JP5766619B2 - Ｎｋ細胞強化型血液製剤の製造方法 - Google Patents
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Description
本発明はNK細胞を活性化及び増殖させた血液製剤の製造方法、及びその血液製剤並びにNK細胞活性用組成物に関する。
悪性新生物である癌は、1981年以降日本人における死因の第1位となっており、全死亡原因の実に約3割を占めている。医学の進歩により、癌の治癒率、生存率は著しく改善してきているが、現在もなお難治性の疾患であることに変わりはない。癌の治療方法は、外科手術療法、化学療法及び放射線療法を標準治療法とするが、近年では、免疫療法が新たな治療法として注目されている（非特許文献１）。
免疫療法は、体内の免疫力を強化することによって癌やウイルス感染症等の治療を行う方法である。特に、癌に対しては、外科療法、化学療法、放射線療法と並ぶ新たな治療法と目され、これまでに様々な方法が開発されている。例えば、サイトカイン療法、ワクチン療法、BRM（生物応答調整剤：Biological Response Modifier）療法、細胞免疫療法等が挙げられる。
サイトカイン療法とは、T細胞やNK細胞等のリンパ球を増殖若しくは活性化させる作用を有するサイトカインを生体内に直接投与することによって、癌細胞やウイルス感染細胞を殺傷する治療法である。例えば、インターロイキン2（以下「IL-2」とする）の投与によるサイトカイン療法等が該当する（非引用文献２）。しかし、この療法は、臨床結果では期待ほどの効果が得られず、また、臓器機能不全や体液貯留（IL-2投与の場合）、感冒症状若しくは精神障害（インターフェロン投与の場合）等の重篤な副作用を生じると言う問題があった。
ワクチン療法とは、癌細胞特異的抗原等を直接人体に接種し、その抗原に対する免疫系を活性化させる治療法である（非特許文献３）。当該治療法は、有効例がいくつか報告されているが、HLAクラスIを発現していない腫瘍等に対しては効果がない等の問題があった。
BRM療法とは、腫瘍細胞等に対する患者の生物学的応答性を修飾する物質による治療法である（非特許文献４）。BRMとしては、PSKやベスタチン、OK-432等が知られている。この治療方法は、一部の癌等では有効性が認められているが、本来外科療法や化学療法のように免疫能が低下する他の治療法と併用して用いることで効果が得られる補助的療法という側面が強い。また、必ずしも免疫力が強化されるとは限らず、単独での抗癌効果等は弱いという問題があった。
細胞免疫療法は、患者から採取した免疫細胞を生体外で活性化、増殖等の処理を行った後に再びその患者の体内に戻すことによって当該患者の免疫力を高める治療法であり、「養子免疫療法（広義の養子免疫療法）」とも呼ばれている（非特許文献５）。細胞免疫療法は、生体外で処理する免疫細胞の種類によって活性化リンパ球療法や樹状細胞療法に分類される。このうち樹状細胞療法については、臨床試験が開始されたばかりであるため、有効性を判断するに十分な結果がまだ得られていない。
活性化リンパ球療法は、生体外でT細胞に対して活性・増殖処理を行う狭義の活性化リンパ球療法（活性化Tリンパ球療法、又は狭義の養子免疫療法）とNK細胞に対して活性・増殖処理を行う活性化NK細胞療法とに、さらに分類される。
狭義の活性化リンパ球療法は、例えば、LAK（リンフォカイン活性化キラー細胞）療法や、TIL（腫瘍組織浸潤リンパ球）療法、CTL（細胞傷害性リンパ球）療法等が該当する。
LAK療法は、患者から採取したリンパ球に大量のIL-2を添加して培養し、T細胞やNK細胞を活性化若しくは増殖させた後に体内に戻す方法である（非特許文献６）。この方法は、生体内に投与したLAKレベルを維持させるために大量のIL-2を生体内に投与する必要があるため、前記IL-2によるサイトカイン療法と同様の副作用を伴うことや、期待ほどの効果が得られないという問題があった。
TIL療法は、腫瘍細胞等に浸潤したリンパ球を採取し、それをLAK療法と同様に体外で培養した後に体内に戻す方法である（非特許文献７）。しかし、この方法は、リンパ球を手術時にしか採取できないことや、期待ほどの効果が得られないという問題があった。
CTL療法は、手術で採取した癌細胞等をリンパ球と共に培養してリンパ球を刺激することにより当該癌細胞等に特異的なリンパ球を誘導させる方法である（非特許文献８）。有効例の報告もあるが、手術により癌細胞を採取しなければならず、侵襲性が高く適応症例が限られ、また、癌細胞を採取かつ培養できない場合は治療が困難となること、主要組織適合抗原が発現している癌にしか効かない等の問題があった。
一方、活性化NK細胞療法は、増殖及び活性化したNK細胞を体内に導入する方法である。NK細胞は、抗原に感作されることなく、癌細胞やウイルス感染細胞を殺傷できるリンパ球集団である（非特許文献９〜１１）。動物実験では、癌の浸潤・転移を抑制できることが知られており（非特許文献１２）、また、長期大規模コホート研究では、末梢血中のNK細胞活性が高い人で癌の発生率が有意に低いという報告もある（非特許文献１３）。それ故、体外で患者のNK細胞を大量に増殖、かつ、活性化して、再びその患者体内に移入すれば、癌やウイルス感染症などを治療することができる。活性化NK細胞療法は、このような原理に基づいた治療方法である。一般的に、NK細胞は、健常者のリンパ球中にも数〜十数％程度しか存在しておらず、癌患者の場合、その数がさらに低下している。また、血中でのNK細胞の癌細胞傷害活性は、NK細胞数が同数であっても、健常者に比べ癌患者では低下していることが多い。したがって、培養による増殖と活性化が必須となる。生体外でのNK細胞増殖は、従来、困難とされてきたが、近年の多くの研究により、NK細胞増殖培養成功例が報告されている（非特許文献１４〜１７）。しかしながら、それらの方法は、癌細胞や遺伝子導入細胞を利用しており、臨床応用時の安全性・実用性において未解決な問題があった。また、NK細胞増殖効率・細胞活性についても、十分に満足するレベルに達していない状況であった。
以上のように、従来の免疫療法は、いずれの方法も十分な治療効果が得られないことや、重篤な副作用を伴うこと、あるいはその他の改善すべき問題を抱えていた。
そこで、本願発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、生体から採取した血液中のNK細胞を効率的に増殖・活性化させることのできるNK細胞強化型血液製剤の製造方法を開発することに成功し、その製造方法及びNK細胞強化型血液製剤について特許を取得した（特許文献１）。この方法で得られたNK細胞強化型血液製剤は、臨床段階で実際に使用され、非常に良好な臨床結果が多数得られている（非特許文献１８−２０）。しかし、この製造方法は、製造工程がやや複雑で、NK細胞の十分な活性化のためには培地を特定の温度下に比較的長時間（10〜30時間）保持しなければならず、温度管理上の手間や製剤が完成するまでに時間を要するという問題があった。
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本発明は、ドナー及び患者に対する侵襲性が低く、かつ生体から採取した血液中のNK細胞を、製造工程が簡便で、迅速に、また多量にNK細胞を増殖・活性化できる新たなNK細胞強化型血液製剤の製造方法を開発し、当該方法により得られるNK細胞強化型血液製剤を安全かつ比較的安価で提供することを課題とする。
上記課題を解決するため、本発明者らは、NK細胞強化型血液製剤の製造方法について、さらなる研究を重ねた結果、特定温度で特定時間時間保持する活性化工程を要さず、また、本発明者らの前記特許発明に係る先の出願（特願2006-124630；特許第4275680号）（以下、本明細書では「先の出願」とする）に係る製造方法でのNK細胞増殖活性をさらに上回る新たなNK細胞強化型血液製剤の方法の開発に成功した。
本発明は、前記結果に基づいて完成されたものであり、すなわち以下を提供する。
（１）生体から採取された血液中に含まれるNK細胞を少なくとも抗CD16抗体、OK432（ピシバニール）、ビスホスホネート誘導体又はその塩若しくはその水和物、及びサイトカインを含むNK細胞増殖刺激因子によって刺激する刺激工程、及び刺激工程後に当該血液を生理的細胞温度で培養する培養工程を含むNK細胞強化型血液製剤の製造方法。
（２）前記刺激工程において、38℃〜40℃で10時間〜30時間保持する高温刺激を加える、（１）に記載の製造方法。
（３）ビスホスホネート誘導体がゾレドロン酸、パミドロン酸、アレンドロン酸、リセドロン酸、イパンドロン酸、インカドロン酸、エチドロン酸及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、（１）又は（２）に記載の製造方法。
（４）サイトカインがIL-2である、（１）から（３）のいずれかに記載の製造方法。
（５）抗CD16抗体が支持体に固相化されている、（１）から（４）のいずれかに記載の製造方法。
（６）培養工程における培養期間が9日〜21日である、（１）から（５）のいずれかに記載の製造方法。
（７）前記血液が末梢血である、（１）から（５）のいずれかに記載の製造方法。
（８）（１）から（７）のいずれかに記載の製造方法で得られるNK細胞強化型血液製剤。
（９）抗CD16抗体、OK432、ビスホスホネート誘導体又はその塩若しくはその水和物、及びサイトカインを含んでなるNK細胞強化用組成物。
（１０）ビスホスホネート誘導体がゾレドロン酸、パミドロン酸、アレンドロン酸、リセドロン酸、イパンドロン酸、インカドロン酸、エチドロン酸及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、（９）に記載の組成物。
（１１）サイトカインがIL-2である、（９）又は（１０）に記載の組成物。
（１２）抗CD16抗体、OK432、及びビスホスホネート誘導体又はその塩若しくはその水和物を含むNK細胞強化型血液製造用キット。
（１３）ビスホスホネート誘導体がゾレドロン酸、パミドロン酸、アレンドロン酸、リセドロン酸、イパンドロン酸、インカドロン酸、エチドロン酸及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、（１１）に記載のキット。
（１４）サイトカインがIL-2である、（１２）又は（１３）に記載のキット。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2010-025940号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
本発明のNK細胞強化型血液製剤の製造方法によれば、血液中のNK細胞を従来方法よりも迅速かつ簡便に、また増殖率をさらに向上させることができる。また、本製造方法によれば、末梢血からの製造が可能なためドナー及び患者に対する侵襲性が低いという利点がある。
本発明のNK細胞強化型血液製剤の製造方法によれば、ゾレドロン酸をNK細胞増殖刺激因子の一つに使用することから、NK細胞の増殖のみならず、同時にγδT細胞の増殖も亢進することができる。それによって、細胞免疫療法において、より効果的な血液製剤を提供することができる。
本発明のNK細胞強化型血液製剤によれば、サイトカインや抗生物質を原則、含有していないため、従来のサイトカイン療法のような副作用の発生がない又は極めて小さいという利点がある。
１．NK細胞強化型血液製剤の製造方法
１−１．概要
本発明の第一の実施形態は、NK細胞強化型血液製剤の製造方法である。本実施形態では、生体より採取した血液中のNK細胞を増殖刺激因子で刺激し、その後生理的細胞温度で培養することを特徴とする。
１−１．概要
本発明の第一の実施形態は、NK細胞強化型血液製剤の製造方法である。本実施形態では、生体より採取した血液中のNK細胞を増殖刺激因子で刺激し、その後生理的細胞温度で培養することを特徴とする。
本発明において「NK細胞強化型血液製剤」とは、本実施形態の製造方法によって得られる活性化された多数のNK細胞を含む血液を主成分とする製剤をいう。また、本発明において「強化」とは、増殖させること及び活性化させること、あるいは増殖させたこと及び活性化されたことを意味する。本明細書において「活性化」とは、細胞、特にNK細胞が有する機能を亢進又は増強することをいう。例えば、細胞傷害機能が増強されること、NK細胞表面の活性及び／又は増殖に関するレセプターの発現が増強されること等が挙げられる。したがって、本明細書において細胞増殖の活性化は、別途「増殖活性（化）」として示す。本発明のNK細胞強化型血液製剤は、単位体積あたり健常者血液の約100倍以上のNK細胞数を包含する。
１−２．構成
本実施形態のNK細胞強化型血液製剤の製造方法は、刺激工程及び培養工程を含む。以下、各工程の構成について具体的に説明をする。なお、本実施形態において、各操作は、原則として滅菌処理済の試薬、培地、器具等を使用し、培養はクリーンルーム内のクリーンベンチ等の無菌的環境下で行うことを前提とする。これは、血液、及び本実施形態で製造するNK細胞強化型血液製剤への雑菌等のコンタミネーションを防止するためである。
本実施形態のNK細胞強化型血液製剤の製造方法は、刺激工程及び培養工程を含む。以下、各工程の構成について具体的に説明をする。なお、本実施形態において、各操作は、原則として滅菌処理済の試薬、培地、器具等を使用し、培養はクリーンルーム内のクリーンベンチ等の無菌的環境下で行うことを前提とする。これは、血液、及び本実施形態で製造するNK細胞強化型血液製剤への雑菌等のコンタミネーションを防止するためである。
１−２−１．刺激工程
「刺激工程」とは、生体から採取された血液中に含まれるNK細胞をNK細胞増殖刺激因子によって刺激する工程である。
「刺激工程」とは、生体から採取された血液中に含まれるNK細胞をNK細胞増殖刺激因子によって刺激する工程である。
（１）血液
本発明において、「血液」とは、少なくともNK細胞を含む血液成分をいう。例えば、全血、臍帯血、骨髄液やその成分の一部、例えば単核球等が該当する。好ましくは、単核球である。これは、赤血球や顆粒球等の血液成分がNK細胞強化型血液製剤の製造上、阻害要因となり得る可能性があるためである。末梢血から得られる末梢血単核球（Peripheral Blood Mononuclear Cells：PBMCs）は、特に好ましい。これは、末梢血であれば時期を選ばずに生体から容易に採取できる上にドナーへの侵襲性が非常に低い等の理由による。
本発明において、「血液」とは、少なくともNK細胞を含む血液成分をいう。例えば、全血、臍帯血、骨髄液やその成分の一部、例えば単核球等が該当する。好ましくは、単核球である。これは、赤血球や顆粒球等の血液成分がNK細胞強化型血液製剤の製造上、阻害要因となり得る可能性があるためである。末梢血から得られる末梢血単核球（Peripheral Blood Mononuclear Cells：PBMCs）は、特に好ましい。これは、末梢血であれば時期を選ばずに生体から容易に採取できる上にドナーへの侵襲性が非常に低い等の理由による。
本発明において「生体」とは、生きている哺乳動物をいう。種類は問わないが、好ましくはヒトである。対象とする生体は、本発明の製造方法で得られたNK細胞強化型血液製剤を投与する動物と同一の種類になるようにする。例えば、本発明のNK細胞強化型血液製剤をヒトに投与する場合、血液はヒトから採取する。最も好ましいのは、本発明のNK細胞強化型血液製剤を投与するその生体自身から採取すること、つまり、養子免疫療法を前提とした血液採取を行うことである。自己の血液由来の血液製剤であれば、投与後の拒絶反応の可能性を限りなく排除することができるからである。養子免疫療法を前提とする場合には、採取する生体が健常体である必要はない。例えば、癌やウイルス感染症に罹患した患者から採取した血液であってもよい。なお、本発明で養子免疫療法とは、以下、断りのない限り前述した広義の養子免疫療法を意味する。
「生体から採取された」とは、生体由来であることを意味する。したがって、生体から直接採取された血液又は間接的に採取された血液のいずれも包含する。直接採取された血液とは、例えば、末梢血や骨髄液のように注射針等を生体に直接刺して採取されたものや、臍帯血のように分娩後の臍帯から直接採取されたもの等が該当する。また、間接的に採取された血液とは、前記直接採取された血液にヘパリン等を添加して抗凝固処理を施した後、又はさらに単核球を単離した後、それらを一旦冷蔵若しくは冷凍で保存したものから採取された血液をいう。
（２）血液の調製
本工程で使用する血液が生体から直接採取された血液である場合、その採取方法は、公知の採血方法に従えばよい。例えば、末梢血であれば、末梢部の静脈等に注射をして採取すればよく、骨髄液であれば骨髄穿刺（マルク）によって採取すればよく、また、臍帯血であれば分娩後胎盤の娩出前の臍帯に針を刺して採取すればよい。以下、末梢血の採取について具体的に説明をする。
本工程で使用する血液が生体から直接採取された血液である場合、その採取方法は、公知の採血方法に従えばよい。例えば、末梢血であれば、末梢部の静脈等に注射をして採取すればよく、骨髄液であれば骨髄穿刺（マルク）によって採取すればよく、また、臍帯血であれば分娩後胎盤の娩出前の臍帯に針を刺して採取すればよい。以下、末梢血の採取について具体的に説明をする。
末梢全血は、生体の末梢部血管、例えば、静脈又は動脈に注射針を刺してシリンジ内に採取すればよい。採取する容量は、必要とするNK細胞強化型血液製剤の量によって変動するが、例えば、ヒトの大人一人に対して一回投与する前記血液製剤を製造する場合、通常20mL〜60mLで足りる。ただし、癌患者のように血中の末梢血単核球数が極端に低下している場合には、成分採血（アフェレーシス）により、末梢血単核球だけを必要量選択的に採取してもよい。採取後、血液が凝固しないように、例えば、シリンジ内部等をヘパリン等の血液凝固阻止剤若しくは血液凝固阻害剤で予めコーティングしておくか、又は採取した血液にヘパリン等を添加しておくことが好ましい。また、末梢全血から血漿を分離し、血球成分を使用してもよい。血漿は、例えば、末梢全血を遠心管に移して、2000rpm〜4000rpmで5〜20分間遠心し、その上清を得ればよい。さらに、それを56℃にて30分間程度加温して非働化し、さらに2000rpm〜4000rpmで5〜20分間遠心して、血小板など沈殿物を除去後、細胞培養の栄養原として使用することができる。
必要に応じて、末梢全血からさらに末梢血単核球（PBMCs）を分離してもよい。PBMCsは、フィコール・ハイパック（Ficoll−Hypaque）やフィコール・コンレイ（Ficoll−Conray）を比重液とした密度勾配遠心法を用いて、末梢全血又は血漿分離後の血球成分から得ることができる。これらの比重液は、市販の分離液等を利用すると便利である。例えば、Ficoll−Paque PLUS（Amersham社）やLYMPHOPREP（AXIS−SHIELD社）等が利用できる。PBMCsの分離方法については、キット添付のプロトコルに従えばよい。
分離後のPBMCsは、比重液を除去するためにPBS（-）や培養細胞用の培地で数回洗浄する。ここで培養細胞用の培地としては、例えば、血清を含まないPBS(-)、RPMI1640培地又は培養に用いる無血清培地等を用いればよい。前記PBS（-）若しくは培地で洗浄後、回収したPBMCsの数を血球計算板でカウントしておくことが好ましい。通常、20mL〜60mLの末梢全血から2×107個以上のPBMCsを回収することができる。
本工程で使用する血液が生体から間接的に採取された血液である場合、その採取方法は、冷凍又は冷蔵血液を公知の方法によって解凍及び加温処理して使用すればよい。例えば、前記直接採取された血液から得られた後に凍結保存されたPBMCsにRPMI-1640培地を添加して解凍後、37℃、5%CO2下で3時間インキュベートしたものから得る方法が挙げられる。
（３）NK細胞増殖刺激因子
本発明において「NK細胞増殖刺激因子」とは、NK細胞の増殖及び／又は活性化を直接的に又は間接的に誘導する因子をいう。直接的に増殖を誘導する因子には、例えば、増殖させるNK細胞表面上の受容体と特異的に結合することによって、そのNK細胞の細胞内に増殖シグナルを伝達させる機能を有する因子が挙げられる。また、間接的に増殖を誘導する因子には、例えば、NK細胞以外の単球等の細胞表面の受容体に結合してサイトカイン等の液性因子の産生・放出を誘導する因子が挙げられる。NK細胞の増殖は、放出された液性因子によって間接的に誘導されることとなる。また、直接的に又は間接的にNK細胞の活性化を誘導する因子にも、前記増殖を誘導する因子と同様の機序を有する因子がその例として挙げられる。
本発明において「NK細胞増殖刺激因子」とは、NK細胞の増殖及び／又は活性化を直接的に又は間接的に誘導する因子をいう。直接的に増殖を誘導する因子には、例えば、増殖させるNK細胞表面上の受容体と特異的に結合することによって、そのNK細胞の細胞内に増殖シグナルを伝達させる機能を有する因子が挙げられる。また、間接的に増殖を誘導する因子には、例えば、NK細胞以外の単球等の細胞表面の受容体に結合してサイトカイン等の液性因子の産生・放出を誘導する因子が挙げられる。NK細胞の増殖は、放出された液性因子によって間接的に誘導されることとなる。また、直接的に又は間接的にNK細胞の活性化を誘導する因子にも、前記増殖を誘導する因子と同様の機序を有する因子がその例として挙げられる。
本発明のNK細胞増殖刺激因子には、少なくとも抗CD16抗体、OK432、ビスホスホネート誘導体又はその塩若しくはその水和物、及びサイトカインが含まれる。この他、シイタケより抽出されるレンチナン（Lentinan）等のBRM等を含むことができる。
「抗CD16抗体」とは、CD16に対する抗体である。CD16は、NK細胞や顆粒球のマーカーであり、ほとんどのNK細胞の細胞表面上に存在するFcレセプターの構成タンパク質として知られている。抗CD16抗体のNK細胞増殖誘導活性については、先の特許出願において見出されたものであり、それ以前には知られていなかった。抗CD16抗体のNK細胞増殖誘導機構については明らかにされていないが、抗CD16抗体をIL-2等のサイトカインと共添加することで、サイトカイン単独で添加した場合と比較して、NK細胞の増殖誘導を飛躍的に増強することができる（特願2006-124630；特許第4275680号）。
「ビスホスホネート誘導体」とは、下記一般式１で示される化合物をいう。
上記式中、R1は、水素原子（H）又は低級アルキル基を表し、R2とR3は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン、ヒドロキシル基、アミノ基、チオール基、置換された若しくは置換されていないアリール基、置換された若しくは置換されていないアルキル基、低級アルキルアミノ基、アルアルキル基、シクロアルキル基又は複素環式基を表し、又はR2とR3は、それらを含む環状構造の一部を形成し、該環状構造を形成する置換基は、R2とR3において、それぞれ独立して、ハロゲン、低級アルキル基、ヒドロキシル基、チオール基、アミノ基、アルコキシ基、アリール基、アリールチオ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、シクロアルキル基又は複素環式基に由来する。
ビスホスホネート誘導体の具体例としては、ゾレドロン酸、パミドロン酸、アレンドロン酸、リセドロン酸、イパンドロン酸、インカドロン酸、エチドロン酸が挙げられる。本発明においては、一以上のビスホスホネート誘導体又はその塩若しくはその水和物をNK細胞増殖刺激因子として添加することができる。本発明において、特に好ましいビスホスホネート誘導体は、ゾレドロン酸又はNK細胞の増殖及び／又は活性化（以下、「増殖／活性化」と表す）を有するゾレドロン酸誘導体又はその塩若しくはその水和物である。
ゾレドロン酸（商品名ゾメタ（登録商標）、ノバルティスファーマ社）は、骨吸収抑制活性を有するビスホスホネートで、悪性腫瘍による高カルシウム血症又は多発性骨髄腫による骨病変及び固形癌骨転移による骨病変に対する治療薬として知られている。また、その化学構造の中に窒素含有ビスホスホネート(N-BPs：Nitrogen containing-BisphosPhonate)を包含するため、細胞内でFarnesyl PyrophosPhate (FPP)の合成を抑制して、その結果、前駆体であるIsoPentenyl Pyrophosphate(IPP)が蓄積する。それによって、その生体の免疫反応を活性化できることが報告されている（van Beek E, et al., 1999, Biochem Biophys Res Commun, 264:108-11; Gober HJ, et al., 2003, J Exp Med, 197:163-8.）。しかしながら、ゾレドロン酸がNK細胞の増殖／活性化を有することについては一切報告がない。したがって、ゾレドロン酸は、本発明者らによって新たに見出された新規のNK細胞増殖刺激因子である。
「その塩」とは、前記ビスホスホネート誘導体、好ましくはゾレドロン酸の塩基性付加塩をいう。塩基性付加塩としては、例えば、ナトリウム塩若しくはカリウム塩のようなアルカリ金属塩、カルシウム塩若しくはマグネシウム塩のようなアルカリ土類金属塩、トリメチルアミン塩、トリエチルアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、エタノールアミン塩、ジエタノールアミン塩、トリエタノールアミン塩若しくはブロカイン塩のような脂肪族アミン塩、Ｎ,Ｎ-ジベンジルエチレンジアミンのようなアラルキルアミン塩、ピリジン塩、ピコリン塩、キノリン塩若しくはイソキノリン塩のような複素環芳香族アミン塩、アルギニン塩若しくはリジン塩のような塩基性アミノ酸塩、アンモニウム塩又はテトラメチルアンモニウム塩、テトラエチルアモニウム塩、ベンジルトリメチルアンモニウム塩、ベンジルトリエチルアンモニウム塩、ベンジルトリブチルアンモニウム塩、メチルトリオクチルアンモニウム塩若しくはテトラブチルアンモニウム塩のような第４級アンモニウム塩が挙げられる。
「OK432」（ピシバニール：Picibanil）とは、溶連菌（ストレプトコッカス・ピオゲネスA群３型）Su株をペニシリン処理したものを有効成分とする抗腫瘍剤である。OK432は免疫アジュバントとして、単球などの細胞表面TLRと結合して、単球細胞を活性化し、免疫反応を活性化できることが知られている（Ryoma Y, et al., 2004, Anticancer Res., 24:3295-301.）。
本発明のNK細胞増殖刺激因子として適当なサイトカインには、例えば、IL-2、IL-12、IL-15、IL-18等が挙げられる。このうち特に好ましいサイトカインは、IL-2である。
（４）刺激付加の方法
「刺激する」とは、上記NK細胞増殖刺激因子をNK細胞に接触させることによって、そのNK細胞の増殖／活性化を誘導することをいう。
「刺激する」とは、上記NK細胞増殖刺激因子をNK細胞に接触させることによって、そのNK細胞の増殖／活性化を誘導することをいう。
具体的な刺激の付加方法としては、まず、生体から採取した血液、例えば、PBMCsを、例えば、細胞密度1〜3×106個/mLとなるように培地で調製する。ここで用いる培地は、細胞培養用の適当な培地に、非働化処理をしたヒト血清若しくは血漿を容量比（V/V）で5〜10％程度添加したものを用いればよい。前記養子免疫療法での投与を前提とする場合には、前記培地は、OpTmizerのような養子免疫療法用の無血清培地に自己血漿を添加したものを用いることが望ましい。自己血漿は、血液採取工程後に得られる血液から調製すればよい。例えば、採取した末梢全血を室温（10℃〜30℃：以下同じ。）にて3000rpmで10分間程度遠心して得た上清を自己血漿とすることができる。また、培地には必要に応じて、ストレプトマイシン、ペニシリン、カナマイシン、ゲンタマイシン等の抗生物質を添加してもよい。
次に、予備調製したPBMCsを含む培養液にNK細胞増殖刺激因子を添加する。
抗CD16抗体による刺激は、例えば、終濃度で50μg/mL〜200μg/mL、好ましくは70μg/mL〜150μg/mL、より好ましくは100μg/mLとなるように培地に直接に添加するか、又はその抗体を支持体に固相化した状態で添加すればよい。好ましくは、支持体に固相化した状態での添加である。これは、抗CD16抗体を固相化することによってNK細胞との一定方向からの接触頻度が高まり、遊離状態よりも効率よくNK細胞に増殖刺激を与えることができるからである。ここでいう「支持体」とは、抗体を固定する足場である。支持体の材質は、抗体を安定した状態で固定できる材質であれば、特に限定はしない。例えば、プラスチック等の合成樹脂、ガラス、金属等が利用できる。支持体の形状は特に限定はしないが、当該支持体に固相化された抗体とNK細胞との接触頻度がより高くなるように培養液との接触表面積が大きな形状のものが好ましい。例えば、球状ビーズやリンパ球大の孔を有する多孔質キューブ等が挙げられる。
抗CD16抗体を支持体に固相化する方法は、支持体の材質がプラスチック等のように抗体と親和性の高いものであれば、単に抗体溶液と支持体を接触（浸漬、塗布、流通、噴霧等を含む）させて、所定の温度と時間で保持するだけで固定できる。抗CD16抗体溶液は、例えば、無菌蒸留水又は細胞培養用培地で抗CD16抗体を溶解した後、必要に応じて、例えば、ポアサイズ0.22μmのフイルタでろ過滅菌し、終濃度1μg/mLになるように無菌蒸留水又は培地で調整することによって得ることができる。抗CD16抗体を支持体に固相化する場合、固相化する支持体の表面積等を勘案した液量の抗CD16抗体溶液を使用することが好ましい。例えば、内壁表面積150cm2のプラスチックフラスコに固相化する場合であれば、1μg/mLの抗CD16抗体溶液を15mL程度使用すればよい。また、25cm2及び75cm2の培養フラスコの場合であれば、それぞれ5mL及び10mL使用すればよい。その後、37℃で12〜24時間インキュベートすれば、抗CD16抗体は支持体に付着する。あるいは、市販の抗体固定化キット等を用いてもよい。例えば、CarboLink（PIERCE社）等が利用できる。このような固定化キットは、支持体が抗体の付着しにくい材質の場合には有用である。
抗CD16抗体を支持体に固相化した後は、必要に応じて、抗CD16抗体を固相化させた支持体を洗浄し、抗CD16抗体溶液を除去することもできる。洗浄は、例えば、支持体を適量のPBSで数回、例えば、2〜5回程度洗えばよい。このように支持体に抗CD16抗体を固相化させた培養容器は、0℃〜8℃、好ましくは3℃〜6℃に保存することによって約1月間、抗体活性能を減少又は失活させず使用することができる。
ビスホスホネート誘導体又はその塩若しくはその水和物による刺激として、ここではその具体例であるゾレドロン酸水和物注射液（ノバルティスファーマ社）4mg/バイアルを使用した場合について説明する。このゾレドロン酸を水（例えば、注射用水）で溶解し、2.94μmol/mLのゾレドロン酸溶液を調製する。必要に応じて、その後、例えば、ポアサイズ0.22μmのフィルタで濾過滅菌してもよい。得られたゾレドロン酸溶液は、例えば、終濃度で1μM/mL〜10μM/mL、好ましくは3μM/mL〜7μM/mL、より好ましくは5μM/mLとなるように培地に添加すればよい。
OK432による刺激は、PBMCsを含む培養液に、例えば、OK432溶液を、例えば、終濃度で0.005KE/mL〜0.02KE/mL、好ましくは0.008KE/mL〜0.015KE/mL、より好ましくは0.01KE/mLとなるように添加すればよい。OK432溶液の調製は中外製薬社ピシバニール（5KE/本）を水（例えば、注射用水）2mLで溶解して調製することができる。
サイトカインによる刺激は、単独で添加してもよいし、複数種類を組み合わせて添加して行えばよい。コスト面等を勘案するとIL-2のみの添加が好ましい。添加する量は、例えば、IL-2であれば、終濃度で100ユニット／mL〜2000ユニット／mLの範囲が好ましい。100ユニット／mLよりも少ない場合は増殖刺激を誘導する上で不十分であり、また2000ユニット／mLよりも多い場合にはIL-2の濃度の増加に応じたNK細胞の増殖が認められないためである。好ましくは、700ユニット/mL〜2000ユニット/mLの範囲である。
前記各NK細胞増殖刺激因子を添加後、PBMCsに十分な刺激を与えるために当該血液を生理的細胞温度（通常は37℃）に1〜3日保持することが好ましい。この期間は、次の培養工程と重複して行なうことが可能で、刺激を付与しながらNK細胞等を培養することができる。
また、上記生理的細胞温度での保持期間内に、38℃〜40℃で10時間〜30時間の期間で高温刺激を加えてもよい。この高温刺激により、NK細胞をより一層活性化させることができる。これは、先の出願の実施例で示されるように、37℃よりも低い温度ではリンパ球を活性化させるには不十分であり、また40℃よりも高い温度ではリンパ球が熱により変性や損傷を受ける可能性が高くなるからである。また、10時間よりも短い時間では一層の活性化には不十分であり、また30時間よりも長い時間では血液が変性や損傷を受ける可能性が高くなるからである。
所定の温度に保持させる手段は、血液を一定温度に保持できれば、特に限定はしない。例えば、CO2インキュベーターを用いて、当該血液の入った容器ごと所定の温度にする手段が挙げられる
１−２−２．培養工程
「培養工程」とは、刺激工程後に当該血液を生理的細胞温度で培養する工程である。本工程では、NK細胞の増殖／活性化を維持しながら、その細胞数を増加させることを特徴とする。
１−２−２．培養工程
「培養工程」とは、刺激工程後に当該血液を生理的細胞温度で培養する工程である。本工程では、NK細胞の増殖／活性化を維持しながら、その細胞数を増加させることを特徴とする。
「生理的細胞温度」とは、血液を培養する上で至適な温度をいう。通常は37℃であるが、当該温度を中心に0.5℃未満の範囲内で前後しても構わない。恒温器内の温度は、前記温度範囲内で前後する可能性があるからである。
本工程は、前記刺激工程を経た培養液を生理的細胞温度で培養することで達成できる。本工程の初期では、刺激工程で付与されたNK細胞増殖刺激因子でNK細胞を十分に刺激する期間を確保することとそれらの細胞の培養を兼ねることができる。その後、培地から一旦NK細胞増殖刺激因子を除去し、刺激工程を解除することが好ましい。サイトカインのような因子の多くは、培養工程でもNK細胞に対して増殖／活性化誘導刺激を与え続けることができるが、抗CD16抗体、OK432及び／又はゾレドロン酸等の長期に渡るNK細胞への刺激は、NK細胞の強化に望ましくない影響、例えば、アポトシースなどの細胞死を与える可能性があるためである。このような刺激因子の除去方法は、例えば、刺激工程後に培養液から一旦PBMCsを回収した後、抗CD16抗体、OK432及びゾレドロン酸等を含まない新たな培養液に移せばよい。前記因子の除去は、刺激工程を経た血液に遠心処理を行い、上清を除去することで達成させる。具体な方法は、以下に述べる培地交換の方法に準じて行えばよい。
培養は、生理的細胞温度条件下にある5％CO2インキュベーター内において、7日〜21日以下の期間で行う。これは、6日以下の培養ではNK細胞の増殖が不十分なためであり、また、22日以上ではNK細胞の増殖が静止状態に達してしまうことや、長期培養により細胞の劣化（老化）等の障害が発生する可能性が高くなるからである。
培養期間内は、2日から5日間隔で定期的に新しい培地を加えていく又は新しい培地に交換することが望ましい。培地交換の具体例は、まず、滅菌済み遠心チューブに刺激工程後のPBMCsを含む培養液を移す。続いて、約1200rpmで8分間ほど室温にて遠心した後に上清を除き、PBMCs若しくはNK細胞である沈殿物を回収する。回収されたPBMCs若しくはNK細胞は、細胞密度が0.6〜1.0×106/mLになるようにIL-2及び血漿を含む新たな培養液に移す。このとき添加するIL-2等のサイトカインは、終濃度で300ユニット/mL〜700ユニット/mL程度でよい。これは、刺激工程後にはNK細胞が既に活性化されており、NK細胞自身がIL-2等のサイトカインを産生しているからである。
培養に用いる培地は、細胞培養で使用するいずれの一般的な培地も原則として使用することができる。好ましくはOpTmizer培地(Invitrogen社)である。
培養後は培養液中に細菌やエンドトキシンのコンタミネーションがないことを確認する。菌の有無はコロニー形成アッセイ法によって、またエンドトキシンの有無は市販のELISA等の比色法やリムルステスト等の懸濁法によって調べればよい。
１−３．効果
本実施形態のNK細胞強化型血液製剤の製造方法によれば、生体から採取した血液からNK細胞を強化した血液製剤を製造することができる。特に当該製造方法によれば、先の出願のNK細胞強化型血液製剤の製造方法で得られるNK細胞の活性を維持しながら、高い増殖率をさらに上回るNK細胞強化型血液製剤を提供することができる。
本実施形態のNK細胞強化型血液製剤の製造方法によれば、生体から採取した血液からNK細胞を強化した血液製剤を製造することができる。特に当該製造方法によれば、先の出願のNK細胞強化型血液製剤の製造方法で得られるNK細胞の活性を維持しながら、高い増殖率をさらに上回るNK細胞強化型血液製剤を提供することができる。
本実施形態のNK細胞強化型血液製剤の製造方法によれば、先の出願で必須の工程であった所定の温度に所定の時間保持する工程（活性化工程。本発明における刺激工程中の高温刺激に相当する。）が必須ではなくなった。これにより、活性化工程に必要であった所定の温度に設定したインキュベーターを必ずしも必要としなくなったことから、本発明を実施する研究施設での設備面や実施者の操作・管理面での負担を大幅に軽減することができる。
当該製造方法によれば、ゾレドロン酸を使用することで、後述する実施例６で示すように、γδT細胞を同時に増殖させることができる。γδT細胞は、NK細胞と共に細胞免疫療法において有効な細胞である。したがって、当該製造方法では、先の出願の製造では成しえなかったNK細胞とγδT細胞の増殖という相乗効果を得ることができる。
また、当該製造方法によれば、生体から採取する血液は、末梢血であってもよいことから、ドナーに対する身体的負荷を最小限に留めることができる。
当該製造方法によれば、特段の専用機器等を必要とせず、細胞培養を行う一般的な検査施設や研究施設等に常備されている機器等がそのまま利用でき、必要とする試薬等はいずれも容易に入手ができる。したがって、クリーンルーム等の無菌で作業のできる研究施設であれば、初期設備投資等をほとんど必要とすることなく本実施形態の製造方法を実施できる利点がある。
本実施形態の製造方法で得られるNK細胞強化型血液製剤によれば、実際の臨床治療において、癌の再発予防や進行阻止の効果を有する。また、当該血液製剤の投与では副作用が認められていない等、安全な血液製剤を提供できる。
２．NK細胞強化型血液製剤
２−１．概要
本発明の第二の実施形態は、実施形態１の製造方法で得られるNK細胞強化型血液製剤である。
２−１．概要
本発明の第二の実施形態は、実施形態１の製造方法で得られるNK細胞強化型血液製剤である。
２−２．構成
本実施形態のNK細胞強化型血液製剤は、前記第一の実施形態において培養工程を経た培養液から得ることができる。ただし、NK細胞強化型血液製剤において培養で用いた培地や当該培地に添加した増殖刺激因子は不要である。したがって、NK細胞強化型血液製剤を使用するに当たっては、培養液から培地や増殖刺激因子を可能な限り除去し、増殖／活性化されたNK細胞等を得ておくことが好ましい。培地や増殖刺激因子の除去方法は、まず、増殖／活性化されたNK細胞を含む培養液を滅菌済み遠心チューブに移し、1200rpmにて8分間ほど室温にて遠心し、増殖刺激因子を含む上清の培地を除去する。NK細胞は、沈殿物として回収できる。回収されたNK細胞は、2回以上PBS（-）で洗浄することが好ましい。洗浄後のNK細胞は、血球計算板を用いて細胞数をカウントし、10mL〜200mLの乳酸リンゲル液又は生理食塩水で調整する。こうして、本実施形態のNK細胞強化型血液製剤を得ることができる。必要に応じて当該血液製剤にサイトカイン等を添加することも可能である。
本実施形態のNK細胞強化型血液製剤は、前記第一の実施形態において培養工程を経た培養液から得ることができる。ただし、NK細胞強化型血液製剤において培養で用いた培地や当該培地に添加した増殖刺激因子は不要である。したがって、NK細胞強化型血液製剤を使用するに当たっては、培養液から培地や増殖刺激因子を可能な限り除去し、増殖／活性化されたNK細胞等を得ておくことが好ましい。培地や増殖刺激因子の除去方法は、まず、増殖／活性化されたNK細胞を含む培養液を滅菌済み遠心チューブに移し、1200rpmにて8分間ほど室温にて遠心し、増殖刺激因子を含む上清の培地を除去する。NK細胞は、沈殿物として回収できる。回収されたNK細胞は、2回以上PBS（-）で洗浄することが好ましい。洗浄後のNK細胞は、血球計算板を用いて細胞数をカウントし、10mL〜200mLの乳酸リンゲル液又は生理食塩水で調整する。こうして、本実施形態のNK細胞強化型血液製剤を得ることができる。必要に応じて当該血液製剤にサイトカイン等を添加することも可能である。
本実施形態の血液製剤を用いて十分な効果を得るためには、含有するNK細胞のがん細胞傷害活性が70％以上にあることが望ましい。NK細胞のがん細胞傷害活性は、K562白血病細胞株を用いた測定は公知である。または、リンパ球活性化マーカー、例えばCD69等の公知のマーカーが利用できる。
２−３．効果
本実施形態のNK細胞強化型血液製剤によれば、20mL〜60mLの末梢全血から5×107個〜4×109個もの活性化されたNK細胞強化型血液製剤を得ることができる。
本実施形態のNK細胞強化型血液製剤によれば、20mL〜60mLの末梢全血から5×107個〜4×109個もの活性化されたNK細胞強化型血液製剤を得ることができる。
本実施形態のNK細胞強化型血液製剤において、NK細胞の約90％が活性化されている。これは、健常な大人の血液と比較して10倍以上に相当する。
本実施形態のNK細胞強化型血液製剤は、製造後直ちに使用することも、また0℃〜8℃の温度下で所定の期間、又は保存液等を加えて超低温下（約-80℃）若しくは液体窒素中で数年に渡る長期間保存することも可能である。前記保存液としては、市販の活性化リンパ球保存液を用いると便利である。例えば、バンバンカー（日本ジェネティックス社）、ケーエムバンカーII（コスモバイオ社）等が利用できる。
３．NK細胞強化用組成物
３−１．概要
本発明の第三の実施形態は、NK細胞強化用組成物である。本実施形態は、本発明で新たに見出されたビスホスホネート誘導体又はその塩若しくはその水和物、特にゾレドロン酸を含むNK細胞増殖刺激因子を包含することを特徴とする。本実施形態のNK細胞強化用組成物を血液、好ましくはPBMCsを含む培地に添加することによって、培地中のNK細胞を簡便かつ効率的に増殖／活性化させることができる。
３−１．概要
本発明の第三の実施形態は、NK細胞強化用組成物である。本実施形態は、本発明で新たに見出されたビスホスホネート誘導体又はその塩若しくはその水和物、特にゾレドロン酸を含むNK細胞増殖刺激因子を包含することを特徴とする。本実施形態のNK細胞強化用組成物を血液、好ましくはPBMCsを含む培地に添加することによって、培地中のNK細胞を簡便かつ効率的に増殖／活性化させることができる。
３−２．構成
「NK細胞強化用組成物」とは、培地に添加することで、その培地中に存在するNK細胞を増殖／活性化させることのできる組成物をいう。
「NK細胞強化用組成物」とは、培地に添加することで、その培地中に存在するNK細胞を増殖／活性化させることのできる組成物をいう。
本実施形態のNK細胞強化用組成物は、前記第一の実施形態で説明した抗CD16抗体、OK432、前記式１で示されるビスホスホネート誘導体又はその塩若しくはその水和物及びサイトカインを含んでなる。ビスホスホネート誘導体は、ゾレドロン酸、パミドロン酸、アレンドロン酸、リセドロン酸、イパンドロン酸、インカドロン酸及びエチドロン酸からなる群から選択される化合物が好ましく、ゾレドロン酸がより好ましい。また、サイトカインは、IL-2、IL-12、IL-15及びIL-18からなる群から選択される化合物が好ましく、IL-2がより好ましい。この他、RPMI-1640のようなリンパ球用培地の成分、pH安定剤、抗生物質等が包含されていてもよい。
組成物における各構成成分の量は、所定量の培地に添加したときに、それぞれが所定の終濃度になるように混合されていればよい。具体的には、抗CD16抗体が終濃度で50μg／mL〜200μg／mL、好ましくは70μg／mL〜150μg／mL、より好ましくは100μg／mLとなるように、ビスホスホネート誘導体又はその塩若しくはその水和物（好ましくはゾレドロン酸）が終濃度で1μM/mL〜10μM/mL、好ましくは3μM/mL〜7μM/mL、より好ましくは5μM/mLとなるように、OK432が終濃度で0.005KE/mL〜0.02KE/mL、好ましくは0.008KE/mL〜0.015KE/mL、より好ましくは0.01KE/mLとなるように、そしてサイトカイン（好ましくはIL-2）が500U/mL〜2000U/mL、好ましくは700U/mL〜1500U/mL、より好ましくは1000U/mLとなるように混合されていればよい。
組成物の剤形は特に問わない。適当なバッファに溶解した液体状態、粉末状態、粉末を適当な賦形剤等を添加し錠剤化したものとすることができる。あるいは異なる状態の混合物、例えば、OK432、前記式１で示されるビスホスホネート誘導体又はその塩若しくはその水和物及びサイトカインは液体に溶解された状態であり、その溶液中にプラスチックビーズ等の支持体に固相化された抗CD16抗体が混合されているような剤形であってもよい。
３−３．効果
本実施形態のNK細胞強化用組成物によれば、NK細胞を含有する所定量の適当な細胞培養液中に添加して、培養するだけでNK細胞を活性化し、また増殖させることができる。
本実施形態のNK細胞強化用組成物によれば、NK細胞を含有する所定量の適当な細胞培養液中に添加して、培養するだけでNK細胞を活性化し、また増殖させることができる。
４．NK細胞強化型血液製造用キット
４−１．概要
本発明の第四の実施形態は、第一の実施形態で説明した抗CD16抗体、OK432、前記式１で示されるビスホスホネート誘導体又はその塩若しくはその水和物及びサイトカインを含むNK細胞強化型血液製造用キットである。本実施形態は、本発明で新たに見出されたビスホスホネート誘導体又はその塩若しくはその水和物、特にゾレドロン酸を含むNK細胞増殖刺激因子を構成要素として包含し、血液、好ましくはPBMCsを培養する際に使用することで、簡便かつ容易にNK細胞強化型血液製剤を製造することができる。
４−１．概要
本発明の第四の実施形態は、第一の実施形態で説明した抗CD16抗体、OK432、前記式１で示されるビスホスホネート誘導体又はその塩若しくはその水和物及びサイトカインを含むNK細胞強化型血液製造用キットである。本実施形態は、本発明で新たに見出されたビスホスホネート誘導体又はその塩若しくはその水和物、特にゾレドロン酸を含むNK細胞増殖刺激因子を構成要素として包含し、血液、好ましくはPBMCsを培養する際に使用することで、簡便かつ容易にNK細胞強化型血液製剤を製造することができる。
４−２．構成
本実施形態のNK細胞強化血液製造用キットは、前記第一の実施形態で説明した抗CD16抗体、OK432、前記式１で示されるビスホスホネート誘導体又はその塩若しくはその水和物及びサイトカインを含んでなる。この他、各NK細胞増殖刺激因子を溶解するために滅菌水やバッファ、使用説明書等を包含することができる。ビスホスホネート誘導体は、ゾレドロン酸、パミドロン酸、アレンドロン酸、リセドロン酸、イパンドロン酸、インカドロン酸及びエチドロン酸からなる群から選択される化合物が好ましく、ゾレドロン酸がより好ましい。また、サイトカインは、IL-2、IL-12、IL-15及びIL-18からなる群から選択される化合物が好ましく、IL-2がより好ましい。
本実施形態のNK細胞強化血液製造用キットは、前記第一の実施形態で説明した抗CD16抗体、OK432、前記式１で示されるビスホスホネート誘導体又はその塩若しくはその水和物及びサイトカインを含んでなる。この他、各NK細胞増殖刺激因子を溶解するために滅菌水やバッファ、使用説明書等を包含することができる。ビスホスホネート誘導体は、ゾレドロン酸、パミドロン酸、アレンドロン酸、リセドロン酸、イパンドロン酸、インカドロン酸及びエチドロン酸からなる群から選択される化合物が好ましく、ゾレドロン酸がより好ましい。また、サイトカインは、IL-2、IL-12、IL-15及びIL-18からなる群から選択される化合物が好ましく、IL-2がより好ましい。
それぞれのNK細胞増殖刺激因子は、単独又は二以上を組み合わせた状態でキット内に包含させることができる。例えば、抗CD16抗体以外のNK細胞増殖刺激因子は、一つにまとめた状態でキット内に包含しておいてもよい。また、各NK細胞増殖刺激因子の状態は、特に限定しない。一のNK細胞増殖刺激因子が液体状態で、他のNK細胞増殖刺激因子が固体状態であってもよい。特に、抗CD16抗体はプラスチックビーズ等の適当な支持体に固相化した状態で包含されていることが好ましい。
５．疾患を治療する細胞免疫療法
５−１．概要
本発明の第五の実施形態は、第一の実施形態で製造されたNK細胞強化型血液製剤を生体に投与して免疫力を高め、疾患を治療する細胞免疫療法に関する。
５−１．概要
本発明の第五の実施形態は、第一の実施形態で製造されたNK細胞強化型血液製剤を生体に投与して免疫力を高め、疾患を治療する細胞免疫療法に関する。
５−２．構成
本実施形態は、第一の実施形態の製造方法で得られるNK細胞強化型血液製剤を生体に投与する細胞免疫療法である。
本実施形態は、第一の実施形態の製造方法で得られるNK細胞強化型血液製剤を生体に投与する細胞免疫療法である。
本実施形態でいう「細胞免疫療法」とは、前記第一の実施形態の製造方法で得られるNK細胞強化型血液製剤を生体に投与することで、その生体の免疫力を高めて疾患を治療する方法である。特に、本実施形態の細胞免疫療法は、養子免疫療法を前提としたものである事が好ましい。これは、前述のように養子免疫療法が拒絶反応の危険性がほとんどないからである。
前記投与されるNK細胞強化型血液製剤は、癌、ウイルス感染症、若くは真菌感染症に対する免疫力を有するリンパ球が単位体積あたりの通常血液平均値よりも多く含まれている血液製剤である。ここでいう「癌」とは、悪性腫瘍全般を意味する。例えば、上皮性腫瘍や肉腫、白血病、骨髄腫等が該当する。「ウイルス感染症」は、ウイルス感染による疾患全般を指すが、特に治癒が難治の慢性ウイルス感染症や急性ウイルス感染症の予防が該当する。当該難治な慢性ウイルス感染症としては、例えば、AIDSを引き起こすHIV感染症、ウイルス性慢性肝炎、子宮頸癌を引き起こすヒトパピローマウイルス感染症が挙げられる。また、急性ウイルス感染症としてはインフルエンザ等のウイルス性呼吸器感染症や免疫不全状態での急性ウイルス感染症が挙げられる。「真菌感染症」とは、糸状菌や酵母等による感染症である。例えば、カンジダ感染症、ブラストミセス症、ヒストプラスマ症等が挙げられる。
「免疫力を有するリンパ球」とは、免疫系における機能が強化されたリンパ球を意味する。例えば、細胞傷害活性が活性化された状態にあるNK細胞、γδT細胞、キラーT細胞、NKT細胞が該当する。また、ここでいう「単位体積あたりの通常血液平均値」とは、健常な個体の血液で一般に観察される癌、ウイルス感染症、若しくは真菌感染症に対する免疫力を有した血中細胞数の単位体積あたりの平均値を意味する。例えば、NK細胞であれば、健常者の大人の血液１mLあたり平均して約5×105個程度のNK細胞が存在している。本実施形態で用いるNK細胞強化型血液製剤は、癌、ウイルス感染症、若しくは真菌感染症に対する免疫力を有するリンパ球、例えば、NK細胞、T細胞、γδT細胞、NKT細胞のいずれか一、又は二以上が、培養に用いた血液量と同じ液量で比較した場合、単位体積あたりの通常の各血球数の平均値よりも100倍以上であることを特徴とする。
５−３．方法
本実施形態の細胞免疫療法におけるNK細胞強化型血液製剤の投与方法について、養子免疫療法を行う場合を例として以下で説明をする。当該投与方法は、実施形態１のNK細胞強化型血液製剤を投与する点を除けば、従来の養子免疫療法で知られる方法と基本的に同様である。したがって、投与方法に関しては公知の養子免疫療法における投与方法に準じて行えばよい。例えば、患者から採取した血液から実施形態１のNK細胞強化型血液製剤の製造方法によって製造された当該血液製剤を、その患者の体内に約2週間後に静脈注射又は点滴等を用いて投与する方法等が挙げられる。
本実施形態の細胞免疫療法におけるNK細胞強化型血液製剤の投与方法について、養子免疫療法を行う場合を例として以下で説明をする。当該投与方法は、実施形態１のNK細胞強化型血液製剤を投与する点を除けば、従来の養子免疫療法で知られる方法と基本的に同様である。したがって、投与方法に関しては公知の養子免疫療法における投与方法に準じて行えばよい。例えば、患者から採取した血液から実施形態１のNK細胞強化型血液製剤の製造方法によって製造された当該血液製剤を、その患者の体内に約2週間後に静脈注射又は点滴等を用いて投与する方法等が挙げられる。
本実施形態におけるNK細胞強化型血液製剤の１回あたりの投与量は、ヒトの場合には細胞数にして5×107個から4×109個の範囲のNK細胞を含む容量であればよい。ただし、これは一般的な大人への投与量である。実際の投与では、当該血液製剤を投与する者の年齢、性別、体重、疾患の状態、体力等を勘案して適宜調節することが好ましい。
本実施形態における細胞免疫療法の一例として、前記投与方法を１サイクルとして、約２週間間隔で１クール（6サイクル）以上投与を継続する方法が挙げられる。養子免疫療法でない場合も、自己でない生体から得られたNK細胞強化型血液製剤を投与する点を除いては、同様の方法で当該細胞免疫療法を行えばよい。
５−４．効果
本実施形態の細胞免疫療法によれば、従来の多くの免疫療法、特に養子免疫療法と比較して、癌等の疾患に対する治癒に高い有効性を有する。また、従来の養子免疫療法と基本的な操作技術等は同様であることから、養子免疫療法の技術を有する者であれば特段の技術習得をすることなく実施できる。
本実施形態の細胞免疫療法によれば、従来の多くの免疫療法、特に養子免疫療法と比較して、癌等の疾患に対する治癒に高い有効性を有する。また、従来の養子免疫療法と基本的な操作技術等は同様であることから、養子免疫療法の技術を有する者であれば特段の技術習得をすることなく実施できる。
以下の実施例をもって本発明を具体的に説明する。なお、以下の実施例は単に例示するのみであり、本発明はこれらの実施例によって何ら限定されるものではない。また、本実施例で使用された温度、量、時間等の数値に関して、実験上の多少の誤差及び偏差は斟酌される。
[実施例１]
＜健常者ドナーの血液を用いたNK細胞強化型血液製剤の製造方法＞
本発明の第一実施形態について、養子免疫療法で用いる当該血液製剤の製造方法についての具体例を挙げて説明をする。
＜健常者ドナーの血液を用いたNK細胞強化型血液製剤の製造方法＞
本発明の第一実施形態について、養子免疫療法で用いる当該血液製剤の製造方法についての具体例を挙げて説明をする。
（１）自己血漿の調製
まず、培養用自己血漿を生体であるドナーから調製した。ドナーは、健常者（30〜40代の男性4名、ドナー#1、2、3及び4とする）とした。採血管にヘパリンを50ユニット／mL加えて、ドナーの静脈から50mLの末梢全血を採取した。採取した末梢全血を無菌コニカル遠心管に移して、3000rpmで10分間遠心した後、上清を血漿として分離した。血漿を採取した残りの血球成分に、血漿分離前の全血量3倍量の無菌PBS(-)又は培養用培地を添加して血球成分溶液とし、以下の末梢血単核球の調製に使用した。血漿は、56℃で30分間処理して非働化し、さらに3000rpmで10分間遠心して、血小板等を除去した。その後、血漿を4℃保存した。この血漿は、細胞培養培地添加用として、培地調製の都度、必要量を使用した。
まず、培養用自己血漿を生体であるドナーから調製した。ドナーは、健常者（30〜40代の男性4名、ドナー#1、2、3及び4とする）とした。採血管にヘパリンを50ユニット／mL加えて、ドナーの静脈から50mLの末梢全血を採取した。採取した末梢全血を無菌コニカル遠心管に移して、3000rpmで10分間遠心した後、上清を血漿として分離した。血漿を採取した残りの血球成分に、血漿分離前の全血量3倍量の無菌PBS(-)又は培養用培地を添加して血球成分溶液とし、以下の末梢血単核球の調製に使用した。血漿は、56℃で30分間処理して非働化し、さらに3000rpmで10分間遠心して、血小板等を除去した。その後、血漿を4℃保存した。この血漿は、細胞培養培地添加用として、培地調製の都度、必要量を使用した。
（２）末梢血単核球（PBMCs）の調製
血球成分溶液に比重液に重層して、密度勾配遠心法を用いて赤血球や顆粒球を除去し、PBMCsを分離した。比重液は、Ficoll-Paqu PLUS（Amersham社）を用い、手順は、添付のプロトコルに従った。回収したPBMCsに30mLの血清を含まないPBS(-)又は培養細胞用の培地を加え、2〜3回洗浄した。培養細胞用培地には、例えば、血清を含まないRPMI1640培地を用いた。洗浄後、得られたPBMCs混濁液から一部サンプリングを取って、チルク染色後、血球計算板を用いてその数をカウントした。50mLの末梢全血から、PBMC細胞数4×107個を回収した。
血球成分溶液に比重液に重層して、密度勾配遠心法を用いて赤血球や顆粒球を除去し、PBMCsを分離した。比重液は、Ficoll-Paqu PLUS（Amersham社）を用い、手順は、添付のプロトコルに従った。回収したPBMCsに30mLの血清を含まないPBS(-)又は培養細胞用の培地を加え、2〜3回洗浄した。培養細胞用培地には、例えば、血清を含まないRPMI1640培地を用いた。洗浄後、得られたPBMCs混濁液から一部サンプリングを取って、チルク染色後、血球計算板を用いてその数をカウントした。50mLの末梢全血から、PBMC細胞数4×107個を回収した。
回収後の末梢血単核球は、5％（V/V）の上記自己血漿を加えたOpTmizer(Life Techelonogy社)培地に、細胞密度が1×106個/mLになるように加えて懸濁した。
（３）刺激工程
1mLの無菌蒸留水に0.2mgの抗CD16抗体（Clone3GB、Beckman Coulter）を溶解した。この抗CD16抗体は無菌製品ではないため、溶解後0.22μmフイルターでろ過滅菌した。無菌蒸留水で最終濃度が1μg/mLになるように199mLを添加して混合した。濾過後、抗CD16抗体溶液を25cm2培養フラスコに5mL入れて、37℃で一晩静置して抗CD16抗体溶液をフラスコ内面に固相化させた。その後、前記溶液を廃棄し、無菌PBS(-)によって2回洗浄した。
1mLの無菌蒸留水に0.2mgの抗CD16抗体（Clone3GB、Beckman Coulter）を溶解した。この抗CD16抗体は無菌製品ではないため、溶解後0.22μmフイルターでろ過滅菌した。無菌蒸留水で最終濃度が1μg/mLになるように199mLを添加して混合した。濾過後、抗CD16抗体溶液を25cm2培養フラスコに5mL入れて、37℃で一晩静置して抗CD16抗体溶液をフラスコ内面に固相化させた。その後、前記溶液を廃棄し、無菌PBS(-)によって2回洗浄した。
前記調製したPBMCsの懸濁液5mLを、前記フラスコ内に移した。続いて、1.7μL/mLのゾレドロン酸（ゾメタ：ノバルティスファーマ社）水溶液を8.5μL、4μL/mLのOK432（ピシバニール：中外製薬）水溶液を20μL、及び900ユニット/μLのIL-2（Proleukin：Chiron社）溶液4μLを前記PBMCsの懸濁液に添加し、十分に撹拌した。
前記各NK細胞増殖刺激因子でPBMCsを十分に刺激するため、予め庫内を37℃に設定した5％CO2インキュベーターに培地を移し、3日間保持しした。
（４）培養工程
その後、NK細胞増殖刺激因子を培養液から除去するため、5mLの培養液をコニカ遠心管に回収して、1200rpmで8分間遠心した。遠心後、上清の培地を除去し、細胞ペレットを700ユニット/μLのIL-2を含有する5％（V/V）の自己血清を含有する4mLのOpTmizer培地に懸濁して回収し、抗CD16抗体の固相化されていない新たなフラスコに移した後、再び37℃に設定した5％CO2インキュベーターで13日間培養した。2〜4日毎に5％（V/V）の自己血清を含有するOpTmizer培地を交換した。以上により、本発明の第二実施形態のNK細胞強化型血液製剤を作製した。
その後、NK細胞増殖刺激因子を培養液から除去するため、5mLの培養液をコニカ遠心管に回収して、1200rpmで8分間遠心した。遠心後、上清の培地を除去し、細胞ペレットを700ユニット/μLのIL-2を含有する5％（V/V）の自己血清を含有する4mLのOpTmizer培地に懸濁して回収し、抗CD16抗体の固相化されていない新たなフラスコに移した後、再び37℃に設定した5％CO2インキュベーターで13日間培養した。2〜4日毎に5％（V/V）の自己血清を含有するOpTmizer培地を交換した。以上により、本発明の第二実施形態のNK細胞強化型血液製剤を作製した。
実際に、NK細胞強化型血液製剤として使用する場合には、コンタミネーションテストや前処理を行う必要がある。以下、それらについて簡単に説明をする。
（コンタミネーションテスト）
培養液中のエンドトキシンの有無についての検証は、Limulus ES-II（Wako社）を用いて、添付のプロトコルに従って確認した。また、細菌やカビの有無については寒天培地に培養液の一部を塗布し、コロニー形成アッセイ法によって確認した。
培養液中のエンドトキシンの有無についての検証は、Limulus ES-II（Wako社）を用いて、添付のプロトコルに従って確認した。また、細菌やカビの有無については寒天培地に培養液の一部を塗布し、コロニー形成アッセイ法によって確認した。
（NK細胞強化型血液製剤前処理）
培養後2週間の培養液を遠心チューブに移し、1200rpmで10分間遠心を行った後、上清を廃棄した。PBS(-）を50mL加えて沈殿を懸濁し、再度1200rpmで10分間遠心を行った後、上清を廃棄した。この操作を3度繰り返して行い、培地成分を除去した。最後に乳酸リンゲル液70mLに懸濁した。以上の操作により、最終産物であるNK細胞強化型血液製剤を得た。
培養後2週間の培養液を遠心チューブに移し、1200rpmで10分間遠心を行った後、上清を廃棄した。PBS(-）を50mL加えて沈殿を懸濁し、再度1200rpmで10分間遠心を行った後、上清を廃棄した。この操作を3度繰り返して行い、培地成分を除去した。最後に乳酸リンゲル液70mLに懸濁した。以上の操作により、最終産物であるNK細胞強化型血液製剤を得た。
[実施例２]
＜NK細胞の増殖（１）＞
本発明のNK細胞強化型血液製剤の製造方法が活性化工程を要さず、製造工程上、先の出願に係る発明よりも有利であることを確認するために、実施例１に記載の健常者（ドナー#1）由来の血液を用いてNK細胞の増殖率について検証した。
＜NK細胞の増殖（１）＞
本発明のNK細胞強化型血液製剤の製造方法が活性化工程を要さず、製造工程上、先の出願に係る発明よりも有利であることを確認するために、実施例１に記載の健常者（ドナー#1）由来の血液を用いてNK細胞の増殖率について検証した。
（方法）
本実施例では、ビスホスホネート誘導体等としてゾレドロン酸水和物（ゾメタ：ノバルティスファーマ社）を、またサイトカインとしてIL-2を使用し、以下の3つのサンプルについてNK細胞の増殖率を検証した。
本実施例では、ビスホスホネート誘導体等としてゾレドロン酸水和物（ゾメタ：ノバルティスファーマ社）を、またサイトカインとしてIL-2を使用し、以下の3つのサンプルについてNK細胞の増殖率を検証した。
・サンプルA： NK細胞増殖刺激因子として、終濃度1μg/mLの抗CD16抗体、0.01KE/mLのOK432及び700ユニット/mLのIL-2を使用した。このサンプルのNK細胞増殖刺激因子は、先の出願に用いた増殖刺激因子に相当する。ただし、本実施例では、先の出願に係る製造方法と異なり、採取した血液を38℃〜40℃で10時間〜30時間保持する活性化工程を経ていない。
・サンプルB： NK細胞増殖刺激因子として、終濃度1μg/mLの抗CD16抗体、0.01KE/mLのOK432、5μM/mLのゾレドロン酸及び700ユニット/mLのIL-2を使用した。このサンプルのNK細胞増殖刺激因子は、本発明のNK細胞増殖刺激因子に相当する。
・サンプルC： サンプル（B）の対照として、5μM/mLのゾレドロン酸及び700ユニット/mLのIL-2を使用している。
基本的な製造方法は、前記実施例１に従った。ただし、サンプルAでは、前述のようにゾレドロン酸を添加せず、かつ先の出願の方法で必須工程であった38℃〜40℃で10時間〜30時間処理する活性化工程を行なっていない。また、サンプルCでは、抗CD16抗体及びOK432を添加していない。OpTmizer培地に、細胞密度が1×106個/mLになるようにPBMCs懸濁した日を0日目とし、各刺激因子による刺激を与え、10％自己血漿を培地に添加して刺激と培養を開始した日を1日目とした。培養（刺激工程を含む）0、3、5、7、9、11及び13日目で培養液の一部を回収し、それぞれの培養液中における培養細胞数を測定した。
培養細胞中NK細胞の測定は、フローサイトメトリー解析法を用いた。すなわち、血液製剤中のNK細胞を、蛍光物質で標識されたモノクローナル抗体（ECD標識-抗CD3抗体、PC5標識-抗CD56抗体Immunotech社）の組み合わせを用いて免疫染色した。免疫染色は、細胞浮遊液に各抗体の添付文書で推奨されている抗体量を加え、遮光室温にて15分間染色し、その後遠心して蛍光抗体を含む上清を洗い流すことで行った。続いてNK細胞の動態をフローサイトメトリーにCytomic FC500（Beckman社）よって、上記の抗体の組み合わせで測定した。測定データはCXP解析によって解析した。
（結果）
図１及び２並びに表１に結果を示す。図１は、上記A〜Cサンプルそれぞれのフローサイトメトリーによる解析結果の一例として、培養11日目のサイトグラムを示す。図１において横軸は、ECD標識−抗CD3抗体の、また縦軸はPC5標識−抗CD56抗体の蛍光強度をそれぞれ対数スケールで示している。各サイトグラムにおける4つの分画X1〜X4は、前記2種類の蛍光強度に基づいてX1(CD3-CD56+)をNK細胞のフラクション、X2(CD3+CD56+)及びX4(CD3+CD56-)をCD3陽性Tリンパ球のフラクション、そしてX3（CD3-CD56-）をB細胞など上記以外の細胞のフラクションとしてそれぞれ区分けしている。また、各分画内の数値は、測定した培養細胞中における当該分画に含まれる細胞の割合（％）を表す。図２は、上記A〜Cサンプルそれぞれの培養期間に経過と培養液中の細胞数の関係を示している。表１は、サンプルA及びBについて、培養0日目及び13日目の総細胞数（0日目の総細胞数は、PBMC総数に相当する）、総細胞数に対するNK細胞の割合（NK%）NK細胞増殖率等を示している。
図１及び２並びに表１に結果を示す。図１は、上記A〜Cサンプルそれぞれのフローサイトメトリーによる解析結果の一例として、培養11日目のサイトグラムを示す。図１において横軸は、ECD標識−抗CD3抗体の、また縦軸はPC5標識−抗CD56抗体の蛍光強度をそれぞれ対数スケールで示している。各サイトグラムにおける4つの分画X1〜X4は、前記2種類の蛍光強度に基づいてX1(CD3-CD56+)をNK細胞のフラクション、X2(CD3+CD56+)及びX4(CD3+CD56-)をCD3陽性Tリンパ球のフラクション、そしてX3（CD3-CD56-）をB細胞など上記以外の細胞のフラクションとしてそれぞれ区分けしている。また、各分画内の数値は、測定した培養細胞中における当該分画に含まれる細胞の割合（％）を表す。図２は、上記A〜Cサンプルそれぞれの培養期間に経過と培養液中の細胞数の関係を示している。表１は、サンプルA及びBについて、培養0日目及び13日目の総細胞数（0日目の総細胞数は、PBMC総数に相当する）、総細胞数に対するNK細胞の割合（NK%）NK細胞増殖率等を示している。
いずれのサンプルも5日目あたりまでは、ほとんど差異はない。サンプルAは、先の出願と同じNK細胞増殖刺激因子を添加しているものの特定の温度で特定時間処理する活性化工程を経ていないことから、その後のNK細胞の増殖も低かった。一方、NK細胞増殖刺激因子以外同一培養条件で培養したサンプルBでは、9日目〜13日目にNK細胞の著しい増加が見られ、13日目ではサンプルAのNK細胞の増殖率の約9倍に達した(表１参照)。よって、本発明の製造方法によれば、活性化工程を必要とすることなくNK細胞を効率的に増殖できることが明らかとなった。さらに、図２Cから、ゾレドロン酸とIL-2の添加のみでは細胞数の増殖は不十分であった。この結果から、本発明の製造方法におけるNK細胞の効率的な増殖には、抗CD16抗体、OK432、ゾレドロン酸及びIL-2のいずれもが必要であることがわかった。
[実施例３]
＜NK細胞の増殖（２）＞
先の出願に係るNK細胞強化型血液製剤の製造方法におけるゾレドロン酸の効果を確認するために、実施例１に記載の健常者（ドナー#2及び3）由来の血液を用いてNK細胞の増殖率について検証した。
＜NK細胞の増殖（２）＞
先の出願に係るNK細胞強化型血液製剤の製造方法におけるゾレドロン酸の効果を確認するために、実施例１に記載の健常者（ドナー#2及び3）由来の血液を用いてNK細胞の増殖率について検証した。
（方法）
以下の2つのサンプルについてNK細胞の増殖率を検証した。
以下の2つのサンプルについてNK細胞の増殖率を検証した。
・サンプルD： NK細胞増殖刺激因子として、終濃度1μg/mLの抗CD16抗体、0.01KE/mLのOK432及び700ユニット/mLのIL-2を使用した。
・サンプルE： NK細胞増殖刺激因子として、終濃度1μg/mLの抗CD16抗体、0.01KE/mLのOK432、5μM/mLのゾレドロン酸及び700ユニット/mLのIL-2を使用した。
上記のように、本実施例でサンプルD及びEに添加するNK細胞増殖刺激因子は、前記実施例２のサンプルA及びBとそれぞれ同じであるが、本実施例では、原則として先の出願に係るNK細胞強化型血液製剤の製造方法に従った点が前記実施例２と異なる。すなわち、増殖刺激因子添加工程（本発明では刺激工程に相当）後に培地を39℃に一晩保持する高温刺激を行った。
NK細胞数の測定は、実施例２と同様にフローサイトメトリー解析法を用いた。
（結果）
表２に結果を示す。この表では、各ドナーのサンプルD及びEに関する培養0日目及び13日目の総細胞数、それに対するNK細胞の割合（NK%）、NK細胞の増殖率等を示している。サンプルDでは、NK細胞の増殖率は、13日目で培養前の245倍（#2）及び160倍（#3）に達した。一方、ゾレドロン酸を添加したサンプルEでは、13日目で培養前の約325倍（#2）及び290倍（#3）に達した。この結果から、先の出願に係る製造方法と同一の反応条件下であっても、ゾレドロン酸を添加する本発明のNK細胞強化型血液製剤の製造方法の方が、約1.3〜1.8倍高いNK細胞増殖率を有することが明らかとなった。すなわち、本発明によれば、活性化工程を行なうことで先の出願に係る製造方法よりも、さらに高いNK細胞増殖率を得ることができる。
表２に結果を示す。この表では、各ドナーのサンプルD及びEに関する培養0日目及び13日目の総細胞数、それに対するNK細胞の割合（NK%）、NK細胞の増殖率等を示している。サンプルDでは、NK細胞の増殖率は、13日目で培養前の245倍（#2）及び160倍（#3）に達した。一方、ゾレドロン酸を添加したサンプルEでは、13日目で培養前の約325倍（#2）及び290倍（#3）に達した。この結果から、先の出願に係る製造方法と同一の反応条件下であっても、ゾレドロン酸を添加する本発明のNK細胞強化型血液製剤の製造方法の方が、約1.3〜1.8倍高いNK細胞増殖率を有することが明らかとなった。すなわち、本発明によれば、活性化工程を行なうことで先の出願に係る製造方法よりも、さらに高いNK細胞増殖率を得ることができる。
[実施例４]
＜凍結血液由来のNK細胞強化型血液製剤によるNK細胞の増殖＞
凍結血液を用いたときの、本発明の製造方法のNK細胞の増殖について、健常者ドナー#4由来の凍結血液を用いてNK細胞強化型血液製剤を製造し、その効果を検証した。
＜凍結血液由来のNK細胞強化型血液製剤によるNK細胞の増殖＞
凍結血液を用いたときの、本発明の製造方法のNK細胞の増殖について、健常者ドナー#4由来の凍結血液を用いてNK細胞強化型血液製剤を製造し、その効果を検証した。
（方法）
NK細胞強化型血液製剤の製造方法の基本手順は、前記実施例１と同様であるが、ドナー#4から血液を採取した後、その血液をそのまま又は適当な処理、例えばPBMCsを分離して一旦凍結したものを前記製造方法に用いる点で異なる。そこで、実施例１と相違する点を以下で具体的に説明し、その他の同じ手順については省略する。
NK細胞強化型血液製剤の製造方法の基本手順は、前記実施例１と同様であるが、ドナー#4から血液を採取した後、その血液をそのまま又は適当な処理、例えばPBMCsを分離して一旦凍結したものを前記製造方法に用いる点で異なる。そこで、実施例１と相違する点を以下で具体的に説明し、その他の同じ手順については省略する。
まず、採血管にヘパリンを50ユニット/mL加えて、ドナー#4の静脈から50mLの末梢全血を採取した。採取した末梢全血を無菌コニカ遠心管に移して、3000rpmで10分間遠心した後、上清を血漿として分離した。血漿を採取した残りの血球成分から実施例１と同様の方法によりPBMCsを調製した。そのまま凍結するか又はPBMCsに凍結剤（バンバンカー；日本ジェネティックス社）を1mL加え、凍結チューブに入れて、-80℃のディープフリーザー内で保存した。
解凍作業は、凍結した細胞を急速解凍後、遠心にて凍結用溶液を洗浄除去し、培養液を加えることにより行なった。サンプルA〜Cについて、以降の方法は、原則として実施例１に記載した「（３）刺激工程」以降と同じである。
（結果）
図３及び表３に結果を示す。
図３及び表３に結果を示す。
図３は、実施例２と同様に、サンプルA、B、Cのフローサイトメトリーによる解析結果の一例として、培養11日目のサイトグラムを示している。各サイトグラムにおける4つの分画X1〜X4は、実施例２と同様である。表３は、血液ドナー#4におけるサンプルA及びBについて、培養0日目及び12日目のNK細胞の絶対数、増殖率等を示している。図３の各区画に分布する細胞のパターンは、サンプルA〜Bのいずれも図１で示した細胞の分布のパターンとほとんど同じであった。
表３では、血液ドナー#4のサンプルA及びBについて、培養0日目及び12日目のNK細胞の絶対数、増殖率等を示している。サンプルAでは、NK細胞の増殖率は、12日目で培養0日目の150倍に達した。一方、ゾレドロン酸を添加したサンプルBでは、12日目で培養0日目の約380倍に達した。すなわち、本発明の製造方法によれば、凍結血液を用いた場合であっても、新鮮な血液を用いた場合と同様に、先の出願に係る製造方法よりも高いNK細胞増殖率を得ることができることが判明した。
[実施例５]
＜健常者ドナー血液由来の活性化NK細胞の測定：K562を用いた細胞傷害活性＞
本発明のNK細胞強化型血液製剤におけるNK細胞の活性化をNK細胞の標的であるK562細胞株に対する細胞傷害活性として測定した。
＜健常者ドナー血液由来の活性化NK細胞の測定：K562を用いた細胞傷害活性＞
本発明のNK細胞強化型血液製剤におけるNK細胞の活性化をNK細胞の標的であるK562細胞株に対する細胞傷害活性として測定した。
（方法）
まず、白血病細胞系株化細胞であるK562細胞を蛍光色素Calcein-AMで標識した。標識は、RPMI-1640培地（10％ウシ胎児血清を含有）に、100分の1容量のCalcein-AM溶液（同仁化学研究所）を加えて37℃で30分間インキュベートして行なった。標識後、当該細胞をPBS（-）で洗浄し、標的K562細胞として用いた。次に、前記実施例２の方法で製造したサンプルA及びB由来のNK細胞強化型血液製剤におけるNK細胞（それぞれ、後述する図４のA及びBに対応）及びNK細胞株KHYG-1、並びに前記実施例３の方法で製造したサンプルD及びE由来のNK細胞強化型血液製剤におけるNK細胞を、それぞれエフェクター細胞（E）として用い、標的K562細胞（ターゲット細胞：T）との比（E/T比）が所定の値となるよう調整した後、それぞれを96ウェルプレートに入れ、37℃にてCO2濃度5％で2時間反応させた。反応後、蛍光を保持している、すなわち生きているターゲット細胞の量をTerascan VP（ミネルバテック社）を用いてその蛍光強度によって検出した。K562の細胞傷害活性値は、傷害前のコントロール、すなわち、エフェクター細胞を加えない状態の蛍光強度との比較により算出した。
まず、白血病細胞系株化細胞であるK562細胞を蛍光色素Calcein-AMで標識した。標識は、RPMI-1640培地（10％ウシ胎児血清を含有）に、100分の1容量のCalcein-AM溶液（同仁化学研究所）を加えて37℃で30分間インキュベートして行なった。標識後、当該細胞をPBS（-）で洗浄し、標的K562細胞として用いた。次に、前記実施例２の方法で製造したサンプルA及びB由来のNK細胞強化型血液製剤におけるNK細胞（それぞれ、後述する図４のA及びBに対応）及びNK細胞株KHYG-1、並びに前記実施例３の方法で製造したサンプルD及びE由来のNK細胞強化型血液製剤におけるNK細胞を、それぞれエフェクター細胞（E）として用い、標的K562細胞（ターゲット細胞：T）との比（E/T比）が所定の値となるよう調整した後、それぞれを96ウェルプレートに入れ、37℃にてCO2濃度5％で2時間反応させた。反応後、蛍光を保持している、すなわち生きているターゲット細胞の量をTerascan VP（ミネルバテック社）を用いてその蛍光強度によって検出した。K562の細胞傷害活性値は、傷害前のコントロール、すなわち、エフェクター細胞を加えない状態の蛍光強度との比較により算出した。
（結果）
前記実施例２の方法で製造した健常者ドナー#1におけるNK細胞の細胞傷害活性を表１に、前記実施例３の方法で製造した健常者ドナー#2及び3におけるNK細胞の細胞傷害活性を表２に、前記実施例４の方法で製造した健常者ドナー#4におけるNK細胞の細胞傷害活性を図５に、それぞれ示す。使用したE/T比は、それぞれの表又は図中に示した。
前記実施例２の方法で製造した健常者ドナー#1におけるNK細胞の細胞傷害活性を表１に、前記実施例３の方法で製造した健常者ドナー#2及び3におけるNK細胞の細胞傷害活性を表２に、前記実施例４の方法で製造した健常者ドナー#4におけるNK細胞の細胞傷害活性を図５に、それぞれ示す。使用したE/T比は、それぞれの表又は図中に示した。
表１及び２並びに図５から、本発明のNK細胞強化型血液製剤の製造方法と先の出願に係るNK細胞強化型血液製剤の製造方法のそれぞれで得られたNK細胞の細胞傷害活性は、ほとんど変わらないことが明らかとなった。したがって、本発明のNK細胞強化型血液製剤の製造方法は、先の出願に係る製造方法で得られたNK細胞の細胞傷害活性を維持しつつ、NK細胞数の増加により、NK細胞における細胞傷害活性を高めることができることが明らかとなった。
[実施例６]
＜γδ T細胞の増殖＞
本発明のNK細胞強化型血液製剤の製造方法で使用するゾレドロン酸は、γδ T細胞の増殖活性を亢進させることが知られている（Sato K, et al.,2005, Int. J. Cancer, 116:94-99; Kondo M, et al.,2008, Cytotherapy, 10(8):842-856.）。そこで、本発明の前記製造方法においてもNK細胞の増殖活性を向上させると共にγδ T細胞を増殖できるか否かについて検証した。
＜γδ T細胞の増殖＞
本発明のNK細胞強化型血液製剤の製造方法で使用するゾレドロン酸は、γδ T細胞の増殖活性を亢進させることが知られている（Sato K, et al.,2005, Int. J. Cancer, 116:94-99; Kondo M, et al.,2008, Cytotherapy, 10(8):842-856.）。そこで、本発明の前記製造方法においてもNK細胞の増殖活性を向上させると共にγδ T細胞を増殖できるか否かについて検証した。
（方法）
血液は、健常者ドナー#2及び3から採取された新鮮血及びそれを処理して一旦冷凍保存した凍結PBMCsをそれぞれ用いた。これらの血液サンプル（PBMCs）中には、対象とするγδ T細胞も混在していることから、基本的な操作手順は、前記実施例３及び４に準じて行なった。
血液は、健常者ドナー#2及び3から採取された新鮮血及びそれを処理して一旦冷凍保存した凍結PBMCsをそれぞれ用いた。これらの血液サンプル（PBMCs）中には、対象とするγδ T細胞も混在していることから、基本的な操作手順は、前記実施例３及び４に準じて行なった。
γδ T細胞数の測定は、NK細胞のときと同様に、フローサイトメトリー解析法を用いた。蛍光物質で標識されたモノクローナル抗体（PC5標識-抗PNA γδ T抗体、ECD標識-抗CD3抗体Immunotech社）の組み合わせを用いて血液製剤中のγδ T細胞を免疫染色した。免疫染色は、細胞浮遊液に各抗体の添付文書で推奨されている抗体量を加え、遮光室温にて15分間染色し、その後遠心して蛍光抗体を含む上清を洗い流すことで行った。続いてγδ T細胞の動態をフローサイトメトリーにCytomic FC500（Beckman社）よって、上記の抗体の組み合わせで測定した。測定データはCXP解析によって解析した。
（結果）
結果を図６及び７並びに表４に示す。
結果を図６及び７並びに表４に示す。
図６は新鮮血を用いたときの、図７は凍結PMBCsを用いたときの、健常者ドナー#2のサンプルA、B、C（それぞれ図６及び７のA、B、Cに対応）のフローサイトメトリーによる解析結果（一例として、培養11日目のみ）のサイトグラムを示している。図６及び７において、横軸はECD標識-抗CD3抗体の、また縦軸はPC5標識-抗PAN γδ T抗体の蛍光強度をそれぞれ対数スケールで示している。各サイトグラムにおける4つの分画Y1〜Y4は、前記2種類の蛍光強度に基づいてY1(CD3-PAN+)を未染色（本染色では該当する細胞なし）のフラクション、Y2(CD3+PAN+)をγδ T細胞のフラクション、Y4(CD3+PAN-)をαβ T細胞のフラクション、そしてY3（CD3-PAN-）をT細胞以外の細胞フラクション（NK細胞を包含する）としてそれぞれ区分けしている。また、各分画内の数値は、測定した培養細胞における当該分画に含まれる細胞の割合（％）を表す。
また、表４は、新鮮血を用いたときの健常者ドナー#2及び#3におけるサンプルA及びBについて、培養0日目の総細胞数、それに対するγδ T細胞の割合（γδ T%）、及び13日目の総細胞数とそれに対するγδ T細胞の割合（γδ T%）、増殖率等を示す。
図６及び７からγδ T細胞のフラクションY2における細胞％は、ゾレドロン酸とIL-2を添加したサンプルCでは、約40％と高いのに対して、ゾレドロン酸を添加していないサンプルAでは、わずか数％に過ぎなかった。一方、本発明の製造方法に相当するサンプルBでは、Y2における細胞％が12％及び19％あり、サンプルAと比較して高かった。これは、表４のサンプルA及びBにおけるγδ T細胞の増殖率からも明らかである。したがって、本発明のNK細胞強化型血液製剤の製造方法は、ゾレドロン酸のγδ T細胞増殖亢進作用を損なうことなく、同時にNK細胞の増殖を亢進できることが明らかとなった。
γδ T細胞は、NK細胞と同様にMHCクラスIを標的とすることなく標的細胞を殺傷することができることから、細胞免疫療法に用いることができる。それ故、本発明の製造方法は、NK細胞の増殖と同時に先の出願に係るNK細胞強化型血液製剤の製造方法では成し得なかったγδ T細胞の増殖を行なうことができるという利点を有している。
[実施例７]
＜癌患者ドナーの血液を用いたNK細胞強化型血液製剤の製造方法と各種検証＞
前記実施例１〜６では、健常者由来の血液を用いて、本発明の方法によるNK細胞強化型血液製剤の製造、及びその方法におけるNK細胞の増殖率、NK細胞傷害活性、γδ T細胞の増殖率等について検証し、従来の方法や先の出願に係る製造方法よりも高いNK細胞の増殖率や傷害活性が得られた。
＜癌患者ドナーの血液を用いたNK細胞強化型血液製剤の製造方法と各種検証＞
前記実施例１〜６では、健常者由来の血液を用いて、本発明の方法によるNK細胞強化型血液製剤の製造、及びその方法におけるNK細胞の増殖率、NK細胞傷害活性、γδ T細胞の増殖率等について検証し、従来の方法や先の出願に係る製造方法よりも高いNK細胞の増殖率や傷害活性が得られた。
しかし、癌患者由来の血液を用いて、本発明のNK細胞強化型血液製剤の製造方法を実施した場合にも、健常者由来の血液と同様の上記効果が得られるとは限らない。
そこで、様々な癌を様々なステージで有する癌患者10名からインフォームドコンセントを得て、これらの癌患者由来の血液を用いて上記実施例と同様の方法によって、NK細胞強化型血液製剤を製造し、NK細胞の増殖率、NK細胞傷害活性、γδ T細胞の増殖率等について検証検証した。
（１）NK細胞強化型血液製剤の製造方法
培養用自己血漿を提供する血液ドナーは、表５に記載の10名（ドナー#1p〜10p）とした。表５に示すように、これらの癌患者は、年齢、性別、原発癌種、そして癌ステージ、いずれも様々である。製造方法は、実施例１に記載の方法と同様の手順で行った。
培養用自己血漿を提供する血液ドナーは、表５に記載の10名（ドナー#1p〜10p）とした。表５に示すように、これらの癌患者は、年齢、性別、原発癌種、そして癌ステージ、いずれも様々である。製造方法は、実施例１に記載の方法と同様の手順で行った。
（２）NK細胞の増殖
癌患者由来の血液を用いた場合でもゾレドロン酸の効果が得られることを確認するために、本実施例上記（１）に記載の癌患者全員の血液を用いてNK細胞の増殖率について検証した。
癌患者由来の血液を用いた場合でもゾレドロン酸の効果が得られることを確認するために、本実施例上記（１）に記載の癌患者全員の血液を用いてNK細胞の増殖率について検証した。
（方法）
基本的な手順は、上記実施例３に記載した方法に準ずるが、本実施例では、NK細胞増殖刺激因子として実施例３に記載のサンプルEと同じNK細胞増殖刺激因子を使用して高温刺激を行い、患者ごとに12、17、19又は21日のいずれかの日数で培養した。培養終了後に培養液の一部を回収し、それぞれの培養液中におけるNK細胞数を測定した。
基本的な手順は、上記実施例３に記載した方法に準ずるが、本実施例では、NK細胞増殖刺激因子として実施例３に記載のサンプルEと同じNK細胞増殖刺激因子を使用して高温刺激を行い、患者ごとに12、17、19又は21日のいずれかの日数で培養した。培養終了後に培養液の一部を回収し、それぞれの培養液中におけるNK細胞数を測定した。
（結果）
表６に結果を示す。
表６に結果を示す。
表６では、培養0日目及び培養終了後の、各患者における総細胞数、培養日数、総細胞数に対するNK細胞率（NK%）、及びNK細胞の増殖率等の10名の平均値及び標準偏差を示している。培養日数は、患者によって12〜21日と幅はあるものの、NK細胞の平均増殖率は、培養前の約450倍に達した。
（３）活性化NK細胞の測定：K562を用いた細胞傷害活性
癌患者由来の血液より製造したNK細胞の活性化をNK細胞の標的であるK562細胞株に対する細胞傷害活性として測定した。
癌患者由来の血液より製造したNK細胞の活性化をNK細胞の標的であるK562細胞株に対する細胞傷害活性として測定した。
（方法）
基本的な手順は、上記実施例５に記載した方法に準ずる。エフェクター細胞として、本実施形態の前記（２）で製造した癌患者10名の各血液由来のNK細胞強化型血液製剤におけるNK細胞を用いた。
基本的な手順は、上記実施例５に記載した方法に準ずる。エフェクター細胞として、本実施形態の前記（２）で製造した癌患者10名の各血液由来のNK細胞強化型血液製剤におけるNK細胞を用いた。
（結果）
表６に結果を示す。本発明のNK細胞強化型血液製剤の製造方法によれば、癌患者の血液由来のNK細胞であっても細胞障害活性は、平均値で84.6％（標準偏差5.7％）と非常に高い活性が見られ、NK細胞の増殖活性を高めることができることが明らかとなった。
表６に結果を示す。本発明のNK細胞強化型血液製剤の製造方法によれば、癌患者の血液由来のNK細胞であっても細胞障害活性は、平均値で84.6％（標準偏差5.7％）と非常に高い活性が見られ、NK細胞の増殖活性を高めることができることが明らかとなった。
（４）γδ T細胞の増殖
癌患者由来の血液を用いた場合であっても、本発明のNK細胞強化型血液製剤製造方法によれば、健常者由来の血液と同様に製剤中のγδ T細胞を増殖できるか否かについて検証した。
癌患者由来の血液を用いた場合であっても、本発明のNK細胞強化型血液製剤製造方法によれば、健常者由来の血液と同様に製剤中のγδ T細胞を増殖できるか否かについて検証した。
（方法）
血液は、表５に示した癌患者10名から採取した新鮮血のみを用いた。基本的な手順は、前記実施例６に準じ、サンプルEと同じNK細胞増殖刺激因子を使用して高温刺激を行い、患者ごとに12、17、19又は21日のいずれかの日数で培養した。
血液は、表５に示した癌患者10名から採取した新鮮血のみを用いた。基本的な手順は、前記実施例６に準じ、サンプルEと同じNK細胞増殖刺激因子を使用して高温刺激を行い、患者ごとに12、17、19又は21日のいずれかの日数で培養した。
（結果）
結果を表７に示す
結果を表７に示す
癌患者の培養0日目及び培養終了後の、各患者における総細胞数、培養日数、総細胞数に対するγδ T細胞率（γδ T%）、及びγδ T細胞の増殖率等の10名の平均値及び標準偏差を示している。本発明のNK細胞強化型血液製剤の製造方法によれば、癌患者由来の血液由来のNK細胞強化型血液製剤であっても、γδ T細胞増殖亢進作用を有することが判明した。
本実施例の結果から、本発明のNK細胞強化型血液製剤の製造方法及びNK細胞強化用組成物によれば、癌患者由来の血液を使用した場合であっても、ドナーの年齢、性別、癌種及びステージ如何にかかわらず、健常者由来の血液を使用した場合と同様の効果が得られることが明らかとなった。これにより、本発明のNK細胞強化型血液製剤の製造方法は、癌患者自身から採取した血液を使用することも可能であり、製造されたそのNK細胞強化用組成物を再びその患者の体内に戻すことで、自己細胞故に拒絶反応もなく、細胞傷害活性が強化されたNK細胞やγδ T細胞を多量に体内に導入できる。したがって、癌治療上、極めて望ましい養子免疫療法が可能となる。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
Claims (8)
- 生体から採取された血液中に含まれるNK細胞を少なくとも抗CD16抗体、OK432（ピシバニール）、ゾレドロン酸又はその塩若しくはその水和物、及びIL-2を含むNK細胞増殖刺激因子によって刺激する刺激工程、及び
刺激工程後に当該血液を生理的細胞温度で培養する培養工程
を含むNK細胞強化型血液製剤の製造方法。 - 前記刺激工程において、38℃〜40℃で10時間〜30時間保持する高温刺激を加える、請求項１に記載の製造方法。
- 抗CD16抗体が支持体に固相化されている、請求項１又は２に記載の製造方法。
- 培養工程における培養期間が9日〜21日である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の製造方法。
- 前記血液が末梢血、臍帯血又は骨髄液である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の製造方法。
- 請求項１から５のいずれか一項に記載の製造方法で得られるNK細胞強化型血液製剤。
- 抗CD16抗体、OK432、ゾレドロン酸又はその塩若しくはその水和物、及びIL-2を含んでなるNK細胞強化用組成物。
- 抗CD16抗体、OK432、ゾレドロン酸又はその塩若しくはその水和物、及びIL-2を含むNK細胞強化型血液製造用キット。
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