KR20160105882A - 신규한 합성 생물학에 기반한 adcc 기술 - Google Patents

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KR20160105882A
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치앙 제이 리
시얌 언니라만
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1글로브 바이오메디칼 씨오., 엘티디.
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Abstract

ADCC 반응을 증강시키거나 가능하게 하는 신규한 합성 생물학에 기반한 ADCC 기술을 제공한다. 이 신규한 ADCC 기술은 암, 감염성 질환, 염증성 질환, 또는 자가면역 질환, 및 병든 세포의 제거가 바람직한 그 밖의 질환들을 예방 또는 치료하는 데 이용될 수 있다.

Description

신규한 합성 생물학에 기반한 ADCC 기술{NOVEL SYNTHETIC BIOLOGY-BASED ADCC TECHNOLOGY}
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2014년 1월 8일에 출원되고 본 출원과 발명의 명칭이 동일한 동시 계류중인 미국 가특허 출원 제61/925,217호에 대해 우선권과 그 이익을 주장하며, 상기 가특허 출원은 본원에서 그 전체가 참고로 포함된다.
기술분야
본 발명은, 면역 이펙터 세포가 항체 의존성 세포독성(ADCC)을 매개하거나 세포가 ADCC를 매개할 수 있도록 하는 능력을 증강시키는 데 사용될 수 있는 합성 생물학 생성물 및 공정과, 암, 감염성 질환, 염증성 질환, 자가면역 질환 및 기타 질환의 치료 및 예방에 이들을 사용하는 방법에 관한 것이다.
포유동물, 특히 인간을 비롯한 고등 척추동물은 외래 병원체와 병든 또는 스트레스를 받은 자가 세포를 검출하거나, 파괴하거나, 적어도 포함하는 다중 메카니즘 및 이펙터를 이용하는 매우 복잡한 면역계를 발달시켰다. 이러한 병든 세포는 바이러스 또는 박테리아로 감염된 것이거나 암으로 된 것일 수 있다.
병든 숙주 세포 및 침입한 세포내 미생물(예를 들어, 바이러스, 박테리아 또는 기생충)을 인식하고 제거하기 위한 면역계의 메카니즘 중 하나는 세포 매개성 세포독성을 통한 것이며, 이것은 수많은 백혈구와 단백질에 의해 행해질 수 있다. 이러한 잠재적 세포독성 이펙터는 림프계로부터 유래된 것, 즉 자연 살해(NK) 세포 및 세포독성 T 림프구(CTL)와, 골수계로부터 유래된 것, 즉 대식세포, 호중구 및 호산구를 포함한다.
면역계가 세포 매개성 세포독성을 촉발시키는 중요한 방식은 항체에 의존하는 것이다. 지난 십년에 걸쳐, 종양 특이적 세포 표면 단백질을 표적으로 하는 단일클론 항체(mAb)가 암에 대한 인기있는 치료적 접근법이 되었다. 리툭시맙(Rituximab)[리툭산(Rituxan), 맙테라(Mabthera)], 트라스투주맙(Trastuzumab)[허셉틴(Herceptin)] 및 세툭시맙(cetuximab)[어비툭스(Erbitux)]을 비롯한 몇 종의 mAb는 통상적인 임상 실시에 들어갔다. mAb의 명성은 이것의 이작용성에 기인한다. 항체의 한쪽 단부(Fab)는, 종양 세포를 사멸시키는 다양한 이펙터 세포 및 단백질을 동원하는 다른쪽 단부(Fc)를 변경하지 않으면서 특정 종양 단백질에 정교하게 특이적으로 만들어질 수 있다.
구체적으로, 항체는, 먼저, 표적 세포의 표면 상에 있는 항원을 인식하여 결합한 후, 어댑터로서 작용하며, 나아가, 면역 이펙터 세포 상의 특정 수용체와의 2차적 결합을 통해 면역 이펙터 세포의 세포독성 능력을 활성화시킨다. 이것을 항체 의존성 세포독성(antibody-dependent cytotoxicity; ADCC)이라 부른다. 예를 들어, 암에 대한 선천성 면역에 있어서는, ADCC가, 병든 표적 세포(예를 들어, 종양 세포) 상의 다가 항원을 피복한 항체의 Fc(불변) 부분에 결합할 때에만 활성화되는 비교적 낮은 친화력의 Fc 수용체(FcγRIIIa; CD16a로도 알려짐)를 발현하는 자연 살해(NK) 세포(및, 더 적은 정도로, 호중구, 단핵구 및 대식세포)에 의해 주로 매개된다. 이러한 결합은 퍼포린 및 그랜자임과 같은 세포독성 그래뉼(이와 함께, IFN-γ를 비롯한 다수의 사이토카인)의 방출을 촉발시켜, 표적 세포의 용해를 유도한다. ADCC 반응의 중요성은 시험관내 시험과 동물 시험 둘 다에서 확인되었다. 뿐만 아니라, 몇몇 임상 시험도 CD16의 저친화력 변이체(F158)를 갖는 환자가 더 나쁜 임상적 결과를 갖는다는 것을 보여주었다.
그러나, 내인성 자연 살해(NK) 세포에 의해 주로 매개되는 ADCC 효능은, 이하에 설명하는 바와 같은 수많은 생리학적 이유와 병리학적 이유로 인하여 체내에서 제한되어 있다(내인성 세포독성 T 림프구가 여하튼 종양 제거에 관여한 범위에서, 그 효능은 역시 매우 제한적이고 부족한 것으로 확인되었다).
첫째, 대식세포 및 호중구와 같은 ADCC 반응에 관여하는 대부분의 세포는 이들이 활성화될 때 증식하지 않는 경향이 있다. NK 세포 또한 활성화에 반응하여 제한된 증식 잠재력을 가지며, 게다가 일찍 죽어버린다. 따라서, 체내에서의 자연적 ADCC 반응은, ADCC 이펙터가 병든 세포를 피복한 항체를 인식한다고 해도, 질병 진행(예를 들어, 바이러스 감염, 암)에 의해 압도될 위험이 있다.
둘째, ADCC 이펙터 세포의 다수가 또한 이들의 면역 반응성을 둔화시키는 억제성 수용체를 발현함으로써, 밸런스와 체크의 시스템을 구축한다. 이들 수용체는 CD56low NK 세포에 대한 억제성 KIR(killer immunoglobulin-like receptor)(킬러 면역글로불린 유사 수용체), 단핵구 및 B 세포 상의 FcγRIIb, 및 T 세포에 대한 CTLA-4(CD152) 및 PD-1(예정 세포사-1, CD279)을 포함한다. 암 세포와 바이러스는 그러한 억제성 경로를 비정상적으로 증폭시킴으로써 신체의 ADCC에 기초한 방어 시스템에 대항한다.
셋째, ADCC 이펙터 세포 상의 주요 Fc 수용체인 FcγRIIIa는 항체에 대해 비교적 낮은 친화력(Kd
Figure pct00001
10-6 M)을 갖는다. 심지어 수용체의 V158 변이체도 수용체의 무효한 F158 형태와 비교할 때 단지 2배 더 높은 친화력을 갖는다. 이것은, 세포 표면 표적의 밀도가 특정 수준 아래로 떨어지면, 암 세포가 일부 치료용 단클론 항체(mAb)에 대해 내성이 되는 메카니즘 중 하나이다.
암 또는 다른 질환과 같은 질환의 환경에서 증식 및 친화력에 있어서의 자연발생적인 제약과 억제성 Fc 수용체를 통한 추가적인 저해에 비추어 볼 때, 신체의 ADCC 기능은 완전히 실현되지 않은 큰 잠재력을 갖고 있다. 따라서, 합성 생물학은 인간 질환의 예방 및 치료에 있어서 ADCC 활성의 완전한 잠재력을 드러내기 위한 신규하고 매우 바람직한 접근법이다.
본 발명은, 암, 감염 및 다른 질환에 대항하는 면역계의 방어 능력을 개선하기 위한 새로운 접근법을 보고한다. 본 발명은, 합성 생물학 및 재조합 기술로부터의 툴을 이용해서, 암을 비롯한 많은 종류의 질환에 맞서는 ADCC 반응의 유효성을 크게 개선하는 ADCC 인핸서(Enhancer) 또는 증강 시스템을 설계하고 구축하는 것을 목적으로 한다. 일 양태에서, 본 발명은 특이성을 손상시키지 않으면서 ADCC 방어 시스템의 "센서(sensor)" 부분에서의 그 결합 친화력을 증강시킴으로써 ADCC 방어 시스템의 검출 민감성과 효율을 개선한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 세포독성 이펙터 세포의 증식 잠재력을 증강시킴으로써 ADCC 방어 시스템의 "이펙터(effector)" 부분을 개선한다. 바람직한 실시형태에서, 상기 양태들 중 하나 이상을 조합한다. 그러나, 본 발명의 다른 실시형태는 전술한 본 발명의 양태들 중 하나만을 반영해도 좋다.
본 발명의 ADCC 인핸서는, 치료 목적으로 투여되는 천연 항체 또는 인공 항체가 인식하거나 결합하는 병든 세포를 표적으로 하기 위해 항체 요법과 병행해서 또는 단독으로 사용될 수 있다.
ADCC 증강 시스템의 "센서" 부분에 중점을 둔 제1 양태에서, 본 발명은, 야생형 인간 CD16(예를 들어, 인간 CD16의 가장 일반적인 형태, F158 변이체)보다 항체에 대한 친화력이 더 큰 엑토도메인 또는 세포외 도메인을 구성하는 것을 설명한다. 이로써 고친화력 막관통 Fc 수용체가 얻어지고, 그 세포외 부분은 기존의 Fc 수용체의 엑토도메인을 기초로 한 것일 수 있다. "키메라" 또는 "융합" 수용체는, 그 일부 또는 전부가, 면역계의 다른 거대분자로부터 빌려오든지 또는 새로 만들어질 수 있다. 고친화력 Fc 수용체를 갖는 것은 면역 이펙터 세포가 서로 다른 항체에 공통된 동일한 Fc 단편에 효율적으로 결합할 수 있게 하고, 이것은 나아가, 다종 다양한 세포 표면 항원을 표적으로 하여, 다종 다양한 질환 및 적응증을 표적으로 하게 한다. 이것은, 매번, 각각의 특이적인 항원에 대해 서로 다른 항체를 생성해야 하는, 시간 및 다른 자원 비용이 많이 드는 프로세스인 항원 의존적 면역요법에 비해 큰 이점이다.
ADCC 시스템의 "이펙터" 부분으로 포커스를 이동시킨 제2 양태에서, 본 발명은, 발현될 경우 ADCC 이펙터 세포의 증폭을 촉진할 수 있는 모듈(들)을 도입한다.
따라서, 일 실시형태에서, 본 발명은 항체의 Fc에 대한 결합 친화력이 인간 CD16의 F158 변이체보다 더 큰 엑토도메인, 막관통 도메인, 및 ADCC 활성화 및 증폭을 매개하기 위한 엔도도메인을 포함하는 막관통 키메라 수용체를 코딩하는 유전자 구성체를 제공한다.
본 발명의 유전자 구성체는 DNA 또는 RNA 분자를 포함할 수 있다. 이 구성체는, 예를 들어 인간의, CD64의 EC3 엑손을 실질적으로 포함할 수 있고, 또는 부가적으로, (인간) CD64의 EC1 엑손 및 EC2 엑손을 실질적으로 포함할 수 있다. 대안으로, 본 발명의 유전자 구성체는 CD64의 엑토도메인을 실질적으로 포함하는 엑토도메인으로 번역되는 RNA를 포함한다. 한 특징에서, 엑토도메인은 CD64 내의 엑손 또는 도메인의 경계를 기초로 선택된다. 바람직하게는, 엑토도메인은 인간 CD16의 V158 변이체보다 Fc에 대한 친화력이 더 크다. 또 다른 특징에서, 막관통 키메라 수용체는 융합 단백질로서 발현된다. 또한, 엔도도메인은 CD3ζ, CD28, CD134, CD137, CD27, CD79a, CD79b, CD40 및 GM-CSF 수용체의 세포내 도메인의 일부 또는 전부로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있는 증폭 모듈(들)을 포함할 수 있다.
추가의 실시형태에서, 본 발명은 상기 유전자 구성체로부터 번역되는 막관통 키메라 수용체를 제공한다. 한 특징에서, 본 발명의 수용체의 엑토도메인은 CD16에 없는 CD64의 엑토도메인 내의 면역글로불린 유사 접힘구조(immunoglobulin-like fold)를 실질적으로 포함하거나 CD64의 엑토도메인을 실질적으로 포함한다. 한 특징에서, 막관통 도메인은 CD16의 막관통 도메인을 실질적으로 포함한다. 수용체는 숙주 면역 이펙터 세포의 생존 및 증식을 증강시키는 ADCC 증폭 모듈을 더 포함할 수 있다. 증폭 모듈은 CD3ζ, CD28, CD134, CD137, CD27, CD79a, CD79b, CD40 및 GM-CSF 수용체의 세포내 도메인의 일부 또는 전부로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 본 발명의 유전자 구성체 또는 단백질로 생체외에서 감염 또는 형질감염된 면역 이펙터 세포를 제공한다. 면역 이펙터 세포는, 예를 들어, 세포독성 T 림프구, 자연 살해 세포, 호산구, 대식세포, 호중구, 호염구, 단핵구, B 세포, 및 세포독성 인자를 발현하도록 조작된 다른 세포일 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 본 발명의 유전자 구성체, 단백질, 또는 면역 이펙터 세포, 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
추가의 실시형태에서, 본 발명은 병태의 치료가 필요한 피험체를 치료적 또는 예방적으로 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은, 본 발명의 약학 조성물의 치료적 또는 예방적 유효량을 상기 피험체에게 투여하는 것을 포함한다. 한 특징에서, 이 방법은 상기 병태를 나타내는 하나 이상의 세포 표면 항원에 대한 치료 항체를 투여하는 것을 추가로 포함한다. 면역 이펙터 세포는 상기 피험체에 대해 자가일 수 있고, 상기 병태는 암, 염증성 질환, 자가면역 질환, 이식 거부반응 및 감염으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 특징에서, 본 발명의 약학 조성물은 상기 병태에 대한 백신으로서 투여된다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은, (a) 병태의 치료가 필요한 피험체로부터 단리된 수지상 세포를 항원 공급원으로 프라이밍하는 단계; (b) 상기 프라이밍된 수지상 세포를 상기 피험체에게 다시 주입하는 단계; (c) 상기 피험체에게 본 발명의 약학 조성물의 치료적 또는 예방적 유효량을 투여하는 단계에 의해, 병태의 치료가 필요한 피험체를 치료적 또는 예방적으로 치료하는 방법을 제공한다. 항원 공급원은 자가여도 좋고 외래의 것이어도 좋으며, 상기 병태는 암, 염증성 질환, 자가면역 질환, 이식 거부반응 및 감염으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 키메라 항체-수용체의 실시형태를 개략적으로 도시한다. 이 키메라 수용체는 항체의 Fc 부분에 대해 비교적 높은 친화력을 갖는 세포외 도메인과, 비교적 높은 증식 자극 활성을 갖는 세포내 신호전달 도메인을 갖는다.
도 2는 CD16 및 CD64의 단백질 도메인 구조를 개략적으로 비교하며, 여기서, CD16 및 CD64의 세포외 도메인은 각각 2개 및 3개의 면역글로불린 접힘구조로 이루어진다. 유사한 셰이딩은 상동성의 접힘구조를 나타낸다.
도 3은 CD16 및 CD64의 게놈 엑손 맵을 개략적으로 비교한다: 분비 신호 서열은 백색으로 표시되어 있고, 세포외 영역은 빗금으로 표시되어 있고, 막관통 및 세포내 영역은 흑색으로 표시되어 있다. 인트론 영역도 엑손 영역도 축척 비율로 그려진 것은 아니다.
도 4는 일 실시형태에 따른 본 발명의 키메라 수용체를 생성할 수 있는 클로닝 전략을 개략적으로 예시한다. 측면에 기재된 문자는 클로닝 과정에서 사용된 제한 효소 사이트를 나타낸다: H-HindIII("H"), B-BamHI("B"), 및 Bg-BglII("Bg").
도 5는 본 발명의 일 실시형태에 따른 수용체를 클로닝하는 데 사용되는 시판되는 렌티바이러스 벡터의 맵이다.
도 6은 본 발명에 따른 수용체를 클로닝하는 데 사용될 수 있는 대안적 벡터 구성체의 맵이다.
도 7은, 발현된 벡터에 의해 방출된 GFP 신호로 측정된, (a) 음성 대조군, (b) 엠프티(empty) 벡터, (c) CD16V를 발현하는 벡터, 및 (d) CD64-16(엑손) 구성체를 발현하는 벡터로 형질감염된 Expi293 세포의 유세포 분석 결과를 보여준다.
도 8은, 형광으로 태깅한 항-CD16(SMPUW 및 CD16V) 또는 항-CD64(엑손 융합에 기초한 CD64-16)에 의해 방출된 형광으로 측정된, (a) 음성 대조군, (b) 엠프티 벡터, (c) CD16V를 발현하는 벡터, 및 (d) CD64-16(엑손) 구성체를 발현하는 벡터로 형질감염된 Expi293 세포의 유세포 분석 결과를 보여준다.
도 9는, Expi293 세포를 (a) 음성 대조군, (b) 엠프티 벡터, (c) CD16V를 발현하는 벡터, 및 (d) CD64-16(엑손) 구성체를 발현하는 벡터로 형질감염시킨 후, 그 세포를 치료 항체인 리툭시맙으로 염색한 것의, 형광으로 태깅한 항-인간 IgG에 의해 방출된 형광으로 측정한 유세포 분석 결과를 보여준다.
도 10은, 인간 CD64의 세포외 영역이, 도메인에 기초한 전략법을 이용하여, 인간 CD16의 영역에 융합되어 있는(융합 지점은 대시 기호(-)로 표시됨), 본 발명의 실시형태에 따른 키메라 수용체로 번역되는 DNA 서열(서열 번호 1)(위쪽)을 기재하고 있다. 상응하는 단백질 서열(서열 번호 2)은 아래쪽에 기재되어 있다.
도 11은, 인간 CD64의 세포외 영역이, 엑손에 기초한 전략법을 이용하여, 인간 CD16의 영역에 융합되어 있는(융합 지점은 대시 기호(-)로 표시됨), 본 발명의 실시형태에 따른 키메라 수용체로 번역되는 DNA 서열(서열 번호 3)(위쪽)을 기재하고 있다. 상응하는 단백질 서열(서열 번호 4)은 아래쪽에 기재되어 있다.
도 12는, 본 발명의 실시형태에 따른 키메라 수용체의 세포내 영역의 DNA 서열(서열 번호 5)을 기재하고 있으며, 여기서, 상기 영역은 인간 CD28, 인간 CD134, 인간 CD137 및 인간 CD3ζ로부터의 증폭 모듈로 이루어진다. 상응하는 단백질 서열(서열 번호 6)은 아래쪽에 기재되어 있다. 스페이서 서열은 소문자로 쓰여져 있다.
도 13은, 인간 CD64의 세포외 영역이, 도메인에 기초한 전략법을 이용하여, 인간 CD16의 영역에 융합되어 있고, 도 13에 도시된 증폭 모듈에 추가로 융합되어 있는, 본 발명의 실시형태에 따른 키메라 수용체로 번역되는 DNA 서열(서열 번호 7)(위쪽)을 기재하고 있다. 상응하는 단백질 서열(서열 번호 8)은 아래쪽에 기재되어 있다. 스페이서 서열은 소문자로 쓰여져 있다.
도 14는, 인간 CD64의 세포외 영역이, 엑손에 기초한 전략법을 이용하여, 인간 CD16의 영역에 융합되어 있고, 도 13에 도시된 증폭 모듈에 추가로 융합되어 있는, 본 발명의 실시형태에 따른 키메라 수용체로 번역되는 DNA 서열(서열 번호 9)(위쪽)을 기재하고 있다. 상응하는 단백질 서열(서열 번호 10)은 아래쪽에 기재되어 있다. 스페이서 및 돌연변이 서열은 소문자로 쓰여져 있다.
I. 정의
달리 나타내지 않는다면, 관행적인 용법에 따라 기술 용어가 사용된다. 분자 생물학에 있어서의 일반적인 용어의 정의는, 예를 들어, 문헌[Benjamin Lewin, Genes VII, Oxford University Press 발행, 2000(ISBN 019879276X); Kendrew et al.(eds.)]; 문헌[The Encyclopedia of Molecular Biology, Blackwell Publishers 발행, 1994(ISBN 0632021829)]; 및 문헌[Robert A. Meyers(ed.), Molecular Biology and Biotechnology: Comprehensive Desk Reference, Wiley, John & Sons, Inc. 발행, 1995(ISBN 0471186341)]; 및 다른 유사한 기술 문헌에서 찾아볼 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 단수 표현은 하나 이상을 의미할 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 어구 "포함하는"과 함께 사용될 때에는, 단수 표현이 하나 또는 하나보다 많은 것을 의미할 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "또 다른"은 적어도 제2 또는 그 이상의 것을 의미할 수 있다. 또한, 문맥상 다르게 요구되지 않는다면, 단수 표현은 복수 표현을 포함하고 복수 표현은 단수 표현을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "약"은, 명시적으로 표시되든 표시되지 않든 간에, 예를 들어, 정수, 분수 및 백분율을 포함한 수치를 나타낸다. 용어 "약"은 일반적으로, 당업자가 언급된 값과 균등한 것(예를 들어, 동일한 기능 또는 결과를 갖는 것)으로 고려하는 수치의 범위(예를 들어, 언급된 값의 +/- 5∼10%)를 의미한다. 몇몇 예에서, 용어 "약"은 가장 가까운 유효 숫자로 반올림 또는 반내림한 수치를 포함할 수 있다.
CD16은 2종의 상이한 형태로서, 즉, 2종의 상이한, 그러나 상동성이 매우 큰 유전자의 생성물인 CD16a 및 CD16b로서 발현된다. CD16a는 폴리펩티드가 앵커링된 막 관통 단백질이고, CD16b는 글리코실포스파티딜이노시톨이 앵커링된 단백질이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, CD16은, 부적절하지 않다면, 당업자에게 명백한 이 단백질의 두 가지 형태를 가르킨다.
본 발명의 ADCC 인핸서는, 세포독성 T 림프구(CTL) 및 헬퍼 T 세포를 비롯한 T 세포, NK 세포(대형 과립 림프구), 호산구, 대식세포, 호중구, 호염구, 단핵구, 및 B 세포를 들 수 있으나 이들에 한정되지 않는, 세포독성 능력을 갖는 임의의 면역 이펙터에 도입될 수 있다. 본 발명의 이펙터 세포는 자가, 동계 또는 동종이계일 수 있고, 그 선택은 치료 대상 질환과 이용 가능한 방법에 따라 달라진다.
II. 조성물
본 발명은 하기 (a) 내지 (c)의 특징적 특징 중 하나 이상을 갖는 ADCC 증강 시스템에 관해 기술한다: (a) 표적 세포의 표면에 결합된 항체의 Fc 단편에 대해 개선된 친화력을 갖는 키메라 수용체를 코딩하는 유전 물질; (b) 천연 또는 치료 항체에 의해 태깅된 표적화된 질병 세포와 계합될 때 ADCC 이펙터 세포의 증식 및 생존을 증강시키는 단백질 및/또는 RNA 모듈(들)을 코딩하는 유전 물질; (c) ADCC 반응의 효율을 증폭시키는 단백질 및/또는 RNA 모듈(들)을 코딩하는 유전 물질. 이를 위해, 그러한 구성요소(들)를 코딩하는 유전자 구성체가, 숙주, 예를 들어 환자 피험체의 세포에, 생체내 또는 생체외에서, ADCC 증강 시스템으로서 도입된다:
ADCC를 활성화시키고 이펙터 증식을 유도하는 세포내 도메인 및 막관통 도메인에 융합된 고친화력의 Fc 결합 엑토도메인을 포함하는 키메라 수용체(도 1);
(1) 키메라 수용체
이펙터에 따라, 키메라 수용체는 이펙터의 천연 구성요소의 일부, 예를 들어, 네이티브 수용체의 엑토도메인, 막관통 도메인 및/또는 세포내 도메인의 일부 또는 전부를 포함할 수 있다. 본 발명에서 고려되는 숙주는 고등 척추동물, 바람직하게는 포유동물이며, 더 바람직하게는 인간이다. 본 발명의 키메라 수용체는 세포외 도메인(엑토도메인), 막관통 도메인, 및 세포내 도메인(세포질 도메인 또는 엔도도메인)을 포함한다.
(1)(a) 엑토도메인
도 1을 참조하면, 일 실시형태(왼쪽)에서, 본 발명의 키메라 수용체는 CD64(FcγRI)의 엑토도메인의 일부 또는 전부를 포함하고 있다. CD64와 CD16 둘 다 항체의 Fc 영역에 결합하지만, CD64가 약 100배∼1,000배 높은 친화력을 갖는다. FcγRI(CD64)는 고친화력 Fc 수용체(IgG1 및 IgG3에 대해 Kd
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10-9)로서, 단핵 식세포 계통(예를 들어, 대식세포 및 호중구)의 모든 세포 표면에 존재하며, 항체 매개성 식세포작용 및 매개인자 방출을 담당한다. 도 2에 도시된 바와 같이, FcγRI는, 세포외 도메인이 항체 결합을 담당하는 3개의 면역글로불린 도메인으로 이루어지는 당단백질 α 사슬을 포함하며, 상기 3개 모두의 면역글로불린 도메인의 존재는 항체와의 고친화력 상호작용에 중요한 것으로 확인되었다. 이와는 달리, CD16의 엑토도메인은 단지 2개의 면역글로불린 유사 도메인을 갖는다. CD64 내의 가외의 면역글로불린 유사 접힘구조의 존재는 높은 Fc 친화력의 강력한 결정인자일 수 있다. 그 정도까지, 본 발명은 또한 단지 CD64 내의 이러한 가외 면역글로불린 유사 접힘구조 또는 그것의 돌연변이 버전을 CD16의 엑토도메인으로 삽입하여, 항체에 대한 고친화력 수용체를 구성하는 것을 고려한다.
본 발명의 실시형태에 따르면, ADCC를 매개하는 고친화력 Fc 수용체를 생성하기 위해 CD64(FcγRI)의 엑토도메인을 임의의 적절한 막관통 도메인 및 세포내 도메인에 융합시킨다. 바람직한 실시형태에서, 인간 CD64(FcγRI)의 엑토도메인을 인간 CD16(FcγRIII)의 일부에, 예를 들어, CD16, 바람직하게는 CD16a(FcγRIIIa)의 막관통 도메인과 세포내 도메인 둘 다에 융합시킨다. 엑토도메인이 신체 고유의 것이어서, 이 실시형태의 키메라 수용체가 동계이며, 따라서 비면역원성인 것이 유익하다.
도 1에 도시된 바와 같이, 본 발명의 키메라 수용체의 세포내 도메인에 추가적인 모듈이 존재할 수 있다. 이것은 증식 및 확장 신호를 증폭시킬 수 있는 하나 이상의 모듈(예를 들어, CD28), 이펙터 세포 생존을 촉진하고 활성화에 의해 유발되는 아폽토시스를 방지하는 하나 이상의 모듈(예를 들어, CD134 및 CD137), 증식 및 세포독성을 위한 신호 전달을 활성화 또는 부스팅하는 하나 이상의 모듈(예를 들어, CD3ζ)을 포함할 수 있다. 이러한 증폭성 및 촉진성 모듈에 관한 상세사항은 하기 섹션에서 추가로 설명한다.
(1)(b) 막관통 도메인
본 발명의 키메라 수용체의 막관통 도메인은 세포막을, 바람직하게는 안정한 방식으로 가로지를 수 있는 임의의 적절한 소수성 영역일 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 막관통 도메인은 세포내 도메인의 이웃한 구성요소에 자연 발생적인 것이다. 예를 들어, 도 1에 도시된 바와 같이, 막에 가장 가까운 세포내 도메인의 구성요소 또는 영역이 CD16으로부터 유래하는 일 실시형태에 있어서, 막관통 도메인은 바람직하게는 CD16의 막관통 도메인이다.
(1)(c) 엔도도메인
(1)(c)(i) ADCC를 위한 신호전달
다시 도 1을 참조하면, 본 발명의 다양한 실시형태에 있어서, 키메라 수용체는 ADCC를 위한 하나 이상의 신호전달 모듈을 포함한다. CD16은 우리 신체의 ADCC 활성의 대부분을 담당하는 이펙터 세포, 특히 NK 세포를 활성화시키는 천연 항체 수용체이다. 따라서, 다양한 실시형태에 있어서, 본 발명의 키메라 수용체의 엔도도메인은 CD16, 바람직하게는 CD16a의 세포내 도메인의 일부 또는 전부를 포함한다. CD16a와 유사한 ITAM 도메인을 공유하는 CD3ζ와 같은 다른 모듈도 ADCC 신호전달에 기여하기 위해 포함될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, CD3ζ는, CD16a 세포내 도메인이 다른 공동자극성 모듈 또는 요소와 나란히 발현되는 한, ADCC 신호전달에 필요하지 않을 수 있다. 반대로, CD3ζ와 같은 모듈은 CD16의 세포내 도메인의 기능을 대체할 수 있어서, 상기 도메인이 불필요해질 수 있다.
(1)(c)(ii) 증폭 모듈
도 1에 도시된 바와 같이, 본 발명의 키메라 수용체는 ADCC 반응을 증폭시키기 위한 요소들을 포함할 수 있다. 이펙터 세포에 따라서, 다양한 기능을 수행하는 하나 이상의 증폭 모듈이 키메라 수용체에 포함될수 있다. 하기 모듈은 비한정적인 예로서 예시를 목적으로 기재된 것이다.
일 실시형태에서, 본 발명의 키메라 수용체의 엔도도메인은 CD3ζ의 세포내 도메인의 일부 또는 전부를 포함한다. T 세포 표면에 본래 존재하는 마커인 CD3ζ는 림프구(예를 들어, T 세포) 활성화 및 증식에 공동자극 효과를 나타내어, 세포독성 T 세포 반응을 크게 증폭시킬 수 있는 것으로 확인되었다.
다양한 실시형태에서, 활성화 효과가 현저히 긴 시간 동안 지속되어, 증식 및 확장 잠재력이 증가하도록, 본 발명의 키메라 수용체에 하나 이상의 추가의 공동자극 모듈을 부가한다. 한 예로 CD28의 신호전달 도메인이 있는데, 이것은 항원 의존성 수용체의 TCRζ 도메인과 함께 발현될 때 T 림프구의 생존 및 증식을 증강시키는 것으로 확인되었다[Krause et al, J. Exp. Med. 188:619-26, 1998]. 본 발명의 키메라 수용체에 도입될 수 있는 다른 선택적 모듈은, 활성화에 의해 유발되는 아폽토시스를 방지함으로써 이펙터 세포의 생존을 부스팅하기 위해, 종양 괴사 인자 수용체 패밀리의 구성원, 예컨대 CD134(OX40), CD137(4-1BB), CD27의 세포내 도메인을 포함한다(예를 들어, 문헌[Finney et al., J Immunol., 2004, 172:104-13] 참조). 몇몇 또는 다수의 세포 유형의 증식에 있어서 도움이 될 수 있는 다른 세포내 도메인은 CD79a, CD79b, CD40, 및 GM-CSF 수용체에서 확인된다.
(2) 세포내 발현
표준 재조합 기술을 이용하여, 키메라 수용체를 위한 하나 이상의 발현 카세트를 구성하여 벡터, 예를 들어 플라스미드 벡터, 아데노바이러스 유래 벡터, 레트로바이러스 또는 렌티바이러스로 클로닝한다. 이 벡터를 임의의 유형의 면역 이펙터 세포로 형질감염(transfection)시킨다[바이러스 매개 유전자 통합의 경우 형질도입(transduction)]. 렌티바이러스 형질도입은, 문헌[Johnson et al.(Blood 114, 535-46, 2009)]에 기재된 기법과 같은, 공지된 기법을 이용하여 수행할 수 있다. 키메라 수용체의 성공적인 형질감염 및 표면 디스플레이는 통상적인 방법을 이용하여, 예를 들어 유세포 분석에 의해 확인한다.
일 실시형태에서, 면역 이펙터 세포를, 림프구(CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, B 세포 및 NK 세포), 단핵구, 대식세포 등을 포함하는 말초혈 단핵 세포(PBMC)로서 인간 환자로부터 얻은 전혈로부터 추출한다. 경우에 따라, 본 발명을 실시하기 위해 선택된 PBMC 서브세트를 농축시킴으로써 이펙터 세포를 더 준비한다. 특정 실시형태에서, 세포 혼합물로부터 B 세포를 제거한다.
형질도입된 세포의 항체 결합 능력은 유세포 분석을 이용하여 확인한다. 항체로 피복된 세포에 결합하고, 사이토카인을 방출하고, ADCC를 수행하고, 증식할 수 있는 세포의 능력은 당업자에게 잘 알려진 표준 어세이(assay) 및 모델(예를 들어, 마우스 이종이식 모델)을 이용하여 생체외 및 생체내에서 테스트하고 확인한다.
III. 치료제 및 백신
암에 대한 ADCC 인핸서의 임상적 의미는 인간 암 세포를 치료 항체와 함께 사용하여 밝힐 수 있다. 예를 들어, 다우디(Daudi) 세포를, (1) 림프종, 자가면역 질환 및 이식 거부반응에 관련되어 있는 CD20을 표적으로 하여, 이펙터 세포 활성화, 탈과립화 및 증식을 유도하는 리툭시맙(상표명 리툭산?), 및 (2) ADCC 인핸서로 형질도입된 면역 이펙터 세포로 처리한다. 표적 세포 사멸을 또한 관찰한다. 생체내 테스트는, 매우 적은 T 세포 및 B 세포를 가지고 NK 세포를 갖지 않는 시판되는 NOD.scid. IL2Rγ-/- 마우스를 사용하여 수행한다. 대안으로, 매우 적은 T 세포 및 B 세포를 가지고 감소된 NK 세포를 갖는 NOD.Scid 마우스를 사용한다. 이들 마우스에 표지된 다우디 세포를 생착시키고, 임의의 적절한 영상화 기법에 의해 종양 성장을 관찰하고 측정한다. 리툭시맙과, ADCC 인핸서로 형질도입된 면역 이펙터 세포를 주입받은 마우스에서, 지속된 기간 동안의 종양 관해, 퇴행 또는 장기간 비진행이 관찰된다.
또 다른 예에서, SK-BR-3 또는 MCF-7 세포를, (1) ADCC 인핸서로 형질도입된 면역 이펙터 세포 및 (2) 유방암에 관련되어 있는 HER2/neu를 표적으로 하여 이펙터 세포 활성화, 탈과립화 및 증식을 유도하는 트라스투주맙(상표명 허셉틴?)으로 처리한다. 표적 세포 사멸을 또한 관찰한다. ADCC 인핸서의 생체내 항종양 효능은 바로 위에 기재한 예와 유사한 마우스 모델에서 관찰한다.
자가면역에 있어서의 ADCC 인핸서의 임상적 용도는 이러한 질환 유형에 대해 잘 확립된 마우스 모델 중 하나를 이용하여 밝힐 수 있다. 예를 들어, 항체 매개성 B 세포 결실이 NOD 마우스에 있어서 1형 당뇨병을 예방하고 나아가 역전시키는 것으로 확인되었다. 그러나, 이러한 효과는 Fc 수용체의 낮은 친화력에 의해 제한된다[Hu et al. J Clin Invest. 2007, 117(12):3857-67; Xiu et al. J Immunol. 2008, 180(5):2863-75]. 대조군 마우스를, 항-CD19 또는 항-CD20 항체를 단독으로, 또는 본 발명의 ADCC 인핸서로 형질도입되거나 이를 다른 방식으로 발현하는 뮤린 면역 이펙터 세포와의 조합으로 투여받은 마우스와 비교한다. ADCC 인핸서를 투여받은 마우스는 질병의 지연 개시 또는 증상의 지속적인 역전을 나타낸다.
항체 매개성 고갈이 다발성 골수종, 또는 실험적 자가면역성 뇌척수염[Barr et al. J Exp Med. 2012, 209(5): 1001-10], 관절염[Yanaba et al. J Immunol. 2007, 179(2): 1369-80] 등과 같은 질환에 영향을 미치는 것으로 확인된 다른 마우스 모델에서 유사한 실험을 수행할 수 있다.
HIV 감염과 같은 바이러스 감염에 있어서의 ADCC 인핸서의 임상적 용도는, 항체의 조합을 사용한 치료가 HIV 복제를 억제하는 것으로 확인된, 잘 확립된 인간화된 마우스 모델[Nature, 2012, 492(7427): 118-22]을 사용하여 밝힐 수 있다. 인간화된 마우스 모델을, 먼저, NOD.RAG1-/-.IL2Rγ-/- 마우스를 인간 태아 간 유래의 CD34+ 조혈모 세포를 사용하여 재구성함으로써 생성한다. 이러한 마우스는 완벽히 인간의 면역계를 가지고 있고, HIV에 의해 감염될 수 있으며, 인간 항체에 대해 음성적으로 반응하지 않는다. 감염된 대조군 마우스를, 중화 항체 칵테일을 단독으로 또는 본 발명의 ADCC 인핸서로 형질도입된 인간 면역 이펙터 세포와의 조합으로 투여받은 마우스와 비교한다. ADCC 인핸서를 투여받은 마우스는 지속된 바이러스혈증 감소와 T 세포수 회복을 나타낸다.
ADCC 인핸서의 임상 효능을 테스트하기 위한 대안적 모델 시스템은 원숭이-인간 면역결핍 바이러스(SHIV) 감염 유아 레서스 머카크(rhesus macaque) 모델이며, 이 모델에서 중화 항체는 질병의 빠른 개시를 예방하는 것으로 확인되었다[Jaworski et al. J Virol. 2013, 87(19): 10447-59]. 감염된 대조군 머카크는 중화 항체 칵테일을 단독으로 또는 본 발명의 ADCC 인핸서로 형질도입된 면역 이펙터 세포와의 조합으로 투여받은 것들과 비교한다. ADCC 인핸서를 투여받은 머카크는 유사하게 바이러스혈증의 지속적인 감소와 T 세포수의 회복을 나타낸다.
본 발명의 ADCC 증강 시스템을 코딩하는 DNA 및 RNA 구성체는 당업자에게 공지된 기법을 이용하여 피험체로의 투여를 위해 제제화될 수 있다. ADCC 증강 시스템을 코딩하는 DNA 및 RNA 구성체를 포함하는 제제는 약학적으로 허용되는 부형제(들)를 포함할 수 있다. 제제에 포함되는 부형제는, 예를 들어, 사용되는 유전자 구성체 또는 이펙터 세포의 종류 및 투여 방식에 따라 서로 다른 목적을 갖는다. 일반적으로 사용되는 부형제의 예로는 식염수, 완충 식염수, 덱스트로스, 주사용수, 글리세롤, 에탄올 및 이들의 조합, 안정화제, 가용화제 및 계면활성제, 완충제 및 방부제, 장성 조절제, 증량제 및 윤활제를 들 수 있으나, 이들에 한정되지 않는다. ADCC 인핸서를 발현하는 면역 이펙터 세포의 집단을 통상적으로 준비하고 생체외에서 배양한다.
본 발명의 방법 실시형태 중 하나에서, 피험체로부터 얻은 전혈로부터 추출한 면역 이펙터 세포를, 먼저, 본 발명의 ADCC 인핸서를 코딩하는 재조합 렌티바이러스(또는 임의의 다른 유전자 치료 벡터, 예를 들어 허피스 바이러스, 아데노바이러스, AAV 등)으로 생체외에서 감염시킨다. 그 후, 감염된 PBMC 세포를, 형질감염 성공을 확인한 후, 동일한 환자 피험체에게 다시 주입한다. 환자 피험체에게 주입된 면역 이펙터 세포는 그 후 항체로 둘러싸인 종양 세포를 포함한 질병 세포를 찾아서 파괴하게 된다. 이러한 방법 실시형태를 실시하기 위해, 본 발명은, 본 발명의 조제된 유전자 구성체를 포함하고, 경우에 따라 PBMC 세포를 준비하기 위한 제제 및 설명서를 포함하는, 의사가 사용할 수 있는 키트를 제공한다. 이 방법의 변형된 실시형태는 PBMC로부터의 세포의 서브세트를 감염시키거나 형질감염시키는 것을 수반한다. 이것은, 특정 세포 유형의 증식을 차등적으로 지지하는 조건 하에 PBMC를 배양하거나, 형광 활성화 세포 분류 또는 자기 활성화 세포 분류와 같은 양성 또는 음성 선별 기법을 통해 세포를 선별하거나, 상기 방법 둘 다를 이용함으로써 수행할 수 있다. 본 발명의 대안적 방법 실시형태는 표준 형질감염 기법을 이용하여 수용체에 대한 DNA 구성체 또는 RNA로 PBMC 또는 정제된 세포 서브세트를 형질감염시키는 것이다.
본 발명의 또 다른 실시형태에서, 제제는 리포솜 또는 나노입자에 기초한 기법에 의해 전달되는 ADCC 인핸서를 코딩하는 유전자 구성체를 포함하고, 당업자에게 공지된 방법 및 기법을 이용하여 피험체에게 투여될 수 있다. 예시적인 방법으로는 정맥내 주사를 들 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 다른 방법으로는 종양내, 피내, 피하((s.c., s.q., sub-Q, Hypo), 근육내(i.m.), 복강내(i.p.), 동맥내, 수질내, 심장내, 관절내(조인트), 활막내(관절액 부위), 두개내, 척수내, 및 척추강내(척수액) 주사를 들 수 있으나 이들에 한정되지 않는다. 제제의 비경구 주사 또는 주입에 유용한 임의의 공지된 디바이스가 그러한 투여를 실시하는 데 사용될 수 있다.
피험체에게 투여되는 ADCC 인핸서를 코딩하는 유전자 구성체를 포함하는 제제는 특정 적응증 또는 질환의 치료 및/또는 예방에 유효한 다수의 유전자 구성체 또는 이펙터 세포를 포함한다. 따라서, 본 발명의 방법을 실시할 때 ADCC 인핸서를 코딩하는 치료적으로 유효한 유전자 구성체를 피험체에게 투여한다. 일반적으로, 약 1x104개∼약 1x1010개의 이펙터 세포를 포함하는 세포를 베이스로 하는 제제를 투여한다. 대부분의 경우, 제제는 약 1x105개∼약 1x109개의 이펙터 세포를 포함한다. 그러나, 피험체에게 투여되는 이펙터 세포의 수는 암 또는 질환의 위치, 근원, 실체, 정도 및 중증도, 치료 대상 개체의 나이 및 상태 등에 따라 넓은 범위에서 달라질 수 있다. 의사가 최종적으로 사용할 적정 투여량을 결정할 것이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "치료하다", "치료하는" 및 "치료"는 이 용어의 일반적이고 통상적인 의미를 가지며, 피험체에서의 질환(예를 들어, 암)의 증상을 그 중증도 및/또는 빈도에 있어서 차단, 개선, 또는 감소시키는 것, 및/또는 피험체에서의 암 세포의 성장, 분화, 확산, 또는 증식을 억제하는 것, 또는 암의 진행(예를 들어, 새로운 종양의 출현)을 억제하는 것 중 하나 이상을 포함한다. 치료는 본 발명의 방법이 실시되지 않은 피험체에 비해 약 1%∼약 100% 차단, 개선, 감소 또는 억제하는 것을 의미한다. 바람직하게는, 차단, 개선, 감소 또는 억제는 본 발명의 방법이 실시되지 않은 피험체 대비 약 100%, 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5% 또는 1%이다.
본 발명의 ADCC 인핸서를 발현하는 면역 이펙터 세포의 치료적 임상 효능과 예방적 임상 효능 둘 다, 경우에 따라, 수지상 세포(DC)의 사용을 통해 추가로 증강될 수 있다. 림프 기관에서, DC는 항원을 T 헬퍼 세포에 제시하고, 이 세포는 CTL, B 세포, 대식세포, 호산구 및 NK 세포를 비롯한 면역 이펙터를 조절한다. HIV 항원을 발현하도록 조작되거나 외인성 HIV 단백질로 펄싱된 자가 DC는 시험관내에서 HIV에 대해 CTL을 프라이밍할 수 있다는 것이 보고되었다[Wilson et al., J Immunol., 1999, 162:3070-78]. 따라서, 본 발명의 일 실시형태에서, 먼저, DC를 피험체 환자로부터 단리하고, 그 후 이것을 표적 항원(들)의 공급원, 예컨대 피험체 환자 또는 외래 공급원으로부터 유래될 수 있는 특정 종양 관련 항원 또는 다른 질병 표면 마커와의 인큐베이션을 통해 생체외에서 프라이밍한다. 이들 DC는, 자가 CTL 및/또는 본 발명의 ADCC 증강 시스템으로 형질감염된 다른 이펙터 세포에 의한, 또는 ADCC 증강 시스템을 코딩하는 DNA 및 RNA 구성체를 포함하는 제제에 의한 치료 전에, 최종적으로 환자에게 다시 주입된다. 이것은 DC의 사용과 함께 ADCC 인핸서를 사용하여 개선된 치료 모델과 백신을 제공한다.
본 발명은 또한, 약학적으로 허용되는 부형제와 함께, 다량의, 본 발명의 ADCC 인핸서를 코딩하는 유전자 구성체가 충전된 하나 이상의 용기를 포함하는 키트를 제공한다. 이 키트는 또한 사용 설명서를 포함할 수 있다. 이 키트에, 약제 또는 생물학적 제품의 제조, 사용, 또는 판매를 규제하는 정부 기관이 정한 형태의 통지문이 추가로 결합될 수 있으며, 상기 통지문은 정부 기관이 인간 투여를 위한 제조, 사용, 또는 판매를 승인함을 반영한다.
IV. 실시예
(1) 키메라 수용체
본 발명의 실시형태에 따라, 키메라 ADCC 증강 수용체의 엑토도메인을 하기 두 가지 방식으로 생성하였다:
(a) 도메인적 융합: FcγRI(CD64) 및 FcγRIII(CD16)의 엑토도메인과 막관통 영역 사이의 예측 아미노산 경계를 기초로, 인간 FcγRI의 예측 엑토도메인을 인간 FcγRIII의 막관통 영역 및 세포내 영역에 융합시켰다. 융합 수용체 내의 형성된 영역에 대한 DNA 및 아미노산 서열이 각각 서열 번호 1 및 2로서 도 10에 도시되어 있다. 명백하게, 서열 번호 1 이외의 DNA 서열이 또한 서열 번호 2의 단백질로 번역될 수 있고, 그러한 DNA 서열 역시 본 출원 전반에 걸쳐서 이러한 예 및 유사한 예에 있어서 본 발명에 의해 고려된다.
(b) 엑손에 기초한 융합: FcγRI 및 FcγRIII 내의 엑손 경계에 기초하여, 인간 FcγRI의 예측 엑토도메인을 인간 FcγRIII의 막관통 영역 및 세포내 영역에 융합시켰다. 도 3에 도시된 바와 같이, 양쪽 단백질은, 분비 펩티드를 코딩하는 2개의 엑손(S1 및 S2)과, 이에 이어 세포외 영역을 코딩하는 3개(CD64) 또는 2개(CD16)의 엑손을 갖는다. 구체적으로, CD64로부터의 S1∼EC3의 엑손을 CD16 내의 TM/C 엑손과 융합하였다. 형성된 영역에 대한 DNA 서열 및 아미노산 서열이 각각 서열 번호 3 및 4로서 도 11에 도시되어 있다.
키메라 수용체를 제조하기 위해, 인간 CD64 및 CD16으로부터의 cDNA 클론을 Origene으로부터 입수하였다(다양한 다른 시판업체로부터도 입수할 수 있음). 플랭킹 프라이머를 디자인하고 합성해서, PCR을 이용하여 cDNA의 선택된 부분을 증폭시키고 하나의 벡터에 재조합적으로 통합시켰다. 프라이머는, 융합 구성체를 생성하기 위한 클로닝과 다양한 시판되는 벡터로의 서브클로닝을 용이하게 하는 제한효소 사이트를 포함하였다. 전 과정에서, 표준적인 제한효소 절단 및 결찰 절차가 이용되었다.
도 4를 참조하면, 인간 CD64의 엑토도메인을 인간 CD16의 막관통 도메인 및 세포내 도메인을 융합시킨 후, 이들을 다양한 인간 단백질에서 확인되는 다양한 증폭 모듈, 구체적으로, CD28(a.a. 162-202), CD134(a.a. 213-249), CD137(a.a. 187-232) 및 CD3ζ(a.a. 31-142)(모든 아미노산 위치는 성숙 단백질 서열에 기초한 것임)에 추가로 융합시켰다. 다음과 같이 별표로 표시되는 서열에 돌연변이를 도입하였다: 시판되는 CD16 cDNA는 복귀된 다형성을 갖는다. 또한, 표면 발현을 하향 조절하는 것으로 알려진 CD28 내의 디루신(dileucine) 모티프를 돌연변이시켰다. 각각의 모듈은 2개의 스페이서 아미노산을 도입한 -GGATCT- 서열에 의해 분리되었다. 융합 수용체 내의 형성된 영역에 대한 DNA 서열과 아미노산 서열이 각각 서열 번호 5 및 6으로서 도 12에 도시되어 있다. CD64, CD16 및 상기에 기재한 4개의 증폭 모듈로부터의 영역을 갖는 전체 융합/키메라 수용체의 DNA 서열 및 아미노산 서열이 서열 번호 7∼10으로서 도 13(도메인적 융합) 및 도 14(엑손에 기초한 융합)에 도시되어 있다. 인간 CD16의 "더 고친화력의" 돌연변이체(V158)를 대조군으로서 사용하였다.
그 후, 키메라 수용체를, 대용 마커를 갖거나(예를 들어, 도 5에 도시된 pSMPUW-IRES-GFP), 갖지 않는(예를 들어, 도 6에 도시된 pSMPUW-puro) 시판되는 렌티바이러스 벡터에 클로닝하였다.
pSMPUW-IRES-GFP(도 5)에 있어서, GFP 발현을 내부 리보솜 유입점을 통해 키메라 수용체에 연결시켰다. pSMPUW-puro 벡터 내의 퓨로마이신 카세트는 안정하고 성공적인 클론을 선택하는 데 이용될 수 있다. 그러나, 본 발명에 의해 고려되는 치료 용도를 위해서는, 도 6에 X자로 표시된 바와 같이, 벡터의 크기를 최소화하기 위해 GFP 카세트와 Puro 카세트 둘 다 제거한다. 엑손에 기초한 융합을 이용하여 키메라 수용체를 생성한 경우에만 수용체 발현이 GFP 발현과 서로 관련되었고, 그에 따라, 키메라 수용체의 그러한 버전은 본원에 기재된 바람직한 디폴트 실시형태가 되었다.
(2) 세포내 발현
유세포 분석에 의해 상기에 기재된 키메라 수용체의 발현을 테스트하기 위해 렌티바이러스 벡터(pSMPUW)로 293T 또는 Expi293 세포를 형질감염시켰다. 형질감염은 위에서 언급한 절차와 유사한 표준 절차로 수행하였다. pSMPUW-IRES-GFP의 경우, 먼저, 형질감염 2∼3일 후 GFP 발현을 통해 형질감염을 확인하였다(도 7). 그 다음, 본 발명의 키메라 수용체의 발현을, 시판되는 형광으로 태깅한 항-CD16 또는 항-CD64 항체로 세포를 염색하고, 발생한 형광을 측정함으로써 확인하였다(도 8).
수용체의 발현은 IRES 요소를 갖는 GFP 발현에 연관되어 있기 때문에, 수용체 발현은 GFP 발현과 서로 관련되었다. 항체에 의한 염색은 일반적으로 106개 세포를 회수하여, 5% 우태 혈청(FBS)을 함유하거나 함유하지 않는 인산염 완충 식염수(PBS)로 세척함으로써 수행하였다. 세포를 적정량의 항체 존재 하에 PBS-FBS 중에서 4℃로 30분 동안 인큐베이트하였다. 세포를 다시 PBS로 세척하고 유세포 분석으로 분석하였다.
도메인적 융합 전략법을 이용하여 제조한 CD64-CD16 키메라 수용체는 엑손에 기초한 융합을 이용하여 제조한 것보다 훨씬 더 약한 발현(데이터는 도시되지 않음)을 나타내었다.
pSMPUW 벡터를 시판되는 헬퍼 플라스미드와 함께 동시 형질감염시켜서 렌티바이러스 입자를 제조하였다. 성공적인 형질감염은 GFP 및/또는 수용체 발현을 분석함으로써 확인하였다.
(3) 치료적 친화력
인간 항체에의 결합 측면에서 키메라 수용체의 능력을 테스트하기 위해, 세포를 먼저 상기와 마찬가지로 시판되는 리툭시맙(리툭산) 항체로 "염색"하였다. 요약하면, 106개 세포를 회수하고, PBS로 세척하여, 0.1 ㎍/ml의 리툭시맙과 함께 4℃에서 30분 동안 인큐베이트하였다. 세포를 다시 PBS로 세척하고, 형광으로 태깅한 염소 항-IgG 항체(리툭시맙 또는 임의의 다른 인간 IgG에 결합하는 항체)로 염색하였다.
테스트 조건 하에서, 엑손에 기초한 융합 전략법으로 제조한 CD64-CD16 키메라 수용체는 CD16의 벤치마크 V158 버전보다 리툭시맙에 현저히 덜 잘 결합하는 것으로 나타났다(도 9). 또한, 유사한 실험을 다른 치료 항체를 사용해서 수행한다.
추가의 기능성 수준은 항체로 피복된 표적 세포에 결합할 수 있는 그 능력이다. 테스트를 위해, 표적 세포, 예를 들어 다우디(버킷 림프종 세포주) 세포를, 우선, 세포 트레이싱 시약, 예를 들어 CellTrace Far Red DDAO-SE로 형광 표지한다. 이것은 통상적으로, 5x106개 세포를 회수하고, 이 세포를 PBS로 세척한 후, 적정량의 시약과 함께 5분 동안 인큐베이트함으로써 수행한다. 과잉량의 PBS-FBS를 첨가하여 반응을 종료시킨 후 세포를 PBS로 2회 세척한다. 그 후, 표지된 세포를 상기에 기재한 바와 같이 리툭시맙으로 피복한다. 리툭시맙은 다우디 세포 표면에 발현되는 세포 표면 CD20 분자에 결합한다. 그 후, 리툭시맙으로 피복된 세포를 서로 다른 키메라 수용체를 발현하는 세포와 함께 37℃에서 60분 동안 인큐베이트하여, 유세포 분석에 의해 이종성 응집체(GFP+, CellTrace+)를 형성하는 능력을 테스트한다. GFP와 같은 대용 마커가 없는 렌티바이러스 벡터를 사용할 경우, 키메라 수용체를 발현하는 세포는 또한 상용성 염료, 예를 들어 CFSE로 염색되어야 할 필요가 있다.
다른 세포주를 적절한 표적화 항체와 함께 사용하여, 예를 들어, 라지(Raji) 또는 라모스(Ramos) 세포를 리툭시맙과 함께 사용하거나, SK-BR-3(유방암종) 세포를 트라스투주맙 등과 함께 사용하여 유사한 실험을 수행할 수 있다.
(4) 면역 이펙터 세포
렌티바이러스 입자를 293T 세포에서 제조한 후, 이들을 사용하여, T 세포에서의 수용체의 기능성을 테스트할 수 있다. 예를 들어, 주르캇(Jurkat)(급성 T 세포 백혈병) 세포는 흔히 사용되는 1차 T 세포의 대용물이다. 수용체의 기능성은 293T 세포에서 상기에 기재한 것과 매우 동일한 방식으로 확인한다. 주르캇 세포를 표준 스피노큘레이션(spinoculation)법을 이용하여 감염시킨다. 통상적으로, 100 ㎕의 2x105개 세포를 96웰 플레이트에 플레이팅한다. 적정량의 바이러스 상청액을 폴리브렌(4 ㎍/ml)과 함께 첨가하고 350xg로 30℃에서 2시간 동안 원심분리한다. 감염 후 2일 이상 동안 세포를 분석한다. puroR 함유 렌티바이러스 벡터의 경우, 세포를 퓨로마이신으로 선별함으로써 안정한 세포주를 생성할 수 있다.
유사한 방법을 이용하여, 항-CD3/CD28로 활성화한 후 나이브 1차 T 세포를 감염시킨다. 주르캇 또는 293 세포와 유사한 분석 이외에도, 본 발명 수용체의, 활성화, 증식 및 세포독성 유발 능력을 밝힐 수 있다. 통상적으로, 증식을 측정하기 위해, 106개의 형질도입된 세포를 50 IU/ml의 IL-2 존재 하에 증식시킨다. 리툭시맙으로 피복된 다우디 세포를 1:1의 비로 서로 다른 날에 이 배양물에 첨가한다. 상기와 같이, 다른 항체 피복 세포도 이들 실험에 사용할 수 있다. 이상적으로는, 증식을 지연시키기 위해 표적 세포(예를 들어, 다우디)를 미토마이신 C로 전처리한다. T 세포 증식은 유세포 분석 또는 다른 전통적인 방법으로, 예를 들어 티미딘 편입, CFSE 희석 등에 의해 측정한다.
리소좀 회합형 막 단백질-1(LAMP-1 또는 CD107a)은, 자극에 따른 용해 과립의 CD8+ T 세포 및 NK 세포 탈과립화의 마커로서 알려져 있다. 상기에 기재한 공배양 실험에서, CD107a+ T 세포의 수준을 유세포 분석에 의해 탈과립화 척도로서 분석할 수 있다.
세포독성을 평가하기 위해, 적절한 치료 항체의 존재 하에, T 세포를 CellTrace 태깅 표적 세포와 몇 시간 동안 공배양한다. 생존 표적 세포의 수용체 형질도입 의존성, 항체 의존성 고갈이 관찰된다. 이것은 프로피듐 요오다이드 또는 7-AAD를 사용하여 유세포 분석에 의해 측정할 수 있다.
(5) 생체내 항종양 활성
항종양 활성은, 잭슨 랩(Jackson lab)[Shultz et al. Nat Rev Immunol. 2007 Feb;7(2):118-30 참조]으로부터 입수한 NSG 마우스를 사용하여 표준 이종이식 종양 모델로 밝힌다. NSG 마우스는 기능성 T, B 또는 NK 세포가 결여되어 있고 심각한 면역 저하를 나타내어, 1차 인간 세포의 생착에 이상적이다. 다른 유사한 마우스 품종, 예를 들어 NOG 마우스도 사용될 수 있다.
예를 들어, 루시퍼라제 발현 표적 종양 세포를 복강내 주사한다(i.p. 0.3x106개 세포/마우스). 며칠 후, 마우스에게, 리툭시맙(150 ㎍) 및 수용체 형질도입 T 세포(107개 세포)를 1,000∼2,000 IU의 IL-2와 함께 복강내 주사하여 처리한다. 대조군으로서, 마우스의 부분집단에서 리툭시맙, 수용체 또는 T 세포를 제외시킨다. 종양 생착 및 성장은 Xenogen IVIS 시스템을 이용하여 측정한다.
대안적 종양 모델은 107개의 다우디 세포를 피하(s.c.) 주사하고 처리제를 정맥내(i.v.) 주사하는 것을 포함한다. 종양 성장은 캘리퍼스로 직접 측정하거나 생존율로 판단한다.
라지 세포의 복강내(i.p.), 피하(s.c.) 또는 정맥내(i.v.) 주사를 포함하는 유사한 실험을 다른 세포주 항체 조합을 이용하여 수행한다. 후자의 경우, 종양 성장을 생존율로 측정한다.
치료 목적을 위해, 관련없는 유전자의 발현이 최소화되도록, 퓨로마이신 또는 GFP 마커를 제거한다.
다른 대안적 실시예는 mRNA를 직접 전기천공으로 도입하거나 형질감염시키는 것이다. 이것은 렌티바이러스보다 안전하다.
본 발명의 범위 또는 사상으로부터 벗어남이 없이 본 발명에 다양한 변형 및 변경이 이루어질 수 있음은 당업자에게 명백할 것이다. 본원에 개시된 발명의 상세한 설명과 실시를 고려할 때 본 발명의 다른 실시형태도 당업자에게 명백할 것이다. 상세한 설명과 실시예는 단지 예시적으로 것으로 간주되어야 하는 것을 의도하며, 본 발명의 진정한 범위 및 사상은 하기 청구범위에 기재된 것이다.
본 출원 전반에 걸쳐서, 본 발명이 속하는 기술분야를 보다 충분히 설명하기 위해 다양한 간행물, 특허 및/또는 특허 출원을 인용하였다. 이러한 간행물, 특허 및/또는 특허출원의 개시사항은, 각각의 독립적 간행물, 특허 및/또는 특허출원이 구체적이고 개별적으로 참고로 포함되었다고 기재한 것과 같은 정도로 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> 1GLOBE HEALTH INSTITUTE LLC LI, Chiang J. UNNIRAMAN, Shyam <120> Novel Synthetic Biology-Based ADCC Technology <130> GHI-002PCT <140> PCT/US15/10708 <141> 2015-01-08 <150> US61/925217 <151> 2014-01-08 <160> 10 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1032 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Fusion of human genetic materials <400> 1 cttggagaca acatgtggtt cttgacaact ctgctccttt gggttccagt tgatgggcaa 60 gtggacacca caaaggcagt gatcactttg cagcctccat gggtcagcgt gttccaagag 120 gaaaccgtaa ccttgcattg tgaggtgctc catctgcctg ggagcagctc tacacagtgg 180 tttctcaatg gcacagccac tcagacctcg acccccagct acagaatcac ctctgccagt 240 gtcaatgaca gtggtgaata caggtgccag agaggtctct cagggcgaag tgaccccata 300 cagctggaaa tccacagagg ctggctacta ctgcaggtct ccagcagagt cttcacggaa 360 ggagaacctc tggccttgag gtgtcatgcg tggaaggata agctggtgta caatgtgctt 420 tactatcgaa atggcaaagc ctttaagttt ttccactgga attctaacct caccattctg 480 aaaaccaaca taagtcacaa tggcacctac cattgctcag gcatgggaaa gcatcgctac 540 acatcagcag gaatatctgt cactgtgaaa gagctatttc cagctccagt gctgaatgca 600 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600 tctgtgacat ccccactcct ggaggggaat ctggtcaccc tgagctgtga aacaaagttg 660 ctcttgcaga ggcctggttt gcagctttac ttctccttct acatgggcag caagaccctg 720 cgaggcagga acacatcctc tgaataccaa atactaactg ctagaagaga agactctggg 780 ttatactggt gcgaggctgc cacagaggat ggaaatgtcc ttaagcgcag ccctgagttg 840 gagcttcaag tgcttggttt ggcagtgtca accatctcat cattctttcc acctgggtac 900 caagtctctt tctgcttggt gatggtactc ctttttgcag tggacacagg actatatttc 960 tctgtgaaga caaacattcg aagctcaaca agagactgga aggaccataa atttaaatgg 1020 agaaaggacc ctcaagacaa a 1041 <210> 4 <211> 343 <212> PRT <213> artificial <220> <223> fusion protein <400> 4 Met Trp Phe Leu Thr Thr Leu Leu Leu Trp Val Pro Val Asp Gly Gln 1 5 10 15 Val Asp Thr Thr Lys Ala Val Ile Thr Leu Gln Pro Pro Trp Val Ser 20 25 30 Val Phe Gln Glu Glu Thr Val Thr Leu His Cys Glu Val Leu His Leu 35 40 45 Pro Gly Ser Ser Ser Thr Gln Trp Phe Leu Asn Gly Thr Ala Thr Gln 50 55 60 Thr Ser Thr Pro Ser Tyr Arg Ile Thr Ser Ala Ser Val Asn Asp Ser 65 70 75 80 Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Arg 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gatggcggag 600 gcctacagtg agattgggat gaaaggcgag cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt 660 taccagggtc tcagtacagc caccaaggac acctacgacg cccttcacat gcaggccctg 720 ccccctcgct aa 732 <210> 6 <211> 243 <212> PRT <213> artificial <220> <223> fusion protein of human genetic codes <400> 6 Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr 1 5 10 15 Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro 20 25 30 Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Gly Ser Arg Arg Asp Gln Arg 35 40 45 Leu Pro Pro Asp Ala His Lys Pro Pro Gly Gly Gly Ser Phe Arg Thr 50 55 60 Pro Ile Gln Glu Glu Gln Ala Asp Ala His Ser Thr Leu Ala Lys Ile 65 70 75 80 Gly Ser Arg Phe Ser Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile 85 90 95 Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp 100 105 110 Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu 115 120 125 Gly Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln 130 135 140 Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly 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ggcaaagcct ttaagttttt ccactggaat tctaacctca ccattctgaa aaccaacata 480 agtcacaatg gcacctacca ttgctcaggc atgggaaagc atcgctacac atcagcagga 540 atatctgtca ctgtgaaaga gctatttcca gctccagtgc tgaatgcatc tgtgacatcc 600 ccactcctgg aggggaatct ggtcaccctg agctgtgaaa caaagttgct cttgcagagg 660 cctggtttgc agctttactt ctccttctac atgggcagca agaccctgcg aggcaggaac 720 acatcctctg aataccaaat actaactgct agaagagaag actctgggtt atactggtgc 780 gaggctgcca cagaggatgg aaatgtcctt aagcgcagcc ctgagttgga gcttcaagtg 840 cttggcctcc agttaccaac tcctgtctgg tttcattacc aagtctcttt ctgcttggtg 900 atggtactcc tttttgcagt ggacacagga ctatatttct ctgtgaagac aaacattcga 960 agctcaacaa gagactggaa ggaccataaa tttaaatgga gaaaggaccc tcaagacaaa 1020 ggatctagga gtaagaggag caggggcggg cacagtgact acatgaacat gactccccgc 1080 cgccccgggc ccacccgcaa gcattaccag ccctatgccc caccacgcga cttcgcagcc 1140 tatcgctccg gatctcggag ggaccagagg ctgccccccg atgcccacaa gccccctggg 1200 ggaggcagtt tccggacccc catccaagag gagcaggccg acgcccactc caccctggcc 1260 aagatcggat ctcgtttctc tgttaaacgg ggcagaaaga aactcctgta tatattcaaa 1320 caaccattta tgagaccagt acaaactact caagaggaag atggctgtag ctgccgattt 1380 ccagaagaag aagaaggagg atgtgaactg ggatctagag tgaagttcag caggagcgca 1440 gacgcccccg cgtaccagca gggccagaac cagctctata acgagctcaa tctaggacga 1500 agagaggagt acgatgtttt ggacaagaga cgtggccggg accctgagat ggggggaaag 1560 ccgcagagaa ggaagaaccc tcaggaaggc ctgtacaatg aactgcagaa agataagatg 1620 gcggaggcct acagtgagat tgggatgaaa ggcgagcgcc ggaggggcaa ggggcacgat 1680 ggcctttacc agggtctcag tacagccacc aaggacacct acgacgccct tcacatgcag 1740 gccctgcccc ctcgctaa 1758 <210> 8 <211> 585 <212> PRT <213> artificial <220> <223> fusion protein of human DNAs <400> 8 Met Trp Phe Leu Thr Thr Leu Leu Leu Trp Val Pro Val Asp Gly Gln 1 5 10 15 Val Asp Thr Thr Lys Ala Val Ile Thr Leu Gln Pro Pro Trp Val Ser 20 25 30 Val Phe Gln Glu Glu Thr Val Thr Leu His Cys Glu Val Leu His Leu 35 40 45 Pro Gly Ser Ser Ser Thr Gln Trp Phe Leu Asn Gly Thr Ala Thr Gln 50 55 60 Thr Ser Thr Pro Ser Tyr Arg Ile 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gaaggataag ctggtgtaca atgtgcttta ctatcgaaat 420 ggcaaagcct ttaagttttt ccactggaat tctaacctca ccattctgaa aaccaacata 480 agtcacaatg gcacctacca ttgctcaggc atgggaaagc atcgctacac atcagcagga 540 atatctgtca ctgtgaaaga gctatttcca gctccagtgc tgaatgcatc tgtgacatcc 600 ccactcctgg aggggaatct ggtcaccctg agctgtgaaa caaagttgct cttgcagagg 660 cctggtttgc agctttactt ctccttctac atgggcagca agaccctgcg aggcaggaac 720 acatcctctg aataccaaat actaactgct agaagagaag actctgggtt atactggtgc 780 gaggctgcca cagaggatgg aaatgtcctt aagcgcagcc ctgagttgga gcttcaagtg 840 cttggtttgg cagtgtcaac catctcatca ttctttccac ctgggtacca agtctctttc 900 tgcttggtga tggtactcct ttttgcagtg gacacaggac tatatttctc tgtgaagaca 960 aacattcgaa gctcaacaag agactggaag gaccataaat ttaaatggag aaaggaccct 1020 caagacaaag gatctaggag taagaggagc aggggcgggc acagtgacta catgaacatg 1080 actccccgcc gccccgggcc cacccgcaag cattaccagc cctatgcccc accacgcgac 1140 ttcgcagcct atcgctccgg atctcggagg gaccagaggc tgccccccga tgcccacaag 1200 ccccctgggg gaggcagttt ccggaccccc atccaagagg agcaggccga cgcccactcc 1260 accctggcca agatcggatc tcgtttctct gttaaacggg gcagaaagaa actcctgtat 1320 atattcaaac aaccatttat gagaccagta caaactactc aagaggaaga tggctgtagc 1380 tgccgatttc cagaagaaga agaaggagga tgtgaactgg gatctagagt gaagttcagc 1440 aggagcgcag acgcccccgc gtaccagcag ggccagaacc agctctataa cgagctcaat 1500 ctaggacgaa gagaggagta cgatgttttg gacaagagac gtggccggga ccctgagatg 1560 gggggaaagc cgcagagaag gaagaaccct caggaaggcc tgtacaatga actgcagaaa 1620 gataagatgg cggaggccta cagtgagatt gggatgaaag gcgagcgccg gaggggcaag 1680 gggcacgatg gcctttacca gggtctcagt acagccacca aggacaccta cgacgccctt 1740 cacatgcagg ccctgccccc tcgctaa 1767 <210> 10 <211> 588 <212> PRT <213> artificial <220> <223> fusion protein of human DNAs <400> 10 Met Trp Phe Leu Thr Thr Leu Leu Leu Trp Val Pro Val Asp Gly Gln 1 5 10 15 Val Asp Thr Thr Lys Ala Val Ile Thr Leu Gln Pro Pro Trp Val Ser 20 25 30 Val Phe Gln Glu Glu Thr Val Thr Leu His Cys Glu Val Leu His Leu 35 40 45 Pro Gly Ser Ser Ser Thr Gln Trp Phe Leu Asn 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Claims (25)

  1. 인간 CD16보다 항체의 Fc에 대한 결합 친화력이 더 큰 엑토도메인, 막관통 도메인, 및 ADCC 활성화 및 증폭을 매개하기 위한 엔도도메인을 포함하는 막관통 키메라 수용체를 코딩하는 유전자 구성체.
  2. 제1항에 있어서, DNA 분자를 포함하는 유전자 구성체.
  3. 제1항에 있어서, RNA 분자를 포함하는 유전자 구성체.
  4. 제1항에 있어서, CD64의 EC3 엑손을 실질적으로 포함하는 유전자 구성체.
  5. 제4항에 있어서, CD64의 EC1 엑손 및 EC2 엑손을 실질적으로 더 포함하는 유전자 구성체.
  6. 제1항에 있어서, 상기 엑토도메인이 CD64 내의 엑손 또는 도메인의 경계를 기초로 선택되는 것인 유전자 구성체.
  7. 제1항에 있어서, CD64의 엑토도메인을 실질적으로 포함하는 엑토도메인으로 번역되는 RNA를 포함하는 유전자 구성체.
  8. 제1항에 있어서, 상기 엑토도메인이, 인간 CD16의 V158 변이체보다 Fc에 대해 더 큰 친화력을 갖는 것인 유전자 구성체.
  9. 제1항에 있어서, 상기 엑토도메인이, 인간 CD16의 F158 변이체보다 Fc에 대해 더 큰 친화력을 갖는 것인 유전자 구성체.
  10. 제1항에 있어서, 상기 엔도도메인이 CD3ζ, CD28, CD134, CD137, CD27, CD79a, CD79b, CD40 및 GM-CSF 수용체의 세포내 도메인의 일부 또는 전부로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 유전자 구성체.
  11. 제1항에 있어서, 서열 번호 1, 3, 5, 7, 및 9로 이루어진 군으로부터 선택되는 DNA 서열을 포함하는 유전자 구성체.
  12. 인간 CD16보다 항체의 Fc에 대한 결합 친화력이 더 큰 엑토도메인, 막관통 도메인, 및 ADCC 활성화 및 증폭을 매개하기 위한 엔도도메인을 포함하는 막관통 키메라 수용체.
  13. 제12항에 있어서, 서열 번호 2, 4, 6, 8, 및 10으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 막관통 키메라 수용체.
  14. 제12항에 있어서, 상기 엑토도메인이, 인간 CD16의 V158 변이체보다 항체의 Fc에 대해 더 큰 결합 친화력을 갖는 것인 막관통 키메라 수용체.
  15. 제12항에 있어서, 상기 엑토도메인이, CD16에 없는 CD64의 엑토도메인 내의 면역글로불린 유사 접힘구조(immunoglobulin-like fold)를 실질적으로 포함하는 것인 막관통 키메라 수용체.
  16. 제12항에 있어서, 상기 엑토도메인이 CD64의 엑토도메인을 실질적으로 포함하는 것인 막관통 키메라 수용체.
  17. 제12항에 있어서, 상기 막관통 도메인이 CD16의 막관통 도메인을 실질적으로 포함하는 것인 막관통 키메라 수용체.
  18. 제12항에 있어서, 숙주 면역 이펙터 세포의 생존 및 증식을 증강시키는 ADCC 증폭 모듈을 더 포함하는 막관통 키메라 수용체.
  19. 제19항에 있어서, 상기 증폭 모듈이 CD3ζ, CD28, CD134, CD137, CD27, CD79a, CD79b, CD40 및 GM-CSF 수용체의 세포내 도메인의 일부 또는 전부로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 막관통 키메라 수용체.
  20. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 유전자 구성체 또는 제12항 내지 제20항 중 어느 한 항의 단백질로 생체외에서 감염 또는 형질감염된 면역 이펙터 세포.
  21. 제21항에 있어서, 세포독성 T 림프구를 포함하는 면역 이펙터 세포.
  22. 제21항에 있어서, 자연 살해 세포를 포함하는 면역 이펙터 세포.
  23. 제21항에 있어서, 호산구, 대식세포, 호중구, 호염구, 단핵구, B 세포, 및 세포독성 인자를 발현하거나 발현하도록 조작된 다른 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 면역 이펙터 세포.
  24. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 유전자 구성체 또는 제12항 내지 제20항 중 어느 한 항의 수용체, 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약학 조성물.
  25. 제22항 내지 제24항 중 어느 한 항의 면역 이펙터 세포 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약학 조성물.

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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2024071544A1 (ko) * 2021-09-29 2024-04-04 카오티에스 주식회사 신규한 재조합 fc 수용체 및 이를 포함하는 세포

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2017503510A (ja) 2014-01-08 2017-02-02 １グローブ バイオメディカル カンパニー， リミテッド 新規の、合成生物学に基づくａｄｃｃ技術
JP2021500923A (ja) * 2017-10-26 2021-01-14 リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ ミネソタ 組換え免疫細胞、作製方法、および使用方法
EP3883955A1 (en) * 2018-11-19 2021-09-29 Board of Regents, The University of Texas System A modular, polycistronic vector for car and tcr transduction
WO2022007796A1 (zh) * 2020-07-06 2022-01-13 上海鑫湾生物科技有限公司 共表达IL-21和hrCD16嵌合受体的免疫细胞及其应用
CN114853905B (zh) * 2022-04-14 2022-11-22 呈诺再生医学科技(珠海横琴新区)有限公司 一种基因修饰nk细胞与抗体联合使用治疗肿瘤方案
WO2024086791A2 (en) * 2022-10-21 2024-04-25 Shoreline Biosciences, Inc. Chimeric receptors and uses thereof

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE145428T1 (de) 1990-12-14 1996-12-15 Cell Genesys Inc Chimärische ketten zur transduktion von rezeptorverbundenen signalwegen
US5641863A (en) 1993-09-30 1997-06-24 University Of Pennsylvania Chimeric IgG Fc receptors
AU750358B2 (en) 1997-12-02 2002-07-18 Medarex, Inc. Cells expressing anti-Fc receptor binding components
EP1931709B1 (en) * 2005-10-03 2016-12-07 Xencor, Inc. Fc variants with optimized fc receptor binding properties
JP5299902B2 (ja) * 2007-01-30 2013-09-25 中外製薬株式会社 キメラＦｃγレセプター及び該レセプターを用いたＡＤＣＣ活性測定方法
EP2309263B1 (en) 2009-09-14 2015-06-17 PLS-Design GmbH Chimeric IgY Fc receptor constructs
US20130071414A1 (en) * 2011-04-27 2013-03-21 Gianpietro Dotti Engineered cd19-specific t lymphocytes that coexpress il-15 and an inducible caspase-9 based suicide gene for the treatment of b-cell malignancies
JP2017503510A (ja) 2014-01-08 2017-02-02 １グローブ バイオメディカル カンパニー， リミテッド 新規の、合成生物学に基づくａｄｃｃ技術

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2024071544A1 (ko) * 2021-09-29 2024-04-04 카오티에스 주식회사 신규한 재조합 fc 수용체 및 이를 포함하는 세포

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