CN113088379A - 一种油脂脱酸方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种油脂脱酸方法,该方法包括以下步骤:将质粒pET28a‑CvFAP导入大肠杆菌感受态细胞,培养至OD600达到0.7~0.8时,加入IPTG孵育,将发酵液离心,取菌体沉淀,洗涤并重悬,并加入蛋白酶抑制剂,得到CvFAP@E.coli细胞制剂;在蓝光照射下,将CvFAP@E.coli细胞制剂与油脂混合反应,离心,所得上层澄清油样即为脱除FFA的油脂。本发明采用常用水相体系,反应体系简单,反应条件温和,脱酸效果好;产物为简单的烷烯烃混合物,与甘油三脂成分的熔沸点差异较大,容易利用蒸馏技术分离,且中性油脂不参与反应,CvFAP对FFA具有专一性催化反应特点,不会对中性的油脂发生作用,回收率高。
Description
技术领域
本发明属于油脂加工领域,具体涉及一种油脂脱酸方法。
背景技术
动植物油在其制造加工、收集、运输和储藏过程中受外界环境、自身水分和脂肪酶的影响,会水解生成大量的游离脂肪酸(Free fatty acid,FFA),成为高酸值动植物毛油,反过来给其储存加工等过程带来更大挑战,质量也会深受影响。
因此,高效、环保脱酸是动植物油脂精炼的关键环节。现有的脱酸方法主要有碱炼脱酸(FFA与碱类物质中和反应)、物理脱酸(真空蒸馏)和酶法脱酸。
碱炼脱酸和物理脱酸是大宗油脂加工工艺中常用的方法。在碱炼脱酸中,碱(如氢氧化钠)被加入到动植物油脂中,从而使FFA沉淀为皂基,通过离心或水洗将其除去,但该方法会造成中性油的损失,并且在这种过程中产生的废水难以处理。物理脱酸是在高温高真空的条件下进行,温度一般在240℃以上,能耗大,容易造成油脂中功能性小分子的氧化分解,故上述两种方法均有其局限性。
酶法脱酸被认为是一种更绿色环保的工艺,与其它脱酸方法相比,其突出优点在于反应条件温和(反应温度一般低于70℃)、能耗低、中性油及功能性脂质小分子保留率高、反应过程易操控、适用范围广,现越来越受到行业和科研工作者的关注。
现有的酶法脱酸一般是利用脂肪酶催化FFA与特定的酰基受体结合达到脱酸的作用。一方面,脂肪酶的存在导致中性油脂的水解损失(油脂中甘油三酯的水解),并产生更多的FFA,影响产品质量,且酰基化反应得到的甲酯等副产物也较难从油脂中分离;另一方面,研究发现,天然动植物油脂中除了甘油三酯、FFA,还含有一定量的甘油二酯、甾醇等营养成分,这些物质在油脂加工过程中需要尽可能地被保留下来,而脂肪酶对甘油二酯等均有催化作用,会造成这些营养成分的大量损失。因此,开发高酸油脂高效脱酸专用酶制剂,建立一种真正可行的高酸油脂工业脱酸工艺具有重要意义。
发明内容
为克服酶法脱酸过程中脂肪酶造成的产品质量不高、应用成本高昂的问题,本发明首次提出利用一种来源于微藻的新型光脱羧酶(Chlorella variabilis fatty acidphotodecarboxylase,CvFAP)加工油脂进行酶法脱酸的方法。CvFAP是一种新型光驱动酶,无需添加昂贵的辅因子,即可利用蓝光催化FFA转化生成烷(烯)烃,代表着全新的应用领域。
在本发明中,首次利用CvFAP的脱羧特性,无需昂贵的辅酶因子,无需引入酰基受体等其它杂质和副反应,即可选择性地对油脂中的FFA进行催化脱羧,除去油脂中的FFA。该方法脱酸效率高,且工艺简单、产物易分离、中性油脂回收率高、反应条件温和,具有良好的产业化应用前景。
本发明的目的通过下述技术方案实现:
一种油脂脱酸方法,包括以下步骤:
(1)将质粒pET28a-CvFAP导入大肠杆菌感受态细胞,培养至OD600达到0.7~0.8时,加入0.5mM异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG),并将细胞在17℃下孵育至少20h;将发酵液离心,取菌体沉淀,洗涤并重悬,并加入蛋白酶抑制剂,得到CvFAP@E.coli细胞制剂;
所述的将质粒pET28a-CvFAP导入大肠杆菌感受态细胞,优选使用现有技术的热激转化法;
所述的大肠杆菌感受态细胞优选大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞;
所述的培养是37℃下在含50μg/mL卡那霉素的超级肉汤(Terrific Broth,TB)中培养;
所述的洗涤并重悬是使用Tris-HCl缓冲液;
所述的蛋白酶抑制剂为苯甲基黄酰氟,添加量为终浓度1mM;
(2)在蓝光照射下,将CvFAP@E.coli细胞制剂与油脂混合,20-37℃下反应4h以上,反应以CvFAP@E.coli细胞为催化剂,以油脂中的FFA为底物,进行脱羧反应,除去油脂中FFA;反应结束后,取反应混合物离心,所得上层澄清油样即为脱除FFA的油脂;
所述的油脂可以是来源于植物或动物的油脂,比如大豆油、棕榈油或米糠油;
所述的细胞制剂中,CvFAP@E.coli细胞的浓度优选0.06-0.20g/mL;
步骤(2)中的反应温度优选30℃;
步骤(2)中,以湿重计,CvFAP@E.coli细胞与大豆油的比例为0.25g:(100-500)μL,优选0.25g:300μL。
所述的蓝光,功率10W,电压220V,波长400-520nm。
所述的离心,优选在10000rpm下离心3min。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果:
(1)本发明针对现有的酶法脱酸过程中脂肪酶催化副反应多、产品质量不高、应用成本高昂的缺点,首次将CvFAP应用于高酸值油脂的脱酸工艺中,仅利用蓝光,无需添加额外辅因子和酰基受体,即可实现油脂的高效脱酸。
(2)本发明采用常用水相体系,反应体系简单,反应条件温和,脱酸效果好;产物为简单的烷烯烃混合物,与甘油三脂成分的熔沸点差异较大,容易利用蒸馏技术分离,且中性油脂不参与反应,CvFAP对FFA具有专一性催化反应特点,不会对中性的油脂发生作用,回收率高,为油脂的酶法脱酸工艺提供了一个崭新的思路,具有良好的工业应用前景。
附图说明
图1是含有空质粒pET28a载体的大肠杆菌细胞对不同油脂的脱酸效果。
图2是大豆油经CvFAP@E.coli脱酸处理前后游离脂肪酸含量的变化曲线。
图3是棕榈油经CvFAP@E.coli脱酸处理前后游离脂肪酸含量的变化曲线。
图4是米糠油经CvFAP@E.coli脱酸处理前后游离脂肪酸含量的变化曲线。
图5是细胞加量和温度影响下大豆油中游离脂肪酸含量的变化曲线;A-细胞加量影响下的变化曲线;B-温度影响下的变化曲线。
图6是CvFAP@E.coli对不同比例大豆油油脂的脱酸效果。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述,但本发明的实施方式不限于此。
材料与试剂:质粒pET28a-CvFAP和空载质粒pET28a均为本实验室保存。质粒pET28a-CvFAP的构建方法见文献(Sorigué D.,Légeret B.,Cuiné S.,et al.An algalphotoenzyme converts fatty acids to hydrocarbons[J].Science,2017,357(6354):903-907);大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞购自唯地生物科技有限公司;质粒提取试剂盒购自生工生物工程(上海)股份有限公司。
本发明中,油类基本品质特性检测方法如下:
脱酸产物分析:采用了高效液相色谱仪(HPLC,Waters,1525),该色谱仪配备Phenomex Luna二氧化硅液相色谱柱(250mm×4.6mm×5μm,Phenomex公司,托伦斯,加利福尼亚,美国)和显差率检测器(Waters,2414)。流动相为正己烷、异丙醇和甲酸(18:1:0.003,v:v:v)的混合物,流速为1ml/min。温度30℃。甘油三酯(triglyceride,TAG)、FFA、1,3-甘油二酯(1,3-diglyceride,DAG)和1,2-甘油二酯(1,2-diglyceride)的保留时间分别为3.66min、4.04min、4.75min和6.05min。应用Waters 2695集成软件计算峰面积百分比;
酸价测定:按GB 5009.229-2016标准进行油脂酸值测定。准确称取3g大豆油(1g米糠油或棕榈油)于100ml清洁圆锥烧瓶中,加入10ml二乙醚-异丙醇混合溶剂和3-4滴酚酞指示剂。样品溶解后,用0.1mol/L KOH(米糠油的碱性蓝6B指示剂)滴定。当碱性6B指示剂溶液呈现红色(蓝色消失)时停止滴定,根据消耗的氢氧化钠溶液计算油的酸值。实验重复三次。
实施例1:CvFAP@E.coli的制备
将质粒pET28a-CvFAP利用热激转化法转入导入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,37℃下在含50μg/mL卡那霉素的超级肉汤(Terrific Broth,TB)中培养,当600nm处的菌液光密度达到0.7~0.8时,加入0.5mM异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG),并将细胞在17℃下孵育20h。将发酵液在4000rpm,4℃下离心30min,弃去培养基,用50mM Tris-HCl缓冲液(pH值8.0,含100mM NaCl)洗涤菌体2次,离心去除洗涤液后,按照(w/v:1/2)重新加入50mMTris-HCl缓冲液(pH值8.0,含100mM NaCl),另加1mM PMSF(苯甲基黄酰氟,蛋白酶抑制剂)进行重悬浮得到CvFAP@E.coli细胞,贮存在-80℃,待用。为了验证CvFAP的催化脱酸作用,按照同样的方法制备了含有质粒pET28a的大肠杆菌细胞(记作empty WC)。
实施例2:CvFAP@E.coli催化大豆油中游离脂肪酸的光酶脱羧反应
(1)CvFAP@E.coli催化大豆油中游离脂肪酸的光酶脱羧验证实验:将500μL湿重质量浓度为0.5g/mL的CvFAP@E.coli和500μL大豆油加入到一个5mL透明反应瓶中,总反应体积为1ml;然后将其置于光催化反应装置中,在500rpm,30℃,蓝光(10W,220V)照射下反应;
反应结束后,取反应混合物于2mL EP管中,在10000rpm下离心3min,取上层澄清油样30μL溶于970μL液相色谱流动相(正己烷:异丙醇:甲酸=18:1:0.003,v:v:v)中,置于2mL色谱瓶利用HPLC分析游离脂肪酸含量;将CvFAP@E.coli换成empty WC,其它条件不变,催化油脂中的FFA脱羧。
图1为empty WC催化油脂脱酸的效果对比图(依步骤1做法反应6h),可以看到,empty WC在油脂脱酸前后FFA含量基本不变,说明该反应是由CvFAP起到催化作用的。
图1中,Premium Quality,PQ;Superior Quality,SQ;Standard Quality I,STQI;Standard Quality II,STQ II;不同型号油脂主要是游离脂肪酸含量不同。
(2)CvFAP@E.coli催化植物油中游离脂肪酸的光酶脱羧反应条件优化
选用不同油脂底物(大豆油、棕榈油和米糠油)进行光酶催化脱酸,步骤如实施例2步骤(1)所示,结果如图2-4所示(图2-4中,各峰分别为:1.甘油三脂;2.FFA;3.甘油二酯;4.甘油单酯),经过CvFAP@E.coli光酶催化反应,各类油脂中所含FFA基本去除(脱羧反应后,基本没有相应峰出现,对应于峰2),而其它成分基本不受影响(油脂的主要成分甘油脂的含量在脱酸前后基本无变化,对应于峰1、3和4)。
对反应细胞浓度做优化:本发明选择5个细胞浓度对CvFAP@E.coli脱酸过程进行优化(0.02、0.04、0.06、0.12和0.20g/mL),为更直观地观察细胞浓度变化对CvFAP@E.coli催化脱酸过程的影响,反应时间按优化时间进行,反应温度按优化温度进行,步骤如实施例2步骤(1)所示,其他条件和处理方式不变;结果如图5A所示,在细胞浓度为0.06g/mL以上时,反应在4h左右即可达到平衡,且游离脂肪酸含量降至0.01%以下,脱酸效果良好。
对反应温度进行优化:本发明选择3个反应温度(20、30和37℃)对CvFAP@E.coli脱酸过程进行优化,步骤如实施例2步骤(1)所示,其他条件和处理方式不变;结果如图5B所示,反应的最佳温度为30℃。
对反应底物加量进行优化:本发明选择大豆油作为标准底物进行底物加量优化(100、300、500、700、900和1000μL),反应时间、温度和酶加量均按上述优化步骤中最佳值进行,步骤如实施例2步骤(1)所示,其他条件不变;结果如图6所示,在使用500μL湿重质量浓度为0.5g/mL的CvFAP@E.coli的情况下,对300μL大豆油的脱酸效果最好,以湿重计,CvFAP@E.coli细胞与大豆油的比例为0.25g:300μL。
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种油脂脱酸方法,其特征在于包括以下步骤:
(1)将质粒pET28a-CvFAP导入大肠杆菌感受态细胞,培养至OD600达到0.7~0.8时,加入0.5mM异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷,并将细胞在17℃下孵育至少20h;将发酵液离心,取菌体沉淀,洗涤并重悬,并加入蛋白酶抑制剂,得到CvFAP@E.coli细胞制剂;
(2)在蓝光照射下,将CvFAP@E.coli细胞制剂与油脂混合,20-37℃下反应4h以上;反应结束后,取反应混合物离心,所得上层澄清油样即为脱除FFA的油脂;
步骤(2)所述的细胞制剂中,CvFAP@E.coli细胞的浓度为0.06-0.20g/mL;
步骤(2)中,以湿重计,CvFAP@E.coli细胞与大豆油的比例为0.25g:(100-500)μL。
2.根据权利要求1所述的油脂脱酸方法,其特征在于:步骤(2)所述的油脂是来源于植物或动物的油脂。
3.根据权利要求1所述的油脂脱酸方法,其特征在于:步骤(2)所述的油脂是大豆油、菜籽油、棕榈油或米糠油。
4.根据权利要求1所述的油脂脱酸方法,其特征在于:步骤(1)所述的洗涤并重悬是使用Tris-HCl缓冲液。
5.根据权利要求1所述的油脂脱酸方法,其特征在于:步骤(2)中,以湿重计,CvFAP@E.coli细胞与大豆油的比例为0.25g:300μL。
6.根据权利要求1所述的油脂脱酸方法,其特征在于:步骤(1)所述的大肠杆菌感受态细胞为大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。
7.根据权利要求1所述的油脂脱酸方法,其特征在于:步骤(1)所述的蛋白酶抑制剂为苯甲基黄酰氟,添加量为终浓度1mM。
8.根据权利要求1所述的油脂脱酸方法,其特征在于:步骤(2)中的反应温度为30℃。
9.根据权利要求1所述的油脂脱酸方法,其特征在于:步骤(1)所述的培养是37℃下在含50μg/mL卡那霉素的超级肉汤中培养。
10.根据权利要求1所述的油脂脱酸方法,其特征在于:步骤(2)所述的蓝光,功率10W,电压220V,波长400-520nm。
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