sistema digestivo), doença desmielinante (incluindo mielite, esclerose múltipla, esclerose disseminada, encefalomielite disseminada aguda, desmielinação peri- venosa, deficiência de vitamina B12, síndrome de Guillain-Barre, retro- vírus associado com MS), dermatomiosite, diverticulite, diarréia exudativa, gastrite, hepatite granulomatosa, inflamação granulomatosa, cole- cistite, diabete melito dependente de insulina, doenças hepáticas inflamatórias (fibrose hepática, cirrose biliar primária, hepatite, colangite esclerosante), inflamação pulmonar (fibrose pulmonar idiopática, granuloma eosinofílica do pulmão, histiocitose pulmonar X, inflamação peribronquiolar, bronquite aguda), linfogranuloma venéreo, melanoma maligno, doença bucal/dentária (incluindo gengivite, doença periodontal), mucosite, inflamação do sistema musculoesqueletal (miosite), es- teatoepatite não alcoólica (doença do fígado gorduroso não alcoólica), inflamação ocular & orbital (incluindo uveíte, neurite ótica, ulceração reumatóide periférica, inflamação córnea periférica), osteoartrite, oste- omielite, inflamação faríngea, poliartrite, proctite, psoríase, dano por radiação, sarcoidose, necropatia da célula falciforme, tromboflebite superficial, síndrome da resposta inflamatória sistêmica, tireoidite, lúpus eritematoso sistêmico, doença do enxerto versus hospedeiro, dano por queimadura aguda, síndrome de Behçet, síndrome de Sjogren.
[085] Os termos paciente e sujeito incluem pacientes humanos e veterinários.
Anticorpo anti-MAdCAM humanos e Sua Caracterização
[086] Em uma modalidade, a invenção fornece anticorpos anti- MAdCAM que compreendem seqüências de CDR humanas. Em uma modalidade preferida, a invenção fornece anticorpos anti-MAdCAM humanos. Em algumas modalidades, os anticorpos anti-MAdCAM humanos são produzidos imunizando-se um animal transgênico não humano, por exemplo, um roedor, cujo genoma compreende genes da imunoglobulina humana de modo que o animal transgênico produza anticorpos humanos. Em algumas modalidades, a invenção fornece um anticorpo anti-MAdCAM que não se liga a complemento.
[087] Em uma modalidade preferida, o anticorpo anti-MAdCAM é 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod ou 7.26.4-mod. Em uma outra modalidade preferida, o anticorpo anti- MAdCAM compreende uma cadeia leve que compreende uma seqüência de aminoácido selecionada da SEQ ID NOs: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 54, 58, 62, 66 ou 68 (com ou sem a seqüência de sinal) ou a região variável de qualquer uma das ditas seqüências de aminoácido ou uma ou mais CDRs destas seqüências de aminoácido. Em uma outra modalidade preferida, o anticorpo anti-MAdCAM compreende uma cadeia pesada que compreende uma seqüência de aminoácido seleciona- da da SEQ ID NO: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42, 46, 52, 56, 60 ou 64 (com ou sem a seqüência de sinal) ou a seqüência de aminoácido da região variável ou de uma ou mais CDRs das ditas seqüências de aminoácido. Também são incluídos na invenção anticorpos anti- MAdCAM humanos que compreendem a seqüência de aminoácido do começo da CDR1 até o final da CDR3 de qualquer uma das seqüências mencionadas acima. A invenção ainda fornece um anticorpo anti- MAdCAM que compreende uma ou mais regiões de FR de qualquer uma das seqüências mencionadas acima.
[088] A invenção ainda fornece um anticorpo anti-MAdCAM que compreende uma das seqüências de aminoácido anteriormente mencionadas em que uma ou mais modificações foram feitas. Em algumas modalidades, as cisteínas no anticorpo, que podem ser quimicamente reativas, são substituídas com um outro resíduo, tal como, sem limitação, alanina ou serina. Em uma modalidade, a substituição é em uma cisteína não canônica. A substituição pode ser feita em uma CDR ou região de matriz de um domínio variável ou no domínio constante de um anticorpo. Em algumas modalidades, a cisteína é canônica.
[089] Em algumas modalidades, uma substituição de aminoácido é feita para eliminar os sítios proteolíticos potenciais no anticorpo. Tais sítios podem ocorrer em uma CDR ou região de matriz de um domínio variável ou no domínio constante de um anticorpo. A substituição de resíduos de cisteína e a remoção de sítios proteolíticos pode diminuir a heterogeneidade no produto de anticorpo. Em algumas modalidades, os pares de asparagina-glicina, que formam sítios de desamidação potenciais, são eliminados alterando-se um ou ambos dos resíduos. Em algumas modalidades, uma substituição de aminoácido é feita para adicionar ou para remover sítios de glicosilação potenciais na região variável de um anticorpo da invenção.
[090] Em algumas modalidades, a lisina de terminal C da cadeia pesada do anticorpo anti-MAdCAM da invenção é clivada. Em várias modalidades da invenção, as cadeias pesada e leve dos anticorpos anti-MAdCAM podem opcionalmente incluir uma seqüência de sinal.
[091] Em um aspecto, a invenção fornece doze anticorpos mono- clonais anti-MAdCAM humanos inibidores e as linhagens de célula de hibridoma que as produzem. A Tabela 1 lista os identificadores de se- qüência (SEQ ID NO: ) dos ácidos nucléicos que codificam as cadeias pesada e leve de tamanho natural (incluindo a seqüência de sinal) e as seqüências de aminoácido deduzidas de tamanho natural correspondente. Tabela 1
Figure img0001
[092] Em um outro aspecto, a invenção fornece uma versão mo- dificada de certos dos anticorpos monoclonais anti-MAdCAM humanos identificados acima. A Tabela 2 lista os identificadores de seqüência para as seqüências de DNA e proteína dos anticorpos modificados. Tabela 2
Figure img0002
Classe e Subclasse de anticorpos anti-MAdCAM
[093] O anticorpo pode ser uma molécula IgG, uma IgM, uma IgE, uma IgA ou uma IgD. Em uma modalidade preferida, o anticorpo é uma classe IgG e é uma subclasse IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4. Em uma modalidade mais preferida, o anticorpo anti-MAdCAM é da subclasse IgG2, ou IgG4. Em uma outra modalidade preferida, o anticorpo anti- MAdCAM é da mesma classe e subclasse como os anticorpos 1.7.2, 1.8.2, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod ou 7.26.4-mod que são IgG2 ou 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1 ou 9.8.2, que são IgG4.
[094] A classe e subclasse de anticorpos anti-MAdCAM podem ser determinadas por qualquer método conhecido na técnica. No geral, a classe e subclasse de um anticorpo pode ser determinada usando anticorpos que são específicos para uma classe e subclasse particulares de anticorpo. Tais anticorpos são comercialmente disponíveis. ELISA, Western Blot assim como outras técnicas podem determinar a classe e subclasse. Alternativamente, a classe e subclasse podem ser determinadas seqüenciando-se todo ou uma porção dos domínios constantes das cadeias pesada e/ou leve dos anticorpos, comparando as suas seqüências de aminoácido com as seqüências de aminoácido conhecidas de várias classes e subclasses de imunoglobulinas e determinando a classe e subclasse dos anticorpos como a classe mostrando a identidade de seqüência mais alta.
Espécies e Seletividade de Molécula
[095] Em um outro aspecto da invenção, o anticorpo anti- MAdCAM demonstra tanto seletividade de espécie quanto de molécula. Em uma modalidade, o anticorpo anti-MAdCAM se liga à MAdCAM humana, cinomolgo ou cão. Em algumas modalidades, o anticorpo anti- MAdCAM não se liga a uma espécie de macaco do Novo Mundo, tal como um sagüi. Seguindo as divulgações do relatório descritivo, pode- se determinar a seletividade de espécie para o anticorpo anti-MAdCAM usando métodos bem conhecidos na técnica. Por exemplo, pode-se determinar a seletividade de espécie usando Western blot, FACS, ELISA ou imunoistoquímica. Em uma modalidade preferida, pode-se determinar a seletividade de espécie usando imunoistoquímica.
[096] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-MAdCAM que especificamente se liga a MAdCAM tem seletividade para MAdCAM em relação a VCAM, fibronectina ou qualquer outro antígeno que seja pelo menos 10 vezes, preferivelmente pelo menos 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 ou 90 vezes, mais preferivelmente pelo menos 100 vezes. Em uma modalidade preferida, o anticorpo anti-MAdCAM não exibe qualquer ligação apreciável a VCAM, fibronectina ou qualquer outro antí- geno outro que não MAdCAM. Pode-se determinar a seletividade do anticorpo anti-MAdCAM para MAdCAM usando métodos bem conhecidos na técnica seguindo as divulgações do relatório descritivo. Por exemplo, pode-se determinar a seletividade usando Western blot, FACS, ELISA ou imunoistoquímica. Afinidade de Ligação de Anticorpo anti-MAdCAMs para MAdCAM
[097] Em um outro aspecto da invenção, os anticorpos anti- MAdCAM especificamente se ligam a MAdCAM com alta afinidade. Em uma modalidade, o anticorpo anti-MAdCAM especificamente se liga a MAdCAM com um Kd de 3 x 10-8 M ou menos, como medido pela ressonância de plasma de superfície, tal como BIAcore. Em modalidades mais preferidas, o anticorpo especificamente se liga a MAdCAM com um Kd de 1 x 10-8 ou menos ou 1 x 10-9 M ou menos. Em uma modalidade ainda mais preferida, o anticorpo especificamente se liga a MAdCAM com um Kd de 1 x 10-10 M ou menos. Em outras modalidades preferidas, um anticorpo da invenção especificamente se liga a MAd- CAM com um Kd de 2,66 x 10-10 M ou menos, 2,35 x 10-11 M ou menos ou 9 x 10-12 M ou menos. Em uma outra modalidade preferida, o anti-corpo especificamente se liga a MAdCAM com um Kd de 1 x 10-11 M ou menos. Em uma outra modalidade preferida, o anticorpo especificamente se liga a MAdCAM substancialmente com o mesmo Kd como um anticorpo selecionado de 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2- mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod ou 7.26.4-mod. Um anticorpo com "substancialmente o mesmo Kd" como um anticorpo de referência tem um Kd que é ± 100 pM, preferivelmente ± 50 pM, mais preferivelmente ± 20 pM, ainda mais preferivelmente ± 10 pM, ± 5 pM ou ± 2 pM, comparado com o Kd do anticorpo de referência no mesmo experimento. Em uma outra modalidade preferida, o anticorpo se liga a MAdCAM substancialmente com o mesmo Kd como um anticorpo que compreende um ou mais domínios variáveis ou uma ou mais CDRs de um anticorpo selecionado de 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod ou 7.26.4-mod. Ainda em uma outra modalidade preferida, o anticorpo se liga a MAdCAM substancialmente com o mesmo Kd como um anticorpo que compreende uma das seqüências de aminoácido selecionadas das SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46 48, 52, 54, 56, 58, 62, 64, 66 ou 68 (com ou sem a seqüência de sinal) ou o seu domínio variável. Em uma outra modalidade preferida, o anticorpo se liga a MAdCAM substancialmente com o mesmo Kd como um anticorpo que compreende uma ou mais CDRs de um anticorpo que compreende uma seqüência de aminoácido selecionada das SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46 48, 52, 54, 56, 58, 62, 64, 66 ou 68.
[098] A afinidade de ligação de um anticorpo anti-MAdCAM para MAdCAM pode ser determinada por qualquer método conhecido na técnica. Em uma modalidade, a afinidade de ligação pode ser medida pelos ELISAs competitivos, RIAs ou ressonância de plasma de superfície, tal como BIAcore. Em uma modalidade mais preferida, a afinidade de ligação é medida pela ressonância de plasma de superfície. Em uma modalidade ainda mais preferida, a afinidade de ligação e a taxa de dissociação são medidas usando um BIAcore. Um exemplo de determinação da afinidade de ligação está descrito abaixo no Exemplo II. Meia vida de Anticorpos anti-MAdCAM
[099] De acordo com um outro objetivo da invenção, o anticorpo anti-MAdCAM tem uma meia vida de pelo menos um dia in vitro ou in vivo. Em uma modalidade preferida, o anticorpo ou porção deste tem uma meia vida de pelo menos três dias. Em uma modalidade mais preferida, o anticorpo ou porção deste tem uma meia vida de quatro dias ou mais longa. Em uma outra modalidade, o anticorpo ou porção deste tem uma meia vida de oito dias ou mais longa. Em uma outra modalidade, o anticorpo ou porção de ligação de antígeno deste é derivatiza- do ou modificado tal que o mesmo tenha uma meia vida mais longa, como debatido abaixo. Em uma outra modalidade preferida, o anticorpo pode conter mutações pontuais para aumentar a meia vida sérica, tal como descrito na WO 00/09560, publicada em 24 de fevereiro de 2000.
[0100] A meia vida de anticorpo pode ser medida por qualquer meio conhecido por uma pessoa versada na técnica. Por exemplo, a meia vida do anticorpo pode ser medida pela Western blot, ELISA ou RIA em um período apropriado de tempo. A meia vida do anticorpo pode ser medida em qualquer animal apropriado, tal como um primata, por exemplo, macaco cinomolgo ou um ser humano. Identificação de Epítopos de MAdCAM Reconhecidos pelo Anticorpo anti-MAdCAM
[0101] A invenção também fornece um anticorpo anti-MAdCAM humano que se liga ao mesmo antígeno ou epítopo como um anticorpo anti-MAdCAM humano aqui fornecido. Além disso, a invenção fornece um anticorpo anti-MAdCAM humano que compete ou compete cruzado com um anticorpo anti-MAdCAM humano. Em uma modalidade preferida, o anticorpo anti-MAdCAM humano é 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod ou 7.26.4-mod. Em uma outra modalidade preferida, o anticorpo anti-MAdCAM humano compreende um ou mais domínios variáveis ou uma ou mais CDRs de um anticorpo selecionado de 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2- mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod ou 7.26.4-mod. Ainda em uma outra modalidade preferida, o anticorpo anti-MAdCAM humano compreende uma das seqüências de aminoácido selecionadas das SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 52, 54, 56, 58, 62, 64, 66 ou 68 (com ou sem a seqüência de sinal) ou um domínio variável deste. Em uma outra modalidade preferida, o anticorpo anti-MAdCAM humano compreende uma ou mais CDRs de um anticorpo que compreende uma das seqüências de ami- noácido selecionadas das SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 52, 54, 56, 58, 62, 64, 66 ou 68. Em uma modalidade altamente preferida, o anticorpo anti-MAdCAM é um outro anticorpo humano.
[0102] Pode-se determinar se um anticorpo anti-MAdCAM se liga ao mesmo antígeno como um outro anticorpo anti-MAdCAM usando uma variedade de métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, pode- se usar um anticorpo anti-MAdCAM conhecido para capturar o antíge- no, eluir o antígeno do anticorpo anti-MAdCAM e depois determinar se o anticorpo de teste ligar-se-á ao antígeno eluído. Pode-se determinar se um anticorpo compete com um anticorpo anti-MAdCAM pela ligação do anticorpo anti-MAdCAM a MAdCAM sob condições de saturação e depois medir a capacidade do anticorpo de teste para ligar MAdCAM. Se o anticorpo de teste é capaz de ligar-se à MAdCAM ao mesmo tempo como o anticorpo anti-MAdCAM, então o anticorpo de teste se liga a um epítopo diferente do que o anticorpo anti-MAdCAM. Entretanto, se o anticorpo de teste não for capaz de ligar-se à MAdCAM ao mesmo tempo, então o anticorpo de teste compete com o anticorpo anti-MAdCAM humano. Este experimento pode ser realizado usando ELISA ou ressonância de plasma de superfície ou, preferivelmente, BIAcore. Para testar se um anticorpo anti-MAdCAM compete cruzado com um outro anticorpo anti-MAdCAM, pode-se usar o método de competição descrito acima em duas direções, isto é, determinando se o anticorpo conhecido bloqueia o anticorpo de teste e vice-versa.
Uso do gene de Cadeia Leve e Pesada
[0103] A invenção também fornece um anticorpo anti-MAdCAM que compreende uma região variável de cadeia leve codificada por um gene K humano. Em uma modalidade preferida, a região variável de cadeia leve é codificada por uma família de gene VK A2, A3, A26, B3, O12 ou O18 humana. Em várias modalidades, a cadeia leve compreende não mais do que onze, não mais do que seis ou não mais do que três substituições de aminoácido da seqüência Vk A2, A3, A26, B3, O12 ou O18 da linhagem germinativa humana. Em uma modalidade preferida, as substituições de aminoácido são substituições conserva- tivas.
[0104] As SEQ ID NOS: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44 e 48 fornecem as seqüências de aminoácido das cadeias leves capa de tamanho natural de doze anticorpos anti-MAdCAM, 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4 e 9.8.2. As Figuras 1K-1T são alinhamentos das seqüências de aminoá- cido dos domínios variáveis de cadeia leve de doze anticorpos anti- MAdCAM com as seqüências da linhagem germinativa das quais os mesmos são derivados. A Figura 2A mostra um alinhamento das se- qüências de aminoácido dos domínios variáveis da cadeia leve das cadeias leves capa de doze anticorpos anti-MAdCAM entre si. Seguindo as divulgações deste relatório descritivo, uma pessoa versada na técnica pode determinar as diferenças entre as seqüências da linhagem germinativa e as seqüências de anticorpo dos anticorpos anti- MAdCAM adicionais. As SEQ ID NOS: 54, 58, 62, 66 ou 68 fornecem as seqüências de aminoácido das cadeias leves capa de tamanho natural de cinco anticorpos adicionais anti-MAdCAM, 6.22.2-mod, 6.34.2- mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod e 7.26.4-mod, modificados pela substituição de aminoácido dos seus anticorpos anti-MAdCAM precursores, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.77.1 ou 7.26.4, respectivamente.
[0105] Em uma modalidade preferida, a VL do anticorpo anti- MAdCAM contém as mesmas mutações, relativas à seqüência de ami- noácido da linhagem germinativa, como qualquer um ou mais das VL dos anticorpos 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1- mod, 6.77.1-mod ou 7.26.4-mod. A invenção inclui um anticorpo anti- MAdCAM que utiliza os mesmos genes VKD humano e Jk humano como um anticorpo exemplificado. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma ou mais das mesmas mutações da linhagem germinativa como um ou mais anticorpos exemplificados. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende substituições diferentes em uma ou mais das mesmas posições como um ou mais dos anticorpos exemplificados. Por exemplo, o VL do anticorpo anti-MAdCAM pode conter uma ou mais substituições de aminoácido que são as mesmas como aquelas presentes no anticorpo 7.16.6 e uma outra substituição de aminoácido que é a mesma como a do anticorpo 7.26.4. Desta maneira, pode-se misturar e emparelhar características diferentes de ligação de anticorpo de modo a alterar, por exemplo, a afinidade do anticorpo para MAdCAM ou a sua taxa de dissociação do antígeno. Em uma outra modalidade, as mutações são feitas na mesma posição como aquelas encontradas em qualquer uma ou mais das VL dos anticorpos 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod ou 7.26.4-mod, mas as substituições de aminoácido con- servativas são feitas ao invés de usar o mesmo aminoácido. Por exemplo, se a substituição de aminoácido comparada com a linhagem germinativa em um dos anticorpos 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2- mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod ou 7.26.4-mod for glutamato, pode-se substituir conservativamente aspartato. Similarmente, se a substituição de aminoácido é serina, pode-se substituir conservativamente a treo- nina.
[0106] Em uma outra modalidade preferida, a cadeia leve compre- ende uma seqüência de aminoácido que é a mesma como a seqüên- cia de aminoácido da VL de 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod ou 7.26.4-mod. Em uma outra modalidade altamente preferida, a cadeia leve compreende as seqüências de ami- noácido que são as mesmas como as regiões de CDR da cadeia leve de 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod ou 7.26.4-mod. Em uma outra modalidade preferida, a cadeia leve compreende uma seqüência de aminoácido com pelo menos uma região CDR da cadeia leve de 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod ou 7.26.4-mod. Em uma outra modalidade preferida, a cadeia leve compreende as seqüências de aminoácido com CDRs de cadeias leves diferentes que usam os mesmos genes VK e JK. Em uma modalidade mais preferida, as CDRs de cadeias leves diferentes são obtidas de 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2- mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod ou 7.26.4-mod. Em uma outra modalidade preferida, a cadeia leve compreende uma seqüência de aminoá- cido selecionada das SEQ ID NOS: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 54, 58, 62, 64, 66 ou 68 com ou sem a seqüência de sinal. Em uma outra modalidade, a cadeia leve compreende uma seqüência de aminoácido codificada por uma seqüência de nucleotídeo selecionada das SEQ ID NOS: 3, 7, 11, 15, 19, 23, 27, 31, 35, 39, 43, 47, 53, 57, 61, 65 ou 67 (com ou sem a seqüência de sinal) ou uma seqüência de nucleotídeo que codifica uma seqüência de aminoácido tendo 1 a 11 inserções, deleções ou substituições de aminoácido disto. Preferivel-mente, as substituições de aminoácido são substituições de aminoáci- do conservativas. Em uma outra modalidade, o anticorpo ou porção deste compreende uma cadeia leve lambda.
[0107] A presente invenção também fornece um anticorpo anti- MAdCAM ou porção deste que compreende uma seqüência de gene VH humano ou uma seqüência derivada de um gene VH humano. Em uma modalidade, a seqüência de aminoácido de cadeia pesada é derivada de uma família de gene VH humana 1-18, 3-15, 3-21, 3-23, 3-30, 3-33 ou 4-4. Em várias modalidades, a cadeia pesada compreende não mais do que quinze, não mais do que seis ou não mais do que três mudanças de aminoácido da seqüência de gene 1-18, 3-15, 3-21, 3-23, 3-30, 3-33 ou 4-4 de VH da linhagem germinativa humana.
[0108] As SEQ ID NOS: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42 e 46 fornecem as seqüências de aminoácido das cadeias pesadas de tamanho natural de doze anticorpos anti-MAdCAM. As Figuras 1A-1J são alinhamentos das seqüências de aminoácido das regiões variáveis da cadeia pesada de doze anticorpos anti-MAdCAM com as seqüên- cias da linhagem germinativa das quais os mesmos são derivados. A Figura 2B mostra os alinhamentos das seqüências de aminoácido das regiões variáveis da cadeia pesada dos doze anticorpos anti-MAdCAM entre si. Seguindo as divulgações deste relatório descritivo e as se- qüências de nucleotídeo da invenção, uma pessoa versada na técnica pode determinar a seqüência de aminoácido codificada das doze cadeias pesadas anti-MAdCAM e as cadeias pesadas da linhagem ger- minativa e determinam as diferenças entre as seqüências da linhagem germinativa e das seqüências de anticorpo. As SEQ ID NOS: 52, 56, 60 e 64 fornecem as seqüências de aminoácido das cadeias pesadas de tamanho natural de anticorpos anti-MAdCAM, 6.22.2-mod, 6.34.2- mod e 6.67.1-mod, modificados pela substituição de aminoácido a partir dos seus anticorpos anti-MAdCAM precursores, 6.22.2, 6.34.2 e 6.67.1 respectivamente. Um outro anticorpo anti-MAdCAM modificado, 7.26.4-mod, tem uma seqüência de aminoácido de cadeia pesada de tamanho natural que é a SEQ ID NO: 42.
[0109] Em uma modalidade preferida, a VH do anticorpo anti- MAdCAM contém as mesmas mutações, relativas à seqüência de ami- noácido da linhagem germinativa, como qualquer uma ou mais das VH dos anticorpos 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1- mod, 6.77.1-mod ou 7.26.4-mod. Similar ao que foi debatido acima, o anticorpo compreende uma ou mais das mesmas mutações da linhagem germinativa como um ou mais anticorpos exemplificados. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende substituições diferentes em uma ou mais das mesmas posições como um ou mais dos anticorpos exemplificados. Por exemplo, a VH do anticorpo anti-MAdCAM pode conter uma ou mais substituições de aminoácido que são as mesmas como aquelas presentes no anticorpo 7.16.6 e uma outra substituição de aminoácido que é a mesma como o anticorpo 7.26.4. Desta maneira, pode-se misturar e emparelhar características diferentes de ligação de anticorpo de modo a alterar, por exemplo, a afinidade do anticorpo para MAdCAM ou a sua taxa de dissociação do antígeno. Em uma outra modalidade, uma substituição de aminoácido comparada com a linhagem germinativa é feita na mesma posição como uma substituição da linhagem germinativa como encontrada em qualquer uma ou mais das VH do anticorpo de referência 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod ou 7.26.4-mod, mas a posição é substituída com um resíduo diferente, que é uma substituição conservativa comparada com o anticorpo de referência.
[0110] Em uma outra modalidade preferida, a cadeia pesada com preende uma seqüência de aminoácido que é a mesma como a se- qüência de aminoácido da VH de 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2- mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod ou 7.26.4-mod. Em uma outra modalidade altamente preferida, a cadeia pesada compreende as seqüências de aminoácido que são as mesmas como as regiões de CDR da cadeia pesada de 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1- mod, 6.77.1-mod ou 7.26.4-mod. Em uma outra modalidade preferida, a cadeia pesada compreende uma seqüência de aminoácido de pelo menos uma região CDR da cadeia pesada de 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.4, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod ou 7.26.4-mod. Em uma outra modalidade preferida, a cadeia pesada compreende as se- qüências de aminoácido com CDRs de cadeias pesadas diferentes. Em uma modalidade mais preferida, as CDRs de cadeias pesadas diferentes são obtidas de 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod ou 7.26.4-mod. Em uma outra modalidade preferida, a cadeia pesada compreende uma seqüência de aminoácido selecionada das SEQ ID NOS: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42, 46, 52, 56, 60 ou 64 com ou sem a seqüência de sinal. Em uma outra modalidade, a cadeia pesada compreende uma seqüência de aminoá- cido codificada por uma seqüência de nucleotídeo selecionada das SEQ ID NOS: 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 29, 33, 37, 41, 45, 51, 55, 59 ou 63 ou uma seqüência de nucleotídeo que codifica uma seqüência de aminoácido tendo de 1 a 15 inserções, deleções ou substituições ami- noácido deste. Em uma outra modalidade, as substituições são substituições de aminoácido conservativas.
Métodos de Produzir Anticorpos e Linhagens de Célula Que Produzem Anticorpo Imunização
[0111] Em uma modalidade da presente invenção, anticorpos hu- manos são produzidos imunizando-se um animal não humano que compreende algum ou todos os locais de cadeia pesada e leve da imunoglobulina humana com um antígeno MAdCAM. Em uma modalidade preferida, o animal não humano é um XENOMOUSE®, que é uma cepa de camundongo engendrada que compreende fragmentos grandes dos locais de imunoglobulina humana e é deficiente na produção de anticorpo de camundongo. Ver, por exemplo, Green et al., Nature Genetics 7: 13-21 (1994) e Patentes U.S. 5.916.771, 5.939.598, 5.985.615, 5.998.209, 6.075.181, 6.091.001, 6.114.598 e 6.130.364. Ver também a WO 91/10741, WO 94/02602, WO 96/34096 e WO 96/33735, WO 98/16654, WO 98/24893, WO 98/50433, WO 99/45031, WO 99/53049, WO 00/09560 e WO 00/037504. O animal XENOMOU- SE® produz um repertório humano como adulto de anticorpos completamente humanos e gera mAbs humanos específicos de antígeno. Um animal XENOMOUSE® de segunda geração contém aproximadamente 80 % do repertório do gene V de anticorpo humano através da introdução de fragmentos YAC de configuração da linhagem germinativa de tamanho de megabase dos locais de cadeia pesada e locais de cadeia leve K humanas. Em outras modalidades, o camundongo XENOMOU- SE® contém aproximadamente todos os locais de cadeia pesada e cadeia leve À humanas. Ver Mendez et al., Nature Genetics 15: 146-156 (1997), Green e Jakobovits, J. Exp. Med. 188: 483-495 (1998), as divulgações das quais são por meio deste incorporadas por referência.
[0112] A invenção também fornece um método para fabricar anti- corpos anti-MAdCAM a partir de animais não humanos, não camundongos imunizando-se os animais transgênicos não humanos que compreendem locais de imunoglobulina humana. Pode-se produzir tais animais usando os métodos descritos imediatamente acima. Os métodos divulgados nestes documentos podem ser modificados como descrito na Patente U.S. 5.994.619 (a "patente 619"), que é aqui incorporada por refe- rência. A patente '619 descreve métodos para produzir novas células de massa de célula interna cultivadas (CICM) e linhagens de célula, derivadas de porcos e vacas e células CICM transgênicas nas quais o DNA heterólogo foi inserido. As células transgênicas CICM podem ser usadas para produzir embriões, fetos e progênie transgênicos clonados. A patente '619 também descreve métodos de produzir animais transgêni- cos que são capazes de transmitir o DNA heterólogo à sua progênie. Em uma modalidade preferida, os animais não humanos podem ser ratos, ovelhas, porcos, cabras, gado ou cavalos.
[0113] Em uma outra modalidade, o animal não humano que com preende locais de imunoglobulina humana são animais que têm um "minilocal" de imunoglobulinas humanas. No método de minilocal, um local Ig exógeno é imitado através da inclusão de genes individuais a partir do local Ig. Assim, um ou mais genes VH, um ou mais genes DH, um ou mais genes JH, um domínio(s) constante(s) μ e um segundo domínio(s) constante(s) (preferivelmente um domínio(s) constante(s) gama são formados em um construto para a inserção em um animal. Este método é descrito, inter alia, na Patente U.S. No 5.545.807, 5.545.806, 5.625.126, 5.633.425, 5.661.016, 5.770.429, 5.789.650, 5.814.318, 5.591.669, 5.612.205, 5.721.367, 5.789.215 e 5.643.763, por meio deste incorporadas por referência.
[0114] Uma vantagem do método de minilocal é a rapidez com que as construções incluindo porções do local Ig podem ser geradas e in-troduzidas nos animais. Entretanto, uma desvantagem potencial do método de minilocal é que pode não haver diversidade de imunoglobu- lina suficiente para suportar o desenvolvimento de célula B completo, tal que possa haver produção de anticorpo mais baixa.
[0115] Para produzir um anticorpo anti-MAdCAM humano, um animal não humano que compreende alguns ou todos os locais da imunoglobulina humana é imunizado com um antígeno de MAdCAM e um anticorpo ou a célula que produz o anticorpo são isolados do animal. O antígeno de MAdCAM pode ser MAdCAM isolada e/ou purificada e é preferivelmente uma MAdCAM humana. Em uma outra modalidade, o antígeno de MAdCAM é um fragmento de MAdCAM, preferivelmente o domínio extracelular de MAdCAM. Em uma outra modalidade, o antígeno de MAdCAM é um fragmento que compreende pelo menos um epítopo de MAdCAM. Em uma outra modalidade, o antíge- no de MAdCAM é uma célula que expressa MAdCAM na sua superfície celular, preferivelmente uma célula que super expressa MAdCAM na sua superfície celular.
[0116] A imunização de animais pode ser feita por qualquer méto do conhecido na técnica. Ver, por exemplo, Harlow e Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Nova Iorque: Cold Spring Harbor Press (1990). Os métodos para imunizar animais não humanos, tais como camundongos, ratos, ovelhas, cabras, porcos, gado e cavalos são bem conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Harlow e Lane e Patente dos Estados Unidos 5.994.619. Em uma modalidade preferida, o antígeno de MAdCAM é administrado com um adjuvante para estimular a resposta imune. Tais adjuvantes incluem o adjuvante de Freund completo ou incompleto, RIBI (dipeptídeos de muramila) ou ISCOM (complexos imunoestimuladores). Tais adjuvantes podem proteger o polipeptídeo da dispersão rápida seqüestrando-o em um depósito local ou eles podem conter substâncias que estimulam o hospedeiro a secretar fatores que são quimiotático para macrófagos e outros componentes do sistema imune. Preferivelmente, se um polipeptídeo está sendo administrado, o programa de imunização envolverá duas ou mais administrações do polipeptídeo, distribuídas em várias semanas.
[0117] O Exemplo I fornece um protocolo para imunizar um animal XENOMOUSE® com MAdCAM humana de tamanho natural em solução salina tamponada com fosfato.
Produção de Anticorpos e Linhagens de Célula que Produzem o Anticorpo
[0118] Depois da imunização de um animal com um antígeno de MAdCAM, anticorpos e/ou células que produzem anticorpo podem ser obtidos a partir do animal. Um soro contendo anticorpo anti-MAdCAM é obtido a partir do animal sangrando-se ou sacrificando-se o animal. O soro pode ser usado como é obtido do animal, uma fração de imu- noglobulina pode ser obtida a partir do soro ou os anticorpos anti- MAdCAM podem ser purificados a partir do soro.
[0119] Em uma outra modalidade, as linhagens de célula imortali zadas que produzem anticorpo podem ser preparadas a partir do animal imunizado. Depois da imunização, o animal é sacrificado e as células B são imortalizadas usando métodos bem conhecidos na técnica. Os métodos de imortalizar as células incluem, mas não são limitados a, transfectá-las com oncogenes, infectando-as com um vírus oncogê- nicas e cultivá-las sob condições que selecionam células imortalizadas, submetendo-as aos compostos carcinogênicos ou mutadores, fundindo-os com uma célula imortalizada, por exemplo, uma célula de mieloma e inativando um gene supressor de tumor. Ver, por exemplo, Harlow e Lane, supra. Em modalidades que envolvam as células de mieloma, as células de mieloma não secretam polipeptídeos de imu- noglobulina (uma linhagem celular não secretora). Depois da imortali- zação e seleção com antibiótico, as células imortalizadas ou sobrena- dantes de cultura destas, são triadas usando MAdCAM, uma porção desta ou uma célula que expresse MAdCAM. Em uma modalidade pre-ferida, a triagem inicial é realizada usando um imunoensaio ligado a enzima (ELISA) ou um radioimunoensaio (RIA), preferivelmente um ELISA. Um exemplo de triagem com ELISA é fornecido na Publicação PCT No WO 00/37504, aqui incorporada por referência.
[0120] Em uma outra modalidade, as células que produzem anti- corpo podem ser preparadas a partir de um ser humano que tenha um distúrbio auto-imune e que expresse os anticorpos anti-MAdCAM. As células que expressam os anticorpos anti-MAdCAM podem ser isoladas isolando-se as células sangüíneas brancas e submetendo-as à classificação de célula ativada por fluorescência (FACS) ou por panning em placas revestidas com MAdCAM ou uma porção destas. Estas células podem ser fundidas com um mieloma não secretor humano para produzir hibridomas humanos que expressem os anticorpos anti- MAdCAM humanos. no geral, esta é uma modalidade menos preferida porque é provável que os anticorpos anti-MAdCAM terão uma afinidade baixa para MAdCAM.
[0121] As células que produzem anticorpo anti-MAdCAM, por exemplo, hibridomas são selecionados, clonados e ainda triados quanto as características desejáveis, incluindo o cultivo de célula robusto, alta produção de anticorpo e características de anticorpo desejáveis, como debatido mais abaixo. Os hibridomas podem ser cultivados e expandidos in vivo em animais singênicos, em animais que carecem de um sistema imune, por exemplo, camundongos nus ou em cultura de célula in vitro. Os métodos de selecionar, clonar e expandir hibri- domas são bem conhecidos por aqueles versados na técnica.
[0122] Preferivelmente, o animal imunizado é um animal não hu mano que expressa genes da imunoglobulina humana e as células B esplênicas são fundidas a um mieloma derivado da mesma espécie como o animal não humano. Mais preferivelmente, o animal imunizado é um animal XENOMOUSE® e a linhagem celular de mieloma é um mieloma de camundongo não secretor, tal como a linhagem celular de mieloma é P3-X63-AG8-653 (ATCC). Ver, por exemplo, o Exemplo I.
[0123] Assim, em uma modalidade, a invenção fornece métodos para produzir uma linhagem celular que produza um anticorpo monoclonal humano ou um fragmento deste direcionado a MAdCAM que compreendem (a) imunizar um animal transgênico não humano aqui descrito com MAdCAM, uma porção de MAdCAM ou uma célula ou tecido que expressam MAdCAM; (b) permitir que o animal transgênico monte uma resposta imune para MAdCAM; (c) isolar as células que produzem anticorpo a partir do transgênico animal; (d) imortalizar as células que produzem anticorpo; (e) criar populações monoclonais individuais das células imortalizadas que produzem anticorpo; e (f) triar as células imortalizadas que produzem anticorpo ou sobrenadantes de cultura destas para identificar um anticorpo direcionado à MAdCAM.
[0124] Em um aspecto, a invenção fornece hibridomas que produ zem anticorpos anti-MAdCAM humanos. Em uma modalidade preferida, os hibridomas são hibridomas de camundongo, como descrito acima. Em uma outra modalidade, os hibridomas são produzidos em uma espécie não humana, que não camundongo tal como ratos, ovelhas, porcos, cabras, gado ou cavalos. Em uma outra modalidade, os hibri- domas são hibridomas humanos, em que um mieloma não secretor humano é fundido com uma célula humana que expressa um anticorpo anti-MAdCAM.
Ácido nucléicos, Vetores, Células hospedeiras e Métodos Recombi- nantes de Fabricar Anticorpos Ácido Nucléicos
[0125] Moléculas de ácido nucléico que codificam os anticorpos anti-MAdCAM da invenção são fornecidas. Em uma modalidade, a molécula de ácido nucléico codifica uma cadeia pesada e/ou leve de uma imunoglobulina anti-MAdCAM. Em uma modalidade preferida, uma única molécula de ácido nucléico codifica uma cadeia pesada de uma imunoglobulina anti-MAdCAM e uma outra molécula de ácido nucléico codifica a cadeia leve de uma imunoglobulina anti-MAdCAM. Em uma modalidade mais preferida, a imunoglobulina codificada é uma imuno- globulina humana, preferivelmente uma IgG humana. A cadeia leve codificada pode ser uma cadeia À ou uma cadeia K, preferivelmente uma cadeia K.
[0126] Em uma modalidade preferida a molécula de ácido nucléico que codifica a região variável da cadeia leve compreende a seqüência da linhagem germinativa de uma Vk humana o gene A2, A3, A26, B3, O12 ou O18 ou uma variante da dita seqüência. Em uma modalidade preferida, a molécula de ácido nucléico que codifica a cadeia leve compreende uma seqüência derivada de um gene Jk1, Jk2, Jk3, Jk4 ou Jk5 humano. Em uma modalidade preferida, a molécula de ácido nucléico que codifica a cadeia leve codifica não mais do que onze mudanças de aminoácido da linhagem germinativa do gene Vk A2, A3, A26, B3, O12 ou O18, preferivelmente não mais do que seis mudanças de aminoácido e ainda mais preferivelmente não mais do que três mudanças de aminoácido. Em uma modalidade mais preferida, o ácido nucléico que codifica a cadeia leve é a seqüência da linhagem germi- nativa.
[0127] A invenção fornece uma molécula de ácido nucléico que codifica uma região variável da cadeia leve (VL) contendo até onze mudanças de aminoácido comparada com a seqüência da linhagem germinativa, em que as mudanças de aminoácido são idênticas às mudanças de aminoácido da seqüência de linhagem germinativa da VL de um dos anticorpos 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod ou 7.26.4-mod. A invenção também fornece uma molécula de ácido nucléico que compreende uma seqüência de nucleotídeo que codifica a seqüência de aminoácido da região variável da cadeia leve de 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1- mod, 6.77.1-mod ou 7.26.4-mod. A invenção também fornece uma molécula de ácido nucléico que compreende uma seqüência de nucleotí- deo que codifica a seqüência de aminoácido de uma ou mais das CDRs de qualquer uma das cadeias leves de 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod ou 7.26.4-mod. Em uma modalidade preferida, a molécula de ácido nucléico compreende uma seqüência de nucleotídeo que codifica a seqüência de aminoáci- do de todas as CDRs de qualquer uma das cadeias leves de 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod ou 7.26.4-mod. Em uma outra modalidade, a molécula de ácido nucléico compreende uma seqüência de nucleotídeo que codifica a seqüência de aminoácido de uma das SEQ ID NOS: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 54, 58, 62, 66, 68 ou compreende uma seqüência de nucleotídeo de uma das SEQ ID NOS: 3, 7, 11, 15, 19, 23, 27, 31, 35, 39, 43, 47, 53, 57, 61, 65 ou 67. Em uma outra modalidade preferida, a molécula de ácido nucléico compreende uma seqüência de nucleotí- deo que codifica a seqüência de aminoácido de uma ou mais das CDRs de qualquer uma das SEQ ID NOS: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 54, 58, 62, 66, 68 ou compreende uma seqüência de nucleotídeo de uma ou mais das CDRs de qualquer uma das SEQ ID NOS: 3, 7, 11, 15, 19, 23, 27, 31, 35, 39, 43, 47, 53, 57, 61, 65 ou 67. Em uma modalidade mais preferida, a molécula de ácido nucléico compreende uma seqüência de nucleotídeo que codifica a seqüência de aminoácido de todas as CDRs de qualquer uma das SEQ ID NOS: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 54, 58, 62, 66, 68 ou compreende uma seqüência de nucleotídeo de todas as CDRs de qualquer uma das SEQ ID NOS: 3, 7, 11, 15, 19, 23, 27, 31, 35, 39, 43, 47, 53, 57, 61, 65 ou 67.
[0128] A invenção também fornece uma molécula de ácido nucléi- co que codifica uma seqüência de aminoácido de uma VL que tem uma seqüência de aminoácido que é pelo menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % idêntica a uma VL descrita acima, particularmente a uma VL que compreende uma seqüên- cia de aminoácido de uma das SEQ ID NOS: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 54, 58, 62, 66 ou 68. A invenção também fornece uma seqüência de nucleotídeo que seja pelo menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % idênticas a uma se- qüência de nucleotídeo de uma das SEQ ID NOS: 3, 7, 11, 15, 19, 23, 27, 31, 35, 39, 43, 47, 53, 57, 61, 65 ou 67.
[0129] Em uma outra modalidade, a invenção fornece uma molé cula de ácido nucléico que hibridiza sob condições altamente severas a uma molécula de ácido nucléico que codificam um VL como descrito acima, particularmente uma molécula de ácido nucléico que compreende uma seqüência de nucleotídeo que codificam uma seqüência de aminoácido das SEQ ID NOS: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 54, 58, 62, 66 ou 68. A invenção também fornece uma molécula de ácido nucléico que hibridiza sob condições altamente severas a uma molécula de ácido nucléico que compreende uma seqüência de nucle- otídeo de uma das SEQ ID NOS: 3, 7, 11, 15, 19, 23, 27, 31, 35, 39, 43, 47, 53, 57, 61, 65 ou 67.
[0130] A invenção também fornece uma molécula de ácido nucléi- co que codifica uma região variável (VH) da cadeia pesada que utiliza um gene VH 1-18, 3-15, 3-21, 3-23, 3-30, 3-33 ou gene VH 4-4 humanos. Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucléico que codifica o gene VH ainda utiliza um gene das famílias JH4 ou JH6 humanas. Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucléico que codifica o gene VH utiliza o gene JH4b ou JH6b humano. Em uma outra modalidade, a molécula de ácido nucléico compreende uma seqüência derivada de um gene D 3-10, 4-23, 5-5, 6-6 ou 6-19 humano. Em uma modalidade ainda mais preferida, a molécula de ácido nucléico que codifica a VH contém não mais do que quinze mudanças de aminoáci- do da linhagem germinativa dos genes VH 1-18, 3-15, 3-21, 3-23, 330, 3-33 ou 4-4, preferivelmente não mais do que seis mudanças de aminoácido e ainda mais preferivelmente não mais do que três mudanças de aminoácido. Em uma modalidade altamente preferida, a molécula de ácido nucléico que codifica a VH contém pelo menos uma mudança de aminoácido comparada com a seqüência da linhagem germinativa, em que a mudança de aminoácido é idêntica a uma mudança de aminoácido da seqüência de linhagem germinativa da cadeia pesada de um dos anticorpos 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2- mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod ou 7.26.4-mod. Em uma modalidade ainda mais preferida, a VH contém não mais do que quinze mudanças de aminoácido comparadas com as seqüências da linhagem germina- tiva, em que as mudanças são idênticas àquelas mudanças da se- qüência da linhagem germinativa da VH de um dos anticorpos 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod ou 7.26.4, mod.
[0131] Em uma modalidade, a molécula de ácido nucléico com preende uma seqüência de nucleotídeo que codifica a seqüência de aminoácido da VH de 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod ou 7.26.4-mod. Em uma outra modalidade, a molécula de ácido nucléico compreende uma seqüência de nucleotí- deo que codifica a seqüência de aminoácido de uma ou mais das CDRs da cadeia pesada de 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod ou 7.26.4-mod. Em uma modalidade preferida, a molécula de ácido nucléico compreende seqüências de nucleotí- deo que codificam as seqüências de aminoácido de toadas as CDRs da cadeia pesada de 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1- mod, 6.77.1-mod ou 7.26.4-mod. Em uma outra modalidade preferida, a molécula de ácido nucléico compreende uma seqüência de nucleotí- deo que codifica a seqüência de aminoácido de uma das SEQ ID NOS: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42, 46, 52, 56, 60 ou 64 ou que compreende uma seqüência de nucleotídeo de uma das SEQ ID NOS: 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 29, 33, 37, 41, 45, 51, 55, 59 ou 63. Em uma outra modalidade preferida, a molécula de ácido nucléico com-preende uma seqüência de nucleotídeo que codifica a seqüência de aminoácido de uma ou mais das CDRs de qualquer uma das SEQ ID NOS: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42, 46, 52, 56, 60 ou 64 ou compreende uma seqüência de nucleotídeo de uma ou mais das CDRs de qualquer uma das SEQ ID NOS: 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 29, 33, 37, 41, 45, 51, 55, 59 ou 63. Em uma modalidade preferida, a molécula de ácido nucléico compreende uma seqüência de nucleotídeo que codifica a seqüência de aminoácidos de todas as CDRs de qualquer uma das SEQ ID NOS: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42, 46, 52, 56, 60 ou 64 ou compreende uma seqüência de nucleotídeo de todas as CDRs de qualquer uma das SEQ ID NOS: 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 29, 33, 37, 41 45, 51, 55, 59 ou 63. Em algumas modalidades a molécula de ácido nucléico compreende uma seqüência de nucleotí- deo que codifica uma região contígua do começo da CDR1 até o final da CDR3 de uma cadeia pesada ou leve de qualquer um dos anticorpos anti-MAdCAM mencionados acima.
[0132] Em uma outra modalidade, a molécula de ácido nucléico codifica uma seqüência de aminoácido de uma VH que é pelo menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % idêntica a uma das seqüências de aminoácido que codificam uma VH co mo descrito imediatamente acima, particularmente a uma VH que compreende uma seqüência de aminoácido de uma das SEQ ID NOS: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42, 46, 52, 56, 60 ou 64. A invenção também fornece uma seqüência de nucleotídeo que é pelo menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % idêntica a uma seqüência de nucleotídeo de uma das SEQ ID NOS: 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 29, 33, 37, 41, 45, 51, 55, 59 ou 63.
[0133] Em uma outra modalidade, a molécula de ácido nucléico que codifica uma VH é uma que hibridiza sob condições altamente severas a uma seqüência de nucleotídeo que codifica uma VH como descrito acima, particularmente a uma VH que compreende uma se- qüência de aminoácido de uma das SEQ ID NOS: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42, 46, 52, 56, 60 ou 64. A invenção também fornece uma seqüência de nucleotídeo que codifica uma VH que hibridiza sob condições altamente severas a uma molécula de ácido nucléico que compreende uma seqüência de nucleotídeo de uma das SEQ ID NOS: 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 29, 33, 37, 41, 45, 51, 55, 59 ou 63.
[0134] A seqüência de nucleotídeo que codifica cada uma ou am bas das cadeias pesada e leve inteiras de um anticorpo anti-MAdCAM ou as suas regiões variáveis pode ser obtida a partir de qualquer fonte que produza um anticorpo anti-MAdCAM. Os métodos de isolar mRNA que codifica um anticorpo são bem conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989). O mRNA pode ser usado para produzir cDNA para o uso na reação de cadeia da polimerase (PCR) ou clonagem de cDNA de genes do anticorpo. Em uma modalidade da invenção, as moléculas de ácido nucléico podem ser obtidas a partir de um hibridoma que expressa um anticorpo anti-MAdCAM, como descrito acima, preferivel-mente um hibridoma que tem como um dos seus parceiros de fusão uma célula de animal transgênico que expressa genes da imunoglobu- lina humana, tal como um animal XENOMOUSE®, um animal camundongo transgênico não humano ou um animal transgênico não humano, não camundongo. Em uma outra modalidade, o hibridoma é derivado de um animal não humano, não transgênico, que pode ser usado, por exemplo, para anticorpos humanizados.
[0135] Uma molécula de ácido nucléico que codifica a cadeia pe sada inteira de um anticorpo anti-MAdCAM pode ser construída fundindo-se uma molécula de ácido nucléico que codifica o domínio variável inteiro de uma cadeia pesada ou um domínio de ligação de antíge- no deste com um domínio constante de uma cadeia pesada. Similarmente, uma molécula de ácido nucléico que codifica a cadeia leve de um anticorpo anti-MAdCAM pode ser construída fundindo-se uma molécula de ácido nucléico que codifica o domínio variável de uma cadeia leve ou um domínio de ligação de antígeno deste com um domínio constante de uma cadeia leve. As moléculas de ácido nucléico que codificam as regiões VH e VL podem ser convertidas aos genes de anticorpo de tamanho natural inserindo-os em vetores de expressão que já codificam as regiões constantes de cadeia pesada e constantes de cadeia leve, respectivamente, tal que o segmento VH seja operativamente ligado ao(s) segmento(s) da região constante de cadeia pesada (CH) dentro do vetor e o segmento VL seja operativamente ligado ao segmento da região constante de cadeia leve (CL) dentro do vetor. Alternativamente, as moléculas de ácido nucléico que codificam as cadeias VH ou VL são convertidos nos genes de anticorpo de tamanho natural por ligação, por exemplo, ligando, a molécula de ácido nucléico que codifica uma cadeia VH a uma molécula de ácido nucléico que codifica uma cadeia CH usando técnicas biológicas moleculares padrão. O mesmo pode ser obtido usando moléculas de ácido nucléico que codificam as cadeias VL e CL. As seqüências de genes da região constante de cadeias pesada e leve humanas são conhecidas na técnica. Ver, por exemplo, Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed., NIH Publ. No 91-3242 (1991). As moléculas de ácido nucléico que codificam as cadeias pesada e/ou leve de tamanho natural podem ser depois expressadas a partir de uma célula na qual elas foram introduzidas e o anticorpo anti-MAdCAM isolado.
[0136] Em uma modalidade preferida, o ácido nucléico que codifi ca a região variável da cadeia pesada codifica a região variável das seqüências de aminoácido das SEQ ID NOS: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42, 46, 52, 56, 60 ou 64 e a molécula de ácido nucléico que codifica a região variável das cadeias leves codifica a região variável da seqüência de aminoácido das SEQ ID NOS: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 54, 58, 62, 66 ou 68.
[0137] Em uma modalidade, uma molécula de ácido nucléico que codifica a cadeia pesada de um anticorpo anti-MAdCAM ou uma porção de ligação de antígeno desta ou a cadeia leve de um anticorpo anti-MAdCAM ou uma porção de ligação de antígeno desta pode ser isolada a partir de um animal não humano, não camundongo que expresse genes da imunoglobulina humana e tenha sido imunizado com um antígeno de MAdCAM. Em outra modalidade, a molécula de ácido nucléico pode ser isolada a partir de uma célula que produz anticorpo anti-MAdCAM derivada de um animal não transgênico ou de um paciente humano que produza os anticorpos anti-MAdCAM. O mRNA das células que produzem anticorpo anti-MAdCAM pode ser isolado pelas técnicas padrão, clonado e/ou amplificado usando PCR e técnicas de construção de biblioteca e triadas usando protocolos padrão para se obter moléculas de ácido nucléico que codificam cadeias pesadas e leves anti-MAdCAM.
[0138] As moléculas de ácido nucléico podem ser usadas para ex pressar recombinantemente quantidades grandes de anticorpos anti- MAdCAMs, como descrito abaixo. As moléculas de ácido nucléico também podem ser usadas para produzir anticorpos quiméricos, anticorpos de cadeia única, imunoadesinas, diacorpos, anticorpos muta- dos e derivados de anticorpo, como descrito mais abaixo. Se as moléculas de ácido nucléico são derivadas de um animal não humano, não transgênico, as moléculas de ácido nucléico podem ser usadas para a humanização de anticorpo, também como descrito abaixo.
[0139] Em uma outra modalidade, as moléculas de ácido nucléico da invenção podem ser usadas como sondas ou iniciadores de PCR para as seqüências de anticorpo específicas. Por exemplo, uma sonda de molécula de ácido nucléico pode ser usada em métodos de diagnóstico ou um iniciador de PCR de molécula de ácido nucléico pode ser usado para amplificar regiões de DNA que podem ser usadas, inter alia, para isolar seqüências de nucleotídeo para o uso na produção de domínios variáveis de anticorpos anti-MAdCAM. Em uma modalidade preferida, as moléculas de ácido nucléico são oligonucleotídeos. Em uma modalidade mais preferida, os oligonucleotídeos são de regiões altamente variáveis das cadeias pesadas e leves do anticorpo de interesse. Em uma modalidade ainda mais preferida, os oligonucleotídeos codificam toda ou uma parte de uma ou mais das CDRs. Vetores
[0140] A invenção fornece vetores que compreendem as molécu las de ácido nucléico da invenção que codificam a cadeia pesada ou a porção de ligação de antígeno desta. A invenção também fornece vetores que compreendem as moléculas de ácido nucléico da invenção que codificam a cadeia leve ou porção de ligação de antígeno desta. A invenção também fornece vetores que compreendem moléculas de ácido nucléico que codificam proteínas de fusão, anticorpos modificados, fragmentos de anticorpo e sondas destes.
[0141] Para expressar os anticorpos ou porções de anticorpo da invenção, DNAs que codificam as cadeias leve e pesada parciais ou de tamanho natural, obtidas como descrito acima, são inseridas em vetores de expressão tal que os genes são operativamente ligados às seqüências de controle transcricionais e traducionais. Os vetores de expressão incluem plasmídeos, retrovírus, adenovírus, vírus adeno- associados (AAV), vírus vegetais, tais como o vírus mosaico da couve- flor, vírus mosaico do tabaco, cosmídeos, YACs, epissomas derivados de EBV e outros. O gene de anticorpo é ligado em um vetor tal que as seqüências transcricionais e traducionais de controle dentro do vetor serve à sua função intencionada de regular a transcrição e tradução do gene anticorpo. O vetor de expressão e as seqüências de controle da expressão são escolhidos para serem compatíveis com a célula hospedeira de expressão usada. O gene de cadeia leve do anticorpo e o gene de cadeia pesada do anticorpo podem ser inseridos em vetor separado. Em uma modalidade preferida, ambos os genes são inseridos no mesmo vetor de expressão. Os genes de anticorpo são inseridos no vetor de expressão pelos métodos padrão (por exemplo, ligação de sítios de restrição complementares no fragmento de gene de anticorpo e vetor ou ligação de extremidade abrupta se nenhum sítio de restrição estiver presente).
[0142] Um vetor conveniente é um que codifica uma seqüência de imunoglobulina CH ou CL humana funcionalmente completa, com sítios de restrição apropriados engendrados de modo que qualquer se- qüência VH ou VL possa ser facilmente inserida e expressada, como descrito acima. Em tais vetores, a união usualmente ocorre entre o sítio doador de união na região J inserida e o sítio aceitador de união que precede a região C humana e também nas regiões de união que ocorrem dentro dos éxons CH humanos. A poliadenilação e a terminação de transcrição ocorrem nos sítios cromossômicos nativos à jusante das regiões codificadoras. O vetor de expressão recombinante tam- bém pode codificar um peptídeo de sinal que facilita a secreção da cadeia de anticorpo de uma célula hospedeira. O gene da cadeia de anticorpo pode ser clonado no vetor tal que o peptídeo de sinal seja ligado na matriz ao término amino do gene da cadeia de anticorpo. O pep- tídeo de sinal pode ser um peptídeo de sinal de imunoglobulina ou um peptídeo de sinal heterólogo (isto é, um peptídeo de sinal de uma proteína que não imunoglobulina).
[0143] Além dos genes da cadeia de anticorpo, os vetores de ex pressão recombinantes da invenção portam seqüências reguladoras que controlam a expressão dos genes da cadeia de anticorpo em uma célula hospedeira. Será avaliado por aqueles versados na técnica que o planejamento dos vetores de expressão, incluindo a seleção de se- qüências reguladoras pode depender de fatores, tais como a escolha da célula hospedeira a ser transformada, o nível de expressão de proteína desejado, etc. As seqüências reguladoras preferidas para a expressão de célula hospedeira de mamífero incluem elementos virais que direcionam altos níveis de expressão de proteína em células de mamífero, tais como promotores e/ou realçadores derivados de LTRs retrovirais, citomegalovírus (CMV) (tal como o promotor/realçador de CMV), Vírus Símio 40 (SV40) (tal como o promotor/realçador de SV40), adenovírus, (por exemplo, o promotor tardio principal de ade- novírus (AdMLP)), promotores de polioma e mamífero forte, tais como promotores de imunoglobulina nativos e de actina. Para descrição adicional de elementos reguladores virais e seqüências destes, ver por exemplo, as Patentes U.S. N°s 5.168.062, 4.510.245 e 4.968.615, cada uma das quais é por meio deste incorporada por referência. Os métodos para expressar anticorpos em plantas, incluindo uma descrição de promotores e vetores, assim como a transformação de plantas são conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Patente dos Estados Unidos 6.517.529. Métodos dos quais expressam polipeptídeos em células bacterianas ou células fúngicas, por exemplo, células de levedura, também são bem conhecidos na técnica.
[0144] Além dos genes da cadeia de anticorpo e seqüências regu ladoras, os vetores de expressão recombinantes da invenção podem portar seqüências adicionais, tais como seqüências que regulam a re- plicação do vetor em células hospedeiras (por exemplo, origens de re- plicação) e genes marcadores selecionáveis. O gene marcador seleci- onável facilita a seleção de células hospedeiras dentro das quais o vetor foi introduzido (ver, por exemplo, as Patentes U.S. N°s 4.399.216, 4.634.665 e 5.179.017). Por exemplo, tipicamente o gene marcador selecionável confere resistência aos fármacos, tais como G418, higro- micina ou metotrexato, em uma célula hospedeira na qual o vetor foi introduzido. Os genes marcadores selecionáveis preferidos incluem o gene da diidrofoliato reductase (DHFR) (para o uso em células hospedeiras dhfr- com seleção/amplificação com metotrexato) e o gene neo (para a seleção de G418) e o gene da glutamato sintetase Células Hospedeiras que não de Hibridoma e Métodos de Produzir Proteína Recombinantemente
[0145] As moléculas de ácido nucléico que codificam a cadeia pe sada ou uma porção de ligação de antígeno desta e/ou a cadeia leve ou uma porção de ligação de antígeno desta de um anticorpo anti- MAdCAM e vetores que compreendem estas moléculas de ácido nu- cléico, podem ser usadas para a transformação de uma célula hospedeira de mamífero, vegetal, bacteriana ou de levedura adequada. A transformação pode ser por qualquer método conhecido para introduzir polinucleotídeos em uma célula hospedeira. Os métodos para a introdução de polinucleotídeos heterólogos em células de mamífero são bem conhecidos na técnica e incluem a transfecção mediada por dextrano, precipitação com fosfato de cálcio, transfecção mediada por polibreno, fusão de protoplasto, eletroporação, encapsulação do(s) polinucleotí- deo(s) em lipossomas, injeção biolística e microinjeção direta do DNA dentro dos núcleos. Além disso, as moléculas de ácido nucléico pode ser introduzida em células de mamífero pelos vetores virais. Os métodos de transformar as células são bem conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, as Patentes U.S. No 4.399.216, 4.912.040, 4.740.461 e 4.959.455 (patentes estas que são por meio deste aqui incorporadas por referência). Os métodos de transformar células vegetais são bem conhecidos na técnica, incluindo, por exemplo, a transformação mediada por Agrobacterium, transformação biolística, injeção direta, eletropo- ração e transformação viral. Métodos de transformação bacteriana e células de levedura também são bem conhecidos na técnica.
[0146] As linhagens de célula de mamífero disponíveis como hos pedeiros para a expressão são bem conhecidas na técnica e incluem muitas linhagens de célula imortalizadas disponíveis da American Type Culture Collection (ATCC). Estas incluem, inter alia, as células do ovário do hamster chinês (CHO), NS0, células SP2, células HEK-293T, células NIH-3T3, células HeLa, células do rim de hamster bebê (BHK), células renais de macaco (COS), células do carcinoma hepatocelular humano (por exemplo, Hep G2), células A549, células 3T3 e várias outras linhagens de célula. As células hospedeiras de mamífero incluem células de ser humano, camundongo, rato, cachorro, macaco, porco, cabra, bovino, cavalo e hamster. As linhagens de célula de preferência particular são selecionadas através da determinação de quais linhagens de célula têm altos níveis de expressão. Outras linhagens de célula que podem ser usadas são linhagens de célula de inseto, tais como células Sf9, células de anfíbio, células bacterianas, células vegetais e células fúngicas. Quando os vetores de expressão recombinan- tes que codificam a cadeia pesada ou porção de ligação de antígeno deste, a cadeia leve e/ou porção de ligação de antígeno deste são introduzidas nas células de mamífero hospedeiras, os anticorpos são produzidos cultivando-se as células hospedeiras por um período de tempo suficiente para permitir a expressão do anticorpo nas células hospedeiras ou, mais preferivelmente, a secreção do anticorpo no meio de cultura nas quais as células hospedeiras são cultivadas. Os anticorpos podem ser recuperados do meio de cultura usando métodos de purificação de proteína padrão. as células hospedeiras vegetais incluem, por exemplo, Nicotiana, Arabidopsis, lentilha d'água, milho, trigo, batata, etc. As células hospedeiras bacterianas incluem espécies de E. coli e Streptomyces. As células hospedeiras de levedura incluem Schizosaccharomyces pombe, Saccharomyces cerevisiae e Pichia pastoris.
[0147] Além disso, a expressão de anticorpos da invenção (ou ou tras porções destas) a partir das linhagens de célula de produção podem ser realçadas usando várias técnicas conhecidas. Por exemplo, o sistema de expressão de gene da glutamina sintetase (o sistema GS) é um método comum para realçar a expressão sob certas condições. O sistema GS é debatido no todo ou parte em conexão com a Patente Européia N°s 0 216 846, 0 256 055, 0 338 841 e 0 323 997.
[0148] É provável que os anticorpos expressados pelas linhagens de célula diferentes ou em animais transgênicos terão glicosilação diferentes entre si. Entretanto, todos os anticorpos codificados pelas moléculas de ácido nucléico aqui fornecidas ou que compreendem as se- qüências de aminoácido aqui fornecidas são parte da presente invenção, independente da glicosilação dos anticorpos.
Animais e Plantas Transgênicas
[0149] A invenção também fornece animais não humanos transgê- nicos e plantas transgênicas que compreendem uma ou mais moléculas de ácido nucléico da invenção que podem ser usadas para produzir anticorpos da invenção. Os anticorpos podem ser produzidos em tecidos e fluidos corporais, tais como leite, sangue ou urina, e a partir des- tes recuperados de cabras, vacas, cavalos, porcos, ratos, camundongos, coelhos, hamsters ou outros mamíferos. Ver, por exemplo, a Patente U.S. N°s 5.827.690, 5.756.687, 5.750.172 e 5.741.957. Como descrito acima, animais transgênicos não humanos que compreendem locais de imunoglobulina humana podem ser imunizados com MAd- CAM ou uma porção desta. Os métodos para fabricar anticorpos em plantas são descritos, por exemplo, nas Patentes U.S. 6.046.037 e 5.959.177, aqui incorporadas por referência.
[0150] Em uma outra modalidade, animais transgênicos não hu manos e plantas transgênicas são produzidas introduzindo-se uma ou mais moléculas de ácido nucléico da invenção no animal ou planta pelas técnicas transgênicas padrão. Ver Hogan, supra. As células trans- gênicas usadas para fabricar o animal transgênico podem ser células- tronco embrionárias, células somáticas ou células de ovo fertilizado. Os organismos não humanos transgênicos podem ser heterozigotos quiméricos, não quiméricos e homozigotos não quiméricos. Ver, por exemplo, Hogan et al., Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual 2a ed., Cold Spring Harbor Press (1999); Jackson et al., Mouse Genetics and Transgenics: A Practical Method, Oxford University Press (2000); e Pinkert, Transgenic Animal Technology: A Laboratory Handbook, Academic Press (1999). Em uma outra modalidade, os organismos não humanos transgênicos podem ter um rompimento e substitui-ção alvejados que codificam uma cadeia pesada e/ou uma cadeia leve de interesse. Em uma modalidade preferida, os animais ou plantas transgênicas compreendem e expressam moléculas de ácido nucléico que codificam as cadeias pesadas e leves que combinam para ligar especificamente ao MAdCAM, preferivelmente MAdCAM humano. Em uma outra modalidade, os animais ou plantas transgênicos compreendem moléculas de ácido nucléico que codificam um anticorpo modificado, tal como um anticorpo de cadeia única, um anticorpo quimérico ou um anticorpo humanizado. Os anticorpos anti-MAdCAM podem ser fabricados em qualquer animal transgênico. Em uma modalidade preferida, os animais não humanos são camundongos, ratos, ovelhas, porcos, cabras, gado ou cavalos. O animal transgênico não humano expressa os ditos polipeptídeos codificados no sangue, leite, urina, saliva, lágrimas, muco e outros fluidos corporais.
Bibliotecas de Demonstração de Fago
[0151] A invenção fornece um método para produzir um anticorpo anti-MAdCAM ou porção de ligação de antígeno deste que compreende as etapas de sintetizar uma biblioteca de anticorpos humanos no fago, triar a biblioteca com um MAdCAM ou uma porção deste, isolar o fago que liga MAdCAM e obter o anticorpo a partir do fago. Um método para preparar a biblioteca de anticorpos compreende as etapas de imunizar um animal hospedeiro não humano que compreende um local de imunoglobulina humana com MAdCAM ou uma porção antigênica deste para criar uma resposta imune, extrair as células do animal hospedeiro as células que são responsáveis pela produção de anticorpos; isolar o RNA das células extraídas, transcrever de modo reverso o RNA para produzir cDNA, amplificar o cDNA usando um preparador e inserir o cDNA no vetor de demonstração de fago tal que os anticorpos sejam expressados no fago. Os anticorpos anti-MAdCAM recombinan- tes da invenção podem ser obtidos deste modo.
[0152] Os anticorpos anti-MAdCAM recombinantes humanos da invenção além dos anticorpos anti-MAdCAM aqui divulgados podem ser isolados pela triagem de uma biblioteca de anticorpo combinatória recombinante, preferivelmente uma biblioteca de demonstração de fa- go scFv, preparada usando os cDNAs VL e VH humanos preparados a partir do mRNA isolado de linfócitos humanos. As metodologias para preparar e triar tais bibliotecas são conhecidas na técnica. Existem kits comercialmente disponíveis para gerar bibliotecas de demonstração de fago (por exemplo, o Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, catálogo no 27-9400-01; e o kit de demonstração de fago SurfZAP® da Stratagene, catálogo no 240612). Existem também outros métodos e reagentes que podem ser usados na geração e triagem das bibliotecas de demonstração de anticorpo (ver, por exemplo, a Patente U.S. No 5.223.409; Publicação PCT No WO 92/18619; Publicação PCT No WO 91/17271; Publicação PCT No WO 92/20791; Publicação PCT No WO 92/15679; Publicação PCT No WO 93/01288; Publicação PCT No WO 92/01047; Publicação PCT No WO 92/09690; Fuchs et al. (1991), Biotechnology, 9: 1369-1372; Hay et al., Hum. Antibod. Hybri- domas, 3: 81-85 (1992); Huse et al., Science, 246: 1275-1281 (1989); McCafferty et al., Nature, 348: 552-554 (1990); Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993); Hawkins et al., J. Mol. Biol., 226: 889-896 (1992); Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991); Gram et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 3576-3580 (1992); Garrad et al., Biotechnology, 9: 1373-1377 (1991); Hoogenboom et al., Nucl Acid Res, 19: 4133-4137 (1991); e Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 7978-7982 (1991).
[0153] Em uma modalidade preferida, para isolar anticorpos anti- MAdCAM humanos com as características desejadas, um anticorpo anti-MAdCAM humano como aqui descrito é primeiro usado para selecionar as seqüências das cadeias pesada e leve humanas tendo atividade de ligação similar para MAdCAM, usando os métodos de marcação de epítopo descritos em Hoogenboom et al., Publicação PCT No WO 93/06213. As bibliotecas de anticorpo usadas neste método são preferivelmente bibliotecas scFv preparadas e triadas como descrito em McCafferty et al., Publicação PCT No WO 92/01047, McCafferty et al., Nature, 348: 552-554 (1990); e Griffiths et al., EMBO J, 12: 725734 (1993). As bibliotecas de anticorpo scFv preferivelmente são triadas usando MAdCAM humano como o antígeno.
[0154] Uma vez que os segmentos de VL e VH humanos iniciais são selecionados, experimentos de "misturar e emparelhar", em que pares diferentes dos segmentos VL e VH inicialmente selecionados são triados quanto a ligação de MAdCAM, são realizados para selecionar a combinações de par VL/VH preferidas. Adicionalmente, para melhorar ainda mais a qualidade do anticorpo, os segmentos VL e VH do(s) par(es) VL/VH preferido(s) pode(m) ser aleatoriamente mutados, preferivelmente dentro da região CDR3 de VH e/ou VL, em um processo análogo ao processo de mutação somática in vivo responsável pela maturação de afinidade de anticorpos durante uma resposta imune natural. Esta maturação de afinidade in vitro pode ser realizada amplificando-se regiões VH e VL usando iniciadores de PCR complementar à CDR3 de VH ou CDR3 de VL, respectivamente, iniciadores estes que foram "reforçados" com uma mistura aleatória das quatro bases de nucleotídeo em certas posições tal que os produtos de PCR resultantes codificam segmentos VH e VL nos quais as mutações aleatórias foram introduzidas nas regiões de CDR3 VH e/ou VL. Estes segmentos VH e VL aleatoriamente mutados podem ser novamente triados quanto a ligação ao MAdCAM.
[0155] A seguir da triagem e isolação de um anticorpo anti- MAdCAM da invenção a partir de uma biblioteca de demonstração de imunoglobulina recombinante, o ácido nucléico que codifica o anticorpo selecionado pode ser recuperado a partir do pacote de demonstração (por exemplo, a partir do genoma de fago) e subclonado em outros vetores de expressão pelas técnicas de DNA recombinante padrão. Se desejado, o ácido nucléico pode ser ainda manipulado para criar outras formas de anticorpo da invenção, como descrito abaixo. Para expressar um anticorpo humano isolado recombinante pela triagem de uma biblioteca combinatória, o DNA que codificam o anticorpo é clo- nado em um vetor de expressão recombinante e introduzido em uma célula hospedeira de mamífero, como descrito acima.
Mudança de Classe
[0156] Um outro aspecto da presente invenção é fornecer um me canismo pelo qual a classe de um anticorpo anti-MAdCAM pode ser mudado com um outro. Em um aspecto da invenção, uma molécula de ácido nucléico que codifica VL ou VH é isolada usando métodos bem conhecidos na técnica tal que não inclua nenhuma seqüência de nu- cleotídeo que codifique CL ou CH. A molécula de ácido nucléico que codifica VL ou VH é depois operativamente ligada a uma seqüência de nucleotídeo que codifica um CL ou CH de uma classe diferente de molécula de imunoglobulina. Isto pode ser obtido usando um vetor ou molécula de ácido nucléico que compreenda uma seqüência que codifique CL ou CH, como descrito acima. Por exemplo, um anticorpo anti- MAdCAM que foi originalmente IgM pode ser mudado de classe para um IgG. Além disso, a mudança de classe pode ser usada para converter uma subclasse de IgG em uma outra, por exemplo, de IgG4 para IgG2. Um método preferido para produzir um anticorpo da invenção que compreenda um isótipo desejado ou subclasse de anticorpo compreende as etapas de isolar um ácido nucléico que codifique a cadeia pesada de um anticorpo anti-MAdCAM e um ácido nucléico que codifique a cadeia leve de um anticorpo anti-MAdCAM, obtendo-se a região variável da cadeia pesada, ligando a região variável da cadeia pesada com o domínio constante de uma cadeia pesada do isótipo desejado, que expresse a cadeia leve e a cadeia pesada ligada em uma célula e coletando o anticorpo anti-MAdCAM com o isótipo desejado.
Derivados de Anticorpo
[0157] Pode-se usar as moléculas de ácido nucléico descritas acima para gerar derivados de anticorpo usando técnicas e métodos conhecidos por uma pessoa versado na técnica.
Anticorpos Humanizados
[0158] A imunogenicidade de anticorpos não humanos pode ser reduzida em algum grau usando técnicas de humanização, potencialmente utilizando técnicas de demonstração usando bibliotecas apropriadas. Será avaliado que anticorpos de murino ou anticorpos de outras espécies podem ser humanizados ou primatizados usando técnicas bem conhecidas no ramo. Ver, por exemplo, Winter e Harris, Immunol Today, 14: 43-46 (1993) e Wright et al., Crit. Reviews in Immunol., 12125-168 (1992). O anticorpo de interesse podem ser engendradas pelas técnicas de DNA recombinante para substituir CH1, CH2, CH3, domínios de dobradiça, e/ou o domínio matriz com a se- qüência humana correspondente (ver a WO 92/02190 e as Patentes U.S. N°s 5.530.101, 5.585.089, 5.693.761, 5.693.792, 5.714.350 e 5.777.085). Em uma outra modalidade, um anticorpo anti-MAdCAM não humano pode ser humanizado pela substituição de CH1, domínio de dobradiça, CH2, CH3, e/ou os domínios de matriz com a seqüência humana correspondente de um anticorpo anti-MAdCAM da invenção. Anticorpos Mutados
[0159] Em uma outra modalidade, as moléculas de ácido nucléico, vetores e células hospedeiras podem ser usados para fabricar anticorpos anti-MAdCAM maturados. Os anticorpos podem ser mutados nos domínios variáveis das cadeias pesada e/ou leve para alterar uma propriedade de ligação do anticorpo. Por exemplo, uma mutação pode ser fabricada em uma ou mais das regiões CDR para aumentar ou diminuir o Kd do anticorpo para MAdCAM. As técnicas na mutagênese direcionada ao sítio são bem conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Sambrook et al. e Ausubel et al., supra. Em uma modalidade preferida, as mutações são fabricadas em um resíduo de aminoácido que é conhecido ser mudado comparado com a linhagem germinativa em uma região variável de um anticorpo anti-MAdCAM. Em uma modalidade mais preferida, uma ou mais mutações são fabricadas em um resíduo de aminoácido que é conhecido ser mudado comparado com a linhagem germinativa em uma região variável ou região de CDR de um dos anticorpos anti-MAdCAM 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod ou 7.26.4-mod. Em uma outra modalidade, uma ou mais mutações são fabricadas em um resíduo de aminoácido que é conhecido ser mudado comparado com a linhagem germinativa em uma região variável ou região de CDR cuja seqüência de aminoá- cido é apresentada nas SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 52, 54, 56, 58, 62, 64, 66 ou 68 ou cuja seqüência de nucleotídeo é apresentada nas SEQ ID NOS: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 51, 53, 55, 57, 61, 63, 65 ou 67. Em uma outra modalidade, as moléculas de ácido nucléico são mutadas em uma ou mais das regiões de matriz. Uma mutação pode ser fabricada em uma região de matriz ou domínio constante para aumentar a meia vida do anticorpo anti-MAdCAM. Ver, por exemplo, a WO 00/09560, publicada em 24 de fevereiro de 2000, aqui incorporada por referência. Em uma modalidade, pode haver uma, três ou cinco ou dez mutações pontuais e não mais do que quinze mutações pontuais. Uma mutação em uma região de matriz ou domínio constante também pode ser feita para alterar a imunogenicidade do anticorpo, para fornecer um sítio para a ligação covalente ou não covalente a uma outra molécula ou para alterar propriedades, tais como a fixação de complemento. As mutações podem ser feitas em cada uma das regiões de matriz, o domínio constante e as regiões variáveis em um anticorpo mutado único. Alternativamente, as mutações podem ser feitas em apenas uma das regiões de matriz, as regiões variáveis ou o domínio constante em um anticorpo mutado único.
[0160] Em uma modalidade, não existe mais do que quinze mu- danças de aminoácido em cada uma das regiões VH ou VL do anticorpo anti-MAdCAM mutado comparado com o anticorpo anti-MAdCAM antes da mutação. Em uma modalidade mais preferida, não existe mais do que dez mudanças de aminoácido em cada uma das regiões VH ou VL do anticorpo anti-MAdCAM mutado, mais preferivelmente não mais do que cinco mudanças de aminoácido ou ainda mais preferivelmente não mais do que três mudança de aminoácidos. Em uma outra modalidade, não existe mais do que quinze mudanças de ami- noácido nos domínios constantes, mais preferivelmente, não mais do que dez mudanças de aminoácido, ainda mais preferivelmente, não mais do que cinco mudanças de aminoácido.
Anticorpos Modificados
[0161] Em uma outra modalidade, um anticorpo de fusão ou imu- noadesina podem ser fabricados compreendendo todo ou uma porção de um anticorpo anti-MAdCAM ligado a um outro polipeptídeo. Em uma modalidade preferida, apenas as regiões variáveis do anticorpo anti-MAdCAM são ligados ao polipeptídeo. Em uma outra modalidade preferida, o domínio VH de um anticorpo anti-MAdCAM é ligado a um primeiro polipeptídeo, enquanto o domínio VL de um anticorpo anti- MAdCAM é ligado a um segundo polipeptídeo que se associa com o primeiro polipeptídeo de uma maneira em que os domínios VH e VL possam interagir com entre si para formar um sítio de ligação de anticorpo. Em uma outra modalidade preferida, o domínio VH é separado do domínio VL por um ligador tal que os domínios VH e VL possam interagir entre si (ver abaixo sob Anticorpos de Cadeia única). O anticorpo VH-ligador-VL é depois ligado ao polipeptídeo de interesse. O anticorpo de fusão é útil para direcionar um polipeptídeo a uma célula ou tecido que expressem MAdCAM. O polipeptídeo pode ser um agente terapêutico, tal como uma toxina, fator de crescimento ou outras proteínas reguladoras ou pode ser um agente de diagnóstico, tal como uma enzima que pode ser facilmente visualizada, tal como rábano peroxidase. Além disso, os anticorpos de fusão podem ser criados em que dois (ou mais) anticorpos de cadeia única são ligados entre si. Isto é útil se deseja-se criar um anticorpo bivalente ou polivalente em uma cadeia de polipeptídeo única ou se deseja-se criar um anticorpo bies- pecífico.
[0162] Para criar um anticorpo de cadeia única, (scFv) os fragmen tos de DNA que codificam VH e VL são operativamente ligados a um outro fragmento que codifica um ligador flexível, por exemplo, que codifica a seqüência de aminoácido (Gly4 -Ser)3, tal que as seqüências VH e VL possam ser expressadas como uma proteína de cadeia única contígua, com as regiões VL e VH unidas pelo ligador flexível (ver, por exemplo, Bird et al., Science, 242: 423-426 (1988); Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 5879-5883 (1988); McCafferty et al., Nature, 348: 552-554 (1990)). O anticorpo de cadeia única pode ser monovalente, se apenas uma única VH e VL são usadas, bivalente, se duas VH e VL são usadas ou polivalente, se mais do que duas VH e VL são usadas.
[0163] Em uma outra modalidade, outros anticorpos modificados podem ser preparados usando moléculas de ácido nucléico que codificam anti-MAdCAM. Por exemplo, "Corpos Capa" (Ill et al., Protein Eng, 10: 949-57 (1997)), "Minicorpos" (Martin et al., EMBO J, 13: 5303-9 (1994)), "Diacorpos" (Holliger et al., PNAS USA, 90: 6444-6448 (1993)) ou "Janusins" (Traunecker et al., EMBO J, 10: 3655-3659 (1991) e Traunecker et al., "Janusin: new molecular design for bispecific reagents," Int J Cancer Suppl, 7: 51-52 (1992)) podem ser preparados usando técnicas biológicas molecular padrão seguindo as divulgações do relatório descritivo.
[0164] Em um outro aspecto, anticorpos quiméricos e biespecíficos podem ser gerados. Um anticorpo quimérico pode ser fabricado de modo que compreenda CDRs e regiões de matriz de anticorpos diferentes. Em uma modalidade preferida, as CDRs do anticorpo quimérico compreende todas as CDRs da região variável de uma cadeia leve ou cadeia pesada de um anticorpo anti-MAdCAM humano, enquanto as regiões de matriz são derivadas de um ou mais anticorpos diferentes. Em uma modalidade mais preferida, as CDRs do anticorpo quimérico compreendem todas as CDRs das regiões variáveis da cadeia leve e da cadeia pesada de um anticorpo anti-MAdCAM humano. As regiões de matriz podem ser de uma outra espécie e, em uma modalidade preferida, podem ser humanizadas. Alternativamente, as regiões de matriz podem ser de um outro anticorpo humano.
[0165] Um anticorpo biespecífico pode ser gerado de modo que se ligue especificamente a MAdCAM através de um domínio de ligação e a uma segunda molécula através de um segundo domínio de ligação. O anticorpo biespecífico pode ser produzido através de técnicas biológicas moleculares recombinantes ou pode ser fisicamente conjugado junto. Além disso, um anticorpo de cadeia única contendo mais do que uma VH e VL pode ser gerado de modo que se ligue especificamente a MAdCAM e a uma outra molécula. Tais anticorpos biespecíficos podem ser gerados usando técnicas que são bem conhecidas por exemplo, em conexão com (i) e (ii) ver, por exemplo, Fanger et al., Immunol Methods 4: 72-81 (1994) e Wright e Harris, supra. e m conexão com (iii) ver, por exemplo, Traunecker et al., Int. J. Cancer (Suppl.) 7: 51-52 (1992). Em uma modalidade preferida, o anticorpo biespecífico se liga a MAdCAM e a uma outra molécula expressada em nível alto em células endoteliais. Em uma modalidade mais preferida, a outra molécula é VCAM, ICAM ou L-selectina.
[0166] Em várias modalidades, os anticorpos modificados descri tos acima são preparados usando uma ou mais das regiões variáveis ou uma ou mais regiões de CDR de um dos anticorpos selecionados de 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod ou 7.26.4-mod. Em uma outra modalidade, os anticorpos modificados são preparados usando uma ou mais das regiões variáveis ou uma ou mais regiões de CDR cuja seqüência de aminoácido é apresentada nas SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 52, 54, 56, 58, 62, 64, 66 ou 68 ou cuja seqüência de nucleotídeo é apresentada nas SEQ ID NOS: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 51, 53, 55, 57, 61, 63, 65 ou 67.
Anticorpos Derivatizados e Rotulados
[0167] Um anticorpo ou porção de anticorpo da invenção podem ser derivatizados ou ligados a uma outra molécula (por exemplo, um outro peptídeo ou proteína). No geral, os anticorpos ou porções destes são derivatizados tal que a ligação de MAdCAM não seja afetada adversamente pela derivatização ou rotulação. Consequentemente, os anticorpos e porções de anticorpo da invenção são intencionados a incluir as formas tanto intactas quanto modificadas dos anticorpos anti-MAdCAM humanos aqui descritos. Por exemplo, um anticorpo ou porção de anticorpo da invenção podem estar funcionalmente ligados (pela ligação química, fusão genética, associação não covalente ou de outro modo) a uma ou mais outras entidades moleculares, tais como um outro anticorpo (por exemplo, um anticorpo biespecífico ou um diacorpo), um agente de detecção, um agente citotóxico, um agente farmacêutico, e/ou uma proteína ou peptídeo que pode mediar a associação do anticorpo ou porção de anticorpo com uma outra molécula (tal como, uma região de núcleo de estreptavidina ou um rótulo de poliistidina).
[0168] Um tipo de anticorpo derivatizado é produzido pela reticula- ção de dois ou mais anticorpos (do mesmo tipo ou de tipos diferentes, por exemplo, para criar anticorpos biespecíficos). Os reticuladores adequados incluem aqueles que são heterobifuncionais, tendo dois grupos distintamente reativos separados por um espaçador apropriado (por exemplo, éster de m-maleimidobenzoil-N-hidróxi-succinimida) ou homobifuncional (por exemplo, suberato de dissuccinimidila). Tais li- gadores são disponíveis da Pierce Chemical Company, Rockford, Ill.
[0169] Um outro tipo de anticorpo derivatizado é um anticorpo rotu lado. Os agentes de detecção úteis com que um anticorpo ou porção de anticorpo da invenção podem ser derivatizados incluem compostos fluorescentes, incluindo fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, ro- damina, cloreto de 5-dimetilamina-1-naftalenossulfonila, ficoeritrina, fósforo lantanídeo e outros. Um anticorpo também pode ser rotulado com enzimas que são úteis para a detecção, tal como rábano peroxidase, β-galactosidase, luciferase, fosfatase alcalina, glicose oxidase e outras. Quando um anticorpo é rotulado com uma enzima detectável, este é detectado pela adição de reagentes adicionais que a enzima usa para produzir um produto de reação que pode ser distinguido. Por exemplo, quando o agente rábano peroxidase está presente, a adição de peróxido de hidrogênio e diaminobenzidina leva a um produto de reação colorido, que é detectável. Um anticorpo também pode ser rotulado com biotina e detectado através da medição indireta da ligação de avidina ou estreptavidina. Um anticorpo pode ser rotulado com um agente magnético, tal como gadolínio. Um anticorpo também pode ser rotulado com um epítopo de polipeptídeo pré determinado reconhecido por um repórter secundário (por exemplo, seqüências de par de zíper de leucina, sítios de ligação para anticorpos secundários, domínios de ligação de metal, rótulos de epítopo). Em algumas modalidades, rótulos são ligados pelas ramificações espaçadoras de vários comprimentos para reduzir o impedimento estérico potencial.
[0170] Um anticorpo anti-MAdCAM também pode ser rotulado com um aminoácido radiorrotulado. O radiorrótulo pode ser usado tanto com propósitos de diagnóstico quanto terapêuticos. Por exemplo, o radiorrótulo pode ser usado para detectar tecidos que expressam MAdCAM pelo raio X ou outras técnicas de diagnóstico. Além disso, o radiorrótulo pode ser usado terapeuticamente como uma toxina para tecido doente ou tumores que expressam MAdCAM. Os exemplos de rótulos para polipeptídeos incluem, mas não são limitados aos seguintes radioisótopos ou radionuclídeos -- 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I.
[0171] Um anticorpo anti-MAdCAM também pode ser derivatizado com um grupo químico, tal como polietileno glicol (PEG), um grupo metila ou etila ou um grupo de carboidrato. Estes grupos podem ser úteis para melhorar as características biológicas do anticorpo, por exemplo, para aumentar a meia vida do soro ou para aumentar a ligação de tecido. Esta metodologia também pode se aplicar a qualquer fragmentos ou versões de ligação de antígeno de anticorpos anti- MAdCAM. Composições e Kits Farmacêuticos
[0172] Em um outro aspecto, a invenção fornece composições que compreendem um anticorpo inibidor anti-MAdCAM humano e métodos para tratar pacientes com tais composições. Em algumas modalidades, o paciente de tratamento é um ser humano. Em outras modalidades, o paciente é um paciente veterinário. Em algumas modalidades, o paciente veterinário é um cão ou um primata não humano.
[0173] O tratamento pode envolver a administração de um ou mais anticorpos monoclonais anti-MAdCAM inibidores da invenção ou fragmentos de ligação de antígeno destes, sozinhos ou com um veículo farmaceuticamente aceitável. Os anticorpos inibidores anti-MAdCAM da invenção e as composições que os compreendem, podem ser administrados em combinação com um ou mais outros agentes terapêuticos, de diagnóstico ou profiláticos. Os agentes terapêuticos adicionais incluem agentes antiinflamatórios ou imunomodulatórios. Estes agentes incluem, mas não são limitados aos corticosteróides tópicos e orais, tais como prednisolona, metilprednisolona, NCX-1015 ou bude- sonida; os aminossalicilatos, tais como mesalazina, olsalazina, balsa- lazida ou NCX-456; a classe de imunomoduladores, tais como azatio- prina, 6-mercaptopurina, metotrexato, ciclosporina, FK506, IL-10 (Ilo- decakin), IL-11 (Oprelevkin), IL-12, antagonistas de MIF/CD74, antagonistas de CD40, tais como TNX-100/5-D12, antagonistas de OX40L, GM-CSF, pimecrolimus ou rapamicina; a classe de agentes anti-TNFα, tal como infliximab, adalimumab, CDP-870, onercept, etanercept; a classe de agentes antiinflamatórios, tais como inibidores de PDE-4 (ro- flumilast, etc), inibidores de TACE (DPC-333, RDP-58, etc) e inibidores de ICE (VX-740, etc) assim como antagonistas do receptor de IL-2, tais como daclizumab, a classe de antagonistas da molécula de adesão seletiva, tal como natalizumab, MLN-02 ou alicaforsen, classes de agentes analgésicos tais como, mas não limitado a, inibidores de COX-2, tais como rofecoxib, valdecoxib, celecoxib, moduladores do canal de sensibilizar voltagem tipo P/Q (α2δ), tal como gabapentina e pregabalina, antagonistas do receptor de NK-1, moduladores do receptor canabinóide e agonistas do receptor de opióide delta, assim como agentes antineoplásticos, antitumor, antiangiogênicos ou quimiotera- pêuticos. Tais agentes adicionais podem ser incluídos na mesma composição ou administrados separadamente. Em algumas modalidades, um ou mais anticorpos inibidores anti-MAdCAM da invenção podem ser usados como uma vacina ou como adjuvantes para uma vacina. Em particular, porque a MAdCAM é expressada em tecido linfóide, antígenos de vacina podem ser vantajosamente alvejados ao tecido linfóide conjugando-se o antígeno a um anticorpo anti-MAdCAM da invenção.
[0174] Como aqui usado, "veículo farmaceuticamente aceitável" significa qualquer um e todos os solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos e realçadores ou retardadores de absorção e outros que sejam fisiologi- camente compatíveis. Alguns exemplos de veículos farmaceuticamen- te aceitáveis são água, solução salina, solução salina tamponada com fosfato, tampão de acetato com cloreto de sódio, dextrose, glicerol, polietileno glicol, etanol e outros, assim como combinações destes. Em muitos casos, será preferível incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares, poliálcoois, tais como manitol, sorbitol ou cloreto de sódio na composição. Os exemplos adicionais de substâncias farmaceutica- mente aceitáveis são tensoativos, agentes umectantes ou quantidades menores de substâncias auxiliares, tais como agentes umectantes ou emulsificantes, conservantes ou tampões, que realçam a vida de prateleira ou a eficácia do anticorpo.
[0175] As composições desta invenção podem estar em uma vari edade de formas, por exemplo, as formas de dosagem líquidas, semi- sólidas e sólidas, tais como soluções líquidas (por exemplo, soluções injetáveis e infusíveis), dispersões ou suspensões, comprimidos, pílulas, tortas liofilizadas, pós secos, lipossomas e supositórios. A forma preferida depende do modo intencionado de administração e aplicação terapêutica. As composições típicas preferidas estão a forma de injetáveis e infusíveis, tais como composições similares àquelas usadas para a imunização passiva de humanos. O modo preferido de administração é parenteral (por exemplo, intravenoso, subcutâneo, intraperitoneal, intramuscular, intradérmico). Em uma modalidade preferida, o anticorpo é administrado pela infusão ou injeção intravenosa. Em uma outra modalidade preferida, o anticorpo é administrado pela injeção intramuscular, intradérmica ou subcutânea.
[0176] As composições terapêuticas tipicamente devem ser esté reis e estáveis sob as condições de fabricação e armazenagem. A composição pode ser formulada como uma solução, torta liofilizada, pó seco, microemulsão, dispersão, lipossoma ou outra estrutura ordenada adequada para concentração de fármaco alta. As soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas incorporando-se o anticorpo anti- MAdCAM na quantidade requerida em um solvente apropriado com um ou uma combinação dos ingredientes enumerados acima, como requerido, seguida pela esterilização. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, os métodos preferidos de preparação são a secagem a vácuo e secagem por congelamento que produz um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente desejado adicional de uma solução previamente estéril deste. No geral, as dispersões são preparadas incorporando-se o composto ativo em um veículo estéril que contém um meio de dispersão básico e os outros in-gredientes requeridos daqueles enumerados acima. As características desejadas de uma solução pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de tensoativos e o tamanho de partícula requerido no caso de dispersão pelo uso de tensoativos, fosfolipídeos e polímeros. A absorção prolongada de composições injetáveis pode ser realizada incluindo-se na composição um agente que retarde a absorção, por exemplo, sais de monoestearato, materiais poliméricos, óleos e gelatina.
[0177] Os anticorpos da presente invenção podem ser administra dos por uma variedade de métodos conhecidos na técnica, embora para muitas aplicações terapêuticas, a via/modo preferidos de administração é a infusão subcutânea, intramuscular, intradérmica ou intravenosa. Como será avaliado pelo versado na técnica, a via e/ou modo de administração variará dependendo dos resultados desejados.
[0178] Em certas modalidades, as composições de anticorpo po dem ser preparadas com um veículo que protegerá o anticorpo contra a liberação rápida, tal como uma formulação de liberação controlada, incluindo implantes, emplastros transdérmicos e sistemas de liberação microencapsulada. Polímeros biodegradáveis, biocompatíveis podem ser usados, tais como etileno acetato de vinila, polianidretos, ácido po- liglicólico, colágeno, poliortoésteres e ácido polilático. Muitos métodos para a preparação de tais formulações são patenteados ou no geral conhecidos por aqueles versados na técnica. Ver, por exemplo, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems (J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., Nova Iorque (1978)).
[0179] Em certas modalidades, um anticorpo anti-MAdCAM da in venção pode ser oralmente administrado, por exemplo, com um diluen- te inerte ou um veículo comestível assimilável. O composto (e outros ingredientes, se desejado) também pode ser fechado em uma cápsula de gelatina de casca dura ou mole, prensado em comprimidos ou incorporados diretamente na dieta do paciente. Para a administração terapêutica oral, os anticorpos anti-MAdCAM podem ser incorporados com excipientes e usados na forma de comprimidos ingeríveis, comprimidos bucais, comprimidos, cápsulas, elixires, suspensões, xaropes, pastilha e outros. Para administrar um composto da invenção por outra administração que não a parenteral, pode ser necessário revestir o composto com ou co-administrar o composto com, um material para prevenir a sua inativação.
[0180] As composições da invenção podem incluir uma "quantida de terapeuticamente eficaz" ou uma "quantidade profilaticamente eficaz" de um anticorpo ou porção de ligação de antígeno da invenção. Uma "quantidade terapeuticamente eficaz" refere-se a uma quantidade eficaz, nas dosagens e por períodos de tempo necessários, para obter o resultado terapêutico desejado. Uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo ou porção de anticorpo pode variar de acordo com fatores, tais como o estado de doença, idade, sexo e peso do indivíduo e a capacidade do anticorpo ou porção de anticorpo para evocar uma resposta desejada no indivíduo. Uma quantidade terapeuticamente eficaz também é uma em que quaisquer efeitos tóxicos ou nocivos do anticorpo ou porção de anticorpo são excedidos pelos efeitos terapeu- ticamente benéficos. Uma "quantidade profilaticamente eficaz" refere- se a uma quantidade eficaz, em dosagens e por períodos de tempo necessários, para se obter o resultado profilático desejado. Tipicamente, visto que uma dose profilática é usada em pacientes antes ou em um estágio inicial de doença, a quantidade profilaticamente eficaz pode ser menos do que a quantidade terapeuticamente eficaz.
[0181] Os regimes de dosagem podem ser ajustados para fornecer a resposta ótima desejada (por exemplo, uma resposta terapêutica ou profilática). Por exemplo, um único bólus pode ser administrado, várias doses divididas podem ser administradas com o tempo ou a dose pode ser proporcionalmente reduzida ou aumentada como indicado pelas exigências da situação terapêutica. É especialmente vantajoso formular as composições parenterais na forma unitária de dosagem para facilidade de administração e uniformidade de dosagem. A forma unitária de dosagem como aqui usada refere-se às unidades fisicamente separadas adaptadas como dosagens unitárias para os pacientes mamíferos a serem tratados; cada unidade contendo uma quantidade predeterminada de composto ativo calculada para produzir o efeito terapêutico desejado em associação com o veículo farmacêutico requerido. As especificações para as formas unitárias de dosagem da invenção são ditadas pelas (a) características únicas do anticorpo anti-MAdCAM ou porção deste e do efeito terapêutico ou profilático particular a ser alcançado e (b) as limitações inerentes na técnica de combinar um tal anticorpo para o tratamento da sensibilidade em indivíduos, e diretamente dependente destes.
[0182] Uma faixa exemplar, não limitante para uma quantidade terapêutica ou profilaticamente eficaz de um anticorpo ou porção de anticorpo da invenção é de 0,025 a 50 mg/kg, mais preferivelmente de 0,1 a 50 mg/kg, mais preferivelmente de 0,1 a 25, 0,1 a 10 ou 0,1 a 3 mg/kg. Em algumas modalidades, uma formulação contém 5 mg/ml de anticorpo em um tampão de acetato de sódio a 20 mM, pH 5,5, 140 mM de NaCl e 0,2 mg/ml de polissorbato 80. Deve ser mencionado que os valores de dosagem podem variar com o tipo e severidade da condição a ser aliviada. Deve ser ainda entendido que para qualquer paciente particular, os regimes de dosagem específicos devem ser ajustados com o tempo de acordo com a necessidade individual e o julgamento profissional da pessoa que administra ou supervisiona a administração das composições e que as faixas de dosagem aqui apresentadas são apenas exemplares e não são intencionadas a limitar o escopo ou prática da composição reivindicada.
[0183] Um outro aspecto da presente invenção fornece kits que compreendem um anticorpo anti-MAdCAM ou porção de anticorpo da invenção ou uma composição que compreenda um tal anticorpo. Um kit pode incluir, além do anticorpo ou composição, agentes de diagnóstico ou terapêuticos. Um kit também pode incluir instruções para o uso em um método de diagnóstico ou terapêutico. Em uma modalidade preferida, o kit inclui o anticorpo ou uma composição que o compreenda e um agente de diagnóstico que possa ser usado em um método descrito abaixo. Em uma outra modalidade preferida, o kit inclui o anticorpo ou uma composição que o compreenda e um ou mais agentes terapêuticos que possam ser usados em um método descrito abaixo.
Terapia de Gene
[0184] As moléculas de ácido nucléico da presente invenção po dem ser administradas a um paciente em necessidade deste por intermédio da terapia de gene. A terapia pode ser in vivo ou ex vivo. Em uma modalidade preferida, as moléculas de ácido nucléico que codificam tanto uma cadeia pesada quanto uma cadeia leve são administradas a um paciente. Em uma modalidade mais preferida, as molécu- las de ácido nucléico são administradas tal que elas sejam estavel- mente integradas nos cromossomas de células B porque estas células são especializadas para produzir anticorpos. Em uma modalidade preferida, as células B precursoras são transfectadas ou infectadas ex vivo e re-transplantadas em um paciente em necessidade deste. Em uma outra modalidade, as células B precursoras ou outras células são infectadas in vivo usando um vírus recombinante conhecido por infectar o tipo de célula de interesse. Os vetores típicos usados para a terapia de gene incluem lipossomas, plasmídeos e vetores virais. Os vetores virais exemplares são retrovírus, adenovírus e vírus adeno- associados. Depois da infecção in vivo ou ex vivo, os níveis de expressão de anticorpo podem ser monitorados tomando-se uma amostra do paciente tratado e usando qualquer imunoensaio conhecido na técnica ou aqui debatido.
[0185] Em uma modalidade preferida, o método da terapia de ge ne compreende as etapas de administrar uma molécula de ácido nu- cléico isolada que codifica a cadeia pesada ou uma porção de ligação de antígeno desta de um anticorpo anti-MAdCAM e que expresse a molécula de ácido nucléico. Em uma outra modalidade, o método da terapia de gene compreende as etapas de administrar uma molécula de ácido nucléico que codifica a cadeia leve ou uma porção de ligação de antígeno desta de um anticorpo anti-MAdCAM e que expresse a molécula de ácido nucléico. Em um método mais preferido, o método da terapia de gene compreende as etapas de administração de uma molécula de ácido nucléico isolada que codifica a cadeia pesada ou uma porção de ligação de antígeno desta e uma molécula de ácido nucléico isolada que codifica a cadeia leve ou a porção de ligação de antígeno desta de um anticorpo anti-MAdCAM da invenção e que expresse as moléculas de ácido nucléico. O método da terapia de gene também pode compreender a etapa de administrar um outro agente antiinflamatório ou imunomodulatório.
Métodos de Uso em Diagnóstico
[0186] Os anticorpos anti-MAdCAM podem ser usados para detec tar MAdCAM em uma amostra biológica in vitro ou in vivo. Os anticorpos anti-MAdCAM podem ser usados em um imunoensaio convencional, incluindo, sem limitação, um ELISA, um RIA, FACS, imunoisto- química de tecido, Western blot ou imunoprecipitação. Os anticorpos anti-MAdCAM da invenção podem ser usados para detectar MAdCAM de seres humanos. Em uma outra modalidade, os anticorpos anti- MAdCAM podem ser usados para detectar MAdCAM de primatas Old World, tais como macacos cinomolgo e rhesus, chimpanzés e bugios. A invenção fornece um método para detectar MAdCAM em uma amostra biológica que compreende contatar uma amostra biológica com um anticorpo anti-MAdCAM da invenção e detectar o anticorpo ligado a MAdCAM. Em uma modalidade, o anticorpo anti-MAdCAM é diretamente derivatizado com um rótulo detectável. Em uma outra modalidade, o anticorpo anti-MAdCAM (o primeiro anticorpo) não é rotulado e um segundo anticorpo ou outra molécula que possam ligar-se ao anticorpo anti-MAdCAM são rotulados. Como é bem conhecido a uma pessoa versada na técnica, um segundo anticorpo é escolhido que é capaz de ligar especificamente as espécies e classes específicas do primeiro anticorpo. Por exemplo, se o anticorpo anti-MAdCAM é uma IgG humana, então o anticorpo secundário pode ser um anti-IgG humano. Outras moléculas que pode se ligar aos anticorpos incluem, sem limitação, Proteína A e Proteína G, ambas das quais são comercialmente disponíveis, por exemplo, da Pierce Chemical Co.
[0187] Os rótulos adequados para o anticorpo ou secundário foram divulgados acima e incluem várias enzimas, grupos protéticos, materiais fluorescentes, materiais luminescentes, agentes magnéticos e materiais radioativos. Os exemplos de enzimas adequadas incluem rába- no peroxidase, fosfatase alcalina, β-galactosidase ou acetilcolinestera- se; os exemplos de complexos de grupo protéticos adequados incluem estreptavidina/biotina e avidina/biotina; os exemplos de materiais fluo-rescentes adequados incluem umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceína, cloreto de dansila ou ficoeritrina; um exemplo de um material luminescente inclui luminol; um exemplo de um agente magnético inclui gadolínio; e exemplos de material radioativo adequado inclui 125I, 131I, 35S ou 3H.
[0188] Em uma modalidade alternativa, MAdCAM pode ser ensai ada em uma amostra biológica por um imunoensaio de competição utilizando padrões de MAdCAM rotulados com uma substância detec- tável e um anticorpo anti-MAdCAM não rotulado. Neste ensaio, a amostra biológica, os padrões de MAdCAM rotulados e o anticorpo anti-MAdCAM são combinados e a quantidade de padrão de MAdCAM rotulado ligado ao anticorpo não rotulado é determinada. A quantidade de MAdCAM na amostra biológica é inversamente proporcional à quantidade de padrão MAdCAM rotulado ligado ao anticorpo anti- MAdCAM.
[0189] Pode-se usar os imunoensaios divulgados acima para vá rios propósitos. Em uma modalidade, os anticorpos anti-MAdCAM podem ser usados para detectar MAdCAM em células em cultura celular. Em uma modalidade preferida, os anticorpos anti-MAdCAM podem ser usados para determinar o nível de expressão de MAdCAM de superfície celular depois do tratamento da células com vários compostos. Este método pode ser usado para testar compostos que podem ser usados para ativar ou inibir MAdCAM. Neste método, uma amostra de células é tratada com um composto de teste por um período de tempo enquanto uma outra amostra é deixada sem tratar, a expressão de superfície celular pode ser depois determinada pela citometria de fluxo, imunoistoquímica, Western blot, ELISA ou RIA. Além disso, os imuno- ensaios podem ser dimensionados para a triagem de alto rendimento de modo a testar um número grande de compostos quanto a sua ativação ou inibição de MAdCAM.
[0190] Os anticorpos anti-MAdCAM da invenção também podem ser usados para determinar os níveis de MAdCAM em um tecido ou em células derivadas do tecido. Em uma modalidade preferida, o tecido é um tecido doente. Em uma modalidade mais preferida, o tecido é do trato gastrointestinal inflamado ou uma biópsia deste. Em uma modalidade preferida do método, um tecido ou uma biópsia deste são excisa- dos de um paciente. O tecido ou biópsia são depois usados em um imunoensaio para determinar, por exemplo, os níveis de MAdCAM, níveis de superfície celular de MAdCAM ou localização de MAdCAM pelos métodos debatidos acima. O método pode ser usado para determinar se um tecido inflamado expressa MAdCAM em um alto nível.
[0191] O método de diagnóstico descrito acima pode ser usado para determinar se um tecido expressa níveis altos de MAdCAM, que podem ser indicativos de que o tecido responderá bem ao tratamento com anticorpo anti-MAdCAM. Além disso, o método de diagnóstico também pode ser usado para determinar se tratamento com anticorpo anti-MAdCAM (ver abaixo) faz com que um tecido expresse níveis mais baixos de MAdCAM e assim pode ser usado para determinar se o tratamento é bem sucedido.
[0192] Os anticorpos da presente invenção também podem ser usados in vivo para localizar tecidos e órgãos que expressem MAd- CAM. Em uma modalidade preferida, os anticorpos anti-MAdCAM podem ser usados para localizar tecido inflamado. A vantagem dos anticorpos anti-MAdCAM da presente invenção é que eles não gerarão uma resposta imune na administração. O método compreende as etapas de administrar um anticorpo anti-MAdCAM ou uma composição farmacêutica deste a um paciente em necessidade de um tal teste de diagnóstico e submeter o paciente à análise de formação de imagem para determinar a localização dos tecidos que expressam MAdCAM. A Análise de formação de imagem é bem conhecida na técnica médica e inclui, sem limitação, análise de raios X, cintigrafia gama, formação de imagem pela ressonância magnética (MRI), tomografia de emissão de pósitron ou tomografia computadorizada (CT). Em uma outra modalidade do método, uma biópsia é obtida do paciente para determinar se o tecido de interesse expressa MAdCAM ao invés de submeter o paciente à análise de formação de imagem. Em uma modalidade preferida, os anticorpos anti-MAdCAM podem ser rotulados com um agente de- tectável que pode ser formado em imagem em um paciente. Por exemplo, o anticorpo pode ser rotulado com um agente de contraste, tal como bário, que pode ser usado para a análise de raios X ou um agente de contraste magnético, tal como um quelato de gadolínio, que pode ser usado para MRI ou CT. Outros agentes de rotulação incluem, sem limitação, radioisótopos, tais como 99Tc. Em uma outra modalidade, o anticorpo anti-MAdCAM não será rotulado e será formado em imagem pela administração de um segundo anticorpo ou outra molécula que seja detectável e que pode ligar o anticorpo anti-MAdCAM.
[0193] Os anticorpos anti-MAdCAM da invenção também podem ser usados para determinar os níveis de MAdCAM solúveis presentes no sangue, soro, plasma ou outro biofluido do doador, incluindo, mas não limitado a, amostras de fezes, urina, escarro ou biópsia. Em uma modalidade preferida, o biofluido é plasma. O biofluido é depois usado em um imunoensaio para determinar níveis de MAdCAM solúveis. A MAdCAM solúvel pode ser um marcador substituto para a inflamação gastrointestinal adiantada e o método de detecção pode ser usado como um marcador de diagnóstico para mediar a gravidade da doença.
[0194] O método de diagnóstico descrito acima pode ser usado para determinar se um indivíduo expressa níveis altos de MAdCAM solúvel, que podem ser indicativos de que o indivíduo responderá bem ao tratamento com um anticorpo anti-MAdCAM. Além disso, o método de diagnóstico também pode ser usado para determinar se o tratamento com anticorpo anti-MAdCAM (ver abaixo) ou outro agente farmacêutico da doença faz com que um indivíduo expresse níveis mais baixos de MAdCAM e assim pode ser usado para determinar se o tratamento é bem sucedido
Inibição da adesão dependente de α4β 7/MAdCAM pelo anticorpo anti- MAdCAM:
[0195] Em uma outra modalidade, a invenção fornece um anticor po anti-MAdCAM que liga MAdCAM e inibe a ligação e adesão de células que carregam α4β7-integrina para MAdCAM ou outros ligandos cognatos, tais como L-selectina, para MAdCAM. Em uma modalidade preferida, a MAdCAM é humana e é uma forma solúvel ou expressada na superfície de uma célula. Em uma outra modalidade preferida, o anticorpo anti-MAdCAM é um anticorpo humano. Em uma outra modalidade, o anticorpo ou porção deste inibe a ligação entre α4β7c e MAd- CAM com um valor de IC50 de não mais do que 50 nM. Em uma modalidade preferida, o valor IC50 não é maior do que 5 nM. Em uma modalidade mais preferida, o valor IC50 é menor do que 5 nM. Em uma modalidade mais preferida, o valor IC50 é menor do que 0,05 μg/ml, 0,04 μg/ml ou 0,03 μg/ml. Em uma outra modalidade preferida o valor IC50 é menor do que 0,5 μg/ml, 0,4 μg/ml ou 0,3 μg/ml. O valor IC50 pode ser medido por qualquer método conhecido na técnica. Tipicamente, um valor IC50 pode ser medido pelo ELISA ou ensaio de adesão. Em uma modalidade preferida, o valor IC50 é medido pelo ensaio de adesão usando células ou tecido que expressam nativamente MAdCAM ou células ou tecido que foram engendrados para expressar MAdCAM.
Inibição do recrutamento de linfócito para tecido linfóide associado com o intestino pelos anticorpos anti-MAdCAM
[0196] Em uma outra modalidade, a invenção fornece um anticor po anti-MAdCAM que liga MAdCAM nativamente expressa e inibe a ligação de linfócitos ao tecido linfóide gastrointestinal especializado. Em uma modalidade preferida, a MAdCAM nativamente expressada é MAdCAM humana ou de primata e é uma forma solúvel ou expressada na superfície de uma célula. Em uma outra modalidade preferida, o anticorpo anti-MAdCAM é um anticorpo humano. Em uma outra modalidade, o anticorpo ou porção deste inibe o recrutamento de linfócitos α4β7 intestino-tróficos para os tecidos que expressam MAdCAM com um valor IC50 de não mais do que 5 mg/kg. Em uma modalidade preferida, o valor IC50 não é maior do que 1 mg/kg. Em uma modalidade mais preferida, o valor IC50 é menor do que 0,1 mg/kg. Em uma modalidade, o valor IC50 pode ser determinado medindo-se a relação de efeito da dose de recrutamento de linfócitos do sangue periférico rotulado com tecnécio para o trato gastrointestinal usando cintigrafia gama ou tomografia computadorizada de emissão de fóton único. Em uma outra modalidade, o valor IC50 pode ser determinado pela medição do aumento nos linfócitos α4β7π intestino-trófico, tal como, mas não limitado a, células T de memória de α4β7 CD4+, na circulação periférica usando citometria de fluxo como uma função da dose de anticorpo an- ti-MAdCAM.
[0197] De modo que esta invenção possa ser melhor entendida, os seguintes exemplos são apresentados. Estes exemplos são apenas para os propósitos de ilustração e não devem ser interpretados como limitando o escopo da invenção de nenhuma maneira.
Exemplo 1: Geração de hibridomas que produzem anti-MAdCAM
[0198] Os anticorpos da invenção foram preparados, ensaiados e selecionados de acordo com o presente Exemplo
Preparação de Imunógeno Primário:
[0199] Dois imunógenos foram preparados para a imunização dos camundongos XenoMouse®: (i) uma proteína de fusão MAdCAM-IgGi Fc e (ii) membranas celulares preparadas a partir de células estavel- mente transfectadas com MAdCAM. (i) Proteína de Fusão MAdCAM-IgG1 Fc
Construção de Vetor de Expressão:
[0200] Um fragmento de cDNA EcoRI/BglII que codifica o domínio maduro extracelular, equivalente à imunoglobulina de MAdCAM foi ex- cisado de um clone pINCY Incyte (3279276) e clonado em sítios Eco- RI/BamHI do vetor pIG1 (Simmons, D. L. (1993) em Cellular Interactions in Development: A Practical Method, ed. Hartley, D. A. (Oxford Univ. Press, Oxford), pp. 93-127.)) para gerar uma fusão IgG1 Fc na matriz. O inserto resultante foi excisado com EcoRI/NotI e clonado no pCDNA3,1+ (Invitrogen). O cDNA MAdCAM-IgG1 Fc no vetor foi confirmado na seqüência. A seqüência de aminoácido da proteína de fusão MAdCAM-IgG1 Fc é mostrada abaixo: Proteína de Fusão MAdCAM-IgG1 Fc: MDFGLALLLAGLLGLLLGQSLQVKPLQVEPPEPVVAVALGASR- QLTCRLACADRGASVQWRGLDTSLGAVQSDTGRSVLTVRNASL- SAAGTRVCVGSCGGRTFQHTVQLLVYAFPDQLTVSPAALVPGDPE- VACTAHKVTPVDPNALSFSLLVGGQELEGAQALG- PEVQEEEEEPQGDEDVLFRVTERWRLPPLGTPVPPALYCQATMRL- PGLELSHRQAIPVLHSPTSPEPPDTTSPESPDTTSPESPDTTSQEPP- DTTSQEPPDTTSQEPPDTTSPEPPDKTSPEPAPQQGSTHTPRS- PGSTRTRRPEIQPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPK- DTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPRE- EQYNSTIRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA- KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN- GQPENNYKATPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN- VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 107) Sublinhado: peptídeo de sinal Negrito: domínio extracelular de MAdCAM
Expressão/Purificação de Proteína Recombinante:
[0201] As células CHO-DHFR foram transfectadas com vetor pCDNA3,1+ contendo cDNA de proteína de fusão MAdCAM-IgG1 Fc e clones estáveis que expressem proteína de fusão MAdCAM-IgG1 Fc selecionado em meio de Iscove contendo 600 μg/ml de G418 e 100 ng/ml de metotrexato. Para a expressão de proteína, um biorreator de fibra oca foi semeado com células CHO que expressam estavelmente MAdCAM-IgG1 Fc em meio de Iscove contendo 10 % de soro bovino fetal de IgG baixo (Gibco), aminoácidos não essenciais (Gibco), 2 mM de glutamina (Gibco), piruvato de sódio (Gibco), 100 μg/ml de G418 e 100 ng/ml de metotrexato e usado para gerar sobrenadante de meio concentrado. A proteína de fusão MAdCAM-IgG1 Fc foi purificada a partir do sobrenadante colhido pela cromatografia de afinidade. Em resumo, o sobrenadante foi aplicado a uma coluna HiTrap Proteína G Sepharose (5 ml, Pharmacia) (2 ml/min), lavado com 25 mM de Tris pH 8, 150 mM de NaCl (5 volumes de coluna) e eluído com 100 mM de glicina pH 2,5 (1 ml/min), imediatamente frações neutralizantes para o pH 7,5 com Tris 1 M pH 8. As frações contendo proteína de fusão MAdCAM-IgG1 Fc foram identificados pela SDS-PAGE, reunidas juntas e aplicadas a uma coluna Sephacril S100 (Pharmacia), pré-equilibrada com 35 mM de BisTris pH 6,5, 150 mM de NaCl. A filtração em gel foi realizada a 0,35 ml/min, coletando um pico de proteína de fusão MAd- CAM-IgG1 Fc em frações de cerca de 3 x 5 ml. Estas amostras foram reunidas e aplicadas a uma coluna Resource Q (6 ml, Pharmacia), pré- equilibrada em 35 mM de Bis Tris pH 6,5. A coluna foi lavada com 5 volumes de coluna de 35 mM de Bis Tris pH 6,5, 150 mM de NaCl (6 ml/min) e proteína de fusão MAdCAM-IgG1 Fc eluída em uma fração de 4 a 6 ml com 35 mM de Bis Tris pH 6,5, 400 mM de NaCl. Neste estágio a proteína foi 90 % pura e migrando como uma faixa única em aproximadamente 68 kD pela SDS-PAGE. Para o uso como um imunógeno e todos os ensaios subsequentes, o material foi trocado de tampão em 25 mM de HEPES pH 7,5, 1 mM de EDTA, 1 mM de DTT, 100 mM de NaCl, 50 % de glicerol e armazenado como alíquotas a - 80oC. (ii) Membranas Celulares que expressam estavelmente MAdCAM
[0202] Um fragmento SacI/NotI que compreende os nucleotídeos 645-1222 da seqüência MAdCAM publicada (Shyjan AM, et al., J Immunol., 156, 2851-7 (1996)) foi amplificado por PCR a partir de uma biblioteca de cDNA colônico e clonado nos sítios SacI/NotI do vetor pIND-Hygro (Invitrogen). Um fragmento SacI, que compreende a se- qüência codificadora 5' adicional foi subclonado neste construto a partir de pCDNA3.1 MAdCAM-IgG1 Fc, para gerar o cDNA de MAdCAM de tamanho natural. Um fragmento KpnI/NotI contendo o cDNA de MAdCAM foi depois clonado nos sítios correspondentes em um vetor pEF5FRTV5GWCAT (Invitrogen) e substituindo a seqüência codificadora CAT. O inserto de cDNA foi verificado quanto a seqüência e usado em transfecções para gerar clones únicos que expressam estavel- mente em células FlpIn NIH 3T3 (Invitrogen) pela tecnologia de Flp recombinase, de acordo com as instruções do fabricante. Os clones que expressam estavelmente foram selecionados pela sua capacidade para suportar a ligação de uma linhagem celular de linfoblastóide B humano α4βy+ JY (Chan BM, et al, J. Biol. Chem., 267: 8366-70 (1992)), resumido abaixo. Os clones estáveis de células CHO que expressam MAdCAM foram preparados do mesmo modo, usando células CHO FlpIn (Invitrogen).
[0203] As células FlpIn NIH-3T3 que expressam MAdCAM foram cultivadas em Meio de Eagles modificado de Dulbecco (Gibco), con- tendo 2 mM de L-glutamina, 10 % de soro de bezerro Doador (Gibco) e 200 μg/ml de Higromicina B (Invitrogen) e expandidos em frascos rolantes. As células FlpIn CHO que expressam MAdCAM foram cultivadas em F12 de Ham/Meio de Eagles modificado de Dulbecco (Gib- co), contendo 2 mM de L-glutamina, 10 % de soro de bezerro Doador (Gibco) e 350 μg/ml de Higromicina B (Invitrogen) e expandidos em frascos rolantes. As células foram colhidas pelo uso de uma solução de dissociação célula não enzimática (Sigma) e raspando, lavando em solução salina tamponada com fosfato pela centrifugação. As membranas de célula foram preparadas a partir do pélete de célula pelas duas rodadas de homogeneização em politron em 25 mM de Bis Tris pH 8, 10 mM de MgCl2, 0,015 % (p/v) de aprotinina, 100 U/ml de baci- tracina e centrifugação. O pélete final foi recolocado em suspensão no mesmo tampão e 50 x 106 equivalentes celulares aliquotados em ep- pendorfs de parede espessa e girados a >100.000 g para gerar péletes de membrana celular para as imunizações de camundongos Xeno- Mouse. O sobrenadante foi decantado e as membranas foram armazenadas em eppendorfs a -80o C até necessárias. A confirmação da expressão de proteína nas membranas celulares foi determinada pela SDS-PAGE e Western blotting com um anticorpo antipeptídeo de coelho incitado contra os resíduos de terminal N de MAdCAM ([C]- KPLQVEPPEP).
Imunização e geração de hibridoma:
[0204] Camundongos XENOMOUSE® de oito a dez semanas de idade foram imunizados intraperitonealmente ou nas suas almofadas da pata traseira com a proteína de fusão MAdCAM-IgG1 Fc recombi- nante purificada (10 μg/dose/camundongo) ou membranas celulares preparadas a partir de células MAdCAM-CHO ou NIH 3T3 que expressam estavelmente (10 x 106 células/dose/camundongo). Esta dose foi repetida cinco a sete vezes em um período de três a oito semanas. Quatro dias antes da fusão, os camundongos receberam uma injeção final do domínio extracelular de MAdCAM humano em PBS. Linfócitos do baço e linfônodo de camundongos imunizados foram fundidos com a linhagem celular P3-X63-Ag8.653 de mieloma não secretor e foram submetidos à seleção HAT como previamente descrito (Galfre e Mils- tein, Methods Enzymol. 73: 3-46 (1981)). Um painel de hibridomas todos anticorpos IgG2K e IgG4K humanos específicos que secretam MAdCAM foram recuperados e subclonados. Doze subclones de hibri- doma, 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4 e 9.8.2, produzindo anticorpos monoclonais específicos para MAdCAM foram recuperados e detectados com os ensaios descritos abaixo. As linhagens precursoras 1.7, 1.8, 6.14, 6.22, 6.34, 6.67, 6.73, 6.77, 7.16, 7.20, 7.26 e 9.8, das quais as linhagens de hibridoma de subclone, 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 7.16.7, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4 e 9.8.2, foram derivadas todas tiveram atividade anti-MAdCAM.
Ensaios de ELISA:
[000205] A detecção de anticorpos específicos de antígeno em soro e sobrenadante de hibridoma de camundongo foi determinada pelo ELISA como descrito (Coligan et al., Unit 2.1 "Enzyme-linked immunosorbent assays," em Current Protocols in Imunology (1994)) usando proteína de fusão MAdCAM-IgG1 Fc para capturar os anticorpos. Para os animais que foram imunizados com proteína de fusão MAdCAM- IgG1 Fc, os anticorpos foram triados quanto a reatividade não específica contra IgG1 humano e quanto a capacidade para ligar às células FlpIn CHO MAdCAM pela citometria de fluxo.
[000206] Em um ensaio ELISA preferido, as seguintes técnicas são usadas:
[000207] Placas de ELISA foram revestidas durante a noite a 4oC com 100 μl/cavidade de fusão MAdCAM-IgGi Fc (4,5 μg/ml) em placa contendo tampão (100 mM de tampão de carbonato/bicarbonato de sódio pH 9,6). Depois da incubação, o tampão de revestimento foi removido e a placa bloqueada com 200 μl/cavidade de tampão de bloqueio (5 % de BSA, 0,1 % de Tween 20, em solução salina tamponada com fosfato) e incubado na temperatura ambiente por 1 hora. O tampão de bloqueio foi removido e 50 μl/cavidade de sobrenadante de hi- bridoma ou outro soro ou sobrenadante (por exemplo, controle positivo) adicionado por 2 horas na temperatura ambiente. Depois da incubação a placa foi lavada com PBS (3 x 100 μl/cavidade) e a ligação do hibridoma mAb detectado com anticorpos secundários conjugados com HRP (isto é, 1:1000 IgG2-HRP anti-humano de camundongo (SB Cat. No 9060-05) para anticorpos IgG2 ou 1:1000 IgG4-HRP anti- humano de camundongo (Zymed Cat. No 3840) para anticorpos IgG4) diluído em PBS. As placas foram incubadas na temperatura ambiente por 1 hora, lavadas em PBS (3 x 100 μl/cavidade) e finalmente desenvolvidos com 100 μl de OPD (o-fenilenodiamina (DAKO S2405) + 5 μl de H2O2 30 %/12 ml). As placas foram deixadas desenvolver 10 a 20 mins, interrompendo a reação com 100 μl de H2SO4 2 M. As placas foram lidas a 490 nm.
Ensaios de adesão:
[000208] Os anticorpos que demonstraram ligação à proteína de fusão MAdCAM-IgG1 Fc pelo ELISA, foram ensaiados quanto a atividade antagonista em um ensaio de adesão com células α4β 7+ JY e (i) proteína de fusão MAdCAM-IgG1 Fc ou (ii) células MAdCAM-CHO.
(i) Ensaio de fusão MAdCAM-IgG1 Fc
[000209] 100 μl de uma solução 4,5 μg/ml de proteína de fusão MAdCAM-IgG1 Fc purificada em PBS de Dulbecco foram adsorvidos em placas de 96 cavidade Black Microfluor "B" de fundo em u (Dynex #7805) durante a noite a 4o C. As placas revestidas com MAdCAM foram depois invertidas e o líquido em excesso absorvido em mata- borrão, antes de bloquear a 37o C por pelo menos 1 hora em BSA a 10 %/PBS. Durante este tempo as células JY cultivadas foram contadas usando a exclusão em azul de triptano (deve ser aproximadamente 8 x 105 células/ml) e 20 x 106 células/placa de ensaio pipetadas em um tubo de centrífuga 50 ml de tubo de centrífuga. As células JY foram cultivadas em meio RPMI1640 (Gibco), contendo 2 mM de L-glutamina e 10 % de soro bovino fetal inativado por calor (Life Technologies #10108-165) e semeadas a 1 a 2 x 105/ml a cada 2 a 3 dias para impedir a cultura de diferenciar. As células foram lavadas duas vezes com meio RPMI 1640 (Gibco) contendo 2 mM de L-glutamina (Gibco) pela centrifugação (240 g), recolocando em suspensão o pélete de célula final a 2 x 106 células/ml em RPMI 1640 para a carga de Calceína AM. A Calceína AM (Molecular Probes #C-3099) foi adicionada às células como uma diluição 1:200 em DMSO (concentração final de cerca de 5 μM) e as células protegidas da luz durante o curso da incubação (37o C por 30 min). Durante esta etapa de incubação de célula os anticorpos a serem testados, foram diluídos como segue: para testar a dose única, os anticorpos foram completados a 3 μg/ml (1 μg/ml final) em 0,1 mg/ml de BSA (Sigma # A3059) em PBS; para as curvas de IC50 completas, os anticorpos foram diluídos em 0,1 mg/ml de BSA/PBS, com 3 μg/ml (1 μg/ml final) sendo a concentração de topo, depois de diluições de duplicação (relação 1:2) através da placa. A cavidade final da fileira foi usado para determinar a ligação total, de modo que 0,1 mg/ml de BSA em PBS fosse usado.
[000210] Depois de bloquear, os conteúdos da placa foram sacudidos e 50 μl de anticorpos/controles foram adicionados a cada cavidade e a placa incubada a 37° C por 20 min. Durante este tempo, as células JY carregadas com Calceína foram lavadas uma vez com meio RPMI 1640 contendo 10 % de soro bovino fetal e uma vez com 1 mg/ml de BSA/PBS pela centrifugação, recolocando em suspensão o pélete de célula final a 1 x 106/ml em 1 mg/ml de BSA/PBS. 100 μl de células foram adicionados a cada cavidade da placa de fundo em U, a placa selada, ligeiramente centrifugada (1000 rpm por 2 min) e a placa depois incubada a 37° C por 45 min. No final deste tempo, as placas foram lavadas com um lavador de placa Skatron e a fluorescência medida usando uma Leitora de Rótulo Múltiplo Wallac Victor2 1420 (excitação À 485 nm, emissão À 535 nm contagem de topo, 8 mm do fundo da placa, para 0,1 s com abertura de emissão normal). Para cada concentração de anticorpo, a adesão percentual foi expressa como uma porcentagem de resposta de fluorescência máxima na ausência de qualquer anticorpo menos a fluorescência associada com a ligação não específica. O valor IC50 é definido como a concentração de anticorpo anti-MAdCAM na qual a resposta de adesão é diminuída a 50 % da resposta na ausência de anticorpo anti-MAdCAM. Os anticorpos que foram capazes de inibir a ligação de células JY à fusão MAdCAM- IgG1 Fc com um valor IC50 <0,1 μg/ml, foram considerados ter atividade antagonista potente e foram avançadas para o ensaio de adesão em MAdCAM-CHO. Todos as doze das Abs testadas mostraram atividade antagonista potente (Tabela 3). Os anticorpos monoclonais 1.7.2, 1.8.2, 7.16.6, 7.20.5 e 7.26.4 foram derivados de linhagens de IgG2K e os anticorpos monoclonais 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1 e 9.8.2 foram derivados das linhagens IgG4K.
(ii) Ensaio de adesão celular de MAdCAM-CHO.
[000211] As células JY foram cultivadas como acima. As células CHO que expressam MAdCAM foram geradas com o construto de cDNA pEF5FRT MAdCAM e usando a tecnologia da Flp recombinase (Invitrogen) como descrita acima. Clones estáveis únicos de células CHO que expressam MAdCAM foram selecionados com base na sua capacidade para suportar a adesão de células JY e a ligação, pela ci- tometria de fluxo, do anticorpo antipeptídeo de coelho, incitado contra o término N de MAdCAM e descrito acima. As células CHO que expressam MAdCAM foram cultivadas em um meio DMEM/F12 (Gibco # 21331-020) contendo 2 mM de L-glutamina, 10 % de soro bovino fetal (Gibco) e 350 μg/ml de Higromicina B (Invitrogen), separação 1:5 a cada 2/3 dias. Para o ensaio de adesão, as células CHO que expressam MAdCAM foram semeadas a 4 x 104 células/cavidade em placas pretas de 96 cavidades - fundo claro (Costar # 3904) em 200 μl de meio de cultura e cultivadas durante a noite a 37o C/5 % de CO2.
[000212] No dia seguinte, o sobrenadante de hibridoma ou anticorpo monoclonal purificado foram diluídos de uma concentração de partida de 30 μg/ml (equivalente a uma concentração final de 10 μg/ml) em 1 mg/ml de BSA/PBS, como descrito acima. Para as placas de MAdCAM CHO, os conteúdos das placas foram sacudidos e 50 μl de anticor- pos/controles foram adicionados a cada cavidade e a placa incubada a 37OC por 20 min. A cavidade final da fileira foi usado para determinar a ligação total, de modo que 0,1 mg/ml de BSA em PBS fosse usado. Células JY carregadas com Calceína AM, a uma concentração final de 1 x 106/ml em 1 mg/ml de BSA/PBS, foram preparadas como acima, depois 100 μl adicionados à placa depois do período de incubação de 20 min com o anticorpo. A placa foi depois incubada a 37O C por 45 min, depois lavada em uma lavadora de placa Tecan (PW 384) e a fluo-rescência medida usando a leitora de placa Wallac como descrito acima. Para cada concentração de anticorpo, a adesão percentual foi expressada como uma porcentagem de resposta de fluorescência máxima na ausência de qualquer anticorpo menos a fluorescência associada com a ligação não específica. Os anticorpos que foram capazes de inibir a ligação de células JY às células MAdCAM CHO com um valor IC50 <1 μg/ml foram consideradas ter atividade antagonista potente. Como antes, o valor IC50 é definido como a concentração de anticorpo anti- MAdCAM na qual a resposta de adesão aumentou a 50 % da resposta na ausência de anticorpo anti-MAdCAM. As potências de IC50 para 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4 e 9.8.2 neste ensaio são descritas abaixo na Tabela 3. Tabela 3. Valores IC50 de anticorpos anti-MAdCAM exemplificados
Figure img0003
[000213 Para medir a potência antagonista de mAbs anti-MAdCAM em ensaios com base em fluxo, sob condições de tensão de cisalha- mento que são designados para imitar o ambiente microvascular nas vênulas endoteliais altas que servem o intestino associadas com tecido linfóide, as células CHO que expressam, MAdCAM foram plaquea- das em microlâminas de vidro (50 x 4 mm) e deixada aderir para formar uma monocamada confluente (cerca de 2,5 x 105 células). As células foram depois incubadas com mAb purificado por afinidade em uma faixa de concentrações (0,1 a 10 μg/ml) por 20 mins a 37°C, antes de serem conectadas ao sistema de ensaio de fluxo. Um isótipo emparelhado IgG2 ou IgG4 mAb (10 μg/ml) foi usado como um controle negativo. Os linfócitos de sangue periférico de doador normal (PBLs) foram perfusado na monocamada de célula a uma tensão de cisalha- mento constante de 0,05 Pa. Os experimentos foram gravados em vídeo e a adesão total de linfócitos (adesão rolante + firme) foi calculada. Todos os anticorpos monoclonais testados foram mostrados ser antagonistas potentes sob as condições descritas.
(iii) Ensaios de Stamper-Woodruff
[000214] Para visualizar vasos MAdCAM+, mAb anti-MAdCAM bioti- nilado foi gerado em 1 a 2 mg de proteína purificada por afinidade, usando um excesso de 20 molares de biotina-NHS (Pierce) em solução salina tamponada com fosfato, de acordo com as instruções do fabricante. A reação foi deixada depositar na temperatura ambiente (30 min) e dessalinizada com uma coluna PD-10 (Pharmacia) e a concentração de proteína determinada.
[000215] O linfônodo hepático normal foi removido de um órgão doador, instantaneamente congelado em nitrogênio líquido e armazenado a -70°C até o uso. 10 μm de seções criostáticas foram cortadas, secas ao ar em lâminas revestidas com poli-L lisina e fixadas em acetona antes do ensaio. As seções foram bloqueada usando um sistema blo- queador de avidina-biotina (DAKO) e depois incubado com mAb anti- MAdCAM biotinilado em uma faixa de concentrações (1 a 50 μg/ml) na temperatura ambiente (2 horas). Um isótipo emparelhado IgG2 ou IgG4 mAb (50 μg/ml) foi usado como um controle negativo e um anticorpo anti-β? bloqueador (50 μg/ml) como um controle positivo.
[000216] Os linfócitos sangüíneos periféricos, tirados de doadores normais, foram rotulados com um mAb CD2 anti-humano de camundongo (DAKO) para permitir a visualisação subsequente de células aderentes. 5 x 105 PBLs foram adicionados a cada seção de linfônodo e incubados por 30 min antes de ser suavemente enxaguado para evitar o descolamento de células aderentes. As seções foram depois re- fixadas em acetona e re-incubadas com mAb anti-MAdCAM biotinilada (10 μg/ml), seguido pelo mAb de cabra-anticamundongo biotinilado (para reconhecer PBLs rotulados com CD2 e vasos MAdCAM+ não tingidos) e depois streptABcomplex/HRP (DAKO). Finalmente vasos MAdCAM+ & PBLs rotulados com CD2 foram visualizados pela adição de substrato DAB (DAKO) às seções, com um produto de reação marrom mostrando áreas de tingimento positivo. A adesão de linfócito foi quantificado pela contagem do número de linfócitos que derem a 50 vasos MAdCAM-1+ de tratos portais, veias ou sinusóides. Os dados, expressados como valores médios, foram depois normalizados para a adesão percentual, usando a adesão de PBLs na ausência de qualquer anticorpo tomado como 100 %. Os dados foram compilados com base de n = 3 doadores PBL diferentes e para doadores de linfônodo hepático diferente. Os dados representativos para anticorpos mono- clonais purificados biotinilados 1.7.2 e 7.16.6 são representados na Figura 4 comparado com um bloqueio de controle de anticorpo anti-β7.
Ensaios de Seletividade:
[000217] VCAM e fibronectina são homólogos estruturais e de se- qüência próximos a MAdCAM. mAbs anti-MAdCAM purificados por afinidade foram ensaiados quanto a especificidade a MAdCAM determinando-se a sua capacidade para bloquear a ligação de células T Jur- kat α4β1+/α5β1+ (ATCC) à sua molécula de adesão celular cognata. 100 μl de uma solução 4,5 μg/ml de fragmento de ligação de célula de Fi- bronectina (110 Kd, Europa Bioproducts Ltd, Cat. No UBF4215-18) ou VCAM (Panvera) em PBS de Dulbecco foi adsorvido em placas de 96 cavidades Black Microfluor "B" fundo em u (Dynex #7805) durante a noite a 4o C. As placas revestidas foram depois invertidas e o líquido em excesso enxugado com mata-borrão, antes de bloquear a 37o C por pelo menos 1 hora em 10 % de BSA/PBS. Durante este tempo as células T Jurkat cultivadas foram contadas usando a exclusão em azul de triptano e carregado com corante de Calceína AM como previamen- te descrito para as células JY acima. Os anticorpos a serem testados, foram diluídos a partir de uma concentração principal de 10 μg/ml em 0,1 mg/ml de BSA em PBS. A cavidade final da fileira foi usada para determinar a ligação total, de modo que 0,1 mg/ml de BSA em PBS fosse usado. Echistatina (Bachem, Cat. No H-9010) preparada em PBS foi usada em uma concentração principal de 100 nM para bloquear a interação de α5β1/Fibronectina. Um mAb anti-CD106 (Clone 51-10C9, BD Pharmingen Cat. No 555645) em uma concentração principal de 1 μg/ml foi usado para bloquear a interação de α5β I/VCAM.
[000218] Depois de bloquear, os conteúdos da placa foram sacudidos e 50 μl de anticorpos/controles foram adicionados a cada cavidade e a placa incubada a 37° C por 20 min. as células T Jurkat carregadas com calceína foram lavadas uma vez como antes, recolocando em suspensão o pélete de célula final a 1 x 106/ml em 1 mg/ml de BSA/PBS. 100 μl de células foram adicionadas a cada cavidade da placa de fundo em U, a placa selada, ligeiramente centrifugada (1000 rpm por 2 min) e a placa depois incubada a 37° C por 45 min. No final deste tempo, as placas foram lavadas com um lavador de placa Skatron e a fluorescência medida usando uma Leitora de Rótulo Múltiplo Wallac Victor2 1420 (excitação À 485 nm, emissão À 535 nm conta do topo, 8 mm do fundo da placa, por 0,1 s com abertura de emissão normal). Para cada anticorpo, o grau de inibição é expressado abaixo por meio de ilustrações, na Tabela 4 (- inibição negligenciável de adesão, *** inibição completa da adesão). Todas as mAbs exemplificadas são antagonistas de anti-MAdCAM potentes e seletivos, demonstrando substancialmente mais do que 100 vezes de seletividade para MAd- CAM em relação à VCAM e fibronectina. Tabela 4. Seletividade comparativa de anticorpo anti-MAdCAM para MAdCAM em outras moléculas de adesão celular, Fibronectina e VCAM
Figure img0004
[000219] Os hibridomas foram depositados na European Collection of Cell Cultures (ECACC), H.P.A m CAMR, Porton Down, Salisbury, Wiltshire SP4 0JG em 9 de setembro de 2003 com os seguintes números de depósito:
Figure img0005
Exemplo II: Determinação das Constantes de Afinidade (Kd) de Anticorpos Mono- clonais Anti-MAdCAM Totalmente Humanos pelo BIAcore
[000220] Foram realizadas medidas de afinidade de anticorpos purificados pela ressonância de plasma de superfície usando o instrumento BIAcore 3000, seguindo os protocolos do fabricante.
Protocolo 1
[000221] Para realizar a análise cinética, uma superfície de anticorpo anti-humano de camundongo de alta densidade (IgG2 e IgG4) em um chip sensor CM5 BIAcore foi preparada usando a ligação de amina de rotina. Os sobrenadantes de hibridoma foram diluídos 10, 5, 2 vezes em tampão de condução HBS-P (10 mM de HEPES pH 7,4, 150 mM de NaCl, 0,005 % de Tensoativo P20) contendo 100 μg/ml de BSA e 10 mg/ml de carboximetildextrano ou usado puro. Cada mAb foi capturado em uma superfície separada usando um tempo de contato de 1 min e uma lavagem de 5 min para a estabilização da referência de mAb. A proteína de fusão MAdCAM-IgG1 Fc (141 nM) foi depois injetada em todas as superfícies por um minuto, seguida por uma dissociação de 3 min. Os dados foram normalizados para a quantidade de anticorpo capturado em cada superfície e avaliados com global fit Langmuir 1:1, usando modelos de desvio de referência disponíveis no software BIAevaluation fornecido pela BIAcore.
Protocolo 2
[000222] As mAbs purificadas por afinidade foram imobilizadas na camada de dextrano de um chip biossensor CM5 usando a ligação de amina. Os chips foram preparados usando tampão de acetato no pH 4,5 como o tampão de imobilização e as densidades de proteína de 2,5 a 5,5 kRU foram obtidas. As amostras de proteína de fusão MAd- CAM-IgG1 Fc em tampão de condução foram preparadas nas concentrações variando de 0,2 a 55 nM (uma solução 0 nM compreendendo apenas tampão de condução foi incluída como uma referência zero). As amostras foram randomizadas e injetadas em duplicata por 3 min cada através de 4 células de fluxo usando HBS-EP (10 mM de HEPES pH 7,4, 150 mM de NaCl, 3 mM de EDTA, 0,005 % de Tensoativo P20) como tampão de condução. Uma taxa de fluxo de 100 μl/min foi usada para minimizar as limitações de transporte de massa. A dissociação da proteína de fusão MAdCAM-IgG1 Fc foi monitorada por 180 mins, a superfície regenerada por uma injeção de 6 s de H3PO4 25 mM (50 μl/min) ou 10 mM (6.22.2), 20 mM (6.67.1, 6.73.2, 6.77.1) a 25 mM (6.34.2) e 45 mM de NaOH (6.14.2) e os dados analisados usando o pacote de software BIAevaluation (v 3.1).
[000223] A Tabela 5 lista as medições de afinidade para os anticorpos anti-MAdCAM representativos da presente invenção: Tabela 5. Determinação da constante de afinidade, Kd, pela ressonância de plasma de superfície (BIAcore)
Figure img0006
[000224] As análises cinéticas indicam que os anticorpos preparados de acordo com a invenção possuem afinidades altas e constantes de ligação fortes para o domínio extracelular de MAdCAM.
Exemplo III: Identificação de seletividade de epítopo e reatividade cruzada de espécies de mAbs anti-MAdCAM
[000225] Os anticorpos reconhecem epítopos expostos na superfície nos antígenos como regiões de seqüência linear (primária) ou seqüên- cia estrutural (secundária). Luminex epítopo binning, BIAcore binning e análise imunoistoquímica de espécie foram usadas em combinação, de modo a definir o panorama do epítopo funcional dos anticorpos an- ti-MAdCAM.
Epítopo Binning Com Base em Luminex:
[000226] Pérolas conjugadas com MxhlgG 2,3,4 (Calbiochem Ml 1427) foram ligadas ao anticorpo anti-MAdCAM primário desconhecido. Foi adicionado 150 μL de diluição de anticorpo primário desconhecido (0,1 μg/ml diluído em meio de hibridoma) a cavidade de uma placa de cultura de tecido de 96 cavidades. O estoque de pérola foi suavemente turbilhonado e diluído no sobrenadante a uma concentração de 0,5 x 105 pérolas/ml. As pérolas foram incubadas no sobrenadante em um agitador durante a noite no escuro a 4°C.
[000227] Cada cavidade de uma placa de filtro microtituladora de 96 cavidades (Millipore # MABVN1250) foi pré-umedecida pela adição de 200 μL de tampão de lavagem (PBS contendo 0,05 % de Tween20) e removido pela aspiração. Em seguida, 50 μL/cavidade do estoque 0,5 x 105 pérolas/ml foram adicionados à placa de filtro e as cavidades lavadas com tampão de lavagem (2 x 100 μl/cavidade). 60 μL/cavidade de antígeno MAdCAM-IgG1 Fc diluído em meio de hibridoma (0,1 μg/ml) foram adicionados. As placas foram cobertas e incubadas na temperatura ambiente com agitação suave por uma hora. As cavidades foram lavados duas vezes pela adição de 100 μL/cavidade de tampão de la- vagem seguida pela aspiração. Em seguida, foi adicionado 60 μL/cavidade de anticorpo anti-MAdCAM secundário desconhecido diluídos em meio de hibridoma (0,1 μg/ml). As placas foram agitadas na temperatura ambiente no escuro por duas horas. Em seguida, as cavidades foram lavadas duas vezes pela adição de 100 μL/cavidade de tampão de lavagem seguida pela aspiração. Em seguida, 60 μL/cavidade de MxhIgG 2,3,4 biotinilado (0,5 μg/ml) foram adicionados. As placas foram agitadas na temperatura ambiente no escuro por uma hora. As cavidades foram lavadas duas vezes pela adição de 100 μL/cavidade de tampão de lavagem seguida pela aspiração. A cada cavidade, 60 μL de 1 μg/ml MxhIgG 2,3,4 Estreptavidina-PE (Pharmacia #554061) diluídos em meio de hibridoma foram adicionados. As placas foram agitadas na temperatura ambiente no escuro por vinte minutos. As cavidades foram lavadas duas vezes pela adição de 100 μL/cavidade de tampão de lavagem seguida pela aspiração. Em seguida, cada cavidade foi recolocada em suspensão em 80 μl de tampão de bloqueio (PBS com 0,5 % de albumina sérica bovina, 0,1 % de TWEEN e 0,01% de Timerosal) cuidadosamente pipetados para cima e para baixo para recolocar em suspensão as pérolas.
[000228] Usando Luminex 100 e o seu software acompanhante (Lu- minex® Corporation) as placas foram lidas para determinar as leituras de luminescência. Com base nos dados de luminescência obtidos para os vários anticorpos anti-MAdCAM testados, os anticorpos anti- MAdCAM foram agrupados de acordo com as suas especificidades de ligação. Os anticorpos anti-MAdCAM que foram testados caem em uma série de epítopo bins, representados na Tabela 8.
BIAcore binning:
[000229] Em um método similar àquele descrito acima, BIAcore também pode ser usado para determinar a exclusividade de epítopo dos anticorpos anti-MAdCAM exemplificados por esta invenção. Nove clones de anticorpo anti-MAdCAM, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.77.1, 7.20.5, 9.8.2, 1.7.2, 7.26.4 e 7.16.6, foram imobilizados na camada de dextrano de células de fluxo separadas de um chip biossensor CM5 usando a ligação de amina. O tampão de imobilização foi 10 mM de tampão de acetato pH 4,5 (clones 6.22.2, 6.34.2, 7.20.5, 9.8.2, 1.7.2, 7.26.4 e 7.16.6) ou 10 mM de tampão de acetato pH 5,5 (clones 6.67.1 e 6.77.1). Uma densidade de proteína de aproximadamente 3750 RU foi obtida em todos os casos. A desativação de ésteres de N- hidroxissuccinimida não reagidos foi realizada usando cloridrato de etanolamina 1 M, pH 8,5.
[000230] A proteína de fusão MAdCAM-IgG1 Fc foi diluída a uma concentração de 1,5 μg/ml (aproximadamente 25 nM) em tampão de condução HBS-EP (0,01 M de HEPES pH 7,4, 0,15 M de NaCl, 3 mM de EDTA, 0,005 % de Polissorbato 20). Esta foi depois injetada através da primeira célula de fluxo, em um volume de 50 μL a uma taxa de 5 μl/min. Depois que a injeção foi completa, a primeira sonda de anticorpo foi adicionada à mesma célula de fluxo. Todos os anticorpos de teste foram diluídos a uma concentração de aproximadamente 20 μg/ml em HBS-EP e também injetada em um volume de 50 μl a uma taxa de fluxo de 5 μl/min. Quando nenhuma ligação do anticorpo de teste foi observada, o clone de teste seguinte foi injetado imediatamente em seguida. Quando a ligação não ocorre, a superfície do sensor foi regenerada para remover tanto a proteína de fusão MAdCAM-IgG1 Fc quanto o anticorpo de teste. Uma variedade de soluções de regeneração foi usada dependendo do anticorpo imobilizado e do anticorpo de teste presente. Um resumo das condições de regeneração usadas está representado na Tabela 6. Tabela 6. Resumo das condições de regeneração usadas para realizar o mapeamento de epítopo BIAcore
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neração)
[000231] Depois da regeneração, a proteína de fusão MAdCAM-IgG1 Fc foi ligada mais uma vez e outros anticorpos de teste foram injetados. Estes procedimentos foram realizados até que o painel inteiro de clones tivessem sido injetados na superfície do anticorpo imobilizado, com proteína de fusão MAdCAM-IgG1 Fc ligada. Uma nova célula de fluxo com um anticorpo imobilizado diferente e MAdCAM ligada foi depois usado para sondar com os nove clones de teste. Os anticorpos anti-MAdCAM 1.7.2 e 1.8.2 foram esperados reconhecer o mesmo epí- topo de MAdCAM, com base na homologia de seqüência de aminoáci- do primária próxima das suas cadeias capa pesada e leve, SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 8 respectivamente. Consequentemente, apenas 1.7.2 foi avaliado através da matriz de resposta BIAcore. Os anticorpos 6.14.2 e 6.73.2 foram omitidos desta análise, mas todas as outras combinações de pares de anticorpo anti-MAdCAM foram testados deste modo. Um nível arbitrário de 100 RU foi escolhido como o patamar entre a ligação/não ligação e uma matriz de resposta, (Tabela 7), foi criada com base em se a ligação foi observada. Tabela 7. Matriz e resposta de binning de epítopo BIAcore
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Matriz de resposta para todas as combinações de pares de anticorpo. - indica nenhuma ligação da sonda de anticorpo, x indica que a ligação foi observada (acima de um nível de patamar escolhido de 100 RU).
[000232] A diagonal de matriz na Tabela 7 (sombreado cinza) detém os dados de ligação para os pares de sonda idênticos. Em todos os casos, exceto para os dois clones 7.16.6 e 9.8.2, os anticorpos foram autobloqueantes. Os anticorpos 7.16.6 e 9.8.2 não competem cruzado. A falta de autobloqueio pode ser devido a uma mudança conformacio- nal induzida pela mAb na proteína de fusão que permite a ligação adicional da mAb a um segundo sítio em MAdCAM-IgFc.
[000233] O agrupamento dos clones que mostram o mesmo padrão de reatividade dá origem a pelo menos seis bins de epítopo diferentes, como mostrado na representação gráfica, Figura 5).
[000234] Outra identificação precisa das seqüências de epítopo MAdCAM com que um anticorpo anti-MAdCAM interage pode ser determinada por qualquer um de vários métodos, incluindo, mas não limitado a, análise de Western de séries de biblioteca de peptídeo manchado (Reineke et al., Curr. Topics in Microbiol. e Immunol 243: 23-36 (1999), M. Famulok, E-L Winnacker, C-H Wong eds., Springer-Verlag, Berlin), demonstração da biblioteca de expressão de fago ou flagel- lin/fliC bacteriana ou análise de MALDI-TOF simples de fragmentos de proteína ligados seguindo a proteólise limitada.
Ensaios Imunoistoquímicos:
[000235] OCT ou espécimens de tecido congelado embutido em sacarose de íleo (placas de Peyer), linfônodo mesentérico, baço, estômago, duodeno, jejuno e cólon foram usados como um controle de tin- gimento positivo para as mAbs anti-MAdCAM. Para o tingimento de seções humanas com mAbs de IgG2 humano, derivados biotinilados das mAbs anti-MAdCAM foram gerados. 10 μm de seções de tecido congelado foram cortadas em lâminas revestidas com poli L-lisina, colocadas diretamente em 100 % de acetona 4o C (10 min), depois 3 % de peróxido de hidrogênio em metanol (10 min), lavando entre as etapas com PBS. As lâminas foram bloqueadas com Biotin Blocking System (DAKO Cat. No X0590), antes da incubação com o anticorpo primário (1:100 a 1:1000) em PBS (1 h), lavadas com PBS-Tween 20 (0,05 %) e depois a ligação desenvolvida com HRP-Estreptavidina (BD Bioscience Cat. No 550946, 30 min) e substrato DAB (Sigma Cat. No D5905). Para mAbs IgG4, uma IgG4 anti-humana de camundongo conjugada com HRP, secundária (Zymed Cat. No 3840) foi usada. As lâminas foram contra tingidas com Mayer's Haemalum (1 min), lavadas e depois montadas em DPX.
[000236] A afinidade de ligação foi comparada para várias espécies (tecidos de camundongo, rato, coelho, cão, porco, cinomolgo e ser humano). Não houve nenhuma reatividade para tecido de rato, coelho e porco pela imunoistoquímica e nenhuma reatividade cruzada dos anticorpos anti-MAdCAM para MAdCAM de camundongo recombinan- te, quando analisados pelo ELISA. Os dados para tecido de ser humano, cinomolgo e cão são apresentados na forma de tabela, na Tabela 8 abaixo: Tabela 8. Padrão de reatividade cruzada de anticorpos anti-MAdCAM para ortólogos de espécie MAdCAM
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nenhuma ligação
Ligação n.d não determinado
[000237] A ligação anti-MAdCAM às estruturas endotelial especializadas e tecido linfóide é indicada pelo sombreamento, de acordo com a chave. O epítopo bin com base na análise de epítopo Luminex e o padrão de reatividade cruzada MAdCAM são indicados para cada anticorpo. Os dados de binning de epítopo Luminex para anticorpos anti- MAdCAM 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73,3 e 6.77.1 (itálicos) foram derivados de experimentos separados que não aqueles para 1.7.2, 1.8.2, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4 e 9.8.2 (negrito), como indicado pela diferença no caractere da fonte.
[000238] Todos os anticorpos anti-MAdCAM testados tiveram a capacidade para reconhecer um epítopo MAdCAM humano expressado nos compartimentos endoteliais vasculares do trato gastrointestinal. À parte de 1.7.2 e 1.8.2, todos os outros anticorpos anti-MAdCAM testados foram capazes de ligar especificamente os compartimentos endo- teliais vasculares do trato gastrointestinal de cinomolgo. Certos outros anticorpos anti-MAdCAM, a saber 6.14.2 e 6.67.1 também tiveram a capacidade para reconhecer especificamente o ortólogo de MAdCAM de cão assim como MAdCAM de cinomolgo.
Geração de uma linhagem celular CHO que expressa MAdCAM de cinomolgo/ser humano quimérica funcionalmente ativa:
[000239] As diferenças na afinidade de ligação de certos anticorpos anti-MAdCAM para MAdCAM de ser humano e cinomolgo levou a determinar se uma base estrutural para esta observação poderia ser feita.
[000240] Com base nas seqüência de aminoácido publicadas para MAdCAM Macaca (Shyjan AM, et al., J Immunol., 156, 2851-7 (1996)), os iniciadores foram planejados para amplificar pela PCR a seqüência do domínio de ligação α4β7 de MAdCAM de cinomolgo. O RNA total foi preparado a partir de linfonodo mesentérico de cinomolgo excisado congelado (cerca de 200 mg) usando o método de Trizol (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. 1 a 2 μg foi oligo-dT iniciado e transcrito de modo reverso com AMV transcriptase reversa (Pro- mega). Uma proporção do produto transcrito de modo reverso foi submetido à PCR com iniciadores avançados 5'-AGC ATG GAT CGG GGC CTG GCC-3' (SEQ ID NO: 67) e reversos 5'-GTG CAG GAC CGG GAT GGC CTG-3' (SEQ ID NO: 68) com GC-2 polimerase em 1M GC fundido (Clontech) e em uma temperatura de recozimento de 62o C. Um produto de RT-PCR do tamanho apropriado foi excisado e purificado a partir de um gel de agarose a 1 % depois da eletroforese, depois clonado em TOPO-TA (Invitrogen) entre os sítios EcoRI de pCR2.1. O inserto foi confirmado na seqüência. O nucleotídeo e as seqüências de aminoácido traduzidas prognosticadas são mostradas nas SEQ ID NOS 49 e 50, respectivamente.
[000241] As seqüências de aminoácido de MAdCAM de ser humano e cinomolgo prognosticadas para os domínio de ligação α4β 7 mostram um alto grau de identidade de seqüência (90,8 %) quando alinhadas (a Figura 3 fornece este alinhamento de seqüência). Para gerar uma linhagem celular que expressa MAdCAM de cinomolgo funcionalmente ativa, que imitou o padrão de ligação anti-MAdCAM representado pela Tabela 8, um fragmento SacI que corresponde à seqüência do domínio de ligação α4β7 de cinomolgo em pCR2.1, foi subclonado diretamente na construção MAdCAM pIND-Hygro de ser humano no terminal C contendo suporte e domínio de transmembrana de mucina no terminal carboxila, descrito acima. A seqüência e orientação foram verificados, depois um fragmento KpnI/NotI foi clonado no vetor pEF5FRTV5GWCAT (Invitrogen), substituindo a seqüência codificadora CAT e usado em transfecções para gerar clones que expressem estavelmente únicos nas células CHO Flp In (Invitrogen), de acordo com as instruções do fabricante.
[000242] A ligação de clones de anticorpo anti-MAdCAM às células CHO que expressam quimeras de MAdCAM de cinomolgo/ser humano foi avaliada pela citometria de fluxo e a atividade funcional de anticorpos anti-MAdCAM foi determinada usando um ensaio de adesão de célula JY muito similar como aquele descrito acima. A ligação e atividade funcional de anticorpos anti-MAdCAM são expressados na Tabela 9. Tabela 9. Correlação entre a atividade funcional no ensaio de adesão de MAdCAM-CHO/JY cinomolgo/ser humano e ligação de célula CHO humana e MAdCAM cinomolgo/humano, como medido pelo FACS, para uma faixa de anticorpos anti-MAdCAM.
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[000243] Quando juntos, existe uma boa correlação entre a capacidade de um dado anticorpo anti-MAdCAM ligar MAdCAM de ser humano ou cinomolgo, como detectado pela imunoistoquímica (Tabela 8), com ligação com base em célula recombinante e atividade funcional (Tabela 9). Os anticorpos anti-MAdCAM 1.7.2, 1.8.2 e 6.73.2, por exemplo, demonstraram uma falta consistente de ligação ao tecido de cinomolgo e as células que expressam uma proteína MAdCAM de ci- nomolgo/ser humano quimérica. Os anticorpos anti-MAdCAM 1.7.2, 1.8.2 e 6.73.2 também não têm a capacidade para detectar a atividade bloqueadora funcional no ensaio de adesão de MAdCAM/JY cinomol- go/ser humano.
[000244] Métodos similares podem ser usados para definir o epítopo dos anticorpos anti-MAdCAM 6.14.2 e 6.67.1 que reconhecem MAd- CAM de cão.
Exemplo IV: Uso de mAbs anti-MAdCAM na detecção de MAdCAM solúvel circulante como um método de diagnóstico de doença
[000245] Os anticorpos anti-MAdCAM podem ser usados para a detecção de MAdCAM solúvel circulante (sMAdCAM). A detecção de sMAdCAM em plasma clínico, amostras de soro ou outros biofluidos, tais como, mas não limitado a, fezes, urina, escarro é provável ser um biomarcador de doença substituto útil para doença subjacente, incluindo, mas não limitada à doença do intestino inflamatório.
[000246] Com base nos dados de binning de epítopo (Tabelas 7 e 8), os anticorpos anti-MAdCAM 1.7.2 e 7.16.6 parecem reconhecer epítopos diferentes em MAdCAM humano. As placas de ELISA foram revestidas durante a noite a 4o C com 100 μl/cavidade de uma solução 50 μg/ml de 1.7.2 em solução salina tamponada com fosfato (PBS). Depois da incubação a placa foi bloqueada por 1,5 horas com um tampão de bloqueio de PBS contendo 10 % de leite (200 μl/cavidade). Depois da incubação a placa foi lavada com PBS (2 x 100 μl/cavidade) e diluições em série da proteína de fusão MAdCAM-IgG1-Fc, a partir de uma concentração principal de 50 μg/ml abaixo de aproximadamente 5 ng/ml em PBS, a um volume final de 100 μl, foram adicionados à placa para incubação de 2 horas na temperatura ambiente. Em um método similar a proteína MAdCAM-IgG1-Fc pode ser diluída no plasma ou soro ou algum outro de tal biofluido relevante e usada para determinar a expressão de MAdCAM solúvel em uma amostra clínica, como descrito abaixo. Como um controle negativo, apenas tampão foi adicionado aos cavidades contendo o anticorpo anti-MAdCAM primário. Depois deste tempo, a placa foi lavada com PBS (3 x 100 μl/cavidade) e a placa depois incubada no escuro com um 7.16.6 rotulado com Alexa488 (100 μl, 5 μg/ml). O 7.16.6 rotulado com Alexa488 foi gerado usando um kit comercialmente disponível (Molecular Probes, A-20181), seguindo os protocolos do fabricante.
[000247] A placa foi lavada com PBS contendo 0,05 % de Tween-20 e a ligação de 7.16.6 rotulado para MAdCAM solúvel capturado determinado medindo-se a fluorescência (Leitora de rótulo Múltiplo Wallac Victor2 1420, excitação X 485 nm, emissão X 535 nm contagem a partir do topo, 3 mm do fundo da placa, para 0,1 s com abertura de emissão normal). Quando a fluorescência é plotada como uma função da concentração de proteína de fusão MAdCAM-IgG1-Fc, Figura 6, ela indica que 1.7.2 e um 7.16.6 rotulado podem ser usados com propósitos de diagnóstico para determinar o nível de MAdCAM solúvel circulante expressado em um biofluido ou amostra clínica. Este método de ELISA intercalado não está restrito ao uso de 1.7.2 e 7.16.6, mas qualquer combinação de anticorpos anti-MAdCAM que reconheçam epítopos diferentes em MAdCAM, como resumido pelos dados e interpretação da Tabela 7 e Figura 5. Estratégias similares podem ser aplicadas ao desenvolvimento de ensaios similares, tal como imunoistoquímica e Western Blot, com os outros anticorpos anti-MAdCAM descritos, usando parceiros, variantes, rótulos, etc. diferentes.
Exemplo V: Estrutura de Aminoácido de mAbs anti-MAdCAM preparadas de acordo com a invenção
[000248] No debate seguinte, a informação estrutural relacionada com mAbs anti-MAdCAM preparadas de acordo com a invenção é fornecida.
[000249] Para analisar as estruturas de mAbs produzidas de acordo com a invenção, nós clonamos os genes que codificam os fragmentos das cadeias pesada e leve do clone de hibridoma específico. A clonagem e seqüênciamento de gene foram realizadas como segue:
[000250] Poli(A)+ mRNA foi isolado de aproximadamente 2 x 105 células de hibridoma derivadas de camundongos XenoMouse imunizados usando o kit Fast-Track (Invitrogen). A geração de cDNA aleatoriamente iniciado foi seguida pela PCR. Os iniciadores específicos da família VH ou VK humana (Marks et al., 'Oligonucleotide primers for polymerase chain reaction amplification of human immunoglobulin variable genese and design of family-especific oligonucleotide probes'; Eur. J. Imunol., 21, 985-991 (1991)) ou um iniciador VH humano universal, MG-30 (5'-CAG GTG CAG CTG GAG CAG TCI GG-3 (SEQ ID NO: 108) foram usados em conjunção com iniciadores específicos para Cy2 humano, MG40-d (5'-GCT GAG GGA GTA GAG TCC TGA GGA-3 (SEQ ID NO: 109) ou região constante Cy4, MG-40d (5'GCT GAG GGA GTA GAG TCC TGA GGA CTG T -3 (SEQ ID NO: 110) ou região constante Ck (hkP2; como anteriormente descrito em Green et al., 1994). As seqüências dos transcritos de cadeia pesada e capa derivadas de mAb humanas de hibrido- mas foram obtidas pelo seqüenciamento direto de produtos de PCR gerados a partir de poli (A+) RNA usando os iniciadores descritos acima. Os produtos de PCR foram clonados em pCR2.1 usando um kit de clonagem TOPO-TA (Invitrogen) e ambos os filamentos foram seqüenciados usando os kits de seqüenciamento Prism dye terminator e uma máquina de seqüenciamento ABI 377. Todas as seqüências foram analisadas pelos alinhamentos com a 'a lista de seqüência V BASE' (Tomlinson, et al, J. Mol. Biol., 227, 776-798 (1992); Hum. Mol. Genet., 3, 853-860 (1994); EMBO J., 14, 4628-4638 (1995).)
[000251] Além disso, cada um dos anticorpos, 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod e 7.26.4-mod, foram submetidos ao seqüenciamento de DNA de tamanho natural. Para tal, o RNA total foi isolado de aproximadamente 3 a 6 x 106 células de hi- bridoma usando um kit RNeasy (Qiagen). O mRNA foi transcrito de modo reverso usando oligo-dT e um sistema de transcriptase reversa com base em AMV (Promega). A V BASE foi usada para planejar os iniciadores de amplificação 5' específicos, contendo uma seqüência Kozak ótima e códon de início ATG (sublinhado) e iniciadores reversos 3' para as cadeias pesada e Capa específicas como representado na Tabela 10. Tabela 10: Pares de iniciadores de PCR para a amplificação de cDNA de hibridomas que expressam mAb anti-MAdCAM e iniciadores usados na construção de versões modificadas de anticorpos anti-MAdCAM.
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[000252] Os pares de iniciadores foram usados para amplificar os cDNAs usando Expand High Fidelity Taq polimerase (Roche) e os pro-dutos de PCR clonados em pCR2.1 TOPO-TA (Invitrogen) para se- qüenciamento subsequente. Os clones verificados quanto a seqüência de cadeias pesada e leve capa foram depois clonados em vetores pEE6.1 e pEE12.1 (LONZA) sítios usando XbaI/EcoRI e HindIII/EcoRI respectivamente.
Análise da Utilização de Gene
[000253] A Tabela 11 demonstra a utilização de gene das cadeias capa pesada e leve para cada hibridoma esboçado na invenção. Tabela 11: Utilização de Gene das Cadeias Pesada e Capa Leve
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Análise de Seqüência
[000254] Para examinar ainda mais a estrutura de anticorpo, as se- qüências de aminoácido prognosticadas dos anticorpos foram obtidas a partir de cDNAs obtidos dos clones.
[000255] Os números identificadores de seqüência (SEQ ID NO: ) 1 a 48 e 51 a 68 fornecem as seqüências de nucleotídeo e aminoácido das cadeias capa pesada e leve dos anticorpos anti-MAdCAM 1.7.2 (SEQ ID NOS 1-4), 1.8.2 (SEQ ID NOS 5-8), 6.14.2 (SEQ ID NOS 912), 6.22.2 (SEQ ID NOS 13-16), 6.34.2 (SEQ ID NOS 17-20), 6.67.1 (SEQ ID NOS 21-24), 6.73.2 (SEQ ID NOS 25-28), 6.77.1 (SEQ ID NOS 29-32), 7.16.6 (SEQ ID NOS 33-36), 7.20.5 (SEQ ID NOS 37-40), 7.26.4 (SEQ ID NOS 41-44), 9.8.2 (SEQ ID NOS 45-48) e os anticorpos anti-MAdCAM modificados 6.22.2-mod (SEQ ID NOS 51-54), 6.34.2-mod (SEQ ID NOS 55-58), 6.67.1-mod (SEQ ID NOS 59-62) e 6.77.1-mod (SEQ ID NOS 63-66) e 7.26.4-mod (SEQ ID NOS 41-42, 67-68). Para cada seqüência de anticorpo anti-MAdCAM clonado, as seqüências da seqüência de peptídeo de sinal (ou as bases que codificam as mesmas) são indicadas em letras minúsculas e sublinhadas.
[000256] As Figuras 1A-1J fornecem alinhamentos de seqüência entre as seqüências de aminoácido da cadeia pesada prognosticada de anticorpos 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4 e 9.8.2 e a seqüência de aminoácido dos produtos de gene da respectiva linhagem germinativa. As posições das se- qüências de CDR1, CDR2 e CDR3 dos anticorpos são sublinhadas, as diferenças entre a seqüência expressada e a seqüência da linhagem germinativa correspondente são indicadas em negrito e onde existe adições na seqüência expressada comparada com a linhagem germi- nativa estas são indicadas como um (-) na seqüência da linhagem germinativa.
[000257] As Figuras 1K-1T fornecem alinhamentos de seqüência entre as seqüências de aminoácido da cadeia leve capa prognosticada dos anticorpos 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4 e 9.8.2 e a seqüência de aminoácido dos produtos de gene da respectiva linhagem germinativa. As posições das seqüências de CDR1, CDR2 e CDR3 dos anticorpos são sublinhadas, as diferenças entre a seqüência expressada e a linhagem germinativa correspondente são indicadas em negrito e onde existe adições na seqüência expressada comparada com a linhagem germi- nativa estas são indicadas como um (-) na seqüência da linhagem germinativa. Presença de modificação pós-traducional: glicosilação e desamidação:
[000258] O efeito de algumas das mudanças na seqüência de anticorpo anti-MAdCAM expressada, comparada com a seqüência da linhagem germinativa derivada, é introduzir resíduos que potencialmente podem ser submetidos à glicosilação (Asn-X-Ser/Thr) e/ou desami- dação (Asn-Gly) ligadas em N (ver Tabela 12). As seqüências de ácido nucléico que codificam as seqüências de aminoácido do domínio variável da cadeia leve capa dos anticorpos anti-MAdCAM 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.26.4 e 9.8.2, (SEQ ID NOS: 16, 20, 24, 28, 32, 44 e 48) e o domínio variável da cadeia pesada do anticorpo 6.14.2, (SEQ ID NO: 10), prediz a presença de glicosilação ligada em N. A presença desta modificação pós-traducional foi investigada usando uma combinação de SDS-PAGE e Glicoproteína Pro-Q® Emerald 488 (Molecular Probes) tingindo com mAbs 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.26.4 e 9.8.2.
[000259] Em resumo, aproximadamente 2 μg de anticorpo anti- MAdCAM reduzido foram carregados em um gel de SDS-poliacrilamida de 4 a 12 % usando um tampão MOPS. A seguir da eletroforese, o gel foi fixado em MeOH a 50 %, ácido acético a 5 % e lavado em ácido acético a 3 %. Qualquer carboidrato no gel foi depois oxidado com ácido periódico e tingido usando o Kit de Tingimento de Glicoproteína Pro-Q® Emerald 488 (Molecular Probes). Depois de uma etapa de lavagem final, o tingimento da glicoproteína foi visualizado usando um escaner de fluorescência ajustado a um comprimento de onda de 473 nm.
[000260] Depois do tingimento da glicoproteína, o gel foi tingido para proteína total usando o corante de gel de proteína SYPRO Ruby e analisados usando um escaner de fluorescência ajustado a um com-primento de onda de 473 nm. As cadeias leves capa de anticorpo anti- MAdCAMs, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.26.4 e 9.8.2, todas tingiram positivamente quanto a presença de glicosilação. Como uma confirmação adicional, o anticorpo anti-MAdCAM 7.26.4, foi submetido à digestão tríptica/quimiotríptica, a análise de LC-MS/MS confirmou a presença de um peptídeo trípitico modificado e forneceu confirmação adicional da glicosilação da cadeia leve capa.
[000261] As seqüências Asn-Gly específicas nas regiões de CDR1 de anticorpos anti-MAdCAM, 1.7.2, 1.8.2, 6.22.2 e 7.20.5, torna estas regiões sensíveis à desamidação. A desamidação no pH neutro introduz uma carga negativa e também pode levar a β-isomerisação, que pode afetar as propriedades de um anticorpo. Quanto aos anticorpos anti-MAdCAM 1.7.2, 1.8.2 e 7.20.5, a presença de resíduos de Asn- isoaspartato desaminados foi ensaiada pela espectroscopia de massa a seguir do aprisionamento da cadeia lateral de isoaspartato com MeOH.
[000262] Em resumo, para o anticorpo anti-MAdCAM 1.7.2, a situa ção do peptídeo trípitico/Asp-N SSQSLLQSNGYNIL (SEQ ID NO: 69) (1573,7 Da) foi selecionada para monitorar pela LC-MS/MS. O anticorpo anti-MAdCAM 1.7.2 foi reduzido em 10 mM de DTT, alquilado em 5 mM de iodoacetato de Na e subseqüentemente trocado de tampão em tampão de digestão de tripsina (50 mM de Tris-HCl, 1 mM de CaCl2, pH 7,6). O anticorpo foi depois misturado com tripsina modificada em grau de seqüenciamento (Promega) em uma relação de pro- tease:proteína de 1:20. A proteína foi digerida em tripsina por 15 horas a 30°C e os peptídeos resultantes separados pela HPLC usando um C-18 RPC em um sistema Ettan LC. O peptídeo contendo 33Asn (4032 Da) foi coletado a partir da coluna e diluído em tampão de digestão Asp-N (50 mM de tampão de fosfato de sódio, pH 8,0). Endoproteinase Asp-N (Roche) foi depois adicionada a uma relação aproximada de peptídeo:enzima de 10:1.
[000263] Cloreto de acetila (100 μl) foi adicionado a uma amostra de metanol (1 ml, -20o C), a mistura aquecida até a temperatura ambiente. A digestão tríptico+Asp-N foi seca em um Speed-Vac e depois 5 μl do metanol/cloreto de acetila foram adicionados (45 min, temperatura ambiente), depois secos mais uma vez em um Speed-Vac. O resíduo resultante foi reconstituído em 0,1 % de TFA e os peptídeos foram analisados inicialmente no espectrômetro de massa Voyager-DE STR MALDI-TOF usando o método de preparação de amostra em camada fina de nitrocelulose ou purificação de fase reversa usando C18 ZipTips (Millipore) seguida pela mistura de gotículas com matriz de a- ciano. A mistura de peptídeo metilado também foi analisada usando LC-MS/MS em um Espectrômetro de Massa de Aprisionamento de Íon Deca XP Plus como acima. A elução foi avaliada direto no MS de Aprisionamento de Íon e os peptídeos foram subseqüentemente analisados pelo MS e MS/MS. O MS foi ajustado para analisar todos os íons entre 300 e 2000 Da. O íon mais forte em qualquer varredura particular foi depois submetido à análise de MS/MS. Tabela 12. Modificação pós-traducional de anticorpos anti-MAdCAM
Figure img0017
Estudos de Mutagênese:
[000264] A seqüência de aminoácido primária dos anticorpos anti- MAdCAM exemplificados nesta invenção pode ser modificada, pela mu- tagênese direcionada ao sítio, para remover sítios potenciais de modifi-cação pós traducionais (por exemplo, glicosilação, desamidação) ou para alterar o fundo isotípico ou para engendrar outras mudanças que possam melhorar a utilidade terapêutica. Como um exemplo, a PCR foi usada para engendrar mudanças aos anticorpos anti-MAdCAM 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.77.1 e 7.26.4, para reverter certas seqüências de matriz para a linhagem germinativa, para remover sítios de glicosilação potenciais e/ou para mudar o fundo isotípico para uma IgG2 humana. cDNAs clonados em pCR2.1 TOPO-TA (100 ng), que correspondem ao nucleotídeo da cadeia pesada SEQ ID NOS: 13, 17, 21 e 29 e nucleotí- deo da cadeia leve capa SEQ ID NOS: 15, 19, 23, 31 e 43, foram usados como um padrão em uma série de PCRs usando sobreposição- extensão e um painel de conjuntos de iniciador descrito na Tabela 10.
[000265] Cadeia pesada 6.22.2: Os conjuntos de iniciador de PCR 6.22.2_VH_F1 e 6.22.2 VH_CS* (1) e VH3-33 e 6.22.2_VH_R1 (2) foram usados para gerar os produtos de PCR separados (1) e (2), usando uma Expand Taq polimerase e um padrão de cDNA pCR2.1 TOPO-TA (100 ng) representado pela seqüência de nucleotídeo SEQ ID NO: 13. Os pro-dutos (1) e (2) foram purificados e combinados em uma terceira etapa de PCR (cerca de 50 ng cada) junto com os iniciadores VH3-33 e VK6.22.2_CS*, para gerar o domínio V da cadeia pesada de 6.22.2 modi-ficado. Esta versão modificada contém uma mutação His/Phe em FR1 e introduz um sítio de restrição XbaI para permitir a clonagem na matriz em um vetor derivado de pEE6.1, chamado de pEE6.1CH, que contém o domínio constante de IgG2 humano correspondente. O fragmento de PCR final foi clonado no sítio XbaI de pEE6.1CH, checado quanto a orientação e a seqüência completa inserida verificada. A seqüência de nu- cleotídeo para a cadeia pesada de 6.22.2 modificada é encontrada na SEQ ID NO: 51 e a seqüência de aminoácido correspondente na SEQ ID NO: 52. As mudanças as seqüências de nucleotídeo e aminoácido comparadas com a precursora são indicadas.
[000266] Cadeia leve capa 6.22.2: os conjuntos de iniciadores de PCR 6.22.2_VK_F1 e revKappa (1) e A26 e 6.22.2_VK_R1 (2) foram usados para gerar os produtos de PCR separados (1) e (2), usando uma Expand Taq polimerase e um padrão de DNA pCR2.1 TOPO-TA (100 ng) repre-sentado pela seqüência de nucleotídeo SEQ ID NO: 15. Os produtos (1) e (2) foram purificados e combinados em uma terceira etapa de PCR (cerca de 50 ng cada) junto com os iniciadores A26 e revKappa, para ge-rar o domínio V da cadeia leve capa de 6.22.2 modificado. Esta versão modificada contém as mudanças Asn/Asp e Gly/Ser para a seqüência FR3. O produto de PCR resultante foi clonado em pEE12.1 usando sítios HindIII/EcoR1 e a seqüência completa verificada. A seqüência de nucleo- tídeo para a cadeia leve capa de 6.22.2 modificada é encontrada na SEQ ID NO: 53 e a seqüência de aminoácido correspondente na SEQ ID NO: 54. As mudanças nas seqüências de nucleotídeo e aminoácido compa-radas com o precursor são indicadas.
[000267] Cadeia pesada de 6.34.2: Conjuntos de iniciadores de PCR 6.34.2_VH_F1 e 6.22.2VH_CS* (1) e VH3-30 e 6.34.2_VH_R1 (2) foram usados para gerar os produtos de PCR separados (1) e (2), usando uma Expand Taq polimerase e um padrão de cDNA pCR2.1 TOPO-TA (100 ng) representado pela seqüência de nucleotídeo SEQ ID NO: 17. Os pro-dutos (1) e (2) foram purificados e combinados em uma terceira etapa de PCR (cerca de 50 ng cada) junto com os iniciadores VH3-30 e VK6.22.2_CS*, para gerar o domínio V da cadeia pesada de 6.34.2 modi-ficado. Esta versão modificada contém uma mutação Ser/Arg em FR3 e introduz um sítio de restrição XbaI para permitir a clonagem na matriz em um vetor derivado de pEE6.1, chamado de pEE6.1CH, que contém o domínio constante da IgG2 humana correspondente. O fragmento de PCR final foi clonado no sítio XbaI de pEE6.1CH, checado quanto a ori-entação e a seqüência de inserto completa verificada. A seqüência de nucleotídeo para a cadeia pesada 6.34.2 modificada é encontrada na SEQ ID NO: 55 e a seqüência de aminoácido correspondente na SEQ ID NO: 56. As mudanças nas seqüências de nucleotídeo e aminoácido comparadas com o precursor são indicadas.
[000268] Cadeia leve capa 6.34.2: Conjuntos de iniciadores de PCR O12 e 6.34.2_VK_R1 (1), 6.34.2_VK_F1 e 6.34.2_VK_R2 (2), assim como 6.34.2_VK_F2 e revKappa (3) foram usados para gerar os produtos de PCR separados (1), (2) e (3), usando um Expand Taq polimerase e um padrão de cDNA pCR2.1 TOPO-TA (100 ng) representado pela se- qüência de nucleotídeo SEQ ID NO: 19. Os produtos (1), (2) e (3) foram purificados e (1) e (2) foram combinados em uma terceira etapa de PCR (cerca de 50 ng cada), junto com iniciadores O12 e 6.34.2_VK_R2, para gerar o produto de PCR (4). Os produtos de PCR (2) e (3) foram combi-nados em uma quarta etapa de PCR (cerca de 50 ng cada), junto com 6.34.2_VK_F1 e revKappa, para gerar o produto de PCR (5). Os produtos de PCR (4) e (5) foram purificados e combinados entre si (cerca de 50 ng cada) com iniciadores O12 e revKappa para gerar o domínio V da cadeia leve capa de 6.34.2 modificado. Esta versão modificada contém uma mudança Asn/Ser na CDR1, uma mudança Phe/Tyr na FR2 e mudanças Arg-Thr/Ser-Ser, Asp/Glu e Ser/Tyr para a seqüência FR3. O produto de PCR resultante foi clonado em pEE12.1 usando os sítios Hin- dIII/EcoR1 e a seqüência completa verificada. A seqüência de nucleotí- deo para a cadeia leve capa 6.34.2 modificada é encontrada na SEQ ID NO: 57 e a seqüência de aminoácido correspondente na SEQ ID NO: 58. As mudanças nas seqüências de nucleotídeo e aminoácido comparada com o precursor são indicadas.
[000269] Cadeia pesada 6.67.1: Os conjuntos de iniciadores de PCR 6.67.1_VH_F1 e 6.67.1VH_CS* (1) e VH4-4 e 6.67.1_VH_R1 (2) foram usados para gerar os produtos de PCR separados (1) e (2), usando uma Expand Taq polimerase e um padrão de cDNA pCR2.1 TOPO-TA (100 ng) representado pela seqüência de nucleotídeo SEQ ID NO: 21. Os pro-dutos (1) e (2) foram purificados e combinados em uma terceira etapa de PCR (cerca de 50 ng cada) junto com os iniciadores VH4-4 e VK6.67.1_CS*, para gerar o domínio V da cadeia pesada de 6.67.1 modi-ficado. Esta versão modificada contém uma conversão de Ile-Leu- Ala/Met-Ser-Val m FR3 e introduz um sítio de restrição XbaI para permitir a clonagem na matriz em um vetor derivado de pEE6.1, chamado de pEE6.1CH, que contém o domínio constante da IgG2 humana corres-pondente. O fragmento de PCR final foi clonado no sítio XbaI de pEE6.1CH, checado quanto a orientação e a seqüência completa do in- serto verificada. A seqüência de nucleotídeo para a cadeia pesada de 6.67.1 modificada é encontrada na SEQ ID NO: 59 e a seqüência de aminoácido correspondente na SEQ ID NO: 60. As mudanças nas se- qüências de nucleotídeo e aminoácido comparada com o precursor são indicadas.
[000270] Cadeia capa leve 6.67.1: Conjuntos de iniciadores de PCR 6.67.1_VK_F1 e revKappa (1) e B3 e 6.67.1_VK_R1 (2) foram usados para gerar os produtos de PCR separados (1) e (2), usando uma Expand Taq polimerase e um padrão de cDNA pCR2.1 TOPO-TA (100 ng) representado pela seqüência de nucleotídeo SEQ ID NO: 23. Os produtos (1) e (2) foram purificados e combinados em uma terceira etapa de PCR (cerca de 50 ng cada) junto com os iniciadores B3 e revKappa, para gerar o domínio V da cadeia capa leve 6.67.1 modificado. Esta versão modificada contém uma mudança de Thr/Asn em CDR1 e uma mudança Arg/Gly em FR2. O produto de PCR resultante foi clonado em pEE12.1 usando sítios HindIII/EcoRI e a seqüência completa verificada. A seqüência de nucleotídeo para a cadeia capa leve de 6.67.1 modificada é encontrada na SEQ ID NO: 61 e a seqüência de aminoácido cor-respondente na SEQ ID NO: 62. As mudanças nas seqüências de nu- cleotídeo e aminoácido comparadas com o precursor são indicadas.
[000271] Cadeia pesada de 6.77.1: Conjuntos de iniciadores de PCR VH 3-21 e 6.22.2VH_CS* foram usados para gerar um único produto de PCR usando uma Expand Taq polimerase e um padrão de cDNA pCR2.1 TOPO-TA (100 ng) representado pela seqüência de nucleotídeo SEQ ID NO: 29. Os produtos de PCR foram digeridos com XbaI, purificados em gel e clonados no sítio XbaI de pEE6,1CH, checando quanto a orientação. O inserto foi completamente verificado na seqüência. A seqüência de nucleotídeo para a cadeia pesada de 6.77.1 modificada é encontrada na SEQ ID NO: 63 e a seqüência de aminoácido correspon-dente na SEQ ID NO: 64. As mudanças nas seqüências de nucleotídeo e aminoácido comparadas com o precursor são indicadas.
[000272] Cadeia capa leve 6.77.1: Conjuntos de iniciadores de PCR A2 e 6.77.1_VK_R1 (1), 6.77.1_VK_VK_F1 e 6.77.1_R2 (2), assim como 6.77.1_VK_F2 e revKappa (3) foram usados para gerar os produtos de PCR separados (1), (2) e (3), usando uma Expand Taq polimerase e um padrão de cDNA pCR2.1 TOPO-TA (100 ng) representado pela seqüên- cia de nucleotídeo SEQ ID NO: 31. Os produtos (1), (2) e (3) foram purifi-cados e, (1) e (2) foram combinados em uma terceira etapa de PCR (cer-ca de 50 ng cada) junto com os iniciadores A2 e 6.77.1_VK_R2, para ge-rar o produto de PCR (4). O produto de PCR (2) e (3) foram combinados em uma quarta etapa de PCR (cerca de 50 ng cada) junto com os inicia-dores 6.77.1_VK_F1 e revKappa, para gerar o produto de PCR (5). Os produtos de PCR (4) e (5) foram purificados e combinados entre si (cerca de 50 ng cada) com os iniciadores A2 e JK2 para gerar o domínio V da cadeia capa leve de 6.77.1 modificado. Esta versão modificada contém uma mudança Asn/Lys em CDR1, uma mudança Ser/Tyr em FR3 e uma mudança de resíduo Cys/Ser na seqüência CDR3. O produto de PCR resultante foi clonado em pEE12.1 usando os sítios HindIII/EcoR1 e a seqüência completa verificada. A seqüência de nucleotídeo para a cadeia leve capa de 6.77.1 modificada é encontrada na SEQ ID NO: 65 e a se- qüência de aminoácido correspondente na SEQ ID NO: 66. As mudanças nas seqüências de nucleotídeo e aminoácido comparadas com o precur-sor são indicadas.
[000273] Cadeia capa leve 7.26.4: Conjuntos de iniciadores de PCR 7.26.4_VK_F1 e revKappa (1) e A2 e 7.26.4_VK_R1 (2) foram usados para gerar os produtos de PCR separados (1) e (2), usando uma Expand Taq polimerase e um padrão de cDNA pCR2.1 TOPO-TA (100 ng) representado pela seqüência de nucleotídeo SEQ ID NO: 43. Os produtos (1) e (2) foram purificados e combinados em uma terceira etapa de PCR (cerca de 50 ng cada) junto com os iniciadores A2 e re- vKappa, para gerar o domínio V da cadeia capa leve de 7.26.4 modificado. Esta versão modificada contém uma mudança Asn/Ser em CDR1. O produto de PCR resultante foi clonado em pEE12.1 usando os sítios HindIII/EcoR1 e a seqüência completa verificada. A seqüência de nucleotídeo para a cadeia capa leve 7.26.4 modificada é encontrada na SEQ ID NO: 67 e a seqüência de aminoácido correspondente na SEQ ID NO: 68. As mudanças nas seqüências de nucleotídeo e ami- noácido comparadas com o precursor são indicadas.
[000274] Um vetor de expressão eucariótico funcional para cada uma das versões modificadas de 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.77.1 e 7.26.4, aludidas como 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod e 7.26.4-mod e representando respectivamente as seqüências da cadeia pesada de nucleotídeo SEQ ID NOS: 51, 55, 59, 63 e 41 e as seqüên- cias de aminoácido correspondentes SEQ ID NOS: 52, 56, 60, 64 e 42, assim como as seqüências de nucleotídeo da cadeia capa leve SEQ ID NOS: 53, 57, 61, 65 e 67 e as seqüências de aminoácido corre-spondentes SEQ ID NOS: 54, 58, 62, 66 e 68 foram montados como segue: Os insertos de cDNA da cadeia pesada correspondendo a 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod e 6.77.1-mod foram excisados do vetor pEE6.1CH com NotI/SalI, a versão precursora das cadeias pesadas de 7.26.4 foi excisada do vetor pEE6.1 com NotI/SalI e os fragmentos purificados foram clonados em sítios idênticos no vetor pEE12.1 correspondente contendo as versões modificadas das se- qüências de cadeia capa leve 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod e 7.26.4-mod. As seqüências dos vetores foram confirmadas e quantidades purificadas usadas nas transfecções transitórias com células HEK 293T. Em resumo, 9 x 106 células HEK 293T, semeadas em um frasco T165 um dia antes da transfecção e lavadas em Optimem, foram transitoriamente transfectadas com cDNAs vetoriais correspondendo a 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1- mod e 7.26.4-mod (40 μg) usando Lipofectamina PLUS (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. As células foram incubadas por 3 horas, depois os meios de transfecção substituídos com=meio DMEM (Invitrogen 21969-035) contendo 10 % de soro de bezerro fetal de IgG ultra-baixo (Invitrogen 16250-078) e L-Glutamina (50 ml). O so- brenadante do meio foi colhido 5 dias mais tarde, esterilizado em filtro e o anticorpo anti-MAdCAM purificado usando a cromatografia de afinidade em proteína G sefarose, em uma maneira similar como aquela descrita acima. A quantidade de anticorpo recuperado (20 a 100 μg) foi quantificada por um ensaio de Bradford.
[000275] A atividade anti-MAdCAM de anticorpo purificado por afinidade correspondendo a 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1- mod e 7.26.4-mod foi avaliada no ensaio de fusão MAdCAM-IgG1-Fc como descrito anteriormente. Os valores IC50 destes anticorpos anti- MAdCAM comparados com os anticorpos anti-MAdCAM precursores a partir dos quais eles foram derivados estão apresentados na Tabela 13. Houve um efeito mínimo das substituições de aminoácido descritas acima sobre a atividade dos anticorpos anti-MAdCAM modificados comparados com os seus precursores foi mínima. Os anticorpos também mantiveram a sua ligação às células CHO que expressam MAd- CAM humana recombinante ou a quimera de MAdCAM cinomolgo/ser humano. Tabela 13. Atividade das versões modificadas de anticorpo anti- MAdCAMs, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod e 7.26.4- mod comparadas com seus precursores.
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Exemplo VI Aumento em linfócitos β7+ na circulação periférica pelo bloqueio de anticorpos anti-MAdCAM
[000276] Um ensaio foi desenvolvido para identificar e correlacionar um efeito mecanístico de um anticorpo anti-MAdCAM e o seu nível circulante no sangue. Um anticorpo anti-MAdCAM inibidor deve ter o efeito de inibir o recrutamento de leucócitos que expressam a integrina α4β7 para o trato gastrointestinal. As classes de leucócitos que carregam a integrina α4β7 devem ser, portanto, restritas à circulação periférica.
[000277] Isto foi demonstrado com um mAb anti-humano de MAd- CAM totalmente humano de 7.16.6, em cinomolgo.
[000278] mAb MAdCAM anti-humano purificado 7.16.6 (1 mg/kg) ou veículo (20 mM de Acetato Na, 0,2 mg/ml de polissorbato 80, 45 mg/ml de manitol e 0,02 mg/ml de EDTA no pH 5,5) foram avaliados de uma maneira similar pela administração intravenosa por intermédio da veia safena a dois grupos de macacos cinomolgo (n = 4/grupo). No dia 3 após a dosagem as amostras de sangue foram coletadas em tubos de EDTA pela venipuntura femoral. Os anticorpos específicos de LPAM, que reagem cruzado com a integrina α4β7 de integrina, não são comercialmente disponíveis, de modo que um anticorpo anti-β7 (que reconhece as integrinas α4β7 e aEβ7) fosse usado no seu lugar. Os anticorpos (30 μl), de acordo com a tabela seguinte, a tabela 15, foram adicionados aos tubos contendo 100 μL de sangue de cinomolgo, misturado pelo turbilhonamento suave e incubado por 20 a 30 mins a 4°C. Tabela 15. Anticorpos (BD Pharmingen) usados na imunofenotipagem de sangue de cinomolgo
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[000279] A cada tubo, 1 ml de solução 1:10 de FACSlyse (BD # 349202) foi adicionado, misturado pelo turbilhonamento suave e incubado na temperatura ambiente por aproximadamente 12 minutos no escuro até que a lise de célula sangüínea vermelha fosse completa. Depois de 2 ml de tampão de corante BD (# 554656) foram adicionados a cada tubo, misturado e centrifugado a 250 x g por 6 a 7 min na temperatura ambiente. O sobrenadante foi decantado e o pélete recolocado em suspensão em 3 ml de tampão corante, misturados mais uma vez e centrifugados a 250 x g por 6 a 7 min na temperatura ambiente. Tampão Cytofix (BD # 554655), contendo p/v paraformaldeídeo (100 μL) foi adicionado aos péletes de célula de sangue periférico de macaco e mis-turado cuidadosamente pela velocidade baixa/moderada do turbilhona- dor. As amostras foram mantidas a 4°C no escuro até que elas captura-ram no FACSCalibur. Exatamente antes da captura, PBS (100 μl) foi adicionado a todos os tubos imediatamente antes da captura. Os núme-ros de célula absoluta de CD4+β7+CD95loCD28+ (ingênuo), CD4+β7+CD95hiCD28+ (memória central), CD4+β7-CD95hiCD28+ (memória central), CD4+β7+CD95hiCD28- (memória efetora) foram capturados pelas análises gating e quandrante apropriadas. Outros subconjuntos de célula T por exemplo, célula da memória central CD8+ T (β7+CD8+CD28+CD95+) e qualquer outros leucócitos que carregam um ligando MAdCAM, também podem ser analisados por este método com os anticorpos apropriados. Comparado com o controle de veículo, a mAb anti-MAdCAM 7.16.6 causou um aumento aproximado de 3 vezes nos níveis de células T de memória central CD4+β 7+CD95hiCD28+ circu-lante, como mostrado na Figura 7. Não houve nenhum efeito sobre a população de células T de memória central CD4+β7-CD95hiCD28+ circu-lantes, indicando que o efeito de mAb anti-MAdCAM 7.16.6 é específico para células T que direcionam ao intestino. Os efeitos de mAb anti- MAdCAM 7.16.6, em cinomolgo, nas populações de linfócitos (α4)β7+ circulantes indica que esta é uma prova substituta robusta de mecanismo biomarcador, particularmente no contexto de aplicação prática em um cenário clínico.
Sequências
[000280] As SEQ ID NOs: 1 a 48 e 51 a 68 fornecem seqüências de nucleotídeo e aminoácido das cadeias pesada e capa leve para doze anticorpos anti-MAdCAM humanos, as seqüências de nucleotídeo e aminoácido das seqüências do domínio de ligação de α4β7 de MAd- CAM cinomolgo e seqüências de nucleotídeo e aminoácido de cinco anticorpos anti-MAdCAM humanos modificados.
[000281] As SEQ ID NO: 1 a 48 fornecem as seqüências de nucleo- tídeo e aminoácido de cadeia pesada e capa leve de doze anticorpos anti-MAdCAM monoclonais humano: 1.7.2 (SEQ ID NO: 1-4), 1.8.2 (SEQ ID NO: 5-8), 6.14.2 (SEQ ID NO: 9-12), 6.22.2 (SEQ ID NO: 1316), 6.34.2 (SEQ ID NO: 17-20), 6.67.1 (SEQ ID NO: 21-24), 6.73.2 (SEQ ID NO: 25-28), 6.77.1 (SEQ ID NO: 29-32), 7.16.6 (SEQ ID NO: 33-36), 7.20.5 (SEQ ID NO: 37-40), 7.26.4 (SEQ ID NO: 41-44) e 9.8.2 (SEQ ID NO: 45-48).
[000282] As SEQ ID NOs: 49-50 fornecem as seqüências de nucleo- tídeo e aminoácido de um domínio de ligação de α4β7 MAdCAM de ci- nomolgo.
[000283] As SEQ ID NOs: 51-68 fornecem as seqüência de nucleotí- deo e aminoácido de cadeia pesada e capa leve para os anticorpos monoclonais anti-MAdCAM modificados: 6.22.2 (SEQ ID NO: 51-54), 6.34.2 modificado (SEQ ID NO: 55-58), 6.67.1 modificado (SEQ ID NO: 59-62), 6.77.1 modificado (SEQ ID NO: 63-66) e as seqüências nu- cleotídeo e aminoácido de cadeia capa leve de anticorpos monoclo- nais anti-MAdCAM modificados: 7.26.4 modificado (SEQ ID NO: 6768).
[000284] As SEQ ID NOS: 70-106 e 108-110 fornecem várias se- qüências de iniciador. Chave: Seqüência Sinal: Caso inferior sublinhado Mudanças de aminoácido na seqüência de anticorpos anti-Mad-CAM modificados comparados à origem: Caso superior sublinhado

Claims (27)

1. Linhagem celular hibridoma, caracterizada pelo fato de que produz um anticorpo monoclonal humano que especificamente se liga à Molécula de Adesão Celular da Adressina Mucósica Humana (MAdCAM), em que o hibridoma é hibridoma ECACC No. de Acesso 03090901 (designação interna 1.7.2).
2. Anticorpo monoclonal, caracterizado pelo fato de que es-pecificamente se liga à Molécula de Adesão Celular da Adressina Mu- cósica Humana (MAdCAM) e inibe a ligação da α4β 7 à MAdCAM humana; em que a cadeia pesada do anticorpo ou porção de ligação ao antígeno compreende as sequências de aminoácidos da CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada, e em que a cadeia leve do anticorpo ou uma porção de ligação ao antígeno do mesmo compreende as sequências de aminoácidos da CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve, do anticorpo monoclonal produzido pelo hibridoma ECACC No. de Acesso 03090901 (designação interna 1.7.2).
3. Anticorpo monoclonal, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou porção de ligação ao an- tígeno do mesmo compreende as sequências de aminoácidos da cadeia pesada e leve do anticorpo monoclonal produzido pelo hibridoma ECACC No. de Acesso 03090901 (designação interna 1.7.2).
4. Anticorpo monoclonal ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo é o anticorpo monoclonal humano produzido pelo hibridoma ECACC No. de Acesso 03090901 (designação interna 1.7.2) ou um antígeno porção de ligação do mesmo.
5. Anticorpo monoclonal, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a lisina C-terminal da cadeia pesada é clivada.
6. Anticorpo monoclonal ou uma porção de ligação ao antí- geno do mesmo que se liga especificamente a MAdCAM e inibe a ligação de MAdCAM humano a α4β7, caracterizado pelo fato de que a cadeia pesada do anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo compreende as sequências de aminoácidos da CDR1, CDR2 e CDR3 na SEQ ID NO: 2 e a cadeia leve do anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo compreende as sequências de aminoácidos da CDR1, CDR2 e CDR3 na SEQ ID NO: 4.
7. Anticorpo monoclonal ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo compreende as sequências de aminoácidos definidas na SEQ ID NOs: 2 e 4 sem as sequências de sinal.
8. Anticorpo monoclonal ou porção de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 2 ou 6, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou porção compreende uma cadeia pesada que utiliza um gene humano VH 3-15.
9. Anticorpo monoclonal ou porção de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 2 ou 6, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou porção compreende uma cadeia leve que utiliza um gene humano VK A3.
10. Anticorpo monoclonal ou porção de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o refe-rido anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma ou mais das sequências de aminoácidos FR1, FR2, FR3 e FR4 do anticorpo monoclonal produzido pelo hibridoma ECACC N° de Acesso 03090901 (designação interna 1.7.2).
11. Anticorpo monoclonal ou porção de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o refe-rido anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo compreen- de uma ou mais das sequências de aminoácidos FR1, FR2, FR3 e FR4 na SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO : 4.
12. Anticorpo monoclonal ou porção de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a cadeia pesada e a cadeia leve compreendem as sequências de aminoá- cidos do início da CDR1 até o final da CDR3 da cadeia pesada e da cadeia leve, respectivamente, do anticorpo monoclonal produzido pelo hibridoma ECACC No. de Acesso 03090901 (designação interna 1.7.2).
13. Anticorpo monoclonal ou porção de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos do início da CDR1 até o final da CDR3 na SEQ ID NO: 2 e a cadeia leve compreende o aminoácido sequência do início do CDR1 até o final do CDR3 na SEQ ID NO: 4.
14. Anticorpo monoclonal ou porção de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que os domínios variáveis da cadeia pesada e da cadeia leve do anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo compreendem as sequências de aminoácidos do domínio variável da cadeia pesada e da cadeia leve, respectivamente, do anticorpo monoclonal produzido pelo hibridoma ECACC No. de Acesso 03090901 (designação interna 1.7.2).
15. Anticorpo monoclonal ou porção de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a cadeia pesada do anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo compreende a sequência de aminoácidos do domínio variável da cadeia pesada na SEQ ID NO: 2 e a cadeia leve do anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo compreende a sequência de amino- ácidos do domínio variável da cadeia leve na SEQ ID NO: 4.
16. Anticorpo monoclonal, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2, 6 e 8 a 15, caracterizado pelo fato de que é uma imunoglobulina G (IgG), uma IgM, uma IgE, uma IgA ou uma molécula de IgD, ou um anticorpo biespecífico.
17. Porção de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 4 e 6 a 15, caracterizada pelo fato de que é um fragmento Fab, um fragmento F(ab')2, um fragmento FV ou um anticorpo de cadeia única.
18. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o anticorpo monoclonal ou porção de ligação ao antí- geno, como definido em qualquer uma das reivindicações 2 a 17 e um veículo farmaceuticamente aceitável.
19. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 18, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um ou mais agentes antiinflamatórios ou imunomoduladores adicionais.
20. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 19, caracterizada pelo fato de que um ou mais agentes anti- inflamatórios ou imunomoduladores adicionais são selecionados do grupo consistindo em: corticosteroides, aminossalicilatos, azatioprina, metotrexato, ciclosporina, FK506, IL-10, GM-CSF, rapamicina, agentes anti-TNFα e antagonistas de moléculas de adesão.
21. Vacina, caracterizada pelo fato de que compreende o anticorpo monoclonal ou porção de ligação ao antígeno, como definido em qualquer uma das reivindicações 2 a 17, e um veículo farmaceuti- camente aceitável.
22. Vacina, de acordo com a reivindicação 21, caracterizada pelo fato de que a vacina é mucosal.
23. Kit de diagnóstico, caracterizado pelo fato de que com-preende o anticorpo monoclonal ou porção de ligação ao antígeno, como definido em qualquer uma das reivindicações 2 a 17.
24. Molécula de ácido nucleico isolada, caracterizada pelo fato de que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica a cadeia pesada ou uma porção de ligação ao antígeno da mesma ou a cadeia leve ou uma porção de ligação ao antígeno da mesma de um anticorpo que se liga especificamente a MAdCAM, em que a cadeia pesada ou a cadeia leve é codificada pela sequência de nucleotídeo selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 1 e 3 ou dita se-quência sem uma sequência sinal.
25. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende a molécula de ácido nucleico, como definida na reivindicação 24.
26. Vetor, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que o vetor compreende uma sequência de controle de expressão operacionalmente ligada à molécula de ácido nucleico.
27. Método para a produção de um anticorpo monoclonal ou porção de ligação ao antígeno do mesmo que se liga especificamente a MAdCAM, caracterizado pelo fato de que compreende cultivar a linhagem celular como definida na reivindicação 1 sob condições adequadas, e a recuperar o anticorpo ou porção de ligação ao antígeno.
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