JP2007167072A - 組換え血管内皮細胞増殖因子d(vegf−d) - Google Patents
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Abstract
【解決手段】PDGFファミリーの増殖因子の新規なメンバーであり、特に内皮細胞増殖および血管新生を刺激し、血管透過性を増大させる、VEGF−Dが記載される。また、それをコードするヌクレオチド配列、その生産方法、それに対する抗体およびその他のアンタゴニスト、それが発現するようにトランスフェクトまたはトランスフォームされた宿主細胞、それを含有する医薬組成物、そして医学上および診断上の適用におけるそれらの利用。
【選択図】なし
Description
血管新生は、組織の正常な成長および発達に必要とされる基礎的なプロセスであり、先在血管からの新しい毛細血管の増殖に関する。血管新生は、胚発生および正常な組織の成長、修復、および再生に関するだけでなく、女性の生殖周期、妊娠の確立と維持、および創傷と骨折の修復にも関与している。正常の個体において起こる血管新生の他に、血管形成の現象は、多くの病的プロセス、特に、腫瘍の増殖および転移、そして特に微小血管系の、血管増殖が増大するその他の状態、例えば、糖尿病性網膜症、乾癬、および関節症などに関係している。血管新生の阻害はこれらの病的プロセスの阻止または緩和において有用である。
cDNAを単離した。VEGF−Dと称する、その新規なタンパク質は、このファミリーのその他のメンバーと構造的類似性を示す。
本発明は、概して、内皮細胞の増殖または分化を刺激および/または増強する能力を有する新規に単離された増殖因子、その新規な増殖因子をコードする単離DNA配列、および診断および/または治療上の適用のために有用な組成物を提供する。
Pro-Xaa-Cys-Val-Xaa-Xaa-Xaa-Arg-Cys-Xaa-Gly-Cys-Cys(配列番号2)
を有するポリペプチドを提供する。前記ポリペプチドは内皮細胞の増殖を刺激する能力を有し、そして前記ポリペプチドは、配列番号3に示すアミノ酸配列、または、内皮細胞の増殖、分化、遊走または生存の内、少なくとも1つを刺激する能力を有する、そのフラグメントまたはアナログに実質的に対応するアミノ酸配列を含む。
図1は、ヒトVEGF−DとヒトVEGF165(図1a)、ヒトVEGF−DとヒトVEGF−B(図1b)、ヒトVEGF−DとヒトVEGF−C(図1c)、そしてヒトVEGF−DとヒトPlGF(図1d)の、配列間の比較を示す。箱は、ヒトVEGF−Dと正確に一致する残基を示す。
図2は、ヒトVEGF−D、ヒトVEGF165、ヒトVEGF−B、ヒト
VEGF−C、およびヒトPlGFの配列間の、配列アラインメントを示す。箱は、VEGF−D配列と正確に一致する残基を示す;そして、
図3は、cDNA配列(配列番号1)から予測した、ヒトVEGF−Dのアミノ酸配列(配列番号3)を示す。箱は、N−結合型グリコシル化の可能性のある部位を示す。
図4は、市販のヒト肺cDNAライブラリーからハイブリダイゼーションによって単離した、ヒトVEGF−Dをコードする第2のcDNA配列のヌクレオチド配列(配列番号4)を示す;このcDNAは、ヒトVEGF−Dの全体のコード領域を含む。
図5は、図4のcDNA配列から推定した(deduced) 、ヒトVEGF−Dのアミノ酸配列(配列番号5)を示す。
図6は、市販のマウス肺cDNAライブラリーからハイブリダイゼーションスクリーニングによって単離した、マウスVEGF−D1をコードするcDNAのヌクレオチド配列(配列番号6)を示す。
図7は、図6と同じライブラリーから単離した、マウスVEGF−D2をコードするcDNAのヌクレオチド配列(配列番号7)を示す。
図8は、マウスVEGF−D1の推定アミノ酸配列(配列番号8)とマウス
VEGF−D2の推定アミノ酸配列(配列番号9)を示す。
図9は、マウスVEGF−D1、マウスVEGF−D2、およびヒトVEGF−Dの推定アミノ酸配列間の、比較を示す。
図10は、ヒトVEGF−D、ヒトVEGF165、ヒトVEGF−B、ヒト
VEGF−C、およびヒトPlGFのアミノ酸配列間の配列アラインメントを示す;そして、
図11は、VEGF−AまたはVEGF−Dのいずれかを発現するCOS細胞からの条件培地を、Ba/F3細胞において発現したキメラ受容体の細胞外ドメインに対して結合する能力についてテストした、バイオアッセイの結果を示す。
図12は、VEGF−Dペプチドの免疫沈降およびウエスタンブロッティング分析の結果を示す。
(A)pEFBOSVEGFDfullFLAGおよびpCDNA−1VEGF−AをCOS細胞にトランスフェクトし、生合成的に35S−システイン/メチオニンで4時間標識した。これら培養からの上清を、M2ゲルまたはプロテインAに結合したVEGF−Aに対する抗血清のいずれかで免疫沈降した。洗浄したビーズを等容量の2xSDS−PAGEサンプルバッファーで溶出し、ボイルした。サンプルを次に12% SDS−PAGEによって分離した。星印(★)でマークしたレーンは、サンプルをジチオスレイトールで還元し、ヨードアセトアミドでアルキル化したものを示す。分子量マーカーが示されている。fAおよびfBは、
pEFBOSVEGFDfullFLAGを発現するCOS細胞からの、M2ゲルによって免疫沈降された、43kDおよび25kD種を示す。
(B)精製したVEGFD△N△Cのウエスタンブロッティング分析である。
M2アフィニティーカラムから溶出した物質のアリコット(フラクション#3、VEGFD△N△C)を、2xSDS−PAGEサンプルバッファーと混合し、そして15% SDS−PAGEゲルで分離した。タンパク質を次にニトロセルロースメンブランにトランスファーし、モノクローナル抗体M2またはコントロールのアイソタイプが一致した抗体(Neg)のいずれかで探索した(probed)。ブロットを、ヤギ抗−マウス−HRP二次抗体および化学発光(ECL, Amersham)を使用して現像した。単量体のVEGFD△N△C、およびこのペプチドの推定上の二量体形態(VEGFD△N△C”)を矢印で示す。分子量マーカーが示されている。
図13は、VEGFR2バイオアッセイを用いた、VEGFD△N△Cタンパク質の分析の結果を示す。組換えVEGFD△N△C、およびM2アフィニティークロマトグラフィーによって精製した物質を、VEGFR2バイオアッセイを用いて評価した。IL−3を除去するために洗浄されたバイオアッセイ細胞(104)を、COS細胞でトランスフェクトされたVEGF−Dからの条件培地のアリコット、アフィニティーカラムからのフラクション#1(ボイド容量)またはアフィニティーカラムからのフラクション#3(VEGFD△N△Cを含有する)とともにインキュベートした。すべてのサンプルは初濃度20%(即ち1/5)で、その後倍加希釈してテストした。細胞を10%CO2の加湿雰囲気において37℃で48時間インキュベートした。細胞の増殖を、1μCiの3H−チミジンを添加し、そして4時間以上かけて取り込まれた量をカウントすることによって定量化した。
図14は、VEGF−Dでトランスフォームされた組換えバキュロウイルスベクターで感染させたHF細胞からの培養上清による、NIH3T3細胞上のVEGFR3受容体(Flt4)のチロシンリン酸化の刺激を示す。
図15は、図14におけるものと同様に調製した培養上清による、PAE細胞におけるVEGFR2受容体(KDR)のチロシンリン酸化の刺激を示す。
図16は、ウシの大動脈の内皮細胞(BAE)に対するVEGFD△N△Cの分裂促進効果を示す。BAEを、VEGFD△N△Cを含有するフラクション#3、およびポジティブコントロールとしてテキストにおいて記載された精製VEGF−Aを用いて処理した。増殖因子を添加していない培地を用いて得られた結果を、培地コントロールと示す。
VEGFRファミリーにおいて、オーファン受容体は知られていないため、VEGFファミリーの更なるメンバーは見いだされないだろうと考えられてきた。さらに、我々は従来技術において、その他のそのようなファミリーメンバーが存在するであろうという示唆について何ら知らない。
dbESTにおいて報告されているXPT cDNAのサンプルを、the IMAGE Consortiumによって得られたcDNAクローンの登録供給者である、ATCC(the American Type Culture Collection)から入手した。XPT cDNAのアイデンティティ(同一性)を、ジデオキシチェーンターミネーション法(サンガー(Sanger)他, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1977 74 5463-5467)を使用したヌクレオチド配列決定によって確認した。
VEGF−Dのアミノ酸配列を、ヒトVEGF−A165,VEGF−B、VEGF−C、およびPlGFのアミノ酸配列と比較した。これらの比較をそれぞれ、図1aから1dに示す。配列ホモロジーの程度を計算したところ、配列内にアラインメント(整列化)の目的で導入された間隙を計算において考慮しない場合、VEGF−Dは、VEGFと31%同一であり、VEGF−Cと48%同一であり、VEGF−Bと28%同一であり、そしてPlGFと32%同一である。したがって、確認された最も近い関係にあるタンパク質はVEGF−Cであった。
VEGF−DのcDNA配列を使用して、VEGF−Dの推定アミノ酸配列、強塩基性、強酸性、疎水性および極性アミノ酸の数、分子量、等電点、pH7における電荷、およびタンパク質全体の組成分析を含む、コードされるポリペプチドの生化学的な特性を予想した。この分析はProteanタンパク質分析プログラム、バージョン1.20(DATASTAR)を使用して行った。これらの結果を以下の表1と表2とに要約する。表1はコドンの使用(codon usage)も示している。
例2に記載した、VEGF−Dに対するcDNAの最初の単離は、ヒト乳房cDNAライブラリーのハイブリダイゼーションスクリーニングによるものであった。そのようにして単離されたVEGF−Dに対するcDNAクローンはただ1つだけだったので、他の別個に単離されたVEGF−D cDNAとの比較によってcDNAの構造を確認することは不可能であった。この例で記載する研究は、更なるヒトVEGF−D cDNAクローンの単離に関するものであり、ヒトVEGF−D cDNAの構造を確認するために行われたものである。それに加えて、マウスVEGF−D cDNAクローンを単離した。
5’−GGGCTGCTTCTAGTTTGGAG(配列番号10)、
および、
5’−CACTCGCAACGATCTTCGTC(配列番号11)
を使用してポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって作成した。
i)mVEGF−D2との比較において、mVEGF−D1には残基30の後に5アミノ酸(DFSFE)が挿入されていること;
ii)mVEGF−D1の残基317、およびmVEGF−D2の残基312の後の、C−末端の終わりの部分に完全な相違があり、その結果mVEGF−D1がかなり長くなっていること、である。
図4に示す配列のヌクレオチド1から1520に渡り、全体のコード領域を含んでいる、VEGF−Dに対するヒトcDNAのフラグメントを、哺乳類の発現ベクターpCDNA1−ampに挿入した。このベクターを用いて、以前に記載されたDEAE−デキストラン法(アルッフォ(Aruffo)およびシード(Seed), 1987)によってCOS細胞を一過性にトランスフェクトし、そしてその結果得られた条件細胞培養培地(conditioned cell culture media)を7日間のインキュベーション後に収集し、Amicon濃縮器(10,000分子量をカットオフするCentricon 10)を用いて、製造業者の指示に従って濃縮した。トランスフェクションのために用いたプラスミドはヒトVEGF−Dのための発現コンストラクトと、ポジティブコントロールとして、マウスVEGF−A cDNAをpCDNA1−ampに挿入することによって作成したコンストラクトであった。条件培地を以下に記載するように2種類のバイオアッセイでテストし、そしてその結果はCOS細胞が実際に生物学的に活性の(有効な)VEGF−Dを発現および分泌していたということを実証するものである。
例5において示したように、VEGF−DはVEGFファミリーの他のメンバーに、一次構造において近い関係にある。このタンパク質ファミリーのメンバーのほとんどは、内皮細胞に対して、(細胞)分裂促進性(mitogenic)および/または走化性を有する(ケック(Keck)他, 1989; リョン(Leung)他, 1989; ヨウコフ(Joukov)他, 1996; オロフソン(Olofsson)他, 1996)。さらに文献に記載された最初のVEGFファミリーのメンバーであるVEGF−A(以前はVEGFとして知られていた)は、血管透過性の強力な誘導物質(インデューサー)である(ケック(Keck)他, 1989)。タンパク質の構造は、タンパク質の機能の重要な決定要因であるので、VEGF−Dも内皮細胞に対して分裂促進性であるか、または血管透過性を誘導する(induce)可能性があると考えられる。したがって、ヒトVEGF−Dをバイオアッセイにて、それが、VEGF−Aによって活性化されると分裂(促進)シグナルを引き起こすと考えられている内皮細胞−特異的受容体である、VEGF受容体−2(VEGFR2;Flk−1としても知られている)(ストローン(Strawn)他, 1996)に結合する能力についてテストした。
i)キメラVEGFR2受容体を産生するためのプラスミドのコンストラクション
マウスVEGFR2の細胞外ドメインをコードするDNAと、他のタンパク質ドメインをコードするDNAとを簡単に結合することが可能となるようなプラスミドコンストラクトを得るために、部位特異的突然変異誘発を使用して、マウスVEGFR2の、細胞外ドメインと膜貫通ドメインとの移行部(ジャンクション)をコードするcDNAの位置に、BglII制限酵素部位を生成した。エルリッヒス(Oelrichs)他 (1993)によって記載されたマウスVEGFR2 cDNAの全長クローンを哺乳類発現ベクターpCDNA1−amp中に、BstXI制限酵素部位を利用してサブクローニングした。一本鎖UTP+DNAをM13複製起点(ori領域)を使用して生成し、そしてこれをテンプレートとして使用して、所望の位置にBglII部位を含むマウスVEGFR2 cDNAを生成した。この変更した(altered) VEGFR2 cDNAを含むプラスミドをpVEGFR2Bglと命名した。キメラVEGFR2受容体を産生するために、あらゆる受容体の膜貫通および細胞質内ドメインをコードするDNAフラグメントをpVEGFR2BglのBglII部位に挿入することができる。
マウスEpoR cDNAを発現ベクターpCDNA1−amp中にサブクローニングし、そして突然変異誘発のためのテンプレートとして一本鎖DNAを生成した。EpoRの、膜貫通ドメインと細胞外ドメインとの移行部(ジャンクション)をコードする位置において、EpoR cDNAに、BglII制限酵素部位を挿入し、このDNAフラグメントが、pVEGFR2Bgl中のVEGFR2細胞外ドメインをコードする前記の変更した(modified)cDNAに直接ライゲーションできるようにした。さらにEpoRの細胞質内ドメインにおけるBglII部位を、無変化の(サイレントな)単一ヌクレオチド置換によって除いた。EpoRの膜貫通ドメインと細胞質内ドメインをコードするDNAフラグメントを用いて、次に、VEGFR2の膜貫通ドメインと細胞質内ドメインをコードする、pVEGFR2Bglの部分と置換した。このようにしてVEGFR2の細胞外ドメインと、EpoRの膜貫通および細胞質内ドメインとからなるキメラ受容体をコードする、単一の読み枠が生成した。
前述のBa/F3−NYK−EpoR細胞を、すべてのIL−3を除去するためにPBS中で3回洗浄し、13.5μlの培地当たり1000細胞の濃度となるように再懸濁し、そして60穴テラサキプレートの各ウェル当たり13.5μlのアリコットに分けた。トランスフェクトされたCOS細胞からの条件培地を次に細胞培養培地中に希釈した。内皮細胞受容体Tie2の細胞外ドメインとEpoRの膜貫通および細胞質内ドメインとからなるキメラ受容体を発現する細胞を非−応答性コントロール細胞ラインとして用いた。細胞を48−96時間インキュベートし、その間に細胞培養培地単独でインキュベートした細胞は死に、その他のウェル(即ちCOS細胞−条件培地の存在下のもの)においてみられた相対的な生存/増殖を、ウェル当たりに存在する生細胞を数えることによってスコアした。
例6のように調製して30倍に濃縮されたヒトVEGF−Dを、麻酔されたモルモット(アルビノ/白色、300−400g)において行ったMiles血管透過性アッセイ(マイルズ(Miles)およびマイルズ(Miles), 1952) においてテストした。pCDNA1−ampでトランスフェクトされたCOS細胞からの濃縮された条件培地を再びネガティブコントロールとして使用した。モルモットを抱水クロラールで麻酔した(3.6g/100ml;体重10g当たり0.1ml)。次にこれら動物の背中をクリッパーで注意深く剪毛した。動物に対してエバンスブルー色素(MT PBS中0.5%、0.5ml)の心臓内注入を23G針を使用して行い、そして次に100−150μlの濃縮されたCOS細胞−条件培地を皮内に注射した。15−20分後これら動物を殺し(sacrificed)、そして背中の皮膚の層を切除して下にある血管を露出させた。定量化のためにそれぞれの注射部分を切除しそして2−5mlのホルムアミド中で45℃に加熱した。その結果得られた血管外遊出した色素を含有する上清を、次に620nmで分光光度的に調べた。
VEGF−Dの推定アミノ酸配列は、他のすべてのVEGFファミリーのメンバーの配列に類似した中央部分を含んでいる(図10におけるアラインメントに示すように、ヒトVEGF−Dアミノ酸配列のおよそ残基100から196)。したがってVEGF−Dの生理活性の部分は、この保存領域に存在するであろうと考えられていた。この仮説についてテストするために、VEGF−Dの生合成について研究し、そしてヒトVEGF−Dの前記保存領域を哺乳動物細胞において発現させ、精製し、そして以下に記載するバイオアッセイにおいてテストした。
ヒトVEGF−Dの残基93から201の部分をコードするDNAフラグメント、即ちN−末端およびC−末端領域を除去したもの、をテンプレートとして全長ヒトVEGF−D cDNAを含むプラスミドを使用して、Pfu DNAポリメラーゼを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅した。増幅されたDNAフラグメントは、その配列をヌクレオチドシークエンシングによって確認し、そして発現ベクターpEFBOSSFLAGに挿入し、それによって生じたプラスミドをpEFBOSVEGFD△N△Cと命名した。pEFBOSSFLAGベクターは、インターロイキン−3(IL−3)遺伝子由来のタンパク質分泌のためのシグナル配列およびFLAGTMオクタペプチドをコードするDNAを含んでいる。
VEGF−Dポリペプチドがプロセシングされて成熟した完全に活性のあるタンパク質となるか否かを調べるため、pEFBOSVEGFDfullFLAGをCOS細胞に一過性にトランスフェクトした(アルッフォ(Aruffo)およびシード(Seed), 1987)。COS細胞中での発現、そしてその後の35S−メチオニン/システインでの生合成ラベリングおよびM2ゲルでの免疫沈降によって、およそ43kD(fA)および25kD(fB)の種が示された(図12A)。これらのバンドは、VEGF−Dは切断されてC−末端フラグメント(FLAGTMがタグ付加)および内部ペプチド(ほぼVEGFD△N△Cタンパク質に対応する)を生じるという考えに一致する。免疫沈降の還元(M2★)によっていくらかfAバンドが還元され、これは2つのフラグメントの間のジスルフィド結合の可能性を示すものである。
プラスミドpEFBOSVEGFD△N△Cを用いて、以前に記載されたDEAE−デキストラン法(アルッフォ(Aruffo)およびシード(Seed), 1987)によってCOS細胞に一過性にトランスフェクトした。その結果得られる条件細胞培養培地(およそ150ml)を、7日間のインキュベーションの後収集し、M2モノクローナル抗体を結合させた樹脂を用いたアフィニティークロマトグラフィーにかけた。簡単に説明すると、前記培地を、1mlのM2抗体カラムに、およそ4時間、4℃でバッチ式に流した。カラムを次に10mM Tris−HCl、pH8.0、150mM NaClで十分に洗浄し、その後同じバッファー中で25μg/mlの遊離のFLAGTMペプチドで溶出した。その結果得られた物質を以下に記載するバイオアッセイにおいて使用した。
ポリペプチドがVEGF受容体−2に結合する能力についてのバイオアッセイに関しては例7において詳細に記載されている。M2アフィニティーカラムから溶出したVEGFD△N△Cタンパク質を含有するフラクションのアリコットを培地で希釈し、そして以前に記載されたようにVEGFR2バイオアッセイにおいてテストした。精製VEGFD△N△Cタンパク質を含有することが示された(図12B)、アフィニティーカラムからのフラクション#3は、この精製フラクションの希釈度1/100まで、バイオアッセイ細胞ラインの増殖を誘導する明らかな能力を示した(図13)。それに対して、アフィニティーカラムのボイド容量(フラクション#1)は活性を示さず、一方オリジナルのVEGFD△N△C条件培地は弱い活性しか示さなかった。
2つの要因によって我々は活性の促進についてVEGF−Dの内部フラグメントを探索することにした。まず第1に、VEGFファミリーのその他のすべてのメンバーとアミノ酸ホモロジーを示すのは、VEGF−Dの中央部分であるということがある。第2に、PDGF−BB等の他の増殖因子では内部生理活性ポリペプチドの生成を引き起こすタンパク分解性プロセシングが起こるということがある。更にCOS細胞中の全長VEGF−Dタンパク質について見られる活性は、VEGF−AをトランスフェクトされたCOS細胞からの条件培地に対応するものよりも低かった。
組換えVEGF−Dの産生のために、ヒトVEGF−D cDNAをバキュロウイルスシャトルベクターにクローニングした。無修飾のVEGF−D cDNA(“全長VEGF−D”と称する)を含む、バキュロウイルスシャトルベクターの他に、VEGF−D cDNAが以下のように修飾された2種のバキュロウイルスシャトルベクターを構築した。
例10において記載されているように組換えVEGF−Dの産生のために、修飾および無修飾のヒトVEGF−D cDNAをバキュロウイルスシャトルベクターにクローニングした。
Five(HF)細胞の上清を、高いタイターのウイルスストックでの感染の48時間後に収集した。上清を、NaOHでpH7に調整し、一容量のD−MEM(0.2% FCS)で希釈した。
ヒトおよびマウス胚におけるVEGF−D遺伝子発現のパターンをキャラクタライズするために、VEGF−D cDNAを、ポリアデニル化されたヒトRNAのノーザンブロット分析、およびマウス胚を用いたin situハイブリダイゼーション分析のための、ハイブリダイゼーションプローブとして使用した。
図4(配列番号4)に示すヒトVEGF−D cDNAの、EcoRV部位から3’−末端にわたる(ヌクレオチド911から2029)1.1kbフラグメントをMegaprime DNAラベリングシステム(Amersham)を用いて製造業者の指示に従って、[α−32P]dATPで標識した。このプローブを用いて、再び製造業者の指示に従って、ヒト多組織ノーザンブロット(Clontech)を、ハイブリダイゼーションによってスクリーニングした。これらのブロットは、見かけ上病気を患っていない成人の組織から得られたポリアデニル化されたRNAを含むものであった。標識されたブロットのオートラジオグラフィーにより、VEGF−D mRNAは、心臓、肺、および骨格筋において最も大量であることが明らかになった。
マウスVEGF−D mRNAに対するアンチセンスRNAプローブを生成するために、図7(配列番号7)に示すマウスVEGF−D2 cDNAを、転写ベクターpBluescriptIIKS+(Stratagene)に挿入した。その結果得られたプラスミドを制限酵素(制限エンドヌクレアーゼ)FokIで完全に(to completion)消化し、そしてT3RNAポリメラーゼを用いたin vitro転写反応のためのテンプレートとして使用した。この転写反応は、VEGF−D2 cDNA(図7)の3’−末端から、最も3’−末端に近いFokI切断部位にわたる領域(ヌクレオチド1135から700)に対して、配列において相補的なVEGF−D mRNAに対するアンチセンスRNAプローブを生じさせるものであった。このアンチセンスRNAプローブを、交尾後15.5日のマウス胚から作成したパラフィン包埋した組織切片と、高いストリンジェンシーにてハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションと洗浄は、本質的に以前に記載されたものと同様であった(アーヘン(Achen)他, 1995)。
VEGF−D遺伝子は成人において広く発現しているが、確実に遍在性に発現している訳ではない。最も強い発現は、心臓、肺および骨格筋において検出された。交尾後15.5日のマウス胚において、強い特異的なVEGF−D遺伝子発現が肺において検出された。これらのデータは、VEGF−Dが肺の発達において役割を果たしている可能性があること、および肺におけるVEGF−D遺伝子発現が、少なくともヒトでは成体においても持続していることを示唆している。成人における他の組織での遺伝子発現は、VEGF−Dがその他の成体組織において別の機能を果たしているということを示唆している。
VEGFファミリーのタンパク質のいくらかのメンバー、すなわちVEGF−A(リョン(Leung)他, 1989)およびVEGF−B(オロフソン(Olofsson)他, 1996)は、内皮細胞に対して(細胞)分裂促進性である。内皮細胞に対するVEGFD△N△Cの分裂促進能力をテストするために、このタンパク質を例9に記載されているように発現させ、アフィニティークロマトグラフィーによって精製した。VEGFD△N△Cを含有する、M2アフィニティーカラムから溶出した、フラクション#3を、5%血清を含む細胞培養培地中で10分の1に希釈し、そして10%血清を含む培地中で増殖させたウシ大動脈内皮細胞(BAE)に与えた。BAEは、VEGFD△N△Cの添加の前日にウェル当たり10,000細胞の密度で24−穴シャーレに播いておき、このポリペプチドの添加の3日後、細胞をトリプシンによって解離させ、数えた。ポジティブコントロールとしてこの実験に精製VEGF−Aを用いた。結果を図16に示す。細胞培養培地にフラクション#3を添加することにより、インキュベーションの3日後のBAEの数は2.4倍に増加し、この結果はVEGF−Aについて得られたものに匹敵するものであった。明らかにVEGFD△N△Cは内皮細胞に対して分裂促進性である。
ヒト染色体上のVEGF−D遺伝子の局在化のためのハイブリダイゼーションプローブを作成するために、ヒトゲノムDNAライブラリー(Clontech)から、VEGF−DのヒトゲノムDNAクローンを単離した。ゲノムライブラリーを、標準的方法(サムブルック(Sambrook)他, 1989)を用いて、図4に示すヒトVEGF−D cDNAでのハイブリダイゼーションによってスクリーニングした。そのようにして単離したクローンの1つは、ヒトVEGF−D cDNAからの配列に由来する多数のオリゴヌクレオチドに対するハイブリダイゼーションにより、VEGF−D遺伝子の部分を含んでいることが示された。およそ13kbのサイズの、このゲノムクローンの領域をアガロースゲルから精製し、ビオチン−14−dATPでニックトランスレーションによって標識し、そして2人の正常ヒト男性からの(分裂)中期(metaphase)に対して最終濃度20ng/μlにてin situでハイブリダイズさせた。蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)法を以前に記載されたもの(カレン(Callen)他, 1990)から以下の点において改変した。つまり、染色体をよう化プロピジウム(対比染色として)とDAPI(染色体同定のため)で分析の前に染色した。中期標本のイメージ(像)を、the CytoVision Ultra image collection and enhancement system(Applied Imaging Int. Ltd.)を用いて、冷却CCDカメラで捕らえた。FISHシグナルとDAPI結合パターンを分析のために組み合わせた(merged)。
VEGF−D遺伝子のマウス染色体の位置を、以前に記載されているように(コープランド(Copeland)およびジェンキンス(Jenkins), 1991)、(C57BL/6JxMus Spretus)F1雌とCB7BL/67雄とを交配することによって得られた子孫を用いた種間戻し交雑分析によって決定した。この種間戻し交雑マッピングパネルは、すべての常染色体およびX染色体の間に広く分布する、2400以上の遺伝子座についてタイプされている(コープランド(Copeland)およびジェンキンス(Jenkins), 1991)。C57BL/6JおよびM. SpretusのDNAをいくつかの酵素で消化し、そして情報源である(informative) 制限断片長多型(RFLP)について、本質的に記載されたように(ジェンキンス(Jenkins)他, 1982)、1.3kbのマウスVEGF−D cDNAプローブを用いてサザンブロットハイブリダイゼーションによって分析した。TaqIで消化したC57BL/6J DNAにおいて、7.1、6.3、4.7、2.5および2.2kbのフラグメントが検出され、そしてTaqIで消化したM. Spretus DNAにおいて、7.1、3.7、2.7、および2.2kbの主要なフラグメントが検出された。同時分離した、3.7および2.7のTaqIM. Spretus 特異的フラグメントの存在または不在は戻し交雑したマウスにおいて伴った(followed)。マッピングの結果は、VEGF−D遺伝子が、Bik、DxPasIおよびPtmb4に連鎖(リンク)して、マウスX染色体の末端領域に位置するということを示す。89のマウスにおいてはすべてのマーカーについて分析したが、133のマウスはいくつかのマーカーの対についてタイプした。それぞれの遺伝子座を、追加のデータを用いて組換え頻度について対の組み合わせにおいて分析した。各遺伝子座の対について分析したマウスの総数に対する、組換え染色体を示すマウスの総数の比、および最も確からしい遺伝子順序は以下の通りである:セントロメア−Btk−14/121―DxPasI―3/99―VEGF−D―5/133−Ptmb4。Map Manager(version 2.6.5)を用いて算出した組換え頻度[遺伝的距離として、センチモルガン(cM)±標準誤差にて表現した]は、−Btk−11.6+/−2.9―DxPasI―3.0+/−1.7―VEGF−D―3.8+/−1.7−Ptmb4である。Btk、DxPasI、およびPtmb4を含む、VEGF−D遺伝子に連鎖した遺伝子座についてのプローブおよびRFLPの記載は、以前に報告されたものである(ハックフリガー(Hacfliger)他, 1992; ホロウェイ(Holloway)他, 1997)。
VEGF−Dが、内皮細胞に対する機能、血管新生および創傷治癒に関して、VEGFと類似の活性を有するか否かを評価するための他のアッセイを行った。受容体結合分布研究の結果によっては更なるアッセイを行ってもよいであろう。
a)内皮細胞増殖
内皮細胞増殖アッセイを、例えばファーララ(Ferrara)およびヘンゼル(Henzel) (1989), ゴスポダロヴィッツ(Gospodarowicz)他(1989),および/またはクラッフェイ(Claffey)他, Biochim. Biophys. Acta, 1995 1246 1-9の方法などの、当業者に周知の方法によって行う。
多形核顆粒球の内皮細胞に対する接着に関するVEGF−Dの効果についてテストする。
標準的なボイデンチャンバー(BoydenChamber) 走化性アッセイを用いて、走化性に関するVEGF−Dの効果についてテストする。
ペッパー(Pepper)他 (1991)の方法を用いて、内皮細胞を、プラスミノーゲン活性化因子およびプラスミノーゲン活性化因子阻害剤の産生に関するVEGF−Dの効果についてテストする。
モンテサノ(Montesano)他 (1986)に記載されているようにして、内皮細胞の遊走および管(チューブ)の形成を刺激するVEGF−Dの能力についてアッセイする。別法として、ヨウコフ(Joukov)他 (1996)によって記載された三次元コラーゲンゲルアッセイまたは改変ボイデンチャンバー(Boyden Chamber)におけるゼラチン化メンブラン(グレイザー(Glaser)他, 1980)を用いてもよい。
リョン(Leung)他 (1989)に記載されているようにして、ニワトリ漿尿膜における血管形成応答を誘導するVEGF−Dの能力についてテストする。別法としてラスティネジャド(Rastinejad)他 (1989)のラット角膜アッセイを用いてもよい;これはin vivo血管新生アッセイについて受け入れられている方法であり、その結果はその他のin vivoシステムにすぐに移行可能である。
創傷治癒を刺激するVEGF−Dの能力について、シリング(Schilling)他 (1959)によって記載され、ハント(Hunt)他 (1967)によって利用された、使用可能な臨床的に最も関連性のあるモデルにおいてテストする。
造血系に特異的な細胞集団を用いた多様なin vitro およびin vivoのアッセイが当業者に知られているが、以下にその概要を述べる。具体的には、蛍光活性化セルソーターで精製した細胞を用いた多様なin vitroマウス幹細胞アッセイが特に便利である。
これらは致死照射されたマウスの骨髄を再増殖させることができ、そしてLin−、Rhh1,Ly−6A/E+、c−kit+の表現型を有する細胞である。VEGF−Dを、これらの細胞単独と、またはその他の因子とともに、共−インキュベーションし、その後3H−チミジン取り込みによる細胞の増殖の測定を行うことによってテストする。
これらは比較的弱い骨髄再増殖能力を有するが、D13 CFU−Sを産生することができる細胞である。これらの細胞はLin−、Rhh1,Ly−6A/E+、c−kit+の表現型を有する。VEGF−Dを、これらの細胞とともに一定期間インキュベートし、致死照射されたレシピエントに注入し、そしてD13脾コロニーの数を数える。
これらはin vitroで単一の増殖因子に応答し、Lin−、Rhh1,Ly−6A/E+、c−kit+の表現型を有する細胞である。このアッセイは、VEGF−Dが直接的に造血前駆細胞に対して作用することができるか否かを示すものである。VEGF−Dをこれらの細胞とともに寒天培養においてインキュベートし、そして7−14日後に存在するコロニーの数を数える。
平滑筋細胞はアテローム性動脈硬化症の発達または惹起において重大な役割を果たしており、それはそれらの表現型が収縮性から合成の状態へと変化することを必要とする。マクロファージ、内皮細胞、Tリンパ球および血小板はすべて、平滑筋細胞の増殖および表現型の変調に影響を与えることによって、アテローム斑の発達において役割を果たしている。その中において異なる細胞タイプが対の(opposite)カバーグラスに播かれる、改変Roseチャンバーを使用したin vitroアッセイは、多細胞の環境における平滑筋細胞の増殖速度および表現型の変調を測定するものであり、それを用いてVEGF−Dの平滑筋細胞に対する効果が評価される。
転移を阻害するVEGF−Dの能力について、例えばカオ(Cao)他(1995)の方法を使用して、ルイス肺癌モデルを用いてアッセイする。
他の細胞タイプ、例えば肝臓細胞、心筋およびその他の細胞、内分泌細胞そして骨芽細胞(造骨細胞)の、増殖、分化そして機能に対するVEGF−Dの効果は、in vitro培養による3H−チミジン取り込みなどの当業者に周知の方法によって簡単にアッセイすることができる。これらおよびその他の組織におけるVEGF−Dの発現は、ノーザンブロッティングおよびハイブリダイゼーション等の技術、またはin situハイブリダイゼーションによって判定することができる。
VEGF−Dは、PDGFファミリーの増殖因子のメンバーであり、PDGFファミリーのその他のメンバーと高度なホモロジーを示す。VEGF−Dはこのファミリーの増殖因子に特有の8つの保存されたシステイン残基を含む。これらの保存されたシステイン残基は、システインノット構造を作る、鎖内ジスルフィド結合、およびPDGFファミリーの増殖因子のメンバーの特徴であるタンパク質ダイマーを作る、鎖間ジスルフィド結合を形成する。VEGF−Dは、タンパク質チロシンキナーゼ増殖因子受容体と相互作用する。
アーヘン,エム,ジー (Achen, M.G.), クラウス,エム(Clauss, M.), シュニュルヒ,エイチ(Schnuerch, H.)およびリソー,ダブリュ(Risau, W.)
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ファン・デ・ポール,エム(van de Poll, M.)およびヘルディン,シー‐エイチ(Heldin, C-H)
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ストローン,エル,エム(Strawn, L.M.), マクマホン,ジー(McMahon, G.), アップ,エイチ(App, H.), シュレック,アール(Schreck, R.), クックラー,ダブリュ,アール(Kuchler, W.R.), ロンギ,エム,ピー(Longhi, M.P.), フイ,ティ,エイチ(Hui, T.H.), タン,シー(Tang, C.), レヴィツキー,エイ(Levitzki, A.), ガジット,エイ(Gazit, A.), チェン,アイ(Chen, I.), ケリ,ジー(Keri, G.), オルフィ,エル(Orfi, L.), リソー,ダブリュ(Risau, W.), フラメ,アイ(Flamme, I.), ユルリッチ,エイ(Ullrich, A.), ヒルス,ケイ,ピー(Hirth, K.P.)およびショーヴァー,エル,ケイ(Shawver, L.K.)
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Claims (32)
- 配列番号5の93〜201のアミノ酸残基からなるポリペプチド、または、少なくとも1のアミノ酸の置換または欠失を有する対応のポリペプチド、をコードする単離核酸分子であって、前記ポリペプチドが、細胞増殖、細胞分化、細胞遊走、細胞生存および血管透過性からなるグループから選択される少なくとも一つの内皮細胞生物活性を刺激する能力を有するか、あるいは、内皮細胞に結合する能力を有するが少なくとも一つの前記生物活性を刺激する能力を有さない、配列番号5の93〜201のアミノ酸残基からなるポリペプチド、または、少なくとも1のアミノ酸の置換または欠失を有する対応のポリペプチド、をコードする単離核酸分子。
- cDNAである、請求項1に記載の核酸分子。
- ゲノムDNAである、請求項1に記載の核酸分子。
- 前記ポリペプチドが、更にアフィニティータグペプチド配列を有する、請求項1〜3のいずれかの核酸分子。
- 請求項1〜4のいずれか記載の核酸分子を有するベクター。
- 請求項5に記載のベクターを含む宿主細胞。
- 配列番号5の93〜201のアミノ酸残基からなるポリペプチド、または、少なくとも1のアミノ酸の置換または欠失を有する対応のポリペプチドであって、前記ポリペプチドが、細胞増殖、細胞分化、細胞遊走、細胞生存および血管透過性からなるグループから選択される少なくとも一つの内皮細胞生物活性を刺激する能力を有するか、あるいは、内皮細胞に結合する能力を有するが少なくとも一つの前記生物活性を刺激する能力を有さない、配列番号5の93〜201のアミノ酸残基からなるポリペプチド、または、少なくとも1のアミノ酸の置換または欠失を有する単離ポリペプチド。
- 更にアフィニティータグペプチド配列を有する、請求項7に記載のポリペプチド。
- 請求項7に記載のポリペプチドに対して特異的な反応性を有する抗体。
- 前記抗体が、ポリクローナル抗体である請求項9に記載の抗体。
- 前記抗体が、モノクローナル抗体である請求項9に記載の抗体。
- 前記抗体が、ヒト化抗体である請求項9に記載の抗体。
- 前記抗体が、キメラ抗体である請求項9に記載の抗体。
- 前記抗体が、検出可能なラベルで標識されている請求項9〜13のいずれかに記載の抗体。
- 請求項7または8に記載のポリペプチドを作る方法であって、前記方法が以下の工程:
i)前記ポリペプチドをコードする核酸配列が発現するように、プロモーター配列に操作可能に結合した前記ポリペプチドをコードする核酸配列を有するベクターを有する宿主細胞を培養する工程;そして
ii)前記宿主細胞から、または、前記宿主細胞が培養される増殖培地から前記ポリペプチドを単離する工程、を有する方法。 - 請求項7または8のポリペプチドを単離する方法であって、下記の工程:
i)前記ポリペプチドを発現する細胞からの前記ポリペプチドの放出を促進するために、前記細胞をヘパリンに曝す工程と、そして、
ii)そのようにして放出されたポリペプチドを精製する工程、
とを有する、方法。 - 請求項1〜4のいずれかに記載の核酸分子によってコードされるポリペプチドを発現する能力のあるベクターを作る方法であって、前記方法が、前記核酸分子が少なくとも一つのプロモーターと作用するように結合する位置において、前記核酸分子をベクターに挿入する工程を有する、方法。
- アンチセンスヌクレオチド配列を有するベクターであって、前記アンチセンスヌクレオチド配列が、請求項7または8に記載のポリペプチドをコードし、血管透過性、内皮細胞の増殖および内皮細胞分化から選択される少なくとも一つの生物活性を促進する、ゲノムDNA配列、RNA配列、またはcDNA配列の少なくとも一部に対して相補的であって、前記ベクターが前記少なくとも一つの活性を阻害するために使用可能である、アンチセンスヌクレオチド配列を有するベクター。
- 内皮細胞の増殖を生体外において刺激する方法であって、内皮細胞を増殖するのに有効な量の請求項7または8に記載のポリペプチドに接触させる工程を有する、内皮細胞の増殖を生体外において刺激する方法。
- 前記内皮細胞が、血管内皮細胞またはリンパ内皮細胞である請求項19に記載の方法。
- 請求項7または8に記載のポリペプチド、および薬学で許容されるキャリアまたはアジュバントを有する、医薬組成物。
- 更に、VEGF,VEGF−B,VEGF−C,PlGF,PDGF,FGFおよびヘパリンからなるグループから選択される少なくとも一つの物質を有する、請求項21に記載の医薬組成物。
- 請求項9に記載の抗体、および薬学で許容されるキャリアまたはアジュバントを有する、医薬組成物。
- 前記抗体が、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、および、キメラ抗体からなるグループから選択される請求項23に記載の医薬組成物。
- 請求項7または8に記載の第一のポリペプチド、および第二のポリペプチドからなる、タンパク質ダイマー。
- 前記タンパク質ダイマーがホモダイマーであり、前記第二のポリペプチドが、前記第一のポリペプチドと同じである、請求項25に記載のタンパク質ダイマー。
- 前記タンパク質ダイマーがヘテロダイマーであり、前記第二のポリペプチドが、VEGF,VEGF−B,VEGF−C,PlGFおよびPDGFからなるグループから選択される、請求項25に記載のタンパク質ダイマー。
- 生物試料中における請求項7または8に記載のポリペプチドを検出する方法であって、前記試料を、前記ポリペプチドに結合する能力のある抗体に接触させる工程と、前記抗体の結合の発生を検出する工程とを有する、方法。
- 生体外におけるVEGF受容体2の活性化方法であって、前記受容体を有する細胞を、前記受容体を活性化するのに有効な用量の請求項7または8に記載のポリペプチドに曝す工程を有する、生体外におけるVEGF受容体2の活性化方法。
- 生体外におけるVEGF受容体3の活性化方法であって、前記受容体を有する細胞を、受容体を活性化するのに有効な用量の請求項7または8に記載のポリペプチドに曝す工程を有する、生体外におけるVEGF受容体3の活性化方法。
- 請求項9に記載の抗体と、前記抗体の結合を検出するための手段を有する、診断または予知のテストキット。
- ポリメラーゼに作用するように結合する、請求項1〜3のいずれかに記載の核酸分子に対して特異的なプライマーの対を有する、診断または予知のテストキットであって、前記ポリメラーゼがDNAサンプルからの前記核酸分子を選択的に増幅することが可能となる、診断または予知のテストキット。
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