CN116003593A - 针对人白介素-2的免疫刺激性人源化单克隆抗体及其融合蛋白 - Google Patents

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I·贝温克
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S·鲍勃
C·雷尼尔
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Abstract

本发明涉及针对人白介素‑2的免疫刺激性人源化单克隆抗体及其融合蛋白。本发明更具体涉及特异性结合hIL‑2的特定表位的人源化抗体，该抗体在结合该表位时展示出抑制hIL‑2与CD25结合的独特能力。

Description

针对人白介素-2的免疫刺激性人源化单克隆抗体及其融合蛋白
本申请是分案申请，其原申请的国际申请号是PCT/IB2017/050127，国际申请日是2017年01月11日，中国国家申请号为201780006001.9，进入中国的日期为2018年07月06日，发明名称为“针对人白介素-2的免疫刺激性人源化单克隆抗体及其融合蛋白”。
技术领域
本发明涉及与人白介素-2(hIL-2)结合的抗体。本发明更具体涉及特异性结合hIL-2的特定表位的人源化抗体，该抗体在结合该表位时展示出抑制hIL-2与CD25结合的独特能力，并且涉及所述抗体和hIL-2之间的融合物。此外，本发明涉及所述抗体与hIL-2组合的体外和体内治疗应用，以及所述融合物的体外和体内治疗应用。
背景技术
白介素-2(IL-2)是一种细胞因子，其能够有效地刺激针对转移性肿瘤的细胞毒性淋巴细胞。然而，IL-2也能刺激所谓的CD25+CD4+调节性T细胞(Treg细胞)，Treg细胞对预防自身免疫疾病至关重要。重要的是，Treg细胞能够显著阻遏细胞毒性淋巴细胞的抗肿瘤应答，因此在一定程度上拮抗IL-2的有益抗肿瘤作用。此外，在达到临床抗肿瘤应答所需的剂量，IL-2可产生毒性副作用。
自二十世纪八十年代早期以来，使用IL-2的免疫治疗已经用于转移性黑色素瘤和转移性肾细胞癌的免疫治疗，这导致FDA分别在1996年和1992年批准用于这些适应症。而IL-2在高剂量给药时显示在患有这些致命转移癌症的患者中约17％的客观响应率和约6％至9％的完全消退，以这些剂量给药的IL-2经常导致毒性副作用，例如低血压、肺水肿、肝细胞损伤、胃肠道毒性、血管渗漏综合征(VLS)和一般性水肿。此外，如上所述，IL-2能够刺激免疫抑制性Treg细胞，其继而能够阻遏抗肿瘤CD8+T细胞和NK细胞的活性。
存在人IL-2的几种变体，并且已经采用了不同的策略来发现具有改善的体内性质的基于IL-2的化合物，如Rosalia等，Current Opinion in Chemical Biology 2014,23:39-46中所述。
然而由于缺乏合适的抗人IL-2抗体，尚未有基于该原理的成功治疗可用于患者。
发明内容
本公开一般性涉及结合人IL-2的特定表位的抗体或其片段、其制备方法和应用，包括治疗病症的方法。
本文公开的抗IL-2抗体或其片段(单独或与其他药剂或治疗形式组合)可以用于治疗、预防和/或诊断病症，例如癌性病症(例如实体和软组织肿瘤和血液肿瘤)以及感染性疾病(例如慢性感染性病症)。因此，本文中公开了包含抗IL-2抗体或其片段的组合物，以及使用抗IL-2抗体或其片段或者包含抗IL-2抗体或其片段的组合物治疗各种病症(包括癌症和/或感染性疾病)的方法。
在第一方面，本公开提供了分离的抗体或其抗原结合部分，其结合如SEQ ID NO:109所示的人IL-2，其中，所述抗体或其抗原结合部分包含：含有LCDR1、LCDR2和LCDR3的轻链可变区以及含有HCDR1、HCDR2和HCDR3的重链可变区，并且其中LCDR1包含SEQ ID NO:122；其中LCDR2包含SEQ ID NO:123；其中LCDR3包含SEQ ID NO:21；其中HCDR1包含SEQ IDNO:119；其中HCDR2包含SEQ ID NO:120；并且其中HCDR3包含SEQ ID NO:121。
在一个实施方式中，第一方面的分离的抗体或其抗原结合部分，其中，所述抗体或其抗原结合部分包含轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区包含：选自由SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:86和SEQ ID NO:90组成的组的LCDR1；选自由SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:32组成的组的LCDR2；如SEQ ID NO:21所示的LCDR3；且所述重链可变区包含：选自由SEQ IDNO:4和SEQ ID NO:13组成的组的HCDR1；选自由SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:12组成的组的HCDR2；和选自由SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:42和SEQ ID NO:45组成的组的HCDR3。
在又一个实施方式中，第一方面的分离的抗体或其抗原结合部分，其中，LCDR1、LCDR2和LCDR3分别为SEQ ID NO:19、20和21，并且HCDR1、HCDR2和HCDR3分别为SEQ ID NO:4、2和3；或LCDR1、LCDR2和LCDR3分别为SEQ ID NO:31、32和21，并且HCDR1、HCDR2和HCDR3分别为SEQ ID NO:4、2和3；或LCDR1、LCDR2和LCDR3分别为SEQ ID NO:19、20和21，并且HCDR1、HCDR2和HCDR3分别为SEQ ID NO:13、12和3；或LCDR1、LCDR2和LCDR3分别为SEQ ID NO:31、32和21并且HCDR1、HCDR2和HCDR3分别为SEQ ID NO:13、12和3；或LCDR1、LCDR2和LCDR3分别为SEQ ID NO:69、20和21并且HCDR1、HCDR2和HCDR3分别为SEQ ID NO:4、2和3；或LCDR1、LCDR2和LCDR3分别为SEQ ID NO:31、32和21，并且HCDR1、HCDR2和HCDR3分别为SEQ ID NO:4、2和3；或LCDR1、LCDR2和LCDR3分别为SEQ ID NO:69、20和21，并且HCDR1、HCDR2和HCDR3分别为SEQ ID NO:4、2和3；或LCDR1、LCDR2和LCDR3分别为SEQ ID NO:19、20和21，并且HCDR1、HCDR2和HCDR3分别为4、2和36；或LCDR1、LCDR2和LCDR3分别为SEQ ID NO:69、20和21，并且HCDR1、HCDR2和HCDR3分别为4、2和36；或LCDR1、LCDR2和LCDR3分别为SEQ ID NO:19、20、21，并且HCDR1、HCDR2和HCDR3分别为4、2和36；和LCDR1、LCDR2和LCDR3分别为SEQ ID NO:69、20、21，并且HCDR1、HCDR2和HCDR3分别为4、2和36。
在另一个实施方式中，第一方面的分离的抗体或其抗原结合部分包括重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)与以下氨基酸序列具有至少95％(例如95％、96％、97％、98％或99％)的同一性：VL：SEQ ID NO:25，VH：SEQ ID NO:7；或VL：SEQ ID NO:27，VH：SEQ ID NO:7；或VL：SEQ ID NO:34，VH，SEQ ID NO:7；或VL：SEQ IDNO:25，VH：SEQ ID NO:15；或VL：SEQ ID NO:27，VH：SEQ ID NO:15；或VL：SEQ ID NO:34，VH：SEQ ID NO:15；或VL：SEQ ID NO:25，VH：SEQ ID NO:17；或VL：SEQ ID NO:27，VH：SEQ IDNO:17；或VL：SEQ ID NO:34，VH：SEQ ID NO:17；或VL：SEQ ID NO:70，VH：SEQ ID NO:7；或VL：SEQ ID NO:25，VH：SEQ ID NO:37；或VL：SEQ ID NO:70，VH：SEQ ID NO:37，VL：SEQ IDNO:79，VH：SEQ ID NO:7；或VL：SEQ ID NO:27，VH：SEQ ID NO:37；或VL：SEQ ID NO:79，VH：SEQ ID NO:37；或VL：SEQ ID NO:70，VH：SEQ ID NO:17；或VL：SEQ ID NO:25，VH：SEQ IDNO:49；或VL：SEQ ID NO:70，VH：SEQ ID NO:49；或VL：SEQ ID NO:79，VH：SEQ ID NO:17；或VL：SEQ ID NO:27，VH：SEQ ID NO:49；或VL：SEQ ID NO:79，VH：SEQ ID NO:49。
在一个实施方式中，第一方面的分离的抗体或其抗原结合部分具有重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)具有以下氨基酸序列：VL：SEQ ID NO:25，VH：SEQ ID NO:7；或VL：SEQ ID NO:27，VH：SEQ ID NO:7；或VL：SEQ ID NO:34，VH：SEQ ID NO:7；或VL：SEQ ID NO:25，VH：SEQ ID NO:15；或VL：SEQ ID NO:27，VH：SEQID NO:15；或VL：SEQ ID NO:34，VH：SEQ ID NO:15；或VL：SEQ ID NO:25，VH：SEQ ID NO:17；或VL：SEQ ID NO:27，VH：SEQ ID NO:17；或VL：SEQ ID NO:34，VH：SEQ ID NO:17；或VL：SEQID NO:70，VH：SEQ ID NO:7；或VL：SEQ ID NO:25，VH：SEQ ID NO:37；或VL：SEQ ID NO:70，VH：SEQ ID NO:37，VL：SEQ ID NO:79，VH：SEQ ID NO:7；或VL：SEQ ID NO:27，VH：SEQ IDNO:37；或VL：SEQ ID NO:79，VH：SEQ ID NO:37；或VL：SEQ ID NO:70，VH：SEQ ID NO:17；或VL：SEQ ID NO:25，VH：SEQ ID NO:49；或VL：SEQ ID NO:70，VH：SEQ ID NO:49；或VL：SEQ IDNO:79，VH：SEQ ID NO:17；或VL：SEQ ID NO:27，VH：SEQ ID NO:49；或VL：SEQ ID NO:79，VH：SEQ ID NO:49。
如前述实施方式所述的分离的抗体可包含选自由SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:103和SEQ ID NO:105组成的组的Fc结构域。在优选的实施方式中，所述分离的抗体包含如SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:103或SEQ ID NO:105所示的Fc结构域。
在具体实施方式中，分离的抗体包含如SEQ ID NO:124所示的轻链和如SEQ IDNO:126所示的重链，或如SEQ ID NO:128所示的轻链和如SEQ ID NO:130所示的重链。
根据本发明的第二方面，提供了这样的分离的抗体或其抗原结合片段：其结合包含氨基酸K52、P54、K55、T57、R58、T61、F62、K63、Q94和K96的人白介素-2(hIL-2)表位。
在一个实施方式中，根据第二方面的分离的抗体或其抗原结合片段特异性结合氨基酸K52、P54、K55、T57、R58、T61、F62、K63、Q94和K96。
根据第二方面的分离的抗体或其抗原结合片段可结合人白介素-2(hIL-2)表位，该表位除了氨基酸K52、P54、K55、T57、R58、T61、F62、K63、Q94和K96之外还包含氨基酸N50、N53、N91、L92、A93和N97中的任一个或多个。
在一个实施方式中，根据第二方面的所述抗体或其抗原结合片段特异性结合氨基酸N50、K52、N53、P54、K55、T57、R58、T61、F62、K63、N91、L92、A93、Q94、K96和N97。
在一个实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区依次包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述重链可变区依次包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中，LCDR1、LCDR2和LCDR3分别为SEQ ID NO:231、232和233，并且HCDR1、HCDR2和HCDR3分别为SEQ ID NO:181、182和183；或LCDR1、LCDR2和LCDR3分别为SEQ ID NO:279、280和281，并且HCDR1、HCDR2和HCDR3分别为SEQ ID NO:213、214和215；或LCDR1、LCDR2和LCDR3分别为SEQ ID NO:231、232和233，并且HCDR1、HCDR2和HCDR3分别为SEQ ID NO:213、214和215；或LCDR1、LCDR2和LCDR3分别为SEQ ID NO:263、264和265，并且HCDR1、HCDR2和HCDR3分别为SEQ ID NO:213、214和215；或LCDR1、LCDR2和LCDR3分别为SEQ ID NO:263、264和265，并且HCDR1、HCDR2和HCDR3分别为SEQ ID NO:149、150和151；或LCDR1、LCDR2和LCDR3分别为SEQ ID NO:69、20和21，并且HCDR1、HCDR2和HCDR3分别为SEQ ID NO:197、198和199；或LCDR1、LCDR2和LCDR3分别为SEQ ID NO:231、232和233，并且HCDR1、HCDR2和HCDR3分别为SEQ ID NO:197、198和199。
在一个实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)与以下氨基酸序列具有至少95％的同一性，例如100％同一性：VL：SEQ ID NO:243，VH：SEQ ID NO:193；或VL：SEQ ID NO:391，VH：SEQ ID NO:225；或VL：SEQ ID NO:243，VH：SEQ ID NO:225；或VL：SEQ ID NO:275，VH：SEQID NO:225；或VL：SEQ ID NO:275，VH：SEQ ID NO:161；或VL：SEQ ID NO:70，VH：SEQ ID NO:209；或VL：SEQ ID NO:243，VH：SEQ ID NO:209。
在具体实施方式中，分离的抗体包含其中重链和轻链区具有下述氨基酸序列；SEQID NO:195所示的重链和SEQ ID NO:245所示的轻链，或SEQ ID NO:227所示的重链和SEQID NO:393所示的轻链，或SEQ ID NO:227所示的重链和SEQ ID NO:245所示的轻链，或SEQID NO:227所示的重链和SEQ ID NO:277所示的轻链，或SEQ ID NO:163所示的重链和SEQID NO:277所示的轻链，或SEQ ID NO:211所示的重链和SEQ ID NO:261所示的轻链，或SEQID NO:211所示的重链和SEQ ID NO:277所示的轻链。
根据本发明的第三方面，提供了一种组合物，其包含本发明第一或第二方面所述的抗体和可选(但优选)的人IL-2。
在一个实施方式中，第三方面所述的组合物包含选自由SEQ ID NO:109所示的人IL-2或SEQ ID NO:110所示的阿地白介素组成的组的人IL-2，优选SEQ ID NO:110所示的阿地白介素。
根据本发明的第四方面，提供了一种融合蛋白，其包含本发明第一或第二方面所述的抗体和人IL-2。
在一个实施方式中，所述抗体和所述人IL-2通过选自由SEQ ID NO:397、SEQ IDNO:398、SEQ ID NO:399、SEQ ID NO:400、SEQ ID NO:401、SEQ ID NO:402、SEQ ID NO:403、SEQ ID NO:404、SEQ ID NO:405、SEQ ID NO:406、SEQ ID NO:407、SEQ ID NO:408、SEQ IDNO:409、SEQ ID NO:410和SEQ ID NO:411组成的组、优选SEQ ID NO:405或SEQ ID NO:407的接头序列连接。
在一个实施方式中，融合蛋白包含本发明第一或第二方面所述的抗体，其中，所述抗体的LCDR1包含根据Kabat定义的残基Y27和残基D30，并且其中残基Y27通过GG接头连接至人IL-2的残基N97，并且其中残基D30通过SEQ ID NO:412所示接头连接至人IL-2的残基K96。
根据本发明的第五方面，提供了作为药物使用的本发明第一或第二方面所述的抗体或其抗原结合片段、或本发明第三方面所述的组合物、或本发明第四方面所述的融合蛋白。
根据本发明的第六方面，提供了用于药物制备中的应用的本发明第一或第二方面所述的抗体或其抗原结合片段、或本发明第三方面所述的组合物、或本发明第四方面所述的融合蛋白。
根据本发明的第七方面，提供了用于治疗癌症的本发明第一或第二方面所述的抗体或其抗原结合片段、或本发明第三方面所述的组合物、或本发明第四方面所述的融合蛋白。
根据本发明的第八方面，提供了一种治疗癌症的方法，所述方法通过施用本发明第一或第二方面所述的抗体或其抗原结合片段、或本发明第三方面所述的组合物、或本发明第四方面所述的融合蛋白进行。
根据本发明的第九方面，提供了一种载体，其包含能够编码本发明第一或第二方面所述的抗体或其片段或者本发明第四方面所述的融合蛋白的核酸分子。
根据本发明的第十方面，提供了一种细胞，其包含本发明第八方面所述的载体。
根据本发明的第十一方面，提供了一种细胞，其能够产生如第一或第二方面所述的人白介素-2(hIL-2)特异性单克隆抗体或其抗原结合片段。
根据本发明的第十二方面，提供了一种产生单克隆抗体的杂交瘤细胞系，其特征在于，所述产生的抗体是本发明第一或第二方面所述的抗体或者本发明第三方面所述的融合蛋白。
根据本发明方面的抗体是有利的，例如因为它们具有一种或多种以下性质。当抗体结合hIL-2时，所得mAb*hIL-2复合物不再能有效结合人IL-2受体α(也称为CD25)，从而与人CD25和游离(未复合的)hIL-2的结合相比，有效地将人CD25与mAb*hIL-2的结合减少至背景水平(通过表面等离子体共振测量)。此外，抗体可能不会显示出可测量的与鼠IL-2交叉反应性。
附图说明
图1提供了实施例2中获得的
Figure BDA0003921317000000071
/Fab-NARA1复合物的三维结构的概览。
图2提供了对表位残基的进一步分析。X-轴列出了根据SEQ ID NO:110的氨基酸序列和编号。Y-轴的上侧显示了来自
Figure BDA0003921317000000072
的相应残基
Figure BDA0003921317000000073
之内的NARA1-Fab的原子的总数，Y轴的下侧显示由于与SEQ ID NO:132所示NARA1-Fab结合，来自
Figure BDA0003921317000000074
的相应残基的减少的溶剂可及面积
Figure BDA0003921317000000075
图3示出了NARA1-Fab识别的最关键的表位残基。
图4显示了
Figure BDA0003921317000000076
/NARA1-Fab复合物与IL-2/CD25/CD122/CD132四元复合物的叠加。
图5显示了IL-2_C145A(PDB:3INK)、D10 IL-2-突变蛋白("超级运动因子”:PDB:3QB1)、IL-2/CD25/CD122/CD132(PDB:2B5I)和
Figure BDA0003921317000000077
/NARA1-Fab的C螺旋的叠加。
图6显示了接受磷酸盐缓冲盐水(PBS)、低剂量人IL-2(IL-2LD)、高剂量人IL-2(IL-2HD)、或通过使用所示的单克隆抗体制备的IL-2/抗体复合物的小鼠脾脏免疫细胞的计数。数值显示在表14和15中。
图7显示了来自如图6处理的小鼠脾脏的CD8+CD44+CD122+T细胞的代表性溴脱氧尿苷(BrdU)图谱。
图8显示了来自如图6处理的小鼠脾脏的CD3-NK1.1+NK细胞的代表性BrdU图谱。
图9和图10是说明根据实施方式的融合蛋白的示意图。
图11示出了根据实施方式的融合蛋白的比对。
图12至15显示了根据实例，如图6中处理的小鼠脾脏的内源性CD8+T细胞、CD8+CD44+CD122+T细胞、CD4+T细胞、CD4+CD25高Foxp3+Treg细胞和CD3-NK1.1+NK细胞的表型表征。
图16和17显示了根据实例，如图6中处理的小鼠脾脏获得的免疫细胞亚群计数和CD8+CD44+T细胞与CD4+CD25高Foxp3+Treg细胞比。
图18至22显示了根据实例，如图6中处理的小鼠脾脏获得的CD8+、CD8+CD44+CD122+T细胞、CD3-NK1.1+DX5+NK细胞、CD4+T细胞和CD4+CD25+T细胞的代表性BrdU图谱。
图23显示了根据实例，接受PBS、融合蛋白L15、L20或L25、或者人IL-2/NARA1复合物的小鼠脾脏的内源性CD8+T细胞和NK细胞的表型特征。
图24显示了根据实例，如图23中处理的小鼠脾脏获得的指定的免疫细胞的细胞计数。
图25显示了根据实例，如图23中处理的小鼠脾脏CD8+CD44+CD122+T细胞和CD3-NK1.1+NK细胞的代表性BrdU图谱。
图26显示了根据实例，利用以滴定剂量的人IL-2/NARA1复合物的或人IL-2的融合蛋白L15、L20或L25刺激的CTLL-2细胞进行的体外实验的CTLL-2细胞生长曲线。
图27显示了根据实例，以滴定剂量的人IL-2的或融合蛋白L15、L20或L25的人IL-2/NARA1复合物刺激的CTLL-2细胞的STAT5磷酸化水平。
表格说明
表1是根据本发明实施方式的抗IL-2抗体的概况。
表2是根据本发明实施方式的IL-2突变蛋白的概况。
表3表示
Figure BDA0003921317000000091
/NARA1-Fab复合物的结构统计。
表4是根据本发明实施方式的表位和互补位的概况。
表5是根据本发明实施方式的可变重链区的概况。
表6是根据本发明实施方式的可变轻链区的概况。
表7包含一些实施方式的抗体的pI数据。
表8包含比较可变区和可变种系区。
表9包含根据本发明实施方式的结构细化的可变区。
表10包含根据本发明实施方式的可变轻链和可变重链的信息。
表11包含根据本发明实施方式的轻链CDR。
表12包含根据本发明实施方式的重链CDR。
表13包含根据本发明实施方式的最佳可变轻链和可变重链。
表14是VH突变序列的概况。
表15是VK突变序列的概况。
表16是质粒序列的概况。
表17是根据本发明实施方式的亲和力成熟的抗体的概况。
表18是第一组抗体的序列概况。
表19是实施例的ELISA值的概况。
表20是实施例的EC50值的概况。
表21是根据本发明实施方式的亲和力成熟的抗体的子集。
表22是表21的抗体子集的序列概况。
表23表示结合亲和力数据。
表24表示CD8+T细胞增殖数据。
表25表示CD8+T细胞和NK细胞增殖数据。
表26和表27表示细胞计数数据。
表28是根据本发明实施方式的接头序列的概况。
表29是根据本发明实施方式的融合蛋白的概况。
表30表示CD8+T细胞和NK细胞增殖数据。
表31表示CD8+T细胞、NK细胞和Treg细胞计数数据。
表32和表33表示细胞计数数据。
表34表示细胞计数比例数据。
表35和表36表示融合蛋白的轻链区域序列。
表37是融合蛋白的概况。
表38表示细胞计数数据。
表39和表40表示实施例的EC50值。
表41是用于实施本发明的序列的序列表。
具体实施方式
本公开涉及结合人IL-2并影响这种细胞因子的体内功能的抗体及其片段。
本文使用的“人白介素-2”或“hIL-2”是指具有UniProt ID号P60568的人IL-2(野生型或wt)，在本文中以SEQ ID NO:109再现。在本发明的各种实施方式中，还包括人野生型IL-2的变体、同种型和物种同源物。因此，本公开的抗体在某些情况下可与来自除人以外的物种的IL-2交叉反应。在某些实施方式中，抗体对于一种或多种人IL-2蛋白可以是完全特异性的，并且可能不显示物种或其他类型的非人类交叉反应性。
术语“突变蛋白”是指其中已经对白介素-2蛋白进行特定取代的多肽。在涉及施用模式和治疗而使用时，术语“IL-2突变蛋白”是指1种、2种、3种、4种或5种以上IL-2突变蛋白。例如，使用IL-2突变蛋白的治疗可以指用单一IL-2突变蛋白或多个IL-2突变蛋白的组合治疗。人IL-2的一个实例是WO2012/107417A1中公开的与wt hIL-2相比具有3个突变的IL-2突变蛋白。
Figure BDA0003921317000000101
(阿地白介素)是人wt IL-2的变体的另一个实例，本领域技术人员众所周知且本文由SEQ ID NO:110表示。
如本文所用，术语“抗体”或“IL-2的抗体”等指与IL-2表位相互作用(例如通过结合、空间位阻、稳定化/去稳定化、空间分布)并干扰IL-2与IL-2受体α(也称为CD25)的结合的完整抗体。天然存在的“抗体”是包含通过二硫键相互连接的至少两条重链(H)和两条轻链(L)的糖蛋白。每条重链由重链可变区(本文缩写为VH)和重链恒定区组成。重链恒定区由三个结构域CH1、CH2和CH3组成。每条轻链由轻链可变区(在本文中缩写为VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。VH和VL区还可以细分为高变区(称为互补决定区(CDR))，中间间隔着更保守的区域(称为框架区(FR))。每个VH和VL由3个CDR和4个FR构成，按照以下顺序从氨基末端至羧基末端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，所述因子包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(Clq)。术语“抗体”包括例如单克隆抗体、人抗体、人源化抗体、骆驼抗体或嵌合抗体。抗体可以是任何同种型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类(例如、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类。
轻链和重链都被分成结构和功能同源性的区域。术语“恒定”和“可变”用在功能方面。在这方面，应该理解的是，轻链(VL)和重链(CL)部分两者的可变结构域决定了抗原识别和特异性。相反，轻链(CL)和重链(CH1、CH2或CH3)的恒定结构域赋予重要的生物学特性，如分泌、跨胎盘移动、Fc受体结合和补体结合等。按照惯例，恒定区的编号随着它们越远离所述抗体的抗原结合位点或氨基末端而增加。N-末端是可变区，而在C-末端是恒定区；CH3和CL结构域实际上分别包含重链和轻链的羧基末端。特别地，术语“抗体”具体包括IgG-scFv形式。
如本文所用，术语抗体的“抗原结合部分”(或简称“抗原部分”)是指抗体(如蛋白)的全长或一个或多个片段，其保留特异性结合抗原或表位(如IL-2的一部分)的能力。
“互补决定区”(“CDR”)是氨基酸序列，其边界使用许多众所周知的方案中的任何一种确定，包括由Kabat等(1991)，“Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest”，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD(“Kabat”编号方案)、Al-Lazikani等人，(1997)JMB 273,927-948(“Chothia”编号方案)和ImMunoGenTics(IMGT)编号(Lefranc,M.-P.，Immunologist,7,132-136(1999)；Lefranc,M.-P.等,Dev.Comp.Immunol.,27,55-77(2003)(“IMGT”编号方案)所述的那些。例如，对于经典格式，遵循Kabat，所述重链可变域(VH)中的CDR氨基酸残基编号为31-35(HCDR1)、50-65(HCDR2)和95-102(HCDR3)；轻链可变域(VL)中的CDR氨基酸残基编号为24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)。遵循Chothia，VH中的CDR氨基酸编号为26-32(HCDR1)、52-56(HCDR2)和95-102(HCDR3)；并且VL中的氨基酸残基编号为26-32(LCDR1)、50-52(LCDR2)和91-96(LCDR3)。通过组合Kabat和Chothia两者的CDR定义，CDR由人VH中的氨基酸残基26-35(HCDR1)、50-65(HCDR2)和95-102(HCDR3)和人VL中的氨基酸残基24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)构成。遵循IMGT，VH中的CDR氨基酸残基编号大致为26-35(CDR1)、51-57(CDR2)和93-102(CDR3)，VL中的CDR氨基酸残基编号大致为27-32(CDR1)、50-52(CDR2)和89-97(CDR3)(根据“Kabat”编号)。遵循IMGT，抗体的CDR区可以使用程序IMGT/DomainGap Align确定。
术语“表位结合域”或“EBD”指抗原结合部分中与目标表位部分上的结合位点特异性相互作用(例如通过结合、空间位阻、稳定化/去稳定化、空间分布)的部分(例如抗体或其表位结合片段或其衍生物)。EBD也指抗体保留与IL-2表位特异性相互作用(例如通过结合、空间位阻、稳定化/去稳定化、空间分布)并干扰IL-2与IL-2受体α(CD25)的结合的能力的一个或多个片段。抗体片段的实例包括但不限于：scFv，Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域构成的单价片段；F(ab)2片段，包含由铰链区处的二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；由VH和CH1结构域组成的Fd片段；抗体单臂的VL和VH结构域构成的Fv片段；dAb片段(Ward等，(1989)Nature 341：544-546)，其由VH域组成；和分离的互补决定区(CDR)。
如本文所用的术语“表位”是指能够以高亲和力结合免疫球蛋白的任何决定簇。表位是特异性地靶向抗原的抗体所结合的抗原区域，并且当该抗原是蛋白质时包括与所述抗体直接接触的特定氨基酸。多数情况下，表位位于蛋白质上，但在某些情况下，可能位于其他种类的分子上，例如核酸。表位决定簇可能包括如氨基酸等分子、糖侧链、磷酰基或磺酰基的化学活性表面集群，并且可具有特定的三维结构特征和/或特定电荷特征。此外，尽管Fv片段的两个区域VL和VH由分开的基因编码，但可以使用重组方法将它们通过合成接头连接起来，使得它们能够被制成单一蛋白链，其中VL和VH区配对形成单价分子(称为单链Fv(scFv))，参见例如，Bird等，(1988)Science242:423-426；和Huston等，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85：5879-5883)。
这样的单链抗体也意图包括在术语“片段”、“表位结合片段”或“抗体片段”内。使用本领域技术人员已知的常规技术获得这些片段，并筛选片段将其按照与完整抗体相同的方式使用。
可以将抗体片段并入单链分子中，所述单链分子包含一对串联的Fv区段(VH-CH1-VH-CH1)，其与互补的轻链多肽一起形成一对抗原结合区(Zapata等，(1995)ProteinEng.8：1057-1062；和美国专利5,641,870号)，还包括Fab片段、F(ab')片段、F(ab')2片段和抗独特型(抗Id)抗体(包括，例如，针对本发明抗体的抗Id抗体)和上述任一种的表位结合片段。
如本领域已知的，EBD还包括单域抗体、最大抗体、单抗体、微抗体、三抗体、四抗体，v-NAR和双scFv(参见例如Hollinger和Hudson，(2005)Nature Biotechnology23：1126-1136)，双特异性单链双抗体或设计为结合两个不同表位的单链双抗体。EBD还包括抗体样分子或抗体模拟物，其包括但不限于特异性结合表位的微抗体、最大抗体、基于Fn3的蛋白支架、Ankrin重复(也称为DARpins)、VASP多肽、禽胰多肽(aPP)、四连环蛋白、Affililin、Knottins、SH3结构域、PDZ结构域、Tendamistat、新制癌菌素(Neocarzinostatin)、蛋白A结构域、脂质运载蛋白(Lipocalins)、转铁蛋白和Kunitz结构域，这些在本发明的范围内。抗体片段可以基于多肽如纤连蛋白III型(Fn3)(参见美国专利6,703,199号，其描述了纤连蛋白多肽单体)移植到支架中。
本文所用的短语“分离的抗体”是指基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体(例如，与IL-2特异性结合的分离抗体基本上不含特异性结合IL-2以外的抗原的抗体)。然而，与IL-2特异性结合的分离抗体可能与其他抗原如来自其他物种的IL-2分子具有交叉反应性。此外，分离的抗体可能基本上不含其他细胞材料和/或化学品。
如本文所用，术语“单价抗体”是指至少结合靶分子如IL-2上的单个表位的抗体。
如本文所用的术语“二价抗体”是指结合至少两个相同的IL-2靶分子上的两个表位的抗体。二价抗体还可以使靶IL-2分子彼此交联。“二价抗体”还指结合至少两个相同的IL-2靶分子上的两个不同表位的抗体。
术语“多价抗体”是指具有多于一价的单一结合性分子，其中“价”被描述为每个抗体构建体分子中存在的抗原结合部分的数目。因此，单一结合分子可以结合目标分子上对于一个的结合位点。多价抗体的实例包括但不限于二价抗体、三价抗体、四价抗体、五价抗体等，以及双特异性抗体和双补位抗体。例如，对于IL-2，多价抗体(例如IL-2双补位抗体)分别具有针对IL-2的两个区域的结合部分。
多价抗体介导生物效应或调节受试者中的疾病或病症(例如通过介导或促进细胞杀伤，或通过调节生物可利用的物质的量。
术语“多价抗体”还指对两个单独的IL-2靶分子具有超过一个抗原结合部分的单一结合性分子。例如，结合IL-2靶分子和非IL-2第二靶分子的抗体。在一个实施方式中，多价抗体是具有四个表位结合域的四价抗体。对于该靶分子上的每个结合位点，四价分子可以是双特异性的和二价的。
本文使用的术语“双补位抗体”是指结合单个IL-2靶标上两个不同表位的抗体。该术语还包括结合至少两个IL-2靶标的两个区域的抗体，例如四价双补位抗体。
如本文所用，术语“双特异性抗体”是指在结合至少两个不同靶标(例如，IL-2和非IL-2靶标)上的两个或更多个不同表位的抗体。
如本文所用，短语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”是指具有基本上相同的氨基酸序列或衍生自相同遗传来源的多肽，包括抗体，双特异性抗体等。该术语还包括单一分子组成的抗体分子的制备物。单克隆抗体组合物对特定表位显示单一结合特异性和亲和性。
如本文所用的术语“人源化抗体”或“人源化抗IL-2抗体”包括其中来源于另一种哺乳动物物种如小鼠的种系的CDR序列已经移植到人框架序列上的抗体。另外的框架区修饰可以在人框架序列内以及衍生自另一种哺乳动物物种的种系的CDR序列内产生。
本发明的人源化抗体可以包括不由人序列编码的氨基酸残基(例如通过体外随机或定点诱变或通过体内体细胞突变引入的突变，或保守取代以促进稳定性或制造)。
如本文所用，短语“重组人源化抗体”包括通过重组手段制备、表达、产生或分离的所有人抗体，诸如从经转化来表达人源化抗体的宿主细胞(例如从转染瘤)分离的抗体，和通过涉及所有或部分人免疫球蛋白基因序列剪接至其他DNA序列任何其他手段分离制备、表达、产生或分离的抗体。
如本文所用的术语“Fc区”是指包含抗体恒定区的部分CH3、CH2和至少一部分铰链区的多肽。可选地，Fc区可以包含存在于某些抗体种类中的CH4域。在一个实施方式中，本发明包含抗体的Fc区和CH1区。在一个实施方式中，本发明包含抗体的Fc区CH3区。在另一个实施方式中，本发明包含Fc区、CH1区和抗体恒定区的Cκ/λ区。在一个实施方式中，本发明的结合分子包含恒定区，例如重链恒定区。在一个实施方式中，与野生型恒定区相比，所述恒定区被修饰。也就是说，本文公开的本发明的多肽可以包含对重链恒定域(CH1、CH2或CH3)中一个或多个和/或对轻链恒定区域(CL)的改变或修饰。示例性修饰包括在一个或多个结构域中添加、删除或取代一个或多个氨基酸。可以包括这些改变以优化效应子功能，半衰期等。
如本文所用，术语“结合位点”包含IL-2靶分子上的区域，抗体或抗原结合片段选择性结合至该区域。
术语“融合蛋白”是两种分开的蛋白的融合物，其具有或不具有额外的接头序列。
术语“接头序列”是用于连接或接合两种蛋白质的氨基酸序列。
通常，对特定靶抗原特异性的抗体将结合在蛋白质和/或大分子的复合物混合物中的靶抗原上的表位。
如本文所用，术语“亲和力”是指在单个抗原位点处抗体和抗原之间相互作用的强度。在每个抗原位点处，所述抗体“臂”的可变区通过弱非共价力与抗原在多个位点处相互作用；相互作用越多，亲和力越强。如本文所用，对于IgG抗体或其片段(例如，Fab片段)的术语“高亲和力”是指抗体对靶抗原的KD为10-8M以下、10-9M以下、或10-10M、或10-11M以下，或10-12M以下、或10-13M以下。然而，对于其他抗体同种型，高亲和力结合可能有所变化。例如，IgM同种型的高亲和力结合是指抗体KD为10-7M以下，或10-8M以下。
如本文所用，术语“亲合力”是指所述抗体-抗原复合物的整体稳定性或强度的信息量度。其受到三个主要因素的控制：抗体表位亲和力；抗原和抗体的价态；以及相互作用部分的结构排列。这些因素最终确定了所述抗体的特异性，即特定抗体与精确抗原表位结合的可能性。
包含表位的给定多肽的区域可使用本领域众所周知的任何数量的表位绘图技术来鉴定。参见例如Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology,第66卷(Glenn E.Morris编著，1996)Humana Press,Totowa,N.J.。例如，线性表位可以通过下述方式来确定：例如在固体支持物上同时合成大量的肽，所述肽对应于蛋白质分子的一部分，并且在这些肽仍然与支持物连接的同时使所述肽与抗体反应。这些技术在本领域中是已知的并且在例如美国专利4,708,871号；Geysen等，(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8:3998-4002；Geysen等,(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:78-182；Geysen等，(1986)Mol.Immunol.23:709-715中描述。类似地，通过确定氨基酸的空间构象可以容易地鉴定构象表位，例如通过X射线晶体学和二维核磁共振。参见例如Epitope Mapping Protocols，同上。蛋白质的抗原区域也可使用标准抗原性和亲水性图来鉴定，例如使用例如可从OxfordMolecular Group获得的Omiga版本1.0软件程序计算的那些图。该计算机程序采用Hopp/Woods方法(Hopp等,(1981)Proc.Natl.Acad.Sci USA 78:3824-3828)用于确定抗原性图谱，以及Kyte-Doolittle技术(Kyte等,(1982)J.MoI.Biol.157:105-132)用于亲水性图。
如说明书和权利要求书中所使用，除非上下文另外明确指出，否则单数形式“一”、“一种”和“该”包括复数形式。例如，术语“一种细胞”包括多个细胞，包括其混合物。
所有的数字指定，例如pH、温度、时间、浓度和分子量(包括范围)都是近似值，其以0.1的增量变化(+)或(-)。尽管并非总是明确地说明，但应理解的是全部数字指称前置有术语“约”。尽管并非总是明确地说明，但是还应该理解的是，本文所述的试剂仅仅是实例，并且其等效物在本领域中是已知的。
如本文所用，术语“氨基酸”是指天然和/或非天然或合成氨基酸以及D和L光学异构体、氨基酸类似物和肽模拟物。如果肽链较短，则三个或更多个氨基酸的肽通常称为寡肽。如果肽链较长，则肽通常称为多肽或蛋白质。术语“生物标志物”或“标志物”在本文中可互换使用。生物标志物是核酸或多肽，并且存在或不存在该多肽的突变或差异表达用于确定对根据本发明的包含抗IL-2抗体的任何治疗的敏感性。例如，当蛋白与正常(非癌性)细胞或对照细胞中的相同蛋白质相比缺陷、突变、缺失时，或在翻译后修饰、生产、表达、水平、稳定性和/或活性方面下降时，该蛋白是癌细胞的生物标志物。
术语“cDNA”指互补DNA，即存在于细胞或生物体中的mRNA分子，其通过逆转录酶等酶成为cDNA。“cDNA文库”是存在于细胞或生物体中的所有mRNA分子的集合，均通过酶逆转录酶转化成cDNA分子，然后插入“载体”(其他DNA分子，在加入外源DNA后可继续复制)。文库的示例载体包括细菌噬菌体(也称为“噬菌体”)，感染细菌的病毒，例如λ噬菌体。然后可以对于该文库可以对感兴趣的cDNA(并因此mRNA)进行探测。
术语“细胞增殖性病症”应包括以异常细胞生长和/或分裂或功能丧失为特征的正常生理功能病症。“细胞增殖性病症”的实例包括但不限于增生、瘤形成、化生和各种自身免疫病症，例如以T细胞凋亡病症为特征的那些。
“组合”是指一种剂量单位形式中的固定组合或者是组合施用，所述组合施用中本发明化合物和组合伴用物(例如下文中解释的另一种药物，也称为“治疗剂”或“共作用试剂”)可以同时独立施用或者在时间间隔内单独施用，尤其是在这些时间间隔允许组合伴用物表现出联合效应(例如协同效应)。单一组分可以包装在试剂盒中或单独包装。一种或两种组分(例如粉末或液体)可以在施用前重构或稀释至所需剂量。本文使用的术语“共同施用”或“组合施用”等意指包括施用所选择的组合伴用物至有需要的单个受试者(例如患者)，并且旨在包括这样治疗方案：其中所述药剂不一定由相同的施用途径施用，或者在同时施用。本文使用的术语“药物组合”是指由多于一种活性成分混合或组合产生的产品，并且包括活性成分的固定和非固定组合。术语“固定组合”指的是活性成分(例如本发明化合物和组合伴用物)以单一实体或剂量的形式同时施用给患者。术语“非固定组合”是指活性成分(例如本发明化合物和组合伴用物)是作为分开的实体同时、共同或顺序地施用给患者并且没有特定的时间限制，其中，这种施用在患者体内提供了治疗有效水平的两种化合物。后者也适用于鸡尾酒疗法，例如施用三种或更多种活性成分。
“基因”是指含有至少一个能够在转录和翻译后编码特定多肽或蛋白质的开放阅读框(ORF)的多核苷酸。多核苷酸序列可以用来鉴定相关基因的更大的片段或全长编码序列。分离较大片段序列的方法是本领域技术人员已知的。
“基因表达”或者“基因产物”是指当基因被转录和翻译时产生的核酸或氨基酸(例如，肽或多肽)。
如本文所用，“表达”指将DNA转录成mRNA的过程和/或转录的mRNA随后翻译成肽、多肽或蛋白质的过程。如果多核苷酸来源于基因组DNA，则表达可包括mRNA在真核细胞中的剪接。
对基因所应用的“差异表达”是指由该基因转录和/或翻译的mRNA或由该基因编码的蛋白质产物的差异生产。与正常或对照细胞的表达水平相比，差异表达基因可以为过表达或低表达(under expressed)。然而，如本文所用，过表达是基因表达的增加，通常是超过正常或对照对应细胞或组织中检测到的表达至少1.25倍、或至少1.5倍、或至少2倍、或至少3倍、或者至少4倍。如本文所用，低表达是基因表达的降低，通常是低于正常或对照对应细胞或组织中检测到的表达至少1.25倍、或至少1.5倍、或至少2倍、或至少3倍、或者至少4倍。术语“差异表达”还指在癌细胞或癌组织中表达可检测到，但在对照细胞或正常组织(例如非癌细胞或组织)中的表达不可检测。
由于基因的过表达或基因拷贝数的增加，可能出现基因高表达水平。由于负调节因子的病症或缺乏，该基因也可以翻译成蛋白水平增加。最后，可能由于蛋白质稳定性增加或降解减少而发生基因高表达，导致蛋白质的积累。
如本文所用，术语癌症细胞的“抑制”、“阻止”或“抑制生长”或“抑制增殖”是指减缓、中断、阻止或终止癌细胞的生长，并且不一定指示癌细胞生长的完全消除。术语“抑制”或“阻止”等表示两种状态之间的定量差异；至少指两种状态之间的统计学显著性差异。例如，“抑制癌细胞的生长的有效量”是指细胞的生长速率与未处理的细胞在统计学上显著不同。这些术语在此用于例如细胞增殖速率。
术语“分离的”是指与其中多核苷酸、肽、多肽、蛋白质、抗体或其片段通常在自然状态下与其相关的组分、细胞和其他物质分离。例如，分离的多核苷酸与3'和5'连续核苷酸分离，分离的多核苷酸在天生或天然环境中例如在染色体上与3'和5'连续核苷酸通常结合。如本领域技术人员显而易见的，非天然存在的多核苷酸、肽、多肽、蛋白质、抗体或其片段不需要“分离”以将其与其天然存在的对应物区分开。此外，“浓缩的”、“分离的”或“稀释的”多核苷酸、肽、多肽、蛋白质、抗体或其片段与其天然存在的对应物的区别在于，每单位体积的分子浓度或数量在“浓缩”版本中更大，而在“分离的”版本中小于其天然存在的对应物。
如本文所用，术语“赘生细胞”、“赘生性疾病”、“赘生瘤形成”、“肿瘤”、“肿瘤细胞”、“癌症”和“癌细胞”(可互换使用)是指展示出相对自主生长从而其表现出以细胞增殖控制显著失控(即，失调的细胞分裂)为特征的异常生长表型的细胞。赘生细胞可以是恶性的或良性的。“转移性细胞或组织”意指细胞可以入侵和摧毁邻近的身体结构。
术语“核酸”和“多核苷酸”可互换使用，并指任何长度的核苷酸(脱氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸或者其类似物)的聚合形式。多核苷酸可以具有任何三维结构并且可以执行任何功能。以下是多核苷酸的非限制性实例：基因或基因片段(例如探针、引物、EST或SAGE标签)、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转移RNA、核糖体RNA、核酶、cDNA、重组多核苷酸、分支的多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA、任何序列的分离的RNA、核酸探针、siRNA、shRNA、RNAi试剂和引物。多核苷酸可以在一个或多个碱基、糖和/或磷酸酯处以本文所述或本领域已知的任何各种修饰或取代进行修饰或取代。多核苷酸可以包含修饰的核苷酸，例如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物。如果存在，可以在聚合物组装之前或之后对核苷酸结构进行修饰。核苷酸序列可以被非核苷酸组分阻断。多聚核苷酸可以在聚合后修饰，例如通过与标记组分偶联。该术语也指是双链和单链分子。除非另有说明或要求，否则本发明作为多核苷酸的任何实施方式包括双链形式和已知或据预测构成双链形式的两种互补单链形式中的每一种。
术语“多肽”与术语“蛋白质”可互换使用，并且在其最广义上指两个或更多个亚基氨基酸、氨基酸类似物或肽模拟物的化合物。所述亚基可以通过肽键连接。在另一个实施方式中，亚基可以通过其他键例如酯、醚等连接。
多核苷酸或多核苷酸区域(或、多肽或多肽区域)与另一个序列具有某一百分比(例如，80％、85％、90％、95％、98％或99％)的“序列同一性”意味着当比对时，所述百分比的碱基(或氨基酸)在比较两个序列时相同。该比对和百分比同源性或序列同一性可以使用本领域已知的软件程序来确定，例如Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel等编辑，(1987)增刊30，第7.7.18节，表7.7.1)中所述的程序。优选地，使用默认参数进行比对。优选的比对程序是BLAST，使用默认参数。特别是，优选程序是BLASTN和BLASTP，使用以下默认参数：遗传密码＝标准(standard)；过滤＝无(none)；链＝两种(both)；截止＝60；期望＝10；矩阵＝BLOSUM62；描述＝50个序列(50sequences)；排序＝高分(HIGH SCORE)；数据库＝非冗余(non-redundant)。
肿瘤生长的“抑制”或“阻遏”表明与不接触根据本发明化合物的抗IL-2抗体的肿瘤生长相比，当与本发明抗IL-2抗体接触时肿瘤细胞生长减少。肿瘤细胞生长可以通过本领域已知的任何方式评估，包括但不限于测量肿瘤大小、使用3H-胸苷掺入测定确定肿瘤细胞是否增殖、通过FDG-PET(氟脱氧葡萄糖正电子发射断层摄影术)成像、或计数肿瘤细胞。“抑制”肿瘤细胞生长是指任何或所有以下状态：减缓、延迟和停止肿瘤生长以及肿瘤缩小。“受试者”、“个体”或“患者”在本文可互换使用，其指至少脊椎动物，优选哺乳动物，更优选人。哺乳动物包括但不限于小鼠、猿猴、人、农场动物、体育运动动物和宠物。
抗IL-2抗体
在第一方面，本发明提供了结合人IL-2的分离的抗体或其抗原结合部分，其中，所述抗体或其抗原结合部分包含：如表11所示的含LCDR1、LCDR2和LCDR3的轻链可变区，和如表12所示的含HCDR1、HCDR2和HCDR3的重链可变区。
在一些实施方式中，分离的抗体或其抗原结合部分包含如表6或表10所示的轻链可变区，和如表5或表10所示的重链可变区。
在一些实施方式中，分离的抗体包含如表10或表13所示的可变轻链和可变重链。
在另一方面，本发明提供了结合人IL-2的抗体或其片段的变体。因此本发明提供了这样的抗体或其片段：其重链和/或轻链可变区序列的非CDR区的氨基酸序列分别与表5和表6中的例如重链和轻链可变区序列的重链或轻链的亲本抗体的重链和/或轻链可变区序列的非CDR区的氨基酸序列具有至少80％的同一性(具有至少80％氨基酸序列同一性)。本发明还提供了这样的抗体或其片段：其重链和/或轻链可变区序列的非扩展CDR区的氨基酸序列与重链或轻链的亲本抗体的重链和/或轻链可变区序列的非扩展CDR区的氨基酸序列具有至少80％的同一性。优选地，重链和/或轻链可变区序列的非CDR区或非扩展CDR区的氨基酸序列同一性为至少85％，更优选至少90％和最优选至少95％，特别是96％，更特别97％，甚至更特别98％，最特别99％，例如包括80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％和100％。
本公开还提供了结合人IL-2的抗体或其片段，其进一步包含重链和/或轻链恒定区，特别是人重链和/或人轻链恒定区。人重链恒定区可以选自由IgG 1(IGHG 1)、IgG2(IGHG2)、IgG3(IGHG3)、IgG4(IGHG4)、IgAI(IGHAl)、IgA2(IGHA2)、IgM(IGHM)、IgD(IGHD)或IgE(lGHE)组成的人免疫球蛋白的组，其中优选人重链恒定区IgG，特别是IgG 1(IGHG 1)。人轻链恒定区可以选自由κ或λ恒定区组成的人免疫球蛋白的组，其中优选人κ恒定区。在优选的实施方式中，所述结合人IL-2的抗体或其片段包含人IgG 1(IGHG 1)重链恒定域和人轻链κ恒定域。
作为框架区或CDR区内进行的修饰的补充或替代，本发明的抗体可以经工程化以包括Fc区内的修饰，通常用以改变所述抗体的一种或多种功能性质，例如血清半衰期、补体结合、Fc受体结合和/或抗原依赖性细胞毒性。
此外，本发明的抗体可以被化学修饰(例如，可以将一个或多个化学部分连接至所述抗体)或被修饰以改变其糖基化。
本发明提供了用于特异性结合人IL-2的抗体，其导致体内半衰期的改变。
许多因素可能影响蛋白质在体内的半衰期。例如，肾过滤、肝中代谢、蛋白水解酶(蛋白酶)降解和免疫原性反应(例如抗体的蛋白质中和、巨噬细胞和树突细胞摄取)。可以使用各种策略来延长本发明的抗体和其抗原结合片段的半衰期。例如，通过化学连接至聚乙二醇(PEG)、reCODE PEG、抗体支架、聚唾液酸(PSA)、羟乙基淀粉(HES)、白蛋白结合配体和糖屏蔽物(carbohydrate shield)；通过与结合血清蛋白(例如白蛋白、IgG、FcRn)的蛋白质融合并转移；通过(基因或化学方式)偶联至结合血清蛋白的其他结合部分，例如作为纳米抗体、Fab、DARPin、avimer、亲和体和抗运载体；通过基因融合至rPEG、白蛋白、白蛋白结构域、白蛋白结合蛋白和Fc；或通过掺入纳米载体、缓释制剂或医学器械中。
为了延长抗体的体内血清循环，可以将惰性聚合物分子(例如高分子量PEG)通过以下方式连接至抗体或其片段(具有或不具有多功能接头)：使PEG定点缀合至抗体N或C末端，或者通过赖氨酸残基上存在的ε-氨基。为了使所述抗体聚乙二醇化，抗体或其抗原结合片段通常在一个或多个PEG基团与所述抗体连接的条件下与聚乙二醇(PEG)例如PEG的反应性酯或醛衍生物反应。聚乙二醇化(pegylation)可通过与反应性PEG分子(或类似的反应性水溶性聚合物)的酰化反应或烷基化反应进行。如本文所用，术语“聚乙二醇”旨在涵盖已经用于衍生其它蛋白质的任何形式的PEG，例如单(C1-C10)烷氧基-聚乙二醇或芳氧基-聚乙二醇或聚乙二醇-马来酰亚胺。在一个实施方式中，要聚乙二醇化的抗体是非糖基化抗体。将使用导致生物活性损失最小的直链或直链聚合物衍生化。可通过SDS-PAGE和质谱严密监测缀合度，以确保将PEG分子正确缀合至抗体。未反应的PEG可通过尺寸排阻或通过离子交换色谱与抗体-PEG缀合物分离。可使用本领域技术人员已知的方法测试PEG衍生的抗体的结合活性以及体内功效，例如通过本文所述的免疫测定方法。本领域已知用于聚乙二醇化蛋白质的方法，并且可以应用于本发明的抗体和其抗原结合片段。例如见Nishimura等的EP0154316和Ishikawa等的EP0401384，其每一篇通过引用并入本文。
其他改进的聚乙二醇化技术包括重构化学正交定向工程技术(ReCODE PEG)，该技术通过包含tRNA合成酶和tRNA的重构系统将化学特定的侧链结合到生物合成蛋白中。该技术能够将超过30种新氨基酸并入大肠杆菌、酵母和哺乳动物细胞中生物合成的蛋白中。tRNA将正规氨基酸合并到琥珀密码子定位的任何位置，将琥珀密码子从终止密码子转化为信号掺入化学指定的氨基酸的密码子。
重组聚乙二醇化技术(rPEG)也可用于血清半衰期延长。该技术涉及将300至600个氨基酸的非结构化蛋白质尾部遗传融合至现有药物蛋白质中。由于这种非结构化蛋白质链的表观分子量比其实际分子量大了约15倍，蛋白质的血清半衰期大大增加。与传统的需要化学缀合和再纯化的聚乙二醇化相反，所述制造过程大大简化，并且产物均匀。
聚唾液酸化(polysialylation)是另一种技术，使用天然聚合物聚唾液酸(PSA)来延长治疗性肽和蛋白质的活性寿命并提高治疗性肽和蛋白质的稳定性。PSA是唾液酸(一种糖)的聚合物。当用于蛋白质和治疗性肽药物递送时，聚唾液酸对缀合提供了保护性微环境。这增加了治疗蛋白质在循环中的活性寿命，并防止其被免疫系统识别。PSA聚合物天然存在于人体内。它被某些进化数百万年的细菌采用来将其涂在细胞壁上。这些天然的聚唾液酸化细菌因此能够凭借分子模仿来击穿身体的防御系统。PSA是自然界的终极隐形技术，可以很容易地由这些细菌大量产生并具有预定的物理特性。细菌PSA是完全非免疫原性的，即使与蛋白质偶联时也是如此，因为它在人体内与PSA在化学上相同。
另一项技术包括使用与抗体连接的羟乙基淀粉(“HES”)衍生物。HES是衍生自蜡质玉米淀粉的改性天然聚合物，并且可以被体内的酶代谢。HES溶液通常施用以替代不足的血容量和改善血液的流变学特性。抗体的HES化(hesylation)通过增加分子的稳定性以及通过减少肾清除率来延长循环半衰期，从而导致生物活性增加。通过改变不同的参数，例如HES的分子量，可以定制多种HES抗体缀合物。
体内半衰期增加的抗体也可以通过在IgG恒定域或FcRn结合其片段(优选为Fc或铰链Fc结构域片段)中引入一个或多个氨基酸修饰(即，取代、插入或缺失)来产生。参见例如国际公开号WO 98/23289；国际公开号WO 97/34631；和美国专利6,277,375号，其每一篇通过引用并入本文。
此外，抗体可以与白蛋白缀合以便使所述抗体或抗体片段在体内更稳定或具有更长的体内半衰期。该技术是本领域众所周知的，参见例如国际公开号WO 93/15199，WO 93/15200和WO 01/77137；以及欧洲专利EP 413622号，其每一篇通过引用并入本文。
用于增加半衰期的策略在纳米抗体、基于纤连蛋白的结合物和其他需要增加体内半衰期的抗体或蛋白质中特别有用。
在另一个实施方式中，修饰所述抗体以增加其生物半衰期。各种方法都是可行的。例如，可以引入如Ward的美国专利6,277,375号(通过引用并入本文)所述的一个或多个以下突变：T252L、T254S、T256F。作为另选，为了增加生物半衰期，所述抗体可以在CH1或CL区内改变，以包含Presta等人的美国专利5,869,046和6,121,022号(通过引用并入本文)中描述的取自IgG的Fc区的两个CH2域的环的补救受体结合位点。
在一个实施方式中，本发明的抗体包含表1所示的轻链和重链。
表1.一个实施方式的抗体的重链和轻链SEQ ID No
抗体 轻链SEQ ID 重链SEQ ID
104343 SEQ ID NO:124 SEQ ID NO:126
104348 SEQ ID NO:128 SEQ ID NO:130
1.核酸、载体和宿主细胞
本发明还涉及表达本发明抗IL-2抗体或其部分的细胞系。产生本发明抗体的细胞系的产生和分离可以使用本领域已知的标准技术完成。优选CHO细胞系(可获得自公共库如ATCC(美国典型培养物保藏中心，马纳萨斯，VA))。
可以使用多种宿主表达系统来表达本发明的抗体，包括原核和真核表达系统(如酵母、杆状病毒、植物、哺乳动物和其他动物细胞、转基因动物和杂交瘤细胞)以及噬菌体展示表达系统。合适的细菌表达载体的一个实例是pUC119，并且合适的真核表达载体是具有减弱的dhfr选择系统的经修饰的pcDNA3.1载体。其他抗体表达系统在本领域中也是已知的。
如本领域技术人员所熟知，本发明的抗体可以通过在宿主细胞中重组表达免疫球蛋白轻链和重链基因来制备。为了重组表达抗体，宿主细胞用一个或多个携带编码所述抗体的免疫球蛋白轻链和/或重链的DNA片段的重组表达载体转化、转导或感染，从而使轻链和/或重链在宿主细胞中表达。重链和轻链可以在相同或不同的宿主细胞中表达。优选地，重组抗体分泌到培养宿主细胞的培养基中，从中可以回收或纯化抗体。
使用标准重组DNA方法学来获得抗体重链和轻链基因，将这些基因整合到重组表达载体中并将载体导入宿主细胞。这种标准重组DNA技术描述于例如Green和Sambrook(编)，Molecular Cloning；A Laboratory Manual，第4版，Cold Spring Harbor，NY，2012。
在一个实施方式中，本发明提供了一种载体，优选(但不限于)质粒、重组表达载体、酵母表达载体或逆转录病毒表达载体，其包含编码本发明抗IL-2抗体的多核苷酸。载体中的编码区可通过任何大小或内容的接头序列分开，优选地当存在所述接头时，其是编码内部核糖体进入位点的多核苷酸。
为了表达本发明的抗体，将表41中所述的编码部分氨基酸链的DNA插入到表达载体中，使得该基因可操作地连接至转录和翻译控制序列。表达载体和表达控制序列选择与所用表达宿主细胞相容。此外，重组表达载体可编码促进抗IL-2抗体轻链和/或重链从宿主细胞分泌的信号肽。抗IL-2抗体轻链和/或重链基因可以克隆到载体中，使得信号肽与抗体链基因的氨基末端符合框地可操作地连接。信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或异源信号肽。
为了表达轻链和/或重链，通过标准技术例如电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖转染、转导和感染等将编码重链和/或轻链的表达载体引入宿主细胞中。尽管理论上可在原核或真核宿主细胞中表达本发明的抗体，但是优选真核细胞，最优选哺乳动物宿主细胞，因为此类细胞更有可能组装和分泌适当折叠的免疫活性抗体。
用于表达本发明重组抗体的优选哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)，例如在Urlaub和Chasin，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216-20,1980中所述。当将编码抗体基因的重组表达载体导入哺乳动物宿主细胞中时，通过培养宿主细胞一段时间来产生抗体，所述时间足以允许所述抗体在宿主细胞中表达，或更优选允许所述抗体分泌到培养基中，其中宿主细胞在本领域已知的适当条件下生长。抗体可以使用标准纯化方法从宿主细胞和/或培养基中回收。
IL-2变体
在本发明的某些实施方式中，使用野生型(wt)的人IL-2。它具有UniProt ID号P60568并且再现为SEQ ID NO:109。人IL-2的另一个实例是WO2012/107417A1公开的IL-2突变蛋白，其与wt hIL-2相比具有3个突变。阿地白介素(商品名
Figure BDA0003921317000000241
)是本领域技术人员公知的人IL-2变体的另一个实例，本文通过SEQ ID NO:110表示。IL-2变体的其他实例是如表2所示的非α突变蛋白和IL-2超级运动因子(superkine)。
表2.IL-2突变蛋白
Figure BDA0003921317000000242
IL-2/抗IL-2抗体组合
在一个实施方式中，如上所述的抗体或其抗原结合部分与如上所述的人IL-2或IL-2突变体组合。
该组合可以是具有1:1、2:1或其他比例的IL-2:抗体结合位点的预制混合物。
在一个实施方式中，抗IL-2抗体和IL-2以以下顺序施用：首先注射抗体，随后注射抗IL-2抗体/IL-2组合。
在另一个实施方式中，抗IL-2抗体和IL-2以以下顺序施用：首先注射抗IL-2抗体/IL-2组合，随后注射IL-2。
药物组合物
本公开的药物组合物也可以在组合疗法中施用，即，与其他药剂组合物施用。例如，组合疗法可以包括与至少一种其他抗炎或另一种化学治疗剂组合的本公开的抗IL-2抗体或其片段。可以用于组合疗法的治疗剂的实例在下面在关于组合疗法的部分中更详细地描述。
如本文所用，“药学上可接受的载体”包括生理学相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗菌和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。载体应该适用于静脉内、肌肉内、皮下、胃肠外、脊柱或表皮施用(例如通过注射或输注)。在一个实施方式中，载体应该适用于皮下途径。取决于施用途径，活性化合物，即抗体、免疫偶联物、或双特异性分子可以涂覆在材料中以保护化合物免受可能使化合物失活的酸和其他自然条件的作用。
本公开的药物组合物可以包括一种或多种药学上可接受的盐。“药学上可接受的盐”是指保留母体化合物的期望生物学活性并且不赋予任何不希望的毒理学作用的盐(参见例如，Berge,S.M.等，1977，J.Pharm.Sci.66：1-19)。这些盐的实例包括酸加成盐和碱加成盐。酸加成盐包括衍生自无毒无机酸，如盐酸、硝酸、磷酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸和磷酸等的盐，以及衍生自无毒有机酸如脂族单羧酸和二羧酸、苯基取代的链烷酸、羟基链烷酸、芳族酸、脂族和芳族磺酸等的盐。碱加成盐包括衍生自碱土金属如钠、钾、镁和钙的盐，以及衍生自无毒有机胺如N,N'-二苄基乙二胺、N-甲基葡糖胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺和普鲁卡因等的盐。
本公开的药物组合物还可以包含药学上可接受的抗氧化剂。药学上可接受的抗氧化剂的实例包括：水溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸、半胱氨酸盐酸盐、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠和亚硫酸钠等；油溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基化羟基茴香醚(BHA)、丁基化羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯和α-生育酚等；和金属螯合剂，如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸和磷酸等。
可用于本公开的药物组合物中的合适的水性和非水性载体的实例包括：水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和聚乙二醇等)及其合适的混合物、植物油(如橄榄油)和注射用有机酯(如油酸乙酯)。通过例如使用包衣材料如卵磷脂、通过在分散体的情况下维持所需的粒度以及通过使用表面活性剂，可以维持适当的流动性。
这些组合物还可以含有佐剂，例如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。通过灭菌程序和通过包含各种抗细菌剂和抗真菌剂(例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚山梨酸等)可以确保防止微生物的存在。也可以希望在组合物中包括等渗剂，例如糖和氯化钠等。此外，可注射的药物形式的延长吸收可以通过包括延缓吸收的试剂如单硬脂酸铝和明胶来实现。
药学上可接受的载体包括无菌水溶液或分散液和用于即时制备无菌注射溶液或分散体的无菌粉末。此类介质和药剂用于药物活性物质的用途是本领域已知的。除了任何常规介质或试剂与活性化合物不相容，否则考虑其在本公开的药物组合物中的使用。也可以将辅助活性化合物掺入到组合物中。
在制造和储存条件下，治疗组合物通常必须是无菌和稳定的。组合物可以配制成适合高药物浓度的溶液、微乳液、脂质体或其它有序结构。载体可以是含有例如以下的溶剂或分散介质：水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适的混合物。例如，通过使用涂层例如卵磷脂、通过在分散的情况下维持所需的粒度、和通过使用表面活性剂，可以维持适当的流动性。在许多情况下，可以在组合物中包括等渗剂，例如糖、多元醇如甘露醇、山梨糖醇或氯化钠。通过在组合物中包含延迟吸收的试剂例如单硬脂酸盐和明胶，可以实现注射组合物的延时吸收。
关于稳定蛋白(例如抗体)制剂开发的综述可见Cleland等，1993，Crit.Reviews.Ther.Drug Carrier Systems 10(4)：307-377和Wei Wang 1999，Int.J.Pharmaceuticals185:129-88。关于抗体的额外制剂讨论可以见例如Daugherty和Mrsny 2006,Advanced Drug Delivery Reviews 58:686-706；美国专利6,171,586、4,618,486号、美国公开20060286103号、PCT公开WO 06/044908、WO 07/095337、WO 04/016286、Colandene等，2007,J.Pharm.Sci 96:1598-1608；Schulman 2001,Am.J.Respir.Crit.CareMed.164:S6-S11和其他已知的参考文献，每篇文献都通过引用并入。
用于皮内或皮下应用的溶液或悬浮液通常包括一种或多种以下组分：无菌稀释剂，如注射用水、盐水溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；抗菌剂，如苄醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂如乙二胺四乙酸；缓冲剂如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；和调节张力的试剂如氯化钠或右旋糖。可用酸或碱调节pH，如盐酸或氢氧化钠。这些制剂可以封装在安瓿、一次性注射器或由玻璃或塑料制成的多剂量小瓶中。
可通过将所需量的活性化合物与上述一种或一组成分(如需要)一起掺入适当的溶剂中，然后进行无菌微滤来制备无菌注射用溶液。一般而言，通过将本公开的抗体或蛋白引入含有基本分散介质和来自上面列举的那些所需的其他成分的无菌载体中来制备分散液。在用于制备无菌注射溶液的无菌粉末的情况下，制备方法是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，从其先前无菌过滤的溶液中得到活性成分加任何另外的所需成分的粉末。
在一个特定的实施方式中，根据本公开的抗体作为小瓶中的液体制剂施用。每个小瓶的药物量为150mg。液体含有150mg/mL的抗体、4.8mM的L-组氨酸、15.2mM的L-组氨酸-HCl、220mM蔗糖和0.04％聚山梨醇酯20，pH 6.0±0.5。加入20％溢出量以允许完全除去预期剂量。
治疗剂和其他应用
本发明的抗体具有众多的体外和体内诊断和治疗用途，涉及诊断和治疗与IL-2依赖性病理生理学相关的病症。例如，这些分子可以体外或离体施用至培养中的细胞，或者施用至人类受试者，例如用以体内治疗、预防和诊断与IL-2依赖性病理生理学相关的各种病症。
因此，在一个实施方式中，本发明提供了抑制受试者体内肿瘤细胞生长的方法，所述包括向受试者施用治疗有效量的如本文所公开的抗IL-2抗体。在一个实施方式中，该方法适合于体内治疗癌症。在一个实施方式中，抗IL-2抗体与IL-2一起施用，例如与IL-2组合施用。
当IL-2抗体与一种或多种药剂以组合方式施用时，所述组合可以以任何顺序施用或同时施用。
另一方面，提供了治疗受试者的方法，例如降低或改善受试者的增殖性病况或病症(例如癌症)，例如实体瘤、软组织肿瘤或转移性病变的方法。
术语癌症意指包括所有类型的癌性生长或致癌过程、转移性组织或恶性转化的细胞、组织或器官，不论组织病理学类型或侵袭阶段如何。癌症病症的实例包括但不限于实体瘤、软组织肿瘤和转移性病灶。实体瘤的实例包括各种器官系统的恶性肿瘤，例如肉瘤、腺癌和癌，例如影响肝、肺、乳腺、淋巴、胃肠(例如结肠)、泌尿生殖道(例如肾，尿道上皮细胞)、前列腺和咽的那些恶性肿瘤。腺癌包括恶性肿瘤，如大多数结肠癌、直肠癌、肾细胞癌、肝癌、非小细胞肺癌、小肠癌和食道癌。在一个实施方式中，癌症是黑色素瘤，例如晚期黑色素瘤。上述癌症的转移性病变也可以使用本发明的方法和组合物治疗或预防。
使用本文公开的抗体分子可抑制其生长的示例性癌症包括通常对免疫疗法有反应的癌症。用于治疗的优选癌症的非限制性实例包括黑色素瘤(例如转移性恶性黑色素瘤)、肾癌(例如透明细胞癌)、前列腺癌(例如激素难治性前列腺癌)、乳腺癌、结肠癌和肺癌(例如非小细胞肺癌)。此外，可以使用本文所述的抗体分子治疗难治性或复发性恶性肿瘤。
可以治疗的其他癌症的实例包括骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头或颈癌、皮肤或眼内恶性黑色素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛门癌、胃食管癌、胃癌、睾丸癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、慢性或急性白血病(包括急性骨髓性白血病、慢性粒细胞性白血病白血病、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞性白血病、包括急性骨髓性白血病、慢性粒细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞性白血病)、儿童实体瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)肿瘤、原发性CNS淋巴瘤、肿瘤血管生成、脊柱轴肿瘤、脑干胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西肉瘤、表皮样癌、鳞状细胞癌、T细胞淋巴瘤、环境诱导的癌症、包括那些由石棉诱导的癌以及所述癌症的组合。
在其他实施方式中，癌症是血液恶性肿瘤或癌症，包括但不限于白血病或淋巴瘤。例如，抗IL-2疗法可用于治疗癌症和恶性肿瘤，包括但不限于例如急性白血病，包括但不限于例如B细胞急性淋巴性白血病(“BALL”)、T细胞急性淋巴性白血病(“TALL”)、急性淋巴性白血病(ALL)；一种或多种慢性白血病，包括但不限于例如慢性骨髓性白血病(CML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)；另外的血液学癌症或血液学病况，包括但不限于例如B细胞幼淋巴细胞性白血病、胚细胞浆细胞样树突状细胞瘤、伯基特氏淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、毛细胞白血病、小细胞或大细胞滤泡性淋巴瘤、恶性淋巴增殖性病况、MALT淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常和骨髓增生异常综合征、非霍奇金淋巴瘤、浆母细胞淋巴瘤、浆细胞样树突状细胞瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症和“白血病前期”，其为由髓样血细胞的无效产生(或发育不良)联合在一起的血液学状况的多样性集合；等等。在一些实施方式中，淋巴瘤(例如间变性大细胞淋巴瘤或非霍奇金淋巴瘤)具有或被鉴定为具有ALK易位，例如EML4-ALK融合。
在一个实施方式中，癌症选自肺癌(例如，非小细胞肺癌(NSCLC)(例如具有鳞状和/或非鳞状组织学的NSCLC))、黑色素瘤(例如晚期黑色素瘤)、肾癌(例如肾细胞癌，例如透明细胞肾细胞癌)、肝癌、骨髓瘤(例如多发性骨髓瘤)、前列腺癌、乳腺癌(例如，不表达一种、两种或全部雌激素受体、孕酮受体或Her2/neu的乳腺癌，例如三阴性乳腺癌)、结肠直肠癌、胰腺癌、头颈癌(例如头和颈鳞状细胞癌(HNSCC)、肛门癌、胃食管癌、甲状腺癌、宫颈癌、淋巴增生性疾病(例如移植后淋巴增殖性疾病)或血液癌症、T细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤或白血病(例如骨髓性白血病)。
在另一个实施方式中，癌症选自癌(例如晚期或转移性癌)、黑色素瘤或肺癌，例如非小细胞肺癌。
在一个实施方式中，癌症是肺癌，例如非小细胞肺癌(NSCLC)。在某些实施方式中，肺癌如非小细胞肺癌具有或被鉴定为具有ALK重排或易位，例如ALK融合，例如EML4-ALK融合。
在另一个实施方式中，癌症是炎症性肌纤维母细胞瘤(IMT)。在某些实施方式中，炎性肌纤维母细胞瘤具有或被鉴定为具有ALK重排或易位，例如ALK融合，例如EML4-ALK融合。
在其他实施方式中，癌症是NSCLC，其中NSCLC的特征在于表皮生长因子受体(EGFR)的异常活化、扩增或突变中的一种或多种。在某些实施方式中，所述癌症是NSCLC，其中NSCLC的特征在于携带EGFR外显子20插入、EGFR外显子19缺失、EGFR L858R突变、EGFRT790M或其任何组合。在一些实施方式中，NSCLC的特征在于包含EGFR外显子20插入和EGFR的T790M突变。在一些实施方式中，NSCLC的特征在于携带EGFR外显子19缺失和EGFR的T790M突变。在一些实施方式中，NSCLC的特征在于携带选自由外显子20插入、外显子19缺失、L858R突变、T790M突变及其任何组合组成的组的EGFR突变。
在又一个实施方式中，癌症是神经母细胞瘤。
在某些实施方式中，神经母细胞瘤具有或被鉴定为具有ALK重排或易位，例如ALK融合，例如EML4-ALK融合。本文公开的方法和组合物可用于治疗与前述癌症相关的转移性病变。
在另一个实施方式中，癌症是具有或没有病毒感染(例如慢性病毒性肝炎)的肝癌，例如晚期肝癌。
在另一个实施方式中，癌症是前列腺癌，例如晚期前列腺癌。
在又一个实施方式中，癌症是骨髓瘤，例如多发性骨髓瘤。
在又一个实施方式中，癌症是肾癌，例如肾细胞癌(RCC)(例如，转移性RCC或透明细胞肾细胞癌)。
在一个实施方式中，癌症是黑色素瘤，例如晚期黑色素瘤。在一个实施方式中，癌症是对其他疗法无反应的晚期或无法切除的黑色素瘤。在其他实施方式中，癌症是伴有BRAF突变(例如BRAF V600突变)的黑色素瘤。
在另一个实施方式中，癌症是炎性肌纤维母细胞瘤(IMT)。在某些实施方式中，炎性肌纤维母细胞瘤具有或被鉴定为具有ALK重排或易位，例如ALK融合，例如EML4-ALK融合。
在又一个实施方式中，癌症是神经母细胞瘤。在某些实施方式中，神经母细胞瘤具有或被鉴定为具有ALK重排或易位，例如ALK融合，例如EML4-ALK融合。本文公开的方法和组合物可用于治疗与上述癌症相关的转移性病变。
组合疗法
本公开的抗体或其抗原结合部分可作为唯一活性成分施用，或例如作为佐剂或与其他药物(例如免疫调节剂或细胞毒素或抗癌剂)组合施用，例如用以治疗或预防上述疾病。
1.示例性STING激动剂
在一个实施方式中，组合包含STING激动剂。在一些实施方式中，组合用于治疗癌症，例如本文所述的癌症，例如实体瘤(例如乳腺癌、鳞状细胞癌、黑色素瘤、卵巢癌、输卵管癌、腹膜癌、软组织肉瘤、黑色素瘤、乳腺癌、食管癌、头颈癌、子宫内膜癌、宫颈癌或基底细胞癌)，例如血液恶性肿瘤(例如白血病(例如慢性淋巴细胞性白血病(CLL)或淋巴瘤(例如边缘区B细胞淋巴瘤、小淋巴细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤))。
在一些实施方式中，STING激动剂是环状二核苷酸，例如包含嘌呤或嘧啶核碱基(例如腺苷、鸟苷、尿苷、胸苷或胞苷核碱基)的环状二核苷酸。在一些实施方式中，环状二核苷酸的核碱基包含相同的核碱基或不同的核碱基。
在一些实施方式中，STING激动剂包含腺苷或鸟苷核碱基。在一些实施方式中，STING激动剂包含一个腺苷核碱基和一个鸟苷核碱基。在一些实施方式中，STING激动剂包含两个腺苷核碱基或两个鸟苷核碱基。
在一些实施方式中，STING激动剂包含修饰的环状二核苷酸，例如包含修饰的核碱基、修饰的核糖或修饰的磷酸酯键。在一些实施方式中，修饰的环状二核苷酸包含修饰的磷酸酯键，例如硫代磷酸酯。
在一些实施方式中，STING激动剂包含具有2’,5’或3’,5’磷酸酯键的环状二核苷酸(例如，修饰的环状二核苷酸)。在一些实施方式中，STING激动剂包含在磷酸酯键周围具有Rp或Sp立体化学的环状二核苷酸(例如，修饰的环状二核苷酸)。
在一些实施方式中，STING激动剂是Rp,Rp二硫代2’,3’c-二-AMP(例如Rp,Rp-二硫代c-[A(2',5')pA(3',5')p])，或其环状二核苷酸类似物。在一些实施方式中，STING激动剂是美国专利公开US2015/0056224号所述的化合物(例如，图2c中的化合物，例如化合物21或化合物22)。在一些实施方式中，STING激动剂是c-[G(2',5')pG(3',5')p]、其二硫代核糖O-取代衍生物，或PCT公开号WO2014/189805和WO2014/189806的图4中所描绘的化合物，其各自通过引用并入本文。在一些实施方式中，STING激动剂是c-[A(2',5')pA(3',5')p]或其二硫代核糖O-取代衍生物，或是PCT公开号WO 2014/189805和WO 2014/189806图5中描述的化合物。在一些实施方式中，STING激动剂是2'-O-炔丙基-环-[A(2',5')pA(3',5')p](2'-O-炔丙基-ML-CDA)或PCT公开号WO 2014/189805和WO 2014/189806图7中描述的化合物，其通过引用并入本文。
其他示例性STING激动剂例如在PCT公开号WO 2014/189805和WO 2014/189806以及美国专利公开US2015/0056225中公开，各自通过引用并入本文。
2.示例性PD-1抑制剂
在一个实施方式中，组合包含抗PD-1或抗PD-1配体(PD-L1)的抗体分子。在一些实施方式中，组合用于治疗癌症，例如本文所述的癌症，例如实体肿瘤(如乳腺癌、鳞状细胞癌、黑色素瘤、卵巢癌、输卵管癌、腹膜癌、软组织肉瘤、黑色素瘤、乳腺癌、食道癌、头颈部癌、子宫内膜癌、宫颈癌或基底细胞癌)，例如血液恶性肿瘤(例如白血病(例如慢性淋巴细胞性白血病(CLL)，或淋巴瘤(例如边缘区B细胞淋巴瘤、小淋巴细胞淋巴瘤、滤泡淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤))。
抗PD-1抗体分子的示例性非限制性组合及其应用公开于US 2015/0210769(2015年7月30日公开，标题为“Antibody Molecules to PD-1and Uses Thereof”)中，其全部内容通过引用并入本文。
在一个实施方式中，抗PD-1抗体分子包含至少一个或两个重链可变区域(可选地包含恒定区)和/或至少一个或两个轻链可变区域(可选地包含恒定区)，其包含BAP049-克隆-A、BAP049-克隆-B、BAP049-克隆-C、BAP049-克隆-D，或BAP049-克隆-E的氨基酸序列；或US2015/0210769的表1所述的氨基酸序列，或US2015/0210769的表1的核苷酸序列编码的氨基酸序列；或与任何上述序列基本上同一(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％以上同一性)的序列。抗PD-1抗体分子可选地包含来自US 2015/0210769的表4所示重链和/或轻链的前导序列；或与其基本上同一的序列。
在又一个实施方式中，抗PD-1抗体分子包含本文公开的抗体的重链可变区和/或轻链可变区的至少一个、二个或三个互补决定区(CDR)，所述抗体例如为选自BAP049-hum01、BAP049-hum02、BAP049-hum03、BAP049-hum04、BAP049-hum05、BAP049-hum06、BAP049-hum07、BAP049-hum08、BAP049-hum09、BAP049-hum10、BAP049-hum11、BAP049-hum12、BAP049-hum13、BAP049-hum14、BAP049-hum15、BAP049-hum16、BAP049-克隆-A、BAP049-克隆-B、BAP049-克隆-C、BAP049-克隆-D、或BAP049-克隆-E中任一种的抗体；或US2015/0210769的表1所示的抗体，或US 2015/02107699的表1所示核苷酸序列编码的抗体；或与任何上述序列基本上同一(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％以上同一性)的序列编码的抗体。
在又一个实施方式中，抗PD-1抗体分子包含重链可变区的至少一个、二个或三个CDR(或统称所有CDR)，所述重链可变区包含US 2015/0210769的表1所示的氨基酸序列，或表1所示核苷酸序列编码的氨基酸序列。在一个实施方式中，相对于US 2015/0210769的表1所示的氨基酸序列，或表1所示核苷酸序列编码的氨基酸序列，所述CDR(或统称所有CDR)中的一个或多个具有1个、2个、3个、4个、5个、6个或更多个变化，例如氨基酸取代或缺失。
在又一个实施方式中，抗PD-1抗体分子包含轻链可变区的至少一个、二个或三个CDR(或统称所有CDR)，所述轻链可变区包含US 2015/0210769的表1所示的氨基酸序列，或表1所示核苷酸序列编码的氨基酸序列。在一个实施方式中，相对于US 2015/0210769的表1所示的氨基酸序列，或表1所示核苷酸序列编码的氨基酸序列，所述CDR(或统称所有CDR)中的一个或多个具有1个、2个、3个、4个、5个、6个或更多个变化，例如氨基酸取代或缺失。在某些实施方式中，抗PD-1抗体分子包含在轻链CDR中的取代，例如在轻链的CDR1、CDR2和/或CDR3中的一个或多个取代。在一个实施方式中，抗PD-1抗链分子包含在轻链可变区第102位的轻链CDR3中的取代，例如在US 2015/0210769的表1的轻链可变区的第102位半胱氨酸被取代为酪氨酸，或半胱氨酸被取代为丝氨酸残基(例如SEQ ID NO:16或24，对于鼠抗体或嵌合抗体，未修饰；或SEQ ID NO:34、42、46、54、58、62、66、70、74或78中的任何一个，对于修饰的序列)。
在另一实施方式中，抗PD-1抗体分子包含重链和轻链可变区的至少1个、2个、3个、4个、5个、6个CDR(或统称所有CDR)，所述重链和轻链可变区包含US2015/0210769的表1所示的氨基酸序列，或US 2015/0210769的表1所示核苷酸序列编码的氨基酸序列。
在一个实施方式中，抗PD-1抗体分子包含：
(a)重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述VH包含SEQ ID NO:4的VHCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:5的VHCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:3的VHCDR3氨基酸序列；所述VL包含SEQ ID NO:13的VLCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:14的VLCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:33的VLCDR3氨基酸序列，每个都在US2015/0210769的表1中公开；
(b)VH和VL，所述VH包含选自SEQ ID NO:1的VHCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:2的VHCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:3的VHCDR3氨基酸序列；和VL，所述VL包含SEQ ID NO:10的VLCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:11的VLCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:32的VLCDR3氨基酸序列，每个都在US2015/0210769的表1中公开；
(c)VH和VL，所述VH包含SEQ ID NO:224的VHCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:5的VHCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:3的VHCDR3氨基酸序列；所述VL包含SEQ ID NO:13的VLCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:14的VLCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:33的VLCDR3氨基酸序列，每个都在US2015/0210769的表1中公开；或者
(d)VH和VL，所述VH包含SEQ ID NO:224的VHCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:2的VHCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:3的VHCDR3氨基酸序列；和VL，所述VL包含SEQ ID NO:10的VLCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:11的VLCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:32的VLCDR3氨基酸序列，每个都在US2015/0210769的表1中公开。
在下面的组合中，在另一实施方式中，抗PD-1抗体分子包含：(i)重链可变区(VH)，其包含选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4、或SEQ ID NO:224的VHCDR1氨基酸序列、SEQ IDNO:2或SEQ ID NO:5的VHCDR2氨基酸序列以及SEQ ID NO:3的VHCDR3氨基酸序列；和(ii)轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:13的VLCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:14的VLCDR2氨基酸序列以及SEQ ID NO:32或SEQ ID NO:33的VLCDR3氨基酸序列，每个都在US2015/0210769的表1中公开。
在其他实施方式中，PD-1抑制剂是选自Nivolumab、Pembrolizumab或Pidilizumab的抗PD-1抗体。
在一些实施方式中，抗PD-1抗体是Nivolumab。Nivolumab的替代性称呼包括：MDX-1106、MDX-1106-04、ONO-4538、或BMS-936558。在一些实施方式中，抗PD-1抗体是Nivolumab(CAS注册号:946414-94-4)。Nivolumab是特异性阻断PD1的完整的人IgG4单克隆抗体。Nivolumab(克隆5C4)和特异性结合PD1的其他人单克隆抗体在US 8,008,449和WO2006/121168公开。在一个实施方式中，PD-1的抑制剂是Nivolumab并具有本文公开的序列(或与其基本同一或相似的序列，例如与指定序列至少85％、90％、95％以上同一的序列)。
在一些实施方式中，抗PD-1抗体是Pembrolizumab。Pembrolizumab(也称为Lambrolizumab、MK-3475、MK03475、SCH-900475或
Figure BDA0003921317000000341
Merck)是结合PD1的人源化IgG4单克隆抗体。Pembrolizumab和其他人源化抗PD-1抗体公开于Hamid,O.等，(2013)New England Journal of Medicine 369(2):134–44、US 8,354,509和WO2009/114335中。
在一个实施方式中，PD-1的抑制剂是Pembrolizumab，其例如公开于US 8,354,509和WO 2009/114335中，并具有本文公开的序列(或与其基本同一或相似的序列，例如与指定序列至少85％、90％、95％以上同一的序列)。
在一些实施方式中，抗PD-1抗体是Pidilizumab。Pidilizumab(CT-011；CureTech)是结合PD1的人源化IgG1k单克隆抗体。Pidilizumab和其他人源化抗PD-1单克隆抗体公开于WO2009/101611。
其他抗PD1抗体包括AMP 514(Amplimmune)等，例如US 8,609,089、US 2010028330和/或US 20120114649公开的抗PD1抗体。
在一些实施方式中，PD-1抑制剂是免疫粘附素(例如，包含与恒定区(例如，免疫球蛋白序列的Fc区)融合的PD-Ll或PD-L2的细胞外或PD-1结合部分的免疫粘附素。在一些实施方式中，PD-1抑制剂是AMP-224(B7-DCIg；Amplimmune；例如WO2010/027827和WO2011/066342公开的那些)是阻断PD-1和B7-H1之间相互作用的PD-L2 Fc融合可溶性受体。
3.示例性TIM-3抑制剂
在一个实施方式中，组合包含TIM-3抑制剂。在一些实施方式中，组合用于治疗癌症，例如本文所述的癌症，例如实体瘤(例如乳腺癌、鳞状细胞癌、黑色素瘤、卵巢癌、输卵管癌、腹膜癌、软组织肉瘤、黑色素瘤、乳腺癌、食管癌、头颈癌、子宫内膜癌、宫颈癌或基底细胞癌)，例如血液恶性肿瘤(例如白血病(例如慢性淋巴细胞性白血病(CLL)，或淋巴瘤(例如边缘区B细胞淋巴瘤、小淋巴细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤))。
在一个实施方式中，本文所述的组合包含TIM-3抑制剂。在一些实施方式中，用于治疗癌症，例如本文所述的癌症，例如实体瘤或血液恶性肿瘤。
抗TIM-3抗体分子的示例性非限制性组合及其应用公开于US 2015/0218274(2015年8月6日公开，标题为“Antibody Molecules to TIM-3and Uses Thereof”)中，其全部内容通过引用并入本文。
在一个实施方式中，抗TIM-3抗体分子包含至少一个或两个重链可变区域(可选地包含恒定区)和/或至少一个或两个轻链可变区域(可选地包含恒定区)，其包含ABTIM3、ABTIM3-hum01、ABTIM3-hum02、ABTIM3-hum03、ABTIM3-hum04、ABTIM3-hum05、ABTIM3-hum06、ABTIM3-hum07、ABTIM3-hum08、ABTIM3-hum09、ABTIM3-hum10、ABTIM3-hum11、ABTIM3-hum12、ABTIM3-hum13、ABTIM3-hum14、ABTIM3-hum15、ABTIM3-hum16、ABTIM3-hum17、ABTIM3-hum18、ABTIM3-hum19、ABTIM3-hum20、ABTIM3-hum21、ABTIM3-hum22、ABTIM3-hum23中任一种的氨基酸序列；或US 2015/0218274的表1-4所述的氨基酸序列；或US 2015/0218274的表1-4的核苷酸序列编码的氨基酸序列；或与任何上述序列基本上同一(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％以上同一)的序列。抗TIM-3抗体分子可选地包含来自US 2015/0218274所示重链和/或轻链的前导序列；或与其基本上同一的序列。
在又一个实施方式中，抗TIM-3抗体分子包含本文公开的抗体的重链可变区和/或轻链可变区的至少一个、二个或三个互补决定区(CDR)，所述抗体例如为选自ABTIM3、ABTIM3-hum01、ABTIM3-hum02、ABTIM3-hum03、ABTIM3-hum04、ABTIM3-hum05、ABTIM3-hum06、ABTIM3-hum07、ABTIM3-hum08、ABTIM3-hum09、ABTIM3-hum10、ABTIM3-hum11、ABTIM3-hum12、ABTIM3-hum13、ABTIM3-hum14、ABTIM3-hum15、ABTIM3-hum16、ABTIM3-hum17、ABTIM3-hum18、ABTIM3-hum19、ABTIM3-hum20、ABTIM3-hum21、ABTIM3-hum22、ABTIM3-hum23中任一种的抗体；或US 2015/0218274的表1-4所示的抗体；或US 2015/0218274的表1-4所示核苷酸序列编码的抗体；或与任何上述序列基本上同一(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％以上同一性)的序列编码的抗体。
在又一个实施方式中，抗TIM-3抗体分子包含重链可变区的至少一个、二个或三个CDR(或统称所有CDR)，所述重链可变区包含US 2015/0218274的表1-4所示的氨基酸序列，或US 2015/0218274的表1-4所示核苷酸序列编码的氨基酸序列。在一个实施方式中，相对于US 2015/0218274的表1-4所示的氨基酸序列，或US 2015/0218274的表1-4所示核苷酸序列编码的氨基酸序列，所述CDR(或统称所有CDR)中的一个或多个具有1个、2个、3个、4个、5个、6个或更多个变化，例如氨基酸取代或缺失。
在又一个实施方式中，抗TIM-3抗体分子包含轻链可变区的至少一个、二个或三个CDR(或统称所有CDR)，所述轻链可变区包含US 2015/0218274的表1-4所示的氨基酸序列，或US 2015/0218274的表1-4所示核苷酸序列编码的氨基酸序列。在一个实施方式中，相对于US 2015/0218274的表1-4所示的氨基酸序列，或US 2015/0218274的表1-4所示核苷酸序列编码的氨基酸序列，所述CDR(或统称所有CDR)中的一个或多个具有1个、2个、3个、4个、5个、6个或更多个变化，例如氨基酸取代或缺失。在某些实施方式中，抗TIM-3抗体分子包含在轻链CDR中的取代，例如在轻链的CDR1、CDR2和/或CDR3中的一个或多个取代。
在另一实施方式中，抗TIM-3抗体分子包含重链和轻链可变区的至少1个、2个、3个、4个、5个、6个CDR(或统称所有CDR)，所述重链和轻链可变区包含US 2015/0218274的表1-4所示的氨基酸序列，或US 2015/0218274的表1-4所示核苷酸序列编码的氨基酸序列。在一个实施方式中，相对于US 2015/0218274的表1-4所示的氨基酸序列，或US 2015/0218274的表1-4所示核苷酸序列编码的氨基酸序列，所述CDR(或统称所有CDR)中的一个或多个具有1个、2个、3个、4个、5个、6个或更多个变化，例如氨基酸取代或缺失。
在一个实施方式中，抗TIM-3抗体分子包含：
(a)重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述VH包含选自SEQ ID NO:9的VHCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:10的VHCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:5的VHCDR3氨基酸序列；所述VL包含SEQ ID NO:12的VLCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:13的VLCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:14的VLCDR3氨基酸序列，每个都在US 2015/0218274的表1-4中公开；
(b)VH和VL，所述VH包含选自SEQ ID NO:3的VHCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:4的VHCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:5的VHCDR3氨基酸序列；所述VL包含SEQ ID NO:6的VLCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:7的VLCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:8的VLCDR3氨基酸序列，每个都在US 2015/0218274的表1-4中公开；
(c)VH和VL，所述VH包含选自SEQ ID NO:9的VHCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:25的VHCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:5的VHCDR3氨基酸序列；所述VL包含SEQ ID NO:12的VLCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:13的VLCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:14的VLCDR3氨基酸序列，每个都在US 2015/0218274的表1-4中公开；
(d)VH和VL，所述VH包含选自SEQ ID NO:3的VHCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:24的VHCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:5的VHCDR3氨基酸序列；所述VL包含SEQ ID NO:6的VLCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:7的VLCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:8的VLCDR3氨基酸序列，每个都在US 2015/0218274的表1-4中公开；
(e)VH和VL，所述VH包含选自SEQ ID NO:9的VHCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:31的VHCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:5的VHCDR3氨基酸序列；所述VL包含SEQ ID NO:12的VLCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:13的VLCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:14的VLCDR3氨基酸序列，每个都在US 2015/0218274的表1-4中公开；或者
(f)VH和VL，所述VH包含选自SEQ ID NO:3的VHCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:30的VHCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:5的VHCDR3氨基酸序列；所述VL包含SEQ ID NO:6的VLCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:7的VLCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:8的VLCDR3氨基酸序列，每个都在US 2015/0218274的表1-4中公开。
示例性抗TIM-3抗体公开于美国专利号:8,552,156、WO 2011/155607、EP 2581113和美国公开号:2014/044728。
示例性LAG-3抑制剂
在一个实施方式中，组合包含LAG-3抑制剂。在一些实施方式中，组合用于治疗癌症，例如本文所述的癌症，例如实体肿瘤(如乳腺癌、鳞状细胞癌、黑色素瘤、卵巢癌、输卵管癌、腹膜癌、软组织肉瘤、黑色素瘤、乳腺癌、食道癌、头颈部癌、子宫内膜癌、宫颈癌或基底细胞癌)，例如血液恶性肿瘤(例如白血病(例如慢性淋巴细胞性白血病(CLL)，或淋巴瘤(例如边缘区B细胞淋巴瘤、小淋巴细胞淋巴瘤、滤泡淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤))。
在一个实施方式中，本文所述的组合包含LAG-3抑制剂。在一些实施方式中，用于治疗癌症，例如本文所述的癌症，例如实体瘤或血液恶性肿瘤。
抗LAG-3抗体分子的示例性非限制性组合及其应用公开于US 2015/0259420(2015年9月17日公开，标题为“Antibody Molecules to LAG-3and Uses Thereof”)中，其全部内容通过引用并入本文。
在一个实施方式中，抗LAG-3抗体分子包含至少一个或两个重链可变区域(可选地包含恒定区)和/或至少一个或两个轻链可变区域(可选地包含恒定区)，其包含BAP050-hum01、BAP050-hum02、BAP050-hum03、BAP050-hum04、BAP050-hum05、BAP050-hum06、BAP050-hum07、BAP050-hum08、BAP050-hum09、BAP050-hum10、BAP050-hum11、BAP050-hum12、BAP050-hum13、BAP050-hum14、BAP050-hum15、BAP050-hum16、BAP050-hum17、BAP050-hum18、BAP050-hum19、BAP050-hum20、huBAP050(Ser)(例如BAP050-hum01-Ser、BAP050-hum02-Ser、BAP050-hum03-Ser、BAP050-hum04-Ser、BAP050-hum05-Ser、BAP050-hum06-Ser、BAP050-hum07-Ser、BAP050-hum08-Ser、BAP050-hum09-Ser、BAP050-hum10-Ser、BAP050-hum11-Ser、BAP050-hum12-Ser、BAP050-hum13-Ser、BAP050-hum14-Ser、BAP050-hum15-Ser、BAP050-hum18-Ser、BAP050-hum19-Ser、或BAP050-hum20-Ser)、BAP050-克隆-F、BAP050-克隆-G、BAP050-克隆-H、BAP050-克隆-I、或BAP050-克隆-J中任一种的氨基酸序列；或US 2015/0259420的表1所述的氨基酸序列，或US 2015/0259420的表1的核苷酸序列编码的氨基酸序列；或与任何上述序列基本上同一(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％以上同一)的序列。
在又一个实施方式中，抗LAG-3抗体分子包含本文公开的抗体的重链可变区和/或轻链可变区的至少一个、二个或三个互补决定区(CDR)，所述抗体例如为选自BAP050-hum01、BAP050-hum02、BAP050-hum03、BAP050-hum04、BAP050-hum05、BAP050-hum06、BAP050-hum07、BAP050-hum08、BAP050-hum09、BAP050-hum10、BAP050-hum11、BAP050-hum12、BAP050-hum13、BAP050-hum14、BAP050-hum15、BAP050-hum16、BAP050-hum17、BAP050-hum18、BAP050-hum19、BAP050-hum20、huBAP050(Ser)(例如BAP050-hum01-Ser、BAP050-hum02-Ser、BAP050-hum03-Ser、BAP050-hum04-Ser、BAP050-hum05-Ser、BAP050-hum06-Ser、BAP050-hum07-Ser、BAP050-hum08-Ser、BAP050-hum09-Ser、BAP050-hum10-Ser、BAP050-hum11-Ser、BAP050-hum12-Ser、BAP050-hum13-Ser、BAP050-hum14-Ser、BAP050-hum15-Ser、BAP050-hum18-Ser、BAP050-hum19-Ser，或BAP050-hum20-Ser)、BAP050-克隆-F、BAP050-克隆-G、BAP050-克隆-H、BAP050-克隆-I，或BAP050-克隆-J中任一种的抗体；或US 2015/0259420的表1所示的抗体，或US 2015/0259420的表1的核苷酸序列编码的的抗体；或与任何上述序列基本上同一(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％以上同一)的序列。
在又一个实施方式中，抗LAG-3抗体分子包含重链可变区的至少一个、二个或三个CDR(或统称所有CDR)，所述重链可变区包含US 2015/0259420的表1所示的氨基酸序列，或US 2015/0259420的表1所示核苷酸序列编码的氨基酸序列。在一个实施方式中，相对于US2015/0259420的表1所示的氨基酸序列，或US 2015/0259420的表1所示核苷酸序列编码的氨基酸序列，所述CDR(或统称所有CDR)中的一个或多个具有1个、2个、3个、4个、5个、6个或更多个变化，例如氨基酸取代或缺失。
在又一个实施方式中，抗LAG-3抗体分子包含轻链可变区的至少一个、二个或三个CDR(或统称所有CDR)，所述轻链可变区包含US 2015/0259420的表1所示的氨基酸序列，或US 2015/0259420的表1所示核苷酸序列编码的氨基酸序列。在一个实施方式中，相对于US2015/0259420的表1所示的氨基酸序列，或US 2015/0259420的表1所示核苷酸序列编码的氨基酸序列，所述CDR(或统称所有CDR)中的一个或多个具有1个、2个、3个、4个、5个、6个或更多个变化，例如氨基酸取代或缺失。在某些实施方式中，抗PD-L1抗体分子包含在轻链CDR中的取代，例如在轻链的CDR1、CDR2和/或CDR3中的一个或多个取代。
在另一实施方式中，抗LAG-3抗体分子包含重链和轻链可变区的至少1个、2个、3个、4个、5个、6个CDR(或统称所有CDR)，所述重链和轻链可变区包含US2015/0259420的表1所示的氨基酸序列，或US 2015/0259420的表1所示核苷酸序列编码的氨基酸序列。在一个实施方式中，相对于US 2015/0259420的表1所示的氨基酸序列，或US 2015/0259420的表1所示核苷酸序列编码的氨基酸序列，所述CDR(或统称所有CDR)中的一个或多个具有1个、2个、3个、4个、5个、6个或更多个变化，例如氨基酸取代或缺失。
在一个实施方式中，抗LAG-3抗体分子包含：
(i)重链可变区(VH)，其包含选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:286的VHCDR1氨基酸序列，SEQ ID NO:2的VHCDR2氨基酸序列以及SEQ ID NO:3的VHCDR3氨基酸序列，每个都在US 2015/0259420的表1中公开；和
(ii)轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO:10的VLCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:11的VLCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:12的VLCDR3氨基酸序列，每个都在US 2015/0259420的表1中公开。
在另一实施方式中，抗LAG-3抗体分子包含：
(i)重链可变区(VH)，其包含选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:286的VHCDR1氨基酸序列，SEQ ID NO:5的VHCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:3的VHCDR3氨基酸序列，每个都在US 2015/0259420的表1中公开；和
(ii)轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO:13的VLCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:14的VLCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:15的VLCDR3氨基酸序列，每个都在US 2015/0259420的表1中公开。
在一个实施方式中，抗LAG-3抗体分子包含SEQ ID NO:1的VHCDR1氨基酸序列。在另一实施方式中，抗LAG-3抗体分子包含SEQ ID NO:4的VHCDR1氨基酸序列。在又一个实施方式中，抗LAG-3抗体分子包含SEQ ID NO:286的VHCDR1氨基酸序列，每个都在US 2015/0259420的表1中公开。
在一些实施方式中，抗LAG-3抗体是BMS-986016。BMS-986016(也称为BMS986016；Bristol-Myers Squibb)是结合LAG-3的单克隆抗体。BMS-986016和其他人源化抗LAG-3抗体公开于US 2011/0150892、WO2010/019570和WO2014/008218中。
5.示例性CTLA-4抑制剂
在一个实施方式中，组合包含CTLA-4抑制剂。在一些实施方式中，组合用于治疗癌症，例如本文所述的癌症，例如实体瘤(例如乳腺癌、鳞状细胞癌、黑色素瘤、卵巢癌、输卵管癌、腹膜癌、软组织肉瘤、黑色素瘤、乳腺癌、食管癌、头颈癌、子宫内膜癌、宫颈癌或基底细胞癌)，例如血液恶性肿瘤(例如白血病(例如慢性淋巴细胞性白血病(CLL)，或淋巴瘤(例如边缘区B细胞淋巴瘤、小淋巴细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤))。
在一个实施方式中，本文所述的组合包含CTLA-4抑制剂。在一些实施方式中，用于治疗癌症，例如本文所述的癌症，例如实体瘤或血液恶性肿瘤。
示例性抗CTLA4抗体包括Tremelimumab(可获自Pfizer的IgG2单克隆抗体，此前称为ticilimumab,CP-675,206)；和Ipilimumab(CTLA-4抗体，也称为MDX-010,CAS号477202-00-9)。
在一个实施方式中，组合包含抗PD-1抗体分子(例如本文公开的抗PD-1抗体分子)和抗CTLA-4抗体(例如ipilimumab)。可使用的示例性剂量包括约1至10mg/kg(例如3mg/kg)剂量的抗PD-1抗体分子和约3mg/kg剂量的抗CTLA-4抗体(例如ipilimumab)。
其他示例性抗CTLA-4抗体公开于例如美国专利5,811,097号中，其通过引用并入本文。
6.示例性GITR调节剂
在一个实施方式中，组合包含GITR调节剂，例如激动剂或拮抗剂。在一个实施方式中，GITR调节剂是拮抗剂。在一些实施方式中，组合用于治疗癌症，例如本文所述的癌症，例如实体瘤(例如乳腺癌、鳞状细胞癌、黑色素瘤、卵巢癌、输卵管癌、腹膜癌、软组织肉瘤、黑色素瘤、乳腺癌、食管癌、头颈癌、子宫内膜癌、宫颈癌或基底细胞癌)，例如血液恶性肿瘤(例如白血病(例如慢性淋巴细胞性白血病(CLL)，或淋巴瘤(例如边缘区B细胞淋巴瘤、小淋巴细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤))。
示例性GITR调节剂包括例如GITR融合蛋白和抗GITR抗体(例如二价抗GITR抗体)，例如美国专利号6,111,090、欧洲专利号0920505B1、美国专利号8,586,023、PCT公开号WO2010/003118和2011/090754中所示的GITR融合蛋白，或例如美国专利号7,025,962、欧洲专利号1947183B1、美国专利号7,812,135、美国专利号8,388,967、美国专利号8,591,886、欧洲专利号EP 1866339、PCT公开号WO 2011/028683、美国专利号8,709,424、PCT公开号WO2013/039954、国际公开号WO2013/039954、美国公开号US2014/0072566、国际公开号WO2015/026684、PCT公开号WO2005/007190、PCT公开号WO 2007/133822、PCT公开号WO2005/055808、PCT公开号WO 99/40196、PCT公开号WO 2001/03720、PCT公开号WO99/20758、美国专利号6,689,607、PCT公开号WO2006/083289、PCT公开号WO 2005/115451、美国专利号7,618,632、PCT公开号WO 2011/051726、国际公开号WO2004060319和国际公开号WO2014012479中所示的抗GITR抗体，其中每一个都通过引用并入本文。
实施例
实施例1:小鼠抗人IL-2抗体NARA1的产生和筛选
命名为NARA1的参比抗体根据本领域技术人员公知的方法衍生、分离并进行结构表征。
在第0、14天(皮下)和28天(静脉内)用人(h)IL-2(34-8029，eBioscience)在弗氏佐剂(F-5881，Sigma)中免疫Balb/c小鼠。第一次免疫前和每次免疫后9-11天收集血清以检查抗hIL-2抗体滴度。第35天，小鼠被安乐死，并按照标准程序收集脾细胞。将脾细胞与骨髓瘤细胞以5：1的比例与聚乙二醇1500(10783641001，Roche)混合。使用从Balb/c小鼠的腹膜灌洗获得的饲养层在补充有10％超低IgG FBS(16250，Life Technologies)、50μM巯基乙醇(313050，Life Technologies)、1：100胰岛素-转铁蛋白-硒(41400-045，LifeTechnologies)、2％IL-6条件培养基、青霉素-链霉素(15240，Life Technologies)、庆大霉素(15750，Life Technologies)和次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸苷(HAT，H037，Sigma-Aldrich)的IMDM选择性培养基(21980，Life Technologies)中生长克隆数天。然后使用直接结合ELISA筛选多克隆的hIL-2结合，并使用竞争性ELISA筛选特异性，并且稀释以获得单克隆。为了扩展单克隆，HAT培养基替换为次黄嘌呤-胸苷培养基(HT，41065，Life Technologies)。然后根据供应商的建议(UFC9100，Merck Millipore)使用100kDa离心过滤器单元浓缩单克隆。浓缩物进一步使用竞争ELISA以剂量依赖性方式测试特异性，并在体内使用每天4次腹膜内注射与1.5μg hIL-2复合的200μl浓缩物，随后通过T细胞子集和自然杀伤(NK)细胞的流式细胞术进行评估。NARA1使用蛋白G琼脂糖(20398.ThermoFisher Scientific)根据供应商的建议纯化。
NARA1的全长重链是SEQ ID NO:115，并且NARA1的全长轻链氨基酸序列是SEQ IDNO:117。
NARA1的相应的可变区VH和VL氨基酸序列是SEQ ID NO:111(可变重链)和SEQ IDNO:113(可变轻链)。
编码NARA1序列的全长轻链和重链核苷酸是SEQ ID NO:116(重链编码序列，包含前导序列)和SEQ ID NO:118(轻链编码序列，包含前导序列)。
编码NARA1序列的可变轻链和重链核苷酸是SEQ ID NO:112(可变重链编码序列)和SEQ ID NO:114(可变轻链编码序列)。
NARA1的CDR区使用Kabat系统描绘(Kabat，E.A.等，1991，Sequences of Proteinsof Immunological Interest，第5版，U.S.Department of Health and Human Services,NIH公布号91-3242，也见于Zhao&Lu 2009,Molecular Immunology 47:694-700)。为了便于阅读，当根据Kabat定义划定CDR区时，它们在下文中分别称为HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、LCDR3。NARA1的CDR区是：根据SEQ ID NO:4的HCDR1、根据SEQ ID NO:2的HCDR2、根据SEQ ID NO:3的HCDR3、根据SEQ ID NO:19的LCDR1、根据SEQ ID NO:20的LCDR2、根据SEQ IDNO:21的LCDR3。
实施例2:NARA1的晶体结构
(1)材料和方法
确定了本领域技术人员公知作为
Figure BDA0003921317000000441
(阿地白介素)的人白介素2突变体(SEQ ID NO:110)结合至抗体NARA 1的Fab片段的复合物结构。所得的
Figure BDA0003921317000000442
上的残基编号根据wt IL-2的编号给出。
如下文中详细论述的是，
Figure BDA0003921317000000443
和wt hIL-2之间的序列差异没有关系并且
Figure BDA0003921317000000444
是hIL-2结构分析的有效模型。
为了限定表位，采用X射线晶体学解析上述复合物的原子分辨率结构。X射线晶体学是已经常规并广泛使用以产生包括抗体及其与抗原复合物在内的生物分子的结构数据的技术(Adams等，(2013)Annual Review Biophysics 42:265-287；Garman,(2014)Science343:1102-1108；Joachimiak,(2009)Current Opinion Structural Biology19:573-584)。
抗原
Figure BDA00039213170000004411
作为与赋形剂一起的冻干粉末商售(每1mg
Figure BDA0003921317000000445
与约50mg甘露醇、0.18mg十二烷基硫酸钠、0.173mg磷酸二氢钠和0.89mg磷酸氢二钠混合)。用于复合物形成之前，通过反相HPLC纯化
Figure BDA0003921317000000446
以去除赋形剂。
NARA1的Fab片段(NARA1-Fab)通过木瓜蛋白酶切割全长抗体，然后进行蛋白A层析来产生。简言之，将6.5ml全长NARA1(9mg/ml，在90mM氯化钠和50mM柠檬酸盐缓冲液中，pH7.0)与5mM DTT和590μg木瓜蛋白酶(Roche)混合。裂解反应在室温下保持16h，并通过加入15μl 56mM E64溶液(Roche)终止。然后将裂解溶液用25mM Tris、25mM NaCl(pH8.0)稀释10倍，并装载到用5倍柱体积的25mM Tris、25mM NaCl(pH8.0)平衡的5ml蛋白A柱(GEHealthcare)上，并且Fab片段处于加载-穿透级分中，且Fc片段与蛋白A柱结合。
为了形成复合物，将HPLC后的
Figure BDA0003921317000000447
粉末以5.5mg/ml的浓度溶解在H2O中。将过量的6.6mg
Figure BDA0003921317000000448
滴加到11.5mg NARA1Fab片段溶液中。使用离心来去除在当前条件下沉淀的过量
Figure BDA0003921317000000449
然后通过Superdex 200 10×300(GE Healthcare)用25mMTris、25mM NaCl(pH 7.4)的运行缓冲液进行凝胶过滤，从而纯化复合物。
凝胶过滤后的
Figure BDA00039213170000004410
/NARA1-Fab复合物浓缩至14mg/ml，并通过蒸发扩散法筛选为坐滴。将蛋白质溶液与储库缓冲液1：1混合至总大小0.4μl。在19℃使用储存在RockImager酒店(Formulatrix)中的Phoenix机器人系统(Art Robbins Instruments)设置试验，并自动成像。在20％w/v聚乙二醇3350和0.2M硝酸钠的条件下筛选后4天收获晶体。用含有10％甘油的储库缓冲液对晶体进行冷冻保护，并在数据收集之前在液氮中闪速冷冻。在Swiss light Source(Villigen,瑞士)以光束线PX-II采用
Figure BDA0003921317000000451
Figure BDA0003921317000000452
的X射线辐射波长通过Pilatus像素检测器收集衍射数据。
使用XDS和XSCALE(2010年12月6日版)处理数据集，并且使用蛋白质数据库条目“3INK”作为IL-2的搜索模型和使用蛋白质数据库条目“3TTI”作为Fab片段的搜索模型，通过程序PHASER以分子置换方法解析结构。用程序Coot(Crystallographic Object-Oriented Toolkit)和AUTOBUSTER(Bricogne等，2011)进行迭代模型构建和精细结构。所有图都是用程序PyMOL(Molecular Graphics System；DeLano Scientific:Palo Alto,CA；http://www.pymol.org)产生。
表位残基定义为来自
Figure BDA0003921317000000453
的与NARA1的Fab片段中的任何原子相距
Figure BDA0003921317000000454
的那些残基，并且还通过CCP4程序CONTACT和AREAIMOL(Collaborative ComputationalProject，第4号，6.4.0版本)确认。类似地，补位残基定义为来自NARA1-Fab的与
Figure BDA0003921317000000455
中的任何原子相距
Figure BDA0003921317000000456
的那些残基。
(2)结果
Figure BDA0003921317000000457
/NARA1-Fab复合物在空间群C1 2 1中解析至
Figure BDA0003921317000000458
晶胞尺寸为
Figure BDA0003921317000000459
α＝90°,β＝102.9°,γ＝90°。具体结构统计见表3。在每个不对称单元中，有一个复合物分子。
表3.
Figure BDA0003921317000000461
/NARA1-Fab复合物的结构统计
Figure BDA0003921317000000462
(3)表位和补位分析
图1提供了实施例1中获得的
Figure BDA0003921317000000463
/Fab-NARA1复合物的三维结构的概述。NARA1的Fab片段的轻链指示为A，NARA1的Fab片段的重链显示为B，被NARA1-Fab识别的表位残基命名为D，并且
Figure BDA0003921317000000464
命名为C，突变C145S被突出显示。
图2提供了还表位残基的分析。X-轴列出了根据SEQ ID No.110的氨基酸序列和编号。Y-轴的上侧显示了来自
Figure BDA0003921317000000465
的相应残基
Figure BDA0003921317000000466
之内的NARA1-Fab的原子的总数，而Y轴的下侧显示与NARA1-Fab结合后溶剂可及面积减少
Figure BDA0003921317000000467
实施例1中使用的
Figure BDA0003921317000000468
含有突变C145S。如图1所示，C145S远离表位区。此外，实施例1中的
Figure BDA0003921317000000469
与含有CD25、CD122和CD132(PDB:2B5I)的复合物中wt hIL-2的Cα原子之间的Cα原子重叠显示r.m.s.d为
Figure BDA00039213170000004610
这表明该突变不干扰整体结构。因此，具有C145S突变的
Figure BDA0003921317000000471
是用于wt hIL-2结构分析的有效模型。
hIL-2是4-螺旋束蛋白，并且4个螺旋从N末端至C末端分别命名为A、B、C和D。如图1所示NARA1-Fab识别的表位是构象表位并跨图2所示的两个区：一个区(N50-K63)包含环和短螺旋并且连接螺旋A和B，另一区(N91-N97)包含环并且连接螺旋B和C。
在表4中总结了表位残基和来自NARA1-Fab的相互作用的补位残基。在所有表位残基中，如图2所示的Arg58是与NARA1-Fab结合最关键的表位残基，因为单单该残基就有42个来自NARA1-Fab的相互作用原子，并且由于与NARA1-Fab结合而导致溶剂可接触面积总体减少17.7％。另外如图3所示，Arg58与HCDR1中的Glu35和LCDR3中的Asp100分别形成两个强盐桥。Arg58还与LCDR3的Tyr100的芳香环发生π-作用相互作用。据认为残基K52、P54、K55、T57、T61、F62、K63、Q94和K96也对于与NARA1-Fab结合很重要，因为它们都显示出来自NARA1-Fab的等于/大于5个相互作用的原子和大于
Figure BDA0003921317000000472
的减少的溶剂可接触面积，如图2所示。
表4.表位和补位(paratope)概述
轻链残基 表位残基 重链残基
Y31 N50
Y31 K52
Y31 N53
Y31,Y36,S95,N96 P54
K55 W99,G101,G103,Y105
D98 T57
D98,Y100 R58 L33,E35,W47,W99
T61 N52,S55,N59
F62 L33,N52
K63 S55
N91 G101,D102,G103
L92 W99,G101
A93 G101
Q94 D102,G103,Y104
D32,D34 K96 Y104
D32 N97  
图3说明Arg58是NARA1-Fab识别的最关键的表位残基。A表示
Figure BDA0003921317000000473
B表示重链并且C表示轻链。参与的残基表示为棒状。
(4)NARA1-Fab结合性质
图4显示了
Figure BDA0003921317000000481
/NARA1-Fab复合物与IL-2/CD25/CD122/CD132四元复合物的叠加。四元复合物结构来自PDB条目“2B5I”，其中淡青色的卡通图示D代表wt hIL-2，红色的卡通图示B代表CD122，蓝色的卡通图示C代表CD132，绿色的表面A代表CD25。在
Figure BDA0003921317000000482
/NARA1-Fab复合物结构中，与wt hIL-2叠加的青色卡通图示D表示
Figure BDA0003921317000000483
洋红色的卡通图示E表示重链和黄色的卡通图示F表示轻链。
如图4所示的两种复合物的结构叠加图清楚地表明NARA1-Fab与CD25形成直接竞争，但不与CD122/CD132形成直接竞争，这与以下观察结果一致：IL-2/NARA1复合物主要表现出T效应细胞活性而不是促-Treg活性。
(5)与NARA1-Fab复合的
Figure BDA0003921317000000484
的C螺旋采取了与四元复合物中相似的构象
图5展示了IL-2_C145A(PDB:3INK)、超级运动因子(PDB:3QB1)、IL-2/CD25/CD122/CD132(PDB:2B5I)和
Figure BDA0003921317000000485
/NARA1-Fab的C螺旋的叠加。
IL-2中的螺旋C和CD122之间的极性界面在两部分之间的结合中起着重要作用(Wang等，(2005)Science 310：1159-1163)。2012年，Levin等证明了超级运动因子(IL-2突变体)单独具有类似于四元复合物中的螺旋C，并且超级运动因子对于CD122的结合亲和力比wtIL-2高约215倍(Levin等人，(2012)Nature 484：529-533)。观察到螺旋C的这种构象变化与构象稳定相关，其然后降低了与CD122结合的能量损失。如图5所示，在来自与NARA1-Fab的复合物中
Figure BDA0003921317000000486
的螺旋C的构象也与在超级运动因子中以及在IL-2/CD25/CD122/CD132四元复合物中观察到的相似，因此
Figure BDA0003921317000000487
/NARA1-Fab复合物可能对CD122表现出比wt hIL-2更高的结合亲和力。
实施例3:小鼠单克隆抗体NARA1的人源化
本文描述了人源化抗人IL-2小鼠抗体NARA1，其包括了选择人受体框架、回复突变和基本上保留和/或改善人CDR-嫁接受体框架的结合特性的突变。
本领域已充分描述了人源化过程(Jones等，1986，Queen等，1989，Riechmann等，1988，Verhoeyen，Milstein和Winter 1988)。术语人源化描述了非人抗体，例如鼠衍生的抗体的抗原结合位点转移至人受体框架，例如人种系序列(Retter等，2005)。抗体人源化的基本原理可见于使人体内发生针对该抗体的免疫原性应答的风险最小化(Rebello等1999)。
抗原结合位点包含互补决定区(CDR)(Chothia和Lesk1987，Kabat等，1991)和CDR外部的位置，即位于直接或间接影响结合的可变域(VL和VH)的框架区中的位置。例如，可直接影响结合的框架残基可见于位于CDR2和CDR3之间的所谓的“外”环区中。间接影响结合的残基例如可见于所谓的Vernier区域(Foote和Winter 1992)。它们被认为支持CDR构象。选择合适的受体框架时，将CDR以外的位置考虑在内，以使最终人源化抗体与人种系受体序列在框架区中的偏离数目最小化。
1.序列优化亲和力成熟
已知某些氨基酸序列基序经历了翻译后修饰(PTM)，如糖基化(即NxS/T，x为除P外的任何基团)、游离半胱氨酸的氧化、脱酰胺(例如NG)或异构化(例如DG)。如果存在于CDR区域中，则理想地通过定点诱变除去那些基序以增加产物均一性。
本领域充分描述了亲和力成熟的过程。在许多展示系统中，噬菌体展示(Smith1985)和在真核细胞如酵母上展示(Boder E.和Wittrup K.(1997).Yeast surfacedisplay for screening combinatorial polypeptide libraries.Nat Biotechnol.,15(6),第553-557页)可能是用于抗体-抗原相互作用选择的最常用的系统。这些展示系统的优点是它们适用于各种抗原，并且选择严格性可以容易地调整。在噬菌体展示中，可以展示scFv或Fab片段，并且在酵母展示中还可以另外展示全长IgG。这些通常应用的方法允许从具有多于107种的多样性的较大文库中选择期望的抗体变体。具有较小多样性如103种的文库可通过微表达和ELISA筛选。
非靶向或随机抗体变异文库可以通过例如易错PCR产生Cadwell和Joyce 1994)，并提供了一种非常简单但有时受限的方法。另一种策略是抗体候选物的CDR指导的多样化。可以使用例如变性寡核苷酸(Thompson等，1996)、三核苷酸诱变(TRIM)(Kayushin等，1996)或本领域已知的任何其他方法特异性靶向一个或多个CDR中的一个或多个位置。
2.表达质粒的产生
编码人源化VL和VH域的DNA序列订购自GeneArt(Life Technologies Inc.，Regensburg，德国)，包含对人类进行优化的密码子。编码VL和VH域的序列是从GeneArt衍生的载体上通过切割和粘贴亚克隆到合适在哺乳动物细胞中分泌的表达载体中。重链和轻链被克隆到允许共转染的单独的表达载体。表达载体的元件包括启动子(巨细胞病毒(CMV)增强子-启动子)、促进分泌的信号序列、聚腺苷酸化信号和转录终止子(牛生长激素(BGH)基因)、在原核生物中允许附加型复制和复制的元件(例如，SV40源点和ColE1或本领域已知的其他元件)和允许选择的元件(氨苄青霉素抗性基因和zeocin标记)。
3.人源化抗体候选者的表达和纯化
组成型表达SV40大T抗原的人胚胎肾细胞(HEK293-T ATCC11268)是用于瞬时表达人源化和/或最佳IgG蛋白质的优选宿主细胞系之一。使用PEI(聚乙烯亚胺，MW 25.000直链，Polysciences，美国，目录号23966)作为转染试剂进行转染。PEI储备溶液通过在室温(RT)将1g PEI小心地溶解在900ml细胞培养级水中而制备。为促进PEI溶解，通过加入HCl至pH 3-5酸化溶液，然后用NaOH中和至最终pH为7.05。最后将体积调至1L，并将溶液通过0.22μm过滤器过滤，等分并在-80℃冷冻直到进一步使用。一旦解冻后，等分试样可以在-20℃重新冷冻3次，但不应长期储存于-20℃。HEK 293T细胞使用Novartis专有的无血清培养基培养，用于转染和繁殖细胞，并作为生产/饲料培养基的ExCell VPRO无血清培养基(SAFCBiosciences，美国，目录号24561C)培养。制备用于瞬时转染的细胞在悬浮培养中培养。对于小规模(<5L)转染，将细胞在5％ CO2的湿润培养箱(种子瓶)中的轨道摇床(100rpm-120rpm)上的Corning摇瓶(Corning，Tewksbury，MA)中培养。种子培养物中的细胞应维持在指数生长期(细胞密度在5×105和3×106/mL之间)并显示转染存活率>90％。在此范围之外的细胞密度将导致稀释后的滞后期或降低的转染效率。对于小规模(<5L)转染，将一份细胞从种子培养物中取出，并用Novartis无血清培养基在最终体积的36％中调整至1.4×106细胞/mL。DNA溶液(溶液1：0.5mg重链和0.5mg轻链表达质粒，用于1L转染)是通过在最终培养体积的7％中将DNA稀释至1mg/L(最终体积)而制备，随后轻柔混合。为了防止细菌污染，使用0.22μm过滤器(例如Millipore Stericup)过滤该溶液。然后将3mg/L(最终体积)的PEI溶液也在最终培养的体积7％中稀释并轻柔混合(溶液2)。将两种溶液在室温(RT)温育5-10分钟。然后将溶液2加入溶液1中，轻柔混合，并在室温温育额外5-15分钟。然后将转染混合物加到细胞中，并继续培养细胞4至6小时。最后，通过加入
Figure BDA0003921317000000501
VPRO无血清培养基获得总生产体积的剩余50％。细胞培养在转染后继续11天。通过在4℃以4500rpm离心20分钟收获培养物(
Figure BDA0003921317000000502
Multifuge 3S-R,Thermo Scientific,Rockford,IL)。回收的细胞上清液通过stericup过滤器(0.22μm)无菌过滤并在4℃保存待进一步处理。
使用新鲜消毒的(0.25M NaOH)HiTrap ProtA MabSelect SuRe 5ml柱，在冷却箱中于4℃在“
Figure BDA0003921317000000511
100explorer Air”色谱系统上进行纯化。柱用5CV PBS(Gibco,LifeTechnologies,Carlsbad,CA)平衡，然后以4.0ml/分钟加载无菌过滤的上清液(2L)。用8CV的PBS洗柱以洗脱未结合的样品并再次用5CV的PBS洗涤。用5CV的50mM柠檬酸盐、70mM NaCl(pH3.2)洗脱抗体。洗脱物以3ml级分收集；储集级分并用1MTris-HCl pH10调节至pH7。储集库并无菌过滤(Millipore Steriflip,0.22um)，并在Spectrophotometer ND-1000(NanoDrop)中测量OD 280nm，并且基于序列数据计算蛋白质浓度。测试洗脱液的聚集(SEC-MALS)和纯度(SDS-PAGE、LAL和MS)。对于第二个纯化步骤，如果需要，来自第一次纯化的库加载到新鲜消毒(0.5M NaOH)的SPX(Hi Load 16/60Superdex 200级120mL(GE-Helthcare)中。用PBS平衡柱，并用PBS缓冲液以1ml/分钟完成运行。以1.2ml的级分收集洗脱物，并如第一次纯化步骤所述进行分析。
因此，产生了如表5中突出显示的3个人源化可变重链区域；VH1、VH3和VH5。
表5.可变重链区域
可变重链区 序列表
VH1 SEQ ID NO:7
VH3 SEQ ID NO:9
VH5 SEQ ID NO:17
此外，产生了如表6中突出显示的3个人源化可变轻链(κ)区；VK1,VK2和VK3。
表6.可变轻链区域
可变轻链区 序列表
VK1 SEQ ID NO:25
VK2 SEQ ID NO:27
VK3 SEQ ID NO:29
实施例4:结构修改的人源化
采用实施例2的晶体结构NARA1/hIL-2结果，对人源化设计进行改进。
在实施例3的最初人源化序列和最接近种系之间计算同一性。另外，计算重链和轻链的等电点(pI)。结果显示在表7和下面。
表7.pI数据
可变区 pI重链 pI重链改进版本 pI轻链 pI轻链改进版本
VH1 9.3 9.4
VH3 9.4 9.4
VH5 9.3 9.4
VK1 5.3 6.6
VK2 4.7 4.6
VK3 4.7 5.0
表8.比较可变区和可变种系区
可变区 ％ID(％sim)VH/VL种系 ％ID(％sim)VH/VL改进种系
VH1 85％(89％) 89％(90％)
VH3 77％(84％) 85％(88％)
VH5 86％(91％) 89％(91％)
VK1 85％(90％) 89％(93％)
VK2 82％(93％) 84％(93％)
VK3 83％(87％) 86％(89％)
根据该数据，决定改进结构VH3和VK3，导致产生表9中突出显示的序列。选择VH3是因为使用结构信息的种系改进序列有助于将与人模板的同一性％从77％增加至85％。
选择VK3是因为pI从4.7增加到5.0(VK1已经是5.3，发明人不打算通过使用结构信息来增加VK2的pI，所以决定使用VK3)。
表9.结构改进的可变区
可变轻链区 序列表
VK3s SEQ ID NO:34
可变重链区
VH3s SEQ ID NO:15
基于这六个可变重链和轻链区，根据表10中的概述，如SEQ ID NO:103所示，使用具有N297A点突变的人IgG1 Fc结构域产生九种抗体。
表10.抗体
抗体 可变轻链区 可变轻链SEQ ID 可变重链区 可变重链SEQ ID
104341 VK1 SEQ ID NO:25 VH1 SEQ ID NO:7
104343 VK2 SEQ ID NO:27 VH1 SEQ ID NO:7
104344 VK3s SEQ ID NO:34 VH1 SEQ ID NO:7
104345 VK1 SEQ ID NO:25 VH3s SEQ ID NO:15
104346 VK2 SEQ ID NO:27 VH3s SEQ ID NO:15
104347 VK3s SEQ ID NO:34 VH3s SEQ ID NO:15
104348 VK1 SEQ ID NO:25 VH5 SEQ ID NO:17
104349 VK2 SEQ ID NO:27 VH5 SEQ ID NO:17
104350 VK3s SEQ ID NO:34 VH5 SEQ ID NO:17
正如本领域技术人员已知的，任何Fc结构域都可以用于产生进一步的抗体。特别考虑的Fc结构域是非Fc修饰的SEQ ID NO:93的人IgG1，SEQ ID NO:95的人IgG2，SEQ IDNO:97的人IgG3，SEQ ID NO:99的人IgG4，根据SEQ ID NO:101的用LALA突变修饰的人IgG1Fc，根据SEQ ID NO:103的利用N297A突变修饰的人IgG1 Fc，根据SEQ ID NO:105的用DAPA突变修饰的人IgG1 Fc。
根据优选的实施方式，Fc结构域是SEQ ID NO:93的人IgG1，并且根据甚至更优选的实施方式，Fc结构域是根据SEQ ID NO:103的用N297A突变修饰的人IgG1Fc。
根据特定实施方式，抗体104343的完整轻链序列如SEQ ID NO:124所示，并且完整重链序列如SEQ ID NO:126所示。根据另一特定实施方式，抗体104348的完整轻链序列如SEQ ID NO:128所示，并且完整重链序列如SEQ ID NO:130所示。
实施例5:结构优化
使用实施例2的晶体结构NARA1/hIL-2结果，鉴定了进一步结构优化的CDR中的某些氨基酸残基。特别地，在LCDR1鉴定了所谓的DG位点并在HCDR3中鉴定了其他DG位点。令人惊讶的是，这些位点的一些突变显著降低了对人IL-2的亲和力，而其他突变不或几乎不影响亲和力。
通过使用诸如PyMOL或MOE等建模软件分析复合物的结构，并选择不与抗原紧密接触(即，距离抗原超过4埃)的CDR环上残基用于进一步人源化，以增加人源化序列和人模板之间的同一性％。
根据Kabat定义的所得轻链(κ)CDR如表11所示。
表11.轻链CDR
VL LCDR1 LCDR2 LCDR3
VK1 SEQ ID NO:19 SEQ ID NO:20 SEQ ID NO:21
VK2 SEQ ID NO:19 SEQ ID NO:20 SEQ ID NO:21
VK3 SEQ ID NO:19 SEQ ID NO:20 SEQ ID NO:21
VK3s SEQ ID NO:31 SEQ ID NO:32 SEQ ID NO:21
VK1_D28Q SEQ ID NO:69 SEQ ID NO:20 SEQ ID NO:21
VK1_G29A SEQ ID NO:72 SEQ ID NO:20 SEQ ID NO:21
VK2_D28Q SEQ ID NO:69 SEQ ID NO:20 SEQ ID NO:21
VK2_G29A SEQ ID NO:72 SEQ ID NO:20 SEQ ID NO:21
VK3_D28Q SEQ ID NO:69 SEQ ID NO:20 SEQ ID NO:21
VK3_G29A SEQ ID NO:72 SEQ ID NO:20 SEQ ID NO:21
VK3s_D28Q SEQ ID NO:86 SEQ ID NO:32 SEQ ID NO:21
VK3s_G29A SEQ ID NO:90 SEQ ID NO:32 SEQ ID NO:21
共有 SEQ ID NO:122 SEQ ID NO:123 SEQ ID NO:21
根据Kabat定义的所得重链CDR如表12所示。
表12.重链CDR
VH HCDR1 HCDR2 HCDR3
VH1 SEQ ID NO:4 SEQ ID NO:2 SEQ ID NO:3
VH3 SEQ ID NO:4 SEQ ID NO:2 SEQ ID NO:3
VH3s SEQ ID NO:13 SEQ ID NO:12 SEQ ID NO:3
VH5 SEQ ID NO:4 SEQ ID NO:2 SEQ ID NO:3
VH1_D98E SEQ ID NO:4 SEQ ID NO:2 SEQ ID NO:36
VH1_G99A SEQ ID NO:4 SEQ ID NO:2 SEQ ID NO:39
VH1_D98Q SEQ ID NO:4 SEQ ID NO:2 SEQ ID NO:42
VH1_D98S SEQ ID NO:4 SEQ ID NO:2 SEQ ID NO:45
VH3_D98E SEQ ID NO:4 SEQ ID NO:2 SEQ ID NO:36
VH3_G99A SEQ ID NO:4 SEQ ID NO:2 SEQ ID NO:39
VH3_D98Q SEQ ID NO:4 SEQ ID NO:2 SEQ ID NO:42
VH3_D98S SEQ ID NO:4 SEQ ID NO:2 SEQ ID NO:45
VH3s_D98E SEQ ID NO:13 SEQ ID NO:12 SEQ ID NO:36
VH3s_G99A SEQ ID NO:13 SEQ ID NO:12 SEQ ID NO:39
VH3s_D98Q SEQ ID NO:13 SEQ ID NO:12 SEQ ID NO:42
VH3s_D98S SEQ ID NO:13 SEQ ID NO:12 SEQ ID NO:45
VH5_D98E SEQ ID NO:4 SEQ ID NO:2 SEQ ID NO:36
VH5_G99A SEQ ID NO:4 SEQ ID NO:2 SEQ ID NO:39
VH5_D98Q SEQ ID NO:4 SEQ ID NO:2 SEQ ID NO:42
VH5_D98S SEQ ID NO:4 SEQ ID NO:2 SEQ ID NO:45
共有 SEQ ID NO:119 SEQ ID NO:120 SEQ ID NO:121
VH5突变D98E可耐受，而D98S和D98Q令人惊讶地不能耐受。突变G99A也被耐受。对于VK1突变，D28Q可耐受，而令人惊讶的是突变G29A不被耐受。
根据本发明人的非结合理论，用氨基酸A、G或T取代VH D98氨基酸和/或VL D28氨基酸也是可以耐受的。另外，用氨基酸T或S取代VH G99氨基酸或VL G29氨基酸也是可以耐受的。
根据这些最佳可变重链和轻链区，使用具有N297A点突变的人IgG1 Fc结构域和根据表13概述的可变轻链和重链区产生了十二种优化的抗体。
表13.优化的抗体
Figure BDA0003921317000000551
正如本领域技术人员已知的，任何Fc结构域都可以用于产生进一步的抗体。特别考虑的Fc结构域是非Fc修饰的SEQ ID NO:93的人IgG1，SEQ ID NO:95的人IgG2，SEQ IDNO:97的人IgG3，SEQ ID NO:99的人IgG4，根据SEQ ID NO:101的用LALA突变修饰的人IgG1Fc，根据SEQ ID NO:103的利用N297A突变修饰的人IgG1 Fc，根据SEQ ID NO:105的用DAPA突变修饰的人IgG1 Fc。
根据优选的实施方式，Fc结构域是SEQ ID NO:93的人IgG1，并且根据甚至更优选的实施方式，Fc结构域是根据SEQ ID NO:103的用N297A突变修饰的人IgG1Fc。
根据特定实施方式，抗体104348_VH5D98E_VK1D28Q的完整重链序列如SEQ ID NO:229所示，并且完整轻链序列如SEQ ID NO:395所示。
实施例6:亲和力成熟
使用人源化NARA1(104348_VH5D98E_VK1D28Q)作为起点，进行基于多个步骤的亲和力成熟过程，以在酵母表面上作为Fab的亲本VH(SEQ ID NO:49)和VK(SEQ ID NO:70)的克隆和表达开始，并确定生物素化
Figure BDA0003921317000000552
的最佳和次佳结合浓度。
简言之，亲本或野生型(WT)VH(SEQ ID NO:49)和VK(SEQ ID NO:70)序列作为Fab克隆到酵母展示载体中，其包含与VH羧基末端符合读框的aga2序列和轻链的羧基末端符合读框的衍生自β-淀粉样蛋白(APP-标签)的6氨基酸标签。该标签的检测允许表面上Fab的表达水平可视化，这是本领域技术人员熟知的。在载体在酵母中电穿孔(Benatuil L.等.(2010).An improved yeast transformation method for the generation of verylarge human antibody libraries。Protein Eng Des Sel.,23(4),pp。155-9.)后，细胞在减去尿嘧啶的CM葡萄糖肉汤培养基中生长。诱导时，用7ml诱导培养基(减去尿嘧啶的CM半乳糖肉汤培养基/0.05％葡萄糖)洗涤在其指数期生长的7.8E+4酵母细胞，并通过在4000rpm旋转细胞10分钟使其沉淀成球。将沉淀重悬于诱导培养基(1E+7细胞/ml)，并在22℃振荡培养16小时(HR)。在4℃预冷离心机中以13000rpm离心1分钟收集诱导的酵母细胞(4E+7)。通过将沉淀重新悬浮在1ml FACS缓冲液(PBS+0.5％BSA)中，然后在4℃预冷的离心机中以13000rpm离心1分钟洗涤细胞。将酵母沉淀重悬于1ml FACS缓冲液中，并将50μl转移至12个在FACS缓冲液中含有不同浓度生物素化的
Figure BDA0003921317000000561
(0nM/0.02nM/0.05nM/0.15nM/0.45nM/1.3nM/4nM/12nM/36nM/100nM/333nM/1μM)的管中。将酵母在室温(RT)在旋转器上温育1小时，用如上所述的1ml FACS缓冲液洗涤两次，并将沉淀重新悬浮于含有抗APP小鼠单克隆抗体的200μl FACS缓冲液中。在旋转器上于室温孵育30分钟后，用1ml FACS缓冲液洗涤酵母两次，并将沉淀物重新悬浮在200μl标记缓冲液(别藻蓝蛋白(APC)-缀合链亲和素/藻红蛋白(PE)标记的抗小鼠抗体/FACS缓冲液)中。在室温下在旋转器上温育30分钟后，用1ml FACS缓冲液洗涤细胞两次，再悬浮于500μl冷FACS缓冲液中，并通过FACS管的帽顾虑。将样品保持在黑暗中直到FACS分析。选择FACS分析的门控策略，使得测量单一酵母细胞(singlets)的PE信号(酵母表面上的Fab表达水平)和APC信号(生物素化的
Figure BDA0003921317000000562
结合)。在酵母表面上生物素化
Figure BDA0003921317000000563
与Fab的结合可以被显现为PE信号和APC信号都为阳性的FACS-图中的事件(数据未显示)。如预期的，酵母与大量生物素化
Figure BDA0003921317000000564
(1μM-12nM)的孵育导致检测到大量PE和APC阳性的事件。该浓度范围被认为是最佳浓度范围。酵母与4nM和1.3nM生物素化
Figure BDA0003921317000000565
的孵育产生相似水平的PE信号，但APC信号急剧下降，表明较少生物素化的
Figure BDA0003921317000000566
与酵母表面上的Fab结合。该浓度范围被认为是次优的浓度。与浓度低于1.3nM(0.45nM/0.15nM/0.05nM/0.02nM)的生物素化
Figure BDA0003921317000000567
孵育的酵母显示背景水平的APC信号，表明没有生物素化的
Figure BDA0003921317000000568
与Fab结合。
在下一个步骤中，通过易错PCR(Cadwell R.和Joyce G(1994)Mutagenic PCR.PCRMethods Appl.,3(6),136-140页)使用GeneMorph II随机诱变试剂盒(Agilent，目录号200550)对VH(SEQ ID NO:49)和VK(SEQ ID NO:70)分别随机诱变。由此产生两个酵母文库(Benatuil等，2010)，其表达由与亲本VK(VKp)(SEQ ID NO:70)配对的诱变的VK(VKep)构成的Fab，或由与VH(VHp)(SEQ ID NO:49)配对的诱变VK(VKep)构成的Fab。在第一轮筛选中，诱导两个酵母文库(VHep/VKp和VHp/VKep)以及亲本(VHp/VKp)表达酵母，并使用上述方案以最佳浓度(10nM)的生物素化的
Figure BDA0003921317000000571
进行FACS染色(1E+9VHep/VKp和VHp/VKep:1E+7VHp/VKp)。对PE和APC均为阳性的至少80 000个酵母细胞在含有1ml减去尿嘧啶的CM葡萄糖肉汤的15ml Falcon管中进行FACS分选。该选择允许富集在其表面上表达功能性Fab的酵母。
在第一轮的FACS分选的酵母扩增后，应用第二轮选择。将表达VHp/VKp,VHep/VKp和VHp/VKep的酵母(1E+7)在没有生物素化的
Figure BDA0003921317000000572
10nM生物素化
Figure BDA0003921317000000573
(最佳浓度)或2nM生物素化
Figure BDA0003921317000000574
(次优浓度)孵育，并如上所述进行FACS染色。如先前所观察到的，表达VHp/VKp的酵母与10nM
Figure BDA0003921317000000575
的孵育导致检测到显著数目的PE和APC均阳性的事件。低于表达VHp/VKep文库的酵母获得了相似结果。有趣的是，在该浓度下，VHep/VKp文库中的APC信号强得多，而PE信号与在表达VHp/VKp和VHp/VKep的酵母中观察到的相当，这表明更多生物素化
Figure BDA0003921317000000576
结合在酵母表面表达的Fab上。当酵母与次最佳生物浓度的生物素化
Figure BDA0003921317000000577
孵育时，这种趋势变得更加明显。在这些条件下，表达VHp/VKp和VHp/VKep的酵母显示出对PE和APC均为阳性的少量事件，而表达VHep/VKp的酵母显示出相似水平的PE，但高得多的水平的APC。基于这些发现，对PE和APC均呈阳性的与2nM生物素化
Figure BDA0003921317000000578
孵育的表达VHep/VKp文库的所有酵母均如前所述进行FACS分选。对于与10nM生物素化
Figure BDA0003921317000000579
孵育的表达VHp/VKep的酵母文库进行了同样的工作。
在扩增两个文库后，通过用消解酶(Zymoresearch,目录号E1004)与酵母沉淀预先孵育从酵母中提取质粒，接着使用小型制备离心柱(Qiagen,目录号27106)回收质粒。将回收的质粒电穿孔进入细菌并在选择平板上生长。挑取单菌落并在96孔板中生长过夜，然后根据制造商方案(Macherey-Nagel,目录号740616.24)使用Nucleospin 96质粒核心试剂盒进行质粒分离。质粒进行测序和分析。表14中总结了VH突变
观察到的突变以各种组合物(表14为VH SEQ ID No，表15为VK SEQ ID No)克隆到亲本IgG1哺乳动物编导载体中(表16)。
表14.VH突变
命名 VH
VHp/WT(VH5_D98E) SEQ ID NO:49
VH-F100dY/N58Y/T30S SEQ ID NO:145
VH-F100dY/N58Y SEQ ID NO:161
VH-F100dY/T30S SEQ ID NO:177
VH-F100dY SEQ ID NO:193
VH-N58Y/T30S SEQ ID NO:209
VH-N58Y SEQ ID NO:225
表15.VK突变
命名 VL
VKp/WT(VK1_D28Q) SEQ ID NO:70
VK-A50S SEQ ID NO:243
VK-A50T SEQ ID NO:259
VK-M33L/A50S SEQ ID NO:275
VK-M33L SEQ ID NO:391
表16.质粒
质粒ID 突变/s VH
SP#2764 WT SEQ ID NO:49
SP#3563 F100d_Y SEQ ID NO:193
SP#3564 N58Y SEQ ID NO:225
SP#3569 F100d_Y+N58Y SEQ ID NO:161
SP#3566 F100d_Y+T30S SEQ ID NO:177
SP#3567 N58Y+T30S SEQ ID NO:209
SP#3587 F100d_Y+N58Y+T30S SEQ ID NO:145
质粒ID 突变/s VL
SP#2445 WT SEQ ID NO:70
SP#3568 M33L SEQ ID NO:391
SP#3569 A50S SEQ ID NO:243
SP#3570 A50T SEQ ID NO:259
SP#3571 M33L+A50S SEQ ID NO:275
随后，如表17中所见，设计了质粒的转染矩阵，所述质粒编码产生35种独特抗体的野生型或突变形式的VH和VK。将质粒转染至在6孔板中使用Fugene HD(Promega,目录号E2311)根据制造商的方法生长的HEK293F细胞。转染后三天收获上清液，使用蛋白A/HPLCA/HPLC(Holenstein F.等(2015)Automated harvesting and 2-step purification ofunclarified mammalian cell-culture broths containing antibodies.JChromatogrA.,1418,103-109页)确定上清液中的抗体滴度(内部过程控制，IPC)。
表17.第一组抗体
Figure BDA0003921317000000591
抗体的序列在表41中列出并总结在下表18中。
表18.第一组抗体的序列总结
抗体 VH VL 全长重链 全长轻链
1 SEQ ID NO:49 SEQ ID NO:70 SEQ ID NO:229 SEQ ID NO:395
2 SEQ ID NO:49 SEQ ID NO:391 SEQ ID NO:229 SEQ ID NO:393
3 SEQ ID NO:49 SEQ ID NO:243 SEQ ID NO:229 SEQ ID NO:245
4 SEQ ID NO:49 SEQ ID NO:259 SEQ ID NO:229 SEQ ID NO:261
5 SEQ ID NO:49 SEQ ID NO:275 SEQ ID NO:229 SEQ ID NO:277
6 SEQ ID NO:193 SEQ ID NO:70 SEQ ID NO:195 SEQ ID NO:395
7 SEQ ID NO:193 SEQ ID NO:391 SEQ ID NO:195 SEQ ID NO:393
8 SEQ ID NO:193 SEQ ID NO:243 SEQ ID NO:195 SEQ ID NO:245
9 SEQ ID NO:193 SEQ ID NO:259 SEQ ID NO:195 SEQ ID NO:261
10 SEQ ID NO:193 SEQ ID NO:275 SEQ ID NO:195 SEQ ID NO:277
11 SEQ ID NO:225 SEQ ID NO:70 SEQ ID NO:227 SEQ ID NO:395
12 SEQ ID NO:225 SEQ ID NO:391 SEQ ID NO:227 SEQ ID NO:393
13 SEQ ID NO:225 SEQ ID NO:243 SEQ ID NO:227 SEQ ID NO:245
14 SEQ ID NO:225 SEQ ID NO:259 SEQ ID NO:227 SEQ ID NO:261
15 SEQ ID NO:225 SEQ ID NO:275 SEQ ID NO:227 SEQ ID NO:277
16 SEQ ID NO:161 SEQ ID NO:70 SEQ ID NO:163 SEQ ID NO:395
17 SEQ ID NO:161 SEQ ID NO:391 SEQ ID NO:163 SEQ ID NO:393
18 SEQ ID NO:161 SEQ ID NO:243 SEQ ID NO:163 SEQ ID NO:245
19 SEQ ID NO:161 SEQ ID NO:259 SEQ ID NO:163 SEQ ID NO:261
20 SEQ ID NO:161 SEQ ID NO:275 SEQ ID NO:163 SEQ ID NO:277
21 SEQ ID NO:177 SEQ ID NO:70 SEQ ID NO:179 SEQ ID NO:395
22 SEQ ID NO:177 SEQ ID NO:391 SEQ ID NO:179 SEQ ID NO:393
23 SEQ ID NO:177 SEQ ID NO:243 SEQ ID NO:179 SEQ ID NO:245
24 SEQ ID NO:177 SEQ ID NO:259 SEQ ID NO:179 SEQ ID NO:261
25 SEQ ID NO:177 SEQ ID NO:275 SEQ ID NO:179 SEQ ID NO:277
26 SEQ ID NO:209 SEQ ID NO:70 SEQ ID NO:211 SEQ ID NO:395
27 SEQ ID NO:209 SEQ ID NO:391 SEQ ID NO:211 SEQ ID NO:393
28 SEQ ID NO:209 SEQ ID NO:243 SEQ ID NO:211 SEQ ID NO:245
29 SEQ ID NO:209 SEQ ID NO:259 SEQ ID NO:211 SEQ ID NO:261
30 SEQ ID NO:209 SEQ ID NO:275 SEQ ID NO:211 SEQ ID NO:277
31 SEQ ID NO:145 SEQ ID NO:70 SEQ ID NO:147 SEQ ID NO:395
32 SEQ ID NO:145 SEQ ID NO:391 SEQ ID NO:147 SEQ ID NO:393
33 SEQ ID NO:145 SEQ ID NO:243 SEQ ID NO:147 SEQ ID NO:245
34 SEQ ID NO:145 SEQ ID NO:259 SEQ ID NO:147 SEQ ID NO:261
35 SEQ ID NO:145 SEQ ID NO:275 SEQ ID NO:147 SEQ ID NO:277
随后，使用ELISA测定存在于上清液中的抗体的hIL-2结合效率。简而言之，将ELISA板(Maxisorp 96孔黑色微量滴定板)在4℃用100μL/孔的
Figure BDA0003921317000000601
(5μg/mlPBS)包被过夜。使用洗板机(BioTek)用TBST(1×TBS/0.05％吐温20)将ELISA板洗涤一次。通过加入350μl/孔封闭缓冲液(TBS/1X酪蛋白(Vector laboratories 10X溶液#SP-5020)，0.22μm过滤)封闭板，并在室温下通过轻轻搅拌孵育2小时。除去封闭缓冲液后，用洗板机以TBST洗涤板1次。将上清液在封闭缓冲液中以1:2稀释，并将50μl转移至ELISA板的指定孔。每个样品存在于三个ELISA板上。三个板在温和搅拌下于室温孵育。孵育2小时后，将其中一个板用TBST洗涤三次，然后加入100μl/孔检测抗体(TBST/山羊多克隆HRP-缀合抗人Fab2；Dianova/Jackson ImmunResearch，目录号109-036-006)。其他两个平板或者每小时用TBST在4小时每小时洗涤3次，或者在12小时每小时洗涤3次，然后加入检测抗体。在温和搅拌下室温孵育1小时后，将孔用洗涤缓冲液洗涤3次，并在加入100μl/孔BM ChemiLuminesenceELISA底物(POD)(Roche Diagnostics#11582950001)之前将板在一叠纸巾上轻拍干燥。发光信号在黑暗中孵育5分钟后测量。表19中显示了35种抗体的ELISA值。所有ELISA值是基于两次测量的平均值。
表19.ELISA值
Figure BDA0003921317000000621
大多数引入的突变(例如抗体编号：8/11/12/13/15/16/20/28/30/31)与亲本抗体(抗体编号：1)相比显示相似或更低的滴度，但是显著提高了结合效率。甚至在12小时过度洗涤后，一些突变体仍显示出高水平的结合(例如抗体编号：12/13/15/20/28)。为了对各种抗体排序，将上清液连续稀释并通过ELISA确定结合亲和力。
根据本领域技术人员熟知的标准方法，使用由蛋白质A/HPLC确定的滴度计算EC50值。结果总结于表20中。
表20.EC50值
Figure BDA0003921317000000631
基于结合效率和突变的表示，选择一组7种抗体(表21)，进行表达和纯化(Holenstein等，2015)并进一步表征。
表21.所选的抗体
Figure BDA0003921317000000641
所选抗体的序列如表41所示，并在下表22中总结。
表22.所选抗体的序列概述
抗体 VH VL 全长重链 全长轻链
108923 SEQ ID NO:193 SEQ ID NO:243 SEQ ID NO:195 SEQ ID NO:245
108924 SEQ ID NO:225 SEQ ID NO:391 SEQ ID NO:227 SEQ ID NO:393
108925 SEQ ID NO:225 SEQ ID NO:243 SEQ ID NO:227 SEQ ID NO:245
108926 SEQ ID NO:225 SEQ ID NO:275 SEQ ID NO:227 SEQ ID NO:277
108928 SEQ ID NO:161 SEQ ID NO:275 SEQ ID NO:163 SEQ ID NO:277
108929 SEQ ID NO:209 SEQ ID NO:259 SEQ ID NO:211 SEQ ID NO:261
108930 SEQ ID NO:209 SEQ ID NO:275 SEQ ID NO:211 SEQ ID NO:277
实施例7:结合亲和力
1.酶联免疫吸附测定(ELISA)
使用本领域技术人员熟知的ELISA筛选候选物。
ELISA板(Corning)在4℃用PBS中10μg/mL的人IL-2
Figure BDA0003921317000000642
包被过夜。将板用PBST洗涤6次，然后在1％ BSA/PBST中封闭2小时。封闭和洗涤后，在1％BSA/PBST中以11点稀释系列在平板上加入抗人IL-2抗体，并孵育2小时。然后再次洗涤平板，接着以在1％BSA/PBST中1:10,000稀释的检测抗体：抗小鼠IgG-生物素化(NARA1)或抗人IgG-生物素化(人源化抗体)孵育2小时。然后再次洗涤平板，并与链亲和素-辣根过氧化物酶在1％ BSA/PBS中孵育45分钟。清洗后，将底物(R&D Systems)加入平板，并在3分钟后通过加入终止溶液停止酶促反应。用酶标仪在450nm处读取平板，波长校正设置为540nm。
整个过程在室温进行。
表23列出了3次独立ELISA实验的平均值。
2.溶液平衡滴定(SET)测试
进行本领域技术人员熟知的SET测试，以确定和比较五种人源化抗IL-2抗体和抗IL-2(NARA1)-小鼠IgG2a与IL-2的亲和力(KD)。
溶液平衡滴定(SET)测试允许测定紧密结合物的抗体-抗原相互作用亲和力(KD)。该技术不需要固定或标记任一相互作用伙伴，并且适合于强相互作用(KD＝pM至低nM范围)。
将恒定浓度的抗体(浓度等于或低于预期的KD)的混合物与合适的浓度范围(远低于和远高于KD)的抗原共孵育直至达到平衡。游离抗体结合位点的量通过转移混合物至抗原包被的平板上并进行简短的孵育来确定。游离抗体然后结合平板并且用检测抗体检测。将所得信号相对于抗原浓度作图。通过非线性曲线拟合精确确定KD。
(1)材料和方法
使用以下抗体：
·抗IL-2(NARA1)-mIgG2a:8.7mg/ml,150kDa,58.00μM
·抗IL-2-hsIgG1 104340(嵌合NARA1抗体):4.25mg/ml,150kDa,28.33μM
·抗IL-2-hsIgG1 104343:3.69mg/ml,150kDa,24.60μM
·抗IL-2-hsIgG1 104347:4.03mg/ml,150kDa,26.87μM
·抗IL-2-hsIgG1 104348:2.71mg/ml,150kDa,18.07μM
·抗IL-2-hsIgG1 104349:3.29mg/ml,150kDa,21.93μM
抗原
·IL-2
Figure BDA0003921317000000651
1.00mg/ml,15.33kDa,65.24μM
·IL-2(WT):0.15mg/ml,15.55kDa,9.65μM
检测抗体
·MSD磺基标记的山羊抗人抗体,Meso Scale Discovery,目录号R32AJ-5
·MSD磺基标记的抗小鼠抗体,Jackson IR,目录号115-005-071
仪器和软件
·MSD SECTOR Imager 6000，由Discovery Workbench软件控制
·以XLfit(MS Excel插件软件)进行数据处理
测试板
·SECTOR Imager 6000用标准384孔板,Meso Scale Discovery，目录号L21XA
·聚丙烯384孔板,Greiner目录号781280
试剂
·牛血清白蛋白(BSA),VWR目录号422351S
·磷酸盐缓冲盐水(PBS)10x,Teknova目录号P0195
·MSD读取缓冲液T 4x,Meso Scale Discovery目录号R92TC-1
·Tris缓冲盐水(TBS)20x,Teknova目录号T1680
·吐温-20,VWR目录号437082Q
缓冲液
·封闭缓冲液:1x PBS+5％(w/v)BSA
·包被缓冲液:1x PBS
·样品缓冲液:1x PBS+0.5％(w/v)BSA+0.02％(v/v)吐温-20
·洗涤缓冲液:1x TBS+0.05％(v/v)吐温-20
·读取缓冲液:1x MSD读取缓冲液
在样品缓冲液中制备22个连续2n稀释的抗原。加入恒定浓度的抗体。抗原和抗体浓度列于下面。体积为60μl的每种抗原:抗体混合物一式两份分配在384孔聚丙烯微量滴定板(PP MTP)中。样品缓冲液用作阴性对照，并且将不含抗原的样品用作阳性对照((Bmax)。将平板密封并在室温(RT)孵育过夜(o/n)。
将384孔标准MSD阵列板用2μg/ml IL-2包被。用洗涤缓冲液洗涤三次后，用50μl/孔封闭缓冲液在室温下封闭平板1小时。洗涤后，将体积为30μl/孔的抗原:抗体混合物从PPMTP转移至包被的MSD板，并在室温孵育20分钟。
在另外的洗涤步骤后，在每个孔中加入样品缓冲液中的30μl检测抗体(1：2000稀释)并在室温孵育30分钟。洗涤MSD板并加入35μl/孔的读取缓冲液并孵育5分钟。用MSDSECTOR Imager 6000测量ECL信号。
(2)结果
SET的结果如表23所示。所有测试的抗IL-2抗体在低pM范围内对IL-2蛋白显示了相似的亲和力(IL-2wt未显示)。
表23.结合亲和力数据
Figure BDA0003921317000000671
从表23中可以看出，大部分人源化抗体具有与NARA1相似的对人IL-2的结合亲和力。然而令人惊讶的是，一些人源化抗体具有较低的结合亲和力(104347的情形)。
实施例8:IL-2/抗IL-2mAb复合物体外评价
在源自PBMC的CD8 T细胞增殖测定中，将人源化抗IL-2抗体的活性与NARA1进行比较。
在从白膜层(Buffy-coat)中在Ficoll后通过负磁分离人CD8T细胞以100000细胞/孔铺板于补充有5％人血清的完全RPMI培养基中。细胞在37℃仅用抗IL-2抗体(0.5μg/ml)刺激48小时或以2:1摩尔比的IL-2(
Figure BDA0003921317000000672
0.1μg/ml)加抗IL-2抗体(0.5μg/ml)刺激48小时。细胞在最后16小时用3H-胸苷掺加，收集，并用β-计数器测量增殖。实验一式三份进行，并且单独的抗体的计数与未受刺激的细胞的背景信号水平相当。
表24.CD8 T细胞增殖数据
Figure BDA0003921317000000681
如表24中所见，大多数人源化抗体在体外诱导人CD8T细胞增殖方面具有与NARA1相似的能力。
在替代性方法中，在人PBMC衍生的CD8T和NK细胞的7天增殖测定中评估一些人源化抗IL-2抗体的活性。
通过Ficoll密度梯度离心法从白膜层中纯化的人PBMC进行磁珠阴性选择，以分离CD8+T和NK细胞。细胞用CellTrace紫罗兰色增殖试剂盒标记，并在补充10％胎牛血清的RPMI 1640培养基中以50000细胞/孔在96U型底板中铺板。然后用hIL-2或hIL-2/抗IL-2mAb复合物(以2:1的摩尔比，10倍连续稀释)刺激细胞，并在37℃孵育7天。通过FACS测量的CellTrace Violet掺入来评估增殖。实验一式三份进行，并且平均EC50值由2次独立实验计算。
表25.CD8 T和NK细胞增殖数据
Figure BDA0003921317000000691
实施例9:IL-2/抗IL-2mAb复合物体外评价
如下所述，在接受IL-2/抗IL-2mAb复合物的WT C57BL/6小鼠中测定CD8+T细胞,CD4+T细胞和NK细胞的计数。平行地，使用溴脱氧尿苷(BrdU)评价CD8+T细胞和NK细胞的增殖水平。
(1)材料和方法
使用了以下抗体：104340(嵌合NARA1抗体)、104343、104347、104348、104349、104341。
使用了
Figure BDA0003921317000000692
IL-2。
这个实验一式两份进行，第一次没有包括人源化104341。
小鼠接受4次连续注射1.5μg(低剂量；LD)或20μg(高剂量；HD)的hIL-2或hIL-2/单克隆抗体(分别为对应于1:1摩尔比的1.5μg和15μg)。最后一次注射当天，在饮用水中以0.8mg/ml给予5-溴-2'-脱氧尿苷(BrdU)24小时。第二天，将小鼠处死，通过流式细胞仪分析脾和淋巴结(LN)。为此，根据标准方案制备LN和脾的单细胞悬液，并将2×106细胞用含2％胎牛血清(FCS)、2mM EDTA和荧光染料缀合的抗体(见下文)的PBS进行染色以用于流式细胞术分析。
进行两种不同的染色：第一次染色是为了鉴定和定量CD4+CD25+叉头箱P3(FoxP3)+T调节细胞。为此，使用FoxP3染色缓冲液并遵循供应商的建议(eBiosciences，00-5523-00)和使用荧光染料缀合的抗体对单细胞悬液进行染色，所述抗体抗以下标记：CD25、CD8a、CD4、CD3、FoxP3。
进行第二次染色以便于鉴定和定量特定细胞子集的细胞增殖，其中使用荧光染料缀合的抗BrdU抗体来染色已经增殖过的细胞。BrdU染色使用FITC BrdU试剂盒并遵循供应商建议(BD Pharmingen，51-2354AK)和使用荧光染料缀合的抗体进行，所述抗体抗以下标记：CD44、CD8a、CD4、NK1.1、CD3、CD122、Brdu。
使用本领域技术人员熟知的Becton Dickinson LSR Fortessa流式细胞仪收集数据。
(2)结果
细胞计数数据的结果如表26和表27所示。
表26.细胞计数数据
Figure BDA0003921317000000701
表27.细胞计数数据细胞计数(×10^6)
Figure BDA0003921317000000702
如表26和表27所示，与IL-2复合的抗体104343、104347、104348、104349和104341可以刺激体内CD8和NK细胞。
另外，图6显示了小鼠脾脏中获得的免疫细胞的数量。绘制的值示于表23和表24中。图7显示小鼠脾脏中CD8+CD44+CD122+T细胞的代表性BrdU谱。图8显示小鼠脾脏中CD3-NK1.1+NK细胞的代表性BrdU谱。
从这些结果我们可以得出结论，与IL-2复合的嵌合NARA1抗体104340一样，人源化抗体104343、104348、104349和104341能够优先刺激CD8+T细胞和NK细胞。人源化104347抗体的情况并非如此。
实施例10:利用接头产生IL-2/抗IL-2mAb融合蛋白
使用实施例2的晶体结构NARA1/hIL-2的结果，已经确定用于连接NARA1重链和轻链N-末端区至hIL-2的方式。
使用PyMOL或MOE等建模软件分析复合物的结构，并观察到hIL-2的C末端位于所述抗体的抗原结合位点的对侧，因此需要接头进行连接。所产生的融合蛋白是由IL-2、随后的接触区、随后的抗体重链区构成。接头区需要覆盖距离至少为
Figure BDA0003921317000000711
Figure BDA0003921317000000712
的距离，因此可以设计和测试不同长度和组成的接头，以实现最佳连接。
融合分子也可以是IL-2、随后的接头、随后的抗体的轻链。在这种融合中，接头区需要覆盖
Figure BDA0003921317000000713
的距离，因此在这里也可以设计和测试数种接头的长度和组成，以找到最佳候选物。
所述抗体重链或轻链的序列可以是使用如SEQ ID NO:93所示的人IgG1Fc结构域和表10中报道的可变域产生的抗体中的任何一种。
IL-2序列可以是由SEQ ID NO:109表示的wt IL-2或由SEQ ID NO:110表示的阿地白介素。
表28中报道了可用于连接IL-2的C末端和所述抗体重链或轻链的N末端残基的接头序列。
表28.接头长度和组成的实例
接头 序列ID
(G4S)3 SEQ ID NO:397
(G4S)4 SEQ ID NO:398
(G4S)5 SEQ ID NO:399
(G4S)6 SEQ ID NO:400
(G4S)7 SEQ ID NO:401
(G4S)8 SEQ ID NO:402
(G4S)9 SEQ ID NO:403
(G3S)4 SEQ ID NO:404
(G3S)5 SEQ ID NO:405
(G3S)6 SEQ ID NO:406
(G3S)7 SEQ ID NO:407
(G3S)8 SEQ ID NO:408
(G3S)9 SEQ ID NO:409
(G3S)10 SEQ ID NO:410
(G3S)11 SEQ ID NO:411
根据表29，产生两种特定融合蛋白。
表29.融合蛋白
命名 IL-2 接头 mAb
107348 阿地白介素 (G4S)5,25aa VH5_D98E_VK1_D28Q-hIgG1
107350 阿地白介素 (G4S)7,35aa VH5_D98E_VK1_D28Q-hIgG1
实施例11:产生IL-2/抗IL-2mAb融合蛋白
已经使用复合物NARA1/hIL-2的结构来指导将IL-2嵌入到NARA1抗体的重链或轻链中。所述抗体的LCDR1和连接残基K96和N97之间的hIL-2螺旋B和螺旋C的区域可以识别为用于进一步工程化的区域。LCDR1在Y27d和D28之间以及G29和D30之间打开，根据Kabat定义编号。hIL-2在K96和N97之间打开。见图9。
所述抗体的LCDR1的残基D28G29被Gs代替。hIL-2新N端N97通过GGG接头连接到LCDR1 Y27d的新C端。hIL-2C端K96通过GGGG接头连接至LCDR1 N端D30。见图10。hIL-2的两个原始N端和C端连接在一起，即IL-2-T153 C端残基直接与IL-2N端残基P22融合。图11是IL-2和抗体VL序列如何融合的示意图。
所得融合蛋白命名为107351。
这个工程化程序允许hIL-2完全嵌入到NARA1抗体的轻链中。这种嵌入可以通过使用表10中报道的任何人源化序列来完成。用于嵌入到轻链的接头的序列和长度hIL-2可以是1至10个重复的甘氨酸(G)，也可以测试融合体，其中LCDR1 Y27d和hIL-2N97、LCDR1 D30和hIL-2K96直接连接而其间没有任何接头序列。hIL-2的编号是指SEQ ID NO:109中报道的全长序列。在SEQ ID NO:110代表的阿地白介素中的相应残基也可以用于嵌入程序。
实施例12:IL-2/抗IL-2mAb融合蛋白的活性
在人PBMC衍生的CD8 T和NK细胞的7天增殖测定中评估一些IL-2/抗IL-2mAb融合蛋白的活性。
通过Ficoll密度梯度离心法从白膜层中纯化的人PBMC进行磁珠阴性选择，以分离CD8+T和NK细胞。细胞用CellTrace紫罗兰色增殖试剂盒标记，并在补充10％胎牛血清的RPMI 1640培养基中以50000细胞/孔在96U型底板中铺板。然后用hIL-2或hIL-2/抗IL-2mAb复合物(以2:1的摩尔比，10倍连续稀释)刺激细胞，并在37℃孵育7天。通过FACS测量的CellTrace紫罗兰色掺入来评估增殖。实验一式三份进行，并且平均EC50值由3次独立实验计算并如表30所示。
表30.CD8 T和NK细胞增殖数据
Figure BDA0003921317000000731
使用25或35个残基的接头序列的IL-2/抗IL-2mAb融合蛋白分别对NK细胞增殖和CD8 T细胞增殖具有有限的活性或没有活性。对比之下，移植到人源化的NARA1抗体的轻链上的IL-2/抗IL-2单克隆抗体融合蛋白与单独IL-2一样有效地激活CD8T细胞增殖并且比IL-2更有效地刺激NK细胞增殖。
后一种融合蛋白随后在体内评估。小鼠接受单次剂量107351(360μg/kg、720μg/kg或1440μg/kg)或PBS，并在注射后96小时处死。通过流式细胞术按照标准方案分析脾细胞，结果汇总于表31。
表31.CD8 T、NK和Treg细胞计数
Figure BDA0003921317000000741
融合蛋白107351可以以剂量依赖性方式诱导CD8+和NK细胞的强力扩增，并具有非常有限的体内调节性T细胞的激活。
实施例13:IL-2/抗IL-2 mAb复合物(人源化和亲和力成熟的人源化抗hIL-2抗体) 体内评价
为了评估IL-2/抗l-IL-2mAb复合物在体内的作用，进行了两种实验方法。在第一种方法中，测定如下所述接受两次IL-2/抗IL-2mAb复合物注射的WT C57BL/6小鼠中的CD8+T细胞、CD4+T细胞和NK细胞计数。第二次实验中，在单次注射IL-2/抗l-IL-2mAb复合物后，使用BrdU评估CD8+T细胞、CD4+T细胞和NK细胞的增殖水平。
(1)材料和方法
使用了以下抗体：NARA1、104348、106260、108923、108924、108925、108926、108929和108930。
使用了
Figure BDA0003921317000000742
IL-2。
在第一个实验中，小鼠在第1天和第3天接受了1.5μg hIL-2和hIL-2/单克隆抗体(15μg，对应于1：1的摩尔比)的2次注射。在第5天，处死小鼠，并通过流式细胞术分析脾和淋巴结(LN)。为此，根据标准方案制备LN和脾的单细胞悬液，并将2×106至3×106细胞用含2％胎牛血清(FCS)、2mM EDTA和荧光染料缀合的抗体的PBS进行染色以用于流式细胞术分析。进行染色，以鉴定和定量CD4+CD25+叉头箱P3(FoxP3)+T调节性细胞(Treg)。为此，单细胞悬浮液使用FoxP3染色缓冲液并遵循供应商的建议(eBiosciences，00-5523-00)和使用荧光染料缀合的抗体对单细胞悬液进行染色，所述抗体抗以下标记：CD25、CD8a、CD44、CD122、NK1.1、DX5、CD4、CD3、FoxP3。
在第二个实验中，小鼠接受单次注射1.5μg hIL-2和hIL-2/单克隆抗体(15μg，对应于1：1的摩尔比)。与此同时，在饮用水中给与0.8mg/ml的BrdU。第二天(注射和BrdU后24小时)进行染色以便鉴定和定量特定细胞免疫子集的细胞增殖，其中使用荧光染料缀合的抗BrdU抗体对已经增殖的细胞进行染色。使用FITC BrdU试剂盒并遵循供应商的推荐(BDPharmingen，51-2354AK)和使用荧光染料缀合的抗体进行BrdU染色，所述抗体抗以下标记：CD44、CD8a、CD4、NK1.1、CD3、CD122、Brdu、CD4。
使用本领域技术人员熟知的Becton Dickinson LSR Fortessa流式细胞仪收集数据。
(2)结果
细胞计数数据的结果如表32和表33所示。
表32.细胞计数数据
Figure BDA0003921317000000751
表33.细胞计数数据
Figure BDA0003921317000000752
表34.细胞计数数据比值
Figure BDA0003921317000000761
从表32、表33和表34中可以看出，与IL-2复合的抗体104348、106260、108923、108924、108925、108926、108929和108930可优先刺激体内CD8+T细胞和NK细胞。
另外，图12-15显示了内源性CD8+、CD8+CD44+CD122+、CD4+T细胞、Treg细胞和NK细胞的表型特征。图16-17显示了小鼠脾脏中获得的免疫细胞子集的数目；表32、表33和表34的绘制值。图18-22显示小鼠脾脏中CD8+、CD8+CD44+CD122+T细胞、CD3-NK1.1+DX5+NK细胞、CD4+和CD4+CD25+T细胞的代表性BrdU谱。可以看到，与IL-2复合的人源化抗体104348、106260和亲和力成熟的人源化抗体108923、108924、108925、108926、108929和108930增加了CD8+T细胞(特别是CD8+CD44+CD122+T细胞)和NK细胞在体内的增殖水平，超过CD4+和CD4+CD25+T细胞。
从这些结果可以得出结论，人源化抗体104348、106260和亲和力成熟的人源化抗体108923、108924、108925、108926、108929和108930与亲本NARA1抗体(105192)相似，当与hIL-2
Figure BDA0003921317000000762
混合时，能够优先刺激CD8+T细胞和NK细胞。
实施例14:基于NARA1的融合蛋白的表达质粒的产生
使用标准克隆技术(利用phusion聚合酶的PCR扩增/组装，Finnzymes,F-530S)通过切割和粘贴和连接来亚克隆编码人IL-2(pORF-hIL-2质粒,Invivogen,porf-hIL-2)和NARA1轻链的DNA序列，在引物内加入目标接头(例如表35、表36和表37中所示的15、20或25个氨基酸接头)。所得PCR产物通过切割和粘贴插入到适合在哺乳动物细胞中分泌的表达载体中。将与hIL-2融合的NARA1的重链和NARA1的轻链克隆到单独的表达载体中以允许共转染。表达载体的元件包括启动子(巨细胞病毒(CMV)增强子-启动子)、促进分泌的信号序列、聚腺苷酸化信号和转录终止子(牛生长激素(BGH)基因)、允许在原核生物中进行附加型复制和复制的元件(例如SV40起点和ColE1或本领域已知的其他)和允许选择的元件(氨苄青霉素抗性基因和zeocin标记)。
表35.轻链区
轻链区 序列表
<![CDATA[IL-2-(G4S)<sub>3</sub>-L(NARA1)]]> SEQ ID NO:413(DNA)
<![CDATA[IL-2-(G4S)<sub>4</sub>-L(NARA1)]]> SEQ ID NO:414(DNA)
<![CDATA[IL-2-(G4S)<sub>5</sub>-L(NARA1)]]> SEQ ID NO:415(DNA)
实施例15:基于NARA1的融合蛋白的表达和纯化
中国仓鼠卵巢(CHO)细胞是用于瞬时表达IgG蛋白质的优选宿主细胞系之一。使用PEI(聚乙烯亚胺，MW 25.000，直链，Polysciences，美国，目录号23966)作为转染试剂进行转染。PEI原液液通过在室温(RT)小心地将1g PEI溶解在900ml细胞培养级水中来制备。为促进PEI溶液的溶解，通过加入HCl至pH 3-5进行酸化，随后用NaOH中和至最终pH 7。最后，将体积调整至1L，并将溶液通过0.22μm过滤器过滤，等分并冷冻在-80℃直至进一步使用。CHO细胞使用具有次黄嘌呤钠和胸苷(HT，41065012，Invitrogen)、L-谷氨酰胺(17-605C，Lonza)和抗生素-抗霉菌(15240062，ThermoFisher)补充剂的Power CHO-2D培养基和ProCHO-4培养基(分别用于繁殖和转染的无血清培养基，12-770Q和12-029Q Lonza)培养。准备用于瞬时转染的细胞在150rpm的摇床中悬浮培养。种子培养物中的细胞应维持在指数生长期(细胞密度在1.5×105和3×106/mL之间)，显示转染的存活率>98％。在该范围之外的细胞密度将导致稀释后的滞后期或降低的转染效率。对于转染，从种子培养物中取出一份细胞，并用Power CHO-4无血清培养基在50％终体积中调整至2×106细胞/mL。通过在150mMNaCL溶液中稀释DNA，制备DNA溶液(对于100ml规模，总DNA＝125ug，调整至与IL-2融合的重链和轻链的摩尔比为1:1)。然后向DNA溶液中加入PEI溶液(对于100ml规模，0.5ml)。将混合物涡旋并且在室温下温育10-12分钟。然后将转染混合物添加至细胞中，并进行细胞培养3至4小时。最终，通过加入Power CHO-2D无血清培养基来实现剩余的50％的总生产体积。在转染后继续培养4至6天。通过在4℃以4700rpm离心45分钟来收获培养物(
Figure BDA0003921317000000781
Multifuge 3S-R,Thermo Scientific,Rockford,IL)。通过Stericup过滤器(0.22μm)无菌过滤回收的细胞上清液，并在4℃用2.5mM ETDA和叠氮化钠(0.01％)保存直至进一步处理。
使用蛋白G琼脂糖(20397,Thermo Scientific)在4℃进行纯化。因此，产生三种融合蛋白，其中IL-2的C末端通过15、20或25个氨基酸长度的甘氨酸-丝氨酸接头融合至NARA1轻链的N端，如表36中突出显示。NARA1的重链保持不变(SEQ ID NO:115)。
表36.轻链区
轻链区 序列表
<![CDATA[IL-2-(G4S)<sub>3</sub>-L(NARA1)]]> SEQ ID NO:416
<![CDATA[IL-2-(G4S)<sub>4</sub>-L(NARA1)]]> SEQ ID NO:417
<![CDATA[IL-2-(G4S)<sub>5</sub>-L(NARA1)]]> SEQ ID NO:418
表37.基于NARA1的融合蛋白
Figure BDA0003921317000000782
实施例16:基于NARA1的融合蛋白的体内评价
在如下所述接受L15、L20、L25或IL-2/NARA1的WT C57BL/6小鼠中测定CD8+T细胞、CD4+T细胞和NK细胞的百分比和计数。同时，利用溴脱氧尿苷(BrdU)评估CD8+T细胞和NK细胞的增殖水平。
(1)材料和方法
采用了以下抗体和融合蛋白：NARA1、L15、L20和L25。
采用了重组人IL-2
Figure BDA0003921317000000783
小鼠接受3次连续注射2μg(20000IU)的hIL-2以及hIL-2/单克隆抗体(NARA1,10μg对应于2:1摩尔比)、L15、L20、L25(以活性计，为相应的IL-2量)或PBS。最后一次注射当天，在饮用水中以0.8mg/ml给予BrdU 24小时。第二天，将小鼠处死，通过流式细胞仪分析脾和淋巴结(LN)。为此，根据标准方案制备LN和脾的单细胞悬液，并将2×106细胞用含2％胎牛血清(FCS)、2mM EDTA和荧光染料缀合的抗体(见下文)的PBS进行染色以用于流式细胞术分析。
进行两种不同的染色：第一次染色是为了鉴定和定量CD4+CD25+叉头箱P3(FoxP3)+T调节细胞。为此，使用FoxP3染色缓冲液并遵循供应商的建议(eBiosciences，00-5523-00)和使用荧光染料缀合的抗体对单细胞悬液进行染色，所述抗体抗以下标记：CD25、CD8a、CD4、CD3、FoxP3。
进行第二次染色以便于鉴定和定量特定细胞子集的细胞增殖，其中使用荧光染料缀合的抗BrdU抗体来染色已经增殖过的细胞。BrdU染色使用FITC BrdU试剂盒并遵循供应商建议(BD Pharmingen，51-2354AK)和使用荧光染料缀合的抗体进行，所述抗体抗以下标记：CD44、CD8a、CD4、NK1.1、CD3、CD122、Brdu。
使用本领域技术人员熟知的Becton Dickinson LSR Fortessa流式细胞仪收集数据。
(2)结果
细胞计数数据的结果如表38所示。
表38.细胞计数
Figure BDA0003921317000000791
如表38所示，融合蛋白L15、L20和L25能够体内刺激CD8+T细胞和NK细胞。
另外，图23显示了内源性CD8+T细胞和NK细胞的表型特征。图24显示了小鼠脾脏中获得的免疫细胞的数量，为标绘的表38中的值。图25显示了小鼠脾脏中CD8+CD44+CD122+T细胞和CD3-NK1.1+NK细胞的代表性BrdU谱。
从这些结果我们可以得出结论：基于NARA1的融合蛋白能够优先刺激CD8+T细胞和NK细胞，与人IL-2组合中的亲本NARA1抗体类似。
实施例17:基于NARA1的融合蛋白的体外评价
基于NARA1的融合蛋白的活性与单独的NARA1和IL-2在细胞增殖测定中进行比较，所述细胞增殖测定使用响应于人IL-2的CTLL-2鼠细胞系。
将CTLL-2细胞接种到96孔板(10000细胞/孔)中，并使用hIL-2或hIL-2/NARA1复合物(2:1摩尔比)、L15、L20或L25(相应的IL-2量)刺激，并在37℃孵育48小时后评估增殖。通过向细胞添加WST-1(Sigma-Aldrich)至少4小时评估增殖，随后在iMark微板读板器上于450nm读数。
实验以一式两份进行，并且表39提供了获得的EC50值。
表39.CTTL-2细胞增殖数据(EC50)
L15 L20 L25 hIL-2 hIL-2/Nara1
EC50(ng/ml) 2.7 1.6 2.6 0.8 0.7
如表39所示，基于NARA1的融合蛋白具有在体外诱导CTLL-2细胞增殖的能力，但是其程度相比于hIL-2和hIL-2/NARA1更低。
另外，图26显示了获得的增殖曲线。
在使用响应于人IL-2的CTLL-2鼠细胞系的STAT5磷酸化(P-STAT5)测定中，比较基于NARA1的融合蛋白与单独的NARA1和IL-2的活性。CTLL-2(200000细胞/孔)接种在96孔板中，并使用hIL-2hIL-2/NARA1复合物(以2:1摩尔比)、L15、L20或L25(相应的IL-2量)刺激。刺激15分钟后，评估STAT5的磷酸化，用pSTAT5-特定mAb(BD Biosciences)通过细胞内染色进行检测。
实验以一式两份进行，并且表40提供了获得的EC50值。
表40.P-STAT5(EC50)
hIL-2 hIL-2/NARA1 L15 L20 L25
EC50(ng/ml) 1.03 1.4 107.2 ～426.6 ～434.8
另外，图27提供了获得的磷酸化水平。观察到，在表达高CD25水平的细胞例如CTLL-2细胞上获得的体外效应在用L15、L20和L25刺激细胞时低于IL-2或IL-2/NARA1。这种差异在短时间内更为突出(例如对P-STAT5，刺激15分钟)。实际上，用最短的接头的L15，IL-2可能更容易与NARA1解离，从而允许在短时间内刺激细胞。另一方面，对于融合蛋白L20和L25，IL-2可能保持更长时间的与NARA1的结合，从而阻止对CTLL-2细胞的刺激。
序列表
实施本发明的有用氨基酸和核苷酸序列见表41。在本申请文本中，如果说明书文本(例如表41)和序列表文本之间存在差异，以说明书文本为准。
表41.序列表
Figure BDA0003921317000000811
Figure BDA0003921317000000821
Figure BDA0003921317000000831
Figure BDA0003921317000000841
Figure BDA0003921317000000851
Figure BDA0003921317000000861
Figure BDA0003921317000000871
Figure BDA0003921317000000881
Figure BDA0003921317000000891
Figure BDA0003921317000000901
Figure BDA0003921317000000911
Figure BDA0003921317000000921
Figure BDA0003921317000000931
Figure BDA0003921317000000941
Figure BDA0003921317000000951
Figure BDA0003921317000000961
Figure BDA0003921317000000971
Figure BDA0003921317000000981
Figure BDA0003921317000000991
Figure BDA0003921317000001001
Figure BDA0003921317000001011
Figure BDA0003921317000001021
Figure BDA0003921317000001031
Figure BDA0003921317000001041
Figure BDA0003921317000001051
Figure BDA0003921317000001061
Figure BDA0003921317000001071
Figure BDA0003921317000001081
Figure BDA0003921317000001091
Figure BDA0003921317000001101
Figure BDA0003921317000001111
Figure BDA0003921317000001121
Figure BDA0003921317000001131
Figure BDA0003921317000001141
Figure BDA0003921317000001151
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Claims (35)

1.一种分离的抗体或其抗原结合片段，其结合SEQ ID NO:109所示的人IL-2，其中，所述抗体或其抗原结合片段包含含LCDR1、LCDR2和LCDR3的轻链可变区以及含HCDR1、HCDR2和HCDR3的重链可变区，并且其中LCDR1包含SEQ ID NO:122；其中LCDR2包含SEQ ID NO:123；其中LCDR3包含SEQ ID NO:21；其中HCDR1包含SEQ ID NO:119；其中HCDR2包含SEQ ID NO:120；并且其中HCDR3包含SEQ ID NO:121。
2.如权利要求1所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区和重链可变区，
所述轻链可变区包含：
选自由SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:86和SEQ ID NO:90组成的组的LCDR1；
选自由SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:32组成的组的LCDR2；
如SEQ ID NO:21所示的LCDR3；且
所述重链可变区包含：
选自由SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:13组成的组的HCDR1；
选自由SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:12组成的组的HCDR2；和
选自由SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:42和SEQ ID NO:45组成的组的HCDR3。
3.如权利要求1或2所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中，
LCDR1、LCDR2和LCDR3分别为SEQ ID NO:31、32和21，并且HCDR1、HCDR2和HCDR3分别为SEQ ID NO:4、2和3；或
LCDR1、LCDR2和LCDR3分别为SEQ ID NO:19、20和21，并且HCDR1、HCDR2和HCDR3分别为SEQ ID NO:13、12和3；或
LCDR1、LCDR2和LCDR3分别为SEQ ID NO:69、20和21，并且HCDR1、HCDR2和HCDR3分别为SEQ ID NO:4、2和3；或
LCDR1、LCDR2和LCDR3分别为SEQ ID NO:19、20和21，并且HCDR1、HCDR2和HCDR3分别为4、2和36；或
LCDR1、LCDR2和LCDR3分别为SEQ ID NO:69、20和21，并且HCDR1、aHCDR2和HCDR3分别为4、2和36。
4.如前述权利要求中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中，所述重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)与以下氨基酸序列具有至少95％同一性：
VL：SEQ ID NO:25，VH：SEQ ID NO:7；或
VL：SEQ ID NO:27，VH：SEQ ID NO:7；或
VL：SEQ ID NO:34，VH：SEQ ID NO:7；或
VL：SEQ ID NO:25，VH：SEQ ID NO:15；或
VL：SEQ ID NO:27，VH：SEQ ID NO:15；或
VL：SEQ ID NO:34，VH：SEQ ID NO:15；或
VL：SEQ ID NO:25，VH：SEQ ID NO:17；或
VL：SEQ ID NO:27，VH：SEQ ID NO:17；或
VL：SEQ ID NO:34，VH：SEQ ID NO:17；或
VL：SEQ ID NO:70，VH：SEQ ID NO:7；或
VL：SEQ ID NO:25，VH：SEQ ID NO:37；或
VL：SEQ ID NO:70，VH：SEQ ID NO:37；或
VL：SEQ ID NO:79，VH：SEQ ID NO:7；或
VL：SEQ ID NO:27，VH：SEQ ID NO:37；或
VL：SEQ ID NO:79，VH：SEQ ID NO:37；或
VL：SEQ ID NO:70，VH：SEQ ID NO:17；或
VL：SEQ ID NO:25，VH：SEQ ID NO:49；或
VL：SEQ ID NO:70，VH：SEQ ID NO:49；或
VL：SEQ ID NO:79，VH：SEQ ID NO:17；或
VL：SEQ ID NO:27，VH：SEQ ID NO:49；或
VL：SEQ ID NO:79，VH：SEQ ID NO:49。
5.如权利要求4所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中，所述重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)具有以下氨基酸序列：
VL：SEQ ID NO:25，VH：SEQ ID NO:7；或
VL：SEQ ID NO:27，VH：SEQ ID NO:7；或
VL：SEQ ID NO:34，VH：SEQ ID NO:7；或
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VL：SEQ ID NO:79，VH：SEQ ID NO:37；或
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VL：SEQ ID NO:27，VH：SEQ ID NO:49；或
VL：SEQ ID NO:79，VH：SEQ ID NO:49。
6.如前述权利要求中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其包含选自由SEQID NO:93、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:103和SEQ ID NO:105组成的组的Fc结构域。
7.如权利要求6所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其包含如SEQ ID NO:93、SEQ IDNO:101、SEQ ID NO:103或SEQ ID NO:105所示的Fc结构域。
8.如权利要求7所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其包含：如SEQ ID NO:124所示的轻链和如SEQ ID NO:126所示的重链，或如SEQ ID NO:128所示的轻链和如SEQ ID NO:130所示的重链。
9.如前述权利要求中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其结合包含氨基酸K52、P54、K55、T57、R58、T61、F62、K63、Q94和K96的人白介素-2(hIL-2)表位。
10.如权利要求9所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段特异性结合氨基酸K52、P54、K55、T57、R58、T61、F62、K63、Q94和K96。
11.如权利要求10所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中，所述表位还包含氨基酸N50、N53、N91、L92、A93和N97中的任一个或多个。
12.如权利要求11所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段特异性结合氨基酸N50、K52、N53、P54、K55、T57、R58、T61、F62、K63、N91、L92、A93、Q94、K96和N97。
13.一种分离的抗体或其抗原结合片段，其结合如SEQ ID NO:109所示的人IL-2，其中，所述抗体或其抗原结合片段包含：依次包含LCDR1、LCDR2和LCDR3的轻链可变区；和依次包含HCDR1、HCDR2和HCDR3的重链可变区，其中，
LCDR1、LCDR2和LCDR3分别为SEQ ID NO:231、232和233，并且HCDR1、HCDR2和HCDR3分别为SEQ ID NO:181、182和183；或
LCDR1、LCDR2和LCDR3分别为SEQ ID NO:279、280和281，并且HCDR1、HCDR2和HCDR3分别为SEQ ID NO:213、214和215；或
LCDR1、LCDR2和LCDR3分别为SEQ ID NO:231、232和233，并且HCDR1、HCDR2和HCDR3分别为SEQ ID NO:213、214和215；或
LCDR1、LCDR2和LCDR3分别为SEQ ID NO:263、264和265，并且HCDR1、HCDR2和HCDR3分别为SEQ ID NO:213、214和215；或
LCDR1、LCDR2和LCDR3分别为SEQ ID NO:263、264和265，并且HCDR1、HCDR2和HCDR3分别为SEQ ID NO:149、150和151；或
LCDR1、LCDR2和LCDR3分别为SEQ ID NO:69、20和21，并且HCDR1、HCDR2和HCDR3分别为SEQ ID NO:197、198和199；或
LCDR1、LCDR2和LCDR3分别为SEQ ID NO:231、232和233，并且HCDR1、HCDR2和HCDR3分别为SEQ ID NO:197、198和199。
14.如权利要求13所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中，所述重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)与以下氨基酸序列具有至少95％的同一性：
VL：SEQ ID NO:243，VH：SEQ ID NO:193；或
VL：SEQ ID NO:391，VH：SEQ ID NO:225；或
VL：SEQ ID NO:243，VH：SEQ ID NO:225；或
VL：SEQ ID NO:275，VH：SEQ ID NO:225；或
VL：SEQ ID NO:275，VH：SEQ ID NO:161；或
VL：SEQ ID NO:70，VH：SEQ ID NO:209；或
VL：SEQ ID NO:243，VH：SEQ ID NO:209。
15.如权利要求14所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中，所述重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)具有以下氨基酸序列：
VL：SEQ ID NO:243，VH：SEQ ID NO:193；或
VL：SEQ ID NO:391，VH：SEQ ID NO:225；或
VL：SEQ ID NO:243，VH：SEQ ID NO:225；或
VL：SEQ ID NO:275，VH：SEQ ID NO:225；或
VL：SEQ ID NO:275，VH：SEQ ID NO:161；或
VL：SEQ ID NO:70，VH：SEQ ID NO:209；或
VL：SEQ ID NO:243，VH：SEQ ID NO:209。
16.如权利要求13至15中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其包含：选自由SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:103和SEQ ID NO:105组成的组的Fc结构域。
17.如权利要求15所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中，所述重链和轻链区具有以下氨基酸序列:
重链SEQ ID NO:195和轻链SEQ ID NO:245；或
重链SEQ ID NO:227和轻链SEQ ID NO:393；或
重链SEQ ID NO:227和轻链SEQ ID NO:245；或
重链SEQ ID NO:227和轻链SEQ ID NO:277；或
重链SEQ ID NO:163和轻链SEQ ID NO:277；或
重链SEQ ID NO:211和轻链SEQ ID NO:261；或
重链SEQ ID NO:211和轻链SEQ ID NO:277。
18.一种人源化抗体或其抗原结合片段，所述人源化抗体或其抗原结合片段结合SEQID NO:109所示的人IL-2，其中所述人源化抗体或其抗原结合片段特异性结合包括氨基酸K52、P54、K55、T57、R58、T61、F62、K63、Q94和K96的人白介素-2(hIL-2)表位。
19.如权利要求18所述的人源化抗体或其抗原结合片段，其中，所述人白介素-2(hIL-2)表位还包括氨基酸N50、N53、N91、L92、A93和N97中的任何一个或多个。
20.一种组合物，其包含前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段和任选的人IL-2。
21.如权利要求20所述的组合物，其中，所述人IL-2选自由SEQ ID NO:109所示的人IL-2或SEQ ID NO:110所示的阿地白介素组成的组。
22.一种融合蛋白，其包含权利要求1至17中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或者权利要求18或19所述的人源化抗体或其抗原结合片段以及人IL-2。
23.如权利要求22所述的融合蛋白，其中，所述人IL-2选自由SEQ ID NO:109所示的人IL-2或SEQ ID NO:110所示的阿地白介素组成的组，并且任选地，其中所述抗体通过接头序列与所述人IL-2连接。
24.如权利要求22或23所述的融合蛋白，其中，所述人IL-2与所述抗体的重链或轻链的N端区域连接。
25.如权利要求22或23所述的融合蛋白，其中，所述人IL-2嵌入所述抗体的重链或轻链中。
26.如权利要求22至24中任一项所述的融合蛋白，其中，所述抗体和所述人IL-2通过选自由SEQ ID NO:397、SEQ ID NO:398、SEQ ID NO:399、SEQ ID NO:400、SEQ ID NO:401、SEQID NO:402、SEQ ID NO:403、SEQ ID NO:404、SEQ ID NO:405、SEQ ID NO:406、SEQ ID NO:407、SEQ ID NO:408、SEQ ID NO:409、SEQ IDNO:410和SEQ ID NO:411组成的组的接头序列连接。
27.如权利要求26所述的融合蛋白，其中，所述接头序列是SEQ ID NO:405或SEQ IDNO:407。
28.如权利要求22、23或25所述的融合蛋白，其中，所述抗体的LCDR1包含根据Kabat定义的残基Y27d和残基D30，并且其中残基Y27d通过GGG接头连接至人IL-2的残基N97，并且其中残基D30通过SEQ ID NO:412所示接头连接至人IL-2的残基K96。
29.一种融合蛋白，所述融合蛋白包含：(i)结合人IL-2的抗体或其抗原结合片段，和(ii)人IL-2，其中所述人IL-2嵌入所述抗体的重链或轻链中；并且其中，所述融合蛋白诱导具有非常有限的对调节T细胞的活化的CD8+T细胞增殖和NK细胞增殖。
30.如权利要求1至17中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、或权利要求18或19所述的人源化抗体或其抗原结合片段、或权利要求20或21所述的组合物、或权利要求22至29中任一项所述的融合蛋白，其用于制备药物。
31.如权利要求1至17中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、或权利要求18或19所述的人源化抗体或其抗原结合片段、或权利要求20或21所述的组合物、或权利要求22至29中任一项所述的融合蛋白，其用于治疗癌症。
32.一种载体，其包含能够编码权利要求1至17中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、或权利要求18或19所述的人源化抗体或其抗原结合片段、或权利要求22至29中任一项所述的融合蛋白的核酸分子。
33.一种细胞，其包含权利要求32所述的载体。
34.一种细胞，其能够产生权利要求1至17中任一项所述的人白介素-2(hIL-2)特异性单克隆抗体或其抗原结合片段、或权利要求18或19所述的人源化抗体或其抗原结合片段、或权利要求22至29中任一项所述的融合蛋白。
35.一种产生单克隆抗体的杂交瘤细胞系，其特征在于，所产生的抗体是权利要求1至17中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、或权利要求18或19所述的人源化抗体或其抗原结合片段、或权利要求22至29中任一项所述的融合蛋白。
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