JPH11507527A - 発生的に調節される内皮細胞遺伝子座−１ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、発生的に調節される内皮細胞遺伝子座−１(del-1)と呼ばれる新規な遺伝子ファミリーのメンバーに関する。特に、本発明はdel-1ヌクレオチド配列、Del-1アミノ酸配列、機能性遺伝子産物の発現方法、並びに該遺伝子および遺伝子産物の使用方法に関する。構造的には、この遺伝子ファミリーのメンバーは３つのＥＧＦ類似ドメインおよび２つのジスコイジンＩ／第VIII因子類似ドメインを含む。del-1は内皮細胞および特定の癌細胞において発現されるため、内皮細胞および腫瘍マーカーとして有用でありうる。さらに、脈管形成を抑制するDel-1の能力は、抗血管形成剤としてのその使用を可能とする。

Description

【発明の詳細な説明】 発生的に調節される内皮細胞遺伝子座−１ 本発明は、部分的には、米国国立衛生研究所によって授与されたHD 25580のも とに政府からの援助を受けてなされた。政府は本発明に一定の権利を持ちうる。 １．序論 本発明は、発生的に調節される内皮細胞遺伝子座−１(del-1)と呼ばれる新規 な遺伝子ファミリーのメンバーに関する。特に、本発明はdel-1ヌクレオチド配 列、Del-1アミノ酸配列、機能性遺伝子産物の発現方法、該遺伝子産物に特異的 な抗体、および該遺伝子および遺伝子産物の使用方法に関する。del-1は内皮細 胞および特定の癌細胞において発現されるため、この遺伝子は内皮細胞および腫 瘍マーカーとして有用でありうる。さらに、脈管形成を抑制するDel-1タンパク 質の能力は、抗血管形成剤としての用途を提供する。 ２．発明の背景 2.1.内皮細胞生物学および血管発生 内皮は、血液の循環する体液性および細胞性要素と、種々の器官を構成する固 体組織との境界面に中心的位置を占める。この独特の位置にあって、内皮は多数 の重要なプロセスを調節する。そのようなプロセスには、白血球の付着および血 管壁を経た通過、血管緊張(tone)の局所的コントロール、免疫応答の変調、血栓 症と血栓崩壊のバランス、および新しい血管の発生が含まれる(Bevilacquaら，1 993，J．Clin．Invest 91:379-387; Folkmanら，1987，Science 235:442-447; F olkmanら，J．Biol．Chem.，267:10931-10934; Gimbrone，1986，Churchill Liv ingstone，London; Issekutz，1992，Curr．Opin．Immunol．4:287-293; Jansse nsら，1992，J．Biol．Chem．267:14519-14522; Lamasら，1992，Proc．Natl．A cad．Sci．USA 89:6348-6352; Luscherら，1992，Hypertension 19:117-130; Wi lliamsら，1992，Am．Rev．Respir．Dis．146:S45-S50; Yanagisawaら，1988，Nature 332:411-415)。 内皮細胞の機能不全は、高血圧およびアテローム硬化等の血管性疾患の中心的 特徴とみなされてきた。この関係で、平滑筋細胞マイトジェンおよび平滑筋収縮 をコントロールする因子を合成する内皮の能力が大いに注目された(Janssensら ，1992，J．Biol．Chem．267:14519-14522; Lamasら，1992，Proc．Natl．Acad ．Sci．USA 89:6348-6352; Luscherら，1992，Hypertension 19:117-130; Raine sら，1993，Br．Heart J．69:S30-S37; Yanagisawaら，1988，Nature 332:411-4 15)。内皮細胞もまた、性質において本来血管性ではない疾患の研究において注 目の的となった。多様な疾患プロセス、例えば成人呼吸促進症候群、敗血性ショ ック、固形腫瘍形成、腫瘍細胞転移、慢性間接リウマチ、および移植片拒絶等が 現在では内皮細胞の正常なまたは異常な機能に関連していることが理解されてい る。主要な治療作用が内皮細胞機能を変更することである薬理学的作用物質が、 急速にその数を増やしつつ開発されている。さらに、遺伝子療法への最近の注目 が内皮細胞に焦点をあてた(Nabelら，1991，J．Am．Coll．Cardiol．17:189B-19 4B)。内皮細胞への遺伝子の移入は、血管性疾患のための治療戦略を提供しうる 。または、内皮は単に血液で生まれた、不足した因子のための便利な細胞工場と して役立ちうる。したがって、内皮細胞における基本的プロセスに関する情報は 、疾患プロセスの理解を助け、そしてより効果的な治療戦略を可能とするであろ う。 多数の研究所での研究が、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）α等のサイトカインに応答 して劇的に基礎活性を変更する内皮細胞の能力を特徴づけた。ＴＮＦαの刺激は 、酸化窒素およびエンドセリン等の血管作用性化合物の生産の有意な変更を誘導 し、種々のタイプの白血球に対する表面粘着性を増大させ、そして凝固因子前駆 体および抗凝固因子の両方の発現を変調する(Cotranら，1990，J．Am．Soc．Nep rol．1:225-235; Mantovaniら，1992，FASEB J．6:2591-2599)。次に、内皮細胞 はインターロイキン１、６および８を含むサイトカインおよびホルモン生産の重 要な源であることが示された(Gimbroneら，1989，Science 246:1601-1603; Lock sleyら，1987，J．Immunol．139:1891-1895; Loppnowら，1989，Lymphokine．Re s.8:293-299; Warnerら，1987，J．Immunol．139:1911-1917)。 顆粒球、顆粒球−マクロファージ、およびマクロファージコロニー刺激因子を 生産する内皮細胞の能力は、内皮細胞は造血発生における重要な面(facet)であ るという推測を導いた(Broudyら，1987，J．Immunol．139:464-468; Seelentag ら，1987，EMBO J．6:2261-2265)。初期の研究が多数の「内皮細胞特異的」遺伝 子のクローニングのための基礎を提供した。これらの遺伝子の幾つかは、ICAM-1 、ICAM-2、VCAM-1 ELAM-1、エンドセリン−１、構造性内皮細胞酸化窒素シンセ ターゼ、トロンボモジュリン、およびトロンビン受容体を含む(Bevilacquaら，1 989，Science 243:1160-1165; Jackmanら，1986，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 83:8834-8838; Janssensら，1992，J．Biol．Chem．267:14519-14522; Lamasら ，1992，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 89:6348-6352; Osbornら，1989，Cell 59 :1203-1211; Stauntonら，1989，Nature 339:61-64; Stauntonら，1988，Cell 5 2:925-933; Vuら，1991，Cell 64:1057-1068; Yanagisawaら，Nature 332:411-4 15)。 すべての血管は、内皮細胞のみで構成される毛細管としてその存在を開始する 。血管発生における内皮細胞の役割を探究している分子研究の多くが、病理学的 状態と結びつけて、成体器官におけるこのプロセスに焦点をあてた。これらの状 況において、既存の血管から出芽させ分岐させることによって新たな血管が形成 される。内皮細胞分裂に依存するこのプロセスは、血管形成(angiogenesis)と名 付けられた。このプロセスに関する研究は、内皮細胞の増殖因子である小さいタ ンパク質に主に焦点をあててきた(Folkmanら，1987，Science 235:442-447; Fol kmanら，1992，J．Biol．Chem．267:10931-10934)。血管形成についての感受性 バイオアッセイは、疾患組織および正常組織の両方に由来する多数の血管形成因 子の特徴づけを可能とした。繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）ファミリーのメンバ ー、血小板由来内皮細胞増殖因子、および血管内皮細胞増殖因子（血管透過性因 子）は、これまでに特徴づけされた血管形成因子の幾つかである（Folkmanら，1 987，Science 235:442-447; Folkmanら，1992，J．Biol．Chem．267:10931-1093 4; Ishikawaら，1989，Nature 338:557-562: Keckら，1989，Science 246:1309- 1312; Leungら，1989，Science 246:1306-1309)。 このような情報は、胚における血管発生の研究に若干の洞察をもたらした。血 管発生と血管形成因子を結び付ける研究は、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ） を用いる研究に帰着した。ＶＥＧＦ発現が、時間的および空間的様式で、胚にお ける血管発生と相関された(Breierら，1992，Development 114:521-532)。高親 和性ＶＥＧＦ受容体であるflk-1は、最も初期の内皮細胞上に平行的な様式で発 現されることが示された(Millauerら，1993，Cell 72:835-846)。 血管は２つの主要プロセスの組合せにより形成される。ある血管の増殖は、成 人の病理学的状態に関連するプロセスに非常に類似したプロセスにおいて、血管 形成に依存する。例えば、中枢神経系はその脈管供給の発生を血管形成のみに依 存する(Noden，1989，Am．Rev．Respir．Dis．140:1097-1103: Risauら，1988， EMBO J．7:959-962)。第２のプロセスである脈管形成(vasculogenesis)は、発生 しつつある血管への遊走性の個々の内皮細胞（血管芽細胞）の取り込みに依存す る。これらの血管芽細胞は、殆どすべての中胚葉の成分であるように思われ、そ してこれらは侵襲性の様式で胚中を遊走することができる（Coffinら，1991，An at．Rec．231:383-395; Noden，1989，Am．Rev．Respir．Dis．140:1097-1103; Noden，1991，Development 111:867-876)。この細胞の正確な起源および分化の 特徴は明確にされていない。 血管発生における内皮細胞分化の分子的基礎の理解は、治療目的のための血管 増殖の操作を可能とし得る。血管増殖を抑制する能力はまた、固形腫瘍および糖 尿病性網膜症などの疾患に対する治療戦略を提供しうる。他方、冠状動脈疾患な どの疾患は、管理された血管増殖を薬理学的に誘導することにより、および冠状 血管床における副行循環を増大させることにより治療することができる。アテロ ーム硬化および高血圧などの血管性疾患、および内皮細胞に依存する非血管性疾 患の両方の疾患は、内皮細胞のより一層の理解から利益をうけるであろう。 2.2.上皮増殖因子類似ドメイン 上皮増殖因子（ＥＧＦ）は種々の細胞型の増殖を刺激する。ＥＧＦ類似ドメイ ンが多数の細胞外および膜結合タンパク質に見いだされている(Anderson，1990 ，Experientia 46(1):2;およびDoolittle，1985，TIBS，June:233)。これ らのタンパク質は、可溶性の分泌タンパク質、増殖因子、膜貫通シグナルおよび 受容体分子、および細胞外マトリックスの成分として機能する分子を含む(Lawle rおよびHynes，1986，J．Cell．Biol．103:1635; Durkinら，1988，J．Cell Bio l．107:2749; Wuら，1990，Gene 86:275; BisgroveおよびRaff，1993，Develop ．Biol．157:526)。 多くの場合、特徴的な、長さが40アミノ酸の、６個のシステインを含有する配 列の複数のタンデムな繰り返しが観察される(Anderson，1990，Experientia 46( 1):2)。ＥＧＦ類似ドメインは、１コピーの標準的ＥＧＦドメインからなるペプ チド増殖因子ＥＧＦに相同である。これらのドメインは、進化において高度に保 存されており、線虫からショウジョウバエ、ウニ、および脊椎動物にいたる多様 な種において見いだされる。 ＥＧＦ分子および密接に関連するトランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）α は、チロシンキナーゼ受容体と結合することにより細胞増殖を誘導する。他のＥ ＧＦ類似ドメインもまた受容体分子のリガンドとして機能することが示唆された (Engel，1989，FEBS Lett．251:1-7)。基本的には、ＥＧＦ反復は特定のタンパ ク質-タンパク質相互作用に関与するタンパク質構造である。 ショウジョウバエNotchタンパク質、線虫lin-12およびglp-1タンパク質、およ び密接に関連する脊椎動物相同体であるMotch(マウスNotch)、Xotch(アフリカツ メガエルNotch)、ラットNotchおよびTAN 1(ヒトNotch)は、胚発生の初期におけ る種々の細胞型について細胞運命の特定をコントロールする、膜結合受容体分子 である(Rebayら，1991，Cell 67:687; HutterおよびSchnabel，1994，Developme nt 120:2051; Del Amoら，1992，Development 115:737; Reaumeら，1992，Devel op．Biol．154:377; およびEllisenら，1991，Cell 66:649)。Notch受容体にお ける特異的ＥＧＦ類似反復は、シグナル伝達をもたらすタンパク質リガンドと結 合する結合部位である（Rebayら，1991，Cell 67:687; CousoおよびArias，1994 ，Cell 79:259; FortiniおよびArtavanis-Tsakonas，1994，Cell 79:273; Hende rsonら，1994，Development 120:2913)。細胞外マトリックスタンパク質、例え ばトロンボスポンジン、エンタクチン、テナスチンおよびラミニンなどは、そこ に細胞が結合して組織の形態を形成し、維 持する物理的骨組みを提供することによって、形態形成において重要な役割を果 たす(Frazier，1987，J．Cell．Biol．105:625; Tarabolettiら，1990，J．Cell ．Biol．111:765; Ekblomら，1994，Development 120:2003)。 2.3.ジスコイジンＩ／第VIII因子類似ドメイン 相同的ドメイン構造が血液凝固第VIIIおよび第Ｖ因子に見いだされた(Kaneお よびDavie，1986，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 83:6800)。このドメインは、細 菌性粘菌ジクチオステリウム・ジスコイデウム(Dictyostelium discoideum)によ って産生されるジスコイジン(discoidin)Ｉタンパク質中に最初に観察された、 より古い構造に関連している。ジスコイジンＩは、ジクチオステリウム細胞によ って細胞凝集のプロセス中に分泌される、炭水化物結合レクチンであり、細胞− 下層結合および秩序だった細胞遊走に関与している(Springerら，1984，Cell 39 :557)。 ジスコイジンＩ／第VIII因子類似ドメインは、多数の他のタンパク質中にも観 察されている。例えば、乳脂乳球タンパク質(BA46)、乳脂乳球膜タンパク質(MFG -E8)、乳房細胞癌ジスコイジンドメイン受容体(DDR)およびアフリカツメガエル ニューロン性認識分子(A5)である(Stubbsら，1990，Proc．Natl．Acad．Sci．US A 87:8417; Laroccaら，1991，Cancer Res．51:4994; Johnsonら，1993，Proc． Natl．Acad．Sci．USA 90:5677)。脊椎動物タンパク質のジスコイジンＩ／第VII I因子類似ドメインはすべて、ジクチオステリウムの配列とかすかに関連してい るが、相互により密接に関連している。 ジスコイジンＩ／第VIII因子類似ドメインは、正に荷電した塩基性アミノ酸に 富んでおり、そして負に荷電した物質、例えばアニオン性リン脂質またはプロテ オグリカン等と結合するものと考えられる。上記の乳脂乳球タンパク質は両方と も細胞膜と密接に会合することが示され、そして血液凝固第VIIIおよび第Ｖ因子 は特定の血小板膜タンパク質と相互作用する(Stubbsら，1990，Proc．Natl．Aca d．Sci．USA 87:8417; Laroccaら，1991，Cancer Res．51:4994)。 ３．発明の概略 本発明はdel-1と呼ばれる新規な遺伝子ファミリーに関する。特に、本発明はd el-1ヌクレオチド配列、該配列を含む発現ベクター、遺伝子工学的に作製された del-1を発現する宿主細胞、Del-1タンパク質、Del-1突然変異型ポリペプチド、d el-1の発現方法、並びに種々の正常および疾患状態（例えば、癌）におけるdel- 1およびその遺伝子産物の使用方法に関する。 本発明は、部分的には、出願人がマウスＤＮＡクローン（配列番号９）del-1 およびその相同的なヒト等価物（配列番号11）を単離したことに基づいている。 Del-1タンパク質の構造的特徴は、GenbankおよびNBRF-PIRデータベースにある配 列との相同性比較によって推定される。Del-1タンパク質は、多数の別個のタン パク質に存在する２つの異なる配列モチーフの繰り返しからなる、モジュール型 の分子である。該２つの配列モチーフとは、ＥＧＦ類似ドメイン（配列番号26） およびジスコイジンＩ／第VIII因子類似ドメイン（配列番号１〜８）である。こ れらのドメインは、分子全体にわたって特定に位置に分布した保存されたアミノ 酸の特徴的パターンによって規定される。Del-1は他のタンパク質とある配列相 同性を示すが、Del-1はその一次配列および全般的構造の両方において独特であ る。ＥＧＦ類似およびジスコイジンＩ類似ドメインが同定された全ての場合にお いて、これらの構造物は両方とも常に細胞外の位置に見いだされる。Del-1タン パク質の変異形が存在し、その１つは本明細書に細胞外マトリックスタンパク質 であると示されており、細胞表面と会合している。del-1の発現パターンはさら に、del-1が内皮細胞機能に関与していることを示す。さらに、多数のヒト腫瘍 細胞がdel-1を発現する。さらに、腫瘍小結節を横断する宿主由来の血管もまたd el-1を発現する。Del-1タンパク質は、血管の形態形成を抑制し、その細胞受容 体としてαｖβ３と結合する。したがって、本発明は多様な使用を包含する。そ こには、癌診断および治療のための腫瘍マーカーとしてのDel-1の使用、胚内皮 細胞の単離のためのDel-1の使用、Del-1結合パートナーの同定のためのDel-1の 使用、並びに内皮細胞増殖および血管形成の刺激または抑制のためのDel-1の使 用、を含むがそれらだけに限定されない。 ４．図面の簡単な説明 図１。 SLM275トランスジェニックマウスから構築されたλ固定ライブ ラリーおよび野性型129SV λ固定ライブラリーからのクローニングによって特徴 づけられた、マウスdel-1遺伝子座の42kbのゲノム構成。点線は、ズーブロット( zoo blot)およびエキソントラッピングによって今日までに研究されたＤＮＡを 示す。エキソントラッピングによって同定されたエキソンの位置が示されている 。 図２。 推定上のdel-1遺伝子(m-dell)（配列番号１）の推定されるア ミノ酸配列と「ジスコイジン類似ドメイン」を有する他のタンパク質との間の相 同性分析。同一の残基を四角で囲み、保存された残基に影をつけた(Geneworks， Intelligenetics，Mountain View，CA)。m-del-1配列（配列番号１）はトラップ したエキソンおよびマウス胚ｃＤＮＡに由来した。略字：h-MEGヒト乳脂乳球タ ンパク質（配列番号２）；h-FVヒト血液凝固第Ｖ因子（配列番号３）；m-FVIII マウス血液凝固第VIII因子（配列番号４）；X-A5b1（配列番号５）およびX-A5b2 （配列番号６）、アフリカツメガエルニューロン性抗原A5のb1およびb2ドメイン ；dis-IジスコイジンＩ（配列番号７）。 図３Ａ〜３Ｅ。 マウスdel-1 ｃＤＮＡ（配列番号９）のヌクレオチド配列およ び推定されるアミノ酸配列。 図４Ａ〜４Ｃ。 ヒトdel-1 ｃＤＮＡ（配列番号11）のヌクレオチド配列および 推定されるアミノ酸配列。 図５。 ヒトdel-1のクローン化およびノーザンブロットのプローブと して用いたマウスdel-1断片（配列番号19）。 図６。 マウス(m-del-1)(配列番号10)およびヒト(h-del-1)(配列番号2 9)Del-1タンパク質のアミノ酸配列比較。ＥＧＦ類似およびジスコイジン類似ド メインは、それぞれ"egf"および"ジスコイジン"と示す。 図７。 "EGF"と記した小さい長方形はDel-1の３個のＥＧＦ類似ドメイ ンの位置および相対的サイズを示す。タンパク質のこれらの領域は長さが約40ア ミノ酸である。各ＥＧＦ類似ドメインは、この共通モチーフを含むタンパク質に おいて高度に保存されたパターンで分布している、６個のシステイン残基および 付加的な保存されたアミノ酸を含む。さらに、第２のＥＧＦ類似反復の中央にア ミノ酸配列ＲＧＤが存在する。この配列は種々の細胞外マトリックスタンパク質 に見い出されるものであり、ある場合には、この配列はインテグリンタンパク質 と結合するために必要とされる。ＲＧＤ配列は、MFG-E8の第２のＥＧＦ類似反復 の同じ位置に存在する。右側の大きい長方形は、タンデムなジスコイジンＩ／第 VIII因子類似ドメインを表す。このタンパク質モチーフは、Ｄ．ジスコイジウム のジスコイジンＩタンパク質と哺乳動物血液凝固第VIII因子の間の相同性によっ て規定される、アミノ酸の保存されたパターンに基づいている。 図８。 タンデムなジスコイジンＩ／第VIII因子ドメインにおけるヒト Del-1とMFG-E8（配列番号21）の間の54.2%アミノ酸相同性を示す。これらのドメ インは塩基性アミノ酸アルギニンおよびリシンに富んでいる。５’ドメインは９ 個の酸性残基に対して12個のアルギニンおよび12個のリシンを含む。他方、３’ ドメインは16個の酸性残基に対して８個のアルギニンおよび10個のリシンを含む 。血液凝固第VIII因子タンパク質中の類似のドメインは、血小板表面の負に荷電 したリン脂質と結合すると思われる。MFG-E8タンパク質は、乳脂乳球膜と密接に 結合することが判明した。 図９。 ヒトDel-1タンパク質（配列番号22）のアミノ末端の予想され るアミノ酸配列は、シグナルペプチドに共通した特徴を示す。推定上のシグナル は塩基性アルギニン残基で始まり、この後に疎水性残基に富んだ18個のアミノ酸 が続く。シグナルペプチドは典型的にはグリシンまたはアラニンなどの小さいア ミノ酸で終わる。さらに、ChouおよびFasmanのアルゴリズムは、推定上のシグナ ル 配列の後に、シグナルペプチドの後に共通した特徴であるタンパク質ターン（tu rn変わり目）構造が続くと予想している。Del-1タンパク質は発現細胞により分 泌される。 図10。 Del-1の３つのＥＧＦ類似ドメイン（配列番号23〜25）の間の 配列類似性、および共通ＥＧＦ類似ドメインアミノ酸配列（配列番号26）との相 同性。また、アミノ酸配列ＲＧＤが第２のＥＧＦ類似反復の中央に存在する。こ の配列は種々の細胞外マトリックスタンパク質に見い出されるものであり、ある 場合には、この配列はインテグリンタンパク質と結合するために必要とされる。 ＲＧＤ配列は、MFG-E8の第２のＥＧＦ類似反復の同じ位置に存在する。 図11。 主要形と比較した変化を示す、ヒトdel-1スプライシング変形 体の部分配列（配列番号27）。 図12A〜12E マウスdel-1の端を切断したマイナーなヌクレオチド配列およ び推定されるアミノ酸配列（配列番号28）。 図13A〜13H SLM275系統由来の胚の全マウント(whole mount)および組織切 片におけるX-gal染色。(13A)全マウントとして染色した受胎後7.5日の胚（頭が 折り畳まれる(headfold)段階）。X-gal染色が、卵黄嚢およびそこに結合した血 島を生じさせる胚外中胚葉(xm)の細胞に見られる。略語: ng神経溝。70xで写真 撮影。（13B）受胎後８日の胚由来の卵黄嚢および血島の切片。無傷の膜を持つ 全マウントとして染色し、その後切片を作製し対比染色した。血島における丸い 細胞のクラスターはX-gal染色を示す。他方、成熟した内皮細胞は染色されない （白抜き矢印）。400xで写真撮影。（13C）受胎後9.5日の胚。顕著なX-gal染色 （青緑）が心臓および流出管(outflow tract)（胚の中央部）に見られる。さら に、大動脈（矢印）および椎骨間の血管が染色されている。約30xで、暗野照明 で撮影。(13D)心臓および流出管を示す9.5日胚の切片。この切片は、心臓および 流出管におけるX-gal染色が内皮細胞（心 内膜）に限定されていることを示す。ヘマトキシリンおよびエオシンで切片を対 比染色し、200Xで撮影した。(13E)解剖し、全マウントとしてX-gal染色した受胎 後13.5日の胚。この段階では、組織切片の検査で確認されるように、心室(v)お よび大動脈（黒塗り矢印）等の大きい血管に沿って内皮細胞はその染色を失って いる。心房（ａ）の内皮細胞染色は減少したが全マウントではまだ明らかである 。この段階で最も顕著なのは、発生しつつある肺における染色である（白抜き矢 印）。X-gal染色細胞は明らかに肺の腺芽と結合しているが、これらの細胞を全 マウントで同定することは不可能である。X-gal染色を示す唯一の非心臓血管細 胞は、骨形成領域、例えばここに示す近位の肋骨における細胞である。50xで撮 影。(13F)全マウントとして染色し、切片にし、nuclear fast redで対比染色し た、受胎後13.5日の胚。ここに示される肺組織のX-gal染色は、横（矢印）およ び縦（矢尻）方向に切断した血管チャンネルから分かるように、内皮細胞に関連 している。染色は気管支細胞とは関連していない。切片は400xで撮影した。(13G )流出管における弁形成を経た、13.5日胚の断面。血管壁の内皮細胞は上皮−間 葉変換を経験しつつある。これは弁組織の形成をもたらす。染色された細胞が、 発生しつつある弁構造内に見られ、この表現型変換の間にこれらの細胞がdel-1 マーカーを発現し続けることを示す。胚は全マウントとして染色し、切片を作製 し、nuclear fast redで対比染色し、400xで撮影した。(13H)受胎後9.5日の心臓 の流出管におけるらせん状中隔膜の形成。内皮細胞は上皮−間葉変換を経験しつ つあり、形態および挙動において間葉となりつつある。この変換後もしばらく、 内皮細胞は導入遺伝子マーカーを発現し続ける。全マウント染色胚由来の切片、 200x。 図14Aおよび14B del-1を用いてトランスフェクションした卵黄嚢を使用したイ ムノブロッティング。(14A)マウスの主要形のdel-1(+)をコ ードする真核細胞発現ベクターまたは空の発現ベクター(-)を用いて安定にトラ ンスフェクションした卵黄嚢YS-B細胞を、Del-1タンパク質発現プールとして選 択し評価した。溶菌緩衝液（溶菌）または標準的Laemmliゲルローディング緩衝 液(Laemmli)に溶解した細胞から、またはトランスフェクションした細胞を培養 皿から除去した後に残った細胞外マトリックス(ECM)からタンパク質を単離した 。優勢なバンドは分子量52キロダルトン(kDa)に対応する。別の翻訳開始部位の 使用も可能であるが、より分子量の低いバンドは多分タンパク質分解産物を表し ている。(14B)YS-B細胞を、del-1発現構築物または空の発現プラスミドを用いて 安定にトランスフェクションし、個別のクローンとして選択した。del-1を発現 するクローンを、細胞外マトリックスタンパク質のウエスタン ブロット分析に よってアッセイした種々のレベルのタンパク質生産について選択した。クローン L10は最高レベルのdel-1 ｍＲＮＡを示し、クローンL13およびL14は中くらいの 量のdel-1 ｍＲＮＡを有し、また陰性対照クローンはdel-1を発現しない。 図15A〜15B 卵黄嚢細胞の免疫染色。（15A）del-1でトランスフェクション した卵黄嚢細胞および細胞外マトリックスは抗Del-1抗体によって染色される。 矢印は細胞膜の染色を示す。(15B)にせものでトランスフェクションした卵黄嚢 細胞は、抗体によって染色されない。 図16。 13.5日マウス胚の発生しつつある骨（脊柱）におけるDel-1の 免疫染色。骨内のラクアニ(laquanae)は細胞外マトリックスタンパク質からなる 構造体で、それらはDel-1ゆえに染色される。 図17。 ヌードマウス中で増殖させたヒト神経膠腫の免疫染色。(17A) 腫瘍細胞は抗Del-1抗体によって染色される。分極化した染色パターンが観察さ れる（矢印）。(17B)血管は腫瘍内で抗Del-1抗体によって染色される。 図18A〜18H (18A)通常の培養条件下の親卵黄嚢細胞系YS-B。フェースコン トラスト、写真100x。(18B)"MATRIGEL"上に24時間置いた後のYS-B細胞は、血管 形態形成のパターンを示す。細胞はトルイジンブルーで染色された。明野、写真 40x。(18C)陰性対照トランスフェクタントは24時間後に"MATRIGEL"上に血管ネッ トワークを形成する。明るい領域は組織された細胞を表す；暗野照明のもとで50 xで撮影。(18D)卵黄嚢トランスフェクタントであるクローンL10は、"MATRIGEL" 上に24時間置いた後、血管形成の形跡を全く示さなかった。代わりに、細胞が多 数の凝集体を形成した。暗野照明のもとで50xで撮影。(18E)陰性対照トランスフ ェクタントによって生産されたマトリックスを用いて増殖させた親卵黄嚢YS-B細 胞は、複雑な構造性ネットワークを作る。明るい領域は組織された細胞を表す； 暗野照明のもとで30xで撮影。(18F)del-1トランスフェクタントによって生産さ れたマトリックスを用いて増殖させた親YS-B細胞。細胞は密な単層を形成してお り、組織化の形跡は全くない。暗野照明のもとで30xで撮影。(18G)陰性対照によ ってトランスフェクションした卵黄嚢細胞の凝集体をポリマー化"MATRIGEL"上に 置いた。24時間後に、細胞は芽を出すような(sprouting)血管形成を示す。フェ ースコントラストの下で100xで撮影。(18H)del-1でトランスフェクションした卵 黄嚢クローンL10の凝集体を18Gのようにポリマー化"MATRIGEL"上に置いた。24時 間後に100xで撮影。これらの細胞は芽を出す形跡を全く示していない。 図19。 マウス組換えDel-1とHUVECとの結合は、抗αVβ３抗体によっ て阻害される。組換えDel-1で被覆したプレートに接着したHUVECの相対細胞数を 、種々の抗体の存在下で示す。 図20。 マウス組換えDel-1とHUVECとの結合は、ＲＧＤペプチドによっ て阻害される。組換えDel-1で被覆したプレートに接着したHUVECの相対細胞数を 、ＲＧＤおよびＲＧＥペプチドの存在下 (10μg/ml)で示す。 図21Aおよび21B P1クローン10043の5q14という染色体上の位置を示す２つの記 号図。(21A)ヒト細胞遺伝学命名法のための国際システム(International System for Human Cytogenetic Nomenclature)(1985)より採択。(21B)実際の染色体測 定に由来する相対的なバンドの位置および腕の比を示すCytogenet．Cell Genet ．65:206-219(1994)から採択した記号図。５．発明の詳細な説明 本発明はこの中でｄｅｌ−１と呼ぶ遺伝子の新規家族に関する。この遺伝子家 族の一員をクローニングする方法、ネズミの一員およびヒトの相同物の特性、組 換え遺伝子産物の発現、遺伝子およびその遺伝子産物の利用方法を以下に述べる 。構造上この遺伝子家族の一員は３個のＥＧＦ様ドメインおよび２個のジスコイ ジンＩ／因子VIII様ドメインを含む。 ｄｅｌ−１分子の全体構造は乳脂小滴膜タンパク質（ＭＦＧ−Ｅ８）に類似し ている（Stubbs et al.,1990,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:8417）。ＭＦＧ−Ｅ ８は、ヒト胸部腫瘍の大部分と同様に乳を分泌する乳房上皮細胞により、高く発 現する。２個のジスコイジンＩ／因子VIII様ドメインが後に続く２個のタンデム ＥＧＦ様ドメインから成る。ＭＦＧ−Ｅ８の機能は知られていないが、細胞膜と 密接に関係することが示されており、抗体に基づく腫瘍映像技術のための標的と して研究されている。ＭＦＧ−Ｅ８と細胞膜との観察された関係は、混在する細 胞集団から内皮細胞を同定し区分する、また診断と治療のためにｄｅｌ−１を発 現する腫瘍細胞を標的にするというｄｅｌ−１に対する抗体利用の可能性を示し ている。 ＭＦＧ−Ｅ８の第二のＥＧＦ様反復は、ｄｅｌ−１の第二のＥＧＦ様反復と同 じ位置にアミノ酸配列Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）を含む。ＲＧＤ配列は 、フィブロネクチン、ジスコイジンＩ、ニドゲン／エンタクチン、テナスチンに 対する細胞結合位置であることがわかっている（Anderson,1990,Experientia 46 :2）。ＲＧＤ配列を通じる細胞表面イン テグリン分子とフィブロネクチンの結合は広範囲にわたって研究されている（Ma in et al.,1992,Cell 71:671;Hynes,1992,Cell 69:11）。インテグリンは細胞が 細胞外間質に着く主要な受容体であると思われる。インテグリンに結合する基質 は、チロシンリン酸化、細胞質のアルカリ化、分泌と分化の活性化等の事項を導 くシグナル形質導入を起こすことがわかっている（Hynes,1992,Cell 69:11）。 ｄｅｌ−１中のＲＧＤ配列の存在は、分子のこの部分が細胞表面インテグリンに 結合し、たぶん必然的な発展的事項を起こすことを示す。特にｄｅｌ−１は内皮 細胞上のインテグリンαＶβ３に結合することが示される。数例で、ＲＧＤ配列 を含む合成ペプチドは、インテグリン結合に関し天然タンパク質と競合し、下流 の事項の開始を妨げることがわかっている（Brooks et al.,1994,Cell 79:1157 ）。 議論を明快にするために、本発明は下記の項にｄｅｌ−１遺伝子およびマウス とヒトにおけるその産物に関する実施例を用いて記述する。しかしながらこの中 に開示された発見結果は、すべての種におけるｄｅｌ−１家族の他の一員にも類 似して適用できる。 ５．１．ｄｅｌ−１コード配列 本発明はｄｅｌ−１遺伝子家族の核酸分子およびポリペプチトに関する。下記 の６章の実施例による特定の実施態様において、ネズミとヒトのｄｅｌ−１核酸 分子はクーロン化され、そのヌクレオチドおよび演繹されるアミノ酸配列が特徴 づけられた。ｄｅｌ−１のヌクレオチドコード配列も演繹されるアミノ酸配列も 共に独特である。本発明に従って、ｄｅｌ−１遺伝子産物のアミノ酸配列をコー ドするヌクレオチド配列のいずれも、ｄｅｌ−１遺伝子の発現を指示する組換え 分子の産生に使用することができる。 エンハンサーわなは、ショウジョウバエの遺伝子分析に首尾良く用いられた計 略であるが、より高等な生物にも適用可能である。この方法は、報告者の遺伝子 への影響力を通してゲノムの遺伝子座中に調節領域を同定する（Okane et al.,1 987,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84:9123-9127）。報告者の遺伝子は、弱い構造 的に発現された真核生物プロモーターの制御下 転写単位として、多数の生物に導入される。これら生物の子孫はその後報告者の 遺伝子発現のパターン分析によりふるい分けされる。適当な細胞に適当な時期に 発現を示す系列が次の研究のために保存される。この計略は、複雑な発生過程に 関係するショウジョウバエ上のいくつかの遺伝子座を首尾良く同定した。 エンハンサーわな実験は限定された範囲でマウスに実施された（Allen et al. ,1988,Nature 333:852-855）。そのような実験のいくつかは報告者の遺伝子の興 味ある遺伝子座に偶然の組込みを通じてなされた（Kothary et al.,1988,Nature 335:435-437）。ゲノムとｃＤＮＡクローニングと組み合わせたこの方法を用い て、外来遺伝子と組み合わせたネズミｄｅｌ−１遺伝子座が同定された。そのト ランスジェニックマウスから遺伝子ライブラリーと、外来遺伝子とインテグリン 位置のわきにある配列を含むクーロンを単離するために用いられる外来遺伝子か らのプルーブが生まれる。調整領域の特性は、わきにある配列を用いる機能試験 により、適当な細胞培養系とのトランスフェクション実験を経て、またはその次 の外来遺伝子実験を経て特徴づけられる（Bhat et al.,1988,Mol.Cell.Biol.8:3 251-3259）。 転写単位の分析のために、エクソン部分を含むわきにある配列の領域の同定が 必要である。これは、ノーザン法またはズー法中のプルーブとして、わきにある 遺伝子配列をむやみに用いることによって為し遂げられた（Soinen et al.,1992 ,Mechanisms of Development 39:111-123）。そうしてエクソン配列を含んで同 定されたＤＮＡ断片は、ｃＤＮＡクローニング用のプルーブとして使用される。 同様のクローニング実験は、外来遺伝子の組込みに伴う挿入的突然変異の誘発に より不活性化される遺伝子座を特徴づけるよう導かれた。これらの実験は、ゲノ ムＤＮＡの大部分の欠失が外来遺伝子の組込みを伴い、転写単位の複雑さがこの 種所の分析を大いに複雑にするだろうことを示す（Karls et al.,1992，Mol．Ce ll．Biol．12: 3644-3652; Woychik et al.,1990，Nature 346:850-853）。 ｄｅｌ−１配列のその後の分析は、ＥＧＦ様とジスコイジンＩ／因子VIII 様ドメインの両方を示した。ｄｅｌ−１と他の既知の分子との間の共有する相同 性は下記の項６．２において議論する。しかしながらこの分子もまた過去に報告 されない特有のヌクレオチド配列の領域を含む。ノーザン法のハイブリッド分析 は、ｄｅｌ−１ｍＤＮＡが胎児細胞に高く発現することを示す。さらにｄｅｌ− １配列はある腫瘍細胞に発現する。 完全なｄｅｌ−１ｃＤＮＡをコードするいずれかの種から全長のｃＤＮＡ配列 をクローン化、または分子の種々の形をクローン化するために、この中に開示さ れた部分的ｃＤＮＡのいずれかのネズミとヒトに相当する核酸断片から得た標識 されたＤＮＡプルーブを用いて、ｃＤＮＡライブラリーをふるい分けすることが できる。さらに詳細に述べると、ｃＤＮＡ配列の５’または３’末端のどちらか に相当するオリゴヌクレオチドは、さらに長いヌクレオチド配列を得るために用 いることができる。手短に言うと、ライブラリーは各１５０ｍｍプレートに対し 最高３０，０００ｐｆｕ生じるよう作ることができる。約４０枚のプレートがふ るい分けられる。そのプレートを、プラークが直径０．２５ｍｍに達するまで、 または互いに接触し始める瞬間まで（３−８時間）３７℃でインキュベートする 。ナイロンフィルターを柔らかい頂上のアガロース上に置き、６０秒後そのフィ ルターをはぐり、０．４Ｎ水酸化ナトリウムから成るＤＮＡ変性溶液に浮かす。 その後フィルターを１ＭトリスＨＣｌ、ｐＨ７．５から成る中和溶液に浸した後 、空気乾燥させる。そのフィルターを、１０％硫酸デキストラン、０．５Ｍ Ｎ ａＣｌ、５０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ７．５、０．１％ピロリン酸ナトリウム、 １％カゼイン、１％ＳＤＳ、および０．５ｍｇ／ｍｌで６時間６０℃で変性した サケ精子ＤＮＡを含むカゼインハイブリッド緩衝液中であらかじめハイブリッド 化する。次に放射線で標識されたプルーブを２分間９５℃迄加熱することにより 変性し、フィルターを含むハイブリッド化溶液に加える。フィルターを６０℃で １６時間ハイブリッド化する。次にそのフィルターを１倍の洗浄混合物（１０倍 の洗浄混合物は３Ｍ ＮａＣｌ、０．６Ｍトリス塩基、０．０２Ｍ ＥＤＴＡを 含む）中で２回５分間各々室温で洗い、最後に０．１％ＳＤＳを含む０．３倍の 洗 浄混合物中で６０℃で３０分間洗う。その後フィルターを空気乾燥し、オートラ ジオグラフィーのためにＸ線フィルムにさらす。展開後フィルムをフィルターと 並べ正のプラークを選別する。もし単一の単離された正のプラークが得られない ならば、プラークを含む寒天のプラグを除き、０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．０１Ｍ 硫酸マグネシウム、０．０３５ＭトリスＨＣｌ、ｐＨ７．５、０．０１％ゼラチ ンを含むラムダ希釈溶液に入れる。次にファージを再び置き、再びふるい分けし て単一の、うまく単離された正のプラークを得ることができる。正のプラークが 単離され、ｃＤＮＡクローンは既知のｃＤＮＡ配列に基づくプライマーを用いて 配列できる。全長のｃＤＮＡが得られる迄この工程をくり返すことができる。 全長のｃＤＮＡを得るために異なる組織から多様なｃＤＮＡライブラリーをふ るい分けることが必要かも知れない。完全な５’末端コード領域をコードするｃ ＤＮＡクローンを同定することが難しいという事項において、ｃＤＮＡクローニ ングにおいてしばしば出会う状態、ＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ末端の高速増幅）技術を 利用できる。ＲＡＣＥは不完全なｃＤＮＡの５’末端の増幅のための証明された ＰＣＲに基づく方法である。特有のアンカー列を含むヒト胎児肝臓から合成され る５’−ＲＡＣＥ−レディｃＤＮＡは市販されている（Clontech）。ｃＤＮＡの ５’末端を得るために、ＰＣＲは、供給されたアンカープライマーおよび３’プ ライマーを用い、５’−ＲＡＣＥ−レディｃＤＮＡ上で行われる。次に第２のＰ ＣＲ反応が、大量生産施設によってアンカープライマーと巣ごもった３’プライ マーを用いて行われる。いったん得られると、全長のｃＤＮＡ配列はアミノ酸配 列に翻訳され、翻訳の開始および終了位置のわきにある連続した開放の読み取り 枠、ＥＧＦ様ドメイン、ジスコイジンＩ様ドメイン、潜在的シグナル配列および 膜ドメイン、およびこの中に開示されたｄｅｌ−１遺伝子への最終的全体構造上 の類似性などの、確実な標識点を求めて試験できる。 ５．２．ｄｅｌ−１配列の発現 本発明に従い、ｄｅｌ−１タンパク質、突然変異ポリペプチド、ｄｅｌ −１のペプチド断片、ｄｅｌ−１融合タンパク質またはその機能的同等物をコー ドするｄｅｌ−１ポリペプチド配列を用いて、適当な宿主細胞中に、ｄｅｌ−１ タンパク質、ｄｅｌ−１ペプチド断片、融合タンパク質またはその機能的同等物 の発現を指示する組換えＤＮＡ分子を生じさせることができる。そのようなｄｅ ｌ−１ポリヌクレオチド配列は、そのようなｄｅｌ−１ポリヌクレオチドまたは その補足物の少なくとも一部と選択的にハイブリッドする他のポリヌクレオチド と同様に、サザン法やノーザン法などの、核酸ハイブリッド検定にも用いること ができる。 遺伝子コードの固有の縮重性ゆえに、同じまたは機能的に同等のアミノ酸配列 を本質的にコードする他のＤＮＡ配列は、ｄｅｌ−１タンパク質のクローニング と発現のために本発明の実施中で使用できる。そのようなＤＮＡ配列は、厳密な 条件下でネズミおよび／またはヒトのｄｅｌ−１配列とハイブリッドできるもの を含む。”厳密な条件”の句はこの中で用いられるとき次のハイブリッド条件を 言う、１洗浄用に、たとえば５０℃で０．０１５Ｍ ＮａＣｌ／０．００１５Ｍ クエン酸ナトリウム／０．１％ＳＤＳ等の低いイオン強度と高温を用いる；２ハ イブリッドの間、４２℃でたとえば７５０ｍＭ ＮａＣｌ、７５ｍＭクエン酸ナ トリウムに０．１％の牛の血清アルブミン／０．１％フィコール／０．１％ポリ ビニルピロリドン／５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．５を伴う５０％ （容積／容積）ホルムアミド等の変性剤を用いる；または３４２℃で５０％ホル ムアミド、５倍のＳＳＣ（０．７５Ｍ ＮａＣｌ、０．０７５Ｍピロリン酸ナト リウム、５倍のDenhardt溶液、超音波処理したサケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ ）、０，１％ＳＤＳ、および１０％硫酸デキストランを用い、４２℃で０．２倍 のＳＳＣと０．１％ＳＤＳ中で洗浄する。 本発明に従って用いることができる別のＤＮＡ配列は、同じまたは機能的に同 等の遺伝子産物をコードする配列に帰着する、種々のヌクレオチド残基の欠失、 付加、または置換を含む。遺伝子産物はそれ自身、ｄｅｌ−１配列内にアミノ酸 残基の欠失、付加、または置換を含み、その結果機能的に同等のｄｅｌ−１タン パク質を産生する発現しない変化となる。その ようなアミノ酸置換は、極性、荷電、溶解度、疎水性、親水性、および／または 含まれる残基の両親媒性の性質の類似性の基礎となっている。たとえば負に荷電 したアミノ酸はアスパラギン酸とグルタミン酸を含み；正に荷電したアミノ酸は リジン、ヒスチジン、アルギニンを含み；同様の親水性値を有する非荷電で極性 基を持つアミノ酸は次のものを含む：グリシン、アスパラギン、グルタミン、セ リン、スレオニン、チロシン；非極性基を持つアミノ酸はアラニン、バリン、イ ソロイシン、ロイシン、フェニルアラニン、プロリン、メチオニン、トリプトフ ァンを含む。 本発明のＤＮＡ配列は限定するものではないが、遺伝子産物の処理と発現を修 飾する変更を含み、種々の末端に関しｄｅｌ−１コード配列を変えるために工夫 できる。たとえば突然変異が従来技術でよく知られた技術、たとえば部位指定突 然変異誘発を用いて、新規限定部位への挿入、グリコシル化パターン、ホスホリ ル化を変えるなどして、導入できる。 ｄｅｌ−１タンパク質のドメイン構成に基づき、多数のｄｅｌ−１突然変異ポ リペプチドは、ｄｅｌ−１ドメインをコードするヌクレオチド配列を再編するこ とにより構成できる。ｄｅｌ−１のＥＧＦ様ドメインはタンパク質の結合に関係 することが知られているので、ｄｅｌ−１は他の細胞表面受容体または細胞外間 質タンパク質とこれらドメインを経て直接結合でき、それによってノッチおよび ノッチリガンドと同様の様式で、細胞の運命の決定または分化を制御する。さら に第２のＥＧＦ様ドメイン中のＲＧＤ配列は、あるインテグリンに結合すること が知られていて、そのためｄｅｌ−１はこの配列を経て細胞の付着性、転位、分 化および生命力を調節できる。ｄｅｌ−１のジスコイジンＩ様ドメインは分離型 の細胞結合活性に関係する。因子ＶおよびVIIIの観察された特性にしたがって、 ｄｅｌ−１はそのドメインを経て細胞外間質中のまたは細胞表面上のプロテオグ リカンと直接結合できる。それ故、全長のｄｅｌ−１の種々のドメインの組合せ は分子が結合の多様な型をとることを許す。たとえばｄｅｌ−１の主な形は、Ｅ ＧＦ様およびジスコイジンＩ様ドメインの両方によってインテグリン受容体に群 がることができる。逆にｄｅｌ−１のより小さい断片ま たはその少数の形は、受容体への群がりを起こす能力なしにインテグリンに結合 し、細胞に別のシグナルを起こすだろう。 前述の見地から、ｄｅｌ−１突然変異ポリペプチドを産生することができ、そ の機能上の活性を比較できる。少数の形のほかに、ｄｅｌ−１突然変異はＥＧＦ 様またはジスコイジンＩ様ドメインのみを含むよう構成できる。さらに小型ポリ ペプチドは、ＥＧＦ様およびジスコイジンＩ様ドメインのいずれか一つを含む構 造物から得ることができる。 本発明の別の実施態様において、ｄｅｌ−１または修飾されたｄｅｌ−１配列 は、異種配列と配位し融合タンパク質をコードできる。たとえばｄｅｌ−１と結 合する分子のためのペプチドライブラリーのスクリーニングには、市販の抗体に よって認識される異種のエピトープを発現するキメラｄｅｌ−１タンパク質をコ ードすることが有用である。融合タンパク質はまた、ｄｅｌ−１が異種部分から 開裂できるように、ｄｅｌ−１配列と異種のタンパク質配列との間に位置する開 裂部位を含むよう工夫できる。 本発明の別の実施態様において、ｄｅｌ−１のコード配列はすべてあるいは一 部分従来技術でよく知られた化学的方法を用いて合成できる。たとえば、Caruth ers et al.,1980,Nuc.Acids Res.Symp.Ser.7:215-233、Crea and Horn，180，N uc．Acids Res．9(10): 2331、Matteucci and Caruthers，1980 Tetrahedron L etter 21: 719、Chow and Kempe，1981，Nuc．Acids Res.9(12):2807-2817を参 照されたい。一方、タンパク質自身が化学的方法を用いて合成され、すべてある いは一部分ｄｅｌ−１アミノ酸配列を合成できる。たとえばペプチドは固相技術 により合成し、樹脂からはずし、調製用高速液体クロマトグラフィーにより精製 できる。（たとえば、Creighton,1983,Proteins Structures And Molecular Pri nciples,W.H.Freeman and Co.,N.Y.pp.50-60を参照されたい）。合成ペプチドの 組成はアミノ酸分析またはシークエンシングにより決定できる（たとえば、Ｅｄ ｍａｎ分解法、Creighton,1983,Proteins Structures And Molecular Principle s,W.H.Freeman and Co.,N.Y.pp.34- 49を参照されたい）。 生物学的に活性なｄｅｌ−１を発現するために、ｄｅｌ−１または機能的同等 物用にコードするヌクレオチド配列は適当な発現ベクター、すなわち挿入される コード配列の転写と翻訳のために必要な要件を有するベクターに挿入される。組 換えｄｅｌ−１発現ベクターを用いてトランスフェクトまたはトランスフォーム した、ｄｅｌ−１遺伝子産物は宿主細胞または細胞系と同様に種々の目的のため に利用できる。これらは限定するものではないが、ｄｅｌ−１タンパク質の活性 を拮抗的に阻害しその活性を中和する抗体。及び受容体等のｄｅｌ−１結合パー トナーの活性によく似た抗体（すなわちモノクローナルまたはポリクローナル） の産出を含む。抗−ｄｅｌ−１抗体は、ｄｅｌ−１に陽性の細胞の単離と同様に 、内皮細胞やある腫瘍細胞などの細胞と組織中のｄｅｌ−１の発現レベルの検出 と定量に使用できる。 ５．３．発現システム 当業者によく知られた方法が、ｄｅｌ−１コード配列及び適当な転写／翻訳制 御シグナルを含む発現ベクターの構成に使用できる。これらの方法は、in vitro 組換えＤＮＡ技術、合成技術及びin vivo組換え／遺伝子組換えを含む。たとえ ば、Sambrook et al.,1988,Molecular Cloning A Laboratory Manual,Cold Spri ng Harbor Laboratory,N.Y．と、Ausubel et al.,1989,Current Protocols in M olecular Biology,Green Publishing Associates and Wiley Interscience,N.Y. に記述された技術を参照されたい。 種々の宿主発現ベクターシステムはｄｅｌ−１コード化配列を利用して発現で きる。これらは限定するものではないが次のものを含む、ｄｅｌ−１コード配列 を含む組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮ Ａ発現ベクターにより形質転換されたバクテリアなどの微生物；ｄｅｌ−１コー ド配列を含む組換え酵母発現ベクターにより形質転換された酵母；ｄｅｌ−１コ ード配列を含む組換えウイルス発現ベク ター（たとえばバキュロウイルス）により感染した昆虫細胞システム；組換えウ イルス発現ベクター（たとえば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タ バコモザイクウイルス、ＴＭＶ）により感染した、またはｄｅｌ−１コード配列 を含む組換えプラスミド発現ベクター（たとえばＴｉプラスミド）により形質転 換された植物細胞システム；または動物細胞システム。これらシステムの発現要 件はその強度と特異性によって変わる。利用される宿主／ベクターシステムによ って、いくつかの適当な転写及び翻訳要件は、構成分であり導入可能なプロモー ターを含み、発現ベクターで使用できる。たとえば、バクテリアシステムでのク ローニングでは、バクテリオファージλのｐＬ、ｐｌａｃ、ｐｔｒｐ、ｐｔａｃ （ｐｔｒｐ−ｌａｃハブリッドプロモーター；シトメガロウイルスプロモーター ）等の導入できるプロモーターが使用できる；昆虫細胞システムでのクローニン グでは、バキュロウイルスポリヘドリンプロモーターなどのプロモーターが使用 できる；植物細胞システムでのクローニングでは、植物細胞のゲノムに由来する プロモーター（たとえば、熱ショックプロモーター；ＲＵＢＩＳＣＯの小単位用 のプロモーター；クロロフィルα／β結合タンパク質用のプロモーター）または 、植物ウイルスに由来するプロモーター（たとえば、ＣａＭＶの３５Ｓ ＲＮＡ プロモーター；ＴＭＶのコートタンパク質プロモーター）が使用できる；哺乳動 物細胞システムでのクローニングでは、哺乳動物細胞のゲノムに由来するプロモ ーター（たとえば、メタロチオネインプロモーター）または、哺乳動物ウイルス に由来するプロモーター（たとえば、アデノウイルス後期プロモーター；ワクシ ニアウイルス７．５Ｋプロモーター）が使用できる；ｄｅｌ−１ＤＮＡの多数の コピーを含む細胞系を産生するときには、ＳＶ４０−、ＢＰＶ−及びＥＢＶ−ベ ースのベクターが適当な選択できるマーカーとともに使用できる。 バクテリアシステムにおいて、発現したｄｅｌ−１をもくろむ用途に従って多 数の発現ベクターが有利に選択できる。たとえば、抗体の産生のために、または ペプチドライブラリーをふるい分けするために多量のｄｅｌ−１を製造するとき には、たやすく精製される高レベルの融合タンパク質 産物の発現を指示するベクターが望ましい。そのようなベクターは限定するもの ではないが次のものを含む、Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターｐＵＲ２７８（Ruther e t al.,1983,EMBO J.2:1791）、そのベクターではｄｅｌ−１コード配列が、ｌａ ｃＺコード領域を伴う枠内のベクターに配位でき、そのためハイブリッドＡＳ− ｌａｃＺタンパク質が製造される；ｐＩＮベクター（Inouye & Inouye,1985,Nuc leic acids Res.13:3101-3109;VanHeeke & Schuster,1989,J.Biol.Chem.264:550 3-5509）；等。ｐＧＥＸベクターもまたグルタチオンＳ−ストラスフェラーゼ（ ＧＳＴ）と共に融合タンパク質として外来ポリペプチドの発現に使用できる。一 般にそのような融合タンパク質は可溶で、グルタチオン−アガロースのビーズに 吸着させ次に遊離のグルタチオンの存在で溶出させることによって、溶解した細 胞から容易に精製できる。ｐＧＥＸベクターはスロムビンまたは因子Ｘａプロテ アーゼ開裂部位を含むよう設計されており、そのため興味あるクローン化したポ リペプチドはＧＳＴ部分から離れることができる。特にネズミｄｅｌ−１の主要 なおよび少数のコード配列は、Ｔ７プローター、およびｐＭＡＬＣ２（New Engl and Biolabs）を含むｐＥＴ２８ａ（Novagen Inc.）に挿入された。これらのベ クターは、容易に精製できる融合タンパク質をコードする。 酵母において、構成分でありまたは導入可能なプロモーターを含む多数のベク ターが使用できる。概説として参照されたい、Current Protocols in Molecila r Biology，Vol.2，1988，Ed.Ausubel et al.,Greene Publish．Assoc．& Wiley Interscience，Ch.13; Grant et al.，1987，Expression and Secretion Vecto rs for Yeast，in Methods in Enzymology，Eds．Wu & Grossman，1987，Acad． Press，N.Y.，Vol．153，pp.516-544; Glover，1986,DNA Cloning,Vol.II,IRL P ress，Wash.，D.C.，Ch.3;Bitter,1987,Heterologous Gene Expression in Yeas t,Methods in Enzymology，Eds.Berger & Kimmel,Acad.Press.N.Y.,Vol.152,pp. 673-684;The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces，1982，Eds．Str athern et al.,Cold Spring arbor Press,Vols.I and II。 植物発現ベクターが使用される場合には、ｄｅｌ−１コード配列の発現はいく つかのプロモーターによって行われる。たとえば、ＣａＭＶの３５ＳＲＮＡおよ び１９ＳＲＮＡプロモータ等のウイルスプロモーター（Brisson et al.,1984,Na ture 310:511-514）、またはＴＭＶのコートタンパク質プロモーター（Takamath u et al.,1987,EMBO J.6:307-311）が使用でき；一方ＲＵＢＩＳＣＯの小単位な どの植物プロモーター（Coruzzi et al.,1984,EMBO J.3:1671-1680;Broglie et al.,1984,Science 224:838-843）；または熱ショックプロモーター、たとえばダ イズｈｓｐ１７．５−Ｅまたはｈｓｐ１７．３−Ｂ（Gurley et al.，1986，Mol ．Cell．Biol．6: 559-565）が使用できる。これら構成物は、Ｔｉプラスミド、 Ｒｉプラスミド、植物ウイルスベクター、直接ＤＮＡ形質転換、顕微注射、エレ クトロポレーション等を用いて植物細胞に導入できる。そのような技術の概説と してたとえば、Weissbach & Weissbach,1988,Methods for Plant Molecular Bio logy，Academic Press,NY,Section VIII，pp.421-463; Grierson & Corey，1988 ，Plant Molecular Biology，2d Ed.，Blackie，London，Ch.7-9。 ｄｅｌ−１発現に使用できるもう一つの発現システムは昆虫システムである。 そのような１システムにおいて、オートグラファ核多角形ウイルス（ＡｃＮＰＶ ）が前述の遺伝子を発現するためのベクターとして使用される。そのウイルスは Spodoptera frugiperda細胞中で成長する。そのｄｅｌ−１コード配列は、ウイ ルスの非本質領域（たとえばポリヘドリン遺伝子）へとクローン化し、ＡｃＮＰ Ｖプロモーター（たとえばポリヘドリンプロモーター）の制御下に置かれる。ｄ ｅｌ−１コード配列が首尾よく挿入される結果、ポリヘドリン遺伝子の失活と非 吸蔵組換えウイルス（すなわちポリヘドリン遺伝子により、コード化したタンパ ク質のコートを失ったウイルス）となるだろう。これら組換えウイルスをその後 、挿入された遺伝子が発現するSpodoptera frugiperda細胞に感染するのに使用 される（たとえば、Smith et al.,1983,J.Viol.46:584;Smith,米国特許第４，２ １５，０５１号を参照されたい）。市販のバキュロウイルス発現ベクタ ーｐＦａｓｔＢａｃｌ（Gibco BRL,Inc.）はネズミのｄｅｌ−１コード配列を含 むよう構成された。 哺乳動物宿主細胞において、発現システムに基づく多数のウイルスが利用でき る。アデノウイルスが発現ベクターとして使用される場合には、ｄｅｌ−１コー ド配列はアデノウイルスの転写／翻訳制御複合体に配位できる、たとえば後期プ ロモーターや三部リーダー配列。このキメラ遺伝子をその後in vitroまたはin v ivo組換えによりアデノウイルスゲノムに挿入できる。ウイルスゲノムの非本質 領域（たとえば領域Ｅ１またはＥ３）に挿入した結果、生存でき、感染した宿主 中にｄｅｌ−１の発現が可能な組換えウイルスとなるだろう。（たとえば、Loga n & Shenk，1984，Proc．Natl．Acad．Sci.USA 81:3655-3659）一方、ワクシニ ア７．５プロモーターが使用できる。（たとえばMackett et al.，1982，Proc． Natl．Acad．Sci．USA 79:7415-7419; Mackett et al.，1984，J.Virol.49: 857 -864; Panicali et al.，1982，Proc．Natl．Acad．Sci．USA79: 4927-4931）。 さらに、ネズミｄｅｌ−１とヒト両方のコード配列を、シトメガロウイルスプ ロモーターの制御下にある、哺乳動物発現ベクター、ｐｃＤＮＡ３(Imvitrogen, Inc．）に挿入した。テトラサイクリン導入できるベクター等の調節できる発現 ベクターもまた制御された様式でコード配列の発現に使用できる。 特異な開始シグナルもまた、挿入されたｄｅｌ−１コード配列の有効な翻訳に 求められる。これらシグナルはＡＴＧ開始コドンと隣接した配列を含む。完全な ｄｅｌ−１遺伝子がそれ自身の開始コドンと隣接した配列を含んで、適当な発現 ベクターに挿入される場合には、追加の翻訳制御シグナルは必要としない。しか しながらｄｅｌ−１コード配列の一部分だけが挿入された場合には、外因性の翻 訳制御シグナルがＡＴＧ開始コドンを含んで供給されなければならない。さらに 、その開始コドンは、完全な挿入の翻訳を確実にするために、ｄｅｌ−１コード 配列の読み取り枠と共に相中になければならない。これらの外因性翻訳制御シグ ナルと開始コドンは種々の起源、天然と合成の両方であることができる。適当な 転写エンハン サー要件、転写ターミネーター等の包含により、発現の有効性は高められる（Bi ttner et al.,1987,Methods in Enzymol.153:516-544）。 さらに宿主細胞種族は、挿入された配列の発現を調整する、または望む特定の 様式で遺伝子産物を修飾し処理するものを選ぶことができる。タンパク質産物の そのような修飾（たとえばグリコシル化）と処理（たとえば開裂）はタンパク質 の機能にとって重要である。ｄｅｌ−１細胞外ドメイン中のいくつかの合意のＮ −グリコシル化位置の存在は、ｄｅｌ−１機能にとって固有の修飾が重要かも知 れないという可能性を支えている。タンパク質の翻訳後の処理と修飾に関し、種 々の宿主細胞は固有の特異なメカニズムをもっている。適当な細胞系または宿主 システムは、発現した外来タンパク質の正しい修飾と処理を選んで確保すること ができる。この結末のために、遺伝子産物の第１の転写、グリコシル化、ホスホ リル化の固有の処理のための細胞機構を持つ真核生物が使用される。そのような 哺乳動物宿主細胞は限定するものではないが、ＣＨＯ、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、Ｈｅ Ｌａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、ＷＩ３８、卵黄のう細胞などを含む。 組換えタンパク質の長期間の高収率製造のためには安定した発現が所望される 。たとえば安定してｄｅｌ−１を発現する細胞系が工夫される。複雑なウイルス 起源を含む発現ベクターを使用するよりも、適当な発現制御要件（たとえば、プ ロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化位置な ど）および選択できるマーカーにより制御されたｄｅｌ−１ＤＮＡを用いて、宿 主細胞を形質転換できる。外来ＤＮＡの導入に続き、工夫された細胞を富化培地 で１−２日間成長させ、その後選択した培地に移す。組換えプラスミド中の選択 できるマーカーは選択性への抵抗を授け、細胞が安定してプラスミドを染色体に 組込み、成長してその後クローン化し細胞系に拡大できる焦点を形成させる。こ の方法は、細胞表面上のｄｅｌ−１タンパク質を発現する細胞系を工夫するのに 有利に使用される。そうして工夫された細胞系は、ｄｅｌ−１機能に影響を与え る分子または薬物のスクリーニングにおいて特に有用である。 限定するものではないが、ヘルペスシンプレックスウイルスチミジンキ ナーゼ（Wigler，et al.,1977,Cell 11:223）、ヒポキサンチン−グアニン ホ スホリボシルトランスフェラーゼ（Szybalska & Szybalski，1962，Proc．Natl ．Acad．Sci．USA 48:2026）、アデニン ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ Lowy,et al.，1980,Cell 22:817）、各々ｔｋ^-、ｈｇｐｒｔ^-またはａｐｒｔ^-細 胞に遺伝子を用いることができる、を含んで多数の選択システムが用いられる。 また、選択の基礎として抗中間代謝物抵抗性が使用でき、メトトレキセイトへの 抵抗性を授けるｄｈｆｒ（Wigler,et al.,1 980,Natl.Acad.Sci.USA 77:3567;O' Hara,et al.,1981，Proc．Natl．Acad．Sci.USA 78:1527）；ミコフェノール酸 への抵抗性を授けるｇｐｔ（Mulligan & Berg,1981,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78 :2072）；アミノグリコシドＧ−４１８への抵抗性を授けるｎｅｏ（Colberre-Ga rapim,et al.,1981,J.Mol.Biol.150:1）；ヒグロマイシンへの抵抗性を授けるｈ ｙｇｒｏ（Santerre,et al.,1984,Gene 30:147）。最近追加の選択できる遺伝子 が記述され、細胞にトリプトファンの代わりにインドールを利用させる、名づけ てｔｒｐＢ；細胞にヒスチジンの代わりにヒスチノールを利用させるｈｉｓＤ（ Hartman & Mulligan，1988，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 85:8047）；オルニチ ンデカルボキシラーゼ阻害物、２−（ジフルオロメチル）−ＤＬ−オルニチン、 ＤＦＭＯ（McConlogueL.，1987,Current Communications in Molecular Biology ，Cold Spring Harbor Laboratory ed．）への抵抗を授けるＯＤＣ（オルニチン デカルボキシラーゼ）。 ５．４．ｄｅｌ−１発現細胞の同定 コード配列を含む宿主細胞及び、生物学的に活性なｄｅｌ−１遺伝子産物また はその断片を発現する宿主細胞は、少なくとも４つの一般的アプローチにより同 定できる；ａＤＮＡ−ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド法；ｂ”マーカ ー”遺伝子機能の存在または不存在；ｃ宿主細胞中のｄｅｌ−１ｍＲＮＡ転写の 発現による測定のような、転写レベルの評価；ｄ免疫検定によるまたはその生物 学的活性による測定のような、遺伝子産 物の検定。遺伝子発現の同定に先立ち、宿主細胞は、特に少量のｄｅｌ−１を産 生する細胞系において、ｄｅｌ−１の発現レベルが増大するよう突然変異させて よい。 第１のアプローチのおいて、発現ベクターに挿入されたｄｅｌ−１コード配列 の存在は、各々ｄｅｌ−１コード配列またはその部分またはその誘導体と相同で あるヌクレオチド配列を含むプルーブを用いる、ＤＮＡ−ＤＮＡまたはＤＮＡ− ＲＮＡハイブリッド法により検定できる。 第２のアプローチのおいて、組換え発現ベクター／宿主システムは、ある”マ ーカー”遺伝子機能の存在または不存在に基づいて同定し選別できる（たとえば 、チミジンキナーゼ活性、抗体への抵抗性、メトトレキセイトへの抵抗性、形質 転換表現型、バキュロウイルス中の閉鎖体形など）。たとえば、もしｄｅｌ−１ コード配列をベクターのマーカー遺伝子配列内に挿入すると、ｄｅｌ−１コード 配列を含む組換え体はマーカー遺伝子機能の存在により同定できる。一方、ｄｅ ｌ−１コード配列の発現の制御に用いられる、同じまたは異なるプロモーターの 制御下、マーカー遺伝子をｄｅｌ−１配列のタンデム中に置くことができる。導 入または餞別への応答におけるマーカーの発現は、ｄｅｌ−１コード配列の発現 を示す。 第３のアプローチのおいて、ｄｅｌ−１コード領域に関する転写活性はハイブ リッド検定により評価できる。たとえば、ｄｅｌ−１コード配列またはその特定 の部分と相同なプルーブを用いてノーザン法により、ＲＮＡが単離し分析できる 。一方、宿主細胞の全核酸を抽出し、そのようなプルーブに対するハイブリッド に関し検定できる。さらにＲＴ−ＰＣＲが低レベルの遺伝子発現を検出するのに 用いられる。 第４のアプローチのおいて、ｄｅｌ−１タンパク質産物の発現は免疫学的に、 たとえばウェスタン法、放射線免疫沈降法、酵素結合免疫検定などの免疫検定法 によって評価できる。抗−ｄｅｌ−１抗体と、αＶβ３などのｄｅｌ−１結合パ ートナーを用いてこれを行うことができる。一方、ｄｅｌ−１の生理活性は内皮 細胞の導管形態形成を阻害する能力の検定によ って決定できる。 ５．５．ｄｅｌ−１処理された細胞系の利用 本発明の実施態様において、ｄｅｌ−１を発現するｄｅｌ−１タンパク質およ び／または細胞系は、抗体、ペプチド、天然および合成化合物または結合した他 の細胞、またはｄｅｌ−１タンパク質に結合する可溶な分子をふるい分けするの に使用できる、たとえば抗−ｄｅｌ−１−抗体はｄｅｌ−１機能を阻害または刺 激するために使用できる。一方、組換えて発現した可溶なｄｅｌ−１タンパク質 またはｄｅｌ−１タンパク質を発現する細胞系を用いるペプチドライブラリーの スクリーニングは、ｄｅｌ−１の生物学的活性の阻害または刺激によって機能す る治療上の分子の同定に有用である。ｄｅｌ−１タンパク質と処理された細胞系 の利用は、下記に述べるが、種々の種中のｄｅｌ−１遺伝子家族の他の種類に対 しても同様に十分行える。 本発明の実施態様において、イムノグロブリンの一定の領域等の他の分子と融 合した大部分のｄｅｌ−１コード領域またはその一部を発現するよう処理された 細胞系（Hollenbaugh and Aruffo,1992,Current Protocols in Immunology,Unit 10.19;Aruffo et al.,1990,Cell 61:1303）を利用して、可溶な分子を作製し、 結合パートナーをふるい分け、同定できる。可溶なタンパク質または融合タンパ ク質は、結合検定、アフィニティークロマトグラフィー、免疫沈降法、ウェスタ ン法などで分子を同定できる。一方、ｄｅｌ−１の部分はＥＧＦ受容体膜と細胞 質領域のコード配列に融合できる。ｄｅｌ−１が細胞と結合する受容体として機 能できると仮定すると、このアプローチは、細胞内シグナルを起こすことが可能 な様式で、ｄｅｌ−１と結合する分子の検出のための方法として、ＥＧＦ受容体 シグナルの形質導入の近道の利用を供給提供する。他方では、ｄｅｌ−１は、イ ンテグリン等の特異な既知の受容体を発現する細胞系との結合における可溶な因 子として使用できる。合成化合物、天然産物、および潜在的に生物学的に活性な 物質の他の起源は従来技術でよく知られた検定法でふるい分 けできる。 固相支持体に付着したアミノ酸のすべての可能な組合せから成るランダムなペ プチドライブラリーは、付与された受容体、またはキナーゼドメイン等の受容体 の他の機能性ドメインのリガンド結合位置に結合できるペプチドの同定に使用で きる（Lam,K.S.et al.,1991,Nature 354:82-84）。ペプチドライブラリーのスク リーニングは、与えられた受容体との関係を通じて受容体の生物学的活性を刺激 または阻害する薬剤の発見において、治療上の価値を持つ。 ｄｅｌ−１タンパク質と結合できる分子の同定は、組換えた可溶なｄｅｌ−１ タンパク質によるペプチドライブラリーのスクリーニングによって行うことがで きる。ｄｅｌ−１の発現と精製のための方法は上記項５．２に記載されており、 組換えた全長のｄｅｌ−１または興味ある機能的ドメインをたよるｄｅｌ−１の 断片の発現に使用される。たとえばｄｅｌ−１のＥＧＦ様およびジスコイジンＩ ／因子VIIIドメインは別々に発現しペプチドライブラリーのふるい分けに使用で きる。 ｄｅｌ−１との複合体に関係し形成しているペプチド／固相支持体を同定し単 離するために、ｄｅｌ−１分子を”標識”することが必要である。ｄｅｌ−１タ ンパク質は、アルカリ性ホスファターゼまたはホースラディッシュパーオキシダ ーゼ等の酵素、またはフルオレスセインイソシアナート（ＦＩＴＣ）、フィコエ リトリン（ＰＥ）またはローダミンを含む蛍光標識などの他の試薬と抱合できる 。いずれかの与えられた標識とｄｅｌ−１の抱合は従来技術分野でよく知られた 技術を用いて行える。一方、ｄｅｌ−１発現ベクターは、市販されている抗体が 存在するエピトープを含むキメラｄｅｌ−１タンパク質を発現するよう工夫され る。エピトープ特異性抗体は、酵素、蛍光染料または着色または磁気ビーズによ る標識を含む、従来技術分野でよく知られた方法を用いて標識できる。 ”標識された”ｄｅｌ−１抱合体を２２℃で３０分から１時間ランダムなペプ チドライブラリーとともにインキュベートし、ｄｅｌ−１とライブラリー中のペ プチド種との間に錯体形成をさせる。次にそのライブラリー を洗い、結合していないタンパク質を除く。もしｄｅｌ−１がアルカリ性ホスフ ァターゼまたはホースラディッシュパーオキシダーゼと抱合していたならば、ア ルカリ性ホスファターゼまたはパーオキシダーゼのいずれかのための基質、たと えば各々、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート（ＢＣＩＰ） 、または，３，３’，４，４″−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）、を含むペトリ 皿に全ライブラリーを注ぐ。数分インキュベートすると、ペプチド／固相−ｄｅ ｌ−１錯体は変色し、ミクロマニピュレーターによる解剖顕微鏡下で物理的に容 易に同定し単離できる。もし蛍光標識したｄｅｌ−１が使われたならば、錯体は 蛍光活性化選別法によって単離できる。もし異種のエピトープを発現するキメラ ｄｅｌ−１タンパク質が使われたならば、ペプチド／ｄｅｌ−１錯体の検出は標 識したエピトープ特異性抗体の使用によって行える。単離した後、固相支持体に 付着したペプチドの同定はペプチド配列決定法によって決定できる。 可溶なｄｅｌ−１分子の使用に加えて、別の実施態様において、手をつけない 細胞を用いる、細胞表面受容体に結合するペプチドの検出は可能である。手をつ けない細胞の利用は、多元的または可変である受容体、または細胞膜の脂質ドメ インが機能することを求める受容体との使用にとって望ましい。ｄｅｌ−１を発 現する細胞系を産生する方法は項５．３に記載している。この技術で使用する細 胞は生きているか、または固定細胞のいずれかである。細胞をランダムなペプチ ドライブラリーとともにインキュベートし、ライブラリー中のあるペプチドと結 合して、標的細胞と適当な固相支持体／ペプチドとの間に”ロゼット”を形成さ せる。その後ロゼットは分画遠心分離により単離するか、または解剖顕微鏡下で 物理的に除ける。 膜結合受容体または細胞膜の脂質ドメインが機能することを求める受容体につ いての全細胞検定の代わりとして、受容体分子を”標識”が着くことができるリ ポソーム内に再構成できる。 従来技術でよく知られた種々の方法が、天然および、組換えて産生したｄｅｌ −１タンパク質のエピトープに対する抗体の作製に使用できる。そ のような抗体は限定するものではないが、ポリクローナル、モノクローナル、キ メラ、単鎖、Ｆａｂ断片およびＦａｂ発現ライブラリーから作製された断片を含 む。中和抗体、すなわちｄｅｌ−１タンパク質のリガンド結合位置に関し競合す る抗体は、特に診断学と治療学に好まれる。 ｄｅｌ−１と結合するモノクローナル抗体は、注入後体内の所在と分布に従う よう放射能標識できる。放射性同位体標識抗体は、新たに腫瘍と転位の細胞を映 し出す、侵入しない診断道具として使用できる。 免疫毒素もまた体内の特定の部位めがけて細胞毒薬剤を送るよう設計できる。 たとえば高親和力のｄｅｌ−１特異的モノクローナル抗体は、ジフテリア毒素、 リチン等のバクテリアまたは植物毒素と共役的に複合できる。抗体／ハイブリッ ド分子の一般的調製法は、抗体上の第１級アミノ基を攻撃し、ジスルフィド交換 により毒素を抗体に結びつける、ＳＰＤＰなどのチオール橋かけ剤の使用を含む ことができる。ハイブリッド抗体はｄｅｌ−１発現腫瘍細胞の排除に特異的に使 用できる。 抗体製造のために、限定するものではないがウサギ、マウス、ラット等を含む 、組換え体または天然に精製されたｄｅｌ−１タンパク質、融合タンパク質また はペプチドを用いて、種々の宿主動物は注射により免疫になる。種々のアジュバ ンドが、宿主の種によって、免疫学的応答を増大するよう用いられ、限定するも のではないがフロイトアジュバンド（完全なおよび不完全な）、水酸化アルミニ ウム等の無機質ゲル、リゾレシチン、プルロニック多価アルコール、多価アニオ ン、ペプチド、オイルエマルジョン、キーホールリムペットヘモシアニン、ジニ トロフェノール等の界面活性物質、ＢＣＧ（bacilli Calmette-Guerin）Coryneb acterium parvum等の潜在的に有用なヒトアジュバンドを含む。 ｄｅｌ−１に対するモノクローナル抗体は、培養中の連続細胞系による抗体分 子の製造を供給するいずれかの技術を用いて調製できる。これらは限定するもの ではないが、KohlerとMilsteinにより最初に述べられたハイブリドーマ技術（Na ture,1975,256:495-497）、ヒトＢ−細胞ハイブリドーマ技術（Kosbor et al.,1 983,Immunology Today,4:72;Cote et al.,1983,Proc.Natl.Acad.Sci.,80:2026-2030）、ＥＢＶ−ハイブリドーマ技術 （Cole et al.,1985,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss, Inc.,pp.77-96）を含む。さらに適当な抗原特異性のマウス抗体分子からの遺伝 子を、適当な生物学的活性のヒト抗体分子からの遺伝子とともにスプライニング することによる、”キメラ抗体”の製造のために開発された技術（Morrison et al.，1984，Proc．Natl．Acad．Sci.，81: 6851-6855; Neuberger et al.,．198 4，Nature，312: 604-608; Takedaet al.，1985，Nature，314:452-454）が使用 できる。一方、単鎖抗体の製造のために述べられた技術（米国特許第４，９４６ ，７７８号）が、ｄｅｌ−１−特異的単鎖抗体の製造に応用できる。 ハイブリドーマは、再生組換えｄｅｌ−１に特異的な抗体を分泌する培養を検 定するために、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）を用いてふるい分けでき る。培養もまたＥＬＩＳＡによってふるい分けし、哺乳動物産生ｄｅｌ−１に特 異的な抗体を分泌する培養を検定できる。抗体特異性の確定は同じ抗原を用いる ウェスタン法によって得られる。その後のＥＬＩＳＡ試験を組換えｄｅｌ−１断 片に行って、モノクローナル抗体が結合するｄｅｌ−１分子の特定の部分を同定 できる。組織学的切断の染色法、ｄｅｌ−１の免疫沈降法、またはｄｅｌ−１活 性の中和などの所望の機能特性を用いるモノクローナル抗体の同定も、さらに試 験できる。モノクローナル抗体アイソタイプの決定はＥＬＩＳＡにより行われ、 精製と機能に関するさらなる情報を供給する。 ｄｅｌ−１の特定の結合部位を含む抗体断片は既知の技術によって産生できる 。たとえばそのような断片は断定するものではないが、抗体分子のペプシン消化 により作ることができるＦ（ａｂ’）₂、Ｆ（ａｂ’）₂断片のジスルフィド橋の 還元によって産生できるＦａｂ断片を含む。一方、Ｆａｂ発現ライブラリーは構 成され（Huse et al.，1989，Science，246: 1275-1281）、所望のｄｅｌ−１へ の特異性による、モノクローナルＦａｂ断片の早く容易な同定を許している。抗 −ｄｅｌ−１抗体は、ｄｅｌ−１発現細胞の単離または、細胞混合体からのその ような細胞の除去に使用 できる。 ５．６．ｄｅｌ−１ポリヌクレオチドの利用 ｄｅｌ−１ポリヌクレオチドは診断および／または治療目的で使用できる。診 断目的で、ｄｅｌ−１ポリヌクレオチドは、疾病状態におけるｄｅｌ−１遺伝子 発現または異常ｄｅｌ−１遺伝子発現の検出に使用できる。ｄｅｌ−１の翻訳を 阻害するよう機能する、アンチセンスＲＮＡとＤＮＡ分子およびリボザイムとを 含むオリゴヌクレオチド配列は、本発明の範囲に含まれる。 ５．６．１．ｄｅｌ−１ポリヌクレオチドの診断への利用 ｄｅｌ−１ポリヌクレオチドは、ｄｅｌ−１の異常発現に由来する疾病の診断 のための多数の用途を持つことができる。たとえば、ｄｅｌ−１ＤＮＡ配列は、 ｄｅｌ−１発現の異常を診断するための生検または剖検のハイブリッド検定、た とえばその場でのハイブリッド検定を含むサザンまたはノーザン検定に使用でき る。そのような技術は従来技術でよく知られており、事実上多くの市販されてい る診断装置の基礎である。 ５．６．２．ｄｅｌ−１ポリヌクレオチドの治療への利用 ｄｅｌ−１ポリヌクレオチドは種々の異常な状態の治療に有用である。細胞へ の遺伝子配列の導入によって、正常なｄｅｌ−１の発現不足または異常／不活の ｄｅｌ−１の発現のために、細胞が正常に複生または分化しない状態の治療に、 遺伝子治療を使用することができる。いくつかの例で、ｄｅｌ−１をコードする ポリヌクレオチドは、機能的に不十分な生来の遺伝子にとって変わってまたは代 わりに働くつもりである。一方、複生しすぎによって特徴づけられる異常な状態 は、下に記載する遺伝子治療技術を用いて治療することができる。 異常な細胞の複生は多様な疾病状態の重要な要素である。ウイルスベクターな どの組換え遺伝子治療ベクターは、自然に生じる生来のｄｅｌ−１の活性を阻害 するよう用いられる、ｄｅｌ−１の異なる、シグナリングが無能な形を発現する よう工夫できる。たとえばシグナリングが無能な形は、そのシグナルの形質導入 ドメインのすべてまたは一部を欠くタンパク質の先端を切ったような形である。 そのような先端を切った形は、基質との正常な結合に関係するが、シグナルの形 質導入活性を欠く。そのため組換え遺伝子治療ベクターは、ｄｅｌ−１の異常な 発現または活性に由来する疾病の処置に治療的に用いられる。さらに、ｄｅｌ− １タンパク質のシグナリングが無能な形をコードするＤＮＡ分子のデリバリーか ら成る、細胞中の生来のｄｅｌ−１タンパク質によるシグナルの形質導入の効果 を阻害する方法を、本発明は供給し、そのためシグナリングが不能なｄｅｌ−１ タンパク質が細胞中に産生し、生来のｄｅｌ−１タンパク質により活性化するま たは活性化された、ｄｅｌ−１タンパク質シグナリングの近道中の分子への接近 に関し、生来のｄｅｌ−１タンパク質と競合する。 レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイル ス、またはウシパピローマウイルスなどのウイルスに由来する発現ベクターは、 標的にする細胞集団への組換え体ｄｅｌ−１のデリバリーのために使用できる。 当業者によく知られた方法を用いて、ｄｅｌ−１ポリヌクレオチド配列を含む組 換えウイルスベクターを構成することができる。たとえば、Maniatis et al.,19 89,Molecular Cloning A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y．とAusubel et al.，1989，Current Protocols in Molecular Biology，Gre ene Publishing Associates and Wiley Interscience，N.Y．に記載の技術を参 照されたい。一方、組換えｄｅｌ−１分子は、標的細胞へのデリバリーのためリ ポソームに再構成できる。 ｄｅｌ−１ｍＲＮＡの翻訳を阻害するよう機能するアンチセンスＲＮＡとＤＮ Ａおよびリボザイムを含むオリゴヌクレオチド配列は本発明の範囲内にある。ア ンチセンスＲＮＡとＤＮＡ分子は、標的としたｍＲＮＡと結合しタンパク質翻訳 を妨げることによって、ｍＲＮＡの翻訳を直接妨害するよう働く。アンチセンス ＤＮＡに関しては、翻訳開始位置、たとえばｄ ｅｌ−１ヌクレオチド配列の−１０と＋１０領域の間、に由来するオリゴデオキ シリボヌクレオチドが好ましい。 リボザイムはＲＮＡの特異的な開裂を触媒することが可能な、酵素のＲＮＡ分 子である。リボザイムの作用のメカニズムは、補足的標的ＲＮＡへのリボザイム 分子の配列が特異なハイブリッド化を含み、ヌクレオチド内開裂がその後に続く 。ｄｅｌ−１ＲＮＡ配列のヌクレオチド内開裂を特異的に効果的に触媒する、ハ ンマーの頭モチーフの工夫されたリボザイム分子は、本発明の範囲内である。 潜在的ＲＮＡ標的内の特異的リボザイム開裂位置は、標的分子の走査によって 、次の配列、ＧＵＡ、ＧＵＵ、およびＧＵＣ、を含むリボザイム開裂位置として 、まず同定された。同定した後、開裂位置を含む標的遺伝子の領域に相当する、 １５と２０の間のリボヌクレオチドの短いＲＮＡ配列は、オリゴヌクレオチド配 列を不適当にする第２構造などの予想される構造的特徴に関し、評価される。候 補の標的の適合性もまた、リボヌクレアーゼ保護検定を用い、補足的オリゴヌク レオチドを伴うハイブリッド化への近づき易さを試験することにより評価できる 。 本発明のアンチセンスＲＮＡとＤＮＡ分子およびリボザイムはともに、ＲＮＡ 分子の合成に関し従来技術で知られたいずれかの方法によって調製できる。たと えば固相ホスホルアミジート化学合成などの、従来技術でよく知られたオリゴデ オキシリボヌクレオチドの化学的合成技術も含まれる。一方、ＲＮＡ分子は、ア ンチセンスＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列のin vitroおよびin vivo転写に よって産生できる。そのようなＤＮＡ配列は、Ｔ７またはＳＰ６ポリメラーゼプ ロモーターなどの適当なＲＮＡポリメラーゼプロモーターを組み入れる、多様な ベクターに組み入れられる。一方、アンチセンスＲＮＡを構造的にまたは導入的 に合成するアンチセンスｃＤＮＡ構成物は、使用するプロモーターによって、細 胞系に安定して導入できる。 ＤＮＡ分子への種々の修飾は、細胞内安定性および半減期を高める手段として 導入できる。可能性のある修飾は限定するものではないが、分子の ５’および／または３’末端へのリボ−またはデオキシ−ヌクレオチドのわきに ある配列の付加、またはオリゴデオキシリボヌクレオチド背骨中のホスホジエス テラーゼよりもむしろホスホロチオアートまたは２’Ｏ−メチル結合の使用を含 む。 そのような細胞または組織へポリヌクレオチドを導入する方法は、裸のポリヌ クレオチドの挿入、すなわち組織への注射による、などのポリヌクレオチドのin vitro導入、細胞ex vivo中のｄｅｌ−１ポリヌクレオチドの導入、すなわち同 元細胞治療での利用、ウイルス、レトロウイルス、ファージまたはプラスミドな どのベクターの使用、またはin vivoまたはex vivoで使用できるエレクトロポレ ーション等の技術を含む。 5.7.ＤＥＬ−１タンパク質の用途 β-gal遺伝子発現がdel-1エンハンサーによって制御されるトランスジェニッ クマウスにおけるβ-gal発現の分析は、del-1遺伝子が脈管形成(vasculogenesis )を行う内皮細胞中で活性化されることを示している。脈管形成とは胚前駆体細 胞からのde novoの血管の発生をいう。血管形成(angiogenesis)の関連プロセス は、現存している血管が先に存在している血管からの増殖によって発生するプロ セスである。脈管形成は胚に限定されるが、その一方血管形成は、創傷治癒応答 として、又は慢性的にストレスを受けている組織の酸素付加を増大させるために 一生を通じて続く（Pardanaudら，1989 Development 105:473; Granger 1994，C ell and Mol．Biol．Res．40:81）。 Del-1は胚の脈管形成中及び血管形成において機能しそうである。治療的用途 のためにば、Del-1、Del-1の部分又はDel-1をブロックする抗体は、臨床的に関 連した抗原細胞を刺激し、抑制するので、これらの抗原細胞と相互作用し得るこ とが必須である。Del-1がかかるプロセスに正常に関係するならば、Del-1の機能 の操作は血管形成において有意な効果を及ぼし得る。 第９節及び第10節の作業実施例は、Del-1が血管形成において抑制効果を発揮 することを示すものであり、そのような効果はDel-1のαＶβ３発現内皮細胞と の相互作用によって仲介され得る。Del-1タンパク質又はDel-1の部分か らなる組換えタンパク質は、血管形成を抑制するために、又は内皮細胞アポトー シスを誘発するために機能し得る。このような機能は、腫瘍小節等の組織の新生 血管形成を防ぐのに臨床的に有用であり得る。血管形成の抑制は腫瘍転移を防ぐ のに有用である(Fidler及びEllis，1994，Cell 79:185)。最近、O'Reillyら(199 4，Cell，79:315)は、腫瘍を有するマウスから単離した新規の血管形成抑制剤で あるアンギオスタチン(angiostatin)が特に内皮細胞増殖を抑制するということ を報告した。in vivoにおいて、アンギオスタチンは新生血管形成及び腫瘍転移 の増大のの強力な抑制剤である。関連した報告においては、Brooksら(1994，Cel l 79:115)は、インテグリン拮抗薬が血管由来の血管のアポトーシスを誘発する ことによって腫瘍退縮を促進するということを示した。これらのインテグリン拮 抗薬はＲＧＤアミノ酸配列を含む環状ペプチドを含んでいた。Del-1はＲＧＤ配 列を含んでいるので、Del-1分子のかかる部分の使用は同様の効果を及ぼし得る 。 また、Del-1のジスコイジン(discoidin)Ｉ／因子VIII様ドメインの操作も、血 管形成を抑制するために使用し得る。アポリポタンパク質Ｅ（アポＥ）はin vit roで、基礎的(basic)線維芽細胞増殖因子(bFGF)の刺激による内皮細胞増殖を抑 制することが示されている(Vogelら，1994，J．Cell．Biochem．54:299)。また 、このような作用はアポＥ配列の一部に基づいた合成ペプチドでも生じさせるこ とができた。これらの結果は、ヘパリン硫酸プロテオグリカンへの結合に対する アポＥと増殖因子との直接的な競合、又はアポＥによる細胞−トリックス相互作 用の分断によるものであり得る。Del-1中のジスコイジンＩ／因子VIII様ドメイ ン等のジスコイジンＩ／因子VIII様ドメインがプロテオグリカンに結合するとい うことが提案されている。さらに、Del-1は多くの細胞外マトリックスタンパク 質の構造に似ている。したがって、Del-1は、bFGF等の増殖因子の活性に作用す るように、又は内皮細胞と細胞外マトリックスの間の相互作用を変化させるよう に操作され得る。 Del-1の抗血管形成活性は、血管形成によって生ずる異常な状態を治療するた めに用いられ得る。かかる状態には、限定するものではないが、癌、糖尿病性網 膜症、慢性関節リウマチ及び子宮内膜症が含まれる。また、Del-1が自然に 血管の形成を抑制する状況におけるDel-1の除去又は阻害は、血管形成を促進す るために用いられ得る。このような状況には、限定するものではないが、心臓虚 血、血栓発作(thrombotic stroke)、創傷治癒及び末梢血管疾患が含まれる。さ らに、Del-1は骨形成を刺激するために用いられ得る。 ６．実施例：ヒト及びマウスdel-1ヌクレオチド配列の分子クローニング 6.1.材料及び方法 6.1.1.トランスジェニックマウスの作製 SLM275トランスジェニックマウス系統をC57BL6×DBA/F1バックグラウンド中で 作製した。そのトランスジェニック動物はその系統の保存及び胚の発生のために 同様のB6D2F1動物と戻し交配しておいた。このトランスジーンはヘテロ接合性状 態で保存されており、これらのヘテロ接合性マウスは正常な繁殖能力を有してい た。しかしながら、予備実験によってこれらの動物がホモ接合性状態では生存可 能ではないことが示された。 6.1.2.del-1 の分子クローニング SLM275トランスジェニック動物の腎臓から単離した高分子量のＤＮＡからゲノ ムライブラリーを構築した。前記ＤＮＡをSau3Aにより部分的に消化して20kbの 平均サイズのものを得て、部分代用反応(partial fill-in reaction)にかけ、次 いで同じように処理したλファージベクター(λFix，Stratagene)にクローニン グした。このようにして構築したライブラリーは約２百万のクローンのベースを 有していた。これらのクローンを増幅し、ライブラリーを−70℃で保存した。ト ランスジーンのSV40ポリアデニル化シグナルから誘導した200塩基対(bp)のプロ ーブをプローブとして使用し、12個のλファージクローンを単離した。これらの クローン中の６個をさらなる研究のためにランダムに選択した。これらのクロー ンをマッピングしてトランスジーン配列を含まない制限断片を同定した。このク ローンを共通の非トランスジェニック断片に基づいて２つのグループに分けた。 第１のグループのファージ由来の１つの断片はゲノムブロットに特異的にハイブ リダイゼーションし、その断片が組み込み部位に隣接した領域由来のものである という証拠を示した。このプローブへのハイブリダイゼーションに よって、同一の遺伝的背景(B6D2F1)の非トランスジェニックマウス由来のゲノム ＤＮＡを、SLM275トランスジーン動物のものと比較した。トランスジーン組み込 みによって分断された断片を表す再配列したバンドが、EcoR1及びBamH1消化物と ともにSLM275レーンに観察された。隣接配列プローブを用いて、129SVマウス系 統から構築した市販のλFixIIゲノムライブラリー(Stratagene)をスクリーニン グした。 マウスｃＤＮＡ断片をプローブとして使用してそのヒト相同体のｃＤＮＡクロ ーンを同定した。このプローブは、マウスdel-1主働(major)配列におけるヌクレ オチド1249〜1566と一致していた。標準的な手続きの後にヒトｃＤＮＡクローン をヒト胎児肺ｃＤＮＡライブラリー(Clonetech社)から単離した。 6.2.結果 偶然のエンハンサートラップ(trap)事件によってある１つのトランスジェニッ クマウス系統が創出された。最初の研究はマウスSPARCプロモーターの細胞特異 的及び発生特異的調節領域をマッピングするために計画された。その2.2キロベ ース(kb)のSPARC 5'隣接配列はE.coli lacZ（β−ガラクトシダーゼ又はβ-gal ）リポーター遺伝子の上流に位置していた。マウスSPARC遺伝子は、一般に、特 定の細胞外マトリックスを合成する広範な種類の成体細胞及び胚細胞中で発現す る(Nomuraら，1989，J．Biol．Chem．264:12201-12207)。しかしながら、その創 始マウス系統の中の１つは、天然SPARC遺伝子とは全く異なった、かなり制限さ れた発現のパターンを示した。マウスのこの特定の系統におけるlacZリポーター の発現は、SLM275が内皮系列の細胞中にかなり早期にみられることと関係してい た。全体封入(whole mount)lacZ染色を最初の研究のために用いた。続いて、こ れらの胚を薄片に切って光学顕微鏡で調べた。染色するための第１の細胞は心内 膜、流出路(outflow tract)、及びを発達中の椎骨間管(developing interverteb ral vessels)を形成する内皮細胞であった。染色は主な血管の形成に関係する内 皮細胞に顕著に制限されるようであった。発現はpc11.5日後に低下し始めた。 このトランスジーンによって標的とされるゲノム領域を本明細書中ではdel-1 という。最初のクローニング実験は、トランスジーン組み込み部位に隣接するゲ ノム配列を単離することにねらいをつけていた。多くのλファージクローンが単 離され、マッピングされた（図１）。これらのクローン中に、約40kbの野生型de l-1配列が含まれていた。これらのλファージの制限消化物を含有するサザンブ ロットをSLM λファージクローン由来の非トランスジェニック断片を用いてプロ ーブすることによって、トランスジーン組み込みの部位をマッピングした。トラ ンスジーン複合体の挿入は約８kbのＤＮＡの欠失と関係していた。１つの組み込 み部位には約25kbの隣接配列が存在し、約５kbのその他の隣接配列がこれらのク ローンに含まれていた。 エキソントラッピング(trapping)を用いてエキソンの存在のについてゲノム断 片を評価した。このアプローチではスプライス供与部位及びスプライス受容部位 を含むＤＮＡ断片を通じて転写を走らせる構成プロモーターを有するベクターを 利用した。これらのスプライシングシグナルの間は、評価されるゲノムＤＮＡ断 片がクローニングされている共通のクローニング部位であった。構築物がＣＯＳ 細胞等の真核細胞にトランスフェクションされている場合、これらの断片内のエ キソンは転写物にスプライシングされるであろう。トラップされた(trapped)エ キソン配列を含有する転写物を、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)によ ってＣＯＳ細胞から解放した。ＰＣＲ増幅ＤＮＡをクローニングし、評価した。 「左端」組み込み部位から約10kbに位置するゲノムＤＮＡの断片から160kbの エキソンをトラップした。トラップされたエキソンのヌクレオチド配列を用いて NCBIにおけるBLASTルーチンを通じて種々の核酸データバンクをスクリーニング したところ、有意な核酸相同性を有する他の遺伝子は存在しないことが明らかに なった。続いて、１個のオープンリーディングフレームの推定アミノ酸配列をデ ータバンク検索に用いた。この検索によって、トラップされたエキソン中にコー ドされているタンパク質ドメインが、因子Ｖ、因子VIII及びジスコイジンＩ（図 ２）（Jennyら，1987，Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．84:4846-4850; Pooleら ，1981，J．Mol．Biol．153:273-289; Tooleら，1984，Nature 312:342-347）を 含む、多くのタンパク質のドメインに幾分似ているということが明らかになった 。最も似ているタンパク質は乳脂肪小球タンパク質であった。 乳脂肪小球タンパク質は、乳房上皮細胞の表面で見い出されたものである(1994 ，WO 94/11508)。このタンパク質におけるジスコイジンＩ様ドメインがかかるタ ンパク質を上皮細胞の表面に局在化させるものと仮定されている(Laroccaら，19 91，Cancer Res．51:4994-4998; Stubbsら，Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．87 :8471-8421)。因子Ｖ及び因子VIIIの相同領域は、上皮細胞及び血小板の表面の リン脂質との相互作用に関与している(Jennyら，1987，Proc．Natl．Acad．Sci ．U.S.A．84:4846-4850; Tooleら，1984，Nature 312:342-347)。また、ツメガ エル属タンパク質Ａ５との相同性も観察された。Ａ５は、網膜ニューロン及び網 膜ニューロンが接触する視覚中枢にあるニューロン中で発現する神経細胞表面分 子である(Takagiら，1991，Neuron 7:295-307)。Ａ５は、おそらく細胞内シグナ ル伝達を仲介することによって、この神経回路の発達における神経認識分子とし ての役割を演ずると提案されている。このジスコイジンＩ様ドメインと名付けら れたタンパク質は、細胞性粘菌(Dictyostelium discoideum)中で発現するタンパ ク質であり、このタンパク質は個々の細胞の凝集において必須の役割を有する。 トラップされたエキソンをコードするＤＮＡ断片をサザンブロット実験におけ るプローブとして使用したところ、エキソントラップ構築物中で用いられる領域 の外側のdel-1遺伝子座の領域とハイブリダイゼーションすることがわかった。 かかる発見を得たので、エキソントラッププローブを用いることによってｃＤＮ Ａクローニングを追跡し、11.5日胚マウスｃＤＮＡライブラリーをスクリーニン グした。クローンをプラーク精製し、さらなる分析のために挿入断片をプラスミ ドにサブクローニングした。ヌクレオチド配列分析によって、胚ｃＤＮＡクロー ンの中の２つがトラップされたエキソンの配列を含有していることが示された。 そのクローンの配列を用いてジスコイジンＩ様ドメインの推定アミノ酸配列を拡 充した（図２）。これらのｃＤＮＡの完全なヌクレオチド配列を分析し、RNアー ゼ保護及びin situハイブリダイゼーションのためにｃＲＮＡ転写物の作製を可 能にするプラスミドベクターにクローニングした（図３Ａ〜３Ｅ）。 Clontech社から購入したヒト胎児肺ｃＤＮＡλファージライブラリーからヒト ｃＤＮＡを単離した（図４Ａ〜４Ｃ）。マウスdel-1 ｃＤＮＡの一部をプロ ーブとして用いた（図５）。ヒトｃＤＮＡクローンの同一性をヒト及びマウスＤ ＮＡ配列を比較することによって確認した。これらのクローンは約80％のＤＮＡ 配列相同性及び約94％のアミノ酸配列相同性を示す（図６）。これらの配列を、 del-1の「主働(major)」体という。del-1の最初の単離に基づいて、標準的な分 子生物学的方法をさらなるクローンの単離に用いた。 ヒトdel-1のＤＮＡ配列分析によって分子量53,797の481アミノ酸タンパク質を コードすると予言される1,446の塩基対のオープンリーディングフレームが明ら かになった。マウスｃＤＮＡは480アミノ酸タンパク質をコードする。ＤＮＡ及 びタンパク質データベースによる相同性比較によって、Del-1タンパク質は３つ のＥＧＦ様タンパク質ドメイン、及びそれに続く２つのジスコイジンＩ／因子VI II様ドメインから構成されることが示された（図７）。del-1に似た遺伝子はNot ch等のいくつかの重要な細胞決定及び細胞分化の調節遺伝子を含んでいた。全体 的に、Del-1タンパク質は、膜関連乳脂肪球皮膜タンパク質MGF-E8に似た構造を 有している。このMGF-E8は、乳癌をイメージングするための抗体を発生させるた めに用いられている（図８）。 Del-1タンパク質の生理学的な機能は、他のタンパク質におけるＥＧＦ様及び ジスコイジンＩ／因子VIII様ドメインで証明されている活性に関係している。Ｅ ＧＦ様ドメインはタンパク質−タンパク質結合相互作用に関与することが示され ている一方、因子VIIIのジスコイジンＩ様ドメインは負に荷電したリン脂質と会 合することによって細胞膜への結合を仲介すると考えられる。したがって、Del- 1タンパク質は、前駆体細胞の膜に結合してＥＧＦ様ドメイン受容体タンパク質 と相互作用することによって、内皮細胞決定又は分化に対するシグナルを創出し 得る。 ヒトDel-1のオープンリーディングフレームの重要な構造的特徴は、下記のも のを含む： １）推定イニシエーターメチオニン及び推定分泌シグナル配列（図９）、 ２）３つのＥＧＦ様ドメイン（図10）、 ３）２つのジスコイジンＩ様ドメイン。 ヒト及びマウスの両方のdel-1遺伝子をさらにクローニング及び分析するこ とによってさらなる変異体が明らかになった。例えば、del-1の主働体の第１及 び第２のＥＧＦ様ドメインの間の30bp（すなわち10アミノ酸）が取り除かれたヒ トスプライシング変異体（Ｚ20クローン）を得た。さらに、マウスdel-1の切形 版を単離した。これは、シグナルペプチド配列、全ての３つのＥＧＦ様ドメイン 、及び部分的なアミノ末端ジスコイジンＩ／因子VIII様ドメインのみ（約40％） を含有していた。この変異体は、マウスdel-1微働(minor)配列といい、図12Ａ〜 12Ｅに開示されている。この転写物はマウス胚ライブラリーからのみクローニン グされたが、いくつかの独立したｃＤＮＡのクローニングによって確認された。 ７．実施例：del-1遺伝子発現の組織分布 7.1.材料及び方法 7.1.1.トランスジェニックマウス胚の全体封入染色 第２世代又は第３世代の雄性トランスジェニック動物を８〜10週齢のB6D2F1雌 と交配させて、胚を7.5、8.5、9.5、10.5及び13.5日目に採収した。時間の計測 は、交配の日の正午を交配後(pc)0.5日とする慣行に基づいた。脱落膜及び膜の ない胚を採収し、切開して２％グルタルアルデヒド中に固定し、標準プロトコル にしたがって標準Ｘ-gal指示溶液中で全体封入として染色した。例外は、11.5日 よりも加齢した胚を、固定及び染色溶液がより浸透するように二等分したという ことであった。染色した組織を全体封入胚中でオリンパスSZH10立体顕微鏡を用 いて７〜70×で検査することによって同定し、暗視野照明下で撮影した。pc7.5 、8.5、9.5、及び13.5日の胚をパラフィンに包埋し、切片を作製し、ヌクレアフ ァーストレッド法(nuclear fast red)によって対比染色してZeiss Axioplan顕微 鏡で明視野照明下で調べた。 7.1.2 ノーザンブロット分析 del-1遺伝子の発現を研究するために、種々のヒト及びマウス組織から得られ たＲＮＡ(Clontech、パロアルト(Palo Alto)、カリフォルニア州(CA))を含むノ ーザンブロットを図５に示したような放射標識ＤＮＡプローブを用いてハ イブリダイゼーションさせた。さらに、成体器官、pc15.5日の全胚及び胚から切 り出した器官をポリトロンで粉砕し、ＲＮＡをC３Clグラジエントによって単離 した(Sambrookら，1989，分子クローニング(Molecular Cloning)、実験の手引き (A Laboratory Mannual)、Cold Spring Harbor Laboratory、ニューヨーク)。簡 単に言うと、ブロットを５×SSPE、10×デンハルト溶液、100μg/mlの新たに変 性させ破砕したサケ精子ＤＮＡ、50％ホルムアルデヒド（新たに脱イオン化した もの）及び２％ＳＤＳを含有する溶液中で42℃にて３〜６時間予備ハイブリダイ ゼーションさせた。放射標識プローブを加熱変性し、予備ハイブリダイゼーショ ン混合物に添加し、絶えず振盪しながら42℃で18〜24時間ハイブリダイゼーショ ンさせた。ブロットを２×SSC、0.05％ＳＤＳで室温で数回すすいだ後、0.1×SS C、0.1％ＳＤＳを含有する洗浄溶液に移して50℃で40分間激しく攪拌した。次い で、ブロットをプラスチックラップでカバーし、ワットマン紙にのせて、補力(i ntensifying)スクリーンを用いて−70℃にてＸ線フィルムに曝した。 7.1.3.逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR） 標準的な実験手順(Sambrookら，1989，分子クローニング、実験の手引き、Col d Spring Harbor Laboratory、ニューヨーク)を用いて全ＲＮＡを単離した。全 ＲＮＡ約１μｇを逆転写してｃＤＮＡをＰＣＲによって増幅した(Perkin Elmer 、ノーウォーク(Norwalk)、コネティカット州(CT))。ＰＣＲ増幅条件は下記のと おりである：94℃で30秒、60℃で30秒、72℃で30秒を合計40サイクル。増幅産物 をアガロースゲル電気泳動によって分離し、エチジウムブロミド染色によって視 覚化した。増幅物(amplimer)は下記のとおりである： 7.2.結果 ヒト及びマウスの種々の組織及び細胞系統中のdel-1の発現を全体封入染色、 ノーザンブロット分析及びRT-PCRによって調べた。実験結果を以下の項に要約 する。 7.2.1.組織化学による発現分析 最も早い時点を全体封入及び組織化学的染色によってpc7.5日のトランスジェ ニックマウスにおいて調べたところ、lacZリポーター遺伝子の発現が胚外中胚葉 を形成する細胞中に現れていた（図13Ａ）。これらの細胞は卵黄嚢を形成し、血 島の細胞を生じさせるものである。したがって、この遺伝子座におけるlacZリポ ーター遺伝子の発現は、内皮細胞系列の最も初期の公知のマーカーの１つである 。この発達の初期の段階において内皮細胞の前駆体中で発現することが示されて いる唯一のその他のマーカーは、受容体チロシンキナーゼflk-1である(Millauer ら，1993，Cell 72:835-846)。しかしながら、del-1発現は、flk-1等の内皮のそ の他の初期マーカーのように、尿膜中では見い出されなかった(Yamaguchiら，19 93，Development 118:489-498)。 8.5日では、卵黄嚢の血島中の細胞中でlacZ染色が観察された。興味深いこと に、血島内の凝集塊中に見出される円形細胞中以外の、血島をライニングする成 熟内皮細胞中では染色が検出されなかった（図13Ｂ）。これらの円形細胞は大き な核を有し、内皮細胞というよりはむしろ造血前駆体に見かけ上は似ている。こ の発現パターンは他の全ての初期の内皮マーカーとは異なっていた。したがって 、del-1遺伝子座は内皮及び造血系列の両方に対する前駆体である初期胚細胞中 で発現し得る。また、pc8.5日の後期原始線条段階の胚においては、発達中の対 の背部大動脈に関係した内皮細胞の染色もあった。かかる段階における形成中の 心臓の領域にある細胞中でlacZ染色が観察され、これらの細胞はおそらく心内膜 を形成する内皮細胞であった。9.5日（10〜14体節）までに、心内膜及び流出管 及び大動脈を形成する内皮細胞はlacZ染色を示した（図13Ｃ、13Ｄ）。この染色 は10.5日及び11.5日まで続いており、全体封入分析によると、全ての大きな血管 構造に関係する内皮細胞がリポーター遺伝子を発現していた。 発達の13.5日における胚のlacZ染色を、全体封入及びパラフィン包埋胚から作 製した切片において評価した。この時期までに、大動脈等の大きな血管中の内皮 細胞はほんのつぎはぎだらけではあるが染色していたが、小さい血管はほと んど染色していなかった（図13Ｅ）。この段階で目立ったlacZ染色を示す唯一の 血管は肺毛細血管であった。発達中の肺血管網は激しく染色し、肺全体を著しく 青緑色に見えさせている（図13Ｅ）。染色された細胞の同定を染色した切片の顕 微鏡検査によって行った（図13Ｆ）。また、ノマルスキー微分干渉コントラスト 光学系を用いて薄片を観察することによって、血管チャネルを形成するＸ-gal染 色細胞の視覚化も可能であった。肝臓、脳、及び腎臓に関係する器官血管系は染 色を示さなかった。心臓においては、房の内皮細胞の染色が少し残留していた。 室をライニングする内皮細胞の大部分はもはや染色されなかった。室における印 象的な発見は乳頭筋及び僧帽弁を形成する細胞が著しい染色を示すということで あった。この標識は表面の内皮細胞中のみならず、これらの構造を形成する細胞 中でも観察された。同様の様式で、大動脈及び肺動脈の形成中の弁の領域にある 細胞はlacZ活性を示した。再び、形成中の弁及び管の壁における細胞を染色した （図13Ｇ及び13Ｈ）。活動的に骨を形成している領域の細胞において、唯一の非 心血管染色が観察された。特に、肋骨、脊椎、及び肢帯の基部において染色が最 も目立っていた（図13Ｅ）。13.5日後、lacZ遺伝子を発現している唯一の細胞は 肺動脈内皮細胞であった。発達の約15.5日後、リポータートランスジーンの発現 は減少し、出産のときまでに完全に陰性になった。 前述の観察は、del-1遺伝子座中の転写単位によってコードされるタンパク質 が、心血管系における初期の発達プロセスに関与しているということを示すもの である。この遺伝子は時間的に調節される様式で内皮細胞の限られたグループで 発現するので、唯一の系列マーカーではない。後期段階で見られる限られた発現 は、これらの内皮細胞の起源、血管形成のメカニズム又はこれらの細胞の情況か ら誘導される(context-derived)表現型との関係を示すものである。原始性心内 膜の細胞はかかるマーカーを発現する。このことは心臓発生における役割を示す ものである。最も印象的なことは、心臓の発達中の弁状器官における発現のパタ ーンである。形成中の隔壁及び弁におけるコンピテント内皮細胞では上皮−間葉 変換(epithelial-mesenchymal transformation)が行われることが示された。こ の変換は、少なくとも一部は、トランスフォーミング成長因子β３（これは、心 筋から放出される）等の誘導シグナルによることは明白である(Pottsら， 1991，Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．88:1516-1520; Sinningら，1992，Anat ．Rec．232:285-292)。SLM275マウスにおけるリポーター遺伝子発現はこのシグ ナルに応答するであろう心内膜のコンピテント細胞をマーキングした。この発現 は変換後しばらくの間持続することは明白である（図13Ｇ及び13Ｈ）。この遺伝 子発現のパターンは、公知の分子について記載されたパターンのどれとも似てい ない。初期内皮発現パターンはチロシンキナーゼtek及びflk-1に対して特徴付け たパターンと似ている(Dumontら，1992，Oncogene 7:1471-1480; Millauerら，1 993，Cell 72:835-846)が、トランスジェニックマウスにおけるlacZ発現が新規 遺伝子をマーキングすることを明確に示す後期段階では著しい相違がある。 7.2.2.ノーザンブロットによる発現分析 種々の胎児及び成体組織におけるdel-1の発現をノーザンブロット分析によっ て調べた（表１及び２）。マウスｃＤＮＡクローンの一部(0.3kb Sac Ｉプロー ブ)をClontech社から購入した６ポリＡ ＲＮＡフィルター上でプローブとして 用いた。脈管形成が行われているヒト胎児組織は陽性であった（表２）。15.5日 マウス胚由来のＲＮＡを用いて作製した器官ブロットは、腎臓、胚、神経系及び 頭等の非常に脈管の多い器官における発現を示した。また、マウス胚全体におけ る発現の経時進行は、トランスジェニックマウスにおいて観察されたβ-gal染色 結果と一致していた（表３）。一般に、成体マウス組織は陰性であるか、ほんの わずかの陽性を示すのみであった（表４）。脳ｃＤＮＡライブラリーから単離し たマウスｃＤＮＡクローンは胚del-1と同一であるように見えた。試験された２ つのヒト癌細胞系は、わずかに陽性であった（表５）。ノーザンブロット分析の 結果は、内皮細胞の発達中に特に活性である遺伝子のパターンと基本的に一致し ていた。 ７．２．３．ＲＴ−ＰＣＲによる発現分析 マウス卵黄嚢（８〜１２日齢）およびマウス胎児肝（１３〜１８日齢）に由来 するＲＮＡのｄｅｌ−１発現を、ＲＴ−ＰＣＲによって試験した。試験したサン プルはすべて陽性であり、これはトランスジェニックマウスにおけるノーザンブ ロット分析およびβ-ｇａｌ染色の結果（表６）と一致していた。マウス卵黄嚢 に由来するいくつかの細胞系は、ｄｅｌ−１の発現についてもＲＴ−ＰＣＲで試 験した。比較のため、他のいくつかの細胞系および全ｄ１５マウス胎児肝ＲＮＡ サンプルを試験した。表７に示したサンプルのうちＥＶＣ３０４（ヒト内皮細胞 系）を除いたものはすべてマウス起源である。長時間培養で成長させた卵黄嚢由 来の細胞系は検出可能なレベルのｄｅｌ−１を発現していなかった。これらの細 胞培養では、これらの条件下で内皮細胞様の構造が形成されていなかった。対照 的に、内皮腫瘍系ＥＯＭＡは高レベルのｄｅｌ−１を発現した。 ヌードマウスに移植した、またin vitroで培養したたくさんのヒト腫瘍がｄｅ ｌ−１を発現することがＲＴ−ＰＣＲによって示された。たとえば、表８は、ヒ ト骨肉腫細胞系１４３Ｂにおけるin vivoとin vitroでのｄｅｌ−１の発現を示 している。ＥＯＭＡは陽性のコントロールとして使用した。ＣＤ３４、ｆｌｋ− １およびｔｉｅ−２は内皮細胞に対する公知のマーカーである。ヒトおよびマウ スのｄｅｌ−１特異的ＰＣＲプライマーを使用すると、ヒト（腫瘍）とマウス（ 宿主）の両方でｄｅｌ−１発現が検出された。また、さまざまなヒト腫瘍細胞系 が培養においてｄｅｌ−１を発現した（表９）。これらの結果は、Ｄｅｌ−１は 診断および治療上ある種の癌で腫瘍マーカーとして使用できるということを示し ている。さらに、ｄｅｌ−１の宿主発現はまた、多分腫瘍部位における血管 新生のために、アップレギュレーションもされる。 ８．実施例：ＤＥＬ−１遺伝子産物の免疫反応性 ８．１．材料と方法 ８．１．１．抗体産生 マウス遺伝子のアミノ酸３５３〜４８９をコードする部分ｄｅｌ−１ ｃＤＮ ＡをｐＭＡＬＣ２(New England Biolabs)にクローニングしてマルトース結合性 タンパク質-部分Ｄｅｌ−１融合タンパク質を生成した。この構築物に含まれて いるｄｅｌ−１配列はカルボキシル末端ジスコイディン(discoidin)様ドメイン の一部をコードしている。組換え融合タンパク質を発現させ、製造業者の推奨に 従ってアミロースアフィニティーマトリックスで精製した。タンパク質をフロ イント完全アジュバントに乳化させ、二匹のNew Zealand Whiteウサギに多重皮 下注射として注射した。ブースターおよび免疫血清の収集は確立されている方法 に従って行なった(HarlowとLane，1988，Antibody: A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory)。第二のブーストの後に得られた免疫血清をアフィ ニティー精製にかけた。まず第一に抗血清を、全細菌溶解物に結合したSepharos eカラムで予備的に清浄化した。次いでこの抗血清を、Sepharoseに結合した組換 え融合タンパク質から作成したアフィニティーカラムで精製した。この抗血清の 特異性を評価するためにまず第Ｘａ因子による開裂の前もしくは後に組換え融合 タンパク質を発現する細菌に由来するタンパク質を含有するウェスタンブロット にかけた。ＩＰＴＧで誘発した細胞に由来する全細菌溶解物をポリアクリルアミ ドゲルにかけ、ニトロセルロースに移し、アフィニティー精製した抗血清で探査 した。粗抗血清は融合タンパク質のマルトース結合性タンパク質およびＤｅｌ− １部分に対応するバンドを標識したが、アフィニティー精製した抗血清は融合タ ンパク質のＤｅｌ−１成分を特異的に標識した。 ８．１．２．ウェスタンブロット 真核生物タンパク質のウェスタンブロットでは、標準的な溶解緩衝液またはLa emmli負荷(loading)緩衝液中に溶解させることによって細胞を収集した。細胞培 養上清を集め、centriconフィルターで遠心濃縮し、ＰＢＳ中の１ｍＭ ＥＤＴ Ａで細胞を除いた後に少容量のLaemmli緩衝液を用いて９０℃で細胞培養皿をこ することによって細胞外マトリックスを収集した。 ８．１．３．免疫組織化学 充分に確立された方法(Hogan et al.，1994，Manipulating the Mouse Embryo ．Cold Spring Harbor Press; Quertermous et al.，1994，Proc．Natl．Acad． Sci．USA 91:7066)に従って、Bouinの固定されパラフィン包埋されたstagedマウ ス胚から調製した切片について免疫組織化学を行なった。アフィニティー精製し たＤｅｌ−１抗血清を１：５００〜１：１０００の希釈で用い、染色の特異性は 組換えタンパク質との競合によって確認した。軟骨の染色は、あら かじめ切片を薄いトリプシン溶液で処理することによって増幅した。 ８．１．４．卵黄嚢細胞のトランスフェクション 主要なｄｅｌ−１転写物のオープンリーディングフレーム全体をphbAPr-3-neo (Gunning et al.，1987，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 84:4831)にクローニング することによって真核生物発現ベクターを構築した。この構築物を、Lipofectam ine(Gibco BRL)を用いて卵黄嚢細胞にトランスフェクトし、１０００μｇ／ｍｌ のＧ４１８の存在下でクローンを選択した。ノーザンブロッティングとウェスタ ンブロッティングによりクローンのｄｅｌ−１発現を評価し、さまざまな量のＤ ｅｌ−１タンパク質を有する一群のクローンをさらに研究するために選択した。 陰性対照として使用するため、空のphbAPr-3-neoベクターを用いてトランスフェ クションしたものから一群のクローンをランダムに選択した。 ８．２．結果 主要なマウスｄｅｌ−１コード配列を真核生物発現ベクターに挿入し、Ｄｅｌ −１非発現卵黄嚢細胞(Wei et al.，1995，Stem Cell 13:541)にトランスフェク トした。空の発現ベクターまたはｄｅｌ−１構築物を有するプールしたトランス フェクタントをＧ４１８で選択した。トランスフェクトした細胞から溶解物、細 胞培養上清および細胞外マトリックスを調製し、アフィニティー精製したウサギ 抗血清とウェスタンブロットで反応させた。細菌で発現させた組換えＤｅｌ−１ 融合タンパク質に対するポリクローナル抗血清を生成させた。図１４Ａに示され ているように、溶解物もしくは標準Laemmliゲル負荷緩衝液中、または細胞外マ トリックス中の細胞を収集することによって調製した細胞溶解物に分子量５２， ０００ダルトンのバンドが認められた。このバンドは、推定されたアミノ酸配列 に基づいて予期されたＤｅｌ−１に対する分子量と一致しており、全長Ｄｅｌ− １タンパク質を示していた。対照的に、トランスフェクタントから収集した培養 上清では、１００倍に濃縮してもタンパク質は同定されなかった。また、それよ り小さいタンパク質分解断片も検出されなかった。これらの結果は、Ｄｅｌ−１ が内皮細胞の表面を通って分泌され、細胞外マトリックスに堆積されることを示 している。 ｄｅｌ−１遺伝子を有する安定にトランスフェクトされた卵黄嚢細胞クローン をいくつか選択した（図１４Ｂ）。これらのトランスフェクトされた細胞を前述 の抗体と反応させると、いくつかの卵黄嚢細胞の膜と細胞外マトリックスの両方 が、陰性対照の疑似トランスフェクトされた卵黄嚢細胞と同様に染色された（図 １５Ａ、１５Ｂ）。この染色パターンを考慮して、１３．５日のマウス胚の骨を 発生させる免疫染色によって、骨内部のlaquanaeでＤｅｌ−１タンパク質が検出 された。これらは細胞外マトリックスタンパク質から構成されていた（図１６） 。 腫瘍細胞におけるｄｅｌ−１の発現を免疫組織化学で試験するために、ヒトグ リオーム細胞をヌードマウスに移植した。腫瘍を単離し、切開し、前述の抗体で 染色した後、西洋ワサビペルオキシダーゼと結合させSigma Fast Redsubstitute で展開した(developed)抗ウサギ抗体を用いて染色した。図１７Ａに、in vivo腫 瘍細胞がこの抗体により偏在化されて染色されたことを示す。腫瘍細胞における ｄｅｌ−１発現の偏在化は、遺伝子産物と隣接細胞上の細胞受容体との相互作用 の結果であると思われる。さらに、ヒト腫瘍を横断するマウス由来の血管もまた この抗体によって染色された（図１７Ｂ）。 ９．実施例：ＤＥＬ−１は血管形成を阻害する ９．１．材料と方法 ９．１．１．血管新生アッセイ “MATRIGEL”(Biocoat，Becton Dickinson)によるin vitro血管新生アッセイ を、５０μｌの“MATRIGEL”で被覆した２４ウェルプレートで実施した。ｄｅｌ −１トランスフェクタントとコントロールのトランスフェクタントを、５×１０ ４細胞／ウェル（低密度）または２×１０５細胞／ウェル（高密度）の密度で植 え付け、７日間観察した。 ｄｅｌ−１条件マトリックスに対する野生型卵黄嚢細胞の形態形成上の可能性 を評価するアッセイでは、６ｃｍの皿で７日間１０６のｄｅｌ−１トランスフェ クタントを増殖させることによってマトリックスを生成した。コントロール のマトリックスは、同じ条件下でコントロールのトランスフェクタントを増殖さ せて作成した。トランスフェクトされた細胞を０．５ＭのＥＤＴＡ処理および充 分な洗浄により除き、１０６の野生型卵黄嚢細胞を、ｄｅｌ−１またはコントロ ールのトランスフェクタントによって産生したマトリックスに植え付けた。細胞 を培養し、７日間にわたって観察した。 in vitro血管形成発芽(sprouting)アッセイでは、ｄｅｌ−１およびコントロ ールのトランスフェクタントをトリプシン処理し、１０６個の細胞を１５ｍｌの コニカルチューブで４８時間培養した。細胞培養物を次に細菌用ペトリ皿に移し 、４〜７日間培養した。この条件下で細胞凝集物が形成された。ｄｅｌ−１およ びコントロールのトランスフェクタントに関していくつかの凝集物を集め、これ らを“Matrigel”で被覆した２４穴のプレートに移した。２４時間および４８時 間で発芽する血管新生を評価した。 ９．２．結果 卵黄嚢細胞系ＹＳ−Ｂは胚内皮細胞の特徴をもっており、ｄｅｌ−１を発現せ ず、クローン性であり、かつ培養で長期にわたり生き続けるので（図１８Ａ）、 これをｄｅｌ−１トランスフェクション用の親細胞として選択した。最も大事な ことは、これらの細胞が早期卵黄嚢の血管形成のモデルを提供することである。 これらの細胞は容易に増殖し頻繁な継代で維持されたが、高密度になるまで集積 させたところ自発的に血管構造を形成した。この過程は細胞を基底膜様物質“MA TRIGEL”上に置くと促進された。この物質上ではこれらの細胞は各種タイプの培 養内皮細胞と類似の挙動を示した（図１８Ｂ）。ｄｅｌ−１の主要形態をコード するｃＤＮＡでトランスフェクトした細胞系を、トランスフェクトした構築物の いろいろな発現レベルについて選択した（図１４Ｂ）。陰性対照として使用する ために、空の発現プラスミドでトランスフェクトした細胞系を選択した。 ｄｅｌ−１をトランスフェクトした卵黄嚢クローンとｍｏｃｋをトランスフェ クトした卵黄嚢クローンとを、“MATRIGEL”上で分枝性の血管様構造を形成する 能力に関して比較した。“MATRIGEL”上で２４時間後陰性対照のトランスフェク タントはこれらの細胞にとって典型的な入り組んだネットワークを確立した （図１８Ｃ）。高レベルのｄｅｌ−１を発現する細胞（Ｌ１０）は非常に異なっ たパターンを示し、多数の充分に離れたクラスターとなった（図１８Ｄ）。この 形態形成の中止はｄｅｌ−１発現のレベルと直接関連していた。すなわち、ｄｅ ｌ−１の低発現クローンＬ１３とＬ１４はある程度の分枝性形態を示したからで ある。 Ｄｅｌ−１タンパク質は細胞外マトリックスに付着するので、ｄｅｌ−１を発 現するひとつのクローンＬ１０を使用してＤｅｌ−１タンパク質を含有する細胞 培養マトリックスを生成した。陰性対照クローンから生成したマトリックスはＤ ｅｌ−１がないという点でのみ異なっているはずである。トランスフェクトした 系と対照の系とを７日間培養した後１ｍＭのＥＤＴＡで充分に洗浄することによ って穏やかに培養皿から取り出した。目視観察によるとこの技術で取り出せなか ったのはまれな細胞だけであった。次に、トランスフェクトしてない天然の卵黄 嚢細胞をＤｅｌ−１含有マトリックスと対照マトリックス上に載せ、ネットワー クを形成する能力を評価した。卵黄嚢細胞は形態形成する高密度になるのに数日 が必要であり、そのネットワークは外観がレース状であった。陰性対照のトラン スフェクタントから生成したマトリックス上で増殖させた細胞はネットワークを 生成する能力があった（図１８Ｅ）。対照的に、Ｄｅｌ−１を含有するマトリッ クス上で増殖させた卵黄嚢細胞は形態形成の徴候を示さず、その代わりに稠密な 単層を形成した（図１８Ｆ）。 次に、トランスフェクトした卵黄嚢系について、in vitro血管新生発芽アッセ イを使用した。このアッセイは血管新生能を評価するのに使われている(Pepper et al.，1991，J．Cell．Physiol．146:170)。トランスフェクトした細胞をコニ カルチューブ中に一晩放置して凝集させた後細胞塊を“MATRIGEL”上に載せた。 ｄｅｌ−１を発現する細胞が“MATRIGEL”上に移行し分枝構造を形成する能力を 対照の細胞と比較した。対照細胞は２４時間以内に一連の分枝する突起を形成し たが、ｄｅｌ−１を発現する細胞は細胞凝集物にほぼ限定されたままであった（ 図１８Ｇおよび１８Ｈ）。４８時間後にはｄｅｌ−１発現細胞の拡大する徴候が 多少見られたが発芽する構造というよりはシート状であった。 このように、Ｄｅｌ−１は血管の形態形成を阻害し、内皮細胞の分化を調節 するのに使用できる。 １０．実施例：ＤＥＬ−１はインテグリンαＶβ３に結合する １０．１．材料と方法 １０．１．１．組換えＤＥＬ−１の精製とリフォールディング 組換えマウスＤｅｌ−１タンパク質（主要形態）は、大腸菌(E．coli)発現系 とタンパク質リフォールディング（再生）技術を用いて調製した。ｄｅｌ−１を 含有するpET28aベクター(Novagen Inc.)を有するE．coli細胞を、製造業者が推 奨するプロトコルに従って増殖させ誘発した。１Ｌの細菌培養物から約５０〜１ ００ｍｇの粗製組換えＤｅｌ−１が不溶性の細胞質封入体の形態で常に生成した 。E．coli細胞の超音波処理、遠心分離およびペレット画分の回収によって封入 体を単離した。次いで、５００ｍｌの培養物から得た封入体を２Ｍ尿素、０．０ ２５ＭのTris−Ｃｌ（ｐＨ８．０）、０．０２５％のTriton X100を含む５０ｍ ｌで三回洗浄した。この手順により、＞８０％の純度の粗製不溶性Ｄｅｌ−１生 成物が得られた。 ５００ｍｌの培養物から得たペレットを８Ｍ尿素、１００ｍＭのＤＴＴ、０． １ＭのTris-Ｃｌ（ｐＨ８．０）、０．０５％のTriton X100を含む２．５ｍｌに 懸濁させた後室温で１時間インキュベーションすることによって組換えＤｅｌ− １を溶解させた。残っている不溶性の物質を遠心分離によって除去し、可溶性の 上清画分を８Ｍ尿素、１００ｍＭのTris−Ｃｌ（ｐＨ８．０）、０．０５％のTr iton X100を含む２５ｍｌで１０倍に希釈した。その後Bradfordタンパク質決定 アッセイによってタンパク質濃度を測定した。 可溶性の還元Ｄｅｌ−１を、リフォールディング緩衝液（１００ｍＭのTris− Ｃｌ（ｐＨ８．０）、１００ｍＭの（ＮＨ４）２ ＳＯ４、２ｍＭの還元グルタ チオン、０．５ｍＭの酸化グルタチオン、０．０５％のナトリウムアジド、０． ０２５ｍｇ／ｍｌのＰＭＳＦ）に最終濃度０．０１ｍｇ／ｍｌまで希釈すること によってリフォールディングした。リフォールディングは、この反応混合物を４ ℃で１週間インキュベートすることによって実施した。次いで、リフォールディ ングされたＤｅｌ−１を、Amicon螺旋濃縮器を用いて濃縮し、残っている可 溶性物質を収集した。 pET28a発現ベクターから生成した組換えＤｅｌ−１生成物はＮ末端とＣ末端の 両方にポリヒスチジンが付いた融合タンパク質である。Novagen Hisタグ樹脂精 製システムを供給業者が推奨するプロトコルに従って用いて、この生成物を精製 した。 リフォールディングされたマウス組換えＤｅｌ−１は可溶性で、１００ｍＭの （ＮＨ４）２ ＳＯ４を含むTris−Ｃｌ緩衝液中に１００ｍｇ／ｍｌまでの濃度 で４℃で貯蔵したときに安定であった。 １０．１．２．細胞接着アッセイ ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）(Clonetics Inc.，San Diego，CA)を、供 給業者の指示に従って、１０ｎｇ／ｍｌのヒト組換え上皮増殖因子、１μｇ／ｍ ｌのヒドロコルチゾン、５０μｇ／ｍｌのゲンタマイシン、１２μｇ／ｍｌのウ シ脳抽出物および２％のＦＢＳを補充した内皮増殖培地で増殖させた。細胞は結 合アッセイに使用する前に３７℃／５％ＣＯ２でコンフルエントの７０％になる まで増殖させた。組織培養処理してない９６ウェルプレートを、４℃で２４時間 かけて、カルシウムとマグネシウムを含まないＰＢＳで希釈した適当なレベルの 標的タンパク質（１〜２０μｇのマウス組換えＤｅｌ−１、ビトロネクチン、ま たはＢＳＡ）で被覆した。プレートをＰＢＳで洗浄し、３％のＢＳＡを含有する 熱処理（９５℃、５分間）したＰＢＳの溶液で３０分かけてブロックした。トリ プシン処理によってＨＵＶＥＣ細胞を収集し、接着緩衝液（１０ｍＭのＨＥＰＥ Ｓ、２．２ｍＭのＭｇＣｌ２、２ｍＭのＣａＣｌ２、０．２ｍＭのＭｎＣｌ２お よび１％のＢＳＡを含有するHanks平衡化塩溶液、ｐＨ７．４）に再懸濁させた 。指示されたアンタゴニストまたは対照を種々の濃度で存在させるかまたは存在 させないで、細胞（１０４／１００μｌ）を各ウェルに加えた。アンタゴニスト としては、抗ヒトαＶβ３（クローンＬＭ６０９、Chemicon Inc.）、ＲＧＥペ プチド（不活性対照ＧＲＧＥＳＰ）またはＲＧＤ（安定なアンタゴニストGPenGR GDSPCAまたはGRGDdSP、すべてGibco）が包含される。細胞を３７℃／５％ＣＯ２ で６０〜９０分間インキュベートし、ウェルをＢＳＡ対照中に残存 する細胞がなくなるまで洗浄した。残っている細胞を計数するために各ウェルに １００μｌの内皮培地を加えた。細胞数は、製造強者が指示している通りPromeg a CellタイターＡＱによって行なった。 １０．２．結果 組換えＤｅｌ−１タンパク質およびｄｅｌ−１トランスフェクタントはＨＵＶ ＥＣに結合した。Ｄｅｌ−１に対するＨＵＶＥＣ上の細胞受容体を同定するため に、種々のペプチドおよび抗体を用いて細胞接着アッセイにおけるＤｅｌ−１と ＨＵＶＥＣとの相互作用を阻害した。図１９は、抗αＶβ３抗体がＨＵＶＥＣに 結合する組換えＤｅｌ−１を特異的に阻害したことを示している。対照的に、抗 αＶβ５は阻害しないし、対照Ｉｇも阻害しない。さらに、ＲＧＤペプチドもＨ ＵＶＥＣに結合するＤｅｌ−１を阻害することが示された（図２０）。ｄｅｌ− １でトランスフェクトした細胞から得られた細胞外マトリックスを使用して同様 な結果が得られた。したがって、Ｄｅｌ−１は、おそらくその二番目のＥＧＦ様 ドメイン中のＲＧＤを介して、ＨＵＶＥＣにより発現されたαＶβ３に結合する 。 αＶβ３は、ある種の細胞タイプによって発現されるインテグリンであり、ｂ ＦＧＦが誘発する血管新生内皮細胞と関連している。このインテグリンに結合す る剤は血管新生内皮細胞のアポトーシスを誘発する。Ｄｅｌ−１はこのインテグ リンに結合するので、腫瘍部位における血管新生の間にアポトーシスを誘発して 腫瘍の増殖を低減するのに使用することができる。 １１．実施例：ヒトＤＥＬ−１の染色体上の位置決定 Ｐ１クローン１００４３のＤＮＡをニックトランスレーションによってジゴキ シゲニン(digoxigenin)ｄＵＴＰで標識した。この標識したプローブを剪断した ヒトＤＮＡと合わせ、５０％のホルムアミド、１０％の硫酸デキストランおよび ２ＸのＳＳＣを含有する溶液中で、ＰＨＡで刺激した抹消血リンパ球由来の正常 中期染色体にハイブリダイズさせた。ハイブリダイズしたスライドをフルオレセ イン化した抗ジゴキシゲニン抗体とインキュベートした後ＤＡＰＩで対比染色 することによって、特異的なハイブリダイゼーションシグナルを検出した。最初 の実験では、Ｂ群染色体の長腕の特異的標識が得られた。 二番目の実験では、すでに５ｑ３４にマッピングされており、５ｐ１５に位置 することが知られているネコ鳴き遺伝子座由来のプローブと共にハイブリダイゼ ーションすることによって確認されているプローブを、クローン１００４３と共 にハイブリダイゼーションさせた。この実験の結果、第５染色体の中央と遠位の 長腕が特異的に標識された（図２１ＡおよびＢ）。特異的にハイブリダイズした １０の第５染色体の測定により、クローン１００４３は染色体腕５Ｑの動原体か らテロメアに向かって２９％の距離の位置、すなわちバンド５ｑ１４に相当する 領域に位置することが立証された。全部で８０の中期細胞を解析したところ７４ が特異的標識を示した。この染色体のこの領域はいくつかのヒト癌において切断 点であることが見出だされている(WielandとBohm，1994，Cancer Res．54:1772 、Fong et al.，1995，Cancer Res．55:220、Wieland et al.，1996，12:97，On cogene 12:97)。すなわち、第５染色体異常によってｄｅｌ−１の発現が変化し 得、悪性表現型になり得る。 １２．微生物の寄託 次の微生物は、米国メリーランド州２０８５２のロックビル(Rockville)、Par klawn Drive１２３０１のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(Amer ican Type Culture Collection)（ＡＴＣＣ）に寄託した。 株 名 受託番号 Ｈｕ ＤＥＬ−１．Ｚ１ ＡＴＣＣ ９７１５５ Ｈｕ ＤＥＬ−１．Ｚ２０ ＡＴＣＣ ９７１５４ ｍｕｓ ＤＥＬ−１．１ ＡＴＣＣ ９７１９６ ｍｕｓ ＤＥＬ−１．１８ ＡＴＣＣ ９７１９７ 本発明の範囲は、本発明の簡単な局面の例証として挙げた例示の具体例または 寄託した微生物に限られることはなく、機能的に等価なクローン、ＤＮＡまたは アミノ酸配列のすべてが本発明の範囲内に入る。実際、本明細書に記載したもの に加えて本発明の各種の修正が以上の説明と添付の図面から当業者には明らか になろう。そのような修正は請求の範囲の範囲内に入るものとする。また、ヌク レオチドに対して与えた塩基対の大きさは適宜であり、説明の便宜のために使用 するものと理解されたい。 本明細書で引用した刊行物はすべて引用したことによってその全体が本明細書 に含まれているものとする。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｑ 1/02 1/68 Ａ 1/68 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/53 Ｄ 33/53 Ｃ１２Ｐ 21/08 // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 ホーガン，ブリジッド アメリカ合衆国 37027 テネシー州，ブ レントウッド，ロバート イー．リー レ ーン 1303 (72)発明者 スノッドグラス，エイチ．，ラルフ アメリカ合衆国 43065 オハイオ州，ポ ウェル，リトリート レーン 650 (72)発明者 ズパンシック トーマス，ジェイ. アメリカ合衆国 43085 オハイオ州，ウ ォーシントン，パーク ブルバード 501

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． ３つのＥＧＦ様ドメインと２つのジスコイディンＩ／第VIII因子様ドメ インを有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列からなる、単離されたヌ クレオチド核酸分子。 ２． ストリンジェントな条件下で配列番号１９のヌクレオチド配列を有する 核酸分子とハイブリダイズするヌクレオチド配列からなる、単離された核酸分子 。 ３． 配列番号１０のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレ オチド配列またはその相補体からなる、単離された核酸分子。 ４． 配列番号２９のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレ オチド配列またはその相補体からなる、単離された核酸分子。 ５． 配列番号２８のヌクレオチド配列またはその相補体からなる、単離され た核酸分子。 ６． 請求項２、３、４または５のヌクレオチド配列を含有する組換えＤＮＡ ベクター。 ７． Ｄｅｌ−１融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有する組 換えＤＮＡベクター。 ８． ｄｅｌ−１ヌクレオチド配列が、宿主細胞におけるｄｅｌ−１遺伝子の 発現を制御する調節配列と機能上有効に結合されている、請求項６の組換えＤＮ Ａベクター。 ９． ｄｅｌ−１融合タンパク質ヌクレオチド配列が、宿主細胞におけるｄｅ ｌ−１融合タンパク質遺伝子の発現を制御する調節配列と機能上有効に結合され ている、請求項７の組換えＤＮＡベクター。 １０． 請求項６、７、８または９の組換えＤＮＡ発現ベクターを含有する、 工学処理された宿主細胞。 １１． 請求項８の組換えＤＮＡ発現ベクターを含有しＤｅｌ−１を発現する 、工学処理された細胞系。 １２． 請求項９の組換えＤＮＡ発現ベクターを含有しＤｅｌ−１融合タンパ ク質を発現する、工学処理された細胞系。 １３． 細胞の表面にＤｅｌ−１を発現する、請求項１１または１２記載の工 学処理された細胞系。 １４． 可溶性のタンパク質またはその断片としてＤｅｌ−１を発現する、請 求項１１または１２記載の工学処理された細胞系。 １５． 換えＤｅｌ−１を製造する方法であって、 （ａ）Ｄｅｌ−１タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有する組換えＤ ＮＡ発現ベクターで形質転換された宿主細胞を培養し、 （ｂ）Ｄｅｌ−１タンパク質遺伝子産物を細胞培養物から回収する ことからなる方法。 １６． 換えＤｅｌ−１融合タンパク質を製造する方法であって、 （ａ）Ｄｅｌ−１融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有する組換 えＤＮＡ発現ベクターで形質転換された宿主細胞を培養し、 （ｂ）Ｄｅｌ−１融合タンパク質遺伝子産物を細胞培養物から回収する ことからなる方法。 １７． ３つのＥＧＦ様ドメインと２つのジスコイディンＩ／第VIII因子様ド メインを有する、単離された組換えＤｅｌ−１タンパク質。 １８． 異種タンパク質もしくはペプチド配列またはこれらの一部に結合した Ｄｅｌ−１からなる融合タンパク質。 １９． ｄｅｌ−１ヌクレオチド配列と相補的なアンチセンス配列をコードし ており、細胞中でｄｅｌ−１遺伝子の翻訳を阻害するオリゴヌクレオチド。 ２０． ｄｅｌ−１のアミノ末端領域をコードするヌクレオチド配列と相補的 である、請求項１９記載のオリゴヌクレオチド。 ２１． Ｄｅｌ−１のエピトープと免疫特異的に結合する抗体。 ２２． モノクローナル起源である、請求項２１記載の抗体。 ２３． 分子とＤｅｌ−１の結合を競合的に阻害する、請求項２２記載の抗体 。 ２４． 細胞障害剤と結合している、請求項２２記載の抗体。 ２５． 放射性同位体と結合している、請求項２２記載の抗体。 ２６． 固体支持体に結合されている、請求項２２記載の抗体。 ２７． ビオチンと結合している、請求項２２記載の抗体。 ２８． Ｄｅｌ−１のアンタゴニストをスクリーニングし同定する方法であっ て、 （ａ）Ｄｅｌ−１を発現する細胞系を試験化合物と接触させ、 （ｂ）その試験化合物がＤｅｌ−１の発現または機能を阻害するか否かを決定す る ことからなる方法。 ２９． 細胞系が遺伝子工学的に処理された細胞系である、請求項２８記載の 方法。 ３０． 細胞系が内因的にＤｅｌ−１を発現する、請求項２８記載の方法。 ３１． Ｄｅｌ−１活性の結合相手をスクリーニングし同定する方法であって 、 （ａ）Ｄｅｌ−１タンパク質をランダムなペプチドライブラリーと接触させて、 Ｄｅｌ−１がそのライブラリー中の１つ以上のペプチド種を認識し結合するよう にし、 （ｂ）Ｄｅｌ−１組み合わせ物を単離し、 （ｃ）ステップｂで単離したペプチドの配列を決定する ことからなる方法。 ３２． Ｄｅｌ−１タンパク質が遺伝子工学的に処理されている、請求項３１ 記載の方法。 ３３． 細胞混合物を抗Ｄｅｌ−１抗体と共にインキュベートし、抗体に結合 した細胞を単離することからなる、胚細胞を検出し単離する方法。