JP2002532113A - 切断vegf−dの抗体及びその利用法 - Google Patents
切断vegf−dの抗体及びその利用法Info
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Abstract
Description
ドに対して特異的に反応する抗体を有する組成物に関する。前記抗体は、モノク
ローナル抗体(MAbs)、免疫反応性フラグメント、又はその組換え体を含む
。本発明は、更に、これらの抗体を利用した薬用及び診断用組成物及び方法にも
関する。
enesis)と呼ばれるプロセスに於いて中胚葉細胞のインサイチュ分化によ
って確立される。胎児における新しい血管の生成に関連するすべてのその後のプ
ロセスと、成体に於ける新血管新生(neovascularization)
は、脈管形成(angiogenesis)と呼ばれるプロセスに於ける既存の
血管からの新しい毛細管の発芽又は分裂によって支配されているものと考えられ
ている(ペッパー(Pepper)等、Enzyme&Protein,199
6 49 138−162;ブライアー(Breier)等、Dev.Dyn.
1995 204 228−239;リソー(Risau)、Nature,1
997 386 671−674)。脈管形成は、胚発達と正常な組織成長、修
復及び再生のみならず、女性の生殖サイクル、妊娠状態の確立及び維持、そして
、損傷及び破損の修復にも関連している。正常な個体に於いて行われる脈管形成
の他に、脈管形成現象は、多数の病理プロセス、特に腫瘍の成長と転移、そして
、糖尿病網膜症、乾癬症、及び関節疾患(arthropathies)等のよ
うに、血管増殖、特に微小血管系の血管形成、が増加する、その他の状態、に関
連している。脈管形成の抑制は、これらの病理的プロセスを防止又は軽減するの
に有用である。
いは、冠状動脈心臓疾患や血栓性閉塞性動脈炎等に於けるように、組織梗塞又は
動脈狭窄に於いて側副血行の形成を刺激する為、等の状況においては脈管形成を
促進することが望ましい。
持、細胞外マトリクスの分解、周囲の組織の遊走と浸潤、そして最後に管腔形成
、に関連している。これら複雑な脈管形成プロセスの背後の分子メカニズムはま
だほとんど判っていない。
ているので、脈管形成の制御に関連している因子が集中的に研究されている。多
くの増殖因子が、脈管形成の調節に関連していることが示されている。これらの
ものとしては、線維芽細胞増殖因子(FGF)、血小板由来増殖因子(PDGF
)、トランスフォーミング増殖因子アルファ(TGFα)、及び肝細胞増殖因子
(HGF)がある。たとえば、フォークマン(Falkman)等、J.Bio
l.Chem.,1992 267 10931−10934を参照。
、それらに対応するレセプターが、内皮細胞の増殖と分化の刺激と、分化細胞の
或る種の機能とに主に寄与していることが示唆されている。これらの因子は、P
DGFファミリーのメンバーであって、主に内皮レセプターチロシンキナーゼ(
RTK)を介して作用しているように思える。
A及びB)と、VEGFと、VEGFに密接に関連している6つのメンバー、が
同定された。VEGFに密接に関連する前記6つのメンバーは、Ludwig
Institute for Cancer Researchとヘルシンキ大
学とによる、国際特許出願PCT/US96/02957(WO96/2673
6)及び米国特許5,840,693号及び5,607,918号とに記載のV
EGF−Bと、ヨウコフ(Joukov)等、EMBO J.,1996 15 290−298及びリー(Lee)等、Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA,1996 93 1988−1992に記載のVEGF−Cと、国
際特許出願PCT/US97/14696(WO98/07832)及びアチェ
ン(Achen)等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,199
8 95 548−553に記載のVEGF−Dと、マグリオン(Maglio
ne)等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1991 88
9267−9271に記載の胎盤増殖因子(PlGF)と、Human Gen
ome Sciences社の国際特許出願PCT/US94/05291(W
O 95/24473)に記載のVEGF2と、Human Genome S
ciences社の国際特許出願PCT/US95/07283(WO 96/
39421)に記載のVEGF3とである。これら各VEGFファミリーメンバ
ーは、VEGFに対して30%ないし45%のアミノ酸配列同一性を有する。こ
れらVEGFファミリーメンバーは、システイン・ノット・モチーフ(cyst
eine knot motif)を形成する6つのシステイン残基を含むVE
GF相同性ドメインを共有している。VEGFファミリーの機能的特徴には、内
皮細胞に対する種々の程度のマイトジェン活性の誘発、血管透過性及び脈管形成
及びリンパ管形成特性の誘発、が含まれる。
マー糖タンパク質である。VEGFは、内皮細胞に対して高度に特異的なマイト
ジェン活性を示す。VEGFは、胎児血管形成中の新しい血管の形成と、成体の
脈管形成とに於いて重要な調節機能を有する(カーメリエット(Carmeli
et)等、Nature,1996 380 435−439;ファーララ(F
errara)等、Nature,1996 380 439−442;ファー
ララ(Ferrara)及びデイヴィス−スミス(Davis−Smyth),
Endocrine Rev.,1997 18 4−25によって検討されて
いる)。VEGFが果す役割の重要性は、一つのVEGF対立遺伝子が不活性化
するだけで、血管の発達不全によって胎児が致死することを示す研究によって示
されている(カーメリエット(Carmeliet)等、Nature,199
6 380 435−439;ファーララ(Ferrara)等、Nature
,1996 380 439−442)。更に、VEGFは、単球に対する強力
な化学誘引活性を有し、内皮細胞に於いてプラスミノーゲンアクチベーターとプ
ラスミノーゲンアクチベーターインヒビターとを誘発することができ、又、微小
血管透過性を誘発することができる。その後者の活性に依り、それは、時として
、血管透過性因子(VPF)と称される。VEGFの単離と性質は既に研究され
ている。ファーララ(Ferrara)等、J.Cellular Bioch
em.,1991 47 211−218とコノリー(Connolly)J.
Cellular Biochem.,1991 47 219−223を参照
。一つのVEGF遺伝子の選択的mRNAスプライシングによってVEGFの5
つのアイソフォームが得られる。
れは、VEGFと異なる組織に分布し、発現される。具体的には、VEGF−B
は心臓に於いて非常に強力に発現されるが、肺に於いては弱くしか発現されない
。これに対して、VEGFの場合はその反対である。これは、VEGFとVEG
F−Bとは、それらが多くの組織に於いて共発現されるという事実にも拘わらず
、機能的な相違を有するものである可能性があることを示唆している。
)と相互作用する可能性のある細胞タンパク質をスクリーニングすることによる
酵母共ハイブリッド相互作用トラップスクリーニング法(co−hybrid
interaction trap screening technique
)を使用して単離された。その単離と特徴は、PCT/US96/02957と
、オロフソン(Olofsson)等、Proc.Natl.Acad.Sci
.USA,1996 93 2576−2581とに詳細に記載されている。
(conditioned media)から、VEGFR−3を発現するべく
トランスフェクトされた細胞を使用して、この培地が内皮細胞特異性レセプター
チロシンキナーゼVEGFR−3(Flt4)を生成する能力をスクリーニング
することによって単離された。VEGF−Cは、組換えVEGFR−3でのアフ
ィニティークロマトグラフィーを使用して精製され、PC−3cDNAライブラ
リーからクローニングされた。その単離と特徴とは、ヨウコフ(Joukov)
等、EMBO J.,1996 15 290−298に詳述されている。
ラリーから、ハイブリダイゼーションプローブとして“Soares Brea
st 3NbHBst”と命名されているヒトcDNAライブラリーから得た発
現配列タグによるスクリーニングによって単離された(アチェン(Achen)
等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1998 95 548
−553)。その単離と特徴とは、国際特許出願PCT/US97/14696
(WO98/07832)に詳細に記載されている。
に発現されるものではない。VEGF−Dは、心臓、肺及び骨格筋に於いて強力
に発現される。VEGF−Dは脾臓と、卵巣、小腸、及び結腸に於いて中レベル
で発現され、より低い発現が腎臓、膵臓、胸腺、前立腺、及び精巣で発生する。
脳、胎盤、肝臓又は末しょう血液白血球からのRNAにはVEGF−DmRNA
は検出されなかった。
離と特徴とは、マグリオン(Maglione)等、Proc.Natl.Ac
ad.Sci.USA,1991 88 9267−9271に詳細に記載され
ている。現在に於いて、その生物学的機能はよく理解されていない。
ンから単離された。この分子は、PDGFに対する約22%の相同性と、VEG
Fに対する30%の相同性を有すると述べられているものの、VEGF2をコー
ドする遺伝子を単離する方法は明らかでなく、その生物学的活性の特徴付けは開
示されていない。
F3は、VEGFに対する約36%の同一性と、66%の類似性を有すると記載
されている。VEGF3をコードする遺伝子を単離する方法は明らかでなく、そ
の生物学的活性の特徴付けは開示されていない。
保存アミノ酸置換を、第2のタンパク質の配列と比較することによって判定され
るのに対して、同一性は、保存アミノ酸置換を含めることなく判定される。
ナーゼに結合することによって作用する。5つの内皮細胞特異的レセプターチロ
シンキナーゼが同定されている。即ち、VEGFR−1(Flt−1)、VEG
FR−2(KDR/Flk−2)、VEGFR−3(Flt4)、Tieそして
Tek/Tie−2である。これらの全ては、シグナル伝達に必要な内在性チロ
シンキナーゼ活性を有する。VEGFR−1,VEGFR−2,VEGFR−3
、Tie及びTek/Tie−2の、血管形成及び脈管形成に於ける本質的で特
異的な役割は、マウス胎児に於いてこれらのレセプターを不活性化する標的化突
然変異によって示されている。
GFR−1,VEGFR−2及びVEGFR−3だけである。VEGFR−1と
VEGFR−2とは、高い親和性でVEGFと結合し、VEGFR−1は、VE
GF−BとPlGFとにも結合する。VEGF−Cは、VEGFR−3のリガン
ドであることが示されており、これは、又、VEGFR−2を活性化する(ヨウ
コフ(Joukov)等、The EMBO Journal,1996 15 290−298)。VEGF−DはVEGFR−2およびVEGFR−3の双
方に結合する。Tek/Tie−2のリガンドは、Regeneron Pha
rmaceuticals,社の国際特許出願PCT/US95/12935(
WO 96/11269)に記載されている。Tieのリガンドは、まだ同定さ
れていない。
ーが精製されクローニングされた(ソーカー(Soker)等、Cell,19
98 92 735−745)。このVEGFレセプターは、ヘパリンに対する
弱い親和性を示すエクソン7コード化配列を介してVEGF165アイソフォーム
に結合することが判った(ソーカー(Soker)等、Cell,1998 9
2 735−745)。驚くべきことに、前記レセプターは、ヒトニューロピリ
ン(neuropilin)−1(NP−1)、初期段階の神経形態形成に関わ
るレセプター、と同一であることが示された。P1GF−2も、NP−1と相互
作用するようである(ミグダール(Migdal)等、J.Biol.Chem
.,1998 273 22272−22278)。
る状態で発現される。VEGFR−1とVEGFR−2は、共に、血管内皮に発
現され(エールリッヒス(Oelrichs)等、Oncogene,1992
8 11−18;カイパイネン(Kaipainen)等、J.Exp.Me
d.,1993 178 2077−2088;デュモント(Dumont)等
、Dev.Dyn.,1995 203 80−92;フォン(Fong)等、
Dev.Dyn.,1996 207 1−10)、VEGFR−3は、ほとん
ど、成体組織のリンパ内皮に発現される(カイパイネン(Kaipainen)
等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1995 9 3566
−3570)。VEGFR−3は、又、腫瘍周囲の血管にも発現される。
熟致死となる。完全に不活性化されたVEGFR−1遺伝子を有する胎児の分析
は、このレセプターが内皮の機能的組織化に必要であるということを示唆してい
る(フォン(Fong)等、Nature,1995 376 66−70)。
しかしながら、VEGFR−1の細胞内チロシンキナーゼドメインの欠失は、正
常な血管を有する生育可能なマウスを作り出す(ヒラツカ(Hiratsuka
)等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA1998 95 934
9−9354)。これらの相違の理由は、今後の説明を必要とするが、これは、
VEGFR−1の適切な機能の為にチロシンキナーゼを介したレセプターシグナ
リングが必要とされない、ということを示唆している。VEGFR−2の不活性
化対立遺伝子を有する同型接合体マウスの分析は、このレセプターが、内皮細胞
増殖、血液生成及び血管形成のために必要であることを示唆している(シャラビ
ー(Shalaby)等、Nature,1995 376 62−66;シャ
ラビー(Shalaby)等,Cell,1997 89 981−990)。
VEGFR−3の不活性化によって、大きな血管の組織異常によって心血管不全
が起こる(デュモント(Dumont)等、Science,1998 282 946−949)。
、胚形成の初期段階に於いて造血前駆細胞にも見られる(フォン(Fong)等
、Nature,1995 376 66−70)。成体に於いて、単球とマク
ロファージも、このレセプターを発現する(バーレオン(Barleon)等、
Blood,1995 87 3336−3343)。胚に於いて、それは、ほ
とんどが、全部ではないにせよ、血管に発現される(ブライアー(Breier
)等、Dev.Dyn.,1995 204 228−239);フォン(Fo
ng)等、Dev.Dyn.,1996 207 1−10)。
、胚形成が進むにつれて、静脈内皮に徐々に限定され、その後、リンパ内皮に限
定される(カイパイネン(Kaipainen)等、Cancer Res.,
1994 54 6571−6577、カイパイネン(Kaipainen)
等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1995 92 356
6−3570)。VEGFR−3は、成体に於いてリンパ内皮細胞に発現され続
ける。このレセプターは、胚形成中の血管発達のために必須である。マウスに於
けるVEGFR−3遺伝子の両方の複製を完全に不活性化したところ、性交後9
.5日に於いて、欠陥管腔を有する組織化が異常な大きな血管によって特徴付け
られる欠陥血管形成が発生し、心膜腔に於いて体液が貯留し、心血管不全が発生
した。これらの知見に基づき、VEGFR−3は、一次血管網状組織がより大き
な血管に成熟するために必要であることが示唆されている。しかしながら、リン
パ管の発達に於けるVEGFR−3の役割は、胚がリンパ系が現れる前に死亡し
た為、これらのマウスでは研究することができなかった。それにも拘わらず、V
EGFR−3は、胚形成及び成体生涯に於けるリンパ内皮細胞でのその特異的発
現に依り、リンパ管系の発達とリンパ管形成(lymphangiogenes
is)に役割を果しているものと推定される。これは、VEGFR−3のリガン
ドであるVEGF−Cのトランスジェニックマウスの皮膚に於ける偏位発現によ
って、リンパ内皮細胞の増殖と真皮に於ける血管の拡大が発生したという知見に
よってサポートされる。更に、これは、VEGF−Cが、リンパ内皮に於いて一
次機能を有し、VEGFと共通する脈管形成及び透過性調節に於いて二次機能を
有している可能性があることを示唆している(ヨウコフ(Joukov)等、E
MBO J.,1996 15 290−298)。
カニズムを介して腫瘍の増殖を防ぐことが示されている。キム(Kim)等、N
ature,1993 362 841−844及びサレー(Saleh)等、
Cancer Res.,1996 56 393−401を参照。
リペプチドに対して特異的に反応する抗体を有する組成物に関する。前記抗体は
、モノクローナル抗体(MAb)、免疫反応性フラグメント、又はその組換え体
である。本発明の別実施例に於いて、前記組成物は、哺乳動物VEGFR−2に
よって仲介されるVEGF−Dの活性を干渉(interfere)する、およ
び/又は、VEGF−Dの哺乳動物VEGFR−3に対する結合を干渉すること
が可能な抗体を有する。特に好適な抗体は、VEGFR−2によって仲介される
VEGF−Dの活性を干渉する、および/又は、VEGF−DのVEGFR−3
に対する結合は干渉するが、VEGFR−2に仲介されるVEGFの活性は干渉
せず、VEGF−Cには結合しない。本発明は、更に、前記抗体を利用した薬用
及び診断用組成物と方法とに関する。
列を有するポリペプチドに対して特異的に反応する抗体を有する組成物を提供す
る。それら抗体の具体例は、2F8,4A5,4E10,5F12,4H4及び
3C10と称されるモノクローナル抗体(MAb)を含む。
−Dの活性を干渉する抗体を有する組成物を提供する。一好適実施例に於いて、
この抗体は、更に、VEGF−DのVEGFR−3に対する結合は干渉するが、
VEGFR−2に仲介されるVEGFの活性は干渉せず、VEGF−Cには結合
しない。そのような抗体の具体例は、アイソタイプIgG1を有する抗体MAb
4A5である。
を干渉する抗体を有する組成物を提供する。
ミノ酸配列を有するポリペプチド、又は、このポリペプチドのフラグメントに対
して育成することができる。更に、このポリペプチドは、アフィニティー精製を
補助するべく、FLAG(登録商標)オクタペプチド(Sigma,セントルイ
ス,MO)等の、エピトープタグにリンクさせることが可能である。いくつかの
目的の為に、たとえば、抗体が臨床状況に於いてVEGF−Dの作用を抑制する
ために使用される場合、等に於いては、ヒト化又はキメラモノクローナル抗体又
は免疫反応性フラグメント、を使用することが望ましいかもしれない。これらを
作成する方法を以下に示すが、これらは、又、組換えDNA法を含めて、当該技
術に於いて周知である。
含み、それらは適切に標識出来る。
る。前記抗体は、イメージングのために、適切な超磁性体、常磁性体、高電子密
度、エコジェニック(ecogenic)又は放射性物質と共役又は非共役結合
させることができる。診断上のアッセイにおける使用では、放射性あるいは非放
射性標識が使用される。放射性標識の具体例としては、125Iや32P等の、放射
性原子又は原子団がある。非放射性標識の具体例としては、ホースラディッシュ
ペルオキシダーゼ、又は、フルオレシン−5−イソチオシアネート(FITC)
等の蛍光標識がある。標識は、直接的あるいは間接的、共役あるいは非共役のも
のとすることができる。
るポリペプチドに対して特異的に反応するモノクローナル抗体の製造方法に関す
る。更に、このポリペプチドは、FLAG(登録商標)オクタペプチド(Sig
ma−Aldrich)等の、エピトープタグにリンクさせることが可能である
。この方法は、免疫適格哺乳動物(immunocompetent mamm
al)を、図1(配列識別番号1)に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド
又は該ポリペプチドのフラグメントと、オプションとして、リンクされたエピト
ープタグとを有する免疫原によって免疫する工程と、前記免疫された免疫適格哺
乳動物のリンパ球を、骨髄腫細胞と融合させてハイブリドーマ細胞を形成する工
程と、前記ハイブリドーマ細胞によって作り出されたモノクローナル抗体(MA
b)を図1(配列識別番号1)に記載のアミノ酸配列を有する前記ポリペプチド
に対する特異的結合活性に関してスクリーニングする工程と、図1(配列識別番
号1)に記載のアミノ酸を有する前記ポリペプチドに対する特異的結合活性を有
するMAbを産生するハイブリドーマ細胞を、培地で培養して、増殖させ、およ
び/又は、前記モノクローナル抗体を分泌させる工程と、前記モノクローナル抗
体を前記培養上清から回収する工程、とを有する。
又は、VEGF−DのVEGFR−3に対する結合を干渉するモノクローナル抗
体を作る方法が提供される。この方法は、免疫適格哺乳動物を、図1(配列識別
番号1)に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド又は該ポリペプチドのフラ
グメントと、オプションとして、リンクされたエピトープタグとを有する免疫原
によって免疫する工程と、前記免疫された免疫適格哺乳動物のリンパ球を、骨髄
腫細胞と融合させてハイブリドーマ細胞を形成する工程と、前記ハイブリドーマ
細胞によって作り出されたモノクローナル抗体(MAb)をVEGF−D干渉活
性(interfering activity)および/又はVEGF−D結
合干渉活性に関してスクリーニングする工程と、VEGF−D干渉活性および/
又はVEGF−D結合干渉活性を有するMAbを産生するハイブリドーマ細胞を
、培地で培養して、増殖させ、および/又は、前記モノクローナル抗体を分泌さ
せる工程と、前記モノクローナル抗体を前記培養上清から回収する工程、とを有
する。これら両方の方法に於いて、好適な免疫適格哺乳動物は、マウス又はラッ
トである。
るポリペプチドに対して特異反応性の、又は、VEGF−2に仲介されるVEG
F−Dの活性を干渉する、および/又は、VEGF−DのVEGF−3に対する
結合を干渉する、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞である。
るポリペプチドに対して特異反応性の、又は、VEGF−2に仲介されるVEG
F−Dの活性を干渉する、および/又は、VEGF−DのVEGF−3に対する
結合を干渉する、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞を作る方法
を提供し、この方法は、免疫適格哺乳動物を、図1(配列識別番号1)に記載の
アミノ酸配列を有するポリペプチド又は該ポリペプチドのフラグメントと、オプ
ションとして、リンクされたエピトープタグとを有する免疫原によって免疫する
工程と、前記免疫された免疫適格哺乳動物のリンパ球を得る工程と、前記リンパ
球を骨髄腫細胞と融合させてハイブリドーマ細胞を形成する工程と、前記ハイブ
リドーマ細胞によって作り出されたモノクローナル抗体(MAb)を図1(配列
識別番号1)に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドに対する特異的結合活
性および/又はVEGF−D干渉活性および/又はVEGF−D結合干渉活性に
関してスクリーニングする工程と、図1(配列識別番号1)に記載のアミノ酸配
列を有するポリペプチドに対する特異的結合活性および/又はVEGF−D干渉
活性および/又はVEGF−D結合干渉活性を有する前記モノクローナル抗体を
生成するハイブリドーマ細胞を培養する工程、とを有する。
リドーマ細胞のクローニングと、上記抗体を分泌させるための前記ハイブリドー
マの誘導、とをいう。
り誘導される少なくとも一つの生物活性を干渉する方法であって、この方法は、
効果的に生物活性を干渉する量の前記モノクローナル抗体を、前記哺乳動物に対
して投与する、又は、前記細胞培地に対して添加する工程を有する。
テストすることができる。具体的には、VEGF−Dは、血管内皮細胞および/
又はリンパ内皮細胞の増殖又は分化を非限定的に含む、内皮細胞の増殖又は分化
を刺激する能力を有する。考慮されるその他の生物活性としては、脈管形成、リ
ンパ管形成、及び血管及びリンパ管の透過性の誘導、がある。
されるVEGF−Dの活性を干渉可能な、および/又は、VEGF−Dの哺乳動
物VEGFR−3に対する結合を干渉可能な、抗体を含む組成物をいう。特に好
適な抗体は、VEGF−2よってに仲介されるVEGF−Dの活性を干渉する、
および/又は、VEGF−DのVEGF−3に対する結合は干渉するが、VEG
F−2に仲介されるVEGFの活性は干渉せず、VEGF−Cには結合しない。
性塩と、薬用的に許容可能な固体又は液体キャリア又はアジュバントとを有する
薬用組成物の提供に関する。そのようなキャリア又はアジュバントの具体例とし
ては、非限定的に、食塩水、緩衝食塩水、Ringer’s溶液、ミネラルオイ
ル、タルク、コーンスターチ、ゼラチン、ラクトース、スクロース、微結晶性セ
ルロース、カオリン、マンニトール、燐酸二カルシウム、塩化ナトリウム、アル
ギニン酸、デキストローズ、水、グリセロール、エタノール、濃化剤、安定化剤
、懸濁剤、及びそれらの組み合わせがある。それらの組成物は、溶液、懸濁液、
タブレット、カプセル、クリーム、塗剤(salve)、エリキシル、シロップ
、ウエハース、軟膏(ointment)、その他の従来の形状とすることがで
きる。その製剤形態は、投与形態に適したものとされる。PDGF−Cを有する
組成物は、約0.1wt.%〜90wt.%、最も一般的には約10%〜30%
の前記活性化合物(単数又は複数)を含んだものとなる。
は担当医師又は獣医の裁量によったものとなる。適当な投与経路としては、経口
、皮下、筋肉内、腹腔内、又は静脈注射、非経口、局所塗布、移植、等がある。
たとえば、有効量の抗体を、それを必要とする生物に対して、体重の約0.1〜
1000μg/kgの投与量、投与する。
及び関節疾患(arthopathies)の治療に於ける、脈管形成および/
又はリンパ管形成の抑止(suppression)又は抑制(inhibit
ion)がある。従って、本発明は、更に、そのような治療を必要とする哺乳動
物に於いて、脈管形成、リンパ管形成および/又は新血管形成、を干渉する方法
であって、前記哺乳動物に対して有効量の抗体を投与する工程を有する方法にも
関する。前記抗体は、少なくともVEGFR−2の活性化を阻止することによっ
て、VEGF−Dの活性を干渉する。
ループから選択される哺乳動物の病気に於いて、脈管形成、リンパ管形成および
/又は新血管形成から成るグループから選択される少なくとも一つの生物活性を
干渉する方法であって、効果的に脈管形成、リンパ管形成又は新血管形成を干渉
する量の抗体を前記哺乳動物に投与する工程を有する方法を提供する。上述した
ように、前記抗体は、少なくとも部分的には、VEGFR−2によって仲介され
るVEGF−Dの活性、および又はVEGFR−3に対するVEGF−Dの結合
、を干渉することによって、VEGF−Dの作用を干渉する。
に関連する圧迫性心不全等の状態を、前記体液貯留を妨げるために血管透過性に
対して相殺作用(offsetting effect)を提供することによっ
て治療するために使用することができる。従って、本発明は、哺乳動物に於ける
血管透過性の増大に依る、心臓および/又は肺の体液貯留を治療する方法を提供
する。この方法は、その治療を必要とする前記哺乳動物に対して、効果的に血管
透過性を減少させる量の抗体を投与する工程を有する。
て、前記サンプルを抗体に接触させる工程と、前記抗体に関係する結合を検出す
る工程とを有する方法を提供する。一好適実施例に於いて、前記結合および/又
は結合の程度は、検出可能な標識によって検出され、適当な標識は上述した通り
である。
予後判定装置を提供する。たとえば、本発明の一実施例に於いて、図1(配列識
別番号1)のポリペプチドに対する前記抗体と、この抗体とVEGF−Dとの結
合を検出するための手段とを有する、診断/予後判定装置が提供される。本発明
のこの診断/予後判定装置の一好適実施例に於いて、図1(配列識別番号1)の
ポリペプチドに対する前記抗体(1次抗体)と同じアイソタイプで同じ動物源の
抗体に対する第2の抗体(2次抗体)が提供される。この2次抗体は、検出可能
標識に結合され、その後、非標識1次抗体又はVEGF−Dが基質結合され、こ
れによって、前記1次抗体とVEGF−Dとの間の結合と、その後の前記標識2
次抗体の前記1次抗体に対する結合との後の、基質に結合した標識の量を測定す
ることによって、VEGF−D/1次抗体相互作用を確立することができる。本
発明の特に好適な実施例に於いて、前記診断/予後判定装置は、従来式の酵素結
合イムノソルベント検定法(ELISA)キットとして提供することができる。
互作用を干渉する化合物を同定する方法を提供する。この方法は、VEGFR−
3の細胞外ドメインを有するポリペプチドを基質に供する工程と、前記基質をV
EGF−Dと共に、同定対象化合物の存在下でインキュベートする工程と、VE
GFR−3とVEGF−Dとの間の相互作用を検出する工程、とを有する。
方法であって、前記組織を抗体に接触させる工程と、前記抗体の結合の発生を検
出する工程とを有する方法、を提供する。
オクタペプチド無し)のアミノ酸配列(配列識別番号1)を図示している。 図2は、VEGF−D△N△CへのBa/F3−NYK−EpoR細胞の応答
に対する前記モノクローナル抗体の作用を図示している。 図3Aと図3Bは、VEGF−D△N△Cに対する前記モノクローナル抗体の
相対結合アフィニティーを図示している。 図4は、マウスVEGF164へのBa/F3−NYK−EpoR細胞の応答に
対する前記モノクローナル抗体の作用を図示している。 図5は、VEGFR−3の細胞外ドメインへのVEGF−D△N△Cの結合に
対する抗−VEGF−D MAbの作用を図示している。
ド無しのポリペプチドアミノ酸配列(配列識別番号1)を図示している。
ノクローナル抗体をマウス中で産生した。本発明の抗体を産生するために免疫源
として使用されたポリペプチドは、そのN末端でタグされたFLAG(登録商標
)であった(下記の説明を参照)。このアミノ酸配列は、VEGF−Dの中心領
域であり、それは、VEGFファミリーのその他すべてのメンバと配列に於いて
類似している。従って、VEGF−Dの生物活性部位は、その保存領域に恐らく
存在しているものと考えられる。ヒトVEGF−Dの残基93から201の、即
ちN及びC末端領域が除去された、切断部分(truncated porti
on)をコードするDNAフラグメントを、全長ヒトVEGF−DcDNAを有
するプラスミドをテンプレートとして使用して、Pfu DNAポリメラーゼに
よりポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって増幅した。その配列をヌクレオチ
ド配列決定によって確認したこの増幅されたDNAフラグメントを、次に、発現
ベクターpEFBOSSFLAG(Walter and Eliza Hal
l Institute for Medical Research(WEH
I),メルボルン、オーストラリア、のクレア・マクファーレン(Clare
McFarlane)博士からの贈呈物)に挿入して、pEFBOSVEGF−
D△N△Cと称するプラスミドを得た。このpEFBOSSFLAGベクターは
、インターロイキン−3(IL−3)遺伝子及びFLAG(登録商標)オクタペ
プチドからのタンパク質分泌物のためのシグナル配列をコードするDNAを含ん
でいる。前記FLAG(登録商標)オクタペプチド(Sigma,セントルイス
,MO)は、M2モノクローナル抗体(Sigma,セントルイス,MO)等の
市販の抗体によって認識可能である。VEGF−D PCRフラグメントを、前
記ベクターに挿入すると、IL−3シグナル配列は、前記FLAG(登録商標)
オクタペプチドのすぐ上流側に位置しているので、このオクタペプチドは前記切
断VEGF−D配列のすぐ上流側に位置することになった。これら三つの配列は
すべて、同じ読み取り枠内にあったので、pEFBOSVEGF−D△N△Cの
哺乳動物細胞へのトランスフェクションから起こったmRNAの翻訳によって、
そのN末端にIL−3シグナル配列を有し、その後に、前記FLAG(登録商標
)オクタペプチドと前記切断VEGF−D配列を有するタンパク質が得られるで
あろう。前記シグナル配列の開裂と、それに続く細胞からの前記タンパク質の分
泌とによって、N末端の近傍で前記FLAG(登録商標)オクタペプチドによっ
てタグされたVEGF−Dポリペプチドが得られるであろう。このタンパク質を
、VEGF−D△N△Cと命名した。VEGF−D△N△Cを、前記プラスミド
pEFBOSVEGF−D△N△Cと過渡的にトランスフェクトしておいたCO
S細胞の培地から抗−FLAG(登録商標)アフィニティークロマトグラフィー
によって精製した(国際特許出願PCT/US97/14696の例9を参照)
。
ミエローマP3X63Ag8.653(NS−1)細胞への融合の前の、85日
目(腹膜内)、71日目(腹膜内)及び4日目(静脈内)に、精製されたVEG
F−D△N△Cを使用して、メスBalb/Cマウスを免疫した。最初の二回の
免疫に於いては、約10μgのVEGF−D△N△Cと、燐酸緩衝食塩水(PB
S)とTiterMaxアジュバント(#R−1 リサーチアジュバント:Cy
tRx Corp.,Norcross,GA)との1:1の混合物と、注射し
た。これに対して第3回目の免疫に於いては、PBS中に含まれた35μgのV
EGF−D△N△Cを使用した。
アッセイを使用して精製VEGF−D△N△C上でハイブリドーマによって産生
されたMAbをスクリーニングすることによって選択した。簡単に説明すると、
96−ウェルのマイクロタイタープレートを、VEGF−D△N△Cでコーティ
ングし、その後、ハイブリドーマ上澄みを添加し、4℃で2時間インキュベート
し、その後、0.02%Tween20を含むPBS中で6回洗浄した。その後
、ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合抗マウスIg(Bio−Rad,H
ercules,CA)とのインキュベーションを1時間、4℃で行った。洗浄
後、前記アッセイを、2,2‘−アジノ−ジ−(3−エチルベンズ−チアゾリン
スルホン酸(ABTS)基質システム(Zymed,サンフランシスコ,CA)
で発現させ(developed)、そのアッセイを、マルチウェルプレートリ
ーダー(Flow Laboratories MCC/340,McLean
,VA)で405nmでの吸光度を読み取ることによって量化した。更なる分析
のために6の抗体を選択し、これらを、制限希釈によって2回サブクローニング
した。これらの抗体を2F8,3C10,4A5,4E10,4H4及び5F1
2と命名した。これらの抗体のアイソタイプを、IsostripTMアイソタイ
プキット(Boehringer Mannheim,インディアナポリス,I
N)を使用して判定した。抗体2F8,4A5,4E10及び5F12はIgG 1 クラスであったのに対して、4H4と3C10はIgMクラスであった。これ
ら6つの抗体はすべてカッパL鎖(kappa light chain)を含
んでいた。
BRL,Gaithersburg,MD)、5mMのL−グルタミン、50μ
g/mlのゲンタマイシン及び10μg/mlの組換えIL−6を含むでダルベ
ッコ調整イーグル培地(DMEM)中で育成した。抗体2F8,4A5,4E1
0及び5F12を、ダービー(Darby)他、J.Immunol.Meth
ods 159:125−129,1993の方法によって、プロテインG−セ
ファロースを使用したアフィニティークロマトグラフィーによって精製し、その
産物を280nmでの吸光度を測定することによって評価した。
MAb、2F8,4A5,4E10及び5F12の相対的結合アフィニティーを
、ナイス(Nice)とカチメル(Catimel)の方法,Bioassay
s 21:339−352,1999に依る表面プラスモン共振を使用したバイ
オセンサ研究によって、これらの相互作用に対する結合反応(binding
kinetics)の分析によって判定した。VEGFR−2−FLAG,VE
GFR−3−Ig及び抗−VEGF−Dモノクローナル抗体を、ナイス(Nic
e)とカチメル(Catimel),Bioassays 21:339−35
2,1999に記載されているように標準アミン結合化学作用を使用したセンサ
ーチップのカルボキシメチル化デキストラン層に結合させた(それぞれ、4.7
,5.2,5.7及び5.6ng/mm2に対応して固定化されたVDI 47
39RU,VD2 5268 RU,VD3 5781 RU及びVD4 56
34 RU(ステンバーグ(Stenberg)他、J.Colloid In
terface 43:513−526,1990))。リガンド結合を、BI
Acore3000光学バイオセンサ(BIAcore,Uppsala、スウ
ェーデン)を使用して、分析した。固定化レベルの自動的標的化を、BIAco
re3.1制御ソフトウエア(カチメル(Catimel)他、J.Chrom
atogr.A.776:15−39,1997)を使用して達成した。固定化
後、残余の活性化エステル基を、1MのエタノールアミンヒドロクロリドpH8
.5による処理によってブロックした。その後、10mMのジメチルアミンでの
洗浄によって、非共役結合物質を除去するとともに、分析間のセンサ表面を再生
した。アッセイのサンプルを、ランニングバッファー(10mM HEPES,
pH7.4,150mM NaCl,3.4mM EDTA,0.005%Tw
een20)中で希釈した。ヒトVEGF−D△N△Cを表面(41−689n
M)上で10μl/分の流量で流すことによって結合曲線が得られた。ヒトVE
GF−D△N△Cに対する抗体の相対結合アフィニティーの判定の為に、カチメ
ル(Catimel)他、J.Chromatogr.A.776:15−39
,1997に記載されているように、BIAevaluation3.0(BI
Acore,Uppsala、スウェーデン)を使用してデータを分析した。最
初の分離相を分析したkdを得て、次に、これを使用して1:1ラングミュアモ
デルが有効である曲線の関連領域のグローバル分析を固定(constrain
)することによって結合定数が得られた。ヒトVEGF−D△N△Cに対する抗
体の相対的結合アフィニティーのこれらの分析を下記の表に示す。抗体は固定化
されていたので、前記リガンドの原子価(valency)は1と見做された。
全ての抗体は、ksが7.4〜10.7x104M-1s-1、kdが2.1〜5.2
x10-3s-1で、類似のアフィニティー(kDが30〜60nM)を示した。
ッセイを使用して、前記精製モノクローナル抗体(MAb)2F8,4A5,4
E10及び5F12の、マウスVEGFR−2(FlklとNykとしても知ら
れている)によって仲介されるVEGF−D△N△Cの活性を干渉する能力をテ
ストした。前記バイオアッセイは、国際特許出願PCT/US95/16755
にも記載されている。このアッセイは、VEGFR−3の細胞外ドメインと、エ
リトロポイエチンレセプター(EpoR)の細胞質ドメインとから成るキメラレ
セプターをコードするプラスミド構造物でトランスフェクトされたBa/F3
pre−B細胞(Ba/F3−NYK−EpoR細胞)を使用するものである。
これらの細胞は、ルーチン的にインターロイキン−3(IL−3)で継代(pa
ssaged)され、IL−3の不在下では死滅する。しかしながら、もしも前
記キメラレセプターの細胞質ドメインからシグナリングが誘導されれば、これら
の細胞はIL−3の不在下で生存し増殖する。そのようなシグナリングは、前記
キメラレセプターのVEGFR−2細胞外ドメインに結合するリガンドによって
誘導される。従って、VEGF−D△N△C又はVEGFのVEGFR−2細胞
外ドメインへの結合によって、前記細胞は、IL−3の不在下で生存、増殖され
る。そのようなリガンドの前記細胞外ドメインへの結合、又は、前記細胞質ドメ
インの活性化、を干渉する抗体の添加によって、IL−3の不在下に於ける細胞
死が起こる。前記キメラレセプターを欠く親Ba/F3細胞は、IL−3の不在
下に於いてVEGF/D△N△C又はVEGFによって誘導されて増殖せず、こ
れは、これらのリガンドに対するBa/F3−NYK−EpoR細胞の応答が前
記キメラレセプターに完全に依存するものであることを示している。
℃で、この混合物をIL−3欠如細胞培養培地との1:10の希釈の前に、PB
S中でインキュベートした。これによって得られた媒質(media)は、約5
00ng/mlのVEGF−D△N△Cと、最高100μg/mlまでの種々の
濃度の抗体とを含有していた。次に、Ba/F3−NYK−EpoR細胞を、前
記媒質中で48時間、37℃でインキュベートした。次に、DNA分析を、採収
の前に、1μCiの3H−チミジンの添加と、更に4時間インキュベーションす
ることによって、量化した。導入された3H−チミジンを、セル-ハーベスター(
Tomtec(登録商標),オレンジ、Conn)とベータ計数とを使用して測
定した。VEGF−D△N△Cに対するBa/F3−NYK−EpoRの増殖応
答に対する抗体2F8,4A5,4E10及び5F12の作用が図2に図示され
ており、ここで、データポイントは、二つの実験の平均を示し、エラーバーは、
各ポイントに於ける二つの実験の範囲を表わしている。
YK−EpoR細胞の応答を阻止した(図2)。培養培地に抗体4A5を40μ
g/ml添加することで、細胞の応答を完全に阻止するのに十分であった。これ
に対して、その他の三つの抗体は、ほぼ80μg/mlの濃度に於いても、応答
に対して検出可能な作用を示さなかった。これらの結果は、抗体4A5が、VE
GFR−2によって仲介されるVEGF−Dの活性を干渉することを示している
。抗体4A5を産生するマウスハイブリドーマ細胞4A5Aは、既にAmeri
can Type Culture Collection(ATCC)Man
assas,va 20110−2209 USAに1999年4月16日に寄
託されている(ATCC#HB−12698)。この寄託は、特許手続の為の微
生物寄託の国際認識に関するブタペスト条約の要求に基づいて行われた。
GF−D△N△Cのレセプターへの結合、又は、その後のレセプタークロスリン
クを妨げる作用である可能性がある。例IVのバイオアッセイでは、これら二つ
による干渉の異なるメカニズムを区別することができない。前記4種類の抗−V
EGF−D△N△C MAb,2F8,4A5,4E10及び5F12の、VE
GF−D△N△Cのそれぞれのレセプターへの結合に対する作用を直接調べるた
めに、VEGF−D△N△Cと固定化レセプター細胞外ドメインとの相互作用を
バイオセンサーを使用して分析した。マウスVEGFR−2の細胞外ドメイン(
VEGFR−2−FLAG)と、ヒトVEGFR−3の細胞外ドメインと、ヒト
IgG1のFc部分(VEGFR−3−Ig)とから成るキメラタンパク質とを
、例IIIに記載したようにセンサーチップ上に固定した(4677と5113
RUとは、それぞれ4.7,5.1ng/mm2に均等に固定)。前記抗体のレ
セプター相互作用に対する影響を、種々の濃度(37.5〜1200nM)のV
EGF−D△N△Cの抗体とPBS中で4℃で1時間予めインキュベートしてお
いた精製ヒトVEGF−D△N△C(61nM)との混合物を流すことによって
測定した。図3A及び3Bに図示されているように、2ng/mlのヒトVEG
F−D△N△Cと、種々の濃度の抗体とを含む前記混合物の30μlのアリコッ
トを、10μl/mlの流率で前記センサーチップ上に注入した。図3A及び3
Bは、このアッセイの結果を示している。抗体4A5は、両方のレセプターへの
結合をほぼ完全に阻止するのに十分であった。抗体2F8と5F12とも、両方
のレセプターとの相互作用を抑制したが、但し、4A5よりも遥かに高い抗体濃
度に於いてであった。両方のレセプターに対する結合をほぼ完全に阻止するため
に、約40倍のモルの2F8及び5F12が必要であった。これに対して、4E
10は、僅かな作用しかなかった。これらのデータは、抗体4A5,2F8及び
5F12は、VEGF−Dの生物学的機能の分析と、臨床用途に於いてVEGF
−Dの生物活性を抑制するのとに有用であろう、ということを示している。結合
の抑制の率を、競合物質(RUc)の存在下に於ける分離段階の初期に観察され
たバイオセンサシグナルと、非特異的対照抗体(抗−EGFR MAb 528
(8))(RUt)の存在下に於いてVEGF−D△N△Cを2μg/mlで注
入した時に観察されたシグナルとを使用して、次の式:%競合=RUt−RUc
/RUt x 100によって計算した。
F164に対する増殖反応を干渉する能力をテストした。これらのテストの結果を
図4に示す。前記抗体はいずれも、前記細胞のマウスVEGF164に対する増殖
反応に対して有意な作用を示さなかった。これらの結果は、抗体4A5は、VE
GFR−2によって仲介されるVEGF−Dの活性は干渉するが、このレセプタ
ーによって仲介されるVEGFの活性は干渉しないということを示している。
D MAbの、VEGF−C△N△Cに結合する能力をテストした。VEGF−
C△N△Cは、VEGF−CのVEGF相同ドメイン(VHD)(残基103〜
215)から成り、これは、VEGF−D△N△Cに対してほぼ同一であるVE
GF−Cの領域である。そのC末端に予め6Xヒスチジンタグを添加しておいた
VEGF−C△N△Cを、製造業者の指示に従って、発現ベクタpIC9(In
vitrogen,サンディエゴ,CA)を使用して酵母P.pastoris
のGS115株において発現させ、Ni−NTA Superflow樹脂(Q
IAGEN,バレンシア、CA)を使用して精製した。このイムノアッセイによ
ってテストされた前記6種類の抗体の内、4E10のみがVEGF−C△N△C
に結合した。
F−D△N△C MAb、2F8,4A5,4E10及び5F12が、VEGF
R−3の細胞外ドメインへのVEGF−D△N△Cの結合を干渉する能力をテス
トした。ヒトVEGFR−3の細胞外ドメインと、ヒトIgGのFc部分とから
成るキメラタンパク質をコードするプラスミド構造物(K.Pajusola,
Biotechnology Institute,ヘルシンキ)を、その製造
業者の指示に従って、Fugene6(Boehringer Mannhei
m,ドイツ)を使用して293−EBNA細胞にトランスフェクトした。前記キ
メラタンパク質を、プロテインAセファロースビーズ(Amersham,UK
)と一晩4℃でゆっくりと攪拌させ、100mMのグリシン−HCl,pH2.
8で溶出させることによって細胞上清から精製した。溶出液中の前記キメラタン
パク質の存在を、ウェスタンブロット分析用のサンプルの小部分を、ペルオキシ
ダーゼ結合アフィニティー精製ヤギ抗−ヒトIgG,Fcフラグメント−特異的
抗体(Jackson Immunoresearch Labs.,ウエスト
グルーブ,PA)と使用して確認した。前記サンプルの残りを、50mMの重炭
酸ナトリウム緩衝液(sodium bicarbonate buffer)
(pH9.6)と1:3で希釈し、Centricon10濃縮器(Amico
n,ベバリー,MA)を使用して約4倍に濃縮し、96−ウェルマイクロタイタ
ープレート(Linbro/Titertek,ICN Biomedical
s,オーロラ、OH)のウェル中で、37℃で1時間インキュベートした。前記
キメラタンパク質を含有する溶液を除去した後、プレートを、PBSと0.05
% Tween 20(PT20)とでよく洗浄し、PBS中で1%のウシ血清
アルブミンで、室温で30分間ブロックした。これらのプレートを、PT20で
再度洗浄し、次に、VEGF−D△N△C(7.3μg/ml)とMAbとを含
有するPBSと共に室温で1時間インキュベートした。前記マイクロタイタープ
レートを添加する前に、前記VEGF−D△N△CとMAbとは、予め、1時間
、4℃でインキュベートしておいた。VEGF−D△N△CとMAbとの溶液と
のインキュベーション後、前記プレートを、PT20で洗浄し、3.5μg/m
lのビオチン化(biotinylated)M2抗−FLAG MAb(Si
gma,セントルイス、MO)を含有するPBSと、2時間4℃で振とうするこ
とによってインキュベートした。ポリヌクレオチドがFLAG(登録商標)オク
タペプチド(Sigma,セントルイス、MO)によつてN末端にタグされてい
るので、M2 MAbを使用して、前記レセプター−結合アッセイに於いてVE
GFR−3に結合したVEGF−D△N△Cを検出するために使用することがで
きた。これらプレートを、次に、PT20で洗浄し、ストレプトアビジン−ペル
オキシダーゼ共役物(Boehringer Mannheim,ドイツ)と1
時間4℃で振とうすることによってインキュベートし、PT20で再び洗浄した
。次に、このアッセイを、ABTS基質システム(Zymed,サンフランシス
コ、CA)で発現させ、マルチウェルプレートリーダ(Flow Labora
tories MCC/340,McLean,VA)で414nmでの吸光度
を読み取ることによって量化した。
93−EBNA細胞を、ヒトVEGFR−1の細胞外ドメインと、ヒトIgGの
Fc部位とから成るキメラタンパク質を発現するプラスミド構造物(E.Kor
pelainen,Haartman Institute,ヘルシンキ)とト
ランスフェクトした。293−EBNA細胞のトランスフェクション、キメラタ
ンパク質の精製、ウェスタンブロットによる分析、及び結合アッセイ(MAbの
不在下)は、全く上述したものと同様に行われた。VEGF−D△N△CはVE
GFR−1に結合しないので、VEGFR−1/Igタンパク質は、前記アッセ
イのネガティブコントロールとして作用する。第2に、293−EBNA細胞を
、VEGFレセプターをコードする配列が欠如した発現ベクターとトランスフェ
クトした。これらの細胞からの培養上清を、VEGFR−3/IgとVEGFR
−1/Igキメラタンパク質とを含むものと全く同様に使用した。
るか否かをテストするために、アフィニティー精製VEGF−D△N△Cを、5
0mMの重炭酸ナトリウム緩衝液(pH9.6)中で37℃、1時間のインキュ
ベーションによってマイクロタイタープレートの表面上にコーティングした。次
に、これらプレートを、PT20で洗浄し、抗−VEGF−D MAbの存在下
又は不在下で、1時間4℃でインキュベートし、PT20で再び洗浄し、ビオチ
ン化M2 MAbとインキュベートし、洗浄し、発現し、上述したようにして量
化した。これらのコントロールアッセイは、一定量のVEGF−D△N△Cと、
前記レセプター結合アッセイに於いて使用したものと同じ濃度範囲の前記4種類
の抗−VEGF−D MAbとを使用して行われた。更に、一定濃度の各MAb
(200μg/ml)と、約100倍の濃度範囲のVEGF−D△N△Cとで対
照(control)を行った。これら両セットのコントロールに於いて、ビオ
チン化M2 MAbによるVEGF−D△N△Cの検出は、これらアッセイに於
ける抗−VEGF−D MAb又はVEGF−D△N△Cの濃度と関係無く、抗
−VEGF−D MAbの存在下又は不在下に於いて同じであった。これらのコ
ントロールアッセイは、テストされたこれら4種類のMAbのいずれも、M2
MAbのVEGF−D△N△Cへの結合に対してなんら影響しないことを示した
。
3への結合に対する作用を図4に示す。MAb濃度は、前記マイクロタイタープ
レートのウェル中に於けるVEGF−D△N△Cとの溶液中の各MAbの濃度を
示している。各曲線は、二つのアッセイの結果を表わし、エラーバーは、各抗体
濃度に於いて二つの実験で測定された吸光度の範囲を示している。MAb 4E
10は、200μg/mlの濃度までは、この相互作用にたいして作用を示さな
かった。これに対して、MAb 4A5は、25μg/mlの濃度で、前記リガ
ンドとVEGFR−3の細胞外ドメインとの間の相互作用をほぼ完全に妨げるの
に十分であった。MAb 2F8と5F12とは、90μg/ml以上の濃度に
於いて僅かな抑制作用しか示さず、これらは、4A5の作用と比較すると顕著に
低いものであった。VEGFR−1/Igキメラタンパク質を発現する細胞、又
はVEGFレセプター誘導体を発現しない細胞は、MAb 4A5が200μg
/mlの濃度で含まれていた時、即ち、VEGF−D△N△CとVEGFR−3
との相互作用が完全に妨げられた時、のVEGFR−3/Igアッセイのそれに
等しい吸光度を示した。これは、これらアッセイに於けるVEGF−D△N△C
のマイクロタイタープレートに対する結合が、VEGFR−3の細胞外ドメイン
に依存していることを示すものであった。
のではない。当業者は本発明の精神及び要旨を含むここに開示した実施例の改変
を想到する可能性があるので、本発明は、添付のクレームの範囲に含まれるそれ
らすべての改変構造及びそれらの均等物を含むものと広く解釈されるべきである
。
チド無し)のアミノ酸配列(配列識別番号1)を示している図
記モノクローナル抗体の作用を示している図
ーを示している図
ーを示している図
モノクローナル抗体の作用を示している図
VEGF−D MAbの作用を示している図
Claims (45)
- 【請求項1】 図1(配列識別番号1)に記載のアミノ酸配列を有するポリ
ペプチドと特異的に反応する抗体を有する組成物であって、前記抗体は、モノク
ローナル抗体又は、そのF(ab’)2,F(ab’),F(ab)フラグメン
ト、又はキメラ抗体である。 - 【請求項2】 前記抗体は検出可能標識によって標識される、請求項1の組
成物。 - 【請求項3】 前記検出可能標識は放射性同位体である、請求項2の組成物
。 - 【請求項4】 前記抗体はヒト化抗体である、請求項1の組成物。
- 【請求項5】 前記抗体は、MAb 2F8,MAb 4A5,MAb 4
E10,MAb 5F12,MAb 4H4及びMAb 3C10、又は、その
F(ab’)2,F(ab’),又はF(ab)フラグメントから成るグループ
から選択される、請求項1の組成物。 - 【請求項6】 前記抗体は、MAb 4A5又は、そのF(ab’)2,F
(ab’),又はF(ab)フラグメントである、請求項1の組成物。 - 【請求項7】 VEGFレセプター−2によって仲介されるVEGF−Dの
活性を干渉する抗体を有する組成物であって、前記抗体は、モノクローナル抗体
又は、そのF(ab’)2,F(ab’),F(ab)フラグメント、又はキメ
ラ抗体である。 - 【請求項8】 前記抗体は、VEGFレセプター−2によって仲介されるV
EGFの活性は干渉しない、請求項7の組成物。 - 【請求項9】 前記抗体は、VEGF−Cには結合しない、請求項7の組成
物。 - 【請求項10】 前記抗体は、VEGF−DのVEGFレセプター−3に対
する結合を干渉する、請求項7の組成物。 - 【請求項11】 前記抗体はヒト化抗体である、請求項7の組成物。
- 【請求項12】 前記抗体は、MAb 4A5又は、そのF(ab’)2,
F(ab’),又はF(ab)フラグメントである、請求項7の組成物。 - 【請求項13】 請求項1のモノクローナル抗体を製造する方法であって、
以下の工程を有する、 a)免疫適格哺乳動物を、図1(配列識別番号1)に記載のアミノ酸配列を有
するポリペプチド又は該ポリペプチドのフラグメントを有する免疫原、によって
免疫する、 b)前記免疫された免疫適格哺乳動物のリンパ球を、骨髄腫細胞と融合させて
ハイブリドーマ細胞を形成する、 c)前記工程b)の前記ハイブリドーマ細胞によって産生されたモノクローナ
ル抗体を図1(配列識別番号1)に記載のアミノ酸配列を有する前記ポリペプチ
ドに対する特異的結合活性に関してスクリーニングする、 d)図1(配列識別番号1)に記載のアミノ酸配列を有する前記ポリペプチド
に対する特異的結合活性を有するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ
細胞を、培地で培養して、増殖させ、および/又は、前記モノクローナル抗体を
分泌させる、そして、 e)前記モノクローナル抗体を前記培養上清から回収する。 - 【請求項14】 前記免疫適格哺乳動物はマウスである、請求項13の方法
。 - 【請求項15】 前記免疫適格哺乳動物はラットである、請求項13の方法
。 - 【請求項16】 請求項1のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ
細胞。 - 【請求項17】 請求項1のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ
を製造する方法であって、以下の工程を有する、 a)免疫適格哺乳動物を、図1(配列識別番号1)に記載のアミノ酸配列を有
するポリペプチド又は該ポリペプチドのフラグメントを有する免疫原、によって
免疫する、 b)前記免疫された免疫適格哺乳動物のリンパ球を得る、 c)前記リンパ球を骨髄腫細胞と融合させてハイブリドーマ細胞を形成する、
そして、 d)前記工程c)の前記ハイブリドーマ細胞によって産生されたモノクローナ
ル抗体を図1(配列識別番号1)に記載のアミノ酸配列を有する前記ポリペプチ
ドに対する特異的結合活性に関してスクリーニングする、 e)図1(配列識別番号1)に記載のアミノ酸配列を有する前記ポリペプチド
に対する特異的結合活性を有するモノクローナル抗体を産生する前記工程d)の
ハイブリドーマ細胞を培養する。 - 【請求項18】 生物サンプル中のVEGF−Dを検出する方法であって、
前記サンプルを請求項1の抗体と接触させる工程と、前記抗体に対する結合の発
生を検出する工程とを有する方法。 - 【請求項19】 VEGF−Dのための診断/予後判定テストキットであっ
て、請求項1の抗体と、前記抗体の結合を検出するための手段とを有する。 - 【請求項20】 薬用組成物であって、請求項1の抗体と、薬用的に許容可
能なキャリア又はアジュバントとを有する。 - 【請求項21】 請求項7のモノクローナル抗体を製造する方法であって、
以下の工程を有する、 a)免疫適格哺乳動物を、図1(配列識別番号1)に記載のアミノ酸配列を有
するポリペプチド又は該ポリペプチドのフラグメントを有する免疫原、によって
免疫する、 b)前記免疫された免疫適格哺乳動物のリンパ球を、骨髄腫細胞と融合させて
ハイブリドーマ細胞を形成する、 c)前記工程b)の前記ハイブリドーマ細胞によって産生されたモノクローナ
ル抗体をVEGF−D干渉活性に関してスクリーニングする、 d)VEGF−D干渉活性を有する前記工程c)のモノクローナル抗体を産生
するハイブリドーマ細胞を、培地で培養して、増殖させ、および/又は、前記モ
ノクローナル抗体を分泌させる、そして、 e)前記モノクローナル抗体を前記培養上清から回収する。 - 【請求項22】 前記免疫適格哺乳動物はマウスである、請求項21の方法
。 - 【請求項23】 前記免疫適格哺乳動物はラットである、請求項21の方法
。 - 【請求項24】 請求項7のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ
細胞。 - 【請求項25】 請求項7のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ
を製造する方法であって、以下の工程を有する、 a)免疫適格哺乳動物を、図1(配列識別番号1)に記載のアミノ酸配列を有
するポリペプチド又は該ポリペプチドのフラグメントを有する免疫原、によって
免疫する、 b)前記免疫された免疫適格哺乳動物のリンパ球を得る、 c)前記リンパ球を骨髄腫細胞と融合させてハイブリドーマ細胞を形成する、
そして、 d)前記工程c)の前記ハイブリドーマ細胞によって産生されたモノクローナ
ル抗体をVEGF−D干渉活性に関してスクリーニングする、 e)VEGF−D干渉活性モノクローナル抗体を産生する前記工程d)のハイ
ブリドーマ細胞を培養する。 - 【請求項26】 血管透過性、内皮細胞増殖、脈管形成、リンパ管形成、及
び内皮細胞分化から選択されるVEGF−Dによって誘導される少なくとも一つ
の生物活性を干渉する方法であって、効果的に生物活性を干渉する量の請求項7
の抗体を投与する工程を有する。 - 【請求項27】 哺乳動物に於ける脈管形成、リンパ管形成及び新血管新生
から選択される少なくとも一つの生物活性を干渉する方法であって、前記哺乳動
物に対して、効果的に脈管形成、リンパ管形成又は新血管新生を干渉する量の請
求項7の抗体を投与する工程を有する。 - 【請求項28】 ガン、糖尿病網膜症、乾癬症、及び関節疾患のグループか
ら選択される哺乳動物の病気において、脈管形成、リンパ管形成及び新血管新生
から選択される少なくとも一つの生物活性を干渉する方法であって、前記哺乳動
物に対して、効果的に脈管形成、リンパ管形成及び新血管新生を干渉する量の請
求項7の抗体を投与する工程を有する。 - 【請求項29】 生物サンプル中のVEGF−Dを検出する方法であって、
前記サンプルを請求項7の抗体と接触させる工程と、前記抗体の結合の発生を検
出する工程とを有する。 - 【請求項30】 哺乳動物の血管透過性を調節する方法であって、前記哺乳
動物に対して、効果的に血管透過性を調節する量の請求項7の抗体を投与する工
程を有する。 - 【請求項31】 VEGF−Dのための診断/予後判定テストキットであっ
て、請求項7の抗体と、前記抗体の結合を検出するための手段とを有する。 - 【請求項32】 哺乳動物の血管透過性の増大に依る心臓および/又は肺内
の体液貯留を治療する方法であって、前記方法は、前記哺乳動物に対して、効果
的に血管透過性を低減させる量の請求項7の抗体を投与する工程を有する。 - 【請求項33】 薬用組成物であって、請求項7の抗体と、薬用的に許容可
能なキャリア又はアジュバントとを有する。 - 【請求項34】 VEGFレセプター−3へのVEGF−Dの結合を干渉す
る抗体を有する組成物であって、前記抗体は、モノクローナル抗体又は、そのF
(ab’)2,F(ab’),F(ab)フラグメント、又はキメラ抗体である
。 - 【請求項35】 前記抗体はヒト化抗体である、請求項34の組成物。
- 【請求項36】 前記抗体は、MAb 4A5又は、そのF(ab’)2,
F(ab’),又はF(ab)フラグメントである、請求項34の組成物。 - 【請求項37】 VEGF−Dによって誘導される生物活性を干渉する薬用
組成物であって、請求項34の抗体と、薬用的に許容可能なキャリア又はアジュ
バントとを有する。 - 【請求項38】 組織中のリンパ管構造をイメージングする方法であって、
前記組織を請求項34の抗体に接触させる工程と、前記抗体の結合の発生を検出
する工程とを有する。 - 【請求項39】 請求項34のモノクローナル抗体を製造する方法であって
、以下の工程を有する、 a)免疫適格哺乳動物を、図1(配列識別番号1)に記載のアミノ酸配列を有
するポリペプチド又は該ポリペプチドのフラグメントを有する免疫原、によって
免疫する、 b)前記免疫された免疫適格哺乳動物のリンパ球を、骨髄腫細胞と融合させて
ハイブリドーマ細胞を形成する、 c)前記工程b)の前記ハイブリドーマ細胞によって産生されたモノクローナ
ル抗体をVEGF−D結合干渉活性に関してスクリーニングする、 d)VEGF−D結合干渉活性を有する前記工程c)のモノクローナル抗体を
産生するハイブリドーマ細胞を、培地で培養して、増殖させ、および/又は、前
記モノクローナル抗体を分泌させる、そして、 e)前記モノクローナル抗体を前記培養上清から回収する。 - 【請求項40】 請求項34のモノクローナル抗体を産生するハイブリドー
マ細胞。 - 【請求項41】 請求項34のモノクローナル抗体を産生するハイブリドー
マを製造する方法であって、以下の工程を有する、 a)免疫適格哺乳動物を、図1(配列識別番号1)に記載のアミノ酸配列を有
するポリペプチド又は該ポリペプチドのフラグメントを有する免疫原、によって
免疫する、 b)前記免疫された免疫適格哺乳動物のリンパ球を得る、 c)前記リンパ球を骨髄腫細胞と融合させてハイブリドーマ細胞を形成する、
そして、 d)前記工程c)の前記ハイブリドーマ細胞によって作り出されたモノクロー
ナル抗体をVEGF−D結合干渉活性に関してスクリーニングする、そして、 e)VEGF−D結合干渉モノクローナル抗体を産生する前記工程d)のハイ
ブリドーマ細胞を培養する。 - 【請求項42】 VEGFR−3とVEGF−Dとの間の相互作用を干渉す
る化合物を同定する方法であって以下の工程を有する、 a)VEGFR−3の細胞外ドメインを有するポリペプチドを基質に供する、 b)前記工程a)の基質をVEGF−Dと共に、同定対象化合物の存在下でイ
ンキュベートする、そして、 c)VEGFR−3とVEGF−Dとの間の相互作用を検出する。 - 【請求項43】 VEGF−DとVEGF−Cとの両方に対して交差反応性
である抗体を有する組成物。 - 【請求項44】 請求項43の組成物であって、前記抗体は、ヒト化抗体で
ある。 - 【請求項45】 請求項43の組成物であって、前記抗体は、MAb 4E
10又は、そのF(ab’)2,F(ab’),又はF(ab)フラグメントで
ある。
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