KR20230052279A - 비-천연 발생 변형 fc 수용체에 특이적으로 결합하는 igg의 인간 비-천연 발생 변형 fc 영역 - Google Patents

비-천연 발생 변형 fc 수용체에 특이적으로 결합하는 igg의 인간 비-천연 발생 변형 fc 영역 Download PDF

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히로키 시라이
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Abstract

본 발명은 IgG의 변형된 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드, 및 상기 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 변형된 Fcγ 수용체, 및 면역요법을 사용하여 환자의 질병 또는 장애를 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.

Description

비-천연 발생 변형 FC 수용체에 특이적으로 결합하는 IGG의 인간 비-천연 발생 변형 FC 영역
본 출원은 2020년 8월 19일자에 출원된 미국 가출원 제63/067,629호의 우선권을 주장한다. 전술한 출원의 전체 내용은 여기에 참조로서 혼입된다.
본 발명은 IgG의 변형된 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드, 및 상기 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 변형된 Fcγ 수용체, 및 면역요법을 사용하여 환자의 질병 또는 장애를 치료 또는 예방하는 방법에 관한 것이다.
면역계를 활용하여 암세포를 제거하는 암 면역요법의 연구 및 개발은 최근에 진행되고 있다(Nature Reviews Drug Discovery (2019) 18, pp. 899-900). 특히, 항원 인식 부위 및 활성화 신호 전달 부위가 연결된 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 키메라 항원 수용체 T-세포(CAR-T)는, 단회 투여 후 극적인 치료 효과를 나타내는 것으로 보고되었고(The New England Journal of Medicine (2017) 377, pp. 2545-2554), 새로운 암 치료법은 널리 기대되고 있다.
몇 가지 문제점들은 다양한 암 타입에 대한 종래의 CAR-T 요법의 개발에서 발생하였다(Nature Reviews Clinical Oncology (2020) 17, pp. 147-167). 먼저, CAR-T를 사용한 면역 세포 요법에서 사이토카인 방출 증후군과 같은 심각한 면역 반응-기반 부작용이 보고됨에 따라 안전성에 대한 문제가 있다. 종래의 CAR-T에서, CAR-발현 세포의 활성이 환자에게 세포를 이식한 후 선택적으로 조절될 수 없기 때문에 부작용의 발생을 다루는 것은 어려웠다. 암 조직은 치료 저항성을 획득하는 메커니즘을 가지고 있으며, 치료 과정 동안에 암-관련 항원을 상실한 암 세포의 출현(Cancer Discovery (2018) 8(10), pp. 1219-1226) 및 다양한 특성(이질성)을 가진 세포 개체군과 같은 문제점들도 발생했다. 단일 항원을 표적으로 하는, 종래의 CAR-T를 사용하는 현재 치료법들은 이러한 문제점들을 극복할 수 없다.
이러한 문제점을 해결하기 위해, 암 표적 분자 및 면역 효과기 세포(immune effector cells), 예컨대, T 세포 및 자연 살해(NK) 세포를 사용한 복합 요법이 연구되고 있다. FITC 및 CAR-T와 같은 태그 분자(tag molecules)를 갖고, 이러한 태그 분자를 인식하는 항체 분자가 개발되었다(WO 2012/082841, WO 2016/030414, 및 WO 2017/091546). 다양한 암 표적 분자와 태그-인식 CAR-T를 조합하였고, 이러한 기술은 단일 타입의 태그-인식 CAR-T에 여러 암 항원 및 암세포에 대한 세포독성 활성을 부여할 수 있다. 그러나, 원래 생체 내에 존재하지 않는 태그 분자를 항체에 부여함으로써 항체 분자의 면역원성이 높아질 위험이 있다.
한편, 태그 분자를 첨가하지 않은 항체 분자 자체 및 효과기 세포를 활용하는 기술도 개발되었다. 항체는 Fc 영역을 통해 Fc 수용체에 결합할 수 있고, 효과기 세포에 신호를 전달할 수 있다. 암 항원 인식 기능을 갖는 항체와 함께 사용하기 위해 생성된 세포는, Fc 수용체로서 (FcγRⅢA, CD16A로 알려진) IgG 수용체 Ⅲa의 Fc 단편을 발현하는 NK 세포(JCI Insight. (2019) 4(20): e130688) 및 신호 전달 부위 및 CD16A와 융합된 CAR을 발현하는 NK 세포(CD16A CAR-NK) 또는 T 세포(CD16A CAR-T)(British Journal of Cancer (2019) 120(1), pp. 79-87 , Oncotarget.(2017) 8(23), pp.37128-37139)를 포함한다. 단일 타입의 CD16A-발현 NK 및 T 세포가 다양한 암 표적 항체와 조합될 수 있기 때문에, 이들 세포들은 또한 다양한 항원을 발현하는 세포에 대한 세포독성 활성을 획득할 수 있는 우수한 치료 방법이 될 수 있는 잠재력을 가지고 있다. 항체 분자 자체를 사용하기 때문에, 태그 항체를 사용하는 것보다 더 낮은 면역원성 및 더 높은 수준의 안전성을 갖는 치료 방법이 얻어질 수 있는 것으로 믿어진다.
그러나, 생체 내 혈청에는 다량의 내인성 면역글로불린이 존재하며, 이들은 또한 CD16A에 결합한다. 혈청 내 가용성 Fc 수용체의 존재도 확인되었으며(Journal of Clinical Investigation (1990) 86, pp. 416-423), 이들은 치료용 항체에 결합한다. 다시 말하면, 효과기 세포 상에 CD16A가 체내 면역글로불린에 의해 점유되거나 또는 투여된 항체가 가용성 Fc 수용체에 의해 점유된 경우, 투여된 항체는 효과기 세포에 활성화 신호를 전달할 수 없어, 약효 저하가 예상된다. 또한, CD16A-발현 NK 세포, CD16A CAR-T 또는 CAR-NK 세포가, 자가항체와 같은, 환자 자신의 조직을 인식하는 항체 분자를 환자에게 투여된 경우, 이들은 환자 자신의 조직에 대해 활성화될 수 있고, 조직 손상을 유발할 수 있다. CD16A 돌연변이는 어푸코실화된 항체(afucosylated antibodies)에 결합하지만, 비-어푸코실화된 내인성 면역글로불린에는 결합하지 않는 것으로 알려져 있으나(WO 2017/161333), 이러한 어푸코실화된 항체는 CD16A 돌연변이뿐만 아니라 내인성 CD16A에도 신호를 전달한다. 내인성 면역글로불린에 결합하지 않는 CD16A 돌연변이와 내인성 CD16A에 결합하지 않는 Fc 돌연변이의 조합, 및 서로 특이적으로 결합하는 돌연변이의 조합은 현재까지 알려지지 않았다.
본 발명은 변형된 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드 및 면역요법으로 사용될 수 있는 이러한 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 변형된 Fcγ 수용체에 관한 것이다. 본 발명의 목적은 내인성 분자가 약효를 감소시키지 않는 면역요법을 제공하는데 있다.
본 발명은, 적어도 부분적으로, 내인성 면역글로불린에 결합하지 않는 비-천연 발생 Fcγ 수용체 돌연변이 및 내인성 Fcγ 수용체에 결합하지 않는 비-천연 발생 Fc 영역 돌연변이의 조합의 발견, 피험자를 치료하기 위한 면역요법으로서 비-천연 발생 Fcγ 수용체 돌연변이 및 비-천연 발생 Fc 영역 돌연변이에 특이적으로 결합하기 위한 이들 조합의 용도, 및 이들 조합을 제조하는 방법에 기초한다. 예를 들어, 본 발명자들은 인실리코(in silico)로 CD16A와 항체의 Fc 영역 사이에 결합 활성에 영향을 미치는 아미노산 부위를 추출했고, 돌연변이가 CD16A와 항체의 Fc 영역에 도입된 돌연변이체를 제조했으며, 야생형에 대한 결합 활성에서의 변화를 평가하여, 야생형에 대한 결합 활성이 감소되었음을 발견하였다(실시예 1-4). 이러한 발견에 기초하여, 본 발명자들은 야생형 CD16A에 대한 결합 활성을 나타내지 않지만, 비-천연 발생 돌연변이된 CD16A에 대한 높은 결합 활성을 유지하는 비-천연 발생 Fc 영역 돌연변이체를 확인했다. 본 발명자들은 또한 야생형 CD16A에 결합하지 않는 비-천연 발생 변형된 Fc 영역 및 야생형 항체 Fc 영역에 결합하지 않는 비-천연 발생 돌연변이된 CD16A의 조합을 확인했다. 다른 항원에 대한 다수의 항체를 사용하여 유사한 결과가 얻어졌기 때문에, 이들 특성들이 항원에 의존하지 않는다는 것을 또한 밝혀냈다(실시예 5-8). 본 발명자들은 야생형 CD16A 또는 비-천연 발생 돌연변이된 CD16A를 발현하는 자연 살해(NK) 세포주를 더욱 확립하고, 항체-의존성 세포매개 세포독성(ADCC)이 실시예 6에서 확인된 결합 활성을 반영함을 확인했다(실시예 10, 11). 더군다나, 본 발명자들은 실시예 6에서 과잉의 IgG1 항체 존재하에서의 결합 활성 특성을 확인했다(실시예 9).
본 발명은 의학 및 산업에서 유용할 것으로 기대되는 조성물 및 방법으로서 다음의 관점들을 제공한다.
하나의 관점에서, 본 발명은 IgG의 변형된 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드를 제공하며, 여기서, 상기 변형된 Fc 영역은 비-천연 발생이고, 야생형 또는 천연 발생 IgG의 Fc 영역과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함한다. 상기 폴리펩티드는 야생형 또는 천연 발생 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성이 본질적으로 없고, 야생형 또는 천연 발생 Fcγ 수용체와 비교하여 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는 비-천연 발생 Fcγ 수용체에 결합할 수 있다.
몇몇 구현예에서, 야생형 또는 천연 발생 Fcγ 수용체는 야생형 또는 천연 발생 CD16A이고, 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는 비-천연 발생 Fcγ 수용체는 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는 비-천연 발생 CD16A이다.
몇몇 구현예에서, 야생형 또는 천연 발생 CD16A는 SEQ ID NO: 78에 나타낸 아미노산 서열을 포함한다.
몇몇 구현예에서, 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는 CD16A는, (i) SEQ ID NO: 78에서의 위치 131에 상응하는 위치에서 라이신에서 아스파르트산(K131D 돌연변이), (ⅱ) SEQ ID NO: 78에서의 위치 128에 상응하는 위치에서 라이신에서 글루탐산(K128E 돌연변이), 및 (ⅲ) SEQ ID NO: 78에서의 위치 131에 상응하는 위치에서 라이신에서 글루탐산(K131E 돌연변이)으로부터 선택된 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다.
몇몇 구현예에서, 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는 CD16A는, K131D 돌연변이 및 K128E 돌연변이 중 하나 또는 둘 모두를 포함한다. 다른 구현예에서, 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는 CD16A는, K131E 돌연변이 및 K128E 돌연변이 중 하나 또는 둘 모두를 포함한다. 몇몇 구현예에서, 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는 CD16A는, K131D 돌연변이를 포함하고, (ⅳ) SEQ ID NO: 78에서의 위치 38에 상응하는 위치에서 아스파라긴에서 글루타민(N38Q 돌연변이) 및 (v) SEQ ID NO: 78에서의 위치 74에 상응하는 위치에서 아스파라긴에서 글루타민(N74Q 돌연변이)으로부터 선택된 적어도 하나의 돌연변이를 더욱 포함한다. 다른 구현예에서, 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는 CD16A는, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, 또는 SEQ ID NO: 88에 나타낸 아미노산 서열을 포함한다.
몇몇 구현예에서, 상기 폴리펩티드는 인간 Igγ1의 변형된 Fc 영역을 포함하고, 상기 변형된 Fc 영역은 (i) EU 인덱스 넘버링(index numbering)에 따른 위치 269에 상응하는 위치에서 글루탐산에서 아르기닌으로의 돌연변이(E269R 돌연변이) 및 (ⅱ) (a) EU 인덱스 넘버링에 따른 위치 294에 상응하는 위치에서 글루탐산에서 아르기닌(E294R 돌연변이) 및 (b) EU 인덱스 넘버링에 따른 위치 294에 상응하는 위치에서 글루탐산에서 라이신(E294K 돌연변이)으로부터 선택된 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다.
몇몇 구현예에서, 폴리펩티드는 항체이다. 다른 구현예에서, 폴리펩티드는 암 항원에 결합하는 항체이다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 면역요법을 사용하여 환자의 질병 또는 장애를 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 여기에 기재된 바와 같은 폴리펩티드 및 야생형 또는 천연 발생 Fcγ 수용체와 비교하여 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는 비-천연 발생 Fcγ 수용체를 발현하는 세포를 환자에게 투여하는 단계를 포함하고, 여기서, 상기 폴리펩티드는 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는 상기 비-천연 발생 Fcγ 수용체에 결합할 수 있다.
몇몇 구현예에서, 세포는 인간 면역 세포이다. 다른 구현예에서, 인간 면역 세포는, T 세포, 대식세포, 수지상 세포, NKT-세포, NK 세포, 미세아교세포(microglia), 파골세포, 과립구, 단핵구, 및 선천성 면역 세포로부터 선택되는 세포이다. 몇몇 구현예에서, 세포는 줄기 세포로부터 유래된다. 다른 구현예에서, 줄기 세포는, 만능 줄기 세포(pluripotent stem cell), 조혈 줄기 세포, 성체 줄기 세포, 태아 줄기 세포, 중간엽 줄기 세포, 산후 줄기 세포, 다능성 줄기 세포(multipotent stem cell), 및 배아 생식 세포로부터 선택된다. 몇몇 구현예에서, 줄기 세포는 만능 줄기 세포이다. 다른 구현예에서, 만능 줄기 세포는 유도 만능 줄기 세포(iPS 세포) 또는 배아 줄기 세포(ES 세포)이다.
몇몇 구현예에서, 세포는 베타-2 마이크로글로불린(B2M) 유전자에서 유전적으로 조작된 파괴를 포함한다.
몇몇 구현예에서, 상기 세포는, 인간 백혈구 항원(HLA)-1α 사슬의 적어도 일부에, 직접적으로 또는 링커 서열(linker sequence)을 통해, 공유적으로 결합된 B2M 단백질의 적어도 일부를 포함하는 단일 사슬 융합 인간 백혈구 항원(HLA) 클래스 I 단백질을 인코딩할 수 있는 폴리뉴클레오티드를 더욱 포함한다. 몇몇 구현예에서, 상기 HLA-1α 사슬은, HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F, 및 HLA-G로부터 선택된다.
몇몇 구현예에서, 세포는 인간 백혈구 항원(HLA) 클래스 Ⅱ-관련 유전자에서 유전적으로 조작된 파괴를 포함한다. 몇몇 구현예에서, 상기 HLA 클래스 Ⅱ-관련 유전자는, 조절 인자 X-관련 안키린-함유 단백질(RFXANK), 조절 인자 5(RFX5), 조절 인자 X 관련 단백질(RFXAP), 클래스 Ⅱ 트랜스활성자(transactivator)(CⅡTA), HLA-DPA(α 사슬), HLA-DPB(β 사슬), HLA-DQA, HLA-DQB, HLA-DRA, HLA-DRB, HLA-DMA, HLA-DMB, HLA-DOA, 및 HLA-DOB로부터 선택된다.
몇몇 구현예에서, 세포는 단일 사슬 융합 HLA 클래스 Ⅱ 단백질 또는 HLA 클래스 Ⅱ 단백질을 인코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
몇몇 구현예에서, 상기 방법은 암을 치료 또는 예방하는 방법이다.
하나의 관점에서, 본 개시는 여기에 기재된 바와 같은 폴리펩티드 및 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
몇몇 구현예에서, 상기 약학 조성물은 면역요법용 세포와 병용하며, 여기서, 상기 세포는 야생형 또는 천연 발생 Fcγ 수용체와 비교하여 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는 비-천연 발생 Fcγ 수용체를 발현하고, 여기서, 상기 폴리펩티드는 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는 비-천연 발생 Fcγ 수용체에 결합할 수 있다.
몇몇 구현예에서, 세포는 인간 면역 세포이다. 몇몇 구현예에서, 상기 인간 면역 세포는, T 세포, 대식세포, 수지상 세포, NKT-세포, NK 세포, 미세아교세포, 파골세포, 과립구, 단핵구, 및 선천성 면역 세포로부터 선택된 세포이다. 몇몇 구현예에서, 상기 세포는 줄기 세포로부터 유래된다. 몇몇 구현예에서, 줄기 세포는, 만능 줄기 세포, 조혈 줄기 세포, 성체 줄기 세포, 태아 줄기 세포, 중간엽 줄기 세포, 산후 줄기 세포, 다능성 줄기 세포, 및 배아 생식 세포로부터 선택된다. 몇몇 구현예에서, 줄기 세포는 만능 줄기 세포이다. 몇몇 구현예에서, 만능 줄기 세포는 유도 만능 줄기 세포(iPS 세포) 또는 배아 줄기 세포(ES 세포)이다.
몇몇 구현예에서, 세포는 베타-2 마이크로글로불린(B2M) 유전자에서 유전적으로 조작된 파괴를 포함한다.
몇몇 구현예에서, 상기 세포는, 인간 백혈구 항원(HLA)-1α 사슬의 적어도 일부에, 직접적으로 또는 링커 서열을 통해, 공유적으로 결합된 B2M 단백질의 적어도 일부를 포함하는 단일 사슬 융합 인간 백혈구 항원(HLA) 클래스 I 단백질을 인코딩할 수 있는 폴리뉴클레오티드를 더욱 포함한다. 몇몇 구현예에서, 상기 HLA-1α 사슬은 HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F, 및 HLA-G로부터 선택된다.
몇몇 구현예에서, 상기 세포는 인간 백혈구 항원(HLA) 클래스 Ⅱ-관련 유전자에서 유전적으로 조작된 파괴를 포함한다. 몇몇 구현예에서, 상기 HLA 클래스 Ⅱ-관련 유전자는, 조절 인자 X-관련 안키린-함유 단백질(RFXANK), 조절 인자 5(RFX5), 조절 인자 X 관련 단백질(RFXAP), 클래스 Ⅱ 트랜스활성자(CⅡTA), HLA-DPA(α 사슬), HLA-DPB(β 사슬), HLA-DQA, HLA-DQB, HLA-DRA, HLA-DRB, HLA-DMA, HLA-DMB, HLA-DOA, 및 HLA-DOB로부터 선택된다.
몇몇 구현예에서, 상기 세포는 단일 사슬 융합 HLA 클래스 Ⅱ 단백질 또는 HLA 클래스 Ⅱ 단백질을 인코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 면역요법을 사용하여 환자의 질병 또는 장애를 치료 또는 예방하기 위한 키트를 제공한다. 상기 키트는 (i) 여기에 기재된 바와 같은 폴리펩티드 및 (ⅱ) 야생형 또는 천연 발생 Fcγ 수용체와 비교하여 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는 비-천연 발생 Fcγ 수용체를 발현하는 세포를 포함하고, 여기서, 상기 폴리펩티드는 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는 비-천연 발생 Fcγ 수용체에 결합할 수 있다.
몇몇 구현예에서, 상기 세포는 인간 면역 세포이다. 몇몇 구현예에서, 상기 인간 면역 세포는, T 세포, 대식세포, 수지상 세포, NKT-세포, NK 세포, 미세아교세포, 파골세포, 과립구, 단핵구, 및 선천성 면역 세포로부터 선택되는 세포이다. 몇몇 구현예에서, 상기 세포는 줄기 세포로부터 유래된다. 몇몇 구현예에서, 상기 줄기 세포는, 만능 줄기 세포, 조혈 줄기 세포, 성체 줄기 세포, 태아 줄기 세포, 중간엽 줄기 세포, 산후 줄기 세포, 다능성 줄기 세포, 및 배아 생식 세포로부터 선택된다. 몇몇 구현예에서, 줄기 세포는 만능 줄기 세포이다. 몇몇 구현예에서, 만능 줄기 세포는 유도 만능 줄기 세포(iPS 세포) 또는 배아 줄기 세포(ES 세포)이다.
몇몇 구현예에서, 세포는 베타-2 마이크로글로불린(B2M) 유전자에서 유전적으로 조작된 파괴를 포함한다.
몇몇 구현예에서, 상기 세포는, 인간 백혈구 항원(HLA)-1α 사슬의 적어도 일부에, 직접적으로 또는 링커 서열을 통해, 공유적으로 결합된 B2M 단백질의 적어도 일부를 포함하는 단일 사슬 융합 인간 백혈구 항원(HLA) 클래스 I 단백질을 인코딩할 수 있는 폴리뉴클레오티드를 더욱 포함한다. 몇몇 구현예에서, 상기 HLA-1α 사슬은 HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F, 및 HLA-G로부터 선택된다.
몇몇 구현예에서, 상기 세포는 인간 백혈구 항원(HLA) 클래스 Ⅱ-관련 유전자에서 유전적으로 조작된 파괴를 포함한다. 몇몇 구현예에서, 상기 HLA 클래스 Ⅱ-관련 유전자는, 조절 인자 X-관련 안키린-함유 단백질(RFXANK), 조절 인자 5(RFX5), 조절 인자 X 관련 단백질(RFXAP), 클래스 Ⅱ 트랜스활성자(CⅡTA), HLA-DPA(α 사슬), HLA-DPB(β 사슬), HLA-DQA, HLA-DQB, HLA-DRA, HLA-DRB, HLA-DMA, HLA-DMB, HLA-DOA, 및 HLA-DOB로부터 선택된다.
몇몇 구현예에서, 상기 세포는 단일 사슬 융합 HLA 클래스 Ⅱ 단백질 또는 HLA 클래스 Ⅱ 단백질을 인코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
하나의 관점에서, 본 발명은, 야생형 또는 천연 발생 CD16A와 비교하여 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는 비-천연 발생 CD16A를 발현하는 세포를 제공하며, 여기서, 상기 적어도 하나의 아미노산 돌연변이는, (i) SEQ ID NO: 78에서의 위치 131에 상응하는 위치에서 라이신에서 아스파르트산(K131D 돌연변이), (ⅱ) SEQ ID NO: 78에서의 위치 128에 상응하는 위치에서 라이신에서 글루탐산(K128E 돌연변이), 및 (ⅲ) SEQ ID NO: 78에서의 위치 131에 상응하는 위치에서 라이신에서 글루탐산(K131E 돌연변이)으로부터 선택되고, 여기서, 상기 비-천연 발생 CD16A는 SEQ ID NO: 78과 90% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
몇몇 구현예에서, 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는 CD16A는 K131D 돌연변이 및 K128E 돌연변이 중 하나 또는 둘 모두를 포함한다.
몇몇 구현예에서, 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는 CD16A는 K131E 돌연변이 및 K128E 돌연변이 중 하나 또는 둘 모두를 포함한다.
몇몇 구현예에서, 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는 CD16A는 K131D 돌연변이를 포함하고, (ⅳ) SEQ ID NO: 78에서의 위치 38에 상응하는 위치에서 아스파라긴에서 글루타민(N38Q 돌연변이) 및 (v) SEQ ID NO: 78에서의 위치 74에 상응하는 위치에서 아스파라긴에서 글루타민(N74Q 돌연변이)으로부터 선택된 적어도 하나의 돌연변이를 더욱 포함한다.
몇몇 구현예에서, 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는 CD16A는, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, 또는 SEQ ID NO: 88에 나타낸 아미노산 서열을 포함한다.
몇몇 구현예에서, 상기 세포는 인간 면역 세포이다. 몇몇 구현예에서, 상기 인간 면역 세포는, T 세포, 대식세포, 수지상 세포, NKT-세포, NK 세포, 미세아교세포, 파골세포, 과립구, 단핵구, 및 선천성 면역 세포로부터 선택되는 세포이다. 몇몇 구현예에서, 상기 세포는 줄기 세포로부터 유래된다. 몇몇 구현예에서, 상기 줄기 세포는, 만능 줄기 세포, 조혈 줄기 세포, 성체 줄기 세포, 태아 줄기 세포, 중간엽 줄기 세포, 산후 줄기 세포, 다능성 줄기 세포, 및 배아 생식 세포로부터 선택된다. 몇몇 구현예에서, 상기 줄기 세포는 만능 줄기 세포이다. 몇몇 구현예에서, 만능 줄기 세포는 유도 만능 줄기 세포(iPS 세포) 또는 배아 줄기 세포(ES 세포)이다.
몇몇 구현예에서, 세포는 베타-2 마이크로글로불린(B2M) 유전자에서 유전적으로 조작된 파괴를 포함한다.
몇몇 구현예에서, 상기 세포는, 인간 백혈구 항원(HLA)-1α 사슬의 적어도 일부에, 직접적으로 또는 링커 서열을 통해, 공유적으로 결합된 B2M 단백질의 적어도 일부를 포함하는 단일 사슬 융합 인간 백혈구 항원(HLA) 클래스 I 단백질을 인코딩할 수 있는 폴리뉴클레오티드를 더욱 포함한다. 몇몇 구현예에서, 상기 HLA-1α 사슬은 HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F, 및 HLA-G로부터 선택된다.
몇몇 구현예에서, 상기 세포는 인간 백혈구 항원(HLA) 클래스 Ⅱ-관련 유전자에서 유전적으로 조작된 파괴를 포함한다. 몇몇 구현예에서, 상기 HLA 클래스 Ⅱ-관련 유전자는, 조절 인자 X-관련 안키린-함유 단백질(RFXANK), 조절 인자 5(RFX5), 조절 인자 X 관련 단백질(RFXAP), 클래스 Ⅱ 트랜스활성자(CⅡTA), HLA-DPA(α 사슬), HLA-DPB(β 사슬), HLA-DQA, HLA-DQB, HLA-DRA, HLA-DRB, HLA-DMA, HLA-DMB, HLA-DOA, 및 HLA-DOB로부터 선택된다.
몇몇 구현예에서, 세포는 단일 사슬 융합 HLA 클래스 Ⅱ 단백질 또는 HLA 클래스 Ⅱ 단백질을 인코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
하나의 관점에서, 본 발명은 여기에 기재된 바와 같은 세포 및 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
몇몇 구현예에서, 상기 약학 조성물은, 면역치료용 IgG의 변형된 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드와 병용하며, 여기서, 상기 변형된 Fc 영역은 비-천연 발생이고, 야생형 또는 천연 발생 IgG의 Fc 영역과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하며, 상기 폴리펩티드는 야생형 또는 천연 발생 CD16A에 대해 결합 활성이 본질적으로 없고, 세포에 의해 발현된 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는 비-천연 발생 CD16A에 결합할 수 있다.
몇몇 구현예에서, 상기 폴리펩티드는 인간 Igγ1의 변형된 Fc 영역을 포함하고, 상기 변형된 Fc 영역은 (i) EU 인덱스 넘버링에 따른 위치 269에 상응하는 위치에서 글루탐산에서 아르기닌으로의 돌연변이(E269R 돌연변이) 및 (ⅱ) (a) EU 인덱스 넘버링에 따른 위치 294에 상응하는 위치에서 글루탐산에서 아르기닌(E294R 돌연변이) 및 (b) EU 인덱스 넘버링에 따른 위치 294에 상응하는 위치에서 글루탐산에서 라이신(E294K 돌연변이)으로부터 선택된 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다.
몇몇 구현예에서, 상기 폴리펩티드는 항체이다. 몇몇 구현예에서, 상기 폴리펩티드는 암 항원에 결합하는 항체이다.
몇몇 구현예에서, 상기 약학 조성물은 암을 치료하기 위한 것이다.
하나의 관점에서, 본 발명은 IgG의 변형된 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드를 제조하는 방법을 제공한다. 상기 방법은: 1) IgG의 변형된 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드를 제공하는 단계로서, 여기서, 상기 변형된 Fc 영역은 비-천연 발생이고, 야생형 또는 천연 발생 IgG와 비교하여 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는, 폴리펩티드를 제공하는 단계; 2) 야생형 또는 천연 발생 Fcγ 수용체에 대한 단계 1)에서 얻은 폴리펩티드의 결합 활성을 측정하는 단계; 3) 야생형 또는 천연 발생 Fcγ 수용체와 비교하여 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는 비-천연 발생 Fcγ 수용체에 대한 단계 1)에서 얻은 폴리펩티드의 결합 활성을 측정하는 단계; 및 4) 단계 1)에서 얻은 폴리펩티드로부터, 야생형 또는 천연 발생 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성이 본질적으로 없고, 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는 비-천연 발생 Fcγ 수용체에 결합하는 폴리펩티드를 선택하는 단계를 포함한다.
몇몇 구현예에서, 상기 야생형 또는 천연 발생 Fcγ 수용체는 야생형 또는 천연 발생 CD16A이고, 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는 비-천연 발생 Fcγ 수용체는 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는 비-천연 발생 CD16A이다.
몇몇 구현예에서, 상기 야생형 또는 천연 발생 CD16A는 SEQ ID NO: 78에 나타낸 아미노산 서열을 포함한다.
몇몇 구현예에서, 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는 비-천연 발생 CD16A는, (i) SEQ ID NO: 78에서의 위치 131에 상응하는 위치에서 라이신에서 아스파르트산(K131D 돌연변이), (ⅱ) SEQ ID NO: 78에서의 위치 128에 상응하는 위치에서 라이신에서 글루탐산(K128E 돌연변이), 및 (ⅲ) SEQ ID NO: 78에서의 위치 131에 상응하는 위치에서 라이신에서 글루탐산(K131E 돌연변이)으로부터 선택된 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다.
몇몇 구현예에서, 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는 CD16A는 K131D 돌연변이 및 K128E 돌연변이 중 하나 또는 둘 모두를 포함한다.
몇몇 구현예에서, 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는 CD16A는 K131E 돌연변이 및 K128E 돌연변이 중 하나 또는 둘 모두를 함유한다.
몇몇 구현예에서, 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는 CD16A는 K131D 돌연변이를 포함하고, (ⅳ) SEQ ID NO: 78에서의 위치 38에 상응하는 위치에서 아스파라긴에서 글루타민(N38Q 돌연변이) 및 (v) SEQ ID NO: 78에서의 위치 74에 상응하는 위치에서 아스파라긴에서 글루타민(N74Q 돌연변이)으로부터 선택된 적어도 하나의 돌연변이를 더욱 포함한다.
몇몇 구현예에서, IgG의 변형된 Fc 영역을 포함하는 비-천연 발생 폴리펩티드는 항체이다. 몇몇 구현예에서, 상기 항체는 암 항원에 결합하는 항체이다.
몇몇 구현예에서, IgG의 변형된 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드는 항체이고, 상기 방법은 상기 항체와 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는 비-천연 발생 Fcγ 수용체를 발현하는 면역 세포 및 상기 항체가 결합하는 항원을 발현하는 세포를 접촉시키는 단계, 및 항체-의존성 세포매개 세포독성(ADCC) 활성을 측정하는 단계를 더욱 포함한다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 비-천연 발생 Fcγ 수용체의 제조 방법을 제공한다. 상기 방법은: 1) 야생형 또는 천연 발생 Fcγ 수용체와 비교하여 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는 비-천연 발생 Fcγ 수용체를 제공하는 단계; 2) 야생형 또는 천연 발생 IgG의 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드 및 상기 야생형 또는 천연 발생 IgG와 비교하여 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는 IgG의 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드를 제공하는 단계; 3) 상기 야생형 또는 천연 발생 IgG의 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드에 대한 단계 1)에서 얻은 비-천연 발생 Fcγ 수용체의 결합 활성을 측정하는 단계; 4) 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는 IgG의 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드에 대한 단계 1)에서 얻은 비-천연 발생 Fcγ 수용체의 결합 활성을 측정하는 단계; 및 5) 단계 1)에서 얻은 비-천연 발생 Fcγ 수용체로부터, 야생형 또는 천연 발생 IgG의 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드에 대한 결합 활성이 본질적으로 없고, 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는 IgG의 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드에 결합하는 비-천연 발생 Fcγ 수용체를 선택하는 단계를 포함한다.
몇몇 구현예에서, 상기 Fcγ 수용체는 CD16A이다.
몇몇 구현예에서, 야생형 또는 천연 발생 Fcγ 수용체는 SEQ ID NO: 78에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 CD16A이다.
몇몇 구현예에서, 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는 IgG의 Fc 영역은, 야생형 또는 천연 발생 인간 Igγ1과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는 인간 Igγ1의 Fc 영역이고, (a) EU 인덱스 넘버링에 따른 위치 269에 상응하는 위치에서 글루탐산에서 아르기닌으로의 돌연변이(E269R 돌연변이) 및 (b) (i) EU 인덱스 넘버링에 따른 위치 294에 상응하는 위치에서 글루탐산에서 아르기닌으로의 돌연변이(E294R 돌연변이) 및 (ⅱ) EU 인덱스 넘버링에 따른 위치 294에 상응하는 위치에서 글루탐산에서 라이신으로의 돌연변이(E294K 돌연변이)로부터 선택된 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다.
몇몇 구현예에서, 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는 IgG의 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드는 항체이다. 몇몇 구현예에서, 상기 항체는 암 항원에 결합하는 항체이다.
몇몇 구현예에서, 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는 IgG의 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드는 항체이고, 상기 방법은 단계 2)에서 얻은 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는 IgG의 Fc 영역을 포함하는 항체와 단계 1)에서 얻은 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는 Fcγ 수용체를 발현하는 면역 세포 및 상기 항체가 결합하는 항원을 발현하는 세포를 접촉시키는 단계, 및 항체-의존성 세포매개 세포독성(ADCC) 활성을 측정하는 단계를 더욱 포함한다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 (a) IgG의 변형된 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드 및 (b) 비-천연 발생 변형된 Fcγ 수용체를 포함하는 결합 쌍(binding pair)을 제조하는 방법을 제공한다. 상기 방법은: 1) 야생형 또는 천연 발생 IgG의 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드 및 IgG의 변형된 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드를 제공하는 단계로서, 여기서, 상기 변형된 Fc 영역은 비-천연 발생이며, 야생형 또는 천연 발생 IgG의 Fc 영역과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는, 폴리펩티드를 제공하는 단계; 2) 야생형 또는 천연 발생 Fcγ 수용체 및 비-천연 발생 변형된 Fcγ 수용체를 제공하는 단계로서, 여기서, 상기 변형된 Fcγ 수용체는 야생형 또는 천연 발생 Fcγ 수용체와 비교하여 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는, Fcγ 수용체를 제공하는 단계; 3) 단계 1)에서 얻은 각 폴리펩티드에 대한 단계 2)에서 얻은 각 Fcγ 수용체의 결합 활성을 측정하는 단계; 및 4) (a) 변형된 Fcγ 수용체에 결합하고, 야생형 또는 천연 발생 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성이 본질적으로 없는 변형된 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드, 및 (b) 변형된 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드에 결합하고, 야생형 또는 천연 발생 IgG의 Fc 영역에 결합하지 않는 변형된 Fcγ 수용체를 선택하는 단계를 포함한다.
몇몇 구현예에서, 상기 Fcγ 수용체는 CD16A이다.
몇몇 구현예에서, 야생형 또는 천연 발생 CD16A는 SEQ ID NO: 78에 나타낸 아미노산 서열을 함유한다.
몇몇 구현예에서, IgG의 변형된 Fc를 포함하는 폴리펩티드는 항체이다. 몇몇 구현예에서, 상기 항체는 암 항원에 결합하는 항체이다.
몇몇 구현예에서, 단계 4)에서 선택된 IgG의 변형된 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드는 항체이고, 상기 방법은 상기 항체와 단계 4)에서 선택된 변형된 Fcγ 수용체를 발현하는 면역 세포 및 상기 항체가 결합하는 항원을 발현하는 세포를 접촉시키는 단계, 및 항체-의존성 세포매개 세포독성(ADCC) 활성을 측정하는 단계를 더욱 포함한다.
본 발명이 특이적 결합 패턴을 나타내는 돌연변이된 Fc 영역 및 돌연변이된 Fcγ 수용체의 조합 및 이들 조합을 사용하여 내인성 분자가 약효를 감소시키지 않는 면역요법을 제공할 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 CD16V 또는 CD16V 돌연변이체에 대한 야생형 Fc 또는 돌연변이 Fc 타입(mutant Fc type) 항-HER2 항체의 결합 활성을 도시한다. 수직축은 450 ㎚에서의 흡광도와 기준 파장 570 ㎚에서의 흡광도 사이에 차이를 나타내고, 수평축은 CD16V 또는 CD16V 돌연변이체 농도(ng/mL)를 나타낸다.
도 2는 CD16V 또는 CD16V 돌연변이체에 대한 야생형 Fc 또는 돌연변이 Fc 타입 항-HER2 항체의 결합 활성을 도시한다. 수직축은 450 ㎚에서의 흡광도와 기준 파장 650 ㎚에서의 흡광도 사이에 차이를 나타내고, 수평축은 CD16V 또는 CD16V 돌연변이체 농도(ng/mL)를 나타낸다.
도 3은 CD16V 또는 CD16V 돌연변이체에 대한 야생형 Fc 또는 돌연변이 Fc 타입 항-EGFR 항체의 결합 활성을 도시한다. 수직축은 450 ㎚에서의 흡광도와 기준 파장 650 ㎚에서의 흡광도 사이에 차이를 나타내고, 수평축은 CD16V 또는 CD16V 돌연변이체 농도(ng/mL)를 나타낸다.
도 4는 CD16V 또는 CD16V 돌연변이체에 대한 야생형 Fc 또는 돌연변이 Fc 타입 항-EpCAM 항체의 결합 활성을 도시한다. 수직축은 450 ㎚에서의 흡광도와 기준 파장 650 ㎚에서의 흡광도 사이에 차이를 나타내고, 수평축은 CD16V 또는 CD16V 돌연변이체 농도(ng/mL)를 나타낸다.
도 5는 항-KLH 항체 경쟁 조건하에서 CD16V 또는 CD16V 돌연변이체에 대한 야생형 Fc 또는 돌연변이 Fc 타입 항-HER2 항체의 결합 활성을 도시한다. 수직축은 450 ㎚에서의 흡광도와 기준 파장 650 ㎚에서의 흡광도 사이에 차이를 나타내고, 수평축은 CD16V 또는 CD16V 돌연변이체 농도(ng/mL)를 나타낸다.
도 6은 유동 세포측정 분석(flow cytometric analysis)에서 CD16V 또는 CD16V 돌연변이체-발현 KHYG-1 세포에서의 CD16V 또는 CD16V 돌연변이체의 발현 수준을 도시한다. 수직축은 세포 수를 나타내고, 수평축은 형광 강도(CD16V 발현 수준)를 나타낸다. 도면에서 숫자는 CD16V 또는 CD16V 돌연변이체를 발현하는 세포의 비율을 나타낸다.
도 7은 항-HER2 항체의 존재하에서 HER2-양성 SK-BR-3 세포에 대한 KHYG-1 세포의 ADCC 활성을 도시한다. 수직축은 세포독성 활성(%)을 나타내고, 수평축은 항체 농도(ng/mL)를 나타낸다.
도 8은 인간 혈청의 존재하에서 HER2-양성 SK-BR-3 세포에 대한 KHYG-1 세포의 항-HER2 항체-유도 ADCC 활성을 도시한다. 수직축은 세포독성 활성(%)을 나타낸다.
도 9는 항-HER2 항체의 존재하에서 HER2-양성 SK-BR-3 세포에 대한 CD16V CAR-T의 세포독성 활성을 도시한다. 수직축은 세포독성 활성(%)을 나타내고, 수평축은 항체 농도(ng/mL)를 나타낸다.
다음은 본 발명의 상세한 설명이다. 본 발명은 이러한 상세한 설명에 제한되지 않음에 유의한다. 본 명세서에서, 본 발명과 관련하여 사용되는 과학 및 기술 용어는, 특별한 정의가 없는 한, 당업자가 일반적으로 이해하는 의미를 갖는다.
I. 정의
여기에서 사용된 바와 같은, 용어 "항체"는 면역글로불린을 의미하며, 이황화 결합에 의해 안정화된 2개의 중쇄(H 사슬)와 2개의 경쇄(L 사슬)를 포함하는 생체분자를 지칭한다. 중쇄는 중쇄 가변 영역(VH), 중쇄 불변 영역(CH1, CH2, CH3) 및 CH1과 CH2 사이에 위치한 힌지 영역(hinge region)으로 이루어지며, 경쇄는 경쇄 가변 영역(VL)과 경쇄 불변 영역(CL)으로 이루어진다. 이들 중에서, VH와 VL로 구성된 가변 영역 단편(Fv)은 항원 결합에 직접 참여하고 항체에 다양성을 제공하는 영역이다. 가변 영역 중에서, 항원과 직접 접촉하는 영역들은 특히 중요한 변화를 가지며, 상보성-결정 영역(CDRs)으로 알려져 있다. 상대적으로 적은 돌연변이를 갖는 CDR의 외부 부분은 프레임워크 영역(FR)으로 알려져 있다. 경쇄 및 중쇄 가변 영역들은 각각 3개의 CDRs을 가지며, 이는, 각각, N-말단 측으로부터 순차적으로 중쇄 CDR1 내지 CDR3 및 경쇄 CDR1 내지 CDR3로 알려져 있다.
여기에서 사용된 바와 같은, 용어 "IgG"는, 5개 클래스의 면역글로불린(IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE) 중 하나를 지칭한다. IgG는 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 서브클래스(subclasses)를 가지며, 이들의 상응하는 중쇄는 Igγ1, Igγ2, Igγ3 및 Igγ4로 지칭된다.
여기에서 사용된 바와 같은, 용어 "Fc 영역"은, 항체의 중쇄에서 힌지 영역, CH2, 및 CH3으로 이루어진 영역, 또는 항체의 중쇄에서 CH2 및 CH3으로 이루어진 영역을 지칭한다. Fc 영역은 다형성(polymorphism)을 함유할 수 있다(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., 1991, NIH Publication No. 91-3242).
여기에서 사용된 바와 같은, 용어 "항원-결합 단편"은 항원에 결합할 수 있는 항체의 단편을 의미한다. 항원-결합 단편의 특정 예로는, VL, VH, CL 및 CH1 영역으로 이루어진 Fab; 2개의 Fabs가 힌지 영역에서 이황화 결합에 의해 연결된 F(ab')2; VL 및 VH로 이루어진 Fv; VL과 VH가 인공 폴리펩티드 링커(artificial polypeptide linker)에 의해 연결된 단일 사슬 항체인 scFv; 및 디아바디(diabodies), 단일-사슬 디아바디(scDb), 탠덤(tandem) scFv, 및 류신 지퍼(leucine zippers)와 같은 이중특이성 항체를 포함한다.
여기에서 사용된 바와 같은, 용어 "인간 항체"는 인간 면역글로불린 아미노산 서열을 갖는 항체를 지칭한다. 본 명세서에서, "인간화 항체"는, CDRs 이외의 아미노산 잔기의 일부, 대부분, 또는 전부가 인간 면역글로불린 분자로부터 유래된 아미노산 잔기로 대체된 항체를 지칭한다. 인간화 방법은 특별한 제한이 없으며, 예를 들어, 미국 특허 제5225539호 또는 미국 특허 제6180370호를 참조하여, 인간화 항체는 제조될 수 있다. 전술한 특허 각각의 전체적인 내용은 여기에 참조로 혼입된다.
정상적인 전장 항체(full-length antibodies)에 부가하여, 항체는 전장 항체, 항원-결합 단편 및/또는 Fc 영역을 조합하여 구축된 외팔형 항체(one-armed antibodies)(Proceedings of the National Academy of Sciences, (2013) 110 (32), pp. E2987-2996) 및 이중특이성 항체(Nature Reviews Drug Discovery, (2019)18, pp. 585-608)와 같은 다양한 형태의 항체를 포함한다.
본 명세서에서 사용된 항체에 대한 아미노산 잔기 번호는, EU 인덱스 넘버링을 사용하여 명시되고(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., 1991, NIH Publication No. 91-3242), 이러한 넘버링 시스템에 따라 정의될 수 있다.
여기에서 사용된 바와 같은, 용어 "Fcγ 수용체(FcγR)"는 많은 면역 세포에서 발현되는 면역글로불린 상과(superfamily)에 속하는 단백질을 지칭한다. FcγR은 IgG의 Fc 영역에 대한 수용체 단백질이며, IgG의 Fc 영역에 대한 결합 활성을 갖는다. FcγR은 FcγRI(CD64), FcγRIIA(CD32A), FcγRIIB(CD32B), FcγRⅢA(CD16A), 및 FcγRⅢB(CD16B)를 포함한다. 대식세포 및 수지상 세포에서 발현되는 FcγRI(CD64)은 IgG의 Fc 영역에 강하게 결합하는 것으로 알려져 있으며, 단핵구 및 호중구에서 발현되는 FcγRIIA(CD32A), FcγRIIB(CD32B) 및 FcγRIIC(CD32C) 뿐만 아니라 대식세포 및 NK 세포에서 발현되는 FcγRⅢA(CD16A) 및 FcγRⅢB(CD16B)는 IgG의 Fc 영역에 약하게 결합하는 것으로 알려져 있다. CD16A는 IgG의 Fc 영역에 결합하여 (아래에서 기재된) ADCC의 개시에 관여하는 것으로 알려져 있다.
여기에서 사용된 바와 같은, 용어 "항체-의존성 세포매개 세포독성(ADCC) 작용"은 항체의 Fc 영역에 기인할 수 있는 효과기 작용 중 하나를 지칭한다. ADCC는 대식세포 및 NK 세포와 같은 면역 세포 및 표적 세포 상의 항원에 대한 항체의 결합을 통해 면역 세포가 표적 세포를 파괴하는 작용이다. 면역 세포에 대한 항체의 결합은 항체의 Fc 영역 및 면역 세포의 Fcγ 수용체를 통해 발생한다. ADCC는 Fcγ 수용체 ⅢA(CD16A)에 Fc 영역의 결합에 의해 유도된다.
여기에서 사용된 바와 같은, 용어 "병용"은, 치료 목적을 위해 동일한 피험자에게 다른 타입의 활성 약학적 성분을 동시에 또는 개별적으로 투여하는 것을 지칭한다. 병용 동안에, 다른 타입의 활성 약학적 성분은 동일한 조성물에 포함될 수 있거나 또는 다른 조성물에 개별적으로 포함될 수 있다.
여기에서 사용된 바와 같은, 용어 "약학 조성물"은 하나 이상의 약학적 활성 성분을 함유하는 단일 조성물을 지칭한다. "복합제(Combination drug)"은 다른 활성 약학 성분이 다른 조성물에 개별적으로 함유된 약학 조성물의 조합을 의미한다.
여기에서 사용된 바와 같은, 용어 "천연 발생"은 임의의 인공적 또는 인위적 변형 없이 자연에 존재하는 것을 지칭한다. "천연 발생" 및 "야생형"은 상호교환적으로 사용될 수 있다. 본 명세서에서, "비-천연 발생"은, 야생형 또는 천연 발생 생성물과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는 본 발명의 생성물과 같은, 자연에 천연적으로 존재하지 않는 인공적 또는 인위적인 생성물을 의미한다. 본 발명의 비-천연 발생 폴리펩티드 및 Fcγ 수용체와 관련하여, "비-천연 발생"은 또한 이의 야생형 또는 천연 발생 대응물에 본질적으로 결합하지 않지만, 야생형 또는 천연 발생 대응물과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는 비-천연 발생 대응물에 결합하는 것을 지칭할 수 있다.
Ⅱ. 본 발명의 폴리펩티드
본 발명은 IgG의 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드를 제공하며, 여기서, 상기 Fc 영역은 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하고, 상기 폴리펩티드는 야생형 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성이 본질적으로 없고, 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는 Fcγ 수용체에 결합한다.
상기 폴리펩티드는 IgG의 Fc 영역을 포함한다. 몇몇 구현예에서, IgG의 Fc 영역은 인간 IgG의 Fc 영역이고, 다형성을 함유할 수 있다. 몇몇 구현예에서, IgG의 Fc 영역은 인간 Igγ1의 Fc 영역이다. Fc 영역의 아미노산 서열은 UniProt와 같은 공개 데이터베이스로부터 당업자가 용이하게 얻을 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드는 이것이 IgG의 Fc 영역을 함유하는 한 임의의 형태의 폴리펩티드일 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드는 항체와 생체분자의 Fc 융합 단백질 또는 이의 단편 및 Fc 영역일 수 있다.
몇몇 구현예에서, 상기 폴리펩티드는 항체이다. 몇몇 구현예에서, 상기 폴리펩티드는 인간 항체 및 인간화 항체이다. 본 발명에서, "항체"는 보통의 IgG 타입 항체뿐만 아니라, Fc 영역을 갖는 한, 외팔형 항체 및 이중특이성 항체와 같이 다양한 형태의 항체를 포함한다.
몇몇 구현예에서, Fc 영역은 IgG의 변형된 Fc 영역이고, Fc 영역은 비-천연 발생이며, 야생형 또는 천연 발생 IgG의 Fc 영역과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함한다. 본 발명에서, Fc 영역에서 "아미노산 돌연변이"는, Fc 영역에서 미리결정된 아미노산 위치에 아미노산의 치환, 결실, 또는 삽입을 지칭한다. 본 발명에서, 폴리펩티드는 야생형 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성이 본질적으로 없고, 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는 Fcγ 수용체에 결합한다. 본 발명의 폴리펩티드의 Fc 영역에서 아미노산 돌연변이는, 본 발명의 폴리펩티드가 이러한 결합 특성을 나타내는 한, 임의의 아미노산 돌연변이일 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서, Fc 영역에서 아미노산 돌연변이는 야생형 Fcγ 수용체에 대한 Fc 영역의 결합에 관련된 Fc 영역 내에 아미노산 잔기에서의 아미노산 돌연변이이다. 본 발명의 일 구현예에서, Fc 영역은 인간 Igγ1의 Fc 영역이고, 상기 Fc 영역에서 아미노산 돌연변이는 EU 인덱스 넘버링에 따른 인간 Igγ1 불변 영역 내에 아미노산 위치 233, 234, 235, 236, 237, 239, 265, 269, 294, 297, 299, 328, 및 329에서의 아미노산으로부터 선택된 적어도 하나 이상의 아미노산 위치에서의 아미노산 돌연변이이다(Nature (2000) 406, pp. 267-273, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America (2015) 112, pp. 833-838). 본 발명의 일 구현예에서, Fc 영역은 인간 Igγ1의 Fc 영역이고, 상기 Fc 영역에서 아미노산 돌연변이는 EU 인덱스 넘버링에 따른 인간 Igγ1 불변 영역 내에 아미노산 위치 269 및 294에서의 아미노산으로부터 선택된 적어도 하나 이상의 아미노산 위치에서의 아미노산 돌연변이이다. 본 발명의 일 구현예에서, Fc 영역은 인간 Igγ1의 Fc 영역이고, 상기 Fc 영역에서 아미노산 돌연변이는 EU 인덱스 넘버링에 따른 인간 Igγ1 불변 영역 내에 아미노산 위치 269 및 294에서의 아미노산으로부터 선택된 1개 또는 2개의 아미노산 위치에서의 아미노산 돌연변이이다. 본 발명의 일 구현예에서, 돌연변이의 도입 전에 인간 Igγ1 불변 영역은 SEQ ID NO: 24에 나타낸 아미노산 서열을 함유한다. 본 발명의 일 구현예에서, 돌연변이의 도입 전에 인간 Igγ1 Fc 영역은 SEQ ID NO: 24에 나타낸 아미노산 서열에서 서열 1 내지 330을 함유한다.
본 발명의 폴리펩티드에서, 표적 Fcγ 수용체에서 "아미노산 돌연변이"는 상응하는 야생형 Fcγ 수용체에서 미리결정된 아미노산 위치에서 아미노산의 치환, 결실, 또는 삽입을 지칭한다. 야생형 Fcγ 수용체는 다형성을 함유할 수 있는 천연 발생 Fcγ 수용체를 지칭한다.
적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는 Fcγ 수용체는, 야생형 Fcγ 수용체의 아미노산 서열과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명의 구현예에서, 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는 Fcγ 수용체는, 야생형 Fcγ 수용체의 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명의 구현예에서, 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는 Fcγ 수용체는, 야생형 Fcγ 수용체의 아미노산 서열에 비해 5, 4, 3, 2, 또는 1개의 아미노산 돌연변이를 함유한다.
여기에서 사용된 바와 같은, 용어 "동일성"은 디폴트(default)로 제공되는 파라미터에 의해 EMBOSS Needle(Nucleic Acids Res. (2015) 43, pp. W580-W584)을 사용하여 얻은 동일성 값을 지칭한다. 이러한 파라미터는 다음과 같다.
갭 오픈 페널티(Gap Open Penalty) = 10
갭 확장 페널티(Gap Extend Penalty) = 0.5
매트릭스 = EBLOSUM62
본 발명의 폴리펩티드와 Fcγ 수용체의 결합 특성은 임의의 공지된 결합 활성 측정 방법을 사용하여 확인될 수 있다. 예를 들어, 결합 활성은 효소-결합 면역흡착 검사(enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA))를 사용하여 측정될 수 있다. 하나의 실시예에서, 다음의 단계들은 본 발명의 폴리펩티드와 Fcγ 수용체의 결합 특성을 확인하기 위해 수행될 수 있다. 야생형 Fcγ 수용체 및 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는 Fcγ 수용체는 본 발명의 폴리펩티드에 의해 표적화되는 Fcγ 수용체로서 제조된다. 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드(예를 들어, 항체)는 제조된다. 폴리펩티드에 의해 표적화되는 단백질(예를 들어, 항원 단백질)은 ELISA 플레이트 상에 고정되고, 폴리펩티드가 첨가되며 이것과 반응된다. 폴리펩티드와 반응한 후, 각각의 Fcγ 수용체는 첨가되며 반응된다. 이러한 반응 후에, 겨자무 과산화효소(horseradish peroxidase(HRP))와 같은 효소로 표지된 항-Fcγ 수용체 항체와 같은 2차 항체가 반응된다. 이들 반응 후, 세척 작업은 수행되고, 2차 항체의 결합은 활성을 검출하는 시약(예컨대, HRP 표지의 경우 TMB 시약(DAKO, Cat. S1599))을 사용하여 이러한 활성을 측정하여 확인되며, 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 함유하는 Fc 영역을 포함하는 항체가 야생형 Fcγ 수용체 및 아미노산 돌연변이 또는 돌연변이들을 함유하는 Fcγ 수용체에 결합하는지 여부를 평가할 수 있다. 사용된 특정 평가 방법은 하기 실시예 4에 기재된 방법일 수 있다.
여기에서 사용된 바와 같은, 야생형 Fcγ 수용체에 대한 문구 "결합 활성이 본질적으로 없고"는, 본 발명의 폴리펩티드가 결합하는 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 함유하는 Fcγ 수용체에 대한 본 발명의 폴리펩티드의 결합 활성보다 현저히 높지 않은 야생형 Fcγ 수용체에 대한 본 발명의 폴리펩티드의 결합 활성을 지칭한다. 본 발명의 일 구현예에서, 야생형 Fcγ 수용체에 대한 "결합 활성이 본질적으로 없음"이 ELISA 방법을 사용하여 측정된 경우, 이것은 대조군으로 사용된 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 함유하는 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성의 10% 이하, 5% 이하, 3% 이하, 2% 이하, 1% 이하, 0.5% 이하, 0.1% 이하, 또는 0.05% 이하이다.
본 발명의 폴리펩티드에 의해 표적화된 Fcγ 수용체는 본 발명의 폴리펩티드에 대한 의도된 용도 및 기타 요인에 기초하여 당업자에 의해 선택될 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서, Fcγ 수용체는 FcγRI(CD64), FcγRIIA(CD32A), FcγRIIB(CD32B), FcγRⅢA(CD16A), 또는 FcγRⅢB(CD16B)일 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 폴리펩티드에 의해 표적화된 Fcγ 수용체는 CD16이다. 본 발명의 일 구현예에서, Fcγ 수용체는 CD16A이다. 야생형 CD16A는 CD16A V158 및 CD16A F158의 두 가지 다형성을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 일 구현예에서, 야생형 CD16A는 CD16A V158이다.
본 발명의 폴리펩티드의 구현예에서, 표적 Fcγ 수용체는 CD16A이고, 야생형 CD16A는 SEQ ID NO: 78에 나타낸 아미노산 서열을 함유한다.
본 발명의 폴리펩티드의 구현예에서, 표적 Fcγ 수용체는 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는 CD16A이고, 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는 CD16A는 SEQ ID NO: 78에서의 위치 131에 상응하는 위치에서 라이신으로부터 아스파르트산으로의 돌연변이(K131D 돌연변이), SEQ ID NO: 78에서의 위치 128에 상응하는 위치에서 라이신으로부터 글루탐산으로의 돌연변이(K128E 돌연변이), 및 SEQ ID NO: 78에서의 위치 131에 상응하는 위치에서 라이신으로부터 글루탐산으로의 돌연변이(K131E 돌연변이)로부터 선택된 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다. 본 발명의 일 구현예에서, 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는 CD16A는 K131D 돌연변이 및 K128E 돌연변이 중 하나 또는 둘 모두를 함유한다. 본 발명의 일 구현예에서, 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는 CD16A는 K131E 돌연변이 및 K128E 돌연변이 중 하나 또는 둘 모두를 포함한다. 본 발명의 일 구현예에서, 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는 CD16A는 K131D 돌연변이 및 SEQ ID NO: 78에서의 위치 38에 상응하는 위치에서 아스파라긴으로부터 글루타민으로의 돌연변이(N38Q 돌연변이) 및 SEQ ID NO: 78에서의 위치 74에 상응하는 위치에서 아스파라긴으로부터 글루타민으로의 돌연변이(N74Q 돌연변이)로부터 선택되는 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 경우, SEQ ID NO: 78에서의 위치에 "상응하는 위치"라는 용어는, CD16A에서의 아미노산 서열이 BLAST와 같은 서열 정렬 프로그램을 사용하여 SEQ ID NO: 78에서의 아미노산 서열과 정렬된 경우, CD16A에서의 아미노산 위치가 SEQ ID NO: 78에서의 아미노산 위치와 동일한 위치로 정렬된 것을 지칭한다.
본 발명의 일 구현예에서, 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는 CD16A는, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, 또는 SEQ ID NO: 88에 나타낸 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 78에서의 아미노산 서열을 포함하는 CD16A에 대한 결합 활성이 본질적으로 없지만, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, 또는 SEQ ID NO: 88에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 CD16A에 결합한다.
본 발명의 일 구현예에서, 폴리펩티드는 인간 Igγ1의 Fc 영역을 포함하고, 상기 Fc 영역은 EU 인덱스 넘버링에 따른 인간 Igγ1 불변 영역 내에 아미노산 위치 269 및 294에서의 아미노산으로부터 선택된 적어도 하나 이상의 아미노산 위치에서의 아미노산 돌연변이를 포함한다. 본 발명의 일 구현예에서, 폴리펩티드는 인간 Igγ1의 Fc 영역을 포함하고, 상기 Fc 영역은 EU 인덱스 넘버링에 따른 인간 Igγ1 불변 영역 내에 아미노산 위치 269 및 294에서의 아미노산으로부터 선택된 1개 또는 2개의 아미노산 위치에서의 아미노산 돌연변이를 포함한다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 폴리펩티드는 인간 Igγ1의 Fc 영역을 포함하고, 상기 Fc 영역은 EU 인덱스 넘버링에 따른 위치 269에 상응하는 위치에서 글루탐산으로부터 아르기닌으로의 돌연변이(E269R 돌연변이) 및 EU 인덱스 넘버링에 따른 위치 294에 상응하는 위치에서 글루탐산으로부터 아르기닌으로의 돌연변이(E294R 돌연변이) 및 EU 인덱스 넘버링에 따른 위치 294에 상응하는 위치에서 글루탐산으로부터 라이신으로의 돌연변이(E294K 돌연변이)로부터 선택된 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다.
본 발명의 폴리펩티드 및 상기 폴리펩티드에 의해 표적화되는 Fcγ 수용체에 대한 아미노산 서열 정보는, UniProt와 같은 공개 데이터베이스로부터 입수할 수 있고, 이들은 이러한 아미노산 서열 정보에 기초로 하여 당업자에게 공지된 임의의 방법을 사용하거나 또는 본 명세서에 기재된 방법을 사용하여 용이하게 제조될 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드가 항체인 경우, 임의의 항원에 대한 항체는 사용될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드가 항체인 경우, 상기 항체는 당업자에게 공지된 항체 제조 방법에 따라 표적 항원으로 면역화시켜 얻어질 수 있거나, 또는 공지된 항체의 Fc 영역 내로 아미노산 돌연변이를 도입하여 제조될 수 있다.
본 발명의 구현예에서, 폴리펩티드는 암 항원에 결합하는 항체이다. 본 발명의 폴리펩티드를 제조하는데 사용될 수 있는 공지된 항체는, 항-CD19 항체(tafacitamab, Drug Bank Accession Number: DB15044), 항-HER2 항체, 항-EpCAM 항체, 또는 항-EGFR 항체를 포함한다.
본 발명의 일 구현예에서, 폴리펩티드는 인간 Igγ1의 Fc 영역을 포함하는 항-CD19 항체, 항-HER2 항체, 항-EpCAM 항체, 또는 항-EGFR 항체이고, 상기 Fc 영역은 EU 인덱스 넘버링에 따른 인간 Igγ 불변 영역에서의 위치 269에서 글루탐산으로부터 아르기닌으로의 돌연변이(E269R 돌연변이) 및 EU 인덱스 넘버링에 따른 위치 294에서 인간 Igγ 불변 영역에서의 글루탐산으로부터 아르기닌으로의 돌연변이(E294R 돌연변이) 및 글루탐산으로부터 라이신으로의 돌연변이(E294K 돌연변이)로부터 선택된 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다.
Ⅲ. 아미노산 돌연변이를 포함하는 CD16A를 발현하는 세포
본 발명은 또한 본 발명의 폴리펩티드와 함께 사용될 수 있는 CD16A-발현 세포를 제공한다.
하나의 관점에서, 본 발명은 야생형 또는 천연 발생 CD16A와 비교하여 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는 비-천연 발생 CD16A를 발현하는 세포를 제공하며, 여기서, 상기 적어도 하나의 아미노산 돌연변이는, (i) SEQ ID NO: 78에서의 위치 131에 상응하는 위치에서 라이신에서 아스파르트산(K131D 돌연변이), (ⅱ) SEQ ID NO: 78에서의 위치 128에 상응하는 위치에서 라이신에서 글루탐산(K128E 돌연변이), 및 (ⅲ) SEQ ID NO: 78에서의 위치 131에 상응하는 위치에서 라이신에서 글루탐산(K131E 돌연변이)으로부터 선택되고, 여기서, 상기 비-천연 발생 CD16A는 SEQ ID NO: 78과 90% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 CD16A-발현 세포에 의해 발현되는 CD16A는 K131D 돌연변이 및 K128E 돌연변이 중 하나 또는 둘 모두를 포함한다. 본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 CD16A-발현 세포에 의해 발현되는 CD16A는 K131E 돌연변이 및 K128E 돌연변이 중 하나 또는 둘 모두를 포함한다. 본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 CD16A-발현 세포에 의해 발현되는 CD16A는 K131D 돌연변이 및 SEQ ID NO: 78에서의 위치 38에 상응하는 위치에서 아스파라긴으로부터 글루타민으로의 돌연변이(N38Q 돌연변이) 및 SEQ ID NO: 78에서의 위치 74에 상응하는 위치에서 아스파라긴으로부터 글루타민으로의 돌연변이(N74Q 돌연변이)로부터 선택된 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다.
본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 CD16A-발현 세포에 의해 발현되는 CD16A는 SEQ ID NO: 78의 아미노산 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 CD16A-발현 세포에 의해 발현되는 CD16A는 SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, 또는 SEQ ID NO: 88에 나타낸 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 CD16A-발현 세포로 사용되는 세포는, 본 발명의 폴리펩티드와 함께 사용하여 면역 반응이 조절(예를 들어, 유도 또는 억제)될 수 있는 한, 임의의 세포일 수 있다. 상기 세포는 선천 면역계 또는 후천 면역계의 면역 세포일 수 있으며, 그 예로는 NK 세포, NKT-세포, 대식세포, 미세아교세포, 파골세포, (호중구, 호산구, 및 호염기구를 포함하는) 과립구, 단핵구, 수지상 세포, T 세포, 및 B 세포, 및 이와 유사한 것을 포함한다. 본 발명의 구현예에서, 상기 세포는 인간 기원의 세포이다. 본 발명의 일 구현예에서, 상기 세포는 인간 면역 세포이다. 본 발명의 일 구현예에서, 상기 세포는 인간 NK 세포 또는 인간 T 세포이다.
본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 CD16A-발현 세포로 사용되는 세포는, 만능 줄기 세포, 조혈 줄기 세포, 성체 줄기 세포, 태아 줄기 세포, 중간엽 줄기 세포, 산후 줄기 세포, 다능성 줄기 세포, 또는 배아 생식 세포를 포함하지만, 이에 한정되지 않는, 줄기 세포, 또는 이러한 줄기 세포로부터 유래된 세포, 예컨대, 전술된 면역 세포일 수 있다. 본 발명의 구현예에서, 줄기 세포는 만능 줄기 세포이다. 만능 줄기 세포는 유도 만능 줄기 세포(iPS 세포) 또는 배아 줄기 세포(ES 세포)일 수 있고, 인간 기원일 수 있다. iPS 세포 또는 ES 세포는 임의의 공지된 방법을 사용하여 당업자에 의해 제조될 수 있다. iPS 세포 또는 ES 세포와 같은 줄기 세포를 본 발명의 CD16A-발현 세포로 분화시키기 위해 사용되는 방법은 당업자에게 공지된 임의의 방법일 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 CD16A-발현 세포는 만능 줄기 세포로부터 유래된 인간 면역 세포이다. 본 발명의 일 구현예에서, 상기 CD16A-발현 세포는 만능 줄기 세포로부터 유래된 인간 NK 세포 또는 인간 T 세포이다.
본 발명의 일 구현예에서, 줄기 세포는, 줄기 세포가 NK 세포에 의한 동종이계 반응(allogeneic responses) 및 용해를 회피하도록 유전자-편집된, 범용 공여자 세포(universal donor cell)일 수 있다. 범용 공여자 세포 및 상기 범용 공여자 세포로부터 유래된 세포는, 예를 들어, 전체적인 내용이 참조로서 여기에 혼입되는, WO 2012/145384호에 기재된 바와 같은 HLA 클래스 I 분자의 발현을 제거하기 위해 베타-2 마이크로글로불린(B2M) 유전자에서 유전적으로 조작된 파괴를 포함할 수 있다. 범용 공여자 세포 및 상기 범용 공여자 세포로부터 유래된 세포는, 인간 백혈구 항원(HLA)-1α 사슬의 적어도 일부에, 직접적으로 또는 링커 서열을 통해, 공유적으로 결합된 B2M 단백질의 적어도 일부를 포함하는 단일 사슬 융합 인간 백혈구 항원(HLA) 클래스 I 단백질을 인코딩할 수 있는 폴리뉴클레오티드를 더욱 포함할 수 있다. 하나의 구현예에서, HLA-1α 사슬은, HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F, 및 HLA-G로부터 선택된다. WO 2012/145384호를 참조. 범용 공여자 세포 및 상기 범용 공여자 세포로부터 유래된 세포는, 예를 들어, 전체적인 내용이 참조로서 여기에 또한 혼입되는, WO 2013/158292호에 기재된 바와 같은, 조절 인자 X-관련 안키린-함유 단백질(RFXANK), 조절 인자 5(RFX5), 조절 인자 X 관련 단백질(RFXAP), 클래스 Ⅱ 트랜스활성자(CⅡTA), HLA-DPA(α 사슬), HLA-DPB(β 사슬), HLA-DQA, HLA-DQB, HLA-DRA, HLA-DRB, HLA-DMA, HLA-DMB, HLA-DOA, 및 HLA-DOB와 같은, HLA 클래스 Ⅱ 유전자의 발현에 필요한 전사 인자 중 하나 이상을 녹아웃(knocking out)시켜 HLA 클래스 Ⅱ-관련 유전자에서 유전적으로 조작된 파괴를 부가적으로 함유할 수 있다. 세포는 단일 사슬 융합 HLA 클래스 Ⅱ 단백질 또는 HLA 클래스 Ⅱ 단백질을 인코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 더욱 포함할 수 있다. 또한 WO 2013/158292호를 참조. 본 발명의 구현예에서, 범용 공여자 세포 및 상기 범용 공여자 세포로부터 유래된 세포는 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는 CD16A를 발현한다. 본 발명의 일 구현예에서, 범용 공여자 세포는 iPS 세포 또는 ES 세포이고, CD16A-발현 세포는 이러한 범용 공여자 세포로부터 유래된 세포, 예컨대, 전술된 면역 세포이다. 본 발명의 일 구현예에서, CD16A-발현 세포는 범용 공여자 세포로부터 유래된 인간 면역 세포이다. 본 발명의 일 구현예에서, CD16A-발현 세포는 범용 공여자 세포로부터 유래된 인간 NK 세포 또는 인간 T 세포이다.
본 발명의 일 구현예에서, CD16A-발현 세포는 분리 및/또는 정제될 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서, CD16A-발현 세포는 불멸화 세포 또는 확립된 세포주(established cell line)이고, 이러한 불멸화 세포 또는 확립된 세포주는 임의의 공지된 방법을 사용하여 당업자에 의해 제조될 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 CD16A-발현 세포로 사용되는 세포는 인간 기원의 불멸화 세포 또는 확립된 세포주이다. 본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 CD16A-발현 세포로 사용되는 세포는 환자로부터 유래된 세포이다.
본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 CD16A-발현 세포는 CD16A를 외인성으로 발현하는 세포이다. 본 발명의 CD16A-발현 세포는 원하는 아미노산 돌연변이를 함유하는 CD16A를 인코딩하는 유전자를 세포에 도입하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 유전자는 뉴클레오티드 서열에 기초한 포스포르아미다이트(phosphoramidite) 방법을 사용하여 합성될 수 있거나, 또는 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction, PCR)을 사용하여 cDNA 라이브러리에서 얻은 DNA 단편을 조합하여 제조될 수 있다. 표적 유전자는 cDNA의 형태로 유전자를 함유하는 발현 벡터를 사용하여 세포 내로 도입될 수 있다. 유전자는 또한 mRNA의 형태로 폴리뉴클레오티드와 함께 세포 내로 도입될 수 있다. 대안적으로, 표적 유전자는 전기천공법(electroporation) 또는 리포펙션(lipofection)과 같은 방법을 사용하여 세포 내로 직접 도입될 수 있다. 세포는 세포 내로 표적 유전자의 도입 후 배양 및 증식될 수 있다.
본 발명의 CD16A-발현 세포를 제조하는데 사용되는 발현 벡터는, 표적 세포에서 아미노산 돌연변이를 함유하는 CD16A와 같이 표적 단백질을 발현할 수 있는 한, 특별한 제한이 없다. 사용될 수 있는 발현 벡터의 예로는, 플라스미드 벡터(예컨대, Thermo Fisher Scientific의 pcDNA 시리즈, Promega의 pALTER®-MAX 벡터, 및 Takara의 pHEK293 Ultra Expression Vector) 또는 바이러스 벡터(예컨대, 렌티바이러스(lentivirus), 아데노바이러스, 레트로바이러스, 또는 아데노-관련 바이러스)를 포함한다. 바이러스 벡터의 생산에서, 렌티바이러스의 생산에 사용되는 pLVSIN-CMV/EF1α 벡터(Takara Bio) 또는 pLenti 벡터(Thermo Fisher Scientific)는 사용될 수 있다.
발현 벡터는 개시 코돈(start codon) 및 정지 코돈을 포함할 수 있다. 이러한 경우에, 이것은 인핸서 서열(enhancer sequence), 비-번역 영역, 스플라이싱 접합부(splicing junction), 폴리아데닐화 부위, 또는 복제가능한 단위를 포함할 수 있다. 발현 벡터는 표적 유전자(예컨대, 약물 내성 유전자, 리포터 효소를 인코딩하는 유전자, 또는 형광 단백질을 인코딩하는 유전자)의 발현을 확인하는 마커(marker)로서 역할을 할 수 있는 유전자를 포함할 수 있다.
배양은 본 발명의 CD16A-발현 세포를 얻거나 또는 유지하기 위해 공지된 방법으로 수행될 수 있다. 사용할 수 있는 기본 배지의 예로는, MEM 배지(Science (1955) 122, pp.501-504), DMEM 배지(Virology (1959) 8, pp. 396-397), RPMI1640 배지(The Journal of the American Medical Association (1967) 199, pp. 519-524), 199 배지 (Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine (1950) 73, pp. 1-8), FreeStyleTM293 Expression 배지(Thermo Fisher Scientific, Cat. 12338026), CD293 배지(Thermo Fisher Scientific, Cat. 11913019), 또는 Expi293TM Expression 배지(Thermo Fisher Scientific, Cat. A1435101)를 포함한다. 배양 배지는 또한 혈청(예컨대, 태아 소 혈청; FBS), 혈청 대체물(예컨대, Knock Out Serum Replacement: KSR), 지방산 또는 지질, 아미노산, 비타민, 성장 인자, 사이토카인, 항산화제, 2-메르캅토에탄올, 피루브산, 완충제, 무기염, 및 항생제를 함유할 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서, 배지는 무-혈청 배지 또는 화학적으로 정의된 배지(chemically defined medium)이다. 배양 조건(예컨대, 배양 시간, 온도, 배지 pH, 및 CO2 농도)은 당업자에 의해 적절히 선택될 수 있다. 배지의 pH는 바람직하게는 약 6 내지 8이다. 배양 온도에 대해 특별한 제한은 없으나, 약 30 내지 40℃, 바람직하게는 약 37℃에서 배양 온도는 사용될 수 있다. CO2 농도는 약 1 내지 10%, 바람직하게는 약 5%일 수 있다. 배양 시간은, 특별한 제한은 없으나, 약 15 내지 336시간일 수 있다. 배양물은 필요에 따라 통기되거나 교반될 수 있다. 테트라사이클린 또는 독시사이클린(doxycycline)과 같은 약물에 의해 유도되는 유도성 프로모터가 사용되는 경우, 약물을 함유하는 배지에서 세포를 배양한 다음, 암 항원과 같은 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결된 유전자의 발현을 유도하는 단계가 포함될 수 있다. 이러한 단계는 일반적인 유전자 유도 시스템을 사용한 유전자 유도 방법에 따라 수행될 수 있다.
Ⅳ. 면역요법을 사용하여 환자의 질병 또는 장애를 치료 및 예방하는 방법
본 발명은 또한 면역요법을 사용하여 환자의 질병 또는 장애를 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 환자에게 본 발명의 폴리펩티드 및 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는 비-천연 발생 Fcγ 수용체를 발현하는 세포를 투여하는 단계를 포함하며, 여기서, 상기 폴리펩티드는 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는 상기 비-천연 발생 Fcγ 수용체에 결합할 수 있다.
본 명세서에서, 용어 "면역요법"은, 외인성 박테리아, 바이러스 및 암세포와 같은 외부 물질을 제거하기 위해 자기/비-자기-인식 면역 세포의 기능을 사용하여 다양한 박테리아 또는 바이러스에 의해 유발되는 자가면역 질병, 암 및 감염성 질병을 예방 또는 치료하는 방법을 지칭한다.
본 발명의 치료 방법에 사용되는 세포는, 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는 Fcγ 수용체를 발현하는 세포이며, 여기서, 상기 Fcγ 수용체는 본 발명의 폴리펩티드에 결합할 수 있다. Fcγ 수용체를 발현하는 세포는, 본 발명의 폴리펩티드와 함께 사용하여 면역 반응이 조절(예를 들어, 유도 또는 억제)될 수 있는 한, 임의의 세포일 수 있다. 세포는 선천성 면역계 또는 획득된 면역계의 면역 세포일 수 있으며, 그 예로는 NK 세포, NKT-세포, 대식세포, 미세아교세포, 파골세포, (호중구, 호산구, 및 호염기구를 포함하는) 과립구, 단핵구, 수지상 세포, T 세포, 및 B 세포, 및 이와 유사한 것을 포함한다. 본 발명의 구현예에서, 세포는 인간 기원의 세포이다. 본 발명의 일 구현예에서, 세포는 인간 면역 세포이다. 본 발명의 일 구현예에서, 세포는 인간 NK 세포 또는 인간 T 세포이다.
본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 치료 방법에 사용되는 세포, 예컨대, 전술된 면역 세포는, 만능 줄기 세포, 조혈 줄기 세포, 성체 줄기 세포, 태아 줄기 세포, 중간엽 줄기 세포, 산후 줄기 세포, 다능성 줄기 세포, 또는 배아 생식 세포를 포함하지만, 이에 제한되지 않는, 줄기 세포로부터 유래될 수 있다. 본 발명의 구현예에서, 줄기 세포는 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는 Fcγ 수용체를 발현하도록 유전자 조작되며, 여기서, 상기 Fcγ 수용체는 본 발명의 폴리펩티드에 결합할 수 있다. 본 발명의 구현예에서, 줄기 세포는 만능 줄기 세포이다. 만능 줄기 세포는 유도 만능 줄기 세포(iPS 세포) 또는 배아 줄기 세포(ES 세포)일 수 있고, 인간 기원일 수 있다. iPS 세포 또는 ES 세포는 임의의 공지된 방법을 사용하여 당업자에 의해 제조될 수 있다. iPS 세포 또는 ES 세포와 같은 줄기 세포를 본 발명의 치료 방법에 사용되는 세포로 분화시키기 위해 사용되는 방법은 당업자에게 공지된 임의의 방법일 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서, 세포는 만능 줄기 세포로부터 유래된 인간 면역 세포이다. 본 발명의 일 구현예에서, 세포는 만능 줄기 세포로부터 유래된 인간 NK 세포 또는 인간 T 세포이다.
본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 치료 방법에 사용되는 세포는, 줄기 세포가 NK 세포에 의한 동종이계 반응 및 용해를 회피하도록 유전자-편집된, 범용 공여자 세포로부터 유래될 수 있다. 범용 공여자 세포 및 상기 범용 공여자 세포로부터 유래된 세포는, 예를 들어, 전체 내용이 참조로서 여기에 포함되는, WO 2012/145384호에 기재된 바와 같은 HLA 클래스 I 분자의 발현을 제거하기 위해 베타-2 마이크로글로불린(B2M) 유전자에서 유전적으로 조작된 파괴를 포함할 수 있다. 범용 공여자 세포 및 상기 범용 공여자 세포로부터 유래된 세포는, 인간 백혈구 항원(HLA)-1α 사슬의 적어도 일부에, 직접적으로 또는 링커 서열을 통해, 공유적으로 결합된 B2M 단백질의 적어도 일부를 포함하는 단일 사슬 융합 인간 백혈구 항원(HLA) 클래스 I 단백질을 인코딩할 수 있는 폴리뉴클레오티드를 더욱 포함할 수 있다. 하나의 구현예에서, HLA-1α 사슬은, HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F, 및 HLA-G로부터 선택된다. WO 2012/145384호를 참조. 범용 공여자 세포 및 상기 범용 공여자 세포로부터 유래된 세포는, 예를 들어, 전체적인 내용이 참조로서 여기에 또한 혼입되는, WO 2013/158292호에 기재된 바와 같은, 조절 인자 X-관련 안키린-함유 단백질(RFXANK), 조절 인자 5(RFX5), 조절 인자 X 관련 단백질(RFXAP), 클래스 Ⅱ 트랜스활성자(CⅡTA), HLA-DPA(α 사슬), HLA-DPB(β 사슬), HLA-DQA, HLA-DQB, HLA-DRA, HLA-DRB, HLA-DMA, HLA-DMB, HLA-DOA, 및 HLA-DOB와 같은, HLA 클래스 Ⅱ 유전자의 발현에 필요한 전사 인자 중 하나 이상을 녹아웃시켜 HLA 클래스 Ⅱ-관련 유전자에서 유전적으로 조작된 파괴를 부가적으로 함유할 수 있다. 세포는 단일 사슬 융합 HLA 클래스 Ⅱ 단백질 또는 HLA 클래스 Ⅱ 단백질을 인코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 더욱 포함할 수 있다. 또한 WO 2013/158292호를 참조. 또 다른 구현예에서, 범용 공여자 세포 및 상기 범용 공여자 세포로부터 유래된 세포는, 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 함유하는 Fcγ 수용체를 발현하도록 유전자 조작되며, 여기서, 상기 Fcγ 수용체는 본 발명의 폴리펩티드에 결합할 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서, 범용 공여자 세포는 iPS 세포 또는 ES 세포이다. 본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 치료 방법에 사용되는 세포는 범용 공여자 세포로부터 유래된 인간 면역 세포이다. 본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 치료 방법에 사용되는 세포는 범용 공여자 세포로부터 유래된 인간 NK 세포 또는 인간 T 세포이다.
본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 치료 방법에 사용되는 세포는 분리 및/또는 정제될 수 있다. 여기서 "분리"는 살아있는 조직으로부터의 분리를 의미하고, "정제"는 세포가 유래된 조직에서 하나 이상의 부가적인 성분으로부터 세포를 분리하는 것을 의미한다. 본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 치료 방법에 사용되는 세포는, 불멸화 세포 또는 확립된 세포주이고, 이러한 불멸화 세포 또는 확립된 세포주는 임의의 공지된 방법을 사용하여 당업자에 의해 제조될 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 치료 방법에 사용되는 세포는 인간 기원의 불멸화 세포 또는 확립된 세포주이다. 본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 치료 방법에 사용되는 세포는 환자로부터 유래된 세포이다.
본 발명의 치료 방법에 사용되는 세포에서 발현되는 Fcγ 수용체는, 본 발명의 폴리펩티드에 의해 표적화되는 Fcγ 수용체이며, 본 발명의 폴리펩티드에 대한 의도된 용도 및 기타 요인에 기초하여 당업자에 의해 선택될 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서, Fcγ 수용체는, FcγRI(CD64), FcγRIIA(CD32A), FcγRIIB(CD32B), FcγRⅢA(CD16A), 또는 FcγRⅢB(CD16B)일 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 폴리펩티드에 의해 표적화되는 Fcγ 수용체는 CD16이다. 본 발명의 일 구현예에서, Fcγ 수용체는 CD16A이다. CD16A는, CD16A V158 및 CD16A F158의 두 가지 다형성을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 일 구현예에서, CD16A는 CD16A V158이다.
본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 치료 방법에 사용되는 세포에 의해 발현되는 Fcγ 수용체는, SEQ ID NO: 78에서의 위치 131에 상응하는 위치에서 라이신으로부터 아스파르트산으로의 돌연변이(K131D 돌연변이), SEQ ID NO: 78에서의 위치 128에 상응하는 위치에서 라이신으로부터 글루탐산으로의 돌연변이(K128E 돌연변이), 및 SEQ ID NO: 78에서의 위치 131에 상응하는 위치에서 라이신으로부터 글루탐산으로의 돌연변이(K131E 돌연변이)로부터 선택된 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 CD16A이다. 본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 치료 방법에 사용되는 세포에 의해 발현되는 Fcγ 수용체는 K131D 돌연변이 및 K128E 돌연변이 중 하나 또는 둘 모두를 포함하는 CD16A이다. 본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 치료 방법에 사용되는 세포에 의해 발현되는 Fcγ 수용체는 K131E 돌연변이 및 K128E 돌연변이 중 하나 또는 둘 모두를 포함하는 CD16A이다. 본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 치료 방법에 사용되는 세포에 의해 발현되는 Fcγ 수용체는, K131D 돌연변이 및 SEQ ID NO: 78에서의 위치 38에 상응하는 위치에서 아스파라긴으로부터 글루타민으로의 돌연변이(N38Q 돌연변이) 및 SEQ ID NO: 78에서의 위치 74에 상응하는 위치에서 아스파라긴으로부터 글루타민으로의 돌연변이(N74Q 돌연변이)로부터 선택된 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 CD16A이다.
본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 치료 방법에 사용되는 세포에 의해 발현되는 Fcγ 수용체는, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, 또는 SEQ ID NO: 88에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 CD16A이다.
본 발명의 일 구현예에서, 치료 방법은: (A) 인간 Igγ1의 Fc 영역을 포함하고, 여기서, 상기 Fc 영역은 EU 인덱스 넘버링에 따른 인간 Igγ1 불변 영역에서 위치 269에서의 글루탐산으로부터 아르기닌으로의 돌연변이(E269R 돌연변이), 및 EU 인덱스 넘버링에 따른 인간 Igγ1 불변 영역에서 위치 294에서의 글루탐산으로부터 아르기닌으로의 돌연변이(E294R 돌연변이) 및 EU 인덱스 넘버링에 따른 인간 Igγ1 불변 영역에서 위치 294에서의 글루탐산으로부터 라이신으로의 돌연변이(E294K 돌연변이)로부터 선택된 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는, 폴리펩티드; 및 (B) (i) (a) SEQ ID NO: 78에서의 위치 131에 상응하는 위치에서 라이신으로부터 아스파르트산으로의 돌연변이(K131D 돌연변이), (b) SEQ ID NO: 78에서의 위치 128에 상응하는 위치에서 라이신으로부터 글루탐산으로의 돌연변이(K128E 돌연변이), 및 (c) SEQ ID NO: 78에서의 위치 131에 상응하는 위치에서 라이신으로부터 글루탐산으로의 돌연변이(K131E 돌연변이)로부터 선택된 적어도 하나의 돌연변이를 함유하는 CD16A를 발현하는 세포; (ⅱ) K131D 돌연변이 및 K128E 돌연변이 중 하나 또는 둘 모두를 함유하는 CD16A를 발현하는 세포; (ⅲ) K131E 돌연변이 및 K128E 돌연변이 중 하나 또는 둘 모두를 함유하는 CD16A를 발현하는 세포; 및 (ⅳ) K131D 돌연변이 및 SEQ ID NO: 78에서의 위치 38에 상응하는 위치에서 아스파라긴으로부터 글루타민으로의 돌연변이(N38Q 돌연변이) 및 SEQ ID NO: 78에서의 위치 74에 상응하는 위치에서 아스파라긴으로부터 글루타민으로의 돌연변이(N74Q 돌연변이)로부터 선택된 적어도 하나의 돌연변이를 함유하는 CD16A를 발현하는 세포로부터 선택된 세포를 환자에게 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명의 일 구현예에서, 치료 방법은: (A) 인간 Igγ1의 Fc 영역을 포함하고, 여기서, 상기 Fc 영역은 EU 인덱스 넘버링에 따른 인간 Igγ1 불변 영역에서 위치 269에서의 글루탐산으로부터 아르기닌으로의 돌연변이(E269R 돌연변이), 및 EU 인덱스 넘버링에 따른 인간 Igγ1 불변 영역에서 위치 294에서의 글루탐산으로부터 아르기닌으로의 돌연변이(E294R 돌연변이) 및 EU 인덱스 넘버링에 따른 인간 Igγ1 불변 영역에서 위치 294에서의 글루탐산으로부터 라이신으로의 돌연변이(E294K 돌연변이)로부터 선택된 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는, 폴리펩티드; 및 및 (B) SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, 또는 SEQ ID NO: 88에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 CD16A를 발현하는 세포를 환자에게 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명의 일 구현예에서, 치료 방법에 사용되는 폴리펩티드는 항체이다. 본 발명의 일 구현예에서, 항체는 암 항원에 결합하는 항체이다. 본 발명의 일 구현예에서, 치료 방법에 사용되는 폴리펩티드는, 인간 Igγ1의 Fc 영역인 Fc 영역을 갖고, EU 인덱스 넘버링에 따른 인간 Igγ1 불변 영역에서 위치 269에서의 글루탐산으로부터 아르기닌으로의 돌연변이(E269R 돌연변이), 및 EU 인덱스 넘버링에 따른 인간 Igγ1 불변 영역에서 위치 294에서의 글루탐산으로부터 아르기닌으로의 돌연변이(E294R 돌연변이) 및 EU 인덱스 넘버링에 따른 인간 Igγ1 불변 영역에서 위치 294에서의 글루탐산으로부터 라이신으로의 돌연변이(E294K 돌연변이)로부터 선택된 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는, 항-CD19 항체, 항-HER2 항체, 항-EpCAM 항체, 또는 항-EGFR 항체이다.
본 발명의 치료 방법에 사용되는 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는 Fcγ 수용체를 발현하는 세포는, 표적 아미노산 돌연변이를 포함하는 Fcγ 수용체를 인코딩하는 유전자를 세포에 도입하여 제조될 수 있다. 아미노산 돌연변이를 포함하는 Fcγ 수용체를 인코딩하는 유전자는, 표적 Fcγ 수용체의 아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이 NCBI Ref Seq ID 또는 GenBank 기탁 번호로부터 획득되는 표준 분자 생물학 및/또는 화학적 기술을 사용하여 제조될 수 있고, 표적 아미노산 돌연변이를 포함하는 Fcγ 수용체를 인코딩하는 유전자의 서열은 이러한 뉴클레오티드 서열을 사용하여 설계된다. 유전자의 세포 내로의 도입 및 세포의 배양은, 당업자에게 공지된 임의의 방법, 및 여기에 기재된 방법을 사용하여 수행될 수 있다.
박테리아 감염, 바이러스 감염, 자가면역 질환, 및 암일 수 있는, 본 발명의 치료 방법에 의해 표적화되는 질병은 특별히 제한이 없다. 본 발명의 일 구현예에서, 치료 방법은 암을 치료 또는 예방하기 위해 사용된다. 본 발명의 일 구현예에서, 치료 방법은 암 면역요법을 사용하는 환자를 위한 치료 또는 예방 방법이다. 여기서, "암 면역요법"은 면역력에 의해 체내에서 발생하는 암세포를 외부 물질로 식별하고 이들을 제거하는 역할을 하는 면역 세포를 활성화 또는 증식시켜 암을 예방 또는 치료하는 방법을 지칭한다.
본 발명의 방법에 있어서, 본 발명의 폴리펩티드 및 상기 폴리펩티드가 결합하는 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는 Fcγ 수용체를 발현하는 세포는, 당업자에게 공지된 임의의 방법을 사용하여 면역요법을 필요로 하는 피험자에게 투여될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드가 피험자에게 투여되는 경우, 이것은 본 발명의 폴리펩티드 및 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약학 조성물의 형태로 피험자에게 투여될 수 있다. 폴리펩티드가 결합하는 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는 Fcγ 수용체를 발현하는 세포가 피험자에게 투여되는 경우, 이들은 세포 및 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약학 조성물의 형태로 피험자에게 투여될 수 있다. 본 발명의 치료 방법에 있어서, 본 발명의 폴리펩티드, 상기 폴리펩티드가 결합하는 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는 Fcγ 수용체를 발현하는 세포, 및 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약학 조성물은 피험자에게 투여될 수 있다. 여기에 기재된 바와 같은 약학 조성물은 사용될 수 있다.
피험자에게 투여되는 본 발명의 폴리펩티드 및 상기 폴리펩티드가 결합하는 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는 Fcγ 수용체를 발현하는 세포의 투여량 및 투여 횟수는, 표적 질병, 치료될 피험자의 연령, 체중 및 상태, 투여 형태, 본 발명의 폴리펩티드의 타입 및 역가, 및 본 발명의 치료 방법에 사용되는 세포의 타입에 따라 적절하게 조정될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드의 투여량은, 예를 들어, 약 0.001 mg/kg 내지 100 mg/kg일 수 있다. 상기 방법에 사용되는 세포의 투여량은, 예를 들어, 피험자에 대한 투여당 1×103 cells/kg 내지 1×109 cells/kg일 수 있다.
상기 방법에 사용되는 세포 및 본 발명의 폴리펩티드는, 임의의 적절한 투여 경로, 예를 들어, 정맥내 주사, 종양내 주사, 피내 주사, 피하 주사, 근육내 주사, 복강내 주사, 또는 동맥내 주사에 의해 피험자에게 투여될 수 있다.
본 발명의 방법에 있어서, 피험자에게 투여되는 본 발명의 폴리펩티드 및 상기 폴리펩티드가 결합하는 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는 Fcγ 수용체를 발현하는 세포는, 동시에, 연속적으로, 또는 순차적으로 투여될 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 폴리펩티드를 피험자에게 투여한 후, 본 발명의 치료 방법에 사용되는 세포의 투여는 시작된다. 본 발명의 일 구현예에서, 피험자에게 본 발명의 치료 방법에 사용되는 세포의 투여가 시작된 후, 본 발명의 폴리펩티드의 투여는 시작된다. 본 발명의 일 구현예에서, 피험자에게 본 발명의 폴리펩티드의 투여가 완료된 후, 본 발명의 치료 방법에 사용되는 세포의 투여는 시작된다. 본 발명의 일 구현예에서, 피험자에게 본 발명의 치료 방법에 사용되는 세포의 투여가 완료된 후, 본 발명의 폴리펩티드의 투여는 시작된다.
V. 본 발명의 약학 조성물 및 복합제
본 발명은 다음의 약학 조성물 및 복합제를 더욱 제공한다:
(1) 본 발명의 폴리펩티드 및 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약학 조성물;
(2) 본 발명의 CD16A-발현 세포 및 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약학 조성물;
(3) 본 발명의 폴리펩티드, 상기 폴리펩티드가 결합하는 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는 Fcγ 수용체를 발현하는 세포, 및 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약학 조성물; 및
(4) 본 발명의 폴리펩티드 및 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약학 조성물, 및 상기 폴리펩티드가 결합하는 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는 Fcγ 수용체를 발현하는 세포 및 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약학 조성물의 복합제.
본 발명의 복합제는 약학 조성물의 구성분 각각이 단일 패키지에 포함되는 키트의 형태일 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은, 당업계에서 통상적인 부형제, 즉, 약학적으로 허용가능한 부형제, 또는 약학적으로 허용가능한 담체를 사용하여 당업계에서 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 이들 약학 조성물의 투여 형태는 주사 또는 주입과 같은 비경구 제제일 수 있다. 제형화 동안에, 투여 형태에 적합한 부형제, 담체 및 첨가제는 약학적으로 허용가능한 범위 내에서 사용될 수 있다.
(1)에서의 약학 조성물의 구현예에 있어서, (1)에서의 약학 조성물은 면역요법에 의한 환자에 대한 치료 또는 예방 방법에서 세포와의 병용을 위한 약학 조성물이고, 여기서, 상기 세포는 폴리펩티드가 결합하는 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 함유하는 Fcγ 수용체를 발현하는 세포이다. 본 발명의 일 구현예에서, 세포는 인간 면역 세포이다. 본 발명의 일 구현예에서, 인간 면역 세포는 인간 T 세포 또는 인간 NK 세포이다. 본 발명의 일 구현예에서, 세포는 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 함유하는 CD16A를 발현하는 세포이다. 본 발명의 일 구현예에서, 세포는 본 발명의 CD16A-발현 세포이다.
본 발명의 일 구현예에서, (1)에서의 약학 조성물은 인간 Igγ1의 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 약학 조성물일 수 있으며, 여기서, 상기 Fc 영역은 EU 인덱스 넘버링에 따른 인간 Igγ1 불변 영역에서 위치 269에서의 글루탐산으로부터 아르기닌으로의 돌연변이(E269R 돌연변이), 및 EU 인덱스 넘버링에 따른 인간 Igγ1 불변 영역에서 위치 294에서의 글루탐산으로부터 아르기닌으로의 돌연변이(E294R 돌연변이) 및 EU 인덱스 넘버링에 따른 인간 Igγ1 불변 영역에서 위치 294에서의 글루탐산으로부터 라이신으로의 돌연변이(E294K 돌연변이)로부터 선택된 적어도 하나의 돌연변이를 포함하고, 여기서, 상기 약학 조성물은: (i) SEQ ID NO: 78에서의 위치 131에 상응하는 위치에서 라이신으로부터 아스파르트산으로의 돌연변이(K131D 돌연변이), SEQ ID NO: 78에서의 위치 128에 상응하는 위치에서 라이신으로부터 글루탐산으로의 돌연변이(K128E 돌연변이), 및 SEQ ID NO: 78에서의 위치 131에 상응하는 위치에서 라이신으로부터 글루탐산으로의 돌연변이(K131E 돌연변이)로부터 선택된 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 CD16A를 발현하는 세포; (ⅱ) K131D 돌연변이 및 K128E 돌연변이 중 하나 또는 둘 모두를 포함하는 CD16A를 발현하는 세포; (ⅲ) K131E 돌연변이 및 K128E 돌연변이 중 하나 또는 둘 모두를 포함하는 CD16A를 발현하는 세포; 또는 (ⅳ) K131D 돌연변이 및 SEQ ID NO: 78에서의 위치 38에 상응하는 위치에서 아스파라긴으로부터 글루타민으로의 돌연변이(N38Q 돌연변이) 및 SEQ ID NO: 78에서의 위치 74에 상응하는 위치에서 아스파라긴으로부터 글루타민으로의 돌연변이(N74Q 돌연변이)로부터 선택된 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 CD16A를 발현하는 세포로부터 선택된 세포와 병용을 위한 약학 조성물이다.
본 발명의 일 구현예에서, (1)에서의 약학 조성물은 인간 Igγ1의 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 약학 조성물이며, 여기서, 상기 Fc 영역은 EU 인덱스 넘버링에 따른 인간 Igγ1 불변 영역에서 위치 269에서의 글루탐산으로부터 아르기닌으로의 돌연변이(E269R 돌연변이), 및 EU 인덱스 넘버링에 따른 인간 Igγ1 불변 영역에서 위치 294에서의 글루탐산으로부터 아르기닌으로의 돌연변이(E294R 돌연변이) 및 EU 인덱스 넘버링에 따른 인간 Igγ1 불변 영역에서 위치 294에서의 글루탐산으로부터 라이신으로의 돌연변이(E294K 돌연변이)로부터 선택된 적어도 하나의 돌연변이를 포함하고, 여기서, 상기 약학 조성물은 SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, 또는 SEQ ID NO: 88에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 CD16A를 발현하는 세포와 병용하기 위한 약학 조성물이다.
본 발명의 일 구현예에서, (1)에서의 약학 조성물에 사용되는 폴리펩티드는 항체이다. 본 발명의 일 구현예에서, 항체는 암 항원에 결합하는 항체이다. 본 발명의 일 구현예에서, (1)에서의 약학 조성물에 사용되는 폴리펩티드는, 인간 Igγ1의 Fc 영역인 Fc 영역을 갖고, EU 인덱스 넘버링에 따른 인간 Igγ1 불변 영역에서 위치 269에서의 글루탐산으로부터 아르기닌으로의 돌연변이(E269R 돌연변이), 및 EU 인덱스 넘버링에 따른 인간 Igγ1 불변 영역에서 위치 294에서의 글루탐산으로부터 아르기닌으로의 돌연변이(E294R 돌연변이) 및 EU 인덱스 넘버링에 따른 인간 Igγ1 불변 영역에서 위치 294에서의 글루탐산으로부터 라이신으로의 돌연변이(E294K 돌연변이)로부터 선택된 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는, 항-CD19 항체, 항-HER2 항체, 항-EpCAM 항체, 또는 항-EGFR 항체이다.
(2)에서의 약학 조성물의 일 구현예에서, (2)에서의 약학 조성물은, 면역요법에 의해 환자의 질병 또는 장애의 치료 또는 예방에 있어서 폴리펩티드와 병용하기 위한 약학 조성물이며, 여기서, 상기 펩티드는 IgG의 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드이고, 여기서, 상기 Fc 영역은 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하며, 상기 폴리펩티드는 야생형 CD16A에 대한 결합 활성이 본질적으로 없고, 세포에서 발현되는 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는 CD16A에 결합한다. 본 발명의 일 구현예에서, 폴리펩티드는 인간 Igγ1의 Fc 영역을 포함하고, 상기 Fc 영역은 EU 인덱스 넘버링에 따른 인간 Igγ1 불변 영역에서 위치 269에서의 글루탐산으로부터 아르기닌으로의 돌연변이(E269R 돌연변이), 및 EU 인덱스 넘버링에 따른 인간 Igγ1 불변 영역에서 위치 294에서의 글루탐산으로부터 아르기닌으로의 돌연변이(E294R 돌연변이) 및 EU 인덱스 넘버링에 따른 인간 Igγ1 불변 영역에서 위치 294에서의 글루탐산으로부터 라이신으로의 돌연변이(E294K 돌연변이)로부터 선택된 적어도 하나의 돌연변이를 함유한다. 본 발명의 구현예에서, 폴리펩티드는 항체이다. 본 발명의 일 구현예에서, 항체는 암 항원에 결합하는 항체이다. 본 발명의 일 구현예에서, 폴리펩티드는, 인간 Igγ1의 Fc 영역인 Fc 영역을 갖고, EU 인덱스 넘버링에 따른 위치 269에서의 글루탐산으로부터 아르기닌으로의 돌연변이(E269R 돌연변이), 및 EU 인덱스 넘버링에 따른 인간 Igγ1 불변 영역에서 위치 294에서의 글루탐산으로부터 아르기닌으로의 돌연변이(E294R 돌연변이) 및 EU 인덱스 넘버링에 따른 인간 Igγ1 불변 영역에서 위치 294에서의 글루탐산으로부터 라이신으로의 돌연변이(E294K 돌연변이)로부터 선택된 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는, 항-CD19 항체, 항-HER2 항체, 항-EpCAM 항체, 또는 항-EGFR 항체이다.
(3)에서의 약학 조성물의 일 구현예에서, (3)에서의 약학 조성물은, 면역요법을 사용하여 환자의 질병 또는 장애의 예방 및 치료를 위한 약학 조성물이다. (4)에서의 복합제의 일 구현예에서, (4)에서의 복합제는, 면역요법을 사용하여 환자의 질병 또는 장애의 예방 및 치료를 위한 복합제이다.
(3)에서의 약학 조성물 및 (4)에서의 복합제의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 폴리펩티드가 결합하는 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는 Fcγ 수용체를 발현하는 세포는 인간 면역 세포이다. 본 발명의 일 구현예에서, 인간 면역 세포는 인간 T 세포 또는 인간 NK 세포이다. 본 발명의 일 구현예에서, 세포는 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는 CD16A를 발현하는 세포이다. 본 발명의 일 구현예에서, 세포는 본 발명의 CD16A-발현 세포이다.
(3)에서의 약학 조성물 및 (4)의 복합제의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 폴리펩티드가 결합하는 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는 Fcγ 수용체를 발현하는 세포가 본 발명의 CD16A-발현 세포인 경우, 본 발명의 폴리펩티드는 IgG의 Fc 영역을 포함하고, 상기 Fc 영역은 EU 인덱스 넘버링에 따른 인간 Igγ1 불변 영역에서 위치 269에서의 글루탐산으로부터 아르기닌으로의 돌연변이(E269R 돌연변이), 및 EU 인덱스 넘버링에 따른 인간 Igγ1 불변 영역에서 위치 294에서의 글루탐산으로부터 아르기닌으로의 돌연변이(E294R 돌연변이) 및 EU 인덱스 넘버링에 따른 인간 Igγ1 불변 영역에서 위치 294에서의 글루탐산으로부터 라이신으로의 돌연변이(E294K 돌연변이)로부터 선택된 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다. 본 발명의 구현예에서, 폴리펩티드는 항체이다. 본 발명의 일 구현예에서, 항체는 암 항원에 결합하는 항체이다. 본 발명의 일 구현예에서, 폴리펩티드는, 인간 Igγ1의 Fc 영역인 Fc 영역을 갖고, EU 인덱스 넘버링에 따른 인간 Igγ1 불변 영역에서 위치 269에서의 글루탐산으로부터 아르기닌으로의 돌연변이(E269R 돌연변이), 및 EU 인덱스 넘버링에 따른 인간 Igγ1 불변 영역에서 위치 294에서의 글루탐산으로부터 아르기닌으로의 돌연변이(E294R 돌연변이) 및 EU 인덱스 넘버링에 따른 인간 Igγ1 불변 영역에서 위치 294에서의 글루탐산으로부터 라이신으로의 돌연변이(E294K 돌연변이)로부터 선택된 적어도 하나의 돌연변이를 함유하는, 항-CD19 항체, 항-HER2 항체, 항-EpCAM 항체, 또는 항-EGFR 항체이다.
특별한 제한은 없으나, 본 발명의 약학 조성물 또는 복합제는, 박테리아 감염, 바이러스 감염, 자가면역 질환, 및 암을 치료하거나 또는 예방하는데 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 여기에 기재된 바와 같은 CD16A-발현 세포 및 폴리펩티드의 하기 조합을 제공한다.
(1) 본 발명의 폴리펩티드가 결합하는 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는 Fcγ 수용체를 발현하는 세포와 병용하는 면역요법을 사용하여 환자의 질병 또는 장애의 치료 또는 예방을 위한 본 발명의 폴리펩티드. 본 발명의 일 구현예에서, 폴리펩티드는 암을 치료 또는 예방하는데 사용된다.
(2) 야생형 CD16A에 대한 결합 활성이 본질적으로 없지만 본 발명의 CD16A-발현 세포에서 발현되는 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는 CD16A에 결합할 수 있는 IgG의 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드와 병용하는 면역요법을 사용하여 환자의 질병 또는 장애를 치료 또는 예방하기 위한 본 발명의 CD16A-발현 세포. 본 발명의 일 구현예에서, CD16A-발현 세포는 암을 치료 또는 예방하는데 사용된다.
(3) 본 발명의 폴리펩티드가 결합하는 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는 Fcγ 수용체를 발현하는 세포와 병용하는 면역요법을 사용하여 환자의 질병 또는 장애를 치료 또는 예방하기 위한 약학 조성물의 생산에 있어서 본 발명의 폴리펩티드의 용도. 본 발명의 일 구현예에서, 폴리펩티드는 암을 치료 또는 예방하는데 사용된다.
(4) 야생형 CD16A에 대한 결합 활성이 본질적으로 없지만 본 발명의 CD16A-발현 세포에서 발현되는 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는 CD16A에 결합할 수 있는 IgG의 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드와 병용하는 면역요법을 사용하여 환자의 질병 또는 장애를 치료 또는 예방하기 위한 약학 조성물의 생산에서 본 발명의 CD16A-발현 세포의 용도. 본 발명의 일 구현예에서, CD16A-발현 세포는, 박테리아 감염, 바이러스 감염, 자가면역 질환, 및/또는 암을 치료 또는 예방하는데 사용된다.
본 발명의 폴리펩티드 및 본 발명의 CD16A-발현 세포와 관련된 구현예는 본 발명의 약학 조성물 및 복합제의 이러한 설명과 유사하게 적용된다.
Ⅵ. IgG의 변형된 Fc 영역, 변형된 Fcγ 수용체, 및 이들의 조합을 제조하는 방법
본 발명은 또한, 하나의 관점에서, IgG의 변형된 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드를 얻는 방법을 제공하며, 상기 방법은:
1) IgG의 변형된 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드를 제공하는 단계로서, 여기서, 상기 변형된 Fc 영역은 비-천연 발생이고, 야생형 또는 천연 발생 IgG와 비교하여 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는, 폴리펩티드를 제공하는 단계;
2) 야생형 또는 천연 발생 Fcγ 수용체에 대한 단계 1)에서 얻은 폴리펩티드의 결합 활성을 측정하는 단계;
3) 야생형 또는 천연 발생 Fcγ 수용체와 비교하여 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는 비-천연 발생 Fcγ 수용체에 대한 단계 1)에서 얻은 폴리펩티드의 결합 활성을 측정하는 단계; 및
4) 단계 1)에서 얻은 폴리펩티드로부터, 야생형 또는 천연 발생 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성이 본질적으로 없고, 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는 비-천연 발생 Fcγ 수용체에 결합하는 폴리펩티드를 선택하는 단계를 포함한다.
몇몇 구현예에서, IgG의 변형된 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드는 항체이다. 단계 4)는 상기 항체와 Fcγ 수용체를 발현하는 면역 세포 및 상기 항체가 결합하는 항원을 발현하는 세포를 접촉시키는 단계, 및 그 다음 ADCC 활성을 측정하는 단계를 더욱 포함할 수 있다.
상기 방법에 사용되는 본 발명의 폴리펩티드 및 본 발명의 CD16A-발현 세포와 관련된 구현예는 이러한 본 발명의 폴리펩티드의 설명과 유사하게 적용된다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 비-천연 발생 Fcγ 수용체의 제조 방법을 제공한다. 상기 방법은:
1) 야생형 또는 천연 발생 Fcγ 수용체와 비교하여 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는 비-천연 발생 Fcγ 수용체를 제공하는 단계;
2) 야생형 또는 천연 발생 IgG의 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드 및 상기 야생형 또는 천연 발생 IgG와 비교하여 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는 IgG의 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드를 제공하는 단계;
3) 상기 야생형 또는 천연 발생 IgG의 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드에 대한 단계 1)에서 얻은 비-천연 발생 Fcγ 수용체의 결합 활성을 측정하는 단계;
4) 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는 IgG의 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드에 대한 단계 1)에서 얻은 비-천연 발생 Fcγ 수용체의 결합 활성을 측정하는 단계; 및
5) 단계 1)에서 얻은 비-천연 발생 Fcγ 수용체로부터, 야생형 또는 천연 발생 IgG의 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드에 대한 결합 활성이 본질적으로 없고, 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는 IgG의 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드에 결합하는 비-천연 발생 Fcγ 수용체를 선택하는 단계를 포함한다.
상기 방법에 사용되는 본 발명의 폴리펩티드 및 본 발명의 CD16A-발현 세포와 관련된 구현예는 본 발명의 폴리펩티드의 이러한 설명과 유사하게 적용된다.
하나의 관점에서, 본 발명은 (a) IgG의 변형된 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드 및 (b) 비-천연 발생 변형된 Fcγ 수용체를 포함하는 결합 쌍을 제조하는 방법을 제공한다. 상기 방법은:
1) 야생형 또는 천연 발생 IgG의 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드 및 IgG의 변형된 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드를 제공하는 단계로서, 여기서, 상기 변형된 Fc 영역은 비-천연 발생이며, 야생형 또는 천연 발생 IgG의 Fc 영역과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는, 폴리펩티드를 제공하는 단계;
2) 야생형 또는 천연 발생 Fcγ 수용체 및 비-천연 발생 변형된 Fcγ 수용체를 제공하는 단계로서, 여기서, 상기 변형된 Fcγ 수용체는 야생형 또는 천연 발생 Fcγ 수용체와 비교하여 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는, Fcγ 수용체를 제공하는 단계;
3) 단계 1)에서 얻은 각 폴리펩티드에 대한 단계 2)에서 얻은 각 Fcγ 수용체의 결합 활성을 측정하는 단계; 및
4) (a) 변형된 Fcγ 수용체에 결합하고, 야생형 또는 천연 발생 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성이 본질적으로 없는 변형된 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드, 및 (b) 변형된 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드에 결합하고, 야생형 또는 천연 발생 IgG의 Fc 영역에 결합하지 않는 변형된 Fcγ 수용체를 선택하는 단계를 포함한다.
몇몇 구현예에서, IgG의 변형된 Fc 영역을 함유하는 폴리펩티드는 항체이다. 단계 4)는 항체와 Fcγ 수용체를 발현하는 면역 세포 및 상기 항체가 결합하는 항원을 발현하는 세포를 접촉시키는 단계, 및 그 다음 ADCC 활성을 측정하는 단계를 더욱 포함할 수 있다.
상기 방법에 사용되는 본 발명의 폴리펩티드 및 본 발명의 CD16A-발현 세포와 관련된 구현예는 본 발명의 폴리펩티드의 이러한 설명과 유사하게 적용된다.
전술한 방법에서, 각 단계는 당업자에게 공지된 임의의 방법 또는 본 명세서에 기재된 방법을 사용하여 당업자에 의해 수행될 수 있다.
이하, 구체적인 실시예들은 본 발명의 이해를 돕기 위하여 참조로서 제공되지만, 이들은 예시적인 목적을 위해 제공되며, 본 발명은 이들 실시예에 제한되는 것은 아니다.
실시예
인간 CD16A는 2개의 다형성: CD16A V158 및 CD16A F158이 있다. 하기 실시예들은 항체 Fc에 대해 더 높은 결합 활성을 갖는 CD16A V158(이하 "CD16V")을 사용하여 수행된다. 시판 키트 또는 시약을 사용한 실험은, 방법이 입증된 경우를 제외하고, 첨부된 프로토콜에 따라 수행된다.
실시예 1: 인실리코 계산을 사용한 단백질 설계
복합체의 결합 활성 및 안정성이 복합체 형성에 중요한 것으로 고려되는 하전된 아미노산에 돌연변이의 도입에 의해 영향을 받고, 인실리코 계산이 결합 활성에 대한 하전된 아미노산에 돌연변이를 도입하는 효과를 예측하는데 사용될 수 있음을 복합 단백질의 3-차원 구조를 분석하여 보고되었다(Scientific Reports (2019) 9, pp. 4482). 따라서, 본 발명자들은 MOE 소프트웨어(Chemical Computing Group)를 사용하여 CD16V와 항체 Fc(PDB code; 3ay4) 사이에 복합체의 3-차원 구조를 분석했고, CD16V와 항체 Fc 사이에 결합 계면에서 염기성 또는 산성 아미노산 잔기를 추출했다. 이들 아미노산 잔기 중에서, 돌연변이체는 CD16V 상에 염기성 아미노산이 산성 아미노산으로 대체되거나 또는 항체 Fc 상에 산성 아미노산이 염기성 아미노산으로 대체되는 것으로 설계되었다(표 1). 하기 실시예에 기재된 CD16V 돌연변이체의 명칭은, 1번째 내지 18번째 아미노산 서열(SEQ ID NO: 78)(표에서 "3ay4")을 제외한 CD16V 단백질의 서열(GenBank 기탁 번호: AAH17865.1)에 기초한, 3ay4에 등록된 CD16A 단백질의 아미노산 잔기의 수에 따른 것이다. "3ay4"에 나타낸 돌연변이에 상응하는 1번째 내지 18번째 아미노산 서열을 함유하는 CD16V 단백질에서 돌연변이는 표 1에서 세로행 "AAH17865.1"에 나타내었다.
표에서 Fc 아래의 숫자는 EU 인덱스 넘버링에 따른 인간 Igγ1 불변 영역에서의 아미노산 위치를 나타낸다.
그룹 CD16V Fc
3ay4 AAH17865.1 EU 인덱스
그룹 1 K120D K138D D265K
K120E K138E D265R
그룹 2 K128D K146D E294K
K128E K146E E294R
그룹 3 K131D K149D E269K
K131E K149E E269R
그룹 4 K161D K179D S239K
K161E K179E S239R
실시예 2: CD16V 단백질 및 CD16V 돌연변이 단백질(mutant protein)의 제조
본 실시예에서, CD16V에 돌연변이가 도입된 단백질은 "CD16V_도입된 돌연변이"로 표시되고, 이하 총칭하여 CD16V 돌연변이체로 지칭된다.
CD16V 단백질을 얻기 위해, FLAG 서열(DYKDDDDK, SEQ ID NO: 91)이 C-말단(SEQ ID NO: 1)에 연결되는, CD16V의 세포외 부분에서 폴리펩티드(GenBank 기탁 번호: AAH17865.1에서 아미노산 1 내지 208)를 인코딩하는 유전자는 pcDNA3.4 벡터(Thermo Fisher Scientific, Cat. A14697) 내로 서브클로닝된다. 구축된 벡터는 그 다음 ExpiCHO-S 세포(Thermo Fisher Scientific, Cat. A29133) 내로 형질감염된다. CD16V 돌연변이 단백질을 얻기 위하여, C-말단에 연결된 FLAG 서열(SEQ ID NOs: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15 또는 17) 및 표 1에 나타낸 아미노산 돌연변이를 갖는 CD16V의 세포외 부분에 폴리펩티드(CD16V_K120D, CD16V_K120E, CD16V_K128D, CD16V_K128E, CD16V_K131D, CD16V_K131E, CD16V_K161D 또는 CD16V_K161E)를 인코딩하는 유전자는 pcDNA3.4 벡터에 도입된다. 구축된 벡터는 ExpiCHO-S 세포 내로 형질감염된다. CD16V 단백질 및 CD16V 돌연변이 단백질은 항-FLAG(등록 상표) M2 항체 친화성 겔(SIGMA-ALDRICH, Cat. A2220)을 사용하여 표준 방법에 따라 ExpiCHO-S 세포의 배양 상층액으로부터 정제된다. AAH17865.1의 CD16V에서 1 내지 18번째 아미노산 서열은 성숙형 형태(mature form)로 절단되는 점에 유의된다. 본 실시예에 기재된 CD16V 단백질에 도입된 아미노산 돌연변이의 위치는, 3ay4에 등록된 아미노산 번호를 따른 것이며, 1 내지 18번째 아미노산 서열을 제외한 CD16V에 기초하여 넘버링된다. 서열 목록에 기재된 각 CD16V 돌연변이 단백질의 아미노산 서열에서 각 돌연변이는 표 1의 세로행 "AAH17865.1"에 나타낸 돌연변이에 상응한다.
실시예 3: Fc_wt-타입 항-HER2 항체 또는 돌연변이 Fc 타입 항-HER2 항체의 생산
다음 연구에서, 트라스투주맙(Drug Bank Accession Number: DB00072)은 항-HER2 항체로서 사용된다.
야생형 인간 Igγ1 불변 영역의 Fc 서열을 갖는 항체는 총칭하여 Fc_wt로 지칭된다. Fc_wt-타입 항-HER2 항체의 생산에 사용되는 발현 벡터는 하기 방식으로 구축되었다. 중쇄 발현 벡터는, 5'-측 상에 부가된 신호 서열을 인코딩하는 유전자(MEFGLSWVFLVAILKGVQC)(SEQ ID NO: 19) 및 3'-측 상에 부가된 인간 Igγ1 불변 영역을 인코딩하는 유전자(SEQ ID NO: 23)와 함께 트라스투주맙의 중쇄 가변 영역을 인코딩하는 유전자(SEQ ID NO: 21)의 폴리뉴클레오티드를 pcDNA3.4 벡터 내에 삽입시켜 구축된다. 경쇄 발현 벡터는, 5'-측 상에 부가된 신호 서열을 인코딩하는 유전자(MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARC)와 함께 트라스투주맙의 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 유전자(SEQ ID NO: 27)의 폴리뉴클레오티드를 pcDNA3.4 벡터 내에 삽입시켜 구축된다. 이러한 경쇄 발현 벡터는 이하 트라스투주맙 경쇄 발현 벡터로 지칭된다. 이들 벡터들은 ExpiCHO-S 세포 내로 공동-형질감염되고, 야생형 Fc 영역(이하 Fc_wt-타입이라 함)을 갖는 항-HER2 항체는 표준 방법에 따라 배양 상층액으로부터 제조된다.
Fc 영역에 돌연변이(이하 "Fc_도입된 돌연변이"라 함, 이하 총칭하여 돌연변이 Fc 타입 항체라 함)를 갖는 항체는 제조된다.
Fc_S239K, Fc_S239R, Fc_E294K, 및 Fc_E294R의 생산에 사용되는 중쇄 발현 벡터는, 5'-측 상에 부가된 신호 서열을 인코딩하는 유전자(MEFGLSWVFLVAILKGVQC)(SEQ ID NO: 19) 및 3'-측 상에 부가된 S239 또는 E294에서 라이신(K) 또는 아르기닌(R)을 치환하는 아미노산 돌연변이가 도입된 인간 Igγ1 불변 영역을 인코딩하는 유전자(SEQ ID NOs: 33, 35, 29 및 31)와 함께 트라스투주맙의 중쇄 가변 영역을 인코딩하는 유전자(SEQ ID NO: 21)의 폴리뉴클레오티드를 pcDNA3.4 벡터 내에 도입하여 구축된다. Fc_D265K, Fc_D265R, Fc_E269K, 및 Fc_E269R의 생산에 사용되는 중쇄 발현 벡터는, 5'-측 상에 부가된 신호 서열을 인코딩하는 유전자(MEWSWVFLFFLSVTTGVHS) (SEQ ID NO: 37) 및 3'-측 상에 부가된 D265 또는 E269에서 라이신(K) 또는 아르기닌(R)을 치환하는 아미노산 돌연변이가 도입된 인간 Igγ1 불변 영역을 인코딩하는 유전자(SEQ ID NOs: 41, 43, 45 및 47)와 함께 트라스투주맙의 중쇄 가변 영역을 인코딩하는 유전자(SEQ ID NO: 39)의 폴리뉴클레오티드를 pcDNA3.4 벡터 내에 도입하여 구축된다. 이들 발현 벡터 각각은 ExpiCHO-S 세포 내로 트라스투주맙 경쇄 발현 벡터로 공동-형질감염되고, 돌연변이 Fc 타입 항-HER2 항체는 표준 방법에 따라 배양 상층액으로부터 제조된다.
실시예 4: Fc_wt-타입 및 돌연변이 Fc-타입 항-HER2 항체와 CD16V 및 CD16V 돌연변이 단백질의 결합 활성의 평가
실시예 2에서 얻은 CD16V 및 CD16V 돌연변이체와 실시예 3에서 얻은 Fc_wt-타입 및 돌연변이 Fc-타입 항-HER2 항체의 결합 활성은 평가된다. HER2 단백질(Sino Biological, Cat. 10004-H08H)은 인산 완충 식염수(PBS)로 2 ㎍/mL로 희석되고, 20 μL의 희석된 HER2 단백질은 Maxisorp 384-웰(well) 투명 플레이트(Thermo Fisher Scientific, Cat. 464718)의 각 웰에 첨가되며, 4℃에서 밤새 배양하여 고정화된다. HER2 단백질 용액을 제거한 후, 플레이트는 50 μL의 Blocking One(Nacalai Tesque, Cat. 03953-95)을 함유하는 PBS로 실온에서 1시간 동안 배양된 다음, 0.05% Tween 20(TBS-T, Nippon Gene, Cat. 310-07375)을 함유하는 트리스 완충 식염수(Tris buffered saline)로 세척된다. 실시예 3에서 얻은 각각의 항-HER2 항체는, 5% Blocking One을 함유하는 TBS-T(이하 희석액으로 간단히 지칭됨)로 4 ㎍/mL로 희석되고, 20 μL의 희석된 항체는 각 웰에 첨가된다. 실온에서 1시간 동안 배양한 후, 플레이트는 TBS-T로 세척된다. 실시예 2에서 얻은 각 CD16V 단백질은 희석액으로 희석되어 10 ㎍/mL의 최대 농도로부터 약 3-배의 공비(common ratio)로 희석 시리즈가 준비되고, 20 μL의 희석된 CD16V 단백질은 각 웰에 첨가된다. 실온에서 1시간 동안 배양한 후, 플레이트는 TBS-T로 세척된다. 다음으로, 희석액으로 희석된 20 μL의 양고추냉이 퍼옥시다제-표지 항-FLAG(등록 상표) M2 항체(SIGMA-ALDRICH, Cat. A8592)는 검출 항체로서 씩 각 웰에 첨가된다. 실온에서 1시간 동안 배양한 후, 플레이트는 TBS-T로 세척된다. TMB+Substrate-Chromogen(DAKO, Cat. S1599)을 첨가하고 배양한 후, 반응은 1M 황산을 첨가하여 정지되고, 450 ㎚에서의 흡광도 및 기준 파장은 Infinite 200 PRO(TECAN)를 사용하여 측정된다.
그 결과, CD16V_K131D는 Fc_wt에 결합하지 않고, Fc_E269R에만 결합한다. 그러나, CD16V_K131D와 Fc_E269R 사이에 결합 활성은, Fc_wt와 CD16V 사이에 결합 활성보다 낮았다. 또한, Fc_E269R은 CD16V에 약하게 결합했다. CD16V_K128E 및 K131E 모두는 돌연변이 Fc에 결합하는 것이 확인되었지만, Fc_wt에 대한 결합은 약간 확인되었다. 한편, CD16V_K128D, CD16V_K120D, CD16V_K120E, CD16V_K161D 및 CD16V_K161E와 Fc_wt 또는 돌연변이 Fc 중 어느 하나의 결합하지 않거나 극히 낮은 결합은 확인되었다(도 1).
이것은 CD16V에서 위치 K128 및 위치 K131 뿐만 아니라 항체의 Fc 영역에서 위치 E269 및 위치 E294가 CD16V 돌연변이체와 돌연변이 Fc 타입 항체 사이에 특이적 결합 활성에 대해 중요한 아미노산 잔기임을 시사한다. 따라서, 특정 아미노산 돌연변이들이 이들 돌연변이의 조합 및 이들 돌연변이와 결합 활성을 증가시키는 것으로 알려진 돌연변이의 조합을 사용하여 도입된 서로 특이적으로만 결합하는 돌연변이 Fc 및 CD16V 돌연변이체를 얻기 위해 연구는 수행된다.
실시예 5: 돌연변이 Fc-타입 항-HER2 항체 및 CD16V 돌연변이 단백질의 생성
CD16V_K128E_K131D(이하 CD16V_ED라 함) 및 CD16V_K128E_K131E(이하 CD16V_EE라 함)는 K128E 및 K131D 또는 K131E의 돌연변이를 CD16V와 조합하여 제조된다. 구체적으로, 실시예 2에서와 같이, 발현 벡터는 pcDNA3.4 벡터에 C-말단에 도입된 FLAG 서열(SEQ ID NOs: 49 및 51)에 연결된 아미노산 돌연변이와 함께 CD16V 단백질의 세포외 폴리펩티드를 인코딩하는 유전자를 도입하여 구축된다. 이러한 발현 벡터는 그 다음 ExpiCHO-S 세포에 형질감염된다. CD16V_ED 및 CD16V_EE는 실시예 2와 동일한 방식으로 각각의 배양 상층액으로부터 제조된다.
N38Q, N74Q 또는 N169Q의 CD16V로의 돌연변이 유발은 Fc_wt의 결합 활성을 약간 향상시키는 것으로 보고되었다(Journal of Biological Chemistry (2018) 293, pp. 16842-16850). CD16V_K131D(이하 CD16V_D라 함)는 Fc_E269R-타입 항체에만 결합하므로, CD16V_K131D_N38Q(이하 CD16V_DQ1라 함) 및 CD16V_D가 N38Q 또는 N74Q 돌연변이와 조합된 CD16V_K131D_N74Q(이하 CD16V_DQ2라 함)는 제조된다. 구체적으로, 발현 벡터는, C-말단에 도입된 FLAG 서열(SEQ ID NOs: 53 및 55)에 연결되고, 아미노산 돌연변이 중 하나가 도입된, CD16V 단백질의 세포외 도메인의 폴리펩티드를 인코딩하는 유전자를 pcDNA3.4 벡터에 도입하여 실시예 2와 동일한 방식으로 구축된다. 각 발현 벡터는 그 다음 ExpiCHO-S 세포에 형질감염된다. CD16V_DQ1 및 CD16V_DQ2는 실시예 2와 동일한 방식으로 각각의 배양 상층액으로부터 제조된다.
Fc_E269R_E294K(이하 Fc_RK) 및 Fc_E269R_E294R(이하 Fc_RR) 타입 항-HER2 항체는 제조된다. 구체적으로, 발현 벡터는, 5'-측 상에 부가된 신호 서열(MEWSWVFLFFLSVTTGVHS)을 인코딩하는 유전자(SEQ ID NO: 37) 및 3'-측 상에 부가된 위치 E269에서 아르기닌 및 위치 E294의 라이신(K) 또는 아르기닌(R)에 도입된 아미노산 돌연변이를 갖는 인간 Igγ1 불변 영역을 인코딩하는 유전자(SEQ ID NOs: 57 및 59)와 함께 트라스투주맙의 중쇄 가변 영역을 인코딩하는 유전자(SEQ ID NO: 39)의 폴리뉴클레오티드를 pcDNA3.4 벡터에 도입하여 실시예 3과 동일한 방식으로 구축된다. 그 결과로 생성된 중쇄 발현 벡터 및 실시예 3에서 얻은 트라스투주맙 경쇄 발현 벡터는 ExpiCHO-S 세포에 공동-형질감염되고, 돌연변이 Fc-타입 항-HER2 항체는 표준 방법에 따라 각각의 배양 상층액으로부터 제조된다.
실시예 6: Fc_wt-타입 및 돌연변이 Fc-타입 항-HER2 항체와 CD16V 및 CD16V 돌연변이 단백질의 결합 활성의 평가
실시예 2에서 얻은 CD16V_D 및 실시예 5에서 얻은 CD16V_ED, CD16V_EE, CD16V_DQ1 및 CD16V_DQ2와 실시예 3에서 얻은 Fc_wt 타입 항-HER2 항체, 또는 실시예 5에서 얻은 Fc_RK 또는 Fc_RR 타입 항-HER2 항체의 결합 활성은 실시예 4와 동일한 방식으로 평가된다(도 2).
그 결과, Fc_wt 타입 항-HER2 항체는 CD16V에 결합하였지만, CD16V_D, CD16V_ED, CD16V_EE, CD16V_DQ1 및 CD16V_DQ2에 대한 결합 활성을 나타내지 않았다. 한편, Fc_RK 또는 Fc_RR 타입 항-HER2 항체는 CD16V 돌연변이체에 결합하지만, CD16V에는 결합하지 않는다. 따라서, 돌연변이 Fc-타입 항체의 CD16V 돌연변이체에 대한 결합 특이성이 Fc_E269R 내로 위치 E294에 돌연변이를 도입하여 향상되었음은 명백하다. 또한, CD16V_DQ1 및 CD16V_DQ2의 Fc_RK 및 Fc_RR에 대한 결합 활성은, CD16V의 Fc_wt에 대한 결합 활성과 거의 동일했다. 따라서, 부가적인 돌연변이가 CD16V_D에 도입된, CD16V_DQ1 및 CD16V_DQ2가 향상된 Fc_wt 결합 활성을 갖지 않지만, 향상된 Fc_RR 및 Fc_RK 결합 활성만 갖는 것은 명백하다.
실시예 7: Fc_wt-타입 및 돌연변이 Fc-타입 항-EGFR 항체 및 항-EpCAM 항체의 생산
Fc_wt, Fc_RK, Fc_RR 타입 항-EGFR 항체 및 항-EpCAM 항체는, 항-HER2 항체 이외의 항체에 사용되는 경우 실시예 2에서 얻은 CD16V_D 및 실시예 5에서 얻은 CD16V_ED, CD16V_EE, CD16V_DQ1 및 CD16V_DQ2에 대해 실시예 5에서 제조된 Fc 서열이 특이적인 결합 활성을 갖는지 시험하기 위하여 제조된다.
Fc_wt, Fc_RK, 및 Fc_RR 타입 항-EGFR 항체의 생산에 있어서, 중쇄 발현 벡터는, 5'-측 상에 부가된 신호 서열(MEFGLSWVFLVALLRGVQC)을 인코딩하는 유전자(SEQ ID NO: 61), 및 3'-측 상에 부가된 인간 Igγ1 불변 영역을 인코딩하는 유전자(SEQ ID NO: 23), Fc_RK를 함유하는 인간 Igγ1 불변 영역을 인코딩하는 유전자(SEQ ID NO: 57), 또는 Fc_RR을 포함하는 인간 Igγ1 불변 영역을 인코딩하는 유전자(SEQ ID NO: 59)와 함께 항-EGFR(세툭시맙, Drug Bank Accession No: DB00002)의 중쇄 가변 영역을 인코딩하는 유전자(SEQ ID NO: 63)의 폴리뉴클레오티드를 pcDNA3.4 벡터에 도입하여 제조된다. 또한, 경쇄 발현 벡터는, 5'-측 상에 부가된 신호 서열(MLPSQLIGFLLLWVPASRG)을 인코딩하는 유전자(SEQ ID NO: 65)와 함께 세툭시맙의 경쇄 영역을 인코딩하는 유전자(SEQ ID NO: 67)를 pcDNA3.4 벡터에 도입하여 제조된다.
Fc_wt, Fc_RK, 및 Fc_RR 타입 항-EpCAM 항체의 생산에 있어서, 중쇄 발현 벡터는, 5'-측 상에 부가된 신호 서열(MEWSWVFLFFLSVTTGVHS)을 인코딩하는 유전자(SEQ ID NO: 69), 및 3'-측 상에 부가된 인간 Igγ1 불변 영역을 인코딩하는 유전자(SEQ ID NO: 23), Fc_RK를 함유하는 인간 Igγ1 불변 영역을 인코딩하는 유전자(SEQ ID NO: 57), 또는 Fc_RR을 포함하는 인간 Igγ1 불변 영역을 인코딩하는 유전자(SEQ ID NO: 59)와 함께 항-EpCAM(에드레콜로맙, IMGT INN No: 7471)의 중쇄 가변 영역을 인코딩하는 유전자(SEQ ID NO: 71)의 폴리뉴클레오티드를 pcDNA3.4 벡터에 도입하여 제조된다. 또한, 경쇄 발현 벡터는 5'-측 상에 부가된 신호 서열(MSVPTQVLGLLLLWLTDARC)을 인코딩하는 유전자(SEQ ID NO: 73)와 함께 에드레콜로맙의 경쇄 영역을 인코딩하는 유전자(SEQ ID NO: 75)를 pcDNA3.4 벡터에 도입하여 제조된다.
각각의 중쇄 발현 벡터는 세툭시맙 경쇄 또는 에드레콜로맙 경쇄 발현 벡터로 ExpiCHO-S 세포 내로 공동-형질감염되고, 항-EGFR 항체 및 항-EpCAM 항체는 실시예 3과 동일한 방식으로 정제된다.
실시예 8: Fc_wt-타입 및 돌연변이 Fc-타입 항-EGFR 항체 또는 항-EpCAM 항체와 CD16V 및 CD16V 돌연변이 단백질의 결합 활성의 평가
실시예 2에서 얻은 CD16V, CD16V_D 및 실시예 5에서 얻은 CD16V_ED, CD16V_EE, CD16V_DQ1 및 CD16V_DQ2와 실시예 7에서 얻은 Fc_wt, Fc_RK 또는 Fc_RR 타입 항-EGFR 항체 또는 항-EpCAM 항체의 결합 활성은 평가된다. EGFR 단백질(Abcam, Cat. ab155639)은 4 ㎍/mL로 희석되거나 또는 EpCAM 단백질(Sino Biological, Cat. 10694-H08H)은 PBS에서 2 ㎍/mL로 희석되며, 20 μL의 희석된 단백질은 Maxisorp 384-well 투명 플레이트의 각 웰에 첨가되고, 4℃에서 밤새 배양하여 고정화된다. 다음날, EGFR 또는 EpCAM 단백질 용액은 제거되고, 플레이트는 50 μL의 Blocking One을 함유하는 PBS로 실온에서 1시간 동안 배양된 다음, TBS-T로 세척된다. 실시예 7에서 얻은 각 항-EGFR 항체는 희석액으로 2 ㎍/mL로 희석되고, 동일한 실시예에서 얻은 각 항-EpCAM 항체는 희석액으로 10 ㎍/mL로 희석되며, 20 μL의 희석된 항체는 각 웰에 첨가된다. 실온에서 1시간 동안 배양한 후, 플레이트는 TBS-T로 세척된다. 실시예 2 또는 실시예 5에서 얻은 각각의 CD16V 단백질은 희석액으로 희석되어 10 ㎍/mL의 최대 농도로부터 약 3-배의 공비로 희석 시리즈가 준비되고, 20 μL의 희석된 CD16V 단백질은 각 웰에 첨가된다. 실온에서 1시간 동안 배양한 후, 플레이트는 TBS-T로 세척된다. 다음으로, 희석액으로 희석된 20 μL의 양고추냉이 퍼옥시다제-표지 항-FLAG(등록 상표) M2 항체는 검출 항체로서 씩 각 웰에 첨가된다. 실온에서 1시간 동안 배양한 후, 플레이트는 TBS-T로 세척된다. TMB+Substrate-Chromogen을 첨가하고 배양한 후, 반응은 1M 황산을 첨가하여 정지되고, 450 ㎚에서의 흡광도 및 기준 파장은 Infinite 200 PRO를 사용하여 측정된다.
항-EGFR 항체 및 항-EpCAM 항체의 경우에, 항-HER2 항체의 경우와 마찬가지로, Fc_wt 타입 항체는 CD16V에 결합하지만 CD16V 돌연변이체에는 결합하지 않고, Fc_RK 및 Fc_RR 타입 항체는 CD16V에 결합하지 않고 CD16V 돌연변이체에만 결합했다(도 3, 도 4). 이러한 결과로부터 Fc_RK 및 Fc_RR은 항-HER2 항체뿐만 아니라 다른 항체에서도 CD16V 돌연변이체에 특이적으로 결합하는 것이 명백하다.
실시예 9: 과잉 IgG1 항체의 존재하에서 CD16V 및 CD16V 돌연변이 단백질과 돌연변이 Fc-타입 항-HER2 항체의 결합 활성의 평가
Fc_wt 타입 항체를 사용한 경쟁 시험은 생체 내에서 돌연변이 Fc-타입 항-HER2 항체와 CD16V 돌연변이 단백질 사이에 결합 활성을 확인하기 위해 수행된다. 유사 내인성 면역글로불린으로 여기에서 사용되는 Fc_wt 타입 항체는, 생체 내에 존재하지 않는 항원인, 키홀(keyhole) 림펫 헤모시아닌(KLH)에 대한 인간 IgG1 항체이다. 이러한 항체는 표준 방법에 따라 얻어진다. 실시예 4에서와 같이, HER2 단백질은 Maxisorp 384-웰 투명 플레이트 상에 고정된다. 다음날, HER2 단백질 용액이 제거된 후, 플레이트는 Blocking One을 함유하는 PBS로 실온에서 1시간 동안 배양된 다음, TBS-T로 세척된다. Fc_wt, Fc_RK 및 Fc_RR 타입 항-HER2 항체는 각 웰에 첨가되고, 실온에서 1시간 동안 배양된다. 각각의 CD16V 및 CD16V 돌연변이 단백질은 희석액으로 희석되어 20 ㎍/mL의 최대 농도로부터 약 3-배의 공비로 희석액 시리즈가 준비되고, 희석제로 2 mg/mL로 조정된 항-KLH 항체 또는 희석액과 1:1로 혼합된다. 플레이트를 TBS-T로 세척한 후, 20 μL의 이들 혼합 용액은 첨가되고 실온에서 1시간 동안 배양된다. 이 시점에서, 10 ㎍/mL의 CD16V 단백질 최종농도로부터 약 3-배의 공비이다. 플레이트가 TBS-T로 세척된 후, 희석액으로 2,000배 희석된 20 μL의 양고추냉이 퍼옥시다제-표지 항-FLAG(등록 상표) M2 항체는 검출 항체로서 각 웰에 첨가된다. 실온에서 1시간 동안 배양한 후, 플레이트는 TBS-T로 세척된다. TMB+Substrate-Chromogen을 첨가하고 배양한 후, 반응은 1M 황산을 첨가하여 정지되고, 450 ㎚에서의 흡광도 및 기준 파장은 Infinite 200 PRO를 사용하여 측정된다.
그 결과, 항-KLH 항체의 존재하에서 CD16V와 Fc_wt 타입 항-HER2 항체 사이에 결합 활성은 10 ㎍/mL의 최대 CD16V 농도에서 매우 낮았으며, CD16V가 3 ㎍/mL 이하에서 반응된 경우 흡광도는 배경(background)과 동일한 수준이었다. 한편, 항-KLH 항체의 존재하에서 Fc_RK 및 Fc_RR 타입 항-HER2 항체와 각각의 CD16V 돌연변이체(CD16V_D, CD16V_ED, CD16V_EE, CD16V_DQ1 및 CD16V_DQ2)의 결합 활성은 감소하였으나, 일정 범위의 감소 내에서 유지되었다(도 5). 혈청 내 면역글로불린의 대부분이 IgG1이기 때문에, 이것은 돌연변이 Fc-타입 항체 및 CD16V 돌연변이체가 혈청 내 Fc_wt 및 CD16V보다 더 낮은 농도에서 결합을 나타냄을 시사한다.
실시예 10: CD16V-발현 KHYG-1 세포의 확립
CD16V 서열은 성숙형 타입(SEQ ID NO: 78)과 미성숙형 타입(GenBank accession number: AAH17865.1, SEQ ID NO: 90)을 갖는 것으로 알려져 있다. 미성숙형 타입을 인코딩하는 유전자(SEQ ID NO: 89)는 pLVSIN-CMV Pur Vector(Takara Bio, Cat. 6183)에서 멀티클로닝 부위(multicloning site) 내로 삽입된다. 유사하게, CD16V 돌연변이체(CD16V_D, CD16V_ED, CD16V_EE, CD16V_DQ1, CD16V_DQ2)의 아미노산 서열(SEQ ID NOs: 80, 82, 84, 86, 88)을 인코딩하는 유전자(SEQ ID NOs: 79, 81, 83, 85, 87)는 pLVSIN-CMV Pur Vector 내로 도입되어 각 CD16V 돌연변이체의 벡터가 구축된다. Lenti-X(등록 상표) 293T 세포주(Takara Bio, Cat. 632180)는, Lentiviral High Titer Packaging Mix(Takara Bio, Cat. 6194)와 함께 Lipofectamine 2000(Thermo Fisher Scientific, Cat. 11668027)을 사용하여 이들 벡터로 형질감염되고, 그 결과로 생성된 배양 상층액은 수집된다. PEG-it Virus Precipitation Solution(5x)(System Biosciences, Cat. LV810A-1)은 각 배양 상층액에 첨가되고, 4℃에서 밤새 배양되어 CD16V 또는 CD16V 돌연변이체-발현 렌티바이러스 벡터를 농축시킨다. 렌티바이러스 벡터를 KHYG-1 세포(JCRB Cell Bank, JCRB0156)에 감염시키고, 퓨로마이신(Puromycin)으로 형질전환 세포만을 선별하여, 도입된 CD16V 또는 CD16V 돌연변이체 유전자를 갖는 CD16V-발현 KHYG-1(CD16V/KHYG-1) 세포 또는 CD16V 돌연변이체-발현 KHYG-1(CD16V 돌연변이체/KHYG-1) 세포는 제조된다.
제조된 CD16V/KHYG-1 세포 또는 CD16V 돌연변이체/KHYG-1 세포에서 발현되는 CD16V 또는 CD16V 돌연변이체의 발현 수준은 유세포 분석기(flow cytometry)로 측정된다. 피코에리트린-표지된 항-인간 CD16 항체(클론: 3G8, BioLegend, Cat. 302008)는, STAIN BUFFER(BD Bioscience, Cat. 554656)에서 현탁된 각 KHYG-1 세포에 첨가되고, 얼음 상에서 20분 동안 배양된다. 세포를 STAIN BUFFER로 3회 세척한 후, 7-AAD(BD Bioscience, Cat. 559925)는 첨가되고 어두운 조건에서 15분 동안 배양된다. 피코에리트린의 형광 강도는 그 다음 FACS 어레이(BD Bioscience)를 사용하여 7-AAD 음성 생존 세포 분획에서 측정된다. FlowJo(BD Bioscience)는 분석을 위해 사용된다. 그 결과, 확립된 세포 모두는 CD16V 또는 CD16V 돌연변이체를 75% 이상의 발현율로 발현했다(도 6).
실시예 11: CD16V-발현 KHYG-1 세포를 사용한 항체 ADCC 활성의 평가
CD16V/KHYG-1 세포 또는 CD16V 돌연변이체/KHYG-1 세포의 ADCC 활성을 평가하기 위하여, 1:10의 비율로 Calcein-AM Solution(Dojindo Laboratories, C396)으로 염색된 10,000개 세포의 HER2-양성 SK-BR-3 세포 및 100,000개 세포의 CD16V/KHYG-1 세포 또는 CD16V 돌연변이체/KHYG-1 세포는, 96-웰 플레이트(CORNING, Cat. 353077)에서 200 μL의 배양 배지에서 4 ㎍/mL의 최고 농도로부터 4-배 희석 시리즈로 희석된 각 항-HER2 항체의 존재하에서 4시간 동안 배양된다. 100 μL의 상층액에서 Calcein-AM으로부터 유래된 형광 강도는 FlexStation 3(Molecular Devices)를 사용하여 측정되어 SK-BR-3 세포 생존율을 관찰했다. 세포독성 활성은 하기 수학식을 사용하여 계산되며, 여기서, T-MAX는 1% Triton X-100(SIGMA-ALDRICH, Cat. 30-5140)가 SK-BR-3 세포에 첨가된 경우의 값이고, T-Spon은 오직 배지만이 첨가된 경우의 값이다.
세포독성 활성(%)(세포 용해의 %) = 100×(Data-(T-Spon))/((T-MAX)-(T-Spon))
그 결과, CD16V/KHYG-1 세포는, Fc_wt 타입 항-HER2 항체의 경우에만 농도-의존적 방식으로 SK-BR-3 세포에 대해 세포독성을 나타냈다. 세포독성은 Fc_RK 및 Fc_RR 타입 항-HER2 항체의 경우에 극히 낮았다. 한편, Fc_wt 타입 항-HER2 항체는, 평가된 모든 CD16V 돌연변이체/KHYG-1 세포에서 세포독성 활성을 나타내지 않거나 또는 극히 낮은 세포독성 활성을 나타냈다. Fc_RK 및 Fc_RR 타입 항-HER2 항체만이 평가된 모든 CD16V 돌연변이체/KHYG-1 세포에서 세포독성 활성을 나타냈다(도 7). 따라서, CD16V 돌연변이체 및 Fc 돌연변이체가 특이적인 결합 활성을 가지며, 조합이 ADCC 유도 작용에 특이성을 나타내는 것은 명백하다.
실시예 12: 인간 혈청의 존재하에서 CD16V-발현 KHYG-1 세포를 사용한 ADCC 활성의 평가
CD16V 또는 CD16V 돌연변이체/KHYG-1 세포의 ADCC 활성에 대한 인간 혈청의 효과를 확인하기 위해, SK-BR-3 세포에 대한 세포독성은, 실시예 11과 동일한 방식으로 5% 소태아혈청(FBS) 또는 5% 인간 혈청을 함유하는 배양 배지에서 1 μg/mL의 농도로 각각의 항-HER2 항체를 사용하여 평가된다. 각 혈청의 보체 활성(complement activity)은 보체-의존성 세포독성의 유도에 의한 ADCC 활성의 평가의 방해를 피하기 위해 열-불활성화된다.
그 결과, Fc_wt 타입 항-HER2 항체의 경우에 CD16V/KHYG-1의 SK-BR-3에 대한 세포독성은 FBS와 비교하여 인간 혈청 존재하에서 감소했다. 한편, 인간 혈청 존재하에서 Fc_RK 타입 항-HER2 항체의 경우에 CD16V 돌연변이체/KHYG-1의 SK-BR-3에 대한 세포독성은 FBS의 존재하에서와 거의 동일했다(도 8). 유사하게, 인간 혈청 존재하에서 Fc_RK 타입 항-HER2 항체의 경우에 CD16V 돌연변이체/KHYG-1의 SK-BR-3에 대한 세포독성은 CD16V_EE/KHYG-1을 제외하고는 FBS의 존재하에서와 거의 동일했다(도 8).
따라서, 이러한 결과는, 인간 혈청이 Fc_wt 타입 항체와 CD16V 사이에 상호작용을 방해하는 반면, Fc_RK 또는 Fc_RR 타입 항체 및 인간 혈청 IgG가 CD16V 돌연변이체/KHYG-1에 대한 ADCC 유도 작용에 대해 덜 경쟁적임을 나타낸다.
실시예 13: CD16V CAR-발현 T 세포의 세포독성 활성의 평가
CAR-T는 암 면역요법에서 암세포에 대한 가장 강력한 효과기 세포 중 하나로 알려져 있다. CD16V 돌연변이체와 Fc 돌연변이체의 조합에 대한 적용을 확장하기 위해, CD16V 또는 CD16V 돌연변이체의 세포외 도메인이 신호 전달 도메인(CD16V CAR 또는 CD16V 돌연변이체 CAR)과 융합된 키메라 수용체는 일차 T 세포 상에 발현되고, 암세포에 대한 이들 CD16V CAR 또는 CD16V 돌연변이체 CAR-발현 T 세포들(CD16V/CAR-T 또는 CD16V 돌연변이체/CAR-T)의 세포독성 활성은 평가된다.
5'-측 상에 부가된 신호 서열(MALPVTALLPLALLLHAARP)을 인코딩하는 유전자(SEQ ID NO: 104)와 함께 CD8a 힌지 및 CD8 막관통 도메인을 통한 CD137 및 CD3ζ의 신호 도메인과 CD16V의 세포외 도메인의 융합 단백질인, CD16V CAR의 아미노산 서열을 인코딩하는 유전자(SEQ ID NO: 92)는, pLVSIN-EF1a Neo Vector(Takara Bio, Cat. 6184)에서 멀티클로닝 부위 내로 삽입된다. 유사하게, 5'-측 상에 부가된 신호 서열(MALPVTALLPLALLLHAARP)을 인코딩하는 유전자(SEQ ID NO: 104)와 함께 각각의 CD16V 돌연변이체(CD16V_D, CD16V_ED, CD16V_EE, CD16V_DQ1, 및 CD16V_DQ2)의 아미노산 서열을 인코딩하는 각각의 유전자(SEQ ID NOs: 94, 96, 98, 100, 및 102)는 pLVSIN-EF1α Neo 벡터의 멀티클로닝 부위에 삽입된다. 이들 벡터를 사용하여, CD16V 또는 CD16V 돌연변이체-발현 렌티바이러스 벡터는 실시예 10과 동일한 방식으로 제조된다.
렌티바이러스 벡터를 Pan T 세포 분리 키트(Miltenyi Biotec, Cat. 130-096-535)를 사용하여 인간 말초 혈액 단핵 세포(Lonza, Cat. CC-2702)로부터 정제된 인간 T 세포 내로 감염시켜, CD16V/CAR -T 및 CD16V 돌연변이체/CAR-T는 제조된다. T 세포 상에 CD16V 또는 각 CD16V 돌연변이체의 발현율은 60%를 초과했다. CD16V/CAR-T 또는 CD16V 돌연변이체/CAR-T의 세포독성 활성을 평가하기 위해, 1:15 비율로 Calcein-AM 용액으로 염색된 10,000개 세포의 SK-BR-3 세포 및 150,000개 세포의 CD16V/CAR-T 또는 CD16V 돌연변이체/CAR-T는, 200 μL의 배양 배지에서 16 ㎍/mL의 최고 농도로부터 4-배 희석 시리즈로 희석된 각 항-HER2 항체의 존재하에서 4시간 동안 배양된다. 100 μL의 상층액에서 Calcein-AM으로부터 유래된 형광 강도는 측정되고, 세포독성 활성은 실시예 11과 동일한 방식으로 계산된다.
그 결과, CD16V/CAR-T는 Fc_wt 타입 항-HER2 항체의 경우에만 농도-의존적 방식으로 SK-BR-3 세포에 대한 세포독성을 나타냈다. 세포독성은 Fc_RK 및 Fc_RR 타입 항-HER2 항체의 경우에 극히 낮았다. 한편, Fc_wt 타입 항-HER2 항체는 모든 CD16V 돌연변이체/CAR-T의 세포독성 활성을 유도하지 않거나 또는 극히 낮은 세포독성 활성을 유도했다. Fc_RK 및 Fc_RR 타입 항-HER2 항체만이 모든 CD16V 돌연변이체/CAR-T의 세포독성 활성을 유도했다(도 9). 따라서, CD16V 돌연변이체와 Fc 돌연변이체의 조합이 CAR과 같은 키메라 단백질에 적용하는 경우에 특이성을 유지하는 것은 명백하다.
본 발명의 Fcγ 수용체 돌연변이체 및 Fc 영역 돌연변이체는 내인성 면역글로불린 또는 내인성 Fcγ 수용체와 본질적으로 결합하지 않으나, Fcγ 수용체 돌연변이체 및 Fc 영역 돌연변이체는 서로 특이적으로 결합한다. 따라서, 이들 조합은 내인성 분자가 약효를 감소시키지 않는 면역요법을 제공할 것으로 기대된다.
균등물
당업자는, 여기에 기재된 특정 구현예들 및 방법들에 대한 많은 균등물을 단지 일상적인 실험을 사용하여 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 이러한 균등물은 하기 청구범위의 범주에 포괄되는 것으로 의도된다.
[서열 목록 프리 텍스트]
인공 서열(Artificial Sequence)에 대한 설명은 아래 서열 목록에서 숫자 표제 <223>으로 제공된다. 구체적으로, 서열 목록에서 SEQ ID NO: 1로 표시되는 뉴클레오티드 서열은, FLAG 서열이 CD16V 서열의 세포외 부분 서열 단백질의 C-말단에 연결된 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이다. SEQ ID NO: 2에 나타낸 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 1에 의해 인코딩된 아미노산 서열이다. SEQ ID NOs: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15 및 17에 나타낸 뉴클레오티드 서열은, 돌연변이가 CD16V 서열의 세포외 부분서열 내로 도입된 단백질의 C-말단에 FLAG 서열이 연결된 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이다. SEQ ID NOs: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 및 18에 나타낸 아미노산 서열은, 각각, SEQ ID NOs: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15 및 17에 의해 인코딩된 아미노산 서열이다. SEQ ID NOs: 19 및 37은 트라스투주맙의 중쇄 가변 영역을 인코딩하는 유전자의 N-말단에 연결된 신호 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이다. SEQ ID NOs: 21 및 39는, 트라스투주맙의 중쇄 가변 영역을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이고, SEQ ID NO: 23은 인간 Igγ1 불변 영역을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이다. SEQ ID NOs: 20, 22, 24, 38 및 40은, 각각, SEQ ID NOs: 19, 21, 23, 37 및 39에 의해 인코딩된 아미노산 서열이다. SEQ ID NO: 27은 트라스투주맙의 경쇄 영역을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이고, SEQ ID NO: 28은 SEQ ID NO: 27에 의해 인코딩된 아미노산 서열이다. SEQ ID NO: 25는 트라스투주맙의 경쇄 영역의 5'-측 상에 연결된 신호 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이고, SEQ ID NO: 26은 SEQ ID NO: 25에 의해 인코딩된 아미노산 서열이다. SEQ ID NOs: 29, 31, 33, 및 35는 인간 Igγ1 불변 영역을 인코딩하는 유전자 내로 돌연변이가 도입된 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이고, SEQ ID NOs: 30, 32, 34, 및 36은, 각각, SEQ ID NOs: 29, 31, 33, 및 35에 의해 인코딩된 아미노산 서열이다. SEQ ID NOs: 41, 43, 45 및 47로 표시되는 뉴클레오티드 서열은 인간 Igγ1 불변 영역을 인코딩하는 유전자 내로 아미노산 돌연변이가 도입된 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이고, SEQ ID NOs: 42, 44, 46 및 48은, 각각, SEQ ID NOs: 41, 43, 45 및 47에 의해 인코딩된 아미노산 서열이다. SEQ ID NOs: 49, 51, 53 및 55에 나타낸 뉴클레오티드 서열은 CD16V 서열의 세포외 부분서열 내로 돌연변이가 도입된 단백질의 C-말단에 FLAG 서열이 연결된 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이다. SEQ ID NOs: 50, 52, 54 및 56에 나타낸 아미노산 서열은, 각각, SEQ ID NOs: 49, 51, 53 및 55에 의해 인코딩된 아미노산 서열이다. SEQ ID NOs: 57 및 59로 표시되는 뉴클레오티드 서열은 인간 Igγ1 불변 영역 내로 도입된 돌연변이를 갖는 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이다. SEQ ID NOs: 58 및 60은 SEQ ID NOs: 57 및 59에 의해 인코딩된 아미노산 서열이다. SEQ ID NO: 61은 세툭시맙의 중쇄 가변 영역을 인코딩하는 유전자의 N-말단에 연결된 신호 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이고, SEQ ID NO: 65는 세툭시맙의 경쇄 영역을 인코딩하는 유전자의 N-말단에 연결된 신호 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이다. SEQ ID NOs: 62 및 66은 SEQ ID NOs: 61 및 65에 의해 인코딩된 아미노산 서열이다. SEQ ID NOs: 63 및 67은, 각각, 세툭시맙의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 영역을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이고, SEQ ID NOs: 64 및 68은, 각각, SEQ ID NOs: 63 및 67에 의해 인코딩된 아미노산 서열이다. SEQ ID NO: 69는 에드레콜로맙의 중쇄 가변 영역을 인코딩하는 유전자의 N-말단에 연결된 신호 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이고, SEQ ID NO: 73은 에드레콜로맙의 경쇄 영역을 인코딩하는 유전자의 N-말단에 연결된 신호 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이다. SEQ ID NOs: 70 및 74는, 각각, SEQ ID NOs: 69 및 73에 의해 인코딩된 아미노산 서열이다. SEQ ID NOs: 71 및 75는, 각각, 에드레콜로맙의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 영역을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이고, SEQ ID NOs: 72 및 76은, 각각, SEQ ID NOs: 71 및 75에 의해 인코딩된 아미노산 서열이다. SEQ ID NO: 77은 성숙형 CD16V 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이고, SEQ ID NO: 78은 SEQ ID NO: 77에 의해 인코딩된 아미노산 서열이다. SEQ ID NOs: 79, 81, 83, 85 및 87은 돌연변이가 도입된 CD16V 돌연변이체의 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이고, SEQ ID NOs: 80, 82, 84, 86 및 88은, 각각, SEQ ID NOs: 79, 81, 83, 85 및 87에 의해 인코딩된 아미노산 서열이다. SEQ ID NO: 89는 미성숙형 CD16V 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이고, SEQ ID NO: 90은 SEQ ID NO: 89에 의해 인코딩된 아미노산 서열이다. SEQ ID NO: 91은 FLAG의 아미노산 서열이다. SEQ ID NO: 92에 나타낸 뉴클레오티드 서열은, 신호 서열이 N-말단에 연결된, CD8a 힌지과 CD8 막관통 도메인을 통해 CD137 및 CD3ζ의 신호 도메인 및 CD16V의 세포외 부분 단백질의 융합 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이다. SEQ ID NO: 93에 나타낸 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 92에 의해 인코딩된 아미노산 서열이다. SEQ ID NOs: 94, 96, 98, 100, 및 102에 나타낸 뉴클레오티드 서열은, 신호 서열이 N-말단에 연결된, CD8a 힌지과 CD8 막관통 도메인을 통해 CD137 및 CD3ζ의 신호 도메인 및 돌연변이가 도입된 CD16V의 세포외 부분 단백질의 융합 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이다. SEQ ID NOs: 95, 97, 99, 101, 및 103에 나타낸 아미노산 서열은, 각각, SEQ ID NOs: 94, 96, 98, 100, 및 102에 의해 인코딩된 아미노산 서열이다. SEQ ID NO: 104는 CD16V CAR 또는 CD16V 돌연변이 CAR 단백질의 N-말단에 연결된 신호 서열의 아미노산 서열이다.
SEQUENCE LISTING <110> ASTELLAS PHARMA, INC. <120> HUMAN NON-NATURALLY OCCURRING MODIFIED FC REGION OF IGG SPECIFICALLY BINDING TO NON-NATURALLY OCCURRING MODIFIED FC RECEPTOR <130> 127206-07820 <150> 63/067,629 <151> 2020-08-19 <160> 104 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 651 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA encoding CD16A_V158_FLAG <220> <221> CDS <222> (1)..(651) <400> 1 atg tgg cag ctg ctg ctg cct aca gct ctg ctg ctg ttg gtg tct gcc 48 Met Trp Gln Leu Leu Leu Pro Thr Ala Leu Leu Leu Leu Val Ser Ala 1 5 10 15 ggc atg aga acc gag gat ctg cct aag gcc gtg gtg ttc ctg gaa cct 96 Gly Met Arg Thr Glu Asp Leu Pro Lys Ala Val Val Phe Leu Glu Pro 20 25 30 cag tgg tac aga gtg ctg gaa aag gac agc gtg acc ctg aag tgc cag 144 Gln Trp Tyr Arg Val Leu Glu Lys Asp Ser Val Thr Leu Lys Cys Gln 35 40 45 ggc gct tac tct ccc gag gac aac tct acc cag tgg ttc cac aac gag 192 Gly Ala Tyr Ser Pro Glu Asp Asn Ser Thr Gln Trp Phe His Asn Glu 50 55 60 tcc ctg atc tcc agc cag gcc tcc tcc tac ttt atc gat gcc gcc acc 240 Ser Leu Ile Ser Ser Gln Ala Ser Ser Tyr Phe Ile Asp Ala Ala Thr 65 70 75 80 gtg gac gac tct ggc gag tat aga tgc cag acc aac ctg agc acc ctg 288 Val Asp Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr Asn Leu Ser Thr Leu 85 90 95 agc gat cct gtg cag ctg gaa gtg cat atc ggc tgg ctg ttg ctg cag 336 Ser Asp Pro Val Gln Leu Glu Val His Ile Gly Trp Leu Leu Leu Gln 100 105 110 gcc cct aga tgg gtg ttc aaa gaa gag gac ccc atc cac ctg aga tgc 384 Ala Pro Arg Trp Val Phe Lys Glu Glu Asp Pro Ile His Leu Arg Cys 115 120 125 cac tct tgg aag aac acc gct ctg cac aaa gtg acc tac ctg cag aac 432 His Ser Trp Lys Asn Thr Ala Leu His Lys Val Thr Tyr Leu Gln Asn 130 135 140 ggc aag ggc aga aag tac ttc cac cac aac tcc gac ttc tac atc ccc 480 Gly Lys Gly Arg Lys Tyr Phe His His Asn Ser Asp Phe Tyr Ile Pro 145 150 155 160 aag gct acc ctg aag gac tcc ggc tcc tac ttc tgt aga ggc ctc gtg 528 Lys Ala Thr Leu Lys Asp Ser Gly Ser Tyr Phe Cys Arg Gly Leu Val 165 170 175 ggc tcc aag aac gtg tcc tcc gag aca gtg aac atc acc atc aca cag 576 Gly Ser Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr Val Asn Ile Thr Ile Thr Gln 180 185 190 ggc ctc gcc gtg tct acc atc tcc agc ttt ttc cca cct ggc tac cag 624 Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Phe Pro Pro Gly Tyr Gln 195 200 205 gac tac aag gac gac gac gac aag tga 651 Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 210 215 <210> 2 <211> 216 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 2 Met Trp Gln Leu Leu Leu Pro Thr Ala Leu Leu Leu Leu Val Ser Ala 1 5 10 15 Gly Met Arg Thr Glu Asp Leu Pro Lys Ala Val Val Phe Leu Glu Pro 20 25 30 Gln Trp Tyr Arg Val Leu Glu Lys Asp Ser Val Thr Leu Lys Cys Gln 35 40 45 Gly Ala Tyr Ser Pro Glu Asp Asn Ser Thr Gln Trp Phe His Asn Glu 50 55 60 Ser Leu Ile Ser Ser Gln Ala Ser Ser Tyr Phe Ile Asp Ala Ala Thr 65 70 75 80 Val Asp Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr Asn Leu Ser Thr Leu 85 90 95 Ser Asp Pro Val Gln Leu Glu Val His Ile Gly Trp Leu Leu Leu Gln 100 105 110 Ala Pro Arg Trp Val Phe Lys Glu Glu Asp Pro Ile His Leu Arg Cys 115 120 125 His Ser Trp Lys Asn Thr Ala Leu His Lys Val Thr Tyr Leu Gln Asn 130 135 140 Gly Lys Gly Arg Lys Tyr Phe His His Asn Ser Asp Phe Tyr Ile Pro 145 150 155 160 Lys Ala Thr Leu Lys Asp Ser Gly Ser Tyr Phe Cys Arg Gly Leu Val 165 170 175 Gly Ser Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr Val Asn Ile Thr Ile Thr Gln 180 185 190 Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Phe Pro Pro Gly Tyr Gln 195 200 205 Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 210 215 <210> 3 <211> 651 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA encoding CD16A_V158_K120D_FLAG <220> <221> CDS <222> (1)..(651) <400> 3 atg tgg cag ctg ctg ctg cct aca gct ctg ctg ctg ttg gtg tct gcc 48 Met Trp Gln Leu Leu Leu Pro Thr Ala Leu Leu Leu Leu Val Ser Ala 1 5 10 15 ggc atg aga acc gag gat ctg cct aag gcc gtg gtg ttc ctg gaa cct 96 Gly Met Arg Thr Glu Asp Leu Pro Lys Ala Val Val Phe Leu Glu Pro 20 25 30 cag tgg tac aga gtg ctg gaa aag gac agc gtg acc ctg aag tgc cag 144 Gln Trp Tyr Arg Val Leu Glu Lys Asp Ser Val Thr Leu Lys Cys Gln 35 40 45 ggc gct tac tct ccc gag gac aac tct acc cag tgg ttc cac aac gag 192 Gly Ala Tyr Ser Pro Glu Asp Asn Ser Thr Gln Trp Phe His Asn Glu 50 55 60 tcc ctg atc tcc agc cag gcc tcc tcc tac ttt atc gat gcc gcc acc 240 Ser Leu Ile Ser Ser Gln Ala Ser Ser Tyr Phe Ile Asp Ala Ala Thr 65 70 75 80 gtg gac gac tct ggc gag tat aga tgc cag acc aac ctg agc acc ctg 288 Val Asp Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr Asn Leu Ser Thr Leu 85 90 95 agc gat cct gtg cag ctg gaa gtg cat atc ggc tgg ctg ttg ctg cag 336 Ser Asp Pro Val Gln Leu Glu Val His Ile Gly Trp Leu Leu Leu Gln 100 105 110 gcc cct aga tgg gtg ttc aaa gaa gag gac ccc atc cac ctg aga tgc 384 Ala Pro Arg Trp Val Phe Lys Glu Glu Asp Pro Ile His Leu Arg Cys 115 120 125 cac tct tgg aag aac acc gct ctg cac gat gtg acc tac ctg cag aac 432 His Ser Trp Lys Asn Thr Ala Leu His Asp Val Thr Tyr Leu Gln Asn 130 135 140 ggc aag ggc aga aag tac ttc cac cac aac tcc gac ttc tac atc ccc 480 Gly Lys Gly Arg Lys Tyr Phe His His Asn Ser Asp Phe Tyr Ile Pro 145 150 155 160 aag gct acc ctg aag gac tcc ggc tcc tac ttc tgt aga ggc ctc gtg 528 Lys Ala Thr Leu Lys Asp Ser Gly Ser Tyr Phe Cys Arg Gly Leu Val 165 170 175 ggc tcc aag aac gtg tcc tcc gag aca gtg aac atc acc atc aca cag 576 Gly Ser Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr Val Asn Ile Thr Ile Thr Gln 180 185 190 ggc ctc gcc gtg tct acc atc tcc agc ttt ttc cca cct ggc tac cag 624 Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Phe Pro Pro Gly Tyr Gln 195 200 205 gac tac aag gac gac gac gac aag tga 651 Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 210 215 <210> 4 <211> 216 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 4 Met Trp Gln Leu Leu Leu Pro Thr Ala Leu Leu Leu Leu Val Ser Ala 1 5 10 15 Gly Met Arg Thr Glu Asp Leu Pro Lys Ala Val Val Phe Leu Glu Pro 20 25 30 Gln Trp Tyr Arg Val Leu Glu Lys Asp Ser Val Thr Leu Lys Cys Gln 35 40 45 Gly Ala Tyr Ser Pro Glu Asp Asn Ser Thr Gln Trp Phe His Asn Glu 50 55 60 Ser Leu Ile Ser Ser Gln Ala Ser Ser Tyr Phe Ile Asp Ala Ala Thr 65 70 75 80 Val Asp Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr Asn Leu Ser Thr Leu 85 90 95 Ser Asp Pro Val Gln Leu Glu Val His Ile Gly Trp Leu Leu Leu Gln 100 105 110 Ala Pro Arg Trp Val Phe Lys Glu Glu Asp Pro Ile His Leu Arg Cys 115 120 125 His Ser Trp Lys Asn Thr Ala Leu His Asp Val Thr Tyr Leu Gln Asn 130 135 140 Gly Lys Gly Arg Lys Tyr Phe His His Asn Ser Asp Phe Tyr Ile Pro 145 150 155 160 Lys Ala Thr Leu Lys Asp Ser Gly Ser Tyr Phe Cys Arg Gly Leu Val 165 170 175 Gly Ser Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr Val Asn Ile Thr Ile Thr Gln 180 185 190 Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Phe Pro Pro Gly Tyr Gln 195 200 205 Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 210 215 <210> 5 <211> 651 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA encoding CD16A_V158_K120E_FLAG <220> <221> CDS <222> (1)..(651) <400> 5 atg tgg cag ctg ctg ctg cct aca gct ctg ctg ctg ttg gtg tct gcc 48 Met Trp Gln Leu Leu Leu Pro Thr Ala Leu Leu Leu Leu Val Ser Ala 1 5 10 15 ggc atg aga acc gag gat ctg cct aag gcc gtg gtg ttc ctg gaa cct 96 Gly Met Arg Thr Glu Asp Leu Pro Lys Ala Val Val Phe Leu Glu Pro 20 25 30 cag tgg tac aga gtg ctg gaa aag gac agc gtg acc ctg aag tgc cag 144 Gln Trp Tyr Arg Val Leu Glu Lys Asp Ser Val Thr Leu Lys Cys Gln 35 40 45 ggc gct tac tct ccc gag gac aac tct acc cag tgg ttc cac aac gag 192 Gly Ala Tyr Ser Pro Glu Asp Asn Ser Thr Gln Trp Phe His Asn Glu 50 55 60 tcc ctg atc tcc agc cag gcc tcc tcc tac ttt atc gat gcc gcc acc 240 Ser Leu Ile Ser Ser Gln Ala Ser Ser Tyr Phe Ile Asp Ala Ala Thr 65 70 75 80 gtg gac gac tct ggc gag tat aga tgc cag acc aac ctg agc acc ctg 288 Val Asp Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr Asn Leu Ser Thr Leu 85 90 95 agc gat cct gtg cag ctg gaa gtg cat atc ggc tgg ctg ttg ctg cag 336 Ser Asp Pro Val Gln Leu Glu Val His Ile Gly Trp Leu Leu Leu Gln 100 105 110 gcc cct aga tgg gtg ttc aaa gaa gag gac ccc atc cac ctg aga tgc 384 Ala Pro Arg Trp Val Phe Lys Glu Glu Asp Pro Ile His Leu Arg Cys 115 120 125 cac tct tgg aag aac acc gct ctg cac gag gtg acc tac ctg cag aac 432 His Ser Trp Lys Asn Thr Ala Leu His Glu Val Thr Tyr Leu Gln Asn 130 135 140 ggc aag ggc aga aag tac ttc cac cac aac tcc gac ttc tac atc ccc 480 Gly Lys Gly Arg Lys Tyr Phe His His Asn Ser Asp Phe Tyr Ile Pro 145 150 155 160 aag gct acc ctg aag gac tcc ggc tcc tac ttc tgt aga ggc ctc gtg 528 Lys Ala Thr Leu Lys Asp Ser Gly Ser Tyr Phe Cys Arg Gly Leu Val 165 170 175 ggc tcc aag aac gtg tcc tcc gag aca gtg aac atc acc atc aca cag 576 Gly Ser Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr Val Asn Ile Thr Ile Thr Gln 180 185 190 ggc ctc gcc gtg tct acc atc tcc agc ttt ttc cca cct ggc tac cag 624 Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Phe Pro Pro Gly Tyr Gln 195 200 205 gac tac aag gac gac gac gac aag tga 651 Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 210 215 <210> 6 <211> 216 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 6 Met Trp Gln Leu Leu Leu Pro Thr Ala Leu Leu Leu Leu Val Ser Ala 1 5 10 15 Gly Met Arg Thr Glu Asp Leu Pro Lys Ala Val Val Phe Leu Glu Pro 20 25 30 Gln Trp Tyr Arg Val Leu Glu Lys Asp Ser Val Thr Leu Lys Cys Gln 35 40 45 Gly Ala Tyr Ser Pro Glu Asp Asn Ser Thr Gln Trp Phe His Asn Glu 50 55 60 Ser Leu Ile Ser Ser Gln Ala Ser Ser Tyr Phe Ile Asp Ala Ala Thr 65 70 75 80 Val Asp Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr Asn Leu Ser Thr Leu 85 90 95 Ser Asp Pro Val Gln Leu Glu Val His Ile Gly Trp Leu Leu Leu Gln 100 105 110 Ala Pro Arg Trp Val Phe Lys Glu Glu Asp Pro Ile His Leu Arg Cys 115 120 125 His Ser Trp Lys Asn Thr Ala Leu His Glu Val Thr Tyr Leu Gln Asn 130 135 140 Gly Lys Gly Arg Lys Tyr Phe His His Asn Ser Asp Phe Tyr Ile Pro 145 150 155 160 Lys Ala Thr Leu Lys Asp Ser Gly Ser Tyr Phe Cys Arg Gly Leu Val 165 170 175 Gly Ser Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr Val Asn Ile Thr Ile Thr Gln 180 185 190 Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Phe Pro Pro Gly Tyr Gln 195 200 205 Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 210 215 <210> 7 <211> 651 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA encoding CD16A_V158_K128D_FLAG <220> <221> CDS <222> (1)..(651) <400> 7 atg tgg cag ctg ctg ctg cct aca gct ctg ctg ctg ttg gtg tct gcc 48 Met Trp Gln Leu Leu Leu Pro Thr Ala Leu Leu Leu Leu Val Ser Ala 1 5 10 15 ggc atg aga acc gag gat ctg cct aag gcc gtg gtg ttc ctg gaa cct 96 Gly Met Arg Thr Glu Asp Leu Pro Lys Ala Val Val Phe Leu Glu Pro 20 25 30 cag tgg tac aga gtg ctg gaa aag gac agc gtg acc ctg aag tgc cag 144 Gln Trp Tyr Arg Val Leu Glu Lys Asp Ser Val Thr Leu Lys Cys Gln 35 40 45 ggc gct tac tct ccc gag gac aac tct acc cag tgg ttc cac aac gag 192 Gly Ala Tyr Ser Pro Glu Asp Asn Ser Thr Gln Trp Phe His Asn Glu 50 55 60 tcc ctg atc tcc agc cag gcc tcc tcc tac ttt atc gat gcc gcc acc 240 Ser Leu Ile Ser Ser Gln Ala Ser Ser Tyr Phe Ile Asp Ala Ala Thr 65 70 75 80 gtg gac gac tct ggc gag tat aga tgc cag acc aac ctg agc acc ctg 288 Val Asp Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr Asn Leu Ser Thr Leu 85 90 95 agc gat cct gtg cag ctg gaa gtg cat atc ggc tgg ctg ttg ctg cag 336 Ser Asp Pro Val Gln Leu Glu Val His Ile Gly Trp Leu Leu Leu Gln 100 105 110 gcc cct aga tgg gtg ttc aaa gaa gag gac ccc atc cac ctg aga tgc 384 Ala Pro Arg Trp Val Phe Lys Glu Glu Asp Pro Ile His Leu Arg Cys 115 120 125 cac tct tgg aag aac acc gct ctg cac aaa gtg acc tac ctg cag aac 432 His Ser Trp Lys Asn Thr Ala Leu His Lys Val Thr Tyr Leu Gln Asn 130 135 140 ggc gat ggc aga aag tac ttc cac cac aac tcc gac ttc tac atc ccc 480 Gly Asp Gly Arg Lys Tyr Phe His His Asn Ser Asp Phe Tyr Ile Pro 145 150 155 160 aag gct acc ctg aag gac tcc ggc tcc tac ttc tgt aga ggc ctc gtg 528 Lys Ala Thr Leu Lys Asp Ser Gly Ser Tyr Phe Cys Arg Gly Leu Val 165 170 175 ggc tcc aag aac gtg tcc tcc gag aca gtg aac atc acc atc aca cag 576 Gly Ser Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr Val Asn Ile Thr Ile Thr Gln 180 185 190 ggc ctc gcc gtg tct acc atc tcc agc ttt ttc cca cct ggc tac cag 624 Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Phe Pro Pro Gly Tyr Gln 195 200 205 gac tac aag gac gac gac gac aag tga 651 Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 210 215 <210> 8 <211> 216 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic 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aac ggc aaa gag tac aag tgc aag gtg tcc aac 624 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 aag gcc ctg cct gct cct atc gaa aag acc atc tcc aag gcc aag ggc 672 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 cag cct agg gaa ccc cag gtt tac acc ttg cct cca tct cgg gac gag 720 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 225 230 235 240 ctg acc aag aac cag gtg tcc ctg acc tgt ctc gtg aag ggc ttc tac 768 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 cct tcc gat atc gcc gtg gaa tgg gag tct aac ggc cag cca gag aac 816 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 aac tac aag aca acc cct cct gtg ctg gac tcc gac ggc tca ttc ttc 864 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 ctg tac tcc aag ctg aca gtg gat aag tcc cgg tgg cag cag ggc aac 912 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 gtg ttc tct tgc tct gtg atg cac gag gcc ctg cac aac cac tac aca 960 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 cag aag tct ctg tct ctg agc ccc ggc aag tga 993 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 36 <211> 330 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 36 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Arg Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 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aag tcc tgc gac aag acc cac acc tgt cct cca tgt 336 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 cct gct cca gaa ctg ctc ggc gga cct tcc gtg ttc ctg ttt cct cca 384 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 aag cct aag gac acc ctg atg atc tct cgg acc cct gaa gtg acc tgc 432 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 gtg gtg gtg aga gtg tct cac gag gac cca gaa gtg aag ttc aat tgg 480 Val Val Val Arg Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 tac gtg gac ggc gtg gaa gtg cac aac gcc aag acc aag cct aga gag 528 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 gaa cag tac aac tcc acc tac aga gtg gtg tcc gtg ctg acc gtg ctg 576 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 cac cag gat tgg ctg aac ggc aaa gag tac aag tgc aag gtg tcc aac 624 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 aag 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245 250 255 tgc gat atc tac atc tgg gcc cct ctg gct ggc aca tgt ggc gtt ctg 816 Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu 260 265 270 ctg ctc agc ctg gtc atc acc ctg tac tgc aag cgg ggc aga aag aaa 864 Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys 275 280 285 ctg ctg tac atc ttc aag cag ccc ttc atg cgg ccc gtg cag acc aca 912 Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr 290 295 300 caa gag gaa gat ggc tgc agc tgt cgg ttc ccc gag gaa gaa gaa ggc 960 Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly 305 310 315 320 ggc tgc gag ctg aga gtg aag ttc agc aga tcc gcc gac gct cct gcc 1008 Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala 325 330 335 tat cag cag gga cag aac cag ctg tac aac gag ctg aac ctg ggg aga 1056 Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg 340 345 350 aga gaa gag tac gac gtg ctg gac aag cgg aga ggc aga gat cct gag 1104 Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu 355 360 365 atg ggc ggc aag ccc aga cgg aag aat cct caa gag ggc ctg tat aat 1152 Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn 370 375 380 gag ctg cag aaa gac aag atg gcc gag gcc tac agc gag atc gga atg 1200 Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met 385 390 395 400 aag ggc gag cgc aga aga ggc aag gga cac gat gga ctg tac cag ggc 1248 Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly 405 410 415 ctg agc acc gcc acc aag gat acc tat gac gca ctg cac atg cag gcc 1296 Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala 420 425 430 ctg cct cca aga taa 1311 Leu Pro Pro Arg 435 <210> 103 <211> 436 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 103 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Gly Met Arg Thr Glu Asp Leu Pro Lys Ala Val 20 25 30 Val Phe Leu Glu Pro Gln Trp Tyr Arg Val Leu Glu Lys Asp Ser Val 35 40 45 Thr Leu Lys Cys Gln Gly Ala Tyr Ser Pro Glu Asp Asn Ser Thr Gln 50 55 60 Trp Phe His Asn Glu Ser Leu Ile Ser Ser Gln Ala Ser Ser Tyr Phe 65 70 75 80 Ile Asp Ala Ala Thr Val Asp Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr 85 90 95 Gln Leu Ser Thr Leu Ser Asp Pro Val Gln Leu Glu Val His Ile Gly 100 105 110 Trp Leu Leu Leu Gln Ala Pro Arg Trp Val Phe Lys Glu Glu Asp Pro 115 120 125 Ile His Leu Arg Cys His Ser Trp Lys Asn Thr Ala Leu His Lys Val 130 135 140 Thr Tyr Leu Gln Asn Gly Lys Gly Arg Asp Tyr Phe His His Asn Ser 145 150 155 160 Asp Phe Tyr Ile Pro Lys Ala Thr Leu Lys Asp Ser Gly Ser Tyr Phe 165 170 175 Cys Arg Gly Leu Val Gly Ser Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr Val Asn 180 185 190 Ile Thr Ile Thr Gln Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Phe 195 200 205 Pro Pro Gly Tyr Gln Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro 210 215 220 Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys 225 230 235 240 Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala 245 250 255 Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu 260 265 270 Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys 275 280 285 Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr 290 295 300 Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly 305 310 315 320 Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala 325 330 335 Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg 340 345 350 Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu 355 360 365 Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn 370 375 380 Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met 385 390 395 400 Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly 405 410 415 Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala 420 425 430 Leu Pro Pro Arg 435 <210> 104 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> signal sequence <400> 104 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro 20

Claims (98)

  1. IgG의 변형된 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드로서, 상기 변형된 Fc 영역은 비-천연 발생이고, 야생형 또는 천연 발생 IgG의 Fc 영역과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하며, 상기 폴리펩티드는 야생형 또는 천연 발생 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성이 본질적으로 없고, 야생형 또는 천연 발생 Fcγ 수용체와 비교하여 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는 비-천연 발생 Fcγ 수용체에 결합할 수 있는, 폴리펩티드.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 야생형 또는 천연 발생 Fcγ 수용체는, 야생형 또는 천연 발생 CD16A이고, 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는 상기 비-천연 발생 Fcγ 수용체는 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는 비-천연 발생 CD16A인, 폴리펩티드.
  3. 청구항 2에 있어서,
    상기 야생형 또는 천연 발생 CD16A는, SEQ ID NO: 78에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는, 폴리펩티드.
  4. 청구항 2 또는 3에 있어서,
    적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는 CD16A는, (i) SEQ ID NO: 78에서의 위치 131에 상응하는 위치에서 라이신에서 아스파르트산(K131D 돌연변이), (ⅱ) SEQ ID NO: 78에서의 위치 128에 상응하는 위치에서 라이신에서 글루탐산(K128E 돌연변이), 및 (ⅲ) SEQ ID NO: 78에서의 위치 131에 상응하는 위치에서 라이신에서 글루탐산(K131E 돌연변이)으로부터 선택된 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는, 폴리펩티드.
  5. 청구항 4에 있어서,
    적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는 CD16A는, K131D 돌연변이 및 K128E 돌연변이 중 하나 또는 둘 모두를 포함하는, 폴리펩티드.
  6. 청구항 4에 있어서,
    적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는 CD16A는, K131E 돌연변이 및 K128E 돌연변이 중 하나 또는 둘 모두를 포함하는, 폴리펩티드.
  7. 청구항 4에 있어서,
    적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는 CD16A는, K131D 돌연변이를 포함하고, (ⅳ) SEQ ID NO: 78에서의 위치 38에 상응하는 위치에서 아스파라긴에서 글루타민(N38Q 돌연변이) 및 (v) SEQ ID NO: 78에서의 위치 74에 상응하는 위치에서 아스파라긴에서 글루타민(N74Q 돌연변이)으로부터 선택된 적어도 하나의 돌연변이를 더욱 포함하는, 폴리펩티드.
  8. 청구항 4에 있어서,
    적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는 CD16A는, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, 또는 SEQ ID NO: 88에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는, 폴리펩티드.
  9. 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 폴리펩티드는 인간 Igγ1의 변형된 Fc 영역을 포함하고, 상기 변형된 Fc 영역은 (i) EU 인덱스 넘버링에 따른 위치 269에 상응하는 위치에서 글루탐산에서 아르기닌으로의 돌연변이(E269R 돌연변이) 및 (ⅱ) (a) EU 인덱스 넘버링에 따른 위치 294에 상응하는 위치에서 글루탐산에서 아르기닌(E294R 돌연변이) 및 (b) EU 인덱스 넘버링에 따른 위치 294에 상응하는 위치에서 글루탐산에서 라이신(E294K 돌연변이)으로부터 선택된 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는, 폴리펩티드.
  10. 청구항 1 내지 9 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 폴리펩티드는 항체인, 폴리펩티드.
  11. 청구항 10에 있어서,
    상기 폴리펩티드는 암 항원에 결합하는 항체인, 폴리펩티드.
  12. 면역요법을 사용하여 환자의 질병 또는 장애를 치료 또는 예방하는 방법으로서, 상기 방법은 청구항 1 내지 11 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드 및 야생형 또는 천연 발생 Fcγ 수용체와 비교하여 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는 비-천연 발생 Fcγ 수용체를 발현하는 세포를 환자에게 투여하는 단계를 포함하고, 여기서, 상기 폴리펩티드는 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는 상기 비-천연 발생 Fcγ 수용체에 결합할 수 있는, 방법.
  13. 청구항 12에 있어서,
    상기 세포는 인간 면역 세포인, 방법.
  14. 청구항 13에 있어서,
    상기 인간 면역 세포는 T 세포, 대식세포, 수지상 세포, NKT-세포, NK 세포, 미세아교세포, 파골세포, 과립구, 단핵구, 및 선천성 면역 세포로부터 선택되는 세포인, 방법.
  15. 청구항 12-14 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포는 줄기 세포로부터 유래되는, 방법.
  16. 청구항 15에 있어서,
    상기 줄기 세포는 만능 줄기 세포, 조혈 줄기 세포, 성체 줄기 세포, 태아 줄기 세포, 중간엽 줄기 세포, 산후 줄기 세포, 다능성 줄기 세포, 및 배아 생식 세포로부터 선택되는, 방법.
  17. 청구항 16에 있어서,
    상기 줄기 세포는 만능 줄기 세포인, 방법.
  18. 청구항 17에 있어서,
    상기 만능 줄기 세포는 유도 만능 줄기 세포(iPS 세포) 또는 배아 줄기 세포(ES 세포)인, 방법.
  19. 청구항 12-18 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포는 베타-2 마이크로글로불린(B2M) 유전자에서 유전적으로 조작된 파괴를 포함하는, 방법.
  20. 청구항 19에 있어서,
    상기 세포는, 인간 백혈구 항원(HLA)-1α 사슬의 적어도 일부에, 직접적으로 또는 링커 서열을 통해, 공유적으로 결합된 B2M 단백질의 적어도 일부를 포함하는 단일 사슬 융합 인간 백혈구 항원(HLA) 클래스 I 단백질을 인코딩할 수 있는 폴리뉴클레오티드를 더욱 포함하는, 방법.
  21. 청구항 20에 있어서,
    상기 HLA-1α 사슬은, HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F, 및 HLA-G로부터 선택되는, 방법.
  22. 청구항 12-21 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포는 인간 백혈구 항원(HLA) 클래스 Ⅱ-관련 유전자에서 유전적으로 조작된 파괴를 포함하는, 방법.
  23. 청구항 22에 있어서,
    상기 HLA 클래스 Ⅱ-관련 유전자는 조절 인자 X-관련 안키린-함유 단백질(RFXANK), 조절 인자 5(RFX5), 조절 인자 X 관련 단백질(RFXAP), 클래스 Ⅱ 트랜스활성자(CⅡTA), HLA-DPA(α 사슬), HLA-DPB(β 사슬), HLA-DQA, HLA-DQB, HLA-DRA, HLA-DRB, HLA-DMA, HLA-DMB, HLA-DOA, 및 HLA-DOB로부터 선택되는, 방법.
  24. 청구항 12-23 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포는 단일 사슬 융합 HLA 클래스 Ⅱ 단백질 또는 HLA 클래스 Ⅱ 단백질을 인코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 방법.
  25. 청구항 12 내지 24 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 방법은 암을 치료 또는 예방하는 방법인, 방법.
  26. 청구항 1 내지 11 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드 및 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는, 약학 조성물.
  27. 청구항 26에 있어서,
    면역요법용 세포와 병용하며, 여기서, 상기 세포는 야생형 또는 천연 발생 Fcγ 수용체와 비교하여 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는 비-천연 발생 Fcγ 수용체를 발현하고, 여기서, 상기 폴리펩티드는 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는 비-천연 발생 Fcγ 수용체에 결합할 수 있는, 약학 조성물.
  28. 청구항 27에 있어서,
    상기 세포는 인간 면역 세포인, 약학 조성물.
  29. 청구항 28에 있어서,
    상기 인간 면역 세포는 T 세포, 대식세포, 수지상 세포, NKT-세포, NK 세포, 미세아교세포, 파골세포, 과립구, 단핵구, 및 선천성 면역 세포로부터 선택된 세포인, 약학 조성물.
  30. 청구항 27-29 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포는 줄기 세포로부터 유래되는, 약학 조성물.
  31. 청구항 30에 있어서,
    상기 줄기 세포는 만능 줄기 세포, 조혈 줄기 세포, 성체 줄기 세포, 태아 줄기 세포, 중간엽 줄기 세포, 산후 줄기 세포, 다능성 줄기 세포, 및 배아 생식 세포로부터 선택되는, 약학 조성물.
  32. 청구항 31에 있어서,
    상기 줄기 세포는 만능 줄기 세포인, 약학 조성물.
  33. 청구항 32에 있어서,
    상기 만능 줄기 세포는 유도 만능 줄기 세포(iPS 세포) 또는 배아 줄기 세포(ES 세포)인, 약학 조성물.
  34. 청구항 27-33 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포는 베타-2 마이크로글로불린(B2M) 유전자에서 유전적으로 조작된 파괴를 포함하는, 약학 조성물.
  35. 청구항 34에 있어서,
    상기 세포는, 인간 백혈구 항원(HLA)-1α 사슬의 적어도 일부에, 직접적으로 또는 링커 서열을 통해, 공유적으로 결합된 B2M 단백질의 적어도 일부를 포함하는 단일 사슬 융합 인간 백혈구 항원(HLA) 클래스 I 단백질을 인코딩할 수 있는 폴리뉴클레오티드를 더욱 포함하는, 약학 조성물.
  36. 청구항 35에 있어서,
    상기 HLA-1α 사슬은 HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F, 및 HLA-G로부터 선택되는, 약학 조성물.
  37. 청구항 27-36 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포는 인간 백혈구 항원(HLA) 클래스 Ⅱ-관련 유전자에서 유전적으로 조작된 파괴를 포함하는, 약학 조성물.
  38. 청구항 37에 있어서,
    상기 HLA 클래스 Ⅱ-관련 유전자는, 조절 인자 X-관련 안키린-함유 단백질(RFXANK), 조절 인자 5(RFX5), 조절 인자 X 관련 단백질(RFXAP), 클래스 Ⅱ 트랜스활성자(CⅡTA), HLA-DPA(α 사슬), HLA-DPB(β 사슬), HLA-DQA, HLA-DQB, HLA-DRA, HLA-DRB, HLA-DMA, HLA-DMB, HLA-DOA, 및 HLA-DOB로부터 선택되는, 약학 조성물.
  39. 청구항 27-38 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포는 단일 사슬 융합 HLA 클래스 Ⅱ 단백질 또는 HLA 클래스 Ⅱ 단백질을 인코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 약학 조성물.
  40. 면역요법을 사용하여 환자의 질병 또는 장애를 치료 또는 예방하는 키트로서, 상기 키트는 청구항 1 내지 11 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드 및 야생형 또는 천연 발생 Fcγ 수용체와 비교하여 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는 비-천연 발생 Fcγ 수용체를 발현하는 세포를 포함하고, 여기서, 상기 폴리펩티드는 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는 상기 비-천연 발생 Fcγ 수용체에 결합할 수 있는, 키트.
  41. 청구항 40에 있어서,
    상기 세포는 인간 면역 세포인, 키트.
  42. 청구항 41에 있어서,
    상기 인간 면역 세포는 T 세포, 대식세포, 수지상 세포, NKT-세포, NK 세포, 미세아교세포, 파골세포, 과립구, 단핵구, 및 선천성 면역 세포로부터 선택되는 세포인, 키트.
  43. 청구항 40-42 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포는 줄기 세포로부터 유래되는, 키트.
  44. 청구항 43에 있어서,
    상기 줄기 세포는, 만능 줄기 세포, 조혈 줄기 세포, 성체 줄기 세포, 태아 줄기 세포, 중간엽 줄기 세포, 산후 줄기 세포, 다능성 줄기 세포, 및 배아 생식 세포로부터 선택되는, 키트.
  45. 청구항 44에 있어서,
    상기 줄기 세포는 만능 줄기 세포인, 키트.
  46. 청구항 45에 있어서,
    상기 만능 줄기 세포는 유도 만능 줄기 세포(iPS 세포) 또는 배아 줄기 세포(ES 세포)인, 키트.
  47. 청구항 40-46 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포는 베타-2 마이크로글로불린(B2M) 유전자에서 유전적으로 조작된 파괴를 포함하는, 키트.
  48. 청구항 47에 있어서,
    상기 세포는, 인간 백혈구 항원(HLA)-1α 사슬의 적어도 일부에, 직접적으로 또는 링커 서열을 통해, 공유적으로 결합된 B2M 단백질의 적어도 일부를 포함하는 단일 사슬 융합 인간 백혈구 항원(HLA) 클래스 I 단백질을 인코딩할 수 있는 폴리뉴클레오티드를 더욱 포함하는, 키트.
  49. 청구항 48에 있어서,
    상기 HLA-1α 사슬은 HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F, 및 HLA-G로부터 선택되는, 키트.
  50. 청구항 40-49 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포는 인간 백혈구 항원(HLA) 클래스 Ⅱ-관련 유전자에서 유전적으로 조작된 파괴를 포함하는, 키트.
  51. 청구항 50에 있어서,
    상기 HLA 클래스 Ⅱ-관련 유전자는, 조절 인자 X-관련 안키린-함유 단백질(RFXANK), 조절 인자 5(RFX5), 조절 인자 X 관련 단백질(RFXAP), 클래스 Ⅱ 트랜스활성자(CⅡTA), HLA-DPA(α 사슬), HLA-DPB(β 사슬), HLA-DQA, HLA-DQB, HLA-DRA, HLA-DRB, HLA-DMA, HLA-DMB, HLA-DOA, 및 HLA-DOB로부터 선택되는, 키트.
  52. 청구항 40-51 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포는 단일 사슬 융합 HLA 클래스 Ⅱ 단백질 또는 HLA 클래스 Ⅱ 단백질을 인코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 키트.
  53. 야생형 또는 천연 발생 CD16A와 비교하여 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는 비-천연 발생 CD16A를 발현하는 세포로서, 여기서, 상기 적어도 하나의 아미노산 돌연변이는, (i) SEQ ID NO: 78에서의 위치 131에 상응하는 위치에서 라이신에서 아스파르트산(K131D 돌연변이), (ⅱ) SEQ ID NO: 78에서의 위치 128에 상응하는 위치에서 라이신에서 글루탐산(K128E 돌연변이), 및 (ⅲ) SEQ ID NO: 78에서의 위치 131에 상응하는 위치에서 라이신에서 글루탐산(K131E 돌연변이)으로부터 선택되고, 여기서, 상기 비-천연 발생 CD16A는 SEQ ID NO: 78과 90% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 세포.
  54. 청구항 53에 있어서,
    적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는 CD16A는 K131D 돌연변이 및 K128E 돌연변이 중 하나 또는 둘 모두를 포함하는, 세포.
  55. 청구항 53에 있어서,
    적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는 CD16A는 K131E 돌연변이 및 K128E 돌연변이 중 하나 또는 둘 모두를 포함하는, 세포.
  56. 청구항 53에 있어서,
    적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는 CD16A는 K131D 돌연변이를 포함하고, (ⅳ) SEQ ID NO: 78에서의 위치 38에 상응하는 위치에서 아스파라긴에서 글루타민(N38Q 돌연변이) 및 (v) SEQ ID NO: 78에서의 위치 74에 상응하는 위치에서 아스파라긴에서 글루타민(N74Q 돌연변이)으로부터 선택된 적어도 하나의 돌연변이를 더욱 포함하는, 세포.
  57. 청구항 53에 있어서,
    적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는 CD16A는, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, 또는 SEQ ID NO: 88에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는, 세포.
  58. 청구항 53 내지 57 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포는 인간 면역 세포인, 세포.
  59. 청구항 58에 있어서,
    상기 인간 면역 세포는, T 세포, 대식세포, 수지상 세포, NKT-세포, NK 세포, 미세아교세포, 파골세포, 과립구, 단핵구, 및 선천성 면역 세포로부터 선택되는 세포인, 세포.
  60. 청구항 53-59 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포는 줄기 세포로부터 유래되는, 세포.
  61. 청구항 60에 있어서,
    상기 줄기 세포는, 만능 줄기 세포, 조혈 줄기 세포, 성체 줄기 세포, 태아 줄기 세포, 중간엽 줄기 세포, 산후 줄기 세포, 다능성 줄기 세포, 및 배아 생식 세포로부터 선택되는, 세포.
  62. 청구항 61에 있어서,
    상기 줄기 세포는 만능 줄기 세포인, 세포.
  63. 청구항 62에 있어서,
    상기 만능 줄기 세포는 유도 만능 줄기 세포(iPS 세포) 또는 배아 줄기 세포(ES 세포)인, 세포.
  64. 청구항 53-63 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포는 베타-2 마이크로글로불린(B2M) 유전자에서 유전적으로 조작된 파괴를 포함하는, 세포.
  65. 청구항 64에 있어서,
    상기 세포는, 인간 백혈구 항원(HLA)-1α 사슬의 적어도 일부에, 직접적으로 또는 링커 서열을 통해, 공유적으로 결합된 B2M 단백질의 적어도 일부를 포함하는 단일 사슬 융합 인간 백혈구 항원(HLA) 클래스 I 단백질을 인코딩할 수 있는 폴리뉴클레오티드를 더욱 포함하는, 세포.
  66. 청구항 65에 있어서,
    상기 HLA-1α 사슬은 HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F, 및 HLA-G로부터 선택되는, 세포.
  67. 청구항 53-66 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포는 인간 백혈구 항원(HLA) 클래스 Ⅱ-관련 유전자에서 유전적으로 조작된 파괴를 포함하는, 세포.
  68. 청구항 67에 있어서,
    상기 HLA 클래스 Ⅱ-관련 유전자는, 조절 인자 X-관련 안키린-함유 단백질(RFXANK), 조절 인자 5(RFX5), 조절 인자 X 관련 단백질(RFXAP), 클래스 Ⅱ 트랜스활성자(CⅡTA), HLA-DPA(α 사슬), HLA-DPB(β 사슬), HLA-DQA, HLA-DQB, HLA-DRA, HLA-DRB, HLA-DMA, HLA-DMB, HLA-DOA, 및 HLA-DOB로부터 선택되는, 세포.
  69. 청구항 53-68 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포는 단일 사슬 융합 HLA 클래스 Ⅱ 단백질 또는 HLA 클래스 Ⅱ 단백질을 인코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 세포.
  70. 청구항 53 내지 69 중 어느 한 항에 따른 세포 및 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약학 조성물.
  71. 청구항 70에 있어서,
    면역치료용 IgG의 변형된 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드와 병용하며, 여기서, 상기 변형된 Fc 영역은 비-천연 발생이고, 야생형 또는 천연 발생 IgG의 Fc 영역과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하며, 상기 폴리펩티드는 야생형 또는 천연 발생 CD16A에 대해 결합 활성이 본질적으로 없고, 세포에 의해 발현된 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는 비-천연 발생 CD16A에 결합할 수 있는, 약학 조성물.
  72. 청구항 71에 있어서,
    상기 폴리펩티드는 인간 Igγ1의 변형된 Fc 영역을 포함하고, 상기 변형된 Fc 영역은 (i) EU 인덱스 넘버링에 따른 위치 269에 상응하는 위치에서 글루탐산에서 아르기닌으로의 돌연변이(E269R 돌연변이) 및 (ⅱ) (a) EU 인덱스 넘버링에 따른 위치 294에 상응하는 위치에서 글루탐산에서 아르기닌(E294R 돌연변이) 및 (b) EU 인덱스 넘버링에 따른 위치 294에 상응하는 위치에서 글루탐산에서 라이신(E294K 돌연변이)으로부터 선택된 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는, 약학 조성물.
  73. 청구항 71 또는 72에 있어서,
    상기 폴리펩티드는 항체인, 약학 조성물.
  74. 청구항 73에 있어서,
    상기 폴리펩티드는 암 항원에 결합하는 항체인, 약학 조성물.
  75. 청구항 71 내지 74 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 약학 조성물은 암 치료용인, 약학 조성물.
  76. IgG의 변형된 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드를 제조하는 방법으로서, 상기 방법은:
    1) IgG의 변형된 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드를 제공하는 단계로서, 여기서, 상기 변형된 Fc 영역은 비-천연 발생이고, 야생형 또는 천연 발생 IgG와 비교하여 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는, 폴리펩티드를 제공하는 단계;
    2) 야생형 또는 천연 발생 Fcγ 수용체에 대한 단계 1)에서 얻은 폴리펩티드의 결합 활성을 측정하는 단계;
    3) 야생형 또는 천연 발생 Fcγ 수용체와 비교하여 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는 비-천연 발생 Fcγ 수용체에 대한 단계 1)에서 얻은 폴리펩티드의 결합 활성을 측정하는 단계; 및
    4) 단계 1)에서 얻은 폴리펩티드로부터, 야생형 또는 천연 발생 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성이 본질적으로 없고, 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는 비-천연 발생 Fcγ 수용체에 결합하는 폴리펩티드를 선택하는 단계를 포함하는, 폴리펩티드를 제조하는 방법.
  77. 청구항 76에 있어서,
    상기 야생형 또는 천연 발생 Fcγ 수용체는 야생형 또는 천연 발생 CD16A이고, 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는 비-천연 발생 Fcγ 수용체는 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는 비-천연 발생 CD16A인, 폴리펩티드를 제조하는 방법.
  78. 청구항 77에 있어서,
    상기 야생형 또는 천연 발생 CD16A는 SEQ ID NO: 78에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는, 폴리펩티드를 제조하는 방법.
  79. 청구항 77 또는 78에 있어서,
    적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는 비-천연 발생 CD16A는, (i) SEQ ID NO: 78에서의 위치 131에 상응하는 위치에서 라이신에서 아스파르트산(K131D 돌연변이), (ⅱ) SEQ ID NO: 78에서의 위치 128에 상응하는 위치에서 라이신에서 글루탐산(K128E 돌연변이), 및 (ⅲ) SEQ ID NO: 78에서의 위치 131에 상응하는 위치에서 라이신에서 글루탐산(K131E 돌연변이)으로부터 선택된 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는, 폴리펩티드를 제조하는 방법.
  80. 청구항 79에 있어서,
    적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는 CD16A는 K131D 돌연변이 및 K128E 돌연변이 중 하나 또는 둘 모두를 포함하는, 폴리펩티드를 제조하는 방법.
  81. 청구항 79에 있어서,
    적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는 CD16A는 K131E 돌연변이 및 K128E 돌연변이 중 하나 또는 둘 모두를 함유하는, 폴리펩티드를 제조하는 방법.
  82. 청구항 79에 있어서,
    적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는 CD16A는, K131D 돌연변이를 포함하고, (ⅳ) SEQ ID NO: 78에서의 위치 38에 상응하는 위치에서 아스파라긴에서 글루타민(N38Q 돌연변이) 및 (v) SEQ ID NO: 78에서의 위치 74에 상응하는 위치에서 아스파라긴에서 글루타민(N74Q 돌연변이)으로부터 선택된 적어도 하나의 돌연변이를 더욱 포함하는, 폴리펩티드를 제조하는 방법.
  83. 청구항 79 내지 82 중 어느 한 항에 있어서,
    IgG의 변형된 Fc 영역을 포함하는 비-천연 발생 폴리펩티드는 항체인, 폴리펩티드를 제조하는 방법.
  84. 청구항 83에 있어서,
    상기 항체는 암 항원에 결합하는 항체인, 폴리펩티드를 제조하는 방법.
  85. 청구항 83 또는 84에 있어서,
    IgG의 변형된 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드는 항체이고, 상기 방법은 상기 항체와 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는 비-천연 발생 Fcγ 수용체를 발현하는 면역 세포 및 상기 항체가 결합하는 항원을 발현하는 세포를 접촉시키는 단계, 및 항체-의존성 세포매개 세포독성(ADCC) 활성을 측정하는 단계를 더욱 포함하는, 폴리펩티드를 제조하는 방법.
  86. 비-천연 발생 Fcγ 수용체의 제조 방법으로서, 상기 방법은:
    1) 야생형 또는 천연 발생 Fcγ 수용체와 비교하여 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는 비-천연 발생 Fcγ 수용체를 제공하는 단계;
    2) 야생형 또는 천연 발생 IgG의 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드 및 상기 야생형 또는 천연 발생 IgG와 비교하여 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는 IgG의 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드를 제공하는 단계;
    3) 상기 야생형 또는 천연 발생 IgG의 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드에 대한 단계 1)에서 얻은 비-천연 발생 Fcγ 수용체의 결합 활성을 측정하는 단계;
    4) 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는 IgG의 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드에 대한 단계 1)에서 얻은 비-천연 발생 Fcγ 수용체의 결합 활성을 측정하는 단계; 및
    5) 단계 1)에서 얻은 비-천연 발생 Fcγ 수용체로부터, 야생형 또는 천연 발생 IgG의 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드에 대한 결합 활성이 본질적으로 없고, 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는 IgG의 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드에 결합하는 비-천연 발생 Fcγ 수용체를 선택하는 단계를 포함하는, 비-천연 발생 Fcγ 수용체의 제조 방법.
  87. 청구항 86에 있어서,
    상기 Fcγ 수용체는 CD16A인, 비-천연 발생 Fcγ 수용체의 제조 방법.
  88. 청구항 87에 있어서,
    상기 야생형 또는 천연 발생 Fcγ 수용체는 SEQ ID NO: 78에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 CD16A인, 비-천연 발생 Fcγ 수용체의 제조 방법.
  89. 청구항 86 내지 88 중 어느 한 항에 있어서,
    적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는 IgG의 Fc 영역은, 야생형 또는 천연 발생 인간 Igγ1과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는 인간 Igγ1의 Fc 영역이고, (a) EU 인덱스 넘버링에 따른 위치 269에 상응하는 위치에서 글루탐산에서 아르기닌으로의 돌연변이(E269R 돌연변이) 및 (b) (i) EU 인덱스 넘버링에 따른 위치 294에 상응하는 위치에서 글루탐산에서 아르기닌으로의 돌연변이(E294R 돌연변이) 및 (ⅱ) EU 인덱스 넘버링에 따른 위치 294에 상응하는 위치에서 글루탐산에서 라이신으로의 돌연변이(E294K 돌연변이)로부터 선택된 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는, 비-천연 발생 Fcγ 수용체의 제조 방법.
  90. 청구항 86 내지 89 중 어느 한 항에 있어서,
    적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는 IgG의 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드는 항체인, 비-천연 발생 Fcγ 수용체의 제조 방법.
  91. 청구항 90에 있어서,
    상기 항체는 암 항원에 결합하는 항체인, 비-천연 발생 Fcγ 수용체의 제조 방법.
  92. 청구항 90 또는 91에 있어서,
    적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는 IgG의 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드는 항체이고, 상기 방법은 단계 2)에서 얻은 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는 IgG의 Fc 영역을 포함하는 항체와 단계 1)에서 얻은 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는 Fcγ 수용체를 발현하는 면역 세포 및 상기 항체가 결합하는 항원을 발현하는 세포를 접촉시키는 단계, 및 항체-의존성 세포매개 세포독성(ADCC) 활성을 측정하는 단계를 더욱 포함하는, 비-천연 발생 Fcγ 수용체의 제조 방법.
  93. (a) IgG의 변형된 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드 및 (b) 비-천연 발생 변형된 Fcγ 수용체를 포함하는 결합 쌍을 제조하는 방법으로서, 상기 방법은:
    1) 야생형 또는 천연 발생 IgG의 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드 및 IgG의 변형된 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드를 제공하는 단계로서, 여기서, 상기 변형된 Fc 영역은 비-천연 발생이며, 야생형 또는 천연 발생 IgG의 Fc 영역과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는, 폴리펩티드를 제공하는 단계;
    2) 야생형 또는 천연 발생 Fcγ 수용체 및 비-천연 발생 변형된 Fcγ 수용체를 제공하는 단계로서, 여기서, 상기 변형된 Fcγ 수용체는 야생형 또는 천연 발생 Fcγ 수용체와 비교하여 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는, Fcγ 수용체를 제공하는 단계;
    3) 단계 1)에서 얻은 각 폴리펩티드에 대한 단계 2)에서 얻은 각 Fcγ 수용체의 결합 활성을 측정하는 단계; 및
    4) (a) 변형된 Fcγ 수용체에 결합하고, 야생형 또는 천연 발생 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성이 본질적으로 없는 변형된 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드, 및 (b) 변형된 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드에 결합하고, 야생형 또는 천연 발생 IgG의 Fc 영역에 결합하지 않는 변형된 Fcγ 수용체를 선택하는 단계를 포함하는, 결합 쌍을 제조하는 방법.
  94. 청구항 93에 있어서,
    상기 Fcγ 수용체는 CD16A인, 결합 쌍을 제조하는 방법.
  95. 청구항 93 또는 94에 있어서,
    야생형 또는 천연 발생 CD16A는 SEQ ID NO: 78에 나타낸 아미노산 서열을 함유하는, 결합 쌍을 제조하는 방법.
  96. 청구항 93 내지 95 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 IgG의 변형된 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드는 항체인, 결합 쌍을 제조하는 방법.
  97. 청구항 96에 있어서,
    상기 항체는 암 항원에 결합하는 항체인, 결합 쌍을 제조하는 방법.
  98. 청구항 93-97 중 어느 한 항에 있어서,
    단계 4)에서 선택된 IgG의 변형된 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드는 항체이고, 상기 방법은 상기 항체와 단계 4)에서 선택된 변형된 Fcγ 수용체를 발현하는 면역 세포 및 상기 항체가 결합하는 항원을 발현하는 세포를 접촉시키는 단계, 및 항체-의존성 세포매개 세포독성(ADCC) 활성을 측정하는 단계를 더욱 포함하는, 결합 쌍을 제조하는 방법.
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