CN113088379A - 一种油脂脱酸方法 - Google Patents

一种油脂脱酸方法 Download PDF

Info

Publication number
CN113088379A
CN113088379A CN202110250534.XA CN202110250534A CN113088379A CN 113088379 A CN113088379 A CN 113088379A CN 202110250534 A CN202110250534 A CN 202110250534A CN 113088379 A CN113088379 A CN 113088379A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cvfap
oil
grease
deacidifying
fat
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202110250534.XA
Other languages
English (en)
Inventor
杨博
张细珍
马云建
王永华
王卫飞
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
South China University of Technology SCUT
Original Assignee
South China University of Technology SCUT
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by South China University of Technology SCUT filed Critical South China University of Technology SCUT
Priority to CN202110250534.XA priority Critical patent/CN113088379A/zh
Publication of CN113088379A publication Critical patent/CN113088379A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11B—PRODUCING, e.g. BY PRESSING RAW MATERIALS OR BY EXTRACTION FROM WASTE MATERIALS, REFINING OR PRESERVING FATS, FATTY SUBSTANCES, e.g. LANOLIN, FATTY OILS OR WAXES; ESSENTIAL OILS; PERFUMES
    • C11B3/00—Refining fats or fatty oils
    • C11B3/003—Refining fats or fatty oils by enzymes or microorganisms, living or dead

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种油脂脱酸方法，该方法包括以下步骤：将质粒pET28a‑CvFAP导入大肠杆菌感受态细胞，培养至OD600达到0.7～0.8时，加入IPTG孵育，将发酵液离心，取菌体沉淀，洗涤并重悬，并加入蛋白酶抑制剂，得到CvFAP@E.coli细胞制剂；在蓝光照射下，将CvFAP@E.coli细胞制剂与油脂混合反应，离心，所得上层澄清油样即为脱除FFA的油脂。本发明采用常用水相体系，反应体系简单，反应条件温和，脱酸效果好；产物为简单的烷烯烃混合物，与甘油三脂成分的熔沸点差异较大，容易利用蒸馏技术分离，且中性油脂不参与反应，CvFAP对FFA具有专一性催化反应特点，不会对中性的油脂发生作用，回收率高。

Description

一种油脂脱酸方法
技术领域
本发明属于油脂加工领域，具体涉及一种油脂脱酸方法。
背景技术
动植物油在其制造加工、收集、运输和储藏过程中受外界环境、自身水分和脂肪酶的影响，会水解生成大量的游离脂肪酸(Free fatty acid，FFA)，成为高酸值动植物毛油，反过来给其储存加工等过程带来更大挑战，质量也会深受影响。
因此，高效、环保脱酸是动植物油脂精炼的关键环节。现有的脱酸方法主要有碱炼脱酸(FFA与碱类物质中和反应)、物理脱酸(真空蒸馏)和酶法脱酸。
碱炼脱酸和物理脱酸是大宗油脂加工工艺中常用的方法。在碱炼脱酸中，碱(如氢氧化钠)被加入到动植物油脂中，从而使FFA沉淀为皂基，通过离心或水洗将其除去，但该方法会造成中性油的损失，并且在这种过程中产生的废水难以处理。物理脱酸是在高温高真空的条件下进行，温度一般在240℃以上，能耗大，容易造成油脂中功能性小分子的氧化分解，故上述两种方法均有其局限性。
酶法脱酸被认为是一种更绿色环保的工艺，与其它脱酸方法相比，其突出优点在于反应条件温和(反应温度一般低于70℃)、能耗低、中性油及功能性脂质小分子保留率高、反应过程易操控、适用范围广，现越来越受到行业和科研工作者的关注。
现有的酶法脱酸一般是利用脂肪酶催化FFA与特定的酰基受体结合达到脱酸的作用。一方面，脂肪酶的存在导致中性油脂的水解损失(油脂中甘油三酯的水解)，并产生更多的FFA，影响产品质量，且酰基化反应得到的甲酯等副产物也较难从油脂中分离；另一方面，研究发现，天然动植物油脂中除了甘油三酯、FFA，还含有一定量的甘油二酯、甾醇等营养成分，这些物质在油脂加工过程中需要尽可能地被保留下来，而脂肪酶对甘油二酯等均有催化作用，会造成这些营养成分的大量损失。因此，开发高酸油脂高效脱酸专用酶制剂，建立一种真正可行的高酸油脂工业脱酸工艺具有重要意义。
发明内容
为克服酶法脱酸过程中脂肪酶造成的产品质量不高、应用成本高昂的问题，本发明首次提出利用一种来源于微藻的新型光脱羧酶(Chlorella variabilis fatty acidphotodecarboxylase，CvFAP)加工油脂进行酶法脱酸的方法。CvFAP是一种新型光驱动酶，无需添加昂贵的辅因子，即可利用蓝光催化FFA转化生成烷(烯)烃，代表着全新的应用领域。
在本发明中，首次利用CvFAP的脱羧特性，无需昂贵的辅酶因子，无需引入酰基受体等其它杂质和副反应，即可选择性地对油脂中的FFA进行催化脱羧，除去油脂中的FFA。该方法脱酸效率高，且工艺简单、产物易分离、中性油脂回收率高、反应条件温和，具有良好的产业化应用前景。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种油脂脱酸方法，包括以下步骤：
(1)将质粒pET28a-CvFAP导入大肠杆菌感受态细胞，培养至OD600达到0.7～0.8时，加入0.5mM异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)，并将细胞在17℃下孵育至少20h；将发酵液离心，取菌体沉淀，洗涤并重悬，并加入蛋白酶抑制剂，得到CvFAP@E.coli细胞制剂；
所述的将质粒pET28a-CvFAP导入大肠杆菌感受态细胞，优选使用现有技术的热激转化法；
所述的大肠杆菌感受态细胞优选大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞；
所述的培养是37℃下在含50μg/mL卡那霉素的超级肉汤(Terrific Broth，TB)中培养；
所述的洗涤并重悬是使用Tris-HCl缓冲液；
所述的蛋白酶抑制剂为苯甲基黄酰氟，添加量为终浓度1mM；
(2)在蓝光照射下，将CvFAP@E.coli细胞制剂与油脂混合，20-37℃下反应4h以上，反应以CvFAP@E.coli细胞为催化剂，以油脂中的FFA为底物，进行脱羧反应，除去油脂中FFA；反应结束后，取反应混合物离心，所得上层澄清油样即为脱除FFA的油脂；
所述的油脂可以是来源于植物或动物的油脂，比如大豆油、棕榈油或米糠油；
所述的细胞制剂中，CvFAP@E.coli细胞的浓度优选0.06-0.20g/mL；
步骤(2)中的反应温度优选30℃；
步骤(2)中，以湿重计，CvFAP@E.coli细胞与大豆油的比例为0.25g:(100-500)μL，优选0.25g:300μL。
所述的蓝光，功率10W，电压220V，波长400-520nm。
所述的离心，优选在10000rpm下离心3min。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明针对现有的酶法脱酸过程中脂肪酶催化副反应多、产品质量不高、应用成本高昂的缺点，首次将CvFAP应用于高酸值油脂的脱酸工艺中，仅利用蓝光，无需添加额外辅因子和酰基受体，即可实现油脂的高效脱酸。
(2)本发明采用常用水相体系，反应体系简单，反应条件温和，脱酸效果好；产物为简单的烷烯烃混合物，与甘油三脂成分的熔沸点差异较大，容易利用蒸馏技术分离，且中性油脂不参与反应，CvFAP对FFA具有专一性催化反应特点，不会对中性的油脂发生作用，回收率高，为油脂的酶法脱酸工艺提供了一个崭新的思路，具有良好的工业应用前景。
附图说明
图1是含有空质粒pET28a载体的大肠杆菌细胞对不同油脂的脱酸效果。
图2是大豆油经CvFAP@E.coli脱酸处理前后游离脂肪酸含量的变化曲线。
图3是棕榈油经CvFAP@E.coli脱酸处理前后游离脂肪酸含量的变化曲线。
图4是米糠油经CvFAP@E.coli脱酸处理前后游离脂肪酸含量的变化曲线。
图5是细胞加量和温度影响下大豆油中游离脂肪酸含量的变化曲线；A-细胞加量影响下的变化曲线；B-温度影响下的变化曲线。
图6是CvFAP@E.coli对不同比例大豆油油脂的脱酸效果。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
材料与试剂：质粒pET28a-CvFAP和空载质粒pET28a均为本实验室保存。质粒pET28a-CvFAP的构建方法见文献(Sorigué D.,Légeret B.,Cuiné S.,et al.An algalphotoenzyme converts fatty acids to hydrocarbons[J].Science,2017,357(6354):903-907)；大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞购自唯地生物科技有限公司；质粒提取试剂盒购自生工生物工程(上海)股份有限公司。
本发明中，油类基本品质特性检测方法如下：
脱酸产物分析：采用了高效液相色谱仪(HPLC，Waters，1525)，该色谱仪配备Phenomex Luna二氧化硅液相色谱柱(250mm×4.6mm×5μm，Phenomex公司，托伦斯，加利福尼亚，美国)和显差率检测器(Waters，2414)。流动相为正己烷、异丙醇和甲酸(18:1:0.003，v:v:v)的混合物，流速为1ml/min。温度30℃。甘油三酯(triglyceride，TAG)、FFA、1,3-甘油二酯(1,3-diglyceride，DAG)和1,2-甘油二酯(1,2-diglyceride)的保留时间分别为3.66min、4.04min、4.75min和6.05min。应用Waters 2695集成软件计算峰面积百分比；
酸价测定：按GB 5009.229-2016标准进行油脂酸值测定。准确称取3g大豆油(1g米糠油或棕榈油)于100ml清洁圆锥烧瓶中，加入10ml二乙醚-异丙醇混合溶剂和3-4滴酚酞指示剂。样品溶解后，用0.1mol/L KOH(米糠油的碱性蓝6B指示剂)滴定。当碱性6B指示剂溶液呈现红色(蓝色消失)时停止滴定，根据消耗的氢氧化钠溶液计算油的酸值。实验重复三次。
实施例1：CvFAP@E.coli的制备
将质粒pET28a-CvFAP利用热激转化法转入导入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，37℃下在含50μg/mL卡那霉素的超级肉汤(Terrific Broth，TB)中培养，当600nm处的菌液光密度达到0.7～0.8时，加入0.5mM异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)，并将细胞在17℃下孵育20h。将发酵液在4000rpm，4℃下离心30min，弃去培养基，用50mM Tris-HCl缓冲液(pH值8.0，含100mM NaCl)洗涤菌体2次，离心去除洗涤液后，按照(w/v:1/2)重新加入50mMTris-HCl缓冲液(pH值8.0，含100mM NaCl)，另加1mM PMSF(苯甲基黄酰氟，蛋白酶抑制剂)进行重悬浮得到CvFAP@E.coli细胞，贮存在-80℃，待用。为了验证CvFAP的催化脱酸作用，按照同样的方法制备了含有质粒pET28a的大肠杆菌细胞(记作empty WC)。
实施例2：CvFAP@E.coli催化大豆油中游离脂肪酸的光酶脱羧反应
(1)CvFAP@E.coli催化大豆油中游离脂肪酸的光酶脱羧验证实验：将500μL湿重质量浓度为0.5g/mL的CvFAP@E.coli和500μL大豆油加入到一个5mL透明反应瓶中，总反应体积为1ml；然后将其置于光催化反应装置中，在500rpm，30℃，蓝光(10W，220V)照射下反应；
反应结束后，取反应混合物于2mL EP管中，在10000rpm下离心3min，取上层澄清油样30μL溶于970μL液相色谱流动相(正己烷:异丙醇:甲酸＝18:1:0.003，v:v:v)中，置于2mL色谱瓶利用HPLC分析游离脂肪酸含量；将CvFAP@E.coli换成empty WC，其它条件不变，催化油脂中的FFA脱羧。
图1为empty WC催化油脂脱酸的效果对比图(依步骤1做法反应6h)，可以看到，empty WC在油脂脱酸前后FFA含量基本不变，说明该反应是由CvFAP起到催化作用的。
图1中，Premium Quality，PQ；Superior Quality，SQ；Standard Quality I，STQI；Standard Quality II，STQ II；不同型号油脂主要是游离脂肪酸含量不同。
(2)CvFAP@E.coli催化植物油中游离脂肪酸的光酶脱羧反应条件优化
选用不同油脂底物(大豆油、棕榈油和米糠油)进行光酶催化脱酸，步骤如实施例2步骤(1)所示，结果如图2-4所示(图2-4中，各峰分别为：1.甘油三脂；2.FFA；3.甘油二酯；4.甘油单酯)，经过CvFAP@E.coli光酶催化反应，各类油脂中所含FFA基本去除(脱羧反应后，基本没有相应峰出现，对应于峰2)，而其它成分基本不受影响(油脂的主要成分甘油脂的含量在脱酸前后基本无变化，对应于峰1、3和4)。
对反应细胞浓度做优化：本发明选择5个细胞浓度对CvFAP@E.coli脱酸过程进行优化(0.02、0.04、0.06、0.12和0.20g/mL)，为更直观地观察细胞浓度变化对CvFAP@E.coli催化脱酸过程的影响，反应时间按优化时间进行，反应温度按优化温度进行，步骤如实施例2步骤(1)所示，其他条件和处理方式不变；结果如图5A所示，在细胞浓度为0.06g/mL以上时，反应在4h左右即可达到平衡，且游离脂肪酸含量降至0.01％以下，脱酸效果良好。
对反应温度进行优化：本发明选择3个反应温度(20、30和37℃)对CvFAP@E.coli脱酸过程进行优化，步骤如实施例2步骤(1)所示，其他条件和处理方式不变；结果如图5B所示，反应的最佳温度为30℃。
对反应底物加量进行优化：本发明选择大豆油作为标准底物进行底物加量优化(100、300、500、700、900和1000μL)，反应时间、温度和酶加量均按上述优化步骤中最佳值进行，步骤如实施例2步骤(1)所示，其他条件不变；结果如图6所示，在使用500μL湿重质量浓度为0.5g/mL的CvFAP@E.coli的情况下，对300μL大豆油的脱酸效果最好，以湿重计，CvFAP@E.coli细胞与大豆油的比例为0.25g:300μL。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种油脂脱酸方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)将质粒pET28a-CvFAP导入大肠杆菌感受态细胞，培养至OD600达到0.7～0.8时，加入0.5mM异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷，并将细胞在17℃下孵育至少20h；将发酵液离心，取菌体沉淀，洗涤并重悬，并加入蛋白酶抑制剂，得到CvFAP@E.coli细胞制剂；
(2)在蓝光照射下，将CvFAP@E.coli细胞制剂与油脂混合，20-37℃下反应4h以上；反应结束后，取反应混合物离心，所得上层澄清油样即为脱除FFA的油脂；
步骤(2)所述的细胞制剂中，CvFAP@E.coli细胞的浓度为0.06-0.20g/mL；
步骤(2)中，以湿重计，CvFAP@E.coli细胞与大豆油的比例为0.25g:(100-500)μL。
2.根据权利要求1所述的油脂脱酸方法，其特征在于：步骤(2)所述的油脂是来源于植物或动物的油脂。
3.根据权利要求1所述的油脂脱酸方法，其特征在于：步骤(2)所述的油脂是大豆油、菜籽油、棕榈油或米糠油。
4.根据权利要求1所述的油脂脱酸方法，其特征在于：步骤(1)所述的洗涤并重悬是使用Tris-HCl缓冲液。
5.根据权利要求1所述的油脂脱酸方法，其特征在于：步骤(2)中，以湿重计，CvFAP@E.coli细胞与大豆油的比例为0.25g:300μL。
6.根据权利要求1所述的油脂脱酸方法，其特征在于：步骤(1)所述的大肠杆菌感受态细胞为大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。
7.根据权利要求1所述的油脂脱酸方法，其特征在于：步骤(1)所述的蛋白酶抑制剂为苯甲基黄酰氟，添加量为终浓度1mM。
8.根据权利要求1所述的油脂脱酸方法，其特征在于：步骤(2)中的反应温度为30℃。
9.根据权利要求1所述的油脂脱酸方法，其特征在于：步骤(1)所述的培养是37℃下在含50μg/mL卡那霉素的超级肉汤中培养。
10.根据权利要求1所述的油脂脱酸方法，其特征在于：步骤(2)所述的蓝光，功率10W，电压220V，波长400-520nm。
CN202110250534.XA 2021-03-08 2021-03-08 一种油脂脱酸方法 Pending CN113088379A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110250534.XA CN113088379A (zh) 2021-03-08 2021-03-08 一种油脂脱酸方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110250534.XA CN113088379A (zh) 2021-03-08 2021-03-08 一种油脂脱酸方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN113088379A true CN113088379A (zh) 2021-07-09

Family

ID=76666785

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110250534.XA Pending CN113088379A (zh) 2021-03-08 2021-03-08 一种油脂脱酸方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113088379A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114438064A (zh) * 2021-12-28 2022-05-06 重庆大学 厌氧条件下制备含光脱羧酶催化剂及烃类燃料的方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106566658A (zh) * 2016-10-10 2017-04-19 华南理工大学 一种高酸价油脂的酶法脱酸方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106566658A (zh) * 2016-10-10 2017-04-19 华南理工大学 一种高酸价油脂的酶法脱酸方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MIEKE M. E. HUIJBERS等: "Light-Driven Enzymatic Decarboxylation of Fatty Acids", 《ANGEW. CHEM. INT. ED.》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114438064A (zh) * 2021-12-28 2022-05-06 重庆大学 厌氧条件下制备含光脱羧酶催化剂及烃类燃料的方法
CN114438064B (zh) * 2021-12-28 2023-08-25 重庆大学 厌氧条件下制备含光脱羧酶催化剂及烃类燃料的方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Amini et al. State of the art and prospective of lipase-catalyzed transesterification reaction for biodiesel production
Ma et al. Biodiesels from microbial oils: opportunity and challenges
Deeba et al. Converting paper mill sludge into neutral lipids by oleaginous yeast Cryptococcus vishniaccii for biodiesel production
Tomás-Pejó et al. Microbial lipids from organic wastes: outlook and challenges
Tran et al. Enzymatic transesterification of microalgal oil from Chlorella vulgaris ESP-31 for biodiesel synthesis using immobilized Burkholderia lipase
He et al. Cost-effective biodiesel production from wet microalgal biomass by a novel two-step enzymatic process
Christophe et al. Recent developments in microbial oils production: a possible alternative to vegetable oils for biodiesel without competition with human food?
EP1893764B1 (en) Enzymatic production of degummed fatty acid alkyl esters
Abdelmoez et al. Utilization of oleochemical industry residues as substrates for lipase production for enzymatic sunflower oil hydrolysis
Ahmad et al. Transesterification of oil extracted from different species of algae for biodiesel production
Li et al. Synthesis of wax esters by lipase-catalyzed esterification with immobilized lipase from Candida sp. 99–125
Razzak et al. Valorization of microalgae biomass to biofuel production: a review
EP2691532A1 (en) Esterification process
MY182317A (en) Method for preparing bio diesel
CN109295030A (zh) 一种基于液态固定化酶富集鱼油中dha和epa的方法
Yi-Feng et al. Production of biodiesel from algal biomass: current perspectives and future
Pinyaphong et al. Biodiesel fuel production by methanolysis of fish oil derived from the discarded parts of fish catalyzed by Carica papaya lipase
CN113088379A (zh) 一种油脂脱酸方法
WO2017012445A1 (zh) 生物柴油的制备方法
CN112695060A (zh) 一种新型生物酶法生产生物柴油工艺
Zhang et al. A New Deacidification Strategy for Crude Vegetable Oil: Removal of Free Fatty Acids via Photobiocatalytic Decarboxylation
Raut et al. Trends in production and fuel properties of biodiesel from heterotrophic microbes
Paes et al. Omics in biofuel production: a sustainable approach
WO2015016587A1 (ko) 고정화 효소를 이용한 연속식 바이오디젤 생산 반응기 및 바이오디젤 생산 방법
EP4045669A1 (en) Fatty acid esterification process

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20210709

RJ01 Rejection of invention patent application after publication