CN107849138A - 抗Aggrus单克隆抗体、与CLEC－2的结合所需的Aggrus的区域和Aggrus－CLEC‐2结合抑制剂的筛选方法 - Google Patents

Abstract

本发明对参与和CLEC‐2的结合的新的Aggrus结构域进行了探索，获得了识别该结构域的单克隆抗体。新发现的PLAG4结构域在与CLEC‐2的结合中很重要，进而研制出识别该区域的单克隆抗体。本发明能够提供使用该抗体的新型的Aggrus－CLEC‐2结合抑制剂、血小板凝集抑制剂、癌转移抑制剂。

Description

抗Aggrus单克隆抗体、与CLEC－2的结合所需的Aggrus的区域 和Aggrus－CLEC‐2结合抑制剂的筛选方法

技术领域

本发明涉及参与Aggrus与CLEC‐2的结合的Aggrus的区域和识别该区域的抗体。还涉及含有包含该Aggrus的区域的肽和单克隆抗体的Aggrus－CLEC‐2结合抑制剂以及包含其的药物组合物。还涉及以向该区域的结合作为指标的药物的筛选方法。

背景技术

癌症是以细胞无序增殖作为特征的疾病，但决定癌症的死亡率的大的因素与其说是产生了癌的原发病灶的增殖，不如说是转移病灶的增殖。据称实际上被诊断为转移癌的患者的5年生存率为20％以下，癌转移的抑制已成为临床上大的课题。

临床上早已确认癌细胞依赖性的血小板凝集参与了癌的血行性转移。本发明人团队构建了显示血小板凝集诱导活性的高转移癌细胞株，并对在高转移癌细胞株的细胞膜表面上表达的诱导血小板凝集的因子Aggrus进行了鉴定(专利文献1、非专利文献1)。

已知血小板凝集促进因子Aggrus(也已知为平足蛋白(podoplanin)、gp44、T1α等。)是I型跨膜蛋白，在鳞状细胞癌、间皮瘤、卡波氏肉瘤(Kaposi's sarcoma)、睾丸肿瘤、脑肿瘤或膀胱癌等各种癌中表达增加(非专利文献2～13)。

最近鉴定了在血小板上表达的C型凝集素样受体(CLEC‐2)是Aggrus的配对受体中的一种(非专利文献14)。已知当CLEC‐2与在肿瘤细胞上表达的Aggrus结合，即使没有血浆成分，在血小板中血小板凝集的信号也会被活化而诱导血小板凝集。即，考虑是由于抑制Aggrus与CLEC‐2的结合的物质抑制血小板凝集，而抑制癌的转移。因此，抑制Aggrus与CLEC‐2的结合的物质在癌症和血栓病的治疗中的应用受到期待。实际上，本发明的发明人公开了利用对Aggrus的单克隆抗体和低分子化合物，Aggrus与CLEC‐2的相互作用被抑制，血小板凝集和癌转移被抑制(专利文献2、3，非专利文献15)。

单克隆抗体能够与细胞表面抗原特异性地结合，并能够对靶细胞产生免疫学响应。利用该反应，许多单克隆抗体已被用于癌症治疗和免疫疾病的治疗。单克隆抗体通过中和、抗体依赖性细胞毒性(antibody-dependent cellular cytotoxicity；ADCC)和补体依赖性细胞毒性(complement-dependent cytotoxicity；CDC)的3个代表性的作用方式而显示治疗效果。

迄今为止，本发明的发明人已明确了，所构建的杂交瘤产生的抗Aggrus单克隆抗体、P2－0、MS－1、MS－3、MS－4都是抑制Aggrus－CLEC‐2的结合的中和抗体，不依赖ADCC活性地显示血小板凝集抑制、癌转移抑制、肿瘤增殖抑制作用(专利文献2)。

在这4种抗体中，抑制Aggrus－CLEC‐2的结合的活性高的P2－0和MS－1抗体都是识别PLAG结构域(Platelet-Aggregation stimulating domain，刺激血小板凝集的结构域)区域内的氨基酸作为表位的抗体。PLAG结构域是以与人、小鼠、大鼠跨物种保守的EDXXVTPG作为共有序列的氨基酸序列。PLAG结构域是在接近的区域PLAG1～PLAG3重复3次存在的氨基酸序列，在人Aggrus的情况下，存在于氨基酸序列的第29～54位的区域。

已知PLAG结构域存在于细胞外，并与血小板凝集活性有关。另外，Aggrus与CLEC‐2的共结晶结构分析的结果显示了，除了Aggrus的第47位的谷氨酸和第48位的天冬氨酸以外，与第52位的苏氨酸加成的唾液酸还与存在于CLEC‐2的第107～157位的区域中的4个精氨酸结合(非专利文献16)。本发明的发明人研制的P2－0和MS－1抗体也识别与该Aggrus－CLEC‐2结合区域重合的Aggrus的氨基酸序列的第45～49位的区域作为表位。另外，MS－3、MS－4抗体识别与Aggrus－CLEC‐2结合区域接近的Aggrus的氨基酸序列的第54～61位的区域作为表位。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开2004－350677号公报

专利文献2：国际公开2012/128082号

专利文献3：日本特开2013－71916号公报

非专利文献

非专利文献1：Kato Y.et al.,2003,J.Biol.Chem.,Vol.278,p.51599-51605.

非专利文献2：Kato,Y.et al.,2005,Tumour.Biol.Vol.26,p.195-200.

非专利文献3：Martin-Villar,E.et al.,2005,Int.J.Cancer,Vol.113,p.899-910.

非专利文献4：Yuan P.et al.,2006,Cancer,Vol.107,p.563-569.

非专利文献5：Wicki,A.et al.,2006,Cancer Cell,Vol.9,p.261-272.

非专利文献6：Kimura,N.&Kimura,I.,2005,Pathol.Int.,Vol.55,p.83-86.

非专利文献7：Fukunaga,M.,2005,Histopathology,Vol.46,p.396-402.

非专利文献8：Kato,Y.et al.,2004,Oncogene,Vol.23,p.8552-8556.

非专利文献9：Mishima,K.et al.,2006,Acta Neuropathol.,Vol.111,p.563-568.

非专利文献10：Mishima,K.et al.,2006,Acta Neuropathol.,Vol.111,p.483-488.

非专利文献11：Yuan,P.et al.,2006,Cancer,Vol.107,p.563-569.

非专利文献12：Kunita,A.et al.,2007,Am.J.Pathol.,Vol.170,p.1337-1347.

非专利文献13：Takagi,S.et al.,2014,Int.J.Cancer,Vol.134,p.2605-2614.

非专利文献14：Suzuki-Inoue,K.et al.2007,J.Biol.Chem.,Vol.282,p.25993-26001.

非专利文献15：Fujita N.&Takagi,S.,2012,J.Biochem.,Vol.152,p.407-413.

非专利文献16：Nagae,M.et al.,2014,Structure,Vol.22,p.1711-1721.

非专利文献17：Morrison,S.L.et al.,1984,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,Vol.81,p.8651-6855.

非专利文献18：Jones,P.T.et al.,1986,Nature,Vol.321,p.522-525.

非专利文献19：Amano,K.et al.,2008,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,Vol.105,p.3232-3237.

非专利文献20：Takagi,S.et al.,2013,PLoS One Vol.8,e73609.

发明内容

发明所要解决的课题

然而，如下所示，明确了，即使是对由Aggrus与CLEC‐2的共结晶结构分析的结果所明确的参与和CLEC‐2的结合的Aggrus的第48位的天冬氨酸进行丙氨酸取代而得到的Aggrus突变体，也与CLEC‐2结合。还确认了，关于对Aggrus的第48位的天冬氨酸进行丙氨酸取代而得到的Aggrus突变体所导致的血小板凝集，虽然也可以看到血小板凝集开始的时间的延迟，但最终引起血小板凝集。

另外，本发明的发明人公开了，利用对Aggrus的单克隆抗体和低分子化合物，Aggrus与CLEC‐2的相互作用被抑制，血小板凝集被抑制，进而癌转移被抑制(专利文献2、3)，这些单克隆抗体和低分子化合物虽然具有血小板凝集开始时间的延迟效果，但无法完全抑制Aggrus所导致的血小板凝集。即，暗示了Aggrus与CLEC‐2的结合部位也存在于已知的PLAG结构域以外的区域的可能性。

本发明的课题在于，进行参与Aggrus与CLEC‐2的结合的新的结构域的探索，获得与该结构域结合的单克隆抗体。课题还在于，通过对与该结构域结合的化合物进行探索，提供一种抑制癌的增殖和转移、血小板凝集的化合物的筛选方法。

用于解决课题的方法

本发明涉及以下所示的识别Aggrus的区域的单克隆抗体、产生其的杂交瘤、与CLEC－2的结合所需的Aggrus的区域、Aggrus－CLEC‐2结合抑制剂、药物组合物、检查用试剂、Aggrus－CLEC‐2结合抑制剂的筛选方法。

(1)与由序列号1(GIRIEDLPT)所示的氨基酸序列中的至少5个残基序列构成的Aggrus的区域结合的单克隆抗体或由其功能性片段构成的片段。

(2)如(1)所述的单克隆抗体或由其功能性片段构成的片段，其由保藏号为NITEP－02070(PG4D1)或NITE P－02071(PG4D2)的杂交瘤产生。

(3)如(1)所述的单克隆抗体或由其功能性片段构成的片段，其被嵌合化或人源化。

(4)保藏号为NITE P－02070或NITE P－02071的杂交瘤。

(5)包含(1)～(3)中任一项所述的单克隆抗体或由其功能性片段构成的片段的Aggrus－CLEC‐2结合抑制剂。

(6)如(5)所述的Aggrus－CLEC‐2结合抑制剂，其特征在于，还包含至少1个识别存在于序列号2(GAEDDVVTPGTSEDRYK)所示区域的表位的单克隆抗体、其嵌合抗体、其人源化抗体和/或由其功能性片段构成的片段。

(7)如(6)所述的Aggrus－CLEC‐2结合抑制剂，其特征在于，识别存在于上述序列号2的区域的表位的上述单克隆抗体为P2－0、MS－1、MS－3和/或MS－4。

(8)一种用于抑制血小板凝集、抑制血栓、抑制癌恶化和转移、抗炎症的药物组合物，其包含(1)～(3)中任一项所述的单克隆抗体或由其功能性片段构成的片段。

(9)如(8)所述的药物组合物，其特征在于，还包含至少1个识别存在于序列号2(GAEDDVVTPGTSEDRYK)所示区域的表位的单克隆抗体、其嵌合抗体、其人源化抗体和/或由其功能性片段构成的片段。

(10)如(9)所述的药物组合物，其特征在于，识别存在于上述序列号2的区域的表位的上述单克隆抗体为P2－0、MS－1、MS－3和/或MS－4。

(11)一种用于检测Aggrus表达的检查用试剂，其包含(1)～(3)中任一项所述的单克隆抗体或由其功能性片段构成的片段。

(12)一种CLEC‐2的结合所需的与PLAG4结构域重合的Aggrus的区域，其特征在于，该区域由序列号1(GIRIEDLPT)表示。

(13)如(12)所述的CLE C‐2的结合所需的与PLAG4结构域重合的Aggrus的区域，其特征在于，上述氨基酸序列包含序列号3(RIEDL)所示的氨基酸序列。

(14)一种Aggrus－CLEC‐2结合抑制剂，其由包含(12)或(13)的区域的肽构成。

(15)一种用于抑制血小板凝集、抑制血栓、抑制癌恶化和转移、抗炎症的药物组合物，其以包含(12)或(13)的区域的肽作为有效成分。

(16)一种抑制剂筛选方法，其是CLEC‐2与Aggrus的结合抑制剂的筛选方法，其特征在于，以向由序列号1(GIRIEDLPT)所示的氨基酸序列中的至少5个残基序列构成的Aggrus表位的结合作为指标。

(17)如(16)所述的抑制剂筛选方法，其特征在于，以向序列号3(RIEDL)所示的氨基酸序列的结合作为指标。

(18)一种抑制剂筛选方法，其是CLEC‐2与Aggrus的结合抑制剂的筛选方法，其特征在于，以向序列号4(EDXXTS)所示的氨基酸序列的结合作为指标。

发明效果

本发明的发明人发现了Aggrus与CLEC‐2的结合所需的新的PLAG结构域，由此获得了与该区域结合的新的单克隆抗体。与该区域结合的单克隆抗体强烈抑制Aggrus与CLEC‐2的结合，因此，期待对癌症和血栓病的治疗有效。另外，也能够进行以新的PLAG结构域作为靶标的抗癌剂的筛选。

附图说明

图1A是表示使用Aggrus突变体的中和抗体的识别部位的验证结果的图。

图1B是表示人Aggrus氨基酸序列中的PLAG结构域的图。

图2A是表示导入到CHO细胞的Aggrus野生型、Aggrus突变体蛋白的表达量和与CLEC‐2蛋白质的结合的图。

图2B是表示第48位的氨基酸突变D48A对血小板凝集的效果的图。

图3A是表示哺乳类Aggrus氨基酸序列的同源性的图。

图3B是表示PLAG结构域的共有序列的图。

图4A是表示Aggrus突变体的蛋白质表达的图。

图4B是表示导入到CHO细胞的Aggrus野生型、Aggrus突变体蛋白的表达量和与CLEC‐2蛋白质的结合的图。

图4C是表示第48位的氨基酸突变D48A、第82位的氨基酸突变体D82A、第48位和第82位的氨基酸的双突变D48A/D82A对血小板凝集的效果的图。

图4D是示意地表示PLAG结构域缺失突变体的图。

图4E是表示导入到CHO细胞的Aggrus缺失突变体蛋白的表达量和与CLEC‐2蛋白质的结合的图。

图5A是定量表示导入到CHO细胞的Aggrus野生型、Aggrus点突变体蛋白的表达量和与CLEC‐2蛋白质的结合的图。

图5B是定量表示导入到CHO细胞的Aggrus野生型、Aggrus缺失突变体蛋白的表达量和与CLEC‐2蛋白质的结合的图。

图5C是表示D48A、D82A、D48A/D82A对血小板凝集的效果的图。

图6A-B是表示PLAG4结构域(EDXXTS)的第81位的谷氨酸、第82位的天冬氨酸、第85位的苏氨酸参与CLEC‐2结合的图。

图7A是表示抗Aggrus单克隆抗体的表位分析的图。

图7B是表示抗体对在哺乳类细胞中表达的Aggrus的反应性的图。

图7C是表示抗Aggrus单克隆抗体对Aggrus表达细胞的反应性的图。

图8A-B是对PG4D1、PG4D2抗体的识别部位进行研究的图。

图8C是对PG4D1抗体的反应性进行研究的图。

图8D是对PG4D2抗体的反应性进行研究的图。

图9A-B是表示利用抗Aggrus单克隆抗体抑制Aggrus－CLEC‐2的结合的图。

图10A是表示利用抗Aggrus单克隆抗体抑制Aggrus－CLEC‐2的结合的图。

图10B是表示分别识别PLAG3和PLAG4结构域的抗体与Aggrus结合时相互不干涉的图。

图10C是表示利用分别识别PLAG3和PLAG4结构域的抗体完全抑制Aggrus与CLEC‐2的结合的图。

图11A是表示利用识别PLAG4结构域的抗Aggrus单克隆抗体抑制Aggrus－CLEC‐2的结合的图。

图11B是表示利用识别PLAG4结构域的抗Aggrus单克隆抗体抑制血小板凝集的图。

图12A是表示利用识别PLAG4结构域的抗Aggrus单克隆抗体和识别PLAG3结构域的抗Aggrus单克隆抗体抑制血小板凝集的图。

图12B是表示并用识别PLAG4结构域的抗Aggrus单克隆抗体和识别PLAG3结构域的抗Aggrus单克隆抗体抑制血小板凝集的图。

图13A-B是表示利用识别PLAG4结构域的抗Aggrus单克隆抗体抑制向肺的血行性转移的图。

图14A-B是表示利用PG4D1抗体和PG4D2抗体抑制向肺的血行性转移的图。

图15是表示抑制LC-SCC-015细胞的肺转移的PG4D2抗体的效果的图。

图16是表示PG4D2抗体对肺鳞状上皮癌细胞PC-10的肿瘤增殖的抑制效果的图。

图17A是表示嵌合化PG4D2抗体对Aggrus的结合的图。

图17B是表示嵌合化PG4D2抗体抑制Aggrus-CLEC-2结合的图。

图18A是骨肉瘤切片的HE染色图。

图18B是表示PG4D1抗体和PG4D2抗体比D2-40抗体更高灵敏度地识别骨肉瘤的图。

具体实施方式

本发明的抗Aggrus单克隆抗体或功能性片段是指识别新发现的Aggrus的与PLAG4结构域重合的区域作为表位的抗体，功能性片段是指具有与原抗体实质上相同的抗原特异性的抗体的片段。

作为本发明的对于Aggrus的单克隆抗体的优选例子，可以列举由2015年7月14日以保藏号NITE P－02070、NITE P－02071保藏在国家技术评估学会专利微生物保藏中心(NITE-NPMD(292－0818日本千叶县木更津市上总镰足2－5－8 122号室)的杂交瘤产生的单克隆抗体。另外，具有与其同等的结合特异性的其他抗体也优选作为本发明的抗Aggrus单克隆抗体。

另外，在本发明中，单克隆抗体不仅包括由所获得的杂交瘤产生的抗体，也包括利用基因重组技术制作的人型嵌合抗体(以下，有时也记载为嵌合抗体。)或者人型CDR(互补性决定区域、Complementarity Determining Region)移植抗体(以下，有时也记载为人源化抗体。)等所有可以确保向人给药时的安全性的抗体。

人型嵌合抗体是指抗体的可变区(以下，有时也称为V区。)为人以外的动物的抗体且恒定区(以下，有时也称为C区。)为人抗体的抗体(非专利文献17)。人型CDR移植抗体是将人以外的动物的抗体的V区中的CDR的氨基酸序列移植到人抗体的适当位置而得到的抗体(非专利文献18)。向人给药时，嵌合抗体和人源化抗体与人以外的动物的抗体相比，副作用少，长期持续其治疗效果。另外，嵌合抗体和人源化抗体可以利用基因重组技术制作成各种形态的分子。由单克隆抗体制作嵌合抗体和人源化抗体的方法可以使用公知的方法。

抗体的功能性片段包括Fab、Fab′、F(ab′)₂、单链抗体(scFv)、二硫化物稳定化V区片段(dsFv)或者包含CDR的肽等的抗体的功能性片段。抗体的功能性片段可以通过利用胃蛋白酶或木瓜蛋白酶等酶消化等公知的方法获得。

本发明在其他的方式中，能够提供包含单克隆抗体或其片段的Aggrus－CLEC‐2结合抑制剂、用作血小板凝集抑制剂、抗癌剂的药物组合物。血小板凝集抑制剂例如能够用于处置脑梗塞或心肌梗塞这样的血栓病。作为抗癌剂，不仅可以作为癌转移抑制剂，也可以用于抑制癌的恶化、因癌而引起的炎症。关于癌或肿瘤，可以期待对于至今已确认到Aggrus分子的表达增加的癌、即鳞状细胞癌、纤维肉瘤、间皮瘤、卡波氏肉瘤、睾丸肿瘤、脑肿瘤或膀胱癌适当地发挥作用。

作为本发明的药物组合物的剂型的种类，在肽、抗体药物的情况下，例如通常作为非口服剂的注射剂使用。另外，在通过筛选得到的化合物等的情况下，不仅可以作为注射剂，而且可以作为口服剂、非口服剂进行给药。作为口服剂，例如可以列举片剂、粉末剂、丸剂、散剂、颗粒剂、软/硬胶囊剂、薄膜包衣剂、小丸剂、舌下剂、膏剂等。另外，作为非口服剂，除了注射剂以外，还可以列举栓剂、经皮剂、软膏剂、外用液剂等。然而，并不限于此处所列举的剂型，本领域技术人员可以根据给药方式、给药对象适当选择最适合的剂型。另外，作为有效成分，使用本发明的抗Aggrus抗体时，在制剂中可以含有0.1～99.9重量％。

药剂的有效成分的给药量可以根据给药对象、对象脏器、症状、给药方法适当判断最适合的给药量。口服给药时，通常优选对患者一天给药0.1μg～1000mg、优选1.0μg～100mg、更优选1.0mg～50mg。非口服给药时，其一次给药量也因给药对象、对象脏器、症状、给药方法等的不同而不同，例如为注射剂的形态时，通常合适的是对患者一天通过静脉注射给药0.01～30mg左右、优选0.1～20mg左右、更优选0.1～10mg左右。然而，最终可以考虑患者的年龄和体重、症状等由医生的判断决定。

还已经明确，将识别PLAG4结构域的抗体和识别从PLAG2至PLAG3的区域的抗体并用时，基本完全抑制Aggrus与CLEC‐2的结合。因此，通过并用这些识别与CLEC‐2和Aggrus的结合有关的2个区域的抗体，可以期待更强的血小板凝集抑制、癌转移抑制效果。

如上所述，本发明的发明人已经获得了识别作为包含Aggrus的PLAG2和PLAG3的区域的Aggrus的第45～61位的区域(序列号2)作为表位的单克隆抗体。具体而言，是识别Aggrus的第45～49位的区域的P2－0和MS－1抗体、识别第53～58位的区域的MS－3抗体、识别第53～61位的区域的MS－4抗体。本发明的发明人已经公开了嵌合化的P2－0抗体在使用小鼠模型的实验系统中具有癌转移抑制作用(专利文献2)，但将识别该区域的单克隆抗体应用于临床时，也可以使用嵌合化或人源化的抗体。通过将这些单克隆抗体中的至少任意1种和本发明的抗体并用使用，可以期待实现更高的效果。通过将所并用的2种抗体作为嵌合抗体、人源化抗体而使用，应用于血栓病或癌症的治疗时，能够期待更强的效果。

另外，本发明的识别Aggrus的抗体可以用于癌的检查。已知Aggrus的表达参与了癌的血行性转移。因此，通过使用本发明的抗体对癌组织或者在血中循环的癌细胞的Aggrus的表达进行检测，能够进行预后预测。癌组织或者癌细胞中的Aggrus表达的确认可以使用利用了本发明的抗体的ELISA、FACS等公知的免疫测定法。另外，只要是表达Aggrus的癌，就可以期待通过包含本发明的抗体作为有效性成分的药物的治疗效果。

关于本发明的筛选方法，课题在于对抑制Aggrus与CLEC‐2的结合的物质进行探索，提供抑制血小板凝集和癌的转移的化合物。例如，本发明的筛选方法可以按照以下的步骤进行。使用化合物阵列或化合物库，探索与本发明中新鉴定的参与和CLEC‐2的结合的Aggrus的氨基酸序列发生相互作用的化合物。作为用于筛选的参与和CLEC‐2的结合的Aggrus的区域，优选使用本发明的抗体识别的GIRIEDLPT(序列号1)中的至少5个残基序列、特别是作为获得显示高的结合力的抗体的区域的RIEDL(序列号3)。另外，也可以使用PLAG4结构域的PLAG共有序列EDXXTS(序列号4)。参与和CLEC‐2的结合的Aggrus的区域是短的区域，因此，即使使用合成肽，也可以使包含该区域的重组体在大肠杆菌或动物细胞等中表达而使用。

进一步而言，如本发明的发明人发现并报告的那样，Aggrus的氨基酸45～61的遍及PLAG2、PLAG3结构域的区域也参与了Aggrus与CLEC‐2的相互作用(专利文献2、3)。因此，也可以使该部位缺失或突变，只利用本发明所涉及的Aggrus的新发现的CLEC‐2结合区域，使其与CLEC‐2结合的重组体在大肠杆菌和动物细胞等中表达而使用。

另外，也可以使P2－0、MS－1、MS－3或MS－4抗体与大肠杆菌或动物细胞等中表达的野生型的Aggrus反应而遮挡该部位，只利用本发明所涉及的Aggrus的新发现的CLEC‐2结合区域与CLEC‐2结合。可以使用本发明的抗Aggrus单克隆抗体检测与化合物结合的肽和重组体。上述方法是示例，并不限于此，当然也可以使用公知的筛选方法。

另外，通过向本发明的抗体识别的区域(表位)赋予糖链、进行合成并给药，可以期待竞争性抑制Aggrus与CLEC‐2的结合。因此，可以向包含抗体识别的区域的肽赋予糖链，用作Aggrus与CLEC‐2的结合抑制剂。由此，也能够使用肽本身作为血小板凝集的抑制剂、癌转移抑制剂。其中，可以利用使用酵母赋予人型糖链(非专利文献19)等公知的方法进行糖链的赋予。

以下，例示实施例对本发明进行详细说明。

实施例1

已报告的中和抗体的识别部位的验证

本发明的发明人已经公开了抑制与CLEC‐2的结合并具有血小板凝集抑制作用和癌转移抑制作用的抗Aggrus单克隆抗体(专利文献2、非专利文献20)。这些单克隆抗体的表位是识别遍及PLAG2、PLAG3结构域的区域的抗体。

首先，进行这些中和抗体的识别部位的验证。向中国仓鼠卵巢(Chinese HamsterOvary(CHO))细胞中导入以下的质粒，使人Aggrus和Aggrus突变体表达。人Aggrus基因使用野生型Aggrus cDNA(GenBank No.AB127958.1)，载体使用pcDNA3(Life Technologies公司制造)，按照常规方法利用PCR进行扩增、克隆。

用于中和抗体的识别部位的研究的构建如下所述。构建没有插入基因的单纯pcDNA3载体(mock)、插入了野生型人Aggrus cDNA的质粒(Aggrus-WT)、插入了将第45位的甘氨酸取代为丙氨酸的Aggrus cDNA的质粒(Aggrus-G45A)、插入了将第48位的天冬氨酸取代为丙氨酸的Aggrus cDNA的质粒(Aggrus-D48A)、插入了将第49位的天冬氨酸取代为丙氨酸的Aggrus cDNA的质粒(Aggrus-D49A)，并导入CHO细胞，使蛋白质稳定表达。以下，将导入了各质粒的CHO细胞分别称为CHO/mock、CHO/Aggrus-WT、CHO/Aggrus-G45A、CHO/Aggrus-D48A、CHO/Aggrus-D49A。

利用各细胞制备细胞裂解液，使用D2－40、MS－1、P2－0、NZ-1的4种抗Aggrus单克隆抗体，进行蛋白质印迹分析。D2-40抗体(AbDSerotec公司制造)是没有Aggrus中和活性的小鼠单克隆抗体，MS－1抗体、P2－0抗体是本发明的发明人研制的具有中和活性的小鼠单克隆抗体。另外，NZ-1抗体(AngioBio公司制造)是具有Aggrus中和活性的大鼠单克隆抗体。将结果示于图1A。

没有Aggrus中和活性的D2-40抗体识别全部所导入的野生型和单氨基酸取代型的Aggrus蛋白质。即，在CHO/mock以外的细胞中可以确认到信号。还确认了在Aggrus野生型、Aggrus突变体中蛋白质表达量基本一致。另外，由使用识别α-微管蛋白(α-tubulin)的抗体的蛋白质印迹分析的结果(图1A)也可以明确，电泳的细胞裂解液中的蛋白质量相同。

MS-1抗体和P2-0抗体识别野生型的Aggrus，但单氨基酸取代型的Aggrus蛋白质、Aggrus－G45A、Aggrus－D48A、Aggrus－D49A的识别弱，可知这些氨基酸部位在抗体识别中是必须的。特别而言，无论是P2-0抗体还是MS-1抗体，均无法完全识别将第48位的天冬氨酸取代为丙氨酸的D48A。暗示了PLAG结构域中的第48位的天冬氨酸在通过抗体的识别中很重要。

另外，具有Aggrus中和活性的大鼠单克隆抗体NZ-1抗体，单氨基酸取代型的Aggrus蛋白质的识别也弱。因此暗示了，为了发挥中和活性，导入突变的Aggrus的从第45位至第49位的区域、即从PLAG2至PLAG3的部位(参照图1B)是重要的。

实施例2

涉及与CLEC‐2的相互作用和血小板凝集诱导的Aggrus的部位的研究

(1)CLEC‐2结合中的Aggrus的第48位的天冬氨酸的作用研究

将插入了人Aggrus及其突变体cDNA的质粒导入CHO细胞，进行第48位的天冬氨酸的作用的研究。使用上述制作的野生型Aggrus表达细胞株CHO/Aggrus－WT及其突变体表达CHO细胞株CHO/AggrusD48A和将第48位的天冬氨酸取代为谷氨酸的CHO/Aggrus-D48E、取代为天冬氨酸的CHO/Aggrus-D48N，利用FACS法对与CLEC‐2的反应性进行研究。

首先，对基因导入株、CHO/Aggrus-WT、CHO/Aggrus-D48E、CHO/Aggrus-D48N、CHO/Aggrus-D48A的Aggrus表达量进行研究。具体而言，从培养容器中回收这些基因导入株，用PBS清洗后，制备成1.5×10⁵cells/ml的细胞密度，添加D2-40抗体，在冰上反应30分钟。之后，用PBS清洗细胞，添加Alexa488标记的抗小鼠IgG抗体(Life Technologies公司制造)作为二次抗体，在冰上再反应30分钟。最后，用PBS清洗细胞3次后，利用Cytomics FC500(Beckman Coulter公司制造)进行分析(图2A左图、无底色白峰)。其中，对照是代替D2-40抗体而使对照小鼠抗体(Sigma公司制造)与各种细胞反应并进行与上述相同的操作所得到的结果(图2A左图、填充黑色的峰)。

按照如下的操作对与CLEC‐2的反应性进行研究。同样地，将基因导入株制备成1.5×10⁵cells/ml的细胞密度后，添加带(His)₁₀标签的重组CLEC‐2蛋白质(rCLEC‐2；R&DSystems公司制造)，在冰上反应30分钟。用PBS清洗后，添加识别His标签的荧光标记的二次抗体(QIAGEN公司制造)，在冰上再反应30分钟。另外，带(His)₁₀标签的重组CLEC‐2蛋白质是从哺乳动物细胞中纯化得到的蛋白质，并利用糖链进行了修饰。用PBS清洗细胞3次后，同样利用CytomicsFC500进行分析(图2A右图、无底色白峰)。其中，对照是只添加PBS来代替带(His)₁₀标签的重组CLEC‐2蛋白质并进行与上述相同的操作而得到的结果(图2A右图、填充黑色的峰)。

Aggrus和Aggrus突变体蛋白的表达示于图2A左图，与CLEC‐2的结合示于图2A右图。图2A左图的无底色白峰表示利用D2-40抗体对野生型Aggrus或Aggrus突变体进行染色而得到的结果。填充黑色的峰表示利用对照小鼠抗体得到的结果。图2A左图的无底色白峰所示的顶点位置的荧光强度基本相同，由此确认了Aggrus蛋白质在各基因导入株的细胞膜上的表达水平基本一致。

图2A右图是对重组CLEC‐2与表达野生型或单氨基酸取代型的Aggrus的细胞是否结合进行分析的图。如上所述，无底色白峰表示利用抗His抗体对与在CHO细胞表面表达的野生型Aggrus或Aggrus突变体结合的重组CLEC‐2进行检测而得到的结果。填充黑色的峰表示只添加PBS来代替CLEC‐2蛋白质的对照的结果。

将第48位的天冬氨酸取代为作为相同的酸性氨基酸的谷氨酸的D48E(CHO/Aggrus-D48E)与野生型(CHO/Aggrus-WT)基本同样地结合CLEC‐2。然而，对于取代为中性氨基酸的D48N(CHO/Aggrus-D48N)或者D48A突变体(CHO/Aggrus-D48A)，观察到了CLEC‐2的结合力减少。然而明确的是，任何突变体都没有完全丧失结合，在一定程度上结合CLEC‐2。

(2)Aggrus的第48位的天冬氨酸的血小板凝集的作用研究

如上所述，CLEC‐2是与Aggrus结合的血小板上的受体。Aggrus通过与血小板上的CLEC‐2结合而传递血小板凝集诱导信号。预想到与CLEC‐2的结合弱的D48A突变体(CHO/Aggrus-D48A)的血小板凝集诱导活性变弱，因此，利用血小板凝集抑制试验进行确认。具体而言，使用MCM HEMA TRACER 313M(MC Medical公司制造)进行分析。该分析法是利用透光率监测的使用小鼠洗涤血小板的体外(in vitro)血小板凝集分析法。

如图2B所示，在CHO/mock细胞中没有看到诱导血小板凝集的活性，但在表达野生型Aggrus的CHO/Aggrus-WT中从与血小板混合算起约6分钟后开始凝集。另一方面，将与CLEC‐2的结合力弱的CHO/Aggrus-D48A和血小板混和时，约14分钟后看到凝集，血小板凝集的开始延迟约8分钟。该结果支持了与CLEC‐2的结合力弱这样的图2A的结果，并且暗示了，至今已被鉴定的PLAG3的结构域以外的部位参与了与CLEC‐2的结合、并因经由该部位的与CLEC‐2的结合而诱导了血小板凝集的可能性。

实施例3

涉及与CLEC‐2的结合的新型PLAG4结构域的发现

利用哺乳类的系谱树(图3A下图)，对智人(Homo sapiens、序列号5)、倭黑猩猩(Pan paniscus、序列号6)、猕猴(Macaca mulatta、序列号7)、猪(Sus scrofa、序列号8)、抹香鲸(Physeter catodon、序列号9)、牛(Bos Taurus、序列号10)、家犬(Canis lupusfamiliaris、序列号11)、蝙蝠(Myotis brandtii、序列号12)、大鼠(Rattus norvengicus、序列号13)、小鼠(Mus musculus、序列号14)的Aggrus蛋白质的氨基酸序列的同源性进行研究。

图3A是排列各动物的Aggrus蛋白质的同源性高的部分的图。其中，各动物的Aggrus蛋白质的序列是根据图3A下部所示的GenBank登录号(accession No.)的序列。作为其结果，发现了与至今已有报告的PLAG结构域1～3类似的在哺乳类中高度保守的PLAG4结构域(图3A)。图3B表示PLAG结构域的共有序列(序列号15)和PLAG1～PLAG4的序列(序列号16～19)。人PLAG4保存了已被报告为涉及与CLEC‐2的结合的高度保守的谷氨酸和与其接续的天冬氨酸的ED序列，还保存了作为糖链附加部位的苏氨酸T。其中，发现了如下的差异，即，ED序列与T之间的氨基酸数不是在PLAG4结构域中至今鉴定出的3个氨基酸而是2个氨基酸。

实施例4

新型PLAG4结构域的与CLEC‐2的相互作用和血小板凝集诱导能力的作用的研究

(1)所构建的Aggrus突变体的表达量研究

将推定为新型的PLAG结构域的PLAG4结构域内具有氨基酸突变的PLAG4突变体向CHO细胞进行基因导入。具体而言，在CHO细胞中导入在pcDNA3载体插入了将作为PLAG4区域内的氨基酸的第82位的天冬氨酸取代为丙氨酸的人Aggrus cDNA而成的质粒(Aggrus-D82A)、插入了将第48位的天冬氨酸和第82位的天冬氨酸均取代为丙氨酸的人Aggrus cDNA而成的质粒(Aggrus-D48A/D82A)，使蛋白质稳定表达。以下，将导入了各质粒的CHO细胞称为CHO/Aggrus-D82A、CHO/Aggrus-D48A/D82A。

利用CHO/mock、CHO/Aggrus－WT、CHO/Aggrus-D48A、CHO/Aggrus-D82A、CHO/Aggrus-D48A/D82A细胞株分别制备细胞裂解液。使用各细胞裂解液，利用D2-40抗体进行蛋白质印迹分析。作为其结果，在CHO/mock以外的细胞中看到了所导入的野生型和突变型的Aggrus蛋白质的表达，并且确认了其表达量基本一致(图4A)。

(2)PLAG3和PLAG4在与CLEC‐2的结合中的作用研究

使用这些CHO的基因稳定表达株，与实施例2同样利用FACS法对Aggrus表达量的确认和与CLEC‐2的反应性进行研究。图4B左图与图2A同样，无底色白峰表示使D2-40抗体反应并对野生型Aggrus或Aggrus突变体进行染色而得到的结果，填充黑色的峰表示代替D2-40抗体而使对照小鼠抗体(Sigma公司制造)反应所得到的结果。如图4B(左图)所示，各图的无底色白峰所示的顶点位置的荧光强度基本相同，由此也确认了Aggrus蛋白质在各基因导入株的细胞膜上的表达水平基本一致。

图4B右图是与实施例2同样利用FACS法对与CLEC‐2的结合进行分析的图。无底色白峰表示利用识别His标签的荧光标记后的二次抗体对与在CHO细胞表面表达的野生型Aggrus或Aggrus突变体结合的带(His)₁₀标签的重组CLEC‐2进行检测而得到的结果。另外，填充黑色的峰是添加对照小鼠抗体来代替带(His)₁₀标签的重组CLEC‐2蛋白质并进行与上述相同的操作而得到的结果。

明确的是，将第82位的天冬氨酸取代为丙氨酸的D82A突变体(CHO/Aggrus-D82A)与CLEC‐2的结合比与将第48位的天冬氨酸取代为丙氨酸的D48A突变体(CHO/Aggrus-D48A)的结合还弱(图4B、右图)。进一步明确的是，将第48位的天冬氨酸和第82位的天冬氨酸均取代为丙氨酸的D48A/D82A双突变体(CHO/Aggrus-D48A/D82A)完全不与CLEC‐2结合。这些结果不仅暗示了Aggrus上的新发现的PLAG4结构域与PLAG3结构域一起在与CLEC‐2的结合中发挥了重要的作用，而且暗示了PLAG4与PLAG3相比，在与CLEC‐2的结合中发挥了主要的作用。

(3)PLAG3和PLAG4在血小板凝集中的作用研究

由于已明确了PLAG4结构域在与CLEC‐2的结合中发挥了重要的作用，所以接下来对PLAG4结构域在血小板凝集中的作用进行研究。如上所述，Aggrus通过与血小板上的CLEC‐2结合而传递血小板凝集诱导信号。关于PLAG4结构域内的氨基酸突变是否抑制血小板凝集，利用实施例2所记载的血小板凝集抑制试验，对Aggrus依赖性的血小板凝集的诱导活性进行研究。将结果示于图4C。

使用CHO/Aggrus-D48A、CHO/Aggrus-D82A、CHO/Aggrus-D48A/D82A突变体表达细胞，与实施例2同样对各突变体表达细胞的血小板凝集能力进行研究。明确的是，各突变体表达细胞的血小板凝集诱导活性与和CLEC‐2的结合力成比例，D82A突变体与D48A突变体相比，血小板凝集诱导活性弱，D48A/D82A双突变体不显示血小板凝集诱导活性(图4C)。因此可以明确，新鉴定的PLAG4在Aggrus依赖性的血小板凝集中发挥了主要的作用。

为了确认PLAG4结构域的重要性，将分别缺失了PLAG1、3、4结构域的突变体向CHO细胞进行基因导入。具体而言，将在pcDNA3载体中插入缺失了PLAG1区域内的第29位至第34位的氨基酸的人Aggrus cDNA而成的质粒(Aggrus-Δ29-34)、插入缺失了PLAG3区域内的第47位至第52位的氨基酸的人Aggrus cDNA而成的质粒(Aggrus-Δ47-52)、插入缺失了PLAG4区域内的第81位至第85位的氨基酸的人Aggrus cDNA而成的质粒(Aggrus-Δ81-85)、插入缺失了PLAG3区域内的第47位至第52位和PLAG4区域内的第81位至第85位的氨基酸两者的人Aggrus cDNA而成的质粒(Aggrus-Δ47-52/Δ81-85)向CHO细胞进行基因导入，使蛋白质稳定表达(参照图4D)。以下，将导入了各质粒的CHO细胞称为CHO/Aggrus-Δ29-34、CHO/Aggrus-Δ47-52、CHO/Aggrus-Δ81-85、CHO/Aggrus-Δ47-52/Δ81-85。

使用CHO/Aggrus-Δ29-34、CHO/Aggrus-Δ47-52、CHO/Aggrus-Δ81-85、CHO/Aggrus-Δ47-52/Δ81-85突变体表达细胞株，与实施例2同样利用FACS法对Aggrus表达量的确认和与CLEC‐2的反应性进行研究(图4E)。其中，在本研究中，Aggrus表达量的研究不使用D2-40抗体，而使用市售的FL-162抗体(Santa Cruz Biotechnology公司制造)。另外，使用Alexa488标记的抗兔IgG抗体(Life Technologies公司制造)作为二次抗体(图4E左图)。其中，作为对照，是代替FL-162抗体而使对照兔抗体(Santa Cruz Biotechnology公司制造)与各种细胞反应并进行与上述相同的操作所得到的结果。无底色白峰表示使FL-162抗体反应并对PLAG结构域缺失Aggrus突变体进行染色而得到的结果，填充黑色的峰表示代替FL-162抗体使对照兔抗体反应而得到的结果。如图4E(左图)所示，各图的无底色白峰所示的顶点位置的荧光强度基本相同，由此也确认了Aggrus蛋白质在各基因导入株的细胞膜上的表达水平基本一致。

图4E右图是与实施例2同样利用FACS法对与CLEC‐2的结合进行分析的图。无底色白峰表示利用识别His标签的荧光标记后的二次抗体对与在CHO细胞表面表达的PLAG结构域缺失Aggrus突变体结合的带(His)₁₀标签的重组CLEC‐2进行检测而得到的结果。另外，填充黑色的峰是添加PBS来代替带(His)₁₀标签的重组CLEC‐2蛋白质并进行与上述相同的操作而得到的结果。

可以明确关于与CLEC‐2的相互作用，与图4B所示的点突变体的数据同样，PLAG4结构域缺失突变体(CHO/Aggrus-Δ81-85)与CLEC‐2的结合比与PLAG3结构域缺失突变体(CHO/Aggrus-Δ47-52)的结合还弱。进一步明确的是，同时缺失了PLAG3结构域和PLAG4结构域的双突变体(CHO/Aggrus-Δ47-52/Δ81-85)完全不与CLEC‐2结合。

这些结果不仅暗示了Aggrus上的新发现的PLAG4结构域与PLAG3结构域一起在与CLEC‐2的结合中发挥了重要的作用，而且再次确认了PLAG4与PLAG3相比，在与CLEC‐2的结合中发挥了主要的作用。

实施例5

新型PLAG4结构域的与CLEC‐2的相互作用和血小板凝集诱导能力的作用的定量分 析

(1)PLAG3和PLAG4在与CLEC‐2的结合中的作用研究

对Aggrus表达量和与CLEC‐2的反应性进行定量分析。具体而言，重复进行3次实施例4(图4B参照)中进行的使用FACS法的Aggrus表达量的确认和与CLEC‐2的反应性的研究并平均化。图表中表示将CHO/Aggrus－WT的无底色白峰所示的顶点位置的荧光强度的平均值设为1时的Aggrus突变体蛋白的表达量。与Aggrus野生型的表达量进行比较后的统计分析的结果显示了，Aggrus突变体蛋白(D48A、D82A、D48A/D82A)的表达量没有显著性差异(标记为ns)，表达量基本一致(图5A、左图)。另外，图表中表示了将表示与CLEC‐2的反应性的无底色白峰所示的顶点位置的荧光强度的平均值设为1时的Aggrus突变体蛋白与CLEC‐2的反应性。显示了将Aggrus野生型与CLEC‐2的反应性设为1时，Aggrus突变体蛋白(D48A、D82A、D48A/D82A)与CLEC‐2的反应性显著减少(＊＊，P＜0.01；＊＊＊，P＜0.001)(图5A、右图)，再现了实施例4的结果。

关于Aggrus缺失突变体，也与上述同样对Aggrus表达量和与CLEC‐2的反应性(图5B)进行定量分析。重复进行3次实施例4(图4E参照)中进行的使用FACS法的Aggrus表达量的确认和与CLEC‐2的反应性的研究并平均化。图表中表示了将CHO/Aggrus－WT的无底色白峰所示的顶点位置的荧光强度的平均值设为1时的Aggrus缺失突变体蛋白的表达量。与Aggrus野生型的表达量进行比较后的统计分析的结果显示了，Aggrus缺失突变体蛋白(Δ29-34、Δ47-52、Δ81-85、Δ47-52/Δ81-85)的表达量没有显著性差异(标记为ns)，表达量基本一致(图5B、左图)。另一方面，确认了与CLEC‐2的反应性在缺失突变体中显著减少。在图4E右图中，图表中表示了将表示与CLEC‐2的反应性的无底色白峰所示的顶点位置的荧光强度的平均值设为1时的Aggrus缺失突变体蛋白与CLEC‐2的反应性。显示了将Aggrus野生型与CLEC‐2的反应性设为1时，Aggrus缺失突变体蛋白(Δ29-34、Δ47-52、Δ81-85、Δ47-52/Δ81-85)与CLEC‐2的反应性除了Δ29-34的情况以外，全部显著减少(＊＊，P＜0.01)(图5B、右图)，再现了实施例4的结果。

(2)PLAG3和PLAG4在血小板凝集中的作用研究

接着，使用CHO/mock、CHO/Aggrus－WT、CHO/Aggrus-D48A、CHO/Aggrus-D82A、CHO/Aggrus-D48A/D82A突变体表达细胞，与实施例2同样对各突变体表达细胞的血小板凝集能力进行研究。确认到了图4C的再现性，即，各突变体表达细胞的血小板凝集诱导活性与和CLEC‐2的结合力成比例，D82A突变体与D48A突变体相比，血小板凝集诱导活性弱。进一步明确的是，D48A/D82A双突变体表达细胞与CHO/mock同样不显示血小板凝集诱导活性(图5C)。因此再次确认了，新鉴定的PLAG4在Aggrus依赖性的血小板凝集中发挥了主要的作用。

实施例6

PLAG4结构域中的E81、D82、T85参与和CLEC‐2的结合

在新鉴定的PLAG4结构域中存在与PLAG3结构域类似的EDXXT模体。对PLAG4结构域中的第81位的谷氨酸(E)、第82位的天冬氨酸(D)、第85位的苏氨酸(T)(图6B(右图、划下划线的氨基酸))直接参与和CLEC‐2的结合进行分析。使用导入了在pcDNA3载体中插入将第81位的谷氨酸取代为丙氨酸的人Aggrus cDNA而成的质粒的CHO细胞(CHO/Aggrus－E81A)、导入了插入将第82位的天冬氨酸取代为丙氨酸的人Aggrus cDNA而成的质粒的CHO细胞(CHO/Aggrus－D82A)、导入了插入将第85位的苏氨酸取代为丙氨酸的人Aggrus cDNA而成的质粒的CHO细胞(CHO/Aggrus－T85A)，利用FACS进行分析。其中，作为对照，还制作导入了插入野生型人Aggrus cDNA而成的质粒的CHO细胞(CHO/Aggrus－WT)和导入了插入将PLAG3结构域中的第47位的谷氨酸、第48位的天冬氨酸、第52位的苏氨酸(图6A(右图、划下划线的氨基酸))分别取代为丙氨酸的人Aggrus cDNA而成的质粒的CHO细胞(CHO/Aggrus－E47A、CHO/Aggrus－D48A、CHO/Aggrus－T52A)，同样进行分析。

使用野生型或者突变型Aggrus表达CHO细胞，与实施例2同样利用FACS法对Aggrus表达量的确认和与CLEC‐2的反应性进行研究。与图2同样，无底色白峰表示使D2‐40抗体反应并对野生型Aggrus或Aggrus突变体进行染色而得到的结果，填充黑色的峰表示代替D2‐40抗体而使对照小鼠抗体(Sigma公司制造)反应所得到的结果。如图6A(左图)和图6B(左图)所示，各图的无底色白峰所示的顶点位置的荧光强度基本相同，由此也确认了Aggrus蛋白质在各基因导入株的细胞膜上的表达水平基本一致。

图6A(右图)和图6B(右图)是与实施例2同样利用FACS法对各突变体与CLEC‐2的结合进行分析的图。无底色白峰表示利用识别His标签的荧光标记后的二次抗体对与在CHO细胞表面表达的野生型Aggrus或Aggrus突变体结合的带(His)₁₀标签的重组CLEC‐2进行检测而得到的结果。另外，填充黑色的峰是添加对照小鼠抗体来代替带(His)₁₀标签的重组CLEC‐2蛋白质并进行与上述相同的操作而得到的结果。

关于与CLEC‐2的相互作用，将PLAG3结构域中的第47位的谷氨酸、第48位的天冬氨酸、第52位的苏氨酸分别取代为丙氨酸得到的人Aggrus突变体与CLEC‐2的结合，与野生型相比，同等程度地减弱了。因此确认了，这3个氨基酸参与了与CLEC‐2的结合(图6A、右图)。进一步明确的是，将作为其相同部位的PLAG4结构域中的第81位的谷氨酸、第82位的天冬氨酸、第85位的苏氨酸分别取代为丙氨酸得到的人Aggrus突变体与CLEC‐2的结合，与野生型和将PLAG3结构域中的第47位的谷氨酸、第48位的天冬氨酸、第52位的苏氨酸分别取代为丙氨酸得到的人Aggrus相比，也同等程度以上地减弱了(图6B、右图)。

这些结果显示了，Aggrus上新发现的PLAG4结构域中的第81位的谷氨酸、第82位的天冬氨酸、第85位的苏氨酸与PLAG3结构域中的第47位的谷氨酸、第48位的天冬氨酸、第52位的苏氨酸同样参与了与CLEC‐2的结合。还可以明确的是，序列号4所示的EDXXTS(PLAG4结构域)在与CLEC‐2的结合中发挥了重要的作用。

实施例7

产生识别新型PLAG4结构域的抗人Aggrus单克隆抗体的杂交瘤的制作

按照如下的操作，制作产生识别PLAG4结构域的抗人Aggrus单克隆抗体的杂交瘤。

(1)免疫原

将人Aggrus cDNA的从第76位的苏氨酸残基至第89位的苏氨酸残基(序列：ThrGly Ile Arg Ile Glu Asp Leu Pro Thr Ser Glu Ser Thr)的部位重复12次或40次而得到的序列克隆到pGEX-6P3载体(GE Healthcare公司制造)上，获得带有GST标签的免疫原。利用该质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，利用谷胱甘肽琼脂糖凝胶(Glutathione Sepharose)对所表达的GST标签融合重组蛋白质进行纯化。

(2)致敏

对6周龄的雌性BALB/c小鼠(由日本Charles River购入)将所获得的免疫原100μg/只和TiterMax Gold(TiterMax USA公司制造)的混合溶液在颈部皮下进行给药。为了追加免疫，隔周共计9次向腹腔内给药免疫原100μg/只。另外，在部分致敏中，按照向雌性BDF－1小鼠(由日本Clea购入)的尾根部给药2次的方法进行研究。

(3)杂交瘤的构建

按照常规方法，由免疫过的小鼠提取脾脏细胞或髂骨淋巴结细胞，使用聚乙二醇4000，与小鼠骨髓瘤细胞株P3U1融合。通过在包含次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶核苷的Escrown克隆培养基(CloningMedium)(Eidia株式会社制造)中进行培养，使融合的杂交瘤增殖，成功构建了产生对于PLAG4结构域区域的抗体的包含PG4D1和PG4D2的多个杂交瘤。由髂骨淋巴结细胞成功构建了包含6G42A4和9D62D6的多个杂交瘤。

实施例8

识别新型PLAG4结构域的抗人Aggrus单克隆抗体的性状分析

(1)表位的探索

将从人Aggrus cDNA除去包含信号肽部位的氨基末端24个氨基酸而成的序列克隆到pGEX-6P-3载体上，制作带有GST标签的野生型Aggrus蛋白质表达载体。以下，将所表达的重组蛋白质称为ΔN24-WT。另外，使用QuickChange定点突变试剂盒(Site-DirectedMutagenesis Kit)(Agilent Technology公司制造)，将作为免疫原的相当于第76位至第89位的氨基酸的密码子一次将一处取代为编码丙氨酸的密码子，制作丙氨酸突变型Aggrus表达载体。以下，重组突变体例如是使作为第76位的氨基酸的苏氨酸(T)突变为丙氨酸(A)而得到的突变体时，标记为ΔN24－T76A。

利用所制作的质粒转化BL21(DE3)大肠杆菌并进行培养。使用大肠杆菌破碎液作为样品，利用蛋白质印迹法研究MS-1、PG4D1、PG4D2、6G42A4、9D62D6、抗GST(alpha-GST)抗体(Abcam公司制造)对重组人Aggrus蛋白质的反应性。作为其结果，如图7A所示，MS-1抗体和抗GST抗体识别包括突变体的全部Aggrus蛋白质，但PG4D1抗体和PG4D2抗体对将从第79位的精氨酸至第83位的亮氨酸的5个氨基酸分别取代为丙氨酸的Aggrus突变体只显示低的反应性。另外，6G42A4抗体和9D62D6抗体对将从第77位的甘氨酸至第83位的亮氨酸的7个氨基酸分别取代为丙氨酸的Aggrus突变体，除了将第80位的异亮氨酸取代为丙氨酸的Aggrus突变体以外，只显示低的反应性。进一步明确的是，将第84位的脯氨酸取代为丙氨酸时，9D62D6抗体的识别能力减弱。

因此可以明确，如图7A的下段所示，所制作的抗体识别的区域是无底色白字所示的从第77位至第84位的肽部分(序列：Gly Ile Arg IleGlu Asp Leu Pro)，PG4D1抗体和PG4D2抗体识别的最小的表位是从第79位至第83位的肽部分(序列：Arg Ile Glu AspLeu)，与图3B所示的PLAG结构域中具有同源性的新型的PLAG4结构域(第81位至第85位的序列(图7A中点划线所围的序列：Glu Asp Leu Pro Thr))部分重叠。

(2)对哺乳类细胞中表达的Aggrus的反应性的研究

已知哺乳类细胞中表达的人Aggrus与大肠杆菌中表达的Aggrus不同，附加有多条糖链。使用表面等离子体共振分析装置Biacore X100(GE Healthcare公司制造)，研究新研制的PG4D1抗体和PG4D2抗体对哺乳类细胞中表达的人Aggrus的反应性。在实施了羧甲基葡聚糖涂覆处理的传感芯片CM5上，利用胺偶联法将来自哺乳动物细胞的市售的纯化重组Aggrus蛋白质(带有人IgG1Fc标签的蛋白质：R&DSystems公司制造)固定化，得到相当于520RU(PG4D1抗体的检测用)或者600RU(PG4D2抗体的检测用)的固定化量。

在25度、30μL/分钟的流速的条件下，在流路中充满HBS－EP+缓冲液(GEHealthcare公司制造)，进行测定。具体而言，将PG4D1抗体和PG4D2抗体稀释成6.25nM、12.5nM、25nM、50nM、100nM，在固定化有Aggrus蛋白质的传感芯片CM5上流动60秒，观察结合反应，紧接着，使HBS－EP+缓冲液流动120秒，观察解离反应。将通过测定获得的数据示于图7B。

所研制的抗体均识别Aggrus蛋白质并进行结合(结合速度常数(k_a)＝3×10⁴)，另外，即使流过清洗用的HBS－EP+缓冲液，也几乎看不到解离反应，解离速度常数(k_d)为所使用的Biacore X100的测量极限以下，即k_d值为≤10^－5。因此可以明确，PG4D1抗体和PG4D2抗体的解离常数(K_D)为≤3×10^－10M这样的值，显示非常强的结合。

(3)对Aggrus表达细胞的识别能力

MS-1抗体几乎无法识别mRNA水平上的Aggrus表达已被确认的人膀胱鳞状上皮癌细胞株UM-UC-5细胞和人纤维肉瘤细胞株HT1080细胞等。因此，利用MS-1抗体，作为治疗对象的癌的种类受到限定。使用新研制的PG4D1抗体和PG4D2抗体，进行了是否能够识别在MS-1抗体无法识别的UM-UC-5细胞、HT1080细胞表面表达的Aggrus的研究。使用PG4D1抗体和PG4D2抗体作为一次抗体，使用Alexa488标记的抗小鼠IgG抗体作为二次抗体，利用FACS对UM-UC-5细胞、HT1080细胞进行了分析。作为其结果，确认了PG4D1抗体、PG4D2抗体也能够识别利用MS－1抗体无法识别的UM-UC-5细胞、HT1080细胞(图7C)。

实施例9

识别新型PLAG4结构域的抗人Aggrus单克隆抗体的识别部位的研究和反应性

在实施例8(参照图7A)中，研究了对大肠杆菌中表达的人Aggrus蛋白质的反应性。其结果如图7A的下段所示，显示了PG4D1抗体和PG4D2抗体识别的区域是无底色白字所示的从第77位至第84位的肽部分(序列：Gly Ile Arg Ile Glu Asp Leu Pro)。其中，为了确认对哺乳类细胞中表达的包含糖链的Aggrus的识别能力及其识别部位，使用导入CHO细胞的Aggrus野生型、Aggrus突变体蛋白、Aggrus缺失突变体蛋白的细胞裂解液作为样品，利用蛋白质印迹法对PG4D1抗体、PG4D2抗体的反应性进行研究。

其结果，如图8A所示，确认了PG4D1抗体和PG4D2抗体不识别缺失了相当于PLAG4结构域的第81位至第85位的5个氨基酸的Aggrus突变体。如图8B所示，还确认了PG4D1抗体不识别将PLAG4结构域中的第82位的天冬氨酸取代为丙氨酸的D82A‐Aggrus突变体，与之相对，PG4D2抗体较弱地识别D82A-Aggrus突变体。即使根据图7A所示的调查对大肠杆菌中表达的人Aggrus蛋白质的反应性而得到的结果，上述情况也符合PG4D2抗体较弱地识别D82A‐Aggrus突变体的事实。另外，由使用识别α‐微管蛋白(α‐tubulin)的抗体的蛋白质印迹分析的结果(图8A、8B)也可以明确，电泳的细胞裂解液中的蛋白质浓度是相同的。

在实施例8(参照图7B)中，由于没有进行是否为非特异结合的研究，因此，在使用表面等离子体共振分析装置Biacore X100(GE Healthcare公司制造)研究PG4D1抗体(亚类(subclass)为小鼠IgG1)和PG4D2抗体(亚类为小鼠IgG2a)对人Aggrus的反应性时，也增加了对照小鼠IgG1(Sigma公司制造)、对照小鼠IgG2a(Sigma公司制造)作为比较对象，进行了研究(图8C、8D)。具体而言，在实施了羧甲基葡聚糖涂覆处理的传感芯片CM5上，利用胺偶联法将市售的纯化重组Aggrus蛋白质(带有人IgG1Fc标签的蛋白质：R&D Systems公司制造)固定化，得到相当于562.2RU(PG4D1抗体的检测用)的固定化量。在25度、30μL/分钟的流速的条件下，在流路充满HBS－EP+缓冲液(GE Healthcare公司制造)，进行测定。具体而言，将对照小鼠IgG1(Control IgG1)稀释成3.7nM、11.1nM、33.3nM、100nM、300nM，在固定化有Aggrus蛋白质的传感芯片CM5上流动60秒，观察结合反应，紧接着，使HBS－EP+缓冲液流动1800秒，观察解离反应。紧接着，使用相同的传感芯片CM5，使PG4D1抗体在相同条件下流动，观察结合反应。将通过测定获得的数据示于图8C。

接着，对于得到相当于562.6RU(PG4D2抗体的检测用)的固定化量的传感芯片CM5，最初，使对照小鼠IgG2a(Control IgG2a)流动，紧接着，使PG4D2抗体在相同条件下流动，观察结合反应。将通过测定获得的数据示于图8D。

确认了对照小鼠IgG1和对照小鼠IgG2a都不与固定化有Aggrus的传感芯片结合，与之相对，确认了PG4D1抗体和PG4D2抗体都是与实施例8(参照图7B)同样强的结合，因此证明了，PG4D1抗体和PG4D2抗体向Aggrus固定化传感芯片的结合不是非特异性结合。还明确了，本检测中的PG4D1抗体和PG4D2抗体的解离常数(K_D)也与

实施例8(参照图7B)同样，成为≤3×10^-10M这样的值，显示非常强的结合。

实施例10

通过PG4D1和PG4D2抗体的Aggrus与CLEC‐2的结合抑制

(1)利用AlphaScreen法的研究

使用作为非放射性的均相邻近检测的Alpha Screen(注册商标)法，分析本发明所获得的单克隆抗体PG4D1、PG4D2对Aggrus与CLEC‐2的结合的抑制效果。

将1ng的纯化重组Aggrus蛋白质(带有人IgG1Fc标签的蛋白质、R&D Systems公司制造)和30ng的纯化重组CLEC‐2蛋白质(带(His)₁₀标签的蛋白质；rCLEC‐2、R&D Systems公司制造)分别注入96孔板，向其添加对照小鼠IgG1(Sigma公司制造)、对照小鼠IgG2a(Sigma公司制造)、MS-1、PG4D1、PG4D2、6G42A4、9D62D6抗体，使得最终浓度成为12.5μg/mL～5ng/mL。添加后，在26度反应1小时，之后，添加用AlphaLISA通用缓冲液(Universal Buffer)稀释的AlphaScreen镍螯合供体珠(Nickel Chelate AlphaScreen Donor Beads)和AlphaLISA蛋白A受体珠(Protein A AlphaLISA Acceptor Beads)，再在26度反应1小时后，使用Envision(Perkin Elmer公司制造)，利用680nm波长的激光激发。

利用激发，供体珠(Donor Beads)将氧转变为单态，使接近该单态氧的受体珠(Acceptor Beads)所含的荧光物质活化，从而放出615nm的荧光信号。即，与AlphaScreen镍螯合供体珠(Nickel Chelate AlphaScreen Donor Beads)结合且被赋予His标签的CLEC‐2蛋白质和与AlphaLISA蛋白A受体珠(Protein A AlphaLISA Acceptor Beads)结合且被赋予Fc标签的重组Aggrus蛋白质接近时，放出荧光信号。因此，通过对该荧光信号定量，能够对Aggrus与CLEC‐2的结合状态进行定量。

将无抗体添加时的荧光信号强度设为100％时，如图9A所示，确认了所添加的PG4D1抗体、PG4D2抗体、MS-1抗体全部浓度依赖性地抑制Aggrus与CLEC‐2的结合。特别明确了PG4D1抗体和PG4D2抗体，与MS-1抗体相比，其抑制活性强。另外，6G42A4、9D62D6抗体也看到了抑制Aggrus与CLEC‐2的结合的活性，但其效果比MS-1抗体弱(图9B)。

该结果显示了，抗体作为表位而识别的区域、即从第77位至第84位的肽部分在CLEC-2与Aggrus的结合中是重要的。另外，由使用点突变体的实施例6的分析可以明确，第85位的苏氨酸在CLEC－2与Aggrus的结合中是重要的。因此可以得出结论：从第77位至第85位的氨基酸序列(序列号1：GIRIEDLPT)在Aggrus与CLEC－2的结合中是重要的序列。

考虑是序列号1所示的区域在Aggrus与CLEC-2的结合中是必需的区域，另外，PG4D1抗体、PG4D2抗体识别的序列号3(RIEDL)是其核心区域。因此，合成包含序列号1或序列号3的肽并给药时，能够抑制CLEC-2与Aggrus的结合，能够抑制CLEC-2与Aggrus的结合。若能够抑制CLEC-2与Aggrus的结合，则能够抑制血小板凝集，并能够抑制癌的恶化、转移，从而成为以该区域作为有效成分的药物组合物。

作为竞争性抑制中必需的肽，可以是包含序列号1或3的肽，考虑肽的合成和作用时，优选不太大的肽。具体而言，优选为包含序列号1或3且比这些肽长数个氨基酸～数10个氨基酸左右的序列的肽，更优选为序列号1或3的肽序列本身。

(2)利用FACS法的研究

利用FACS对通过PG4D1抗体、PG4D2抗体的Aggrus与CLEC‐2的结合抑制进行分析。进行抗Aggrus单克隆抗体是否抑制CHO/Aggrus－WT细胞与重组CLEC‐2(rCLEC‐2)的结合的分析。使用识别重组CLEC‐2的His标签的抗体进行检测。

具体而言，从培养容器中回收CHO/Aggrus－WT细胞，用PBS清洗后，制备成1.5×10⁵cells/ml的细胞密度。向100μL的反应溶液中添加小鼠对照IgG(100μg/mL：w/o rCLEC‐2或者rCLEC‐2单独(rCLEC‐2alone)的样品)、PG4D1抗体(100μg/mL：PG4D1+rCLEC‐2样品)、PG4D2抗体(100μg/mL：PG4D2+rCLEC‐2样品)、MS-1抗体(100μg/mL：MS-1+rCLEC‐2样品)，在冰上反应30分钟。接着，用PBS清洗细胞，之后，将从哺乳动物细胞中纯化而得到的0.4μg/mL带(His)₁₀标签的重组CLEC‐2蛋白质(rCLEC‐2)添加至w/o rCLEC‐2以外的样品中，在冰上反应30分钟。用PBS清洗后，添加被荧光标记的识别His标签的二次抗体，在冰上再反应30分钟。最后，用PBS清洗细胞3次后，利用Cytomics FC500进行分析。其结果如图10A所示，确认了PG4D1抗体和PG4D2抗体与MS-1抗体同样抑制rCLEC‐2向Aggrus表达细胞的结合，并且其抑制活性比MS-1抗体强，因此，峰大幅向左偏移。

MS-1抗体识别从PLAG2至PLAG3结构域的区域(参照图1)，与之相对，PG4D1抗体和PG4D2抗体识别PLAG4结构域附近(参照图7)。因此，对PG4D1抗体或者PG4D2抗体与Aggrus结合时的MS-1抗体的Aggrus识别能力的变化进行研究。制作DyLight 594标记的MS-1抗体和DyLight 594标记的PG4D2抗体。具体而言，按照DyLight 594微量抗体标记试剂盒(Microscale Antibody Labeling Kit)(Life Technologies公司制造)的说明书，对MS-1抗体和PG4D2抗体进行荧光标记。

从培养容器中回收CHO/Aggrus-WT细胞株，用PBS清洗后，制备成1.5×10⁵cells/ml的细胞密度，添加DyLight 594标记的MS-1抗体或DyLight 594标记的PG4D2抗体，在冰上反应30分钟。向一部分样品中添加DyLight 594标记的抗体时，添加无标记的MS-1抗体或PG4D2抗体。之后，用PBS清洗细胞3次后，利用Cytomics FC500进行分析。其中，填充黑色的峰是代替荧光标记的抗体而使无标记的对照小鼠抗体(Sigma公司制造)与各个细胞反应并进行与上述相同的操作所得到的结果。

如图10B(最上边的图)所示，由于MS-1抗体和PG4D2抗体的DyLight 594标记进行充分，因此，无底色白峰比填充黑色的峰更向右偏移。DyLight 594标记的MS-1抗体对CHO/Aggrus-WT细胞的反应性，在共存无标记的MS-1抗体时，以依赖于该无标记的MS-1抗体的浓度的方式被抑制(图10B左图、中段)，但即使共存无标记的PG4D2抗体，也不被抑制(图10B左图、下段)。另外，DyLight 594标记的PG4D2抗体对CHO/Aggrus-WT细胞的反应性，在共存无标记的PG4D2抗体时，以依赖于该无标记的PG4D2抗体的浓度的方式被抑制(图10B右图、下段)，但即使共存无标记的MS-1抗体，也不被抑制(图10B右图、中段)。因此暗示了，MS-1抗体和PG4D2抗体分别识别PLAG3和PLAG4结构域，由此抑制Aggrus与CLEC‐2的结合，换言之，PLAG3和PLAG4结构域独立地参与了与CLEC‐2的结合。

若MS-1抗体和PG4D2抗体分别识别PLAG3和PLAG4结构域而抑制CLEC‐2的结合，则考虑存在通过并用MS-1抗体和PG4D2抗体而能够完全抑制Aggrus与CLEC‐2的结合的可能性。因此，为了验证该可能性，利用FACS对MS-1抗体单独和除了MS-1抗体还并用PG4D2抗体时的Aggrus与CLEC‐2的结合进行分析。进行MS-1抗体和PG4D2抗体是否抑制CHO/Aggrus－WT细胞与重组CLEC‐2(rCLEC‐2)的结合的分析。使用识别His标签的抗体对重组CLEC‐2进行检测(图10C)。

具体而言，从培养容器中回收CHO/Aggrus－WT细胞，用PBS清洗后，制备成1.5×10⁵cells/ml的细胞密度。向100μL的反应溶液中添加小鼠对照IgG(100μg/mL：w/o rCLEC‐2或者rCLEC‐2单独(rCLEC‐2alone)的样品)、PG4D2抗体(100μg/mL：PG4D2+rCLEC‐2样品)、PG4D2抗体和MS-1抗体(各100μg/mL：PG4D2+MS-1+rCLEC‐2样品)，在冰上反应30分钟。接着，用PBS清洗细胞，之后，将从哺乳动物细胞中纯化而得到的0.4μg/mL带(His)₁₀标签的重组CLEC‐2蛋白质(rCLEC‐2)添加至w/o rCLEC‐2以外的样品中，在冰上反应30分钟。用PBS清洗后，添加被荧光标记的识别His标签的二次抗体，在冰上再反应30分钟。最后，用PBS清洗细胞3次后，利用Cytomics FC500进行分析。其结果，如图10C所示，确认了通过并用PG4D2抗体和MS-1抗体，与单独使用PG4D2抗体相比，强烈抑制rCLEC‐2的结合，峰大幅向左偏移。

因此可以明确，PG4D1抗体或者PG4D2抗体识别的PLAG4结构域与PLAG3结构域独立地参与了与CLEC‐2的结合，通过并用识别PLAG4结构域的抗体和识别PLAG3结构域的抗体，可以看到CLEC‐2结合的更强的抑制。

实施例11

使用Aggrus突变体分析通过PG4D1和PG4D2抗体的CLEC‐2结合抑制和血小板凝集 抑制

(1)与CLEC‐2的结合的抑制

Aggrus通过与血小板上的CLEC‐2结合而传递血小板凝集诱导信号。对PG4D1抗体或者PG4D2抗体识别的PLAG4结构域直接参与了与CLEC‐2的结合以及血小板凝集进行分析。使用导入了在pcDNA3载体中插入将PLAG3结构域内的第48位的天冬氨酸取代为丙氨酸的人Aggrus cDNA而成的质粒的CHO细胞(CHO/Aggrus－D48A)进行研究。通过使用表达Aggrus－D48A的突变体，能够不需要考虑Aggrus的PLAG3结构域对于CLEC‐2的结合的参与，来评价PLAG4结构域与CLEC‐2的结合。利用FACS对PLAG4结构域是否直接参与了CLEC‐2与Aggrus的结合进行分析。

从培养容器中回收CHO/Aggrus－D48A细胞，用PBS清洗后，制备成1.5×10⁵cells/ml的细胞密度。向100μL的反应溶液中添加PBS(w/o rCLEC‐2或者不添加抗体(Add noantibody)的样品)、各种浓度的PG4D1抗体(图11A左图)、PG4D2抗体(图11A右图)，在冰上反应30分钟。之后，用PBS清洗细胞，将从哺乳动物细胞中纯化而得到的带(His)₁₀标签的重组CLEC‐2蛋白质(rCLEC‐2)0.4μg/mL添加至w/o rCLEC‐2以外的样品中，在冰上反应30分钟。用PBS清洗后，添加被荧光标记的识别His标签的二次抗体，在冰上再反应30分钟。最后，用PBS清洗细胞3次后，利用Cytomics FC500进行分析。如图11A所示，明确的是通过添加PG4D1抗体或者PG4D2抗体，浓度依赖性地抑制rCLEC‐2向Aggrus表达细胞的结合，并且以100μg/mL的浓度进行添加时，基本完全抑制rCLEC‐2的结合。因此可以明确，PG4D1抗体或者PG4D2抗体识别的PLAG4结构域直接参与了与CLEC‐2的结合。

(2)血小板凝集的抑制

接着，利用血小板凝集抑制试验确认PLAG4结构域对CLEC‐2的结合。具体而言，利用使用MCM HEMA TRACER 313的透光率的监测，进行使用小鼠洗涤血小板的体外(invitro)血小板凝集分析。如图11B所示，观察到CHO/Aggrus－D48A细胞诱导血小板凝集，但预先添加50ng/mL的PG4D2抗体时，没有引起血小板凝集(图11B)。另外，虽然此处未图示，但即使事先添加PG4D1抗体，也确认了大致相同的血小板凝集抑制效果。因此可以明确，PG4D1抗体或者PG4D2抗体识别的PLAG4结构域直接参与了血小板凝集，另外，新研制的抗体是通过与PLAG4结构域结合并覆盖该结构域而抑制血小板凝集的中和抗体。

在血小板凝集抑制试验中，进行了识别PLAG4结构域的PG4D1抗体或者PG4D2抗体、识别PLAG3结构域的MS-1抗体的差异的研究以及PG4D2抗体和MS‐1抗体的并用效果的研究。使用CHO/Aggrus－WT细胞，与上述同样进行体外(in vitro)血小板凝集分析。如图12A所示，观察到CHO/Aggrus－WT细胞诱导血小板凝集，但添加10μg/mL的MS-1抗体、PG4D1抗体、PG4D2抗体时，与添加对照抗体(Control IgG)时相比，血小板凝集开始的时间延迟(图12A)。另外明确了，PG4D1抗体和PG4D2抗体的血小板凝集抑制活性比MS‐1抗体的血小板凝集抑制活性强，因此，至凝集开始的时间延迟了。

进一步确认了，关于CHO/Aggrus－WT细胞依赖性的血小板凝集，并用10μg/mL的MS‐1抗体和10μg/mL的PG4D2抗体时，与单独添加PG4D2抗体时相比，基本完全抑制血小板凝集(图12B)。因此可以明确，PG4D1抗体或者PG4D2抗体识别的PLAG4结构域和MS-1抗体识别的PLAG3结构域两者都参与了血小板凝集。

实施例12

利用PG4D1和PG4D2抗体的向肺的血行性转移抑制

已知经由裸小鼠的尾静脉导入表达人Aggrus的CHO细胞时，约20天后形成肺转移结节。另外，本发明的发明人已经公开了Aggrus依赖性的肺转移被MS-1抗体抑制(专利文献2)。在此，对通过在细胞移植1天前投予本发明的抗Aggrus抗体，是否抑制Aggrus依赖性的血行性转移进行分析。

使用6周龄的雌性BALB/c－nu裸小鼠(由Charles River Japan购入)进行分析。在作为肿瘤细胞的CHO/Aggrus－WT细胞移植1天前，经由小鼠尾静脉以10μg/小鼠的用量投予对照小鼠抗体(Sigma公司制造)、MS－1抗体、PG4D1抗体或PG4D2抗体。次日，从培养容器中回收CHO/Aggrus－WT细胞，用PBS清洗后，制备成2.5×10⁶cells/ml的细胞密度，以100μL/只小鼠经由尾静脉进行移植。如图13所示，通过在肿瘤移植前1天投予PG4D1抗体和PG4D2抗体，与肿瘤移植前1天给药MS－1抗体的情况同样，显著抑制了CHO/Aggrus－WT细胞的肺转移。因此显示了，PG4D1抗体和PG4D2抗体不仅具有Aggrus中和活性，而且强烈抑制Aggrus依赖性的血行性转移。

使用各抗体的亚类一致的同型匹配的对照抗体进行相同的研究。另外，在本研究中，各组使用8只5周龄的雌性BALB/c－nu裸小鼠(由Charles River Japan购入)进行。在作为肿瘤细胞的CHO/Aggrus－WT细胞移植1天前，经由小鼠尾静脉以10μg/小鼠的用量投予对照小鼠IgG1(Control IgG1、Sigma公司制造)、对照小鼠IgG2a(Control IgG2a、Sigma公司制造)、PG4D1抗体、PG4D2抗体、MS－1抗体。次日，从培养容器中回收CHO/Aggrus－WT细胞，用PBS清洗后，制备成2.5×10⁶cells/ml的细胞密度，以100μL/小鼠经由尾静脉进行移植。19天后，摘出肺进行分析。如图14A所示，拍摄使用苦味酸染色后的照片，并进行肺表面的转移结节数的计数(图14B)。确认了通过在肿瘤移植前1天投予PG4D1抗体和PG4D2抗体，与MS－1抗体的情况同样，CHO/Aggrus－WT细胞的肺转移与各同型匹配的对照抗体给药组相比，被显著抑制(＊＊，P＜0.01)。

因此显示了，PG4D1抗体和PG4D2抗体不仅具有中和Aggrus依赖性的血小板凝集的活性，而且强烈抑制Aggrus依赖性的血行性转移。据报告血小板凝集与癌细胞的转移微环境(niche)的形成(转移微小环境的形成)有关，由此考虑到PG4D1抗体和PG4D2抗体具有与转移有关的微环境形成的抑制效果。进一步明确的是，血小板也与原发病灶的肿瘤增殖有关，因此暗示了PG4D1抗体和PG4D2抗体通过抑制转移癌在转移脏器内的增殖而发挥转移抑制效果。

实施例13

PLAG4结构域识别抗体PG4D2抑制LC-SCC-015细胞的肺转移的效果的实证

将本发明的发明人构建的人肺鳞状上皮癌细胞株LC-SCC-015移植至各组3只5周龄的雄性CB-17SCID小鼠(由Charles River Japan购入)而进行。具体而言，在作为肿瘤细胞的LC-SCC-015细胞移植1天前，经由小鼠尾静脉以30μg/小鼠的用量投予对照小鼠IgG2a(Mouse IgG2a、Sigma公司制造)、PG4D2抗体。次日，从培养容器中回收LC-SCC-015细胞，用PBS清洗后，制备成2.5×10⁶cells/ml的细胞密度，以100μL/小鼠经由尾静脉进行移植。31天后，摘出肺，使用苦味酸染色后，进行肺表面的转移结节数的计数(图15)。确认了在肿瘤移植前1天投予PG4D2抗体时，与对照小鼠IgG2a抗体给药组相比，也显著抑制肺转移(＊，P＜0.05)。

确认了PG4D2抗体不仅具有中和Aggrus依赖性的血小板凝集的活性，而且在所构建的人肺鳞状上皮癌细胞株LC-SCC-015的肺转移中，Aggrus依赖性的血小板凝集也参与了血行性肺转移。显示了PG4D2抗体通过强烈抑制Aggrus依赖性的血行性转移而抑制了LC-SCC-015细胞的肺转移。

据报告血小板凝集与癌细胞的转移微环境的形成(转移微小环境的形成)有关。由此，考虑到PG4D2抗体也具有与转移有关的微环境形成的抑制效果。进一步明确的是，血小板也与原发病灶的肿瘤增殖有关，因此暗示了PG4D2抗体通过抑制转移癌在转移脏器内的增殖而发挥转移抑制效果。

实施例14

利用PLAG4结构域识别抗体PG4D2抑制PC-10细胞的肿瘤增殖的效果的验证

将人肺鳞状上皮癌细胞株PC-10移植至各组4或5只5周龄的雄性NOD SCID小鼠(NOD.CB17-Prkdcscid/J；由Charles River Japan购入)。PC-10细胞移植后，在11天后的肿瘤体积成为约80mm³左右的时刻，以各组的肿瘤体积的平均大致均等的方式将小鼠分为两组。之后，经由小鼠尾静脉，以200μg/只小鼠(mouse)(n＝5)的用量投予对照小鼠IgG2a(Control IgG2a、Sigma公司制造)，以100μg/只小鼠(mouse)(n＝4)的用量投予PG4D2抗体，以100μg/只小鼠(mouse)(n＝5)的用量投予MS-1抗体，以各100μg且合计200μg/只小鼠(mouse)(n＝4)的用量投予PG4D2抗体和MS-1抗体。将抗体给药开始之日作为0天，在之后的3、7、10、14、17、21、24天进行同量的抗体给药。

如图16所示，投予了PG4D2抗体或者MS-1抗体的组与对照小鼠抗体给药组相比，肿瘤增殖被抑制。其倾向也与并用PG4D2抗体和MS-1抗体的情况相同。另外，稍微看到了因并用而得到的肿瘤抑制效果的增强。另外，在投予PG4D2抗体的组(PG4D2抗体给药组以及PG4D2抗体和MS-1抗体的并用组)中，在各组每1只中都看到了肿瘤的完全消退，但也考虑了这是由PC-10细胞的特异性或者小鼠的个体差异引起的可能性，而没有包括在肿瘤体积的平均值等的计算中。其中，只有投予了PG4D2抗体的组看到了肿瘤消退，也存在PG4D2抗体具有与MS-1抗体不同的强的抗肿瘤效果的可能性。

因此，使用作为重度联合免疫缺陷小鼠的NOD SCID小鼠进行研究。实施例12所使用的裸小鼠和实施例13所使用的SCID小鼠是缺失了T细胞和B细胞的小鼠，与之相对，NODSCID小鼠不仅缺失了T细胞和B细胞，而且NK活性也下降了。因此可以认为，使用NOD SCID小鼠的实施例14的实验所看到的Aggrus中和抗体的抗肿瘤效果不依赖于抗体的ADCC活性和CDC活性。暗示了此处所使用的识别PLAG3、PLAG4结构域的抗体通过中和Aggrus的血小板凝集诱导活性而抑制来自血小板的各种增殖因子的游离，作为其结果，引起了增殖抑制。因此暗示了，PG4D2抗体不是直接杀死PC-10细胞，而是间接地通过使增殖因子枯竭而抑制原发病灶的肿瘤增殖。即表明，识别PLAG4结构域的抗体不仅如实施例12和实施例13所示地抑制血行性转移，也抑制原发病灶的肿瘤增殖。

实施例15

通过人‐小鼠嵌合化PG4D2抗体的Aggrus中和活性的研究

对PG4D2抗体的抗原识别部位进行基因克隆，通过与编码人IgG4的Fc部位的基因连接而制作IgG4型的人‐小鼠嵌合化PG4D2抗体(Ch.PG4D2-IgG4SP)，通过与编码人IgG1的Fc部位的基因连接而制作IgG1型的人‐小鼠嵌合化PG4D2抗体(Ch.PG4D2-IgG1)。

图17A表示使用CHO/Aggrus-WT细胞并与实施例2同样研究各抗体对Aggrus的反应性而得到的结果。左图表示使CHO/Aggrus-WT细胞和作为没有嵌合化的小鼠抗体的PG4D2抗体以图中所示的浓度反应、用PBS清洗后使作为二次抗体的Alexa488标记抗小鼠IgG(anti-mouse IgG-Alexa488)反应而得到的结果。中央图表示使CHO/Aggrus-WT细胞和IgG4型的人‐小鼠嵌合化PG4D2抗体(Ch.PG4D2-IgG4SP)以图中所示的浓度反应、用PBS清洗后使作为二次抗体的Alexa488标记抗人IgG(anti-human IgG-Alexa488)反应而得到的结果。右图表示使CHO/Aggrus-WT细胞和IgG1型的人‐小鼠嵌合化PG4D2抗体(Ch.PG4D2-IgG1)以图中所示的浓度反应、用PBS清洗后使作为二次抗体的Alexa488标记抗人IgG反应而得到的结果。确认了嵌合化的Ch.PG4D2-IgG4SP和Ch.PG4D2-IgG1均显示了对Aggrus的反应性。

图17B表示与实施例10同样利用FACS对Aggrus与CLEC-2的结合抑制进行分析而得到的结果。使用作为没有嵌合化的小鼠抗体的PG4D2抗体(图17B上)、IgG4型的人‐小鼠嵌合化PG4D2抗体(Ch.PG4D2-IgG4SP)(图17B下左)、IgG1型的人‐小鼠嵌合化PG4D2抗体(Ch.PG4D2-IgG1)(图17B下右)进行检测。其中，在各检测中，使用种和抗体的亚类相同的抗体作为对照抗体。具体而言，使用对照小鼠(Control mouse)IgG2a(Sigma公司制造)、对照人(Control human)IgG4(Sigma公司制造)、对照人(Control human)IgG1(Sigma公司制造)。

作为其结果，IgG4型的人‐小鼠嵌合化PG4D2抗体(Ch.PG4D2-IgG4SP)显示与原来的作为没有嵌合化的小鼠抗体的PG4D2抗体大致同等的Aggrus中和活性，但IgG1型的人‐小鼠嵌合化PG4D2抗体(Ch.PG4D2-IgG1)的Aggrus中和活性略弱。因此，Ch.PG4D2-IgG1在与CLEC-2的结合抑制中需要比原来的PG4D2抗体多的抗体量，但使Ch.PG4D2-IgG1以60μg/mL反应时，能够充分抑制rCLEC-2向Aggrus的结合。

实施例16

利用骨肉瘤组织切片的使用PG4D1抗体和PG4D2抗体的免疫染色

由US Biomax公司购入骨和软骨恶性肿瘤组织微阵列(Bone and cartilagemalignant tumor tissue microarray)，其包括4例恶性肿瘤(containing 4cases ofmalignant tumor)(软骨肉瘤、骨肉瘤和尤文氏肉瘤各2例(2each of chondrosarcoma、osteosarcoma and Ewing’s sarcoma))，每例四点(quadruple cores per case)(制品编号T264a)，按照常规方法进行HE染色(图18A)。

在该组织阵列(Tissue array)中，配置有软骨肉瘤(Chondrosarcoma)、骨肉瘤(Osteosarcoma)、尤文氏肉瘤(Ewing’s Sarcoma)的组织样品各2个病例、每1个病例4个切片和作为组织标记的嗜铬细胞瘤(Pheochromocytoma)，能够利用免疫染色对病期等不同的患者的肿瘤组织中的蛋白质表达进行分析。在该载玻片所载的骨肉瘤2个病例中，利用免疫染色法对D2－40、PG4D1、PG4D2的骨肉瘤识别能力进行研究。

使用D2-40抗体(DAKO公司：制品编号M3619、抗平足蛋白小鼠单克隆抗体(Anti-podoplanin mouse monoclonal antibody))、PG4D1抗体(5mg/ml)、PG4D2抗体(5mg/ml)作为一次抗体，按照以下的方法进行免疫染色。具体而言，脱石蜡后水洗，室温下在0.3％过氧化氢水/甲醇中浸渍10分钟，用PBS清洗5分钟并重复3次。之后，在室温下在Blocking One P(Nacalai Tesque公司制造，#05999-84)中浸渍15分钟后，用PBS清洗5分钟。之后，在使用D2-40抗体作为一次抗体的情况下，将用PBS进行1/100稀释而成的抗体溶液在4度反应16小时。在使用PG4D1或者PG4D2抗体作为一次抗体的情况下，将用PBS进行1/1000稀释而成的抗体溶液(最终抗体浓度5μg/ml)在4度反应16小时。D2-40抗体是培养上清液，因此，难以进行克换算，如下所述地选择对照组织中的染色程度在全部的抗体中都成为同等这样的抗体浓度，进行染色。用PBS清洗5分钟并重复3次后，室温下在作为二次抗体的One-Step Polymer-HRP(BioGenex公司制造，#HK595-50K)中反应15分钟。用PBS清洗5分钟并重复3次后，在DAB(商品名Super Sensitive DAB(即用型(Ready to use))，BioGenex公司制造，#HK542-XAK)中显色5分钟。水洗后，通过将点在Mayer's苏木精溶液(Hematoxylin Solution)(武藤化学株式会社制造，#3000-2)中浸渍1分钟而进行对比染色，之后，按照常规方法进行水洗、脱水、澄清、封入。

在作为组织阵列(Tissue array)的T264a载玻片上，如上所述地载置骨肉瘤2个病例的肿瘤组织，图18A所示的A3和A6的肿瘤组织是第1个骨肉瘤病例(10岁男性)，B1和B4的肿瘤组织来自第2个骨肉瘤病例(21岁女性)。如图18B所示，可知利用向位于D7的对照肿瘤组织(嗜铬细胞瘤(Pheochromocytoma))的染色程度基本一致的染色程度进行比较时，使用PG4D1抗体和PG4D2抗体的免疫染色的染色程度与D2-40抗体的染色程度相比，染色更深，PG4D1抗体和PG4D2抗体，与D2-40抗体相比，骨肉瘤识别能力更高。因此暗示了，至少作为骨肉瘤的增殖抑制药和转移抑制药是有用的。

虽然在mRNA中能够确认Aggrus的表达，但有时在抗体中无法检出，有Aggrus抗体在治疗中的应用受到限定的担忧。例如，本发明的发明人例示了PG4D1抗体、PG4D2抗体识别MS-1抗体无法识别的人膀胱鳞状上皮癌细胞株UM-UC-5细胞和人纤维肉瘤细胞株HT1080细胞(图7C)。根据癌的种类等，能够识别Aggrus的情形和无法识别Aggrus的情形的机理尚不明确，但可以考虑PG4D1抗体、PG4D2抗体至少能够适用于此处所示的骨肉瘤、使用细胞株的实验系统中结合已被验证的膀胱鳞状细胞癌、纤维肉瘤、肺鳞状细胞癌的治疗中。

如上所示，与序列号1所示的区域结合的抗Aggrus抗体抑制Aggrus与CLEC-2的结合，抑制血小板凝集，并抑制癌的恶化、转移。进而，能够以该区域与CLEC-2的结合作为指标，对抑制与CLEC-2的结合的药物进行筛选。

保藏号

NITE P－02070

NITE P－02071

受理机关记录栏

国际事务局记录栏

0-5	该用纸由国际事务局受理的日期
			0-5-1	有权限的职员

序列表

<110> 公益财团法人癌研究会

<120> 抗Aggrus单克隆抗体、与CLEC－2的结合所需的Aggrus的区域和Aggrus－CLEC‐2结合抑制剂的筛选方法

<130> S15053PCT

<160> 19

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 9

<212> PRT

<213> 智人

<400> 1

Gly Ile Arg Ile Glu Asp Leu Pro Thr

1 5

<210> 2

<211> 17

<212> PRT

<213> 智人

<400> 2

Gly Ala Glu Asp Asp Val Val Thr Pro Gly Thr Ser Glu Asp Arg Tyr

1 5 10 15

Lys

<210> 3

<211> 5

<212> PRT

<213> 智人

<400> 3

Arg Ile Glu Asp Leu

1 5

<210> 4

<211> 6

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> misc_feature

<222> (3)..(4)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400> 4

Glu Asp Xaa Xaa Thr Ser

1 5

<210> 5

<211> 144

<212> PRT

<213> 智人

<400> 5

Met Trp Lys Val Ser Ala Leu Leu Phe Val Leu Gly Ser Ala Ser Leu

1 5 10 15

Trp Val Leu Ala Glu Gly Ala Ser Thr Gly Gln Pro Glu Asp Asp Thr

20 25 30

Glu Thr Thr Gly Leu Glu Gly Gly Val Ala Met Pro Gly Ala Glu Asp

35 40 45

Asp Val Val Thr Pro Gly Thr Ser Glu Asp Arg Tyr Lys Ser Gly Leu

50 55 60

Thr Thr Leu Val Ala Thr Ser Val Asn Ser Val Thr Gly Ile Arg Ile

65 70 75 80

Glu Asp Leu Pro Thr Ser Glu Ser Thr Val His Ala Gln Glu Gln Ser

85 90 95

Pro Ser Ala Thr Ala Ser Asn Val Ala Thr Ser His Ser Thr Glu Lys

100 105 110

Val Asp Gly Asp Thr Gln Thr Thr Val Glu Lys Asp Gly Leu Ser Thr

115 120 125

Val Thr Leu Val Gly Ile Ile Val Gly Val Leu Leu Ala Ile Gly Phe

130 135 140

<210> 6

<211> 144

<212> PRT

<213> 倭黑猩猩

<400> 6

Met Trp Lys Val Ser Ala Leu Leu Phe Val Leu Gly Ser Ala Ser Leu

1 5 10 15

Trp Val Leu Ala Glu Gly Ala Ser Thr Gly Gln Pro Glu Asp Asp Thr

20 25 30

Glu Thr Thr Gly Leu Glu Gly Gly Phe Ala Val Pro Gly Ala Glu Asp

35 40 45

Asp Val Val Thr Pro Gly Thr Ser Glu Asp Arg Tyr Lys Ser Gly Leu

50 55 60

Thr Thr Leu Val Ala Thr Ser Val Asn Ser Val Thr Gly Ile Arg Ile

65 70 75 80

Glu Asp Leu Pro Thr Ser Glu Ser Thr Val His Ala Gln Glu Gln Ser

85 90 95

Pro Ser Ala Thr Ala Ser Asn Val Ala Thr Ser His Ser Thr Glu Lys

100 105 110

Val Asp Gly Asp Thr Gln Thr Thr Val Glu Lys Asp Gly Leu Ala Thr

115 120 125

Val Thr Leu Val Gly Ile Ile Val Gly Val Leu Leu Ala Ile Gly Phe

130 135 140

<210> 7

<211> 144

<212> PRT

<213> 猕猴

<400> 7

Met Trp Lys Val Ser Ala Leu Leu Phe Val Leu Gly Ser Ala Ser Leu

1 5 10 15

Trp Val Leu Ala Glu Gly Ala Ser Thr Gly Gln Pro Glu Asp Asp Ile

20 25 30

Glu Thr Thr Gly Met Glu Gly Gly Val Ala Met Pro Gly Ala Glu Asp

35 40 45

Asp Val Val Thr Pro Gly Thr Ser Glu Asp Arg Tyr Lys Ser Gly Leu

50 55 60

Thr Thr Pro Val Ala Thr Ser Val Asn Ser Val Thr Asp Ile His Ile

65 70 75 80

Glu Asp Leu Pro Thr Pro Glu Ser Thr Val His Ala Gln Gly Gln Ser

85 90 95

Pro Ser Thr Thr Ala Ser Asn Val Ala Thr Ser His Ser Thr Asp Lys

100 105 110

Val Asp Gly Asp Thr Gln Thr Ala Ile Glu Lys Asp Gly Leu Ala Thr

115 120 125

Val Thr Leu Val Gly Ile Ile Val Gly Val Leu Leu Ala Ile Gly Phe

130 135 140

<210> 8

<211> 141

<212> PRT

<213> 猪

<400> 8

Met Trp Lys Val Pro Val Leu Leu Phe Val Leu Gly Ser Ala Ser Leu

1 5 10 15

Trp Val Leu Ala Glu Gly Ala Ser Thr Val Leu Pro Glu Asp Gly Val

20 25 30

Thr Pro Gly Val Glu Gly Ser Ser Lys Ala Ser Pro Gly Val Glu Asp

35 40 45

Tyr Thr Val Thr Pro Arg Thr Arg Glu Glu Pro Tyr Ala Thr Pro Leu

50 55 60

Val Pro Thr Arg Thr Lys Gly Thr Thr Gly Ser Pro Thr Glu Asp Val

65 70 75 80

Phe Thr Val Gly Ser Thr Thr His Ser His Lys Gly Ser Gln Ser Thr

85 90 95

Thr Thr Gln Asn Val Val Thr Ser Gln Ser His Asp Lys Gly Asp Glu

100 105 110

Glu Lys Ser Lys Thr Val Thr Lys Asp Gly Leu Gly Thr Val Thr Leu

115 120 125

Val Gly Ile Thr Val Gly Val Leu Leu Ala Ile Gly Phe

130 135 140

<210> 9

<211> 143

<212> PRT

<213> 抹香鲸

<400> 9

Met Trp Lys Gly Pro Val Leu Phe Phe Val Leu Gly Ser Ala Ser Leu

1 5 10 15

Trp Val Leu Ala Glu Ala Ser Thr Val Arg Pro Glu Asp Gly Met Thr

20 25 30

Thr Gly Val Glu Asn Gly Lys Ala Thr Pro Gly Val Glu Asp His Val

35 40 45

Glu Thr Pro Gly Ala Ser Gly Glu Pro His Glu Ser Ala Gly Leu Thr

50 55 60

Ala Pro Met Pro Thr Arg Thr Lys Ser Met Thr Glu Val His Lys Glu

65 70 75 80

Asp Leu Pro Thr Ala Glu Ser Thr Ile His Ser Gln Gly Gln Ser Gln

85 90 95

Ser Thr Thr Thr Leu Asn Val Ala Thr Ser Gln Ser Pro Gly Lys Thr

100 105 110

Asp Gly Glu Lys Pro Thr Thr Val Glu Lys Gly Gly Ser Ser Thr Val

115 120 125

Thr Leu Val Gly Ile Ile Val Gly Val Leu Leu Ala Ile Gly Phe

130 135 140

<210> 10

<211> 152

<212> PRT

<213> 牛

<400> 10

Met Trp Lys Val Pro Val Leu Phe Phe Ile Leu Gly Ser Ala Ser Phe

1 5 10 15

Trp Val Leu Ala Glu Gly Ala Ser Thr Val Arg Pro Glu Asp Asp Val

20 25 30

Thr Thr Gly Val Thr Ser Glu Lys Thr Thr Leu Gly Val Glu Asp Tyr

35 40 45

Thr Thr Thr Pro Ala Ala Ser Lys Glu Ser Leu Ala Thr Pro Met Pro

50 55 60

Ala Gly Thr Glu Asn Val Ser His Asp His Arg Glu Asp Leu Pro Thr

65 70 75 80

Ala Glu Gly Thr Thr Ala Glu Gly Thr Thr Ala Lys Ser Thr Pro Ala

85 90 95

Arg Ser Thr Pro Ala Arg Ser Thr Thr Thr Val Leu Thr Arg Val Pro

100 105 110

Ala Thr Ser His Ser Gln Gly Lys Thr Asp Gly Glu Lys Pro Lys Ser

115 120 125

Thr Gln Lys Gly Gly Leu Ser Val Gly Thr Leu Val Gly Ile Ile Val

130 135 140

Gly Val Leu Val Gly Ile Ala Val

145 150

<210> 11

<211> 151

<212> PRT

<213> 犬

<400> 11

Met Trp Arg Val Pro Val Leu Leu Leu Val Leu Gly Gly Ala Gly Leu

1 5 10 15

Arg Val Pro Ala Ala Gly Ala Ser Thr Val Arg Pro Asp Asp Ile Ile

20 25 30

Pro Gly Val Glu Asp Ser Val Val Thr Pro Gly Thr Glu Asp Ser Val

35 40 45

Val Thr Pro Gly Ala Glu Asp Asn Val Val Thr Asp Gly Ala Thr Glu

50 55 60

Glu Pro Tyr Glu Ser Gly Leu Thr Pro Leu Val Thr Lys Asn Thr Glu

65 70 75 80

Ser Val Thr Asp Leu His Leu Glu Asp Gly Pro Thr Gln Glu Ser Thr

85 90 95

Val His Ala Lys Glu Glu Ser Gln Ser Thr Thr Thr Leu Asn Val Val

100 105 110

Thr Ser His Ser Arg Glu Lys Val Gly Glu Asp Thr Glu Thr Thr Val

115 120 125

Glu Lys Asp Gly Leu Ala Thr Val Thr Leu Val Gly Ile Ile Val Gly

130 135 140

Val Leu Leu Ala Ile Gly Phe

145 150

<210> 12

<211> 140

<212> PRT

<213> 蝙蝠

<400> 12

Met Trp Lys Ala Arg Val Leu Leu Leu Val Trp Gly Ser Ala Leu Leu

1 5 10 15

Trp Ala Pro Ala Gly Gly Ala Ser Thr Val Leu Pro Glu Asp Glu Ala

20 25 30

Thr Thr Ala Ser Met Glu Asn Gly Met Val Thr Pro Gly Val Gly Gly

35 40 45

Asn Thr Met Thr Pro Gly Ala Ser Glu Gln Ser His Lys Pro Val Gly

50 55 60

Phe Thr Ser Gln Val Pro Thr Asn Thr Lys Arg Thr Asp Thr Pro Ile

65 70 75 80

Glu Asp Leu Pro Thr Thr Glu Ser Thr Gly His Ala Gln Glu Glu Thr

85 90 95

Gln Ser Thr Thr Ala Leu Asn Gly Ala Thr Ser His Pro Arg Glu Asp

100 105 110

Thr Gln Thr Thr Gly Ala Lys Asp Gly Phe Ser Thr Gly Thr Leu Ile

115 120 125

Gly Ile Ile Val Gly Val Leu Leu Gly Ile Gly Phe

130 135 140

<210> 13

<211> 148

<212> PRT

<213> 大鼠

<400> 13

Met Trp Thr Ala Pro Val Leu Leu Trp Val Leu Gly Ser Val Trp Phe

1 5 10 15

Trp Asp Ser Ala Gln Gly Gly Ala Ile Gly Ala Leu Glu Asp Asp Leu

20 25 30

Val Thr Pro Gly Pro Gly Asp Asp Met Val Asn Pro Gly Leu Glu Asp

35 40 45

Arg Ile Glu Thr Thr Asp Thr Thr Gly Glu Leu Asp Lys Ser Thr Ala

50 55 60

Lys Ala Pro Leu Val Pro Thr Gln Pro Pro Ile Glu Glu Leu Pro Thr

65 70 75 80

Ser Gly Thr Ser Asp His Asp His Lys Glu His Glu Ser Thr Thr Thr

85 90 95

Val Lys Ala Val Thr Ser His Ser Thr Asp Lys Lys Thr Thr His Ser

100 105 110

Asn Arg Asp Asn Ala Gly Gly Glu Thr Gln Thr Thr Asp Lys Lys Asp

115 120 125

Gly Leu Ala Val Val Thr Leu Val Gly Ile Ile Ile Gly Val Leu Leu

130 135 140

Ala Ile Gly Phe

145

<210> 14

<211> 154

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 14

Met Trp Thr Val Pro Val Leu Phe Trp Val Leu Gly Ser Val Trp Phe

1 5 10 15

Trp Asp Ser Ala Gln Gly Gly Thr Ile Gly Val Asn Glu Asp Asp Ile

20 25 30

Val Thr Pro Gly Thr Gly Asp Gly Met Val Pro Pro Gly Ile Glu Asp

35 40 45

Lys Ile Thr Thr Thr Gly Ala Thr Gly Gly Leu Asn Glu Ser Thr Gly

50 55 60

Lys Ala Pro Leu Val Pro Thr Gln Arg Glu Arg Gly Thr Lys Pro Pro

65 70 75 80

Leu Glu Glu Leu Ser Thr Ser Ala Thr Ser Asp His Asp His Arg Glu

85 90 95

His Glu Ser Thr Thr Thr Val Lys Val Val Thr Ser His Ser Val Asp

100 105 110

Lys Lys Thr Ser His Pro Asn Arg Asp Asn Ala Gly Asp Glu Thr Gln

115 120 125

Thr Thr Asp Lys Lys Asp Gly Leu Pro Val Val Thr Leu Val Gly Ile

130 135 140

Ile Val Gly Val Leu Leu Ala Ile Gly Phe

145 150

<210> 15

<211> 8

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> misc_feature

<222> (3)..(4)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400> 15

Glu Asp Xaa Xaa Val Thr Pro Gly

1 5

<210> 16

<211> 8

<212> PRT

<213> 智人

<400> 16

Glu Asp Asp Thr Glu Thr Thr Gly

1 5

<210> 17

<211> 8

<212> PRT

<213> 智人

<400> 17

Glu Gly Gly Val Ala Met Pro Gly

1 5

<210> 18

<211> 8

<212> PRT

<213> 智人

<400> 18

Glu Asp Asp Val Val Thr Pro Gly

1 5

<210> 19

<211> 7

<212> PRT

<213> 智人

<400> 19

Glu Asp Leu Pro Thr Ser Glu

1 5

Claims (18)

1.一种单克隆抗体或由其功能性片段构成的片段，其特征在于：

其与由序列号1(GIRIEDLPT)所示的氨基酸序列中的至少5个残基序列构成的Aggrus的区域结合。

2.如权利要求1所述的单克隆抗体或由其功能性片段构成的片段，其特征在于：

其由保藏号为NITE P－02070(PG4D1)或NITE P－02071(PG4D2)的杂交瘤产生。

3.如权利要求1所述的单克隆抗体或由其功能性片段构成的片段，其特征在于：

其被嵌合化或人源化。

4.保藏号为NITE P－02070或NITE P－02071的杂交瘤。

5.一种Aggrus－CLEC‐2结合抑制剂，其特征在于：

其包含权利要求1～3中任一项所述的单克隆抗体或由其功能性片段构成的片段。

6.如权利要求5所述的Aggrus－CLEC‐2结合抑制剂，其特征在于：

还包含至少1个识别存在于序列号2(GAEDDVVTPGTSEDRYK)所示区域的表位的单克隆抗体、其嵌合抗体、其人源化抗体和/或由其功能性片段构成的片段。

7.如权利要求6所述的Aggrus－CLEC‐2结合抑制剂，其特征在于：

识别存在于所述序列号2的区域的表位的所述单克隆抗体为P2－0、MS－1、MS－3和/或MS－4。

8.一种药物组合物，其用于抑制血小板凝集、抑制血栓、抑制癌恶化和转移、抗炎症，该药物组合物的特征在于：

包含权利要求1～3中任一项所述的单克隆抗体或由其功能性片段构成的片段。

9.如权利要求8所述的药物组合物，其特征在于：

还包含至少1个识别存在于序列号2(GAEDDVVTPGTSEDRYK)所示区域的表位的单克隆抗体、其嵌合抗体、其人源化抗体和/或由其功能性片段构成的片段。

10.如权利要求9所述的药物组合物，其特征在于：

识别存在于所述序列号2的区域的表位的所述单克隆抗体为P2－0、MS－1、MS－3和/或MS－4。

11.一种用于检测Aggrus表达的检查用试剂，其特征在于：

包含权利要求1～3中任一项所述的单克隆抗体或由其功能性片段构成的片段。

12.一种CLEC‐2的结合所需的与PLAG4结构域重合的Aggrus的区域，其特征在于：

该区域由序列号1(GIRIEDLPT)表示。

13.如权利要求12所述的CLEC‐2的结合所需的与PLAG4结构域重合的Aggrus的区域，其特征在于：

所述氨基酸序列包含序列号3(RIEDL)所示的氨基酸序列。

14.一种Aggrus－CLEC‐2结合抑制剂，其特征在于：

由包含权利要求12或13的区域的肽构成。

15.一种药物组合物，其用于抑制血小板凝集、抑制血栓、抑制癌恶化和转移、抗炎症，该药物组合物的特征在于：

以包含权利要求12或13的区域的肽作为有效成分。

16.一种抑制剂筛选方法，其是CLEC‐2与Aggrus的结合抑制剂的筛选方法，其特征在于：

以向由序列号1(GIRIEDLPT)所示的氨基酸序列中的至少5个残基序列构成的Aggrus表位的结合作为指标。

17.如权利要求16所述的抑制剂筛选方法，其特征在于：

以向序列号3(RIEDL)所示的氨基酸序列的结合作为指标。

18.一种抑制剂筛选方法，其是CLEC‐2与Aggrus的结合抑制剂的筛选方法，其特征在于：

以向序列号4(EDXXTS)所示的氨基酸序列的结合作为指标。