CN114480358B - 一种光脱羧酶或其重组酶的应用及一种重组光脱羧酶 - Google Patents

一种光脱羧酶或其重组酶的应用及一种重组光脱羧酶 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种光脱羧酶或其重组酶的应用及一种重组光脱羧酶。本发明涉及的光脱羧酶来源于一株分离自南极洲干藻泥碳的绿微藻菌(Coccomyxa sp.)C‑169，其制备方法简单，可作为催化剂应用于脱羧反应，适用的化合物范围广，具有优异的催化活性，可获得良好转化率、较佳光学纯度的直链烷烃化合物，且反应条件温和、对环境友好，具有很好的工业应用开发前景。

Description

一种光脱羧酶或其重组酶的应用及一种重组光脱羧酶
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种光脱酶或其重组酶在光照(蓝光)条件下催化脂肪酸脱羧以制备燃料烷烃的应用，以及一种重组光脱羧酶。
背景技术
现已报道的来源于海洋小球藻(Chlorella variabilis)NC64A的脂肪酸光脱羧酶CvFAP能在蓝光的驱动下催化脂肪酸脱羧生成少一个碳的链状烷烃，值得注意的是，在目前的研究中，已发现能够在生物体中独立直接利用光能来催化生物化学反应的酶很罕见，而性能类似的非光驱动的脱羧酶也需要额外加入辅因子来驱动反应，因此光脱羧酶的发现给予光生物催化的研究莫大的希望。光脱羧酶CvFAP在催化应用中固然存在着问题，主要有两点，一是固有的特性光致失活，由于脱羧酶CvFAP内含有一个起关键作用的黄素腺嘌呤二核苷酸辅因子FAD，它能捕获蓝光从而驱动脱羧反应的发生，正常日光下对CvFAP进行常规纯化，由于光照以及操作过程中辅因子FAD的丢失，将引起酶失活，因此仅能在黑暗或暗红光下进行纯化操作及储存。二是催化底物谱范围较窄，其脂肪酸结合位点所在的疏水通道较为狭窄，对底物的结构选择性强。
发明内容
本发明中，下文所述的光脱羧酶在NCBI上的分类ID号为:574566，下文简称光脱羧酶CsFAP。
本发明的目的之一在于，提供一种能在蓝光驱动下催化脂肪单酸及脂肪二酸脱羧制备直链烷烃的重组光脱羧酶。
本发明的目的之一在于，提供含有上述光脱羧酶基因的重组表达载体和重组表达转化体；
本发明的目的之一在于，提供一种应用重组光脱羧酶催化脂肪单酸脂肪二酸脱羧的方法。
第一方面，提供一种重组光脱羧酶，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.2所示，其来源于一株分离自南极洲干藻泥碳的绿微藻菌(Coccomyxa sp.)C-169；其碱基序列如序列表中SEQ ID No.1所示；或其编码由序列表中SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。
所述重组光脱羧酶由下述方法制得：培养包含碱基序列如序列表中SEQ ID No.1所示的光脱羧酶基因的表达转化体，即可。
所述的酶基因表达质粒中使用的质粒载体为pET28a(+)。
其中，所述的培养步骤的方法和条件没有特殊限制，可以根据宿主类型和所选培养方法等因素的不同按本领域普通知识进行适当的选择，只要使表达转化体能够生长并产生本发明的光脱羧酶即可，表达质粒转化至宿主微生物中制得的异源表达菌株；所述的宿主微生物为大肠杆菌，较佳的为大肠埃希氏菌(E.coli)BL21(DE3)，具体地，将包含碱基序列如序列表中SEQ ID No.1所示的大肠杆菌接种于含卡那霉素的TB培养基。
对于培养基，本发明优选包括下述成分的培养基：胰蛋白胨12.0g/L，酵母提取物24.0g/L，磷酸氢二钾12.54g/L，磷酸二氢钾2.31g/L，甘油4mL/L，pH 7.2±0.2。
在一些实施例中，培养液的光密度OD600达到0.6-0.8，优选0.70时，在终浓度为0.1-1.0mmol/L，优选0.5mmol/L的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)的诱导下，即可高效表达本发明的光脱羧酶。其中，所述的诱导的时间较佳的为16-20℃，更佳的为17℃。所述的诱导的时间较佳的为12-25h，更佳的为20h。
按上述方法制得本发明的重组光脱羧酶后，可按本领域常规方法收集待用：培养结束后，在4℃，11000g下离心10min，倒去上清液，再用Tris-HCl Buffer(pH8.0，50mM，NaCl100mM)洗涤再离心，重复两次，收集得到的全细胞可置于-80℃保存待用。
本发明第二方面提供第一方面所述表达质粒的制备方法：以现有报道的光脱羧酶基因的保守区域与已知酶基因进行比对，确定具有潜在光脱羧酶活性的酶基因，通过基因合成，合成绿微藻菌(Coccomyxa sp.)C-169中编码光脱羧酶基因SEQ ID No.1所示的序列，之后连接于质粒载体pET28a(+)上得到包含序列表中SEQ ID No.1所示的光脱羧酶基因的表达质粒。
所述的包含碱基序列如序列表中SEQ ID No.1所示的光脱羧酶基因的表达质粒可按下述方法制得：将碱基序列如序列表中SEQ ID No.1所示的光脱羧酶基因连接于质粒载体pET28a(+)上，即可。所述的载体可为本领域常规的各种载体，如市售的质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体等，优选质粒载体pET28a(+)。较佳的，可通过下述方法制得本发明的表达质粒:将碱基序列如序列表中SEQ ID No.1所示的光脱羧酶基因和质粒载体pET28a(+)用限制性内切酶ECORI和HindIII双酶切，然后使用Basic Seamless Cloning and Assembly Kit重组酶试剂盒连接，即可得本发明的表达质粒。
本发明第三方面提供一种光脱羧酶重组表达转化体表达的光脱酶在催化还原脂肪酸为其对应链长的直链烷烃中的应用。
直链烃化合物的制备方法，其包括：在蓝光的照射的条件下，在光脱羧酶的作用下，将作为底物的脂肪酸和脂肪二酸脱羧进行光脱羧反应，制得一系列直链烷烃化合物，
R-X-(CH2)n-Y-COOH→CH3-X-(CH2)n-Y-CH3
其中，n为1-16，R为羧基或烷烃，X和Y为碳碳单键或碳碳双键。
所述的光脱羧反应的各条件可按本领域此类反应的常规条件进行选择，所述的脂肪酸和脂肪二酸类化合物较佳的为碳链长度在C12-C20的脂肪酸和脂肪二酸化合物，在一些实施例中，所述脂肪酸的碳链长度在C16-C18的脂肪酸和脂肪二酸化合物，在反应液中的浓度较佳的为1-15mM，最佳为13.0mM。
按常规方法，所述的光脱羧酶可采用下述形式加入反应体系：将粗酶液直接加入反应体系，或者将悬浮或溶解有冻干细胞或粗酶粉的pH 7-9、优选pH8.5的缓冲液加入反应体系。
在一些实施例中，所述的缓冲液种类可为本领域常用的各种缓冲液，优选Tris-HCl缓冲液。所述的缓冲液的浓度可为50-100mM。本发明优选pH 8.5、100mM的Tris-HCl缓冲液。所述的光脱羧酶的量为催化有效量以上，一般为0.30g/mL，优选0.20-0.30g/mL。
所述的光脱羧反应的温度一般为20-40℃，优选25-35℃。所述的光脱羧反应的时间以反应完全为准，所述的含还原酶或重组酶基因的全细胞的用量为0.30g/mL；所述的Tris-HCl缓冲液浓度为100mM，pH为8.5；所述的光脱羧反应的温度为30℃；所述的光脱羧反应的时间为反应完全为准，一般为6-12小时。
所述的光脱羧反应的溶剂体系可为通常的缓液体系，光脱羧反应结束后，可按照本领域常规方法从反应液中提取不同链长的直链烷烃化合物。
本发明取得如下有益技术效果：
本发明挖掘出的CsFAP同样具有独立利用光能进行生物催化的性能，能够利用蓝光将脂肪酸与脂肪二酸转化为相应的烷烃，无需加入额外的辅因子，也可省略繁琐的纯化过程，直接使用全细胞的形式进行催化反应，避免光致失活。
附图说明
图1为实施例1中重组表达光脱羧酶CsFAP质粒pET28a-CsFAP的质粒构建示意图。
图2为实施例1中CsFAP基因片段及实施例3中载体质粒pET28a经EcoRI和HindIII双酶切后的线性载体片段示意图。
图3为实施例2中重组表达光脱羧酶CsFAP粗酶液的SDS-PAGE电泳图。
图4为实施例2中纯化后的重组表达光脱羧酶CsFAP的SDS-PAGE电泳图。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实施1大肠埃希氏菌(E.coli)BL21(DE3)/pET28a(+)-CsFAP的构建
1.表达质粒pET28a(+)-CsFAP的制备
如序列表中SEQ ID No.1所示的光脱羧酶基因的碱基序列是由华大基因生物技术公司以序列表SEQ ID No.2的氨基酸序列经优化密码子后得到，并以ECORI和HindIII为酶切位点，组装插入pET28a(+)载体，构建pET28a(+)-CsFAP表达质粒。
2.大肠埃希氏菌(E.coli)BL21(DE3)/pET28a(+)-CsFAP的构建
将重组表达质粒pET28a(+)-CsFAP转入大肠埃希氏菌(E.coli)DH5α感受态细胞中，在含有卡那霉素的抗性平板上对阳性重组体进行筛选，挑取单克隆，培养重组菌，代质粒扩增后提取质粒，重新转化至大肠埃希氏菌(E.coli)BL21(DE3)感受态中，即获得重组表达转化体大肠埃希氏菌(E.coli)BL21(DE3)pET28a(+)-CsFAP，单菌落经PCR验证阳性。
实施例2光脱羧酶CsFAP的制备
将实施例1中所得的大肠埃希氏菌(E.coli)BL21(DE3)pET28a(+)-CsFAP接种于含卡那霉素(终浓度50mg/L)的TB培养基(胰蛋白胨12.0g/L，酵母提取物24.0g/L，磷酸氢二钾12.54g/L，磷酸二氢钾2.31g/L，甘油4mL/L，pH7.2±0.2L)中，37℃震荡培养过夜。再按2％(v/v)的接种量将种子液接种到装有250mL相同的LB培养基的的1L锥形瓶中，置37℃、200rpm摇床培养，当培养液的OD600达到0.6-0.8时，加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG作为诱导剂，17℃诱导20h。
将所得培养液11000×g，4℃，10min离心去上清，收集湿细胞。取部分湿细胞用Tris-HCl缓冲液(50mM,pH8.0,100mM NaCl)洗涤两次，冷冻干燥，即得冻干细胞，备用。另取部分湿细胞悬浮于pH 8.0、50mM的Tris-HCl缓冲液中得悬浮液，在冰浴中超声破碎，离心收集上清液，即为光脱羧酶的粗酶液。粗酶液经SDS-PAGE电泳图分析(图1)，蛋白部分以可溶性形式存在。
实施例3光脱羧酶CsFAP催化脂肪酸及脂肪二酸脱羧反应
在1.0mL Tris-HCl缓冲液(100mM、pH 8.5)中加入13.0mM表1所示的底物和0.30g/mL的CsFAP湿细胞，30℃，100rpm磁力搅拌反应12h。反应结束后加入两倍体积的乙酸乙酯萃取，经充分震荡混匀，离心，取上清液通过气相色谱(毛细管柱CP Sil 5CB)分析产物产率，结果如表1所示。
产物产率的检测方法如下：
实施例4使用气相色谱(毛细管柱CP Sil 5CB)分析底物的转化率，载气氮气，进样口温度280℃，检测器FID温度280℃。其他条件如下：
程序升温条件
表1：光脱羧酶CsFAP催化脂肪酸和脂肪二酸的反应结果
SEQUENCE LISTING
<110> 中山大学
<120> 一种光脱羧酶或其重组酶的应用及一种重组光脱羧酶
<130> NA
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1743
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atgcaccacc accaccacca cgcgccagca gctgacaaat atgacttcat tctggtaggt 60
ggtggtaccg caggctgtgt tctggcgaac cgtctgaccg ctgatggctc caagaaggta 120
ctgctgctgg aggctggcgg tgctaacaaa gcccgcgagg ttcgcactcc ggctggtctg 180
ccgcgcctgt tcaagagcgc cctggactgg aacctgtaca gctctctgca gcaggccgct 240
agcgaccgtt ccatctatct ggctcgtggc aaactgctgg gtggctctag cgcgactaac 300
gcgactctgt atcaccgtgg caccgcagca gactacgacg catggggcgt tccgggctgg 360
acctcccagg acgcgctgcg ttggttcatc caggcggaaa ataactgtcg cggtatcgag 420
gacggtgtac acggcactgg cggtctgatg cgcgttgaga acccgcgtta taacaacccg 480
ctgcacgagg ttttcttcca ggctgctaag caggcaggtc tgccggaaaa cgataacttc 540
aacaactggg gccgttccca agcgggctac ggtgagttcc aggtgactca ttctaaaggt 600
gagcgtgcag actgctttcg tatgtatctg gagccggtaa tgggccgctc taacctgact 660
gtactgactg gtgccaaaac tctgaagatc gaaaccgaaa agtccggcgg tgcgactgtt 720
tctcgtggcg ttactttcca agtaaacggc caggacggct ctaaacatag cgcggagctg 780
gcggctggtg gtgaagtagt gctgtgcgca ggcagcatcc attctccgca gatcctgcag 840
ctgtctggta tcggtccaca ggcggagctg cgctctaaag acattccggt tgtggcggat 900
ctgccgggtg taggccagaa catgcaggat cacccggcgt gcctgtctgc tttctacctg 960
aaagaaagcg ccggtccgat tagcgttacc gacgaactgc tgcatactaa cggtcgtatc 1020
cgtgcccgtg ctatcctgaa atatctgctg tttaagaagg gtccactggc taccactggt 1080
tgtgaccacg gtgcattcgt taagactgcc ggtcagtccg agccggacct gcagatccgt 1140
ttcgtgccgg gcctggcgct ggacccggac ggtattggtt cctacaccgc cttcggtaag 1200
atgaaagacc agaaatggcc gtctggtatc actttccagc tgctgggtgt tcgtccaaaa 1260
tctcgcggtt ctgttggcct gcgctccgac gatccgtggg atgcaccgaa actggacatt 1320
ggtttcctga ccgataaaga gggcgctgac ctggctactc tgcgttccgg tattaagctg 1380
tctcgtgaaa tcgcggctga accggcgttc ggcgcctatg tgggtaacga actgcaccca 1440
ggtgcggcag caagctccga ctctgctatt gatagcttca ttcgtgacac tgttcactct 1500
ggtaacgcga acgtgggtac ttgtagcatg ggtgtgaacg gcaacgcggt tgttgacccg 1560
tctctgcgcg tatttggcat tcgtggtctg cgcgttgctg acgcgagcgt tatcccggta 1620
attccgggtg gtcagactgg cgcagccact gttatggttg cggagcgtgc cgcagaaatc 1680
ctgctgggca gcaaccagaa acagccggca gcagctgttc cggcagcgca gccggccctg 1740
gct 1743
<210> 2
<211> 581
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Met His His His His His His Ala Pro Ala Ala Asp Lys Tyr Asp Phe
1 5 10 15
Ile Leu Val Gly Gly Gly Thr Ala Gly Cys Val Leu Ala Asn Arg Leu
20 25 30
Thr Ala Asp Gly Ser Lys Lys Val Leu Leu Leu Glu Ala Gly Gly Ala
35 40 45
Asn Lys Ala Arg Glu Val Arg Thr Pro Ala Gly Leu Pro Arg Leu Phe
50 55 60
Lys Ser Ala Leu Asp Trp Asn Leu Tyr Ser Ser Leu Gln Gln Ala Ala
65 70 75 80
Ser Asp Arg Ser Ile Tyr Leu Ala Arg Gly Lys Leu Leu Gly Gly Ser
85 90 95
Ser Ala Thr Asn Ala Thr Leu Tyr His Arg Gly Thr Ala Ala Asp Tyr
100 105 110
Asp Ala Trp Gly Val Pro Gly Trp Thr Ser Gln Asp Ala Leu Arg Trp
115 120 125
Phe Ile Gln Ala Glu Asn Asn Cys Arg Gly Ile Glu Asp Gly Val His
130 135 140
Gly Thr Gly Gly Leu Met Arg Val Glu Asn Pro Arg Tyr Asn Asn Pro
145 150 155 160
Leu His Glu Val Phe Phe Gln Ala Ala Lys Gln Ala Gly Leu Pro Glu
165 170 175
Asn Asp Asn Phe Asn Asn Trp Gly Arg Ser Gln Ala Gly Tyr Gly Glu
180 185 190
Phe Gln Val Thr His Ser Lys Gly Glu Arg Ala Asp Cys Phe Arg Met
195 200 205
Tyr Leu Glu Pro Val Met Gly Arg Ser Asn Leu Thr Val Leu Thr Gly
210 215 220
Ala Lys Thr Leu Lys Ile Glu Thr Glu Lys Ser Gly Gly Ala Thr Val
225 230 235 240
Ser Arg Gly Val Thr Phe Gln Val Asn Gly Gln Asp Gly Ser Lys His
245 250 255
Ser Ala Glu Leu Ala Ala Gly Gly Glu Val Val Leu Cys Ala Gly Ser
260 265 270
Ile His Ser Pro Gln Ile Leu Gln Leu Ser Gly Ile Gly Pro Gln Ala
275 280 285
Glu Leu Arg Ser Lys Asp Ile Pro Val Val Ala Asp Leu Pro Gly Val
290 295 300
Gly Gln Asn Met Gln Asp His Pro Ala Cys Leu Ser Ala Phe Tyr Leu
305 310 315 320
Lys Glu Ser Ala Gly Pro Ile Ser Val Thr Asp Glu Leu Leu His Thr
325 330 335
Asn Gly Arg Ile Arg Ala Arg Ala Ile Leu Lys Tyr Leu Leu Phe Lys
340 345 350
Lys Gly Pro Leu Ala Thr Thr Gly Cys Asp His Gly Ala Phe Val Lys
355 360 365
Thr Ala Gly Gln Ser Glu Pro Asp Leu Gln Ile Arg Phe Val Pro Gly
370 375 380
Leu Ala Leu Asp Pro Asp Gly Ile Gly Ser Tyr Thr Ala Phe Gly Lys
385 390 395 400
Met Lys Asp Gln Lys Trp Pro Ser Gly Ile Thr Phe Gln Leu Leu Gly
405 410 415
Val Arg Pro Lys Ser Arg Gly Ser Val Gly Leu Arg Ser Asp Asp Pro
420 425 430
Trp Asp Ala Pro Lys Leu Asp Ile Gly Phe Leu Thr Asp Lys Glu Gly
435 440 445
Ala Asp Leu Ala Thr Leu Arg Ser Gly Ile Lys Leu Ser Arg Glu Ile
450 455 460
Ala Ala Glu Pro Ala Phe Gly Ala Tyr Val Gly Asn Glu Leu His Pro
465 470 475 480
Gly Ala Ala Ala Ser Ser Asp Ser Ala Ile Asp Ser Phe Ile Arg Asp
485 490 495
Thr Val His Ser Gly Asn Ala Asn Val Gly Thr Cys Ser Met Gly Val
500 505 510
Asn Gly Asn Ala Val Val Asp Pro Ser Leu Arg Val Phe Gly Ile Arg
515 520 525
Gly Leu Arg Val Ala Asp Ala Ser Val Ile Pro Val Ile Pro Gly Gly
530 535 540
Gln Thr Gly Ala Ala Thr Val Met Val Ala Glu Arg Ala Ala Glu Ile
545 550 555 560
Leu Leu Gly Ser Asn Gln Lys Gln Pro Ala Ala Ala Val Pro Ala Ala
565 570 575
Gln Pro Ala Leu Ala
580

Claims (7)

1.一种重组光脱羧酶，其碱基序列如SEQ ID No.1所示，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，其来源于一株分离自南极洲干藻泥碳的绿微藻菌C-169；
将包含碱基序列如SEQ ID No.1所示的光脱羧酶基因的宿主微生物E.coli BL21大肠杆菌接种于含卡那霉素终浓度50 µg/mL的5mL TB预培养基中培养4-6h，直至菌液OD600达到0.7-1.0，以2%的转接量转接到250mL含有终浓度50 µg/mL的卡那霉素TB培养基，培养至OD600达到0.7时加入0.5mM诱导剂IPTG在17℃进行诱导表达20h即可；其中，培养所用的TB培养基包括下述成分：酵母提取物24g/L、多价蛋白胨12g/L、甘油4mL/L、磷酸氢二钾12.54g/L和磷酸二氢钾2.31g/L，培养温度为30～37℃；培养转速为200rpm转速下进行振荡培养；
所示的重组光脱羧酶基因的表达质粒可按下述方法制得：将碱基序列如SEQ ID No.1所示的重组光脱羧酶基因和质粒载体pET28a(+)用限制性内切酶EcoRI和HindIII双酶切，然后使用Basic Seamless Cloning and Assembly Kit重组酶试剂盒连接，即可获得重组光脱羧酶表达质粒。
2.如权利要求1所述的重组光脱羧酶的制备方法，将包含碱基序列如SEQ ID No.1所示的大肠杆菌接种于含终浓度50 µg/mL卡那霉素的TB培养基后进行诱导培养后，可按下述任一中的方法收集：（1）收集培养液中含表达光脱羧酶基因质粒的细胞，洗涤，晾至稍干，分装至1.5mL或2.0mL灭菌EP管中备用，即得重组光脱羧酶的全细胞；（2）收集培养液中含表达光脱羧酶基因质粒的细胞，洗涤，冷冻干燥，得冻干细胞；（3）将收集的菌体细胞进行低温超声破壁处理，并低温离心获取上清液，即得粗酶液；（4）按方式（3）进行破壁处理后的粗酶液，进行冷冻干燥，得粗酶液粉。
3.如权利要求1所述的重组光脱羧酶在催化还原脂肪酸为其对应链长的直链烷烃中的应用，所述的脂肪酸的碳链长度为C12-C18。
4.一种直链烃化合物的制备方法，其包括：在蓝光的照射的条件下，将权利要求1所述的重组光脱羧酶加入脂肪酸进行光脱羧反应，制得一系列直链烷烃化合物，
R-X-(CH2)n-Y-COOH→CH3-X-(CH2)n-Y-CH3
其中，n为1-16，R为羧基或烷烃，X和Y为碳碳单键或碳碳双键，所述脂肪酸的碳链长度为C12-C18。
5.如权利要求4所述的制备方法，所述脂肪酸在反应液中的浓度为13.0mM。
6.如权利要求4所述的制备方法，所述重组光脱羧酶的量为0.30g/mL。
7.如权利要求4所述制备方法，所述的光脱羧反应的温度为25-35℃。
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