CN114438064B - 厌氧条件下制备含光脱羧酶催化剂及烃类燃料的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种厌氧条件下制备含光脱羧酶催化剂及烃类燃料的方法,其特征在于,该方法包括以下步骤:第一步:将含有光脱羧酶基因的转基因工程菌株进行细胞裂解和酶纯化,在可见光及厌氧条件下进行分装,分别获得含光脱羧酶的破碎细胞和/或粗酶和/或纯酶;第二步:以助溶溶剂配制含脂肪酸的原料;第三步:将含脂肪酸的原料和含光脱羧酶的催化剂添加到反应器中,采用含氧气的惰性气体置换反应器中的空气,封闭反应器;第四步:采用含蓝光的光源照射反应器以启动反应,控制光源光强、反应器温度、pH值和反应时间,催化脂肪酸脱羧得到烃类燃料;本发明通过在厌氧条件下制备含高活性光脱羧酶催化剂,实现光脱羧酶高效催化脂肪酸脱羧制备烃类燃料,可广泛应用于新能源和环保等领域。
Description
技术领域
本发明涉及烃类燃料制备方法技术领域,具体是涉及一种厌氧条件下制备含光脱羧酶催化剂及烃类燃料的方法。
背景技术
为了应对全球温室效应,我国提出2030年前碳达峰、2060年前碳中和的碳减排目标,为此我国大力发展基于可再生能源的电气化。但是,由于电池能量密度低,航空、海运等长途运输还将长期依赖高能量密度的液体燃料。生物基航空煤油是航空煤油的替代品,其碳减排量是石油基航空煤油的90%,它是以生物质如废弃油脂和木质纤维素等可再生资源为原料,主要通过裂解、费托合成、加氢改制制备的。近年来我国餐饮业的迅猛发展,导致废弃油脂产量与日俱增。据统计我国废弃油脂年产量达1000万吨以上,其中不足10%用于生产生物柴油。废弃油脂的不当处理,会污染环境,严重威胁人们的生命健康。废弃油脂主要成分为甘油三酸脂和游离脂肪酸,它可以通过加氢脱氧制备航空煤油。传统的生物基航空煤油合成方法存在能耗高和设备要求高等弊端,如需要昂贵的贵金属(Pd、Pt、Ru、Mo 等)作为催化剂,需要高温(250~360℃)及高氢气分压(20~110bar)。因此,寻找一种绿色的生物基航空煤油制备方法势在必行。
在变异小球藻中新发现的光脱羧酶可以在常温常压下催化脂肪酸脱羧生成烃类,由此光脱羧酶在绿色高效制备生物基航空煤油等方面具有很大潜力。光脱羧酶是一种黄素酶,其在含蓝光的可见光照射下会发生光敏化,产生活性氧自由基,破坏酶活性中心的氨基酸残基。大量研究报道,在含蓝光的可见光下制备的光脱羧酶在0.5~2h内会丧失活性。因此,光脱羧酶的稳定性差、催化效率低等缺点,限制了其在制备新能源方面的工业化应用。如何制备高活性的光脱羧酶以及提高其催化效率一直是学术界和工业界关注的研究热点。
发明内容
本发明旨在提供一种厌氧条件下制备含光脱羧酶催化剂及烃类燃料的方法。
本发明采用如下技术方案:
一种厌氧条件下制备含光脱羧酶催化剂及烃类燃料的方法,其特征在于,该方法包括以下步骤:
第一步:将含有光脱羧酶基因的转基因工程菌株进行细胞裂解和酶纯化,在可见光及厌氧条件下进行分装,分别获得含光脱羧酶的催化剂包括破碎细胞和/或粗酶和/或纯酶;
第二步:以助溶溶剂配制含脂肪酸的原料;
第三步:将含脂肪酸的原料和含光脱羧酶的催化剂添加到反应器中,采用含氧气的惰性气体置换反应器中的空气,封闭反应器;
第四步:采用含蓝光的光源照射反应器以启动反应,控制光源光强、反应温度、pH值和反应时间,催化脂肪酸脱羧得到烃类燃料。
本发明在厌氧条件下制备具有高活性的含光脱羧酶的催化剂,在含蓝光的光源照射下及一定氧气分压下,实现催化脂肪酸脱羧制备烃类燃料。
本发明在厌氧条件下制备的含光脱羧酶催化剂具有高的活性,提高了含光脱羧酶催化剂的制备效率。采用含一定比例氧气的惰性气体置换反应器中的空气,可以提高光脱羧酶的光稳定性,促进脂肪酸脱羧制备烃类燃料的转化效率。
根据本发明所述的厌氧条件下制备含光脱羧酶催化剂及烃类燃料的方法的优选方案,步骤一中的可见光为含蓝光的光源。
根据本发明所述的厌氧条件下制备含光脱羧酶催化剂及烃类燃料的方法的优选方案,步骤一中的厌氧条件为氧气分压是0~20kPa的混合气氛。
根据本发明所述的厌氧条件下制备含光脱羧酶催化剂及烃类燃料的方法的优选方案,步骤一中的分装可持续0~24h。
根据本发明所述的厌氧条件下制备含光脱羧酶催化剂及烃类燃料的方法的优选方案,步骤二中的助溶溶剂为二甲基亚砜和/或醇类。
根据本发明所述的厌氧条件下制备含光脱羧酶催化剂及烃类燃料的方法的优选方案,步骤二中的原料为液态和/或固态。
根据本发明所述的厌氧条件下制备含光脱羧酶催化剂及烃类燃料的方法的优选方案,步骤三中的含光脱羧酶的催化剂为含光脱羧酶的转基因工程菌株全细胞和/或其破碎细胞和/或其粗酶和/或其纯酶。
根据本发明所述的厌氧条件下制备含光脱羧酶催化剂及烃类燃料的方法的优选方案,步骤三中含脂肪酸的原料和含光脱羧酶催化剂按质量比 (5~90):(10~95)添加到反应器中。
根据本发明所述的厌氧条件下制备含光脱羧酶催化剂及烃类燃料的方法的优选方案,步骤三中的反应器具有透光性和密封性。
根据本发明所述的厌氧条件下制备含光脱羧酶催化剂及烃类燃料的方法的优选方案,步骤三中的含氧气的惰性气体中氧气的含量为0~2kPa。
根据本发明所述的厌氧条件下制备含光脱羧酶催化剂及烃类燃料的方法的优选方案,步骤四中的含蓝光的光源光强为10~3000μmol/(m2 ·s)、反应温度为10~40℃、pH为6~9、反应时间为0~24h。
本发明所述的厌氧条件下制备含光脱羧酶催化剂及烃类燃料的方法的有益效果是:
(1)厌氧条件下制备的含光脱羧酶催化剂具有高的活性,提高了含光脱羧酶催化剂的制备效率。
(2)通过调控反应体系中的氧气分压,有助于提高光脱羧酶的光稳定性。
(3)通过优化催化过程中的光强和时间,提高了光脱羧酶催化剂的催化效率,具有更广的应用前景。
(4)利用含光脱羧酶的破碎细胞作为催化剂,提供了一种新型高效的光脱羧酶生物催化剂。
本发明可广泛应用于新能源和环保等领域。
附图说明
图1为实施例一中蓝光照射30min制备的含光脱羧酶破碎细胞的催化效果。
图2为实施例二中蓝光照射60min制备的含光脱羧酶破碎细胞的催化效果。
图3为实施例三中蓝光照射180min制备的含光脱羧酶破碎细胞的催化效果。
图4为实施例四中含光脱羧酶全细胞在不同氧气分压下的催化效果。
图5为实施例五中含光脱羧酶破碎细胞在不同氧气分压下的催化效果。
图6为实施例六中全细胞和破碎细胞在不同光强下的催化效果。
图7为实施例七中全细胞和破碎细胞在不同催化时间下的催化效果。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明做进一步的说明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围,对本发明作各种改动和修改的等效变化和修饰同样落入本发明权利要求所限定的范围。
实施例一
一种厌氧条件下制备含光脱羧酶催化剂及烃类燃料的方法,该方法包括以下步骤:
第一步:将含光脱羧酶基因的质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,获得含光脱羧酶基因的转基因工程菌株;
第二步:将工程菌株接种在含50μg/mL肉汤培养基(TB培养基)中, 37℃培养3-6h,当OD值达到0.7-0.8时,向TB培养基中添加异丙基-β-D- 硫代半乳糖苷,在17℃诱导20h,4℃、4000rpm离心30min,获得含光脱羧酶的全细胞;
第三步:将全细胞按1:(1~50)(m/V)的比例重悬在预冷的三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液中,利用超声波细胞粉碎机将重悬细胞进行裂解,超声条件为200W、开6s/关10s、共10min,可获得破碎细胞;
第四步:在蓝光照射下(光强为200μmol/(m2 s)),将破碎细胞进行分装。对照组是在空气中进行分装,实验组是氧气分压为0~2kPa的惰性气体氛围中进行分装,分装过程持续30min。由此可获得蓝光照射30min后的含光脱羧酶的破碎细胞催化剂。
第五步:将实验组和对照组制备的破碎细胞催化剂分别添加到含54 mM/L棕榈酸的反应体系中。反应体系组成为30%助溶溶剂含180mM棕榈酸和70%光脱羧酶破碎细胞催化剂,混合后添加至透明的反应器中。使用氧气分压为0Pa的惰性气体置换反应器中的空气,封闭反应器并放置于摇床中。采用200μmol/(m2·s)蓝光照射反应器,控制反应温度30℃、pH值 8.0、反应时间3h和摇床转速200rpm。
如图1所示,反应结束后十五烷在对照组和实验组中含量分别为0.2 mM和40.5mM,实验组中棕榈酸的转化率是对照组的202.5倍。
实施例二
一种厌氧条件下制备含光脱羧酶催化剂及烃类燃料的方法,该方法包括以下步骤:
第一步:将含光脱羧酶基因的质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,获得含光脱羧酶基因的转基因工程菌株;
第二步:将工程菌株接种在含50μg/mL肉汤培养基(TB培养基)中, 37℃培养3-6h,当OD值达到0.7-0.8时,向TB培养基中添加异丙基-β-D- 硫代半乳糖苷,在17℃诱导20h,4℃、4000rpm离心30min,可获得含光脱羧酶的全细胞;
第三步:将全细胞按1:(1~50)(m/V)的比例重悬在预冷的三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液中,利用超声波细胞粉碎机将重悬细胞进行裂解,超声条件为200W、开6s/关10s、共10min,可获得破碎细胞;
第四步:在蓝光照射下(光强为200μmol/(m2 s)),将破碎细胞进行分装。对照组是在空气中进行分装,实验组是氧气分压为0~2kPa的惰性气体氛围中进行分装,分装过程持续60min。由此可获得蓝光照射60min的光脱羧酶破碎细胞催化剂。
第五步:将实验组和对照组制备的破碎细胞催化剂分别添加到含54 mM/L棕榈酸的反应体系中。反应体系组成为30%助溶溶剂含180mM棕榈酸和70%光脱羧酶破碎细胞催化剂,混合后添加至透明的反应器中。使用氧气分压为0Pa的惰性气体置换反应器中的空气,封闭反应器并放置于摇床中。采用200μmol/(m2·s)蓝光照射反应器,控制反应温度30℃、pH 8.0、反应时间3h和摇床转速200rpm。
如图2所示,反应结束后对照组中光脱羧酶完全失活,没有十五烷产生。实验组中十五烷的产量为37.3mM,其中棕榈酸的转化率是69.1%。
实施例三
一种厌氧条件下制备含光脱羧酶催化剂及烃类燃料的方法,该方法包括以下步骤:
第一步:将含光脱羧酶基因的质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,获得含光脱羧酶基因的转基因工程菌株;
第二步:将工程菌株接种在含50μg/mL肉汤培养基(TB培养基)中, 37℃培养3-6h,当OD值达到0.7-0.8时,向TB培养基中添加异丙基-β-D- 硫代半乳糖苷,在17℃诱导20h,4℃、4000rpm离心30min,可获得含光脱羧酶的全细胞;
第三步:将全细胞按1:(1~50)(m/V)的比例重悬在预冷的三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液中,利用超声波细胞粉碎机将重悬细胞进行裂解,超声条件为200W、开6s/关10s、共10min,可获得破碎细胞;
第四步:在蓝光照射下(光强为200μmol/(m2 s)),将破碎细胞进行分装。对照组是在空气中进行分装,实验组是氧气分压为0~2kPa的惰性气体氛围中进行分装,分装过程持续180min。由此可获得蓝光照射180min的光脱羧酶破碎细胞催化剂。
步骤五:将实验组和对照组制备的破碎细胞催化剂分别添加到含54 mM/L棕榈酸的反应体系中。反应体系组成为30%助溶溶剂含180mM棕榈酸和70%光脱羧酶破碎细胞催化剂,混合后添加至透明的反应器中。使用氧气分压为0Pa的惰性气体置换反应器中的空气,封闭反应器并放置于摇床中。采用200μmol/(m2·s)蓝光照射反应器,控制反应器温度30℃、pH 8.0、反应时间3h和摇床转速200rpm。
如图3所示,反应结束后对照组中光脱羧酶完全失活,没有十五烷产生。实验组中十五烷的产量为25.6mM,其中棕榈酸的转化率是47.4%。
实施例四
一种厌氧条件下制备含光脱羧酶催化剂及烃类燃料的方法,该方法包括以下步骤:
第一步:反应体系组成为30%二甲基亚砜助溶溶剂含180mM棕榈酸和70%含光脱羧酶全细胞催化剂,混合后添加至透明的反应器中。
第二步:实验组使用氧气分压为0~2kPa的惰性气体置换反应器中的空气,对照组中不置换反应器中的空气。封闭反应器并放置于摇床中。采用 300μmol/(m2·s)蓝光照射反应器,控制反应温度30℃、pH 8.0、反应时间3 h和摇床转速200rpm。
如图4所示,反应结束后十五烷在对照组和实验组中含量分别为16.3 和39.8mM,实验组中棕榈酸的转化率比对照组提高了143.7%。
实施例五
一种厌氧条件下制备含光脱羧酶催化剂及烃类燃料的方法,该方法包括以下步骤:
第一步:利用超声波细胞粉碎机破碎含光脱羧酶基因的重组大肠杆菌,获得破碎细胞,超声条件为:在冰水浴条件下200W,超声10分钟,6s 开、10s关。
第二步:反应体系组成为30%二甲基亚砜助溶溶剂含180mM棕榈酸和70%含光脱羧酶破碎细胞催化剂,混合后添加至透明的反应器中。
第三步:实验组使用氧气分压为0~2kPa的惰性气体置换反应器中的空气,对照组中不置换反应器中的空气。封闭反应器并放置于摇床中。采用 300μmol/(m2·s)蓝光照射反应器,控制反应温度30℃、pH 8.0、反应时间3 h和摇床转速200rpm。
如图5所示,反应结束后,十五烷在对照组和实验组中含量分别为24.7 和40.4mM,实验组中棕榈酸的转化率比对照组提高了63.6%。
实施例六
一种厌氧条件下制备含光脱羧酶催化剂及烃类燃料的方法,该方法包括以下步骤:
第一步:利用超声波细胞粉碎机破碎含光脱羧酶基因的重组大肠杆菌,获得破碎细胞,超声条件为:在冰水浴条件下200W,超声10分钟,6s 开、10s关。
第二步:反应体系组成为30%二甲基亚砜助溶溶剂含180mM棕榈酸和70%含光脱羧酶的生物催化剂,混合后添加至透明的反应器中。设置两组实验:实验组1采用全细胞为催化剂,实验组2采用破碎细胞为催化剂。
第三步:使用氧气分压为0~2kPa的惰性气体置换反应器中的空气,封闭反应器并放置于摇床中。采用不同光强的蓝光照射反应器,光强分别为 50、100、200、300μmol/(m2·s),控制反应温度30℃、pH 8.0、反应时间3 h和摇床转速200rpm。
如图6所示,随着光强逐渐增强,全细胞和破碎细胞催化的十五烷产量逐渐提高。当光强达到200μmol/(m2·s)时,全细胞和破碎细胞催化的十五烷产量达到最高值,分别为44.0和42.1mM。进一步提高光强,两种催化剂的十五烷产量没有提高。由此可知,200μmol/(m2·s)是最优光强,其中两种催化剂催化棕榈酸的转化率分别为81.2%和78.0%。
实施例七
一种厌氧条件下制备含光脱羧酶催化剂及烃类燃料的方法,该方法包括以下步骤:
第一步:利用超声波细胞粉碎机破碎含光脱羧酶的重组大肠杆菌,获得破碎细胞,超声条件为:在冰水浴条件下200W,超声10分钟,6s开、 10s关。
第二步:反应体系组成为30%二甲基亚砜助溶溶剂含180mM棕榈酸和70%含光脱羧酶的生物催化剂,混合后添加至透明的反应器中。设置两组实验:实验组1采用全细胞为催化剂,实验组2采用破碎细胞为催化剂。
第三步:使用氧气分压为0~10kPa的惰性气体置换反应器中的空气,封闭反应器并放置于摇床中。采用光强分别为200μmol/(m2·s)的蓝光照射反应器,控制反应温度30℃、pH 8.0和摇床200rpm。,设置不同的反应时间(0.5、1、2、3、4h)。
如图7所示,随着催化时间延长,全细胞和破碎细胞催化的十五烷产量逐渐提高。当时间为3h时,全细胞和破碎细胞催化的十五烷产量达到最高值,分别为45.6和46.5mM。进一步延长催化时间,两种催化剂的十五烷产量没有提高。由此可知,3h是最优催化时间,其中全细胞和破碎细胞催化棕榈酸的转化率分别为84.4%和86.0%。
实施例八
一种厌氧条件下制备含光脱羧酶催化剂及烃类燃料的方法,该方法包括以下步骤:
第一步:利用超声波细胞粉碎机破碎含光脱羧酶基因的重组大肠杆菌,获得破碎细胞,超声条件为:在冰水浴条件下200W,超声10分钟,6s 开、10s关。将破碎细胞在10000rpm,4℃离心20min,获得上清液为粗酶。将粗酶经镍柱吸附和脱附,即可获得纯酶。
第二步:反应体系组成为30%二甲基亚砜助溶溶剂含180mM棕榈酸和70%含光脱羧酶的生物催化剂,混合后添加至透明的反应器中。设置两组实验:实验组1采用粗酶为催化剂,实验组2采用纯酶为催化剂。
第三步:实验组使用氧气分压为0~10kPa的惰性气体置换反应器中的空气。封闭反应器并放置于摇床中。采用300μmol/(m2·s)蓝光照射反应器,反应时间3h、反应温度30℃和摇床转速200rpm。由此可实现粗酶或纯酶催化脂肪酸脱羧制备烃类燃料。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例,本领域的普通技术人员可以理解:在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型,本发明的范围由权利要求及其等同物限定。
Claims (9)
1.一种厌氧条件下制备含光脱羧酶催化剂及烃类燃料的方法,其特征在于,该方法包括以下步骤:
第一步:将含有光脱羧酶基因的转基因工程菌株进行细胞裂解和酶纯化,在可见光及厌氧条件下进行分装,分别获得含光脱羧酶的破碎细胞和/或粗酶和/或纯酶;
第二步:以助溶溶剂配制含脂肪酸的原料;
第三步:将含脂肪酸的原料和含光脱羧酶的催化剂添加到反应器中,采用含氧气的惰性气体置换反应器中的空气,封闭反应器;所述含氧气的惰性气体中氧分压为0~2 kPa;
第四步:采用含蓝光的光源照射反应器以启动反应,控制光源光强、反应温度、pH和反应时间,催化脂肪酸脱羧得到烃类燃料。
2.根据权利要求1所述的厌氧条件下制备含光脱羧酶催化剂及烃类燃料的方法,其特征在于,步骤一中的可见光为含蓝光的光源。
3. 根据权利要求1所述的厌氧条件下制备含光脱羧酶催化剂及烃类燃料的方法,其特征在于,步骤一中的厌氧条件为氧气分压是0~2 kPa的混合气氛。
4.根据权利要求1所述的厌氧条件下制备含光脱羧酶催化剂及烃类燃料的方法,其特征在于,步骤二中的助溶溶剂为二甲基亚砜或醇类。
5.根据权利要求1所述的厌氧条件下制备含光脱羧酶催化剂及烃类燃料的方法,其特征在于,步骤二中的原料为液态或固态。
6.根据权利要求1所述的厌氧条件下制备含光脱羧酶催化剂及烃类燃料的方法,其特征在于,步骤三中的含光脱羧酶的催化剂为含光脱羧酶的重组大肠杆菌全细胞和/或其破碎细胞和/或其粗酶和/或其纯酶。
7.根据权利要求1所述的厌氧条件下制备含光脱羧酶催化剂及烃类燃料的方法,其特征在于,步骤三中含脂肪酸的原料和含光脱羧酶催化剂按质量比(5~90):(10~95)添加到反应器中。
8.根据权利要求1所述的厌氧条件下制备含光脱羧酶催化剂及烃类燃料的方法,其特征在于,步骤三中的反应器具有透光性和密封性。
9. 根据权利要求1所述的厌氧条件下制备含光脱羧酶催化剂及烃类燃料的方法,其特征在于,步骤四中的含蓝光光源的光强为10~10000 μmol/(m2·s),反应温度为10~40 °C、pH为6~9、反应时间为0~24 h。
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