MXPA96006218A - Cinasa de tirosina receptora de flt4 y su uso endiagnostico y terapia - Google Patents

Abstract

Los anticuerpos de anti-FLT4, especialmente anticuerpos monoclonales de anti-FLT4, que sonútiles como un marcador específico para células endoteliales de vasos linfáticos y HEVs, como una herramienta de diagnóstico para detectar cambios en el tejido linfático, especialmente en vasos linfáticos y HEVs en estados de enfermedad, tales como linfangioma, nódulos linfáticos metastásicos y enfermedades inflamatorias, infecciosas e inmunológicas.

Description

CINASA DE TIROSINA RECEPTORA DE FLT4 Y SU USO EN DIAGNÓSTICO Y TERAPIA CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere en general a cinasas de tirosina receptora, sondas de ácido nucleico y anticuerpos que reconocen específicamente tales receptores, y el uso de tales sondas y anticuerpos para identificar vasos linfáticos y altas vénulas endoteliales (HEV) en tejidos animales y humanos y células endoteliales linfáticas en cultivos. Más específicamente, la presente invención se dirige a anticuerpos específicos para FLT4, una cinasa de tirosina receptora, y a métodos para identificar la expresión de FLT4 en vasos linfáticos y finalmente diagnosticar y tratar estados de enfermedad en animales y humanos que involucran cambios en el tej ido linfático, tal como enfermedades inflamatorias, infecciosas e inmunológicas, nodulos linfáticos metastásicos y linfangiomas . ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La fisiología del sistema vascular, vasculogénesis embriónica y angigénesis, coagulación sanguínea, curación de heridas y reproducción, así como enfermedades severas, involucran que el endotelio vascular cubra los vasos sanguíneos. El desarrollo del árbol vascular ocurre a través de angiogénesis y, de acuerdo a algunas teorías, la formación del sistema linfático se inicia poco después del desarrollo arterial y venoso mediante el brote de las venas(1'2). Después del periodo fetal, las células endoteliales proliferan muy lentamente, excepto durante la angiogénesis asociada con la neovascularización. Los factores de crecimiento que estimulan la angiogénesis ejercen sus efectos a través de cinasas de tirosina receptoras de superficie celular endotelial específica. El producto proteínico de la cinasa de tirosina receptora de FLT4 de cADN, clonada a partir de una línea celular de eritroleucemia humana es N-glicosilada y contiene siete ciclos similares a la inmunoglobulina en su dominio extracelular . El dominio de cinasa de tirosina citoplásmica de FLT4 es aproximadamente 80% idéntico al nivel aminoácido con los dominios correspondientes de FLT1 y KDR y aproximadamente 60% idéntico con los receptores para el factor de crecimiento derivado de la plaqueta, factor-1 de estimulación de la colonia, factor de célula de tallo y el receptor'3' de FLT3. Aunque la función biológica de FLT4 se desconoce aún, su patrón de expresión restringido indica que sus funciones pueden involucrar al endotelio vascular. Nuestros resultados previos revelaron la expresión de mARN de FLT4 en células endoteliales en el desarrollo de vasos de varios órganos fetales según se expone por Kaipainen y Cois, en J. Ex. Med. 178:2077-2088, 1993. Una comparación de señales de mARN receptoras de FLT4, FLT1, y KDR/FLK-1 mostró sobreposición, pero distintos patrones de expresión en los tejidos estudiados (4) . Estos datos sugirieron que las cinasas de tirosina receptoras codificadas mediante esta familia de genes puede tener distintas funciones en la regulación del desarrollo y/o diferenciación de vasos sanguíneos . Una función principal del sistema linfático es proporcionar retorno fluido de los tejidos y transportar muchas substancias extravasculares de regreso a la sangre. Además, durante el proceso de maduración, los linfocitos abandonan la sangre, migran a través de los órganos linfoides y otros tejidos, y entran a los vasos linfáticos, y regresan a la sangre a través del conconducto torásico.

Las vénulas especializadas, vénulas endoteliales altas, (HEVs) enlazan los linfocitos nuevamente y provocan su extravasación en tejidos. Los vasos linfáticos y especialmente los nodulos linfáticos juegan así un papel importante en la inmunología y son también sitios de desarrollo de metástasis de tumores diferentes. A partir del siglo veinte, se han presentado tres diferentes teorías concernientes al origen embriónico del sistema linfático. Sin embargo, antes de la presente invención, los vasos linfáticos han sido difíciles de identificar, debido a que no existen marcadores específicos disponibles para ellos. Los vasos linfáticos son más comúnmente estudiados con la ayuda de linfografía. En la linfografía, un medio de contraste por rayos X se inyecta directamente en un vaso linfático. Ese medio de contraste se distribuye a lo largo de los vasos de drenaje eferentes del sistema linfático. El medio de contraste se recolecta en nodulos linfáticos, donde permanece por más de medio año, durante cuyo tiempo el análisis de rayos X permite el seguimiento de tamaño y arquitectura del nodulo linfático. Este diagnóstico es especialmente importante en pacientes de cáncer con metástasis en los nodulos linfáticos y en las malignidades linfáticas, tal como linfoma. SUMARIO DE LA INVENCIÓN La presente invención se dirige a péptidos de FLT4 y otras construcciones y al uso del FLT4 como un marcador específico para células linfáticas endoteliales. La invención también se dirige a sondas de ácido nucleico y anticuerpos que reconocen específicamente el FLT4, especialmente a anticuerpos monoclonales, y composiciones que contienen tales anticuerpos. Se expone además en la presente solicitud el uso de tales anticuerpos monoclonales con propósitos de diagnóstico para detectar y medir la cantidad de receptores de FLT4 en tejidos, especialmente en tejidos linfáticos y en células endoteliales linfáticas. En una modalidad preferida, la invención proporciona anticuerpos monoclonales que reconocen específicamente al receptor de FLT4. De manera más específica, esta invención proporciona un anticuerpo monoclonal designado 9D9F9. La línea celular de hibridoma que produce el anticuerpo monoclonal 9D9F9 se deposita con la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM) bajo las provisiones del Tratado de Budapest (número de acceso DSM ACC2210) . Los anticuerpos monoclonales etiquetados con un marcador detectable también se proporcionan. Según se utiliza en la presente, el término marcador detectable abarca cualquier marcador detectable conocido por aquel experto en la materia. Sin embargo, en una modalidad preferida de esta invención, el marcador detectable se selecciona del grupo que consiste de radioisótopos, fluorocromos, tinturas, enzimas y biotina. Para el propósito de esta invención los radioisótopos adecuados incluyen pero no se limitan a 1 i y 131| . Los anticuerpos monoclonales de la presente invención también pueden utilizarse en un método para detectar la presencia de receptores de FLT4 en una muestra celular, que comprende las etapas de exponer una muestra celular a un anticuerpo monoclonal de la presente invención y detectar el enlace de dicho anticuerpo monoclonal a receptores de FLT4. Otro aspecto de la presente invención se refiere así a un método para determinar la presencia de receptores de FLT4 en una muestra celular, que comprende las etapas de: (a) exponer una muestra celular a un anticuerpo monoclonal de la presente invención; (b) detectar el enlace de dicho anticuerpo monoclonal a los receptores de FLT4. La exposición de una mezcla celular a los anticuerpos monoclonales de la invención pueden ser en solución, como es el caso para la selección celular activada por fluorescencia, o puede encontrarse en especímenes de tejido sólido, tal como material de biopsia, o puede encontrarse con el anticuerpo monoclonal inmovilizado sobre un soporte sólido, como es el caso con la cromatografía de columna o adherencia inmune directa. La mezcla de células que están por exponerse al anticuerpo monoclonal pueden ser cualquier solución de células sanguíneas o células de tejido. Preferentemente, la mezcla celular es desde tejido normal o patológico que contiene o es sospechoso de contener células endoteliales linfáticas.

Después de la exposición de la mezcla celular al anticuerpo monoclonal, aquellas células con receptores de FLT4 se enlazarán al anticuerpo monoclonal para formar un complejo receptor de anticuerpo-FLT4. La presencia del complejo receptor de anticuerpo-FLT4, y por consiguiente de los receptores de FLT4, puede detectarse mediante métodos conocidos en la materia. Estos métodos incluyen métodos inmunohistoquímicos estándares en la materia, tal como inmunofluorescencia, análisis de FACS, ELISA, IRMA (un tipo emparedado de ensayo inmunoquímico) , inmunohisto-química, RÍA utilizando la etiqueta 125| y la autoradiografía. La presente invención también proporciona anticuerpos monoclonales conjugados con un agente imaginable. Según se utiliza en la presente, el término agente imaginable incluye, pero no se limita a, radioisótopos. Un radioisótopo preferido es tecnetio-99m. En una modalidad específica la invención se dirige a un método para monitorear vasos linfáticos y sus células endoteliales en muestras de tejido y en organismos. La presente invención proporciona además métodos de detección clínica que describen el estado del tejido linfático, especialmente vasos linfáticos (inflamación, infección, traumas, crecimiento, neoplasia, etc.) y métodos para detectar vasos linfáticos y así vascularización linfática en un organismo.

De manera más específica, la presente invención proporciona un método para detectar e identificar cambios linfáticos caracterizados por la expresión de FLT4 en conexión a cánceres metastásicos, condiciones inflamatorias, infecciosas e inmunológicas, cuyo método comprende las etapas de: (a) obtener un tejido y/o muestra de fluido corporal sospechoso de cambios linfáticos, y (b) contactar dicha muestra con un anticuerpo monoclonal específico de FLT4 bajo condiciones adecuadas para formar un complejo entre el anticuerpo monoclonal y el antígeno, y (c) detectar la presencia de cualquier complejo formado. Un tejido que puede detectarse mediante éste método es cualquier tejido de tumor sólido canceroso o precanceroso normal con células linfáticas que contienen FLT4 o células que expresan el receptor de FLT4. En una modalidad de la presente invención, el anticuerpo monoclonal es etiquetado con un marcador detectable según se describe en la presente, los métodos de la invención son útiles para detectar y diferenciar diversas formas de cáncer, especialmente metástasis en los nodulos linfáticos y otras malignidades linfáticas, tal como linfornas, así como linfangiomas .

También se proporciona mediante ésta invención un método para representar la presencia de vasos linfáticos, vénulas endoteliales altas o nodulos linfáticos en pacientes humanos. Este método comprende la administración de anticuerpos etiquetados y la detección mediante la representación en sitios donde se presenten las células que expresan FLT4, en vasos linfáticos o nodulos linfáticos. La invención se dirige además a un método para estimular o antagonizar la función de FTL4 en vascularización linfática y en condiciones inflamatorias, infecciosas e inmunológicas, comprendiendo dicho método la inhibición de la vascularización linfática mediada por FLT4 al proporcionar cantidades de un compuesto de enlace FLT4 suficiente para bloquear los sitios celulares endoteliales de FLT4 que participan en tal reacción, especialmente donde la función del FLT4 se asocia con una enfermedad tal como cánceres metastásicos, linfornas, inflamación (crónica o aguda) , infecciones y enfermedades inmunológicas . BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Figura 1. Expresión de mARN de FLT4 en tejidos de ratón. A. Hibridización de ARN poliadenilado separado de los tejidos indicados del ratón adulto. El tamaño de la banda de mARN de FLT4 está dado en kilobases. B. Análisis de protección de la ARNasa del ARN separado de los embriones de ratón de diversas edades gestacionales (E8-E18) y de un ratón recién nacido (1 día) . La muestra de E8 + P contiene también la placenta. El tamaño de la sonda y el fragmento de FLT4 protegido se dan en nt; la ß-actina se utilizó con un control. Figura 2. Expresión de mARN de FLT4 en un embrión de 7.5-, 8.5- y 11.5-días p.c. Se muestran fotomicrografías con fondo obscuro y con fondo brillante de autoradiogram s in si tu . Ninguna expresión de mARN de FLT4 podría detectarse en un embrión de 7.5 días (A). La expresión de FLT4 de un embrión de ratón de 8.5-días de p.c. se muestra en (B) y (C) . Las flechas señalan hacia las células positivas de FLT4 en el endotelio de la vena cardinal posterior (cv) , en la alantoides (al) en (B) y en angioblastos (ab) de la mesenquima de corazón en (C) . En una placenta de 8, 5-días de p.c. las transcripciones de FLT4 pueden observarse en células endoteliales de laguna venosa (vi) (D) . Los paneles E y F muestran una comparación de las señales de hibridización de FLT4 y Enlace en embriones de 11.5-días p.c. La región de la aorta dorsal en desarrollo y la metamefrosis (mn) se muestra (20x) . Obsérvese que la aorta dorsal es negativa para FLT4, pero positiva para mARN de Enlace, siempre y cuando ambas sondas se hibridizan con el endotelio de la vena subendocardial (sv) . También, la sonda de FLT4 da una señal proveniente de la vena metanéfrica (v) , siempre y cuando el Enlace se hibridice con las capilaridades metanéfricas (flechas, c) . da: aorta dorsal, ng: ranura neural. Escala bar: 30 µm. Figura 3. Expresión de mARN de FLT4 en un embrión de 12.5 días p.c. Se muestra una sección sagital a través del plano axilar. Obsérvese que el mARN de FLT4 es prominente en vasos dilatados de la axila (ax) , en un patrón similar a un plexo en la región periorbital (po) , en el tejido paravertebral (puntas de flecha) y en el tejido subcutáneo (se). b:cerebro, li:hígado. Escala bar: 5 µm. Figura 4. FLT4 en embriones de 14 y 16.5 días p.c. Los paneles A y B muestran representaciones con brillo y con fondo obscuro de una sección media sagital . po:región periorbital, lj :maxilar inferior, ne:región del cuello, sc:subcutis, mt :mesenterio, ao: aorta, dt : conconducto torásico. (C) muestra una sección transversal de un embrión de 16.5 días en tinte de hematoxilina-eosina. th:timo, tr: traquea, e: esófago, ca: arteria carótida, ba: arteria braquiocefálica, dt : conconducto torásico. (D) muestra una mayor amplificación (40x) de la región de conductos torásicos,-los granos autoradiográficos pueden observarse sobre las células endoteliales. También el vaso pequeño (v) en la parte superior de la fotografía es positivo. Escala bar: 10 µm (A-C) , lµm (D) .

Figura 5. Comparación de FLT4 y expresión de mARN de Enlace en células endoteliales cultivadas. Análisis microvascular de la mancha Northern de ARN poliadenilada de prepucio humano (MV) , vena femoral (VE) , células endoteliales de vena aórtica (AO) y umbilical (HU) . Para una comparación, se muestra la señal de hibridización del mARN de cinasa de tirosina receptora de Enlace. Las bandas resultantes del enlace no específico de la sonda al ARN ribosomal se marcan con asteriscos. Figura 6. FLT4 en vasos linfáticos de humano adulto del mesenterio (A, B) , pulmón (C, D) , y amígdala (E, F) . Obsérvese que sólo los vasos linfáticos en A y C dan una señal de FLT4, siempre y cuando las venas, capilares y las arterias sean negativos para mARN de FLT4. En la amígdala, la señal se encuentra en el endotelio de algunos HEVs. Escala bar: 200 µm . Figura 7. mARN de FLT4 en nodulo linfático normal (A, B) y metastásico (C, D) y en linfangioma (E-G) . Las cabezas de las flechas marcan los senos linfáticos y los HEVs, los cuales son FLT4 positivos. Una comparación del FLT4 y las señales del factor de von Willebrand muestra ambos en el endotelio linfático, pero sólo a la señal del factor de von Willebrand en el endotelio capilar (c) y venoso (v) . Escala bars: 10 µm (A-D) y 100 µm (E-G) . Figura 8. Expresión de FLT4 en vasos mesenteriales fetales detectados por teñido de inmunoperoxidasa . Las secciones se tiñeron con anticuerpos (A) , de anti-FLT4 purificados por afinidad, con antisuero (B) bloqueado con antígeno y con suero preinmune (C) y con 5 antisuero específico contra el antígeno relacionado con el factor VIII (D) . Obsérvese que el tinte se confina a algunos, pero no a todos los vasos (v) . Escala bar, 0.05 mm. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN ?o Reconociendo la importancia de identificar cambios en tejidos linfáticos, especialmente en nodulos linfáticos en conexión con cánceres metastásicos y estados de enfermedad inmunológicos, los presentes inventores han mostrado que el FLT4 es un marcador específico que detecta el endotelio de vaso linfático y por consiguiente es útil /". como un marcador para cambios linfáticos en estados patológicos en el hombre. Los presentes inventores han mostrado anteriormente que el patrón de expresión de FLT4 en comparación con el FLTl y KDR difiere enormemente en tejidos de fetos <4) humanos de 18 semanas de edad. Con objeto de entender el papel del FLT4 durante el desarrollo, los inventores clonaron cADNs parciales para FLT4 de ratón. Utilizando éstas pruebas en hibridización in si tu, la expresión de mARN de FLT4 durante el desarrollo del ratón se analizó y se encontró que el FLT4 se expresa durante la vasculogénesis y angiogénesis del sistema linfático. La relevancia de estos hallazgos también se confirmó en tejidos normales patológicos de un adulto humano, ya que el FLT4 se encontró en células endoteliales linfáticas de tejidos de adulto humano en condiciones tanto normales como patológicas, así como en algunas vénulas endoteliales altas (HEVs) . La clonación de los fragmentos de cADN de FLT4 de ratón mostró que su secuencia aminoácida deducida es casi idéntica con la secuencia humana correspondiente (identidad aminoácida de aproximadamente el 96% en ambos segmentos estudiados) . Se obtuvo evidencia adicional para la identidad del cADN de FLT4 de ratón a partir de la hibridización Northern donde las sondas de ambas especies produjeron la señal típica de mARN de 5.8 kb de los tejidos de ratón. El análisis de ARN aislado de los diversos tejidos de ratón adulto mostró la expresión del FLT4 en el hígado, pulmón, corazón, bazo e hígado, con nula o muy poca hibridización en el cerebro y los testículos. Este patrón es similar al patrón reportado anteriormente por Galland y Cols.(5). Los resultados de la protección de la RNasa sugirieron que el gen FLT4 se necesita durante el desarrollo del ratón, iniciando desde los embriones de 8.5 días p.c., y los niveles de expresión relativos aparecieron bastante estables. Para la hibridización in si tu se seleccionaron dos fragmentos de cADN de FLT4 de ratón, los cuales codifican secuencias del dominio extracelular . Esto permitió una clara distinción del patrón de hibridización del FLK-l relacionado y los patrones receptores FLT-1, los cuales mostraron sólo un muy bajo grado de identidad de secuencia con el FLT4 en la región extracelular(6,7,8,9> . El FLT4, de manera similar al FLK-l, FLT-1, el Enlace y los genes de cinasa de tirosina receptora endotelial Tek no se expresaron en embriones de 7.5 días p.c. En un embrión de 8.5 días p.c, las señales de FLT4 más fuertes se localizaron en la alantoides, los angioblastos del mesénquima superior y la vena cardinal. En contraste, la aorta dorsal, el endocardio del corazón y los angioblastos del saco vitelino fueron negativos, a diferencia del Enlace, Tek, FLK-l y FLT-1, Enlace y Tek(10,8). La restricción de la expresión de FLT4 para el sistema venoso fue aún más clara en muestras de embriones de ratón de 11.5 días, donde el mARN de Enlace se expresó también en las arterias. En los embriones de 12.5 días p.c. la señal de FLT4 decoró venas en desarrollo y el endotelio linfático presunto, pero a diferencia para la cinasa de tirosina receptora de Enlace endotelial, el endotelio arterial fue negativo. Durante etapas posteriores de desarrollo, el mARN de FLT4 se restringió a plexos vasculares exentos de células sanguíneas, que representan vasos linfáticos en desarrollo. Sólo el endotelio linfático y algunas vénulas endoteliales altas expresaron mARN de FLT4 en tejidos de humano adulto. La expresión incrementada apareció en los senos linfáticos y vénulas endoteliales altas en nodulos linfáticos metastásicos y en linfangioma. Debido a las dificultades en la interpretación de datos de embriones de ratón, se estudió el endotelio humano, debido a que el sistema linfático está mucho mejor definido en humanos. También, las células establecidas a partir de diversos endotelios podrían estudiarse en cultivo celular para ver si la especificidad de la expresión de FLT4 persiste en condiciones in vi tro . Se sabe que las líneas de células endoteliales pierden características diferenciadas después del cultivo in vitro. Por consiguiente, no se esperaba que fueran negativos para FLT4. Las células endoteliales aórticas cultivadas también se encontraron exentas de mARN de FLT4. Sin embargo, las señales se obtuvieron de células endoteliales humanas desarrolladas a partir de la microvasculatura y a partir de las venas femoral y umbilical. De esta manera, al menos algo de la especificidad de la expresión de FLT4 se retuvo en el cultivo celular. El análisis de hibridización in si tu de los tejidos de humano adulto confirmó la restricción de FLT4 al sistema linfático observado en los embriones de ratón en desarrollo. La expresión del FLT4 se observó en el endotelio linfático y en los senos de nodulos linfáticos humanos. De manera interesante, también algunos de los HEVs, los cuales tienen un endotelio cuboidal, mostraron funcionar en el tráfico de leucocitos hacia los nodulos linfáticos, donde FLT4 es positivo. Además, un análisis de hibridización paralela mostró que los niveles de mARN de FLT4 mejoraron en estas estructuras en metastásica en comparación con los nodulos linfáticos normales. El FLT4 también fue muy prominente en linfangiomas, los cuales son tumores benignos compuestos de canales linfáticos alineados al endotelio, en desarrollo y de tejido conectivo de estroma. El mARN de FLT4 se restringió al endotelio linfático de estos tumores y se ausentó de sus arterias, venas y capilares . En el pulmón humano fuimos capaces de identificar estructuras linfáticas, las cuales fueron los únicos vasos positivos de FLT4 en este tejido. Los resultados anteriores sugieren que el FLT4 es un marcador novedoso para vasos linfáticos y algunas vénulas endoteliales altas en tejidos de adulto humano. También apoyan la teoría del origen venoso de los vasos linfáticos. El FLT4, como un receptor del factor de crecimiento, puede involucrarse en la diferenciación y funciones de estos vasos . Estos resultados, combinados con los compuestos de enlace de FLT4 de acuerdo a la presente invención, permiten un etiquetado selectivo del endotelio linfático, especialmente al utilizar anticuerpos de la presente invención acoplados a substancias radioactivas, densas en electrones u otras informadoras, que puedan visualizarse. Puede ser posible inyectar en el sistema linfático substancias, que contienen anticuerpos monoclonales que inducen la internación del receptor de FLT4, y transporta mediante ésto moléculas predefinidas en el endotelio linfático. También, es posible utilizar tales compuestos de enlace de FLT4 de acuerdo a la invención para la detección de vénulas endoteliales altas, especialmente HEVs activadas, los cuales expresan niveles mejorados del receptor del FLT4. Según sabemos, ninguno de tales marcadores específicos se encuentra actualmente disponible para el endotelio linfático. Los siguientes ejemplos se dan meramente para ilustrar la presente invención y de ninguna manera para limitar su alcance. EJEMPLOS EJEMPLO 1 Clonación de sondas de cADN de FLT4 de ratón Se seleccionaron aproximadamente 106 placas de , una biblioteca genómica |FIX®| I de un ratón 129SV (Estratogenes) con el fragmento de cADN receptor de FLT4 de humano S2.5 que cubre el dominio extracelular13'. Se subclonó un fragmento Bam Hl de 2.5 kb a partir de una 5 placa positiva y se ordenó en secuencia desde ambos extremos. A partir de esta subclona, la reacción en cadena de polimerasa se utilizó para amplificar y clonar en el pBluescript KSll+/-vector (Estratogenes) un fragmento exon que cubre los nucleótidos 1745-2049 de la secuencia de cADN ?o de FLT4 de ratón'9' . De manera similar se clonó un segundo fragmento que cubre los nucleótidos 1-192. EJEMPLO 2 Análisis del mARN de FLT4 en tejidos de ratón 15 El ARN total se aislo de los embriones en desarrollo (ratón de 8-18 días p.c. y de un día de edad) de acuerdo a Chomczynski y Cois.'11'. La muestra de embriones de 8 días p.c. incluyó también la placenta. Para el análisis de protección de la RNasa, la sonda de ARN se generó a partir del plásmido de FLT4 linealizado, obtenido de acuerdo al Ejemplo 1 utilizando polimerasa [32P] -UTP y T7 para la orientación de antidetección. La sonda de ß-actina utilizada corresponde a los nucleótidos 1188-1279 de la secuencia'12' de ß-actina 25 de ratón publicada. Después de la purificación en un gel de urea de poliacrilamida/7M al 6%, las transcripciones etiquetadas se hibridizaron a 30 µg del ARN total durante la noche a 52 °C. El ARN no hibridizado se digirió con la RNasa A (10 U/ml) y TI (1 µg/ml) a 37°C, pH de 7.5 durante 1 hora. Las RNasas se inactivaron mediante la digestión de proteinasa K a 37 °C durante 15 minutos y las muestras se analizaron en un gel de urea de poliacrilamida/7M al 6%. El patrón de expresión de FLT4 analizado en este experimento mostró que se obtuvieran señales de mARN muy débiles partir del pulmón, hígado, corazón, riñon, músculo esquelético y bazo, siempre y cuando los testículos y el cerebro se encuentren aparentemente sin señal específica (figura 1) . El análisis de una serie de ARNs recolectados durante diferentes fases de desarrollo del ratón mediante ensayo de protección de la RNasa mostró que la mARN de FLT4 se expresó a través de embriogénesis a partir del día 8 p.c. de ratón recien nacido sin grandes variaciones en una intensidad de señal (figura IB) . EJEMPLO 3 Hibridización in si tu para FLT4 en <=»m-.-ri oríes de ratón Para asignar mejor las transcripciones de FLT4 a células y tejidos, se hibridizaron las secciones de embriones de ratón de 7.5 a 8.5 días p.c. con ARNs de FLT4 etiquetados . Los embriones de ratón se derivaron de acoplamientos de ratón CBA y NMRI . El ratón preñado se sacrifico por dislocación cervical y los embriones ya sea que se congelaron inmediatamente o se transfirieron a través de una solución salina regulada por fosfato en paraformaldeído al 4%. Los embriones y órganos del ratón aislados se fijaron durante 18 horas a 4°C, deshidratados, incrustados en parafina y cortaron en secciones de 6 µm. Las sondas de ARN (antidetección y detección) de 192 y 349 nucleótidos (ver Ejemplo 1) se generaron a partir de plásmidos linealizados que utilizan [ S]-UTP. La hibridización in si tu de las secciones se llevó a cabo de acuerdo a Wilkinson y Cois.'13'14), con las siguientes modificaciones: l) en lugar de tolueno, se utilizó xileno antes de la incrustación en cera de parafina, 2) se cortaron secciones de 6 µm, se colocaron sobre una capa de agua tratada con pirocarbonato de dietilo sobre la superficie de portaobjetos de vidrio precalentados con 3-trietoxisililpropilamina al 2%, 3) se omitió la hidrólisis alcalina de las sondas, y 4) el enjuague de alta severidad fue durante 80 minutos a 65 °C en una solución que contiene 30 mM de DTT y 1 x SSC. Las secciones se cubrieron con emulsión NTB-2 (Kodak) y se almacenaron a 4°C. Los portaobjetos se expusieron durante 14 días, se desarrollaron y se tiñeron con hematoxilina. Las hibridizaciones de control con filamento de detección y secciones tratadas con A de RNasa no dieron una señal específica por encima del trasfondo. Como se muestra en las figuras 2A y B, el mARN de FLT4 no se expresó en embriones de ratón de 7.5 días p.c., pero se detectaron señales brillantes en la vena cardinal posterior (cv) el día 8.5 de desarrollo. En contraste, el corazón en desarrollo (dato no mostrado) y la aorta dorsal (da) fueron negativos de FLT4. En los tejidos extraembriónicos, el FLT4 se expresó prominentemente en la alantoides (al en el panel B) , ya que las islas de sangre en desarrollo del saco vitelino fueron negativas (datos no mostrados) . Por otro lado, los angioblastos (ab) del mesénquima superior fueron fuertemente positivos de FLT4 (C) . En la placenta en desarrollo, la señal de FLT4 se observó primero en venas sinusoidales periféricas (datos no mostrados). El día 9.5 p.c. de la placenta, el endotelio de la laguna venosa (vi en D) y las células gigantes se fusionaron parcialmente a la membrana de Reichert (dato no mostrado) expresada como mARN de FLT4. De esta manera, aunque la expresión de FLT4 fue muy prominente en lo precursores celulares endoteliales anteriores, los angioblastos parecían restringirse solamente a ciertos vasos de embriones de 8.5 días p.c. El receptor de Enlace se sabe expresan todas las células endoteliales de embriones de ratón en desarrollo y de esta manera proporciona un marcador para estas células .

Notablemente, en contraste a la sonda de Enlace, la sonda de FLT4 se hibridiza de manera muy débil cuando mucho con endotelios arteriales de embriones de 11.5 días p.c., por ejemplo con el endotelio de la aorta dorsal en desarrollo (da en la figura 2E, F) o las arterias carótidas (datos no mostrados) . En su lugar, la señal de FLT4 fue mucho más prominente en las venas en desarrollo. Por ejemplo, la señal de FLT4 se detectó en las venas que rodean el metanefros en desarrollo (v, sv en E) , mientras el Enlace sondea predominantemente las capilaridades reconocidas (c) dentro del metanefros (F) . Como puede observarse a partir de la figura 3, el mARN de FLT4 se distribuye en varias regiones de un embrión de ratón de 12.5 días p.c., siendo particularmente prominente en el vaso dilatado en la región axilar (ax) . Se observó una estructura de vaso positiva de FLT4 similar en la región media sagital en el área yugular (dato no mostrado) . Un patrón similar al plexo de los vasos que expresan FLT4 apareció en la región periorbital (po) y rodea las vértebras en desarrollo (vb) . También justo más allá de la piel en desarrollo, fue evidente una red vascular positiva de FLT4. Las señales de capilaridad más débil se obtuvieron de diferentes regiones incluyendo el cerebro en desarrollo (b) . El mARN de FLT4 podría detectarse también en vasos pequeños de la región del cuello, de la nariz en desarrollo y en la base de la lengua en desarrollo, así como de la región de la cola (dato no mostrado) . Más allá, el hígado (li) fue fuertemente positivo para el mARN de FLT4 en un patrón similar a una mancha . Durante el desarrollo posterior, el ARN de FLT4 pareció volverse más restringido a ciertos vasos del embrión. Un embrión de 14.5 días p.c. muestra agradablemente este patrón restringido de expresión (figura 4A, B) . En la sección media sagital de la figura 4, la señal más prominente de FLT4 se observa a lo largo de la columna vertebral de desarrollo en su parte interior. Se consideró que esta señal se origina a partir de las células endoteliales del conducto torásico (dt) , el cual es el vaso linfático más grande formado en este momento de desarrollo.

En contraste, la aorta dorsal (da) y la vena cava inferior (vc) fueron negativas. Los vasos dilatados en la región mesentérica también fueron fuertemente positivos para FLT4.

Además, como en los embriones de 12.5 días p.c., las redes de vasos a lo largo de límites anatómicos en lo periorbital (po) , maxilar inferior (lj) así como en la región del cuello (en) contuvieron endotelios positivos de FLT4. Se presentaron estructuras similares en el espacio pericardial y a través de todo el tejido subcutáneo (se) . Notablemente, en contraste con los vasos negativos de FLT4, todos los vasos positivos de FLT4 se encontraron exentos de células sanguíneas en su lumen. Estos patrones de expresión sugieren que el FLT4 se confine al endotelio de vasos linfáticos en este momento de desarrollo. Un sitio adicional donde se observó expresión de FLT4, fue en los sinusoides de la médula ósea en desarrollo (bm) . En los paneles C y D de la figura 4 se muestran fotografías de una sección transversal del tórax superior de un embrión de 16.5 días p.c. hibridizado con la sonda de FLT4. La sección mostrada en C ha sido teñida con hematoxilina-eosina para visualizar los diferentes tipos de vasos en esta área. Esta incluye las arterias caródica y braquiocefálica (ca, ba) , la vena cava (vc) y el conconducto torásico, el cual es más pequeño de tamaño y carece de tejido muscular y conectivo circundante (flecha) . Una amplificación de la región del conconducto torásico se muestra en el panel D, donde los granos autorradiográficos de FLT4 pueden observarse. Las células endoteliales del conducto torásico así como un pequeño vaso (v) en la inmediación se hibridizan con la sonda de FLT4. EJEMPLO 4 Análisis de mARN de FLT4 en células endoteliales de cultivo Los resultados de la hibridización in si tu descritos en el Ejemplo 3, mostraron que el FLT4 se expresa en células endoteliales venosas y más tarde en vasos linfáticos y algunas células endoteliales venosas, pero no en endotelios arteriales. Con objeto de ver si tal regulación se mantiene in vi tro, estudiamos células endoteliales cultivadas utilizando manchado Northern y análisis de hibridización. Las células endoteliales de la aorta humana, vena femoral, vena umbilical y microvasos del prepusio se aislaron, cultivaron y caracterizaron como se describió previamente por Van Hinsberg, <15,16) . se utilizaron en densidad confluente después de cinco a seis pasos (proporción de fraccionado 1:3) para el aislamiento de ARN poliadenilado . Las líneas celulares endoteliales EA-hy926, BCE y LEU no expresaron FLT4 (datos no mostrados) . Sin embargo, las células endoteliales, venosas y umbilicales microvasculares humanas cultivadas, fueron positivas para los mARNs de 5.8 y 4.5 kb específicos de FLT4, tomando en cuenta que las células endoteliales aórticas fueron negativas (figura 5) . En contraste, se expresó otro gen de cinasa de tirosina receptora endotelial, de Enlace, como un mARN de 4.4 kb en todos los tipos de célula endotelial estudiados. EJEMPLO 5 mARN de FLT4 en tenidos humanos adultos Los resultados obtenidos en el Ejemplo 3 indicaron que el mARN de FLT4 se confina enormemente al endotelio de vasos linfáticos durante el desarrollo. Debido al significado potencial de este hallazgo en los humanos, también estudiamos el FLT4 en tejidos humanos adultos, utilizando una sonda de FLT4 humano. La sonda de FLT4 humano utilizado fue un fragmento de EcoRI-Sphl que cubre los pares de bases 1-595 del cADN(3) . La sonda del factor de von Willebrand fue un fragmento de EcoRI-HindIII que cubre los pares de bases 1-2334(17). Utilizamos material normalmente fijo enviado para diagnósticos histopatológicos . Se obtuvo tejido de pulmón normal a partir de una resección del lóbulo inferior izquierdo del pulmón afectado por cáncer epidermoide. Los nodulos linfáticos del mesenterio y mesenteriales se obtuvieron de un paciente que tiene un adenocarcinoma colónico. Un nodulo linfático adyacente a la glándula salival se extirpó debido a su tamaño anormal. Las amígdalas de dos pacientes y los dos apéndices no tuvieron cambios diagnósticos. Se estudiaron dos linfangiomiomas y tres linfangiomas císticos con resultados similares. Para tejidos humanos, los cuales fueron muestras de rutina fijos con formalina al 10% para un diagnóstico histopatológico, el protocolo in si tu normal dio solo un giro hacia atrás, puesto que el tratamiento de microondas en lugar de proteinasa K permitió la hibridización especi^f-i.ca (18,19) En el mesenterio, los endotelios linfáticos de pulmón y apéndice (lv) dieron señales de FLT4, mientras que las venas (v) , arterias (a) y capilares (c) fueron negativos (figura 6A-D y datos no mostrados) . Para estudiar si el FLT4 se expresa en los HEVs, se estudiaron las amígdalas. No obstante, en las amígdalas, se detectaron granos autorradiográficos específicos de FLT 4 en algunos HEVs (E, F) . EJEMPLO 6 Análisis de mARN de FLT4 en nodulos linfáticos normales y metastásicos y en linfangioma Se analizó una porción de un nodulo linfático mesenterial humano (ver Ejemplo 5) para la expresión de FLT4. Los resultados se muestran en la figura 7. El FLT4 se expresa en los senos linfáticos (ls) y en vasos linfáticos aferentes y eferentes (datos no mostrados) . El mismo patrón se observa en un nodulo linfático que contiene metástasis de adenocarcinoma (C, D) . Algunos HEVs en nodulos linfáticos tanto normales como metastásicos también fueron positivos. En el panel E, la expresión de FLT4 se mostró en un linfangioma cístico (en comparación con la sección teñida con hematoxilina-eosina en F) . Notablemente, la especificidad de FLT4 para el endotelio linfático es evidente a partir de la comparación con las señales in si tu para el factor von Willebrand en todos los vasos sanguíneos (F) . EJEMPLO 7 Localización del FLT4 en células endoteliales fetales Un fragmento de cADN de FLT4 que codifica los aminoácidos de la terminal carboxi de la forma corta, se clonó como un fragmento EcoRI de 657 bp hacia el vector de expresión bacterial pGEX-llT (Pharmacia) en estructura con la región de codificación de glutationa-S-transferasa. La proteína de fusión de GST-FLT4 resultante se produjo en E. coli y se purificó mediante cromatografía por afinidad utilizando una columna 4B de glutationa-Sefarosa. La proteína purificada se liofilizó, disolvió en PBS, mezcló con adyuvante de Freund y se utilizó para la inmunización de conejos. El antisuero se utilizó después de la cuarta inmunización de refuerzo. Los tejidos de fetos humanos de 17 y 20 semanas se obtuvieron de abortos legales inducidos con prostaglandinas . El estudio se aprobó por el Comité Etico del Hospital Central de la Universidad de Helsinki. La edad gestacional se estimó a partir de la longitud del pie fetal. Los tejidos fetales se incrustaron en Tejido-Tek (Miles) , se congelaron inmediatamente y se almacenaron a -70°C. El antisuero de anti-FLT4 se absorbió de manera cruzada hacia una columna de GST-Sefarosa para retirar anticuerpos anti-GST y después purificarlos mediante cromatografía por afinidad de GST-FLT4. Se fijaron varias secciones criostáticas de 6 µm de grosor de los tejidos con acetona y se trataron con H202 al 0.3% en metanol durante 30 minutos para bloquear la actividad de peroxidasa endógena. Después del lavado, las secciones se incubaron con suero de cerdo normal al 5%. Las secciones se incubaron después con anticuerpos contra FLT4, los anticuerpos lavados y enlazados se detectaron con IgG anticonejo y con peroxidasa enjungada de cerdo, seguido por teñido para la actividad de peroxidasa utilizando 3,3-diaminobenzidina al 0.2% (Amersham) como un substrato. Las secciones se contratiñeron en hematoxilina de Meyer. El tinte con inmunoperoxidasa de anti-FLT4 del mesenterio fetal humano mostró proteína de FLT4 en el endotelio de varios vasos (figura 4A) , mientras que los tintes de control con anticuerpos de anti-FLT4 bloqueados con antígeno (B) y suero preinmune (C) fueron negativos. Para comparación, la figura 4D muestra los resultados del tinte utilizando un antisuero contra el antígeno relacionado con el factor VIII, el cual es específico para células endoteliales vasculares.

EJEMPLO 8 Producción de anticuerpos monoclonales contra FLT4 Fusión I; Un ratón macho Balb/c de cuatro meses de edad se inmunizó mediante inyección intraperitonial de la proteína de FLT4 producida de manera recombinante (ver Ejemplo 7) en un medio concentrado (150 µg/ratón) , emulsificicado con adyuvante completo de Freund. Se dieron inyecciones de refuerzo de 150 µg en intervalos de tres a cuatro semanas y se dio un refuerzo final (10 µg de FLT4 en PBS administrado intraperitonialmente) después de otro intervalo de tres semanas. Cuatro días después de la dosis de refuerzo final, el ratón fue sacrificado y las células linfoides esplénicas del ratón se fusionaron con células de plasmacitoma SP 2/0 en una proporción de 2:1, respectivamente . Las células fusionadas se recolectaron en placas de cultivo de 96 perforaciones (NUNC) en un medio Ex-Celular 320 (SERALAB) que contiene 20% de suero bovino fetal y suplemento de HAT (hipoxantina-aminopterina-timidina; GIBCO, 043-01060H; diluido 50 veces) . Las células se cultivaron a +37 °C, en una atmósfera de C02 al 5%. Después de 10 días, el medio suplementado con HAT se cambió a medio de cultivo celular suplementado con HT (GIBCO; 043-01065H, diluido 50 veces) . El medio de HT es idéntico al medio de HAT, pero carece de aminopterina . En tres semanas, se determinó la producción de anticuerpo específica mediante el ensayo inmunofluorométrico específico de antígeno, IFMA, descrito en el Ejemplo 10. Las clonas principales se clonaron mediante dilusiones limitadas según se describe por Staszewski y Cois., Yale Journal of Biology and Medicine, 57:865-868 (1984). Las clonas positivas se expandieron sobre placas de cultivo de tejido de 24 perforaciones (NUNC) , se volvieron a clonar, y se volvieron a examinar mediante el mismo método. Las clonas positivas se examinaron por selección celular activada por fluorescencia (FACS) . Las clonas estables segregaron inmunoglobulinas pertenecientes a la clase IgGl, excepto una, que produjo Ig probablemente perteneciente a la clase IgA. La subclase de anticuerpo monoclonal se determinó utilizando anticuerpo monoclonal de rata para la subclase de ratón como conjugado de biotina (SEROTEC) en el IFMA. El ratón Balb/c se utilizó para producir anticuerpos monoclonales en fluidos de ascitas. Los hibridomas descritos arriba se inyectaron intraperitonialmente en el ratón después del pretratamiento de los animales con pristano (2, 6, 10, 14-tetrametilpentadecano al 98%, ALDRICH-CHEMIE D7924 Steinheim, Cat. No. T2, 280-2). Se inyectaron 0.5 mi de pristano (i.v.) aproximadamente de dos semanas antes de las células de hibridoma. La cantidad de células inyectadas fue de aproximadamente 7.5 a 9 x 106 por ratón. Las ascitas se recolectaron de 10 a 14 días después de la inyección de los hibridomas . Fusión II; Un ratón (hembra) Balb/c de dos meses de edad se inmunizó mediante inyección intraperitonial de la proteína de FLT4 producida de manera recombinante (ver Ejemplo 7) (20 µg/ratón) , emulsificicado con adyuvante completo de Freund. Se dieron inyecciones de refuerzo de 20 µg en intervalos de tres a cuatro semanas y se dio un refuerzo final (10 µg de FLT4 en PBS administrado i.v.) después de otro intervalo de tres semanas . Cuatro días después de la dosis de refuerzo final, el ratón fue sacrificado y las células linfoides esplénicas del ratón se fusionaron con células de plasmacitoma SP 2/0 en una proporción de 2:1, respectivamente . Las células fusionadas se recolectaron en placas de cultivo de 96 perforaciones (FALCON) en un medio OptiMEM 1 (con Glutamax 1, 51985-026, GIBCO BRL) que contiene 20% de suero bovino fetal y suplemento de HAT (hipoxantina-aminopterina-timidina; GIBCO BRL 21060-017; diluido 1:50 veces) . Las células se cultivaron a +37 °C, en una atmósfera de C02 al 5%. Después de 10 días, el medio suplementado con HAT se cambió a medio de cultivo celular suplementado con HT (GIBCO BRL; 41065-012, diluido 1:50 veces) . El medio de HT es idéntico al medio de HAT, pero carece de aminopterina . En tres semanas, se determinó la producción de anticuerpo específica mediante el Ensayo InmunoFluoroMétrico específico de antígeno (IFMA) descrito en el Ejemplo 9. Las clonas principales se clonaron mediante dilusiones limitadas según se describe por Staszewski y Cois., Yale Journal of Biology and Medicine, 57:865-868 (1984). Las clonas positivas se expandieron sobre placas de cultivo de tejido de 24 perforaciones (FALCON) , se volvieron a clonar, y se volvieron a examinar mediante el mismo método. Las clonas positivas se examinaron por selección celular activada por fluorescencia (FACS) . Las clonas 2E11 y 6B2 segregaron inmunoglobulinas pertenecientes a la clase IgG1; las clonas 2B12 produjeron Ig perteneciente a la subclase IgM. La subclase de ratón IgGx se determinó utilizando anticuerpo monoclonal de rata contra una cadena pesada de subclase de ratón como conjugado de biotina (SEROTEC) en IFMA y la subclase de ratón IgM se determinó con un Equipo de Isotopía de Anticuerpo Monoclonal de Ratón (Formato de Varilla de Nivel) (19663-012, Life Technologies Inc.). EJEMPLO 9 Especificidad de anticuerpos monoclonales contra el FLT4 Anticuerpos de la Fusión I: El dominio extracelular del FLT4 descrito en el Ejemplo 7, se etiquetó de acuerdo a Mukkala y Cois., en Anal. Biochem . 176 (2) :319-325, 1989, con la siguiente modificación: se añadió un exceso molar de 250 veces el DTTA-Eu de isotiocianato (quelato NI, WALLAC, Finlandia) a la solución de FLT4 (0.5 mg/ml en PBS) y el pH se ajustó a aproximadamente 9 al añadir 0.5 mol/L de regulador de carbonato de sodio, pH de 9.8. El etiquetado se llevó a cabo durante la noche a +4°C. La etiqueta no unida se retiró utilizando PD-10 (PHARMACIA, Suecia) con regulador de TSA (50 mmol/L de Tris-HCl, pH de 7.8 que contiene 0.15 mol/l de NaCl) como eluyente. Después de la purificación, se añadió 1 mg/ml de albúmina de suero bovino (BSA) al FLT4 etiquetado y la etiqueta se almacenó a +4°C. El número de iones de europio incorporados por molécula de FLT4 fue de 1.9, según se determinó mediante la medición de la fluorescencia en una proporción hacia aquellos estándares conocidos de EuCl3 (Hemmilá y Cois., Anal . Biochem. , 137:335-343, 1984). Los anticuerpos producidos en el Ejemplo 8, se seleccionaron utilizando un ensayo inmunofluorométrico de tipo Emparedado que utiliza perforaciones de tira de microtitulación (polisorbido, NUNC) cubiertas con antiratón de conejo Ig (Z 259, DAKOPATTS) . Las perforaciones precubiertas se lavaron una vez mediante la Placa de Lavado 1296-024 (WALLAC) con solución de enjuague DELFIA. El regulador de ensayo DELFIA se utilizó como un regulador de dilusión para sobrenadantes de cultivo celular y para el suero del ratón esplenectomisado (en dilusiones entre 1:1000 a 1:100000) utilizado como control positivo en el ensayo de selección preliminar. Se inició una incubación durante la noche a +4°C (o alternativamente durante 2 horas a temperatura ambiente) al agitarla en un agitador de Agitación de Placa (1296-001, WALLAC) durante 5 minutos seguido por el lavado cuatro veces con solución de lavado según se describió arriba. El FLT4 etiquetado por europio se añadió a una dilusión de 1:500 en 100 µl del regulador de ensayo. Después de 5 minutos en un agitador de Agitación de Placa y una hora de incubación en RT, las tiras se lavaron según se describe arriba. La solución mejorada (DELFIA) se añadió a 200 µl/perforación. Las placas se agitaron entonces durante 5 minutos en un agitador de Agitación de Placa y la intensidad de la fluorescencia se midió por ARCUS-1230 (WALLAC) durante 10-15 minutos. (Lóvgren y cois., En: Cllins W.P. (De) Alternative Innmunoassays, John Wiley & Sons Ltd, 1985; pp. 203-216) . Los anticuerpos monoclonales resultantes contra el FLT4 y los resultados de FACS correspondientes se resumen en la Tabla 2. TABLA 2 Clonas Mab. LTR%a' NEO%b) conteos -DELFIA 1B1 67,3 1 20625 1B1D11 75 1,2 19694 1B1F8 76,1 1,4 18580 4F6 69,9 1,2 23229 4F6B8G12 75 0,3 24374 4F6B8H11 75,9 0,3 28281 4F6B8E12 74,8 0,4 27097 4F6B8G10 75,3 0,4 26063 9D9 45,1 0,75 17316 9D9D10 71,7 2,3 18230 9D9F9 73 1,8 11904 9D9G6 74,3 2,9 16743 9D9G7 70,7 1,3 17009 10E4 24,2 1,4 39202 10E4B10E12 32,3 0,3 42490 10E4B10G10 36,5 0,3 54815 10E4B10F12 45,6 0,4 43909 10E4B10G12 45,7 0,5 35576 11G2 30,2 1,6 11304 11G2D12 74,4 1,5 14660 11G2G9 74,2 0,9 10283 11G2H7 74,4 2,1 25382 a) resultados de FACTS con células infectadas con LTR b) resultados de FACTS con células de NEO (control) Se encontró que una clona, designada 9D9F9 de anti-FLT4 segrega de manera estable anticuerpo monoclonal que se determinó ser de clase de inmunoglobulina IgGl mediante el IFMA. El hibridoma 9d9f9 se depositó con la Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares, Departamento de Cultivos y Virus Celulares Humanos y Animales, Mascheroder Weg lb, 3300 Braunschweig, Alemania, 23 de marzo de 1995, y se dio acceso al número ACC2210. Anticuerpos de la Fusión II; El dominio extracelular del FLT4 descrito en el Ejemplo 7, se etiquetó de acuerdo a Mukkala y Cois., en Anal . Biochem . 176 (2) : 319-325, 1989, con la siguiente modificación: se añadió un exceso molar de 250 veces el DTTA-Eu de isotiocianato (quelato NI, WALLAC, Finlandia) a la solución de FLT4 (0.5 mg/ml en PBS) y el pH se ajustó a aproximadamente 9 al añadir 0.5 mol/L de regulador de carbonato de sodio, pH de 9.8. El etiquetado se llevó a cabo durante la noche a +4°C. La etiqueta no unida se retiró utilizando PD-10 (PHARMACIA) con regulador de TSA (50 mmol/L de Tris-HCl, pH de 7.8 que contiene 0.15 mol/1 de NaCl) como eluyente. Después de la purificación, se añadió 1 mg/ml de albúmina de suero bovino (BSA) al FLT4 etiquetado y la etiqueta se almacenó a +4°C. El número de iones de europio incorporados por molécula de FLT4 fue de 1.9, según se determinó mediante la medición de la fluorescencia en una proporción hacia aquellos estándares conocidos de EuC13 (Hemmil y Cois., Anal. Biochem. , 137:335-343, 1984). Los anticuerpos producidos en el Ejemplo 8, se seleccionaron utilizando un IFMA específico de FLT4 que utiliza perforaciones de microtitulación (polisorbido, NUNC) cubiertas con Ig de conejo anti-ratón (Z 259, DAKO) . Las perforaciones precubiertas se lavaron una vez con solución de lavado (WALLAC) mediante el uso de una Placa de Lavado DELFIA. El regulador de ensayo DELFIA se utilizó como regulador de dilución para sobrenadantes de cultivo celular (dilución de 1:2 en selección preliminar) y para suero de ratón esplenectomisado (dilusiones de 1:1000 hasta 1:100000), lo cual se utilizó como control positivo. Se utilizó como estándar, el anti-FLT-4 purificado 9D9F9 (subclase de ratón IgGl) en concentraciones entre 1.0 ng/ml y 250 ng/ml. Las muestras se agitaron primero a temperatura ambiente durante 5 minutos sobre la Placa de Agitación (Wallac) y después se incubó aproximadamente 18 horas a +4°C. Las estructuras se lavaron primero cuatro veces, después se añadió el FLT-4 etiquetado Eu (1:2000, en 100 µl de regulador de ensayo) y finalmente las estructuras se incubaron durante una hora a temperatura ambiente . Después del lavado según se describe, se añadió la solución de mejora (200 µl/perforación, Wallac) y las estructuras se agitaron durante 5 minutos sobre la Placa de Agitación. La intensidad de fluorescencia se midió mediante ARCUS-1230 (Wallac) . Los anticuerpos monoclonales resultantes contra FLT-4 y los resultados correspondientes se resumen en la Tabla 3. Se elaboró una curva estándar para la cuantificación de anticuerpos de antiFLT-4 mediante el uso de 9D9F9 de antiFLT-4 purificado por afinidad. El rango lineal alcanzó desde 1.0 ng/ml hasta 250 ng/ml. El lisado celular de las células de NIH 3T3 contra-infectadas con la construcción de pLTRFLT4 que expresa la longitud completa de FLT4 sobre la superficie, pasó por electroforesis en SDS-PAGE al 6.5%, las proteínas se transfirieron a la membrana de nitrato de nitrocelulosa (0.45 µm, SCHLEICHER & SCHUELL) y se inmunomancharon con sobrenadantes de cultivo celular Mab (1:10, 50 mmol/L de TRIS-40 mmol/L de regulador de glicina que contiene metanol al 4%, SDS al 0.04%). La especificidad de Mab se detectó utilizando la incubación con Ig de antiratón de conejo conjugado con HRP (P 161, DAKO, diluido 1:1000 en 20 mmol/L de regulador TRIS pH de 7.5 que contiene 150 mmol/L de solución salina, leche en polvo al 5%) y SL (fosforescencia química mejorada, AMERSHAM) . TABLA 3 clonas Mab. LTR%a) NEOb) prod. aprox de Mab. WB ng/ml/106 células 2B12E10 39.5 6.0 440 2E11D11 44.6 8.8 110 2E11F9 49.5 4.5 100 2E11F12 46.0 4.1 180 2E11G8 41.2 7.8 160 6B2E12 NF NF 1390 6B2F8 NF NF 470 6B2G6 NF NF 630 6B2H5 NF NF 740 6B2H8 NF NF 1800 a) resultados de FACS con células infectadas de LTR b) resultados de FACS con células NEO (control) sin funcionar NF en FACS c) cuantificación de la producción de Mab en base al anticuerpo de 9D9F9 de antiFLT purificado por afinidad utilizado como estándar.

Como es evidente a partir de lo anterior, los anticuerpos de acuerdo a la presente invención son útiles en el diagnóstico e identificación de vasos linfáticos, células endoteliales linfáticas, vénulas endoteliales altas, linfangiomas, nodulos linfáticos metastásicos y otros estados de enfermedad del sistema linfático, la detección y monitoreo de difusión metastásica, en la estimulación e inhibición de células endoteliales de vasos linfáticos y vénulas endoteliales altas, en la introducción de moléculas selectivamente en células endoteliales y en la simbolización de vasos linfáticos y sus estados de enfermedad. Son aparentes otros usos de la materia sujeto actualmente reivindicada a aquellos trabajadores expertos. ( 2 ) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 1: CCACGCGCAG CGGCCGGAG ATG CAG C GG GGC GCC GCG CTG TGC CTG CGA CTG 52 Met Gln Arg Gly Ala Ala Leu Cys Leu Arg Leu 1 5 10 TGG CTC TGC CTG GGA CTC CTG GAC GGC CTG GTG AGT GGC TAC TCC ATG 100 Trp Leu Cys Leu Gly Leu Leu Asp Gly Leu Val Ser Gly Tyr Ser Met 15 20 25 ACC CCC CCG ACC TTG AAC ATC ACG GAG GAG TCA CAC GTC ATC GAC ACC 148 Thr Pro Pro Thr Leu Asn lie Thr Glu Glu Ser His Val lie Asp Thr 30 35 40 GGT GAC AGC CTG TCC ATC TCC TGC AGG GGA CAG CAC CCC CTC GAG TGG 196 Gly Asp Ser Leu Ser lie Ser Cys Arg Gly Gln His Pro Leu Glu Trp 45 50 55 GCT TGG CCA GGA GCT CAG GAG GCG CCA GCC ACC GGA GAC AAG GAC AGC 244 Ala Trp Pro Gly Ala Gln Glu Ala Pro Ala Thr Gly Asp Lys Asp Ser 60 65 70 75 GAG GAC ACG GGG GTG GTG CGA GAC TGC GAG GGC ACÁ GAC GCC AGG CCC 292 Glu Asp Thr Gly Val Val Arg Asp Cys Glu Gly Thr Asp Ala Arg Pro 80 85 90 TAC TGC AAG GTG TTG CTG CTG CAC GAG GTA CAT GCC AAC GAC ACÁ GGC 340 Tyr Cys Lys Val Leu Leu Leu His Glu Val His Ala Asn Asp Thr Gly 95 100 105 AGC TAC GTC TGC TAC TAC AAG TAC ATC AAG GCA CGC ATC GAG GGC ACC 388 Ser Tyr Val Cys Tyr Tyr Lys Tyr lie Lys Ala Arg lie Glu Gly Thr 110 115 120 ACG GCC GCC AGC TCC TAC GTG TTC GTG AGA GAC TTT GAG CAC CCA TTC 436 Thr Ala Ala Ser Ser Tyr Val Phe Val Arg Asp Phe Glu Gln Pro Phe 125 130 135 ATC AAC AAG CCT GAC ACG CTC TTG GTC AAC AGG AAG GAC GCC ATG TGG 484 lie Asn Lys Pro Asp Thr Leu Leu Val Asn Arg Lys Asp Ala Met Trp 140 145 150 155 GTG CCC TGT CTG GTG TCC ATC CCC GGC CTC AAT GTC ACG CTG CGC TCG 532 Val Pro Cys Leu Val Ser lie Pro Gly Leu Asn Val Thr Leu Arg Ser 160 165 170 CAÁ AGC TCG GTG CTG TGG CCA GAC GGG CAG GAG GTG GTG TGG GAT GAC 580 Gln Ser Ser Val Leu Trp Pro Asp Gly Gln Glu Val Val Trp Asp Asp 175 180 185 CGG CGG GGC ATG CTC GTG TCC ACG CCA CTG CTG CAC GAT GCC CTG TAC 628 Arg Arg Gly Met Leu Val Ser Thr Pro Leu Leu His Asp Ala Leu Tyr 190 195 200 CTG CAG TGC GAG ACC ACC TGG GGA GAC CAG GAC TTC CTT TCC AAC CCC 676 Leu Gln Cys Glu Thr Thr Trp Gly Asp Gln Asp Phe Leu Ser Asn Pro 205 2i0 215 TTC CTG GTG CAC ATC ACÁ GGC AAC GAG CTC TAT GAC ATC CAG CTG TTG 724 Phe Leu Val His lie Thr Gly Asn Glu Leu Tyr Asp lie Gln Leu Leu 220 225 230 235 CCC AGG AAG TCG CTG GAG CTG CTG GTA GGG GAG AAG CTG GTC CTG AAC 772 Pro Arg Lys Ser Leu Glu Leu Leu Val Gly Glu Lys Leu Val Leu Asn 240 245 250 TGC ACC GTG TGG GCT GAG TTT AAC TCA GGT GTC ACC TTT GAC TGG GAC 820 Cys Thr Val Trp Ala Glu Phe Asn Ser Gly Val Thr Phe Asp Trp Asp 255 260 265 TAC CCA GGG AAG CAG GCA GAG CGG GGT AAG TGG GTG CCC GAG CGA CGC 868 Tyr Pro Gly Lys Gln Ala Glu Arg Gly Lys Trp Val Pro Glu Arg Arg 270 275 280 TCC CAG CAG ACC CAC ACÁ GAA CTC TCC AGC ATC CTG ACC ATC CAC AAC 916 Ser Gln Gln Thr His Thr Glu Leu Ser Ser lie Leu Thr lie His Asn 285 290 295 GTC AGC CAG CAC GAC CTG GGC TCG TAT GTG TGC AAG GCC AAC AAC GGC 964 Val Ser Gln His Asp Leu Gly Ser Tyr Val Cys Lys Ala Asn Asn Gly 300 305 310 315 ATC CAG CGA TTT CGG GAG AGC ACC GAG GTC ATT GTG CAT GAA AAT CCC 1012 lie Gln Arg Phe Arg Glu Ser Thr Glu Val lie Val His Glu Asn Pro 320 325 330 TTC ATC AGC GTC GAG TGG CTC AAA GGA CCC ATC CTG GAG GCC ACG GCA 1060 Phe lie Ser Val Glu Trp Leu Lys Gly Pro lie Leu Glu Ala Thr Ala 335 340 345 GGA GAC GAG CTG GTG AAG CTG CCC GTG AAG CTG GCA GCG TAC CCC CCG 1108 Gly Asp Glu Leu Val Lys Leu Pro Val Lys Leu Ala Ala Tyr Pro Pro 350 355 360 CCC GAG TTC CAG TGG TAC AAG GAT GGA AAG GCA CTG TCC GGG CGC CAC 1156 Pro Glu Phe Gln Trp Tyr Lys Asp Gly Lys Ala Leu Ser Gly Arg His 365 370 375 AGT CCA CAT GCC CTG GTG CTC AAG GAG GTG ACÁ GAG GCC AGC ACÁ GGC 1204 Ser Pro His Ala Leu Val Leu Lys Glu Val Thr Glu Ala Ser Thr Gly 380 385 390 395 ACC TAC ACC CTC GCC CTG TGG AAC TCC GCT GCT GGC CTG AGG CGC AAC . 1252 Thr Tyr Thr Leu Ala Leu Trp Asn Ser Ala Ala Gly Leu Arg Arg Asn 400 405 410 ATC AGC CTG GAG CTG GTG GTG AAT GTG CCC CCC CAG ATA CAT GAG AAG 1300 lie Ser Leu Glu Leu Val Val Asn Val Pro Pro Gln He His Glu Lys 415 420 425 GAG GCC TCC TCC CCC AGC ATC TAC TCG CGT CAC AGC CGC CAG GCC CTC 1348 Glu Ala Ser Ser Pro Ser He Tyr Ser Arg His Ser Arg Gln Ala Leu 430 435 440 ACC TGC ACG GCC TAC GGG GTG CCC CTG CCT CTC AGC ATC CAG TGG CAC 1396 Thr Cys Thr Ala Tyr Gly Val Pro Leu Pro Leu Ser He Gln Trp His 445 450 455 TGG CGG CCC TGG ACÁ CCC TGC AAG ATG TTT GCC CAG CGT AGT CTC CGG 1444 Trp Arg Pro Trp Thr Pro Cys Lys Met Phe Ala Gln Arg Ser Leu Arg 460 465 470 475 CGG CGG CAG CAG CAÁ GAC CTC ATG CCA CAG TGC CGT GAC TGG AGG GCG 1492 Arg Arg Gln Gln Gln Asp Leu Met Pro Gln Cys Arg Asp Trp Arg Ala 480 485 490 GTG ACC ACG CAG GAT GCC GTG AAC CCC ATC GAG AGC CTG GAC ACC TGG 1540 Val Thr Thr Gln Asp Ala Val Asn Pro He Glu Ser Leu Asp Thr Trp 495 500 505 ACC GAG TTT GTG GAG GGA AAG AAT AAG ACT GTG AGC AAG CTG GTG ATC 1588 Thr Glu Phe Val Glu Gly Lys Asn Lys Thr Val Ser Lys Leu Val He 510 515 520 CAG AAT GCC AAC GTG TCT GCC ATG TAC AAG TGT GTG GTC TCC AAC AAG 1636 Gln Asn Ala Asn Val Ser Ala Met Tyr Lys Cys Val Val Ser Asn Lys 525 530 535 GTG GGC CAO GAT GAG CGG CTC ATC TAC TTC TAT GTG ACC ACC ATC CCC 1684. Val Gly Gln Asp Glu Arg Leu He Tyr Phe Tyr Val Thr Thr He Pro 540 545 550 555 GAC GGC TTC ACC ATC GAA TCC AAG CCA TCC GAG GAG CTA CTA GAG GGC 1732 Asp Gly Phe Thr He Glu Ser Lys Pro Ser Glu Glu Leu Leu Glu Gly 560 565 570 CAG CCG GTG CTC CTG AGC TGC CA GCC GAC AGC TAC AAG TAC GAG CAT 1780 Gln Pro Val Leu Leu Ser Cys Gln Ala Asp Ser Tyr Lys Tyr Glu His 575 580 585 CTG CGC TGG TAC CGC CTC AAC CTG TCC ACG CTG CAC GAT GCG CAC GGG 1828 Leu Arg Trp Tyr Arg Leu Asn Leu Ser Thr Leu His Asp Ala His Gly 590 595 600 AAC CCG CTT CTG CTC GAC TGC AAG AAC GTG CAT CTG TTC GCC ACC CCT 1876 Asn Pro Leu Leu Leu Asp Cys Lys Asn Val His Leu Phe Ala Thr Pro 605 610 615 CTG GCC GCC AGC CTG GAG GAG GTG GCA CCT GGG GCG CGC CAC GCC ACG 1924 Leu Ala Ala Ser Leu Glu Glu Val Ala Pro Gly Ala Arg His Ala Thr 620 625 630 635 CTC AGC CTG AGT ATC CCC CGC GTC GCG CCC GAG CAC GAG GGC CAC TAT 1972 Leu Ser Leu Ser He Pro Arg Val Ala Pro Glu His Glu Gly His Tyr 640 645 650 GTG TGC GAA GTG CAÁ GAC CGG CGC AGC CAT GAC AAG CAC TGC CAC AAG 2020 Val Cys Glu Val Gln Asp Arg Arg Ser His Asp Lys His Cys His Lys 655 660 665 AAG TAC CTG TCG GTG CAG GCC CTG GAA GCC CCT CGG CTC ACG CAG AAC 2068 Lys Tyr Leu Ssr Val Gln Ala Leu Glu Ala Pro Arg Leu Thr Gln Asn 670 675 680 TTG ACC GAC CTC CTG GTG AAC GTG AGC GAC TCG CTG GAG ATG CAG TGC 2116 Leu Thr Asp Leu Leu Val Asn Val Ser Asp Ser Leu Glu Met Gln Cys 685 690 695 TTG GTG GCC GGA GCG CAC GCG CCC AGC ATC GTG TGG TAC AAA GAC GAG 2164 Leu Val Ala Gly Ala His Ala Pro Ser He Val Trp Tyr Lys Asp Glu 700 705 710 715 AGG CTG CTG GAG GAA AAG TCT GGA GTC GAC TTG GCG GAC TCC AAC CAG 2212 Arg Leu Leu Glu Glu Lys Ser Gly Val Asp Leu Ala Asp Ser Asn Gln 720 725 730 AAG CTG AGC ATC CAG CGC GTG CGC GAG GAG GAT GCG GGA CGC TAT CTG 2260 Lys Leu Ser He Gln Arg Val Arg Glu Glu Asp Ala Gly Arg Tyr Leu 735 740 745 TGC AGC GTG TGC AAC GCC AAG GGC TGC GTC AAC TCC TCC GCC AGC GTG 2308 Cys Ssr Val Cys Asn Ala Lys Gly Cys Val Asn Ser Ser Ala Ser Val 750 755 760 GCC GTG GAA GGC TCC GAG GAT AAG GGC AGC ATG GAG ATC GTG ATC CTT 2356 Ala Val Glu Gly Ser Glu Asp Lys Gly Ser Met Glu He Val He Leu 765 770 775 GTC GGT ACC GGC GTC ATC GCT GTC TTC TTC TGG GTC CTC CTC CTC CTC 2404 Val Gly Thr Gly Val He Ala Val Phe Phe Trp Val Leu Leu Leu Leu 780 785 790 795 ATC TTC TGT AAC ATG AGG AGG CCG GCC CAC GCA GAC ATC AAG ACG GGC 2452 He Phe Cys Asn Met Arg Arg Pro Ala His Ala Asp He Lys Thr Gly 800 805 810 TAC CTG TCC ATC ATC ATG GAC CCC GGG GAG GTG CCT CTG GAG GAG CAÁ 2500 Tyr Leu Ser He He Met Asp Pro Gly Glu Val Pro Leu Glu Glu Gln 815 820 825 TGC GAA TAC CTG TCC TAC GAT GCC AGC CAG TGG GAA TTC CCC CGA GAG 2548 Cys Glu Tyr Leu Ser Tyr Asp Ala Ser Gln Trp Glu Phe Pro Arg Glu 830 835 840 CGG CTG CAC CTG GGG AGA GTG CTC GGC TAC GGC GCC TTC GGG AAG GTG 2596 Arg Leu His Leu Gly Arg Val Leu Gly Tyr Gly Ala Phe Gly Lys Val 845 850 855 GTG GAA GCC TCC GCT TTC GGC ATC CAC AAG GGC AGC AGC TGT GAC ACC 2644 Val Glu Ala Ser Ala Phe Gly He His Lys Gly Ser Ser Cys Asp Thr 860 865 870 875 GTG GCC GTG AAA ATG CTG AAA GAG GGC GCC ACG GCC AGC GAG CAC CGC 2692 Val Ala Val Lys Met Leu Lys Glu Gly Ala Thr Ala Ser Glu His Arg 880 885 890 GCG CTG ATG TCG GAG CTC AAG ATC CTC ATT CAC ATC GGC AAC CAC CTC 2740 Ala Leu Met Ser Glu Leu Lys He Leu He His He Gly Asn His Leu 895 900 905 AAC GTG GTC AAC CTC CTC GGG GCG TGC ACC AAG CCG CAG GGC CCC CTC 2788 Asn Val Val Asn Leu Leu Gly Ala Cys Thr Lys Pro Gln Gly Pro Leu 910 915 920 ATG GTG ATC GTG GAG TTC TGC AAG TAC GGC AAC CTC TCC AAC TTC CTG 2836 Met Val He Val Glu Phe Cys Lys Tyr Gly Asn Leu Ser Asn Phe Leu 925 930 935 CGC GCC AAG CGG GAC GCC TTC AGC CCC TGC GCG GAG AAG TCT CCC GAC 2884 Arg Ala Lys Arg Asp Ala Phe Ser Pro Cys Ala Glu Lys Ser Pro Glu 940 945 950 955 CAG CGC GGA CGC TTC CGC GCC ATG GTG GAG CTC GCC AGG CTG GAT CGG 2932 Gln Arg Gly Arg Phe Arg Ala Met Val Glu Leu Ala Arg Leu Asp Arg 960 965 970 AGG CGG CCG GGG AGC AGC GAC AGG GTC CTC TTC GCG CGG TTC TCG AAG 2980 rJ Arg Arg Pro Gly Ser Ser Asp Arg Val Leu Phe Ala Arg Phe Ser Lys 975 980 985 ACC GAG GGC GGA GCG AGG CGG GCT TCT CCA GAC CA GAA GCT GAG GAC 3028 Thr Glu Gly Gly Ala Arg Arg Ala Ser Pro Asp Gln Glu Ala Glu Asp 990 995 1000 CTG TGG CTG AGC CCG CTG ACC ATG GAA GAT CTT GTC TGC TAC AGC TTC 3076 Leu Trp Leu Ser Pro Leu Thr Met Glu Asp Leu Val Cys Tyr Ser Phe 1005 1010 1015 CAG GTG GCC AGA GGG ATG GAG TTC CTG GCT TCC CGA AAG TGC ATC CAC 3124 Gln Val Ala Arg Gly Met Glu Phe Leu Ala Ser Arg Lys Cys He His 1020 1025 1030 1035 AGA GAC CTG GCT GCT CGG AAC ATT CTG CTG TCG GAA AGC GAC GTG GTG 3172 Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn He Leu Leu Ser Glu Ser Asp Val Val 1040 1045 1050 AAG ATC TGT GAC TTT GGC CTT GCC CGG GAC ATC TAC AAA GAC CCT GAC 3220 Lys He Cys Asp Phe Gly Leu Ala Arg Asp He Tyr Lys Asp Pro Asp 1055 1060 1065 TAC GTC CGC AAG GGC AGT GCC CGG CTG CCC CTG AAG TGG ATG GCC CCT 3268 Tyr Val Arg Lys Gly Ser Ala Arg Leu Pro Leu Lys Trp Met Ala Pro 1070 1075 1080 GAA AGC ATC TTC GAC AAG GTG TAC ACC ACG CAG AGT GAC GTG TGG TCC 3316 Glu Ser He Phe Asp Lys Val Tyr Thr Thr Gln Ser Asp Val Trp Ser 1085 1090 1095 TTT GGG GTG CTT CTC TGG GAG ATC TTC TCT CTG GGG GCC TCC CCG TAC 3364 Phe Gly Val Leu Leu Trp Glu He Phe Ser Leu Gly Ala Ser Pro Tyr 1100 1105 1110 1115 CCT GGG GTG CAG ATC AAT GAG GAG TTC TGC CAG CGG CTG AGA GAC GGC 3412 Pro Gly Val Gln He Asn Glu Glu Phe Cys Gln Arg Leu Arg Asp Gly 1120 1125 1130 ACÁ AGG ATG AGG GCC CCG GAG CTG GCC ACT CCC GCC ATA CGC CGC ATC 3460 Thr Arg Met Arg Ala Pro Glu Leu Ala Thr Pro Ala He Arg Arg He 1135 1140 1145 ATG CTG AAC TGC TGG TCC GGA GAC CCC AAG GCG AGA CCT GCA TTC TCG 3508 Met Leu Asn Cys Trp Ser Gly Asp Pro Lys Ala Arg Pro Ala Phe Ser 1150 1155 1160 GAG CTG GTG GAG ATC CTG GGG GAC CTG CTC CAG GGC AGG GGC CTG CAÁ 3556 Glu Leu Val Glu He Leu Gly Asp Leu Leu Gln Gly Arg Gly Leu Gln 1165 1170 1175 GAG GAA GAG GAG GTC TGC ATG GCC CCG CGC AGC TCT CAG AGC TCA GAA 3604 Glu Glu Glu Glu Val Cys Met Ala Pro Arg Ser Ser Gln Ser Ser Glu 1180 1185 1190 1195 GAG GGC AGC TTC TCG CAG GTG TCC ACC ATG GCC CTA CAC ATC GCC CAG 3652 Glu Gly Ser Phe Ser Gln Val Ser Thr Met Ala Leu His He Ala Gln 1200 1205 1210 GCT GAC GCT GAG GAC AGC CCG CCA AGC CTG CAG CGC CAC AGC CTG GCC 3700 Ala Asp Ala Glu Asp Ser Pro Pro Ser Leu Gln Arg His Ser Leu Ala 1215 1220 1225 GCC AGG TAT TAC AAC TGG GTG TCC TTT CCC GGG TGC CTG GCC AGA GGG 3748 Ala Arg Tyr Tyr Asn Trp Val Ser Phe Pro Gly Cys Leu Ala Arg Gly 1230 1235 1240 GCT GAG ACC CGT GGT TCC TCC AGG ATG AAG ACÁ TTT GAG GAA TTC CCC 3796 Ala Glu Thr Arg Gly Ser Ser Arg Met Lys Thr Phe Glu Glu Phe Pro 1245 1250 1255 ATG ACC CCA ACG ACC TAC AAA GGC TCT GTG GAC AAC CAG ACÁ GAC AGT 3844 Met Thr Pro Thr Thr Tyr Lys Gly Ser Val Asp Asn Gln Thr Asp Ser 1260 1265 1270 1275 GGG ATG GTG CTG GCC TCG GAG GAG TTT GAG CAG ATA GAG AGC AGG CAT 3892 Gly Met Val Leu Ala Ser Glu Glu Phe Glu Gln He Glu Ser Arg His 1280 1285 1290 AGA CAÁ GAA AGC GGC TTC AGG TAGCTGAAGC AGAGAGAGAG AAGGCAGCAT 3943 Arg Gln Glu Ser Gly Phe Arg 1295 ACGTCAGCAT TTTCTTCTCT GCACTTATAA GAAAGATCAA AGACTTTAAG ACTTTCGCTA 4003 TTTCTTCTAC TGCTATCTAC TACAAACTTC AAAGAGGAAC CAGGAGGACA AGAGGAGCAT 4063 GAAAGTGGAC AAGGAGTCTG ACCACTGAAG CACCACAGGG AAGGGGTTAG GCCTCCGGAT 4123 GACTGCGGGC AGGCCTGGAT AATATCCAGC CTCCCACAAG AAGCTGGTGG AGCAGAGTGT 4183 TCCCTGACTC CT 4195 REFERENCIAS 1. 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Claims (14)

1. NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito la presente invención se considera como novedad y por lo tanto se reclama como propiedad lo descrito en las siguientes reivindicaciones . 1. Un anticuerpo monoclonal dirigido contra una cinasa de tirosina receptora de FLT4.
2. 2. El anticuerpo monoclonal según la reivindicación 1, caracterizado porque, dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal anti-FLT4 producido por una línea celular de hibridoma depositada como DSM ACC 2210.
3. 3. Una línea celular de hibridoma, que produce el anticuerpo monoclonal según la reivindicación 1.
4. 4. La línea celular de hibridoma según la reivindicación 3, caracterizada porque dicha línea celular de hibridoma es depositada como DSM ACC 2210.
5. 5. Un anticuerpo monoclonal producido por la línea de célula de hibridoma según la reivindicación 4.
6. 6. Un anticuerpo etiquetado de manera detectable según las reivindicaciones 1 o 2.
7. 7. Un método para detectar FLT4 en una muestra biológica, que comprende las etapas de: a) exponer una muestra sospechosa de contener FLT4 a un anticuerpo de anti-FLT4 etiquetado de manera detectable de acuerdo a la reivindicación 6; b) lavar la muestra; y c) detectar la presencia de dicho anticuerpo de anti-FLT4 etiquetado de manera detectable en dicha muestra.
8. 8. Un método para representar vasos linfáticos en una muestra de tejido, que comprende las etapas de: a) aplicar un anticuerpo de anti-FLT4 etiquetado de manera detectable a un sitio sospechoso de contener vasos linfáticos; y d) detectar dicho anticuerpo de anti-FLT4 etiquetado de manera detectable enlazado a dicho tejido.
9. 9. Un método para diagnosticar enfermedades caracterizadas por cambios en vasos linfáticos y HEVs, que comprende las etapas de: a) obtener una muestra de tejido de un paciente sospechoso de tener una enfermedad caracterizada por cambios en células linfáticas y HEVs; b) exponer dicha muestra de tejido a un anticuerpo de anti-FLT4 etiquetado de manera detectable; c) lavar dicha muestra de tejido; y d) detectar la presencia de dicho anti-FLT4 etiquetado de manera detectable en dicha muestra de tejido.
10. 10. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo de anti-FLT4 según las reivindicaciones 1, 2, 5 o 6 en un diluyente, adyuvante o vehículo farmacéuticamente aceptable, encontrándose dicha composición en una forma adecuada para inyección.
11. 11. Un método para detectar vasos linfáticos y HEVs en un organismo, que comprende las etapas de a) inyectar una composición farmacéutica según la reivindicación 10, en dicho organismo; b) detectar la cantidad de dicho anticuerpo de anti-FLT4 enlazado a sitios que comprenden vasos linfáticos o HEVs en dicho organismo.
12. 12. El método según la reivindicación 11, caracterizado porque el tejido linfático por detectarse es tejido de nodulo linfático.
13. 13. Un método para estimular o antagonizar la función de FLT4 en un organismo que comprende la etapa de proporcionar una composición farmacéutica según la reivindicación 10 en una cantidad suficiente para estimular o bloquear el receptor de FLT4.
14. 14. El método según la reivindicación 13, caracterizado porque la actividad del receptor de FLT4 se asocia con una enfermedad seleccionada del grupo que consiste de cánceres metastásicos, linfornas, linfangiomas, inflamación (crónica o aguda) , infecciones y enfermedades inmunológicas .