CN110520167A

CN110520167A - 稳定的三维血管和形成其的方法

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Publication number: CN110520167A
Application number: CN201880022477.6A
Authority: CN
Inventors: S·拉菲; B·帕里库奇
Original assignee: Cornell University
Current assignee: Cornell University
Priority date: 2017-02-03
Filing date: 2018-02-02
Publication date: 2019-11-29
Anticipated expiration: 2038-02-02
Also published as: US11932876B2; JP2023052674A; EP3576756A1; WO2018144860A1; JP2020505053A; US20190376044A1; EP3576756A4; JP7265988B2; CN110520167B

Abstract

本公开提供了用于形成稳定的三维血管结构(例如血管)的方法及其用途。更具体地，本公开提供了在基质上培养包含编码ETV2转录因子的外源核酸的分化的内皮细胞的方法，培养条件使得在内皮细胞中表达外源ETV2蛋白以形成稳定的三维人造血管而无需使用支架、周细胞或灌注。本公开还提供了能够自主形成功能性三维血管网络的稳定的三维血管，及其用途。另外，本公开包括使类器官和脱细胞器官血管化的方法，其通过将类器官或脱细胞器官与包含编码ETV2转录因子的外源核酸的内皮细胞在使内皮细胞中表达外源ETV2蛋白的条件下培养，以使类器官或脱细胞器官血管化。

Description

稳定的三维血管和形成其的方法

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技术领域

本公开主要涉及用于形成稳定的三维血管结构(例如血管)的方法。更具体地，本公开涉及稳定的三维人造血管，用于形成这种血管的无支架方法及其用途。

背景技术

胚胎器官发生和组织再生依赖于具有功能性持久血管的血管化。Carmeliet,P.&Jain,R.K.Nature(2011)473,298-307。血管对于维持组织特异性体内平衡以及提供旁分泌血管生成因子以指导发育组织的适当成型和形态发生至关重要。参见，例如，Ramasamy,S.K.等人Trends Cell Biol(2015)25,148-157；和Rafii,S.等人Nature(2016)529,316-325。

为修复受损器官而诱导新血管形成(这一过程称为血管生成)的尝试面临一些障碍。参见，Samuel,R.等人Sci Transl Med(2015)7,309。迄今为止，将血管生成因子注射到受损器官中以诱导血管化对于建立可以长期使用的功能性的耐用的毛细血管没有效果。此外，在体外产生稳定血管以转化为临床环境的方法繁琐且耗时。例如，目前的方法需要制造支架以形成三维血管，使用血管周围的周细胞和强制灌注以重建血液动力学微环境。参见Huh,D.等人Trends Cell Biol(2011)21,745-754。

另外，现有模型使用临床上不相容的人工细胞外基质，例如Matrigel^TM(Corning)，其限制推定的毛细血管网络在培养中的重塑和成型(patterning)。虽然成熟的人内皮细胞在体外或体内在Matrigel^TM(Corning)基质中形成血管网络，但这些血管不稳定，具有有限的重塑潜力，并且在几周内消退。

产生器官芯片模型的技术(参见Huh,D.等人Trends Cell Biol(2011)21,745-754)和三维生物打印(参见Zhang,Y.S.等人ACS Biomater Sci Eng(2016)2,1710-1721)大大改善了疾病建模和药物筛选。然而，将生理相关的血管细胞纳入这些方法的能力却滞后。具体地，在当前方法中，由于人造生物材料所引入的物理性约束，内皮细胞与组织特异性上皮细胞和肿瘤细胞的直接相互作用受到限制。此外，当前的器官芯片或血管支架方法需要通过半透性人工生物材料层分离，这会损害内皮细胞和非血管细胞之间必需的物理性细胞-细胞相互作用，从而限制适应性或适应不良的内皮细胞重塑。参见Ginsberg,M.等人Cell(2012)151,559-575；Schachterle,W.等人Nature communications(2017)8,13963；Israely,E.等人Stem Cells(2013)1521；和James,D.等人Nat Biotechnol(2010)28,161-166。

由于需要使用支架、物理屏障和人造基质，限制了内皮细胞与类器官培养物的交叉对话以及组织特异性人造血管结构的转化的体外研究。因此，新的方法使用可与器官型干细胞共混和重塑的内皮细胞，使肿瘤或组织特异性类器官或脱细胞器官血管化，这将改善向用于再生、药物筛选和肿瘤靶向的临床环境的应用转化。

本公开的稳定的三维血管和方法利用未被识别的重编程元件，其指示形成稳定的三维人造血管，所述三维人造血管在体内具有完整功能的持续时间比现在的人造血管长得多。此外，本文公开的组合物和方法产生器官特异性的血管，使受损组织、类器官和脱细胞器官能够血管化。

公开概述

本公开揭示了ETS转录因子变体2(ETV2(ER71，ETSRP71))指导内皮细胞发育，并且揭示了ETV2瞬时表达在将分化的内皮细胞重编程为更具塑性的、易适应的和对环境刺激有反应的原始样内皮细胞，以及适应其他非血管细胞类型(包括正常上皮细胞和肿瘤细胞)中发挥重要作用。更具体地，本公开的方法和组合物确定了在含有细胞外基质组分的基质上培养的内皮细胞中，ETV2转录因子的外源表达导致在体外和体内形成稳定且功能性的三维人造血管，而无需使用周细胞、灌注和笨重的支架。因此，本公开涉及以下发现：在基质(例如基质，包括层粘连蛋白、巢蛋白和/或胶原蛋白IV)上培养的重编程的内皮细胞在体外以及体内形成持久的、功能性的三维人造血管。

因此，本公开的第一方面涉及用于形成稳定的三维血管结构(例如管腔化的血管小管)的方法。本文描述的方法的一个显著优点是它们不利用三维支架，从而有利地消除了目前形成人造三维血管所需的昂贵且耗时的要素。本方法的另一个优点是确定和使用生物相容性基质，其导致稳定的血管网络的重塑和成型。因此，本方法消除了许多损害现有血管形成方法的现有缺点。

在本公开的一个实施方式中，提供了用于形成稳定的三维血管的方法，其包括在基质上培养包含编码ETV2转录因子的外源核酸的内皮细胞，使得内皮细胞表达ETV2转录因子蛋白至少3周。

ETV2转录因子蛋白在分化的内皮细胞中的外源性表达可重编程分化的内皮细胞，使它们能够自组装成稳定的、功能性的三维血管结构，例如管腔化的血管，其然后可以分离并用于多种目的，例如受损组织的血管化，类器官的血管化或脱细胞器官的再血管化。因此，在一些实施方式中，用于本发明方法的内皮细胞是分化的内皮细胞。在某些实施方式中，分化的内皮细胞是人内皮细胞。在具体的实施方式中，分化的人内皮细胞是人脐静脉来源的内皮细胞(HUVEC)、人脂肪来源的内皮细胞或组织/器官特异性人内皮细胞。在本发明方法的一些实施方式中，分化的内皮细胞是器官特异性内皮细胞，包括但不限于心脏，肾，睾丸，卵巢，视网膜，肝，胰腺，脑，肺，脾，大肠或小肠的内皮细胞。在其他实施方式中，分化的内皮细胞是来自肌肉，淋巴组织，嗅觉组织，成骨组织，口腔(牙齿)组织或腺体组织(例如，内分泌腺、胸腺)的组织特异性内皮细胞。

在本发明方法的某些实施方式中，外源ETV2编码核酸存在于内皮细胞中。在一个实施方式中，外源ETV2编码核酸对应于SEQ ID NO：1中所示的人ETV2基因核苷酸序列，其编码具有SEQ ID NO：2中所示氨基酸序列的人ETV2转录因子蛋白。在其他实施方式中，外源ETV2编码核酸是编码ETV2转录因子蛋白的ETV2核糖体核酸(RNA)转录物。

在某些实施方式中，通过转染或转导将外源ETV2核酸提供给内皮细胞。在一个具体实施方式中，使用病毒载体(例如慢病毒载体)将编码ETV2的核酸转导入内皮细胞。在一个实施方式中，使用诱导型表达系统将外源ETV2转录因子编码核酸提供给分化的内皮细胞，所述诱导型表达系统例如，反向tet-反式激活因子(rtTA)-多西环素诱导型表达系统。

在一些实施方式中，本发明方法包括在表达ETV2转录因子蛋白的条件下培养包含外源ETV2编码核酸的内皮细胞。ETV2蛋白可以组成型或瞬时表达。在某些情况下，外源ETV2转录因子在分化的内皮细胞中表达至少3周，至少4周，至少5周，至少6周，至少7周，至少8周或更长时间以重编程分化的内皮细胞和诱导管腔化血管形成。在一个具体实施方式中，外源ETV2蛋白表达至少3-4周以诱导血管形成。

在其他实施方式中，本发明方法包括在表达ETV2转录因子蛋白的条件下培养具有外源ETV2编码核酸的内皮细胞，然后在内皮细胞不表达外源ETV2的条件下进一步培养一段时间。在此，内皮细胞可以首先在表达外源ETV2转录因子的条件下培养第一段时间，然后在不表达外源ETV2的条件下进行第二次培养，例如在不存在能够激活诱导型启动子的物质(例如多西环素、四环素)的情况下。在一些情况下，本发明方法包括在瞬时表达ETV2转录因子蛋白的条件下(例如，在多西环素的存在下)培养具有外源ETV2编码核酸的内皮细胞至少3周，至少4周，至少5周，至少6周，至少7周，至少8周或更长时间，然后在不表达外源ETV2的条件下(例如在不存在多西环素的情况下)进行第二次培养数天、数周或数月时间。

在本发明方法的一些实施方式中，包含外源ETV2编码核酸的内皮细胞在基质上培养。在某些实施方式中，基质由限定的细胞外基质组分组成，例如层粘连蛋白、巢蛋白和胶原。在具体的实施方式中，本发明方法中使用的基质由层粘连蛋白、巢蛋白和胶原蛋白IV的组合(L.E.C.)组成。在一个实施方式中，基质可包括组合浓度为至少5mg/mL的层粘连蛋白和巢蛋白。在一个示例性实施方式中，表达ETV2的内皮细胞在以5mg/mL的组合浓度包含层粘连蛋白和巢蛋白的基质上培养。由于层粘连蛋白和巢蛋白可彼此结合并形成复合物，因此基质可包括层粘连蛋白和巢蛋白的复合物。例如，基质可包含至少5mg/mL的层粘连蛋白和巢蛋白的复合物。例如，内皮细胞可以在含有浓度至少为5mg/mL的层粘连蛋白和巢蛋白复合物、以及至少0.2mg/mL胶原蛋白IV的基质上培养，以形成持久的、功能性的三维人造血管。在一个具体实施方式中，内皮细胞在由组合浓度为5.25mg/mL的层粘连蛋白和巢蛋白以及0.2mg/mL胶原蛋白IV组成的基质上培养。在其他实施方式中，基质是Matrigel^TM(Corning)。

在本发明方法的一个实施方式中，在无血清培养基中培养包含外源ETV2编码核酸的内皮细胞。在一些实施方式中，本发明方法包括在无血清培养基中培养内皮细胞至少7天，至少10天，至少2周，至少3周，至少4周，至少5周，至少6周，至少7周，至少8周或更长时间。在其他实施方式中，本方法包括在低氧气分压(即低于大气压氧气分压(20％氧气分压))下在无血清培养基中培养包含外源ETV2编码核酸的内皮细胞。在具体的实施方式中，在氧气分压为4％和15％之间，5％和10％之间，4％和8％之间，或4％和6％之间的无血清培养基中培养细胞。在一个实施方式中，将细胞在氧气分压为5％的无血清培养基中培养至少7天。

在一些实施方式中，本发明方法包括在基质上培养包含外源ETV2编码核酸的内皮细胞，在培养条件下表达ETV2转录因子，以诱导形成管腔化的、稳定的三维血管，并分离该稳定的三维血管。

本公开还揭示了ETV2蛋白在分化的内皮细胞中的外源表达导致稳定的、功能性的三维血管的自主自组装，其具有在不存在周细胞、灌注和支架的情况下在体外和体内形成功能性血管网络的能力。

因此，在本公开的另一方面中，提供了一种能够自主形成三维血管网络的稳定的三维血管。

在某些实施方式中，本公开的稳定的三维血管包括管状结构，例如由至少一个连续的重编程内皮细胞层组成的腔管。在一些实施方式中，重编程的内皮细胞含有编码ETV2转录因子的外源核酸。

在某些实施方式中，稳定的三维血管的内皮细胞表达编码ETV2转录因子的外源核酸。在一个实施方式中，ETV2转录因子的表达是瞬时的，即一段有限的时间，例如数天、数周或数月的时间。在具体的实施方式中，ETV2转录因子的瞬时表达通过诱导型表达系统例如反向tet-反式激活因子(rtTA)-多西环素诱导型表达系统调节。在其他实施方式中，本公开的稳定的三维血管包含组成型(即，永久地)表达外源ETV2转录因子的内皮细胞。在其他实施方式中，稳定的三维血管由表达外源ETV2转录因子的内皮细胞和不表达外源ETV2的内皮细胞的组合所组成。在另一个实施方式中，稳定的三维血管由不表达外源ETV2转录因子的重编程内皮细胞组成。

在一些实施方式中，分离本公开的稳定的三维血管。在此，将血管全部或部分地自其形成的环境中移除。在某些实施方式中，分离的稳定的三维血管不含培养基、培养基组分和添加剂，以及其形成所附着的任何基质，例如Matrigel^TM或L.E.C基质。在其他实施方式中，本公开的分离的、稳定的三维血管已自培养基、培养基组分和添加剂中除去，但包括至少一部分基质，例如Matrigel^TM或L.E.C基质。

在本公开的一个实施方式中，稳定的三维血管是功能性的。在特定实施方式中，功能性的、稳定的三维血管能够使流体(灌注)通过血管。在其他实施方式中，功能性的、稳定的三维血管能够使血液通过血管。在又一个实施方式中，功能性的、稳定的三维血管能够形成三维血管网络。在一个实施方式中，稳定的三维血管形成功能性的三维血管网络，其包括能够将血液输送至组织(血管化组织)的至少一个毛细血管、至少一个小动脉、至少一个小静脉、至少一个淋巴血管或其组合。

在一些实施方式中，本公开的功能性的、稳定的三维血管在至少一个月，至少2个月，至少3个月，至少4个月，至少5个月或更长时间内具有功能。在具体实施方式中，本公开的稳定三维血管在血管形成后稳定4周，5周，6周，7周，8周，9周，10周，11周，12周，13周，14周，15周，16周，17周，18周，19周，20周或更长时间。

由于本公开显示包含外源ETV2的内皮细胞自主地组织成能够在体内血管化的，成型的、稳定的人造血管，因此本公开还提供了促进血管化的方法。因此，在另一方面，提供了一种用于促进受试者中血管化的方法，其包括向受试者施用稳定的三维血管。在一些实施方式中，受试者具有受损组织，例如需要血管化的器官。在具体的实施方式中，受试者具有受损的心脏组织、受损的肝组织、受损的淋巴组织、受损的肾组织、受损的睾丸组织、受损的卵巢组织、受损的视网膜、受损的胰腺组织、受损的脑组织、受损的肺组织、受损的肠组织、受损的腺体组织、受损的肌肉组织或其组合。

在一个实施方式中，本发明方法包括通过手术植入至需要血管化的受试者的受损组织而向受试者施用稳定的三维血管。在具体实施方式中，将稳定的三维血管直接植入受损器官或其组织上。在其他实施方式中，本发明方法包括通过注射向受试者施用稳定的三维血管，例如直接注射至受损组织。在某些实施方式中，通过静脉内注射、腹膜内注射、肌内注射、皮下注射或其组合向受试者施用稳定的三维血管。

在一些实施方式中，在受试者中促进血管化的方法包括向受试者施用至少一种体外已形成的稳定的三维血管。在其他实施方式中，该方法包括施用已在体外形成的本公开的2种或更多种稳定的三维血管。在一个具体实施方式中，本发明方法包括将由层粘连蛋白、巢蛋白和胶原蛋白IV组成的基质上的多个稳定的三维血管直接施用至需要血管化的组织，例如受损组织。

一旦将稳定的三维血管施用于受试者，功能性的、稳定的三维血管建立能够使内源组织血管化的三维血管网络。在一些实施方式中，稳定的三维血管形成三维血管网络，其包括能够将血液运输至组织的至少一个毛细管、至少一个小动脉、至少一个小静脉、至少一个淋巴血管或其组合。

在本公开的另一方面中，提供了一种使类器官血管化的方法。在此，使类器官血管化的方法包括在基质上将类器官与包含编码ETV2转录因子的外源核酸的内皮细胞一起培养，在培养条件下内皮细胞中表达外源ETV2蛋白，以在类器官上形成稳定的三维血管网络。

在一些实施方式中，使类器官血管化的方法包括在基质上与内皮细胞一起培养类器官。在某些实施方式中，基质由限定的细胞外基质组分组成，例如层粘连蛋白、巢蛋白和胶原蛋白。在具体的实施方式中，本发明方法中使用的基质由层粘连蛋白、巢蛋白和胶原蛋白IV的组合(L.E.C.)组成。在一个实施方式中，基质可包括组合浓度为至少5mg/mL的层粘连蛋白和巢蛋白。在一个示例性实施方式中，将类器官与内皮细胞在包括组合浓度为5mg/mL的层粘连蛋白和巢蛋白的基质上一起培养。由于层粘连蛋白和巢蛋白可彼此结合并形成复合物，因此基质可包括层粘连蛋白和巢蛋白的复合物。例如，基质可包含至少5mg/mL的层粘连蛋白和巢蛋白的复合物。例如，内皮细胞可以在含有浓度至少为5mg/mL的层粘连蛋白和巢蛋白复合物、以及至少0.2mg/mL胶原蛋白IV的基质上培养，以使类器官血管化。在一个具体实施方式中，基质由组合浓度为5.25mg/mL的层粘连蛋白和巢蛋白以及0.2mg/mL胶原蛋白IV组成。在其他实施方式中，基质是Matrigel^TM(Corning)。

在一个实施方式中，使类器官血管化的方法包括在包含成纤维细胞生长因子(FGF)的培养基中在基质上将类器官与内皮细胞一起培养。在一个具体实施方式中，培养基包括碱性成纤维细胞生长因子(FGF2)。在一些实施方式中，培养基包括肝素。在一个具体实施方式中，使类器官血管化的方法包括在包含FGF2和肝素的培养基中在基质上将类器官与内皮细胞一起培养。

可以将类器官与包含编码ETV2转录因子的外源核酸的内皮细胞在内皮细胞中表达外源ETV2蛋白的条件下在基质上培养所需的时间长度，以诱导在类器官上形成功能性三维血管网络(即使类器官血管化)。例如，在某些实施方式中，将类器官与分化的内皮细胞培养至少一周(7天)，至少10天，至少2周，至少3周，至少4周，至少5周，至少6周，至少7周，至少8周或更长时间以重编程内皮细胞并诱导在类器官上形成成型的、持久的人造血管。在一些实施方式中，血管化的类器官具有三维血管网络，其包括能够在整个类器官中输送血液的至少一个毛细血管，至少一个小动脉，至少一个小静脉，至少一个淋巴血管或其组合。

本发明的使类器官血管化的方法可以应用于任何类型的类器官。例如，用于本发明方法的类器官可以是小肠类器官，结肠类器官，肾脏类器官，心脏类器官或肿瘤类器官。在一些实施方式中，该方法可用于使肿瘤类器官血管化，其中肿瘤类器官可以是组织特异性的，例如乳腺癌类器官，结肠癌类器官，肾癌类器官或肠癌类器官。

本领域普通技术人员可以将本公开的血管化的类器官用于多种目的。因此，因此，在一些实施方式中，用于使类器官血管化的本发明方法包括分离血管化的类器官。

一旦获得血管化的类器官，就可以将血管化的类器官施用于受试者，例如人或动物(例如，小鼠、大鼠、狗、猴)。在具体的实施方式中，血管化的类器官可以通过手术植入施用于小鼠。

在其他实施方式中，分离的血管化的类器官可用于确定治疗剂的功效。在此，将血管化的类器官与治疗剂接触，并在治疗剂的存在下培养一段时间。在培养期间，可以分析类器官功能、细胞生长和健康以确定治疗剂的功效。

本公开还揭示了在内皮细胞中表达外源ETV2蛋白的条件下，将脱细胞器官与包含编码ETV2转录因子的外源核酸的内皮细胞一起培养会导致脱细胞器官上功能性血管结构的发展。因此，本公开的一个方面提供了用于使脱细胞器官再血管化的方法。

在一些实施方式中，用于使脱细胞器官再血管化的方法包括在基质上将脱细胞器官与重编程的内皮细胞一起培养。在具体的实施方式中，本发明方法中使用的基质由层粘连蛋白、巢蛋白和胶原蛋白IV的组合(L.E.C.)组成。在某些实施方式中，基质由限定的细胞外基质组分组成，例如层粘连蛋白、巢蛋白和胶原蛋白。在一个实施方式中，基质可包括组合浓度为至少5mg/mL的层粘连蛋白和巢蛋白。在一个示例性实施方式中，将器官与内皮细胞一起在基质上培养，所述基质包括组合浓度为5mg/mL的层粘连蛋白和巢蛋白。基质可包含至少5mg/mL的层粘连蛋白和巢蛋白的复合物。例如，内皮细胞可以在含有浓度为至少5mg/mL的层粘连蛋白和巢蛋白的复合物，以及至少0.2mg/mL胶原蛋白IV的基质上培养，以使器官血管化。在一个具体实施方式中，基质由组合浓度为5.25mg/mL的层粘连蛋白和巢蛋白以及0.2mg/mL胶原蛋白IV组成。在其他实施方式中，基质是Matrigel^TM(Corning)。

在一些实施方式中，用于使脱细胞器官再血管化的方法包括，在使外源ETV2转录因子蛋白表达的培养条件下，在基质上将脱细胞器官与内皮细胞在生物反应器中一起培养。

在一个实施方式中，用于使脱细胞器官再血管化的方法包括在内皮细胞中表达外源ETV2蛋白的条件下，在基质上将脱细胞器官与内皮细胞一起培养所需的时间长度，以诱导在脱细胞器官上形成功能性三维血管网络(即使器官再血管化)。例如，在某些实施方式中，将脱细胞器官和重编程内皮细胞培养至少一周(7天)，至少10天，至少2周，至少3周，至少4周，在至少5周，至少6周，至少7周，至少8周或更长时间以诱导内皮细胞在脱细胞器官上组织成管腔化的、持久的血管。在其他实施方式中，内皮细胞在脱细胞器官上形成功能性三维血管网络，其包括能够在整个器官中输送血液的至少一个毛细血管，至少一个小动脉，至少一个小静脉，至少一个淋巴血管或其组合。

本发明方法可以应用于任何类型的脱细胞器官。例如，可以在脱细胞器官上的内皮细胞中表达外源ETV2蛋白的条件下培养所述内皮细胞，所述脱细胞器官为例如脱细胞的心脏，肾，睾丸，卵巢，视网膜，骨，内分泌腺，甲状腺，气管，淋巴结，肝，胰腺，脑，肺，脾，大肠或小肠。

本领域普通技术人员可以将本公开的再血管化的器官用于多种目的。因此，在一些实施方式中，本发明的用于使脱细胞器官再血管化的方法包括分离再血管化的器官。在一个示例性实施方式中，可以将再血管化的器官分离，然后施用于受试者，例如人或动物(例如，小鼠、大鼠、狗、猴)。在具体的实施方式中，将再血管化的脱细胞器官分离并通过手术植入施用于人受试者。

在其他实施方式中，分离的再血管化的脱细胞器官可用于确定治疗剂的功效。在此，将再血管化的脱细胞器官与治疗剂接触，并在治疗剂的存在下培养一段时间。在培养期间，可以分析器官功能、细胞生长和健康以确定治疗剂的功效。

附图简述

本专利的文件包含至少一幅彩色附图。具有彩色附图的本专利的副本将由专利和商标局根据请求并支付必要的费用而提供。

图1A-1M.包括外源ETV2的重编程内皮细胞在体外自组装成稳定的、三维的、功能性的和管腔化的人造血管。A.对单层对照HUVEC(CTRL-EC)或lenti-ETV2转导的HUVEC进行VECAD、ETV2和DAPI(R-VEC)染色。B.对对照-EC或R-VEC进行针对ETV2、VEGFR2和转录因子Fli1的蛋白质印迹分析。GAPDH用作上样对照。C.在12周的由表达外源ETV2的内皮细胞(R-VEC)形成的管上进行针对VECAD和ETV2的免疫染色。D.CTRL-EC和R-VEC的管形成时间过程(24小时至8周)图像。E.第16周时R-VEC血管的整孔概观，证明存在有组织的血管丛。F.在培养12周的不同时间点对血管密度进行定量。G.当使用R-VEC或ETS1或myrAKT转导的内皮细胞时对血管形成的定量。H.在Matrigel上的血管形成测定中，ETS1或myrAKT1转导的HUVEC的代表性图像。I.由表达外源ETV2的内皮细胞(R-VEC)形成的人造血管针对适当管腔极性的免疫染色，其具有足糖萼蛋白(顶端，红色)和层粘连蛋白(基底，绿色)。J.电子显微镜显示存在由表达外源ETV2的内皮细胞在8/12周时间点形成的完整管腔人造血管，K.针对CTRL-EC和R-VEC，在1周和4周时对细胞外基质蛋白的不同混合物的筛选进行定量。L.使用R-VEC通过8周时间点对Matrigel^TM(corning)或层粘连蛋白/巢蛋白/胶原蛋白IV(L.E.C.)基质上的血管形成的长期血管定量。M.如电子显微镜所示，当使用Matrigel^TM以及L.E.C.基质时，由表达外源ETV2的内皮细胞(R-VEC)形成的人造血管中存在管腔。ns＝不显著，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

图2A-2B.稳定的三维血管在体外是功能性的。A.通过灌注红色荧光标记珠显示血管耐久性和功能性。B.在微流体装置中培养后第6天的血管密度的定量。*P<0.05。

图3A-3M.包括外源ETV2的内皮细胞组织成能够在体内血管化的成型的、持久的血管。A.在2个月时含有CTRL-EC和表达ETV2的重编程内皮细胞(R-VEC)的栓塞的图像。B–C.在2个月时间点和5个月时间点分离包括层粘连蛋白/巢蛋白/胶原蛋白IV(L.E.C)基质和内皮细胞的栓塞的整装共聚焦图像，并将R-VEC栓塞与含有CTRL-EC的栓塞进行比较。处死前在小鼠中眼眶后(活体注射)注射对人内皮细胞具有特异性并与Alexa647(白色)缀合的单克隆VECAD抗体。D.在1个月和2个月时，在切片中以荧光强度百分比对血管密度定量。E.在1周、1个月和2个月时栓塞的整装图像。F.在1周、1个月和2个月时间点对R-VEC和CTRL-EC栓塞中形成的血管的定量。G.2个月时栓塞切片的H&E染色。H.2个月时栓塞切片(20μm)的免疫荧光染色。在针对小鼠PDGFRβ染色的栓塞中形成的血管。I.自具有R-VEC、ETS1表达内皮细胞(ETS1-VEC)或myrAKT1表达内皮细胞(myrAKT1-EC)和CTRL-EC的栓塞获得的1个月时间点时的Matrigel^TM栓塞的图像。J.在1个月时的R-VEC、ETS1-VEC或myrAKT1-EC和CTRL-EC的整装显微镜检查。K.在1个月时对R-VEC、ETS1-VEC或myrAKT1-EC和CTRL-EC的H&E染色。只有重编程内皮细胞(R-VEC栓塞)形成灌注和成型的血管，如红细胞的存在所示。L.移植血管(人VECAD，蓝色)小鼠周细胞(小鼠PDGFRβ，绿色)的染色切片。较小的毛细血管和小动脉样结构的图像。M.植入的R-VEC血管，其在体内由小鼠PDGFRβ阳性周细胞包裹。图(i和ii)放大来自图3L的图像。图(iii)植入的R-VEC血管的3D重建。ns＝不显著，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

图4A-4H.瞬时ETV2表达足以形成和维持稳定且功能性持久的人血管。使用诱导型ETV2系统完成人工血管的形成，其中ETV2表达由多西环素的存在驱动。多西环素(Dox)在试验的第0天、试验开始后1个月去除，或总是存在。A.荧光图像描绘了仅存在rtTa、诱导型ETV2的样品的血管形成，其中Dox在第0天去除，在1个月后去除，或连续添加至2D或3D培养物。B.体内栓塞试验，其中小鼠从未暴露于Dox饮食、在Dox饮食中持续1个月然后转为常规饮食1个月、以及持续进行Dox饮食。红色代表经注射的人内皮细胞。白色提供了静脉内(活体内)注射的VECAD，然后处死小鼠以鉴定灌注的吻合血管。C.在瞬时ETV2表达期间发育1个月和2个月时的血管密度的定量。D.当多西环素连续存在时的血管中、和当多西环素于1个月之后去除后的血管中管腔的电子显微镜图像。E.显示4周后表达ETV2的重编程内皮细胞(R-VEC)和培养的对照HUVEC形成的血管中，重叠差异表达基因的数目的维恩图。F.显示与对照HUVEC相比，培养4周后R-VEC血管之间共享的前20个上调和下调基因(按倍数变化排序)的热图。G.显示培养4周后R-VEC血管和R-VEC单层中前25个上调和下调基因(按倍数变化排序)的热图。H.如通过相对于GAPDH表达的qPCR分析所示，在1周和4周时去除Dox时，ETV2关闭。ns＝不显著，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

图5A-5L.表达外源ETV2的重编程内皮细胞使类器官血管化。人或小鼠来源的类器官单独培养，或与人CTRL-EC(对照)或含有外源ETV2的重编程内皮细胞(R-VEC)一起培养。A.单独培养(绿色)以及与CTRL-EC或R-VEC共培养(红色荧光)的小鼠小肠类器官的时间过程(24小时、4天和7天)的代表性共聚焦显微镜图像。B.在7天的时间过程中CTRL-EC与R-VEC类器官共培养物的血管密度。C.与CTRL-EC对比R-VEC一起培养的类器官中以芽/类器官定量的血管分化(血管化)。D.人正常结肠类器官单独培养、或与CTRL-EC或R-VEC共培养实验的共聚焦代表性图像。图像拍摄于第8天。E.第8天时结肠类器官/视野的定量。F.在第8天时CTRL-EC与R-VEC类器官共培养物中的血管密度/视野。G.单独或与CTRL-EC或R-VEC共培养的结肠肿瘤类器官的代表性共聚焦图像。在共培养R-VEC与肿瘤类器官的第8天，将类器官针对角蛋白20(KRT20)和EdU进行后染色。H.在第8天对CTRL-EC或R-VEC类器官共培养物中的血管密度进行定量。I.在第8天用EpCam、EDU和DAPI染色的肿瘤结肠类器官的免疫荧光分析。J.各种正常和肿瘤类器官分枝后达到的R-VEC形态学教育的示意图。肠类器官与R-VEC的亲密的细胞相互作用导致形成有组织的几何成型的适当适应性血管。相比之下，R-VEC与肿瘤类器官的共混合导致通常在体内异常肿瘤脉管系统中看到的，无组织和被破坏的血管的产生。因此，ETV2转导的内皮细胞获得独特的塑性特征，以适应正常的类器官，并且不适应于肿瘤类器官，从而表现出成体脉管系统的体内行为。K.单独或与CTRL-EC或R-VEC共培养的三阴性人乳腺肿瘤类器官在24小时时的代表性共聚焦图像。L.第8天时乳腺肿瘤类器官的R-VEC血管化的共聚焦图像。重编程内皮细胞形成无组织且成型不良的血管，使人想起体内异常的肿瘤血管。**P<0.01，***P<0.001。

图6A-6J.包括外源ETV2的移入物的，在脱细胞化的大鼠肠中增殖的，并且在异位植入再内皮化的肠后植入宿主脉管系统内的内皮细胞。A.收获的大鼠肠通过管腔、肠系膜动脉和肠系膜静脉插管。比例尺1cm。B.脱细胞肠在宏观上保留天然脉管系统支架结构，比例尺为5mm。C.接种的R-VEC迁移并覆盖远端毛细血管。比例尺5mm。D.在生物反应器中培养7天后，用荧光低密度脂蛋白(LDL)灌注显示出明显的内皮化血管。比例尺50μm。E.R-VEC重新填充脉管系统。比例尺100μm。F.R-VEC均匀地分布在整个脉管系统中，形成远端毛细血管和血管，而CTRL-EC不能使器官血管化。比例尺500μm。G.与对照EC相比，对由R-VEC血管化的区域的定量显示R-VEC的再内皮化增加。H-K.通过活体静脉内注射荧光同工凝集素和抗人VE-钙粘着蛋白抗体，再内皮化的肠的异位植入显示细胞在1周和4周后植入并与宿主血管系统吻合(比例尺50μm和20μm)。*P<0.05，**P<0.01。

公开详述

本文中已经认识到，ETS转录因子变体2(ETV2(ER71，ETSRP71))在内皮细胞(EC)中的外源表达在将分化的内皮细胞重编程为能够自主形成功能性的、稳定的三维血管和血管网络的更原始的内皮细胞中发挥重要作用。因此，本发明提供了在不存在周细胞、强制灌注和人工支架的情况下，通过在内皮细胞中外源表达ETV2来形成稳定的三维血管的方法，通过这些方法产生的稳定且功能性的三维人造血管，以及使用其的方法。

用于形成稳定的三维血管的方法

本公开的第一方面涉及用于形成稳定的三维血管结构(例如人造血管)的方法。不受任何特定理论的束缚，据信ETV2在内皮细胞中适当时间的表达可以重编程培养物中的内皮细胞以在体外以及体内形成持久的、功能性的三维血管。当在限定的基质上培养时，外源ETV2转录因子在分化的内皮细胞中的表达导致功能性的、稳定的三维血管的自主形成。由于本发明方法不使用三维支架，因此本文提供的方法有利地消除了目前形成三维血管所需的昂贵且耗时的要素。

大致上，本发明中用于形成稳定的三维血管的方法包括，在生物相容性基质上培养包含编码ETV2转录因子的外源核酸的内皮细胞，在所述培养条件下外源ETV2转录因子表达至少3周。在分化的内皮细胞中，ETV2转录因子蛋白的外源性表达使分化的内皮细胞重编程，赋予细胞自组装成稳定的、功能性三维血管结构(例如腔内血管)的能力，然后可以将其分离并用于多种目的，例如使受损组织血管化，使类器官血管化或使脱细胞器官再血管化。

在一个实施方式中，用于本发明方法的内皮细胞是分化的内皮细胞(EC)。如本文所用的术语“分化的”或“分化的内皮细胞”是指内皮细胞变得特化于特定功能的发育过程，例如，其中细胞获得不同于初始细胞类型的一种或多种形态学特征和/或功能。术语“分化”包括谱系定型和细胞发育成成熟的、完全分化的成体内皮细胞。可以例如通过使用免疫组织化学或本领域技术人员已知的其他方法监测谱系标志物的存在或不存在来评估分化。

内皮细胞可通过本领域已知的方法获得。例如，可以使用基于胶原酶的消化方法从组织中分离内皮细胞，如以下中所述：Ginsberg,M.等人Cell(2012)151,559-575和Ferrara等人的美国专利号6,899,822。可以通过用例如抗CD31抗体、VE-钙粘蛋白或抗血管性血友病因子抗体染色来验证内皮细胞谱系。EC的分离可以使用对EC表面标志物具有特异性的抗体实现，例如VE-钙粘蛋白、CD31或VEGFR2，所述抗体与磁珠或荧光团连接，用于磁性或荧光激活细胞分选(MACS或FACS)。

或者，内皮细胞可以从商业来源获得。可以在维持其分化谱系和复制能力的条件下培养和维持(扩增)内皮细胞。这些条件已在本领域中充分记载。例如，分离的内皮细胞可以在包括内皮细胞生长补充剂的完全培养基中，在涂覆的组织培养皿中培养。然后可以将内皮细胞分开并传代直至使用。

在一些实施方式中，分化的内皮细胞是人内皮细胞。在某些实施方式中，分化的人内皮细胞是人脐静脉来源的内皮细胞(HUVEC)、人脂肪来源的内皮细胞或组织/器官特异性人内皮细胞。在本发明方法的一些实施方式中，分化的内皮细胞是器官特异性内皮细胞，包括但不限于心脏，肾，睾丸，卵巢，视网膜，肝，胰腺，脑，肺，脾，大肠或小肠的内皮细胞。在其他实施方式中，分化的内皮细胞是来自肌肉，淋巴组织，嗅觉组织，成骨组织，口腔(牙齿)组织或腺体组织(例如，内分泌腺，胸腺)的组织特异性内皮细胞。

可以培养分化的内皮细胞以引发稳定的三维血管的形成。细胞可以在能够维持内皮细胞生长的任何培养基中培养，例如但不限于DMEM(高或低葡萄糖)、高级DMEM、DMEM/MCDB 201、Eagle基础培养基、Ham F10培养基(F10)、Ham F-12培养基(F12)、Hayflick培养基、Iscove改良Dulbecco培养基、间充质干细胞生长培养基(MSCGM)、DMEM/F12、RPMI 1640和CELL-GRO-FREE(Corning cellgro，Corning，NY)。培养基可以补充有一种或多种组分，包括例如胎牛血清，优选约2-15％(v/v)；马血清；人血清；胎牛血清；β-巯基乙醇，优选约0.001％(v/v)；一种或多种生长因子，例如血小板衍生生长因子(PDGF)、表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、白细胞抑制因子(LIF)和促红细胞生成素；氨基酸，包括L-缬氨酸；和一种或多种抗生素和/或抗真菌剂以单独或组合控制微生物污染，例如青霉素G、硫酸链霉素、两性霉素B、庆大霉素和制霉菌素。

在重编程之前，可以培养内皮细胞以扩增细胞数量。可以从初始样品中分离出足够数量的内皮细胞；然而，即使在初始样品中存在可接受数量的分化的内皮细胞，培养物中细胞的扩增也可以提供更大量的内皮细胞用于重编程。培养和扩增细胞的方法是本领域已知的。参见，例如，Helgason等人，Basic Cell Culture Protocols,第4版，Human PressPublishing，2013；和Mitry等人，Human Cell Culture Protocols,第3版，Human PressPublishing，2012。

可以通过分化的内皮细胞并入和表达外源ETV2编码核酸来“重编程”分化的内皮细胞。

根据本文公开的方法，通过表达外源ETV2转录因子蛋白，将内皮细胞“重编程”(导致去分化成更具塑性的状态)，其改变内皮细胞形成管状(管腔化)血管和其他血管结构的能力。

术语“ETV2”或“ETV2转录因子”在本文中可互换使用，是指RefSeq Gene ID 2116，NCBI参考序列号NC_000019中列出的人ETS转录因子变体2(ETV2(ER71，ETSRP71))，其编码具有NP 055024中所示氨基酸序列的DNA结合转录因子蛋白。本公开的ETV2核酸可包括ETV2DNA序列或其部分，以及其RNA转录物，如登录号：NM_001300974.1，NM_014209.3和NM_001304549.1中所述的RNA转录物。还考虑将ETV2的功能衍生物和同源物用于所公开的方法中。如本文所用，“功能衍生物”是具有执行ETV2的生物学功能的能力的分子。例如，如本文所公开的ETV2的功能衍生物是这样的分子，其能够结合DNA如ETV2转录因子并重编程分化的内皮细胞。功能衍生物包括来自天然、合成或重组来源(包括融合蛋白)的片段、变体、部分、部分、等同物、类似物、突变体、模拟物。“同源物”是通过从共同的祖先核酸序列传承的与ETV2转录因子相关的蛋白质。本文考虑的同源物包括但不限于源自不同物种(例如小鼠、大鼠和猴)的ETV2蛋白。

在本发明方法的一个具体实施方式中，存在于内皮细胞中的外源ETV2编码核酸是如SEQ ID NO：1中所示的人ETV2，其编码SEQ ID NO：2中所示的人ETV2转录因子蛋白。在一个实施方式中，存在于内皮细胞中的外源ETV2编码核酸是人ETV2核糖体核酸(RNA)转录物，其编码人ETV2转录因子蛋白。在其他实施方式中，提供给分化的内皮细胞的外源ETV2编码核酸是修饰的合成RNA。修饰的合成RNA分子可以通过本领域普通技术人员已知的方法产生，例如Machnicka,MA等人Nucleic Acids Res.(2013)41pp.D262-D267中所述的那些。用于本发明的示例性的修饰的合成分子包括调节稳定性(改变核酸酶抗性)或细胞摄取(例如，RNA多核苷酸与胆固醇、接头、脂质、聚合物、肽或适体的缀合)的RNA多核苷酸的化学修饰。

可以通过本领域普通技术人员熟知的方法将编码ETV2转录因子的核酸提供给细胞。例如，编码ETV2的核酸可以将ETV2核酸序列整合到内皮细胞基因组中，或者其是非整合性的，这意味着ETV2基因自染色体外的位置表达。在一些实施方式中，编码ETV2的核酸序列由载体提供，其中通过本领域已知的技术克隆核酸序列。载体可以通过任何合适的方法引入，例如通过转染或通过病毒介导的转导。

用于表达ETV2转录因子的载体包括，例如，逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺病毒相关病毒和一旦引入细胞即整合到受试者基因组内的染色体位置的其他载体，并且提供稳定、长期的ETV2表达。其他载体包括染色体外载体，以及非整合性的工程化慢病毒载体变体。在此，ETV2核苷酸序列可以克隆到载体序列中；载体在分化的内皮细胞中生长，并用于使用本文所述的方法重编程内皮细胞。

在一个实施方式中，ETV2核酸包含在慢病毒载体中，并通过慢病毒介导的转导提供给内皮细胞。在一个具体实施方式中，使用慢病毒载体将编码SEQ ID NO：1的ETV2的核酸转导到分化的内皮细胞中。在一个实施方式中，慢病毒载体是Lenti pgk-载体。在具体的实施方式中，通过用诱导型表达系统(例如反向tet-反式激活因子(rtTA)-多西环素诱导型表达系统)转导而将SEQ ID NO：1的编码外源ETV2的核酸提供给内皮细胞。

在其他实施方式中，ETV2核酸是递送至内皮细胞的RNA转录物。在某些具体的实施方式中，递送至细胞的ETV2 RNA是经修饰的合成RNA分子。将RNA分子引入细胞的方法是本领域普通技术人员所熟知的，并且在此可以使用这些方法。例如，ETV2 RNA转录物如mRNA转录物可通过转染递送至内皮细胞。在另一个非限制性实例中，通过电穿孔将ETV2 RNA转录物递送至细胞。

本发明方法包括在表达ETV2转录因子蛋白的条件下培养包括外源ETV2编码核酸的分化的内皮细胞。在某些实施方式中，ETV2蛋白组成型表达。在其他实施方式中，ETV2蛋白质瞬时表达，例如在诱导型启动子的控制下。在某些实施方式中，外源ETV2转录因子在内皮细胞中表达至少3周，至少4周，至少5周，至少6周，至少7周，至少8周，至少9周，至少10周，至少11周，至少12周或更长时间以诱导内皮细胞形成管腔化血管。在一个具体实施方式中，外源ETV2蛋白表达至少4周以诱导血管形成。在另一个实施方式中，外源ETV2蛋白表达至少3至4周以诱导腔形成。

在其他实施方式中，本发明方法包括在表达ETV2转录因子蛋白的条件下培养具有外源ETV2编码核酸的内皮细胞，然后在内皮细胞不表达外源ETV2的条件下的进一步培养一段时间。在此，内皮细胞可以首先在表达外源ETV2转录因子的条件下培养第一段时间，然后在不表达外源ETV2的条件下进行第二次培养，例如在不存在能够激活诱导型启动子的物质(例如多西环素、四环素)的情况下。在一个实施方式中，外源ETV2编码核酸是经修饰的合成RNA分子，其在培养期间导致瞬时ETV2转录因子表达。

在一些实施方式中，本发明方法包括在表达ETV2转录因子蛋白的条件下培养具有外源ETV2编码核酸的内皮细胞至少3周，至少4周，至少5周，至少6周，至少7周，至少8周，至少9周，至少10周，至少11周，至少12周或更长时间，然后在不表达外源ETV2的条件下(例如在不存在多西环素的情况下)进行第二次培养，持续数天、数周或数月时间。在一个具体实施方式中，将内皮细胞在表达外源ETV2转录因子蛋白的条件下培养至少3至4周，然后在不表达ETV2转录因子的条件下培养内皮细胞的时间范围是从7天至6个月，从7天至5个月，从7天至4个月，从7天至3个月，从7天至2个月，或从7天至1个月。无论在表达ETV2蛋白的条件下培养重编程内皮细胞的时间量如何，内皮细胞都将继续发展稳定的、功能性三维血管结构，例如血管，如图4A-4H中所示。

本发明方法包括在基质上培养含有外源ETV2编码核酸的内皮细胞。事实上，本公开鉴定了必需的细胞外基质组分，即层粘连蛋白、巢蛋白和胶原蛋白IV，当用于培养重编程内皮细胞时，其导致在体外和体内形成稳定的且功能性的三维人造血管，而无需使用周围细胞、灌注和笨重的支架。因此，在某些实施方式中，基质由细胞外基质组分例如层粘连蛋白、巢蛋白和/或胶原蛋白组成。

在一个实施方式中，用于本发明方法的基质可包括组合浓度为至少5mg/mL的层粘连蛋白和巢蛋白。由于层粘连蛋白和巢蛋白可彼此结合并形成复合物，因此用于本发明方法的基质可包括层粘连蛋白和巢蛋白的复合物。例如，基质可包含至少5mg/mL的层粘连蛋白和巢蛋白的复合物。在一个示例性实施方式中，表达ETV2的内皮细胞在包含组合浓度为5mg/mL的层粘连蛋白和巢蛋白的基质上培养。在具体的实施方式中，本发明方法中使用的基质由层粘连蛋白、巢蛋白和胶原蛋白IV的组合(L.E.C.)组成。例如，内皮细胞可以在含有至少5mg/mL的层粘连蛋白和巢蛋白以及至少0.2mg/mL胶原蛋白IV的基质上培养，以形成持久的、功能性的三维人造血管。在一个具体实施方式中，内皮细胞在由组合浓度为5.25mg/mL的层粘连蛋白和巢蛋白以及0.2mg/mL的胶原蛋白IV组成的基质上培养。在其他实施方式中，基质是Matrigel^TM(Corning)。

用于测定溶液或材料中物质(例如，分子和蛋白质，或其复合物)浓度的方法是本领域技术人员已知的。例如，分光光度法可用于确定样品中物质的浓度。

在本发明方法的一个实施方式中，将包含外源ETV2编码核酸的内皮细胞在无血清培养基中培养一段时间。在一些实施方式中，本发明方法包括在无血清培养基中培养内皮细胞至少7天，至少10天，至少2周，至少3周，至少4周，至少5周，至少6周，至少7周，至少8周或更长时间。

在其他实施方式中，本发明方法包括培养包括外源ETV2编码核酸的内皮细胞，其在低氧气分压下在无血清培养基中培养。在一些实施方式中，内皮细胞在低于大气氧气分压(即20％)的无血清培养基中培养。在具体的实施方式中，细胞在氧气分压为4％和15％，5％和10％，4％和8％或4％和6％之间的无血清培养基中培养。在一个实施方式中，细胞在无血清培养基中以5％的氧气分压培养。在一个具体实施方式中，本发明方法包括在无血清培养基中在5％氧气分压下培养包括外源ETV2编码载体的内皮细胞7天。

无论持续时间或特定培养条件如何，本发明方法包括在表达ETV2转录因子的条件下在基质上培养包含外源ETV2编码核酸的内皮细胞，以诱导形成管腔化的、稳定的、功能性的三维血管并将其分离。

“稳定”是指三维血管在延长的时间段内维持其结构和功能，例如，至少一个月，至少2个月，至少3个月，至少4个月，至少5个月，至少6个月或更长时间。稳定的三维血管是指具有完整管腔的内皮细胞的管状结构，显示适当的顶端-基底极性，并且维持管状(管腔化)结构至少一个月而不会塌陷、穿刺或离解，并且不使用支架、强制灌注或血管周围支持。

如本文所用的术语“功能性”是指稳定的三维血管可以进行通常由天然(内源性)血管进行的过程。例如，本公开的功能性血管可以将流体(例如血液)灌注到，吻合至其他血管(例如，毛细血管、静脉、动脉、小动脉、小静脉或淋巴管)或组织，在组织上自主地形成整合的成型(分支)血管网络，使得可以在不使用支架、强制灌注或血管周围支持的情况下将血液和/或流体供应到组织(“血管化”)。

如图2A-2B和3A-3M中所示，通过本发明方法产生的稳定的三维血管可以形成灌注流体的功能性血管(图2A)，并且当分离并植入受试者中时可以形成包括毛细血管和小动脉结构的三维血管网络(图3L-3M)。此外，如图3M中所示，通过将内源性周细胞整合到腔内血管中，植入的稳定的三维血管与周围组织吻合。另外，如图1E中所示，本公开的稳定的三维血管保持稳定和功能超过4个月(16周)。

因此，在一些实施方式中，本公开的稳定的三维血管稳定且保持功能至少2周，至少3周，至少4周，至少5周，至少6周，至少7周，至少8周，至少9周，至少10周，至少11周，至少12周，至少13周，至少14周，至少16周，至少17周，至少18周，至少19周，至少20周或更长时间。在一个具体实施方式中，通过本发明方法形成的三维血管稳定且保持功能至少一个月，或至少2个月。在其他实施方式中，通过本发明方法形成的三维血管稳定且保持功能至少3个月，至少4个月，至少5个月，至少6个月或更长。在一个实施方式中，通过本发明方法形成的三维血管稳定且保持功能4个月。

稳定的三维血管组合物和治疗方法用途

本文公开的培养方法允许可重复产生稳定的三维血管，其可用于若干目的，例如使类器官血管化和使受损组织治疗性血管化(组织再生)。本公开还揭示ETV2蛋白在分化的内皮细胞中的外源表达导致稳定的、功能性的三维血管的自主自组装，其具有在不存在周细胞、灌注和支架的情况下，在体外和体内形成功能性血管网络的能力。

因此，在另一方面，本公开提供了一种组合物，其含有能够自主形成三维血管网络的稳定的三维血管。

在某些实施方式中，本公开的稳定的三维血管包括管状结构(管腔)，例如由至少一个连续的重编程内皮细胞层组成的血管。在其他实施方式中，稳定的三维血管包括由至少2层重编程内皮细胞组成的腔。在另一个实施方式中，稳定的三维血管具有由至少一层重编程内皮细胞和至少一层其他细胞(例如分化的血管内皮细胞或非血管细胞)组成的腔。在其他实施方式中，稳定的三维血管由表达外源ETV2转录因子的重编程内皮细胞和不表达外源ETV2的内皮细胞的组合组成。

在某些实施方式中，稳定的三维血管的内皮细胞表达编码外源ETV2转录因子的核酸。在一个实施方式中，ETV2转录因子的表达是瞬时的，即一段有限的时间，例如数天、数周或数月的时间段。在具体的实施方式中，ETV2转录因子的瞬时表达通过诱导型表达系统调节，例如反向tet-反式激活因子(rtTA)-多西环素诱导型表达系统。在其他实施方式中，通过引入编码ETV2蛋白的修饰的合成RNA分子来调节ETV2转录因子的瞬时表达。在其他实施方式中，本公开的稳定的三维血管包含组成型(即，永久地)表达外源ETV2转录因子的内皮细胞。在其他实施方式中，稳定的三维血管由表达外源ETV2转录因子的内皮细胞和不表达外源ETV2的内皮细胞的组合组成。在另一个实施方式中，稳定的三维血管由不表达外源ETV2转录因子的重编程内皮细胞组成。

在一些实施方式中，本公开的稳定的三维血管是分离的血管。

当用于提及稳定的三维血管或重编程内皮细胞时，术语“分离的”是指血管或细胞已从其天然存在的环境或其形成的环境中移除，并且基本上不含其他分子或培养基。“基本上不含”是指分离的三维血管或分离的细胞占组合物或制剂的至少60％，70％，80％，90％或95％(以干重或体积计)。例如，分离的稳定的三维血管可以基本上不含培养基，即培养基占制剂体积的小于约20％，占制剂体积的小于约10％或占制剂体积的小于约5％。纯化水平可以基于预期用途。在某些非限制性实例中，可以从用于形成稳定的三维血管的细胞培养基以及添加到细胞培养基中的任何分子(例如，细胞因子、生长因子或氨基酸)中移除本公开的分离的稳定的三维血管。在另一个实例中，可以通过从用于形成重编程的内皮细胞的细胞培养基以及任何细胞培养添加剂中除去细胞来分离重编程的内皮细胞，但是至少一部分基质保留在分离的细胞中。

在一些实施方式中，分离的稳定的三维血管从其形成的环境(例如细胞培养物、生物反应器或受试者)全部或部分地移除。在某些实施方式中，分离的稳定的三维血管不含培养基、培养基组分和添加剂，以及其形成所位于的任何基质，例如Matrigel^TM或L.E.C基质。在其他实施方式中，本公开的分离的稳定的三维血管已从培养基、培养基组分和添加剂中除去，但包括至少一部分基质，例如Matrigel^TM或L.E.C基质。在本公开的一个实施方式中，稳定的三维血管是功能性的。在特定实施例中，功能性的、稳定的三维血管能够使流体通过(灌注)管腔化血管。在一个实施方式中，功能性的、稳定的三维血管能够使血液通过血管。在又一个实施方式中，功能性的、稳定的三维血管能够形成三维血管网络。在一些实施方式中，三维血管网络包括组织上的整合成型的血管网络，使得血液和/或流体可被供应至组织(“血管化”)而无需使用支架、强制灌注或血管周围支持。在具体的实施方式中，三维血管网络由稳定的三维血管和至少一个毛细血管，至少一个小动脉，至少一个小静脉，至少一个淋巴血管或其组合自主形成。

在一些实施方式中，本公开的功能化的、稳定的三维血管保持功能至少1个月，至少2个月，至少3个月，至少4个月，至少5个月或更长时间。在具体的实施方式中，本公开的稳定的三维血管稳定且保持功能4周，5周，6周，7周，8周，9周，10周，11周，12周，13周，14周，15周，16周，17周，18周，19周，20周或更长时间。在一个实施方式中，本公开的三维血管稳定至少4个月(16周)，如图1E中所示。

促进血管化的方法

由于本公开的图3L和3M显示通过培养包括外源ETV2的内皮细胞形成的稳定的三维血管自主地组织成成型的、持久的血管网络，其能够在植入后使内源组织血管化，因此本公开的稳定的三维血管还可用于促进受试者中受损组织的血管化。

因此，在另一方面，提供了一种用于促进受试者中血管化的方法，其包括向受试者施用稳定的三维血管。例如，本申请的三维血管可治疗性地用于缺血组织的修复、血管和心脏瓣膜的形成、受损血管的修复、以及诱导工程组织中的血管形成(例如，在移植之前)。在一些实施方式中，受试者具有受损组织，例如需要血管化的器官。

该方法包括向需要这种治疗的人类受试者施用含有本公开的三维血管的组合物，以促进此组织中的血管化。促进组织中的血管化(血管生成)对于已经具有或有风险发展为包括缺血性病症在内的病症的受试者可能是有益的，所述病症例如心肌梗塞、充血性心力衰竭和外周血管阻塞性疾病、中风、再灌注损伤、肢体缺血；神经病(例如，周围神经病或糖尿病性神经病)、器官衰竭(例如，肝衰竭、肾衰竭等)、糖尿病、类风湿性关节炎和骨质疏松症。

需要血管化的组织可以是心脏组织、肝组织、胰腺组织、肾组织、肌肉组织、神经组织、骨组织等，其可以是以过量细胞死亡为特征并因此而受损伤的组织、有受损伤风险的组织、或人工设计的组织。在具体的实施方式中，受试者具有受伤的心脏组织、受损的肝组织、受损的淋巴组织、受损的肾组织、受损的睾丸组织、受损的卵巢组织、受损的视网膜、受损的胰腺组织、受损的脑组织、受损的肺组织、受损的肠组织、受损的腺体组织、受损的肌肉组织、或其组合。

本发明方法包括以导致血管递送至需要修复或血管化的组织或附近的方式将稳定的三维血管施用于受试者。在一些情况下，稳定的三维血管局部施用，例如直接递送(通过注射、植入或任何合适的方式)到需要血管化的组织或附近组织中。在一个实施方式中，通过手术植入将稳定的三维血管施用于需要血管化的受试者的受损组织。在具体实施方式中，将稳定的三维血管直接植入受损器官或其组织上。在其他实施方式中，本发明方法包括通过注射向受试者施用稳定的三维血管，例如直接注射到受损组织。在某些实施方式中，通过静脉内注射、腹膜内注射、肌内注射、皮下注射或其组合向受试者施用稳定的三维血管。

在一个实施方式中，稳定的三维血管与基质一起施用，例如在细胞外基质组分的悬浮液中。在具体的实施方式中，稳定的三维血管在基质上施用，所述基质包括层粘连蛋白、巢蛋白和胶原蛋白IV的组合(L.E.C.)。在一个实施方式中，基质可包括组合浓度为至少5mg/mL的层粘连蛋白和巢蛋白。在一个示例性实施方式中，血管与包含组合浓度为5mg/mL的层粘连蛋白和巢蛋白的基质一起施用。由于层粘连蛋白和巢蛋白可彼此结合并形成复合物，因此基质可包括层粘连蛋白和巢蛋白的复合物。例如，基质可包含至少5mg/mL的层粘连蛋白和巢蛋白的复合物。例如，血管与含有浓度为至少5mg/mL的层粘连蛋白和巢蛋白的复合物以及至少0.2mg/mL胶原蛋白IV的基质一起施用。在一个具体实施方式中，基质由组合浓度为5.25mg/mL的层粘连蛋白和巢蛋白以及0.2mg/mL的胶原蛋白IV组成。在其他实施方式中，基质是Matrigel^TM(Corning)。

在一些实施方式中，在受试者中促进血管化的方法包括向受试者施用至少一种体外已形成的稳定的三维血管。在其他实施方式中，该方法包括施用已在体外形成的本公开的2种或更多种稳定的三维血管。

无论施用途径如何，一旦将稳定的三维血管施用于受试者，功能性的稳定的三维血管即建立能够使受损组织血管化的三维血管网络。例如，稳定的三维血管可以形成三维血管网络，其包括能够运输血液到受损组织的至少一个毛细血管，至少一个小动脉，至少一个小静脉，至少一个淋巴血管或其组合。

本公开还揭示了当伴随某些细胞外基质组分注射入受试者中时，表达外源ETV2转录因子的分化的内皮细胞可以自主地形成稳定的三维血管。

因此，本公开的另一方面提供了通过将基质上的多个重编程内皮细胞施用于组织或器官来促进血管化的方法。例如，本发明方法包括施用本文所述基质上的多种重编程内皮细胞，所述内皮细胞包括编码外源ETV2转录因子的核酸。

在一些实施方式中，重编程内皮细胞和基质可以直接施用于需要血管化的受试者。此处，重编程内皮细胞和基质可通过腹膜内注射、肌内注射、皮下注射、手术植入或其组合直接递送至受损组织。

使类器官或脱细胞器官血管化的方法

在本公开的另一方面，提供了一种用于使类器官血管化的方法。在此，该方法包括在内皮细胞中表达外源ETV2蛋白的条件下，在基质上将类器官与包含编码ETV2转录因子的外源核酸的内皮细胞一起培养，以在类器官上形成稳定的三维血管网络。

在一些实施方式中，用于使类器官血管化的方法包括在基质上将类器官与重编程内皮细胞一起培养。用于本发明方法的基质可包括组合浓度为至少5mg/mL的层粘连蛋白和巢蛋白。由于层粘连蛋白和巢蛋白可彼此结合并形成复合物，因此用于本发明方法的基质可包括层粘连蛋白和巢蛋白的复合物。例如，基质可包含至少5mg/mL的层粘连蛋白和巢蛋白的复合物。在一个示例性实施方式中，重编程内皮细胞在包含组合浓度为5mg/mL的层粘连蛋白和巢蛋白的基质上培养。在具体的实施方式中，本发明方法中使用的基质由层粘连蛋白、巢蛋白和胶原蛋白IV的组合(L.E.C.)组成。例如，内皮细胞和类器官可以在含有至少5mg/mL层粘连蛋白和巢蛋白以及至少0.2mg/mL胶原蛋白IV的基质上培养，以在类器官上形成持久的、功能性的三维人造血管。在一个具体实施方式中，基质由组合浓度为5.25mg/mL的层粘连蛋白和巢蛋白以及0.2mg/mL的胶原蛋白IV组成。在其他实施方式中，基质是Matrigel^TM(Corning)。

内皮细胞和类器官可以在能够维持内皮细胞生长和发育的任何培养基中培养，所述培养基例如但不限于DMEM(高或低葡萄糖)，高级DMEM，DMEM/MCDB 201，Eagle基础培养基，Ham F10培养基(F10)，Ham F-12培养基(F12)，Hayflick培养基，Iscove改良Dulbecco培养基，间充质干细胞生长培养基(MSCGM)，DMEM/F12，RPMI 1640和CELL-GRO-FREE(Corningcellgro，Corning，NY)。培养基可以补充有一种或多种组分，包括例如胎牛血清，优选约2-15％(v/v)；马血清；人血清；胎牛血清；β-巯基乙醇，优选约0.001％(v/v)；一种或多种生长因子，例如血小板衍生生长因子(PDGF)，表皮生长因子(EGF)，成纤维细胞生长因子(FGF)，血管内皮生长因子(VEGF)，胰岛素样生长因子-1(IGF-1)，白细胞抑制因子(LIF)和促红细胞生成素；氨基酸，包括L-缬氨酸；和一种或多种抗生素和/或抗真菌剂以单独或组合控制微生物污染，例如青霉素G，硫酸链霉素，两性霉素B，庆大霉素和制霉菌素。

在一个实施方式中，使类器官血管化的方法包括在包含成纤维细胞生长因子(FGF)的培养基中，在基质上将类器官与内皮细胞一起培养。在一个具体实施方式中，培养基包括碱性成纤维细胞生长因子(FGF2)。在一些实施方式中，培养基包括肝素。在一个具体实施方式中，使类器官血管化的方法包括在含有FGF2和肝素的培养基中，在基质上将类器官与内皮细胞一起培养。

可以将类器官与包含编码ETV2转录因子的外源核酸的内皮细胞，在内皮细胞中表达外源ETV2蛋白的条件下，在基质上培养所需的时间长度，以诱导在类器官上形成功能性的、管腔化的三维血管网络(即使类器官血管化)。在将类器官与重编程内皮细胞一起培养期间，将形成功能性血管网络，其包括至少一个毛细血管，至少一个小动脉，至少一个小静脉，至少一个淋巴血管或其组合，其能够在整个类器官中输送血液。例如，在某些实施方式中，将器官和内皮细胞一起培养至少一周(7天)，至少10天，至少2周，至少3周，至少4周，至少5周，至少6周，至少7周，至少8周或更长时间，以诱导内皮细胞组织成类器官上的成型的、持久的血管。

用于使类器官血管化的本发明方法可以应用于任何类型的类器官。例如，用于本发明方法的类器官可以是小肠类器官、结肠类器官、肾脏类器官、心脏类器官、或肿瘤类器官。在一些实施方式中，所述方法可用于使肿瘤类器官血管化，其中肿瘤类器官可以是组织特异性的，例如乳腺癌类器官、结肠癌类器官、肾癌类器官、或肠癌类器官。

本领域普通技术人员可以将本公开的血管化的类器官用于多种目的。因此，在一些实施方式中，用于使类器官血管化的本发明方法包括分离血管化的类器官。

一旦获得血管化的类器官，即可以将血管化的类器官施用于受试者，例如人或动物(例如，小鼠、大鼠、狗、猴)。在具体的实施方式中，血管化的类器官可以通过手术植入施用于人类受试者。

在其他实施方式中，分离的血管化的类器官可用于确定治疗剂的功效。在此，使血管化的类器官与治疗剂接触，并在治疗剂的存在下培养一段时间。然后可以分析类器官功能、细胞生长和健康以确定治疗剂的功效。

可用于本发明方法的治疗剂的实例包括但不限于抗炎药、抗血管生成分子、抗体、细胞毒性药物、其他毒素、放射性核素、免疫细胞调节剂、小分子、外来体和基因表达产物。例如，可以将化学治疗剂施用于血管化的类器官(即肿瘤类器官)以确定化学治疗剂的抗肿瘤活性(功效)。

本公开还揭示了在细胞中表达外源ETV2蛋白的条件下，将脱细胞器官与包含编码ETV2转录因子的外源核酸的内皮细胞一起培养会导致脱细胞器官上功能性血管结构的发展。

因此，本公开的另一方面提供了用于使脱细胞器官再血管化的方法。使脱细胞器官再血管化的方法包括，在基质上将脱细胞器官与内皮细胞一起培养一段时间，该时间足以在脱细胞器官上形成功能性三维血管网络。在将脱细胞器官与重编程内皮细胞一起培养期间，将形成功能性血管网络，其包括能够在整个类器官输送血液的至少一个毛细血管，至少一个小动脉，至少一个小静脉，至少一个淋巴血管或其组合。例如，在某些实施方式中，将脱细胞器官和内皮细胞培养至少一周(7天)，至少10天，至少2周，至少3周，至少4周，至少5周，至少6周，至少7周，至少8周或更长时间，以诱导内皮细胞在脱细胞器官上组织成成型的、持久的血管，随后形成使脱细胞器官再血管化的功能性血管网络。

在一些实施方式中，用于使脱细胞器官再血管化的方法包括在生物反应器中，在表达外源ETV2蛋白的条件下，在基质上将脱细胞器官与内皮细胞一起培养。用于本发明方法的基质可包括组合浓度为至少5mg/mL的层粘连蛋白和巢蛋白。例如，基质可包含至少5mg/mL的层粘连蛋白和巢蛋白的复合物。在一个示例性实施方式中，基质包括组合浓度为5mg/mL的层粘连蛋白和巢蛋白。在具体的实施方式中，本发明方法中使用的基质由层粘连蛋白、巢蛋白和胶原蛋白IV的组合(L.E.C.)组成。例如，该方法包括在含有至少5mg/mL层粘连蛋白和巢蛋白以及至少0.2mg/mL胶原蛋白IV的基质上培养，以形成持久的、功能性的三维人造血管。在一个具体实施方式中，基质含有组合浓度为5.25mg/mL的层粘连蛋白和巢蛋白以及0.2mg/mL的胶原蛋白IV。在其他实施方式中，基质是Matrigel^TM(Corning)。

本发明方法可以应用于任何类型的脱细胞器官。例如，可以在脱细胞器官上表达外源ETV2蛋白的条件下培养内皮细胞，所述脱细胞器官例如脱细胞的心脏，肾，睾丸，卵巢，视网膜，骨，内分泌腺，甲状腺，气管，淋巴结，肝，胰腺，脑，肺，脾，大肠或小肠。

本领域普通技术人员可以将本公开的再血管化的器官用于多种目的。因此，在一些实施方式中，用于使脱细胞器官再血管化的本发明方法包括分离再血管化的器官。

在一个示例性实施方式中，可以获得再血管化的器官，然后将其施用于受试者，例如人或动物(例如，小鼠、大鼠、狗、猴)。在具体的实施方式中，分离血管化的类器官并将其通过手术植入施用于受试者。

在其他实施方式中，分离的再血管化的器官可用于确定治疗剂的功效。在此，使再血管化的器官与治疗剂接触，并在治疗剂的存在下培养一段时间。然后可以分析再血管化的器官功能、细胞生长和器官健康以确定治疗剂的功效。

实施例

通过以下实施例进一步说明本说明书，以下实施例不应被解释为以任何方式进行限制。所有引用的参考文献(包括整个本申请中引用的参考文献、授权专利和公开的专利申请)的内容在此通过引用明确并入。

实施例1：材料和方法

细胞培养.使用基于胶原酶的消化方法在实验室中分离人脐静脉内皮细胞(HUVEC)和人脂肪组织内皮细胞，如Ginsberg,M.等人Cell(2012)151,559-575中所述，其全部内容通过引用并入本文。然后将分离的内皮细胞培养在涂有0.2％明胶的组织培养皿中，其生长在完全培养基中(400ml M199，100ml热灭活的FBS，7.5ml Hepes，5ml抗生素，5ml谷氨酰胺，5ml脂质混合物，和1/2瓶内皮细胞生长补充剂(Alpha Aesar)。传代后用Lentipgk-ETV2或空的慢病毒载体转导细胞。必要时，施用pgk-mCherry或pgk-GFP慢病毒标记细胞。使用细胞消化液将细胞分成1：2并在凝胶化的平板上传代。必要时，将细胞冷冻以用于未来的实验。总体而言，超过10批不同的HUVEC用于实验。用于管形成测定的内皮细胞是通道5-10。

通过机械破碎，然后胶原酶消化30分钟来分离人脂肪来源的内皮细胞。将粗制细胞群接种在塑料皿上并扩增5至7天后，然后分选细胞以纯化VE-钙粘蛋白⁺CD31⁺内皮细胞并如上所述进行扩增。

管形成测定.在培养箱中将24孔板用250-300μl Matrigel^TM(Corning)包被30分钟。同时，消化具有或不具有ETV2的细胞并计数。然后将细胞重悬于补充有敲除血清和细胞因子(10ng/ml FGF-2,10ng/ml IGF1，20ng/ml EGF，20ng/ml SCF，10ng/ml IL6)(Peprotech)的StemSpan(Stem Cell Technologies)中。然后将具有或不具有ETV2的100,000个细胞分散在每个孔中。将板在5％氧气下孵育以进行剩余的实验。对于基于层粘连蛋白/巢蛋白/胶原蛋白IV(L.E.C)的实验，将高浓度(即15mg/mL)的层粘连蛋白和巢蛋白(Corning)与不同量的胶原蛋白IV(Corning)在磷酸盐缓冲溶液(PBS)中混合。用于管腔形成的L.E.C.的最有效的浓度包括由200μl(15mg/mL)层粘连蛋白/巢蛋白复合物和100μl胶原蛋白IV制备的，由5.25mg/mL层粘连蛋白/巢蛋白复合物和2.0mg/mL胶原蛋白IV组成的最终基质。在24小时至16周的过程中测量血管密度。用倒置显微镜以4倍放大率针对每种条件和时间点在每个孔的四个不同随机区域中捕获图像。然后使用ImageJ追踪分析所有图像的血管密度。对于用ETS1或myrAKT1转导的细胞使用相同的方法。

体外管染色.在8至12周时，从孔中去除所有培养基。将管用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤一次，然后在室温下固定30分钟，再次用PBS洗涤并在室温下置于封闭缓冲液中1小时。然后用VECAD(R&D)，层粘连蛋白(abcam)，胶原蛋白IV(abcam)和/或Podocylaxin(R&D)对管进行染色。第二天，将管再次在PBS中洗涤，在第二抗体中孵育3小时，并用DAPI复染。所有图像均通过Zeiss 710共聚焦显微镜获得。

电子显微镜.用无血清培养基或磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤组织，然后用改良的Karmovsky固定液固定(2.5％戊二醛、4％多聚甲醛和0.02％苦味酸于0.1M二甲胂酸钠缓冲液中，pH7.2)。在1％四氧化锇中进行二次固定后，将1.5％铁氰化钾样品通过分级乙醇系列脱水，并包埋在Epon模拟树脂中。使用Diatome金刚石刀(Diatome，USA，Hatfield，PA)在Leica Ultracut S超微切片机(Leica，Vienna，Austria)上切割超薄切片。在铜网格上收集切片并进一步用铅衬比，并在100kV下操作的JVD 1400电子显微镜(JEOL，USA，Inc.，Peabody，MA)上观察。用Veleta 2K x2K数码相机(Olympus-SIS，德国)记录图像。

用于评估三维血管灌注能力的珠流.每个装置由两层聚二甲基硅氧烷(PDMS；Sylgard 184；Dow-Corning)形成，它们由硅晶片母模铸成。用等离子蚀刻器(PlasmaEtch)对装置进行等离子体处理，随后用三甲氧基硅烷(Sigma)处理过夜。在使用之前，将装置用MiliQ H₂O洗涤过夜。用两个400μm针灸针(Hwato)将300万重编程内皮细胞(R-VEC)或对照非转导内皮细胞(CTRL-EC)在2.5mg/mL牛纤维蛋白原(Sigma)和3U/ml牛凝血酶(Sigma)中的混合物注入装置中。在细胞和凝胶混合物聚合后，将针拉出，形成两个中空通道。将ETV2转导(重编程内皮细胞)和未转导(对照)内皮细胞分别接种到中空通道中，以在第二天形成两个母体血管。将细胞在内皮细胞生长培养基2(Promocell)中培养并每天更新直至第6天。在第6天，将装置连接至注射泵(Harvard Apparatus)并将4μm红色荧光微球(Invitrogen)注射至其中一个母体血管中，每个装置中为50μL/min。采用装有Andor Zyla sCMOS 5.5MP相机(Andor)的Nikon Eclipse TiE(Nikon)以50ms间隔对装置中流动的荧光珠进行延时拍摄。使用ImageJ软件将荧光珠的延时拍摄图像堆叠在一起，并叠加HUVEC血管。

示例性血管的体内评估.用慢病毒空载体或lenti-ETV2载体转导人脐静脉来源的内皮细胞(HUVEC)和人脂肪来源的人内皮细胞，并用GFP或mCherry荧光标记物(200万个细胞/栓塞)标记，将其皮下注射到雄性或雌性8-12周龄SCID-BEIGE小鼠(Taconic)中。首先将细胞重悬于PBS(50μl)中，然后如上所述与Matrigel^TM或L.E.C基质混合(350μl)。细胞/基质悬浮液还包括FGF-2(10ng/ml)，VEGF-A(20ng/ml)和肝素(100ng/ml)。每只小鼠接受两个栓塞，一个针对对照细胞，一个针对表达ETV2的细胞。在1周、1个月、2个月或5个月时，给小鼠注射与Alexa-647(在100μl PBS中25μg)缀合的VECAD(克隆BV9-Biolegend)，其仅检测人内皮细胞，以评估ETV2表达(重编程的，R-VEC)和非ETV2表达(对照)的人内皮细胞的灌注和吻合潜能。使用包含盖玻片底部的池直接在Zeiss 710共聚焦显微镜上拍摄整个装载图像。将栓塞在4％PFA中固定过夜，然后在乙醇中脱水或置于蔗糖中进行进一步的免疫染色。将脱水的栓塞切片并用H&E染色。如下所述处理切片用于免疫染色。当ETS1和/或myrAKT1表达细胞植入1个月时，遵循相同的程序。

组织切片的免疫染色.将预先固定在4％PFA中并在蔗糖中处理的冷冻切片(20μM)用PBS洗涤一次。然后将载玻片在封闭缓冲液中在室温下孵育30分钟，并在4℃下在第一抗体(1：500)中孵育过夜。第二天，将载玻片在室温下洗涤3次，持续10分钟，然后在荧光缀合的第二抗体中孵育3小时。最后，将载玻片洗涤3次，持续10分钟，并用DAPI复染。将切片用盖玻片封固，并进一步用于使用共聚焦显微镜拍摄图像。对于基质染色，使用检测小鼠血管周围细胞的PDGFRβ抗体(1：500，Biolegend)。自每个栓塞的不同部分的切片拍摄了若干图像。对于每个条件和时间点，获得来自不同载玻片的至少12个图像。使用ImageJ处理图像，并通过使用ImageJ软件中的阈值特征量化每个图像区域的血管面积百分比。

预先形成的稳定的三维人造血管的移植.通过除去培养基并用200μl Matrigel^TM或L.E.C覆盖来分离如上所述在Matrigel^TM或L.E.C.基质上形成的8-12周龄的人造血管。在30分钟内，将胶凝栓塞皮下施用于SCID-BEIGE小鼠。将整个栓塞通过外科手术插入通过皮下切口形成的口袋中并缝合闭合。两周后，给小鼠注射人VECAD的活体抗体，以检测吻合灌注血管的形成。

肠组织收获和器官脱细胞化.从重量为250g至350g的Sprague Dawley大鼠收获肠。简言之，在无菌条件下进行中线剖腹手术并暴露肠道。分离出5cm长的肠段，保留灌注孤立节段的肠系膜动脉和肠系膜静脉。两个血管用26G插管进行插管，使用带四分之一英寸倒钩的连接器对肠腔进行插管。通过使用蠕动泵(iPump)以1ml/min灌注脉管系统和管腔来使分离的肠段脱细胞。脱细胞化过程由灌注milliQ水24小时，脱氧胆酸钠(Sigma)4小时和脱氧核糖核酸酶I(Sigma)3小时组成。将脱细胞的肠在使用前用γ射线灭菌。

生物反应器培养.用500万个GFP⁺ETV2⁺人内皮细胞(表达外源ETV2的重编程EC)或500万个GFP⁺对照内皮细胞(CTRL-EC)接种脱细胞化的肠。通过肠系膜动脉和肠系膜静脉接种细胞。在无菌条件下将接种的肠安装在生物反应器内。24小时后，使用蠕动泵(iPump)以1ml/min的速度通过肠系膜动脉开始灌注。细胞在前5天在M199/EBSS(HyClone)中生长，其补充有20％热灭活的FBS，1％Pen-Strep，1.5％HEPES(Corning)，1％Glutamax^TM(Gibco)，1％脂质混合物(Gibco)，1％肝素(Sigma)和15μg/ml内皮细胞生长补充剂(Merck)，然后细胞在补充有1.1％敲除血清(Thermo)，1％Pen-Strep，1％Glutamax，10ng/ml FGF(Peprotech)，20ng/ml EGF(Invitrogen)，10ng/ml IGF2(Peprotech)，20ng/ml SCF(Peprotech)和10ng/ml IL6(Peprotech)的StemSpan(Stemcell Technologies)中生长2天。7天后，在无菌条件下收获再内皮化的肠，切下5×7mm的片段用于植入。然后将剩余的肠组织固定在4％多聚甲醛中，封固并准备用于通过荧光显微镜成像。为了评估血管的开放性，将一些再内皮化的肠用荧光标记的LDL或抗人PECAM(CD31)抗体进行活体内灌注。

异位移植物植入.将年龄在8和12周之间的免疫受损的NOD-SCID-γ(NSG)小鼠用2-5％异氟烷-氧气混合物麻醉。在诱导镇痛时施用丁丙诺啡0.1mg/Kg。在无菌条件下进行中线剖腹手术。将胃自切口外化，并将网膜从大弯伸展。然后将一段工程肠包封在网膜中，使用8/0缝合线以确保网膜包封物的封闭。将胃和网膜放回腹部，并使用6/0缝线闭合剖腹手术。允许动物在手术后立即正常进食和饮水，并且在术后期间不再施用药物。在1周或4周后，向小鼠静脉内注射荧光标记的抗VECAD或荧光标记的同工凝集素，并将其安乐死。将移植物与网膜包封物一起取出并固定在4％多聚甲醛中，封固并准备用于通过荧光显微镜成像。

功能性血管灌注、吻合、大小、形状和密度的分析.内皮再血管化的体外定量在5x510x视野区域上进行。使用ImageJ软件通过设定阈值并量化CD31信号相对于肠区域所覆盖的区域来处理图像。对采用评估3x3 20x视野面积的共聚焦显微镜(Zeiss LSM710)获得的图像进行GCR和VE-钙粘蛋白阳性细胞的体内定量。使用Angiotool软件(NationalCancer Institute)进行血管参数的评估。

器官分离和培养.分离并维持小鼠小肠类器官，如先前O’Rourke,K.P.,等人BioProtoc.(2016)6中所述，其全部内容在此通过引用并入。分离人结肠隐窝和腺瘤；进行类器官培养物的培养和维持，如先前Sugimoto,S.&Sato,T.Methods Mol Biol(2017)1612,97-105中所述，其全部内容在此通过引用并入。收集正常组织和腺瘤组织。简言之，培养物生长在含有Wnt3a，R-spondin-3和Noggin连同10mM烟酰胺(Sigma-Aldrich)的无血清培养基中，并在Matrigel^TM(Corning)中繁殖。通过在补充有10μM M27632(Tocris Bioscience)的TrypLE Select(Thermofisher)中消化，每7天传代一次类器官。

类器官与重编程的人内皮细胞共培养.将MCherry ETV2或对照(CTRL)EC(最终浓度为4百万个细胞/ml)与小鼠小肠类器官、正常人结肠或患者来源的肿瘤类器官在24孔板中的75μl Matrigel^TM泡中或载玻片小室中的40μl Matrigel^TM中的混合(正常类器官以1：2传代，肿瘤类器官以1：3传代)，并在添加FGF-2(10ng/ml)和肝素(100ng/ml)的类器官培养基中培养。在第24小时、第4天、第5天和第7天自活培养物拍摄图像。在第8天将共培养物固定并用角蛋白20(KRT20)、EdU和/或EpCam整体染色。

RNA文库制备和序列数据处理.每个样品分离至少100ng总RNA(TRIzol LS的苯酚-氯仿分离)，并使用Qiagen的RNeasy Mini Kit纯化。使用Agilent Technologies 2100生物分析仪验证RNA质量。使用Illumina TruSeq RNA文库制备试剂盒v2(非链和聚腺苷酸选择)制备并复用RNA文库制备物，并使用10nM cDNA作为输入，通过产生51碱基配对末端读数的Illumina的HiSeq 2500进行高通量测序。对测序读数进行解复用(bcl2fastq)，并将高质量读数映射(TopHat2；Bowtie2)至为HUVEC样品构建的UCSC hg19基因组和为小鼠EC构建的UCSC mm10基因组的转录组序列参考。对于基因丰度测量(FPKM值)，将映射读数组装成转录本并定量(Cufflinks)。滤出FPKM<1的基因，并使用碱基-2log转换的FPKM值绘制MDS、火山图和热图。使用DAVID Bioinformatics Resource Tools进行基因本体分析。基于超几何分布曲线的累积分布函数(CDF)计算维恩图内显示的P值。

ChIP和抗体.每次实验用约1x10⁷个细胞进行ChIP测定。简言之，将细胞在1％多聚甲醛(PFA)中于37℃下交联10分钟，然后用0.125M甘氨酸淬灭。使用Bioruptor(Diagenode)剪切染色质以产生200-400个碱基对的片段，将其与2-5mg与75ml Dynabeads M-280(Invitrogen)结合的抗体一起孵育，并在4℃下温育过夜。洗涤磁珠并洗脱染色质。对ChIPDNA进行反向交联和柱纯化。使用以下抗体进行ChIP：Flag(Sigma F1804)；H3K4me3(Abcamab8580)；和H3K27ac(Abcam ab4729)。使用QIAGEN RNeasy试剂盒分离RNA。用IlluminaTruSeq RNA样品制备试剂盒制备RNA-seq文库。用Illumina TruSeq DNA样品制备试剂盒制备ChIP-seq文库。用Illumina HiSeq 4000系统对RNA-seq和ChIP-seq文库进行测序。

使用BWA比对软件(版本0.5.9)将ChIP-seq读数与参考人类基因组(hg19，GenomeReference Consortium GRCh37)比对。映射到单个最佳匹配位置的唯一读数具有不超过4％的错配读取长度，将其用于峰识别和配置文件生成。通过标准化至1百万个读数，用IGV显示序列数据。将软件MACS2应用于ChIP-seq数据，其中来自输入DNA的测序数据作为对照以鉴定ETV2或特定组蛋白修饰的基因组富集(峰)。对于ETV2，通过p值<0.05过滤得到的峰，对于K4me3或K27ac修饰，通过p值<0.01过滤得到的峰。通过HOMER按各启动子计算读数。通过HOMER将每个鉴定的峰注释至启动子(自转录起始位点±2kb)、基因体或基因间区域。

实施例2.外源ETV2在内皮细胞中的瞬时表达在体外形成持久且稳定的三维人造血管本研究表明，在分化的内皮细胞中瞬时诱导ETV2将重编程内皮细胞，以获得增强的针对非血管细胞的细胞亲和力，以及发展耐久性和成型可塑性以在体外和体内形成稳定的三维人造血管。为了确定ETV2转录因子表达是否改变血管形成，将采用ETV2转导的内皮细胞进行单细胞FACS分选并长成克隆。内皮细胞中的外源ETV2表达始终导致分支的新生血管网络的形成，这些血管网络具有人造血管的通常定位于细胞外基质表面的有组织的耐久几何型式。

通过免疫染色和蛋白质印迹分析，在形成典型平面单层鹅卵石的平坦内皮细胞和三维(3D)管中，评估使用慢病毒载体给予的ETV2。参见图1A-1C。培养7天以上，在5％氧气分压(常氧)的无血清条件下，表达外源ETV2(R-VEC)的人脐静脉内皮细胞或成体脂肪来源的内皮细胞在形成功能性3D人造血管方面明显更好，与不包括外源ETV2的对照内皮细胞相比，表现出高于50倍的血管形成增加，如图1D-1F中所示。值得注意的是，形成的三维人造血管能够在体外维持超过16周，如图1E中所示。

为了确定分化的内皮细胞自组装成管腔化的、稳定的3D人造血管的能力是否是其他ETS家族转录因子管的特征，用另一种ETS转录因子ETS1转导分化的内皮细胞。此外，为了检查ETV2是否通过增加细胞存活而赋予内皮细胞血管生成功能，用组成型活性的豆蔻酰化-AKT1(myrAKT1)转导内皮细胞。如图1G中所示，ETS1和myrAKT1的表达均不能像ETV2那样使分化的内皮细胞形成稳定的3D人造血管。因此，已经显示外源ETV2在分化的人内皮细胞中的表达使细胞重编程并使EC具有自组装成稳定的3D血管的能力，而不受用于形成人造血管的现有方法所需的人造支架、周细胞覆盖、强制灌注或剪切应力的限制。

人造3D血管功能需要适当的管腔形成。如图1H中所示，共聚焦显微镜显示在本公开的稳定3D人造血管中存在连续不间断的管腔。该血管表现出适当的极化，其中在顶侧表达足糖萼蛋白且在基底侧表达层粘连蛋白(图1I)。此外，如图1J中所示，在血管形成后的第8-12周，人造3D血管自主地形成具有明显的腔和紧密连接的分支成型血管。因此，本公开的稳定的三维血管经管腔化并显示出适当的顶端-基底极性。

当前用于体外血管成型和类器官形成的方法需要使用细胞外基质的粗制剂，例如Matrigel^TM。Matrigel^TM含有许多经消化的基质成分，因此难以确定是否需要特定成分用于血管形成或它们与类器官细胞成分的相互作用。通过血管细胞外基质的多种组合进行筛选，本文已经确定允许本公开的稳定3D血管的自组装的基质组分层粘连蛋白、巢蛋白和胶原蛋白IV(L.E.C)的精确化学计量。值得注意的是，如图1K中所示，当使用L.E.C作为基质时，对照幼稚人内皮细胞不形成血管网络。此外，如图1L中所示，8周后在L.E.C和Matrigel^TM上形成的血管表现出相似的血管密度和分支。电子显微镜观察证实了在L.E.C上形成的血管中存在管腔。参见图1M。总之，ETV2在分化的内皮细胞中的外源表达在包括至少层粘连蛋白、巢蛋白和胶原蛋白IV的基质上形成稳定的三维人造血管。

为测试R-VEC血管灌注和维持层流的能力，将荧光标记的对照-EC(CTRL-EC)或包含编码ETV2的外源核酸的内皮细胞(R-VEC)平行接种于微流体装置。如图2A中所示，接种后，表达外源ETV2的内皮细胞组织并自组装成管腔化血管，而对照细胞未能产生血管。一旦建立了人造血管的血管网络，将mCherry标记珠(4μM)循环通过该装置的一个通道，以确定本公开的稳定的三维人造血管是否可以维持层流。如图2A中所示，由表达外源ETV2的内皮细胞形成的稳定的三维人造血管耐受珠子穿过通道的流动。相反，珠子未流动穿过包括对照非ETV2转导的内皮细胞(CTRL-EC)的通道。进一步如图2B中所示，与含有CTRL-EC的那些相比，由表达外源ETV2的内皮细胞形成的人造血管中的血管密度显著更高。因此，由表达外源ETV2的内皮细胞形成的稳定的三维管腔化血管小管维持灌注，而无需血管周围支持或受限支架限制。

实施例3.表达外源ETV2的内皮细胞在体内形成稳定的三维功能性血管

使用体内鼠模型评估表达外源ETV2的内皮细胞维持功能性成型血管的潜力。在此，SCID-BEIGE小鼠皮下植入栓塞，其含有与层粘连蛋白、巢蛋白和胶原蛋白IV(L.E.C.)混合的mCherry或GFP标记的对照人内皮细胞或表达外源ETV2的重编程内皮细胞。植入后一至五个月，如图3A-M中所示，通过活体染色评估血管化程度(血管持续性和与先前存在的鼠血管系统的吻合)图3A显示施用具有表达外源ETV2的重编程内皮细胞(R-VEC)的栓塞的小鼠明显比施用非ETV2转导的对照内皮细胞的小鼠具有更多血管化。整装共聚焦图片以及栓塞的后切片显示，与对照非ETV2表达的内皮细胞栓塞相比，施用表达外源ETV2的重编程内皮细胞的小鼠中具有更高的血管密度、组织和成型。

通过检查稳定的3D人造血管灌注液体和吻合至小鼠脉管系统的能力，在体内进一步评估血管功能。参见图3B-C。此外，如图3D中所示，在1个月和2个月的时间点，注射表达外源ETV2的重编程内皮细胞的动物中的血管密度显著高于对照EC。当分析使用Matrigel^TM作为基质而不是L.E.C形成的人造血管的功能时，在1周、1个月和2个月的时间点获得了类似的结果。参见图3E-F。组织学分析显示，与对照内皮细胞相比，采用表达外源ETV2的重编程内皮细胞时功能性的灌注的血管以更高的速率形成。图3G。此外，图3H显示本公开的稳定3D血管包含小鼠周细胞，其进一步稳定管腔几何形状。值得注意的是，myrAKT1或ETS1转导的内皮细胞形成非功能性人造血管。例如，这些血管是非灌注的并且在小鼠中不能血管化，如图3I-3K中所示。鉴于前述内容，当作为限定基质中的单一细胞群注射时，本公开的表达外源ETV2的重编程内皮细胞在体内血管化，形成功能性血管网络。

类似地，当植入由表达外源ETV2的内皮细胞形成的稳定的三维血管而不是作为单细胞悬浮液施用时，血管功能和血管密度随时间保持不变。这表明本公开的稳定3D血管可以与类器官一起移植以再生器官特异性组织。将表达外源ETV2的内皮细胞培养8周以在体外形成稳定的血管网络，然后作为完全形成的血管外植体皮下注射到SCID-beige小鼠中。然后给小鼠注射VEcad抗体以鉴定灌注的血管。如图3L和3M中所示，植入的血管在功能上与内源性小鼠血管吻合，因为在移植的血管周围募集了小鼠PFGFRβ⁺周细胞以稳定并形成毛细血管样血管和小动脉的血管网络。因此，本公开的三维血管是稳定的、功能性的，并且在不需要支架或血管周围支持的情况下能够承受移植应力。这表明本公开的稳定3D血管是促进受试者中血管化的可行载体。

实施例4.瞬时ETV2表达形成功能性人造血管.

为了确定ETV2的瞬时表达是否足以维持稳定的3D血管形成，使用反向tet-反式激活因子(rtTA)-多西环素诱导型表达系统。定量PCR分析证实了去除多西环素后ETV2的快速下调。图4H。上述体外血管形成测定和体内栓塞测定显示仅需要ETV2表达直至血管在4周(即1个月)适当形成时，此后便不再需要。图4A-B。实际上，在培养的前4周内由表达ETV2的内皮细胞形成的人造血管维持了其ETV2赋予的血管适应性，如图4C-D中所示。

此外，与体外培养的内皮细胞相比，由表达ETV2的内皮细胞形成的人造血管获得了与新鲜分离的内皮细胞的转录相似性，如图4E和4F中所示。值得注意的是，随着3D人造血管在4周时变得稳定，上调基因的表达变得下调，并且细胞适应整个微环境。参见图4G。

实施例5.表达ETV2的重编程内皮细胞使类器官血管化

阐明了在小鼠、人或恶性上皮类器官培养物中表达ETV2的内皮细胞的分化(即形成分支三维血管网络)的可能性。将GFP标记的人或小鼠小肠类器官与表达ETV2的重编程内皮细胞(R-VEC)或幼稚内皮细胞(CTRL-EC)混合。如图5A中所示，R-VEC能够形成高度有组织的3D血管，并且在24小时内与含有干细胞的隐窝芽和分化的绒毛状中央区域相关联。表达ETV2的重编程内皮细胞对肠类器官的血管化变得更加有组织，在第4天和第7天形成几乎分枝于每个扩展的类器官单位的成型血管。相比之下，幼稚的非ETV2转导的内皮细胞(CTRL-EC)无法在存在类器官的情况下形成血管，从而缺乏使类器官血管化的能力。图5A。

如图5B和5C中所示，发现在与重编程内皮细胞一起培养的类器官中血管密度和每个类器官形成的毛细血管数量显著更高。

如图5D-5F中所示，表达ETV2的重编程内皮细胞分枝并形成伴随人源正常结肠类器官的血管网络。此外，当与表达ETV2的重编程内皮细胞共培养时，发现血管密度、结肠类器官数目以及类器官尺寸更高。因此，重编程内皮细胞使得分化的内皮细胞能够与内源性上皮细胞结合并形成功能性血管网络。

如图5G-5J中所示，在24小时内，表达ETV2的重编程内皮细胞(R-VEC)向肿瘤类器官迁移，并且侵袭性地和大量地使肿瘤类器官血管化，而幼稚内皮细胞(CTRL-EC)则无法这样做。例如，图5G显示，在七天内，所有肿瘤类器官均由无组织的高密度血管群产生分枝。与对照非ETV2转导的内皮细胞相比，在R-VEC共培养物中也发现高得多的血管密度，如图5H中所示。上皮标记物EpCam的染色揭示了肿瘤结肠类器官细胞和重编程内皮细胞之间的紧密细胞-细胞相互作用。参见图5I。值得注意的是，与其中重编程内皮细胞形成有组织的血管丛的正常的肠和结肠类器官共培养物不同，肿瘤类器官内的血管紊乱并且形状和大小异常，模仿了肿瘤脉管系统。参见图5G和5J。

其他患者来源的肿瘤类器官，包括三阴性乳腺癌类器官，也产生类似的结果，如图5K-5L中所例示。

鉴于前述内容，本公开的重编程内皮细胞和稳定的3D人造血管能够使许多不同组织类型的类器官血管化，并适应它们所引入的环境，在正常和致瘤类器官的设置中表现出改变的重塑和形态。参见，例如，图5J。

实施例6.重编程内皮细胞使脱细胞器官血管化

在再生医学中，尚未实现包括毛细血管和小动脉在内的长效功能性血管结构的生成。具体而言，虽然大口径血管可以用内皮细胞定殖，但是难以形成可以为器官或模型器官提供持久且分布式的血液供应的较小的毛细血管尺寸的血管。在此，将表达外源ETV2的重编程内皮细胞引入脱细胞的肠器官模型，其中它们能够在生物反应器内体外建立血管化结构。参见图6A-B。结果显示，表达外源ETV2的重编程内皮细胞(R-VEC)大量构成脱细胞肠的毛细血管，实现肠壁的整个区域内的均匀分布。参见图6C。如图6D-6E中所示，与使用对照非ETV2转导的内皮细胞(CTRL-EC)相比，当使用R-VEC时，采用CD31抗体的活体染色和乙酰化LDL摄取显示出更高的血管包覆。再内皮化区域和血管网络参数的定量证实了表达外源ETV2的重编程内皮细胞的更高血管化潜力，如图6F和6G中所示。在体外培养1周后，将再血管化的肠植入免疫受损的NOD-SCID-γ小鼠的网膜中。表达外源ETV2的重编程内皮细胞使脱细胞肠血管化，其保持大(动脉和静脉)和小口径血管(毛细血管)的连续性并与小鼠脉管系统吻合，如1周和4周时的活体同工凝集素和人VEcad注射所示。参见图6H-6J。

序列表

<110> 康奈尔大学

<120> 稳定的三维血管和形成其的方法

<130> 34633 (7600-02-PC)

<150> 62/454,161

<151> 2017-02-03

<160> 2

<170> PatentIn 版本 3.5

<210> 1

<211> 3697

<212> DNA

<213> 智人

<400> 1

attacaggcg tgaatcaccg cgcccaacca caagttacag acattataac atttcatctc 60

tgagttcatt ttctaaatga tatctttcct cctgaatacc attatcaaat ctaagaaaag 120

aattctatga tatttcatat tcagttcata ctccagtttc cccaattgtc ctaaactatt 180

acagcgcgga agggcatggg gtctggagaa ggagagcagt gggaggatgc ctgccttacc 240

ttcccccttc atcaaatgag agtatgtatt gtacttgcct catagaagga ttcaatgaag 300

gggtatggca cagttggttt cacacaatga gccctcattt aatgttggcc gttattgcta 360

ctattgttat tgttgaaatt gttgatgtca atattgctat gattggcact cctgggaagc 420

agccccagga cgccctccct actgggcctg gtggaggatt gggtgggcct tcactcctgc 480

tccacgcccc cgcagttact ctgccgattg tgacgtcagc tgacgctggg ggcgggtggg 540

ggaatctggc cggaaatccc tcttcctgtt gcagataagc ccagcttagc ccagctgacc 600

ccagaccctc tcccctcact ccccccatgt cgcaggatcg agaccctgag gcagacagcc 660

cgttcaccaa gccccccgcc ccgcccccat caccccgtaa acttctccca gcctccgccc 720

tgccctcacc cagcccgctg ttccccaagc ctcgctccaa gcccacgcca cccctgcagc 780

agggcagccc cagaggccag cacctatccc cgaggctggg gtcgaggctc ggccccgccc 840

ctgcctctgc aacttgagcc tggctgcgac ccctgctctg acgtctcgga aaattccccc 900

ttgcccaggc ccttggggga gggggtgcat ggtatgaaat ggggctgaga cccccggctg 960

ggggcagagg aacccgccag aggtgagcga tgaactgagg actagatgcc tgggtgtctg 1020

ggttaggaag gacctggggg actagactcc caagaagccg ggggcctgga ctcctgggtc 1080

taacagagga agagagctgg ggtccctcac tcccaggacc aagattttag gctcctgggg 1140

aaggagggag cggaggcctg gactcctggc tctgagggaa gctagggctg gggcccagac 1200

tccagggcct ccaagtgtca ccagctcacc cattgccatc tggacttttc ccgacccaga 1260

acattcagaa ggccttcatc gcatccatgg acctgtggaa ctgggatgag gcatccccac 1320

aggaagtgcc tccagggaac aagctggcag ggcttggtag gctgccgagg ctgccacaac 1380

gtgtgtgggg agggtgtcca ggtggggcct ctgctgaccc taacccctta tcgcctgcag 1440

aaggagccaa attaggcttc tgtttccctg atctggcact ccaaggggac acgccgacag 1500

cgacagcaga gacatgctgg aaaggtggct gcgggctggg acccctaagt gctggagaag 1560

aagcggggag gctgggatcc tagggcaaag ggaggagggg ggcgtgccta ggttcctggg 1620

actgggtggg gaggggccgc gtgcttgacc cctgagggtg aaggaaaagg gggcgcgggg 1680

tgctgaaata cgggctgggg ggccataact cccagtccct gacaagtaga gactagagag 1740

tgggtagttg aggggtctct ttcattgctc acagtcctcc ctaaactcag gtacaagctc 1800

atccctggca agcttcccac agctggactg gggctccgcg ttactgcacc cagaagttcc 1860

atggggggcg ggtgagtgtg gggagaggcg gtgggaggtg gggactgggg tcccgaggca 1920

ccggggctag aggtgtagac tccctgatct ttgaggactg agaacacctg cgccctcaag 1980

gtggcatgac ctggatccgg gtcagccggg ccccaagtgc cagggttgag agcttagacc 2040

ctagagtttt tgagggggca cctgggctcc cctcactcgg gatccgttac tcctcacaga 2100

gcccgactct caggctcttc cgtggtccgg ggactggaca gacatggcgt gcacagcctg 2160

ggactcttgg agcggcgcct cgcagaccct gggccccgcc cctctcggcc cgggccccat 2220

ccccgccgcc ggctccgaag gcgccgcggg ccagaactgc gtccccgtgg cgggagaggc 2280

cacctcgtgg tcgcgcgccc aggccgccgg gagcaacacc agctgggact gttctgtggg 2340

gcccgacggc gatacctact ggggcagtgg cctgggcggg gagccgcgca cggactgtac 2400

catttcgtgg ggcgggcccg cgggcccgga ctgtaccacc tcctggaacc cggggctgca 2460

tgcgggtggc accacctctt tgaagcggta ccagagctca gctctcaccg tttgctccga 2520

accgagcccg cagtcggacc gtgccagttt ggctcgatgc cccaaaacta accaccgagg 2580

tgagagggcc gcaaagactg cggggagggc gaagctggag tcctgagccg ggacccaggc 2640

acctaagggg gcggggcccg ggagactgac agtgaggggg cgggggctta gggaccaggg 2700

gctcgaagga ggggccggtg gcccgcactc caggtccttg gggaggagag ggctaagaaa 2760

ctggtagtct tatagggacc aaggggatga ggacccaggc tcctggatta tataaaacga 2820

aagcgataaa ggcccagatt cctgggtctc cgagatgggg aggccaaact cctaaatctc 2880

tgagactggg gccctggacg cttgagtctc caaggctgac tgttggatct cagagaaggg 2940

ggggcggatc cccttctcgg gtcctgggtc ccgagttggg aggacccgga cctctagatc 3000

attgaagtgg tgtgatctag ggccgggaag actgagtgtg cccctccctt catcccgcag 3060

gtcccattca gctgtggcag ttcctcctgg agctgctcca cgacggggcg cgtagcagct 3120

gcatccgttg gactggcaac agccgcgagt tccagctgtg cgaccccaaa gaggtggggc 3180

agctcccctg cccagccaaa tccgccccgt ctcttctagt tcaatttagc tccgcccaag 3240

ggctaggttc aaccgcgtag ccctcggccc cgccgctccc cggcccactc gaggccccgc 3300

ccaacccttc tcaaacccaa tctcccgcct gtactcctgc ctcaaccaac ccagtctcca 3360

ccgggctctg cgaggcctcg cccaggtctg cactgcacac cgcccccagg cccggccctc 3420

cccactatcg ccaagccccg ccccttccca ctccgaccga gcgggcctct gtcctaggtg 3480

gctcggctgt ggggcgagcg caagagaaag ccgggcatga attacgagaa gctgagccgg 3540

ggccttcgct actactatcg ccgcgacatc gtgcgcaaga gcggggggcg aaagtacacg 3600

taccgcttcg ggggccgcgt gcccagccta gcctatccgg actgtgcggg aggcggacgg 3660

ggagcagaga cacaataaaa attcccggtc aaacctc 3697

<210> 2

<211> 342

<212> PRT

<213> 智人

<400> 2

Met Asp Leu Trp Asn Trp Asp Glu Ala Ser Pro Gln Glu Val Pro Pro

1 5 10 15

Gly Asn Lys Leu Ala Gly Leu Glu Gly Ala Lys Leu Gly Phe Cys Phe

20 25 30

Pro Asp Leu Ala Leu Gln Gly Asp Thr Pro Thr Ala Thr Ala Glu Thr

35 40 45

Cys Trp Lys Gly Thr Ser Ser Ser Leu Ala Ser Phe Pro Gln Leu Asp

50 55 60

Trp Gly Ser Ala Leu Leu His Pro Glu Val Pro Trp Gly Ala Glu Pro

65 70 75 80

Asp Ser Gln Ala Leu Pro Trp Ser Gly Asp Trp Thr Asp Met Ala Cys

85 90 95

Thr Ala Trp Asp Ser Trp Ser Gly Ala Ser Gln Thr Leu Gly Pro Ala

100 105 110

Pro Leu Gly Pro Gly Pro Ile Pro Ala Ala Gly Ser Glu Gly Ala Ala

115 120 125

Gly Gln Asn Cys Val Pro Val Ala Gly Glu Ala Thr Ser Trp Ser Arg

130 135 140

Ala Gln Ala Ala Gly Ser Asn Thr Ser Trp Asp Cys Ser Val Gly Pro

145 150 155 160

Asp Gly Asp Thr Tyr Trp Gly Ser Gly Leu Gly Gly Glu Pro Arg Thr

165 170 175

Asp Cys Thr Ile Ser Trp Gly Gly Pro Ala Gly Pro Asp Cys Thr Thr

180 185 190

Ser Trp Asn Pro Gly Leu His Ala Gly Gly Thr Thr Ser Leu Lys Arg

195 200 205

Tyr Gln Ser Ser Ala Leu Thr Val Cys Ser Glu Pro Ser Pro Gln Ser

210 215 220

Asp Arg Ala Ser Leu Ala Arg Cys Pro Lys Thr Asn His Arg Gly Pro

225 230 235 240

Ile Gln Leu Trp Gln Phe Leu Leu Glu Leu Leu His Asp Gly Ala Arg

245 250 255

Ser Ser Cys Ile Arg Trp Thr Gly Asn Ser Arg Glu Phe Gln Leu Cys

260 265 270

Asp Pro Lys Glu Val Ala Arg Leu Trp Gly Glu Arg Lys Arg Lys Pro

275 280 285

Gly Met Asn Tyr Glu Lys Leu Ser Arg Gly Leu Arg Tyr Tyr Tyr Arg

290 295 300

Arg Asp Ile Val Arg Lys Ser Gly Gly Arg Lys Tyr Thr Tyr Arg Phe

305 310 315 320

Gly Gly Arg Val Pro Ser Leu Ala Tyr Pro Asp Cys Ala Gly Gly Gly

325 330 335

Arg Gly Ala Glu Thr Gln

340

Claims

1.一种用于产生稳定的三维血管的方法，其包括：

a)在基质上培养编码ETV2转录因子的外源核酸的内皮细胞，在培养条件下所述内皮细胞表达所述ETV2转录因子至少3-4周，以诱导血管形成；和

b)分离所述稳定的三维血管。

2.权利要求1所述的方法，进一步包括将步骤a)的所述细胞再培养一段时间，其中所述进一步培养是在所述细胞不表达所述ETV2转录因子的条件下进行。

3.权利要求2所述的方法，其中所述进一步培养至少进行一周。

4.权利要求1所述的方法，其中所述基质包括层粘连蛋白、巢蛋白、胶原或其组合。

5.权利要求4所述的方法，其中所述基质包含：

组合浓度为5.25mg/mL的层粘连蛋白和巢蛋白；和

0.2mg/mL的胶原蛋白IV。

6.权利要求1所述的方法，其中所述基质是Matrigel^TM。

7.权利要求1所述的方法，其中所述内皮细胞包括人脐静脉内皮细胞(HUVEC)、脂肪来源的内皮细胞或器官特异性内皮细胞。

8.权利要求7所述的方法，其中所述器官特异性内皮细胞选自心脏、肌肉、肾、睾丸、卵巢、淋巴、肝、胰腺、脑、肺、骨髓、脾、大肠和小肠。

9.权利要求1所述的方法，其中所述3-4周的培养步骤包括在无血清培养基中培养所述内皮细胞至少7天。

10.权利要求9所述的方法，其中所述在无血清培养基中的培养是在低于大气氧气分压(20％)下进行。

11.权利要求10所述的方法，其中所述氧气分压为5％。

12.权利要求1所述的方法，其中所述培养步骤a)在不存在支架或血管周围支持物的情况下进行。

13.一种通过权利要求1所述的方法生产的稳定的三维血管。

14.一种能够自主形成三维血管网络的稳定的三维血管。

15.权利要求14所述的稳定的三维血管，其中所述稳定的三维血管包含具有至少一个连续的重编程内皮细胞层的管状结构。

16.权利要求15所述的稳定的三维血管，其中所述重编程内皮细胞包含编码ETV2的外源核酸序列。

17.权利要求14所述的稳定的三维血管，其中所述稳定的三维血管具有功能至少2个月。

18.一种用于促进受试者中血管形成的方法，其包括向所述受试者施用权利要求13所述的稳定的三维血管。

19.权利要求18所述的方法，其中所述施用包括将所述稳定的三维血管植入所述受试者中，以在所述受试者中形成功能性三维血管网络。

20.权利要求19所述的方法，其中所述功能性三维血管网络包括毛细血管、小动脉、小静脉或淋巴管。

21.一种使类器官血管化的方法，其包括将所述类器官和包含编码ETV2转录因子的外源核酸的内皮细胞一起培养，在培养条件下所述内皮细胞表达所述ETV2转录因子。

22.权利要求21所述的方法，其中所述基质包括层粘连蛋白、巢蛋白、胶原或其组合。

23.权利要求21所述的方法，其中所述类器官选自包含以下的组：小肠类器官、结肠类器官、肾类器官、心脏类器官和肿瘤类器官。

24.权利要求21所述的方法，其中所述培养包括在包含碱性FGF(FGF-2)和肝素的培养基中培养至少7天。

25.权利要求21所述的方法，进一步包括分离所述血管化的类器官。

26.权利要求25所述的方法，其中将所述分离的血管化的类器官施用至受试者。

27.权利要求25所述的方法，其中通过手术植入将所述分离的血管化的类器官施用至所述受试者。

28.权利要求25所述的方法，其中使所述分离的血管化的类器官与治疗剂接触，并测定所述治疗剂的功效。

29.一种使脱细胞器官再血管化的方法，其包括将所述脱细胞器官和包含编码ETV2转录因子的外源核酸的内皮细胞一起培养，在培养条件下所述内皮细胞表达所述ETV2转录因子，其中所述培养使所述脱细胞器官血管化。

30.权利要求29所述的方法，其中所述脱细胞器官选自心脏、肾、睾丸、卵巢、骨、淋巴、肝、胰腺、脑、肺、骨髓、脾、大肠和小肠。

31.权利要求29所述的方法，其中所述血管化包括形成动脉、静脉、毛细血管、小动脉、小静脉或其组合。

32.权利要求29所述的方法，其中所述培养在生物反应器中进行。

33.权利要求29所述的方法，进一步包括分离所述血管化的脱细胞器官。

34.权利要求33所述的方法，进一步包括将所述血管化的脱细胞器官施用至受试者。