JP4632543B2 - 切断vegf−dの抗体及びその利用法 - Google Patents
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Description
本発明は、図1(配列識別番号1)に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドに対して特異的に反応する抗体を有する組成物に関する。前記抗体は、モノクローナル抗体(MAbs)、免疫反応性フラグメント、又はその組換え体を含む。本発明は、更に、これらの抗体を利用した薬用及び診断用組成物及び方法にも関する。
【0002】
発明の背景
発育途上の胎児に於いて、一次血管網状組織が、血管生成(vasculogenesis)と呼ばれるプロセスに於いて中胚葉細胞のインサイチュ分化によって確立される。胎児における新しい血管の生成に関連するすべてのその後のプロセスと、成体に於ける新血管新生(neovascularization)は、脈管形成(angiogenesis)と呼ばれるプロセスに於ける既存の血管からの新しい毛細管の発芽又は分裂によって支配されているものと考えられている(ペッパー(Pepper)等、Enzyme&Protein,1996 49 138−162;ブライアー(Breier)等、Dev.Dyn.1995 204 228−239;リソー(Risau)、Nature,1997 386 671−674)。脈管形成は、胚発達と正常な組織成長、修復及び再生のみならず、女性の生殖サイクル、妊娠状態の確立及び維持、そして、損傷及び破損の修復にも関連している。正常な個体に於いて行われる脈管形成の他に、脈管形成現象は、多数の病理プロセス、特に腫瘍の成長と転移、そして、糖尿病網膜症、乾癬症、及び関節疾患(arthropathies)等のように、血管増殖、特に微小血管系の血管形成、が増加する、その他の状態、に関連している。脈管形成の抑制は、これらの病理的プロセスを防止又は軽減するのに有用である。
【0003】
他方、たとえば、組織又は器官移植後等、血管新生を確立又は拡張したり、或いは、冠状動脈心臓疾患や血栓性閉塞性動脈炎等に於けるように、組織梗塞又は動脈狭窄に於いて側副血行の形成を刺激する為、等の状況においては脈管形成を促進することが望ましい。
【0004】
脈管形成プロセスは高度に複雑であって、細胞サイクルに於ける内皮細胞の維持、細胞外マトリクスの分解、周囲の組織の遊走と浸潤、そして最後に管腔形成、に関連している。これら複雑な脈管形成プロセスの背後の分子メカニズムはまだほとんど判っていない。
【0005】
脈管形成は非常に多くの生理的、及び、病理的プロセスに重要な役割を果たしているので、脈管形成の制御に関連している因子が集中的に研究されている。多くの増殖因子が、脈管形成の調節に関連していることが示されている。これらのものとしては、線維芽細胞増殖因子(FGF)、血小板由来増殖因子(PDGF)、トランスフォーミング増殖因子アルファ(TGFα)、及び肝細胞増殖因子(HGF)がある。たとえば、フォークマン(Falkman)等、J.Biol.Chem.,1992 267 10931−10934を参照。
【0006】
特定のファミリーの内皮細胞特異的増殖因子、血管内皮増殖因子(VEGF)、それらに対応するレセプターが、内皮細胞の増殖と分化の刺激と、分化細胞の或る種の機能とに主に寄与していることが示唆されている。これらの因子は、PDGFファミリーのメンバーであって、主に内皮レセプターチロシンキナーゼ(RTK)を介して作用しているように思える。
【0007】
PDGFファミリー中に於いて9種類のタンパク質、即ち、二つのPDGF(A及びB)と、VEGFと、VEGFに密接に関連している6つのメンバー、が同定された。VEGFに密接に関連する前記6つのメンバーは、Ludwig Institute for Cancer Researchとヘルシンキ大学とによる、国際特許出願PCT/US96/02957(WO96/26736)及び米国特許5,840,693号及び5,607,918号とに記載のVEGF−Bと、ヨウコフ(Joukov)等、EMBO J.,1996 15 290−298及びリー(Lee)等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1996 93 1988−1992に記載のVEGF−Cと、国際特許出願PCT/US97/14696(WO98/07832)及びアチェン(Achen)等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1998 95 548−553に記載のVEGF−Dと、マグリオン(Maglione)等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1991 88 9267−9271に記載の胎盤増殖因子(PlGF)と、Human Genome Sciences社の国際特許出願PCT/US94/05291(WO 95/24473)に記載のVEGF2と、Human Genome Sciences社の国際特許出願PCT/US95/07283(WO 96/39421)に記載のVEGF3とである。これら各VEGFファミリーメンバーは、VEGFに対して30%ないし45%のアミノ酸配列同一性を有する。これらVEGFファミリーメンバーは、システイン・ノット・モチーフ(cysteine knot motif)を形成する6つのシステイン残基を含むVEGF相同性ドメインを共有している。VEGFファミリーの機能的特徴には、内皮細胞に対する種々の程度のマイトジェン活性の誘発、血管透過性及び脈管形成及びリンパ管形成特性の誘発、が含まれる。
【0008】
血管内皮増殖因子(VEGF)は、複数のソースから単離されているホモダイマー糖タンパク質である。VEGFは、内皮細胞に対して高度に特異的なマイトジェン活性を示す。VEGFは、胎児血管形成中の新しい血管の形成と、成体の脈管形成とに於いて重要な調節機能を有する(カーメリエット(Carmeliet)等、Nature,1996 380 435−439;ファーララ(Ferrara)等、Nature,1996 380 439−442;ファーララ(Ferrara)及びデイヴィス−スミス(Davis−Smyth),Endocrine Rev.,1997 18 4−25によって検討されている)。VEGFが果す役割の重要性は、一つのVEGF対立遺伝子が不活性化するだけで、血管の発達不全によって胎児が致死することを示す研究によって示されている(カーメリエット(Carmeliet)等、Nature,1996 380 435−439;ファーララ(Ferrara)等、Nature,1996 380 439−442)。更に、VEGFは、単球に対する強力な化学誘引活性を有し、内皮細胞に於いてプラスミノーゲンアクチベーターとプラスミノーゲンアクチベーターインヒビターとを誘発することができ、又、微小血管透過性を誘発することができる。その後者の活性に依り、それは、時として、血管透過性因子(VPF)と称される。VEGFの単離と性質は既に研究されている。ファーララ(Ferrara)等、J.Cellular Biochem.,1991 47 211−218とコノリー(Connolly)J.Cellular Biochem.,1991 47 219−223を参照。一つのVEGF遺伝子の選択的mRNAスプライシングによってVEGFの5つのアイソフォームが得られる。
【0009】
VEGF−Bは、VEGFに類似の血管形成及びその他の特性を有するが、それは、VEGFと異なる組織に分布し、発現される。具体的には、VEGF−Bは心臓に於いて非常に強力に発現されるが、肺に於いては弱くしか発現されない。これに対して、VEGFの場合はその反対である。これは、VEGFとVEGF−Bとは、それらが多くの組織に於いて共発現されるという事実にも拘わらず、機能的な相違を有するものである可能性があることを示唆している。
【0010】
VEGF−Bは、細胞レジノイド酸結合タンパク質タイプI(CRABP−I)と相互作用する可能性のある細胞タンパク質をスクリーニングすることによる酵母共ハイブリッド相互作用トラップスクリーニング法(co−hybrid interaction trap screening technique)を使用して単離された。その単離と特徴は、PCT/US96/02957と、オロフソン(Olofsson)等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1996 93 2576−2581とに詳細に記載されている。
【0011】
VEGF−Cは、PC−3前立腺癌細胞ライン(CRL1435)の培養上清(conditioned media)から、VEGFR−3を発現するべくトランスフェクトされた細胞を使用して、この培地が内皮細胞特異性レセプターチロシンキナーゼVEGFR−3(Flt4)を生成する能力をスクリーニングすることによって単離された。VEGF−Cは、組換えVEGFR−3でのアフィニティークロマトグラフィーを使用して精製され、PC−3cDNAライブラリーからクローニングされた。その単離と特徴とは、ヨウコフ(Joukov)等、EMBO J.,1996 15 290−298に詳述されている。
【0012】
VEGF−Dは、Clontechから市販されているヒト胸cDNAライブラリーから、ハイブリダイゼーションプローブとして“Soares Breast 3NbHBst”と命名されているヒトcDNAライブラリーから得た発現配列タグによるスクリーニングによって単離された(アチェン(Achen)等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1998 95 548−553)。その単離と特徴とは、国際特許出願PCT/US97/14696(WO98/07832)に詳細に記載されている。
【0013】
前記VEGF−D遺伝子は、成人ヒトに広く発現されるが、もちろん、遍在的に発現されるものではない。VEGF−Dは、心臓、肺及び骨格筋に於いて強力に発現される。VEGF−Dは脾臓と、卵巣、小腸、及び結腸に於いて中レベルで発現され、より低い発現が腎臓、膵臓、胸腺、前立腺、及び精巣で発生する。脳、胎盤、肝臓又は末しょう血液白血球からのRNAにはVEGF−DmRNAは検出されなかった。
【0014】
PlGFは、(妊娠の)満期胎盤cDNAライブラリーから単離された。その単離と特徴とは、マグリオン(Maglione)等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1991 88 9267−9271に詳細に記載されている。現在に於いて、その生物学的機能はよく理解されていない。
【0015】
VEGF2は、高度に腫瘍生成的なエストロゲン非依存ヒト胸部ガン細胞ラインから単離された。この分子は、PDGFに対する約22%の相同性と、VEGFに対する30%の相同性を有すると述べられているものの、VEGF2をコードする遺伝子を単離する方法は明らかでなく、その生物学的活性の特徴付けは開示されていない。
【0016】
VEGF3は、結腸組織由来のcDNAライブラリーから単離された。VEGF3は、VEGFに対する約36%の同一性と、66%の類似性を有すると記載されている。VEGF3をコードする遺伝子を単離する方法は明らかでなく、その生物学的活性の特徴付けは開示されていない。
【0017】
二つのタンパク質の間の類似性は、これらタンパク質の一方のアミノ酸配列と保存アミノ酸置換を、第2のタンパク質の配列と比較することによって判定されるのに対して、同一性は、保存アミノ酸置換を含めることなく判定される。
【0018】
PDGF/VEGFファミリーメンバーは、主として、レセプターチロシンキナーゼに結合することによって作用する。5つの内皮細胞特異的レセプターチロシンキナーゼが同定されている。即ち、VEGFR−1(Flt−1)、VEGFR−2(KDR/Flk−2)、VEGFR−3(Flt4)、TieそしてTek/Tie−2である。これらの全ては、シグナル伝達に必要な内在性チロシンキナーゼ活性を有する。VEGFR−1,VEGFR−2,VEGFR−3、Tie及びTek/Tie−2の、血管形成及び脈管形成に於ける本質的で特異的な役割は、マウス胎児に於いてこれらのレセプターを不活性化する標的化突然変異によって示されている。
【0019】
VEGFに結合することが知られているレセプターチロシンキナーゼは、VEGFR−1,VEGFR−2及びVEGFR−3だけである。VEGFR−1とVEGFR−2とは、高い親和性でVEGFと結合し、VEGFR−1は、VEGF−BとPlGFとにも結合する。VEGF−Cは、VEGFR−3のリガンドであることが示されており、これは、又、VEGFR−2を活性化する(ヨウコフ(Joukov)等、The EMBO Journal,1996 15 290−298)。VEGF−DはVEGFR−2およびVEGFR−3の双方に結合する。Tek/Tie−2のリガンドは、Regeneron Pharmaceuticals,社の国際特許出願PCT/US95/12935(WO 96/11269)に記載されている。Tieのリガンドは、まだ同定されていない。
【0020】
最近、新規な130−135kDa VEGFアイソフォーム特異的レセプターが精製されクローニングされた(ソーカー(Soker)等、Cell,1998 92 735−745)。このVEGFレセプターは、ヘパリンに対する弱い親和性を示すエクソン7コード化配列を介してVEGF165アイソフォームに結合することが判った(ソーカー(Soker)等、Cell,1998 92 735−745)。驚くべきことに、前記レセプターは、ヒトニューロピリン(neuropilin)−1(NP−1)、初期段階の神経形態形成に関わるレセプター、と同一であることが示された。P1GF−2も、NP−1と相互作用するようである(ミグダール(Migdal)等、J.Biol.Chem.,1998 273 22272−22278)。
【0021】
VEGFR−1,VEGFR−2,VEGFR−3は、内皮細胞によって異なる状態で発現される。VEGFR−1とVEGFR−2は、共に、血管内皮に発現され(エールリッヒス(Oelrichs)等、Oncogene,1992 8 11−18;カイパイネン(Kaipainen)等、J.Exp.Med.,1993 178 2077−2088;デュモント(Dumont)等、Dev.Dyn.,1995 203 80−92;フォン(Fong)等、Dev.Dyn.,1996 207 1−10)、VEGFR−3は、ほとんど、成体組織のリンパ内皮に発現される(カイパイネン(Kaipainen)等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1995 9 3566−3570)。VEGFR−3は、又、腫瘍周囲の血管にも発現される。
【0022】
VEGFR遺伝子が崩壊すると、血管の発達の異常が起こり、妊娠期間中に未熟致死となる。完全に不活性化されたVEGFR−1遺伝子を有する胎児の分析は、このレセプターが内皮の機能的組織化に必要であるということを示唆している(フォン(Fong)等、Nature,1995 376 66−70)。しかしながら、VEGFR−1の細胞内チロシンキナーゼドメインの欠失は、正常な血管を有する生育可能なマウスを作り出す(ヒラツカ(Hiratsuka)等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA1998 95 9349−9354)。これらの相違の理由は、今後の説明を必要とするが、これは、VEGFR−1の適切な機能の為にチロシンキナーゼを介したレセプターシグナリングが必要とされない、ということを示唆している。VEGFR−2の不活性化対立遺伝子を有する同型接合体マウスの分析は、このレセプターが、内皮細胞増殖、血液生成及び血管形成のために必要であることを示唆している(シャラビー(Shalaby)等、Nature,1995 376 62−66;シャラビー(Shalaby)等,Cell,1997 89 981−990)。VEGFR−3の不活性化によって、大きな血管の組織異常によって心血管不全が起こる(デュモント(Dumont)等、Science,1998 282 946−949)。
【0023】
VEGFR−1は、主として、発育中の内皮細胞に発現されるが、それは、又、胚形成の初期段階に於いて造血前駆細胞にも見られる(フォン(Fong)等、Nature,1995 376 66−70)。成体に於いて、単球とマクロファージも、このレセプターを発現する(バーレオン(Barleon)等、Blood,1995 87 3336−3343)。胚に於いて、それは、ほとんどが、全部ではないにせよ、血管に発現される(ブライアー(Breier)等、Dev.Dyn.,1995 204 228−239);フォン(Fong)等、Dev.Dyn.,1996 207 1−10)。
【0024】
レセプターVEGFR−3は、初期の胚成長中に内皮細胞に広く発現されるが、胚形成が進むにつれて、静脈内皮に徐々に限定され、その後、リンパ内皮に限定される(カイパイネン(Kaipainen)等、Cancer Res., 1994 54 6571−6577、カイパイネン(Kaipainen)等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1995 92 3566−3570)。VEGFR−3は、成体に於いてリンパ内皮細胞に発現され続ける。このレセプターは、胚形成中の血管発達のために必須である。マウスに於けるVEGFR−3遺伝子の両方の複製を完全に不活性化したところ、性交後9.5日に於いて、欠陥管腔を有する組織化が異常な大きな血管によって特徴付けられる欠陥血管形成が発生し、心膜腔に於いて体液が貯留し、心血管不全が発生した。これらの知見に基づき、VEGFR−3は、一次血管網状組織がより大きな血管に成熟するために必要であることが示唆されている。しかしながら、リンパ管の発達に於けるVEGFR−3の役割は、胚がリンパ系が現れる前に死亡した為、これらのマウスでは研究することができなかった。それにも拘わらず、VEGFR−3は、胚形成及び成体生涯に於けるリンパ内皮細胞でのその特異的発現に依り、リンパ管系の発達とリンパ管形成(lymphangiogenesis)に役割を果しているものと推定される。これは、VEGFR−3のリガンドであるVEGF−Cのトランスジェニックマウスの皮膚に於ける偏位発現によって、リンパ内皮細胞の増殖と真皮に於ける血管の拡大が発生したという知見によってサポートされる。更に、これは、VEGF−Cが、リンパ内皮に於いて一次機能を有し、VEGFと共通する脈管形成及び透過性調節に於いて二次機能を有している可能性があることを示唆している(ヨウコフ(Joukov)等、EMBO J.,1996 15 290−298)。
【0025】
VEGF/VEGFレセプター系のインヒビターのいくつかは、抗脈管形成メカニズムを介して腫瘍の増殖を防ぐことが示されている。キム(Kim)等、Nature,1993 362 841−844及びサレー(Saleh)等、Cancer Res.,1996 56 393−401を参照。
【0026】
発明の要旨
本発明は、一般に、図1(配列識別番号1)に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドに対して特異的に反応する抗体を有する組成物に関する。前記抗体は、モノクローナル抗体(MAb)、免疫反応性フラグメント、又はその組換え体である。本発明の別実施例に於いて、前記組成物は、哺乳動物VEGFR−2によって仲介されるVEGF−Dの活性を干渉(interfere)する、および/又は、VEGF−Dの哺乳動物VEGFR−3に対する結合を干渉することが可能な抗体を有する。特に好適な抗体は、VEGFR−2によって仲介されるVEGF−Dの活性を干渉する、および/又は、VEGF−DのVEGFR−3に対する結合は干渉するが、VEGFR−2に仲介されるVEGFの活性は干渉せず、VEGF−Cには結合しない。本発明は、更に、前記抗体を利用した薬用及び診断用組成物と方法とに関する。
【0027】
第1の態様に依れば、本発明は、図1(配列識別番号1)に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドに対して特異的に反応する抗体を有する組成物を提供する。それら抗体の具体例は、2F8,4A5,4E10,5F12,4H4及び3C10と称されるモノクローナル抗体(MAb)を含む。
【0028】
第2の態様に依れば、本発明は、VEGFR−2によって仲介されるVEGF−Dの活性を干渉する抗体を有する組成物を提供する。一好適実施例に於いて、この抗体は、更に、VEGF−DのVEGFR−3に対する結合は干渉するが、VEGFR−2に仲介されるVEGFの活性は干渉せず、VEGF−Cには結合しない。そのような抗体の具体例は、アイソタイプIgG1を有する抗体MAb 4A5である。
【0029】
第3の態様に於いて、本発明は、VEGF−DのVEGFR−3に対する結合を干渉する抗体を有する組成物を提供する。
【0030】
抗体は、従来技術の標準方法を使用して、図1(配列識別番号1)に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド、又は、このポリペプチドのフラグメントに対して育成することができる。更に、このポリペプチドは、アフィニティー精製を補助するべく、FLAG(登録商標)オクタペプチド(Sigma,セントルイス,MO)等の、エピトープタグにリンクさせることが可能である。いくつかの目的の為に、たとえば、抗体が臨床状況に於いてVEGF−Dの作用を抑制するために使用される場合、等に於いては、ヒト化又はキメラモノクローナル抗体又は免疫反応性フラグメント、を使用することが望ましいかもしれない。これらを作成する方法を以下に示すが、これらは、又、組換えDNA法を含めて、当該技術に於いて周知である。
【0031】
本発明のこれらの態様は、更に、MAb、免疫反応性フラグメントや組換体を含み、それらは適切に標識出来る。
【0032】
本発明の抗体は、検出可能標識で標識し、診断目的の為に利用することができる。前記抗体は、イメージングのために、適切な超磁性体、常磁性体、高電子密度、エコジェニック(ecogenic)又は放射性物質と共役又は非共役結合させることができる。診断上のアッセイにおける使用では、放射性あるいは非放射性標識が使用される。放射性標識の具体例としては、125Iや32P等の、放射性原子又は原子団がある。非放射性標識の具体例としては、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、又は、フルオレシン−5−イソチオシアネート(FITC)等の蛍光標識がある。標識は、直接的あるいは間接的、共役あるいは非共役のものとすることができる。
【0033】
本発明の第4の態様は、図1(配列識別番号1)に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドに対して特異的に反応するモノクローナル抗体の製造方法に関する。更に、このポリペプチドは、FLAG(登録商標)オクタペプチド(Sigma−Aldrich)等の、エピトープタグにリンクさせることが可能である。この方法は、免疫適格哺乳動物(immunocompetent mammal)を、図1(配列識別番号1)に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド又は該ポリペプチドのフラグメントと、オプションとして、リンクされたエピトープタグとを有する免疫原によって免疫する工程と、前記免疫された免疫適格哺乳動物のリンパ球を、骨髄腫細胞と融合させてハイブリドーマ細胞を形成する工程と、前記ハイブリドーマ細胞によって作り出されたモノクローナル抗体(MAb)を図1(配列識別番号1)に記載のアミノ酸配列を有する前記ポリペプチドに対する特異的結合活性に関してスクリーニングする工程と、図1(配列識別番号1)に記載のアミノ酸を有する前記ポリペプチドに対する特異的結合活性を有するMAbを産生するハイブリドーマ細胞を、培地で培養して、増殖させ、および/又は、前記モノクローナル抗体を分泌させる工程と、前記モノクローナル抗体を前記培養上清から回収する工程、とを有する。
【0034】
更に、VEGFR−2に仲介されるVEGF−Dの活性を干渉する、および/又は、VEGF−DのVEGFR−3に対する結合を干渉するモノクローナル抗体を作る方法が提供される。この方法は、免疫適格哺乳動物を、図1(配列識別番号1)に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド又は該ポリペプチドのフラグメントと、オプションとして、リンクされたエピトープタグとを有する免疫原によって免疫する工程と、前記免疫された免疫適格哺乳動物のリンパ球を、骨髄腫細胞と融合させてハイブリドーマ細胞を形成する工程と、前記ハイブリドーマ細胞によって作り出されたモノクローナル抗体(MAb)をVEGF−D干渉活性(interfering activity)および/又はVEGF−D結合干渉活性に関してスクリーニングする工程と、VEGF−D干渉活性および/又はVEGF−D結合干渉活性を有するMAbを産生するハイブリドーマ細胞を、培地で培養して、増殖させ、および/又は、前記モノクローナル抗体を分泌させる工程と、前記モノクローナル抗体を前記培養上清から回収する工程、とを有する。これら両方の方法に於いて、好適な免疫適格哺乳動物は、マウス又はラットである。
【0035】
本発明の第5の態様は、図1(配列識別番号1)に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドに対して特異反応性の、又は、VEGF−2に仲介されるVEGF−Dの活性を干渉する、および/又は、VEGF−DのVEGF−3に対する結合を干渉する、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞である。
【0036】
本発明の第6の態様は、図1(配列識別番号1)に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドに対して特異反応性の、又は、VEGF−2に仲介されるVEGF−Dの活性を干渉する、および/又は、VEGF−DのVEGF−3に対する結合を干渉する、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞を作る方法を提供し、この方法は、免疫適格哺乳動物を、図1(配列識別番号1)に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド又は該ポリペプチドのフラグメントと、オプションとして、リンクされたエピトープタグとを有する免疫原によって免疫する工程と、前記免疫された免疫適格哺乳動物のリンパ球を得る工程と、前記リンパ球を骨髄腫細胞と融合させてハイブリドーマ細胞を形成する工程と、前記ハイブリドーマ細胞によって作り出されたモノクローナル抗体(MAb)を図1(配列識別番号1)に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドに対する特異的結合活性および/又はVEGF−D干渉活性および/又はVEGF−D結合干渉活性に関してスクリーニングする工程と、図1(配列識別番号1)に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドに対する特異的結合活性および/又はVEGF−D干渉活性および/又はVEGF−D結合干渉活性を有する前記モノクローナル抗体を生成するハイブリドーマ細胞を培養する工程、とを有する。
【0037】
ここで、前記「培養」という用語は、それを増殖させることによる前記ハイブリドーマ細胞のクローニングと、上記抗体を分泌させるための前記ハイブリドーマの誘導、とをいう。
【0038】
本発明の更に別の態様は、哺乳動物又は細胞培地中に於いてVEGF−Dにより誘導される少なくとも一つの生物活性を干渉する方法であって、この方法は、効果的に生物活性を干渉する量の前記モノクローナル抗体を、前記哺乳動物に対して投与する、又は、前記細胞培地に対して添加する工程を有する。
【0039】
「VEGF−Dによって誘導される生物活性」は、公知の方法によって容易にテストすることができる。具体的には、VEGF−Dは、血管内皮細胞および/又はリンパ内皮細胞の増殖又は分化を非限定的に含む、内皮細胞の増殖又は分化を刺激する能力を有する。考慮されるその他の生物活性としては、脈管形成、リンパ管形成、及び血管及びリンパ管の透過性の誘導、がある。
【0040】
「抗体群」又は「抗体」という用語は、哺乳動物VEGFR−2によって仲介されるVEGF−Dの活性を干渉可能な、および/又は、VEGF−Dの哺乳動物VEGFR−3に対する結合を干渉可能な、抗体を含む組成物をいう。特に好適な抗体は、VEGF−2よってに仲介されるVEGF−Dの活性を干渉する、および/又は、VEGF−DのVEGF−3に対する結合は干渉するが、VEGF−2に仲介されるVEGFの活性は干渉せず、VEGF−Cには結合しない。
【0041】
本発明の更に別の態様は、治療有効量の抗体と、その薬用的に許容可能な非毒性塩と、薬用的に許容可能な固体又は液体キャリア又はアジュバントとを有する薬用組成物の提供に関する。そのようなキャリア又はアジュバントの具体例としては、非限定的に、食塩水、緩衝食塩水、Ringer’s溶液、ミネラルオイル、タルク、コーンスターチ、ゼラチン、ラクトース、スクロース、微結晶性セルロース、カオリン、マンニトール、燐酸二カルシウム、塩化ナトリウム、アルギニン酸、デキストローズ、水、グリセロール、エタノール、濃化剤、安定化剤、懸濁剤、及びそれらの組み合わせがある。それらの組成物は、溶液、懸濁液、タブレット、カプセル、クリーム、塗剤(salve)、エリキシル、シロップ、ウエハース、軟膏(ointment)、その他の従来の形状とすることができる。その製剤形態は、投与形態に適したものとされる。PDGF−Cを有する組成物は、約0.1wt.%〜90wt.%、最も一般的には約10%〜30%の前記活性化合物(単数又は複数)を含んだものとなる。
【0042】
投与の量と経路は、患者の性質と治療される状態とに応じたものとされ、それは担当医師又は獣医の裁量によったものとなる。適当な投与経路としては、経口、皮下、筋肉内、腹腔内、又は静脈注射、非経口、局所塗布、移植、等がある。たとえば、有効量の抗体を、それを必要とする生物に対して、体重の約0.1〜1000μg/kgの投与量、投与する。
【0043】
本発明の臨床応用としては、診断用途、及び、ガン、糖尿病網膜症、乾癬症、及び関節疾患(arthopathies)の治療に於ける、脈管形成および/又はリンパ管形成の抑止(suppression)又は抑制(inhibition)がある。従って、本発明は、更に、そのような治療を必要とする哺乳動物に於いて、脈管形成、リンパ管形成および/又は新血管形成、を干渉する方法であって、前記哺乳動物に対して有効量の抗体を投与する工程を有する方法にも関する。前記抗体は、少なくともVEGFR−2の活性化を阻止することによって、VEGF−Dの活性を干渉する。
【0044】
更に、本発明のこの態様は、ガン、糖尿病網膜症、乾癬症、及び関節疾患のグループから選択される哺乳動物の病気に於いて、脈管形成、リンパ管形成および/又は新血管形成から成るグループから選択される少なくとも一つの生物活性を干渉する方法であって、効果的に脈管形成、リンパ管形成又は新血管形成を干渉する量の抗体を前記哺乳動物に投与する工程を有する方法を提供する。上述したように、前記抗体は、少なくとも部分的には、VEGFR−2によって仲介されるVEGF−Dの活性、および又はVEGFR−3に対するVEGF−Dの結合、を干渉することによって、VEGF−Dの作用を干渉する。
【0045】
前記抗体は、たとえば、血管透過性の増大から発生する肺に於ける体液の貯留に関連する圧迫性心不全等の状態を、前記体液貯留を妨げるために血管透過性に対して相殺作用(offsetting effect)を提供することによって治療するために使用することができる。従って、本発明は、哺乳動物に於ける血管透過性の増大に依る、心臓および/又は肺の体液貯留を治療する方法を提供する。この方法は、その治療を必要とする前記哺乳動物に対して、効果的に血管透過性を減少させる量の抗体を投与する工程を有する。
【0046】
本発明は、更に、生物サンプル中に於いてVEGF−Dを検出する方法であって、前記サンプルを抗体に接触させる工程と、前記抗体に関係する結合を検出する工程とを有する方法を提供する。一好適実施例に於いて、前記結合および/又は結合の程度は、検出可能な標識によって検出され、適当な標識は上述した通りである。
【0047】
更に別の態様に於いて、本発明は、典型的にはテストキット形態である診断/予後判定装置を提供する。たとえば、本発明の一実施例に於いて、図1(配列識別番号1)のポリペプチドに対する前記抗体と、この抗体とVEGF−Dとの結合を検出するための手段とを有する、診断/予後判定装置が提供される。本発明のこの診断/予後判定装置の一好適実施例に於いて、図1(配列識別番号1)のポリペプチドに対する前記抗体(1次抗体)と同じアイソタイプで同じ動物源の抗体に対する第2の抗体(2次抗体)が提供される。この2次抗体は、検出可能標識に結合され、その後、非標識1次抗体又はVEGF−Dが基質結合され、これによって、前記1次抗体とVEGF−Dとの間の結合と、その後の前記標識2次抗体の前記1次抗体に対する結合との後の、基質に結合した標識の量を測定することによって、VEGF−D/1次抗体相互作用を確立することができる。本発明の特に好適な実施例に於いて、前記診断/予後判定装置は、従来式の酵素結合イムノソルベント検定法(ELISA)キットとして提供することができる。
【0048】
更に別の態様に於いて、本発明は、VEGFR−3とVEGF−Dとの間の相互作用を干渉する化合物を同定する方法を提供する。この方法は、VEGFR−3の細胞外ドメインを有するポリペプチドを基質に供する工程と、前記基質をVEGF−Dと共に、同定対象化合物の存在下でインキュベートする工程と、VEGFR−3とVEGF−Dとの間の相互作用を検出する工程、とを有する。
【0049】
更に別の態様に依れば、本発明は、組織中のリンパ管構造をイメージングする方法であって、前記組織を抗体に接触させる工程と、前記抗体の結合の発生を検出する工程とを有する方法、を提供する。
【0050】
図面の簡単な説明
図1は、抗体を産生するのに使用されたポリペプチド(FLAG(登録商標)オクタペプチド無し)のアミノ酸配列(配列識別番号1)を図示している。
図2は、VEGF−D△N△CへのBa/F3−NYK−EpoR細胞の応答に対する前記モノクローナル抗体の作用を図示している。
図3Aと図3Bは、VEGF−D△N△Cに対する前記モノクローナル抗体の相対結合アフィニティーを図示している。
図4は、マウスVEGF164へのBa/F3−NYK−EpoR細胞の応答に対する前記モノクローナル抗体の作用を図示している。
図5は、VEGFR−3の細胞外ドメインへのVEGF−D△N△Cの結合に対する抗−VEGF−D MAbの作用を図示している。
【0051】
好適実施例の詳細な説明
図1は、抗体を育成するのに使用された、FLAG(登録商標)オクタペプチド無しのポリペプチドアミノ酸配列(配列識別番号1)を図示している。
【0052】
例I:抗体産生
図1(配列識別番号1)に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドに対するモノクローナル抗体をマウス中で産生した。本発明の抗体を産生するために免疫源として使用されたポリペプチドは、そのN末端でタグされたFLAG(登録商標)であった(下記の説明を参照)。このアミノ酸配列は、VEGF−Dの中心領域であり、それは、VEGFファミリーのその他すべてのメンバと配列に於いて類似している。従って、VEGF−Dの生物活性部位は、その保存領域に恐らく存在しているものと考えられる。ヒトVEGF−Dの残基93から201の、即ちN及びC末端領域が除去された、切断部分(truncated portion)をコードするDNAフラグメントを、全長ヒトVEGF−DcDNAを有するプラスミドをテンプレートとして使用して、Pfu DNAポリメラーゼによりポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって増幅した。その配列をヌクレオチド配列決定によって確認したこの増幅されたDNAフラグメントを、次に、発現ベクターpEFBOSSFLAG(Walter and Eliza Hall Institute for Medical Research(WEHI),メルボルン、オーストラリア、のクレア・マクファーレン(Clare McFarlane)博士からの贈呈物)に挿入して、pEFBOSVEGF−D△N△Cと称するプラスミドを得た。このpEFBOSSFLAGベクターは、インターロイキン−3(IL−3)遺伝子及びFLAG(登録商標)オクタペプチドからのタンパク質分泌物のためのシグナル配列をコードするDNAを含んでいる。前記FLAG(登録商標)オクタペプチド(Sigma,セントルイス,MO)は、M2モノクローナル抗体(Sigma,セントルイス,MO)等の市販の抗体によって認識可能である。VEGF−D PCRフラグメントを、前記ベクターに挿入すると、IL−3シグナル配列は、前記FLAG(登録商標)オクタペプチドのすぐ上流側に位置しているので、このオクタペプチドは前記切断VEGF−D配列のすぐ上流側に位置することになった。これら三つの配列はすべて、同じ読み取り枠内にあったので、pEFBOSVEGF−D△N△Cの哺乳動物細胞へのトランスフェクションから起こったmRNAの翻訳によって、そのN末端にIL−3シグナル配列を有し、その後に、前記FLAG(登録商標)オクタペプチドと前記切断VEGF−D配列を有するタンパク質が得られるであろう。前記シグナル配列の開裂と、それに続く細胞からの前記タンパク質の分泌とによって、N末端の近傍で前記FLAG(登録商標)オクタペプチドによってタグされたVEGF−Dポリペプチドが得られるであろう。このタンパク質を、VEGF−D△N△Cと命名した。VEGF−D△N△Cを、前記プラスミドpEFBOSVEGF−D△N△Cと過渡的にトランスフェクトしておいたCOS細胞の培地から抗−FLAG(登録商標)アフィニティークロマトグラフィーによって精製した(国際特許出願PCT/US97/14696の例9を参照)。
【0053】
免疫されたマウスからの脾臓細胞の採収と、その後のこれら脾臓細胞のマウスミエローマP3X63Ag8.653(NS−1)細胞への融合の前の、85日目(腹膜内)、71日目(腹膜内)及び4日目(静脈内)に、精製されたVEGF−D△N△Cを使用して、メスBalb/Cマウスを免疫した。最初の二回の免疫に於いては、約10μgのVEGF−D△N△Cと、燐酸緩衝食塩水(PBS)とTiterMaxアジュバント(#R−1 リサーチアジュバント:CytRx Corp.,Norcross,GA)との1:1の混合物と、注射した。これに対して第3回目の免疫に於いては、PBS中に含まれた35μgのVEGF−D△N△Cを使用した。
【0054】
VEGF−D△N△Cに対するモノクローナル抗体(MAb)を、酵素イムノアッセイを使用して精製VEGF−D△N△C上でハイブリドーマによって産生されたMAbをスクリーニングすることによって選択した。簡単に説明すると、96−ウェルのマイクロタイタープレートを、VEGF−D△N△Cでコーティングし、その後、ハイブリドーマ上澄みを添加し、4℃で2時間インキュベートし、その後、0.02%Tween20を含むPBS中で6回洗浄した。その後、ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合抗マウスIg(Bio−Rad,Hercules,CA)とのインキュベーションを1時間、4℃で行った。洗浄後、前記アッセイを、2,2‘−アジノ−ジ−(3−エチルベンズ−チアゾリンスルホン酸(ABTS)基質システム(Zymed,サンフランシスコ,CA)で発現させ(developed)、そのアッセイを、マルチウェルプレートリーダー(Flow Laboratories MCC/340,McLean,VA)で405nmでの吸光度を読み取ることによって量化した。更なる分析のために6の抗体を選択し、これらを、制限希釈によって2回サブクローニングした。これらの抗体を2F8,3C10,4A5,4E10,4H4及び5F12と命名した。これらの抗体のアイソタイプを、IsostripTMアイソタイプキット(Boehringer Mannheim,インディアナポリス,IN)を使用して判定した。抗体2F8,4A5,4E10及び5F12はIgG1クラスであったのに対して、4H4と3C10はIgMクラスであった。これら6つの抗体はすべてカッパL鎖(kappa light chain)を含んでいた。
【0055】
例II:抗体の精製
ハイブリドーマ細胞ラインを、5%v/vのIgG−欠乏血清(Gibco BRL,Gaithersburg,MD)、5mMのL−グルタミン、50μg/mlのゲンタマイシン及び10μg/mlの組換えIL−6を含むでダルベッコ調整イーグル培地(DMEM)中で育成した。抗体2F8,4A5,4E10及び5F12を、ダービー(Darby)他、J.Immunol.Methods 159:125−129,1993の方法によって、プロテインG−セファロースを使用したアフィニティークロマトグラフィーによって精製し、その産物を280nmでの吸光度を測定することによって評価した。
【0056】
例III:VEGF−D△N△Cに対する抗体の結合アフィニティー
ヒトVEGF−D△N△Cに対する、前記4つの抗−VEGF−D△N△C MAb、2F8,4A5,4E10及び5F12の相対的結合アフィニティーを、ナイス(Nice)とカチメル(Catimel)の方法,Bioassays 21:339−352,1999に依る表面プラスモン共振を使用したバイオセンサ研究によって、これらの相互作用に対する結合反応(binding kinetics)の分析によって判定した。VEGFR−2−FLAG,VEGFR−3−Ig及び抗−VEGF−Dモノクローナル抗体を、ナイス(Nice)とカチメル(Catimel),Bioassays 21:339−352,1999に記載されているように標準アミン結合化学作用を使用したセンサーチップのカルボキシメチル化デキストラン層に結合させた(それぞれ、4.7,5.2,5.7及び5.6ng/mm2に対応して固定化されたVDI 4739RU,VD2 5268 RU,VD3 5781 RU及びVD4 5634 RU(ステンバーグ(Stenberg)他、J.Colloid Interface 43:513−526,1990))。リガンド結合を、BIAcore3000光学バイオセンサ(BIAcore,Uppsala、スウェーデン)を使用して、分析した。固定化レベルの自動的標的化を、BIAcore3.1制御ソフトウエア(カチメル(Catimel)他、J.Chromatogr.A.776:15−39,1997)を使用して達成した。固定化後、残余の活性化エステル基を、1MのエタノールアミンヒドロクロリドpH8.5による処理によってブロックした。その後、10mMのジメチルアミンでの洗浄によって、非共役結合物質を除去するとともに、分析間のセンサ表面を再生した。アッセイのサンプルを、ランニングバッファー(10mM HEPES,pH7.4,150mM NaCl,3.4mM EDTA,0.005%Tween20)中で希釈した。ヒトVEGF−D△N△Cを表面(41−689nM)上で10μl/分の流量で流すことによって結合曲線が得られた。ヒトVEGF−D△N△Cに対する抗体の相対結合アフィニティーの判定の為に、カチメル(Catimel)他、J.Chromatogr.A.776:15−39,1997に記載されているように、BIAevaluation3.0(BIAcore,Uppsala、スウェーデン)を使用してデータを分析した。最初の分離相を分析したkdを得て、次に、これを使用して1:1ラングミュアモデルが有効である曲線の関連領域のグローバル分析を固定(constrain)することによって結合定数が得られた。ヒトVEGF−D△N△Cに対する抗体の相対的結合アフィニティーのこれらの分析を下記の表に示す。抗体は固定化されていたので、前記リガンドの原子価(valency)は1と見做された。全ての抗体は、ksが7.4〜10.7x104M-1s-1、kdが2.1〜5.2x10-3s-1で、類似のアフィニティー(kDが30〜60nM)を示した。
【0057】
【表1】
【0058】
例IV:VEGFR−2によって仲介されるVEGF−Dの活性を干渉する抗体
国際特許出願PCT/US95/14696の例7に記載されているバイオアッセイを使用して、前記精製モノクローナル抗体(MAb)2F8,4A5,4E10及び5F12の、マウスVEGFR−2(FlklとNykとしても知られている)によって仲介されるVEGF−D△N△Cの活性を干渉する能力をテストした。前記バイオアッセイは、国際特許出願PCT/US95/16755にも記載されている。このアッセイは、VEGFR−3の細胞外ドメインと、エリトロポイエチンレセプター(EpoR)の細胞質ドメインとから成るキメラレセプターをコードするプラスミド構造物でトランスフェクトされたBa/F3 pre−B細胞(Ba/F3−NYK−EpoR細胞)を使用するものである。これらの細胞は、ルーチン的にインターロイキン−3(IL−3)で継代(passaged)され、IL−3の不在下では死滅する。しかしながら、もしも前記キメラレセプターの細胞質ドメインからシグナリングが誘導されれば、これらの細胞はIL−3の不在下で生存し増殖する。そのようなシグナリングは、前記キメラレセプターのVEGFR−2細胞外ドメインに結合するリガンドによって誘導される。従って、VEGF−D△N△C又はVEGFのVEGFR−2細胞外ドメインへの結合によって、前記細胞は、IL−3の不在下で生存、増殖される。そのようなリガンドの前記細胞外ドメインへの結合、又は、前記細胞質ドメインの活性化、を干渉する抗体の添加によって、IL−3の不在下に於ける細胞死が起こる。前記キメラレセプターを欠く親Ba/F3細胞は、IL−3の不在下に於いてVEGF/D△N△C又はVEGFによって誘導されて増殖せず、これは、これらのリガンドに対するBa/F3−NYK−EpoR細胞の応答が前記キメラレセプターに完全に依存するものであることを示している。
【0059】
精製されたVEGF−D△N△Cのサンプルを、種々の量の抗体と、1時間4℃で、この混合物をIL−3欠如細胞培養培地との1:10の希釈の前に、PBS中でインキュベートした。これによって得られた媒質(media)は、約500ng/mlのVEGF−D△N△Cと、最高100μg/mlまでの種々の濃度の抗体とを含有していた。次に、Ba/F3−NYK−EpoR細胞を、前記媒質中で48時間、37℃でインキュベートした。次に、DNA分析を、採収の前に、1μCiの3H−チミジンの添加と、更に4時間インキュベーションすることによって、量化した。導入された3H−チミジンを、セル-ハーベスター(Tomtec(登録商標),オレンジ、Conn)とベータ計数とを使用して測定した。VEGF−D△N△Cに対するBa/F3−NYK−EpoRの増殖応答に対する抗体2F8,4A5,4E10及び5F12の作用が図2に図示されており、ここで、データポイントは、二つの実験の平均を示し、エラーバーは、各ポイントに於ける二つの実験の範囲を表わしている。
【0060】
抗体4A5は、投与量依存的にVEGF−D△N△Cに対するBa/F3−NYK−EpoR細胞の応答を阻止した(図2)。培養培地に抗体4A5を40μg/ml添加することで、細胞の応答を完全に阻止するのに十分であった。これに対して、その他の三つの抗体は、ほぼ80μg/mlの濃度に於いても、応答に対して検出可能な作用を示さなかった。これらの結果は、抗体4A5が、VEGFR−2によって仲介されるVEGF−Dの活性を干渉することを示している。抗体4A5を産生するマウスハイブリドーマ細胞4A5Aは、既にAmerican Type Culture Collection(ATCC)Manassas,va 20110−2209 USAに1999年4月16日に寄託されている(ATCC#HB−12698)。この寄託は、特許手続の為の微生物寄託の国際認識に関するブタペスト条約の要求に基づいて行われた。
【0061】
例V:抗体の、VEGF−Dが固定化VEGFR−2及びVEGFR−3に結合 することを干渉する能力のテスト
例IVのバイオアッセイに於ける抗体4A5の抑制作用は、この抗体が、VEGF−D△N△Cのレセプターへの結合、又は、その後のレセプタークロスリンクを妨げる作用である可能性がある。例IVのバイオアッセイでは、これら二つによる干渉の異なるメカニズムを区別することができない。前記4種類の抗−VEGF−D△N△C MAb,2F8,4A5,4E10及び5F12の、VEGF−D△N△Cのそれぞれのレセプターへの結合に対する作用を直接調べるために、VEGF−D△N△Cと固定化レセプター細胞外ドメインとの相互作用をバイオセンサーを使用して分析した。マウスVEGFR−2の細胞外ドメイン(VEGFR−2−FLAG)と、ヒトVEGFR−3の細胞外ドメインと、ヒトIgG1のFc部分(VEGFR−3−Ig)とから成るキメラタンパク質とを、例IIIに記載したようにセンサーチップ上に固定した(4677と5113RUとは、それぞれ4.7,5.1ng/mm2に均等に固定)。前記抗体のレセプター相互作用に対する影響を、種々の濃度(37.5〜1200nM)のVEGF−D△N△Cの抗体とPBS中で4℃で1時間予めインキュベートしておいた精製ヒトVEGF−D△N△C(61nM)との混合物を流すことによって測定した。図3A及び3Bに図示されているように、2ng/mlのヒトVEGF−D△N△Cと、種々の濃度の抗体とを含む前記混合物の30μlのアリコットを、10μl/mlの流率で前記センサーチップ上に注入した。図3A及び3Bは、このアッセイの結果を示している。抗体4A5は、両方のレセプターへの結合をほぼ完全に阻止するのに十分であった。抗体2F8と5F12とも、両方のレセプターとの相互作用を抑制したが、但し、4A5よりも遥かに高い抗体濃度に於いてであった。両方のレセプターに対する結合をほぼ完全に阻止するために、約40倍のモルの2F8及び5F12が必要であった。これに対して、4E10は、僅かな作用しかなかった。これらのデータは、抗体4A5,2F8及び5F12は、VEGF−Dの生物学的機能の分析と、臨床用途に於いてVEGF−Dの生物活性を抑制するのとに有用であろう、ということを示している。結合の抑制の率を、競合物質(RUc)の存在下に於ける分離段階の初期に観察されたバイオセンサシグナルと、非特異的対照抗体(抗−EGFR MAb 528(8))(RUt)の存在下に於いてVEGF−D△N△Cを2μg/mlで注入した時に観察されたシグナルとを使用して、次の式:%競合=RUt−RUc/RUt x 100によって計算した。
【0062】
例VI:抗体の、VEGFR−2によって仲介されたVEGFの活性を干渉する能力のテスト
対照として、抗体の、Ba/F3−NYK−EpoR細胞の精製マウスVEGF164に対する増殖反応を干渉する能力をテストした。これらのテストの結果を図4に示す。前記抗体はいずれも、前記細胞のマウスVEGF164に対する増殖反応に対して有意な作用を示さなかった。これらの結果は、抗体4A5は、VEGFR−2によって仲介されるVEGF−Dの活性は干渉するが、このレセプターによって仲介されるVEGFの活性は干渉しないということを示している。
【0063】
例VII:抗体のVEGF−Cに結合する能力のテスト
上述したものと同じ酵素イムノアッセイを使用して、前記6種類のVEGF−D MAbの、VEGF−C△N△Cに結合する能力をテストした。VEGF−C△N△Cは、VEGF−CのVEGF相同ドメイン(VHD)(残基103〜215)から成り、これは、VEGF−D△N△Cに対してほぼ同一であるVEGF−Cの領域である。そのC末端に予め6Xヒスチジンタグを添加しておいたVEGF−C△N△Cを、製造業者の指示に従って、発現ベクタpIC9(Invitrogen,サンディエゴ,CA)を使用して酵母P.pastorisのGS115株において発現させ、Ni−NTA Superflow樹脂(QIAGEN,バレンシア、CA)を使用して精製した。このイムノアッセイによってテストされた前記6種類の抗体の内、4E10のみがVEGF−C△N△Cに結合した。
【0064】
例VIII:VEGF−DのVEGFR−3への結合を干渉する抗体
イン・ヴィトロレセプター結合アッセイを使用して、前記4種類の抗−VEGF−D△N△C MAb、2F8,4A5,4E10及び5F12が、VEGFR−3の細胞外ドメインへのVEGF−D△N△Cの結合を干渉する能力をテストした。ヒトVEGFR−3の細胞外ドメインと、ヒトIgGのFc部分とから成るキメラタンパク質をコードするプラスミド構造物(K.Pajusola,Biotechnology Institute,ヘルシンキ)を、その製造業者の指示に従って、Fugene6(Boehringer Mannheim,ドイツ)を使用して293−EBNA細胞にトランスフェクトした。前記キメラタンパク質を、プロテインAセファロースビーズ(Amersham,UK)と一晩4℃でゆっくりと攪拌させ、100mMのグリシン−HCl,pH2.8で溶出させることによって細胞上清から精製した。溶出液中の前記キメラタンパク質の存在を、ウェスタンブロット分析用のサンプルの小部分を、ペルオキシダーゼ結合アフィニティー精製ヤギ抗−ヒトIgG,Fcフラグメント−特異的抗体(Jackson Immunoresearch Labs.,ウエストグルーブ,PA)と使用して確認した。前記サンプルの残りを、50mMの重炭酸ナトリウム緩衝液(sodium bicarbonate buffer)(pH9.6)と1:3で希釈し、Centricon10濃縮器(Amicon,ベバリー,MA)を使用して約4倍に濃縮し、96−ウェルマイクロタイタープレート(Linbro/Titertek,ICN Biomedicals,オーロラ、OH)のウェル中で、37℃で1時間インキュベートした。前記キメラタンパク質を含有する溶液を除去した後、プレートを、PBSと0.05% Tween 20(PT20)とでよく洗浄し、PBS中で1%のウシ血清アルブミンで、室温で30分間ブロックした。これらのプレートを、PT20で再度洗浄し、次に、VEGF−D△N△C(7.3μg/ml)とMAbとを含有するPBSと共に室温で1時間インキュベートした。前記マイクロタイタープレートを添加する前に、前記VEGF−D△N△CとMAbとは、予め、1時間、4℃でインキュベートしておいた。VEGF−D△N△CとMAbとの溶液とのインキュベーション後、前記プレートを、PT20で洗浄し、3.5μg/mlのビオチン化(biotinylated)M2抗−FLAG MAb(Sigma,セントルイス、MO)を含有するPBSと、2時間4℃で振とうすることによってインキュベートした。ポリヌクレオチドがFLAG(登録商標)オクタペプチド(Sigma,セントルイス、MO)によつてN末端にタグされているので、M2 MAbを使用して、前記レセプター−結合アッセイに於いてVEGFR−3に結合したVEGF−D△N△Cを検出するために使用することができた。これらプレートを、次に、PT20で洗浄し、ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ共役物(Boehringer Mannheim,ドイツ)と1時間4℃で振とうすることによってインキュベートし、PT20で再び洗浄した。次に、このアッセイを、ABTS基質システム(Zymed,サンフランシスコ、CA)で発現させ、マルチウェルプレートリーダ(Flow Laboratories MCC/340,McLean,VA)で414nmでの吸光度を読み取ることによって量化した。
【0065】
前記アッセイに於いて二つのネガティブコントロールが発現した。第1に、293−EBNA細胞を、ヒトVEGFR−1の細胞外ドメインと、ヒトIgGのFc部位とから成るキメラタンパク質を発現するプラスミド構造物(E.Korpelainen,Haartman Institute,ヘルシンキ)とトランスフェクトした。293−EBNA細胞のトランスフェクション、キメラタンパク質の精製、ウェスタンブロットによる分析、及び結合アッセイ(MAbの不在下)は、全く上述したものと同様に行われた。VEGF−D△N△CはVEGFR−1に結合しないので、VEGFR−1/Igタンパク質は、前記アッセイのネガティブコントロールとして作用する。第2に、293−EBNA細胞を、VEGFレセプターをコードする配列が欠如した発現ベクターとトランスフェクトした。これらの細胞からの培養上清を、VEGFR−3/IgとVEGFR−1/Igキメラタンパク質とを含むものと全く同様に使用した。
【0066】
前記4種類のMAbがM2 MAbのVEGF−D△N△Cへの結合を干渉するか否かをテストするために、アフィニティー精製VEGF−D△N△Cを、50mMの重炭酸ナトリウム緩衝液(pH9.6)中で37℃、1時間のインキュベーションによってマイクロタイタープレートの表面上にコーティングした。次に、これらプレートを、PT20で洗浄し、抗−VEGF−D MAbの存在下又は不在下で、1時間4℃でインキュベートし、PT20で再び洗浄し、ビオチン化M2 MAbとインキュベートし、洗浄し、発現し、上述したようにして量化した。これらのコントロールアッセイは、一定量のVEGF−D△N△Cと、前記レセプター結合アッセイに於いて使用したものと同じ濃度範囲の前記4種類の抗−VEGF−D MAbとを使用して行われた。更に、一定濃度の各MAb(200μg/ml)と、約100倍の濃度範囲のVEGF−D△N△Cとで対照(control)を行った。これら両セットのコントロールに於いて、ビオチン化M2 MAbによるVEGF−D△N△Cの検出は、これらアッセイに於ける抗−VEGF−D MAb又はVEGF−D△N△Cの濃度と関係無く、抗−VEGF−D MAbの存在下又は不在下に於いて同じであった。これらのコントロールアッセイは、テストされたこれら4種類のMAbのいずれも、M2 MAbのVEGF−D△N△Cへの結合に対してなんら影響しないことを示した。
【0067】
前記4種類のVEGF−D MAbの、VEGF−D△N△CのVEGFR−3への結合に対する作用を図4に示す。MAb濃度は、前記マイクロタイタープレートのウェル中に於けるVEGF−D△N△Cとの溶液中の各MAbの濃度を示している。各曲線は、二つのアッセイの結果を表わし、エラーバーは、各抗体濃度に於いて二つの実験で測定された吸光度の範囲を示している。MAb 4E10は、200μg/mlの濃度までは、この相互作用にたいして作用を示さなかった。これに対して、MAb 4A5は、25μg/mlの濃度で、前記リガンドとVEGFR−3の細胞外ドメインとの間の相互作用をほぼ完全に妨げるのに十分であった。MAb 2F8と5F12とは、90μg/ml以上の濃度に於いて僅かな抑制作用しか示さず、これらは、4A5の作用と比較すると顕著に低いものであった。VEGFR−1/Igキメラタンパク質を発現する細胞、又はVEGFレセプター誘導体を発現しない細胞は、MAb 4A5が200μg/mlの濃度で含まれていた時、即ち、VEGF−D△N△CとVEGFR−3との相互作用が完全に妨げられた時、のVEGFR−3/Igアッセイのそれに等しい吸光度を示した。これは、これらアッセイに於けるVEGF−D△N△Cのマイクロタイタープレートに対する結合が、VEGFR−3の細胞外ドメインに依存していることを示すものであった。
【0068】
以上の説明及び例は、本発明を単に例示するためのものであって、限定的なものではない。当業者は本発明の精神及び要旨を含むここに開示した実施例の改変を想到する可能性があるので、本発明は、添付のクレームの範囲に含まれるそれらすべての改変構造及びそれらの均等物を含むものと広く解釈されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【図1】抗体を育成するのに使用されたポリペプチド(FLAG(登録商標)オクタペプチド無し)のアミノ酸配列(配列識別番号1)を示している図
【図2】VEGF−D△N△CへのBa/F3−NYK−EpoR細胞の応答に対する前記モノクローナル抗体の作用を示している図
【図3A】VEGF−D△N△Cに対する前記モノクローナル抗体の相対結合アフィニティーを示している図
【図3B】VEGF−D△N△Cに対する前記モノクローナル抗体の相対結合アフィニティーを示している図
【図4】マウスVEGF164へのBa/F3−NYK−EpoR細胞の応答に対する前記モノクローナル抗体の作用を示している図
【図5】VEGFR−3の細胞外ドメインへのVEGF−D△N△Cの結合に対する抗−VEGF−D MAbの作用を示している図
【配列表】
Claims (9)
- American Type Culture CollectionにATCC#HB−12698として寄託され、VEGF−D△N△Cに結合し、VEGF−DのVEGFR−2とVEGFR−3への結合を干渉し、VEGF−Cには結合せず、VEGFR−2によって仲介されるVEGFの活性は干渉しない、マウスのハイブリドーマ細胞4A5Aから産生される4A5抗体。
- 前記抗体は検出可能標識によって標識される、請求項1に記載の抗体。
- 前記検出可能標識は放射性同位体である、請求項2に記載の抗体。
- 前記抗体はヒト化抗体である、請求項1に記載の抗体。
- 請求項1に記載の抗体を産生するハイブリドーマ細胞。
- VEGF−Dのためのテストキットであって、請求項1又は4に記載の抗体と、前記抗体の結合を検出するための手段とを有するキット。
- 生物サンプル中のVEGF−Dを検出する方法であって、前記サンプルを請求項1又は4に記載の抗体と接触させる工程と、前記抗体の結合の発生を検出する工程とを有する生物サンプル中のVEGF−Dを検出する方法。
- 組織中のリンパ管構造を生体外でイメージングする方法であって、生体から採取された前記組織を請求項1又は4に記載の抗体に生体外で接触させる工程と、前記抗体の結合の発生を検出する工程とを有する組織中のリンパ管構造を生体外でイメージングする方法。
- 請求項1〜4のいずれか一項に記載の抗体を含む、VEGF−DのVEGFR−2又はVEGFR−3との結合を阻害する結合阻害剤。
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