KR20220065805A - 요세포로부터 생성된 조직과 같은 내피 및 평활근 및 이와 관련된 용도 - Google Patents

요세포로부터 생성된 조직과 같은 내피 및 평활근 및 이와 관련된 용도 Download PDF

Info

Publication number
KR20220065805A
KR20220065805A KR1020227012521A KR20227012521A KR20220065805A KR 20220065805 A KR20220065805 A KR 20220065805A KR 1020227012521 A KR1020227012521 A KR 1020227012521A KR 20227012521 A KR20227012521 A KR 20227012521A KR 20220065805 A KR20220065805 A KR 20220065805A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
cells
endothelial
gly
urine
smooth muscle
Prior art date
Application number
KR1020227012521A
Other languages
English (en)
Inventor
윤영섭
손영덕
이상호
Original Assignee
에모리 유니버시티
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 에모리 유니버시티 filed Critical 에모리 유니버시티
Publication of KR20220065805A publication Critical patent/KR20220065805A/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/44—Vessels; Vascular smooth muscle cells; Endothelial cells; Endothelial progenitor cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/069—Vascular Endothelial cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/3604—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix characterised by the human or animal origin of the biological material, e.g. hair, fascia, fish scales, silk, shellac, pericardium, pleura, renal tissue, amniotic membrane, parenchymal tissue, fetal tissue, muscle tissue, fat tissue, enamel
    • A61L27/3625—Vascular tissue, e.g. heart valves
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/069—Vascular Endothelial cells
    • C12N5/0691—Vascular smooth muscle cells; 3D culture thereof, e.g. models of blood vessels
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/32—Amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/34—Sugars
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/38—Vitamins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/46—Amines, e.g. putrescine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/11—Epidermal growth factor [EGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/115—Basic fibroblast growth factor (bFGF, FGF-2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/165—Vascular endothelial growth factor [VEGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/30—Hormones
    • C12N2501/38—Hormones with nuclear receptors
    • C12N2501/39—Steroid hormones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/80—Neurotransmitters; Neurohormones
    • C12N2501/81—Adrenaline
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/90—Polysaccharides
    • C12N2501/91—Heparin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/25—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from renal cells, from cells of the urinary tract
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2513/00—3D culture
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/50—Proteins
    • C12N2533/54—Collagen; Gelatin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Materials For Medical Uses (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

본 개시내용은 요세포로부터 생성된 내피 및 평활근 유사 혈관 조직에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용은 상기 세포가 내피 표면 마커의 증가된 수준을 발현하는 세포 풀을 형성하도록 변형되도록 하는 조건 하에 제1 성장 배지에서 ETV2로 소변 유래 세포를 노출시킨 후, 상기 세포가 내피 표면 마커에 더하여 증가된 수준의 평활근 표면 마커를 발현하는 세포를 함유하는 조직을 형성하도록 변형되도록 하는 조건 하에서 제2 성장 배지에 세포 풀을 노출시킴으로서 혈관 조직과 같은 내피 및 평활근을 생산하는 방법에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용은 혈관, 심장 및 상처 치유 징후의 치료를 위한 본원에 보고된 세포 및 조직을 사용하는 것에 관한 것이다.

Description

요세포로부터 생성된 조직과 같은 내피 및 평활근 및 이와 관련된 용도
본 출원은 2019년 9월 20일에 출원된 미국 가출원 번호 62/903,154를 우선권으로 주장한다. 본 출원 전체는 모든 목적을 위해 본 출원의 참고문헌이다.
이 발명은 국립 보건원에서 수여한 DK108245, HL127759 및 HL129511에 따른 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에 대한 특정 권리가 있다.
본 출원과 관련된 서열 목록은 종이 사본 대신에 텍스트 형식으로 제공되며 참조에 의해 명세서에 통합된다. 서열목록이 포함된 텍스트 파일의 이름은 19161PCT_ST25.txt이다. 상기 텍스트 파일은 11KB로 2020년 7월 9일에 생성되었으며 EFS-Web을 통해 전자적으로 제출되고 있다.
허혈성 심혈관 질환(Ischemic cardiovascular diseases)은 선진국에서 질병율(morbidity)과 사망률(mortality)의 주요 원인이다. 위험 인자 관리, 약리학적 치료 및 외과적 혈관 재건술은 현재 치료 옵션이지만, 영구적인 혈관 손실이 발생할 때 항상 효과적인 것은 아니다. 지난 수십 년 동안 상당한 노력을 기울였음에도 불구하고, 허혈성 심장 및 혈관 질환 환자를 치료하는 것은 여전히 어려운 일이다. 따라서, 신생혈관(neovascularization)을 통해 숙주 장기의 혈액 공급을 회복시키는 치료법의 개발이 절실히 요구되고 있다.
내피 세포(Endothelial cells, EC)는 혈관 구조의 핵심 요소이며 손상되거나 허혈성 조직을 복구하는 데 필수적이다. 수년에 걸쳐, 세포 치료에 사용하기 위해 EC를 생성하려는 시도가 있었다. 초기의 열정에도 불구하고, 성체 줄기 또는 전구 세포는 최소한의 내피 전환분화(transdifferentiation) 가능성을 갖는 것으로 밝혀졌다. 배아줄기세포(Embryonic stem cells, ESC)와 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cells, iPSC)가 유망한 대안으로 떠올랐다; 그러나 종양 발생 가능성 또는 비효율적인 세포 생산과 같은 문제는 임상 적용을 제한하였다. 따라서, 개선 사항을 식별할 필요가 있다.
Lee et al.은 ER71/ETV2를 사용하여 인간 진피 섬유아세포를 내피 세포로 재프로그래밍하는 것을 보고하였다.
Veldman et al.은 전사 인자 Etv2에 의해 생체 내에서 빠른 골격근이 기능적 내피로 전환분화된다고 보고하였다. PLoS Biol, 2013, 11(6): e1001590.
Bharadwaj et al.은 인간 소변-유래 줄기 세포(urine-derived stem cells)의 다분화능을 보고하였다. Stem Cells 2013, 31:1840-1856.
본원에 인용된 참고문헌은 선행 기술을 인정하는 것이 아니다.
본 개시내용은 요세포로부터 생성된 내피 및 평활근 유사 혈관 조직에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용은 상기 세포가 내피 표면 마커의 증가된 수준을 발현하는 세포 풀을 형성하도록 변형되도록 하는 조건 하에 제1 성장 배지에서 ETV2로 소변 유래 세포를 노출시킨 후, 상기 세포가 내피 표면 마커에 더하여 증가된 수준의 평활근 표면 마커를 발현하는 세포를 함유하는 조직을 형성하도록 변형되도록 하는 조건 하에서 제2 성장 배지에 세포 풀을 노출시킴으로서 혈관 조직과 같은 내피 및 평활근을 생산하는 방법에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용은 혈관, 심장 및 상처 치유 징후의 치료를 위한 본원에 보고된 세포 및 조직을 사용하는 것에 관한 것이다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용은 하기를 포함하는 내피 및 평활근 유사 혈관 조직의 제조 방법에 관한 것이다: i) 개체의 소변 세포를 농축하는 단계; ii) a) EGF, b) 히드로코르티손(hydrocortisone), c) 에피네프린(epinephrine) 및 d) 인간 혈청 또는 동물 혈청을 포함하는 제1 성장 배지에서 농축된 소변 세포를 복제하여 정제된 농축 소변 유래 세포(purified concentrated urine derive cells)를 제공하는 단계; iii) 정제된 농축 소변 유래 세포를 ETV2에 노출시키는 단계; iv) 제1 성장 배지에서 정제된 농축 소변 유래 세포를 배양하여 내피 유사 소변 유래 세포를 제공하는 단계;v) a) EGF, b) VEGFA, c) bFGF, d) 헤파린(heparin), e) L-아스코르브산(L-ascorbic acid), 및 d) 인간 혈청 또는 동물 혈청을 포함하는 제2 성장 배지에서 내피 유사 소변 유래 세포를 배양하여, 내피 및 평활근 유사 혈관 조직을 제공하는 단계. 특정 실시양태에서, 상기 인간 혈청은 혈관 조직으로 치료되거나 이식될 개체로부터 유래된다.
특정 실시양태에서, 정제된 농축 소변 유래 세포를 ETV2에 노출시키는 단계는 정제된 농축 소변 유래 세포를 감염시키고 ETV2를 인코딩하는 유전자를 포함하고 감염 후 ETV2를 발현하는 재조합 바이러스와 정제 농축 소변 유래 세포를 혼합하는 단계에 의한 것이다. 특정 실시양태에서, 상기 재조합 바이러스는 아데노바이러스(adenovirus) 또는 렌티바이러스(lentivirus)이다.
특정 실시양태에서, 제1 또는 제2 성장 배지는 글루코오스(glucose), 아미노산(amino acids), 및 비타민(vitamins), 글루타민(glutamine), 및 소듐 피루베이트(sodium pyruvate)를 포함한다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 내피 및 평활근 유사 혈관 조직을 3차원 구조로 폴딩하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 내피 및 평활근 유사 혈관 조직을 개체에 이식하는 단계를 추가로 포함한다.
특정 실시양태에서, 내피 및 평활근 유사 혈관 조직을 이식하는 단계는 내피 및 평활근 유사 혈관 조직을 정맥, 동맥, 모세혈관 또는 심장 근육과 접촉시키는 단계이다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용은 ETV2가 세포에서 형성되고 확장된 소변 세포가 변형되어 증가된 수준의 내피를 발현하는 세포 풀을 형성하도록 하는 조건 하에 프로모터와 작동 가능한 조합으로 ETV2를 인코딩하는 재조합 벡터를 포함하는 확장된 소변 세포를 프로모터의 자극에 노출시키는 단계를 포함하는 내피 및 내피 유사 세포를 생성하는 방법에 관한 것이며, 상기 표면 마커는 KDR 및 CDH5이며, 이에 내피 유사 세포를 제공한다.
특정 실시양태에서, 상기 세포 풀은 표면 마커 KDR 및 CDH5의 증가된 수준을 발현한다. 특정 실시양태에서, 상기 세포 풀은 표면 마커 PECAM1 및 TEK의 증가된 수준을 발현한다.
특정 실시양태에서, 소변 세포 또는 확장된 세포는 ERG 또는 FLI1을 인코딩하는 재조합 벡터를 포함하거나 포함하지 않거나, FOXC2, MEF2C, SOX17, NANOG 또는 HEY1을 인코딩하는 재조합 벡터를 포함하거나 포함하지 않는다.
특정 실시양태에서, 소변 세포 또는 확장된 소변 유래 세포는 TGFβ 억제제를 포함하는 배지와 접촉하거나 접촉하지 않는다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 KDR 소변 유래 세포의 정제된 풀을 제공하는 KDR을 발현하는 세포를 선택함으로써 정제된 소변 유래 세포의 풀을 정제하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 KDR 음성 소변 유래 세포의 정제된 풀을 제공하는 KDR을 발현하지 않는 세포를 선택함으로써 정제된 소변 유래 세포의 풀을 정제하는 단계를 추가로 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 방법에 의해 제조된 세포를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 본원에서 생성된 세포를 발프로산(valproic acid)과 접촉시키는 것을 포함하는 내피 유사 세포를 생성하는 단계를 추가로 포함한다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 본원에서 생성된 세포를 프로모터 자극과 접촉시키는 것을 포함하는 변형된 세포 풀을 생성하는 단계를 추가로 포함한다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 본원에서 생성된 세포를 콜라겐과 접촉시키는 것을 포함하는 변형된 세포 풀을 생성하는 단계를 추가로 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용은 피부 상태, 질병, 손상, 타박상, 개방-상처, 열상, 혈관 상태, 질명, 심장 상태, 질병, 죽상 동맥 경화증, 관상 동맥 질환, 또는 허혈을 치료하거나 예방하는 방법에 관한 것으로, 본원에서 생산된 세포 또는 조직의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함한다.
본 개시 내용이 더 상세하게 설명되기 전에, 본 개시 내용은 설명된 특정 실시양태들에 제한되지 않고, 당연히 달라질 수 있음을 이해해야 한다. 본원에서 사용된 용어는 단지 특정 실시양태를 설명하기 위한 것이며, 본 개시의 범위가 첨부된 청구범위에 의해서만 제한될 것이기 때문에, 제한하려는 의도가 아님을 이해해야 한다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 개시가 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 재료가 또한 본 개시내용의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 재료가 이제 기재된다.
본 명세서에 인용된 모든 간행물 및 특허는 각각의 개별 간행물 또는 특허가 참조로 포함되는 것으로 구체적이고 개별적으로 표시되고 여기에 포함되는 것처럼 여기에 참조로 포함되며, 참고로 출판물이 인용된 방법 및/또는 자료를 공개하고 설명한다. 모든 간행물의 인용은 출원일 이전의 공개를 위한 것이며 본 개시가 사전 공개로 인해 그러한 간행물보다 선행할 자격이 없음을 인정하는 것으로 해석되어서는 안된다. 또한, 제공된 출판 날짜는 독립적으로 확인해야 할 수 있는 실제 출판 날짜와 다를 수 있다.
본 개시내용을 읽을 때 당업자에게 명백한 바와 같이, 본원에서 설명되고 예시된 각각의 개별적인 실시양태는 본 개시의 범위 또는 정신을 벗어나지 않고서 다른 몇몇 실시양태의 특징과 쉽게 분리되거나 결합될 수 있는 별개의 구성요소 및 특징을 갖는다. 나열된 모든 방법은 나열된 사건의 순서로 또는 논리적으로 가능한 다른 순서로 수행될 수 있다.
본 개시내용의 실시양태는 달리 나타내지 않는 한, 당업계의 기술 내에 있는 의약, 유기 화학, 생화학, 분자 생물학, 약리학 등의 기술을 사용할 것이다. 이러한 기술은 문헌에 완전하게 설명되어 있다.
명세서 및 첨부된 청구범위에 사용된 바와 같이 단수형 "a", "an" 및 "the"는 문맥에서 명백하게 달리 지시하지 않는 한 복수 지시 대상을 포함한다는 점에 유의해야한다. 따라서, 예를 들어 "지지대(a support)"에 대한 언급은 복수의 지지대를 포함한다. 본 명세서 및 다음의 청구범위에서, 반대 의도가 명백하지 않는 한 다음과 같은 의미를 갖는 것으로 정의될 다수의 용어가 참조될 것이다.
본 개시 및 청구범위에 사용된 바와 같이, 단어 “포함하는(comprising)”및 “포함하다(comprise)”및“포함한다(comprises)”와 같은 ‘포함하는’의 임의의 형태), “갖는(having)”및 “가지다(have)”및 “가진다(has)”와 같은 ‘갖는’의 임의의 형태), “포함하는(including)”및 “포함하다(includes)”및 “포함한다(include)”와 같은 ‘포함하는’의 임의의 형태) 또는 “함유하는(containing)”및 “함유하다(contains)”및 “함유한다(contain)”와 같은 ‘함유하는’의 임의의 형태)은 포괄적이거나 개방형이며 추가의 인용되지 않은 요소 또는 방법 단계를 배제하지 않는다는 점에서 미국 특허법에서 부여한 의미를 갖는다. 예를 들어, 핵산 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드와 관련하여 상기 용어 "포함하는(comprising)"은 추가의 5'(5' 말단) 또는 3'(3' 말단) 뉴클레오티드를 함유할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 의미하며, 즉, 이 용어는 더 큰 핵산 내에 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하도록 의도된다. 본 개시내용에 포함되는 방법 및 조성물에 적용될 때 "필수적으로 이루어지는(Consisting essentially of)" 또는 "이루어지는(consists of)" 등은 청구범위의 독창적인 특징을 제공하기 위해 특정 선행 기술 요소를 배제하는 본원에 개시된 것과 같은 조성물을 의미하나, 본원에 개시된 상응하는 조성물 또는 방법과 비교하여, 조성물 또는 방법의 기본적이고 신규한 특성(들)에 실질적으로 영향을 미치지 않는 추가 조성물 성분 또는 방법 단계 등을 포함할 수 있다.
상기 용어 "혈청(serum)"은 동물의 혈액을 응고시켜 얻은 혈액 제품을 의미하며, 상기 혈전(clot)이 혈액에서 분리된다. 소 태아 혈청은 도축된 소에서 태아(fetus)를 제거한 후 소 태아의 혈액에서 추출한다.
본원에 사용된 바와 같이, “성장 배지(growth medium)”또는 “배지(media)”는 단백질 생합성을 통해 세포 유지 및 성장을 촉징하는 성분, 예컨대 비타민, 아미노산, 무기염, 버퍼 및 연료, 예를 들어, 아세테이트, 숙시네이트, 당류 및/또는 선택적으로 뉴클레오티드를 함유하는 조성물을 의미한다. 추가적으로, 성장 배지는 pH 표시로 페놀 레드(phenol red)를 함유할 수 있다. 상기 성장 배지의 성분은 혈청에서 유래하거나 성장 배지에 무혈청일 수 있다. 상기 성장 배지는 선택적으로 알부민, 지질, 인슐린 및/또는 아연, 트랜스페린(transferrin) 또는 철, 셀레늄, 아스코르브산, 및 항산화제, 예컨대 글루타티온, 2-머캅토에탄올(mercaptoethanol) 또는 1-티오글리세롤(thioglycerol)로 보충될 수 있다. 성장 배지에서 고려되는 다른 고려되는 성분은 암모늄 메타바나데이트(ammonium metavanadate), 황산구리(cupric sulfate), 염화망간(manganous chloride), 에탄올아민(ethanolamine) 및 소듐 피루베이트(sodium pyruvate)을 포함한다. 최소 필수 배지(Minimal Essential Medium, MEM)는 염화칼슘(calcium chloride), 염화칼륨(potassium chloride), 황산마그네슘(magnesium sulfate), 염화나트륨(sodium chloride), 인산나트륨(sodium phosphate), 중탄산나트륨(sodium bicarbonate), 필수아미노산, 비타민: 티아민(thiamine)(비타민 B1), 리보플라빈(riboflavin)(비타민 B2), 니코틴아미드(nicotinamide)(비타민 B3), 판토텐산(pantothenic acid)(비타민 B5), 피리독신(pyridoxine)(비타민 B6), 엽산(folic acid)(비타민 B9), 콜린(choline), 및 미오-이노시톨(myo-inositol)(원래 비타민 B8로 알려짐)을 함유하는 성장 배지를 의미하는 기술 용어이다.
다양한 성장 배지가 당업계에 공지되어 있다. Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM)는 글리신(glycine), 세린(serine) 및 질산 제2철(ferric nitrate)과 같은 추가 성분을 함유한 성장 배지로, 하기 표 1에 나타낸 바와 같이 비타민, 아미노산 및 포도당의 양이 증가한다.
Figure pct00001
Ham의 F-12 배지는 높은 수준의 아미노산, 비타민 및 기타 미량 원소가 있다. 퓨트레신(Putrescine)과 리놀레산(linoleic acid)이 제형에 포함되어 있다. 하기 표 2를 참조한다.
Ham의 F-12 배지의 조성
물질(Substance) 농도
(Concentration)
(mg / L) 		물질 농도
(mg / L)
NaCI 7599 L-메니오닌
(L-methionine)		 4.47
KCI 223.6 L-페닐알라닌
(L-phenylalanine) 		5
Na2HPO4 142 L-프롤린
(L-proline) 		34.5
CaCI2ㆍ2H2O 44 L-세린
(L-serine) 		10.5
MgCl2 122 L-트레오닌
(L-threonine) 		12
FeSO4ㆍ7H2O 0.834 L-트립토판
(L-tryptophan) 		2
CuSO4ㆍ5H2O 0.00249 L-티로신
(L-tyrosine) 		5.4
ZnSO4ㆍ7H2O 0.863 L-발린
(L-valine)		 11.7
D-글루코스
(D-glucose)		 1802 비오틴
(Biotin) 		0.0073
Na-피루베이트
(Na-pyruvate)		 110 D-Ca-판토테네이트
(D-Ca-pantothenate) 		0.48
페놀 레드
(Phenol red)		 1.2 콜린 클로라이드
(Choline chloride) 		14
NaHCO3 1176 엽산(Folic acid) 1.3
L-알라닌
(L-alanine)		 9 미오-이노시톨
(Myo-inositol)		 18
L-아르기닌(L-arginine)ㆍHCl 211 니코틴산 아미드
(Nicotinic acid amid)		 0.037
L-아스파라긴(L-asparagine) 13.2 13.2 피리독신(Pyridoxin)ㆍHCI 0.062
L-아스파르트산
(L-aspartic acid) 		13.3 리포플라빈
(Riboflavin)		 0.038
L-시스테인(L-cysteine)ㆍHCI 31.5 티아민(Thiamine)ㆍHCI 0.34
L-글루타민
(L-glutamine)		 146 비타민(Vitamin) B12 1.36
L-글루타민산
(L-glutamic acid) 		14.7 Hypoxanthine L 4.1
글리신(Glycine) 7.5 티미딘(Thymidine) 0.73
L-히스티딘(L-histidine)
ㆍHCIㆍH2O 		21 리포산(Lipoic acid) 0.21
L-이소류신
(L-isoleucine)		 4 리놀레산
(Linoleic acid)		 0.084
L-류신(L-leucine) 13 퓨트레신(Putrescine)ㆍ2HCI 0.161
L-리신(L-lysine)ㆍHCI 36.5
특정 실시양태에서, 본 개시내용은 DMEM 및 Ham's F-12의 1:1 혼합물인 DMEM 및 F-12 배지의 혼합물을 사용하는 본원에 기재된 성장 배지를 고려한다. 최적의 이산화탄소는 DME에 10% 필요하고, F-12에 5% 필요하다. 이 배지는 혼합물이기 때문에, 상기 최적의 이산화탄소 농도는 일반적으로 5~8%이다.
본원에 사용된 바와 같이, "헤파린(heparin)"은 다양하게 설페이트화된 반복 이당류 단위를 갖는 항응고 중합체를 의미한다. 일반적인 이당류 단위는 2-O-설포-α-L-이두론산(2-O-sulfo-α-L-iduronic acid) 및 2-데옥시-2-설파미도-α-D-글루코피라노실-6-O-설페이트(2-deoxy-2-sulfamido-α-D-glucopyranosyl-6-O-sulfate)로 구성된다.
상기 용어 "ETS 전위 변이체 2(ETS translocation variant 2)" 및 "ETV2"는 조혈 및 혈관 발달에 관여하는 전사 인자를 의미한다. 마우스에서 ETV2 결핍은 조혈 및 혈관 형성과 배아 치사율을 완전한 차단을 야기한다. 인간 재조합 ETV2는 NCBI 참조 서열: NP_055024.2(서열번호: 1)를 갖는 상업적으로 입수가능한 단백질이다. ETV2를 인코딩하는 아데노바이러스는 또한 ETV2 mRNA를 발현하기 위해 상업적으로 이용 가능하다(NCBI 참조 서열: NM_014209.4 참조).
특정 실시양태에서, 본 기재 내용은 ETV2가 선택적으로 세포-투과 펩티드(cell-penetrating peptide, CPP), 예를 들어 폴리-아르기닌과의 C-말단 또는 N-말단 융합체로서 생성되도록 하는, 즉 ETV2 융합체를 소변 유래 세포와 접촉시키는 조건 하에 ETV2로 소변 유래 세포를 노출시키는 것을 고려한다. Warren et al.은 합성 변형 mRNA를 사용한 인간 세포의 다능성 및 유도 분화로의 재프로그래밍을 보고한다. Cell stem cell, 2010, 7:618-630. 특정 실시양태에서, 본 개시내용은 ETV2의 mRNA로 소변 유래 세포를 노출시키는 것, 예를 들어, 전기천공법을 사용하거나 RNA를 양이온성 비히클과 복합화하여 세포내이입에 의한 흡수를 촉진함으로써 세포 내로 mRNA의 전달을 고려한다.
상기 용어, "표피 성장 인자(Epidermal growth factor)" 및 "EGF"는 약 6-kDa인 단백질을 의미한다. 인간 EGF 유전자는 표피 및 기타 세포의 분열을 자극하는 기능을 하는 펩티드를 생성하기 위해 단백질 분해 처리된 전단백질(preproprotein)을 인코딩한다. 인간 재조합 VEGFA는 하기 서열을 갖는 54개 아미노산 단백질의 형태로 상업적으로 입수가능하다:
MNSDSECPLSHDGYCLHDGVCMYIEALDKYACNCVVGYIGERCQYRDLKWWELR (서열번호 3).
상기 용어 "혈관 내피 성장 인자 A(vascular endothelial growth factor A)" 또는 "VEGFA"는 혈관 내피 세포의 증식 및 이동을 유도하는 이황화-결합 동종이량체로 존재하는 헤파린-결합 단백질을 의미한다. 인간 재조합 VEGFA는 하기 서열을 갖는 165개 아미노산 단백질의 형태로 상업적으로 입수가능하다:
APMAEGGGQNHHEVVKFMDVYQRSYCHPIETLVDIFQEYPDEIEYIFKPSCVPLMRCGGCCNDEGLECVPTEESNITMQIMRIKPHQGQHIGEMSFLQHNKCECRPKKDRARQENPCGPCSERRKHLFVQDPQTCKCSCKNTDSRCKARQLELNERTCRCDKPRR (서열번호 4).
상기 용어 "기본 섬유아세포 성장 인자(basic fibroblast growth factor)" 또는 "bFGF"는 FGF 수용체(FGFR) 패밀리 구성원에 결합하는 β-트레포일 구조(β-trefoil structure)를 갖는 단백질을 의미한다. 인간 재조합 bFGF는 하기 서열을 갖는 154개 아미노산 단백질의 형태로 상업적으로 입수가능하다:
AAGSITTLPALPEDGGSGAFPPGHFKDPKRLYCKNGGFFLRIHPDGRVDGVREKSDPHIKLQLQAEERGVVSIKGVCANRYLAMKEDGRLLASKCVTDECFFFERLESNNYNTYRSRKYTSWYVALKRTGQYKLGSKTGPGQKAILFLPMSAKS (서열번호 5).
본원에 기재된 단백질의 변이체는 숙련된 기술자에 의해 용이하게 생산될 수 있다. 컴퓨터 모델링을 사용하여 구조적 유사성을 가진 기능 변형을 예측할 수 있다. 고유 활성을 확인하는 테스트는 문헌 또는 이 사양에 설명된 절차를 사용하여 수행할 수 있다. 숙련된 기술자는 바람직한 특성을 가질 것으로 예상되는 많은 수의 작동 가능한 변형을 생산할 수 있음을 이해할 것이다. 유전자가 알려져 있고 멤버는 한 종에서 다른 종으로 상당한 상동성을 공유한다. 상기 서열은 도 6에 도시된 인간 및 마우스 서열 서열번호 1 및 2 사이의 차이점에 의해 예시된 바와 같이 동일하지 않다. 상기 서열은 명세서에 개시된 인간 서열과 마우스 서열 간의 차이점에 의해 예시된 바와 같이 동일하지 않다. 344개 아미노산 중 232개(67%)만 동일하다. 일부는 보존된 대체(더하기(plus) 사인)이다. 일부는 보존된 대체가 아니다. 기능하는 변형을 만들기 위해, 숙련된 기술자는 무작위 조합을 맹목적으로 시도하지 않는 대신 컴퓨터 프로그램을 사용하여 안정적인 대체를 만든다. 숙련된 기술자는 특정 보존된 대체가 바람직하다는 것을 알 것이니다. 또한, 숙련된 기술자는 일반적으로 진화적으로 보존된 위치를 변경하지 않는다. Saldano et al. Evolutionary Conserved Positions Define Protein Conformational Diversity, PLoS Comput Biol. 2016, 12(3):e1004775 참조.
생물학적 활성을 제거하지 않으면서 어느 아미노산 잔기가 치환, 삽입 또는 결실될 수 있는지를 결정하는 지침은 당업계에 잘 알려진 공개적으로 이용 가능한 데이터베이스와 함께 컴퓨터 프로그램, 예를 들어, RaptorX, ESyPred3D, HHpred, Homology Modeling Professional for HyperChem, DNAStar, SPARKS-X, EVfold, Phyre, 및 Phyre2 소프트웨어를 사용하여 찾을 수 있다. 단백질 모델링, 예측 및 분석을 위한 Phyre2 웹 포털을 보고하는 Kelley et al.을 참조한다. Nat Protoc. 2015, 10(6):845-58. 또한 Marks et al., Protein structure from sequence variation, Nat Biotechnol, 2012, 30(11):1072-80; Mackenzie et al. Curr Opin Struct Biol, 2017, 44:161-167; Mackenzie et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 113(47):E7438-E7447 (2016) and Wei et al. Int. J. Mol. Sci. 2016, 17(12), 2118 참조.
특정 실시양태에서, 본 개시내용은 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 그 초과의 동일성을 갖는 본원에 기재된 폴리펩티드 서열의 변이체를 사용하는 것을 고려한다. "서열 동일성(sequence identity)"은 2개 이상의 핵산 또는 단백질 간의 관련성의 척도를 의미하며, 일반적으로 전체 비교 길이를 기준으로 백분율로 지정된다. 동일성 계산은 각각의 더 큰 서열에서 동일하고 동일한 상대적 위치에 있는 아미노산 잔기를 고려한다. 동일성의 계산은 기본 매개변수를 사용하여 "GAP"(Genetics Computer Group, Madison, WI) 및 "ALIGN"(DNAStar, Madison, WI)과 같은 컴퓨터 프로그램에 포함된 알고리즘에 의해 수행될 수 있다. 특정 실시양태에서, 서열 "동일성(identity)"은 정렬의 두 서열 사이의 서열 정렬에서 정확히 일치하는 잔기의 수(백분율로 표시됨)를 의미한다. 특정 실시양태에서, 정렬의 동일성 백분율은 동일한 위치의 수를 최단 서열 중 더 큰 것으로 나눈 값 또는 내부 갭이 등가 위치로 계산되는 오버행(overhang)을 제외한 등가 위치의 수를 사용하여 계산될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩타이드 GGGGGG(서열번호 6) 및 GGGGT(서열번호 7)는 5 또는 80% 중 4의 서열 동일성을 갖는다. 예를 들어, 폴리펩타이드 GGGPPP(서열번호: 8) 및 GGGAPPP(서열번호: 9)는 7 또는 85% 중 6의 서열 동일성을 갖는다.
특정 실시양태에서, 임의의 고려되는 백분율 서열 동일성에 대해, 상기 서열은 동일한 백분율 이상의 서열 유사성을 가질 수 있는 것으로 또한 고려된다. 백분율 "유사성(similarity)"은 상기 정렬의 두 서열 사이의 아미노산의 유사성(예를 들어, 소수성, 수소 결합 전위, 정전기 전하)의 정도를 정량화하는 데 사용된다. 이 방법은 특정 아미노산이 일치하기 위해 동일할 필요가 없다는 점을 제외하고는 동일성을 결정하는 것과 유사하다. 특정 실시양태에서, 서열 유사성은 기본 매개변수를 사용하여 잘 알려진 컴퓨터 프로그램으로 계산될 수 있다. 일반적으로, 아미노산은 예를 들어 다음 아미노산 그룹: Aromatic - F Y W; hydrophobic-A V I L; Charged positive: R K H; Charged negative - D E; Polar - S T N Q에 따라 유사한 특성을 가진 그룹에 속하는 경우 일치하는 것으로 분류된다.
"개체(Subject)"는 임의의 동물을 의미하지만, 예를 들어 인간, 원숭이, 마우스 또는 토끼와 같은 포유동물이 바람직하다.
본원에서 사용된 바와 같이, 상기 용어 "치료하다(treat)" 및 "치료하는(treating)"은 개체(예를 들어, 환자)가 치유되어 질병이 근절된 경우에 한정되지 않는다. 오히려, 본 개시내용의 실시양태는 또한 단순히 증상을 감소시키고/감소시키거나 질병 진행을 지연시키는 치료를 고려한다.
상기 용어 "핵산(nucleic acid)"은 뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드의 중합체를 의미한다. 상기 용어는 단일 분자 또는 분자 집합을 지정하는 데 사용된다. 핵산은 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있으며, 하기 기재된 바와 같이 다양한 제어 요소의 코딩 영역 및 영역을 포함할 수 있다.
상기 용어 "유전자를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드(a polynucleotide having a nucleotide sequence encoding a gene)" 또는 특정 폴리펩티드를“인코딩하는 핵산 서열(a nucleic acid sequence encoding)”은 유전자의 코딩 영역을 포함하는 핵산 서열 또는 다른 말로 유전자 생성물을 인코딩하는 핵산 서열을 의미한다. 상기 코딩 영역은 cDNA, 게놈 DNA 또는 RNA 형태로 존재할 수 있다. DNA 형태로 존재할 때, 올리고뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 단일 가닥(즉, 센스 가닥) 또는 이중 가닥일 수 있다. 인핸서/프로모터, 스플라이스 접합, 폴리아데닐화 신호 등과 같은 적절한 제어 요소는 전사의 적절한 개시 및/또는 1차 RNA 전사체의 정확한 처리를 허용하는 데 필요한 경우 상기 유전자의 코딩 영역에 매우 근접하게 배치될 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 발현 벡터에 사용되는 코딩 영역은 내인성 인핸서/프로모터, 스플라이스 접합, 중간 서열, 폴리아데닐화 신호 등 또는 내인성 및 외인성 제어 요소 둘 다의 조합을 함유할 수 있다.
상기 용어는 "작동 가능한 조합으로(in operable combination)", "작동 가능한 순서로(in operable order)" 및 "작동 가능하게 연결된(operably linked)"은 주어진 유전자의 전사 및/또는 원하는 단백질 분자의 합성을 지시할 수 있는 핵산 분자가 생성되는 방식으로 핵산 서열의 연결을 의미한다. 상기 용어는 또한 기능성 단백질이 생성되도록 하는 방식으로 아미노산 서열의 연결을 의미한다.
상기 용어 "조절 요소(regulatory element)"는 핵산 서열의 발현의 일부 양태를 제어하는 유전 요소를 의미한다. 예를 들어, 프로모터는 작동 가능하게 연결된 코딩 영역의 전사 개시를 촉진하는 조절 요소이다. 다른 조절 요소는 스플라이싱 신호(splicing signals), 폴리아데닐화 신호(polyadenylation signals), 종료 신호(termination signals) 등이다.
프로모터는 구성적이거나 규제 가능하다. 프로모터와 관련하여 만들어진 용어 "구성적(constitutive)"은 프로모터가 자극(예를 들어, 열 충격, 화학 물질, 빛 등)의 부존재하에 작동 가능하게 연결된 핵산 서열의 전사를 지시할 수 있음을 의미한다. 일반적으로, 구성적 프로모터는 실질적으로 임의의 세포 및 임의의 조직에서 이식유전자(transgene의 발현을 지시할 수 있다. 대조적으로, "조절 가능한(regulatable)" 또는 "유도 가능한(inducible)" 프로모터는 자극(예: 열 충격, 화학 물질, 빛 등)의 존재 하에 작동 가능하게 연결된 핵산 서열의 전사 수준을 지시할 수 있는 프로모터이며, 이는 상기 자극의 부존재하에 작동 가능하게 연결된 핵산 서열의 전사 수준과 상이하다.
상기 인핸서(enhancer) 및/또는 프로모터(promoter)는 "내인성(endogenous)" 또는 "외인성(exogenous)" 또는 "이종성(heterologous)"일 수 있다. "내인성(endogenous)" 인핸서 또는 프로모터는 게놈에서 주어진 유전자와 자연적으로 연결된 것이다. "외인성(exogenous)" 또는 "이종성(heterologous)" 인핸서 또는 프로모터는 유전자의 전사가 연결된 인핸서 또는 프로모터에 의해 지시되도록 유전자 조작(즉, 분자 생물학적 기술)에 의해 유전자에 병치로 배치된 것이다. 예를 들어, 제1 유전자와 작동 가능한 조합의 내인성 프로모터는 단리되고, 제거되고, 제2 유전자와 작동 가능한 조합으로 배치되어, 이를 제2 유전자와 작동 가능한 조합의 "이종성 프로모터(heterologous promoter)"로 만들 수 있다. 이러한 다양한 조합이 고려된다(예를 들어, 제1 및 제2 유전자는 동일한 종으로부터 유래하거나 상이한 종으로부터 유래할 수 있다).
도 1은 혈관 모방 조직(vascular mimetic tissue)을 생성하는 방법을 도시한다. 인간 소변 세포는 소변의 원심 분리에 의해 수집된다. 세포 펠렛은 성장 배지(소변 세포 성장 배지: Dulbecco's Modified Eagle's 배지(DMEM), DMEM/영양소 혼합물 F-12(DMEM/F-12는 단백질, 지질 또는 성장 인자를 함유하지 않음)를 함유한 10% 소 태아 혈청)에 현탁된다. 성장인자 EGF, 하이드로코르티손(hydrocortisone) 및 에피네프린(epinephrine)이 추가된다. 상기 세포 현탁액을 37℃, CO2(5%) 인큐베이터에서 14일 동안 인큐베이션하였다. 선택 세포는 콜로니를 형성하기 위해 복제된다. 복제된 소변 세포의 재프로그래밍은 ETV2를 인코딩하는 아데노바이러스 감염에 의해 시작된다. 상기 소변 유래 세포는 24시간 동안 성장한다. 그 후, 상기 배지는 VEGFA, EGF, bFGF, 헤파린 및 비타민 C를 포함하도록 변경된다.
도 2는 ETV2 처리된 복제 소변 세포에서 내피 유전자가 유의하게 유도되었음을 나타내는 데이터를 보여준다.
도 3은 혈관 모방 조직의 관형 네트워크 구조를 보여준다.
도 4는 비-EC 집단(KDR 음성)이 평활근 세포 특이적 유전자로 유의하게 풍부함을 나타내는 데이터를 보여준다.
도 5는 혈관 모방 조직의 제작을 도시한다.
도 6은 인간(H. sapiens, Query, NCBI Accession Number NP_055024.2) 및 마우스(M. musculus, Subject, NCBI Accession Number NP_031985.2)에 대한 ETV2, 동형 1의 서열 비교를 도시한다. 232/344(67%의 동일성), 250/344(73%의 양성), 11/344(3%의 격차).
인간 소변 세포를 재프로그래밍된 혈관 조직(rVT)으로 직접 재프로그래밍
관상 동맥 질환(예를 들어, 심근 경색) 및 말초 동맥 질환(예를 들어, 심각한 사지 허혈)을 포함하는 허혈성 심혈관 질환은 질병율 및 사망률의 빈번한 원인이다. 이러한 임상 결과의 주요 원인은 혈관 손실이다. 혈관 구조의 핵심 요소인 내피 세포(Endothelial cells, ECs)는 손상되거나 허혈성 조직을 복구하는 데 필수적이다. 세포 치료에 사용하기 위한 EC를 생성하기 위해 여러 접근 방식이 개발되었다. EC를 생성하기 위한 한 가지 접근 방식은 단일 전사 인자(TF) ETV2(변형된 mRNA, 단백질, 엑소좀을 포함하는 단백질을 포함하는 유전자 또는 유전자 생성물)를 사용하여 직접 혈통 재프로그래밍을 하는 것인데, 이는 EC 개발에 특이적이고 중요하다. 이 전략은 만능 줄기 세포(pluripotent stem cells, PSCs) 및 유도 만능 줄기 세포(iPSCs)의 사용으로 발생하는 잠재적인 종양원성의 회피 및 더 간단한 과정을 포함한 잠재적인 이점으로 인해 강조되었다. 본원에 개괄된 재프로그래밍 접근법은 자가 세포 요법에 적용될 수 있다.
평활근 세포를 포함하는 혈관 모방 조직의 형성을 초래하는 짧은 기간 내에 EC 성숙을 이용하는 향상된 재프로그래밍 방법이 개발되었다. 소스 세포는 임상 적용에 활용될 수 있는 비-침습적 방식으로 환자로부터 수집된다. 인간 소변 세포를 사용하여, 피부에서 진피 섬유아세포에 대한 생검을 통해 소스 세포를 샘플링하는 것과 관련된 통증을 피할 수 있다. 상기 소변 세포는 복제되고 내피와 유사하고 평활근 유사 조직으로 변형되어 관상 동맥 질환(coronary artery diseases), 심근 경색증(myocardial infarction), 심부전(heart failure), 말초 동맥 질환(peripheral artery diseases), 심각한 사지 허혈(critical limb ischemia), 뇌졸중(stroke), 당뇨병 합병증(diabetic complications), 및 상처 치유(would healing)를 포함하나 이에 제한되지 않는 혈관 재생이 필요한 질병을 치료하는 데 유용하다. 인간 소변 세포의 혈관 모방 조직으로의 변형은 특수 배양 조건 및 인간 소변 세포로의 ETV2 유전자 전달을 포함하는 프로토콜을 사용하여 달성된다.
자가 소스(autologous source)로부터의 천연 바이오스캐폴드 또는 바이오매트릭스의 내인성 합성은 표적 조직에서 이식된 세포의 생존을 향상시킨다. 상기 천연 ECM은 치료 세포에서 방출된 성장 인자를 침전시키고 세포가 신혈관 형성을 개시하기에 적합한 미세 환경을 제공한다.
치료용 세포 성분에서 자연적으로 형성된 천연 바이오매트릭스는 개별 세포 생성 및 인공 조직 구성에 필요한 복잡한 과정을 우회하면서 조직을 생성하는 효과적인 방법을 제시한다. 상기 천연 바이오매트릭스는 자가 소스에서 생성되기 때문에 생체 적합성이 더 높고, 상기 생성 메커니즘은 제조 공정 중 병원체 전달 위험이 가장 적다. 세포 매개 기질 합성은 실질적으로 조사되지 않았지만 본 연구는 합성 표현형을 가진 VSMC가 천연 기질 형성에 중요한 역할을 한다는 것을 나타낸다. TGFB 및 PDGFB의 도입은 콜라겐 합성을 유도하였다. 젖산염 배양 배지에서 VSMC는 또한 콜라겐 합성이 유의하게 높았으며, 이는 포도당 대사가 세포의 합성 표현형에 영향을 미칠 수 있음을 나타낸다. 아스코르브산의 투여는 VSMC와 피부 섬유아세포로부터 콜라겐 생합성을 자극하였다. 하이드록실프롤린(hydroxylproline)과 하이드록실리신(hydroxylysine)의 보조인자인 아스코르브산은 콜라겐 생합성 동안 알파 펩타이드 가교-결합에 중요한 역할을 한다.
인간 소변에서 소변 세포 추출:
샘플에서 소변 세포를 얻기 위해 소변을 수집하고 원심분리한다. 농축된 소변 세포를 수집하고, EGF, 하이드로코르티손, 에피네프린 및 소 태아 혈청(FBS)을 포함하는 성장 배지에 현탁하였다. 상기 세포 현탁액을 젤라틴으로 미리 코팅된 세포 배양 플레이트에 시딩하고 37℃, CO2(5%)에서 14일 동안 인큐베이션하였다. 소변 세포는 직접 재프로그래밍을 위한 소스 세포(source cells)로 추가 계대 배양(sub-culture)을 위해 유지되는 콜로니를 형성한다. FBS는 이종이 없는 상태(xeno free condition)를 제공하는 임상 목적을 위해 환자의 인간 혈청으로 대체될 수 있다.
인간 소변 세포를 혈관-모방 이슈(vascular-mimetic issue)/재프로그래밍된 혈관 조직(reprogrammed vascular tissue, rVT)으로 재프로그래밍
혈관 모방 조직을 생성하기 위해, 인간 소변 세포는 특정 배양 조건에서 ETV2의 과발현을 통해 내피 세포로 재프로그래밍된다. 인간 소변 세포의 재프로그래밍은 24시간 동안 소변 세포 성장 배지에서 ETV2를 발현하는 아데노바이러스의 세포 감염을 통해 시작된다. 그 후, 상기 내피 재프로그래밍 배지는 VEGFA, EGF, bFGF, 헤파린 및 비타민 C를 포함하도록 변경된다(도 1 참조). ETV2의 형질도입 후, 소변 세포의 형태는 코벨 스톤(corbel stone) 모양의 내피 세포로 나타난다. 재프로그래밍 과정은 재프로그래밍되지 않은 대조군 소변 세포와 비교하여 유전자 프로필 및 단백질 발현의 전환에 의해 모니터링되었다. 소변 세포가 내피 세포로 재프로그래밍되는지 여부를 결정하기 위해 정량 실시간 PCR을 통해 KDR, CDH5, PECAM1 및 VWF와 같은 내피 특이적 유전자에 대한 mRNA 수준을 측정하였다(도 2). EC 유전자는 ETV2 처리된 소변 세포에서 유의하게 유도되었다. 초기 내피 유전자 외에도, PECAM1 및 VWF와 같은 후기 성숙 내피 유전자가 발현되었다(도 2). 따라서, EC 마커의 유도는 빠르게 증가하고 진피 섬유아세포와 같은 다른 유형의 소스 세포에서는 발생하지 않는 PECAM1과 같은 성숙한 내피 표면 마커의 더 많은 수에 도달하였다. 인간 진피 섬유아세포는 ETV2 과발현을 통해 14일 미만의 짧은 재프로그래밍 기간 내에 더 높은 수준의 PECAM1을 발현하지 않는다. 소변 유래 세포는 또한 세포와 같은 평활근과 같은 여러 계통으로 전환-분화되었다.
내피 재프로그래밍 동안, 소변 세포는 세포 시트의 상단에 튜브와 같은 구조의 특수한 형태를 형성하였다. 기능적 특성을 테스트하기 위해, EC 특이적 아세트산 LDL의 흡수 및 UEA1 렉틴의 결합을 형광 세포화학법으로 확인하였다. 이 조직은 EC 마커와 CDH5, PECAM1, ACTA2 및 CNN1과 같은 평활근 마커와 함께 염색되었다. 재프로그래밍된 조직은 효소적으로 소화되었고 EC 특이적 마커인 KDR을 사용하여 EC 및 비-EC에 대한 집단으로 분리되었다. EC(ETV-VMT) 대 비-EC 마커를 통해 분리된 인구는 재프로그래밍된 조직이 각각 내피 및 평활근 유사 세포로 풍부하다는 것을 나타내었다(도 4). 상기 재프로그래밍된 조직은 기계적으로 수확되고 혈관 모방 구조를 위해 폴딩될 수 있다(도 5). 이 조직은 KDR, CDH5 및 PECAM1과 같은 세포를 발현하는 EC 마커의 30~50%를 포함하였다. ETV2 유도, 성숙한 EC 마커를 사용한 인간 진피 섬유아세포의 재프로그래밍과 비교하여, PECAM1은 더 짧은 재프로그래밍 기간으로 유의미하게 더 높고 효율적으로 유도된다. 비-EC 마커 발현 세포(KDR 음성)는 SM22a, SMTN, ACTA2 및 CNN1과 같은 평활근 마커의 높은 수준을 보여준(도 4). 재프로그래밍된 내피 및 평활근 유사 세포를 함유하는 조직을 마우스 뒷다리 허혈 모델에 이식하였다. 이 조직은 3개월 이상 생체 내에서 유지되었다. 따라서, 이 조직은 치료하는 동안 높은 체류성과 세포 생존이 필요한 허혈성 조직에 직접 이식 또는 주입하는 데 더 유리하다.
PSC의 분화 및 체세포의 직접 재프로그래밍과 같은, 다양한 다른 프로토콜을 사용하여 내피 세포를 생성하는 것은 임상 적용에 바람직한 기간 내에 충분한 수의 기능적 내피 세포를 달성하는 것으로 보고되지 않았다. 임상 적용을 위해 재프로그래밍된 EC를 사용하는 데 있어 주요 장애물은 환자의 허혈성 표적 영역에 주입된 EC의 낮은 보유 효율이었다. 본원에 기재된 방법은 다른 EC 생성 기술과 비교하여 몇 가지 장점이 있다. 소변은 비-침습적 방식으로 얻을 수 있는 소스 세포의 무한한 공급을 제공한다. EC 생성은 다른 방법에 비해 시기적절하다. 하나는 외부 생체 물질 없이 허혈성 영역에서 우수한 보유력을 갖는 세포 시트 구조 내에서 함께 재프로그래밍된 내피 및 평활근 세포를 얻는다. 이 재프로그래밍된 혈관 모방 조직은 PAD 및 MI와 같은 다양한 허혈성 질환에서 자가 세포 치료에 적용할 수 있다.
<110> Emory University <120> Endothelial and Smooth Muscle Like Tissue Produced from Urine Cells and Uses Related Thereto <130> IP22-0008 <150> US 62/903,154 <151> 2019-09-20 <150> PCT/US 2020/041537 <151> 2020-07-10 <160> 9 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 342 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Asp Leu Trp Asn Trp Asp Glu Ala Ser Pro Gln Glu Val Pro Pro 1 5 10 15 Gly Asn Lys Leu Ala Gly Leu Glu Gly Ala Lys Leu Gly Phe Cys Phe 20 25 30 Pro Asp Leu Ala Leu Gln Gly Asp Thr Pro Thr Ala Thr Ala Glu Thr 35 40 45 Cys Trp Lys Gly Thr Ser Ser Ser Leu Ala Ser Phe Pro Gln Leu Asp 50 55 60 Trp Gly Ser Ala Leu Leu His Pro Glu Val Pro Trp Gly Ala Glu Pro 65 70 75 80 Asp Ser Gln Ala Leu Pro Trp Ser Gly Asp Trp Thr Asp Met Ala Cys 85 90 95 Thr Ala Trp Asp Ser Trp Ser Gly Ala Ser Gln Thr Leu Gly Pro Ala 100 105 110 Pro Leu Gly Pro Gly Pro Ile Pro Ala Ala Gly Ser Glu Gly Ala Ala 115 120 125 Gly Gln Asn Cys Val Pro Val Ala Gly Glu Ala Thr Ser Trp Ser Arg 130 135 140 Ala Gln Ala Ala Gly Ser Asn Thr Ser Trp Asp Cys Ser Val Gly Pro 145 150 155 160 Asp Gly Asp Thr Tyr Trp Gly Ser Gly Leu Gly Gly Glu Pro Arg Thr 165 170 175 Asp Cys Thr Ile Ser Trp Gly Gly Pro Ala Gly Pro Asp Cys Thr Thr 180 185 190 Ser Trp Asn Pro Gly Leu His Ala Gly Gly Thr Thr Ser Leu Lys Arg 195 200 205 Tyr Gln Ser Ser Ala Leu Thr Val Cys Ser Glu Pro Ser Pro Gln Ser 210 215 220 Asp Arg Ala Ser Leu Ala Arg Cys Pro Lys Thr Asn His Arg Gly Pro 225 230 235 240 Ile Gln Leu Trp Gln Phe Leu Leu Glu Leu Leu His Asp Gly Ala Arg 245 250 255 Ser Ser Cys Ile Arg Trp Thr Gly Asn Ser Arg Glu Phe Gln Leu Cys 260 265 270 Asp Pro Lys Glu Val Ala Arg Leu Trp Gly Glu Arg Lys Arg Lys Pro 275 280 285 Gly Met Asn Tyr Glu Lys Leu Ser Arg Gly Leu Arg Tyr Tyr Tyr Arg 290 295 300 Arg Asp Ile Val Arg Lys Ser Gly Gly Arg Lys Tyr Thr Tyr Arg Phe 305 310 315 320 Gly Gly Arg Val Pro Ser Leu Ala Tyr Pro Asp Cys Ala Gly Gly Gly 325 330 335 Arg Gly Ala Glu Thr Gln 340 <210> 2 <211> 335 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2 Met Asp Leu Trp Asn Trp Asp Glu Ala Ser Leu Gln Glu Val Pro Pro 1 5 10 15 Gly Asp Lys Leu Thr Gly Leu Gly Ala Glu Phe Gly Phe Tyr Phe Pro 20 25 30 Glu Val Ala Leu Gln Glu Asp Thr Pro Ile Thr Pro Met Asn Val Glu 35 40 45 Gly Cys Trp Lys Gly Phe Pro Glu Leu Asp Trp Asn Pro Ala Leu Pro 50 55 60 His Glu Asp Val Pro Phe Gln Ala Glu Pro Val Ala His Pro Leu Pro 65 70 75 80 Trp Ser Arg Asp Trp Thr Asp Leu Gly Cys Asn Thr Ser Asp Pro Trp 85 90 95 Ser Cys Ala Ser Gln Thr Pro Gly Pro Ala Pro Pro Gly Thr Ser Pro 100 105 110 Ser Pro Phe Val Gly Phe Glu Gly Ala Thr Gly Gln Asn Pro Ala Thr 115 120 125 Ser Ala Gly Gly Val Pro Ser Trp Ser His Pro Pro Ala Ala Trp Ser 130 135 140 Thr Thr Ser Trp Asp Cys Ser Val Gly Pro Ser Gly Ala Thr Tyr Trp 145 150 155 160 Asp Asn Gly Leu Gly Gly Glu Ala His Glu Asp Tyr Lys Met Ser Trp 165 170 175 Gly Gly Ser Ala Gly Ser Asp Tyr Thr Thr Thr Trp Asn Thr Gly Leu 180 185 190 Gln Asp Cys Ser Ile Pro Phe Glu Gly His Gln Ser Pro Ala Phe Thr 195 200 205 Thr Pro Ser Lys Ser Asn Lys Gln Ser Asp Arg Ala Thr Leu Thr Arg 210 215 220 Tyr Ser Lys Thr Asn His Arg Gly Pro Ile Gln Leu Trp Gln Phe Leu 225 230 235 240 Leu Glu Leu Leu His Asp Gly Ala Arg Ser Ser Cys Ile Arg Trp Thr 245 250 255 Gly Asn Ser Arg Glu Phe Gln Leu Cys Asp Pro Lys Glu Val Ala Arg 260 265 270 Leu Trp Gly Glu Arg Lys Arg Lys Pro Gly Met Asn Tyr Glu Lys Leu 275 280 285 Ser Arg Gly Leu Arg Tyr Tyr Tyr Arg Arg Asp Ile Val Leu Lys Ser 290 295 300 Gly Gly Arg Lys Tyr Thr Tyr Arg Phe Gly Gly Arg Val Pro Val Leu 305 310 315 320 Ala Tyr Gln Asp Asp Met Gly His Leu Pro Gly Ala Glu Gly Gln 325 330 335 <210> 3 <211> 54 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 3 Met Asn Ser Asp Ser Glu Cys Pro Leu Ser His Asp Gly Tyr Cys Leu 1 5 10 15 His Asp Gly Val Cys Met Tyr Ile Glu Ala Leu Asp Lys Tyr Ala Cys 20 25 30 Asn Cys Val Val Gly Tyr Ile Gly Glu Arg Cys Gln Tyr Arg Asp Leu 35 40 45 Lys Trp Trp Glu Leu Arg 50 <210> 4 <211> 165 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 4 Ala Pro Met Ala Glu Gly Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys 1 5 10 15 Phe Met Asp Val Tyr Gln Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr Leu 20 25 30 Val Asp Ile Phe Gln Glu Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys 35 40 45 Pro Ser Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu 50 55 60 Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile 65 70 75 80 Met Arg Ile Lys Pro His Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe 85 90 95 Leu Gln His Asn Lys Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg 100 105 110 Gln Glu Asn Pro Cys Gly Pro Cys Ser Glu Arg Arg Lys His Leu Phe 115 120 125 Val Gln Asp Pro Gln Thr Cys Lys Cys Ser Cys Lys Asn Thr Asp Ser 130 135 140 Arg Cys Lys Ala Arg Gln Leu Glu Leu Asn Glu Arg Thr Cys Arg Cys 145 150 155 160 Asp Lys Pro Arg Arg 165 <210> 5 <211> 154 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 5 Ala Ala Gly Ser Ile Thr Thr Leu Pro Ala Leu Pro Glu Asp Gly Gly 1 5 10 15 Ser Gly Ala Phe Pro Pro Gly His Phe Lys Asp Pro Lys Arg Leu Tyr 20 25 30 Cys Lys Asn Gly Gly Phe Phe Leu Arg Ile His Pro Asp Gly Arg Val 35 40 45 Asp Gly Val Arg Glu Lys Ser Asp Pro His Ile Lys Leu Gln Leu Gln 50 55 60 Ala Glu Glu Arg Gly Val Val Ser Ile Lys Gly Val Cys Ala Asn Arg 65 70 75 80 Tyr Leu Ala Met Lys Glu Asp Gly Arg Leu Leu Ala Ser Lys Cys Val 85 90 95 Thr Asp Glu Cys Phe Phe Phe Glu Arg Leu Glu Ser Asn Asn Tyr Asn 100 105 110 Thr Tyr Arg Ser Arg Lys Tyr Thr Ser Trp Tyr Val Ala Leu Lys Arg 115 120 125 Thr Gly Gln Tyr Lys Leu Gly Ser Lys Thr Gly Pro Gly Gln Lys Ala 130 135 140 Ile Leu Phe Leu Pro Met Ser Ala Lys Ser 145 150 <210> 6 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 6 Gly Gly Gly Gly Gly Gly 1 5 <210> 7 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 7 Gly Gly Gly Gly Thr 1 5 <210> 8 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 8 Gly Gly Gly Pro Pro Pro 1 5 <210> 9 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 9 Gly Gly Gly Ala Pro Pro Pro 1 5

Claims (8)

  1. 하기를 포함하는 내피 및 평활근 유사 혈관 조직의 제조 방법:
    i) 개체의 소변 세포를 농축하는 단계;
    ii) 다음을 포함하는 제1 성장 배지에서 농축된 소변 세포를 복제하는 단계
    a) EGF,
    b) 히드로코르티손(hydrocortisone),
    c) 에피네프린(epinephrine) 및
    d) 인간 혈청 또는 동물 혈청;
    정제된 농축 소변 유래 세포(purified concentrated urine derive cells)를 제공하는 단계;
    iii) 정제된 농축 소변 유래 세포를 ETV2에 노출시키는 단계;
    iv) 제1 성장 배지에서 정제된 농축 소변 유래 세포를 배양하여 내피 유사 소변 유래 세포를 제공하는 단계;
    v) 다음을 포함하는 제2 성장 배지에서 내피 유사 소변 유래 세포를 배양하는 단계:
    a) EGF,
    b) VEGFA,
    c) bFGF,
    d) 헤파린(heparin),
    e) L-아스코르브산(L-ascorbic acid), 및
    d) 인간 혈청 또는 동물 혈청;
    내피 및 평활근 유사 혈관 조직을 제공하는 단계.
  2. 제1항에 있어서, 상기 인간 혈청이 개체로부터 유래하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 정제된 농축 소변 유래 세포를 ETV2에 노출시키는 단계는 정제된 농축 소변 유래 세포를 감염시키고 ETV2를 인코딩하는 유전자를 포함하고 감염 후 ETV2를 발현하는 재조합 바이러스와 정제 농축 소변 유래 세포를 혼합하는 단계에 의한 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 재조합 바이러스는 아데노바이러스(adenovirus) 또는 렌티바이러스(lentivirus)인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 성장 배지는 글루코오스(glucose), 아미노산(amino acids), 및 비타민(vitamins), 글루타민(glutamine), 및 소듐 피루베이트(sodium pyruvate)를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 내피 및 평활근 유사 혈관 조직을 3차원 구조로 폴딩하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제1항에 있어서, 내피 및 평활근 유사 혈관 조직을 개체에 이식하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 내피 및 평활근 유사 혈관 조직을 이식하는 단계는 내피 및 평활근 유사 혈관 조직을 정맥, 동맥, 모세혈관, 심장 근육, 피부, 폐, 신장 또는 장과 접촉시키는 단계인 것을 특징으로 하는 방법.
KR1020227012521A 2019-09-20 2020-07-10 요세포로부터 생성된 조직과 같은 내피 및 평활근 및 이와 관련된 용도 KR20220065805A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201962903154P 2019-09-20 2019-09-20
US62/903,154 2019-09-20
PCT/US2020/041537 WO2021055081A1 (en) 2019-09-20 2020-07-10 Endothelial and smooth muscle like tissue produced from urine cells and uses related thereto

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20220065805A true KR20220065805A (ko) 2022-05-20

Family

ID=74883434

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020227012521A KR20220065805A (ko) 2019-09-20 2020-07-10 요세포로부터 생성된 조직과 같은 내피 및 평활근 및 이와 관련된 용도

Country Status (8)

Country Link
US (1) US20220370507A1 (ko)
EP (1) EP4031151A4 (ko)
JP (1) JP2022549245A (ko)
KR (1) KR20220065805A (ko)
CN (1) CN114514315A (ko)
AU (1) AU2020350442A1 (ko)
CA (1) CA3154458A1 (ko)
WO (1) WO2021055081A1 (ko)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2024031033A2 (en) * 2022-08-04 2024-02-08 Wake Forest University Health Sciences In vitro construct useful for drug toxicity screening

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10398804B2 (en) * 2007-05-21 2019-09-03 Wake Forest University Health Sciences Progenitor cells from urine and methods for using the same
WO2010065239A1 (en) * 2008-12-05 2010-06-10 Wake Forest University Health Sciences Stem cells from urine and methods for using the same
JP5897002B2 (ja) * 2010-07-07 2016-04-13 セルラー ダイナミクス インターナショナル， インコーポレイテッド プログラミングによる内皮細胞の産生
WO2012168167A1 (en) * 2011-06-09 2012-12-13 F. Hoffmann-La Roche Ag Method for differentiation of pluripotent stem cells into vascular bed cells
KR101344719B1 (ko) * 2011-07-19 2013-12-26 한국과학기술연구원 응력을 가하여 줄기세포를 평활근세포로 분화시키는 방법 및 평활근세포를 함유하는 조직공학용 복합체
CN104520422B (zh) * 2012-05-30 2019-08-23 康奈尔大学 由人羊水来源的细胞生成功能性的和持久的内皮细胞
WO2014040030A1 (en) * 2012-09-10 2014-03-13 Wake Forest University Health Sciences Urine stem cells for skeletal muscle generation and uses thereof
CN102925409B (zh) * 2012-11-19 2014-07-02 上海市第六人民医院 尿液间充质干细胞的提取及扩增培养方法和应用
WO2014200340A1 (en) * 2013-06-10 2014-12-18 Academisch Ziekenhuis Leiden Differentiation and expansion of endothelial cells from pluripotent stem cells and the in vitro formation of vasculature like structures
JP2015109833A (ja) * 2013-11-08 2015-06-18 学校法人慶應義塾 線維芽細胞から血管内皮細胞を製造する方法
US10023842B2 (en) * 2014-04-29 2018-07-17 Emory University Endothelial and endothelial like cells produced from fibroblasts and uses related thereto
US11932876B2 (en) * 2017-02-03 2024-03-19 Cornell University Stable three-dimensional blood vessels and methods for forming the same
JP6916318B2 (ja) * 2017-06-30 2021-08-11 ステムラボ・インコーポレイテッド 尿細胞からケラチノサイト幹細胞への直接逆分化方法および逆分化したケラチノサイト幹細胞を利用した皮膚再生促進用組成物の製造方法
CN108570446A (zh) * 2017-12-05 2018-09-25 皓昇莱生物制药有限公司 一种尿液来源细胞的培养方法
CN108570443A (zh) * 2017-12-05 2018-09-25 皓昇莱生物制药有限公司 一种用于培养尿液来源细胞的培养基

Also Published As

Publication number Publication date
WO2021055081A1 (en) 2021-03-25
CN114514315A (zh) 2022-05-17
EP4031151A1 (en) 2022-07-27
CA3154458A1 (en) 2021-03-25
AU2020350442A1 (en) 2022-03-31
JP2022549245A (ja) 2022-11-24
US20220370507A1 (en) 2022-11-24
EP4031151A4 (en) 2023-10-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP1974022B1 (en) Mass producing method of growth factor using adipose derived adult stem cells
CN105316278B (zh) 用于转染细胞的方法和产品
CN105940110A (zh) 用于核酸产生和递送的方法和产品
CN102369212B (zh) 具有降低的bmp拮抗剂敏感性的骨形成蛋白2(bmp2)变体
CN108603169B (zh) 来自成体干细胞的诱导型起搏细胞和浦肯野细胞
CN105601728A (zh) 间充质干细胞分化
DK2913059T3 (en) Hitherto UNKNOWN PROCEDURE FOR TREATMENT OF SPINE INJURY USING HMGB1 FRAGMENT
JPWO2019107566A1 (ja) 外胚葉性間葉系幹細胞およびその製造方法
JP6999918B2 (ja) 血小板表面抗原と間葉系細胞表面抗原を共発現する血小板様細胞を含む創傷治癒促進剤
KR101349183B1 (ko) 3차원 세포배양으로 수득한 조건 배지를 유효성분으로 포함하는 허혈성 질환 치료용 약학적 조성물
US20220370507A1 (en) Endothelial and smooth muscle like tissue produced from urine cells and uses related thereto
CN107475185A (zh) 一种用于培养人间充质干细胞的无动物源成分培养基
WO2018144725A1 (en) Engineering blood vessel cells for transplantation
KR101698984B1 (ko) 렙틴을 포함하는 유도만능줄기세포로의 역분화 유도용 조성물 및 이를 이용한 유도만능줄기세포로의 역분화 유도 방법
CN107056895B (zh) 诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞分化的人工多肽及其生物制品
TW201537172A (zh) 加強腫瘤生長的方法
US20200385685A1 (en) Robust differentiation of human pluripotent stem cells into endothelial cells using transcription factor etv2
Guo et al. Lentivirus-mediated transfection of chondroitinase ABC gene without the bacterial leader sequence enables long-term secretion of functional chondroitinase ABC in human bone marrow stromal cells
CN111424035A (zh) 基于家蚕丝腺表达具有生物学活性的人结缔组织生长因子的方法及其产品和应用
CN110804593B (zh) 一种诱导皮肤成纤维细胞直接向神经元转分化的小分子化合物组合及应用
KR102400532B1 (ko) 유도 혈관내피세포의 직접교차 분화 효율 및 혈관 형성능 증강을 위한 조성물
CN114470162B (zh) Gdf6及其过表达试剂在制备心肌细胞保护剂中的应用
CN103045540A (zh) 促使骨髓间充质干细胞在大鼠脑内分化成神经元的新方法
KR20180079033A (ko) Igf-1 및 il-10을 분비하는 세포, 및 이의 용도
WO2023087548A1 (zh) Cpe在制备促进原位神经发生及治疗衰老相关神经退行性疾病药物中的应用