WO2005001093A1 - 細胞外基質沈着タンパク質 - Google Patents

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WO2005001093A1
WO2005001093A1 PCT/JP2004/009616 JP2004009616W WO2005001093A1 WO 2005001093 A1 WO2005001093 A1 WO 2005001093A1 JP 2004009616 W JP2004009616 W JP 2004009616W WO 2005001093 A1 WO2005001093 A1 WO 2005001093A1
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protein
seq
amino acid
extracellular matrix
acid sequence
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PCT/JP2004/009616
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Chiaki Hidai
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Nihon University
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    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • Y10S530/81—Carrier - bound or immobilized peptides or proteins and the preparation thereof, e.g. biological cell or cell fragment as carrier

Definitions

  • the present invention relates to extracellular matrix deposition proteins that are partial fragments of the endothelial cell locus-l (Del-l) protein. Further, the present invention relates to a method for identifying an extracellular matrix deposition site using the above partial fragment, and a method for recovering a target molecule (eg, alkaline phosphatase) fused to a Del-1 protein.
  • a target molecule eg, alkaline phosphatase
  • Del-l developmentally endothelial locus-1 protein
  • EGF epidermal growth factor
  • discoidin I-like domain Protein.
  • This protein is an extracellular matrix protein that binds to a protein called ⁇ / 33 integrin receptor or] 35 integrin receptor on the surface of vascular endothelial cells via an EGF-like domain, and binds to endothelial cells. It is known to promote adhesion to the outer matrix (Hidai, C. et al., GENES & DEVELOPMENT 12: 21-33, 1998).
  • full-length Del-1 In recent years, the gene encoding full-length Del-l has been cloned. It has been speculated that full-length Del-1 can bind to proteodalican in the extracellular matrix through part or all of it. Therefore, full-length Del-1 is expressed and a predetermined molecule (protein, proteodalican, etc.) is bound to full-length Del-1, and a molecule bound to full-length Del-1 (protein, proteodarican, etc.) is recovered. A known method is known (see, for example, Japanese Patent Publication No. 11-507527).
  • identifying these binding sites and analyzing the binding mode is important for recovery of the target molecule and for research and analysis of the molecule binding to full-length Del-1.
  • An object of the present invention is to provide a partial fragment of Del-1 containing a region that can efficiently adhere to an extracellular matrix.
  • the present inventors have conducted intensive studies to solve the above-mentioned problems, and as a result, have found that a region near the discoidin I-like domain is efficiently deposited on the extracellular matrix, and have completed the present invention.
  • Ob consists of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 18 or 24 in which one or several amino acids are deleted, substituted or added, and is extracellular Proteins with deposition activity on substrates
  • a method for producing a partial Del-l fragment comprising culturing the transformant according to (11) and collecting a partial fragment of the Del-l protein from the resulting culture.
  • a reagent for identifying an extracellular matrix deposition site comprising the protein according to any one of (1) to (3).
  • a fusion protein wherein the protein according to any one of (1) to (3) is linked to a target molecule for expression.
  • a gene encoding a fusion protein wherein the gene according to any one of (4) to (9) is linked to a gene encoding a target molecule for expression.
  • a method for producing the fusion protein comprising culturing the transformant according to (19), and collecting a fusion protein of a partial fragment of Del-1 protein and a target molecule for expression from the resulting culture.
  • (21) A method for recovering a target molecule, comprising depositing the fusion protein according to (15) on an extracellular matrix and collecting the target molecule.
  • the method comprising: (23) A method for recovering a target molecule, comprising the following steps:
  • the method comprising:
  • a Del-1 partial fragment is provided. Since the expressed protein of the Del-l partial fragment has an activity of depositing on the extracellular matrix, the use of the Del-l partial fragment allows the target molecule bound to the expressed protein of the Del-l partial fragment to be efficiently converted to the extracellular matrix. Can be deposited. Further, the target molecule can be recovered or removed by the deposition.
  • the target molecule By depositing the target molecule on the extracellular matrix using the Del-1 partial fragment, the target molecule can be concentrated and localized in the target tissue. In particular, the transfer of the target molecule to plasma can be prevented by preventing the molecule from flowing out to plasma.
  • the Del-1 partial fragment of the present invention also includes a fragment that expresses a protein having a function of suppressing deposition on an extracellular matrix. Therefore, by increasing or decreasing the deposition activity by combining a fragment having a deposition activity with a fragment that inhibits deposition on the extracellular matrix, Controlling recovery, removal, concentration, etc. of target molecules Brief description of drawings
  • FIG. 1 is a diagram showing the outline of the nucleotide sequence of the Del-1 partial fragment of the present invention and the results of measuring the deposition activity of each partial fragment by alkaline phosphatase activity.
  • FIG. 2 is a diagram showing the binding activity of the Del-1 partial fragment of the present invention to an extracellular matrix.
  • FIG. 3 is a diagram showing the AP / Lac ratio in plasma collected from each liver.
  • FIG. 4 is a diagram showing the AP / Lac ratio in liver tissue collected from each liver.
  • FIG. 5 is a diagram showing the results of staining of liver tissue collected from each liver with alkaline phosphatase.
  • FIG. 6 is a diagram showing a Western plot.
  • FIG. 7 is a diagram showing the results of the recovery of Ari-Liphospha. BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
  • the present invention relates to partial fragments of the full-length Del-1 protein including a region that specifically binds to the extracellular matrix, that is, a Del-1 deposition protein and a Del-1 deposition inhibitory protein (also simply referred to as “Del_l partial fragment”). It is about.
  • the Del-1 partial fragment of the present invention is produced by cutting full-length Del-1 to various lengths, and has a characteristic of having an activity of depositing on an extracellular matrix.
  • the Del-1 partial fragment of the present invention comprises at least an amino acid encoded by a region of the nucleotide sequence of 1270 to 1662 of the full-length Del-1 gene (SEQ ID NO: 1) (amino acid represented by SEQ ID NO: 2). Amino acid sequence at positions 218 to 348 of the sequence).
  • SEQ ID NO: 1 amino acid represented by SEQ ID NO: 2
  • Amino acid sequence at positions 218 to 348 of the sequence The nucleotide sequence of this region is shown in SEQ ID NO: 3, and the amino acid sequence encoded thereby is shown in SEQ ID NO: 4.
  • Del-1 partial fragment of the present invention containing the above-mentioned region has the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 5, 7, 9, 11, 13, 15 or 17, and according to these nucleotide sequences, The encoded amino acid sequences are shown in SEQ ID NOs: 6, 8, 10, 12, 14, 16, 16 or 18, respectively.
  • the partial fragment of Del-1 is derived from the amino acid sequence It is speculated that it can be combined with.
  • a detection method using an alkaline phosphatase is employed. That is, by expressing a protein in which alkaline phosphatase is fused to the N-terminus of the full-length Del-l protein by genetic recombination in cells, the alkaline phosphatase activity can be confirmed in the culture supernatant as well as the extracellular matrix. Can be.
  • a Western plot method can also be used for detection of the Del-1 partial fragment and the like.
  • a nucleotide sequence encoding an amino acid protein obtained by fusing the enzyme phospholipase with full-length Del-l or a partial fragment of Del-l is introduced into cos7 cells, and after culturing for a certain time, And extracellular matrix can be collected and detected by Western blot.
  • laminin and albumin can be used as the control unit.
  • the amount of the culture solution used may be increased and the protein may be concentrated.
  • a Del-l partial fragment of the present invention obtained by cleaving a known full-length Del-l by various methods is prepared, and the Del-l partial fragment is converted into an alkaline phosphatase.
  • Extracellular matrix deposition ability was examined by the above-mentioned detection method and Western blotting method used.
  • the deposition site of the Del-1 partial fragment on the extracellular matrix was identified, and the Del-1 partial fragment was fixed to a specific site in vivo.
  • the expression product of the target gene was recovered using the Del-1 partial fragment.
  • the Del-l partial fragment can be obtained by cutting the DNA encoding full-length Del-l into various lengths and expressing it. Cloning of the full-length Del-1 gene can be performed according to a known method (Hidai C. et al., GENES & DEVELOPMENT, 12: 21-33, 1998). In other words, exons can be obtained from a genome library by exon trapping and used to clone cDNA.
  • a fragment of a genomic clone is inserted into a splicing vector to cause splicing during transcription of mRNA.
  • the spliced mRNA is reverse transcribed and amplified, and exon sequencing is performed.
  • the obtained exon is used as a probe for picking up target DNA from a cDNA library or used for designing a gene-specific primer for 5'-RACE and 3'-RACE.
  • a commercially available kit for example, Marathon TM cDNA Amplification Kit> Clontech can be used to perform the RACE method.
  • the nucleotide sequence of the cDNA can be determined by any known technique, but usually the sequence is determined using an automatic nucleotide sequencer.
  • the nucleotide sequence of the full-length cDNA thus obtained is shown in SEQ ID NO: 1.
  • the amino acid sequence encoded by the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 is shown in SEQ ID NO: 2.
  • One of the truncated Del-1 partial fragments of the present invention comprises the amino acid sequence of positions 1 to 348 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • the partial fragment can be obtained by sequentially removing DNA having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 from the 3 'end using Exonuclease III and Mung bean nuclease.
  • the DNA at the 3 'end to be deleted is determined by the reaction time of Exonuclease III.
  • a commercially available enzyme for example, Exonuclease III: manufactured by Yukara Bio Inc.
  • a schematic diagram of the full-length Del-l (Del-l major), the truncated Del_l partial fragment of the present invention, and the amino acid sequence that affects the deposition activity of the partial fragment is shown in the upper left part of FIG.
  • CY is 218 to 348 (SEQ ID NO: 4)
  • 4-1 is 1 to 348 (SEQ ID NO: 6)
  • 4-14 is 1 to 368 (sequence) in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • Nos. 10) and 4-13 have amino acid sequences of regions 1 to 385 (SEQ ID NO: 12)
  • CB has regions 218 to 480 (SEQ ID NO: 14)
  • XY has regions of 123 to 348 (SEQ ID NO: 18).
  • DNAs encoding these Del-1 partial fragments are CY
  • SEQ ID NO: 1 From 1270 to 1662 (393 bp, SEQ ID NO: 3), for 4-1 to 619 to 1662 (1044 bp, SEQ ID NO: 5), for 4-14 to 619 to 1722 (1104 bp, SEQ ID NO: 9), 619 to 4-13: L773 (1155 bp, SEQ ID NO: 11), CB: 1270 to 2058 (789 bp, SEQ ID NO: 13), XY: 985 to 1662 (678 bp, 678 bp, It has the nucleotide sequence of the region of SEQ ID NO: 17).
  • human XY (SEQ ID NO: 24) corresponding to the mouse fragment XY (SEQ ID NO: 18) was also measured for full-length human Del-1.
  • DNA encoding human XY has the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 23.
  • 4-15 are amino acids 1-365 (SEQ ID NO: 8) of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, and DE is 218- It has the amino acid sequence of the region of No. 319 (SEQ ID NO: 16).
  • the DNAs encoding these amino acid sequences include the nucleotides 619 to 1713 (1095 bp, SEQ ID NO: 7) of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 for 4-15, and the DNAs of 1270 to 1575 (306 bp, SEQ ID NO: 15) for DE. It has the amino acid sequence of the region.
  • XC is 123 to 217 (SEQ ID NO: 20)
  • YB is 349 to 480 (SEQ ID NO: 22). Region.
  • the DNAs encoding these amino acid sequences have the nucleotide sequences of 985 to 1269 (285 bp, SEQ ID NO: 19) for XC and 1663 to 2058 (396 bp, SEQ ID NO: 21) for YB.
  • the partial fragment of the present invention contains at least CY represented by the amino acid sequence of positions 218 to 348 (SEQ ID NO: 4) of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • the partial fragment of the present invention includes a protein in which a plurality of amino acid sequences of at least 218 to 348 (SEQ ID NO: 4) of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 are linked. These regions are central regions that have deposition activity on the extracellular matrix.
  • the above-mentioned CY is encoded by the region of Nos. 1270 to 1662 of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NO: 3).
  • the amino acid sequence (XC) shown in SEQ ID NO: 20 improves the deposition activity on extracellular matrix, and is a positive regulatory region for the deposition activity.
  • the amino acid sequence (YB) shown in SEQ ID NO: 22 reduces the deposition activity on extracellular matrix. It is a negative regulatory region of the deposition activity.
  • “Positive regulatory region” means a region that does not produce deposition activity by itself but can induce deposition activity by including the central region CY.
  • Negative regulatory region means a region of a fragment in which the deposition activity is reduced and the soluble fraction is increased due to the presence or absence of the central region CY or the positive regulatory region XC due to the presence of all or a part thereof. I do.
  • Table 1 summarizes the regions of the Del-1 partial fragment (derived from mouse and human) of the present invention.
  • the region is indicated by base number for DNA and amino acid number for protein.
  • At least one, preferably one or several amino acids in the amino acid sequence of the Del-l partial fragment are used as long as the protein has an activity of depositing with an extracellular matrix. Mutations such as deletion, substitution, and addition may occur in amino acids.
  • the gene of the present invention includes a gene encoding a protein containing the amino acid sequence into which the mutation has been introduced, as long as the protein has an activity of depositing on an extracellular matrix.
  • At least one, preferably one or several amino acids in the amino acid sequence of the Del-l partial fragment are used as long as the protein has a function of suppressing deposition on the extracellular matrix. Mutations such as deletion, substitution, and addition may occur in the amino acids.
  • one or several, for example, 1 to 10, preferably 1 to 5 amino acids of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14 which is a CB region may be deleted, and the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14 L0, preferably 1 to 5 amino acids may be added to the amino acid sequence, or 1 or several amino acids of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14, for example 1 to 10 , Preferably 1 to 5 amino acids may be substituted for other amino acids. It is included in the gene of the present invention as long as it has an activity of suppressing the deposition of chromium.
  • the deletion, substitution, introduction of mutation such as addition, the mutagenesis kit utilizing site-directed mutagenesis, e.g.
  • a DNA consisting of a nucleotide sequence complementary to a DNA encoding the above-mentioned Del-I partial fragment (SEQ ID NOS: 5, 7, 9, 11, 11, 7 or 23) may be used under stringent conditions.
  • the gene of the present invention also includes a DNA that can be hybridized below and that encodes a protein having an activity to bind to an extracellular matrix.
  • the stringent conditions include, for example, a salt (sodium) concentration of 150 to 900 mM, a temperature of 55 to 75 ° C, preferably a salt (sodium) concentration of 150 to 200 mM, and a temperature of 60 to 70 °.
  • a salt (sodium) concentration of 150 to 900 mM a temperature of 55 to 75 ° C, preferably a salt (sodium) concentration of 150 to 200 mM, and a temperature of 60 to 70 °.
  • a DNA having a nucleotide sequence complementary to a DNA encoding the Del-I partial fragment (shown in SEQ ID NO: 13) and a DNA capable of hybridizing under stringent conditions are used.
  • the DNA of the present invention also includes a DNA encoding a protein having an activity of suppressing deposition on the extracellular matrix.
  • extracellular matrix ECM is an extracellular biological structure in animal tissue, and refers to an aggregate of biopolymers that are synthesized inside the cell and secreted and accumulated outside the cell. You.
  • the main components are collagen, elastin, proteodalican, glycosaminodalican, and glycoprotein.
  • the term “depositing activity” refers to an activity in which all or a part of Del-l binds to the extracellular matrix, for example, those having higher deposition activity than full-length Del-l, and those having higher deposition activity than full-length Del-l. Or less than full-length Del-l but with equivalent deposition activity.
  • the activity to suppress the deposition on extracellular matrix refers to the activity of reducing the deposition activity and increasing the soluble fraction regardless of the presence of the central region CY and the positive regulatory region XC due to the presence of the negative regulatory region. means.
  • the measurement of the deposition activity or the activity of suppressing the deposition on the extracellular matrix is performed, for example, as follows.
  • a DNA encoding a marker such as alkaline phosphatase is ligated to the DNA of the present invention, and the resulting DNA is transferred to predetermined cells (eg, cos7 cells, CHO cells, NIH3T3 cells, etc.). Insert and culture. After removing the culture supernatant and cells from the culture vessel, the alkaline phosphatase substrate is added to the extracellular matrix remaining in the culture vessel to develop color, and the deposition activity is measured. Since the marker (alkaline phosphatase) is also bound to the Del-l partial fragment, when the Del-l partial fragment is deposited on the extracellular matrix, the binding activity can be measured using the marker as an indicator. As well as identify the binding position.
  • predetermined cells eg, cos7 cells, CHO cells, NIH3T3 cells, etc.
  • the substrate when a soluble alkaline phosphatase substrate is used, the substrate develops a color (for example, develops a yellow color, etc.), so that the deposition activity can be easily measured by measuring the absorbance at a specific wavelength. it can.
  • the deposition site when a depositable alkaline phosphatase is used, the deposition site is colored (for example, purple), and thus the deposition site can be easily identified by microscopic observation or the like.
  • the enzyme is not limited to alkaline phosphatase, and other GFPs and mutants thereof, tags such as myc and His, GST proteins, isotopes, and biotinylated proteins can be used. It is also possible to perform the assay using reporter genes such as chloramphenicyltransferase (CAT) gene, luciferase gene, and / 3 galactosidase.
  • CAT chloramphenicyltransferase
  • a recombinant vector containing the DNA of the present invention can be obtained by ligating (inserting) the DNA of the present invention into an appropriate vector.
  • the vector for inserting the DNA of the present invention is not particularly limited as long as it can be replicated in a host, and examples thereof include plasmid DNA, phage DNA, and virus.
  • Examples of the plasmid DNA include a plasmid derived from Escherichia coli, a plasmid derived from Bacillus subtilis, and a plasmid derived from yeast, and the phage DNA includes ⁇ phage.
  • the vector of the present invention includes a promoter, the DNA of the present invention, cis elements such as enhancer, splicing signal, polyaddition signal, Selection markers, ribosome binding sequences (SD sequences), etc. can be linked.
  • the selection marker include a dihydrofolate reductase gene, an ampicillin resistance gene, a neomycin resistance gene and the like.
  • the transformant of the present invention can be obtained by introducing the recombinant vector of the present invention into a host so that the target gene can be expressed.
  • the host is not particularly limited as long as it can express the DNA of the present invention.
  • bacteria, yeast, animal cells, and insect cells well known in the field can be used.
  • experimental animals such as mice, livestock such as pigs, and plants such as rice and corn can be used.
  • the recombinant vector of the present invention is capable of autonomous replication in the bacterium and can contain a promoter, a ribosome binding sequence, the DNA of the present invention, and a transcription termination sequence.
  • Bacteria include Escherichia coh, Bacillus subtilis, and the like.
  • the promoter for example, trp promoter, lac promoter, PL promoter, PR promoter and the like are used.
  • the method for introducing the recombinant vector into bacteria is not particularly limited, and examples thereof include a method using calcium ions and an electroporation method.
  • yeast When yeast is used as a host, for example, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe and the like are used.
  • the promoter is not particularly limited as long as it can be expressed in yeast.
  • examples include gall promoter, gallO promoter, heat shock protein promoter, MF al promoter, PH05 promoter, PGK promoter, GAP promoter, ADH promoter and the like.
  • Methods for introducing the recombinant vector into yeast include, for example, elect-portation method, spheroplast method, lithium acetate method and the like.
  • monkey cells cos7 cells
  • Vero Chinese hamster ovary cells
  • mouse L cells mouse L cells
  • rat GH3 cells or human FL, HEK293 cells and the like
  • promoter include an SRa promoter, an SV40 promoter, an LTR promoter, a / 3-actin promoter, and the like.
  • Methods for introducing the recombinant vector into animal cells include, for example, the elect-portion method, the calcium phosphate method, and the lipofection method.
  • Sf9 cells When insect cells are used as a host, Sf9 cells, Sf21 cells, and the like are used.
  • a method for introducing the recombinant vector into insect cells for example, a calcium phosphate method, a ribofection method, an electoral poration method, or the like is used.
  • transgenic animals For gene transfer into animals and plants, there are a method using a viral vector and a lipofection method. It is also possible to produce transgenic animals by introducing genes into germ cells and ES cells.
  • the Del-1 partial fragment of the present invention can be obtained by culturing or breeding the transformant and collecting it from the culture or breeding product.
  • culture refers to any of a culture supernatant, a cultured cell, a cultured cell, or a cell or cell fragment.
  • Culture refers to any animal, plant body, tissue, secretion, excrement, or processed product thereof.
  • the method for culturing the transformant of the present invention is performed according to a usual method used for culturing a host.
  • a medium for culturing a transformant using a bacterium, a yeast, or the like as a host contains a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, and the like that can be utilized by the microorganism, and can efficiently perform culturing of the transformant. If so, either a natural medium or a synthetic medium may be used.
  • carbohydrates such as glucose, fructose, sucrose and starch, organic acids such as acetic acid and propionic acid, and alcohols such as ethanol and propanol are used.
  • ammonia, ammonium salts of inorganic or organic acids such as ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium acetate, ammonium phosphate, etc., eptone, meat extract, corn steep liquor and the like are used.
  • inorganic substance potassium phosphate monobasic, potassium phosphate dibasic, magnesium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, ferrous sulfate, manganese sulfate, copper sulfate, calcium carbonate and the like are used.
  • the cultivation is usually performed under aerobic conditions such as shaking cultivation or aeration and stirring cultivation, for example, at 37 ° C. for 12 to 24 hours. Adjustment of the pH is performed using an inorganic or organic acid, an alkaline solution or the like.
  • an inducer may be added to the medium as necessary.
  • IPTG isopropyl- ⁇ -D-thiogalactoside
  • a medium for culturing a transformant obtained using animal cells as a host commonly used RPMI-1640 medium, DMEM medium, or a medium obtained by adding fetal calf serum or the like to such a medium is used.
  • Culturing is usually, 5% C0 2 presence is performed 1-4 days at 37 ° C.
  • antibiotics such as kinamicin and benicillin may be added to the medium as needed.
  • the proteins are extracted by disrupting the cells or cells.
  • the culture solution may be used as it is, or the cells or cells may be removed by centrifugation or the like. Then, by using general biochemical methods used for protein isolation and purification, such as ammonium sulfate precipitation, gel chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography, etc., alone or in combination as appropriate.
  • the Del-II partial fragment of the present invention can be isolated and purified from the culture.
  • the leaves, flowers, fruits, roots, etc., as well as the soil and water used for cultivation can be used for general biochemical methods such as ammonium sulfate precipitation, gel chromatography, ion exchange chromatography.
  • the Del-l partial fragment of the present invention can be isolated and purified by using chromatography, affinity chromatography or the like alone or in an appropriate combination.
  • synthesis of a partial Del-1 fragment by in vitro translation can be employed.
  • two methods a method for converting RNA into type III and a method for converting DNA into type II (transcription Z translation)
  • type I DNA include those having a promoter and a liposome binding site upstream of the translation initiation site; DNA, and DNA incorporating a promoter required for transcription upstream of the translation initiation site.
  • an in vitro translation system a commercially available system such as an Expressway TM system (Invitrogen), a TNT system (registered trademark; Promega), or the like can be used.
  • the desired fragment can be isolated and purified by using the above biochemical methods alone or in an appropriate combination.
  • a cell line or animal or plant that expresses the Del-l partial fragment and the target molecule can express the target gene and express the target gene (eg, protein, antibody, peptide, natural or synthetic compound, or other cells). , Or soluble molecules).
  • the Del-1 partial fragment can also be used directly.
  • a fusion protein in which the target molecule and the Del-1 partial fragment are bound is prepared. That is, the DNA encoding the molecule and the DNA encoding the Del-1 partial fragment are ligated and ligated to an appropriate vector. This is introduced into a host cell and cultured to produce a fusion protein in which the target molecule is linked. Ligation to a vector, introduction into a cell, a method for culturing a transformed cell, and a method for rearing and cultivating a transformant are the same as those described in the above sections 2 and 3.
  • the Del-l partial fragment can be obtained by using an enzyme such as alkaline phosphatase or horseradish oxidase, or a reagent such as a fluorescent label containing fluorescein isothiocyanate (FITC), phycocyanin or rhodamine. Can be used for labeling.
  • an enzyme such as alkaline phosphatase or horseradish oxidase
  • a reagent such as a fluorescent label containing fluorescein isothiocyanate (FITC), phycocyanin or rhodamine.
  • FITC fluorescein isothiocyanate
  • rhodamine a fluorescent label containing fluorescein isothiocyanate
  • the Del-1 partial fragment of the present invention since the Del-1 partial fragment of the present invention has an activity of depositing on an extracellular matrix, it can be used for a binding assay, affinity chromatography, immunoprecipitation, Western blotting, and the like.
  • Identification of an expression target polypeptide that can bind to the Del-1 partial fragment can also be performed by screening a peptide library using the recombinant Del-1 partial fragment.
  • the labeled fusion protein is incubated with the random peptide library and the Del-l partial fragment is allowed to bind to the peptides in the library.
  • the library is then washed to remove unbound polypeptide.
  • Alkaline phosphatase or peroxidase substrate such as 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (BCIP), 3,3'-diaminobenzidine (DAB)
  • BCIP 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate
  • DAB 3,3'-diaminobenzidine
  • the transformant is an animal or plant
  • the fusion protein when expressed at a specific site, the Del-l partial fragment of the present invention is deposited on the extracellular matrix. It is concentrated. Therefore, the target molecule can be efficiently recovered and used by directly eating or biochemically extracting the agricultural and livestock products.
  • the Del-1 partial fragment of the present invention has a deposition activity on an extracellular matrix.
  • the Del-1 partial fragment of the present invention allows the site of deposition on the extracellular matrix to be visually observed.
  • the Del-1 partial fragment of the present invention can be used as a reagent for identifying the site of deposition on the extracellular matrix, and can be used together with a marker, a chromogenic substrate, an antibody against the marker 1, etc. It can be included in an identification kit.
  • a fusion protein comprising a target molecule and the Del-1 partial fragment of the present invention is expressed in a specific tissue
  • the target molecule is fixed at a predetermined site of the extracellular matrix and does not migrate to another site. As a result, it is concentrated at that site.
  • the nucleotide sequence encoding the Del-l partial fragment of the present invention can be used to express the target molecule in a specific tissue by combining with a promoter sequence specific to an appropriate cell, tissue or organ, It can be used as a vector for restriction and concentration.
  • staining with BCIP revealed that extracellular alkaline phosphatase activity was present in the extracellular matrix.
  • Del-l protein has much stronger extracellular matrix deposition ability than full-length Del-l protein, and serve to anchor other proteins such as alkaline phosphatase to the extracellular matrix. It means there is. 7. Modification of Artificial Artifacts with Bioactive Substances
  • the bioactive substance By culturing Escherichia coli and cells that produce a fusion protein of a certain bioactive substance and a partial fragment of Del-l on an artifact, the bioactive substance can be deposited on the artifact without impairing its biological function.
  • the results in Figure 2 show that the culture dish This indicates that it has been modified with an active substance called phosphasease. It can be applied to the modification of hemodialysis membranes and artificial materials for implantation.
  • the Del-1 partial fragment of the present invention can deposit the target molecule on the extracellular matrix by binding the target molecule.
  • the Del-l partial fragment of the present invention can artificially regulate the deposition activity by using a positive regulatory region and a negative regulatory region.
  • the degree of deposition activity can be changed by the presence or absence of the YB region or XC region shown in FIG. 1, or by appropriately changing the length of these regions (4-8, 4 in FIG. 1). -13, 4-1 and XY).
  • the fusion protein of the present invention can be used as a drug delivery system (drug delivery system: DDS).
  • a gene encoding a fusion protein of 4-1 containing a central region and a positive regulatory region and an enzyme that converts a precursor of an anticancer drug into an anticancer drug is introduced into a cancer tissue. Thereafter, when a large amount of the precursor of the anticancer drug is administered, a high drug concentration can be obtained in the cancer tissue with respect to the healthy tissue.
  • a CB (SEQ ID NO: 13 or 14) gene containing a negative regulatory region after treatment the previously introduced gene product is released into the blood and can be removed by hemodialysis etc. .
  • Example ⁇ following more detailed description of the present invention through examples. However, the present invention is not limited to these embodiments.
  • the base sequence of the primer is as follows.
  • Reaction liquid composition (50 in 1):
  • Del-1 partial fragment CB, CY, YB, XY, XC, human ⁇ , ⁇ only
  • Del'l partial fragment FB (not shown in FIG. 1) Nos. 1576-2058), 4-15 (SEQ ID NO: 8) and CE (SEQ ID NO: 16) were prepared.
  • Example 1 (1) Among the partial fragments prepared in Example 1, 4-8, 4- 13, 4- 14, 4- 1, 4 ⁇ 11, 2-6, Del-1 minor, 1-1, 2.3 were ligated to plasmid pAPtag-5 (Funakoshi) and introduced into cos7 cells. Three days after the introduction, the culture supernatant, cells and extracellular matrix were collected. First, after collecting the supernatant, the cells are detached from the bottom of the culture dish and incubated by adding PBS containing 0.05% EDTA and incubating, and the extracellular matrix is left at the bottom of the culture dish. Thus, the alkaline phosphatase activity contained in each was detected.
  • plasmid pAPtag-5 Frakoshi
  • alkaline phosphatase was expressed in the same manner as above by expressing CB (No. 1270-2058 of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1), CY, YB, XY, XC, human XY and AP only. Activity was measured.
  • XY and human XY showed higher alkaline phosphatase activity than wild-type full-length Del-1, and CB and CY did not have higher alkaline phosphatase activity than wild-type full-length Del-1, but had some alkalinity. Phosphatase activity was observed. In contrast, XC and YB did not show any activity of phospholipase.
  • the active center region was CY shown in SEQ ID NO: 3 (regions 1270 to 1662 of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1), and that the amino acid sequence of amino acids 218 to 348 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 was considered an area.
  • XY in which XC is linked to CY has about 10 times the deposition activity as compared to the active center region CY alone.
  • XC alone has almost no deposition activity. Therefore, XC was considered to be a positive regulatory region of extracellular matrix deposition activity, which enhances extracellular matrix deposition activity.
  • CB in which YB is linked to CY has a deposition activity reduced by about 0.5 times as compared with the active center region CY alone. Therefore, YB was considered to be a negative regulatory region for the deposition activity on extracellular matrix, which reduces the deposition activity on extracellular matrix.
  • Del-l minor the nucleotide sequence Nos. 619 to 1271 of SEQ ID NO: 1 or 4-1 was replaced with plasmid pAPtag-5 (Funakoshi) And introduced into cos7 cells. Three days after the introduction, the culture supernatant, cells and extracellular matrix were collected.
  • a to D are the results of the samples prepared using Del-l minor
  • E to H are the results of the samples prepared using 4-1.
  • a and E show cells stained with a depositing alkaline phosphatase substrate (BCIP).
  • B and F are the results of staining cells with BCIP after detaching the cells using 0.05% EDTA.
  • C and G show the results when the cells were detached using 0.05% EDTA, and the remaining extracellular matrix was colored with soluble alkaline phosphatase substrate (PNPP).
  • D and H are the results obtained when PNPP was added to the cell culture solution (culture supernatant) and the color reaction was performed, as was conventionally performed.
  • the site stained purple is the active site of alkaline phosphatase, ie, the deposition site of 4-1 (E). From the results in FIGS. 2E and F, it can be seen that 4-1 was deposited on cells and extracellular matrix. In contrast, Del-l minor did not deposit on either cells or extracellular matrix (A, B).
  • the extracellular group can be directly used using an absorbance meter or the like. Allelic phosphatase activity in the substance can be measured.
  • alkaline phosphatase activity in the extracellular matrix and in the culture supernatant was measured for the Del-l partial fragment (4-1) and the full-length Del-l, and the two were compared. -1) had 2.5 times higher deposition activity on the substrate than full-length Del-l.
  • the beta-galactosidase gene was introduced simultaneously with the AP / XY or AP, and the beta-galactosidase activity was measured together with the alkaline phosphatase activity. Then, the measured value (AP / Lac ratio) was obtained by dividing the measured overnight galactosidase activity by the value of beta-galactosidase activity. In addition, when the AP / Lac ratio of the plasma or liver tissue collected from the liver of a mouse into which only the alkaline phosphatase gene (AP) was introduced was set to “1”, XY and the alkaline phosphatase gene were compared.
  • the graph shows the AP / Lac ratio in plasma or liver tissue collected from the liver of a mouse transfected with DNA (AP / XY) to which the DNA was ligated.
  • FIG. 3 shows the AP / Lac ratio in plasma collected from each liver
  • FIG. 4 shows the AP / Lac ratio in liver tissue collected from each liver.
  • the liver tissue collected from the liver into which AP / XY had been introduced had an AP / Lac ratio approximately 8 times that of the liver tissue collected from the liver into which only AP had been introduced. ( Figure 4).
  • the AP / Lac ratio in plasma the AP / Lac ratio was almost 0 in plasma collected from the liver into which AP / XY had been introduced, since almost no AP activity was detected.
  • liver tissue prepared from the liver of the mouse transfected with AP / XY prepared in (3) (B, E, F). Similarly, the liver tissue of a mouse transfected with only AP (A, C, D) D
  • FIG. 5 is a diagram showing staining with Ari lipophosphatase staining (A, B, C, E) and / 3 galactosidase (D, F) using a frozen section of liver tissue collected from each liver.
  • a and B are observations at 40x magnification
  • C, D, E and F are observations at 200x magnification. It can be seen that AP / XY (B) is clearly deposited with respect to AP (A).
  • C, D and E, F are serial sections, respectively, stained with both alkaline phosphatase and j3 galactosidase.
  • cos7 cells were cultured for 72 hours, and the culture medium (medium) and extracellular matrix (ECM) were collected and subjected to Western blot.
  • Laminin and albumin were used as controls.
  • FIG. 6 is a photograph showing electrophoresis by Western blotting.
  • a photograph showing electrophoresis using laminin as a control is arranged in the upper row, and a photograph showing electrophoresis using albumin as a control is arranged in the lower row.
  • This example shows an example in which the enzyme was recovered as an expression product of the target gene.
  • the recovery of alkaline phosphatase was confirmed by performing detection by a color reaction with a substrate of alkaline phosphatase.
  • Example 2 After culturing the cells for 3 days, the cells were removed with a 0.05% EDTA solution, and the extracellular matrix on the bottom was collected with a scraper. After centrifuging the collected sample and removing the supernatant after centrifugation to prepare a pellet, the same operation as in Example 2 (Fig. 3B, F) is performed to obtain a substrate for alkaline phosphatase. Color was developed by adding BCIP.
  • Fig. 7 shows the results.
  • (a) is a wild-type cos7 cell
  • (b) is a cos7 cell into which only the alkaline phosphatase gene has been introduced
  • (c) is a fusion gene obtained by connecting the 4-1 partial fragment and the alkaline phosphatase gene
  • a target molecule can be efficiently deposited on an extracellular matrix or an artificial material, and the target molecule can be used for recovery or removal by the deposition.
  • the target molecule can be deposited on the extracellular matrix using the Del-1 partial fragment, and the outflow into plasma can be highly prevented.
  • the fusion protein having the partial fragment of Del-1 and the target molecule can be used as a drug delivery system with few side effects.
  • the degree of local concentration and localization of the target molecule can be controlled to a high degree, and an extremely high-performance drug delivery system Can be used as

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Abstract

本発明は、以下の (a)又は(b)の内皮細胞遺伝子座-1(Del-1)タンパク質の部分断片を提供する： (a) 配列番号６、８、１０、１２、１８若しくは２４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、 (b) 配列番号６、８、１０、１２、１８若しくは２４に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、細胞外基質への沈着活性を有するタンパク質。

Description

明 細 書 細胞外基質沈着タンパク質 技術分野
本発明は、 内皮細胞遺伝子座- l(Del-l)タンパク質の部分断片である細胞外基質沈 着タンパク質に関する。 また、 本発明は、 上記部分断片を用いた細胞外基質沈着部 位の同定方法、 及び、 Del-1 タンパク質と融合した目的分子 （例えば、 アルカリホ スファターゼ） 回収方法に関する。 背景技術
Del- l(developmentally endothelial locus- 1)タンパク質 （単に 「Del'l」、 「全長 Del-1」 ともいう） は、 EGF (上皮増殖因子、 epithelial growth factor)類似のドメイ ン及びジスコィジン I類似ドメインを有するタンパク質である。 このタンパク質は 細胞外基質タンパク質であり、 血管内皮細胞表面の α ν /3 3インテグリン受容体あ るいは ]3 5インテグリン受容体と呼ばれるタンパク質と EGF類似ドメインを介 して結合し、内皮細胞の細胞外基質への接着を促進することが知られている（Hidai, C. et al.， GENES & DEVELOPMENT 12: 21-33, 1998)。
近年、 全長 Del-lをコードする遺伝子がクロ一ニングされた。 全長 Del-1はその 一部あるいは全部を介して細胞外基質中のプロテオダリカンと結合することができ ると推察されている。 そこで、 全長 Del-1を発現させて所定の分子 （タンパク質、 プロテオダリカン等） を全長 Del-1に結合させ、 全長 Del-1に結合した分子 （タン パク質、 プロテオダリカン等) を回収する方法が知られている （例えば特表平 11-507527号公報を参照）。
従って、これらの結合部位を特定し結合様式を解析することは、目的分子の回収、 及び全長 Del- 1に結合する分子の研究解析のために重要である。
しかしながら、 全長 Del-1の細胞外基質沈着能はそれほど高くないため、 当該全 長 Del-1に結合した目的分子を十分に回収することができなかった。 発明の開示
本発明は、 細胞外基質に効率良く接着することができる領域を含む Del-1の部分 断片を提供することを目的とする。
本発明者は、 上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、 ジスコィジン I類 似ドメイン付近の領域が効率的に細胞外基質に沈着することを見出し、 本発明を完 成するに至った。
すなわち、 本発明は以下の通りである。 ( 1 ) 以下の （a)又は (b)のタンパク質。
(a) 配列番号 1 8若しくは 2 4に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質
(b) 配列番号 1 8若しくは 2 4に示されるアミノ酸配列において 1若しくは数個 のアミノ酸が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、 かつ、 細胞 外基質への沈着活性を有するタンパク質
( 2 ) 以下の （a)又は (b)のタンパク質。
(a) 配列番号 6、 8、 1 0、 1 2、 1 8若しくは 2 4に示されるアミノ酸配列か らなるタンパク質
Ob) 配列番号 6、 8、 1 0、 1 2 1 8若しくは 2 4に示されるアミノ酸配列にお いて 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列 からなり、 かつ、 細胞外基質への沈着活性を有するタンパク質
( 3 ) 以下の （a)又は (b)のタンパク質。
(a) 配列番号 1 4に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質
(b) 配列番号 1 4に示されるァミノ酸配列において 1若しくは数個のァミノ酸が 欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、 かつ、 細胞外基質への沈 着を抑制する活性を有するタンパク質
( 4 ) 以下の （a)又は (b)のタンパク質をコードする遺伝子。
(a) 配列番号 1 8若しくは 2 4に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質
(b) 配列番号 1 8若しくは 2 4に示されるアミノ酸配列において 1若しくは数個 のアミノ酸が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、 かつ、 細胞 外基質への沈着活性を有するタンパク質
( 5 ) 以下の （a)又は (b)のタンパク質をコードする遺伝子。
(a)配列番号 6、 8、 1 0、 1 2、 1 8若しくは 2 4に示されるアミノ酸配列から なるタンパク質
(b) 配列番号 6、 8、 1 0、 1 2、 1 8若しくは 2 4に示されるアミノ酸配列に おいて 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配 列からなり、 かつ、 細胞外基質への沈着活性を有するタンパク質
( 6 ) 以下の （a)又は (b)のタンパク質をコードする遺伝子。
(a) 配列番号 1 4に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質
(b) 配列番号 1 4に示されるァミノ酸配列において 1若しくは数個のァミノ酸が 欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、 かつ、 細胞外基質への沈 着を抑制する活性を有するタンパク質
( 7 ) 以下の (a)又は (b)の DNAを含む遺伝子。
(a) 配列番号 1 7若しくは 2 3に示される塩基配列を含む DNA
(b) 配列番号 1 7若しくは 2 3に示される塩基配列からなる DNA に対し相補的 な塩基配列を含む DNA とストリンジェントな条件下でハイプリダイズし、 か つ、 細胞外基質への沈着活性を有するタンパク質をコードする DNA
( 8 ) 以下の (a)又は (b)の DNAを含む遺伝子。
(a) 配列番号 5、 7、 9、 1 1、 1 7若しくは 2 3に示される塩基配列からなる DNA
(lo) 配列番号 5、 7、 9、 1 1、 1 7若しくは 2 3に示される塩基配列からなる DNAに対し相補的な塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件下でハ イブリダィズし、 かつ、 細胞外基質への沈着活性を有するタンパク質をコード する DNA
( 9 ) 以下の (a)又は (b)の DNAを含む遺伝子。
(a) 配列番号 1 3に示される塩基配列を含む DNA
(b) 配列番号 1 3に示される塩基配列からなる DNA に対し相補的な塩基配列を ^む DNA とストリンジェン卜な条件下でハイブリダィズし、 かつ、 細胞外基 質への沈着を抑制する活性を有するタンパク質をコードする DNA
(10) (4) 〜 （9) のいずれか 1項に記載の遺伝子を含む組換えべクタ一。
(1 1) (10) 記載の組換えベクターを含む形質転換体。
(12) (1 1)記載の形質転換体を培養し、 得られる培養物から Del-lタンパク質 の部分断片を採取することを特徴とする Del-l部分断片の製造方法。
(13) (1) 〜 （3) のいずれか 1項に記載のタンパク質と細胞外基質とを反応さ せることにより、 前記夕ンパク質が前記細胞外基質に沈着する部位を同定する 方法。
(14) (1) 〜 （3) のいずれか 1項に記載のタンパク質を含む、 細胞外基質沈着 部位同定用試薬。
(15) (1) 〜 （3) のいずれか 1項に記載のタンパク質と発現の目的分子とが連 結した融合タンパク質。
(16) (15) 記載の融合タンパク質を含有する薬物送達システム。
(17) (4) 〜 （9) のいずれか 1項に記載の遺伝子と、 発現の目的分子をコード する遺伝子とが連結された、 融合タンパク質をコードする遺伝子。
(18) (17) 記載の遺伝子を含む組換えベクター。
(19) (18) 記載の組換えべクタ一を含む形質転換体。
(20) (19)記載の形質転換体を培養し、 得られる培養物から Del-lタンパク質 の部分断片と発現の目的分子との融合タンパク質を採取することを特徴とする 該融合タンパク質の製造方法。
(21) (15)記載の融合タンパク質を細胞外基質に沈着させ、 目的分子を採取す ることを特徴とする目的分子の回収方法。
(22) 目的分子を沈着させる方法であって、 以下の工程：
(a) (19)記載の形質転換体を培養することによって、 発現の目的分子と Del-l タンパク質の部分断片との融合タンパク質を生産させる工程、 及び
(b) 前記融合夕ンパク質を細胞外基質に沈着させる工程
を含む前記方法。 ( 2 3 ) 目的分子を回収する方法であって、 以下の工程：
(a) ( 1 9 )記載の形質転換体を培養することによって、 発現の目的分子と Del-l タンパク質の部分断片との融合タンパク質を生産させる工程、
(b) 前記融合タンパク質を細胞外基質に沈着させる工程、 及び
(c) 前記融合タンパク質から目的タンパク質を切断することによって、 前記目的 分子を採取する工程
を含む前記方法。
( 2 4 ) 配列番号 2に示されるアミノ酸配列のうち、 活性中心領域と陽性調節領域 とを含む断片、 及び/又は活性中心領域と陰性調節領域とを含む断片を細胞外基 質と反応させることを特徴とする、 細胞外基質への沈着活性を調節する方法。 ( 2 5 ) 活性中心領域のアミノ酸配列が配列番号 4に示されるものである （2 4 ) 記載の方法。
( 2 6 )陽性調節領域のアミノ酸配列が配列番号 2 0に示されるものである（2 4 ) 記載の方法。
( 2 7 )陰性調節領域のアミノ酸配列が配列番号 2 2に示されるものである（2 4 ) 記載の方法。 本発明により、 Del-l部分断片が提供される。 Del-l部分断片の発現タンパク質は 細胞外基質への沈着活性を有することから、 Del-l部分断片を用いることによって、 Del-l 部分断片の発現タンパク質と結合した目的分子を細胞外基質に効率的に沈着 させることができる。 また当該沈着によって、 目的分子を回収または除去すること ができる。
Del-l 部分断片を用いて目的分子を細胞外基質上に沈着させることによって、 当 該目的分子を標的組織で濃縮、 限局することができる。 特に、 当該目的分子を血漿 への流出を防ぐことによって、 他の組織への移行を防止できる。
また、 本発明の Del-l部分断片の中には、 細胞外基質への沈着を抑制する機能を 有する蛋白を発現する断片も含まれている。 従って、 沈着活性を有する断片と細胞 外基質への沈着を抑制する断片とを組み合わせて沈着活性を増減することによって、 目的分子の回収、 除去、 濃縮等を制御することができる 図面の簡単な説明
図 1は、 本発明の Del-l部分断片の塩基配列の概略と、 各部分断片のアルカリホ スファ夕一ゼ活性による沈着活性測定結果を示す図である。
図 2は、 本発明の Del-l部分断片の細胞外基質への結合活性を示す図である。 図 3は、 各肝臓から採取した血漿中の AP/Lac比を示す図である。
図 4は、 各肝臓から採取した肝組織中の AP/Lac比を示す図である。
図 5は、 各肝臓から採取した肝組織のアル力リホスファタ一ゼ染色結果を示す図 である。
図 6は、 ウエスタンプロットを示す図である。
図 7は、 アル力リホスファ夕一ゼの回収結果を示す図である。 発明を実施するための最良の形態
本発明は、 細胞外基質に特異的に結合する領域を含む全長 Del-1タンパク質の部 分断片、すなわち Del-1沈着蛋白及び Del-1沈着抑制蛋白（単に、 「Del_l部分断片」 ともいう） に関するものである。 本発明の Del-1部分断片は、 全長 Del-1を種々の 長さに切断することにより作製されたものであり、 細胞外基質への沈着活性を有す ることを特徴とする。
本発明の Del-1部分断片は、 全長 Del-1遺伝子 （配列番号 1 ) の配列のうち、 少 なくとも 1270〜： 1662番の塩基配列の領域によりコードされるアミノ酸 （配列番号 2に示すアミノ酸配列の 218〜348番のアミノ酸配列） を含むものである。 この領 域の塩基配列を配列番号 3に、 これによりコードされるアミノ酸配列を配列番号 4 に示す。 また、 上記領域を含む本発明の Del-1部分断片は、 配列番号 5、 7、 9、 1 1、 1 3、 1 5又は 1 7に示す塩基配列を有するものであり、 これらの塩基配列 によりコードされるアミノ酸配列を、それぞれ配列番号 6、 8、 1 0、 1 2、 1 4， 1 6又は 1 8に示す。
上記 Del-1部分断片は、 それをコードするアミノ酸配列から、 プロテオダリカン と結合することができると推察されている。
全長 Del-l夕ンパク質または Del-I部分断片の検出には、 アル力リホスファタ一 ゼを用いた検出法が採用されている。 すなわち、 遺伝子組み換えにより全長 Del-l タンパク質の N末端にアルカリホスファターゼを融合したタンパク質を細胞に発 現させることによって、 培養上清にも細胞外基質と同様にアルカリホスファタ一ゼ 活性を確認することができる。
また、 本発明においては、 上記アルカリホスファターゼを用いた検出法のほか、 Del-l部分断片等の検出にウエスタンプロット法を用いることもできる。 具体的に は、 アル力リホスファ夕一ゼと全長 Del-lまたは Del-l部分断片とを融合した夕ン パク質をコ一ドする塩基配列を cos7細胞に導入し、一定時間培養後に培養液と細胞 外基質を採取してウェスタンブロットを行うことによって検出できる。 コント口一 ルとしては例えばラミニンとアルブミンを用いることができる。 なお、 ウエスタン ブロット法において、 培養上清中の Del-lタンパク質または Del-l部分断片の検出 の感度を向上させるために、 使用する培養液を増量し、 タンパク質を濃縮してもよ い。
上記検出法はどちらを採用することもできるが、 アルカリホスファタ一ゼを用い た検出法が好ましい。
本発明においては、 既知の全長 Del-lを種々の方法によって切断することによつ て得られた本発明の Del-l部分断片を作製し、 当該 Del-l部分断片をアル力リホス ファターゼを用いた前記検出方法およびウェスタンブロット法による細胞外基質沈 着能を調べた。 また、 Del-l 部分断片の細胞外基質への沈着部位の同定、 及び生体 内特定部位への Del-l部分断片の固定を行なった。 さらに、 Del-l部分断片を用い た目的遺伝子の発現産物の回収を行った。
以下、 本発明の実施の形態について具体的に説明する。
1 . Del-l部分断片をコードする DNA
Del-l部分断片は、 全長 Del-lをコードする DNAを種々の長さに切断し、 これ を発現させることにより得ることができる。 全長 Del-l遺伝子のクロ一ニングは、公知手法に従って行うことができる（Hidai C. et al., GENES & DEVELOPMENT, 12:21-33， 1998)。 すなわち、 ゲノムライブ ラリーからェクソントラッピングによりェクソンを得、 これを用いて cDNAをクロ 一二ングすることができる。
例えば、 ゲノムクローンの断片をスプライシングベクタ一に挿入し、 mRNAの転 写の際にスプライシングを起こさせる。 次に、 スプライスした mRNAを逆転写及 び増幅し、 ェクソンのシークェンスを行う。
得られたェクソンは、 cDNAライブラリーから目的 DNAを釣り上げるためのプ ローブとして用いるか、 あるいは 5'-RACE、 3'-RACEのための遺伝子特異的プライ マ一の設計に用いられる。 なお、 RACE 法を行うには、 市販のキット （例えば、 Marathon™ cDNA Amplification Kit> Clontech社） を用いることができる。
cDNAの塩基配列の決定は、 公知の任意の手法により行うことができるが、 通常 は自動塩基配列決定装置を用いて配列決定が行われる。
このようにして得られた全長 cDNAの塩基配列を配列番号 1に示す。 また、 配列 番号 1に示す塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を配列番号 2に示す。
本発明の切断型 Del-l部分断片の 1つは、 配列番号 2に示すアミノ酸配列のうち 1〜348番目のアミノ酸配列を含むものである。 上記部分断片は、 配列番号 1に示 す塩基配列を有する DNAを Exonuclease IIIと Mung bean nucleaseを用いて 3' 末端から順次削除することにより得ることができる。 削除される 3'末端の DNAは Exonuclease III の反応時間により決定される。 この方法は市販の酵素 （例えば Exonuclease III：夕カラバイオ社製） を用いることができる。
全長 Del-l (Del-l major) , 本発明の切断型 Del_l部分断片および当該部分断片 の沈着活性に影響を与えるアミノ酸配列の模式図を図 1の左側上部に示す。
図 1において、 CYは配列番号 2に示すアミノ酸配列のうち 218〜348番（配列番 号 4 )、 4-1は 1〜348番 （配列番号 6 )、 4-14は 1〜368番 （配列番号 10)、 4-13 は 1〜385番 （配列番号 12)、 CBは 218〜480番 （配列番号 14)、 XYは 123〜348 番 （配列番号 18) の領域のアミノ酸配列を有する。
これらの Del-l部分断片をコードする DNA (「本発明の DNA」 という） は、 CY については、 配列番号 1に示す塩基配列の 1270〜： 1662番 （393bp, 配列番号 3 )、 4-1については 619〜1662番 （1044bp, 配列番号 5 )、 4-14については 619〜1722 番（1104bp， 配列番号 9 )、4-13については 619〜： L773番（1155bp, 配列番号 11)、 CBについては 1270〜2058 (789bp, 配列番号 13)、 XYについては、 985〜1662 (678bp, 配列番号 17) の領域の塩基配列を有する。
また、 ヒトの全長 Del-1においても、 マウス断片 XY (配列番号 18) に対応する human XY (配列番号 24) の沈着活性を測定した。 human XYをコードする DNA は、 配列番号 23の塩基配列を有する。
図 1には示されていないが、 本発明の切断型上記 Del-l部分断片として、 4-15は 配列番号 2に示すアミノ酸配列のうち 1〜365番 （配列番号 8 )、 DEは 218〜319 番（配列番号 16) の領域のアミノ酸配列を有する。 これらのアミノ酸配列をコード する DNAは、 4-15については、配列番号 1に示す塩基配列の 619〜1713番（1095bp， 配列番号 7 )、 DEについては 1270〜1575 (306bp, 配列番号 15) の領域のァミノ 酸配列を,有する。
また、 図 1において、 本発明の Del-l部分断片の沈着活性を向上又は低減させる アミノ酸配列として、 XCは 123〜217番 （配列番号 2 0 )、 YBは 349〜480 (配列 番号 2 2 ) の領域のアミノ酸配列を有する。 また、 これらのアミノ酸配列をコード する DNAは、 XCについては 985〜1269 (285bp, 配列番号 1 9 )、 YBについて は 1663〜2058 (396bp, 配列番号 2 1 ) の領域の塩基配列を有する。
さらに、 本発明の部分断片は、 上記配列番号 2に示すアミノ酸配列の少なくとも 218〜348番のアミノ酸配列 （配列番号 4 ) に示す CYを含むものである。 また、 本 発明の部分断片は、 上記配列番号 2に示すアミノ酸配列の少なくとも 218〜348番 のアミノ酸配列 （配列番号 4 ) を複数連結したタンパク質を含むものである。 これ らの領域は、 細胞外基質への沈着活性を有する中心領域である。 上記 CYは、 配列 番号 1に示す塩基配列の 1270〜： 1662番の領域（配列番号 3 )によりコードされる。 また、 配列番号 2 0に示すアミノ酸配列（XC) は細胞外基質への沈着活性を向上 させるものであり、 当該沈着活性の陽性調節領域である。 他方、 配列番号 2 2に示 すアミノ酸配列 （YB) は細胞外基質への沈着活性を低減させるものであり、 当該沈 着活性の陰性調節領域である。 「陽性調節領域」 とは、 その領域だけでは沈着活性を 生じないが、 中心領域 CYが含まれることにより沈着活性を引き起こすことができ る領域を意味する。 「陰性調節領域」 とは、 その全部又は一部の存在により、 中心領 域 CYや陽性調節領域 XCの存在にかかわらず、 沈着活性が低下して、 可溶性分画 が増加する断片の領域を意味する。
本発明の Del-l部分断片（マウス及びヒト由来）の領域をまとめると表 1の通りで ある。
表 1
Figure imgf000011_0001
* 領域は、 DNAのときは塩基番号、 タンパク質のときはアミノ酸番号で示す。 一度^分断片の領域が決定されると、 その後は、 当該領域を増幅させるようにプ ライマーを設計し、 Del-lをコードする DNAを鎵型として PCRを行うことにより、 容易に部分断片をコ一ドする DNAを得ることができる。
ここで、 本発明においては、 上記 Del-l部分断片のアミノ酸配列からなるタンパ ク質が細胞外基質との沈着活性を有する限り、 当該アミノ酸配列において少なくと も 1個、 好ましくは 1個又は数個のアミノ酸に欠失、 置換、 付加等の変異が生じて もよい。
例えば、 配列番号 6、 8、 10、 12、 18又は 24に示すアミノ酸配列の 1個又は数 個、 例えば 1〜10個、 好ましくは 1〜5個のアミノ酸が欠失してもよく、 配列番号 6、 8、 10、 12、 18又は 24に示すアミノ酸配列に、 1個又は数個、 例えば 1〜： 10 個、好ましくは 1〜5個のアミノ酸が付加してもよく、 あるいは、配列番号 6、 8、 10、 12、 18又は 24に示すアミノ酸配列の 1個又は数個、 例えば 1〜： 10個、 好ま しくは 1〜5個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換してもよい。 従って、 上記変異が 導入されたアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする遺伝子も、 当該タンパク質 が細胞外基質への沈着活性を有する限り本発明の遺伝子に含まれる。 また、 本発明においては、 上記 Del-l部分断片のアミノ酸配列からなるタンパク 質が細胞外基質への沈着を抑制する機能を有する限り、 当該アミノ酸配列において 少なくとも 1個、 好ましくは 1個又は数個のアミノ酸に欠失、 置換、 付加等の変異 が生じてもよい。
' 例えば、 CB領域である配列番号 14に示すアミノ酸配列の 1個又は数個、例えば 1〜10個、 好ましくは 1〜 5個のアミノ酸が欠失してもよく、 配列番号 14に示す アミノ酸配列に、 1個又は数個、 例えば 1〜； L0個、 好ましくは 1〜5個のアミノ酸 が付加してもよく、 あるいは、 配列番号 14に示すアミノ酸配列の 1個又は数個、 例えば 1〜10個、好ましくは 1〜 5個のァミノ酸が他のァミノ酸に置換してもよレ^ 従って、 上記変異が導入されたアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする遺伝子 も、 当該タンパク質が細胞外基質への沈着を抑制する活性を有する限り本発明の遺 伝子に含まれる。 上記欠失、 置換、 付加等の変異の導入は、 部位特異的突然変異誘発法を利用した 変異導入用キット、 例えば GeneTailorTM Site-Directed Mutagenesis System (ィ ンビトロジェン社）、 TaKaRa Site -Directed Mutagenesis System (Mutan'K、 Mutan-Super Express Km等：夕カラバイオ社製） を用いて行うことができる。 さらに、 本発明においては、 上記 Del-l部分断片をコ一ドする DNA (配列番号 5、 7、 9、 11、 Γ7又は 23) に対し相補的な塩基配列からなる DNAと、 ストリ ンジェントな条件下でハイプリダイズすることができる DNAであって細胞外基質 に対し結合活性を有するタンパク質をコードする DNAも本発明の遺伝子に含まれ る。 ストリンジェントな条件とは、 例えば、 塩 （ナトリゥム） 濃度が 150〜900mM であり、 温度が 55〜75°C、 好ましくは塩 （ナトリウム） 濃度が 150〜200mMであ り、 温度が 60〜70°Cでの条件をいう。
さらに、 本発明においては、 Del-l部分断片をコードする DNA (配列番号 13に 示す） に対し相補的な塩基配列からなる DNAと、 ストリンジェン卜な条件下でハ イブリダィズすることができる DNAであって細胞外基質への沈着を抑制する活性 を有するタンパク質をコードする DNAも本発明の遺伝子に含まれる。 ここで、 「細胞外基質」 （ECM) とは、 動物組織中の細胞外に存在する生体構造物 であって、 細胞内で合成され細胞外に分泌 ·蓄積した生体高分子の会合体を意味す る。 主要な構成成分はコラーゲン、 エラスチン、 プロテオダリカン、 グリコサミノ ダリカン、 糖タンパク質である。 「沈着活性」 とは、 Del-lの全部又は一部の領域が 細胞外基質に結合する活性を意味し、例えば全長 Del-lよりも沈着活性が高いもの、 全長 Del-lよりも沈着活性が低いもの、 あるいは全長 Del-lより短いが沈着活性が 同等であるものも含まれる。 細胞外基質への沈着を抑制する活性とは、 陰性調節領 域の存在により、 中心領域 CYや陽性調節領域 XCの存在にかかわらず、 沈着活性 が低下して、 可溶性分画が増加する活性を意味する。 沈着活性又は細胞外基質への 沈着を抑制す 活性の測定は、 例えば以下の通り行われる。
本発明の DNAにアルカリホスファターゼなどのマーカーをコードする DNAを 連結し、 これを所定の細胞 （例えば cos7細胞、 CHO細胞、 NIH3T3細胞等） に導 入して培養する。 培養容器からその培養上清及び細胞を除去した後、 培養容器に残 つた細胞外基質にアルカリホスファタ一ゼの基質を加えて発色させ、 沈着活性を測 定する。 Del-l 部分断片にはマ一カー （アルカリホスファタ一ゼ） も結合している ため、 Del-l 部分断片が細胞外基質に沈着すると、 マ一カーを指標として結合活性 を測定することができるとともに、 結合位置を同定することができる。 例えば、 可 溶性アルカリホスファタ一ゼ基質を用いると、基質が発色（例えば、 黄色等に発色） するため、 特異的な波長での吸光度を測定することで容易に沈着活性を測定するこ とができる。また、沈着性アルカリホスファターゼを用いると、沈着部位が発色（例 えば、 紫等） するため、 顕微鏡観察等によりその沈着部位を容易に同定することが できる。
なお、 マ一力一はアルカリホスファターゼに限定されるものではなく、 その他 GFPとその変異型、 mycや Hisなどの tag、 GST蛋白、 アイソトープ、 ピオチン 化蛋白などを用いることができる。 また、 クロラムフエニコ一ルァセチル卜ランス フェラーゼ （CAT) 遺伝子、 ルシフエラーゼ遺伝子、 /3ガラクトシダ一ゼなどのレ ポー夕一遺伝子を用いてアツセィすることも可能である。
2 . 本発明の DNAを含む組換えベクター及び形質転換体の作製
(l)DNAを含む組換えべクタ一の作製
本発明の DNAを含む組換えべクタ一は、 適当なベクターに本発明の DNAを連 結 (挿入)することにより得ることができる。本発明の DNAを揷入するためのベクタ 一は、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラスミド DNA、 ファ一ジ DNA、 ウィルス等が挙げられる。
プラスミド DNAとしては、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミド、 酵母由来のプラスミドなどが挙げられ、 ファージ DNAとしては λファージ等が挙 る。
本発明のベクタ一には、 プロモ一夕一、 本発明の； DNAのほか、 所望によりェン ハンサ一などのシスエレメント、 スプライシングシグナル、 ポリ Α付加シグナル、 選択マ一カー、 リボソーム結合配列 （SD 配列） などを連結することができる。 な お、 選択マーカーとしては、 例えばジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、 アンピシリン耐 性遺伝子、 ネオマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。 (2)形質転換体の作製
本発明の形質転換体は、 本発明の組換えベクターを、 目的遺伝子が発現し得るよ うに宿主中に導入することにより得ることができる。 ここで、 宿主としては、 本発 明の DNAを発現できるものであれば特に限定されるものではない。 例えば、 当分 野において周知の細菌、 酵母、 動物細胞、 昆虫細胞を用いることができる。 また、 マウスなどの実験動物ゃブタなどの家畜、 イネ、 トウモロコシなどの植物を用いる ことができる。
細菌を宿主とする場合は、 本発明の組換えベクターが該細菌中で自律複製可能で あると同時に、 プロモータ一、 リボゾーム結合配列、 本発明の DNA、 転写終結配 列を含めることができる。 細菌としては、 大腸菌（Escherichia coh) , 枯草菌 {Bacillus subtilis、などが挙げられる。 プロモーターとしては、 例えば trpプロモ一 夕一、 lacプロモーター、 PLプロモー夕一、 PRプロモータ一などが用いられる。 細菌への組換えべクタ一の導入方法は特に限定されるものではなく、 例えばカルシ ゥムイオンを用いる方法、 エレクトロポレーシヨン法等が挙げられる。
酵母を宿主とする場合は、 例えばサッカロミセス ·セレ シェ (Saccharomyces cerevisiae)、 シゾサッカロミ-セス .ホンべ {Schizosaccharomyces pombe)なとカ用 いられる。 この場合、 プロモーターとしては酵母中で発現できるものであれば特に 限定されず、 例えば gallプロモーター、 gallOプロモーター、 ヒートショックタン パク質プロモータ一、 MF a lプロモー夕一、 PH05プロモータ一、 PGKプロモー タ一、 GAPプロモーター、 ADHプロモーター等が挙げられる。 酵母への組換えべ クタ一の導入方法としては、 例えばエレクト口ポレーシヨン法、 スフエロプラスト 法、 酢酸リチウム法等が挙げられる。
動物細胞を宿主とする場合は、 サル細胞 （cos7細胞）、 Vero、 チャイニーズハム スター卵巣細胞 （CHO細胞）、 マウス L細胞、 ラット GH3細胞、 又はヒト FL、 HEK293細胞などが用いられる。プロモータ一としては、 SR aプロモーター、 SV40 プロモーター、 LTR プロモータ一、 /3 -ァクチンプロモータ一等が挙げられる。 動 物細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばエレクト口ポレーシヨン法、 リン酸カルシウム法、 リポフエクシヨン法等が挙げられる。
昆虫細胞を宿主とする場合は、 Sf9細胞、 Sf21細胞などが用いられる。 昆虫細胞 への組換えベクターの導入方法としては、 例えばリン酸カルシウム法、 リボフェク シヨン法、 エレクト口ポレーション法などが用いられる。
また、 動物、 植物に対する遺伝子導入にはウィルスベクターを用いる方法や、 リ ポフエクシヨン法などがある。 また生殖細胞や ES細胞に対して遺伝子を導入し、 遺伝子組み換え動物を作製することも可能である。
3 . 本発明の Del-l部分断片の生産
本発明の Del-l部分断片は、 前記形質転換体を培養あるいは飼育し、 その培養物 あるいは飼育産物から採取することにより得ることができる。 「培養物」 とは、培養 上清、 培養細胞、 培養菌体、 又は細胞若しくは菌体の破碎物のいずれをも意味する ものである。 「飼育産物」 とは動物、 植物の本体、 組織、 分泌物、 排泄物およびそれ らの加工品のいずれをも意味するものである。
本発明の形質転換体を培養する方法は、 宿主の培養に用いられる通常の方法に従 つて行われる。
細菌や酵母等を宿主とする形質転換体を培養する培地としては、 微生物が資化し 得る炭素源、 窒素源、 無機塩類等を含有し、 形質転換体の培養を効率的に行うこと ができる培地であれば、 天然培地、 合成培地のいずれを用いてもよい。
炭素源としては、 グルコース、 フラク卜ース、 スクロース、 デンプン等の炭水化 物、 酢酸、 プロピオン酸等の有機酸、 エタノール、 プロパノール等のアルコール類 が用いられる。
窒素源としては、 アンモニア、 塩化アンモニゥム、 硫酸アンモニゥム、 酢酸アン モニゥム、 リン酸アンモニゥム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニゥム塩、 ぺプ トン、 肉エキス、 コーンスティープリカ一等が用いられる。 無機物としては、 リン酸第一カリウム、 リン酸第二カリウム、 リン酸マグネシゥ ム、 硫酸マグネシウム、 塩化ナトリウム、 硫酸第一鉄、 硫酸マンガン、 硫酸銅、 炭 酸カルシウム等が用いられる。
培養は、 通常、 振盪培養又は通気攙拌培養などの好気的条件下、 例えば 37°Cで 12〜24時間行う。 pHの調整は、 無機又は有機酸、 アルカリ溶液等を用いて行う。 プロモーターとして誘導性のプロモータ一を用いた発現ベクターで形質転換した 微生物を培養する場合は、 必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。 例えば、 Lacプロモータ一を用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養する ときにはィソプロピル- β -D-チォガラクトシド (IPTG)等を培地に添加してもよい。 動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、 一般に使用 されている RPMI-1640培地、 DMEM培地又はこれらの培地に牛胎児血清等を添加 した培地等が用いられる。
培養は、 通常、 5 %C02存在下、 37°Cで 1〜4日行う。 培養中は必要に応じて力 ナマイシン、 ベニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
培養後、 本発明のタンパク質が菌体内又は細胞内に生産される場合には、 菌体又 は細胞を破砕することによりタンパク質を抽出する。 また、 タンパク質が菌体外又 は細胞外に生産される場合には、 培養液をそのまま使用するか、 遠心分離等により 菌体又は細胞を除去する。 その後、 タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生 化学的方法、 例えば硫酸アンモニゥム沈殿、 ゲルクロマトグラフィー、 イオン交換 クロマトグラフィー、 ァフィ二ティ一クロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み 合わせて用いることにより、 前記培養物中から本発明の Del-Ι部分断片を単離精製 することができる。
動物 （マウス、 ラット、 ゥサギ、 ャギ、 ゥシ等の実験動物又は家畜）、 あるいは植 物が形質変換体として用いられる場合、 それらは通常の飼育、 栽培方法以外に、 無 菌環境や特殊飼料など特殊な飼育培養方法を必要とする可能性もある。 形質転換体 が上記動物の場合、 肉、 卵、毛、母乳、 尿、 糞便などから、 一般的な生化学的方法、 例えば硫酸アンモニゥム沈殿、 ゲルクロマトグラフィー、 イオン交換クロマトダラ フィ一、 ァフィ二ティ一クロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用い ることにより、 本発明の Del-l部分断片を単離精製することができる。 また形質転換体が植物の場合、 葉、 花、 実、 根などのほか、 栽培に用いた土や水 などから、 一般的な生化学的方法、 例えば硫酸アンモニゥム沈殿、 ゲルクロマトグ ラフィー、 イオン交換クロマトグラフィー、 ァフィ二ティークロマトグラフィー等 を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、 本発明の Del-l部分断片を単離 精製することができる。
本発明においては、 in vitro翻訳による Del-l部分断片の合成を採用することが できる。 この場合は、 RNAを铸型にする方法と DNAを錶型にする方法 （転写 Z翻 訳） の 2通りの方法を用いることができる。 錶型 DNAとしては、 翻訳開始点の上 流にプロモーターとリポゾ一ム結合部位を有している上記； DNA、 あるいは翻訳開 始点の上流に転写に必要なプロモーター等が組み込まれた DNAが挙げられる。 in vitro翻訳システムは、市販のシステム、例えば ExpresswayTMシステム（Invitrogen 社）、 TNT システム (登録商標； Promega社)などを用いることができる。 in vitro 翻訳システムによる Del-l部分断片の翻訳後は、 上記生化学的方法を単独で、 又は 適宜組み合わせることにより、 目的の断片を単離精製することができる。
4 . 目的遺伝子の発現産物の回収
Del-l 部分断片及び目的分子を発現する細胞系又は動植物は、 目的遺伝子を発現 させることにより、 その発現産物である目的分子 （例えば、 タンパク質、 抗体、 ぺ プチド、 天然若しくは合成化合物、 他の細胞、 又は可溶性分子） を回収するために 使用することができる。 また、 Del-l部分断片を直接使用することもできる。
目的分子を回収する方法を以下に説明する。 まず、 目的分子と Del-l部分断片と が結合した融合タンパク質を作製する。 すなわち、 当該分子をコードする DNA及 び Del-l部分断片コードする DNAを連結し、 これを適当なベクターに連結する。 これを宿主細胞に導入して培養し、目的分子が連結した融合タンパク質を作製する。 ベクターへの連結、 細胞への導入、 形質転換細胞の培養法、 形質転換体の飼育栽培 法は前記 2項， 3項の説明と同様である。
形質転換細胞を用いる場合、 上記融合タンパク質のうち、 Del-l 部分断片の全部 又はその一部の領域は、 培養容器上に広がる細胞外基質に沈着する。 従って、 培養 後に培養上清及び細胞を除去しても、 融合タンパク質は細胞外基質に沈着した状態 で培養容器に残存している。そこで、培養容器から培養上清及び細胞を除去した後、 融合タンパク質が沈着している細胞外基質を機械的にかきとることにより、 目的分 子を回収することができる。 また、 あらかじめ目的分子の DNA塩基配列と Del-1 部分断片の塩基配列の間に特異的な酵素 （例えば Factor Xa) の切断配列を挿入し ておけば、 その酵素を用いて目的分子のみ回収することも可能である。 また、 Del-l 部分断片の陰性調節領域を加えることで溶液中に回収することも可能である。
ここで、 Del-l 部分断片と発現目的分子とが結合している融合タンパク質から、 発現目的分子を同定し単離するために、 Del-l 部分断片に標識を付けることが必要 である。 Del-l 部分断片は、 アルカリホスファタ一ゼ若しくは西洋わさびパ一ォキ シダ一ゼ等の酵素、 あるいはフルォレセインイソチオシアナート (FITC)、 フィコシ ァニン若しくはローダミンを含む蛍光標識などの試薬を用いて標識することができ る。
また、 本発明の Del-l部分断片は、 細胞外基質への沈着活性を有するため、 結合 検定、 ァフィ二ティークロマトグラフィー、 免疫沈降法、 ウエスタン法などに利用 することができる。 一
Del-l部分断片と結合できる発現目的ポリペプチドの同定は、 組換え Del-l部分 断片によるペプチドライブラリーのスクリーニングによって行うことも可能である。 標識された前記融合タンパク質をランダムペプチドライブラリ一とともにインキ ュペートし、 Del-l 部分断片とライブラリ一中のペプチドとを結合させる。 次にそ のライブラリーを洗浄し、 未結合のポリペプチドを除去する。 アルカリホスファタ —ゼ又はパーォキシダ一ゼの基質、 たとえば、 5-ブロモ -4-クロ口- 3-インドリルホス フェート (BCIP)、 3,3'-ジァミノべンジジン (DAB)を含むゥエルにライブラリ一のぺ プチドを添加し、 数分インキュベートすると、 アルカリホスファターゼ等が発色す るため、 目的分子を容易に同定し単離することができる。
形質転換体が動植物の場合、 上記融合タンパク質を特定の部位に発現させると、 本発明の Del-l部分断片は細胞外基質に沈着するため、 目的タンパクはその組織で 濃縮される。 従ってその農畜産物を直接食することや生化学的に抽出することで効 率的に目的分子を回収し利用できる。
5 . 細胞外基質への沈着部位の同定
前記 1項において説明したように、 本発明の Del-l部分断片は、 細胞外基質への 沈着活性を有する。 沈着性マーカーを使用することにより、 本発明の Del-l部分断 片は、 視覚的に細胞外基質への沈着部位を観察することができる。
従って、 本発明の Del-l部分断片は、 細胞外基質への沈着部位を同定するための 試薬として使用することができ、 マーカー、 発色基質、 マーカ一に対する抗体等と ともに、 細胞外基質沈着部位同定用キットに含めることができる。
6 . 生物活性物質の生体内特定部位への固定
目的分子と本発明の Del-l部分断片とからなる融合タンパク質を特定組織内で発 現させた場合、 その目的分子は細胞外基質の所定の部位に固定され他の部位へ移行 しない。 結果として、 その部位で濃縮される。
これによつて、 本発明の Del-l部分断片をコードする塩基配列は、 適切な細胞、 組織又は臓器に特異的なプロモー夕一配列と組み合わせて、 目的分子を特定組織に 発現させ、 固定、 限定、 濃縮するためのベクターとして使用することができる。 さらに BCIPを用いた染色により、 細胞外アル力リホスファタ一ゼ活性は細胞外 基質に存在することがわかった。 （実施例 2 )
このように、 Del-lタンパク質の部分断片は、 全長 Del-lタンパク質よりはるか に強力な細胞外基質沈着能を有し、 アルカリホスファターゼのような他のタンパク 質を細胞外基質に固定する働きがあることを意味している。 7 . 生物活性物質による人工物の修飾
ある生物活性物質と Del-l部分断片の融合蛋白を産生する大腸菌や細胞を人工物 上で培養することで、 人工物に生物活性物質をその生物学的機能を損なうことなく 沈着させることができる。 例えば、 図 2の結果は、 培養皿という人工物がアルカリ ホスファ夕ーゼという活性物質で修飾されたことを示している。 血液透析の膜ゃ植 え込み用人工素材の修飾に応用できる。
8 . 沈着活性の調節、 薬物送達システム
本発明の Del-l部分断片は、 目的分子を結合することにより当該目的分子を細胞 外基質に沈着させることができる。 また、 本発明の Del-l部分断片は、 陽性調節領 域と陰性調節領域を利用することで、 沈着活性を人為的に調節することができる。 例えば、 図 1に示す YB領域又は XC領域の存在又は不存在により、 あるいはこれ らの領域の長さを適宜変えることにより、沈着活性の程度を変えることができる（図 1の 4-8, 4-13, 4-1， XY等）。 具体的には、 配列番号 2に示されるアミノ酸配列のう ち、 活性中心領域 CY (配列番号 4、 5 ) と陽性調節領域 （配列番号 1 9、 2 0 ) とを含む断片、 活性中心領域 CY (配列番号 4、 5 ) と陰性調節領域 （配列番号 2 1、 2 2 ) とを含む断片、 あるいはこれらの両者を、 細胞外基質と反応させること により、 陽性調節又は陰性調節によって種々の強さの沈着活性を得る。 従って、 目 的分子を所定の薬理作用を有するタンパク質とすれば、 本発明の融合タンパク質を 薬物送達システム （ドラッグデリバリーシステム： DDS) として使用することも可 能である。 例えば、 中心領域及び陽性調節領域を含む 4-1と、 抗ガン剤の前駆体を 抗ガン剤に変換する酵素の融合蛋白をコードする遺伝子をガン組織に遺伝子導入し ておく。 その後、 抗ガン剤の前駆体を大量に投与すると、 ガン組織で健常組織に対 して高い薬物濃度を得ることができる。 治療後に陰性調節領域を含む CB (配列番 号 1 3、 1 4 ) の遺伝子を導入することにより、 先に導入した遺伝子産物が血中に 遊離し、 血液透析などで除去することが可能になる。 実施例 Λ 以下、 実施例により本発明をさらに具体的に説明する。 但し、 本発明はこれら実 施例に限定されるものではない。
〔実施例 1〕 Del-l部分断片の作製
受精後 9から 12日のマウス胎児より TRIzol (Invitrogen社)を用いて RNAを抽 出した。 それを鐯型とし、 Supersci'pt II (Inviti'ogen社)を用いて逆転写反応を行い cDNAを作製した。 配列番号 2に示すアミノ酸配列のうち、 シグナルぺプタイドの 配列を除いた塩基配列 697〜2089を、 PCRで増幅した後にベクターに挿入できる 様に、 プライマーの 5末端に制限酵素認識配列を入れた。 プライマ一の塩基配列は 以下の通りである。
Forward primer; AAA GAT CTAACC CGAACC CCT GTG AA (配列番号 25) Reverse primer; AAC TCG AGC ATT GTG GGA TGT GCG (配列番号 26) PGRは、 以下の反応液組成を用いて、 94°Cで 30秒、 62°Cで 30秒、 72°Cで 1分 30秒の反応を 35回行った。 反応液組成 （50 1中） ：
逆転写酵素産生 cDNA 5 li l
プライマー 各 1 W M
dNTP 各 0.5πιΜ
ポリメラーゼ 2 nit
緩衝液 10mM Tris-HCl(pH8.3)
50mM KC1
1.5mM MgCb この PGR産物を制限酵素の Bgl IIと Xho Iで処理し、 プラスミド pAPtag-5(フ ナコシ社)に連結した。 この様にして作製したプラスミドを Xho I で切断した後、 Exonuclease III (タカラバイォ社)で 10秒から 2分処理して、 図 1に示す様々な長 さの Del-1部分断片 （4-8, 4-13, 4-14, 4_1, 4-11， 2"6, Del-1 minor, l'l, 2·3) を作 製した。また、 PCRを用いて図 1に示す様々な長さの： Del-1部分断片（CB, CY， YB, XY, XC, human ΧΥ, ΑΡ only) , および、 図 1に示されていない、 Del'l部分断片 FB (配列番号 1に示す塩基配列の 1576〜2058番）、 4-15 (配列番号 8〉、 CE (配 列番号 16) を作製した。
〔実施例 2〕 Del-1部分断片の細胞外基質への沈着活性
(1) 実施例 1で作製した部分断片のうち、 4-8, 4- 13, 4- 14, 4- 1, 4^11, 2-6, Del-1 minor, 1-1, 2·3をプラスミド pAPtag-5(フナコシ社)に連結し、 cos7細胞に導入した。 導入後 3日後に培養上清、細胞及び細胞外基質を採取した。まず上清を採取した後、 0.05%EDTAを含む PBSを加えてインキュベートすることで細胞が培養皿の底から 剥がれて採取可能になり、 培養皿の底には細胞外基質が残される。 こうしてそれぞ れに含まれるアルカリホスファターゼ活性を検出した。 対照として、 野生型全長 Del-1 (AP4Del-l) 及び培地のみのサンプルを作製し、 アルカリホスファタ一ゼ活 性を検出した。 アル力リホスファターゼ活性は、 上清の活性に対する細胞外基質の 比 （AP活性比 ECM/Medium) として求め、 図 1の右側にグラフで表示した。 図 1より、 4-1、 4-8, 4-14及び 4-13が野生型 Del-1 (Del-1 major) よりも活性が 強く、 4-11及び 2-6は野生型 Del-1よりも活性は低下し、 Del_l minorではほとん ど活性が認められなかつた。
沈着活性の中心領域を検討するため、 CB (配列番号 1に示す塩基配列の 1270〜 2058番）、 CY、 YB、 XY、 XC、 human XYおよび AP onlyを発現させて上記と 同様にしてアルカリホスファターゼ活性を測定した。
その結果、 XYと human XYでは、 野生型全長 Del-1よりも高いアルカリホスフ ァタ一ゼ活性が認められ、 また CBと CYでは、 野生型全長 Del-1よりは高くない が、 ある程度のアルカリホスファタ一ゼ活性が認められた。 これに対し、 XCと YB ではアル力リホスファ夕一ゼ活性が認められなかった。
これらの結果から、 活性中心領域は配列番号 3で示される CY (配列番号 1に示 す塩基配列の 1270〜1662番目の領域）、 配列番号 2に示すアミノ酸配列の 218〜 348番目のアミノ酸配列の領域であると考えられた。
CYに XCを連結させた XYは、前記活性中心領域 CYのみに比べて約 1 0倍の沈 着活性を有する。 また、 XCのみでは、沈着活性をほとんど有しない。 したがって、 XC は細胞外基質への沈着活性を向上させる、 細胞外基質への沈着活性の陽性調節 領域であると考えられた。
他方、 CYに YBを連結させた CBは、 前記活性中心領域 CYのみに比べて、 沈着 活性が約 0.5倍に低減する。 したがって、 YBは細胞外基質への沈着活性を低減さ せる、 細胞外基質への沈着活性の陰性調節領域であると考えられた。 (2) さらに、 実施例 1で作製した Del-l部分断片のうち、 Del-l minor (配列番号 1に示す塩基配列の 619〜1271番） 又は 4-1をプラスミド pAPtag-5(フナコシ社） に連結し、 cos7細胞に導入した。 導入後 3日後に培養上清、 細胞及び細胞外基質を 採取した。 まず上清を採取した後、 0.05%EDTAを含む PBSを加えてィンキュベー 卜することで細胞が培養皿の底から剥がれて採取可能になり、 培養皿の底には細胞 外基質が残される。 そして、 それぞれに含まれるアルカリホスファターゼ活性を検 出した。
結果を図 2に示す。 図 2において、 A〜Dは Del-l minorを用いて作製したサン プルの結果であり、 E〜Hは、 4-1を用いて作製したサンプルの結果である。 また、 A及び Eは細胞を沈着性アルカリホスファタ一ゼ基質 （BCIP) で染色したもので ある。 B及び Fは、 細胞を 0.05%EDTAを用いて剥がした後、 残った細胞外基質を BCIPで染色した結果である。 C及び Gは、 細胞を 0.05%EDTAを用いて剥がした 後、 残った細胞外基質に可溶性アルカリホスファタ一ゼ基質 （PNPP) を加えて発 色させたときの結果である。 D及び Hは、従来行われていたように、細胞培養液（培 養上清） に PNPPを加え発色反応させたときの結果である。
紫色に染まった箇所がアルカリホスファタ一ゼ活性部位、 すなわち 4-1の沈着部 位である （E )。 図 2 E及び Fの結果から、 4-1は細胞及び細胞外基質に沈着した ことが分かる。 これに対し、 Del-l minorは、 細胞及び細胞外基質のいずれにも沈 着しなかった （A，B)。
同様に、 4-1を用いたときは、 細胞外基質は可溶性基質である PNPPによって黄 色に染色されたのに対し (G)、Del_l minorを用いたときは全く染色されなかった (C)。 また、 細胞培養液に PNPPを加え発色反応を行なった場合において、 Del-l minor を用いたときは培養液が黄色に染色されたのに対し (D)、 4-1を用いたときは発色し なかった (H)。 従って、 4-1は細胞外基質に沈着し、 Del-l minorはほとんど沈着し なかったことが分かる。
ところで、 本発明においては、 図 2 Gに示すように可溶性アルカリホスファタ一 ゼを用いて基質を発色させることにより、 そのまま吸光度計などを用いて細胞外基 質中のアル力リホスファターゼ活性を測定することができる。
そこで、 Del-l部分断片 （4-1) 及び全長 Del-lについて、 細胞外基質内及び培養 上清中のアルカリホスファターゼ活性を測定し、 両者を比較したところ、 Del-l 部 分断片 （4-1) は全長 Del-lより 2.5倍も基質への沈着活性が高かった。
(3) 実施例 1で作製した Del-l部分断片のうち、 配列番号 1 7で示す切断型 Del'l 遺伝子配列 （XY) とアルカリホスファタ一ゼ遺伝子とを連結した DNA (AP/XY) を導入したマウスの肝臓と、その対照として、アルカリホスファターゼ遺伝子（AP) のみ導入したマウスの肝臓を調製した。 遺伝子導入から 2 4時間後に、 各肝臓から 血漿と肝組織を採取して、 アルカリホスファターゼ活性を測定した。
ここで、遺伝子導入効率を標準化するため、ベータ一ガラクトシダーゼ遺伝子を、 前記 AP/XYまたは APと同時に導入し、アルカリホスファターゼ活性と共にベータ 一ガラクトシダーゼ活性も測定した。 そして、 測定されたべ一夕一ガラクトシダー ゼ活性をベータ一ガラクトシダーゼ活性の値で割った商を測定値 （AP/Lac 比） と した。 また、 アルカリホスファタ一ゼ遺伝子 （AP) のみを導入したマウスの肝臓か ら採取した血漿または肝組織の AP/Lac比を 「 1」 とした場合の、 XYとアル力リホ スファタ一ゼ遺伝子とを連結した DNA (AP/XY) を導入したマウスの肝臓から採 取した血漿または肝組織中の AP/Lac比をグラフに示した。 図 3は各肝臓から採取 した血漿中の AP/Lac比を示したものであり、 図 4は各肝臓から採取した肝組織中 の AP/Lac比を示したものである。
肝組織中の AP/Lac比に関しては、 AP/XYを導入した肝臓から採取した肝組織の 方が、 APのみを導入した肝臓から採取した肝組織に比べて約 8倍の AP/Lac比を示 した （図 4 )。 これに対し、 血漿中の AP/Lac比に関しては、 AP/XYを導入した肝 臓から採取した血漿では、 AP活性がほとんど検出されなかったため、 その AP/Lac 比もほとんど 0であった。
(4) (3)で調製した、 AP/XY を導入したマウスの肝臓から肝組織の凍結切片を 3つ 作製した （B, E, F)。 同様に、 APのみ導入したマウスの肝臓から肝組織の凍結切 片をそれぞれ 3つ作製した （A， C, D) D
図 5は、 各肝臓から採取した肝組織の凍結切片を用いてアル力リホスファターゼ 染色 （A，B, C, E) と /3ガラクトシダーゼ (D, F)による染色を示す図である。 Aと B は 40倍、 C, D, E, Fは 200倍の倍率での観察である。 AP(A)に対し、 AP/XY(B)が 著明に沈着していることがわかる。 C, Dと E, Fはそれぞれ連続切片であり、'ァ ルカリホスファターゼ染色と j3ガラクトシダーゼ染色の両方で染色した。 AP(C, D) でも AP/XY(E， F)同様に ;8ガラクトシダーゼ染色 (D, F)で染まっており、 遺伝子導 入効率に差がないことがわかる。 (5) 次に、 ウェスタンプロット法を用いて、 全長 Del-1および実施例 1で作製した Del-1部分断片である XYを検出した。具体的には、下記の 3種の遺伝子を用意し、 各遺伝子を cos7細胞に導入した。
(i) 配列番号 1で示す全長 Del-1遺伝子配列 （Del-1 major) とアル力リホスファ タ一ゼ遺伝子とを連結した DNA (AP/Del-l)
(ii)配列番号 1 7で示す切断型 Del-1遺伝子配列 （XY) とアルカリホスファタ一 ゼ遺伝子とを連結した DNA (AP/XY)
(iii) また、 その対照として、 アルカリホスファターゼ遺伝子のみ （AP) と遺伝 子を導入していない （NC) cos7細胞も用意した。
次に、 前記 4種の cos7細胞をそれぞれ 7 2時間培養し、 培養液 （medium) と細 胞外基質 （ECM) を採取してウェスタンブロットを行った。 コントロールとしてラ ミニン （Laminin) とアルブミン （Albmin) を用いた。
図 6は、 ウェスタンプロット法による電気泳動を示す写真である。 ラミニンをコ ントロールとして用いた電気泳動を示す写真が上段に、 アルブミンをコントロール として用いた電気泳動を示す写真が下段に配置されている。
図 6によれば、 AP のみを導入した cos7 細胞では、 遺伝子を導入されていない (NO cos7細胞と同様、 細胞外基質にアルカリホスファタ一ゼの組換えタンパク 質が検出されなかったが、 培地では前記組換えタンパク質が検出された。 これに対 し、 AP/Del-lまたは AP/XYを導入した cos7細胞では、細胞外基質においてアル力 リホスファタ一ゼの組換えタンパク質が高度に検出された。
〔実施例 3〕 目的分子の回収
本実施例は、 アル力リホスファ夕一ゼを目的遺伝子の発現産物として回収した例 を示すものである。 アルカリホスファタ一ゼの回収は、 アルカリホスファタ一ゼの 基質との発色反応により検出を行うことで確認した。
アル力リホスファターゼ遺伝子と切断型 Del-1遺伝子配列 (4-1)を連結した DNA を導入した cos7細胞と、 対照として、 野生型 C0S7細胞およびアルカリホスファタ —ゼ遺伝子のみ導入した cos7細胞を調製した。
それらの細胞を 3日間培養した後に、 0.05%EDTA溶液で細胞を取り除き、 スク レーパーで底面の細胞外基質を回収した。 回収したサンプルを遠心器にかけて、 遠 心の後の上清を取り除くことによってペレットを作製した後、 実施例 2 (図 3 B，F) と同様の操作を行いアルカリホスファタ一ゼの基質である BCIPを加えて発色させ た。
結果を図 7に示す。 図 7において、 （a)は野生型 cos7細胞、 （b)はアルカリホスフ ァターゼ遺伝子のみを導入した cos7細胞、 （c)は 4-1部分断片とアルカリホスファ 夕ーゼ遺伝子を連結した融合遺伝子を導入した cos7細胞の結果である。図 4に示し たように、 Del-l部分断片 （4-1) を導入したサンプル (c)ではペレットが濃青紫に染 色された。 これによつて、 不溶性の細胞外基質に Del-l部分断片 （4-1) を介してァ ルカリホスファターゼが回収されたことがわかった。 これに対し、 対照ではほとん ど発色しなかったことから、 アルカリホスファタ一ゼはほとんど回収されないこと が示された。 産業上の利用可能性
本発明の Del-l部分断片を用いることによって、 目的分子を細胞外基質や人工素 材に効率的に沈着させることができ、 また当該沈着によって、 目的分子を回収又は 除去に用いることができる。 本発明により Del-l部分断片を用いて目的分子を細 胞外基質上に沈着させ、 血漿への流出を高度に防止することができるため、 本発明 の Del-1部分断片と当該目的分子とを有する融合タンパク質は、 副作用の少ないド ラッグデリバリーシステムとして用いることができる。 さらに、 本発明の Del-l部 分断片を用いて沈着活性を調整することによって、 当該目的分子の局所における濃 縮や限局の程度を高度にコントロールすることができ、 極めて高機能なドラッグデ リバリーシステムとして用いることができる。

Claims

請求 の 範 囲
1 . 以下の （a)又は (b)のタンパク質。
(a) 配列番号 1 8若しくは 2 4に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質 5 (b) 配列番号 1 8若しくは 2 4に示されるアミノ酸配列において 1若しくは数個 のアミノ酸が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、 かつ、 細胞 外基質への沈着活性を有するタンパク質
2 . 以下の （a)又は (b)のタンパク質。
(a) 配列番号 6、 8、 1 0、 1 2、 1 8若しくは 2 4に示されるアミノ酸配列か 10 らなるタンパク質
(b) 配列番号 6、 8、 1 0、 1 2、 1 8若しくは 2 4に示されるアミノ酸配列に おいて 1若しくは数個のァミノ酸が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配 列からなり、 かつ、 細胞外基質への沈着活性を有するタンパク質
3 . 以下の （a)又は (b)のタンパク質。
15 (a) 配列番号 1 4に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質
(b) 配列番号 1 4に示されるァミノ酸配列において 1若しくは数個のアミノ酸が 欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、 かつ、 細胞外基質への沈 着を抑制する活性を有するタンパク質
4 . 以下の （a)又は (b)のタンパク質をコードする遺伝子。
20 (a) 配列番号 1 8若しくは 2 4に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質
(b) 配列番号 1 8若しくは 2 4に示されるアミノ酸配列において 1若しくは数個 のアミノ酸が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、 かつ、 細胞 外基質への沈着活性を有するタンパク質
5 . 以下の （a)又は (b)のタンパク質をコードする遺伝子。
（a) 配列番号 6、 8、 1 0、 1 2、 1 8若しくは 2 4に示されるアミノ酸配列か らなるタンパク質
(b) 配列番号 6、 8、 1 0、 1 2、 1 8若しくは 2 4に示されるアミノ酸配列に おいて 1若しくは数個のァミノ酸が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配 列からなり、 かつ、 細胞外基質への沈着活性を有するタンパク質
6 . 以下の （a)又は (b)のタンパク質をコードする遺伝子。
(a) 配列番号 1 4に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質
(b) 配列番号 1 4に示されるァミノ酸配列において 1若しくは数個のァミノ酸が 欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、 かつ、 細胞外基質への沈 着を抑制する活性を有するタンパク質
7 . 以下の (a)又は (b)の DNAを含む遺伝子。
(a) 配列番号 1 7若しくは 2 3に示される塩基配列を含む DNA
(b) 配列番号 1 7若しくは 2 3に示される塩基配列からなる DNA に対し相補的 な塩基配列を含む DNA とストリンジェントな条件下でハイプリダイズし、 か つ、 細胞外基質への沈着活性を有するタンパク質をコ一ドする DNA
8 . 以下の (a)又は (b)の DNAを含む遺伝子。
(a) 配列番号 5、 7、 9、 1 1、 1 7若しくは 2 3に示される塩基配列からなる DNA
(lo) 配列番号 5、 7、 9、 1 1、 1 7若しくは 2 3に示される塩基配列からなる DNAに対し相補的な塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件下でハ イブリダィズし、 かつ、 細胞外基質への沈着活性を有するタンパク質をコード する DNA
9 . 以下の (a)又は (b)の DNAを含む遺伝子。
(a) 配列番号 1 3に示される塩基配列を含む DNA
(b) 配列番号 1 3に示される塩基配列からなる DNA に対し相補的な塩基配列を 含む DNA とストリンジェントな条件下でハイブリダィズし、 かつ、 細胞外基 質への沈着を抑制する活性を有するタンパク質をコードする DNA
1 0 . 請求項 4〜 9のいずれか 1項に記載の遺伝子を含む組換えベクター。
1 1 . 請求項 1 0記載の組換えベクターを含む形質転換体。
1 2 . 請求項 1 1記載の形質転換体を培養し、 得られる培養物から Del-lタンパク 質の部分断片を採取することを特徴とする Del-l部分断片の製造方法。
1 3 . 請求項 1〜3のいずれか 1項に記載のタンパク質と細胞外基質とを反応させ ることにより、 前記タンパク質が前記細胞外基質に沈着する部位を同定する方 法。
1 4 . 請求項 1〜 3のいずれか 1項に記載のタンパク質を含む、 細胞外基質沈着部 位同定用試薬。
1 5 . 請求項 1〜3のいずれか 1項に記載のタンパク質と発現の目的分子とが連結 した融合タンパク質。 '
1 6 . 請求項 1 5記載の融合タンパク質を含有する薬物送達システム。
1 7 . 請求項 4〜 9のいずれか 1項に記載の遺伝子と、 発現の目的分子をコードす る遺伝子とが連結された、 融合タンパク質をコードする遺伝子。
1 8 . 請求項 1 7記載の遺伝子を含む組換えベクター。
1 9 . 請求項 1 8記載の組換えべクタ一を含む形質転換体。
2 0 . 請求項 1 9記載の形質転換体を培養し、 得られる培養物から Del-lタンパク 質の部分断片と発現の目的分子との融合タンパク質を採取することを特徴とす る該融合夕ンパク質の製造方法。
2 1 . 請求項 1 5記載の融合タンパク質を細胞外基質に沈着させ、 目的分子を採取 することを特徴とする目的分子の回収方法。
2 2 . 目的分子を沈着させる方法であって、 以下の工程：
(a) 請求項 1 9記載の形質転換体を培養することによって、 発現の目的分子と Del-lタンパク質の部分断片との融合タンパク質を生産させる工程、 及び (b) 前記融合タンパク質を細胞外基質に沈着させる工程
を含む前記方法。
2 3 . 目的分子を回収する方法であって、 以下の工程：
(a) 請求項 1 9記載の形質転換体を培養することによって、 発現の目的分子と Del-lタンパク質の部分断片との融合タンパク質を生産させる工程、
(b) 前記融合タンパク質を細胞外基質に沈着させる工程、 及び
(c) 前記融合タンパク質から目的タンパク質を切断することによって、 前記目的 分子を採取する工程
を含む前記方法。
. E列番号 2に示されるアミノ酸配列のうち、 活性中心領域と陽性調節領域と を含む断片、 及び/又は活性中心領域と陰性調節領域とを含む断片を細胞外基質 と反応させることを特徴とする、 細胞外基質への沈着活性を調節する方法。 . 活性中心領域のアミノ酸配列が配列番号 4に示されるものである請求項 2 4 記載の方法。
. 陽性調節領域のアミノ酸配列が配列番号 2 0に示されるものである請求項 2 4記載の方法。
. 陰性調節領域のアミノ酸配列が配列番号 2 2に示されるものである請求項 2 4記載の方法。
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