CN112063608B

CN112063608B - 一种脂肪酸光脱羧酶突变体及其在l-草铵膦合成中的应用

Info

Publication number: CN112063608B
Application number: CN202010874756.4A
Authority: CN
Inventors: 薛亚平; 程峰; 吴冬阳; 李举谋; 郑裕国
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2020-08-27
Filing date: 2020-08-27
Publication date: 2022-06-17
Anticipated expiration: 2040-08-27
Also published as: CN112063608A

Abstract

本发明公开了一种脂肪酸光脱羧酶突变体及其在L‑草铵膦合成中的应用，该脂肪酸光脱羧酶突变体为将SEQ ID No.2所示氨基酸第402位甘氨酸突变为苯丙氨酸；或者，第402位突变的同时第370位苏氨酸突变为精氨酸；或者，第402位突变、第370位突变的同时第513位丝氨酸突变为甘氨酸等。本发明利用定点饱和突变技术脂肪酸光脱羧酶基因进行突变，发现第370位、第371位、第402位、第513位、第514位是影响酶活和立体选择性的关键位点，获得酶活和ee值远高于母本脂肪酸光脱羧酶的突变体，最高的转化率为50％，产物ee值为96％。

Description

一种脂肪酸光脱羧酶突变体及其在L-草铵膦合成中的应用

技术领域

本发明涉及L-草铵膦生产技术领域，主要涉及一种脂肪酸光脱羧酶突变体及其在L-草铵膦合成中的应用。

背景技术

草铵膦，也称草丁膦，英文名为：Phosphinothricin(简称PPT)，化学名为2-氨基-4-[羟基(甲基)膦酰基]-丁酸。草铵膦是一种内吸传导型除草剂，具有广谱杀草活性。除草剂用途广泛，国内外市场巨大，草铵膦为三大除草剂之一，近几年由于其作用机理和转基因技术，其市场份额有望进一步突破。

现在市场中的草铵膦主要为外消旋体。草铵膦有两种光学异构体：L-草铵膦和D-草铵膦。但只有L-草铵膦具有除草活性，是外消旋草铵膦的两倍，而且对人和动物的毒性较小，对环境影响小。但是，现在大规模生产的商品化草铵膦都是外消旋混合物的形式。外消旋草铵膦的使用，浪费巨大，而且对环境影响较为严重。为了减轻环保压力，减低生产成本，探索一条具有工业化应用前景的拆分外消旋草铵膦的生产路线具有重要的市场前景和社会意义。

目前，L-PPT的工业合成涉及通过化学合成或生物酶法进行不对称合成和外消旋拆分。然而，不对称合成方法通常需要昂贵的手性试剂，辅因子NADP⁺，酮酸底物或苛刻的反应过程，这些过程不符合“绿色化学”的标准。与不对称合成相比，外消旋拆分，尤其是酶促拆分是工业领域生产光学纯L-PPT的主要方法。

生物酶法拆分一般是通过化学合成外消旋D,L-草铵膦或其衍生物，再利用特定的酶选择性催化某一构型的反应，获得其中一个光学异构体，未反应的另一个异构体衍生物经过分离、消旋后，再进行酶催化反应，其理论产率可达100％；但酶法拆分也面临着复杂的工艺或生产纯化等关键问题。

发明内容

本发明的目的在于针对现有脂肪酸光脱羧酶对D,L-PPT酶法拆分制备L-PPT活性不高和底物浓度低的问题，提供一种立体选择性脂肪酸光脱羧酶突变体以及利用该脂肪酸光脱羧酶突变体基因的重组菌及其粗酶液作为生物催化剂制备L-草铵膦的方法；该突变体具有高酶活的特点，可高效催化D,L-PPT制备L-草铵膦。

具体技术方案如下：

本发明提供了一种脂肪酸光脱羧酶突变体，所述脂肪酸光脱羧酶突变体为下列之一：

(1)将SEQ ID No.2所示氨基酸第402位甘氨酸突变为苯丙氨酸；

(2)将SEQ ID No.2所示氨基酸第402位甘氨酸突变为苯丙氨酸，且第513位丝氨酸突变为甘氨酸；

(3)将SEQ ID No.2所示氨基酸第402位甘氨酸突变为苯丙氨酸，且第514位丝氨酸突变为甘氨酸；

(4)将SEQ ID No.2所示氨基酸第402位甘氨酸突变为苯丙氨酸，且第370位苏氨酸突变为精氨酸；

(5)将SEQ ID No.2所示氨基酸第402位甘氨酸突变为苯丙氨酸，且第371位甘氨酸突变为异亮氨酸；

(6)将SEQ ID No.2所示氨基酸第402位甘氨酸突变为苯丙氨酸，第370位苏氨酸突变为精氨酸，且第513位丝氨酸突变为甘氨酸。

作为优选，所述脂肪酸光脱羧酶突变体由SEQ ID No.2所示氨基酸的第402位甘氨酸突变为苯丙氨酸，第370位苏氨酸突变为精氨酸，且第513位丝氨酸突变为甘氨酸而获得。

本发明野生型脂肪酸光脱羧酶来自单细胞光合绿色微藻小球藻NC64A(CvFAP)(D.Sorigué,B.Légeret,S.Cuiné,S.Blangy,S.Moulin,E.Billon,P.Richaud,S.Brugière,Y.Couté,D.Nurizzo,P.Müller,K.Brettel,D.Pignol,P.Arnoux,Y.Li-Beisson,G.Peltierand F.Beisson,Science,2017,357,903.)。本发明首次提出将该脂肪酸光脱羧酶的突变体用于PPT的动力学拆分；这种光依赖的CvFAP催化PPT的动力学拆分，无需任何底物制备，并且由于Cn-1烷烃和L-PPT的性质差别大，与其他酶促反应相比，L-PPT更易于纯化。

本发明还提供了所述脂肪酸光脱羧酶突变体的编码基因。

本发明还提供了包含所述编码基因的重组载体和基因工程菌；其中，重组表达载体优选pET28b，宿主细胞优选大肠杆菌E.coli BL21(DE3)；该基因工程菌通过蛋白诱导表达、细胞破碎获得粗酶液，催化特性均优于母本脂肪酸光脱羧酶。

本发明还提供了所述的脂肪酸光脱羧酶突变体在催化D,L-草铵膦溶液中D-草铵膦脱羧制备光学纯L-草铵膦中的应用。

本发明还提供了所述的基因工程菌在催化D,L-草铵膦溶液中D-草铵膦脱羧制备光学纯L-草铵膦中的应用。

本发明还提供了一种酶法拆分D,L-草铵膦制备L-草铵膦的方法，该方法包括：蓝光照射下，以D,L-草铵膦为底物，烷烃溶液为辅助底物，在催化剂的作用下，进行反应，得到光学纯L-草铵膦；

所述催化剂为脂肪酸光脱羧酶突变体或包含脂肪酸光脱羧酶突变体基因的基因工程菌或其粗酶液。

具体地，所述催化剂的制备方法为对含脂肪酸光脱羧酶突变体基因的基因工程菌进行诱导培养，得到湿菌体，用磷酸盐缓冲液重悬后，超声破碎，得到作为催化剂的粗酶液。

具体地，所述湿菌体按如下方法制备：将含脂肪酸光脱羧酶突变体基因的重组基因工程菌接种到卡纳霉素的LB液体培养基中培养，以再将重组基因工程菌接种到新鲜的卡纳霉素的LB液体培养基中，培养后，再向培养液中加入IPTG，培养后，离心，获得含脂肪酸光脱羧酶的湿菌体；所述含葡萄糖脱氢酶基因的工程菌经诱导培养获得的湿菌体制备方法同含脂肪酸光脱羧酶基因的湿菌体。

进一步地，反应体系中，脂肪酸光脱羧酶的添加量为10～50g/L，底物的初始浓度为1～10g/L。

进一步地，所述反应的温度为25～27℃，时间为12～18小时；反应体系的pH值为6～8。

本发明所述脂肪酸光脱羧酶突变体的获取是采用定点饱和突变技术，使用该技术对SEQ ID No.1所示的脂肪酸光脱羧酶基因进行突变，将获得的突变质粒以热击方式转入E.coli BL21(DE3)感受态细胞，对获得菌株进行接种、转接、诱导、菌体回收，利用粗酶液催化制备光学纯L-草铵膦。

具体方法如下：第一步将原始菌活化，获得了母本E.coli BL21(DE3)pET28b-CvFAP，提取质粒pET28b-CvFAP，并保存待用。第二步通过SWISS-MODEL与CvFAP比较，获得同源建模的模板蛋白晶体结构，利用Modeller 9.14同源建模，并进行分子对接，选择合适的突变位点，选点主要是活性通道附近获得活性口袋附件的氨基酸残基，设计突变的引物，以pET28b-CvFAP为模板质粒，进行突变PCR，获得突变质粒，并转化，进行优势突变菌的筛选，将优势突变体送序检测并保存。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明利用定点饱和突变技术对SEQ ID No.1所示的脂肪酸光脱羧酶基因进行突变，发现第370位、第371位、第402位、第513位、第514位是影响酶活和立体选择性的关键位点，获得酶活和ee值远高于母本脂肪酸光脱羧酶的突变体。

(2)本发明提供的L-草铵膦制备方法能够直接以D,L-草铵膦为底物进行拆分，无需昂贵的拆分试剂，也无需合成草铵膦衍生物；在突变体CvFAP-T370R-G402F-S513G的作用下，最高的转化率为50％，产物ee值为96％，具有较好的应用价值。

附图说明

图1为利用脂肪酸光脱羧酶制备L-草铵膦的反应示意图。

图2为脂肪酸光脱羧酶突变体CvFAP-T370R、CvFAP-T370R-G402F、CvFAP-T370R-G402F-S513G诱导和未诱导的SDS-PAGE电泳图；

其中，M：标准蛋白分子量；WT：野生型；G:G402F突变体；TG：T370R/G402F突变体；TGS：T370R/G402F/S513G突变体；X+I：加人IPTG(X＝WT，G，TG，TGS)。

图3为实施例4中的反应装置图。

图4为实施例4中的产物质谱图，A为¹H-NMR，B为¹³C-NMR。

图5为实施例5中的反应进程图，WT和T370R/G402F/S513G突变体催化的脱羧过程曲线。(■)代表转换，(▼)代表e.e值。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步描述，以下列举的仅是本发明的具体实施例，但本发明的保护范围不仅限于此。

实施例1

1、脂肪酸光脱羧酶突变体文库的构建及筛选

将脂肪酸光脱羧酶基因(氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示)构建表达载体pET28b-CvFAP，转化大肠杆菌，获得出发菌株E.coli BL21(DE3)/pET28b-CvFAP。

脂肪酸光脱羧酶突变体文库的制备通过3轮定点饱和突变来实现，引物设计如表1。

第一轮，以载体pET28b-CvFAP为模板，以表1中定点饱和突变引物G402NYT-F和G402NYT-R为引物，经饱和突变PCR，将SEQ ID No.2所示的脂肪酸光脱羧酶氨基酸序列的第402苏氨酸突变为丙氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸和缬氨酸中的一种，并转化，涂平板，通过优势菌株筛选，获得脂肪酸光脱羧酶突变体CvFAP-G402F。

第二轮，以氨基酸序列SEQ ID No.3对应的突变体CvFAP-G402F为模板，以表1中定点突变引物T370R-F和T370R-R为引物，经PCR，转化，涂平板，获得脂肪酸光脱羧酶突变体CvFAP-G402F-T370R。

第三轮，以突变体CvFAP-G402F-T370R为模板，以表1中定点饱和突变引物S513G-F和S513G-R为引物，经PCR，转化，涂平板，获得脂肪酸光脱羧酶突变体CvFAP-G402F-T370R-S513G。其他优势菌引物设计也如表中所示。

表1脂肪酸光脱羧酶定点突变引物设计

突变PCR体系(100μL)为：2倍Phanta Max缓冲液25μL，dNTPs 1μL，突变上下引物各1μL，模板1μL，Phanta Super-Fidelity DNA聚合酶1μL，补ddH₂O至50μL。

PCR条件为：95℃预变性5分钟，经30个循环：90℃30秒，62℃30秒，72℃7分钟，最后72℃终延伸10分钟。

PCR结果分别进行DNA琼脂糖凝胶电泳阳性验证，将PCR产物进行Dpn I酶消化模板，37℃，15分钟，160转/分钟，37℃，用纯化试剂盒纯化，将PCR产物热击转化，并将大肠杆菌E.coli BL21(DE3)活化，置于37℃、160转/分钟，培养1小时，涂布于含50μg/mL卡那霉素抗性的LB平板上，37℃倒置培养过夜。

对获得的突变体进行优势突变体的筛选，筛选条件如下：

10g DCW/L脂肪酸光脱羧酶突变细胞，加入pH 7.0的PBS(100mM)重悬细胞，在冰水混合物上破碎10min(超声破碎条件：功率400W，破1s，停1s)，获得粗酶液，30℃、150转/分钟蓝光照射条件下进行反应，反应结束，取样检测L-草铵膦浓度，筛选获得优势菌株。将获得优势菌株送杭州擎科生物技术有限公司测序，并保存。

2、脂肪酸光脱羧酶母本、突变体的诱导表达

将实施例1第一步的出发菌株E.coli BL21(DE3)/pET28b-CvFAP接种到含有终浓度50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养8小时，以体积分数2％(v/v)接种到新鲜的含有终浓度50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、180转/分钟培养2小时，再向培养液中加入终浓度为0.1mM IPTG，28℃培养14小时后，4℃、8000转/分钟离心10分钟，获得相应的湿菌体细胞。以上获得的细胞产有相应的蛋白，可用于蛋白纯酶液的制备，也可用于粗酶液催化酶法拆分外消旋草铵膦获得L-PPT。

3、突变文库筛选

将诱导表达的突变株湿菌体，按照菌体总量50g/L的量加入pH 7.5、100mM磷酸盐缓冲液中重悬，在冰水混合物上超声破碎10分钟，超声破碎条件：功率为400W，破碎1秒、暂停1秒，获得突变株粗酶液。同样条件下，用出发菌株替换突变菌株湿菌体制备出发株粗酶液。

将60mmol D/L-PPT溶解在1L pH 8.5磷酸盐缓冲液(100mM)中，作为原始溶液存储在-4℃下。将300μL原始溶液添加到500μL实施例2中不同突变体的粗酶溶液中(1g湿细胞在10mL pH 8.5中，100mM磷酸盐缓冲液)，使用pH 8.5磷酸盐缓冲液提供至1.0mL。将混合物在蓝光照射下于800rpm于27℃摇动大约10h，然后通过添加10μL6 M HCl终止反应。HPLC检测产物浓度，筛选优势突变体，实验结果示于表2。

高效液相色谱(HPLC)使用带有C18色谱柱的U3000(Unit C 18，5μm，100A，4.6mm×250mm)进行。浓度和e.e.值测定用邻苯二甲醛(OPA)和N-乙酰基-L-半胱氨酸(NAC)4衍生5分钟后，在荧光波长λEx＝340nm，λEm＝450nm处测定D，L-PPT的分子量。柱温和流动相流速分别设置为30℃和1.0mL/min。流动相(pH＝3.7)为50mM乙酸铵与10％(V/V)甲醇的混合物。

表2 CvFAP及其突变体的催化性能和立体选择性

由表2可知，用具有较大侧链的残基替代G402会带来活性的显著提高。值得注意的是，G402F在D-PPT中也表现出中等的对映体偏好(ee＝67％)。因此，选择G402F作为进一步的模板以提高其立体选择性。在G402F突变的基础上，四个双突变体表现出不同的立体选择性(ee＝68％-85％)，两个重要的双突变体G462F/S573G和G462F/T430R显示出活性降低(分别为21％和16％)。当我们进一步结合两个位点时，CvFAP的立体选择性高达95％，活性降低至78％。

实施例2脂肪酸光脱羧酶突变体CvFAP-G402F-T370R-S513G菌株全细胞催化外消旋草铵膦中的D-草铵膦脱羧制备L-草铵膦

使用CvFAP-G402F/T370R/S513G突变体以克为单位生产光学纯L-PPT，在25℃，总体积50mL pH 6、100mM磷酸盐缓冲液，10μL 100mM烷烃分子溶液，25mL CvFAP粗酶溶液(0.25g湿细胞在10mL pH 8.5、100mM磷酸盐缓冲液中)及其溶液中进行D/L-PPT反应的光生物催化脱羧。将100mg D/L-PPT添加到透明玻璃烧杯中(总体积为100mL)。在轻柔的磁力搅拌下，将烧杯暴露于蓝色LED灯下。12h后，取出等分试样进行测定确定转化率和e.e值。

将0.1g D/L-PPT溶解在pH 6磷酸盐缓冲液(100mM)中，在蓝光下脱羧，在12h后，转化率为50，e.e值为96％。产物已通过NMR分析证实：1H NMR(500MHz，D2O)δ3.88(t，J＝6.1Hz，1H)，2.29–1.90(m，2H)，1.81–1.51(m，2H)，1.27(d，J＝13.8Hz，3H)；13C NMR(126MHz，D2O)δ175.18(s)，56.55(d，J＝15.6Hz)，28.68(d，J＝91.9Hz)，26.03(d，J＝2.3Hz)，16.86(d，J＝93.0Hz)。

实施例3脂肪酸光脱羧酶突变体CvFAP-G402F-T370R-S513G菌株全细胞催化外消旋草铵膦中的D-草铵膦脱羧制备L-草铵膦

使用CvFAP-G402F/T370R/S513G突变体以克为单位生产光学纯L-PPT，在25℃，总体积50mL pH 7、100mM磷酸盐缓冲液，10μL 100mM烷烃分子溶液，25mL CvFAP粗酶溶液(0.75g湿细胞在10mL pH 7、100mM磷酸盐缓冲液中)及其溶液中进行D/L-PPT反应的光生物催化脱羧。将500mg D/L-PPT添加到透明玻璃烧杯中(总体积为100mL)。在轻柔的磁力搅拌下，将烧杯暴露于蓝色LED灯下。16h后，取出等分试样进行测定确定转化率和e.e值。

将0.5g D/L-PPT溶解在pH 7磷酸盐缓冲液(100mM)中，在蓝光下脱羧，在16h后，转化率为50，e.e值为96％。

实施例4脂肪酸光脱羧酶突变体CvFAP-G402F-T370R-S513G菌株全细胞催化外消旋草铵膦中的D-草铵膦脱羧制备L-草铵膦

使用CvFAP-G402F/T370R/S513G突变体以克为单位生产光学纯L-PPT，在25℃，总体积50mL pH 8、100mM磷酸盐缓冲液，10μL 100mM烷烃分子溶液，25mL CvFAP粗酶溶液(1.25g湿细胞在10mL pH 8、100mM磷酸盐缓冲液中)及其溶液中进行D/L-PPT反应的光生物催化脱羧。将1g D/L-PPT添加到透明玻璃烧杯中(总体积为100mL)。在轻柔的磁力搅拌下，将烧杯暴露于蓝色LED灯下。18h后，取出等分试样进行测定确定转化率和e.e值。

将1g D/L-PPT溶解在pH 8磷酸盐缓冲液(100mM)中，在蓝光下脱羧，在18h后，转化率为50，e.e值为96％。

序列表

<110> 浙江工业大学

<120> 一种脂肪酸光脱羧酶突变体及其在L-草铵膦合成中的应用

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1782

<212> DNA

<213> 小球藻(Chlorella vulgaris)

<400> 1

atggcgtctg ccgttgaaga catccgtaaa gtcctgtccg attcttcgtc tccggtggcg 60

ggtcagaaat atgactacat cctggttggc ggtggcaccg cggcgtgcgt gctggcaaac 120

cgtctgagcg ctgacggttc caaacgtgta ctggttctgg aagcaggccc ggataacacc 180

tcccgcgacg ttaagattcc ggcggcgatc acccgcctgt tccgctcccc gctggactgg 240

aacctgttct ctgaactgca ggaacagctt gcggaacgtc agatctacat ggcgcgtggc 300

cgtctgctgg gcggttccag cgcgactaac gccactctgt accaccgtgg tgcggcgggt 360

gattacgacg catggggtgt tgaaggctgg tccagcgaag acgttctgtc ttggttcgtc 420

caggcggaaa ccaacgcgga cttcggtccg ggcgcttatc atggcagcgg cggcccgatg 480

cgtgtggaaa acccgcgtta caccaacaaa cagctgcaca ctgctttctt caaggctgct 540

gaagaagttg gtcttacccc gaactccgat ttcaacgatt ggagccatga ccacgccggt 600

tacggcacct ttcaggtgat gcaggataaa ggcacccgcg cggatatgta ccgtcagtat 660

ctgaaacctg tgctgggtcg tcgcaacctg caggtactga ccggcgctgc agtgaccaaa 720

gtcaacatcg accaggctgc gggcaaagcg caggctctgg gtgttgaatt ctccaccgac 780

ggcccaaccg gcgaacgcct gtctgcggaa ctggctccgg gtggtgaggt catcatgtgc 840

gcaggtgctg ttcacacccc gttcctgctg aaacattccg gcgttggccc gtctgctgag 900

ctgaaagaat tcggcatccc ggttgttagc aacctggctg gtgttggcca gaacctgcag 960

gatcagccgg cgtgcctgac cgcggctccg gttaaagaaa aatacgacgg tattgccatt 1020

tctgatcaca tctacaacga aaaaggccag atccgtaaac gtgcaatcgc atcctacctg 1080

ctgggtggtc gtggcggtct gacttccacc ggttgcgatc gcggtgcctt cgttcgtacc 1140

gcgggtcagg cgctgccgga cctgcaggtt cgcttcgttc caggtatggc gctggacccg 1200

gacggtgtta gcacctacgt tcgttttgct aaattccaga gccagggtct gaaatggccg 1260

agcggcatca ccatgcagct gatcgcttgc cgtccgcagt ctaccggctc cgtcggtctt 1320

aaatccgctg acccgtttgc gccgccgaaa ctgtcaccag gttacctgac cgacaaagac 1380

ggtgctgatc tggctaccct gcgtaaaggc atccattggg cacgtgatgt tgcgcgtagc 1440

tctgctctgt ccgaatacct ggatggtgag ctgttcccag gtagcggcgt tgtttctgat 1500

gatcagatcg atgaatatat ccgtcgttct atccactcgt ccaacgctat cactggcacc 1560

tgtaaaatgg gtaacgcagg tgacagcagc tctgtggtag acaaccagct gcgtgttcac 1620

ggtgttgaag gcctgcgcgt tgttgacgct agcgttgttc cgaaaattcc gggtggtcag 1680

accggtgcgc cggtagttat gatcgctgaa cgcgcagcag ctctgctgac ggggaaagca 1740

accattggtg catctgctgc tgcaccggcg accgtagctg ca 1782

<210> 2

<211> 594

<212> PRT

<213> 小球藻(Chlorella vulgaris)

<400> 2

Met Ala Ser Ala Val Glu Asp Ile Arg Lys Val Leu Ser Asp Ser Ser

1 5 10 15

Ser Pro Val Ala Gly Gln Lys Tyr Asp Tyr Ile Leu Val Gly Gly Gly

20 25 30

Thr Ala Ala Cys Val Leu Ala Asn Arg Leu Ser Ala Asp Gly Ser Lys

35 40 45

Arg Val Leu Val Leu Glu Ala Gly Pro Asp Asn Thr Ser Arg Asp Val

50 55 60

Lys Ile Pro Ala Ala Ile Thr Arg Leu Phe Arg Ser Pro Leu Asp Trp

65 70 75 80

Asn Leu Phe Ser Glu Leu Gln Glu Gln Leu Ala Glu Arg Gln Ile Tyr

85 90 95

Met Ala Arg Gly Arg Leu Leu Gly Gly Ser Ser Ala Thr Asn Ala Thr

100 105 110

Leu Tyr His Arg Gly Ala Ala Gly Asp Tyr Asp Ala Trp Gly Val Glu

115 120 125

Gly Trp Ser Ser Glu Asp Val Leu Ser Trp Phe Val Gln Ala Glu Thr

130 135 140

Asn Ala Asp Phe Gly Pro Gly Ala Tyr His Gly Ser Gly Gly Pro Met

145 150 155 160

Arg Val Glu Asn Pro Arg Tyr Thr Asn Lys Gln Leu His Thr Ala Phe

165 170 175

Phe Lys Ala Ala Glu Glu Val Gly Leu Thr Pro Asn Ser Asp Phe Asn

180 185 190

Asp Trp Ser His Asp His Ala Gly Tyr Gly Thr Phe Gln Val Met Gln

195 200 205

Asp Lys Gly Thr Arg Ala Asp Met Tyr Arg Gln Tyr Leu Lys Pro Val

210 215 220

Leu Gly Arg Arg Asn Leu Gln Val Leu Thr Gly Ala Ala Val Thr Lys

225 230 235 240

Val Asn Ile Asp Gln Ala Ala Gly Lys Ala Gln Ala Leu Gly Val Glu

245 250 255

Phe Ser Thr Asp Gly Pro Thr Gly Glu Arg Leu Ser Ala Glu Leu Ala

260 265 270

Pro Gly Gly Glu Val Ile Met Cys Ala Gly Ala Val His Thr Pro Phe

275 280 285

Leu Leu Lys His Ser Gly Val Gly Pro Ser Ala Glu Leu Lys Glu Phe

290 295 300

Gly Ile Pro Val Val Ser Asn Leu Ala Gly Val Gly Gln Asn Leu Gln

305 310 315 320

Asp Gln Pro Ala Cys Leu Thr Ala Ala Pro Val Lys Glu Lys Tyr Asp

325 330 335

Gly Ile Ala Ile Ser Asp His Ile Tyr Asn Glu Lys Gly Gln Ile Arg

340 345 350

Lys Arg Ala Ile Ala Ser Tyr Leu Leu Gly Gly Arg Gly Gly Leu Thr

355 360 365

Ser Thr Gly Cys Asp Arg Gly Ala Phe Val Arg Thr Ala Gly Gln Ala

370 375 380

Leu Pro Asp Leu Gln Val Arg Phe Val Pro Gly Met Ala Leu Asp Pro

385 390 395 400

Asp Gly Val Ser Thr Tyr Val Arg Phe Ala Lys Phe Gln Ser Gln Gly

405 410 415

Leu Lys Trp Pro Ser Gly Ile Thr Met Gln Leu Ile Ala Cys Arg Pro

420 425 430

Gln Ser Thr Gly Ser Val Gly Leu Lys Ser Ala Asp Pro Phe Ala Pro

435 440 445

Pro Lys Leu Ser Pro Gly Tyr Leu Thr Asp Lys Asp Gly Ala Asp Leu

450 455 460

Ala Thr Leu Arg Lys Gly Ile His Trp Ala Arg Asp Val Ala Arg Ser

465 470 475 480

Ser Ala Leu Ser Glu Tyr Leu Asp Gly Glu Leu Phe Pro Gly Ser Gly

485 490 495

Val Val Ser Asp Asp Gln Ile Asp Glu Tyr Ile Arg Arg Ser Ile His

500 505 510

Ser Ser Asn Ala Ile Thr Gly Thr Cys Lys Met Gly Asn Ala Gly Asp

515 520 525

Ser Ser Ser Val Val Asp Asn Gln Leu Arg Val His Gly Val Glu Gly

530 535 540

Leu Arg Val Val Asp Ala Ser Val Val Pro Lys Ile Pro Gly Gly Gln

545 550 555 560

Thr Gly Ala Pro Val Val Met Ile Ala Glu Arg Ala Ala Ala Leu Leu

565 570 575

Thr Gly Lys Ala Thr Ile Gly Ala Ser Ala Ala Ala Pro Ala Thr Val

580 585 590

Ala Ala

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (10)..(10)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 3

gacccggacn ytgttagcac ctacgtt 27

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (11)..(11)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 4

gtgctaacar ngtccgggtc cagcgccata 30

<210> 5

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 5

tgacttccag aggttgcgat cgcggt 26

<210> 6

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 6

atcgcaacct ctggaagtca gaccgcca 28

<210> 7

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 7

tctatccacg gatccaacgc tatcactg 28

<210> 8

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 8

gcgttggatc cgtggataga acgacgg 27

<210> 9

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 9

acttccacca tctgcgatcg cggtgcc 27

<210> 10

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 10

gcgatcgcag atggtggaag tcagacc 27

<210> 11

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 11

atccactcgg gatccaacgc tatcac 26

<210> 12

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 12

agcgttggat ccgtggatag aacgacg 27

Claims

1.一种脂肪酸光脱羧酶突变体，其特征在于，所述脂肪酸光脱羧酶突变体由SEQ IDNo. 2所示氨基酸的第402位甘氨酸突变为苯丙氨酸，第370位苏氨酸突变为精氨酸，且第513位丝氨酸突变为甘氨酸而获得。

2.一种如权利要求1所述的脂肪酸光脱羧酶突变体的编码基因。

3.一种包含权利要求2所述编码基因的重组载体。

4.一种包含权利要求2所述编码基因的基因工程菌。

5.如权利要求1所述的脂肪酸光脱羧酶突变体在催化D,L-草铵膦溶液中D-草铵膦脱羧制备光学纯L-草铵膦中的应用。

6.如权利要求4所述的基因工程菌在催化D,L-草铵膦溶液中D-草铵膦脱羧制备光学纯L-草铵膦中的应用。

7.一种酶法拆分D,L-草铵膦制备L-草铵膦的方法，其特征在于，包括：蓝光照射下，以D,L-草铵膦为底物，烷烃溶液为辅助底物，在催化剂的作用下，进行反应，得到光学纯L-草铵膦；

所述催化剂为如权利要求1所述的脂肪酸光脱羧酶突变体或包含权利要求1所述的脂肪酸光脱羧酶突变体的基因的基因工程菌或其粗酶液。

8.如权利要求7所述的酶法拆分D,L-草铵膦制备L-草铵膦的方法，其特征在于，反应体系中，脂肪酸光脱羧酶突变体的添加量为10~50 g/L，底物的初始浓度为1~10 g/L。

9.如权利要求7所述的酶法拆分D,L-草铵膦制备L-草铵膦的方法，其特征在于，所述反应的温度为25~27℃，时间为12~18小时；反应体系的pH值为6~8。