JP2015500208A - Ｓｎａｐ／ｃｌｉｐタグを検出するためのモノクローナル抗体 - Google Patents

Abstract

配列番号３、４、５のアミノ酸配列のＣＤＲおよび配列番号８、９、１０のアミノ酸配列のＣＤＲを含む、ＳＮＡＰモチーフおよびＣＬＩＰタグに特異的に結合するモノクローナル抗体。

Description

本発明は、ＳＮＡＰ／ＣＬＩＰタグを検出するための抗体、そのような抗体をコードする核酸、およびＳＮＡＰ／ＣＬＩＰタグを含むタンパク質を検出するためのそのような抗体の使用に関する。

ＳＮＡＰおよびＣＬＩＰタグ技術は比較的新しい技術であり、所望のリガンドと共に標的タンパク質、特に融合タンパク質を提供する洗練された方法である。

特許文献１は、ＳＮＡＰ−２５組成物、ＳＮＡＰ−２５切断生成物からのＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断容易結合からのＰ１残基にカルボキシル末端を含むエピトープに結合するα−ＳＮＡＰ２５抗体の製造方法、ＳＮＡＰ−２５切断生成物からのＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断容易結合からのＰ１残基にカルボキシル末端を含むエピトープに結合するα−ＳＮＡＰ−２５抗体、ＢｏＮＴ／Ａ活性の検出方法、およびα−ＢｏＮＴ／Ａ中和抗体の検出方法を開示している。

Ｍ． Ｙａｍａｍｏｔｏ、Ｌ． Ｈａｓｓｉｎｇｅｒ、 Ｊ． Ｅ． Ｃｒａｎｄａｌｌは非特許文献１中で、発生中のラット大脳皮質および小脳皮質におけるステージ特異的神経突起関連タンパク質の電顕的局在を報告している。ＳＮＡＰ／ＴＡＧ−１は、１３５ｋＤａの糖タンパク質であり、発生中のげっ歯類ＣＮＳ中の成長中の軸索のサブセットの表面で発現している。この抗原の電顕的局在が、ＳＮＡＰ／ＴＡＧ−１を認識するモノクローナル抗体（４Ｄ７）およびペルオキシダーゼコンジュゲート二次抗体を用いた免疫電子顕微鏡法により、ラットの胎生期１７日目の大脳皮質および出産後４および８日目の小脳皮質で分析された。胎生期の皮質では、免疫反応性は、中間帯、サブプレート、および皮質板中に位置する限定されたグループの軸索、神経細胞細胞体、およびその先導突起の原形質膜に関連付けられた。免疫反応性軸索は１０〜２０のグループで束になっており、非免疫反応性軸索から隔てられていた。一部の成長円錐は免疫反応性であったが、４Ｄ７免疫反応性軸索の全ての成長円錐が染色されたわけではなかった。出産後の小脳中では、免疫反応性は、外顆粒細胞層の最も内側の部分に位置する顆粒細胞の細胞体および軸索に関連付けられた。大脳皮質および小脳皮質中、免疫反応性は、隣接する細胞膜の対応する点で、断続的に、１００〜２００ｎｍの規則的な周期で現れた。ＳＮＡＰ／ＴＡＧ−１が発生中のＣＮＳ中の特定の軸索サブグループ間の接着分子として作用している可能性が議論されている。

Ｒｉｃｈａｒｄ Ｊ Ｗａｒｄ、Ｊｏｈｎ Ｄ Ｐｅｄｉａｎｉ、およびＧｒａｅｍｅ Ｍｉｌｌｉｇａｎは、非特許文献２中で、Ｎ末端のＳＮＡＰおよびＣＬＩＰタグ化により評価した、リガンドにより誘導されるオレキシンＯＸ_１受容体およびカンナビノイドＣＢ_１受容体の内部移行について報告している。各受容体コンストラクトの細胞表面形態が、抗体によるエピトープタグの認識およびＯ^６−アルキルグアニン−ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼバリアントへのフルオロフォアの共有結合の両方により検出された。アンタゴニストには応答しないがアゴニストに応答する受容体内部移行を各アプローチによりモニタリングすることができたが、ＳＮＡＰタグでは、新規な時間分解蛍光プローブを用いた時に、他のアプローチよりも感度が最大６〜１０倍高かった。しかし、ＣＬＩＰタグでは、おそらくは非特異的結合のレベルがより高いため、感度は増大しなかった。

ＳＮＡＰタグはヒトＤＮＡ修復酵素Ｏ（６）−アルキルグアニンＤＮＡアルキルトランスフェラーゼを基とする。この後者は、分子サイズがより小さく且つベンジルグアニンへの親和性が非常に高いタンパク質バリアントを選択できる程度に、変異を導入することにより改変されている。ＳＮＡＰタグは、ベンジルグアニン誘導体と高度に特異的に反応し、グアニンを切断して、基質がカップリングしているベンジルラジカルを自身へと共有結合させる。これは、組換えタンパク質タグとして、融合タンパク質への種々のベンジルグアニン修飾基質の共有的結合的および化学量論的に定義されるカップリングを可能にする。ＣＬＩＰタグは、突然変異誘発によりＳＮＡＰタグから開発されたものであり、ベンジルグアニンではなくベンジルシトシン誘導体と高度に特異的に反応する。したがって、１つの実験アプローチ中でＳＮＡＰタグおよびＣＬＩＰタグによる区別可能な同時標識が可能である。ＳＮＡＰ技術（ＳＮＡＰ／ＣＬＩＰプラスミドおよび基質）はニュー・イングランド・バイオラボ社（ＮＥＢ）から配布されている。

非特許文献３中でＡｌｉｐｒａｎｄｉ ｅｔ ａｌ．はＶＨＨフォーマットの組換え抗ＳＮＡＰ抗体を開示している。

国際公開第２０００９／１１４７４８（Ａ１）号パンフレット

Journal of Neurocytology 19, 619-627 (1990) British Journal Pharmacology (2011), 162, 1439-1452 "Journal of Biomedicine and Biotechnology", Vol. 2010, Article ID658954, doi: 10.1155/2010/658954

ＣＬＩＰおよびＳＮＡＰタグの両方を検出可能な分析ツールを有することが望ましい。

本発明の目的は、請求項１に記載の抗体により達成される。本発明のモノクローナル抗体は、ＳＮＡＰタグモチーフおよびＣＬＩＰタグに特異的に結合し、配列番号３、４、５のアミノ酸配列のＣＤＲおよび８、９、１０のアミノ酸配列のＣＤＲを含む。特に、本発明の抗体はマウス抗体である。

本発明は更に、本発明の抗体をコードする核酸、特に配列番号１または６の核酸配列を有する核酸に関する。

本発明の抗体は、本発明のプロセスにより得ることができ、該プロセス中、非ヒト哺乳動物、特にマウス中でＳＮＡＰタグタンパク質を用いて免疫化を行い、それからハイブリドーマ細胞を得、それからＳＮＡＰタグおよびＣＬＩＰタグの両方を認識する抗体細胞系を結合アッセイにより同定する。

また、ＳＮＡＰおよびＣＬＩＰタグの両方を検出するための本発明の抗体の使用に関して、Ａｌｉｐｒａｎｄｉ ｅｔ ａｌ．は、ＳＮＡＰタグを認識する組換え抗体を記載している。本発明に係る抗体は、組織切片の染色に用いることができる。本発明に係るマウス抗ＳＮＡＰ抗体は特に、凍結切片およびパラフィン切片の染色に用いることができる。Ａｌｉｐｒａｎｄｉ ｅｔ ａｌ．に既に公開されている抗体に比しての本発明に係る抗体の利点は、価数が大きいことである。Ａｌｉｐｒａｎｄｉ ｅｔ ａｌ．の組換えタンパク質は１つのエピトープしか認識できないが、本発明に係る抗体は２つのエピトープを認識することができる。

免疫組織化学を示す図である。ＨＡＩ ＳＮＡＰ（抗ＥＧＦＲ）およびＭ２Ｄ１１を用いた、マウスから得られたＡ４３１腫瘍の凍結切片の染色。 フローサイトメトリーを示す図である。フローサイトメトリーにおける２つの異なるＳＮＡＰ融合タンパク質へのＭ２Ｄ１１の結合を示している。 ウェスタンブロット分析を示す図である。２つの図は、一方で、変性ゲル中における２つのタンパク質ＳＮＡＰおよびＣＬＩＰ−ＥＧＦへのＭ２Ｄ１１の結合を示している。 ウェスタンブロット分析を示す図である。この図は、溶液中におけるＭ２Ｄ１１とＳＮＡＰタンパク質の結合を検出するための未変性ポリアクリルアミドゲルのブロットを示している。

本発明に係る抗体は、ＳＮＡＰタグおよびＣＬＩＰタグの両方を検出することができる。本発明に係る抗体は、フローサイトメトリーでＳＮＡＰ融合タンパク質を検出できるという利点を有する。ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）およびウェスタンブロットにおける抗体の感度はＡｌｉｐｒａｎｄｉ ｅｔ ａｌ．に記載されている抗体とほぼ同等である。

記載されている方法に加え、本発明に係る抗体を免疫組織化学実験で試験した。抗体は凍結切片およびパラフィン切片中にあるＳＮＡＰ融合タンパク質の検出に用いることができる。

具体的な実施形態では、抗体はモノクローナル抗体である。特に、抗体はマウス起源であり得る。マウスＩｇＧ抗体は分子生物学的研究に最も多く用いられる抗体フォーマットに属するので、マウス抗体が好ましい。したがって、そのような抗体およびマウスＩｇＧ抗体の検出を用いた実験は多くの研究室の熟練者によく知られている。

本発明に係る抗体の重鎖可変領域は配列番号２に示されており、配列番号１がこの領域をコードする核酸に関連する。

本発明に係る抗体の軽鎖可変領域は配列番号７に示されており、配列番号６がこの領域をコードする核酸に関連する。

本発明に係る抗体の重鎖のＣＤＲが配列番号３〜５のアミノ酸配列中に記載されている。本発明に係る抗体の軽鎖のＣＤＲが配列番号８〜１０のアミノ酸配列中に記載されている。

本発明は更に、記載のタンパク質をコードする核酸、特に配列番号１および６に関する。

本発明は更に、本発明に係る抗体の製造プロセスに関し、プロセス中、非ヒト哺乳動物、特にマウス中でＳＮＡＰタグタンパク質を用いて免疫化が行われる。これらから、ハイブリドーマ細胞系が得られ、ＳＮＡＰタグおよびＣＬＩＰタグの両方を認識する抗体細胞系が、対応する結合アッセイにより同定される。

本発明に係る抗体は、ＳＮＡＰタグおよびＣＬＩＰタグの個々の検出に用いることができるが、その組合せの検出にも用いることができる。

ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびウェスタンブロット
分析対象であるサンプルをＬａｅｍｍｌｉバッファー中（またはＳＤＳを含まない未変性サンプルバッファー中）で変性させ、１２％（ｗ／ｖ）ＳＤＳポリアクリルアミドゲルおよびポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動した（１６０Ｖ、６０分）。タンパク質をクーマシー染色で可視化し、ニトロセルロースメンブレン（ドイツ、ダッセル（Ｄａｓｓｅｌ）のワットマン，シュライヒャー＆シュル社（Ｗｈａｔｍａｎ，Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ）製）に転写した（３５０ｍＡ、７０分）。転写後、１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを用いて室温で１時間メンブレンをブロッキングした。ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した後、ブロットを一次抗体とインキュベートした（１時間）。更に洗浄ステップを３回行った後、酵素コンジュゲート二次抗体（１時間）および対応する基質（１０分）を用いて特異的結合を検出した。ＳＮＡＰまたはＣＬＩＰタンパク質の分析では、サンプルをＢＧ基質またはＢＣ基質とインキュベートした後、変性させた。結果を図３に示す。

図３：ウェスタンブロット分析。２つの図３Ａ、３Ｂ、および３Ｃは、一方で、変性ゲル中での２つのタンパク質ＳＮＡＰおよびＣＬＩＰ ＥＧＦへのＭ２Ｄ１１の結合を示す。抗体は、他のＨｉｓ_６タグタンパク質（ＧＦＰ−Ｋｉ４）との交差反応性を示さない。更に、図３Ｂは、抗体がＳＮＡＰとの結合についてＳＮＡＰ基質と競合しないことを示している。ＳＮＡＰタンパク質をＢＧビオチンでビオチン化した後も、タンパク質をＭ２Ｄ１１で検出することができる。更に、図３Ｃは、異なるＳＮＡＰ−ｓｃＦｖ融合体（Ｈ２２−ＳＮＡＰ、ＳＮＡＰ−２７１５）およびＣＬＩＰ−ｓｃＦｖ−ＳＮＡＰ融合タンパク質への抗体の結合を示している。

図４：ウェスタンブロット分析。この図は、溶液中でのＭ２Ｄ１１とＳＮＡＰタンパク質との結合を検出するための未変性ポリアクリルアミドゲルのブロットを示している。パートＡは、タンパク質のＭｙｃタグを介してＳＮＡＰタンパク質の存在を示している。溶液中でもＭ２Ｄ１１がタンパク質に結合することおよび１：４過剰でのみ遊離タンパク質が検出可能であることが明確になっている。図のパートＢでは、両方のタンパク質の共局在が示されるように、更に抗体を検出した。

免疫組織化学
Ａ−４３１腫瘍を有するＢＡＬＢ／ｃマウス起源のＥＧＦＲ陽性皮下腫瘍（ＤＳＭＺ Ｎｏ．ＡＣＣ ９１）から組織切片を調製した。動物を屠殺した後、腫瘍を「Ｊｕｎｇ組織凍結培地」（ドイツ、ヌスロッホのライカ・マイクロシステムズ社製）に埋め込み、液体窒素中で凍結した。Ｌｅｉｃａ ３０５０Ｓ Ｋｒｙｏｓｔａｔで８μｍの凍結切片を調製し、一晩乾燥した。切片をアセトンで１０分間固定し、乾燥し、Ｉｍｍｕｎｏｐｅｎ（シグマ アルドリッチ社製）で輪郭を描いた。腫瘍細胞を一次抗体のＥＧＦＲ特異的ｓｃＦｖ融合タンパク質４２５ｓｃＦｖ ＳＮＡＰ（０．０３４ｍｇ／ｍｌ）で染色した。ＰＢＳＴで３回洗浄した後、種々の濃度のペルオキシダーゼ標識抗体Ｍ２Ｄ１１（ストック溶液：６５７ｎｇ／μｌ）でＳＮＡＰ融合タンパク質を検出した。抗体インキュベーションステップはどちらも室温で４５分間行い、洗浄ステップは室温で５分間振盪しながら行った。ＰＢＳＴで２回洗浄し、ＴＢＳＴで１回洗浄した後、染色が見えるようになるまで組織切片を３−アミノ−９−エチルカルバゾール（ＡＥＣ）溶液中でインキュベートした。その後、ヘマトキシリンで対比染色を行った後、切片をグリセロールゲルに乗せた。結果を図１に示す。

図１；免疫組織化学。４２５（ｓｃＦｖ）−ＳＮＡＰ（抗ＥＧＦＲ）およびＭ２Ｄ１１を用いた、マウスから得られたＡ４３１腫瘍の凍結切片の染色。

フローサイトメトリー
ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ベクトン・アンド・ディッキンソン社製）およびＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアを用いたフローサイトメトリーによりＭ２Ｄ１１の機能性を分析した。種々の細胞系の細胞表面への非特異的結合および細胞に結合したＳＮＡＰ融合タンパク質の特異的結合を検出した。約４×１０^５個の細胞を最初に１００μｌのＰＢＳ中で１〜２μｇのＳＮＡＰ／ＣＬＩＰ融合タンパク質と共にインキュベートし、次いで１００μｌのＰＢＳ中で３．３ｎｇのＭ２Ｄ１１と共に氷上で３０分間インキュベートした。検出のために、細胞をＧａＭ−ＰＥ（１：１００、ドイツ、ハンブルクのディアノバ社（Ｄｉａｎｏｖａ）製）と氷上で３０分間インキュベートした。次いで、細胞をフローサイトメトリーで分析した。全てのステップの間で、標準的な細胞洗浄遠心機を用いてＰＢＳ洗浄ステップを行った。細胞を３００μｌのＰＢＳに再懸濁して測定した。結果を図２に示す。

図２：フローサイトメトリー。図は、フローサイトメトリーにおける２つの異なるＳＮＡＰ融合タンパク質へのＭ２Ｄ１１の結合を示している。どちらの細胞系でも、抗体と細胞表面の交差反応性は全くまたは非常にわずかにしか検出されない。ここではＭｏｎｏ Ｍａｃ １およびＡ４３１細胞を例として示している。細胞系ＰＣ−３、ＣＨＯ−Ｋ１、Ｋａｓｕｍｉ、Ｍｃｆ−７、Ｌ３．６ｐｌ、Ｌ５４０、およびＦＧを用いた分析を更に行った。

Claims (6)

1. 配列番号３、配列番号４、配列番号５のアミノ酸配列のＣＤＲおよび配列番号８、配列番号９、配列番号１０のアミノ酸配列のＣＤＲを含む、ＳＮＡＰタグモチーフおよびＣＬＩＰタグに特異的に結合するモノクローナル抗体。
2. マウス抗体であることを特徴とする、請求項１に記載の抗体。
3. 請求項１または請求項２に記載の抗体をコードする核酸。
4. 配列番号１または配列番号６の核酸配列を有することを特徴とする、請求項３に記載の核酸。
5. 非ヒト哺乳動物、特にマウス中でＳＮＡＰタグタンパク質を用いて免疫化を行い、それからハイブリドーマ細胞を得、それからＳＮＡＰタグおよびＣＬＩＰタグの両方を認識する抗体細胞系を結合アッセイにより同定する、請求項１に記載の抗体を製造するプロセス。
6. ＳＮＡＰおよび／またはＣＬＩＰタグを検出するための、請求項１または請求項２に記載の抗体の使用。