KR20140127692A - 재조합 단백질, 이를 코딩하는 재조합 유전자, 재조합 벡터, 및 이를 포함하는 약학조성물 - Google Patents

재조합 단백질, 이를 코딩하는 재조합 유전자, 재조합 벡터, 및 이를 포함하는 약학조성물 Download PDF

Info

Publication number
KR20140127692A
KR20140127692A KR20130046366A KR20130046366A KR20140127692A KR 20140127692 A KR20140127692 A KR 20140127692A KR 20130046366 A KR20130046366 A KR 20130046366A KR 20130046366 A KR20130046366 A KR 20130046366A KR 20140127692 A KR20140127692 A KR 20140127692A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
leu
ala
ser
lys
arg
Prior art date
Application number
KR20130046366A
Other languages
English (en)
Inventor
박종상
최성현
배재성
진희경
Original Assignee
서울대학교산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 서울대학교산학협력단 filed Critical 서울대학교산학협력단
Priority to KR20130046366A priority Critical patent/KR20140127692A/ko
Publication of KR20140127692A publication Critical patent/KR20140127692A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6489—Metalloendopeptidases (3.4.24)
    • C12N9/6494—Neprilysin (3.4.24.11), i.e. enkephalinase or neutral-endopeptidase 24.11
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • A61K38/4886—Metalloendopeptidases (3.4.24), e.g. collagenase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/24—Metalloendopeptidases (3.4.24)
    • C12Y304/24011—Neprilysin (3.4.24.11), i.e. enkephalinase or neutral endopeptidase 24.11

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 막관통영역이 제거된 재조합된 용해성 네프릴라이신, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.

Description

재조합 단백질, 이를 코딩하는 유전자, 재조합 벡터, 이를 포함하는 약학조성물 및 알츠하이머 질병의 치료 또는 예방 방법{RECOMBINANT PROTEIN, RECOMBINANT GENE CODING THE SAME, RECOMBINANT VECTOR, PHARMACEUTICAL COMPOSITION COMPRISING THE SAME AND METHOD FOR TREATING OR PREVENTING ALZHEIMER DISEASE}
본 발명은 재조합 단백질, 이를 코딩하는 재조합 유전자, 재조합 백터에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 재조합 단백질을 포함하는 약학조성물 및 상기 재조합 단백질을 알츠하이머 질병의 치료 또는 예방에 사용하는 방법에 관한 것이다.
퇴행성 뇌질병 중의 하나인 알츠하이머병은 뇌의 신경세포가 퇴화, 뇌가 축소되어 건망증과 혼동 상태를 거쳐 결국 인격장애와 치매에 이르는 불치병이다. 알츠하이머병의 원인으로는 아밀로이드 베타(amyloid-beta)라고 불리는 단백질과 관련성이 높은 것으로 밝혀졌다. 아밀로이드 베타가 인체에 과도하게 만들어져 뇌세포에 축적되게 되면, 뇌의 신경세포 기능이 떨어져서 알츠하이머병이 발생한다고 한다. 아밀로이드 베타는 신경세포 내 미토콘드리아의 기능을 마비시키거나 왜곡시켜 미토콘드리아에서 배출되는 활성산소를 증가시키게 된다. 이렇게 증가된 활성산소는 세포 내 단백질이나 DNA에 치명적인 상처를 입히게 되고 결국 뇌세포의 손상 또는 사망(아포토시스)을 초래한다는 것이다.
알츠하이머 질병의 여러 원인 중에 하나인 아밀로이드 베타의 축적을 해결하기 위해 바이러스를 이용하여 치료 유전자를 주입하는 연구가 시도되고 있다. 하지만 유전자 치료법은 생체 내에 유전자를 주입하는 것이므로, 생체 내에 유전자가 주입되었을 때 면역(immune) 반응과 염증(inflammatory) 반응이 발생하며, 발현 양의 차이를 제어하기 어려운 문제 등 여러 가지 문제들이 있다.
Y. Liu et al., Molecular and Cellular Neuroscience 45 (2010) pp. 101-107
본 발명의 일 실시상태는 알츠하이머 질병의 치료 또는 예방에 유용한 재조합 단백질을 제공한다.
본 발명의 일 실시상태는 알츠하이머 질병의 치료 또는 예방에 유용한 재조합 단백질의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 또 하나의 실시상태는 알츠하이머 질병의 치료 또는 예방에 유용한 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 하나의 실시상태는 알츠하이머 질병의 치료 또는 예방 방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시상태는 네프릴라이신의 막 관통 영역이 제거된 서열을 갖고, 베타아밀로이드 분해 활성을 갖는 재조합 단백질을 제공한다.
본 발명의 일 실시상태는 네프릴라이신의 N 말단으로부터 51번째까지의 아미노산이 제거된 아미노산 서열을 포함하는 재조합 단백질을 제공한다.
본 발명의 또 하나의 실시상태는 네프릴라이신의 N 말단으로부터 97번째까지의 아미노산이 제거된 아미노산 서열을 포함하는 재조합 단백질을 제공한다.
본 발명의 또 하나의 실시상태는 네프릴라이신의 N 말단으로부터 195번째까지의 아미노산이 제거된 아미노산 서열을 포함하는 재조합 단백질을 제공한다.
본 발명의 또 하나의 실시상태는 네프릴라이신의 N 말단으로부터 300번째까지의 아미노산이 제거된 아미노산 서열을 포함하는 재조합 단백질을 제공한다.
본 발명의 또 하나의 실시상태는 네프릴라이신의 N 말단으로부터 352번째까지의 아미노산이 제거된 아미노산 서열을 포함하는 재조합 단백질을 제공한다.
본 발명의 또 하나의 실시상태는 네프릴라이신의 N 말단으로부터 528번째까지의 아미노산이 제거된 아미노산 서열을 포함하는 재조합 단백질을 제공한다.
본 발명의 또 하나의 실시상태는 서열번호 1 내지 6 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖거나 서열번호 1 내지 6 중 어느 하나의 아미노산 서열과 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상, 더욱 바람직하게는 98% 이상 상동성을 가진 서열을 갖고 베타아밀로이드 분해 활성을 재조합 단백질을 제공한다.
본 발명의 또 하나의 실시상태는 상기 재조합 단백질의 제조방법을 제공한다. 구체적으로, 상기 재조합 단백질의 제조방법은 상기 네프릴라이신의 막 관통 영역이 제거된 서열을 갖고 베타아밀로이드 분해 활성을 갖는 재조합 단백질; 네프릴라이신의 N 말단으로부터 51번째, 97번째, 195번째, 300번째, 403번째까지, 또는 528번째까지의 아미노산이 제거된 아미노산 서열을 포함하는 재조합 단백질; 또는 서열번호 1 내지 6 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖거나 서열번호 1 내지 6 중 어느 하나의 아미노산 서열과 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상, 더욱 바람직하게는 98% 이상 상동성을 가지는 서열을 갖고 베타아밀로이드 분해 활성을 갖는 재조합 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제조하는 단계; 상기 재조합 벡터를 이용하여 상기 유전자를 발현시키는 단계; 및 발현된 재조합 단백질을 분리하는 단계를 포함하는 재조합 단백질의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 또 하나의 실시상태는 네프릴라이신의 막 관통 영역이 제거된 서열을 갖고 베타아밀로이드 분해 활성을 갖는 재조합 단백질; 네프릴라이신의 N 말단으로부터 51번째, 97번째, 195번째, 300번째, 403번째까지, 또는 528번째까지의 아미노산이 제거된 아미노산 서열을 포함하는 재조합 단백질; 또는 서열번호 1 내지 6 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖거나 서열번호 1 내지 6 중 어느 하나의 아미노산 서열과 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상, 더욱 바람직하게는 98% 이상 상동성을 가지는 서열을 갖고 베타아밀로이드 분해 활성을 갖는 재조합 단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다. 상기 유전자의 한 예를 서열번호 8에 나타내었다.
본 발명의 또 하나의 실시상태는 네프릴라이신의 막 관통 영역이 제거되고, 베타아밀로이드 분해 활성을 갖는 재조합 단백질; 네프릴라이신의 N 말단으로부터 51번째, 97번째, 195번째, 300번째, 403번째까지, 또는 528번째까지의 아미노산이 제거된 아미노산 서열을 포함하는 재조합 단백질; 또는 서열번호 1 내지 6 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖거나 서열번호 1 내지 6 중 어느 하나의 아미노산 서열과 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상, 더욱 바람직하게는 98% 이상 상동성을 가지는 서열을 갖고 베타아밀로이드 분해 활성을 갖는 재조합 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명의 또 하나의 실시상태는 상기 재조합 단백질을 유효성분으로 하는 알츠하이머 질병의 치료 또는 예방 제제를 제공한다.
본 발명의 또 하나의 실시상태는 상기 재조합 단백질을 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 구체적으로, 상기 약학 조성물은 알츠하이머 질병 치료 또는 예방용으로 사용될 수 있다.
본 발명의 또 하나의 실시상태는 상기 재조합 단백질 또는 이를 포함하는 약학 조성물을 이용하여 포유류의 알츠하이머 질병을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 이 때, 상기 포유류는 인간을 제외한 포유류이다.
본 발명에 따른 막관통영역을 제거한 재조합 단백질 단백질은 알츠하이머 질병을 겪고 있는 환자들에게 주입되어 뇌에 축적된 아밀로이드 베타를 감소시키는데 영향을 미친다. 이로 인해 환자의 감소된 기억력과 인지력을 개선시킬 수 있다. 특히, 본 발명에 따르면, 유전자가 아닌 단백질을 이용한 치료 또는 예방법을 이용하므로, 적용(application)이 용이하고, 치료가 필요한 부분에 국소적으로 치료부위-특이성(site-specific)을 달성할 수 있다. 따라서, 무엇보다 환자에게 안정감(compliance)과 편안함(comfort)을 제공할 수 있다. 또한, 유전자에 비하여 단백질을 생체내로 전달하는 시스템 개발이 용이하다.
도 1은 네프릴라이신의 막관통영역 제거 전의 특성을 나타낸 모식도이다.
도 2 및 도 3은 예시적인 벡터의 모식도이다.
도 4는 pBAC-6 벡터의 재조합 형태의 모식도이다.
도 5 내지 8은 재조합 단백질의 정제시 컬럼으로부터 얻은 결과를 도시한 것이다.
도 9는 재조합 단백질의 웨스턴 블로팅 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 재조합 단백질의 활성을 나타낸 그래프이다.
도 11은 Aβ 레벨 및 세포 생존력의 평가를 위한 단계들의 모식도이다.
도 12 및 도 13은 각각 실험구와 대조구에서 Aβ 레벨과 세포 생존력을 나타낸 것이다.
도 14 및 도 15는 TUNEL 어세이를 이용하여 Aβ-유도된 세포 사멸 결과를 나타낸 것이다.
도 16은 APP/PSI 마우스에서의 대뇌 피질과 해마에서의 네프릴라이신 발현율을 나타낸 것이다.
도 17은 네프릴라이신(NEP) 발현이 재조합 용해성 네프릴라이신(NEP)에 의하여 상승되는지를 결정하기 위한 실험단계의 모식도이다.
도 18 및 도 19는 해마에 주입된 재조합 용해성 네프릴라이신(NEP)로부터의 높은 레벨의 네프릴라이신(NEP) 발현이 APP/PS1 마우스의 뇌에서 감소된 네프릴라이신(NEP) 레벨의 상승을 이끌 수 있다는 것을 나타내는 도면이다.
도 20 및 도 21은 대뇌 피질과 해마에서의 Aβ침작은 PBS 주입된 대조구에 비하여 재조합 용해성 네프릴라이신(NEP) 처리된 동물에서 극적인 감소를 나타내는 도면이다.
도 22 및 도 24는 제조합 용해성 네프릴라이신(NEP) 주입된 군에서는, PBS 이식된 군에 비하여, G30 및 20G10의 양성 플라크의 수는 상당히 낮아진 것을 나타내는 사진이다.
도 23 및 도 25는 G30 및 20G10 양성 플라크가 재조합 용해성 네프릴라이신(NEP) 주입된 APP/PS1 마우스들에서 동일 월령의 PBS 주입된 대조구에서보다 더 작았다는 것을 나타낸 정량적 이미지 분석 결과이다.
도 26 및 도 27은 안티-글리아 피빌러리 엑시딩 프로테인(glia fibillary acidic protein, GFAP) 항체로 뇌 섹션을 염색하였음에도 불구하고, 재조합 용해성 네프릴라이신(NEP) 처리된 마우스의 대뇌피질 및 해마에서 GFAP-양성 성상 세포의 출현에 어떠한 차이점도 관찰되지 아니한 도면이다.
도 28은 재조합 용해성 네프릴라이신(NEP) 처리된 마우스들은 모리스 수중 미로에서 플랫폼을 찾는 능력이 향상된 것을 나타낸 그래프이다.
도 29는 마우스의 수영 경로를 나타내는 것으로서, 공간 학습 습득이 PBS를 받은 마우스들에서보다 재조합 용해성 네프릴라이신(NEP)이 주입된 APP/PS1 마우스들에서 훨씬 더 향상되었음을 나타낸다.
도 30은 재조합 용해성 네프릴라이신(NEP) 주입된 APP/PS1 마우스들은 PBS 주입된 APP/PS1 마우스들보다 플랫폼 주변의 표적 지점에서 상당히 더 오랜 시간을 보냈음을 나타내는 그래프이다.
도 31은 작은 표적 지점에 들어간 횟수가 PBS 주입된 마우스들보다 재조합 용해성 네프릴라이신(NEP) 처리된 마우스들에서 증가되었음을 나타내는 그래프이다.
본 발명의 일 실시상태는 네프릴라이신의 막 관통 영역이 제거된 서열을 갖고 베타아밀로이드 분해 활성을 갖는 재조합 단백질; 네프릴라이신의 N말단으로부터 51번째, 97번째, 195번째, 300번째, 403번째까지, 또는 528번째까지의 아미노산이 제거된 아미노산 서열을 포함하는 재조합 단백질; 또는 서열번호 1 내지 6 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖거나 서열번호 1 내지 6 중 어느 하나의 아미노산 서열과 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상, 더욱 바람직하게는 98% 이상 상동성을 가지는 서열을 갖고 베타아밀로이드 분해 활성을 갖는 재조합 단백질을 제공한다.
서열번호 1 내지 6는 각각 인간의 네프릴라이신의 아미노산 서열 중 N 말단으로부터 51번째, 97번째, 195번째, 300번째, 403번째까지, 또는 528번째까지의 아미노산이 제거된 아미노산 서열이다. 야생형 인간의 네프릴라이신의 아미노산 서열은 서열번호 7과 같다. 서열번호 1 내지 7에 있어서, *은 어떠한 아미노산이 위치해도 좋은 것을 의미한다.
네프릴라이신은 타입 II 막관통 단백질 분해효소로서, 도 1에 도시한 바와 같이 네프릴라이신의 N 말단은 세포 안 쪽에, C 말단은 세포 바깥쪽으로 나와있는 형태를 갖는다. 본 발명의 상기 실시상태에서는 유전자 재조합을 통하여 네프릴라이신으로부터 막관통영역을 포함하는 N 말단부로부터 특징 길이의 영역을 제거함으로써 재조합 단백질을 제조할 수 있다. 이 재조합 단백질은 용해가능한(용해성) 형태로 분비(secretion)되어 세포 밖에 축적된 베타아밀로이드 베타를 훨씬 더 효율적으로 제거할 수 있다. 본 명세서에 있어서, 베타아밀로이드 분해 활성이란, 베타 아밀로이드를 작은 단편으로 자르거나, 활성 사이트를 방해함으로써 베타아밀로이드의 활성을 없애는 기능을 의미한다.
본 발명에 있어서, 네프릴라이신의 막 관통 영역이 제거된 서열을 갖고, 베타아밀로이드 분해 활성을 갖는 재조합 단백질이란, 네프릴라이신의 막 관통 영역에 해당하는 서열을 포함하지 않는 동시에, 네프릴라이신의 베타아밀로이드 분해 활성을 갖는 서열을 포함하는 재조합 단백질을 의미한다.
상기 재조합 단백질은 네프릴라이신의 막관통영역을 포함하는 N 말단 부위, 예컨대 N 말단으로부터 51번째, 97번째, 195번째, 300번째, 403번째까지, 또는 528번째까지의 아미노산을 포함하지 않는 한, 다른 아미노산 서열을 더 포함할 수도 있다. 예컨대, 상기 재조합 단백질은 벡터의 유전자서열로부터 코딩된 아미노산 서열을 더 포함할 수 있다. 하나의 예로서, 서열번호 9 및 10은 각각 pBAC 벡터 자체의 유전자 서열 및 이로부터 코딩된 아미노산 서열이다. pBAC 벡터를 사용하여 재조합 단백질을 제조하는 경우, 재조합 단백질은 pBAC 벡터 자체의 유전자 서열로부터 코딩된 아미노산 서열을 더 포함할 수 있다. 서열번호 1의 재조합 단백질을 pBAC 벡터를 이용하여 제조하는 경우, 재조합 단백질을 코딩하는 유전자 서열을 포함하는 pBAC 벡터의 유전자 서열을 서열번호 11에 나타내었고, 이로부터 코딩된 아미노산 서열을 서열번호 12에 나타내었다.
또한, 상기 재조합 단백질은 이 단백질이 세포외로 분비되도록 하는 신호 서열, 표적 위치까지 재조합 단백질을 수송하기 위한 서열 또는 단백질 정제를 위한 서열 등을 더 포함할 수 있다.
상기 재조합 단백질은 PTD(protein transduction domain)을 더 포함할 수 있다. 상기 PTD는 상기 재조합 단백질의 말단에 1개 또는 2개 이상 결합되어 있을 수 있다. 상기 PTD는 상기 재조합 단백질의 N 말단 또는 C 말단 또는 둘 다에 결합되어 있을 수 있으며, C 말단에 결합되어 있는 것이 더욱 바람직하다. 상기 PTD는 상기 재조합 단백질이 표적 부위, 구체적으로 표적 세포의 내부 또는 표적 세포의 핵 내부로까지 침투할 수 있도록 도울 수 있다. 상기 PTD는 알지닌(arginine) 및/또는 라이신(lysine)이 결합될 수 있는 부위이며, 이들의 결합에 의하여 재조합 단백질이 표적 세포 내로 용이하게 이동할 수 있다. 상기 PTD로는 당기술분야에 알려져 있는 서열이 사용될 수 있으며, 예컨대 TAT 서열이 사용될 수 있다. TAT 서열이 상기 재조합 단백질의 N 말단에 결합된 예를 서열번호 13에 나타내었다. 서열번호 13은 pBAC-6-TAT-재조합 네프릴라이신(NEP) 서열을 나타낸다. 여기서, 재조합 네프릴라이신은 서열번호 1의 재조합 단백질이다. 서열번호 13 중 "GRKKRRQRRRPPQ"가 TAT 서열이고, "YDDGICKSSDCIKSAARLIQNMDATTEPCTDFFKYACGGWLKRNVIPETSSRYGNFDILRDELEVVLKDVLQEPKTEDIVAVQKAKALYRSCINESAIDSRGGEPLLKLLPDIYGWPVATENWEQKYGASWTAEKAIAQLNSKYGKKVLINLFVGTDDKNSVNHVIHIDQPRLGLPSRDYYECTGIYKEACTAYVDFMISVARLIRQEERLPIDENQLALEMNKVMELEKEIANATAKPEDRNDPMLLYNKMTLAQIQNNFSLEINGKPFSWLNFTNEIMSTVNISITNEEDVVVYAPEYLTKLKPILTKYSARDLQNLMSWRFIMDLVSSLSRTYKESRNAFRKALYGTTSETATWRRCANYVNGNMENAVGRLYVEAAFAGESKHVVEDLIAQIREVFIQTLDDLTWMDAETKKRAEEKALAIKERIGYPDDIVSNDNKLNNEYLELNYKEDEYFENIIQNLKFSQSKQLKKLREKVDKDEWISGAAVVNAFYSSGRNQIVFPAGILQPPFFSAQQSNSLNYGGIGMVIGHEITHGFDDNGRNFNKDGDLVDWWTQQSASNFKEQSQCMVYQYGNFSWDLAGGQHLNGINTLGENIADNGGLGQAYRAYQNYIKKNGEEKLLPGLDLNHKQLFFLNFAQVWCGTYRPEYAVNSIKTDVHSPGNFRIIGTLQNSAEFSEAFHCRKNSYMNPEKKCRVW*" 서열이 재조합 네프릴라이신(NEP) 서열이다.
본 발명의 또 하나의 실시상태는 상기 재조합 단백질의 제조방법을 제공한다. 구체적으로, 상기 재조합 단백질의 제조방법은 전술한 재조합 단백질을 코팅하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제조하는 단계; 상기 재조합 벡터를 증폭 및 발현시키는 단계; 및 발현된 재조합 단백질을 분리하는 단계를 포함하는 재조합 단백질의 제조방법을 제공한다.
여기서, 상기 재조합 단백질을 코딩하는 유전자는 네프릴라이신의 막 관통 영역이 제거된 서열을 갖고, 베타아밀로이드 분해 활성을 갖는 재조합 단백질; 네프릴라이신의 N 말단으로부터 51번째, 97번째, 195번째, 300번째, 403번째까지, 또는 528번째까지의 아미노산이 제거된 아미노산 서열을 포함하는 재조합 단백질; 또는 서열번호 1 내지 6 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖거나 서열번호 1 내지 6 중 어느 하나의 아미노산 서열과 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상, 더욱 바람직하게는 98% 이상 상동성을 가지는 서열을 갖고 베타아밀로이드 분해 활성을 갖는 재조합 단백질을 코딩하는 유전자이다. 상기 재조합 단백질을 코딩하는 유전자의 한 예는 서열번호 8의 서열 또는 이 서열과 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상, 더욱 바람직하게는 98% 이상의 상동성을 가지는 서열을 갖고 베타아밀로이드 분해 활성을 갖는 재조합 단백질을 코딩하는 유전자이다. 상기 서열번호 8는 인간의 네프릴라이신을 코딩하는 유전자에서 N 말단으로부터 서열<ATGGGCAAGTCAGAAAGTCAGATGGATATAACTGATATCAACACTCCAAAGCCAAAGAAGAAACAGCGATGGACTCGACTGGAGATCAGCCTCTCGGTCCTTGTCCTGCTCCTCACCATCATAGCTGTGAGAATGATCGCACTCTATGCAACC>이 제외된 것이다. 이 유전자 서열로부터 서열번호 1의 재조합 단백질이 코딩될 수 있다.
상기 유전자는 당기술분야에 알려져 있는 방법에 의하여 제조될 수 있다. 예컨대, 네프릴라이신의 막 관통 영역이 제거되고, 베타아밀로이드 분해 활성을 갖는 재조합 단백질; 네프릴라이신의 N 말단으로부터 51번째, 97번째, 195번째, 300번째, 403번째까지, 또는 528번째까지의 아미노산이 제거된 아미노산 서열을 포함하는 재조합 단백질; 또는 서열번호 1 내지 6 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖거나 서열번호 1 내지 6 중 어느 하나의 아미노산 서열과 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상, 더욱 바람직하게는 98% 이상 상동성을 가지는 서열을 갖고 베타아밀로이드 분해 활성을 갖는 재조합 단백질을 코딩하는 유전자 서열은 클로닝 과정을 통하여 제조될 수 있다.
상기 재조합 벡터는 전술한 재조합 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 것을 제외하고는 당기술분야에 공지된 것들을 사용할 수 있다. 하나의 예로서, pBAC-6 벡터가 사용될 수 있다(도 2). 또 하나의 예로서, pLEXm 벡터가 사용될 수 있다(도 3). 상기 벡터는 전술한 재조합 단백질을 발현할 수 있는 것이라면 특별히 한정되지 않는다.
상기 벡터는 재조합 단백질이 세포 밖으로 분비(secretion)되게 하는 신호 서열(signal sequence)을 포함하는 것이 바람직하다. 이와 같은 신호 서열에 의하여 상기 재조합 단백질은 발현된 후 세포 밖으로 분비되므로, 정제시 세포를 파열하는 과정없이 효율적으로 이루어질 수 있다. 상기 신호 서열은 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 앞쪽에 위치할 수 있다.
또한, 상기 벡터는 단백질 정제시 필요한 서열을 포함하는 것이 바람직하다. 다시 말하면, 상기 벡터는 단백질 정제 방법에서 식별가능한 단백질을 코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 예컨대, 친화성 컬럼(affinity column)을 이용하는 경우, 상기 벡터는 사용되는 컬럼과 친화도(affinity)를 갖는 아미노산을 코딩하는 유전자 서열을 포함할 수 있다. 더욱 구체적인 예로서, HIS-TAG 컬럼을 사용하는 경우, 히스티딘이 컬럼에 결합하는 방식에 의하여 단백질을 정제할 수 있으므로, 상기 벡터는 1~20개, 예컨대 6개의 히스티딘을 코딩하는 유전자 서열을 포함할 수 있다. 다른 예로서, 단백질 정제시 젤 여과 컬럼(gel filteration column) 또는 크기 배제 컬럼(size exclusion column)을 사용하는 경우에는, 상기 벡터는 단백질의 크기를 제어함으로써 단백질을 식별할 수 있도록 하는 유전자 서열을 포함할 수 있다.
또한, 상기 벡터는 번역(translation)시 필요한 kozak 서열을 포함할 수 있다. Kozak 서열은 당 기술분야에 알려져 있는 서열들이 사용될 수 있으며, 예컨대 GCCACC가 사용될 수 있다. 상기 kozak 서열은 상기 재조합 단백질을 코딩하는 유전자의 앞에, 상기 신호 서열이 존재하는 경우에는 상기 신호 서열 앞에 위치할 수 있다.
상기 재조합 벡터를 발현하는 단계는 상기 재조합 벡터를 숙주 세포에 트렌스펙션(transfection)하여 수행될 수 있다.
코-트렌스펙션(co-transfection) 방법을 이용하여 숙주 세포에 재조합 벡터를 삽입하고, 배양함으로써 수행될 수 있다.
필요한 경우, 상기 재조합 벡터가 삽입된 숙주 세포의 수를 증폭시키는 단계를 더 포함할 수 있다. 예컨대, 상기 재조합 벡터가 삽입된 숙주 세포를 바이러스에 삽입하여 바이러스를 배양함으로써 상기 숙주 세포를 수를 증가시킬 수 있다. 이 단계는 필요에 따라 1회 내지 5회 반복될 수 있다.
필요한 경우, 상기 단백질을 발현시키는 과정을 대규모로 진행할 수 있다. 이 때, 대규모로 발현을 시행하기 전에 재조합 단백질 발현이 효율적으로 이루어지는 조건을 찾기 위하여 소규모 테스트를 수행할 수 있다. 소규모 테스트로는 MOI(multiplicity of infection) 의존 단백질 발현(MOI dependent protein expression) 테스트를 수행할 수 있다. 이 테스트를 통하여 적절한 바이러스 양과, 이에 따른 적절한 배양 기간 및 배양 조건을 찾을 수 있다. 여기서, 적절하다는 것은 효율적으로 다량의 재조합 단백질을 발현시킬 수 있다는 것을 의미한다. 이와 같은 테스트를 통하여 대규모 발현이 효율적으로 이루어질 수 있다.
본 발명의 하나의 실시상태에 따르면, 상기 재조합 벡터를 발현하는 단계는 a) 상기 재조합 벡터를 숙주 세포에 삽입하는 단계; b) 상기 숙주 세포를 바이러스에 삽입하여 배양함으로써 재조합 벡터를 증폭하는 단계; 및 c) 상기 증폭된 재조합 벡터로부터 상기 재조합 단백질을 발현하는 단계를 포함한다. 여기서 상기 b) 단계와 상기 c) 단계 사이에 전술한 소규모 발현 테스트, 예컨대 MOI 의존 단백질 발현 테스트를 통하여 상기 c) 단계에서의 효율적인 조건을 찾을 수 있다.
상기 숙주 세포로는 동물 세포가 이용될 수 있다. 동물 세포에는 포유류 세포 뿐만 아니라 곤충 세포가 이용될 수 있다. 숙주 세포의 종류에 따라 전술한 벡터의 종류가 선택될 수 있다.
예컨대, pBAC-6 벡터를 이용하는 경우 숙주 세포로서 곤충 세포를 이용할 수 있다. 곤충 세포를 사용하는 경우, 재조합 단백질의 발현 후, 이를 분리할 때 스핀-다운(spin-down)시킨 후 상층액을 수거함으로써 간단하게 이루어질 수 있는 장점이 있다. 예컨대, SF9, SF21, TriEx SF9 세포를 이용할 수 있다. SF21는 코-트렌스펙션에 유용하며, SF9, TriEx SF9는 재조합 벡터를 증폭하고, 재조합 단백질을 발현시키고, 단백질을 정제하는데 유용하다.
또 하나의 예로서, pLEXm 벡터를 이용하는 경우 포유류의 세포를 이용할 수 있다. 포유류의 세포라면 특별히 제한되지 않으며, 현재 시판되는 HEK293 세포를 이용할 수도 있다.
상기 바이러스 또는 상기 숙주 세포로부터 재조합 단백질을 분리하는 방법은 당기술분야에 알려져 있는 방법을 이용할 수 있다.
상기 재조합 단백질이 숙주 세포 내에 존재하는 경우에는 숙주 세포를 파열시키는 단계를 거친다.
전술한 바와 같이, 상기 재조합 벡터가 신호 서열을 포함하여 재조합 단백질 발현 후 세포 밖으로 분비되면, 숙주 세포를 파열시키는 단계를 수행할 필요가 없다.
숙주 세포의 파열 후, 또는 세포 밖으로 분비된 재조합 단백질을 포함하는 배지를 가라앉힌 후(spin-down), 재조합 단백질이 포함된 상층액을 수거한다.
필요한 경우, 상기 상층액 중에 배지 등의 이물질을 제거하기 위하여 여과과정을 수행할 수 있다. 이를 TFF(tangential flow filtration)이라고 할 수 있다.
상기 여과과정 이후에, 단백질을 정제한다. 정제방법은 당 기술분야에 알려져 있는 방법을 이용할 수 있다. 정제는 1 단계로 수행할 수 있으나, 필요에 따라 2 단계 이상을 수행할 수 있다. 정제방법으로는 친화도 컬럼(affinity column), 젤 여과 컬럼(gel filteration column), 사이즈 배제 컬럼(size exclusion column), 이온 교환 컬럼(ion exchange column) 등이 사용될 수 있으며, 종류가 다른 컬럼을 순차적으로 사용함으로써 단백질의 순도를 높일 수 있다.
상기와 같은 정제 과정 이후에, 내독소(endotoxin) 제거 과정을 추가로 수행할 수 있다. 단백질을 정제하는 과정 중에 공기중에 노출되어 있기 때문에 시험관내(in vitro)나 생체내(in vivo)에서 실험할 때 오류를 발생할 수 있다. 특히, 동물 실험시 내독소로 인해 염증반응이 일어나면 몸안의 면역반응으로 단백질의 효과가 더 있는 것처럼 데이터가 나올 수 있으므로, 이를 차단하기 위하여 내독소를 제거할 수 있다. 상기 내독소 제거 과정은 컬럼을 이용한 방법을 이용할 수 있다.
본 발명의 또 하나의 실시상태는 상기 재조합 단백질을 유효성분으로 하는 알츠하이머 질병의 치료 또는 예방 제제를 제공한다.
본 발명의 또 하나의 실시상태는 상기 재조합 단백질을 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 구체적으로, 상기 약학 조성물은 알츠하이머 질병 치료 또는 예방용으로 사용될 수 있다. 상기 약학 조성물은 상기 재조합 단백질 이외에 부형제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 부형제는 상기 약학 조성물이 생체 내에 투입되는 방식 또는 생체의 종류에 따라 선택될 수 있다.
상기 제제 또는 약학 조성물은 환자의 뇌에 직접 주사될 수 있다. 그러나, 이에 한정되는 것은 아니며, 환자의 다른 부분에 주사 또는 분무될 수 있다. 예컨대 비강내 주사 또는 분무 방법이 이용될 수 있다. 이 때, 상기 제제 또는 약학 조성물은 버퍼 용액에 용해 또는 현택된 상태이거나, 주사 또는 분무에 적합한 용액이 사용될 수 있다.
비강내에 주사 또는 분무시 키토산이 함께 사용될 수 있다. 키토산은 비강내로 주입된 상기 제제 또는 약학 조성물이 표적 부위인 뇌에 전달되는 효율을 높일 수 있다. 구체적으로, 비강 내의 점액 중에서, 또는 세포들 사이에서, 키토산의 양전하를 띠는 아미노기가 음전하를 띠는 아미노산과 상호작용을 하여, 강한 결합 (tight junction)을 형성함으로써 친수성 화합물이 상피를 통과하여 수송되도록 할 수 있다.
본 발명의 또 하나의 실시상태는 상기 재조합 단백질 또는 이를 포함하는 약학 조성물을 이용하여 포유류의 알츠하이머 질병을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 이 때, 상기 포유류는 인간을 제외한 포유류이다.
상기 재조합 단백질은 단독으로 또는 생체 내에 투여되기 위한 부형제와 함께 투여될 수도 있고, 추가의 약학적 성능을 갖는 유효물질이 병용 투여될 수도 있다.
이하에서는 구체적인 실시예를 통하여 본 발명을 예시한다. 그러나, 이하의 예시에 의하여 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
재조합 벡터의 구성
인간의 네프릴라이신(NEP)의 세포외 도메인을 인코딩하는 유전자(52-750)를 pBAC-6 (Novagen) 벡터 내로 클로닝하였다. pBAC-6 수송 플라스미드를 이용함으로써 단백질을 발현하는 곤충 세포 주를 안정하게 트렌스펙션시켰다. 상기 벡터는 gp64 프로모터, his-tag 및 gp64 신호 서열을 포함하였고, 이들에 의하여 감염된 곤충 세포의 분비 경로로 고농도의 재조합 단백질이 향할 수 있었다.
코-트렌스펙션( Co - transfection )
Sf9 세포를 sf-900TM II SFM 배지 (Thermo scientific) 중의 ml 당 2×106 세포 농도로 25 cm2 T-플라스크 내에 뿌렸다(seeding). 15분 후, 상기 세포들을 신선한 배지(fresh medium)로 2회 세척한 후, 0.5 μg 배큘로바이러스(baculovirus) DNA (BDsciences, BaculoGold), pBAC-6-NEP 플라스미드, 및 20 μg 셀펙틴(cellfectin)을 이용하여 트렌스펙션시켰다. 4시간 후에 신선한 배지로 교체함으로써 트렌스펙션을 중단하였다. 트렌스펙션 후 5일째 세포를 수거하였다.
바이러스 증폭( Virus amplification )
MOI(multiplicity of infection) 테스트 후 TriEx sf9 세포의 감염에 의하여 재조합 배큘로바이러스를 3배 증폭시켰다. 재조합 바이러스의 증폭된 전체 체적은 500 ml까지 되었다.
확장 발현( Scaled - up expression )
대규모 발현(2 L)이 TriEx sf9 세포를 이용하여 수행되었다. 세포를 포함하는 상층액을 원심분리(1000 g, 10 min, 4 ℃)에 의하여 수거하였다. 상층액을 TFF(Tangential Flow Filtration, Pall corporation)에 의하여 점진적으로 50ml까지 농축하고, HiTrap 바인딩 버퍼 A (20 mM Tris-HCl pH 7.5, 500 mM NaCl, 35 mM imidazole)를 이용하여 교환하였다. 농축된 상층액을 4℃에서 30분간 18000 rpm으로 원심분리하여 투명하게 하고, 미리 버퍼 A에서 균형을 유지시킨 HiTrap 킬레이팅 HP 컬럼 (GE Healthcare)에 적용하였다. 컬럼에 결합된 단백질을 선형 그레디언트(linear gradient)의 버퍼 B(20 mM Tris-HCl pH 7.5, 500 mM NaCl, 1 M imidazole)를 이용하여 용출시켰다. 용출된 샘플을 버퍼 C (20 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM NaCl)로 균형을 유지시킨 HiLoad 16/600 Superdex 200 prep-grade 컬럼 (GE Healthcare) 상에서의 젤 여과에 의하여 추가로 정제하였다. 정제된 용해성 네프릴라이신(NEP)를 아미콘 울트라-10K 원심 필터 장치(Millipore)를 이용하여 농축하였다. .
내독소 제거( Endotoxin removal )
디톡시-젤(Detoxi-gel) 수지(Thermo Scientific)를 수지 부피 4배의 발열원 비함유 물(pyrogen-free water, Promega)로 균형을 유지하였다. 발열원 비함유 물을 첨가하면서 상기 컬럼에 샘플을 적용한 후, 컬럼을 통과한 물질을 수집하였다. 임의의 결합된 내독소의 제거를 위하여 디톡시-젤 수지를 수지 부피의 5배의 1% 나트륨 디옥시콜레이트(Sigma-Aldrich)로 세정하였다.
용해성 네프릴라이신 ( NEP ) 활성 어세이
용해성 네프릴라이신(NEP)의 측정은 기질인 글루타릴-Ala-Ala-Phe-4-메톡시-2-나프틸아미드(Sigma, St. Louis, MO)를 이용하여 수행하였다. 반응 혼합물은, 전체 체적 0.9 ml 중에, 200 mM MES 버퍼 (2-(N-모폴리노)에탄술폰산, Sigma) 중의 40 mM 기질 0.5 ml, 10 mM MES 버퍼 중의 용해성 네프릴라이신(NEP) 0.3 ml, pH 6.5의 물 0.1 ml을 포함하였다. 37℃에서 1시간 배양 후, 10 mM MES 버퍼 혼합물 중의 0.5 mM 포스포르아미돈(phosphoramidon) (Sigma-Aldrich)/ 마이크로좀 루신아미노펩타이드(microsomal leucineaminopeptidase) (Sigma) 0.1 ml을 첨가하고, 추가 20분간 반응을 진행시켰다. 여기 파장 340 nm 및 발광 파장 425 nm에서 형광 발광이 관찰되었다.
동물( Animals )
hAPP695swe (APPswe) 및 PS-1M146V (PS1) 돌연변이를 각각 과발현하는 유전자 도입 마우스 라인을 C57BL/6 야생형(wild type) (Charles River, UK) 상의 표준 기술을 이용하여 글락소스미스클라인(GlaxoSmithKline)(Harlow, UK)에서 발생시켰다. 이중 잡종 돌연변이 마우스 (APP/PS1)를 생산하기 위하여, APPswe 마우스를 PSI 마우스와 교배하기 전에 순종 C57BL/6 백그라운드 상에서 역교배시켰다. 모든 과정은 경북대학교 동물실험윤리위원회(Institutional Animal Care and Use Committee, IACUC)에 의하여 승인된 동물 프로토콜에 따라 수행하였다. 동물은 12 h /12 h 낮/밤 사이클에서 제어된 온도 하의 공간에 머물도록 하였다.
해마 세포 배양( Hippocampal cell culture )
E18 C57BL/6 마우스로부터 해마 뉴런을 준비하였다. 해마를 절개한 후, 분리하여 37℃에서 15분간 파파인(papain)에서 배양하였다. 뉴런을 5% CO2의 습한 대기 중의 37℃에서 폴리-L-라이신 코팅된 커버글라스 상에 플레이팅하였다. 뉴런의 생존력 어세이를 위하여, 24-웰 플레이트 내에 웰당 5 × 104 세포의 밀도로 뿌렸다(seeding). 셀이 기질에 부착한 후, 2% B27 보충물 (GIBCO), 1 mM 글루타맥스(Glutamax) 보충물 (GIBCO) 및 100 U/ml 스트렙토마이신/100 U/ml 페니실린(GIBCO)을 갖는, 뉴런 배양 배지인 무혈청 Neurobasal 배지(GIBCO)로 배지를 대체한 후, 해마 뉴런의 숙성을 의하여 필요한 시간 동안 재배양하였다. 두번째 날에, 비뉴런 세포 분할은 5 μM 사이토신 아라비노사이드(cytosine arabinoside) (Sigma)에 의한 배양에 의하여 억제되었다. 세포 배양은 3일마다 신선한 Neurobasal 배지 (2% B27 보충물)로 교체되었다.
Aβ 제조 및 재조합된 용해성 네프릴라이신 ( NEP ) 치료
Aβ1-42 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)를 PBS 중에 용해하여 최종 농도가 10 nM이 되도록 하였다. 이어서, Aβ1-42 용액을 37℃에서 3일간 배양하여 뭉쳐진(aggregated) 형태(즉 올리고머 및 섬유상 Aβ 함유)를 생성하였고, 이어서 웰당 10 mM Aβ1- 42 를 적용하고, 재조합 용해성 네프릴라이신의 웰당 500 ng를 24시간 동안 적용하였다. 해마 세포 배양 이외에 Aβ1-42 및 재조합 용해성 네프릴라이신(NEP)을 배지에서 원하는 레벨로 희석하였다.
WST - 1를 이용한 세포 생존력( cell viability ) 어세이
뉴런 생존의 평가를 위하여, WST-1 어세이(Roche)를 제조자의 지시에 따라 수행하였다. 간단히 설명하면, 전술한 바와 같이 제조한 해마 뉴런으로부터 얻은 배지를 500　μl의 신선한 Neurobasal 배지(2 % B27 보충물 함유)로 대체하고; 50　μl의 세포 확산 시약 WST-1 (Roche)을 각 웰에 첨가하고, 다양한 시간(30분 내지 4시간) 동안 습한 배양기에서 5 % CO2 하에서 37　℃에서 배양하였다. 음성 대조구(단지 배지 + WST-1 제제)도 모든 실험에 포함시켰다. 마이크로플레이트 리더(microplate reader, Biochorm)로 450/655　nm에서 흡광도를 측정하고, 그 데이터를 대조구의 퍼센트로서 표현하였다.
아포토시스 어세이( Apoptosis assay )
제조자의 지시에 따라 DeadEndTMluorometric TUNEL System (Promega Madison, WI)를 이용하여 TUNEL/DAPI에 의하여 아포토시스를 평가하였다. 간단히 설명하면, 해마 뉴런을 폴리-L-라이신 코팅된 커버글라스 상에서 5 × 104 세포/웰의 농도로 키웠다. 처리 후에, 전술한 바와 같이, 세포들을 4℃에서 25분간 4% 파라포름알데하이드에 고정시켰다. 상기 세포를 5분간 PBS 중의 0.2% Triton X-100으로 투과성으로 만들었다. 이어서, 상기 세포들을 37℃에서 60분간 TUNEL 반응 혼합물과 함께 배양함으로써 표지하였다. Fluoview SV1000 이미징 소프트웨어(Olympus FV1000, Japan)를 구비한 레이져 스캐닝 공초점 현미경을 이용하여 청색 배경에서 국소화된 밝은 녹색 세포(양성 세포)로서 아포토시스 세포를 검출하였다. 뉴런 사멸의 정량화를 위하여 TUNEL/DAPI 시스템을 사용하였고, DAPI에 의하여 표시된 바와 같이 TUNEL 염색된 핵의 수를 핵의 전체 수로 나누었다. 세포 생존 분석의 확인을 위하여 맹검 계수(blind count)를 수행하였다.
Aβ42 ELISA
형광계 ELISA 키트(Invitrogen, Camarillo, CA) 및 적절한 Aβ 표준을 이용하여 제조자의 프로토콜에 따라 Aβ 42 ELISA를 수행하였다. Aβ, Aβ+ 재조합 용해성 네프릴라이신(NEP)을 갖는 것과 비처리된 해마 뉴런으로부터 얻은 조절된 배지를 수거하였다. 각 Aβ 표준 및 실험 샘플을 복제하고 결과를 평균화하였다.
가이드 캐뉼라의 삽입을 의한 수술( Surgery for implantation of the guide cannula )
재조합 용해성 네프릴라이신(NEP)의 첫번째 주입 전 3일째에, 각 마우스를 그것의 뇌에 가이드 캐뉼라의 삽입을 위하여 수술하였다. 간단히 설명하면, 100 mg/kg 케타민 및 10 mg/kg 자일라진을 함께 포함하는 마취제를 투여한 후, 뇌 입체 정위 프레임(stereotaxic frame) (David Kopf Instruments, Tujunga, CA)을 이용하여 동물의 해마에 스테인레스 스틸 캐뉼라를 삽입하였다. 가이드 캐뉼라를 다음의 편성에 따라 뇌의 해마 영역에 고정하였다: 브레그마(bregma)의 뒤쪽 1.6 mm, 정중선(midline)의 양측으로 1.7mm, 및 두개골 표면에 배측으로 1.2 mm. 가이드 캐뉼라는 뇌에 안정한 구멍의 형성을 형성하여, 그것을 통하여 처리가 적용될 수 있도록 한다. 처리가 없을 때는, 가이드 캐뉼라는 폐쇄관을 포함하여, 구멍이 주변 조직에 의하여 채워지는 것을 방지한다.
APP / PS1 이중 뮤턴트 마우스( double mutant mice )에의 재조합된 용해성 네프릴라이신( NEP)의 이식( transplantation )
재조합 용해성 네프릴라이신(NEP) 또는 포스페이트 완충된 염수(PBS)의 대뇌 내 이식을 10일간 수행하였다(n=그룹 당 10). 마우수의 이식은 8개월령에 시작하였고, 8개월 2주령에 종료하였다. 주입 캐뉼라의 끝부분은 가이드 캐뉼라를 넘어 1 mm까지 돌출되었다. 그것은 25 μl 해밀톤 시린지(Hamilton syringe)를 수용한 마이크로주입 시스템까지 유연한 폴리에틸렌 튜브에 의하여 연결되었다. 재조합 용해성 네프릴라이신(NEP) 3 μl (약 0.9 μg/ 3 μl /일)를 해마에 양 방향으로(bilaterally) 주입하였다. 재조합 용해성 네프릴라이신(NEP)를 0.5 μl / 분의 속도로 전달하였다. 대조군에 있어서, PBS 3 μl를 삽입하였다. 수술 후, 각 마우스를 개별 케이지(cage)에 두어서, 다른 동물들에 의한 가이드 캐뉼라가 제거되는 것을 방지하였다.
정량적 실시간 PCR( Quantitative real - time PCR )
RNA 추출을 위하여 RNeasy Lipid Tissue Mini 키트 (Qiagen, Korea, Ltd)를 제조자의 지시에 따라 사용하였다. 실험군 당 4마리의 개별 동물들 모두로부터 추출한 RNA 샘플을 사용하여 올리고 (dT)12-18 프라이머 및 SuperScript III RT (Invitrogen)를 이용하는 RT-PCT을 위한 cDNA를 제조하였다. cDNA의 정량을 위하여 QuantiTect SYBR Green PCR 키트 (Qiagen, Korea, Ltd)를 사용하였다. PCR 프라이머는 다음과 같았다: 네프릴라이신: 앞쪽 5'-GAAATTCAGCCAAAGCAAGC-3', 뒷쪽 5'-GATTTCGGCCTGAGGAATAA-3', β-엑틴(actin): 앞쪽 5'-TGACCGGCTTGTATGCTATC-3', 뒷쪽 5'-5'-CAGTGTGAGCCAGGATATAG-3'. 각 조사된 전사체(transcript)에 대하여, 다음의 반응 성분들의 혼합물을 지시된 최종 농도로 제조하였고: 앞쪽 프라이머(5 pM), 뒤쪽 프라이머(5 pM) 및 QuantiTect SYBR Green PCR 매스터 믹스(Master mix); 10 μl의 매스터 믹스를 0.1 ml 튜브에 첨가하고, 100 ng 역전사된 총 RNA를 함유하는 5 μl 체적을 PCR 주형으로 첨가하였다. 튜브를 폐쇄하고, 원심분리하고, 코베트 리서치(Corbett research) RG-6000 리얼타임 PCR 머신에 두었다.
조직 제조( Tissue preparation )
후술하는 행동 테스트 후에 마우스를 희생시켰다. 마우스를 PBS 중의 2.5% 애버틴(Avertin)으로 마취시켰다. PBS 중의 4% 파라포름알데히드로 동물을 급성 심장 관류(immediate cardiac perfusion)를 겪게 하였다. 그 후, 뇌를 제거하고 4℃에서 밤새 유지하고(postfixed), 균형을 이룰 때까지 4℃에서 30% 수크로스에서 배양하였다. 순차적인 30μm 화관 섹션(coronal section)을 저온유지장치(CM3050S; Leica)에 넣고 -20℃에서 보관하였다.
티오플라빈 S 염색( Thioflavin S staining )
프리플로팅 섹션(Free floating section)을 50% 에탄올에 용해된 농도 0.5% 티오플라빈 S (Sigma-Aldrich)에서 5분간 배양한 후, 50% 에탄올로 2회 각 5분간 세척하고, 1회는 탭 워터(tap water)로 5분간 세척하였으며, 마운팅 배지(mounting medium)으로 봉입했다(mounted). 상기 섹션을 Fluoview SV1000 imaging software (Olympus FV1000, Japan)를 구비한 레이져 스캐닝 공초점 현미경을 이용하여 분석하였다.
면역 조직 화학( Immunohistochemistry )
프리플로팅 섹션(Free-floating section)을 5% 노말 염소 혈청, 2% BSA, 및 0.4% Triton X-100을 함유하는 PBS 중에서 1 시간 배양하였다. 동일한 버퍼용액에서, 상기 섹션을 1차 항체와 함께 4 ℃에서 24시간 배양하였다. 다음의 항체가 사용되었다: 35-42 Aβ 단편에 대하여 증가되고 C-말단 Aβ 42 특이성에 대하여 선택된 20G10 (마우스, 1:1000로 희석됨), Aβ 40에 대한 CMVGGVV에 대하여 증가하는 G30 (토끼, 1:1000로 희석됨). 안티-GFAP (토끼, 1:500로 희석됨; Dako)가 뇌 섹션에서 성상 세포의 검출을 위하여 사용되었다. 시각화를 위하여, 대응하는 종에 대한 바이오티닐화된 2차 항체와 함께 상기 1차 항체를 배양함으로써 발달시켰다. 이어서, DAB (Vector Laboratories)의 적용을 제조자의 지시에 따라 수행하였다. 올림푸스 BX51 현미경을 섹션의 분석에 사용하였다.
웨스턴 블롯 분석( Western blot analysis )
행동 테스트 수행 이후에, 상이한 뇌 영역들(대뇌피질, 해마)을 용해성 네프릴라이신(NEP) 또는 PBS 주입된 APP/PS1 마우스들로부터 분리하였다. 뇌조직의 무게를 측정하고 10X 체적의 RIPA 버퍼 플러스 프로테아제 억제제 중에서 초음파처리하였다. SDS(sodium dodecyl sulfate) 샘플 버퍼 중의 단백질 샘플 동량(~80 μg)을 SDS-PAGE에 적용하고, 이어서 전기영동 이송에 의하여 면역블로팅 폴리비닐리덴 디플루오라이드(PVDF) 멤브레인에 적용하였다. 상기 멤브레인은 블로킹 용액(5% 탈지분유, PBS 중의 0.1 % Tween 20)으로 실온에서 1시간 예비처리하였고, 블록킹 용액 중의 β-엑틴(1:500 희석; Santacruz) 및 네프릴라이신(1:700 희석; R&D system)에 대한 1차 항체와 4℃에서 밤새 반응시켰다. 이어서, 그들을 세척 용액(PBS 중의 0.1% Tween 20)으로 5회 각 10분간 세척하였고, 염소 IgG에 대한 서양고추냉이 퍼옥시다제-결합된 2차 항체와 블록킹 용액 중에서 1시간 반응시켰다. 상기 멤브레인을 다시 세척 용액으로 5회 각 10분간 세척하였고, 단백질 시그널을 x-선 필름에 노출된 화학 발광에 의하여 검출하였다. 이미징 농도계(Bio-Rad)를 이용하여 상기 필름으로부터 농도계 측정을 하고, 이어서 Bio-Rad 분석 소프트웨어를 이용하여 정량화하였다. 상대적인 단백질 발현의 정량화를 위하여, 관심있는 단백질 밴드의 광학 농도를 동일한 겔 상의 β-엑틴의 광학 밀도에 일반화하였다.
행동 테스트( Behavioral test )
공간 기억 성능(23) 평가를 위하여 모리스 수중 미로 실험(Morris water maze task)을 수행하였다. 수중 미로는 깊이 20 cm (22-24 ℃)까지 채워진 백색 탱크(1.0 m 지름, 30 cm 높이)로 이루어져 있다. 백색 불투명 비독성 페인트를 물에 첨가하여 가시성을 방해하였다. 수중의 플렉시유리(Plexiglas) 플랫폼(10 cm 직경, 수면으로부터 6-8 mm 아래)을 훈련 세션 곳곳의 고정된 위치에 배치하였다. 플랫폼의 위치는 마우스마다 다양하였지만, 실험군들에 걸쳐 균형을 이루도록 하였다. 모든 마우스들은 훈련전 1일에 미로에 길들어졌다. 상기 동물들은 하루에 4회 시험에 적용되었다. 훈련 세션은 연속된 10 일 동안 하루에 일련의 4회 시험(총 40회)으로 이루어졌다. 4개의 시험의 각각에서, 동물들은 동등하게 백색 탱크의 주변부 근처에서 떨어진(spaced) 상이한 시작 위치에서 무작위 순서로 놓여졌다. 마우스는 수중의 플랫폼을 찾기 위하여 60초가 주어졌다. 마우스가 60초 내에 플랫폼을 올라오지 않았다면, 플랫폼으로 안내하였다. 플랫폼에 올라온 시간은 각 시험의 잠복기로서 기록하였다. 마우스들이 홈 케이지로 돌아오기 전에 10초간 플랫폼에 유지하도록 허용하였다. 플랫폼을 제거한 단일 프로브 시험이 히든 플랫폼 시험(hidden platform task) 완료 후에(11일째) 수행되었다. 각 마우스들은 백색 탱크의 1개의 사분면에 놓여지고, 60초간 수영하도록 허용되었다. 모든 시험은 비디오 모니터 및 컴퓨터에 연결된 CCD(charge-coupled device) 카메라를 이용하여 기록하였다. 상기 테스트는 이미지 J 소프트웨어를 이용하여 진행하였다. 본 연구에서 사용된 모든 장치들은 O'Hara & Company (Tokyo, Japan)에서 제작되었다.
통계적 분석( Statistical analysis )
2개의 군의 비교를 위하여 스튜던트 t-테스트(Student's t-test)를 이용하였고, 다수의 군의 비교를 위하여 터키 HSD 테스트(Tukey? HSD test) 및 다양성 반복 측정 분산 분석 테스트(Repeated Measures Analysis of Variance test)를 이용하였으며, SAS 통계학적 패키지(release 9.1; SAS Institute Inc., Cary, NC)에 따랐다. p < 0.05이 유효하게 고려되었다.
결과
곤충 세포에서의 재조합된 용해성 네프릴라이신(NEP)의 정제
인간 네프릴라이신 cDNA의 세포외 도메인을 pBAC-6 발현 벡터(도 4)내로 클로닝하였다. 이 벡터는 특이적 프로테아제(트롬빈)에 의하여 잘려질 수 있는 6개의 히스티딘 테그(tag)와 함께 주입시 재조합 단백질을 생산한다. 용해성 네프릴라이신(NEP)은, 신호 서열에 융합된 촉매적 세포외 도메인의 분비에 의하여 곤충세포들로부터 생산되었다. 용해성 네프릴라이신(NEP)를 HiTrap Chelating HP 컬럼 및 HiLoad 16/600 Superdex 200 prep-grade 컬럼 (도 5 및 도 7) 상에서 정제하였다. 분획들의 각 단계를 12% SDS-PAGE에 의하여 분석하였다. His-테그된 단백질의 4-10 중 분획들이 HiTrap Chelating HP 컬럼에 대하여 높은 친화도를 나타내었다(도 6). 용출된 샘플들을 HiLoad 16/600 Superdex 200 prep-grade 컬럼 상에서 젤 여과에 의하여 추가로 정제하였다. 12% SDS-PAGE에 의한 분석에 따르면, 쿠마시 블루에 의하여 염색된 젤은 예측된 길이(84kDa)와 일치하는 용해성 네프릴라이신(NEP)의 존재를 나타내었다. 정제된 용해성 네프릴라이신(NEP)를 함유하는 용출된 4번째 피크의 분획들(분획 18-22)는 용해성 네프릴라이신(NEP)의 크기와 유사하였다(도 8). 웨스턴 블로팅은 용해성 네프릴라이신(NEP)의 발현을 확인하기 위하여 수행되었다(도 9). 용해성 네프릴라이신(NEP)(분획 18-22)를 84 kDa 밴드에서 검촐하였다. 이 용해성 네프릴라이신(NEP)의 활성은 농도에 의존적이었다. 정제된 용해성 네프릴라이신(NEP)의 효소 활성은 생리적 네프릴라이신(NEP)의 것과 동일하였다(도 10).
해마 뉴런의 Aβ 유도된 사멸과 Aβ 레벨이 용해성 네프릴라이신(NEP)에 의하여 억제된다.
재조합 용해성 네프릴라이신(NEP) 시험관 내의 AD 환성에서 효과를 갖는지에 대하여 조사하기 위하여, 4일간 배아 해마 뉴런을 배양하였다. 5일째, Aβ 10μM와 함께 해마 뉴런에 재조합 용해성 네프릴라이신(NEP) 500 ng을 적용하였다. 24 시간 후, 조절 배지(condition media)에서의 Aβ 레벨 및 세포 생존력의 평가를 수행하였다(도 11). 도 12에 나타난 바와 같이, 재조합 용해성 네프릴라이신(NEP) 처리된 조절 배지의 Aβ레벨은 Aβ단독의 것보다 1.5 배 낮아졌다(p<0.05). WST-1 어세이의 수행을 통한 세포 생존력은 Aβ단독의 것보다 Aβ와 함께 재조합 용해성 네프릴라이신(NEP)가 있는 것에서 더 증가 경향을 나타내었다(도 13). 또한, TUNEL 어세이를 이용하여 Aβ-유도된 세포 사멸을 관찰하였다. 대조구에서, 아포토시스 셀은 총 세포수의 4.32%를 포함하였다. 10 μM Aβ에의 노출 후, 아포토시스 세포의 퍼센트는 17.91%로 증가됨을 나타내었다. 이 증가는 재조합 용해성 네프릴라이신(NEP)의 첨가에 의하여 방해되었다(p<0.05; 도 14 및 15). 이들 데이터는 재조합 용해성 네프릴라이신(NEP)이 시험관내에서 Aβ-유도된 세포 사멸을 억제할 수 있고, Aβ레벨을 감소시킬 수 있다는 것을 제안한다.
재조합 용해성 네프릴라이신 ( NEP ) 치료된 APP / PS1 마우스의 뇌에서 네프릴라이신( NEP ) 발현의 감소가 증가하였다.
이전 연구의 결과는 9개월령 APP/PS1 수컷 마우스의 대뇌피질 및 해마에서 네프릴라이신(NEP) 발현이 감소됨을 나타내었다. 본 발명자들은 APP/PS1 마우스의 대뇌피질 및 해마에서 낮은 네프릴라이신(NEP) 발현을 재확인하였다(p<0.05; 도 16). 네프릴라이신(NEP) 발현이 재조합 용해성 네프릴라이신(NEP)에 의하여 상승되는지를 결정하기 위하여, 재조합 용해성 네프릴라이신(NEP)를 APP/PS1 마우스의 해마에 10일간 주입하였다(0.9 μg/3 μl/day). 네프릴라이신(NEP) 레벨의 변화를 측정하기 위하여 9개월령의 마우스들을 희생시켰다(도 17). 연구기간동안 이식된 재조합 용해성 네프릴라이신(NEP)의 발현을 확인하기 위하여 네프릴라이신(NEP) 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. 결과는 재조합 용해성 네프릴라이신(NEP) 처리된 마우스의 해마에서 더 높은 네프릴라이신(NEP) 발현을 나타낸 반면, 대뇌 피질에서의 네프릴라이신(NEP) 발현은 PBS 주입된 마우스의 것과 유사하였다(p<0.05; 도 18 및 19). 이들 차이는 재조합 용해성 네프릴라이신(NEP)가 해마에 주입되고 대뇌 피질에는 주입되지 않았다는 사실과 상호연관될 수 있다. 본 연구의 데이터는 해마에 주입된 재조합 용해성 네프릴라이신(NEP)로부터의 높은 레벨의 네프릴라이신(NEP) 발현이 APP/PS1 마우스의 뇌에서 감소된 네프릴라이신(NEP) 레벨의 상승을 이끌 수 있다는 것을 나타낸다.
재조합 용해성 네프릴라이신(NEP)는 APP / PS1 마우스에서 Aβ 축적을 감소시킬 수 있다.
뇌에의 Aβ침작은 알츠하이머 질병(AD)의 공통된 병원성 특징이므로, 먼저 재조합 용해성 네프릴라이신(NEP) 주입된 마우스와 PBS 주입된 마우스의 뇌에 티오플라빈 S 염색을 수행하였다. 예측한 대로, 대뇌 피질과 해마에서의 Aβ침작은 PBS 주입된 대조구에 비하여 재조합 용해성 네프릴라이신(NEP) 처리된 동물에서 극적인 감소를 나타내었다(도 20). Metamorph 7.1.2 소프트웨어를 이용하는 정량적인 이미지 분석(p<0.05; 도 21)은, APP/PS1 마우스의 PBS 주입된 뇌와 비료할 때 재조합 용해성 내프릴라이신(NEP) 주입된 마우스의 해마 및 대뇌피질 모두에 대하여 통계적으로 상당한 감소를 나타내었다.
Aβ40 및 42 레벨의 상승은 치매의 초기에 발생하며, 이러한 변화는 인식 장애와 강한 상호관계를 나타내었다. 따라서, 뇌 아밀로이드 영역에서의 재조합 용해성 네프릴라이신(NEP) 발현의 효과를 추가로 평가하기 위하여, 안티-Aβ40(G30) 42 항체(20G10)을 이용하여 뇌 섹션 중에 Aβ 40 및 42를 측정하고 정량하였다. 제조합 용해성 네프릴라이신(NEP) 주입된 군에서는, PBS 이식된 군에 비하여, G30 및 20G10의 양성 플라크의 수는 상당히 낮아졌다(도 22 및 24). 정량적 이미지 분석은 G30 및 20G10 양성 플라크가 재조합 용해성 네프릴라이신(NEP) 주입된 APP/PS1 마우스들에서 동일 월령의 PBS 주입된 대조구에서보다 더 작았다는 것을 나타내었다(p<0.05; 도 23 및 25). 본 연구의 데이터는 재조합 용해성 네프릴라이신(NEP)의 이식이 APP/PS1 마우스의 뇌에서 Aβ축적을 방지하고, 및/또는 Aβ 참착을 제거한다는 매우 분명한 증거를 제공한다.
신경세포염증에 대하여 재조합 용해성 네프릴라이신(NEP)의 효과를 조사하기 위하여, 안티-글리아 피빌러리 엑시딩 프로테인(glia fibillary acidic protein, GFAP) 항체로 뇌 섹션을 염색하였음에도 불구하고, 재조합 용해성 네프릴라이신(NEP) 처리된 마우스의 대뇌피질 및 해마에서 GFAP-양성 성상 세포의 출현에 어떠한 차이점도 관찰되지 아니하였다(도 26 및 도 27).
재조합 용해성 네프릴라이신(NEP)에 의한 치료는 APP / PS1 마우스에서 학습 및 기억력을 향상시킨다.
재조합 용해성 네프릴라이신(NEP)에 의한 처리가 APP/PS1 마우스의 공간 학습 및 기억의 향상에 영향을 미치는지에 대한 문제를 조사하기 위하여, PBS, 재조합 용해성 네프릴라이신(NEP) 주입된 마우스 및 이들의 대조구(WT) 한배새끼를 모리스 수중 미로 테스트의 히든 플랫폼 버전을 이용한 후 3일에 공간 학습을 테스트하였다. 모리스 수중 미로는 공간 기억의 이용을 필요로 하는 해마-의존적 인식 시험이다. 하루에 4회 시험의 히든 플랫폼 테스트에서 탈출 잠복기를 결정함으로써 공간 기억을 평가할 수 있었다. 도 28에 도시된 바와 같이, PBS 주입된 군과 비교할 때, 재조합 용해성 네프릴라이신(NEP) 처리된 마우스들은 모리스 수중 미로에서 플랫폼을 찾는 능력이 향상되었다. 이들 데이터는 재조합 용해성 네프릴라이신(NEP)가 주입된 APP/PS1 마우스들이 이들의 PBS 처리된 대조구보다 수중 미로에서 상당히 잘 수행하였음을 나타낸다(p<0.05). 훈련 10일째, 대표적인 수영 경로는 공간 학습 습득이 PBS를 받은 마우스들에서보다 재조합 용해성 네프릴라이신(NEP)이 주입된 APP/PS1 마우스들에서 훨씬 더 향상되었음을 나타낸다는 것을 보여준다(도 29). 마지막 날에, 동물들이 플랫폼을 찾기 위하여 비공강적 전략을 사용했는지를 결정하기 위하여, 마우스들은 플랫폼이 없는 프로브 시험을 시행하였다. 재조합 용해성 네프릴라이신(NEP) 주입된 APP/PS1 마우스들은 PBS 주입된 APP/PS1 마우스들보다 플랫폼 주변의 표적 지점에서 상당히 더 오랜 시간을 보냈다(p<0.05; 도 30). 각 동물이 60초 동안 작은 표적 지점에 들어간 횟수를 계산하였다. 재조합 용해성 네프릴라이신(NEP)로 처리된 마우스들은 작은 표적 지점에 평균 2.0 ± 0.73 번 들어갔고, PBS가 주입된 동물들은 평균 1.0 ± 0.5번, PBS 처리된 WT 마우스들은 평균 2.75 ± 0.67번 작은 표적 지점에 들어갔다. 이들 데이터는 작은 표적 지점에 들어간 횟수가 PBS 주입된 마우스들보다 재조합 용해성 네프릴라이신(NEP) 처리된 마우스들에서 증가되었음을 나타낸다(도 31). 이들 결과는 재조합 용해성 네프릴라이신(NEP) 이식이 Aβ 펩타이드의 침착과 관련된 공간 기억의 인식 장애의 감소를 초래할 수 있다는 것을 나타낸다.
디스커션
전술한 실험을 통하여, 본 발명에 따른 재조합 단백질은 APP/PS1 마우스에서 알츠하이머 질병과 같은 병리학적 증상을 감소시켰다. 결과로서, 본 발명에 따른 재조합 단백질을 이용한 치료는, 체외 실험에서 세포 활성을 증가시켰고, 해마 세포(hippocampal cells)의 A-매개 아포토시스(apoptosis)를 감소시켰다. APP/PS1 마우스의 뇌에서 전술한 재조합 단백질의 존재에 의하여 Aβ 플라크(plaque)의 수가 감소되었고, 체내에서 전술한 재조합 단백질에 의하여 APP/PS1 마우스의 기억력 장애가 치유되었다.
<110> SNU R&DB FOUNDATION <120> RECOMBINANT PROTEIN, RECOMBINANT GENE CODIMG THE SAME, RECOMBINANT VECTOR, PHAMACEUTICAL COMPOSITION COMPRISING THE SAME AND METHOD FOR TREATING OR PREVENTING ALOHIBITING ALZHEIMER DISEASE <130> CPA2013-0068 <160> 13 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 700 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant neprilysin protein <400> 1 Tyr Asp Asp Gly Ile Cys Lys Ser Ser Asp Cys Ile Lys Ser Ala Ala 1 5 10 15 Arg Leu Ile Gln Asn Met Asp Ala Thr Thr Glu Pro Cys Arg Asp Phe 20 25 30 Phe Lys Tyr Ala Cys Gly Gly Trp Leu Lys Arg Asn Val Ile Pro Glu 35 40 45 Thr Ser Ser Arg Tyr Gly Asn Phe Asp Ile Leu Arg Asp Glu Leu Glu 50 55 60 Val Val Leu Lys Asp Val Leu Gln Glu Pro Lys Thr Glu Asp Ile Val 65 70 75 80 Ala Val Gln Lys Ala Lys Ala Leu Tyr Arg Ser Cys Ile Asn Glu Ser 85 90 95 Ala Ile Asp Ser Arg Gly Gly Glu Pro Leu Leu Lys Leu Leu Pro Asp 100 105 110 Ile Tyr Gly Trp Pro Val Ala Thr Glu Asn Trp Glu Gln Lys Tyr Gly 115 120 125 Ala Ser Trp Thr Ala Glu Lys Ala Ile Ala Gln Leu Asn Ser Lys Tyr 130 135 140 Gly Lys Lys Val Leu Ile Asn Leu Phe Val Gly Thr Asp Asp Lys Asn 145 150 155 160 Ser Val Asn His Val Ile His Ile Asp Gln Pro Arg Leu Gly Leu Pro 165 170 175 Ser Arg Asp Tyr Tyr Glu Cys Thr Gly Ile Tyr Lys Glu Ala Cys Thr 180 185 190 Ala Tyr Val Asp Phe Met Ile Ser Val Ala Arg Leu Ile Arg Gln Glu 195 200 205 Glu Arg Leu Pro Ile Asp Glu Asn Gln Leu Ala Leu Glu Met Asn Lys 210 215 220 Val Met Glu Leu Glu Lys Glu Ile Ala Asn Ala Thr Ala Lys Pro Glu 225 230 235 240 Asp Arg Asn Asp Pro Met Leu Leu Tyr Asn Lys Met Arg Leu Ala Gln 245 250 255 Ile Gln Asn Asn Phe Ser Leu Glu Ile Asn Gly Lys Pro Phe Ser Trp 260 265 270 Leu Asn Phe Thr Asn Glu Ile Met Ser Thr Val Asn Ile Ser Ile Thr 275 280 285 Asn Glu Glu Asp Val Val Val Tyr Ala Pro Glu Tyr Leu Thr Lys Leu 290 295 300 Lys Pro Ile Leu Thr Lys Tyr Ser Ala Arg Asp Leu Gln Asn Leu Met 305 310 315 320 Ser Trp Arg Phe Ile Met Asp Leu Val Ser Ser Leu Ser Arg Thr Tyr 325 330 335 Lys Glu Ser Arg Asn Ala Phe Arg Lys Ala Leu Tyr Gly Thr Thr Ser 340 345 350 Glu Thr Ala Thr Trp Arg Arg Cys Ala Asn Tyr Val Asn Gly Asn Met 355 360 365 Glu Asn Ala Val Gly Arg Leu Tyr Val Glu Ala Ala Phe Ala Gly Glu 370 375 380 Ser Lys His Val Val Glu Asp Leu Ile Ala Gln Ile Arg Glu Val Phe 385 390 395 400 Ile Gln Thr Leu Asp Asp Leu Thr Trp Met Asp Ala Glu Thr Lys Lys 405 410 415 Arg Ala Glu Glu Lys Ala Leu Ala Ile Lys Glu Arg Ile Gly Tyr Pro 420 425 430 Asp Asp Ile Val Ser Asn Asp Asn Lys Leu Asn Asn Glu Tyr Leu Glu 435 440 445 Leu Asn Tyr Lys Glu Asp Glu Tyr Phe Glu Asn Ile Ile Gln Asn Leu 450 455 460 Lys Phe Ser Gln Ser Lys Gln Leu Lys Lys Leu Arg Glu Lys Val Asp 465 470 475 480 Lys Asp Glu Trp Ile Ser Gly Ala Ala Val Val Asn Ala Phe Tyr Ser 485 490 495 Ser Gly Arg Asn Gln Ile Val Phe Pro Ala Gly Ile Leu Gln Pro Pro 500 505 510 Phe Phe Ser Ala Gln Gln Ser Asn Ser Leu Asn Tyr Gly Gly Ile Gly 515 520 525 Met Val Ile Gly His Glu Ile Thr His Gly Phe Asp Asp Asn Gly Arg 530 535 540 Asn Phe Asn Lys Asp Gly Asp Leu Val Asp Trp Trp Thr Gln Gln Ser 545 550 555 560 Ala Ser Asn Phe Lys Glu Gln Ser Gln Cys Met Val Tyr Gln Tyr Gly 565 570 575 Asn Phe Ser Trp Asp Leu Ala Gly Gly Gln His Leu Asn Gly Ile Asn 580 585 590 Thr Leu Gly Glu Asn Ile Ala Asp Asn Gly Gly Leu Gly Gln Ala Tyr 595 600 605 Arg Ala Tyr Gln Asn Tyr Ile Lys Lys Asn Gly Glu Glu Lys Leu Leu 610 615 620 Pro Gly Leu Asp Leu Asn His Lys Gln Leu Phe Phe Leu Asn Phe Ala 625 630 635 640 Gln Val Trp Cys Gly Thr Tyr Arg Pro Glu Tyr Ala Val Asn Ser Ile 645 650 655 Lys Thr Asp Val His Ser Pro Gly Asn Phe Arg Ile Ile Gly Thr Leu 660 665 670 Gln Asn Ser Ala Glu Phe Ser Glu Ala Phe His Cys Arg Lys Asn Ser 675 680 685 Tyr Met Asn Pro Glu Lys Lys Cys Arg Val Trp *** 690 695 700 <210> 2 <211> 654 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant neprilysin protein <400> 2 Pro Glu Thr Ser Ser Arg Tyr Gly Asn Phe Asp Ile Leu Arg Asp Glu 1 5 10 15 Leu Glu Val Val Leu Lys Asp Val Leu Gln Glu Pro Lys Thr Glu Asp 20 25 30 Ile Val Ala Val Gln Lys Ala Lys Ala Leu Tyr Arg Ser Cys Ile Asn 35 40 45 Glu Ser Ala Ile Asp Ser Arg Gly Gly Glu Pro Leu Leu Lys Leu Leu 50 55 60 Pro Asp Ile Tyr Gly Trp Pro Val Ala Thr Glu Asn Trp Glu Gln Lys 65 70 75 80 Tyr Gly Ala Ser Trp Thr Ala Glu Lys Ala Ile Ala Gln Leu Asn Ser 85 90 95 Lys Tyr Gly Lys Lys Val Leu Ile Asn Leu Phe Val Gly Thr Asp Asp 100 105 110 Lys Asn Ser Val Asn His Val Ile His Ile Asp Gln Pro Arg Leu Gly 115 120 125 Leu Pro Ser Arg Asp Tyr Tyr Glu Cys Thr Gly Ile Tyr Lys Glu Ala 130 135 140 Cys Thr Ala Tyr Val Asp Phe Met Ile Ser Val Ala Arg Leu Ile Arg 145 150 155 160 Gln Glu Glu Arg Leu Pro Ile Asp Glu Asn Gln Leu Ala Leu Glu Met 165 170 175 Asn Lys Val Met Glu Leu Glu Lys Glu Ile Ala Asn Ala Thr Ala Lys 180 185 190 Pro Glu Asp Arg Asn Asp Pro Met Leu Leu Tyr Asn Lys Met Thr Leu 195 200 205 Ala Gln Ile Gln Asn Asn Phe Ser Leu Glu Ile Asn Gly Lys Pro Phe 210 215 220 Ser Trp Leu Asn Phe Thr Asn Glu Ile Met Ser Thr Val Asn Ile Ser 225 230 235 240 Ile Thr Asn Glu Glu Asp Val Val Val Tyr Ala Pro Glu Tyr Leu Thr 245 250 255 Lys Leu Lys Pro Ile Leu Thr Lys Tyr Ser Ala Arg Asp Leu Gln Asn 260 265 270 Leu Met Ser Trp Arg Phe Ile Met Asp Leu Val Ser Ser Leu Ser Arg 275 280 285 Thr Tyr Lys Glu Ser Arg Asn Ala Phe Arg Lys Ala Leu Tyr Gly Thr 290 295 300 Thr Ser Glu Thr Ala Thr Trp Arg Arg Cys Ala Asn Tyr Val Asn Gly 305 310 315 320 Asn Met Glu Asn Ala Val Gly Arg Leu Tyr Val Glu Ala Ala Phe Ala 325 330 335 Gly Glu Ser Lys His Val Val Glu Asp Leu Ile Ala Gln Ile Arg Glu 340 345 350 Val Phe Ile Gln Thr Leu Asp Asp Leu Thr Trp Met Asp Ala Glu Thr 355 360 365 Lys Lys Arg Ala Glu Glu Lys Ala Leu Ala Ile Lys Glu Arg Ile Gly 370 375 380 Tyr Pro Asp Asp Ile Val Ser Asn Asp Asn Lys Leu Asn Asn Glu Tyr 385 390 395 400 Leu Glu Leu Asn Tyr Lys Glu Asp Glu Tyr Phe Glu Asn Ile Ile Gln 405 410 415 Asn Leu Lys Phe Ser Gln Ser Lys Gln Leu Lys Lys Leu Arg Glu Lys 420 425 430 Val Asp Lys Asp Glu Trp Ile Ser Gly Ala Ala Val Val Asn Ala Phe 435 440 445 Tyr Ser Ser Gly Arg Asn Gln Ile Val Phe Pro Ala Gly Ile Leu Gln 450 455 460 Pro Pro Phe Phe Ser Ala Gln Gln Ser Asn Ser Leu Asn Tyr Gly Gly 465 470 475 480 Ile Gly Met Val Ile Gly His Glu Ile Thr His Gly Phe Asp Asp Asn 485 490 495 Gly Arg Asn Phe Asn Lys Asp Gly Asp Leu Val Asp Trp Trp Thr Gln 500 505 510 Gln Ser Ala Ser Asn Phe Lys Glu Gln Ser Gln Cys Met Val Tyr Gln 515 520 525 Tyr Gly Asn Phe Ser Trp Asp Leu Ala Gly Gly Gln His Leu Asn Gly 530 535 540 Ile Asn Thr Leu Gly Glu Asn Ile Ala Asp Asn Gly Gly Leu Gly Gln 545 550 555 560 Ala Tyr Arg Ala Tyr Gln Asn Tyr Ile Lys Lys Asn Gly Glu Glu Lys 565 570 575 Leu Leu Pro Gly Leu Asp Leu Asn His Lys Gln Leu Phe Phe Leu Asn 580 585 590 Phe Ala Gln Val Trp Cys Gly Thr Tyr Arg Pro Glu Tyr Ala Val Asn 595 600 605 Ser Ile Lys Thr Asp Val His Ser Pro Gly Asn Phe Arg Ile Ile Gly 610 615 620 Thr Leu Gln Asn Ser Ala Glu Phe Ser Glu Ala Phe His Cys Arg Lys 625 630 635 640 Asn Ser Tyr Met Asn Pro Glu Lys Lys Cys Arg Val Trp *** 645 650 <210> 3 <211> 556 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant neprilysin protein <400> 3 Gly Lys Lys Val Leu Ile Asn Leu Phe Val Gly Thr Asp Asp Lys Asn 1 5 10 15 Ser Val Asn His Val Ile His Ile Asp Gln Pro Arg Leu Gly Leu Pro 20 25 30 Ser Arg Asp Tyr Tyr Glu Cys Thr Gly Ile Tyr Lys Glu Ala Cys Thr 35 40 45 Ala Tyr Val Asp Phe Met Ile Ser Val Ala Arg Leu Ile Arg Gln Glu 50 55 60 Glu Arg Leu Pro Ile Asp Glu Asn Gln Leu Ala Leu Glu Met Asn Lys 65 70 75 80 Val Met Glu Leu Glu Lys Glu Ile Ala Asn Ala Thr Ala Lys Pro Glu 85 90 95 Asp Arg Asn Asp Pro Met Leu Leu Tyr Asn Lys Met Thr Leu Ala Gln 100 105 110 Ile Gln Asn Asn Phe Ser Leu Glu Ile Asn Gly Lys Pro Phe Ser Trp 115 120 125 Leu Asn Phe Thr Asn Glu Ile Met Ser Thr Val Asn Ile Ser Ile Thr 130 135 140 Asn Glu Glu Asp Val Val Val Tyr Ala Pro Glu Tyr Leu Thr Lys Leu 145 150 155 160 Lys Pro Ile Leu Thr Lys Tyr Ser Ala Arg Asp Leu Gln Asn Leu Met 165 170 175 Ser Trp Arg Phe Ile Met Asp Leu Val Ser Ser Leu Ser Arg Thr Tyr 180 185 190 Lys Glu Ser Arg Asn Ala Phe Arg Lys Ala Leu Tyr Gly Thr Thr Ser 195 200 205 Glu Thr Ala Thr Trp Arg Arg Cys Ala Asn Tyr Val Asn Gly Asn Met 210 215 220 Glu Asn Ala Val Gly Arg Leu Tyr Val Glu Ala Ala Phe Ala Gly Glu 225 230 235 240 Ser Lys His Val Val Glu Asp Leu Ile Ala Gln Ile Arg Glu Val Phe 245 250 255 Ile Gln Thr Leu Asp Asp Leu Thr Trp Met Asp Ala Glu Thr Lys Lys 260 265 270 Arg Ala Glu Glu Lys Ala Leu Ala Ile Lys Glu Arg Ile Gly Tyr Pro 275 280 285 Asp Asp Ile Val Ser Asn Asp Asn Lys Leu Asn Asn Glu Tyr Leu Glu 290 295 300 Leu Asn Tyr Lys Glu Asp Glu Tyr Phe Glu Asn Ile Ile Gln Asn Leu 305 310 315 320 Lys Phe Ser Gln Ser Lys Gln Leu Lys Lys Leu Arg Glu Lys Val Asp 325 330 335 Lys Asp Glu Trp Ile Ser Gly Ala Ala Val Val Asn Ala Phe Tyr Ser 340 345 350 Ser Gly Arg Asn Gln Ile Val Phe Pro Ala Gly Ile Leu Gln Pro Pro 355 360 365 Phe Phe Ser Ala Gln Gln Ser Asn Ser Leu Asn Tyr Gly Gly Ile Gly 370 375 380 Met Val Ile Gly His Glu Ile Thr His Gly Phe Asp Asp Asn Gly Arg 385 390 395 400 Asn Phe Asn Lys Asp Gly Asp Leu Val Asp Trp Trp Thr Gln Gln Ser 405 410 415 Ala Ser Asn Phe Lys Glu Gln Ser Gln Cys Met Val Tyr Gln Tyr Gly 420 425 430 Asn Phe Ser Trp Asp Leu Ala Gly Gly Gln His Leu Asn Gly Ile Asn 435 440 445 Thr Leu Gly Glu Asn Ile Ala Asp Asn Gly Gly Leu Gly Gln Ala Tyr 450 455 460 Arg Ala Tyr Gln Asn Tyr Ile Lys Lys Asn Gly Glu Glu Lys Leu Leu 465 470 475 480 Pro Gly Leu Asp Leu Asn His Lys Gln Leu Phe Phe Leu Asn Phe Ala 485 490 495 Gln Val Trp Cys Gly Thr Tyr Arg Pro Glu Tyr Ala Val Asn Ser Ile 500 505 510 Lys Thr Asp Val His Ser Pro Gly Asn Phe Arg Ile Ile Gly Thr Leu 515 520 525 Gln Asn Ser Ala Glu Phe Ser Glu Ala Phe His Cys Arg Lys Asn Ser 530 535 540 Tyr Met Asn Pro Glu Lys Lys Cys Arg Val Trp *** 545 550 555 <210> 4 <211> 451 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant neprilysin protein <400> 4 Asn Lys Met Thr Leu Ala Gln Ile Gln Asn Asn Phe Ser Leu Glu Ile 1 5 10 15 Asn Gly Lys Pro Phe Ser Trp Leu Asn Phe Thr Asn Glu Ile Met Ser 20 25 30 Thr Val Asn Ile Ser Ile Thr Asn Glu Glu Asp Val Val Val Tyr Ala 35 40 45 Pro Glu Tyr Leu Thr Lys Leu Lys Pro Ile Leu Thr Lys Tyr Ser Ala 50 55 60 Arg Asp Leu Gln Asn Leu Met Ser Trp Arg Phe Ile Met Asp Leu Val 65 70 75 80 Ser Ser Leu Ser Arg Thr Tyr Lys Glu Ser Arg Asn Ala Phe Arg Lys 85 90 95 Ala Leu Tyr Gly Thr Thr Ser Glu Thr Ala Thr Trp Arg Arg Cys Ala 100 105 110 Asn Tyr Val Asn Gly Asn Met Glu Asn Ala Val Gly Arg Leu Tyr Val 115 120 125 Glu Ala Ala Phe Ala Gly Glu Ser Lys His Val Val Glu Asp Leu Ile 130 135 140 Ala Gln Ile Arg Glu Val Phe Ile Gln Thr Leu Asp Asp Leu Thr Trp 145 150 155 160 Met Asp Ala Glu Thr Lys Lys Arg Ala Glu Glu Lys Ala Leu Ala Ile 165 170 175 Lys Glu Arg Ile Gly Tyr Pro Asp Asp Ile Val Ser Asn Asp Asn Lys 180 185 190 Leu Asn Asn Glu Tyr Leu Glu Leu Asn Tyr Lys Glu Asp Glu Tyr Phe 195 200 205 Glu Asn Ile Ile Gln Asn Leu Lys Phe Ser Gln Ser Lys Gln Leu Lys 210 215 220 Lys Leu Arg Glu Lys Val Asp Lys Asp Glu Trp Ile Ser Gly Ala Ala 225 230 235 240 Val Val Asn Ala Phe Tyr Ser Ser Gly Arg Asn Gln Ile Val Phe Pro 245 250 255 Ala Gly Ile Leu Gln Pro Pro Phe Phe Ser Ala Gln Gln Ser Asn Ser 260 265 270 Leu Asn Tyr Gly Gly Ile Gly Met Val Ile Gly His Glu Ile Thr His 275 280 285 Gly Phe Asp Asp Asn Gly Arg Asn Phe Asn Lys Asp Gly Asp Leu Val 290 295 300 Asp Trp Trp Thr Gln Gln Ser Ala Ser Asn Phe Lys Glu Gln Ser Gln 305 310 315 320 Cys Met Val Tyr Gln Tyr Gly Asn Phe Ser Trp Asp Leu Ala Gly Gly 325 330 335 Gln His Leu Asn Gly Ile Asn Thr Leu Gly Glu Asn Ile Ala Asp Asn 340 345 350 Gly Gly Leu Gly Gln Ala Tyr Arg Ala Tyr Gln Asn Tyr Ile Lys Lys 355 360 365 Asn Gly Glu Glu Lys Leu Leu Pro Gly Leu Asp Leu Asn His Lys Gln 370 375 380 Leu Phe Phe Leu Asn Phe Ala Gln Val Trp Cys Gly Thr Tyr Arg Pro 385 390 395 400 Glu Tyr Ala Val Asn Ser Ile Lys Thr Asp Val His Ser Pro Gly Asn 405 410 415 Phe Arg Ile Ile Gly Thr Leu Gln Asn Ser Ala Glu Phe Ser Glu Ala 420 425 430 Phe His Cys Arg Lys Asn Ser Tyr Met Asn Pro Glu Lys Lys Cys Arg 435 440 445 Val Trp *** 450 <210> 5 <211> 348 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant neprilysin protein <400> 5 Glu Thr Ala Thr Trp Arg Arg Cys Ala Asn Tyr Val Asn Gly Asn Met 1 5 10 15 Glu Asn Ala Val Gly Arg Leu Tyr Val Glu Ala Ala Phe Ala Gly Glu 20 25 30 Ser Lys His Val Val Glu Asp Leu Ile Ala Gln Ile Arg Glu Val Phe 35 40 45 Ile Gln Thr Leu Asp Asp Leu Thr Trp Met Asp Ala Glu Thr Lys Lys 50 55 60 Arg Ala Glu Glu Lys Ala Leu Ala Ile Lys Glu Arg Ile Gly Tyr Pro 65 70 75 80 Asp Asp Ile Val Ser Asn Asp Asn Lys Leu Asn Asn Glu Tyr Leu Glu 85 90 95 Leu Asn Tyr Lys Glu Asp Glu Tyr Phe Glu Asn Ile Ile Gln Asn Leu 100 105 110 Lys Phe Ser Gln Ser Lys Gln Leu Lys Lys Leu Arg Glu Lys Val Asp 115 120 125 Lys Asp Glu Trp Ile Ser Gly Ala Ala Val Val Asn Ala Phe Tyr Ser 130 135 140 Ser Gly Arg Asn Gln Ile Val Phe Pro Ala Gly Ile Leu Gln Pro Pro 145 150 155 160 Phe Phe Ser Ala Gln Gln Ser Asn Ser Leu Asn Tyr Gly Gly Ile Gly 165 170 175 Met Val Ile Gly His Glu Ile Thr His Gly Phe Asp Asp Asn Gly Arg 180 185 190 Asn Phe Asn Lys Asp Gly Asp Leu Val Asp Trp Trp Thr Gln Gln Ser 195 200 205 Ala Ser Asn Phe Lys Glu Gln Ser Gln Cys Met Val Tyr Gln Tyr Gly 210 215 220 Asn Phe Ser Trp Asp Leu Ala Gly Gly Gln His Leu Asn Gly Ile Asn 225 230 235 240 Thr Leu Gly Glu Asn Ile Ala Asp Asn Gly Gly Leu Gly Gln Ala Tyr 245 250 255 Arg Ala Tyr Gln Asn Tyr Ile Lys Lys Asn Gly Glu Glu Lys Leu Leu 260 265 270 Pro Gly Leu Asp Leu Asn His Lys Gln Leu Phe Phe Leu Asn Phe Ala 275 280 285 Gln Val Trp Cys Gly Thr Tyr Arg Pro Glu Tyr Ala Val Asn Ser Ile 290 295 300 Lys Thr Asp Val His Ser Pro Gly Asn Phe Arg Ile Ile Gly Thr Leu 305 310 315 320 Gln Asn Ser Ala Glu Phe Ser Glu Ala Phe His Cys Arg Lys Asn Ser 325 330 335 Tyr Met Asn Pro Glu Lys Lys Cys Arg Val Trp *** 340 345 <210> 6 <211> 224 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant neprilysin protein <400> 6 Glu Lys Val Asp Lys Asp Glu Trp Ile Ser Gly Ala Ala Val Val Asn 1 5 10 15 Ala Phe Tyr Ser Ser Gly Arg Asn Gln Ile Val Phe Pro Ala Gly Ile 20 25 30 Leu Gln Pro Pro Phe Phe Ser Ala Gln Gln Ser Asn Ser Leu Asn Tyr 35 40 45 Gly Gly Ile Gly Met Val Ile Gly His Glu Ile Thr His Gly Phe Asp 50 55 60 Asp Asn Gly Arg Asn Phe Asn Lys Asp Gly Asp Leu Val Asp Trp Trp 65 70 75 80 Thr Gln Gln Ser Ala Ser Asn Phe Lys Glu Gln Ser Gln Cys Met Val 85 90 95 Tyr Gln Tyr Gly Asn Phe Ser Trp Asp Leu Ala Gly Gly Gln His Leu 100 105 110 Asn Gly Ile Asn Thr Leu Gly Glu Asn Ile Ala Asp Asn Gly Gly Leu 115 120 125 Gly Gln Ala Tyr Arg Ala Tyr Gln Asn Tyr Ile Lys Lys Asn Gly Glu 130 135 140 Glu Lys Leu Leu Pro Gly Leu Asp Leu Asn His Lys Gln Leu Phe Phe 145 150 155 160 Leu Asn Phe Ala Gln Val Trp Cys Gly Thr Tyr Arg Pro Glu Tyr Ala 165 170 175 Val Asn Ser Ile Lys Thr Asp Val His Ser Pro Gly Asn Phe Arg Ile 180 185 190 Ile Gly Thr Leu Gln Asn Ser Ala Glu Phe Ser Glu Ala Phe His Cys 195 200 205 Arg Lys Asn Ser Tyr Met Asn Pro Glu Lys Lys Cys Arg Val Trp *** 210 215 220 <210> 7 <211> 751 <212> PRT <213> neprilysin <400> 7 Met Gly Lys Ser Glu Ser Gln Met Asp Ile Thr Asp Ile Asn Thr Pro 1 5 10 15 Lys Pro Lys Lys Lys Gln Arg Trp Thr Arg Leu Glu Ile Ser Leu Ser 20 25 30 Val Leu Val Leu Leu Leu Thr Ile Ile Ala Val Arg Met Ile Ala Leu 35 40 45 Tyr Ala Thr Tyr Asp Asp Gly Ile Cys Lys Ser Ser Asp Cys Ile Lys 50 55 60 Ser Ala Ala Arg Leu Ile Gln Asn Met Asp Ala Thr Thr Glu Pro Cys 65 70 75 80 Arg Asp Phe Phe Lys Tyr Ala Cys Gly Gly Trp Leu Lys Arg Asn Val 85 90 95 Ile Pro Glu Thr Ser Ser Arg Tyr Gly Asn Phe Asp Ile Leu Arg Asp 100 105 110 Glu Leu Glu Val Val Leu Lys Asp Val Leu Gln Glu Pro Lys Thr Glu 115 120 125 Asp Ile Val Ala Val Gln Lys Ala Lys Ala Leu Tyr Arg Ser Cys Ile 130 135 140 Asn Glu Ser Ala Ile Asp Ser Arg Gly Gly Glu Pro Leu Leu Lys Leu 145 150 155 160 Leu Pro Asp Ile Tyr Gly Trp Pro Val Ala Thr Glu Asn Trp Glu Gln 165 170 175 Lys Tyr Gly Ala Ser Trp Thr Ala Glu Lys Ala Ile Ala Gln Leu Asn 180 185 190 Ser Lys Tyr Gly Lys Lys Val Leu Ile Asn Leu Phe Val Gly Thr Asp 195 200 205 Asp Lys Asn Ser Val Asn His Val Ile His Ile Asp Gln Pro Arg Leu 210 215 220 Gly Leu Pro Ser Arg Asp Tyr Tyr Glu Cys Thr Gly Ile Tyr Lys Glu 225 230 235 240 Ala Cys Thr Ala Tyr Val Asp Phe Met Ile Ser Val Ala Arg Leu Ile 245 250 255 Arg Gln Glu Glu Arg Leu Pro Ile Asp Glu Asn Gln Leu Ala Leu Glu 260 265 270 Met Asn Lys Val Met Glu Leu Glu Lys Glu Ile Ala Asn Ala Thr Ala 275 280 285 Lys Pro Glu Asp Arg Asn Asp Pro Met Leu Leu Tyr Asn Lys Met Arg 290 295 300 Leu Ala Gln Ile Gln Asn Asn Phe Ser Leu Glu Ile Asn Gly Lys Pro 305 310 315 320 Phe Ser Trp Leu Asn Phe Thr Asn Glu Ile Met Ser Thr Val Asn Ile 325 330 335 Ser Ile Thr Asn Glu Glu Asp Val Val Val Tyr Ala Pro Glu Tyr Leu 340 345 350 Thr Lys Leu Lys Pro Ile Leu Thr Lys Tyr Ser Ala Arg Asp Leu Gln 355 360 365 Asn Leu Met Ser Trp Arg Phe Ile Met Asp Leu Val Ser Ser Leu Ser 370 375 380 Arg Thr Tyr Lys Glu Ser Arg Asn Ala Phe Arg Lys Ala Leu Tyr Gly 385 390 395 400 Thr Thr Ser Glu Thr Ala Thr Trp Arg Arg Cys Ala Asn Tyr Val Asn 405 410 415 Gly Asn Met Glu Asn Ala Val Gly Arg Leu Tyr Val Glu Ala Ala Phe 420 425 430 Ala Gly Glu Ser Lys His Val Val Glu Asp Leu Ile Ala Gln Ile Arg 435 440 445 Glu Val Phe Ile Gln Thr Leu Asp Asp Leu Thr Trp Met Asp Ala Glu 450 455 460 Thr Lys Lys Arg Ala Glu Glu Lys Ala Leu Ala Ile Lys Glu Arg Ile 465 470 475 480 Gly Tyr Pro Asp Asp Ile Val Ser Asn Asp Asn Lys Leu Asn Asn Glu 485 490 495 Tyr Leu Glu Leu Asn Tyr Lys Glu Asp Glu Tyr Phe Glu Asn Ile Ile 500 505 510 Gln Asn Leu Lys Phe Ser Gln Ser Lys Gln Leu Lys Lys Leu Arg Glu 515 520 525 Lys Val Asp Lys Asp Glu Trp Ile Ser Gly Ala Ala Val Val Asn Ala 530 535 540 Phe Tyr Ser Ser Gly Arg Asn Gln Ile Val Phe Pro Ala Gly Ile Leu 545 550 555 560 Gln Pro Pro Phe Phe Ser Ala Gln Gln Ser Asn Ser Leu Asn Tyr Gly 565 570 575 Gly Ile Gly Met Val Ile Gly His Glu Ile Thr His Gly Phe Asp Asp 580 585 590 Asn Gly Arg Asn Phe Asn Lys Asp Gly Asp Leu Val Asp Trp Trp Thr 595 600 605 Gln Gln Ser Ala Ser Asn Phe Lys Glu Gln Ser Gln Cys Met Val Tyr 610 615 620 Gln Tyr Gly Asn Phe Ser Trp Asp Leu Ala Gly Gly Gln His Leu Asn 625 630 635 640 Gly Ile Asn Thr Leu Gly Glu Asn Ile Ala Asp Asn Gly Gly Leu Gly 645 650 655 Gln Ala Tyr Arg Ala Tyr Gln Asn Tyr Ile Lys Lys Asn Gly Glu Glu 660 665 670 Lys Leu Leu Pro Gly Leu Asp Leu Asn His Lys Gln Leu Phe Phe Leu 675 680 685 Asn Phe Ala Gln Val Trp Cys Gly Thr Tyr Arg Pro Glu Tyr Ala Val 690 695 700 Asn Ser Ile Lys Thr Asp Val His Ser Pro Gly Asn Phe Arg Ile Ile 705 710 715 720 Gly Thr Leu Gln Asn Ser Ala Glu Phe Ser Glu Ala Phe His Cys Arg 725 730 735 Lys Asn Ser Tyr Met Asn Pro Glu Lys Lys Cys Arg Val Trp *** 740 745 750 <210> 8 <211> 2100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant neprilysin DNA <400> 8 tacgatgatg gtatttgcaa gtcatcagac tgcataaaat cagctgctcg actgatccaa 60 aacatggatg ccaccactga gccttgtaga gactttttca aatatgcttg cggaggctgg 120 ttgaaacgta atgtcattcc cgagaccagc tcccgttacg gcaactttga cattttaaga 180 gatgaactag aagtcgtttt gaaagatgtc cttcaagaac ccaaaactga agatatagta 240 gcagtgcaga aagcaaaagc attgtacagg tcttgtataa atgaatctgc tattgatagc 300 agaggtggag aacctctact caaactgtta ccagacatat atgggtggcc agtagcaaca 360 gaaaactggg agcaaaaata tggtgcttct tggacagctg aaaaagctat tgcacaactg 420 aattctaaat atgggaaaaa agtccttatt aatttgtttg ttggcactga tgataagaat 480 tctgtgaatc atgtaattca tattgaccaa cctcgacttg gcctcccttc tagagattac 540 tatgaatgca ctggaatcta taaagaggct tgtacagcat atgtggattt tatgatttct 600 gtggccagat tgattcgtca ggaagaaaga ttgcccatcg atgaaaacca gcttgctttg 660 gaaatgaata aagttatgga attggaaaaa gaaattgcca atgctacggc taaacctgaa 720 gatcgaaatg atccaatgct tctgtataac aagatgagat tggcccagat ccaaaataac 780 ttttcactag agatcaatgg gaagccattc agctggttga atttcacaaa tgaaatcatg 840 tcaactgtga atattagtat tacaaatgag gaagatgtgg ttgtttatgc tccagaatat 900 ttaaccaaac ttaagcccat tcttaccaaa tattctgcca gagatcttca aaatttaatg 960 tcctggagat tcataatgga tcttgtaagc agcctcagcc gaacctacaa ggagtccaga 1020 aatgctttcc gcaaggccct ttatggtaca acctcagaaa cagcaacttg gagacgttgt 1080 gcaaactatg tcaatgggaa tatggaaaat gctgtgggga ggctttatgt ggaagcagca 1140 tttgctggag agagtaaaca tgtggtcgag gatttgattg cacagatccg agaagttttt 1200 attcagactt tagatgacct cacttggatg gatgccgaga caaaaaagag agctgaagaa 1260 aaggccttag caattaaaga aaggatcggc tatcctgatg acattgtttc aaatgataac 1320 aaactgaata atgagtacct cgagttgaac tacaaagaag atgaatactt cgagaacata 1380 attcaaaatt tgaaattcag ccaaagtaaa caactgaaga agctccgaga aaaggtggac 1440 aaagatgagt ggataagtgg agcagctgta gtcaatgcat tttactcttc aggaagaaat 1500 cagatagtct tcccagccgg cattctgcag ccccccttct ttagtgccca gcagtccaac 1560 tcattgaact atgggggcat cggcatggtc ataggacacg aaatcaccca tggcttcgat 1620 gacaatggca gaaactttaa caaagatgga gacctcgttg actggtggac tcaacagtct 1680 gcaagtaact ttaaggagca atcccagtgc atggtgtatc agtatggaaa cttttcctgg 1740 gacctggcag gtggacagca ccttaatgga attaatacac tgggagaaaa cattgctgat 1800 aatggaggtc ttggtcaagc atacagagcc tatcagaatt atattaaaaa gaatggcgaa 1860 gaaaaattac ttcctggact tgacctaaat cacaaacaac tatttttctt gaactttgca 1920 caggtgtggt gtggaaccta taggccagag tatgcggtta actccattaa aacagatgtg 1980 cacagtccag gcaatttcag gattattggg actttgcaga actctgcaga gttttcagaa 2040 gcctttcact gccgcaagaa ttcatacatg aatccagaaa agaagtgccg ggtttggtga 2100 2100 <210> 9 <211> 5580 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pBAC-6 vector <400> 9 ggaacggctc cgcccactat taatgaaatt aaaaattcca attttaaaaa acgcagcaag 60 agaaacattt gtatgaaaga atgcgtagaa ggaaagaaaa atgtcgtcga catgctgaac 120 aacaagatta atatgcctcc gtgtataaaa aaaatattga acgatttgaa agaaaacaat 180 gtaccgcgcg gcggtatgta caggaagagg tttatactaa actgttacat tgcaaacgtg 240 gtttcgtgtg ccaagtgtga aaaccgatgt ttaatcaagg ctctgacgca tttctacaac 300 cacgactcca agtgtgtggg tgaagtcatg catcttttaa tcaaatccca agatgtgtat 360 aaaccaccaa actgccaaaa aatgaaaact gtcgacaagc tctgtccgtt tgctggcaac 420 tgcaagggtc tcaatcctat ttgtaattat tgaataataa aacaattata aatgctaaat 480 ttgtttttta ttaacgatac aaaccaaacg caacaagaac atttgtagta ttatctataa 540 ttgaaaacgc gtagttataa tcgctgaggt aatatttaaa atcattttca aatgattcac 600 agttaatttg cgacaatata attttatttt cacataaact agacgccttg tcgtcttctt 660 cttcgtattc cttctctttt tcatttttct cttcataaaa attaacatag ttattatcgt 720 atccatatat gtatctatcg tatagagtaa attttttgtt gtcataaata tatatgtctt 780 ttttaatggg gtgtatagta ccgctgcgca tagtttttct gtaatttaca acagtgctat 840 tttctggtag ttcttcggag tgtgttgctt taattattaa atttatataa tcaatgaatt 900 tgggatcgtc ggttttgtac aatatgttgc cggcatagta cgcagcttct tctagttcaa 960 ttacaccatt ttttagcagc accggattaa cataactttc caaaatgttg tacgaaccgt 1020 taaacaaaaa cagttcacct cccttttcta tactattgtc tgcgagcagt tgtttgttgt 1080 taaaaataac agccattgta atgagacgca caaactaata tcacaaactg gaaatgtcta 1140 tcaatatata gttgctgatc agatctgtcg actgagcgtc cgtgttcatg atcccgtttt 1200 tataacagcc agataaaaat aatcttatca attaagataa aaagataaga ttattaatct 1260 aacaacgtgc cttgtgtcac gtaggccaga taacggtcgg gtatataaga cgcctcaacg 1320 ctactagtaa atcagtcaca ccaaggcttc aataaggaac acacaagcaa gatggtaagc 1380 gctattgttt tatatgtgct tttggcggcg gcggcgcatt ctgcctttgc ggccatggtc 1440 catcatcacc accatcactc cgcgggtttg gtgcccagag gcagcggcaa agaaacggcg 1500 gcggcgaaat ttgaacgcca acacatggac agcgctagcg gtggaggtga tgacgacgac 1560 aagagcccgg gcttctcctc aaaaggcctg gatccgaatt cgagctcgaa gcttgcggcc 1620 gcactcgagc accaccacca ccaccactaa cctaggtagc tgagcgcatg caagctgatc 1680 cgggttatta gtacatttat taagcgctag attctgtgcg ttgttgattt acagacaatt 1740 gttgtacgta ttttaataat tcattaaatt tataatcttt agggtggtat gttagagcga 1800 aaatcaaatg attttcagcg tctttatatc tgaatttaaa tattaaatcc tcaatagatt 1860 tgtaaaatag gtttcgatta gtttcaaaca agggttgttt ttccgaaccg atggctggac 1920 tatctaatgg attttcgctc aacgccacaa aacttgccaa atcttgtagc agcaatctag 1980 ctttgtcgat attcgtttgt gttttgtttt gtaataaagg ttcgacgtcg ttcaaaatat 2040 tatgcgcttt tgtatttctt tcatcactgt cgttagtgta caattgactc gacgtaaaca 2100 cgttaaatag agcttggaca tatttaacat cgggcgtgtt agctttatta ggccgattat 2160 cgtcgtcgtc ccaaccctcg tcgttagaag ttgcttccga agacgatttt gccatagcca 2220 cacgacgcct attaattgtg tcggctaaca cgtccgcgat caaatttgta gttgagcttt 2280 ttggaattat ttctgattgc gggcgttttt gggcgggttt caatctaact gtgcccgatt 2340 ttaattcaga caacacgtta gaaagcgatg gtgcaggcgg tggtaacatt tcagacggca 2400 aatctactaa tggcggcggt ggtggagctg atgataaatc taccatcggt ggaggcgcag 2460 gcggggctgg cggcggaggc ggaggcggag gtggtggcgg tgatgcagac ggcggtttag 2520 gctcaaatgt ctctttaggc aacacagtcg gcacctcaac tattgtactg gtttcgggcg 2580 ccgtttttgg tttgaccggt ctgagacgag tgcgattttt ttcgtttcta atagcttcca 2640 acaattgttg tctgtcgtct aaaggtgcag cgggttgagg ttccgtcggc attggtggag 2700 cgggcggcaa ttcagacatc gatggtggtg gtggtggtgg aggcgctgga atgttaggca 2760 cgggagaagg tggtggcggc ggtgccgccg gtataatttg ttctggttta gtttgttcgc 2820 gcacgattgt gggcaccggc gcaggcgccg ctggctgcac aacggaaggt cgtctgcttc 2880 gaggcagcgc ttggggtggt ggcaattcaa tattataatt ggaatacaaa tcgtaaaaat 2940 ctgctataag cattgtaatt tcgctatcgt ttaccgtgcc gatatttaac aaccgctcaa 3000 tgtaagcaat tgtattgtaa agagattgtc tcaagctcgg atcgatcccg cacgccgata 3060 acaagccttt tcatttttac tacagcattg tagtggcgag acacttcgct gtcgtcgagg 3120 tttaaacgct tcctcgctca ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc ggcgagcggt 3180 atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa tcaggggata acgcaggaaa 3240 gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc 3300 gtttttccat aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag 3360 gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt 3420 gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg 3480 aagcgtggcg ctttctcata gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg 3540 ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg 3600 taactatcgt cttgagtcca acccggtaag acacgactta tcgccactgg cagcagccac 3660 tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg 3720 gcctaactac ggctacacta gaaggacagt atttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt 3780 taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg 3840 tggttttttt gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc aagaagatcc 3900 tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt 3960 ggtcatgaga ttatcaaaaa ggatcttcac ctagatcctt ttaaattaaa aatgaagttt 4020 taaatcaatc taaagtatat atgagtaaac ttggtctgac agttaccaat gcttaatcag 4080 tgaggcacct atctcagcga tctgtctatt tcgttcatcc atagttgcct gactccccgt 4140 cgtgtagata actacgatac gggagggctt accatctggc cccagtgctg caatgatacc 4200 gcgagaccca cgctcaccgg ctccagattt atcagcaata aaccagccag ccggaagggc 4260 cgagcgcaga agtggtcctg caactttatc cgcctccatc cagtctatta attgttgccg 4320 ggaagctaga gtaagtagtt cgccagttaa tagtttgcgc aacgttgttg ccattgctac 4380 aggcatcgtg gtgtcacgct cgtcgtttgg tatggcttca ttcagctccg gttcccaacg 4440 atcaaggcga gttacatgat cccccatgtt gtgcaaaaaa gcggttagct ccttcggtcc 4500 tccgatcgtt gtcagaagta agttggccgc agtgttatca ctcatggtta tggcagcact 4560 gcataattct cttactgtca tgccatccgt aagatgcttt tctgtgactg gtgagtactc 4620 aaccaagtca ttctgagaat agtgtatgcg gcgaccgagt tgctcttgcc cggcgtcaat 4680 acgggataat accgcgccac atagcagaac tttaaaagtg ctcatcattg gaaaacgttc 4740 ttcggggcga aaactctcaa ggatcttacc gctgttgaga tccagttcga tgtaacccac 4800 tcgtgcaccc aactgatctt cagcatcttt tactttcacc agcgtttctg ggtgagcaaa 4860 aacaggaagg caaaatgccg caaaaaaggg aataagggcg acacggaaat gttgaatact 4920 catactcttc ctttttcaat attattgaag catttatcag ggttattgtc tcatgagcgg 4980 atacatattt gaatgtattt agaaaaataa acaaataggg gttccgcgca catttccccg 5040 aaaagtgcca cctgacgcgc cctgtagcgg cgcattaagc gcggcgggtg tggtggttac 5100 gcgcagcgtg accgctacac ttgccagcgc cctagcgccc gctcctttcg ctttcttccc 5160 ttcctttctc gccacgttcg ccggctttcc ccgtcaagct ctaaatcggg ggctcccttt 5220 agggttccga tttagtgctt tacggcacct cgaccccaaa aaacttgatt agggtgatgg 5280 ttcacgtagt gggccatcgc cctgatagac ggtttttcgc cctttgacgt tggagtccac 5340 gttctttaat agtggactct tgttccaaac tggaacaaca ctcaacccta tctcggtcta 5400 ttcttttgat ttataaggga ttttgccgat ttcggcctat tggttaaaaa atgagctgat 5460 ttaacaaaaa tttaacgcga attttaacaa aatattaacg tttacaattt cccattcgcc 5520 attcaggctg cgcaactgtt gggaagggcg atcggtgcgg gcctcttcgc tattacgcca 5580 5580 <210> 10 <211> 1860 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> pBAC-6 vector derived protein <400> 10 Gly Thr Ala Pro Pro Thr Ile Asn Glu Ile Lys Asn Ser Asn Phe Lys 1 5 10 15 Lys Arg Ser Lys Arg Asn Ile Cys Met Lys Glu Cys Val Glu Gly Lys 20 25 30 Lys Asn Val Val Asp Met Leu Asn Asn Lys Ile Asn Met Pro Pro Cys 35 40 45 Ile Lys Lys Ile Leu Asn Asp Leu Lys Glu Asn Asn Val Pro Arg Gly 50 55 60 Gly Met Tyr Arg Lys Arg Phe Ile Leu Asn Cys Tyr Ile Ala Asn Val 65 70 75 80 Val Ser Cys Ala Lys Cys Glu Asn Arg Cys Leu Ile Lys Ala Leu Thr 85 90 95 His Phe Tyr Asn His Asp Ser Lys Cys Val Gly Glu Val Met His Leu 100 105 110 Leu Ile Lys Ser Gln Asp Val Tyr Lys Pro Pro Asn Cys Gln Lys Met 115 120 125 Lys Thr Val Asp Lys Leu Cys Pro Phe Ala Gly Asn Cys Lys Gly Leu 130 135 140 Asn Pro Ile Cys Asn Tyr *** Ile Ile Lys Gln Leu *** Met Leu Asn 145 150 155 160 Leu Phe Phe Ile Asn Asp Thr Asn Gln Thr Gln Gln Glu His Leu *** 165 170 175 Tyr Tyr Leu *** Leu Lys Thr Arg Ser Tyr Asn Arg *** Gly Asn Ile 180 185 190 *** Asn His Phe Gln Met Ile His Ser *** Phe Ala Thr Ile *** Phe 195 200 205 Tyr Phe His Ile Asn *** Thr Pro Cys Arg Leu Leu Leu Arg Ile Pro 210 215 220 Ser Leu Phe His Phe Ser Leu His Lys Asn *** His Ser Tyr Tyr Arg 225 230 235 240 Ile His Ile Cys Ile Tyr Arg Ile Glu *** Ile Phe Cys Cys His Lys 245 250 255 Tyr Ile Cys Leu Phe *** Trp Gly Val *** Tyr Arg Cys Ala *** Phe 260 265 270 Phe Cys Asn Leu Gln Gln Cys Tyr Phe Leu Val Val Leu Arg Ser Val 275 280 285 Leu Leu *** Leu Leu Asn Leu Tyr Asn Gln *** Ile Trp Asp Arg Arg 290 295 300 Phe Cys Thr Ile Cys Cys Arg His Ser Thr Gln Leu Leu Leu Val Gln 305 310 315 320 Leu His His Phe Leu Ala Ala Pro Asp *** His Asn Phe Pro Lys Cys 325 330 335 Cys Thr Asn Arg *** Thr Lys Thr Val His Leu Pro Phe Leu Tyr Tyr 340 345 350 Cys Leu Arg Ala Val Val Cys Cys *** Lys *** Gln Pro Leu *** *** 355 360 365 Asp Ala Gln Thr Asn Ile Thr Asn Trp Lys Cys Leu Ser Ile Tyr Ser 370 375 380 Cys *** Ser Asp Leu Ser Thr Glu Arg Pro Cys Ser *** Ser Arg Phe 385 390 395 400 Tyr Asn Ser Gln Ile Lys Ile Ile Leu Ser Ile Lys Ile Lys Arg *** 405 410 415 Asp Tyr *** Ser Asn Asn Val Pro Cys Val Thr *** Ala Arg *** Arg 420 425 430 Ser Gly Ile *** Asp Ala Ser Thr Leu Leu Val Asn Gln Ser His Gln 435 440 445 Gly Phe Asn Lys Glu His Thr Ser Lys Met Val Ser Ala Ile Val Leu 450 455 460 Tyr Val Leu Leu Ala Ala Ala Ala His Ser Ala Phe Ala Ala Met Val 465 470 475 480 His His His His His His Ser Ala Gly Leu Val Pro Arg Gly Ser Gly 485 490 495 Lys Glu Thr Ala Ala Ala Lys Phe Glu Arg Gln His Met Asp Ser Ala 500 505 510 Ser Gly Gly Gly Asp Asp Asp Asp Lys Ser Pro Gly Phe Ser Ser Lys 515 520 525 Gly Leu Asp Pro Asn Ser Ser Ser Lys Leu Ala Ala Ala Leu Glu His 530 535 540 His His His His His *** Pro Arg *** Leu Ser Ala Cys Lys Leu Ile 545 550 555 560 Arg Val Ile Ser Thr Phe Ile Lys Arg *** Ile Leu Cys Val Val Asp 565 570 575 Leu Gln Thr Ile Val Val Arg Ile Leu Ile Ile His *** Ile Tyr Asn 580 585 590 Leu *** Gly Gly Met Leu Glu Arg Lys Ser Asn Asp Phe Gln Arg Leu 595 600 605 Tyr Ile *** Ile *** Ile Leu Asn Pro Gln *** Ile Cys Lys Ile Gly 610 615 620 Phe Asp *** Phe Gln Thr Arg Val Val Phe Pro Asn Arg Trp Leu Asp 625 630 635 640 Tyr Leu Met Asp Phe Arg Ser Thr Pro Gln Asn Leu Pro Asn Leu Val 645 650 655 Ala Ala Ile *** Leu Cys Arg Tyr Ser Phe Val Phe Cys Phe Val Ile 660 665 670 Lys Val Arg Arg Arg Ser Lys Tyr Tyr Ala Leu Leu Tyr Phe Phe His 675 680 685 His Cys Arg *** Cys Thr Ile Asp Ser Thr *** Thr Arg *** Ile Glu 690 695 700 Leu Gly His Ile *** His Arg Ala Cys *** Leu Tyr *** Ala Asp Tyr 705 710 715 720 Arg Arg Arg Pro Asn Pro Arg Arg *** Lys Leu Leu Pro Lys Thr Ile 725 730 735 Leu Pro *** Pro His Asp Ala Tyr *** Leu Cys Arg Leu Thr Arg Pro 740 745 750 Arg Ser Asn Leu *** Leu Ser Phe Leu Glu Leu Phe Leu Ile Ala Gly 755 760 765 Val Phe Gly Arg Val Ser Ile *** Leu Cys Pro Ile Leu Ile Gln Thr 770 775 780 Thr Arg *** Lys Ala Met Val Gln Ala Val Val Thr Phe Gln Thr Ala 785 790 795 800 Asn Leu Leu Met Ala Ala Val Val Glu Leu Met Ile Asn Leu Pro Ser 805 810 815 Val Glu Ala Gln Ala Gly Leu Ala Ala Glu Ala Glu Ala Glu Val Val 820 825 830 Ala Val Met Gln Thr Ala Val *** Ala Gln Met Ser Leu *** Ala Thr 835 840 845 Gln Ser Ala Pro Gln Leu Leu Tyr Trp Phe Arg Ala Pro Phe Leu Val 850 855 860 *** Pro Val *** Asp Glu Cys Asp Phe Phe Arg Phe *** *** Leu Pro 865 870 875 880 Thr Ile Val Val Cys Arg Leu Lys Val Gln Arg Val Glu Val Pro Ser 885 890 895 Ala Leu Val Glu Arg Ala Ala Ile Gln Thr Ser Met Val Val Val Val 900 905 910 Val Glu Ala Leu Glu Cys *** Ala Arg Glu Lys Val Val Ala Ala Val 915 920 925 Pro Pro Val *** Phe Val Leu Val *** Phe Val Arg Ala Arg Leu Trp 930 935 940 Ala Pro Ala Gln Ala Pro Leu Ala Ala Gln Arg Lys Val Val Cys Phe 945 950 955 960 Glu Ala Ala Leu Gly Val Val Ala Ile Gln Tyr Tyr Asn Trp Asn Thr 965 970 975 Asn Arg Lys Asn Leu Leu *** Ala Leu *** Phe Arg Tyr Arg Leu Pro 980 985 990 Cys Arg Tyr Leu Thr Thr Ala Gln Cys Lys Gln Leu Tyr Cys Lys Glu 995 1000 1005 Ile Val Ser Ser Ser Asp Arg Ser Arg Thr Pro Ile Thr Ser Leu Phe 1010 1015 1020 Ile Phe Thr Thr Ala Leu *** Trp Arg Asp Thr Ser Leu Ser Ser Arg 1025 1030 1035 1040 Phe Lys Arg Phe Leu Ala His *** Leu Ala Ala Leu Gly Arg Ser Ala 1045 1050 1055 Ala Ala Ser Gly Ile Ser Ser Leu Lys Gly Gly Asn Thr Val Ile His 1060 1065 1070 Arg Ile Arg Gly *** Arg Arg Lys Glu His Val Ser Lys Arg Pro Ala 1075 1080 1085 Lys Gly Gln Glu Pro *** Lys Gly Arg Val Ala Gly Val Phe Pro *** 1090 1095 1100 Ala Pro Pro Pro *** Arg Ala Ser Gln Lys Ser Thr Leu Lys Ser Glu 1105 1110 1115 1120 Val Ala Lys Pro Asp Arg Thr Ile Lys Ile Pro Gly Val Ser Pro Trp 1125 1130 1135 Lys Leu Pro Arg Ala Leu Ser Cys Ser Asp Pro Ala Ala Tyr Arg Ile 1140 1145 1150 Pro Val Arg Leu Ser Pro Phe Gly Lys Arg Gly Ala Phe Ser *** Leu 1155 1160 1165 Thr Leu *** Val Ser Gln Phe Gly Val Gly Arg Ser Leu Gln Ala Gly 1170 1175 1180 Leu Cys Ala Arg Thr Pro Arg Ser Ala Arg Pro Leu Arg Leu Ile Arg 1185 1190 1195 1200 *** Leu Ser Ser *** Val Gln Pro Gly Lys Thr Arg Leu Ile Ala Thr 1205 1210 1215 Gly Ser Ser His Trp *** Gln Asp *** Gln Ser Glu Val Cys Arg Arg 1220 1225 1230 Cys Tyr Arg Val Leu Glu Val Val Ala *** Leu Arg Leu His *** Lys 1235 1240 1245 Asp Ser Ile Trp Tyr Leu Arg Ser Ala Glu Ala Ser Tyr Leu Arg Lys 1250 1255 1260 Lys Ser Trp *** Leu Leu Ile Arg Gln Thr Asn His Arg Trp *** Arg 1265 1270 1275 1280 Trp Phe Phe Cys Leu Gln Ala Ala Asp Tyr Ala Gln Lys Lys Arg Ile 1285 1290 1295 Ser Arg Arg Ser Phe Asp Leu Phe Tyr Gly Val *** Arg Ser Val Glu 1300 1305 1310 Arg Lys Leu Thr Leu Arg Asp Phe Gly His Glu Ile Ile Lys Lys Asp 1315 1320 1325 Leu His Leu Asp Pro Phe Lys Leu Lys Met Lys Phe *** Ile Asn Leu 1330 1335 1340 Lys Tyr Ile *** Val Asn Leu Val *** Gln Leu Pro Met Leu Asn Gln 1345 1350 1355 1360 *** Gly Thr Tyr Leu Ser Asp Leu Ser Ile Ser Phe Ile His Ser Cys 1365 1370 1375 Leu Thr Pro Arg Arg Val Asp Asn Tyr Asp Thr Gly Gly Leu Thr Ile 1380 1385 1390 Trp Pro Gln Cys Cys Asn Asp Thr Ala Arg Pro Thr Leu Thr Gly Ser 1395 1400 1405 Arg Phe Ile Ser Asn Lys Pro Ala Ser Arg Lys Gly Arg Ala Gln Lys 1410 1415 1420 Trp Ser Cys Asn Phe Ile Arg Leu His Pro Val Tyr *** Leu Leu Pro 1425 1430 1435 1440 Gly Ser *** Ser Lys *** Phe Ala Ser *** *** Phe Ala Gln Arg Cys 1445 1450 1455 Cys His Cys Tyr Arg His Arg Gly Val Thr Leu Val Val Trp Tyr Gly 1460 1465 1470 Phe Ile Gln Leu Arg Phe Pro Thr Ile Lys Ala Ser Tyr Met Ile Pro 1475 1480 1485 His Val Val Gln Lys Ser Gly *** Leu Leu Arg Ser Ser Asp Arg Cys 1490 1495 1500 Gln Lys *** Val Gly Arg Ser Val Ile Thr His Gly Tyr Gly Ser Thr 1505 1510 1515 1520 Ala *** Phe Ser Tyr Cys His Ala Ile Arg Lys Met Leu Phe Cys Asp 1525 1530 1535 Trp *** Val Leu Asn Gln Val Ile Leu Arg Ile Val Tyr Ala Ala Thr 1540 1545 1550 Glu Leu Leu Leu Pro Gly Val Asn Thr Gly *** Tyr Arg Ala Thr *** 1555 1560 1565 Gln Asn Phe Lys Ser Ala His His Trp Lys Thr Phe Phe Gly Ala Lys 1570 1575 1580 Thr Leu Lys Asp Leu Thr Ala Val Glu Ile Gln Phe Asp Val Thr His 1585 1590 1595 1600 Ser Cys Thr Gln Leu Ile Phe Ser Ile Phe Tyr Phe His Gln Arg Phe 1605 1610 1615 Trp Val Ser Lys Asn Arg Lys Ala Lys Cys Arg Lys Lys Gly Asn Lys 1620 1625 1630 Gly Asp Thr Glu Met Leu Asn Thr His Thr Leu Pro Phe Ser Ile Leu 1635 1640 1645 Leu Lys His Leu Ser Gly Leu Leu Ser His Glu Arg Ile His Ile *** 1650 1655 1660 Met Tyr Leu Glu Lys *** Thr Asn Arg Gly Ser Ala His Ile Ser Pro 1665 1670 1675 1680 Lys Ser Ala Thr *** Arg Ala Leu *** Arg Arg Ile Lys Arg Gly Gly 1685 1690 1695 Cys Gly Gly Tyr Ala Gln Arg Asp Arg Tyr Thr Cys Gln Arg Pro Ser 1700 1705 1710 Ala Arg Ser Phe Arg Phe Leu Pro Phe Leu Ser Arg His Val Arg Arg 1715 1720 1725 Leu Ser Pro Ser Ser Ser Lys Ser Gly Ala Pro Phe Arg Val Pro Ile 1730 1735 1740 *** Cys Phe Thr Ala Pro Arg Pro Gln Lys Thr *** Leu Gly *** Trp 1745 1750 1755 1760 Phe Thr *** Trp Ala Ile Ala Leu Ile Asp Gly Phe Ser Pro Phe Asp 1765 1770 1775 Val Gly Val His Val Leu *** *** Trp Thr Leu Val Pro Asn Trp Asn 1780 1785 1790 Asn Thr Gln Pro Tyr Leu Gly Leu Phe Phe *** Phe Ile Arg Asp Phe 1795 1800 1805 Ala Asp Phe Gly Leu Leu Val Lys Lys *** Ala Asp Leu Thr Lys Ile 1810 1815 1820 *** Arg Glu Phe *** Gln Asn Ile Asn Val Tyr Asn Phe Pro Phe Ala 1825 1830 1835 1840 Ile Gln Ala Ala Gln Leu Leu Gly Arg Ala Ile Gly Ala Gly Leu Phe 1845 1850 1855 Ala Ile Thr Pro 1860 <210> 11 <211> 7611 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant neprilysin DNA <400> 11 ggaacggctc cgcccactat taatgaaatt aaaaattcca attttaaaaa acgcagcaag 60 agaaacattt gtatgaaaga atgcgtagaa ggaaagaaaa atgtcgtcga catgctgaac 120 aacaagatta atatgcctcc gtgtataaaa aaaatattga acgatttgaa agaaaacaat 180 gtaccgcgcg gcggtatgta caggaagagg tttatactaa actgttacat tgcaaacgtg 240 gtttcgtgtg ccaagtgtga aaaccgatgt ttaatcaagg ctctgacgca tttctacaac 300 cacgactcca agtgtgtggg tgaagtcatg catcttttaa tcaaatccca agatgtgtat 360 aaaccaccaa actgccaaaa aatgaaaact gtcgacaagc tctgtccgtt tgctggcaac 420 tgcaagggtc tcaatcctat ttgtaattat tgaataataa aacaattata aatgctaaat 480 ttgtttttta ttaacgatac aaaccaaacg caacaagaac atttgtagta ttatctataa 540 ttgaaaacgc gtagttataa tcgctgaggt aatatttaaa atcattttca aatgattcac 600 agttaatttg cgacaatata attttatttt cacataaact agacgccttg tcgtcttctt 660 cttcgtattc cttctctttt tcatttttct cttcataaaa attaacatag ttattatcgt 720 atccatatat gtatctatcg tatagagtaa attttttgtt gtcataaata tatatgtctt 780 ttttaatggg gtgtatagta ccgctgcgca tagtttttct gtaatttaca acagtgctat 840 tttctggtag ttcttcggag tgtgttgctt taattattaa atttatataa tcaatgaatt 900 tgggatcgtc ggttttgtac aatatgttgc cggcatagta cgcagcttct tctagttcaa 960 ttacaccatt ttttagcagc accggattaa cataactttc caaaatgttg tacgaaccgt 1020 taaacaaaaa cagttcacct cccttttcta tactattgtc tgcgagcagt tgtttgttgt 1080 taaaaataac agccattgta atgagacgca caaactaata tcacaaactg gaaatgtcta 1140 tcaatatata gttgctgatc agatctgtcg actgagcgtc cgtgttcatg atcccgtttt 1200 tataacagcc agataaaaat aatcttatca attaagataa aaagataaga ttattaatct 1260 aacaacgtgc cttgtgtcac gtaggccaga taacggtcgg gtatataaga cgcctcaacg 1320 ctactagtaa atcagtcaca ccaaggcttc aataaggaac acacaagcaa gatggtaagc 1380 gctattgttt tatatgtgct tttggcggcg gcggcgcatt ctgcctttgc ggccatggtc 1440 catcatcacc accatcactc cgcgggtttg gtgcccagag gcagcggcaa agaaacggcg 1500 gcggcgaaat ttgaacgcca acacatggac agcgctagct acgatgatgg tatttgcaag 1560 tcatcagact gcataaaatc agctgctcga ctgatccaaa acatggatgc caccactgag 1620 ccttgtacag actttttcaa atatgcttgc ggaggctggt tgaaacgtaa tgtcattccc 1680 gagaccagct cccgttacgg caactttgac attttaagag atgaactaga agtcgttttg 1740 aaagatgtcc ttcaagaacc caaaactgaa gatatagtag cagtgcagaa agcaaaagca 1800 ttgtacaggt cttgtataaa tgaatctgct attgatagca gaggtggaga acctctactc 1860 aaactgttac cagacatata tgggtggcca gtagcaacag aaaactggga gcaaaaatat 1920 ggtgcttctt ggacagctga aaaagctatt gcacaactga attctaaata tgggaaaaaa 1980 gtccttatta atttgtttgt tggcactgat gataagaatt ctgtgaatca tgtaattcat 2040 attgaccaac ctcgacttgg cctcccttct agagattact atgaatgcac tggaatctat 2100 aaagaggctt gtacagcata tgtggatttt atgatttctg tggccagatt gattcgtcag 2160 gaagaaagat tgcccatcga tgaaaaccag cttgctttgg aaatgaataa agttatggaa 2220 ttggaaaaag aaattgccaa tgctacggct aaacctgaag atcgaaatga tccaatgctt 2280 ctgtataaca agatgacatt ggcccagatc caaaataact tttcactaga gatcaatggg 2340 aagccattca gctggttgaa tttcacaaat gaaatcatgt caactgtgaa tattagtatt 2400 acaaatgagg aagatgtggt tgtttatgct ccagaatatt taaccaaact taagcccatt 2460 cttaccaaat attctgccag agatcttcaa aatttaatgt cctggagatt cataatggat 2520 cttgtaagca gcctcagccg aacctacaag gagtccagaa atgctttccg caaggccctt 2580 tatggtacaa cctcagaaac agcaacttgg agacgttgtg caaactatgt caatgggaat 2640 atggaaaatg ctgtggggag gctttatgtg gaagcagcat ttgctggaga gagtaaacat 2700 gtggtcgagg atttgattgc acagatccga gaagttttta ttcagacttt agatgacctc 2760 acttggatgg atgccgagac aaaaaagaga gctgaagaaa aggccttagc aattaaagaa 2820 aggatcggct atcctgatga cattgtttca aatgataaca aactgaataa tgagtacctc 2880 gagttgaact acaaagaaga tgaatacttc gagaacataa ttcaaaattt gaaattcagc 2940 caaagtaaac aactgaagaa gctccgagaa aaggtggaca aagatgagtg gataagtgga 3000 gcagctgtag tcaatgcatt ttactcttca ggaagaaatc agatagtctt cccagccggc 3060 attctgcagc cccccttctt tagtgcccag cagtccaact cattgaacta tgggggcatc 3120 ggcatggtca taggacacga aatcacccat ggcttcgatg acaatggcag aaactttaac 3180 aaagatggag acctcgttga ctggtggact caacagtctg caagtaactt taaggagcaa 3240 tcccagtgca tggtgtatca gtatggaaac ttttcctggg acctggcagg tggacagcac 3300 cttaatggaa ttaatacact gggagaaaac attgctgata atggaggtct tggtcaagca 3360 tacagagcct atcagaatta tattaaaaag aatggcgaag aaaaattact tcctggactt 3420 gacctaaatc acaaacaact atttttcttg aactttgcac aggtgtggtg tggaacctat 3480 aggccagagt atgcggttaa ctccattaaa acagatgtgc acagtccagg caatttcagg 3540 attattggga ctttgcagaa ctctgcagag ttttcagaag cctttcactg ccgcaagaat 3600 tcatacatga atccagaaaa gaagtgccgg gtttggtgaa agcttgcggc cgcactcgag 3660 caccaccacc accaccacta acctaggtag ctgagcgcat gcaagctgat ccgggttatt 3720 agtacattta ttaagcgcta gattctgtgc gttgttgatt tacagacaat tgttgtacgt 3780 attttaataa ttcattaaat ttataatctt tagggtggta tgttagagcg aaaatcaaat 3840 gattttcagc gtctttatat ctgaatttaa atattaaatc ctcaatagat ttgtaaaata 3900 ggtttcgatt agtttcaaac aagggttgtt tttccgaacc gatggctgga ctatctaatg 3960 gattttcgct caacgccaca aaacttgcca aatcttgtag cagcaatcta gctttgtcga 4020 tattcgtttg tgttttgttt tgtaataaag gttcgacgtc gttcaaaata ttatgcgctt 4080 ttgtatttct ttcatcactg tcgttagtgt acaattgact cgacgtaaac acgttaaata 4140 gagcttggac atatttaaca tcgggcgtgt tagctttatt aggccgatta tcgtcgtcgt 4200 cccaaccctc gtcgttagaa gttgcttccg aagacgattt tgccatagcc acacgacgcc 4260 tattaattgt gtcggctaac acgtccgcga tcaaatttgt agttgagctt tttggaatta 4320 tttctgattg cgggcgtttt tgggcgggtt tcaatctaac tgtgcccgat tttaattcag 4380 acaacacgtt agaaagcgat ggtgcaggcg gtggtaacat ttcagacggc aaatctacta 4440 atggcggcgg tggtggagct gatgataaat ctaccatcgg tggaggcgca ggcggggctg 4500 gcggcggagg cggaggcgga ggtggtggcg gtgatgcaga cggcggttta ggctcaaatg 4560 tctctttagg caacacagtc ggcacctcaa ctattgtact ggtttcgggc gccgtttttg 4620 gtttgaccgg tctgagacga gtgcgatttt tttcgtttct aatagcttcc aacaattgtt 4680 gtctgtcgtc taaaggtgca gcgggttgag gttccgtcgg cattggtgga gcgggcggca 4740 attcagacat cgatggtggt ggtggtggtg gaggcgctgg aatgttaggc acgggagaag 4800 gtggtggcgg cggtgccgcc ggtataattt gttctggttt agtttgttcg cgcacgattg 4860 tgggcaccgg cgcaggcgcc gctggctgca caacggaagg tcgtctgctt cgaggcagcg 4920 cttggggtgg tggcaattca atattataat tggaatacaa atcgtaaaaa tctgctataa 4980 gcattgtaat ttcgctatcg tttaccgtgc cgatatttaa caaccgctca atgtaagcaa 5040 ttgtattgta aagagattgt ctcaagctcg gatcgatccc gcacgccgat aacaagcctt 5100 ttcattttta ctacagcatt gtagtggcga gacacttcgc tgtcgtcgag gtttaaacgc 5160 ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg cggcgagcgg tatcagctca 5220 ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg 5280 agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca 5340 taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa 5400 cccgacagga ctataaagat accaggcgtt tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc 5460 tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc 5520 gctttctcat agctcacgct gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct 5580 gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg 5640 tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag 5700 gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta 5760 cggctacact agaaggacag tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg 5820 aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt 5880 tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt 5940 ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt taagggattt tggtcatgag 6000 attatcaaaa aggatcttca cctagatcct tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat 6060 ctaaagtata tatgagtaaa cttggtctga cagttaccaa tgcttaatca gtgaggcacc 6120 tatctcagcg atctgtctat ttcgttcatc catagttgcc tgactccccg tcgtgtagat 6180 aactacgata cgggagggct taccatctgg ccccagtgct gcaatgatac cgcgagaccc 6240 acgctcaccg gctccagatt tatcagcaat aaaccagcca gccggaaggg ccgagcgcag 6300 aagtggtcct gcaactttat ccgcctccat ccagtctatt aattgttgcc gggaagctag 6360 agtaagtagt tcgccagtta atagtttgcg caacgttgtt gccattgcta caggcatcgt 6420 ggtgtcacgc tcgtcgtttg gtatggcttc attcagctcc ggttcccaac gatcaaggcg 6480 agttacatga tcccccatgt tgtgcaaaaa agcggttagc tccttcggtc ctccgatcgt 6540 tgtcagaagt aagttggccg cagtgttatc actcatggtt atggcagcac tgcataattc 6600 tcttactgtc atgccatccg taagatgctt ttctgtgact ggtgagtact caaccaagtc 6660 attctgagaa tagtgtatgc ggcgaccgag ttgctcttgc ccggcgtcaa tacgggataa 6720 taccgcgcca catagcagaa ctttaaaagt gctcatcatt ggaaaacgtt cttcggggcg 6780 aaaactctca aggatcttac cgctgttgag atccagttcg atgtaaccca ctcgtgcacc 6840 caactgatct tcagcatctt ttactttcac cagcgtttct gggtgagcaa aaacaggaag 6900 gcaaaatgcc gcaaaaaagg gaataagggc gacacggaaa tgttgaatac tcatactctt 6960 cctttttcaa tattattgaa gcatttatca gggttattgt ctcatgagcg gatacatatt 7020 tgaatgtatt tagaaaaata aacaaatagg ggttccgcgc acatttcccc gaaaagtgcc 7080 acctgacgcg ccctgtagcg gcgcattaag cgcggcgggt gtggtggtta cgcgcagcgt 7140 gaccgctaca cttgccagcg ccctagcgcc cgctcctttc gctttcttcc cttcctttct 7200 cgccacgttc gccggctttc cccgtcaagc tctaaatcgg gggctccctt tagggttccg 7260 atttagtgct ttacggcacc tcgaccccaa aaaacttgat tagggtgatg gttcacgtag 7320 tgggccatcg ccctgataga cggtttttcg ccctttgacg ttggagtcca cgttctttaa 7380 tagtggactc ttgttccaaa ctggaacaac actcaaccct atctcggtct attcttttga 7440 tttataaggg attttgccga tttcggccta ttggttaaaa aatgagctga tttaacaaaa 7500 atttaacgcg aattttaaca aaatattaac gtttacaatt tcccattcgc cattcaggct 7560 gcgcaactgt tgggaagggc gatcggtgcg ggcctcttcg ctattacgcc a 7611 <210> 12 <211> 2537 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant neprilysin protein <400> 12 Gly Thr Ala Pro Pro Thr Ile Asn Glu Ile Lys Asn Ser Asn Phe Lys 1 5 10 15 Lys Arg Ser Lys Arg Asn Ile Cys Met Lys Glu Cys Val Glu Gly Lys 20 25 30 Lys Asn Val Val Asp Met Leu Asn Asn Lys Ile Asn Met Pro Pro Cys 35 40 45 Ile Lys Lys Ile Leu Asn Asp Leu Lys Glu Asn Asn Val Pro Arg Gly 50 55 60 Gly Met Tyr Arg Lys Arg Phe Ile Leu Asn Cys Tyr Ile Ala Asn Val 65 70 75 80 Val Ser Cys Ala Lys Cys Glu Asn Arg Cys Leu Ile Lys Ala Leu Thr 85 90 95 His Phe Tyr Asn His Asp Ser Lys Cys Val Gly Glu Val Met His Leu 100 105 110 Leu Ile Lys Ser Gln Asp Val Tyr Lys Pro Pro Asn Cys Gln Lys Met 115 120 125 Lys Thr Val Asp Lys Leu Cys Pro Phe Ala Gly Asn Cys Lys Gly Leu 130 135 140 Asn Pro Ile Cys Asn Tyr *** Ile Ile Lys Gln Leu *** Met Leu Asn 145 150 155 160 Leu Phe Phe Ile Asn Asp Thr Asn Gln Thr Gln Gln Glu His Leu *** 165 170 175 Tyr Tyr Leu *** Leu Lys Thr Arg Ser Tyr Asn Arg *** Gly Asn Ile 180 185 190 *** Asn His Phe Gln Met Ile His Ser *** Phe Ala Thr Ile *** Phe 195 200 205 Tyr Phe His Ile Asn *** Thr Pro Cys Arg Leu Leu Leu Arg Ile Pro 210 215 220 Ser Leu Phe His Phe Ser Leu His Lys Asn *** His Ser Tyr Tyr Arg 225 230 235 240 Ile His Ile Cys Ile Tyr Arg Ile Glu *** Ile Phe Cys Cys His Lys 245 250 255 Tyr Ile Cys Leu Phe *** Trp Gly Val *** Tyr Arg Cys Ala *** Phe 260 265 270 Phe Cys Asn Leu Gln Gln Cys Tyr Phe Leu Val Val Leu Arg Ser Val 275 280 285 Leu Leu *** Leu Leu Asn Leu Tyr Asn Gln *** Ile Trp Asp Arg Arg 290 295 300 Phe Cys Thr Ile Cys Cys Arg His Ser Thr Gln Leu Leu Leu Val Gln 305 310 315 320 Leu His His Phe Leu Ala Ala Pro Asp *** His Asn Phe Pro Lys Cys 325 330 335 Cys Thr Asn Arg *** Thr Lys Thr Val His Leu Pro Phe Leu Tyr Tyr 340 345 350 Cys Leu Arg Ala Val Val Cys Cys *** Lys *** Gln Pro Leu *** *** 355 360 365 Asp Ala Gln Thr Asn Ile Thr Asn Trp Lys Cys Leu Ser Ile Tyr Ser 370 375 380 Cys *** Ser Asp Leu Ser Thr Glu Arg Pro Cys Ser *** Ser Arg Phe 385 390 395 400 Tyr Asn Ser Gln Ile Lys Ile Ile Leu Ser Ile Lys Ile Lys Arg *** 405 410 415 Asp Tyr *** Ser Asn Asn Val Pro Cys Val Thr *** Ala Arg *** Arg 420 425 430 Ser Gly Ile *** Asp Ala Ser Thr Leu Leu Val Asn Gln Ser His Gln 435 440 445 Gly Phe Asn Lys Glu His Thr Ser Lys Met Val Ser Ala Ile Val Leu 450 455 460 Tyr Val Leu Leu Ala Ala Ala Ala His Ser Ala Phe Ala Ala Met Val 465 470 475 480 His His His His His His Ser Ala Gly Leu Val Pro Arg Gly Ser Gly 485 490 495 Lys Glu Thr Ala Ala Ala Lys Phe Glu Arg Gln His Met Asp Ser Ala 500 505 510 Ser Tyr Asp Asp Gly Ile Cys Lys Ser Ser Asp Cys Ile Lys Ser Ala 515 520 525 Ala Arg Leu Ile Gln Asn Met Asp Ala Thr Thr Glu Pro Cys Thr Asp 530 535 540 Phe Phe Lys Tyr Ala Cys Gly Gly Trp Leu Lys Arg Asn Val Ile Pro 545 550 555 560 Glu Thr Ser Ser Arg Tyr Gly Asn Phe Asp Ile Leu Arg Asp Glu Leu 565 570 575 Glu Val Val Leu Lys Asp Val Leu Gln Glu Pro Lys Thr Glu Asp Ile 580 585 590 Val Ala Val Gln Lys Ala Lys Ala Leu Tyr Arg Ser Cys Ile Asn Glu 595 600 605 Ser Ala Ile Asp Ser Arg Gly Gly Glu Pro Leu Leu Lys Leu Leu Pro 610 615 620 Asp Ile Tyr Gly Trp Pro Val Ala Thr Glu Asn Trp Glu Gln Lys Tyr 625 630 635 640 Gly Ala Ser Trp Thr Ala Glu Lys Ala Ile Ala Gln Leu Asn Ser Lys 645 650 655 Tyr Gly Lys Lys Val Leu Ile Asn Leu Phe Val Gly Thr Asp Asp Lys 660 665 670 Asn Ser Val Asn His Val Ile His Ile Asp Gln Pro Arg Leu Gly Leu 675 680 685 Pro Ser Arg Asp Tyr Tyr Glu Cys Thr Gly Ile Tyr Lys Glu Ala Cys 690 695 700 Thr Ala Tyr Val Asp Phe Met Ile Ser Val Ala Arg Leu Ile Arg Gln 705 710 715 720 Glu Glu Arg Leu Pro Ile Asp Glu Asn Gln Leu Ala Leu Glu Met Asn 725 730 735 Lys Val Met Glu Leu Glu Lys Glu Ile Ala Asn Ala Thr Ala Lys Pro 740 745 750 Glu Asp Arg Asn Asp Pro Met Leu Leu Tyr Asn Lys Met Thr Leu Ala 755 760 765 Gln Ile Gln Asn Asn Phe Ser Leu Glu Ile Asn Gly Lys Pro Phe Ser 770 775 780 Trp Leu Asn Phe Thr Asn Glu Ile Met Ser Thr Val Asn Ile Ser Ile 785 790 795 800 Thr Asn Glu Glu Asp Val Val Val Tyr Ala Pro Glu Tyr Leu Thr Lys 805 810 815 Leu Lys Pro Ile Leu Thr Lys Tyr Ser Ala Arg Asp Leu Gln Asn Leu 820 825 830 Met Ser Trp Arg Phe Ile Met Asp Leu Val Ser Ser Leu Ser Arg Thr 835 840 845 Tyr Lys Glu Ser Arg Asn Ala Phe Arg Lys Ala Leu Tyr Gly Thr Thr 850 855 860 Ser Glu Thr Ala Thr Trp Arg Arg Cys Ala Asn Tyr Val Asn Gly Asn 865 870 875 880 Met Glu Asn Ala Val Gly Arg Leu Tyr Val Glu Ala Ala Phe Ala Gly 885 890 895 Glu Ser Lys His Val Val Glu Asp Leu Ile Ala Gln Ile Arg Glu Val 900 905 910 Phe Ile Gln Thr Leu Asp Asp Leu Thr Trp Met Asp Ala Glu Thr Lys 915 920 925 Lys Arg Ala Glu Glu Lys Ala Leu Ala Ile Lys Glu Arg Ile Gly Tyr 930 935 940 Pro Asp Asp Ile Val Ser Asn Asp Asn Lys Leu Asn Asn Glu Tyr Leu 945 950 955 960 Glu Leu Asn Tyr Lys Glu Asp Glu Tyr Phe Glu Asn Ile Ile Gln Asn 965 970 975 Leu Lys Phe Ser Gln Ser Lys Gln Leu Lys Lys Leu Arg Glu Lys Val 980 985 990 Asp Lys Asp Glu Trp Ile Ser Gly Ala Ala Val Val Asn Ala Phe Tyr 995 1000 1005 Ser Ser Gly Arg Asn Gln Ile Val Phe Pro Ala Gly Ile Leu Gln Pro 1010 1015 1020 Pro Phe Phe Ser Ala Gln Gln Ser Asn Ser Leu Asn Tyr Gly Gly Ile 1025 1030 1035 1040 Gly Met Val Ile Gly His Glu Ile Thr His Gly Phe Asp Asp Asn Gly 1045 1050 1055 Arg Asn Phe Asn Lys Asp Gly Asp Leu Val Asp Trp Trp Thr Gln Gln 1060 1065 1070 Ser Ala Ser Asn Phe Lys Glu Gln Ser Gln Cys Met Val Tyr Gln Tyr 1075 1080 1085 Gly Asn Phe Ser Trp Asp Leu Ala Gly Gly Gln His Leu Asn Gly Ile 1090 1095 1100 Asn Thr Leu Gly Glu Asn Ile Ala Asp Asn Gly Gly Leu Gly Gln Ala 1105 1110 1115 1120 Tyr Arg Ala Tyr Gln Asn Tyr Ile Lys Lys Asn Gly Glu Glu Lys Leu 1125 1130 1135 Leu Pro Gly Leu Asp Leu Asn His Lys Gln Leu Phe Phe Leu Asn Phe 1140 1145 1150 Ala Gln Val Trp Cys Gly Thr Tyr Arg Pro Glu Tyr Ala Val Asn Ser 1155 1160 1165 Ile Lys Thr Asp Val His Ser Pro Gly Asn Phe Arg Ile Ile Gly Thr 1170 1175 1180 Leu Gln Asn Ser Ala Glu Phe Ser Glu Ala Phe His Cys Arg Lys Asn 1185 1190 1195 1200 Ser Tyr Met Asn Pro Glu Lys Lys Cys Arg Val Trp *** Lys Leu Ala 1205 1210 1215 Ala Ala Leu Glu His His His His His His *** Pro Arg *** Leu Ser 1220 1225 1230 Ala Cys Lys Leu Ile Arg Val Ile Ser Thr Phe Ile Lys Arg *** Ile 1235 1240 1245 Leu Cys Val Val Asp Leu Gln Thr Ile Val Val Arg Ile Leu Ile Ile 1250 1255 1260 His *** Ile Tyr Asn Leu *** Gly Gly Met Leu Glu Arg Lys Ser Asn 1265 1270 1275 1280 Asp Phe Gln Arg Leu Tyr Ile *** Ile *** Ile Leu Asn Pro Gln *** 1285 1290 1295 Ile Cys Lys Ile Gly Phe Asp *** Phe Gln Thr Arg Val Val Phe Pro 1300 1305 1310 Asn Arg Trp Leu Asp Tyr Leu Met Asp Phe Arg Ser Thr Pro Gln Asn 1315 1320 1325 Leu Pro Asn Leu Val Ala Ala Ile *** Leu Cys Arg Tyr Ser Phe Val 1330 1335 1340 Phe Cys Phe Val Ile Lys Val Arg Arg Arg Ser Lys Tyr Tyr Ala Leu 1345 1350 1355 1360 Leu Tyr Phe Phe His His Cys Arg *** Cys Thr Ile Asp Ser Thr *** 1365 1370 1375 Thr Arg *** Ile Glu Leu Gly His Ile *** His Arg Ala Cys *** Leu 1380 1385 1390 Tyr *** Ala Asp Tyr Arg Arg Arg Pro Asn Pro Arg Arg *** Lys Leu 1395 1400 1405 Leu Pro Lys Thr Ile Leu Pro *** Pro His Asp Ala Tyr *** Leu Cys 1410 1415 1420 Arg Leu Thr Arg Pro Arg Ser Asn Leu *** Leu Ser Phe Leu Glu Leu 1425 1430 1435 1440 Phe Leu Ile Ala Gly Val Phe Gly Arg Val Ser Ile *** Leu Cys Pro 1445 1450 1455 Ile Leu Ile Gln Thr Thr Arg *** Lys Ala Met Val Gln Ala Val Val 1460 1465 1470 Thr Phe Gln Thr Ala Asn Leu Leu Met Ala Ala Val Val Glu Leu Met 1475 1480 1485 Ile Asn Leu Pro Ser Val Glu Ala Gln Ala Gly Leu Ala Ala Glu Ala 1490 1495 1500 Glu Ala Glu Val Val Ala Val Met Gln Thr Ala Val *** Ala Gln Met 1505 1510 1515 1520 Ser Leu *** Ala Thr Gln Ser Ala Pro Gln Leu Leu Tyr Trp Phe Arg 1525 1530 1535 Ala Pro Phe Leu Val *** Pro Val *** Asp Glu Cys Asp Phe Phe Arg 1540 1545 1550 Phe *** *** Leu Pro Thr Ile Val Val Cys Arg Leu Lys Val Gln Arg 1555 1560 1565 Val Glu Val Pro Ser Ala Leu Val Glu Arg Ala Ala Ile Gln Thr Ser 1570 1575 1580 Met Val Val Val Val Val Glu Ala Leu Glu Cys *** Ala Arg Glu Lys 1585 1590 1595 1600 Val Val Ala Ala Val Pro Pro Val *** Phe Val Leu Val *** Phe Val 1605 1610 1615 Arg Ala Arg Leu Trp Ala Pro Ala Gln Ala Pro Leu Ala Ala Gln Arg 1620 1625 1630 Lys Val Val Cys Phe Glu Ala Ala Leu Gly Val Val Ala Ile Gln Tyr 1635 1640 1645 Tyr Asn Trp Asn Thr Asn Arg Lys Asn Leu Leu *** Ala Leu *** Phe 1650 1655 1660 Arg Tyr Arg Leu Pro Cys Arg Tyr Leu Thr Thr Ala Gln Cys Lys Gln 1665 1670 1675 1680 Leu Tyr Cys Lys Glu Ile Val Ser Ser Ser Asp Arg Ser Arg Thr Pro 1685 1690 1695 Ile Thr Ser Leu Phe Ile Phe Thr Thr Ala Leu *** Trp Arg Asp Thr 1700 1705 1710 Ser Leu Ser Ser Arg Phe Lys Arg Phe Leu Ala His *** Leu Ala Ala 1715 1720 1725 Leu Gly Arg Ser Ala Ala Ala Ser Gly Ile Ser Ser Leu Lys Gly Gly 1730 1735 1740 Asn Thr Val Ile His Arg Ile Arg Gly *** Arg Arg Lys Glu His Val 1745 1750 1755 1760 Ser Lys Arg Pro Ala Lys Gly Gln Glu Pro *** Lys Gly Arg Val Ala 1765 1770 1775 Gly Val Phe Pro *** Ala Pro Pro Pro *** Arg Ala Ser Gln Lys Ser 1780 1785 1790 Thr Leu Lys Ser Glu Val Ala Lys Pro Asp Arg Thr Ile Lys Ile Pro 1795 1800 1805 Gly Val Ser Pro Trp Lys Leu Pro Arg Ala Leu Ser Cys Ser Asp Pro 1810 1815 1820 Ala Ala Tyr Arg Ile Pro Val Arg Leu Ser Pro Phe Gly Lys Arg Gly 1825 1830 1835 1840 Ala Phe Ser *** Leu Thr Leu *** Val Ser Gln Phe Gly Val Gly Arg 1845 1850 1855 Ser Leu Gln Ala Gly Leu Cys Ala Arg Thr Pro Arg Ser Ala Arg Pro 1860 1865 1870 Leu Arg Leu Ile Arg *** Leu Ser Ser *** Val Gln Pro Gly Lys Thr 1875 1880 1885 Arg Leu Ile Ala Thr Gly Ser Ser His Trp *** Gln Asp *** Gln Ser 1890 1895 1900 Glu Val Cys Arg Arg Cys Tyr Arg Val Leu Glu Val Val Ala *** Leu 1905 1910 1915 1920 Arg Leu His *** Lys Asp Ser Ile Trp Tyr Leu Arg Ser Ala Glu Ala 1925 1930 1935 Ser Tyr Leu Arg Lys Lys Ser Trp *** Leu Leu Ile Arg Gln Thr Asn 1940 1945 1950 His Arg Trp *** Arg Trp Phe Phe Cys Leu Gln Ala Ala Asp Tyr Ala 1955 1960 1965 Gln Lys Lys Arg Ile Ser Arg Arg Ser Phe Asp Leu Phe Tyr Gly Val 1970 1975 1980 *** Arg Ser Val Glu Arg Lys Leu Thr Leu Arg Asp Phe Gly His Glu 1985 1990 1995 2000 Ile Ile Lys Lys Asp Leu His Leu Asp Pro Phe Lys Leu Lys Met Lys 2005 2010 2015 Phe *** Ile Asn Leu Lys Tyr Ile *** Val Asn Leu Val *** Gln Leu 2020 2025 2030 Pro Met Leu Asn Gln *** Gly Thr Tyr Leu Ser Asp Leu Ser Ile Ser 2035 2040 2045 Phe Ile His Ser Cys Leu Thr Pro Arg Arg Val Asp Asn Tyr Asp Thr 2050 2055 2060 Gly Gly Leu Thr Ile Trp Pro Gln Cys Cys Asn Asp Thr Ala Arg Pro 2065 2070 2075 2080 Thr Leu Thr Gly Ser Arg Phe Ile Ser Asn Lys Pro Ala Ser Arg Lys 2085 2090 2095 Gly Arg Ala Gln Lys Trp Ser Cys Asn Phe Ile Arg Leu His Pro Val 2100 2105 2110 Tyr *** Leu Leu Pro Gly Ser *** Ser Lys *** Phe Ala Ser *** *** 2115 2120 2125 Phe Ala Gln Arg Cys Cys His Cys Tyr Arg His Arg Gly Val Thr Leu 2130 2135 2140 Val Val Trp Tyr Gly Phe Ile Gln Leu Arg Phe Pro Thr Ile Lys Ala 2145 2150 2155 2160 Ser Tyr Met Ile Pro His Val Val Gln Lys Ser Gly *** Leu Leu Arg 2165 2170 2175 Ser Ser Asp Arg Cys Gln Lys *** Val Gly Arg Ser Val Ile Thr His 2180 2185 2190 Gly Tyr Gly Ser Thr Ala *** Phe Ser Tyr Cys His Ala Ile Arg Lys 2195 2200 2205 Met Leu Phe Cys Asp Trp *** Val Leu Asn Gln Val Ile Leu Arg Ile 2210 2215 2220 Val Tyr Ala Ala Thr Glu Leu Leu Leu Pro Gly Val Asn Thr Gly *** 2225 2230 2235 2240 Tyr Arg Ala Thr *** Gln Asn Phe Lys Ser Ala His His Trp Lys Thr 2245 2250 2255 Phe Phe Gly Ala Lys Thr Leu Lys Asp Leu Thr Ala Val Glu Ile Gln 2260 2265 2270 Phe Asp Val Thr His Ser Cys Thr Gln Leu Ile Phe Ser Ile Phe Tyr 2275 2280 2285 Phe His Gln Arg Phe Trp Val Ser Lys Asn Arg Lys Ala Lys Cys Arg 2290 2295 2300 Lys Lys Gly Asn Lys Gly Asp Thr Glu Met Leu Asn Thr His Thr Leu 2305 2310 2315 2320 Pro Phe Ser Ile Leu Leu Lys His Leu Ser Gly Leu Leu Ser His Glu 2325 2330 2335 Arg Ile His Ile *** Met Tyr Leu Glu Lys *** Thr Asn Arg Gly Ser 2340 2345 2350 Ala His Ile Ser Pro Lys Ser Ala Thr *** Arg Ala Leu *** Arg Arg 2355 2360 2365 Ile Lys Arg Gly Gly Cys Gly Gly Tyr Ala Gln Arg Asp Arg Tyr Thr 2370 2375 2380 Cys Gln Arg Pro Ser Ala Arg Ser Phe Arg Phe Leu Pro Phe Leu Ser 2385 2390 2395 2400 Arg His Val Arg Arg Leu Ser Pro Ser Ser Ser Lys Ser Gly Ala Pro 2405 2410 2415 Phe Arg Val Pro Ile *** Cys Phe Thr Ala Pro Arg Pro Gln Lys Thr 2420 2425 2430 *** Leu Gly *** Trp Phe Thr *** Trp Ala Ile Ala Leu Ile Asp Gly 2435 2440 2445 Phe Ser Pro Phe Asp Val Gly Val His Val Leu *** *** Trp Thr Leu 2450 2455 2460 Val Pro Asn Trp Asn Asn Thr Gln Pro Tyr Leu Gly Leu Phe Phe *** 2465 2470 2475 2480 Phe Ile Arg Asp Phe Ala Asp Phe Gly Leu Leu Val Lys Lys *** Ala 2485 2490 2495 Asp Leu Thr Lys Ile *** Arg Glu Phe *** Gln Asn Ile Asn Val Tyr 2500 2505 2510 Asn Phe Pro Phe Ala Ile Gln Ala Ala Gln Leu Leu Gly Arg Ala Ile 2515 2520 2525 Gly Ala Gly Leu Phe Ala Ile Thr Pro 2530 2535 <210> 13 <211> 2553 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant neprilysin protein <400> 13 Gly Thr Ala Pro Pro Thr Ile Asn Glu Ile Lys Asn Ser Asn Phe Lys 1 5 10 15 Lys Arg Ser Lys Arg Asn Ile Cys Met Lys Glu Cys Val Glu Gly Lys 20 25 30 Lys Asn Val Val Asp Met Leu Asn Asn Lys Ile Asn Met Pro Pro Cys 35 40 45 Ile Lys Lys Ile Leu Asn Asp Leu Lys Glu Asn Asn Val Pro Arg Gly 50 55 60 Gly Met Tyr Arg Lys Arg Phe Ile Leu Asn Cys Tyr Ile Ala Asn Val 65 70 75 80 Val Ser Cys Ala Lys Cys Glu Asn Arg Cys Leu Ile Lys Ala Leu Thr 85 90 95 His Phe Tyr Asn His Asp Ser Lys Cys Val Gly Glu Val Met His Leu 100 105 110 Leu Ile Lys Ser Gln Asp Val Tyr Lys Pro Pro Asn Cys Gln Lys Met 115 120 125 Lys Thr Val Asp Lys Leu Cys Pro Phe Ala Gly Asn Cys Lys Gly Leu 130 135 140 Asn Pro Ile Cys Asn Tyr *** Ile Ile Lys Gln Leu *** Met Leu Asn 145 150 155 160 Leu Phe Phe Ile Asn Asp Thr Asn Gln Thr Gln Gln Glu His Leu *** 165 170 175 Tyr Tyr Leu *** Leu Lys Thr Arg Ser Tyr Asn Arg *** Gly Asn Ile 180 185 190 *** Asn His Phe Gln Met Ile His Ser *** Phe Ala Thr Ile *** Phe 195 200 205 Tyr Phe His Ile Asn *** Thr Pro Cys Arg Leu Leu Leu Arg Ile Pro 210 215 220 Ser Leu Phe His Phe Ser Leu His Lys Asn *** His Ser Tyr Tyr Arg 225 230 235 240 Ile His Ile Cys Ile Tyr Arg Ile Glu *** Ile Phe Cys Cys His Lys 245 250 255 Tyr Ile Cys Leu Phe *** Trp Gly Val *** Tyr Arg Cys Ala *** Phe 260 265 270 Phe Cys Asn Leu Gln Gln Cys Tyr Phe Leu Val Val Leu Arg Ser Val 275 280 285 Leu Leu *** Leu Leu Asn Leu Tyr Asn Gln *** Ile Trp Asp Arg Arg 290 295 300 Phe Cys Thr Ile Cys Cys Arg His Ser Thr Gln Leu Leu Leu Val Gln 305 310 315 320 Leu His His Phe Leu Ala Ala Pro Asp *** His Asn Phe Pro Lys Cys 325 330 335 Cys Thr Asn Arg *** Thr Lys Thr Val His Leu Pro Phe Leu Tyr Tyr 340 345 350 Cys Leu Arg Ala Val Val Cys Cys *** Lys *** Gln Pro Leu *** *** 355 360 365 Asp Ala Gln Thr Asn Ile Thr Asn Trp Lys Cys Leu Ser Ile Tyr Ser 370 375 380 Cys *** Ser Asp Leu Ser Thr Glu Arg Pro Cys Ser *** Ser Arg Phe 385 390 395 400 Tyr Asn Ser Gln Ile Lys Ile Ile Leu Ser Ile Lys Ile Lys Arg *** 405 410 415 Asp Tyr *** Ser Asn Asn Val Pro Cys Val Thr *** Ala Arg *** Arg 420 425 430 Ser Gly Ile *** Asp Ala Ser Thr Leu Leu Val Asn Gln Ser His Gln 435 440 445 Gly Phe Asn Lys Glu His Thr Ser Lys Met Val Ser Ala Ile Val Leu 450 455 460 Tyr Val Leu Leu Ala Ala Ala Ala His Ser Ala Phe Ala Ala Met Val 465 470 475 480 His His His His His His Ser Ala Gly Leu Val Pro Arg Gly Ser Gly 485 490 495 Lys Glu Thr Ala Ala Ala Lys Phe Glu Arg Gln His Met Asp Ser Ala 500 505 510 Ser Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln Ile Gly 515 520 525 Ser Tyr Asp Asp Gly Ile Cys Lys Ser Ser Asp Cys Ile Lys Ser Ala 530 535 540 Ala Arg Leu Ile Gln Asn Met Asp Ala Thr Thr Glu Pro Cys Thr Asp 545 550 555 560 Phe Phe Lys Tyr Ala Cys Gly Gly Trp Leu Lys Arg Asn Val Ile Pro 565 570 575 Glu Thr Ser Ser Arg Tyr Gly Asn Phe Asp Ile Leu Arg Asp Glu Leu 580 585 590 Glu Val Val Leu Lys Asp Val Leu Gln Glu Pro Lys Thr Glu Asp Ile 595 600 605 Val Ala Val Gln Lys Ala Lys Ala Leu Tyr Arg Ser Cys Ile Asn Glu 610 615 620 Ser Ala Ile Asp Ser Arg Gly Gly Glu Pro Leu Leu Lys Leu Leu Pro 625 630 635 640 Asp Ile Tyr Gly Trp Pro Val Ala Thr Glu Asn Trp Glu Gln Lys Tyr 645 650 655 Gly Ala Ser Trp Thr Ala Glu Lys Ala Ile Ala Gln Leu Asn Ser Lys 660 665 670 Tyr Gly Lys Lys Val Leu Ile Asn Leu Phe Val Gly Thr Asp Asp Lys 675 680 685 Asn Ser Val Asn His Val Ile His Ile Asp Gln Pro Arg Leu Gly Leu 690 695 700 Pro Ser Arg Asp Tyr Tyr Glu Cys Thr Gly Ile Tyr Lys Glu Ala Cys 705 710 715 720 Thr Ala Tyr Val Asp Phe Met Ile Ser Val Ala Arg Leu Ile Arg Gln 725 730 735 Glu Glu Arg Leu Pro Ile Asp Glu Asn Gln Leu Ala Leu Glu Met Asn 740 745 750 Lys Val Met Glu Leu Glu Lys Glu Ile Ala Asn Ala Thr Ala Lys Pro 755 760 765 Glu Asp Arg Asn Asp Pro Met Leu Leu Tyr Asn Lys Met Thr Leu Ala 770 775 780 Gln Ile Gln Asn Asn Phe Ser Leu Glu Ile Asn Gly Lys Pro Phe Ser 785 790 795 800 Trp Leu Asn Phe Thr Asn Glu Ile Met Ser Thr Val Asn Ile Ser Ile 805 810 815 Thr Asn Glu Glu Asp Val Val Val Tyr Ala Pro Glu Tyr Leu Thr Lys 820 825 830 Leu Lys Pro Ile Leu Thr Lys Tyr Ser Ala Arg Asp Leu Gln Asn Leu 835 840 845 Met Ser Trp Arg Phe Ile Met Asp Leu Val Ser Ser Leu Ser Arg Thr 850 855 860 Tyr Lys Glu Ser Arg Asn Ala Phe Arg Lys Ala Leu Tyr Gly Thr Thr 865 870 875 880 Ser Glu Thr Ala Thr Trp Arg Arg Cys Ala Asn Tyr Val Asn Gly Asn 885 890 895 Met Glu Asn Ala Val Gly Arg Leu Tyr Val Glu Ala Ala Phe Ala Gly 900 905 910 Glu Ser Lys His Val Val Glu Asp Leu Ile Ala Gln Ile Arg Glu Val 915 920 925 Phe Ile Gln Thr Leu Asp Asp Leu Thr Trp Met Asp Ala Glu Thr Lys 930 935 940 Lys Arg Ala Glu Glu Lys Ala Leu Ala Ile Lys Glu Arg Ile Gly Tyr 945 950 955 960 Pro Asp Asp Ile Val Ser Asn Asp Asn Lys Leu Asn Asn Glu Tyr Leu 965 970 975 Glu Leu Asn Tyr Lys Glu Asp Glu Tyr Phe Glu Asn Ile Ile Gln Asn 980 985 990 Leu Lys Phe Ser Gln Ser Lys Gln Leu Lys Lys Leu Arg Glu Lys Val 995 1000 1005 Asp Lys Asp Glu Trp Ile Ser Gly Ala Ala Val Val Asn Ala Phe Tyr 1010 1015 1020 Ser Ser Gly Arg Asn Gln Ile Val Phe Pro Ala Gly Ile Leu Gln Pro 1025 1030 1035 1040 Pro Phe Phe Ser Ala Gln Gln Ser Asn Ser Leu Asn Tyr Gly Gly Ile 1045 1050 1055 Gly Met Val Ile Gly His Glu Ile Thr His Gly Phe Asp Asp Asn Gly 1060 1065 1070 Arg Asn Phe Asn Lys Asp Gly Asp Leu Val Asp Trp Trp Thr Gln Gln 1075 1080 1085 Ser Ala Ser Asn Phe Lys Glu Gln Ser Gln Cys Met Val Tyr Gln Tyr 1090 1095 1100 Gly Asn Phe Ser Trp Asp Leu Ala Gly Gly Gln His Leu Asn Gly Ile 1105 1110 1115 1120 Asn Thr Leu Gly Glu Asn Ile Ala Asp Asn Gly Gly Leu Gly Gln Ala 1125 1130 1135 Tyr Arg Ala Tyr Gln Asn Tyr Ile Lys Lys Asn Gly Glu Glu Lys Leu 1140 1145 1150 Leu Pro Gly Leu Asp Leu Asn His Lys Gln Leu Phe Phe Leu Asn Phe 1155 1160 1165 Ala Gln Val Trp Cys Gly Thr Tyr Arg Pro Glu Tyr Ala Val Asn Ser 1170 1175 1180 Ile Lys Thr Asp Val His Ser Pro Gly Asn Phe Arg Ile Ile Gly Thr 1185 1190 1195 1200 Leu Gln Asn Ser Ala Glu Phe Ser Glu Ala Phe His Cys Arg Lys Asn 1205 1210 1215 Ser Tyr Met Asn Pro Glu Lys Lys Cys Arg Val Trp *** Lys Leu Ala 1220 1225 1230 Ala Ala Leu Glu His His His His His His *** Pro Arg *** Leu Ser 1235 1240 1245 Ala Cys Lys Leu Ile Arg Val Ile Ser Thr Phe Ile Lys Arg *** Ile 1250 1255 1260 Leu Cys Val Val Asp Leu Gln Thr Ile Val Val Arg Ile Leu Ile Ile 1265 1270 1275 1280 His *** Ile Tyr Asn Leu *** Gly Gly Met Leu Glu Arg Lys Ser Asn 1285 1290 1295 Asp Phe Gln Arg Leu Tyr Ile *** Ile *** Ile Leu Asn Pro Gln *** 1300 1305 1310 Ile Cys Lys Ile Gly Phe Asp *** Phe Gln Thr Arg Val Val Phe Pro 1315 1320 1325 Asn Arg Trp Leu Asp Tyr Leu Met Asp Phe Arg Ser Thr Pro Gln Asn 1330 1335 1340 Leu Pro Asn Leu Val Ala Ala Ile *** Leu Cys Arg Tyr Ser Phe Val 1345 1350 1355 1360 Phe Cys Phe Val Ile Lys Val Arg Arg Arg Ser Lys Tyr Tyr Ala Leu 1365 1370 1375 Leu Tyr Phe Phe His His Cys Arg *** Cys Thr Ile Asp Ser Thr *** 1380 1385 1390 Thr Arg *** Ile Glu Leu Gly His Ile *** His Arg Ala Cys *** Leu 1395 1400 1405 Tyr *** Ala Asp Tyr Arg Arg Arg Pro Asn Pro Arg Arg *** Lys Leu 1410 1415 1420 Leu Pro Lys Thr Ile Leu Pro *** Pro His Asp Ala Tyr *** Leu Cys 1425 1430 1435 1440 Arg Leu Thr Arg Pro Arg Ser Asn Leu *** Leu Ser Phe Leu Glu Leu 1445 1450 1455 Phe Leu Ile Ala Gly Val Phe Gly Arg Val Ser Ile *** Leu Cys Pro 1460 1465 1470 Ile Leu Ile Gln Thr Thr Arg *** Lys Ala Met Val Gln Ala Val Val 1475 1480 1485 Thr Phe Gln Thr Ala Asn Leu Leu Met Ala Ala Val Val Glu Leu Met 1490 1495 1500 Ile Asn Leu Pro Ser Val Glu Ala Gln Ala Gly Leu Ala Ala Glu Ala 1505 1510 1515 1520 Glu Ala Glu Val Val Ala Val Met Gln Thr Ala Val *** Ala Gln Met 1525 1530 1535 Ser Leu *** Ala Thr Gln Ser Ala Pro Gln Leu Leu Tyr Trp Phe Arg 1540 1545 1550 Ala Pro Phe Leu Val *** Pro Val *** Asp Glu Cys Asp Phe Phe Arg 1555 1560 1565 Phe *** *** Leu Pro Thr Ile Val Val Cys Arg Leu Lys Val Gln Arg 1570 1575 1580 Val Glu Val Pro Ser Ala Leu Val Glu Arg Ala Ala Ile Gln Thr Ser 1585 1590 1595 1600 Met Val Val Val Val Val Glu Ala Leu Glu Cys *** Ala Arg Glu Lys 1605 1610 1615 Val Val Ala Ala Val Pro Pro Val *** Phe Val Leu Val *** Phe Val 1620 1625 1630 Arg Ala Arg Leu Trp Ala Pro Ala Gln Ala Pro Leu Ala Ala Gln Arg 1635 1640 1645 Lys Val Val Cys Phe Glu Ala Ala Leu Gly Val Val Ala Ile Gln Tyr 1650 1655 1660 Tyr Asn Trp Asn Thr Asn Arg Lys Asn Leu Leu *** Ala Leu *** Phe 1665 1670 1675 1680 Arg Tyr Arg Leu Pro Cys Arg Tyr Leu Thr Thr Ala Gln Cys Lys Gln 1685 1690 1695 Leu Tyr Cys Lys Glu Ile Val Ser Ser Ser Asp Arg Ser Arg Thr Pro 1700 1705 1710 Ile Thr Ser Leu Phe Ile Phe Thr Thr Ala Leu *** Trp Arg Asp Thr 1715 1720 1725 Ser Leu Ser Ser Arg Phe Lys Arg Phe Leu Ala His *** Leu Ala Ala 1730 1735 1740 Leu Gly Arg Ser Ala Ala Ala Ser Gly Ile Ser Ser Leu Lys Gly Gly 1745 1750 1755 1760 Asn Thr Val Ile His Arg Ile Arg Gly *** Arg Arg Lys Glu His Val 1765 1770 1775 Ser Lys Arg Pro Ala Lys Gly Gln Glu Pro *** Lys Gly Arg Val Ala 1780 1785 1790 Gly Val Phe Pro *** Ala Pro Pro Pro *** Arg Ala Ser Gln Lys Ser 1795 1800 1805 Thr Leu Lys Ser Glu Val Ala Lys Pro Asp Arg Thr Ile Lys Ile Pro 1810 1815 1820 Gly Val Ser Pro Trp Lys Leu Pro Arg Ala Leu Ser Cys Ser Asp Pro 1825 1830 1835 1840 Ala Ala Tyr Arg Ile Pro Val Arg Leu Ser Pro Phe Gly Lys Arg Gly 1845 1850 1855 Ala Phe Ser *** Leu Thr Leu *** Val Ser Gln Phe Gly Val Gly Arg 1860 1865 1870 Ser Leu Gln Ala Gly Leu Cys Ala Arg Thr Pro Arg Ser Ala Arg Pro 1875 1880 1885 Leu Arg Leu Ile Arg *** Leu Ser Ser *** Val Gln Pro Gly Lys Thr 1890 1895 1900 Arg Leu Ile Ala Thr Gly Ser Ser His Trp *** Gln Asp *** Gln Ser 1905 1910 1915 1920 Glu Val Cys Arg Arg Cys Tyr Arg Val Leu Glu Val Val Ala *** Leu 1925 1930 1935 Arg Leu His *** Lys Asp Ser Ile Trp Tyr Leu Arg Ser Ala Glu Ala 1940 1945 1950 Ser Tyr Leu Arg Lys Lys Ser Trp *** Leu Leu Ile Arg Gln Thr Asn 1955 1960 1965 His Arg Trp *** Arg Trp Phe Phe Cys Leu Gln Ala Ala Asp Tyr Ala 1970 1975 1980 Gln Lys Lys Arg Ile Ser Arg Arg Ser Phe Asp Leu Phe Tyr Gly Val 1985 1990 1995 2000 *** Arg Ser Val Glu Arg Lys Leu Thr Leu Arg Asp Phe Gly His Glu 2005 2010 2015 Ile Ile Lys Lys Asp Leu His Leu Asp Pro Phe Lys Leu Lys Met Lys 2020 2025 2030 Phe *** Ile Asn Leu Lys Tyr Ile *** Val Asn Leu Val *** Gln Leu 2035 2040 2045 Pro Met Leu Asn Gln *** Gly Thr Tyr Leu Ser Asp Leu Ser Ile Ser 2050 2055 2060 Phe Ile His Ser Cys Leu Thr Pro Arg Arg Val Asp Asn Tyr Asp Thr 2065 2070 2075 2080 Gly Gly Leu Thr Ile Trp Pro Gln Cys Cys Asn Asp Thr Ala Arg Pro 2085 2090 2095 Thr Leu Thr Gly Ser Arg Phe Ile Ser Asn Lys Pro Ala Ser Arg Lys 2100 2105 2110 Gly Arg Ala Gln Lys Trp Ser Cys Asn Phe Ile Arg Leu His Pro Val 2115 2120 2125 Tyr *** Leu Leu Pro Gly Ser *** Ser Lys *** Phe Ala Ser *** *** 2130 2135 2140 Phe Ala Gln Arg Cys Cys His Cys Tyr Arg His Arg Gly Val Thr Leu 2145 2150 2155 2160 Val Val Trp Tyr Gly Phe Ile Gln Leu Arg Phe Pro Thr Ile Lys Ala 2165 2170 2175 Ser Tyr Met Ile Pro His Val Val Gln Lys Ser Gly *** Leu Leu Arg 2180 2185 2190 Ser Ser Asp Arg Cys Gln Lys *** Val Gly Arg Ser Val Ile Thr His 2195 2200 2205 Gly Tyr Gly Ser Thr Ala *** Phe Ser Tyr Cys His Ala Ile Arg Lys 2210 2215 2220 Met Leu Phe Cys Asp Trp *** Val Leu Asn Gln Val Ile Leu Arg Ile 2225 2230 2235 2240 Val Tyr Ala Ala Thr Glu Leu Leu Leu Pro Gly Val Asn Thr Gly *** 2245 2250 2255 Tyr Arg Ala Thr *** Gln Asn Phe Lys Ser Ala His His Trp Lys Thr 2260 2265 2270 Phe Phe Gly Ala Lys Thr Leu Lys Asp Leu Thr Ala Val Glu Ile Gln 2275 2280 2285 Phe Asp Val Thr His Ser Cys Thr Gln Leu Ile Phe Ser Ile Phe Tyr 2290 2295 2300 Phe His Gln Arg Phe Trp Val Ser Lys Asn Arg Lys Ala Lys Cys Arg 2305 2310 2315 2320 Lys Lys Gly Asn Lys Gly Asp Thr Glu Met Leu Asn Thr His Thr Leu 2325 2330 2335 Pro Phe Ser Ile Leu Leu Lys His Leu Ser Gly Leu Leu Ser His Glu 2340 2345 2350 Arg Ile His Ile *** Met Tyr Leu Glu Lys *** Thr Asn Arg Gly Ser 2355 2360 2365 Ala His Ile Ser Pro Lys Ser Ala Thr *** Arg Ala Leu *** Arg Arg 2370 2375 2380 Ile Lys Arg Gly Gly Cys Gly Gly Tyr Ala Gln Arg Asp Arg Tyr Thr 2385 2390 2395 2400 Cys Gln Arg Pro Ser Ala Arg Ser Phe Arg Phe Leu Pro Phe Leu Ser 2405 2410 2415 Arg His Val Arg Arg Leu Ser Pro Ser Ser Ser Lys Ser Gly Ala Pro 2420 2425 2430 Phe Arg Val Pro Ile *** Cys Phe Thr Ala Pro Arg Pro Gln Lys Thr 2435 2440 2445 *** Leu Gly *** Trp Phe Thr *** Trp Ala Ile Ala Leu Ile Asp Gly 2450 2455 2460 Phe Ser Pro Phe Asp Val Gly Val His Val Leu *** *** Trp Thr Leu 2465 2470 2475 2480 Val Pro Asn Trp Asn Asn Thr Gln Pro Tyr Leu Gly Leu Phe Phe *** 2485 2490 2495 Phe Ile Arg Asp Phe Ala Asp Phe Gly Leu Leu Val Lys Lys *** Ala 2500 2505 2510 Asp Leu Thr Lys Ile *** Arg Glu Phe *** Gln Asn Ile Asn Val Tyr 2515 2520 2525 Asn Phe Pro Phe Ala Ile Gln Ala Ala Gln Leu Leu Gly Arg Ala Ile 2530 2535 2540 Gly Ala Gly Leu Phe Ala Ile Thr Pro 2545 2550

Claims (15)

  1. 네프릴라이신의 막 관통 영역이 제거된 서열을 갖고 베타아밀로이드 분해 활성을 갖는 재조합 단백질; 네프릴라이신의 N 말단으로부터 51번째, 97번째, 195번째, 300번째, 403번째까지, 또는 528번째까지의 아미노산이 제거된 아미노산 서열을 포함하는 재조합 단백질; 또는 서열변호 1 내지 5 중 어느 하나의 서열을 갖거나, 이 서열과 90% 이상 상동성을 가지는 서열을 갖고 베타아밀로이드 분해 활성을 갖는 재조합 단백질.
  2. 청구항 1에 있어서, PTD(protein transfer domain)을 1개 또는 2개 이상 더 포함하는 재조합 단백질.
  3. 청구항 2에 있어서, 상기 PTD는 TAT 서열인 것인 재조합 단백질.
  4. 청구항 2에 있어서, 상기 PTD는 재조합 단백질의 C 말단에 결합되어 있는 것인 재조합 단백질.
  5. 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항의 재조합 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제조하는 단계; 상기 재조합 벡터를 이용하여 상기 유전자를 발현시키는 단계; 및 발현된 재조합 단백질을 분리하는 단계를 포함하는 재조합 단백질의 제조방법.
  6. 청구항 5에 있어서, 상기 벡터는 재조합 단백질이 세포 밖으로 분비되게 하는 신호 서열; 단백질 정제시 식별가능한 단백질을 코딩하는 서열 및 kozak 서열 중 적어도 하나를 더 포함하는 것인 재조합 단백질의 제조방법.
  7. 청구항 5에 있어서, 상기 재조합 벡터는 pBAC-6 벡터 또는 pLEXm 벡터인 것인 재조합 단백질의 제조방법.
  8. 청구항 5에 있어서, 상기 유전자를 발현시키는 단계 전에 상기 재조합 벡터의 증폭시키는 단계를 더 포함하는 것인 재조합 단백질의 제조방법.
  9. 청구항 5에 있어서, 상기 유전자를 발현시키는 단계는 a) 상기 재조합 벡터를 숙주 세포에 삽입하는 단계; b) 상기 숙주 세포를 바이러스에 삽입하여 배양함으로써 재조합 벡터를 증폭하는 단계; 및 c) 상기 증폭된 재조합 벡터로부터 상기 재조합 단백질을 발현하는 단계를 포함하는 것인 재조합 단백질의 제조방법.
  10. 청구항 5에 있어서, 상기 유전자를 발현시키는 단계는 상기 재조합 벡터를 숙주 세포에 트랜스펙션시키는 것을 포함하는 것인 재조합 단백질의 제조방법.
  11. 청구항 10에 있어서, 상기 숙주 세포는 곤충 세포 또는 포유류 세포인 것인 재조합 단백질의 제조방법.
  12. 청구항 1 내지 4 중 어느 하나의 항에 따른 재조합 단백질을 코딩하는 유전자.
  13. 청구항 1 내지 4 중 어느 하나의 항에 따른 재조합 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
  14. 청구항 1 내지 4 중 어느 하나의 항에 따른 재조합 단백질을 포함하는 알츠하이머 질병의 치료 또는 예방용 약학 조성물.
  15. 청구항 1 내지 4 중 어느 하나의 항에 따른 재조합 단백질 또는 이를 포함하는 약학 조성물을 이용하여 포유류의 알츠하이머 질병을 치료 또는 예방하는 방법.
KR20130046366A 2013-04-25 2013-04-25 재조합 단백질, 이를 코딩하는 재조합 유전자, 재조합 벡터, 및 이를 포함하는 약학조성물 KR20140127692A (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR20130046366A KR20140127692A (ko) 2013-04-25 2013-04-25 재조합 단백질, 이를 코딩하는 재조합 유전자, 재조합 벡터, 및 이를 포함하는 약학조성물

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR20130046366A KR20140127692A (ko) 2013-04-25 2013-04-25 재조합 단백질, 이를 코딩하는 재조합 유전자, 재조합 벡터, 및 이를 포함하는 약학조성물

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20140127692A true KR20140127692A (ko) 2014-11-04

Family

ID=52451871

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR20130046366A KR20140127692A (ko) 2013-04-25 2013-04-25 재조합 단백질, 이를 코딩하는 재조합 유전자, 재조합 벡터, 및 이를 포함하는 약학조성물

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR20140127692A (ko)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106795484B (zh) 用于在产生岩藻糖基化低聚糖时使用的α(1，2)岩藻糖基转移酶变种
KR101604515B1 (ko) 면역-기반 보툴리눔 독소 세로타입 ａ 활성 검정
KR101923847B1 (ko) 면역 기반 재표적화된 엔도펩티다제 활성 검정
KR101609894B1 (ko) 면역-기반 보툴리눔 독소 세로타입 ａ 활성 검정
KR20210049133A (ko) 무혈청 배지에서 벡터 제조
CN107660231A (zh) 慢病毒载体的生物生产
KR20190055086A (ko) 재조합 자기-상보적인 아데노-부속 바이러스를 이용한 병태의 치료 방법 및 조성물
CN101688195A (zh) 制备重组人凝血酶’644的方法
CN110944656A (zh) 编码人类fkrp蛋白的新型多核苷酸
KR20200086902A (ko) 신경세포 분화 추적용 벡터 및 이를 이용한 신경세포로의 분화 추적 방법
WO1992017581A1 (en) Mammalian expression vector
KR20140127692A (ko) 재조합 단백질, 이를 코딩하는 재조합 유전자, 재조합 벡터, 및 이를 포함하는 약학조성물
CN113046369B (zh) 一种新型冠状病毒的mRNA疫苗
CN109251897A (zh) 一种猪圆环病毒3型毒株及其制备方法和应用
CN112080439B (zh) 人源细胞凋亡调控蛋白Bcl-2在提高酿酒酵母橙花叔醇产量中的应用
CN109321587A (zh) 一种acat1基因干扰的嵌合抗原受体t细胞
CN108642086A (zh) 一种高灵敏融合细胞筛选方法
US20040077573A1 (en) Method for regulating the activity of an expression product of a gene transferred into living body
KR20210074869A (ko) 다이드제인을 포함하는 신경세포의 수초화를 촉진하기 위한 조성물 및 그의 용도
CN114426986B (zh) 一种在赤霉菌中建立的基于CRISPR技术整合的URA-Blaster方法
US6372500B1 (en) Episomal expression cassettes for gene therapy
AU2017225907A1 (en) Use of phosphorylated tau and p38gamma to treat a neurological condition
CN115429796A (zh) 利鲁唑靶向治疗Wolfram综合征
CN101220374A (zh) 鸡痘病毒双基因表达载体（pg7.5n）
CN111560392B (zh) miRNA表达载体及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
AMND Amendment
AMND Amendment
E601 Decision to refuse application
AMND Amendment