KR20140107195A - Ｓｎａｐ／ｃｌｉｐ 태그의 검출용 단일클론 항체 - Google Patents

Ｓｎａｐ／ｃｌｉｐ 태그의 검출용 단일클론 항체 Download PDF

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KR20140107195A
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슈테판 바르트
카타리나 콜베르그
크리스티아네 푸트만
제페린 쉬미즈
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프라운호퍼-게젤샤프트 추르 푀르데룽 데어 안제반텐 포르슝 에 파우
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Abstract

서열번호 3, 4, 5, 및 8, 9, 10의 아미노산 서열을 갖는 CDR을 포함하는, SNAP 모티프 및 CLIP 태그에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체.

Description

ＳＮＡＰ／ＣＬＩＰ 태그의 검출용 단일클론 항체{Monoclonal antibody for the detection of SNAP/CLIP tag}
본 발명은 SNAP/CLIP 태그(tag)의 검출용 항체, 그러한 항체를 코딩하는 핵산, 및 SNAP/CLIP 태그를 포함하는 단백질의 검출을 위한, 그러한 항체의 용도에 관한 것이다.
SNAP 및 CLIP 태그 기술은 비교적 젊은 기술이다. 표적 단백질, 특히, 융합 단백질에 원하는 리간드를 제공하는 명쾌한 방법이다.
WO 20009/114748 A1은 SNAP-25 조성물, SNAP-25 절단 산물(cleavage product)로부터 BoNT/A 절단 부위의 자를 수 있는 결합(BoNT/A cleavage site scissible bond)으로부터 P1 잔기에 있는 카르복시-말단을 포함하는 에피토프에 결합하는 α-SNAP-25 항체를 제조하는 방법, SNAP-25 절단 산물로부터 BoNT/A 절단 부위의 자를 수 있는 결합으로부터 P1 잔기에 있는 카르복시-말단을 포함하는 에피토프에 결합하는 α-SNAP-25 항체, BoNT/A 활성을 검출하는 방법, 및 중화 α-BoNT/A 항체를 검출하는 방법을 개시한다.
M. Yamamoto, L. Hassinger, J. E. Crandall은 Journal of Neurocytology 19, 619-627 (1990)에서 발생하는 랫트 대뇌 피질 및 소뇌 피질에서 단계-특이적 신경돌기-연관 단백질(stage-specific neurite-associated protein)의 초미세구조 국소화(ultrastructural localization)에 관해 보고한다. SNAP/TAG-1은 135 kDa의 당단백질이고, 발생하는 설치류 CNS에서 성장하는 축삭(axon)의 서브세트의 표면에 발현된다. 이 항원의 초미세구조 국소화를 랫트의 배아 17일차 대뇌 피질 및 출생 후 4일차 및 8일차 소뇌 피질에서 SNAP/TAG-1 (4D7)을 인식하는 단일클론 항체 및 퍼옥시다아제-접합 이차 항체를 이용한 면역전자 현미경관찰(immunoelectron microscopy) 을 이용하여 분석했다. 배아 피질에서, 면역반응성은 축삭의 뉴런 체세포(neuronal somata) 및 중간층(intermediate zone), 하판(subplate) 및 수질판(cortical plate)에 위치한 그들의 주된 돌기(leading process)의 한정된 그룹의 의 원형질막과 연관되었다. 면역반응성 축삭은 10-20개로 이루어진 그룹으로 함께 묶였고(bundle) 비-면역반응성(non-immunoreactive) 액손과 분리되었다. 일부 성장 원추(growth cone)는 면역반응성이었으나; 4D7-면역반응성 축삭의 모든 성장 원추가 염색을 보이지는 않았다. 출생 후 소뇌에서, 면역반응성은 외부 과립 세포 층의 가장 내부 부분에 위치한 과립 세포의 체세포 및 액손과 연관되었다. 대뇌 피질 및 소뇌 피질에서, 면역반응성은 간헐적으로(punctuate fashion) 100-200 nm의 규칙적인 주기성으로 인접 세포 막의 상응하는 위치에 나타났다. SNAP/TAG-1이 발생하는 CNS에서 축삭의 특정한 서브그룹 중에서 접합 분자(adhesion molecule)로 작용한다는 가능성이 검토된다.
Richard J Ward, John D Pediani, 및 Graeme Milligan은 British Journal Pharmacology (2011), 162, 1439-1452에서 N-말단 SNAP 및 CLIP-태깅(tagging)을 통해 평가된 오렉신(orexin) OX1 및 칸나비노이드 CB1 수용체의 리간드-유도 내재화(internalization)에 관해 보고한다. 에피토프 태그의 항체 인식 및 O6-알킬구아닌-DNA-알킬트랜스퍼라아제 변이체로의 형광단(fluorophore)의 공유결합에 의해 각 수용체 구조물(receptor construct)의 세포 표면 형태를 검출했다. 길항제에 대한 반응은 아니나, 효능제에 대한 반응의 수용체 내재화를 각 방식에 의해 모니터링할 수 있었으나, 민감도(sensitivity)는 SNAP 태그에 대한 신규한, 시간-분할(time-resolved) 형광 프로브를 이용할 때, 다른 방식보다 6배 내지 10배까지 더 높았다. 그러나, 가능하게는 더 높은 수준의 비특이적 결합 때문에, CLIP 태그에 대해 민감도는 개선되지 않았다.
SNAP 태그는 인간 DNA 수선 효소 O(6)-알킬구아닌 DNA 알킬트랜스퍼라아제에 기반한다. 후자는 더 작은 분자 크기 및 벤질구아닌에 대한 매우 높은 친화도를 갖는 단백질 변이체가 선택될 수 있는 정도까지 돌연변이를 도입하는 것에 의해 변형되었다. SNAP 태그는 벤질구아닌 유도체와의 높은 특이성 반응을 수행하여, 벤질 라디칼을 그에 공유결합에 의해 결합된 기질과 결합시키고, 구아닌을 절단시킨다. 재조합 단백질 태그로서, 이는 다양한 벤질구아닌-변형 기질의 융합 단백질로의 공유 및 화학양론적으로 정의된 커플링(stoichiometrically defined coupling)을 가능하게 한다. 돌연변이유발(mutagenesis)에 의해 SNAP 태그로부터 CLIP 태그를 개발했고 벤질구아닌이 아닌, 벤질시토신 유도체와의 높은 특이성 반응을 수행한다. 따라서, 하나의 실험 방식에서 SNAP 및 CLIP 태그의 동시 차별화 표지화(simultaneous differentiated labeling)가 가능하다. SNAP 기술 (SNAP/CLIP 플라스미드 및 기질)이 New England Biolabs (NEB)에 의해 유통된다.
"Journal of Biomedicine and Biotechnology", Vol. 2010, Article ID658954, doi:　10.1155/2010/658954에서, Aliprandi 등은 VHH 포맷의 재조합 항-SNAP 항체를 개시한다.
CLIP 및 SNAP 태그가 모두 검출될 수 있는 분석 도구를 갖는 것이 요구된다.
본 발명의 목적은 청구항 1에 따른 항체에 의해 달성된다. 본 발명의 단일클론 항체는 SNAP 태그 모티프 및 CLIP 태그에 특이적으로 결합하고 서열번호 3, 4, 5, 및 8, 9, 10의 아미노산 서열을 갖는 CDR을 포함한다. 구체적으로, 본 발명의 항체는 마우스 항체(murine antibody)이다.
본 발명의 대상은 또한 본 발명의 항체를 코딩하는 핵산, 구체적으로, 서열번호 1 또는 6의 핵산 서열을 갖는 핵산이다.
본 발명의 항체는 면역화가 인간이 아닌 포유동물, 특히, 마우스에서 SNAP 태그 단백질에 의해 수행되고, 하이브리도마 세포가 그로부터 수득되고, SNAP 및 CLIP 태그를 인식하는 항체 세포주(antibody cell line)가 결합 분석법(binding assay)에 의해 확인되는 것인 본 발명의 방법에 의해 수득가능하다.
또한, SNAP 및 CLIP 태그의 검출을 위한 본 발명의 항체의 용도에 관한 것이다. Aliprandi 등은 SNAP 태그를 인식하는 재조합 항체를 기술한다. 본 발명에 따른 항체는 조직 절편을 염색하기 위해 이용될 수 있다. 본 발명에 따른 마우스 항-SNAP 항체가 특히, 동결절편(cryosection) 및 파라핀 절편을 염색하기 위해 이용될 수 있다. Aliprandi 등에 이미 공개된 항체 대비 본 발명에 따른 항체의 장점은 그의 더 높은 수가(valence)이다; 공개된 재조합 단백질은 단 하나의 에피토프를 인식할 수 있으나, 본 발명에 따른 항체는 두 개의 에피토프를 인식할 수 있다.
본 발명에 따른 항체는 SNAP 태그(tag) 및 CLIP 태그를 검출할 수 있다. 본 발명에 따른 항체는 SNAP 융합 단백질이 유동 세포계수법에서 검출될 수 있다는 장점을 갖는다. ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) 및 웨스턴 블롯에서 항체의 민감도(sensitivity)는 Aliprandi 등에 의해 기술된 항체의 민감도와 유사하다.
기술된 방법 외에, 본 발명에 따른 항체는 면역조직화학 실험에서 테스트했다. 상기 항체는 동결절편 및 파라핀 절편 중 SNAP 융합 단백질의 검출을 위해 이용될 수 있다.
특정한 구체예에서, 상기 항체는 단일클론 항체이다. 구체적으로, 상기 항체는 마우스 기원(murine origin)일 수 있다. 마우스 IgG 항체가 분자생물학 연구에서 가장 빈번하게 이용되는 항체 포맷(format)에 속하므로, 마우스 항체가 유리하다. 따라서, 그러한 항체 및 마우스 IgG 항체의 검출을 이용한 연구는 다수의 연구실에서 당업자에게 익숙하다.
본 발명에 따른 항체의 중쇄 가변 영역(heavy chain variable region)은 서열번호 2로 표시되고, 서열번호 1은 이 영역을 코딩하는 핵산에 관한 것이다.
본 발명에 따른 항체의 경쇄 가변 영역(light chain variable region)은 서열번호 7로 표시되고, 서열번호 6은 이 영역을 코딩하는 핵산에 관한 것이다.
본 발명에 따른 항체의 중쇄의 CDR은 서열번호 3 내지 5의 아미노산 서열로 열거된다. 본 발명에 따른 항체의 경쇄의 CDR은 서열번호 8 내지 10의 아미노산 서열로 열거된다.
본 발명은 또한 전술된 단백질을 코딩하는 핵산, 특히, 서열번호 1 및 6에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 항체를 제조하는 방법으로서, 면역화는 인간이 아닌 포유동물, 구체적으로 마우스에서 SNAP 태그 단백질에 의해 수행되는 것인 방법에 관한 것이다. 이로부터, 하이브리도마 세포를 수득하고, SNAP 및 CLIP 태그를 인식하는 항체 세포주는 상응하는 결합 분석법에 의해 확인한다.
본 발명에 따른 항체는 SNAP 및 CLIP 태그 각각, 및 이들의 조합의 검출을 위해 이용될 수 있다.
도 1: 면역조직화학; 마우스로부터 수득된 A431 종양의 동결절편의 HAI SNAP (항-EGFR) 및 M2D11에 의한 염색.
도 2: 유동 세포계수법; 이 도면은 유동 세포계수법에서 두 개의 상이한 SNAP 융합 단백질로의 M2D11의 결합을 보여준다.
도 3: 웨스턴 블롯 분석; 두 도면은 변성 겔에서 두 개의 단백질 SNAP 및 CLIP-EGF로의 M2D11의 결합을 보여준다.
도 4: 웨스턴 블롯 분석; 이 도면은 용액 중 M2D11 및 SNAP 단백질의 결합을 검출하기 위한 원형(native) 폴리아크릴아미드 겔의 블롯을 보여준다.
실시예
폴리아크릴아미드 겔 전기영동 및 웨스턴 블롯
분석 대상 시료를 Laemmli 완충액(또는 SDS 불포함 원형 시료 완충액(native sample buffer))에서 변성시키고 12% (w/v) SDS 폴리아크릴아미드 겔 및 폴리아크릴아미드 겔 (160　V, 60　분)에서 전기영동시켰다. 단백질을 쿠마시(Coomassie) 염색에 의해 가시화시키거나 또는 니트로셀룰로오스 막(Whatman, Schleicher & Schuell, Dassel, Germany) (350　mA, 70　분)으로 이동시켰다. 이동 후, 막을 실온에서 1시간 동안 1% (w/v) BSA에서 블록킹(block)시켰다. PBS-T로 3회 세척한 후, 블롯을 1차 항체(primary antibody)와 인큐베이션시켰다(1시간). 3회의 추가적인 세척 단계 후에, 효소-접합 2차 항체(1 시간) 및 상응하는 기질 (10 분)을 이용하여 특이적 결합을 검출했다. SNAP 또는 CLIP 단백질의 분석에서, 시료를 변성 전에 BG 또는 BC 기질과 인큐베이션시켰다. 결과가 도 3에 도시된다.
도 3: 웨스턴 블롯 분석. 두 개의 도면 3A, 3B 및 3C는 변성 겔(denaturing gel)에서 두 개의 단백질 SNAP 및 CLIP EGF로의 M2D11의 결합을 보여준다. 상기 항체는 다른 His6-태깅(tagged) 단백질 (GFP-Ki4)에 대한 교차-반응성(cross-reactivity)을 보이지 않는다. 또한, 도 3B는 상기 항체가 SNAP로의 결합에 대해 SNAP 기질과 경쟁하지 않는다는 것을 보여준다. SNAP 단백질의 BG 비오틴에 의한 비오티닐화(biotinylation) 후, 상기 단백질은 M2D11에 의해 또한 검출될 수 있다. 또한, 도 3C는 상기 항체의 상이한 SNAP-scFv 융합 단백질 (H22-SNAP, SNAP-2715) 및 CLIP-scFv-SNAP 융합 단백질로의 결합을 보여준다.
도 4: 웨스턴 블롯 분석. 이 도면은 용액 중 M2D11 및 SNAP 단백질의 결합을 검출하기 위한 원형(native) 폴리아크릴아미드 겔의 블롯을 보여준다. 파트 A는 단백질의 Myc 태그를 통해 SNAP 단백질의 존재를 보여준다. 단백질이 용액 중 M2D11에 의해 결합되고, 유리 단백질은 1:4의 과량(an excess of 1:4)에서만 검출될 수 있다는 것이 명확해진다. 이 도면의 파트 B에서, 항체가 추가적으로 검출되어, 두 단백질의 동시-국재화(colocalization)를 확인할 수 있었다.
면역조직화학
A-431 종양을 갖는 BALB/c 마우스 (DSMZ No. ACC 91)로부터 유래된 EGFR-양성 피하 종양으로부터 조직 절편을 준비했다. 동물을 희생시킨 후, 종양을 "Jung tissue freezing medium" (Leica Microsystems, Nussloch, Germany)에 포매(embed)시키고 액체 질소로 동결시켰다. Leica 3050S Kryostat을 이용하여 8　㎛의 동결절편(cryosection)을 제조하고, 밤새 건조시켰다. 상기 절편을 10분 동안 아세톤에 고정시키고, 건조시키고 Immunopen (Sigma Aldrich)으로 아웃라이닝(outline)했다. 종양 세포를 일차 항체로 EGFR-특이적 scFv 융합 단백질 425scFv SNAP (0.034　mg/ml)로 염색시켰다. PBST에서 3회 세척 후, SNAP 융합 단백질을 퍼옥시다아제-표지 항체 M2D11 (스톡 용액: 657　ng/㎕)의 상이한 농도로 검출했다. 두 항체 인큐베이션 단계 모두를 실온에서 45분 동안 수행하고, 실온에서 5분 동안 진탕하면서 세척 단계를 수행했다. PBST에서의 2회 세척 및 TBST에서의 1회 세척 후, 염색이 가시화될 때까지, 조직 절편을 3-아미노-9-에틸카르바졸(AEC) 용액에서 인큐베이션시켰다. 뒤이어, 헤마톡실린으로 대조염색(counterstaining)을 수행하고, 그 후 절편을 글리세롤 겔에 적재(mount)했다. 결과가 도 1에 도시된다.
도 1: 면역조직화합(Immunohistochemistry). 마우스로부터 수득된 A431 종양의 동결절편(cryosection)의 425(scFv)-SNAP (항-EGFR) 및 M2D11에 의한 염색.
유동 세포계수법(Flow cytometry)
M2D11의 관능성(functionality)을 FACSCalibur (Becton & Dickinson) 및 CellQuest 소프트웨어를 이용한 유동 세포계수법에 의해 분석했다. 세포에 결합된 SNAP 융합 단백질의 특이적 결합을 검출하고, 상이한 세포주의 세포 표면으로의 비-특이적 결합을 검출했다. 약 4*105　개의 세포를 먼저 100　㎕의 PBS에서 1-2　㎍의 SNAP/CLIP 융합 단백질과 함께 인큐베이션시키고, 그 후, 100　㎕의 PBS에서 3.3　ng의 M2D11과 얼음 상에서 30분 동안 인큐베이션시켰다. 검출을 위해, 세포를 얼음 상에서 GaM-PE (1:100, Dianova, Hamburg, Germany)와 30분 동안 인큐베이션시켰다. 그 후, 세포를 유동 세포계수법으로 분석했다. 모든 단계 사이에 표준 세포 세척 원심분리기에서 PBS 세척 단계를 수행했다. 측정을 위해 세포를 300　㎕의 PBS에 재현탁시켰다. 결과가 도 2에 도시된다.
도 2: 유동 세포계수법. 이 도면은 유동 세포계수법에서 2개의 상이한 SNAP 융합 단백질로의 M2D11의 결합을 보여준다. 두 세포주 모두에서, 상기 항체의 세포 표면과의 교차-반응성은 전혀 검출할 수 없거나, 또는 매우 미량만 검출할 수 있다. Mono Mac 1 및 A431 세포가 예로서 도시된다. 세포주 PC-3, CHO-K1, Kasumi, Mcf-7, L3.6pl, L540 및 FG에 대해 추가적으로 분석을 수행했다.
SEQUENCE LISTING <110> Fraunhofer-Gesellschaft zur F?derung der angewandten Forschung e.V. <120> Monoclonal Antibody for the Detection of SNAP/CLIP tag <130> 121843WO <150> EP11190787.9 <151> 2011-11-25 <160> 10 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 336 <212> DNA <213> Mouse <400> 1 caggtccaac tgcagcagtc tgggcctgaa ctgatgaggc ctgggacttc agtaaagatg 60 tcctgcaagg cttcaggcta tctcttcacc agttattgga tgcactgggt gaaacagagg 120 cctggacaag gccttgagtg gattgccatg atcgatcctt ccaatagtga gacttggttg 180 aatcagaatt tcaaggacaa ggccacattg aatgtagaca aatcctccaa gacagcctac 240 atgcagctca gcaacctgac atctgaggac tctgcagtct attactgtgc aagaggggac 300 tactggggcc aaggcaccac tctcacagtc tcctca 336 <210> 2 <211> 112 <212> PRT <213> Mouse <400> 2 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Met Arg Pro Gly Thr 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Leu Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Ala Met Ile Asp Pro Ser Asn Ser Glu Thr Trp Leu Asn Gln Asn Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Asn Val Asp Lys Ser Ser Lys Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Asn Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 100 105 110 <210> 3 <211> 5 <212> PRT <213> Mouse <400> 3 Ser Tyr Trp Met His 1 5 <210> 4 <211> 17 <212> PRT <213> Mouse <400> 4 Met Ile Asp Pro Ser Asn Ser Glu Thr Trp Leu Asn Gln Asn Phe Lys 1 5 10 15 Asp <210> 5 <211> 3 <212> PRT <213> Mouse <400> 5 Gly Asp Tyr 1 <210> 6 <211> 330 <212> DNA <213> Mouse <400> 6 gacattgtgc tgacacagtc tcctgcttcc ttagctgtat ctctggggca gagggccacc 60 atctcataca gggccagcaa aagtgtcagt acatctggct atagttatat gcactggaac 120 caacagaaac caggacagcc acccagactc ctcatctatc ttgtatccaa cctagaatct 180 ggggtccctg ccaggttcag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat 240 cctgtggagg aggaggatgc tgcaacctat tactgtcagc acattaggga gcttacgttc 300 ggagggggga ccaagctgga aatcaaacgt 330 <210> 7 <211> 110 <212> PRT <213> Mouse <400> 7 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Tyr Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser 20 25 30 Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Asn Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His 65 70 75 80 Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ile Arg 85 90 95 Glu Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 110 <210> 8 <211> 15 <212> PRT <213> Mouse <400> 8 Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Met His 1 5 10 15 <210> 9 <211> 7 <212> PRT <213> Mouse <400> 9 Leu Val Ser Asn Leu Glu Ser 1 5 <210> 10 <211> 7 <212> PRT <213> Mouse <400> 10 Gln His Ile Arg Glu Leu Thr 1 5

Claims (6)

  1. 서열번호 3, 4, 5, 및 8, 9, 10의 아미노산 서열을 갖는 CDR을 포함하는, SNAP 태그 모티프 및 CLIP 태그에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체.
  2. 청구항 1에 있어서, 마우스 항체인 것을 특징으로 하는 항체.
  3. 청구항 1 또는 2에 따른 항체를 코딩하는 핵산.
  4. 청구항 3에 있어서, 서열번호 1 또는 6의 핵산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 핵산.
  5. 청구항 1에 따른 항체를 제조하는 방법으로서, 면역화(immunization)는 인간이 아닌 포유동물, 특히, 마우스에서 SNAP 태그 단백질에 의해 이루어지고, 그로부터 하이브리도마 세포가 수득되고, SNAP 및 CLIP 태그를 모두 인식하는 항체 세포주가 결합 분석법(binding assay)에 의해 확인되는 것인 방법.
  6. SNAP 및/또는 CLIP 태그의 검출을 위한, 청구항 1 또는 2에 따른 항체의 용도.
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