KR102541619B1 - 자연살해세포 활성도 신속검사용 자극조성물 및 이를 이용한 자연살해세포 활성도 신속검사방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 자연살해세포 활성도 신속검사 기술에 대한 것으로, 보다 구체적으로는 자연살해세포를 자극하여 배양 후 늦어도 48시간 이내에 자연살해세포의 활성도 검사가 가능한 자연살해세포 활성도 신속검사용 자극조성물 및 이를 이용한 자연살해세포 활성도 신속검사에 관한 것이다.

Description

자연살해세포 활성도 신속검사용 자극조성물 및 이를 이용한 자연살해세포 활성도 신속검사방법{Stimulation compositions for rapid test of natural killer cell activity and method for rapid test of natural killer cell activity using the same}

본 발명은 자연살해세포 활성도 신속검사 기술에 대한 것으로, 보다 구체적으로는 자연살해세포를 자극하여 배양 후 늦어도 18~48시간 이내에 자연살해세포의 활성도 검사가 가능한 자연살해세포 활성도 신속검사용 자극조성물 및 이를 이용한 자연살해세포 활성도 신속검사에 관한 것이다.

인간은 노화가 진행됨에 따라 면역세포수도 줄어들고 면역세포의 활성도도 점차 줄어든다. 이러한 이유로 면역력은 나이에 반비례해서 지속적으로 떨어지게 되며 100세 시대를 사는 요즘 수명이 길어짐에 따라 면역력 저하로 인한 암환자 또한 증가할 수밖에 없는 상황이다.

인간의 몸은 여러 종류의 면역세포에 의해서 면역력이 유지되는데 그 중에서도 자연살해세포에 관심을 기울이는 이유는 몸 전체의 면역력이 자연살해세포의 활성도와 밀접한 관련이 있기 때문이다. 즉, 자연 살해세포는 인간이 나이를 먹어감에 따라 점차 그 활성을 잃어가고 특히 암환자의 경우 자연살해세포의 활성이 건강한 사람과 크게 차이가 나는 것을 실험을 통하여 확인할 수 있기 때문이다.

한편, 자연살해세포는 면역력이 좋다고 하는 정상인일지라도 평상시에는 그 활성(암세포 살상력)이 거의 없는 상태를 유지하고 있다가 유사시 즉, 감염세포나 박테리아를 만났을 때 바로 활성화 되어 살상효과를 나타낸다. 자연살해세포의 활성은 자극을 주었을 때 얼마나 빨리 비정상적인 세포를 제거할 수 있는 능력을 확보하는가 하는 활성화 시간과 세포독성의 크기로 나타낼 수 있다.

이러한 연구결과들에 의하면 자연살해세포의 활성도를 측정하여 암 발병 가능성을 예측할 수 있을 것으로 보인다. 또한, 자연살해세포의 활성을 직접 확인할 수 있다면 보다 정확한 암 발병 가능성을 예측할 수 있어 암 발병 가능성을 염려하는 많은 준건강인과 암환자들에게 정확한 정보를 제공할 수 있어 질병의 치료와 예방에 많은 도움을 줄 수 있을 것이다.

하지만, 아직까지 자연살해세포의 활성도를 간접법이 아닌 직접법으로 측정하여 질병 발병가능성을 예측하고자 하는 시도는 없었다.

특허공개번호 제10-2018-0057359 호

본 발명자들은 자연살해세포의 활성도를 측정하면 질병 발병가능성을 예측할 수 있는 것에 착안하여 자연살해세포의 활성도를 신속하게 검사할 수 있는 기술을 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 면역력을 측정할 수 있고 감염성 질환의 감염가능성 등을 예측하기 위해 말초혈액에서 분리된 림프구를 배양하여 늦어도 18~48시간 이내에 자연살해세포의 활성도를 측정할 수 있도록 자연살해세포를 자극할 수 있는 자연살해세포 활성도 신속검사용 자극조성물 및 이를 이용한 자연살해세포 활성도 신속검사방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 자연살해세포 활성도 신속검사용 자극조성물을 이용하여 바이러스에 의한 각종 질환의 예방 및/또는 개선 효과를 나타내는 바이러스에 의한 증상 예방 또는 개선용 약학조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 자연살해세포 활성도 신속검사용 자극조성물을 이용하여 소염작용 및 피부를 매끄럽게 하는데 효과적인 화장료조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 목적은 이상에서 언급한 목적으로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 목적들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상술된 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 IL-2, IL-12, IL-18 및 기본배지를 유효성분으로 포함하는 자연살해세포 활성도 신속검사용 자극조성물을 제공한다.

바람직한 실시예에 있어서, 상기 IL-12와 상기 IL-18은 1:3~1:10의 중량비로 포함된다.

바람직한 실시예에 있어서, 상기 IL-2는 700 IU/mL ~ 5000 IU/mL , 상기 IL-12는 1ng/mL ~ 4 ng/mL 및 상기 IL-18은 3 ng/mL ~ 40 ng/mL 포함된다.

또한, 본 발명은 측정대상자의 말초혈액으로부터 림프구를 분리하는 분리단계; 분리된 림프구를 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항의 자극조성물로 18~48시간 이하로 배양하는 배양단계; 및 상기 배양단계에서 얻어진 자연살해세포의 활성도를 검사하는 검사단계;를 포함하는 자연살해세포 활성도 신속검사방법을 제공한다.

바람직한 실시예에 있어서, 상기 배양단계에서 24시간이내에 상기 자극조성물이 상기 림프구에서 얻어지는 자연살해세포의 활성을 신속하게 높인다.

바람직한 실시예에 있어서, 상기 검사단계는 Target cell에 형광염색하는 단계; 상기 형광 염색된 Target cell과 상기 자연살해세포와 반응시키는 단계; 및 상기 자연살해세포에 의해 공격 받은 Target cell이 파괴되어 방출되는 형광물질의 강도를 측정하는 단계;를 포함하여 수행된다.

또한, 본 발명은 상술된 어느 하나의 신속검사용 자극조성물을 유효성분으로 포함하는 바이러스에 의한 증상 예방 또는 개선용 약학조성물을 제공한다.

바람직한 실시예에 있어서, 상기 약학조성물은 스프레이 제형으로 형성된다.

또한, 본 발명은 상술된 어느 하나의 신속검사용 자극조성물; 및 화장료베이스를 포함하는 화장료조성물을 제공한다.

본 발명은 다음과 같은 우수한 효과를 갖는다.

먼저, 본 발명에 의하면 말초혈액에서 분리된 림프구를 배양하여 늦어도 18~48시간 이내에 자연살해세포의 활성도를 측정할 수 있도록 자연살해세포를 자극할 수 있는 자연살해세포 활성도 신속검사용 자극조성물 및 이를 이용한 자연살해세포 활성도 신속검사방법을 통해 면역력을 측정할 수 있고 감염성 질환의 감염가능성 등을 예측할 수 있다.

또한, 본 발명에 의하면 바이러스에 의한 증상 예방 또는 개선용 약학조성물을 통해 자연살해세포 활성도 신속검사용 자극조성물을 이용하여 바이러스에 의한 각종 질환의 예방 및/또는 개선 효과를 나타낼 수 있다.

또한, 본 발명에 의하면 화장료조성물을 통해 자연살해세포 활성도 신속검사용 자극조성물을 이용하여 소염작용 및 피부를 매끄럽게 하는데 효과적이다.

본 발명의 이러한 기술적 효과는 이상에서 언급한 범위만으로 제한되지 않으며, 명시적으로 언급되지 않았더라도 후술되는 발명의 실시를 위한 구체적 내용의 기재로부터 통상의 지식을 가진 자가 인식할 수 있는 발명의 효과 역시 당연히 포함된다.

도 1은 본 발명의 실시예에 따른 자연살해세포 자극조성물과 배양된 자연살해세포의 배양시간에 따른 활성도를 정상인과 암환자를 대상으로 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 도 1에서 측정된 결과를 기반으로 배양시간에 따른 평균활성도를 나타낸 그래프이다.

본 발명에서 사용하는 용어는 단지 특정한 실시예들을 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 출원에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성 요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.

제1, 제2 등의 용어는 다양한 구성 요소들을 설명하는데 사용될 수 있지만, 상기 구성 요소들은 상기 용어들에 의해 한정되어서는 안 된다. 상기 용어들은 하나의 구성 요소를 다른 구성 요소로부터 구별하는 목적으로만 사용된다. 예를 들어, 본 발명의 권리 범위를 벗어나지 않으면서 제1 구성 요소는 제2 구성 요소로 명명될 수 있고, 유사하게 제2 구성 요소도 제1 구성 요소로 명명될 수 있다.

다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥상 가지는 의미와 일치하는 의미를 갖는 것으로 해석되어야 하며, 본 발명에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.

본 발명에서 사용된 "기본 배지"란 용어는 세포의 성장을 지지할 수 있는 임의의 배지를 의미한다. 기본 배지는 표준 무기 염, 예컨대 아연, 철, 마그네슘, 칼슘 및 칼륨뿐만 아니라, 미량원소, 비타민, 에너지원, 완충 시스템 및 필수아미노산을 공급한다.

본 발명의 여러 구현 예들 각각의 특징적인 부분들은 부분적으로 또는 전체적으로 서로 결합 또는 조합가능하고, 기술적으로 다양한 연동 및 구동이 가능하며, 각 구현 예들은 서로에 대하여 독립적으로 실시 가능할 수도 있고 연관 관계로 함께 실시할 수도 있다.

이하, 첨부한 도면 및 바람직한 실시 예들을 참조하여 본 발명의 기술적 구성을 상세하게 설명한다.

그러나, 본 발명은 여기서 설명되는 실시 예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화 될 수도 있다. 명세서 전체에 걸쳐 본 발명을 설명하기 위해 사용되는 동일한 참조번호는 동일한 구성요소를 나타낸다.

본 발명의 기술적 특징은 자연살해세포의 활성도를 측정하여 암 발병 가능성은 물론 면역력을 측정할 수 있고 감염성 질환 등 다양한 질병 가능성을 예측할 수 있다는 이제까지 전혀 알려지지 않은 자연살해세포의 활성도를 활용하는 새로운 용도를 확인한 것에 있다. 또한, 이와 같이 자연살해세포의 활성도를 측정하여 면역력 측정 및 질병발병 가능성 등을 예측하려면 얼마나 빠른 시간 안에 자연살해세포를 활성화하고 측정할 수 있는지 여부가 중요한데, 정상인의 경우 약 18~24시간만에 자연살해세포의 세포독성을 거의 최대로 올릴 수 있는 자연살해세포 자극조성물을 개발하였으며, 이를 이용한 자연살해세포 활성도 신속검사방법을 개발한 것에 있다.

따라서, 본 발명의 자연살해세포 활성도 신속검사용 자극조성물은 IL-2, IL-12, IL-18 및 기본배지를 유효성분으로 포함한다. 다수의 실험을 통해 자연살해세포를 활성화시킬 때 IL-2 단독보다는 IL-12와 IL-18이 일정비율로 포함된 기본배지를 사용했을 때 자연살해세포가 IFN-g를 월등히 많이 생성하고 그 역가가 높게 나오는 것을 확인했기 때문이다.

IL-2는 T 세포가 항원을 인식하여 활성화될 때 만들어지는 분자량 14 ~ 17 kDa의 당단백질(glycoprotein)로서, T 세포 밖으로 분비된 다음, IL-2를 생산한 T 세포 자신과 반응하여 해당 T 세포의 성장을 촉진하므로, NK 세포에 작용하여 성장을 촉진하고 NK 세포의 살해능력을 강화하며, B 세포에 작용하여 그 성장을 촉진하기도 하는 물질로 알려져 있다. 일 구현예로서 본 발명의 자극조성물에 IL-2는 기본배지 1mL당 700 IU ~ 5000 IU 포함될 수 있다.

IL-12는 수지상세포(DC)와 매크로파지, B세포에서 생산되는데, NK세포와 T 림프구에서 IFN-γ와 TNF-α의 생산을 유도하며, IFN-γ를 저해하는 IL-4의 생산을 감소시키는 역할을 하고, NK 세포와 CD8+ cytotoxic T림프구의 세포독성을 증가시키는 물질로서, NK세포 내에 IL-2 신호전달체계와 밀접한 관계를 갖고 있을 뿐만 아니라 NK세포 내에 IL-12 수용체 β1과 IL-12 수용체 β2의 발현을 유도하여 IL-12 신호전달체계에 관련된 단백질들을 발현시키고 활성시키는 것으로 알려져 있다. 이러한 기전은 NK세포의 IFN-γ 생산 능력과 타겟세포 살해능력에서 잘 증명되었다. IL-12 수용체 β2는 IL-12 기능에 중요한 역할을 하는 것으로 보이는데, 이것은 Th2의 발생을 저해하는 동시에 Th1의 발생을 진행시키는 것으로 보고되었다. T세포와 NK세포에서 IL-12의 신호전달은 JAK-STAT 신호전달체계에 포함되며 IL-12 수용체 β2의 활성은 전사인자인 STAT4의 인산화를 유도하여 활성화시키는데 중요한 역할을 한다. 일 구현예로서 본 발명의 자극조성물에 IL-12는 기본배지 1mL당 1ng ~ 4ng 포함될 수 있다.

IL-18은 매크로파지에서 생산되며 proinflamatory 사이토카인으로, IL-18 수용체에 결합하여 IL-12와 함께 박테리아나 바이러스에 감염된 세포에 면역반응을 일으키고 NK세포와 T세포에서 IFN-γ의 생산을 증가시키는 역할을 하는 물질이다. 일 구현예로서 본 발명의 자극조성물에 IL-18은 기본배지 1mL당 3ng ~ 40ng 포함될 수 있다.

기본 배지는 세포의 성장을 지지할 수 있는 임의의 배지로서 기본 배지의 예에는 둘베코(Dulbecco)의 변형 이글(Eagle) 배지(DMEM), DME/F12, 최소필수배지(MEM), 기본 배지 이글(BME), RPMI 1640, F-10, F-12, α-최소 필수 배지(α-MEM), 글라스고우(Glasgow) 최소필수 배지(G-MEM), PF CHO(SAFC Biosciences) 및 이스코브(Iscove)의 변형 둘베코 배지가 포함되지만, 이에 국한되는 것은 아니다. 이하 실시예에서는 기본 배지로 BME가 사용되었다.

상술된 바와 같이, 본 발명의 자극조성물에 포함되는 IL-12와 IL-18는 일정비율로 기본배지에 포함될 수 있는데, 특히 최적의 효과를 나타내는 비율은 실험적으로 1:3~1:10 범위의 중량비로 포함되는 경우였다.

다음으로, 본 발명의 자연살해세포 활성도 신속검사방법은 측정대상자의 말초혈액으로부터 림프구를 분리하는 분리단계; 분리된 림프구를 상술된 어느 하나의자극조성물로 48시간 이하로 배양하는 배양단계; 및 상기 배양단계에서 얻어진 자연살해세포의 활성도를 검사하는 검사단계;를 포함한다.

여기서, 상기 배양단계에서 상술된 자극조성물이 24시간이내에 림프구에서 얻어지는 자연살해세포의 활성을 신속하게 높일 수 있다.

검사단계는 Target cell에 형광염색하는 단계; 상기 형광 염색된 Target cell과 상기 자연살해세포와 반응시키는 단계; 및 상기 자연살해세포에 의해 공격 받은 Target cell이 파괴되어 방출되는 형광물질의 강도를 측정하는 단계;를 포함하여 수행될 수 있다. 이와 같이 검사단계는 In vitro상에서 암세포(Target cell)를 형광염색하여 자기활성화림프구 즉 자연살해세포(Effector cell)와 함께 반응시켜 Effector cell에 의해 공격 받아 파괴된 Target cell로부터 방출된 형광강도를 측정하여 Effector cell의 살해능력을 평가하였다. 즉, 세포상해활성이 높을수록 형광 강도의 측정치가 높아지기 때문이다.

일 구현예로서 Target cell로 K562 cell line을 사용하고, 형광 발색시약으로 Calcein AM을 사용하였다. Calcein AM은 lipid-soluble diester fluorogenic esterase substrate이며 세포막을 통과할 수 있다. 살아있는 세포에서 손상되지 않은 세포막의 세포내 esterase에 의하여 가수분해되어 Calcein AM(non- fluorescence)이 Calcein (fluorescence)으로 전환되어 형광을 띠게 된다. 살아있는 세포의 손상되지 않은 막에 의하여 esterase activity가 유지되어 형광을 띤다. 그러나 죽은 세포의 손상된 세포막의 경우 esterase activity가 상실되어 형광을 띠지 못하게 된다(죽은 세포의 경우 형광유지가 불가능하다).

이와 같이 Target cell(K562 cell line)에 Calcein AM으로 형광염색하여 Effector cell(NK세포)과 반응시키면 Effector cell에 의해 공격을 받은 Target cell은 파괴되어 형광물질을 방출시킨다. 즉, 살아있는 Target Cell이 파괴되었을 때만 형광물질이 나오게 된다. Effector cell에 의하여 손상을 많이 받을수록 파괴된 Target cell로부터 방출된 형광 강도는 높아진다. 형광강도를 측정할 수 있는 기기로 Target cell로부터 방출된 형광강도를 측정할 수 있다. 이러한 원리로 Effector cell의 세포상해활성을 확인할 수 있다.

다음으로, 본 발명의 바이러스에 의한 증상 예방 또는 개선용 약학조성물은 상술된 본 발명의 자극조성물을 유효성분으로 포함한다. 본 발명의 약학조성물이 담체 또는 부형제를 포함하는 경우, 물, 덱스트린, 칼슘카보네이드, 락토스, 프로필렌글리콜, 리퀴드 파라핀, 생리식염수, 덱스트로스, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자이리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유가 1종 이상 사용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며 통상의 담체 및 부형제는 모두 사용가능하다.

또한 본 발명의 바이러스에 의한 증상예방 또는 개선용 약학조성물을 약제화하는 경우, 통상의 충전제, 증량제, 결합제, 붕해제, 계면활성제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 또는 방부제 등을 더 포함할 수 있으며 공지된 모든 제형으로 구현 가능하다. 일구현예로서 스프레이 형태로 구현될 수 있다.

다음으로, 본 발명의 화장료조성물은 신속검사용 자극조성물; 및 화장료베이스를 포함할 수 있다. 특히, 신속검사용 자극조성물은 화장료조성물의 전체중량에 대해 0.1중량% 내지 50중량%까지 사용될 수 있다. 상술된 바와 같이 자연살해세포 활성도 신속검사용 자극조성물을 피부에 도포하게 되면 피부에서 NK Cell의 활성도를 높여서 각종 사이토카인 분비를 촉진하게 되고, 분비된 각종 사이토카인에 의해 알러지 비염, 알러지 피부염, 아토피 피부염, 여드름, 벌레 물려 생긴 염증 등에 염증 개선 효과가 좋았으며 가려움을 신속히 없애 주는 효과가 있었다. 화상, 창상 등의 치료를 통한 피부재생효과와 침착 색소의 제거에 효과가 매우 좋았으며 또한 피부미백에도 효과가 있음을 확인하였다.

본 발명의 화장료 조성물은 본 발명의 신속검사용 자극조성물을 일정 중량으로 포함하는 것만 차이가 있을 뿐 공지된 화장료베이스를 이용하여 에멀젼, 리포좀, 염분산 등을 포함한 화장료조성물 제조방법을 사용하여 공지된 제제인 바디로션, 스킨로션, 에센스, 크림 등으로 구현될 수 있으므로 이에 대해서 상세한 설명은 생략한다.

실시예 1

기본 배지 이글(BME)에 IL-2 3600 IU/mL, IL-12 2ng/mL 및 IL-18 10ng/mL를 첨가한 후 균일하게 혼합하여 자연살해세포 활성도 신속검사용 자극조성물(Media D)을 준비하였다.

비교예 1 내지 3

하기 표 1과 같은 성분비율을 갖는 것을 제외하면 실시예1과 동일한 방법으로 비교예조성물1내지 3(Media A, Media B, Media C)를 준비하였다.

Media	구성성분
Media A	기본 배지 이글(BME)에 IL-2 3600 IU/mL 첨가
Media B	기본 배지 이글(BME)에 IL-2 3600 IU/mL 및 IL-12 2ng/mL 첨가
Media C	기본 배지 이글(BME)에 IL-2 3600 IU/mL, 및 IL-18 10ng/mL 첨가

실시예 2

준비된 자연살해세포 활성도 신속검사용 자극조성물을 스프레이용기에 담아 스프레이 제제로 준비하였다.

실험예 1

말초혈액으로부터 림프구를 분리하여 14일간 배양한 자연살해세포를 가지고 실시예1 및 비교예 1 내지 3에서 얻어진 조성물을 각각 이용하여 3일간 배양한 후 자연살해세포의 역가와 배양액 중의 자연살해세포가 생산한 인터페론 감마, IL-8 및 IL-10의 양을 측정하고 다음과 같이 그 결과를 표 2에 나타냈다.

역가의 측정은 암세포주인 K562 cell line을 사용하였으며 자연살해세포가 K562 cell line을 직접 죽이는 정도를 측정하여 역가를 평가하였다. 역가시험 과정은 통상의 방법을 사용하였고 결과 값은 죽은 암세포주의 퍼센트(%)로 나타내었다.

1. 대조군 (K562 단독 대조군)은 다음과 같이 준비하였다.

(1)Media only

배양액 자체에 대한 형광량 측정

(2)자연유리(Negative control)

자연상태에서 Target cell 스스로 파괴되어 방출하는 형광량을 측정(배양액 + Target cell)

(3)최대유리(Positive control)

1% Triton-X 100을 처리하여 Target cell을 최대로 Lysis시켰을 때의 Target cell로부터 방출된 형광량을 측정(배양액 + Target cell + 1% Triton-X 100)

(4)검체

Target cell과 Effector cell을 함께 처리하여 Effector cell에 의해 파괴된 Target cell로부터 방출된 형광량 측정(Target cell + Effector cell)

2. 시험방법은 다음과 같다.

(1) Target cell(K562)을 다음과 같이 형광염색하여 준비하였다.

(1-1)K562 Cell을 배양시킨 후 15㎖ tube에 모아 1500rpm에서 5분 동안 원심분리한다. 상층액을 버리고 1㎖의 배양액(RPMI1640 + 10% FBS)으로 pellet을 풀어준 후 Cell counting 하였다.

(1-2) 1.5㎖ tube에 세포수가 1ⅹ10⁶/㎖이 되도록 한 후 Calcein AM(1㎎/DMSO 1㎖)염색액을 10㎕을 첨가하고 5% CO₂, 37℃에서 30분 동안 Incubation하였다. (15분 간격으로 cell을 inverting하였다.)

(1-3) Incubation 후 1500 rpm에서 5분 동안 원심분리하였다. 상층액을 제거하고 1㎖ 의 배양액(RPMI1640 + 10% FBS)로 resuspension 후 1500rpm에서 5분 동안 원심분리하여 Cell을 Washing하였다. (2번 반복하였다.)

(1-4) 상층액을 버린 후 1㎖의 배양액을 첨가한 후 Hemocytometer로 cell counting하여 세포농도를 1ⅹ10⁴/50㎕/well에서 2ⅹ10⁵/㎖의 농도 범위에서 준비하였다.

(2) 다음과 같이 Effector cell을 준비하였다.

(2-1)면역세포(NK세포 포함)를 1500rpm에서 5분 동안 원심분리 후 배양액 (RPMI1640 + 10% FBS)으로 1번 Washing하여 주었다.

(2-2)상층액을 버린 후 1㎖의 배양액을 첨가한 후 Hemocytometer로 cell counting하여 세포농도를 Target cell의 10배 농도로 준비하였다.

(3) 다음과 같이 96 well plate에 control 과 Target cell / Effector cell을 제작하여 well에 분주하였다. 모든 시험은 3번 반복 수행하였다.

(3-1)자연유리 Well(Negative control)

배양액(RPMI1640+10%FBS) 100㎕ + Target cell 100㎕

(3-2)최대유리 Well(Positive control)

배양액(RPMI1640+10%FBS) 70㎕ + Target cell 100㎕ +1% Triton X-100 30㎕

(3-3)배양액 Well

배양액(RPMI1640+10%FBS) 200㎕

(3-4) 검체 Well

Target cell (K562) 100㎕ + Effector cell(NK세포) 100㎕

(4) 반응이 잘되도록 배양액과 시료를 섞어주었다.

(5) 5% CO₂, 37℃에서 4시간 Incubation하였다.

(6) 반응 후 1500 rpm에서 5분 동안 원심분리하였다.

(7) 원심분리 후 120㎕를 black plate로 옮겨 Fluoroskan ascent plate reader로 형광값을 측정하였다.

3. 세포상해활성 계산식을 이용하여 Cytotoxicity를 다음과 같이 계산하였다.

Effector cell의 Cytotoxicity(%)

= (검체의 형광값-자연유리 형광값) /(최대유리형광값-자연유리형광값)X100

Media	IFN-g(ng/mL)	IL-8(pg/mL)	IL-10(pg/mL)	역가(%, E/T=10:1)
Media A	8.82	11.15	29.61	40.57
Media B	14.3	9.15	18.9	69.12
Media C	11.55	21.65	18.5	62.15
Media D	122.53	20.6	13.76	79.49

표 2로부터 본 발명의 자극조성물인 Media D에서 역가도 제일 높았고 인터페론 감마의 농도도 제일 높아서 IL-2, IL-12 및 IL-18을 일정비율로 포함하여 자연살해세포와 배양하게 되면 자연살해세포 활성도를 매우 높일 수 있는 것을 알 수 있다.

실험예 2

말기 암환자와 정상인의 혈액으로부터 림프구를 분리하여 실시예1에서 얻어진 자연살해세포 활성도 급속검사용 자극조성물(Media D)로 배양하여 24시간 후 및 48시간 후에 자연살해세포의 활성(K562 cell line에 대한 살상력)을 측정하고 그 결과를 각각 표 3, 표 4 및 도 1과 도 2에 나타냈다.

배양 일	day 0	day 1	day 2
암환자1	0.51	20.00	24.71
암환자2	-9.18	6.23	24.71
암환자3	-1.91	44.67	62.61
암환자평균	-3.53	23.63	37.34

배양 일	day 0	day 1	day 2
정상인1	1.26	98.59	83.10
정상인2	1.58	89.31	92.15
정상인3	1.21	82.99	91.09
정상인4	1.65	71.06	108.80
정상인5	-0.15	90.58	109.12
정상인6	-1.30	102.60	77.60
정상인7	2.12	87.10	91.67
정상인평균	0.91	88.89	93.36

표 3, 표 4 및 도 1 및 도 2의 결과로부터 건강한 상태인 정상인의 경우 자연살해세포 활성도를 측정할 수 있도록 자연살해세포를 자극하는 것은 배양 24시간이면 거의 최대로 끌어 올릴 수 있으나 말기 암환자의 경우 자연살해세포 활성도가 매우 천천히 올라가고 배양 48시간이 지나도 평균활성도가 40%를 밑도는 것을 알 수 있었다.

이러한 결과는 특정 대상자의 말초혈액으로부터 림프구를 분리하여 본 발명의 자극조성물과 배양하게 되면 24시간 이내에 자연살해세포의 활성도를 측정할 수 있고, 측정된 자연살해세포의 활성도 값이 크면 면역력이 좋아서 바이러스 등 질병원에 노출되어도 질병에 걸릴 확률이 높지 않고, 활성도 값이 작으면 면역력이 좋지 않아 질병원에 노출되면 질병이 발병할 확률이 높은 것을 알 수 있음을 명백히 보여준다.

따라서, 본 발명의 자연살해세포 활성도 신속검사방법을 활용하게 되면 질병에 걸리기 전에 미리 대응책을 마련할 수 있게 되므로, 건강 검진시 필수적으로 진행하는 혈액검사를 위해 제공되는 혈액을 이용하여 본 발명의 자연살해세포 활성도 신속검사방법을 수행하고, 각 대상자의 면역력 정도를 고지하게 되면 질병에 선제적으로 대응할 수 있는 예방법을 제공할 수 있을 것이다.

또한, 본 발명의 자연살해세포 활성도 신속검사방법을 활용하면 상술된 바와 같이 면역력의 크기를 파악할 수 있으므로, 치료 중인 암환자의 면역력 회복을 추적 관리할 수 있어 암 치료에 많은 도움을 기대할 수 있을 것이다.

실험예 3

요양원에서 30분을 대상으로 감기가 유행할 겨울과 봄 환절기 동안 아침 저녁으로 1회씩 실시예2에서 자극조성물(Media D)로 준비된 스프레이제제를 분무하였다. 환절기가 지난 후로는 2~3일에 한 번씩 분무하였다. 그 결과를 표 5에 나타내었다.

실험 대상	인원수	처치 전	처치 후
요양 중인 노인 (70세 이상)	30 명	매년 약 6~7명의 감기환자 발생, 특히 처치 전 해에 2명의 노인이 독감으로 사망함	감기환자 1명 발생
요양원 직원 및 관계자	20명	3명의 환자 발생	1~2일만에 감기 증상 사라짐

표 5에 나타난 바와 같이, 아침, 저녁으로 1회씩 분무한 결과 감기에 걸린 노인은 1명 이었는데, 감기에 걸린 노인 분과 요양원 직원 중 환절기를 지나 감기 증상이 있는 분을 아침, 저녁으로 분무하여 치료한 결과 1~2만에 감기 증상이 사라지는 것을 확인하였다.

이것은, 본 발명의 자극조성물을 포함하는 약학조성물을 피부 등 특히 점막에 뿌려 주었을 때 점막에 포진하여 있는 자연살해세포를 직접 자극하여 활성화시킬 수 있음을 보여준다.

뿐만 아니라 실험예로 제시하지는 않았으나 피곤할 때 입술이 부르트는 헤르페스 바이러스 감염증에도 효과가 좋아서 입술이 부르텃을 때 바로 발라주면 평균 약 3일만에 치료가 되는 것을 확인할 수 있었다.

이상의 실험결과들은 본 발명의 자극조성물(Media D)을 유효성분으로 포함하는 약학조성물은 감기 바이러스로 인한 감기증상을 예방하거나 개선할 수 있을 뿐만 아니라 헤르페스바이러스 등 바이러스로 인한 질병을 예방하거나 개선할 수 있는 것을 보여준다.

따라서, 본 발명은 자극조성물(Media D)이 감기 바이러스 감염 즉, 코로나 바이러스 등 각종 바이러스의 감염 예방 및 치료에 사용될 수 있음을 알 수 있다.

본 발명은 이상에서 살펴본 바와 같이 바람직한 실시 예를 들어 도시하고 설명하였으나, 상기한 실시 예에 한정되지 아니하며 본 발명의 정신을 벗어나지 않는 범위 내에서 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 다양한 변경과 수정이 가능할 것이다.

Claims (9)

1. IL-2, IL-12, IL-18 및 기본배지를 유효성분으로 포함하는 조성물로서,
   상기 IL-2는 700 IU/mL ~ 5000 IU/mL, 상기 IL-12는 1ng/mL ~ 4 ng/mL 및 상기 IL-18은 3 ng/mL ~ 40 ng/mL 포함되며,
   상기 조성물로 정상인의 자연살해세포 배양시 70% 이상의 역가가 나타나도록 상기 자연살해세포를 신속하게 자극시켜 24시간 이내에 상기 자연살해세포의 활성도 측정이 가능한 것을 특징으로 하는 자연살해세포 활성도 신속검사용 자극조성물.
   
2. 제 1 항에 있어서,
   상기 IL-12와 상기 IL-18은 1:3~1:10의 중량비로 포함되는 것을 특징으로 하는 자연살해세포 활성도 신속검사용 자극조성물.
   
3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
   상기 측정된 자연살해세포 활성도 값의 크기에 따라 질병원 노출시 질병발병가능성을 예측할 수 있는 것을 특징으로 하는 자연살해세포 활성도 신속검사용 자극조성물.
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