DE69534996T2

DE69534996T2 - Monoklonaler antikörper gegen flt4-rezeptor-tyrosin-kinase und dessen verwendung zur diagnose und therapie

Info

Publication number: DE69534996T2
Application number: DE69534996T
Authority: DE
Inventors: c/o Molecular/Cancer Biology Lab. Kari Alitalo; Arja Kaipainen; Jaana Korhonen; Tuija Mustonen; Marja-Terttu Matikainen; Katri Pajusola; c/o Molecular/Cancer Biology Lab. Päivi Karnani
Original assignee: Ludwig Institute for Cancer Research Ltd; Licentia Oy
Current assignee: Vegenics Pty Ltd
Priority date: 1994-06-09
Filing date: 1995-06-09
Publication date: 2007-05-10
Anticipated expiration: 2015-06-10
Also published as: ES2263152T3; NO965231L; NZ288235A; EP0807124A1; AU694524B2; CA2192235A1; FI964862A; AU2738895A; CA2192235C; DE69534996D1; JP2005139199A; DK0807124T3; WO1995033772A1; ATE326484T1; NO965231D0; EP0807124B1; FI964862A0; JP3723210B2; JP2009102415A; MX9606218A

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein Rezeptor-Tyrosin-Kinasen, Nucleinsäuresonden und Antikörper, die solche Rezeptoren spezifisch erkennen und die Verwendung solcher Sonden und Antikörper zur Identifizierung von Lymphgefäßen und Venolen mit hohem Endothel (HEV) in tierischen und menschlichen Geweben und lymphatischen endothelialen gezüchteten Zellen. Genauer gesagt richtet sich die vorliegende Erfindung auf Antikörper, die spezifisch für FLT4, eine Rezeptor-Tyrosin-Kinase, sind und Verfahren, um die FLT4-Expression in Lymphgefäßen nachzuweisen und schlussendlich auf die Diagnose und Behandlung von Erkrankungszuständen in Tieren und Menschen, welche Veränderungen im lymphatischen Gewebe einschließen, wie zum Beispiel entzündliche infektiöse und immunologische Erkrankungen, metastasischen Lymphknoten und Lymphangiome.
STAND DER TECHNIK
Die Physiologie des vaskulären Systems, die embryonische Vaskulogenese und Angiogenese, Blutgerinnung, Wundheilung und Fortpflanzung sowie verschiedene Erkrankungen sind mit dem vaskulären Endothel, welches die Blutgefäße auskleidet, verbunden. Die Entwicklung des Gefäßbaumes findet durch Angiogenese statt und entsprechend manchen Theorien beginnt die Bildung des lymphatischen Systems kurz nach der arteriellen und venösen Entwicklung durch Sprossung von Venen^(1,2).
Nach der fötalen Periode vermehren sich Endothelzellen sehr langsam, außer während der mit Neovaskularisierung verbundenen Angiogenese. Wachstumsfaktoren, welche die Angiogenese stimulieren üben ihre Wirkung über spezifische Rezeptor-Tyrosin-Kinasen der Endothelzelloberfläche aus.
Das Proteinprodukt der FLT4-Rezeptor-Tyrosin-Kinasen-cDNA, welche von einer menschlichen Erythroleukämie-Zelllinie cloniert wurde, ist N-glykosyliert und enthält sieben Immunglobulin-ähnliche Schleifen in ihrer extrazellulären Domäne. Die cytoplasmatische Tyrosin-Kinasendomäne von FLT4 ist auf dem Aminosäureniveau etwa 80% identisch mit den entsprechenden Domänen von FLT1 und KDR und etwa 60% identisch mit den Rezeptoren für den Platelet-derived Growth Factor (PDGF), Kolonie-stimulierenden Faktor-1, Stammzell-Faktor und den FLT3-Rezeptor⁽³⁾.
Obwohl die biologischen Funktionen von FLT4 bis jetzt nicht bekannt sind, deutet sein eingeschränktes Expressionsmuster darauf hin, dass seine Funktionen das vaskuläre Endothel einschließen. Unsere bisherigen Ergebnisse haben FLT4 mRNA-Expression in Endothelzellen in sich entwickelnden Gefäßen von verschiedenen fötalen Organen erkennen lassen, wie offenbart von Kaipainen et al., in J. Exp. Med. 178: 2077-2088, 1993. Ein Vergleich der mRNA-Signale von FLT4, FLT1 und KDR/FLK-1-Rezeptor zeigte überlappende aber unterschiedliche Expressionsmuster in den untersuchten Geweben⁽⁴⁾. Diese Daten deuteten darauf hin, dass die Rezeptor-Tyorsin-Kinasen, welche durch diese Genfamilie codiert sind, verschiedene Funktionen in der Regulation des Wachstums und/oder der Differenzierung von Blutgefäßen haben könnten.
Eine Hauptfunktion des lymphatischen Systems ist es für den Flüssigkeits-Rückfluss aus Geweben zu sorgen und viele extravaskuläre Substanzen zurück ins Blut zu transportieren. Außerdem verlassen Lymphozyten während des Reifungsprozesses das Blut, wandern durch lymphoide Organe und andere Gewebe und treten in die Lymphgefäße ein und kehren durch den Milchbrustgang ins Blut zurück. Spezialisierte Venolen, Venolen mit hohem Endothel (HEVs), binden Lymphozyten wieder und verursachen ihren Austritt in das Gewebe. Die Lymphgefäße und besonders die Lymphknoten spielen daher eine wichtige Rolle in der Immunologie und sie sind auch Orte für die Metastasen-Entwicklung von verschiedenen Tumoren.
Seit dem Beginn des 20. Jahrhunderts sind 3 verschiedene Theorien betreffend dem embryonischen Ursprung des Lymphsystems vorgestellt worden. Vor der vorliegenden Erfindung ist es jedoch schwierig gewesen Lymphgefäße zu identifizieren, da für sie keine spezifischen Marker vorhanden sind.
Lymphgefäße werden am häufigsten mit Hilfe von Lymphographie untersucht. In der Lymphographie wird ein Röntgenkontrastmittel direkt in ein Lymphgefäß injiziert. Das Kontrastmittel wird entlang der efferenten Abflussgefäße des Lymphsystems verteilt. Das Kontrastmittel sammelt sich in den Lymphknoten an, wo es bis zu einem halben Jahr erhalten bleibt, während dieser Zeit ermöglichen Röntgenanalysen die Nachuntersuchung der Lymphknotengröße und -Architektur. Diese Diagnostik ist besonders bei Krebspatienten mit Metastasen in den Lymphknoten und bei lymphatischen Malignitäten, wie zum Beispiel einem Lymphom, besonders wichtig.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Anmeldung ist auf FLT4-Peptide und andere Konstrukte gerichtet und auf die Verwendung von FLT4 als einen für lymphatische Endothelzellen spezifischen Marker.
Die Erfindung ist auf Antikörper gerichtet die spezifisch FLT4 erkennen, besonders auf monoclonale Antikörper und Zusammensetzungen, die solche Antikörper enthalten. Ferner wird in der vorliegenden Anmeldung die Verwendung von solchen monoclonalen Antikörpern für diagnostische Zwecke zum Nachweis und zur Messung der Menge an FLT4-Rezeptoren in Geweben offenbart, besonders in Lymphgeweben und in lymphatischen Endothelzellen.
In einer bevorzugten Ausführungsform stellt die Erfindung monoclonale Antikörper bereit, welche den FLT4-Rezeptor spezifisch erkennen. Genauer gesagt stellt diese Erfindung einen als 9D9F9 bezeichneten monoclonalen Antikörper bereit. Die Hybridomzelllinie, welche den monoclonalen Antikörper 9D9F9 produziert wurde bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM) unter den Bestimmungen des Budapester Abkommens hinterlegt (DSM-Zugangsnummer ACC2210).
Monoclonale Antikörper, die mit einem nachweisbaren Marker markiert sind, werden auch bereitgestellt. Der Begriff „nachweisbarer Marker", wie er hierin verwendet wird, umfasst jeden einem Fachmann bekannten nachweisbaren Marker. In einer bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung wird dieser nachweisbare Marker jedoch aus der Gruppe bestehend aus Radioisotopen, Fluorochromen, Farbstoffen, Enzymen und Biotin ausgewählt. Die für den Zweck dieser Erfindung geeigneten Radioisotope schließen ¹²⁵I und ¹³¹I ein, sind aber nicht auf sie beschränkt.
Monoclonale Antikörper der vorliegenden Erfindung können auch in einem Verfahren zum Nachweis der Anwesenheit von FLT4-Rezeptoren in einer Zellprobe verwendet werden, umfassend die Schritte des Inkontaktbringens einer Zellprobe mit einem monoclonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung und den Nachweis der Bindung dieses monoclonalen Antikörpers an die FLT4-Rezeptoren.
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft daher ein Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit von FLT4-Rezeptoren in einer Zellprobe, umfassend die Schritte von:

(a) Inkontaktbringen einer Zellprobe mit einem monoclonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung;
(b) Nachweisen der Bindung dieses monoclonalen Antikörpers an FLT4-Rezeptoren.

Das Inkontaktbringen eines Zellgemisches mit monoclonalen Antikörpern der Erfindung kann in Lösung stattfinden, wie es bei der Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierung der Fall ist, oder es kann auf einer festen Gewebeprobe wie zum Beispiel Biopsiematerial stattfinden, oder es kann stattfinden, indem der monoclonale Antikörper auf einem festen Träger immobilisiert wird, wie das bei der Säulenchromatographie oder direkten Immunadhärenz der Fall ist. Das Zellgemisch, das mit dem monoclonalen Antikörper in Kontakt gebracht werden soll, kann jede Lösung von Blutzellen oder Gewebezellen darstellen. Vorzugsweise stammt das Zellgemisch von normalem oder pathogenem Gewebe, welches lymphatische Endothelzellen enthält oder vermutlich enthält. Nach Inkontaktbringen des Zellgemisches mit dem monoclonalen Antikörper werden jene Zellen mit FLT4-Rezeptoren an den monoclonalen Antikörper binden, um einen Antikörper-FLT4-Rezeptorkomplex zu bilden. Die Anwesenheit des Antikörper-FLT4-Rezeptorkomplexes und daher der FLT4-Rezeptoren, kann durch im Fachgebiet bekannte Verfahren nachgewiesen werden. Diese Verfahren schließen immunhistochemische Verfahren ein, welche im Fachgebiet Norm sind, wie zum Beispiel Immunfluoreszenz, FACS-Analyse, ELISA, IRMA (ein Sandwich-Typ eines Immunchemie-Tests), Immunhisto-Chemie, RIA unter Verwendung von ¹²⁵I-Markierung und Autoradiographie.
Die vorliegende Erfindung stellt auch monoclonale Antikörper bereit, die mit einem darstellbaren Agens konjugiert sind. Wie hierin verwendet schließt der Begriff „darstellbares Agens" Radioisotope ein, ist aber nicht auf sie beschränkt. Ein bevorzugtes Radioisotop ist 99 m-Technetium.
In einer besonderen Ausführungsform ist die Erfindung auf ein Verfahren zur Überwachung von Lymphgefäßen und ihren Endothelzellen in Gewebeproben und in Organismen gerichtet. Die vorliegende Erfindung stellt ferner klinische Nachweisverfahren bereit, welche den Zustand des lymphatischen Gewebes und besonders von Lymphgefäßen (Entzündung, Infektion, Verletzungen, Wachstum, Neoplasma usw.) beschreiben und Verfahren zum Nachweis von Lymphgefäßen und demnach der lymphatischen Gefäßneubildung in einem Organismus.
Genauer gesagt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Nachweisen und Identifizieren lymphatischer Veränderungen bereit, gekennzeichnet durch FLT4-Expression im Zusammenhang mit Metastasen-bildenden Krebsarten, Entzündungen, infektiösen und immunologischen Zuständen, wobei dieses Verfahren die Schritte umfasst von

(a) Erhaltung einer Gewebe und/oder einer Körperflüssigkeitsprobe, bei welcher lymphatische Veränderungen vermutet werden, und
(b) Inkontaktbringen dieser Probe mit einem FLT4-spezifischen monoclonalen Antikörper unter Bedingungen, die zur Bildung eines Komplexes zwischen dem monoclonalen Antikörper und dem Antigen geeignet sind, und
(c) Nachweisen der Anwesenheit jedes gebildeten Komplexes.

Ein Gewebe, welches durch dieses Verfahren nachgewiesen werden kann, ist jedes normale, präkanzeröse oder kanzeröse feste Tumorgewebe mit FLT4-enthaltenden Lymphzellen oder Zellen, die den FLT4-Rezeptor exprimieren. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der monoclonale Antikörper mit einem, wie hierin beschriebenen, nachweisbaren Marker markiert. Verfahren der Erfindung sind zum Nachweisen und zum Unterscheiden von verschiedenen Krebsarten nützlich, besonders von Metastasen in den Lymphknoten und anderen lymphatischen Malignitäten, wie zum Beispiel Lymphomen sowie auch Lymphangiomen.
Ein Verfahren zur Darstellung des Vorhandenseins von Lymphgefäßen, Venolen mit hohem Endothel oder Lymphknoten in menschlichen Patienten wird auch durch diese Erfindung bereitgestellt. Dieses Verfahren umfasst die Verabreichung von markierten Antikörpern und den Nachweis durch bildgebende Verfahren an Stellen wo FLT4-exprimierende Zellen in Lymphgefäßen oder Lymphknoten vorhanden sind.
Die Erfindung ist ferner auf ein Verfahren zum Stimulieren oder Entgegenwirken der Funktion von FLT4 in der lymphatischen Gefäßneubildung und in Entzündung, infektiösen und immunologischen Bedingungen gerichtet, wobei dieses Verfahren umfasst Hemmen der FLT4-vermittleten lymphatischen Gefäßneubildung durch Bereitstellen von ausreichenden Mengen an FLT4- bindenden Verbindungen, um die an einer solchen Reaktion teilnehmenden FLT4-Endothelzellstellen zu blockieren, besonders wo die FLT4-Funktion mit einer Krankheit wie Metastasen-bildenden Karzinomen, Lymphomen, Entzündung (chronisch oder akut), Infektionen und immunologischen Erkrankungen, in Zusammenhang steht.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1. Expression von FLT4-mRNA in Mausgeweben.
A. Hybridisierung von polyadenylierter RNA, die von den angegebenen Geweben erwachsener Mäuse isoliert wurde. Die Größe der FLT4-mRNA-Bande wird in Kilobasen angegeben. B. „RNAse-Protection-Analysis" von RNA, welche aus Mausembryos mit unterschiedlicher Trächtigkeitsdauer (E8-E18) und von einer neugeborenen Maus (1 Tag) isoliert wurde. Die Probe E8 + P enthält auch die Plazenta. Die Größe der Sonden und des geschützten FLT4-Fragments werden in Nucleotiden angegeben; β-Actin wurde als Kontrolle verwendet.
2. Expression von FLT4-mRNA in Embryonen 7,5-, 8,5- und 11,5 Tage p.c. Dunkelfeld und Hellfeld Photomikroskopische Aufnahmen von in situ Autoradiogrammen werden gezeigt. Keine Expression von FLT4 mRNA konnte in einem 7,5-Tage-Embryo (A) nachgewiesen werden. Die FLT4-Expression eines Mausembryos 8,5 Tage p.c. wird in (B) und (C) gezeigt. Die Pfeile zeigen auf FLT4-positive Zellen im Endothel der hinteren Kardinalvene (cv) in der Allantois (al) in (B) und im Angioblast (ab) des Kopfmesenchyms in (C). In einer Plazenta 8,5 Tage p.c., können FLT4-Transkripte in Endothelzellen der venösen Lakunen (vl) (D) erkannt werden. Feld E und F zeigen einen Vergleich der FLT4 und Tie-Hybridisierungssignale in Embryonen 11,5 Tage p.c. Der Bereich der sich entwickelnden dorsalen Aorta und des Metanephros (mn) wird gezeigt (20x). Beachten sie, dass die dorsale Aorta für FLT4 negativ ist, aber positiv für Tie-mRNA, wohingegen beide Sonden mit dem Endothel der subendokardinalen Vene (sv) hybridisieren. Außerdem ergibt die FLT4-Sonde ein Signal mit der metanephrischen Vene (v), wohingegen Tie hauptsächlich mit den metanephrischen Kapillaren (c, Pfeile) hybridisiert. da: dorsale Aorta, ng: neurale Furche. Maßstableiste: 30 μm.
3. FLT4-mRNA-Expression in einem Embryo 12,5 Tage p.c. Es wird ein sagittaler Schnitt durch die axilläre Ebene gezeigt. Beachten sie, dass FLT4-mRNA in den erweiterten Gefäßen der Axilla (ax) markant ist, in einem Plexus-ähnlichen Muster im perorbitalen (po) Bereich, im paravertebralen Gewebe (Pfeilspitzen) und im subkutanen (sc) Gewebe. b: Gehirn, li: Leber. Maßstableiste: 5 μm.
4. FLT4 in Embryonen 14 und 16.5 Tage p.c. Felder A und B zeigen Hell- und Dunkelfeldbilder eines mittel-sagittalen Schnittes. po: perorbital Bereich, lj: Unterkiefer, ne: Nackenbereich, sc: Subkutis, mt: Mesenterium, ao: Aorta, dt: Milchbrustgang. (C) zeigt einen querverlaufenden Schnitt eines 16,5-Tage-Embryos in einer Hämatoxylin-Eosin-Färbung. th: Thymus, tr: Trachea, e: Ösophagus, ca: Karotis, ba: brachiocephale Arterie, dt: Milchbrustgang. (D) zeigt eine höhere Vergrößerung (40x) des Bereiches des Ductus Thoracicus; Die Körnung des Autoradiogramms kann über den Endothelzellen erkannt werden. Außerdem ist das kleine Gefäß (v) im oberen Teil des Photos positiv. Maßstableisten: 10 μm (A-C), 1 μm (D).
5. Vergleich von FLT4 und Tie-mRNA-Expression in gezüchteten Endothelzellen. Northern-Blot-Analyse von polyadenylierter RNA von menschlichen Vorhaut-Mikrogefäßen (MV), Oberschenkelvene (VE), Aorta (AO) und Nabelvene (HU)-Endothelzellen. Für einen Vergleich wird das Hybridisierungssignal der Tie-Rezeptor-Tyrosin-Kinasen-mRNA gezeigt. Die aus der unspezifischen Bindung der Sonde an die ribosomale RNA resultierenden Banden, sind mit Sternchen markiert.
6. FLT4 in erwachsenen menschlichen Lymphgefäßen des Mesenteriums (A, B), Lunge (C, D) und Mandel (E, F). Beachten sie dass nur Lymphgefäße in A und C ein FLT4-Signal ergeben, wohingegen die Venen, Kapillaren und die Arterien negativ für FLT4-mRNA sind. In der Mandel wird das Signal im Endothel von manchen HEVs festgestellt. Maßstableiste: 200 μm.
7. FLT4-mRNA im normalen (A, B) und Metastasen-bildenden (C, D) Lymphknoten und im Lymphangiom (E-G). Pfeilspitzen markieren die lymphatischen Sinuse und HEVs, welche FLT4-positiv sind. Ein Vergleich von FLT4 und von Willebrand-Faktorsignalen zeigt beide im lymphatischen Endothel, aber nur von Willebrand-Faktorsignal im kapillaren (c) und venösen (v) Endothel. Maßstableiste: 10 μm (A-D) und 100 μm (E-G).
8. FLT4-Expression in fötalen mesenterialen Gefäßen, nachgewiesen durch Immunperoxydasefärbung. Schnitte werden mit affinitätsgereinigten anti-FLT4-Antikörpern (A), mit Antigen-blockiertem Antiserum (B) und mit Präimmunserum (C) und mit Antiserum spezifisch gegen das Faktor VIII-verwandte Antigen (D) gefärbt. Beachten sie dass die Färbung auf manche aber nicht auf alle Gefäße beschränkt ist (v). Maßstableiste: 0,05 mm.
GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Indem sie die Wichtigkeit der Identifizierung von Veränderungen im lymphatischen Gewebe, besonders in Lymphknoten im Zusammenhang mit Metastasen-bildenden Krebsarten und immunologischen Krankheitsstadien erkannt haben, haben die hier genannten Erfinder gezeigt, dass FLT4 ein spezifischer Marker ist, welcher lymphatisches Gefäß-Endothel nachweist und daher als ein Marker für lymphatische Veränderungen in pathologischen Zuständen im Menschen nützlich ist.
Die hier genannten Erfinder haben früher gezeigt, dass sich die Expressionsmuster von FLT4, im Vergleich zu FLT1 und KDR, in den Geweben von 18-Wochen alten menschlichen Föten stark unterscheiden⁽⁴⁾. Um die Rolle von FLT4 während der Entwicklung zu verstehen, haben die Erfinder partielle cDNAs für Maus-FLT4 cloniert. Unter Verwendung dieser Sonden in der in situ Hybridisierung wurde die FLT4-mRNA-Expression während der Entwicklung der Maus analysiert und es wurde festgestellt, dass FLT4 während der Vaskulogenese und Angiogenese des lymphatischen Systems exprimiert wird. Die Bedeutung dieser Ergebnisse wurde in normalen und pathogenen menschlichen erwachsenen Geweben bestätigt, indem FLT4 in lymphatischen Endothelzellen von menschlichen Erwachsenen Geweben sowohl unter normalen als auch unter pathologischen Bedingungen festgestellt wurde, sowie auch in manchen Venolen mit hohem Endothel (HEVs).
Die Clonierung von Maus-FLT4-cDNA-Fragmenten zeigte, dass ihre abgeleitete Aminosäuresequenz fast identisch ist mit der entsprechenden menschlichen Sequenz (Aminosäure-Identität in beiden untersuchten Segmenten etwa 96%). Ein weiterer Hinweis für die Identität der Maus-FLT4-cDNA wurde durch Northern-Hybridisierung erhalten, wo Proben von beiden Arten das typische 5,8 kb mRNA-Signal von Mausgeweben ergaben. Die Analyse der von verschiedenen Geweben der erwachsenen Mäuse isolierten RNA zeigte FLT4-Expression in der Leber, Lunge, Herz, Milz und Niere, mit keiner oder nur wenig Hybridisierung im Gehirn und den Hoden. Dieses Muster ist ähnlich dem früher von Galland et al.⁽⁵⁾ berichteten Muster. Die Ergebnisse der RNase-Protection deuteten darauf hin, dass das FLT4-Gen während der Maus-Entwicklung gebraucht wird, beginnend von Embryonen 8,5 Tage p.c. und die relativen Expressionsmengen erschienen ziemlich stabil.
Für die in situ Hybridisierung wurden zwei Fragmente der Maus-FLT4-cDNA ausgewählt, welche Sequenzen der extrazellulären Domäne codieren. Das ermöglichte eine klare Unterscheidung der Hybridisierungsmuster von den verwandten FLK-1 und FLT-1-Rezeptormustern, welche in der extrazellulären Region ein sehr niedriges Ausmaß an Sequenzidentität mit FLT4 zeigen^(6,7,8,9). FLT4 wurde, ähnlich zu den FLK-1, FLT-1, Tie und Tek endothelialen Rezeptor-Tyrosin-Kinasegenen in Embryonen 7,5 Tage p.c. nicht exprimiert. In einem 8,5-Tage p.c. Embryo war das stärkste FLT4-Signal in der Allantois, dem Angioblast des Kopfmesenchyms und der Kardinalvene lokalisiert. Im Gegensatz dazu waren die dorsale Aorta, das Endokards des Herzens und der Angioblast des Dottersackes negativ, im Gegensatz zu Tie, Tek, FLK-1 und FLT-1, Tie und Tek^(10,8). Die Beschränkung der FLT4-Expression auf das venöse System war in Proben von 11,5-Tage-Mausembryonen sogar noch klarer, wobei die Tie-mRNA auch in Arterien exprimiert wurde. In Embryonen 12,5-Tage p.c. bedeckte das FLT4-Signal sich entwickelnde venöse und mutmaßlich lymphatische Endothelien, aber im Gegensatz zur endothelialen Tie-Rezeptor-Tyrosin-Kinase waren arterielle Endothelien negativ. Während späterer Entwicklungsstadien wurde FLT4-mRNA auf die vaskulären Nervengeflechte, die frei von Blutzellen sind, beschränkt, welche die sich entwickelnden Lymphgefäße darstellen. Nur das lymphatische Endothel und manche Venolen mit hohem Endothel exprimierten FLT4-mRNA in erwachsenen menschlichen Geweben. Vermehrte Expression fand in lymphatischen Sinusen und in Venolen mit hohem Endothel in Metastasen-bildenden Lymphknoten und in Lymphangiomen statt.
Aufgrund der Schwierigkeiten bei der Deutung der Daten von Mausembryonen wurden menschliche Endothelien untersucht, da das lymphatische System in Menschen viel besser definiert ist. Außerdem konnten Zellen, die von verschiedenen Endothelien etabliert waren, in Zellkultur untersucht werden, um zu sehen, ob die Spezifität der FLT4-Expression auch unter in vitro Bedingungen bestehen bleibt. Von Endothelzelllinien ist bekannt, dass sie Differenzierungsmerkmale nach in vitro Züchtung verlieren. Es war daher nicht unerwartet, dass sie negativ für FLT4 waren. Gezüchtete Aorta-Endothelzellen waren auch frei von FLT4-mRNA. Von menschlichen Endothelzellen, die von den Mikrogefäßen und von Oberschenkel- und Nabelvenen isoliert wurden, wurden jedoch Signale erhalten. Demgemäß wurde in der Zellkultur zumindest ein wenig der Spezifität der FLT4-Expression bewahrt.
In situ Hybridisierungsanalyse von erwachsenen menschlichen Geweben bestätigte die Beschränkung von FLT4 auf das lymphatische System, welches in den sich entwickelnden Mausembryonen beobachtet wurde. Die FLT4-Expression wurde in den lymphatischen Endothelien und in den Sinusen von menschlichen Lymphknoten beobachtet. Interessanterweise waren auch manche der HEVs, welche ein kubisches Endothel aufweisen und von welchen gezeigt wurde, dass sie sich beim Trafficking der Lymphozyten zu den Lymphknoten betätigen, FLT4 positiv. Darüber hinaus zeigte eine parallele Hybridisierungsanalyse, dass FLT4-mRNA-Mengen in diesen Strukturen in Metastasen-bildenden, verglichen mit normalen Lymphknoten, verstärkt waren. FLT4 war auch in Lymphangiomen sehr markant, welche gutartige Tumore darstellen, bestehend aus Bindegewebsstroma und wachsenden mit Endothel ausgekleideten lymphatischen Kanälen. FLT4-mRNA war auf das lymphatische Endothel dieser Tumore beschränkt und fehlte in ihren Arterien, Venen und Kapillaren. In der menschlichen Lunge waren wir in der Lage lymphatische Strukturen zu identifizieren, welche die einzigen FLT4-positiven Gefäße in diesem Gewebe darstellten.
Die vorangehenden Ergebnisse deuten darauf hin, dass FLT4 ein neuer Marker für Lymphgefäße und manche Venolen mit hohem Endothel in menschlichen erwachsenen Geweben ist. Sie unterstützen auch die Theorie des venösen Ursprungs der Lymphgefäße. Als ein Wachstumsfaktor-Rezeptor, kann FLT4 auch an der Differenzierung und an Funktionen dieser Gefäße beteiligt sein.
Zusammengefasst mit den FLT4-bindenden Verbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung ermöglichen diese Ergebnisse ein selektives Markieren des lymphatischen Endothels, besonders unter Verwendung der Antikörper der vorliegenden Erfindung gekoppelt an radioaktive, elektronendichte oder andere Reporter-Substanzen, welche sichtbar gemacht werden können. Es kann möglich sein Substanzen in das lymphatische System zu injizieren, die FLT4-Rezeptor Internalisierungs-induzierende monoclonale Antikörper enthalten und dadurch vordefinierte Moleküle in das lymphatische Endothel transportieren. Außerdem kann es möglich sein, solche FLT4-bindende Verbindungen in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung für den Nachweis von Venolen mit hohem Endothel, besonders aktivierten HEVs, zu verwenden, welche erhöhte Mengen an FLT4-Rezeptor exprimieren. Unseres Wissens sind zurzeit keine solchen spezifischen Marker für lymphatisches Endothel vorhanden.
Die folgenden Beispiele werden lediglich angeführt, um die vorliegende Erfindung zu veranschaulichen und nicht um ihren Umfang in irgendeiner Weise einzuschränken.
BEISPIELE
BEISPIEL 1
Clonierung von Maus-FLT4-cDNA-Sonden
Ungefähr 10⁶ Plaques von einer IFIX^®II genomischen Genbank von 129SV-Mäusen (Stratagene) wurden mit dem S2.5 menschlichen FLT4-Rezeptor-cDNA-Fragment durchmustert, welches die extrazelluläre Domäne⁽³⁾ umfasst. Ein 2,5 kb BamHI-Fragment wurde von einem positiven Plaque subcloniert und von beiden Enden sequenziert. Es wurde von diesem Subclon Polymerasekettenreaktion verwendet, um ein Exon-Fragment, welches die Nucleotide 1745-2049 der Maus-FLT4-cDNA-Sequenz umfasst⁽⁹⁾, zu amplifizieren und in den pBluescript KSII+/-Vektor (Stratagene) zu clonieren.
Ein zweites Fragment, welches die Nucleotide 1-192 umfasste, wurde auf gleiche Weise cloniert.
BEISPIEL 2
Analyse von FLT4-mRNA in Mausgeweben
Gesamt-RNA wurde von sich entwickelnden Embryonen (8-18 Tage p.c. und einen Tag alten Mäusen) in Übereinstimmung mit Chomczynski et al.⁽¹¹⁾ isoliert. Die Probe von 8-Tagen p.c. Embryonen schloss auch Plazenta ein.
Zur RNase-Protection-Analyse wurde eine RNA-Sonde vom linearisierten FLT4-Plasmid hergestellt, welches gemäß Beispiel 1 unter Verwendung von [³²P]-UTP und T7-Polymerase für die Antisense-Orientierung erhalten wurde. Die verwendete β-Actin-Sonde entspricht den Nucleotiden 1188-1279 der veröffentlichten Maus-β-Actinsequenz⁽¹²⁾. Nach Reinigung in einem 6% Polyacrylamid/7 M Harnstoff-Gel wurden die markierten Transkripte mit 30 μg Gesamt-RNA über Nacht bei 52°C hybridisiert. Nicht-hybridiserte RNA wurde mit Rnase A (10 E/ml) und T1 (1 μg/ml) bei 37°C pH-Wert 7,5 für 1 Stunde gespalten. Die RNasen wurden durch Proteinase K-Spaltung bei 37°C für 15 Minuten inaktiviert und die Proben wurden in einem 6% Polyacrylamid/7 M Harnstoff-Gel analysiert.
Die Expressionsmuster des in diesem Experiment analysierten FLT4 zeigte, dass sehr schwache mRNA-Signale von der Lunge, Leber, Herz, Nieren, Skelettmuskel und Milz erhalten wurden, wohingegen die Hoden und das Gehirn offensichtlich kein spezifisches Signal aufwiesen (1A). Die Analyse einer Reihe an RNAs, welche während unterschiedlicher Phasen der Mausentwicklung durch RNase-Protection-Tests gesammelt wurden zeigte, dass die FLT4-mRNA während der Embryogenese von Tag 8 p.c. bis zu neugeborenen Mäusen, ohne große Schwankungen in der Signalintensität (1B), exprimiert wurde.
BEISPIEL 3
In situ Hybridisierung für FLT4 in Mausembryonen
Um FLT4-Transkripte besser zu Zellen und Geweben zuordnen zu können, wurden Schnitte von Mausembryonen 7,5 und 8,5 Tage p.c. mit markierten FLT4-RNAs hybridisiert. Mausembryonen stammten aus Paarungen von CBA- und NMRI-Mäusen. Trächtige Mäuse wurden durch Dislokation der Halswirbel getötet und die Embryonen wurden entweder sofort eingefroren oder über Phosphat-gepufferter Salzlösung in 4% Paraformaldehyd überführt. Die Embryonen und isolierten Mausorgane wurden für 18 Stunden bei 4°C fixiert, dehydriert, in Paraffin eingebettet und in 6 μm Schnitte geschnitten.
RNA-Sonden (Antisense und Sense) von 192 und 349 Nucleotiden (siehe Beispiel 1) wurden von linearisierten Plasmiden unter Verwendung von [³⁵S]-UTP erzeugt. In situ Hybridisierung der Schnitte wurde gemäß Wilkinson et al.^(13,14), mit den folgenden Veränderungen, durchgeführt: 1) Xylen wurde vor dem Einbetten in Paraffinwachs statt Toluen verwendet, 2) 6 μm Schnitte wurden geschnitten und auf eine Schicht von mit Diethyl-Pyrocarbonat-behandeltem Wasser auf die Oberfläche von Glas-Objektträgern gelegt, welche mit 2% 3-Triethoxysilypropylamin vorbehandelt waren, 3) Alkalische Hydrolyse der Sonden wurde unterlassen und 4) das Waschen mit hoher Stringenz dauerte 80 Minuten bei 65°C in einer Lösung, die 30 mM DTT und 1 × SSC enthielt. Die Schnitte wurden mit NTB-2 Emulsion (Kodak) bedeckt und bei 4°C gelagert. Die Objektträger wurden für 14 Tage belichtet und mit Hämatoxylin gefärbt. Kontrollhybridisierungen mit Sense-Strang und RNase-behandelten Schnitten haben keine spezifischen Signale über dem Hintergrund ergeben.
FLT4-mRNA wurde wie in 2A und B gezeigt, in 7,5-Tage p.c. Mausembryonen nicht exprimiert, aber starke Signale wurden in der hinteren Kardinalvene (cv) an Tag 8,5 der Entwicklung nachgewiesen. Im Gegensatz dazu war das sich entwickelnde Herz (Daten nicht gezeigt) und die dorsale Aorta (da) FLT4-negativ. In den außerembryonischen Geweben wurde FLT4 hauptsächlich in der Allantois (al in Feld B) exprimiert, wohingegen sich entwickelnde Blutinseln des Dottersackes negativ waren (Daten nicht gezeigt). Andererseits waren die Angioblasten des Kopfmesenchyms stark FLT4-positiv (C). In der sich entwickelnden Plazenta wurde das FLT4-Signal zuerst in den peripheren sinusoidalen Venen erkannt (Daten nicht gezeigt). In der 9,5-Tage p.c. Plazenta exprimierte das Endothel der venösen Lakunen (vl in D) und die Riesenzellen, welche teilweise mit der Reichert-Membran fusioniert (Daten nicht gezeigt) waren, FLT4-mRNA.
Demnach schien die FLT4-Expression, obwohl sie in den frühesten Endothelzellvorläufern, den Angioblasten, sehr markant war, nur auf bestimmte Gefäße von 8,5-Tage p.c. Embryonen beschränkt zu sein. Vom Tie-Rezeptor ist bekannt, dass er in allen Endothelzellen der sich entwickelnden Mausembryonen exprimiert wird und daher einen Marker für diese Zellen bereitstellt. Besonders im Gegensatz zur Tie-Sonde hybridisiert die FLT4-Sonde sehr schwach wenn überhaupt mit arteriellen Endothelien von 11,5-Tage p.c. Embryonen, z.B. mit dem Endothel der sich entwickelnden dorsalen Aorta (da in 2E, F) oder der karotischen Arterien (Daten nicht gezeigt). Stattdessen war das FLT4-Signal in den sich entwickelnden Venen viel markanter. Zum Beispiel wurde das FLT4-Signal in Venen nachgewiesen, die den sich entwickelnden Metanephros (v, sv in E) umgeben, während die Tie-Sonde hauptsächlich Kapillaren (c) innerhalb des Metanephros (F) erkannte.
Wie aus 3 entnommen werden kann, ist die FLT4-mRNA in mehreren Bereichen eines 12,5-Tage p.c. Mausembryos verteilt und besonders markant in den erweiterten Gefäßen des axillären Bereichs (ax). Eine ähnlich positive Gefäßstruktur wurde im mittleren Sagittalschnitt des Halsbereiches (Daten nicht gezeigt) erkannt. Ein Plexus-ähnliches Muster der FLT4-exprimierenden Gefäße trat im perorbital Bereich (po) und in der Umgebung der sich entwickelnden Wirbel (vb) auf. Außerdem war genau unter der sich entwickelnden Haut ein FLT4-positives vaskuläres Netzwerk (sc) offensichtlich. Schwächere Kapillarsignale wurden von verschiedenen Bereichen erhalten, einschließlich des sich entwickelnden Gehirns (g). FLT4-mRNA konnte auch in kleinen Gefäßen des Nackenbereichs, der sich entwickelnden Schnauze und an der Basis der sich entwickelnden Zunge sowie im Schwanzbereich (Daten nicht gezeigt), nachgewiesen werden. Außerdem war die Leber (le) in einem Fleck-ähnlichen Muster stark positiv für FLT4-mRNA.
Während der weiteren Entwicklung schien FLT4-RNA mehr auf bestimmte Gefäße des Embryos eingeschränkt zu werden. Ein Embryo 14,5-Tage p.c. zeigte dieses eingeschränkte Expressionsmuster gut (4A, B). Im mittelsagittalen-Schnitt von 4 ist das markanteste FLT4-Signal im vorderen Teil entlang der sich entwickelnden Wirbelsäule zu erkennen. Es wurde angenommen, dass das Signal aus Endothelzellen des Milchbrustganges (dt) stammte, welcher das größte zu dieser Entwicklungszeit gebildete Lymphgefäß darstellt. Im Gegensatz dazu waren die dorsale Aorta (da) und die untere Vena cava (vc) negativ. Erweiterte Gefäße im mesenterischen Bereich waren für FLT4 auch stark positiv. Darüber hinaus enthielten, wie in den Embryonen 12,5 Tage p.c., Gefäßnetzwerke entlang der anatomischen Grenzen im Perorbital (po), Unterkiefer (lj) sowie im Nackenbereich (na) FLT4-positive Endothelien. Ähnliche Strukturen waren in der Perikardhöhle und überall im subkutanen Gewebe (sc) vorhanden. Besonders im Gegensatz zu FLT4-negativen Gefäßen fehlten allen FLT4-positiven Gefäßen Blutzellen in ihren Lumen. Diese Expressionsmuster deuten darauf hin, dass FLT4 zu dieser Entwicklungszeit auf die Endothelien der Lymphgefäße beschränkt wird. Eine zusätzliche Stelle wo wir FLT4-Expression beobachtet haben, war im Sinusoid des sich entwickelnden Knochenmarks (bm).
Photographien eines querverlaufenden Schnittes des oberen Thorax eines Embryos 16.5 Tage p.c., hybridisiert mit der FLT4-Sonde, werden in Feld C und D von 4 gezeigt. Der in C gezeigte Schnitt ist mit Hämatoxylin-Eosin gefärbt worden, um die verschieden Arten an Gefäßen in diesem Gebiet sichtbar zu machen. Diese schließen die karotischen und brachicephalen Arterien (ca, ba), die Vena cava (vc) und den Milchbrustgang ein, welcher kleiner ist und dem das umgebende muskuläre- und Bindegewebe (Pfeil) fehlt. Eine Vergrößerung des Bereiches des Milchbrustgangs wird in Feld D gezeigt, wo die FLT4 autoradiographische Körnung erkannt werden kann. Endothelzellen des Milchbrustgangs, sowie ein kleines Gefäß (v) in der Nähe, hybridisieren mit der FLT4-Sonde.
BEISPIEL 4
Analyse von FLT4-mRNA in gezüchteten Endothelzellen
Die in Beispiel 3 beschriebenen Ergebnisse der in situ Hybridisierung zeigten, dass FLT4 in den venösen Endothelzellen exprimiert wird und später in Lymphgefäßen und manchen venösen Endothelzellen, aber nicht in den arteriellen Endothelien. Um zu erkennen, ob eine solche Regulation in vitro beibehalten wurde, haben wir gezüchtete Endothelzellen unter Verwendung von Northern-Blot und Hybridisierungs-Analyse untersucht.
Endothelzellen von der menschlichen Aorta, Oberschenkelvene, Nabelvene und von den Mikrogefäßen in der Vorhaut wurden isoliert, gezüchtet und wie vorher von Van Hinsberg⁽¹⁵⁾ beschrieben charakterisiert. Sie wurden bei einer konfluenten Dichte nach fünf bis acht Passagen (Teilungsrate 1:3) zur Isolierung von polyadenylierter RNA verwendet.
Die Endothelzelllinien EA hy926, BCE und LEII haben FLT4 nicht exprimiert (Daten nicht gezeigt). Gezüchtete menschliche mikrovaskuläre, venöse und Nabelvenen-Endothelzellen waren jedoch positiv für die FLT4-spezifischen 5,8 und 4,5 kb mRNAs, wohingegen die Aorta-Endothelzellen negativ waren (5). Im Gegensatz dazu wurde ein anderes endotheliales Rezeptor-Tyrosin-Kinasegen, Tie, als eine 4,4 kb mRNA in allen endothelialen Zellarten untersucht.
BEISPIEL 5
FLT4-mRNA in erwachsenen menschlichen Geweben
Die in Beispiel 3 erhaltenen Ergebnisse deuten darauf hin, dass die FLT4-mRNA während der Entwicklung weitgehend auf das Endothel der Lymphgefäße beschränkt wird. Aufgrund der möglichen Bedeutung dieser Ergebnisse in Menschen, haben wir FLT4 unter Verwendung einer menschlichen FLT4-Sonde auch in erwachsenen menschlichen Geweben untersucht. Die verwendete menschliche FLT4-Sonde war ein EcoRI-SphI-Fragment, welches die Basenpaare 1-595 der cDNA⁽⁴⁾ umfasste. Die von Willebrand-Faktorsonde war ein EcoRI-HindIII-Fragment, welches die Basenpaare 1-2334⁽¹⁷⁾ umfasste.
Wir haben routinemäßig fixiertes Material verwendet, das zur histopathologischen Diagnose gesandt wurde. Normales Lungengewebe wurde von einer Resektion des linken unteren Lungenlappens erhalten, der durch epidermoiden Krebs angegriffen war. Mesenterium und mesenteriale Lymphknoten wurden von einem Patienten erhalten, der ein Adenokarzinom des Kolons aufwies. Ein normaler neben der Speicheldrüse liegender Lymphknoten wurde aufgrund seiner abnormalen Größe enukleiert. Die Mandeln von zwei Patienten und die zwei Appendixe wiesen keine diagnostischen Veränderungen auf. Zwei Lymphangiomyome und drei zystische Lymphangiome wurden mit ähnlichen Ergebnissen untersucht.
Von menschlichen Geweben, welche mit 10% Formalin fixierte Routineproben für histopathologische Diagnosen waren, ergab das normale in situ Protokoll nur Hintergrund, wohingegen eine Mikrowellenbehandlung anstatt Proteinase K eine spezifische Hybridisierung ermöglichte^(18,19).
Im Mesenterium, Lunge und Appendix ergaben die lymphatischen Endothelien (lv) FLT4-Signale, während Venen (v), Arterien (a) und Kapillaren (k) negativ waren (6A–D und nicht gezeigte Daten). Um zu untersuchen ob FLT4 in den HEVs exprimiert wird, wurden die Mandeln untersucht. In der Tat wurden in den Mandeln FLT4-spezifische autoradiographische Körnungen in manchen HEVs (E, F) nachgewiesen.
BEISPIEL 6
Analyse von FLT4-mRNA in normalen und Metastasen-bildenden Lymphknoten und in Lymphangiomen
Ein Teil eines menschlichen mesenterialen Lymphknotens (siehe Beispiel 5) wurde auf FLT4-Expression hin analysiert. Die Ergebnisse werden in 7 gezeigt.
FLT4 wird in den lymphatischen Sinusen (ls) und in den afferenten und efferenten Lymphgefäßen exprimiert (Daten nicht gezeigt). Das gleiche Muster wird in einem Lymphknoten erkannt, welcher Adenokarzinom-Metastasen enthält (C, D). Manche HEVs, sowohl in normalen als auch in Metastasen-bildenden Lymphknoten, waren auch positiv. In Feld E, wird die FLT4-Expression in einem zystischen Lymphangiom gezeigt (vergleiche mit dem Hämatoxylin-Eosin-gefärbten Schnitt in F). Besonders die Spezifität von FLT4 zu lymphatischen Endothelien ist von dem Vergleich mit den in situ Signalen für von Willebrandt-Faktor in allen Blutgefäßen (F) offensichtlich.
BEISPIEL 7
Lokalisierung von FLT4 in fötalen Endothelzellen
Ein FLT4-cDNA-Fragment, welches die 40 carboxyterminalen Aminosäuren der kurzen Form codiert, wurde im Leserahmen mit der für die Glutathion-S-Transferase codierenden Bereich als ein 657 bp EcoRI-Fragment in den bakteriellen Expressionsvektor pGEX-1IT (Pharmacia) cloniert. Das resultierende GST-FLT4- Fusionsprotein wurde in E. coli produziert und durch Affinitätschromatographie unter Verwendung einer Glutathion-Sepharose 4B-Säule gereinigt. Das gereinigt Protein wurde lyophilisiert, in PBS aufgelöst, mit Freudschem Adjuvans gemischt und zur Immunisierung von Kaninchen verwendet. Antiseren wurden nach der vierten Booster-Immunisierung verwendet.
Gewebe von 17 und 20-Wochen alten menschlichen Föten wurden von legalen mit Prostaglandinen induzierten Abtreibungen erhalten. Die Studie war durch die ethische Kommission des Helsinki University Central Hospitals genehmigt. Die Schwangerschaftsdauer wurde von der fötalen Fußlänge geschätzt. Die fötalen Gewebe wurden in Tissue-Tek (Miles) eingebettet, sofort eingefroren und bei –70°C gelagert.
Anti-FLT4-Antiserum wurde an eine GST-Sepharosesäule quervernetzt angelagert, um anti-GST-Antikörper zu entfernen und dann mit GST-FLT4 Affinitätschromatographie gereinigt. Mehrere 6 μm-dicke Cryostat-Schnitte der Gewebe wurden mit Aceton fixiert und mit 0,3% H₂O₂ in Methanol für 30 Minuten behandelt, um exogene Peroxydaseaktivität zu blockieren. Nach dem Waschen wurden die Schnitte mit 5% normalem Schweineserum inkubiert. Die Schnitte wurden dann mit Antikörpern gegen FLT4 inkubiert, gewaschen und gebundene Antikörper wurden mit Peroxydase-konjugiertem Schwein-anti-Kaninchen IgG nachgewiesen, gefolgt von einer Färbung für Peroxydaseaktivität unter Verwendung von 0,2% 3,3-Diaminobenzidin (Amersham) als Substrat. Die Schnitte wurden in Meyer's Hämatoxylin gegengefärbt.
Anti-FLT4-Immunperoxydase-Färbung von menschlichem fötalem Mesenterium zeigte FLT4-Protein im Endothel von mehreren Gefäßen (4A), während Kontrollfärbungen mit Antigen-blockierten anti-FLT4-Antikörpern (B) und Präimmunseren (C) negativ waren. Zum Vergleich zeigt 4D Ergebnisse einer Färbung unter Verwendung eines Antiserums gegen das Faktor-VIII-verwandte Antigen, welches für vaskuläre Endothelzellen spezifisch ist.
BEISPIEL 8
Produktion von monoclonalen Antikörpern gegen FLT4
Fusion I:
Vier Monate alte männliche Balb/c-Mäuse wurden durch intraperitoneale Injektion des auf rekombinante Weise produzierten FLT4-Proteins (siehe Beispiel 7) in konzentriertem Medium (150 μg/Maus) immunisiert, mit komplettem Freudschem Adjuvans emulgiert. Booster-Injektionen von 150 μg wurden in Intervallen von drei bis vier Wochen verabreicht und ein letzter Booster (10 μg FLT4 in PBS intraperitoneal verabreicht) wurde in einem weiteren 3-Wochen-Intervall gegeben. Vier Tage nach der letzten Boosterdosis wurden die Mäuse getötet und die Lymphzellen der Mausmilz wurden jeweils bei einem 2:1-Verhältnis mit SP 2/0 Plasmacytomzellen fusioniert.
Die fusionierten Zellen wurden in Kulturplatten mit 96-Vertiefungen (NUNC) in Ex-Cell-320-Medium (SERALAB) geerntet, welches 20% fötales Kälberserum und HAT-Ergänzung (Hypoxanthin-Aminopterin-Thymidin; GIBCO, 043-01060H; 50-fach verdünnt) enthielt. Die Zellen wurden bei +37°C in einer 5% CO₂-Atmosphäre gezüchtet. Nach 10 Tagen wurde das HAT-ergänzte Medium mit HT-ergänztem Zellkulturmedium ausgetauscht (GIBCO; 043-01065H, 50-fach verdünnt). HT-Medium ist identisch mit HAT-Medium, aber es fehlt ihm Aminopterin.
Durch den in Beispiel 10 beschriebenen Antigen-spezifischen ImmunoFluoroMetrischen Test IFMA wurde in 3 Wochen die spezifische Antikörperproduktion bestimmt. Die Hauptclone wurden, wie beschrieben von Staszewski et al., Yale Journal of Biology and Medicine, 57: 865-868 (1984), durch limitierte Verdünnungen cloniert. Positive Clone wurden auf Gewebekulturplatten mit 24 Vertiefungen (NUNC) expandiert, wieder cloniert und wieder durch das gleiche Verfahren überprüft. Positive Clone wurden mittels Fluoreszenz-aktivierter-Zell-Sortierung (FACS) überprüft.
Die stabilen Clone sonderten Immunglobuline ab, welche zur IgG1-Klasse gehörten, außer einem, der Ig produzierte, welches wahrscheinlich zur IgA-Klasse gehörte. Die Unterklasse des monoclonalen Antikörpers wurde unter Verwendung von Ratten-monoclonalen Antikörpern gegen die Maus-Unterklasse als Biotin-Konjugat (SEROTEC) in IFMA, bestimmt.
Balb/c-Mäuse wurden verwendet, um monoclonale Antikörper in Ascitesflüssigkeit zu erzeugen. Die vorstehend beschriebenen Hybridome wurden nach Vorbehandlung der Tiere mit Pristan (2, 6, 10, 14-Tetramethylpentadecan 98%, ALDRICH-CHEMIE D7924 Steinheim, Kat. Nr. T 2,280-2) intraperitoneal in die Mäuse injiziert. 0,5 ml Pristan (i.v.) wurde etwa zwei Wochen vor den Hybridomzellen injiziert. Die injizierte Zellmenge war etwa 7,5 bis 9 × 10⁶ pro Maus. Ascites wurde 10 bis 14 Tage nach Injektion der Hybridome geerntet.
Fusion II:
Zwei Monate alte Balb/c-Mäuse (weiblich) wurden durch intraperitoneale Injektion des auf rekombinante Weise erzeugten FLT4-Proteins (siehe Beispiel 7) (20 μg/Maus) immunisiert, mit komplettem Freudschem Adjuvans emulgiert. Booster-Injektionen von 20 μg wurden bei Intervallen von drei bis zu vier Wochen verabreicht und ein letzter Booster (10 μg FLT-4 in PBS, i.v. verabreicht) wurde nach einem weiteren 3-Wochen-Intervall gegeben Tage nach der letzten Boosterdosis wurden die Mäuse getötet und Lymphzellen aus der Mausmilz wurden jeweils in einem Verhältnis von 2:1 mit Plasmacytomzellen fusioniert.
Die fusionieren Zellen wurden in Kulturplatten mit 96 Vertiefungen (FALCON) in OptiMEM 1(mit Glutamax 1, 51985-026, GIBCO BRL)-Medium geerntet, welches 20% fötales Kälberserum und HAT-Ergänzung (Hypoxanthin-Aminopterin-Thymidin; GIBCO BRL, 21060-017; 50-fach verdünnt) enthielt. Die Zellen wurden bei +37°C in einer 5% CO₂-Atmosphere gezüchtet. Nach 10 Tagen wurde das HAT-ergänzte Medium mit HT-ergänztem Zellkulturmedium ausgetauscht (GIBCO BRL; 41065-012, 50-fach verdünnt). HT-Medium ist identisch mit HAT-Medium, aber es fehlt ihm Aminopterin.
Durch den in Beispiel 9 beschriebenen Antigen-spezifischen ImmunoFluoroMetrischen Test (IFMA) wurde in 3 Wochen die spezifische Antikörperproduktion bestimmt. Die Hauptclone wurden, wie beschrieben von Staszewski et al., Yale Journal of Biology and Medicine, 57: 865-868 (1984), durch limitierte Verdünnungen cloniert. Positive Clone wurden auf Gewebekulturplatten mit 24 Vertiefungen (NUNC) expandiert, wieder cloniert und wieder durch das gleiche Verfahren überprüft. Positive Clone wurden mittels Fluoreszenz-aktivierter-Zell-Sortierung (FACS) überprüft.
Die 2E11 und 6B2-Clone sonderten Immunglobuline ab, welche zur IgG₁-Klasse gehörten, 2B12-Clone produzierten Ig, die zur IgM-Unterklasse gehörten. Die Maus-Unterklasse-IgG₁ wurde unter Verwendung des Ratten-monoclonalen Antikörpers gegen die schwere Kette der Maus-Unterklasse als Biotin-Konjugat (SEROTEC) in FIMA bestimmt und die Maus-IgM-Unterklasse wurde mit dem Mausmonoclonalem-Antikörper-Isotyping-Kit (Dipstick Format) (19663-012, Life Technologies Inc.) bestimmt.
BEISPIEL 9
Spezifität der monoclonalen Antikörper gegen FLT4
Fusion I Antikörper:
Die in Beispiel 7 beschriebenen extrazelluläre Domäne wurde gemäß Mukkala et al., in Anal. Biochem. 176(2): 319-325, 1989, mit den folgenden Veränderungen markiert: ein 250-facher molarer Überschuss an Isothiocyanat DTTA-Eu (N1 Chelat, WALLAC, Finnland) wurde zu der FLT4-Lösung (0,5 mg/ml in PBS) hinzugefügt und der pH-Wert wurde durch Hinzufügen von 0,5 mol/l an Natrium-Carbonatpuffer, pH-Wert 9,8, auf etwa 9 eingestellt. Die Markierung wurde über Nacht bei +4°C durchgeführt. Nicht gebundener Marker wurde unter Verwendung von PD-10 (PHARMACIA, Schweden), mit TSA-Puffer (50 mmol/l Tris-HCl, pH-Wert 7,8, enthaltend 0,15 mol/l NaCl) als Elutionsmittel, entfernt.
Nach der Reinigung wurden 1 mg/ml Rinderserumalbumin zu dem markierten FLT4 hinzugefügt und der Marker wurde bei +4°C gelagert. Die Zahl der pro FLT4-Molekül inkorporierten Europiumionen war 1,9, wie bestimmt durch Fluoreszenzmessung in einem Verhältnis wie jenem, von bekannten EuCl₃-Standards (Hemmilä et al., Anal. Biochem., 137: 335-343, 1984).
Die in Beispiel 8 produzierten Antikörper wurden unter Verwendung eines Sandwich-Typ Immunfluorometrischen Tests unter Verwendung von Mikrotitrations-Streifen-Vertiefungen (NUNC, Polysorb) durchmustert, die mit Kaninchen-anti-Maus-Ig (Z 259, DAKOPATTS) beschichtet waren. Die vorbeschichteten Vertiefungen wurden einmal im Platewash 1296-024 (WALLAC) mit DELFIA-Waschlösung gewaschen. Der DELFIA-Testpuffer wurde als ein Verdünnungspuffer für Zellkulturüberstande verwendet und für das Serum der splenektomierten Maus (bei Verdünnungen zwischen 1:1000 bis 1: 100 000), welches als positive Kontrolle in den vorläufigen Durchmusterungstests verwendet wurde.
Eine Inkubation bei +4°C über Nacht (oder alternativ für 2 Stunden bei Raumtemperatur) wurde durch Schütteln auf einem Plattenschüttel-Schüttler (1296-001, WALLAC) für 5 Minuten begonnen, gefolgt von 4-mal Waschen mit einer wie vorstehend beschriebenen Waschlösung.
Das Europium-markierte FLT4 wurde bei einer Verdünnung von 1:500 in 100 μl des Testpuffers hinzugefügt. Nach 5 Minuten auf einem Plattenschüttel-Schüttler und einer Stunde Inkubation bei Raumtemperatur wurden die Streifen wie vorstehend beschrieben gewaschen.
Eine Verstärkerlösung (DELFIA) wurde mit 200 μl/Vertiefung hinzugefügt. Die Platten wurden dann für 5 Minuten auf einem Plattenschüttel-Schüttler geschüttelt und die Intensität der Fluoreszenz wurde durch ARCUS-1230 (WALLAC) für 10-15 Minuten gemessen. (Lövgren et al., In: Collins W. P. (Hrsg.) Alternative Immunoassays, John Wiley & Sons Ltd., 1985; Seiten 203-216).
Die daraus resultierenden monoclonalen Antikörper gegen FLT4 und entsprechende FACS-Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengefasst. TABELLE 2

a) FACS-Ergebnisse mit LTR-transfizierten Zellen
b) FACS-Ergebnisse mit NEO-Zellen (Kontrolle)

Bei einem als anti-FLT4 9D9F9 bezeichneten Clon wurde festgestellt, dass er einen monoclonalen Antikörper stabil absonderte, welcher durch IFMA als Immunglobulinklasse IgG1 bestimmt wurde. Das Hybridom 9D9F9 wurde bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Abteilung für Menschliche und Tierische Zellkulturen und Viren, Mascheroder Weg 1b, 3300 Braunschweig, Deutschland am 23. März 1995 hinterlegt, es wurde die Zugangsnummer ACC2210 verliehen.
Fusion II Antikörper:
Die extrazelluläre Domäne des in Beispiel 7 beschriebenen FLT-4 wurde gemäß Mukkala et al., in Anal. Biochem. 176(2): 319-325, 1989, mit den folgenden Veränderungen markiert: ein 250-facher molarer Überschuss an Isothiocyanat DTTA-Eu (N1 Chelat, WALLAC, Finnland) wurde zu der FLT4-Lösung (0,5 mg/ml in PBS) hinzugefügt und der pH-Wert wurde durch Hinzufügen von 0,5 mol/l an Natrium-Carbonatpuffer, pH-Wert 9,8, auf etwa 9 eingestellt. Die Markierung wurde über Nacht bei +4°C durchgeführt. Nicht gebundener Marker wurde unter Verwendung von PD-10 (PHARMACIA, Schweden), mit TSA-Puffer (50 mmol/l Tris-HCl, pH-Wert 7,8, enthaltend 0,15 mol/l NaCl) als Elutionsmittel, entfernt.
Nach der Reinigung wurde 1 mg/ml Rinderserumalbumin zu dem markierten FLT-4 hinzugefügt und der Marker wurde bei +4°C gelagert. Die Zahl der pro FLT4-Molekül inkorporierten Europiumionen war 1,9, wie bestimmt durch Fluoreszenzmessung in einem Verhältnis wie jenem, von bekannten EuCl₃-Standards (Hemmilä et al., Anal. Biochem., 137: 335-343, 1984).
Die in Beispiel 8 produzierten Antikörper wurden unter Verwendung eines FLT-4-spezifischen IFMA unter Verwendung von Mikrotitrationsvertiefungen (Nunc, Polysorb) durchmustert, die mit Kaninchen-anti-Maus-Ig (Z 259, DAKO) beschichtet waren. Die vorbeschichteten Vertiefungen wurden einmal mit Waschlösung (Wallac) unter Verwendung von DELFIA-Plattenwaschlösung gewaschen.
Der DELFIA-Testpuffer wurde als ein Verdünnungspuffer für Zellkulturüberstände (Verdünnung 1:2 in vorläufiger Durchmusterung) verwendet und für das Serum der splenektomierten Maus (bei Verdünnungen 1:1000 bis 1:100 000), welches als positive Kontrolle verwendet wurde. Als Standard wurde der gereinigte anti-FLT-4 9D9F9 (Maus-Unterklasse-IgG1) bei Konzentrationen zwischen 1,0 ng/ml und 250 ng/ml verwendet. Proben wurden zuerst bei Raumtemperatur für 5 Minuten auf einem Plattenschüttler (Wallac) geschüttelt und dann ungefähr 18 Stunden bei +4°C inkubiert. Die Rahmen wurden zuerst 4-mal gewaschen, dann wurde das Eumarkierte FLT4 (1:2000, in 100 μl Testpuffer) hinzugefügt und die schließlich wurden die Rahmen für eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dem wie beschriebenem Waschen, wurde die Verstärkerlösung (200 μl/Vertiefung, Wallac) hinzugefügt und die Rahmen wurden für 5 Minuten auf dem Plattenschüttler geschüttelt. Die Intensität der Fluoreszenz wurde durch ARCUS-1230 (Wallac) gemessen.
Die daraus resultierenden monoclonalen Antikörper gegen FLT-4 und die entsprechenden Ergebnisse sind in Tabelle 3 zusammengefasst.
Eine Standardkurve zur Quantifizierung von anti-FLT-4-Antikörper wurde durch Verwendung von affinitätsgereinigten anti-FLT-4 9D9F9 erstellt. Der lineare Bereich reichte von 1.0 ng/ml bis 250 ng/ml.
Zelllysat von NIH 3T3-Zellen, welche mit pLTRFLT4-Konstrukt co-transfiziert waren und das Volllängen-FLT4 auf der Oberfläche exprimierten, wurde in 6,5% SDS-PAGE elektrophoretisiert, die Proteine wurden auf Nitrozellulosemembranen (0,45 μm, SCHLEICHER & SCHUELL) übertragen und mit mAk-Zellkultur-Überständen (1:10, 50 mmol/l TRIS – 40 mmol/l Glyzinpuffer, der 4% Methanol, 0,04% SDS enthält), immungeblottet. Die Spezifität des mAk wurde unter Verwendung von Inkubation mit Meerrettichperoxydase-konjugiertem Kaninchen-anti-Maus-Ig (P 161, DAKO, verdünnt 1:1000 in 20 mmol/l TRIS-Puffer pH-Wert 7,5, enthaltend 150 mmol/l Salzlösung, 5% Milchpulver) und ECL (Enhanced Chemiluminescence AMERSHAM) nachgewiesen. TABELLE 3

a) FACS-Ergebnisse mit LTR-transfizierten Zellen
b) FACS-Ergebnisse mit NEO-Zellen (Kontrolle)
NF nicht funktionsfähig in FACS
c) Quantifizierung der mAk-Produktion basierend auf der Affinität des als Standard verwendeten gereinigten anti-FLT 9D9F9-Antikörpers

Wie vom Vorangehenden offensichtlich ist, sind die Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung in der Diagnose und Identifizierung von Lymphgefäßen, lymphatischen Endothelzellen, Venolen mit hohem Endothel, Lymphangiomen, metastasischen Lymphknoten und anderen Krankheitszuständen des lymphatischen Systems, zum Nachweis und der Überwachung der Ausbreitung von Metastasen, in der Stimulation und Hemmung von Endothelzellen der Lymphgefäße und Venolen mit hohem Endothel, in der selektiven Einführung von Molekülen in Endothelzellen und in der Sichtbarmachung von Lymphgefäßen und ihren Krankheitszuständen nützlich. Andere Verwendungen des derzeit geforderten Gegenstandes sind für den Fachmann offensichtlich.
ANGABEN BETREFFEND EINEM HINTERLEGTEN MIKROORGANISMUS (PCT-Regel 13bis)
SEQUENZPROTOKOLL
LITERATURNACHWEIS

1. Sabin, F. R. 1909. The lymphatic system in human embryos, with consideration of the morphology of the system as a whole. Am. J. Anat. 9: 43.
2. van der Putte, S. C. J. 1975. The development of the lymphatic system in man. Adv. Anat. Embryol. Cell Biol. 51: 3.
3. Pajusola, K., O. Aprelikova, J. Korhonen, A. Kaipainan, L. Pertovaara, R. Alitalo, und K. Alitalo. 1992. FLT4 receptor tyrosine kinase contains seven immunoglobulin-like loops and is expressed in multiple human tissues and cell lines. Cancer Res. 52: 5738.
4. Kaipainen, A., J. Korhonen, K. Pajusola, O. Aprelikova, M. G. Persico, B. I. Terman, and K. Alitalo. 1993. The Related FLT4, FLT1 and KDR receptor tyrosine kinases show distinct expression patterns in human fetal endothelial cells. J. Exp. Med. 1782077.
5. Galland, F., A. Karamysheva, M.-J. Pebusque, J.-P. Borg, R. Rottapel, P. Dubreuil, O. Rosnet, und D. Birnbaum. 1993. The FLT4 gene encodes a transmembrane tyrosine kinase related to the vascular endothelial growth factor receptor. Oncogene. 8: 1233.
6. Millauer, B., S. Wizigmann-Voos, H. Schnürch, R. Martinez, N.-P. H. Moller, W. Risau, und A. Ullrich. 1993. High affinity VEGF binding and developmental expression suggest Flk-1 as a major regulator of vasculogenesis and angiogenesis. Cell. 72: 835.
7. Yamaguchi, T. P., D. Dumont, R. A. Conlon, M. L. Breitman, und J. Rossant. 1993. flk-1, an flt-related tyrosine kinase is an early marker for edothelial cell precursors. Development. 118: 489.
8. Peters, K. G., C. De Vries, und L. T. Williams. 1993. Vascular endothelial growth factor receptor expression during embryogenesis and tissue repair suggests a role in endothelial differantiation and blood vessel growth. Proc. Natl. Acad Sci. USA 90: 8915.
9. Finnerty, H., K. Kelleher, G. Morris E., K. Bean, D. Merberg, R. Kritz, J. Morris C., H. Sookdeo, K. J. Turner, and C. R. Wood 1993. Molecular cloning of murine FLT and FLT4. Oncogene. 8: 2293.
10. Korhonen, J., A. Polvi, J. Partanen, und K. Alitalo. 1993. The mouse tie receptor tyrosine kinase gene: expression during embryonic angiogenesis. Oncogene. 8: 395.
11. Chomczynski, P., und N. Sacchi. 1987. Single-step method of RNA isolation by acid guanidium thiocynate-phenol-chloroform extraction. Anal. Biochem. 162: 156.
12. Tokunaga, K., H. Taniguchi, K. Yoda, M. Shimizu, und S. Sakiyama. 1986. Nucleotide sequence of a full-length cDNA for mouse cytoskeletal beta-acting mRNA. Nucleic. Acid. Res. 14: 2829.
13. Wilkinson, D. G., J. A. Bailes, J. E. Champion, und A. P. McMahon. 1987. A molecular analysis of mouse development from 8 to 10 days post coitum detects changes only in embryonic globin expression. Development. 99: 43.
14. Wilkinson, D. G., J. A. Baues, und A. P. McMahon. 1987. Expression of the proto-oncogene int-1 is restricted to specific neural cells in the developing mouse embryo. Cell. 50: 79.
15. Van Hinsberg, V. W. M., D. Binnema, M. A. Scheffer, E. D. Sprengers, T. Kooistra, und D. C. Rijken. 1987. Production of plasminogen activators and inhibitors by serially propagated endothelial cells from adult human blood vessels. Arteriosclerosis. 7: 389.
16. Van Hinsberg, V. W. M., M. A. Scheffer, and T. Kooistra. 1987. Effect of thrombin on the production of plasminogen activators and PA inhibitor-1 by human foreskin microvascutar endothelial celis. Thromb. Haemostas. 57: 148.
17. Bonthron, D. T., E. G. Orr, L. M. Mitsock, D. Gipsberg, R. I. Handin, und S. H. Orkin. 1986. Nucleotide sequence of pre-pro-von Willebrand factor cDNA. Nucleic Acids Res. 141: 7125.
18. Shi, E., M. Kan, J. Xu, and W. L. McKeehan. 1991. 16-kilodatton heparin binding (fibroblast) growth factor type one appers in a stable 40-kilodalton complex after receptor-dependent internalization. J. Biol. Chem. 266: 5774.
9. Catoretti, G., M. H. G. Becker, G. Key, M. Duchrow, C. Schlüter, J. Galle, und J. Gerdest. 1992. Monoclonal antibodies against recombinant parts of the Ki-67 antigen (MIB 1 and MIB 3) detect proliferating cells in microwaveprocessed formalin-fixed paraffin section. J. of Pathol. 168: 357.

Claims

Verwendung eines monoclonalen Antikörpers, der gegen die extrazelluläre Domäne der FLT4-Rezeptor-Tyrosinkinase gerichtet ist, für die Herstellung eines diagnostischen Mittels zur Darstellung von Lymphgefäßen, Lymphknoten oder Venolen mit hohem Endothel (HEVs).
Verwendung eines monoclonalen Antikörpers, der gegen die extrazelluläre Domäne der FLT4-Rezeptor-Tyrosinkinase gerichtet ist, für die Herstellung eines diagnostischen Mittels zum Nachweis von lymphatischem Gewebe, lymphatischen Gefäßen oder Venolen mit hohem Endothel (HEVs).
Verwendung nach Anspruch 2, wobei das nachzuweisende lymphatische Gewebe Lymphknotengewebe ist.
Verwendung eines monoclonalen Antikörpers, der gegen die extrazelluläre Domäne der FLT4-Rezeptor-Tyrosinkinase gerichtet ist, für die Herstellung eines Arzneimittels zur Verhinderung der FLT4-vermittelten lymphatischen Gefäßneubildung, die assoziiert ist mit einer Krankheit ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Metastasen-bildendem Krebs, Lymphomen, Lymphangiomen, Entzündung (chronisch oder akut), Infektionen und immunologischen Krankheiten.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der monoclonale Antikörper ein monoclonaler Anti-FLT4-Antikörper ist, produziert von einer Hybridomzelllinie, die als DSM ACC 2210 hinterlegt ist.
Verfahren zum in vitro-Darstellen von lymphatischen Gefäßen in einer Gewebeprobe, umfassend die Schritte: (a) Applizieren eines nachweisbar markierten Anti-FLT4-Antikörpers auf die Gewebeprobe, die in Verdacht steht, lymphatische Gefäße zu enthalten; und (b) Nachweisen des nachweisbar markierten Anti-FLT4-Antikörpers, der an die Gewebeprobe gebunden ist.
Verfahren zum Diagnostizieren von Krankheiten, die durch Veränderungen in lymphatischen Gefäßen und HEVs charakterisiert sind, umfassend die Schritte: (a) Inkontaktbringen einer Gewebeprobe, die von einem Patienten erhalten wurde, der in Verdacht steht, eine Krankheit zu haben, die durch Veränderungen in lymphatischen Zellen und HEVs charakterisiert ist, mit einem markierten Anti-FLT4-Antikörper; (b) Waschen der Gewebeprobe; und (c) Nachweisen der Gegenwart des nachweisbar markierten Anti-FLT4-Antikörpers in der Gewebeprobe.