JP2004523230A - 新規なフィブロネクチンエピトープおよびエピトープに結合可能な蛋白質性分子 - Google Patents

Abstract

腫瘍成長の少なくとも部分的な阻害に対する手段および方法を提供する。フィブロネクチン蛋白質のサブセットに存在するエピトープに特異的に結合可能な結合分子の使用法。本発明の結合分子を個体に供給することにより、脈管形成部位あるいは活性な脈管形成が見られた部位を妨害可能である。この妨害により、血流が少なくとも部分的に阻害される。この阻害により、腫瘍成長等の前記個体における活性な脈管形成に依存するプロセスを少なくとも部分的に阻害することができる。

Description

【技術分野】
【０００１】
本願発明は医薬の分野、特に癌治療の分野に関する。本願発明は抗体、特にヒトフィブロネクチンと相互作用する抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞外マトリックスは細胞生存、細胞形態、および細胞粘着を支持することによる組織体制を制御する。細胞外マトリックスの再構築および細胞移動は適切に組織化された血管、組織および器官の開発において重要なプロセスであり、病理学のプロセスに結びつけられてきた（Ｗｅｒｂ，１９９７年；Ｌｉｏｔｔａ等，１９９１年）。フィブロネクチンおよびコラーゲンファミリーのメンバー等の多くの細胞外マトリックス、およびプラスミンおよびメタロプロテイナーゼ等のプロテアーゼは再構築プロセスに含まれる。これらの蛋白質は細胞移動、生存および／または血管形成等の重大なプロセスに影響することにより腫瘍表現型の調節に結びつけられる。
【０００３】
フィブロネクチンは分化細胞の多くの型の細胞表面にて発現される高分子量グリコプロテインであり、細胞が周囲の細胞外マトリックスに付着する際に必要とされる。フィブロネクチンは細胞外マトリックス、コラーゲン、およびグリコサミノグリカンの他の主要成分に親和性がある。また、プラスチック等の表面上で不溶化した場合フィブロネクチン−コラーゲン複合体またはフィブロネクチン単独が種々の型の細胞のこのような表面への付着を強化することを見いだすことにより示されるように、細胞表面と相互作用する。立体配座の自由度はフィブロネクチンの生物学的特性に影響を与える可能性を持っている。溶解性プラズマフィブロネクチンは多くの細胞型に対する結合性が低いが、適当な基質に堆積した後は、その細胞結合活性は強化される。基質は末梢血中の細胞外マトリックスまたはフィブリンにおけるコラーゲンである。細胞外マトリックスにおいて、フィブロネクチンは細胞形、移動、増殖、分化、形態形成、および生存を調節する信号を提供する。これにより、フィブロネクチンはパラダイム接着性蛋白質になり、溶解性状態において非反応性、非溶解性の場合に高接着性になる。細胞外マトリックスにおいて、接着性蛋白質は、これらの分子の構造的または配座変換の後に明らかにされかつマトリ潜在的（ｍａｔｒｉｃｒｙｐｔｉｃ）部位と呼ばれる（Ｄａｖｉｓ等、２０００年）、生物学的に活性な潜在的（ｃｒｙｐｔｉｃ）部位を示す。これは、Ｐｉｃｋｆｏｒｄ等（２００１年）による研究と一致し、彼らは、コラーゲン結合が、ドメインＩ−１／Ｉ−２／Ｉ−３／Ｉ−４／Ｉ−５とＩＩＩ−３の分子間相互作用を切り離すフィブロネクチンにおける立体配座変化を誘導することを示した。結果として、フィブロネクチンのこのゼラチン結合ドメインにおける潜在的部位は露出される。
【０００４】
フィブロネクチンは二量体であり、多重構造ドメインから構成される大きいジスルフィド結合サブユニットからなる。この分子の半分より多くがいわゆるフィブロネクチンＩＩＩ型繰り返しからなる。フィブロネクチンの、２種のスプライス変異株が知られている。いわゆるＥＤ−Ａスプライス変異株が幾つかの正常な組織で発現し、血清中でも見付けられる。ＥＤ−Ａ発現は腫瘍組織および胚性組織において上方制御される。いわゆるＥＤ−Ｂスプライス変異株は胚性組織および腫瘍組織において発現されるのみである。健康な大人の組織では検出されない（ＲｅＺａ Ｆａｒｎｏｕｄ等、１９９５年；Ｐｕｊｕｇｕｅｔ等、１９９６年）。
【０００５】
これまで、多くの異なる疾病は抗体により治療されている。しかし、多くの疾患は、治療されないでいる。ナゼナラ、このようなエピトープに結合可能な抗体または他の蛋白質性分子との相互作用を介して免疫系により除去されることが必要である細胞あるいは表面で発現される、特異的なエピトープが発見されないからである。フィブロネクチンに対する分子上に結合した新規なエピトープは、腫瘍表現型および脈管形成に関連し、疾病を診断および／または治療するための候補として関心がもたれる。
【発明の開示】
【０００６】
本発明は一観点において、フィブロネクチン上の新規なエピトープを提供し、別の観点において、前記エピトープに優先的に結合する蛋白質性分子を提供する。このエピトープはＥＤ−Ａ、ＥＤ−Ｂ、および前記癌胎児性エピトープとは異なる。体中の発現パターンはこれらの記載されたエピトープのいずれも暗示しない。ヒト体において本発明のエピトープの観察されたパターンはユニークであり、疾病の診断および／または治療に対する新しい機会を提供する。本発明のエピトープの発現は少なくともある腫瘍細胞、腫瘍細胞近辺の内皮細胞、および腫瘍細胞近辺の細胞外マトリックスに関連する。本発明のエピトープが、ここしばらくの間に脈管形成が生じた領域または活性脈管形成領域に相関することが仮定される。本発明のエピトープは、フィブロネクチンがゼラチンに結合する場合（フィブロネクチン含有プラズマまたはゼラチンセファロースアフィニティクロマトグラフィーによりプラズマから精製されたフィブロネクチンのいずれか）本発明にかかる蛋白質性分子により優先的に認識される。フィブロネクチンがプラスチックに直接被覆される場合に弱い結合が観察された。コラーゲンの原繊維形態がフィブロネクチンに結合することが知られているが、これによって本発明のエピトープの発現は誘導されない。このことは、（ゼラチン等）コラーゲンの分解／変性形態はフィブロネクチンが異なるコンフォーマーに変形するために必要とされ、そして本発明の立体配座エピトープの発現に至ることを表している。本発明にかかる蛋白質性分子は、単層においてあるいはＥＤＴＡで処理した後懸濁液中でヒト真皮微小血管内皮細胞下部（ＨＤＭＥＣ）に結合する。明らかに、フィブロネクチンの内皮細胞結合形態は、本発明のエピトープの露出に至る立体配座変化を示した。
【０００７】
一観点から、本発明は、フィブロネクチンと１以上のゼラチン、フラグメントコラーゲン、および変性コラーゲンとの間の相互作用の際にフィブロネクチンに結合可能な蛋白質性分子を提供する。変性および／または分解／フラグメント化コラーゲンは、酸、高温、プロテアーゼ、これらの組み合わせ等による蛋白質分解により生成できる。ゼラチンは変性コラーゲンが多い材料である。前記蛋白質性分子のフィブロネクチンへの結合は、フィブロネクチンがゼラチンおよび／またはフラグメント化コラーゲン、および／または変性コラーゲンと相互作用する場合に起こり得、フィブロネクチンが前記物質のうちの一つと相互作用しない場合には起こらないかまたは非常に程度が低い。これにより、前記蛋白質性分子は前記条件のうちの一つの下でフィブロネクチンと優先的に結合する。あるいはフィブロネクチンへの結合は前記条件のうち一つの下で誘導または増強される。前記物質のうち一つに対するフィブロネクチンの相互作用により、非制限的に、前記物質にフィブロネクチンが直接結合する。本発明の蛋白質性分子はプラチックに直接被覆したフィブロネクチンに結合するが、この結合は、フィブロネクチンがゼラチンと相互作用する場合に非常に増強される。したがって、本発明の一観点から、フィブロネクチンに結合可能な蛋白質性分子であって、前記結合がフィブロネクチンと１以上のゼラチン、フラグメントコラーゲン、および変性コラーゲンとの間の相互作用により増強される、フィブロネクチンに結合可能な蛋白質性分子を提供する。一観点では、前記結合は、少なくとも２つの因子により、好ましくは少なくとも２０の因子により増強される。別の観点では、前記蛋白質性分子がフィブロネクチンと１以上のゼラチン、フラグメント化コラーゲン、および変性コラーゲンとの間の相互作用により誘導されるエピトープに結合する。前記エピトープがフィブロネクチンと前記物質のうち一つとの相互作用で誘導または露出され、フィブロネクチンが前記物質のうち一つと相互作用しない場合は非常に低い程度に露出されるかマスクされる。エピトープの誘導は、例えば、構造的立体配座変化の後、潜在的エピトープが明らかにされる場合に起こる。本発明のエピトープは試験した正常なヒト組織のいずれにおいても発現しない。しかし、ある型の腫瘍細胞、ある種類の腫瘍細胞の近傍の内皮細胞、および腫瘍細胞の近傍の細胞外マトリックスで発現する。したがって、ある観点では、エピトープは腫瘍特異的である。腫瘍特異的とは、正常組織に比較して腫瘍組織において優先的な発現を含むことを意味する。また、本発明のエピトープはヒト微小血管内皮細胞株において発現し、巨大血管内皮細胞株においては発現しない。したがって、別の観点では、エピトープの誘導は脈管形成と一致する。細胞外マトリックスでは、接着性蛋白質は、これらの分子の構造的または立体配座の変化の後に明らかにされ、マトリ潜在的部位（Ｄａｖｉｓ等、２０００）と呼ばれる生物学的に活性な潜在的部位を示す。こうして、明らかにされたエピトープをマトリ潜在的エピトープという。フィブロネクチンにおけるマトリ潜在的エピトープに結合可能な蛋白質性分子を提供することが本発明の観点である。別の観点では、前記マトリ潜在的エピトープはフィブロネクチンと１以上のゼラチン、フラグメントコラーゲン、または変性コラーゲンとの間の相互作用で誘導される。一態様では、前記マトリ潜在的エピトープは腫瘍特異的である。本発明の蛋白質性分子に結合するエピトープのマッピングにより、前記エピトープがフィブロネクチンの４０ｋＤａフラグメントにおける少なくとも一部であることが明らかになり、これはゼラチン／コラーゲン結合に関係している。したがって、一観点では、本発明のエピトープはフィブロネクチンのゼラチン結合ドメインにおける少なくとも一部である。
【０００８】
本発明の蛋白質性分子はフィブロネクチン含有マトリックスおよび／またはフィブロネクチン含有細胞のサブセットを識別可能である。フィブロネクチン蛋白質のサブセットに存在するエピトープに特異的に結合可能な蛋白質性分子の結合は診断セッティングにおいて使用可能である。例えば、腫瘍組織が患者から採取した試料に存在するか否かを決定するために、または活性な脈管形成の領域を検出または画像化するためである。その標的への前記蛋白質性分子の結合は治療セッティングにおいても使用可能である。好ましい態様において、本発明は腫瘍細胞を提供することおよび／またはマトリックス組織をフィブロネクチン蛋白質のサブセットに存在するエピトープに特異的に結合可能な蛋白質性分子で取り囲むことを含む、腫瘍細胞の成長を少なくとも部分的に防止する方法を提供する。腫瘍の成長は、前記蛋白質性分子と前記フィブロネクチン蛋白質のサブセットとの直接的な相互作用を介して少なくとも部分的に防止される。前記サブセットに属さないフィブロネクチンは前記蛋白質性分子によって結合されず、したがって、蛋白質性分子の影響を受けない。理論はともかく、蛋白質性分子の結合はフィブロネクチンまたはフィブロネクチン関連分子の１種以上の信号伝達特性に干渉することが考えられる。特に血管形成が生じる領域の暫定的な細胞外マトリックスにおいては、フィブロネクチンはこのような血管形成を容易にする。この容易性は、本発明の蛋白質性分子が前記フィブロネクチンに結合することによって少なくとも部分的に影響を受け得る。好ましくは、蛋白質性分子の結合のためのエピトープは、血管形成が少なくとも部分的に阻害される組織に対して少なくとも部分的に特異的である。好ましくは、前記エピトープが本発明のエピトープを含む。本発明のエピトープ分布は治療セッティングに特に好ましいが、これは、少なくとも、試験した正常な組織のいずれにおいても検出されなかったからではない。個体に本発明の結合分子を提供することにより、脈管形成部位または脈管形成が活性であったばかりの部位に干渉することが可能である。この干渉により、血液流は少なくとも部分的に阻害される。この阻害により、腫瘍成長等の前記個体における活性な脈管形成に依存するプロセスを少なくとも部分的に阻害可能である。したがって、本発明の観点は、本発明の蛋白質性分子を使用して脈管形成の検出、画像化、または阻害することである。別の観点は、本発明の蛋白質性分子を使用して、脈管形成の開始および／またはヒト患者の脈管形成に関係する生理学的な条件を検出する。正常な組織には本発明のエピトープがないことにより、本発明の蛋白質性分子の全身的投与経路を可能にする。本発明の蛋白質性分子の普及のために血流を利用できるのは有利であり、これに関連する全利点（適当な浸透および分布）を具える。治療により標的とされる領域の外側の目標エピトープの制限された利用性については通常は許容される。血管形成は正常な個体においては、少なくとも制限された領域で、深刻な副作用を招くことなく、阻害することができる。例えば、妊娠している女性または妊娠を希望している女性等、脈管形成が干渉されてはいけない個体は、種々の有害な影響が観察されるかもしれない。必要な場合には、副作用が予想される患者は、本発明のフィブロネクチン結合蛋白質性分子の受容を排除可能である。
【０００９】
本発明の幾つかの態様では、本発明の蛋白質性分子の結合は結合フィブロネクチンに対する免疫系成分を強化できる。この強化により、結合細胞外マトリックスおよび／または結合細胞の除去が容易になる。あるいは、前記蛋白質性分子はタグを含むかまたは供給されるかもしれない。好ましくは、前記タグは細胞過程に干渉可能である。前記好ましいタグを有する前記蛋白質性分子は本発明の蛋白質性分子の抗腫瘍性能を少なくとも部分的に改良可能である。好ましくは、前記タグは脈管形成阻害体、毒素、抗腫瘍薬、および／または放射性化合物を含む。
【００１０】
本発明の開始において、前記蛋白質性分子は腫瘍性細胞に結合可能である。このような結合は診断アッセイまたは治療セッティングにおいて前記細胞に印を付けるために使用できる。例えば、本発明の蛋白質性分子の結合は、結合細胞の死をトリガーする。ある態様において、前記腫瘍細胞は乳房細胞、前立腺細胞、結腸細胞、肺細胞、皮膚細胞、膵臓細胞、膀胱細胞、頭部細胞、または頸部細胞に由来している。別の観点では、前記蛋白質性分子は微小血管においてフィブロネクチンに結合可能である。別の観点では、前記フィブロネクチンは細胞外マトリックスの一部である。ある態様では、前記細胞外マトリックスは腫瘍細胞の近傍にある。別の態様では、前記蛋白質性分子は微小血管内皮細胞に結合可能である。好ましくは、前記微小血管細胞株は腫瘍細胞の近傍にある。微小血管細胞への本発明の蛋白質性分子の結合は新しい血管という副産物を少なくとも部分的に防止するために使用可能であり、これにより、少なくとも部分的に前記腫瘍細胞の成長を制限する。本発明のエピトープは種々の型の動物に存在する。しかし、診療および診断の使用を考慮すると、前記蛋白質性分子が、ヒトフィブロネクチン蛋白質のサブセットに好ましく結合可能である。
【００１１】
多くの異なる型の結合分子が当業界で知られている。フィブロネクチン等の蛋白質性標的に対して、結合分子は典型的には蛋白質性分子である。これらは少なくとも、ペプチド結合を介して結合したいくつかのアミノ酸を含む。典型的にはこのような蛋白質性結合分子はペプチド結合を介して結合した少なくとも７つのアミノ酸を含む。本発明の蛋白質性分子は例えばペプチドのファージディスプレイを使用して見つけることができる。本発明の好ましい態様では、前記蛋白質性分子は抗体またはその機能的部分またはその誘導体である。抗体の機能的部分は、前記抗体の少なくとも１つの抗原結合部分を含む。非制限部分はＦ（ａｂ）およびＦ（ａｂ）_２フラグメントである。誘導体または抗体の一部は本質的に同じ、本発明の蛋白質性分子の抗原結合特性を有する。誘導体は本発明の、抗体またはその部分に比べて、１以上のアミノ酸置換物、挿入物、または欠損物を含む。別の好ましい態様では、前記蛋白質性分子は単鎖Ｆｖフラグメントである。本発明の蛋白質性分子は当業者が周知の方法を使用して、寄託番号０２０１１５１８の下で２００２年１月１５日に、欧州細胞培養バンク（ＥＣＡＣＣ：European Collection of Cell culture）に寄託した、プラスミド表示Ｆｉｂｍａｂ−Ｈｉｓ／ｍｙｃから、発現により得ることができる。好ましくは、前記抗体またはその機能的部分またはその誘導体は、ヒト的であるかまたはヒト化（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）される。好ましくは、本発明の蛋白質性分子はさらにタグを含む。好ましくは、前記タグが毒および／または放射性物質を含む。好ましい態様では、前記蛋白質性分子がＣＤＲ３領域を含む重鎖を含む。このＣＤＲ３領域が配列ＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ ＮＰＦＱＳＳ ＦＤＹＷＧＱまたはその誘導体および／またはその機能的類似物を含む。別の好ましい態様では、前記蛋白質性分子はＣＤＲ３領域を有する軽鎖を含み、このＣＤＲ３領域が配列ＥＤＦＡＴＹＹＣ ＳＱＦＳＴＭＰＧＧＦＧＱＧＴＫ ＶＥＩＫまたはその誘導体および／またはその機能的類似物を含む。上記重鎖または軽鎖の誘導体および／または機能的類似物は量においては必ずしも同じではないが、本質的に同じ重鎖または軽鎖活性を有する分子である。誘導体または機能的類似物は本発明の配列に比較して１つ以上のアミノ酸の置換物、挿入物、または欠損物を含み、本発明の配列に基づいて当業者によって容易に作ることができ、試験できる。前記重鎖または軽鎖活性は好ましくは両者のうち一方の抗原結合活性または組み合わせを含む。
【００１２】
一観点では、本発明は疾病を患うまたは疾病を患う危険を有する個体を治療する方法であって、本発明の蛋白質性分子を治療に有効な量で前記個体に投与することを含む方法を提供する。ある観点では、前記疾病が腫瘍性疾病である。類似の観点では、薬剤調製のために、本発明の蛋白質性分子を使用することを含む。別の態様では、本発明は、前記細胞が、本発明の蛋白質性分子に特異的に結合できるか否かを決定することを含む、細胞の分離法を提供する。同様に、本発明は、腫瘍性細胞のためのマーカーとしてフィブロネクチン発現細胞のサブセットに発現されるエピトープの使用法であって、前記エピトープが腫瘍特異的マトリ潜在的エピトープである使用法を提供する。別の観点で、本発明は、本発明の蛋白質性分子によって認識される細胞であって、前記細胞がフィブロネクチン上の少なくとも１つのマトリ潜在的エピトープを露出する細胞を提供する。これは、例えば、ファージディスプレイアプローチにおいて選択したファージを増幅することまたはハイブリドーマアプローチにおいて抗体コード化ＲＮＡの増幅を介して行うことができる。したがって、本発明は、本発明の蛋白質性結合分子をコード化する核酸または前記分子のフィブロネクチン結合に必要なその一部をさらに提供することができる。本発明の蛋白質性分子の生成のために、コード化核酸は１種以上の適当な発現ベクターにクローン化され、細胞に移される。したがって、本発明は本発明の核酸を含む細胞をも提供する。好ましくは、前記細胞は霊長類、ゲッ歯類、鳥類、または植物細胞である。このような細胞が結合分子の生成に特に適している。好ましくは、前記細胞はヒト細胞である。この場合、結合分子はヒト細胞により生成され、したがって、ヒトへの使用に適合した翻訳後修飾を含む。このような結合分子によりヒトの薬理特性が改善されることが観察された。別の好ましい態様では、前記細胞は、アデノウイルスの初期蛋白質、またはその機能的部分、誘導体および／または類似物をコード化する核酸を含み、アデノウイルスの前記初期蛋白質がＥ１またはＥ２Ａである。このような細胞は高収率で蛋白質を得るために典型的に非常に適しており、懸濁成長および血清フリーの適応等、典型的に改良された培養特性を示す。
【００１３】
この分野では結合分子は植物または非ヒト動物を使用して生成することもできる。そのため、本発明はこのような生成プラットフォームをも提供する。好ましい態様では、前記植物または非ヒト動物は本発明の核酸に対するトランスジェニックである。
【００１４】
別の観点において、本発明は、本発明の蛋白質性分子を含む遺伝子配送ビヒクルを提供する。このような遺伝子配送ビヒクルはフィブロネクチン蛋白質のサブセットを目標とする。このような遺伝子配送ビヒクルは疾病を患うまたは疾病を患う危険のある個体の治療法において使用でき、前記個体に本発明の遺伝子配送ビヒクルを治療的に受け入れ可能な量で投与することを含む。
前記疾病は好ましくは腫瘍性疾患である。本発明の遺伝子配送ビヒクルは薬剤調製のために好ましく使用される。
【００１５】
本発明の蛋白質性分子および／または遺伝子配送ビヒクルを含むキットをさらに提供する。
【実施例】
【００１６】
実施例１：ヒト微小血管内皮細胞（ＨＤＭＥＣ−１）におけるファージ選択
Ｔ７５フラスコ、Ｔ１７５フラスコおよび６ウェルプレートを１％のゼラチン／ＰＢＳ溶液を用いて一晩で底部をオーバーレイして被覆した。その後、フラスコを３回ＰＢＳで洗浄し、４℃のＰＢＳ１０ｍｌで貯蔵した。内皮細胞を疾病管理および予防センター（ＣＤＣ，アトランタ、ＵＳＡ。Ａｄｅｓ等、１９９２年）から得た。細胞を、ピルビン酸ナトリウム、１００ｍＭグルコースおよびピリドキシン（ギブコ）を入れ、健康なドナーから作った２０％ヒトプール血清（ＨＰＳ）、ペニシリンおよびストレプトマイシンで強化した、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）を入れた、ゼラチン被覆Ｔ７５フラスコで成長させた。さらに、細胞を３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターで培養した。 内皮細胞をゼラチン被覆Ｔ７５フラスコにおいてＤＭＥＭ＋２０％ＨＰＳ＋ペニシリン／ストレプトマイシン中で８０〜９０％の集密度に成長させ、続いて、単細胞懸濁液を作るために、トリプシンで処理し、ＰＢＳで洗浄し、２０〜３０％の集密度で６ウェルプレートにまいた。培養２日後正常な細胞は６５〜７０％の集密度に達し、続いてファージ選択手順に対して使用した。
【００１７】
選択手順に対して使用したｓｃＦｖ抗体ファージディスプレイライブラリーは、Ｄｅ Ｋｒｕｉｆ等（１９９５年）により記載された半合成ｓｃＦｖライブラリー由来の可変重鎖における合成ＣＤＲ３領域を有する半合成ｓｃＦｖライブラリーである。５００μｌのｓｃＦｖ抗体ファージライブラリーを、４％の非脂ミルク粉末（Ｐｒｏｔｉｆａｒ）、１％のゼラチン、２０％のＨＰＳおよび５×１０^８の末梢血細胞（ＰＢＬ）を含有した１．５ｍｌのＰＢＳで３０分４℃でインキュベートした。その後、内皮細胞を６回、４℃の３ｍｌのＰＢＳで洗浄し、４℃で４時間前記ライブラリー混合物を用いてインキュベートした。この培養およびファージ結合期間の後、細胞を４℃で、ＰＢＳ＋０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０で過度に（２０回）およびＰＢＳで２０回洗浄した。次いで、内皮細胞を、細胞スクレーパーを使用してハーベストし、１５００ｒｐｍで遠沈した。その後、細胞および細胞に結合したファージを１０ｍｌの新しいＸＬ１−青バクテリア培地（ストラタジーン）を用いてＯＤ_６０００．５でインキュベートし、ファージによるバクテリアの感染のために３７℃で３０分間放置した。バクテリアを３６００ｒｐｍのスピニングでハーベストし、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび１０μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含有する、ＴＹＥ皿（１０ｇ／ｌのバクトトリプトン、５ｇ／ｌの酵母エキス、１５ｇ／ｌのバクトアガー（ギブコ）および８ｇ／ｌのＮａＣｌ（Ｒｉｅｄｅｌ−ｄｅｈａｅｎ））にプレートした。バクテリアのコロニーをカウントし、プレートから掻き取り、Ｍａｒｋｓ等（１９９１年）に準拠したファージレスキューの次のラウンドのための接種材料として使用した。
【００１８】
実施例２：単離ファージの分析
モノクローナルファージをＭａｒｋｓ等（１９９１年）に準拠して単離し、単離したファージをヒト微小血管内皮細胞においてフローサイトメトリー分析を使用して結合について試験し、これを選択手順（ＨＤＭＥＣ−１）に対して使用した。このため、ＨＤＭＥＣ−１細胞を、１５分間４℃でＰＢＳ中ＥＤＴＡ５０ｍｌにおいて細胞をインキュベートすることによりフラスコから離した。その後、細胞を１００μｌのプレ−フロックドファージマキシプレップで３０分間４℃でインキュベートした（５０μｌファージプレップを１５分間４℃で５０μｌのＰＢＳ４％のミルク粉末（ｐｒｏｔｉｆａｒ）インキュベートした。）。その後、細胞を４回２００μｌのＰＢＳ１％ＢＳＡで洗浄し、ＰＢＳ１％ＢＳＡで１：５００に希釈したマウス抗Ｍ１３（Ａｍｅｒｓｈａｍ）で３０分間４℃にてインキュベートした。４回洗浄した後、細胞をヤギ抗マウスＰＥ１：５００（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ， Ｉｎｃ）で３０分間４℃にてインキュベートした。ＰＢＳ１％ＢＳＡで４回洗浄した後、細胞を、選択細胞に対して使用したＨＤＭＥＣ細胞へのファージのポジティブな結合についてＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒで分析した。
【００１９】
図１は単離ファージを用いてインキュベートしたＨＤＭＥＣ−１細胞の特異的ＦＡＣＳ染色を示す。単離され、かつＨＤＭＥＣ−１細胞を特異的に認識するｓｃＦｖを運ぶシングルファージをＦｉｂＭａｂと呼んだ。ＨＤＭＥＣ−１細胞に結合するためのＦｉｂＭａｂとして同じスクリーンで確認したので、Ｐ９ ｓｃＦｖはポジティブコントロールとして機能し、Ｔｈｙｒｏ ｓｃＦｖ（以下参照）はネガティブコントロールとして機能した。
【００２０】
実施例３：種々の細胞株の大きいパネルを使用したＦｉｂＭａｂの分析
上記と同じ染色プロトコルを使用してＦｉｂＭａｂを細胞株および末梢血白血球の大きいパネルで分析した。ポジティブスコア（＋として表示）を、ネガティブファージ染色より高い染色強度により決定した。結果を表１に示す。
【００２１】
【表１】

表１に記載の結果は、ＦｉｂＭａｂが３つの細胞株に存在するエピトープを認識することを示す：つまり、先に使用したＨＤＭＥＣ−１、プラズマ細胞株ＲＰＭＩ８２２６およびプラズマ細胞株ＤＯＸ４０であり、ＤＯＸ４０はＨＤＭＥＣ−１およびＲＰＭＩ８２２６に比べて僅かに染色強度が低い。ＤＯＸ４０は細胞株ＲＰＭＩ８２２６のドキソルビシン耐性変異体である。
図２は、プラズマ細胞株ＲＰＭＩ８２２６におけるＦｉｂＭａｂのＦＡＣＳ分析を示す。
図３、４および５は短い説明で示ように試験した末梢血白血球（ＰＢＬ）の種々の成分におけるＦｉｂＭａｂのＦＡＣＳ分析を示す。Ｔｈｙｒｏ（Ｔｇ）およびＰ９ ｓｃＦｖはネガティブおよびポジティブコントロールとしてそれぞれ機能した（上記参照）。
【００２２】
実施例４：ＦｉｂＭａｂに存在する重鎖および軽鎖可変領域配列の決定
可変重鎖領域（Ｖｈ）および可変軽鎖領域（Ｖｌ）をＡＢＩ３７３ Ｘｌシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を製造業者による指示にしたがって使用して決定した。このために、８μｌのビッグダイターミネーター混合物、３．２ｐｍｏｌのプライマー（１μｌ中で希釈）、５μｌのプラスミドミニプレップ（Ｑｉａｇｅｎ）および６μｌのＢｉｄｅｓｔを混合し、サーモサイクラー（Ｒｏｃｉｄｉｌｅ ＩＩＩ，Ａｐｌｏｇｅｎ）でインキュベートした。使用したＰＣＲプログラムは：９６℃１分の後、２５回の３工程：１）９６℃１０秒、２）５０℃５秒および６０℃４分である。その後、反応物を４℃に冷却し、ＡＢＩ３７３ＸＬシステムで分析した。ヌクレオチド配列から、重（Ｖｈ）および軽（Ｖｌ）鎖のアミノ酸配列および合成高頻度可変ＣＤＲ３領域（抗体の結合ドメイン）を決定した。ビッグダイ（Ｂｉｇ Ｄｙｅ）ターミネイティングキット（ＰＥ）を当業者に周知の標準プロトコルに従って適用した。標準ＦＤｓｅｑおよびＭ１３配列プライマーを使用した。確認した配列を表２に示す。
表２：
ＦｉｂＭａｂに存在するｓｃＦｖのアミノ酸配列および分類。ＶｈおよびＶｌに対するサブクラス名を示す。
重鎖
Ｖｈ ＦｉｂＭａｂ： Ｖｈ３ １−３ ＤＰ３０．７
ＣＤＲ３領域： ＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ ＮＰＦＱＳＳ ＦＤＹＷＧＱ
軽鎖
Ｖｌ ＦｉｂＭａｂ： Ｖｋｌ
ＣＤＲ３領域： ＥＤＦＡＴＹＹＣ ＳＱＦＳＴＭＰＧＧＦＧＱＧＴＫ ＶＥＩＫ
【００２３】
実施例５：ヒト健康組織およびグラウィッツ腫瘍細胞におけるファージＦｉｂＭａｂからのｓｃＦｖの免疫組織化学分析
【００２４】
ｓｃＦｖプレップの調製のために、ｓｃＦｖをコード化するＤＮＡを、検出および生成のために、ＦｉｂＭａｂのｐＰＶＴプラスミドをＮｃｏＩおよびＮｏｔＩで消化してＦｉｂＭａｂのｓｃＦｖのＶｈおよびＶｌを切り取り、このインサートをヒスチジン−タグとＭｙｃ−タグを含むｐＰＶＴ構築物に結合することによりＨｉｓ−Ｍｙｃ構築物にクローン化し、その結果構築物ＦｉｂＭａｂ−Ｈｉｓ／Ｍｙｃを得た。このプラスミドを寄託番号０２０１１５１８の下で２００２年１月１５日にＥＣＡＣＣに寄託した。
【００２５】
ｓｃＦｖ（ＴＥＳ）プレップを、浸透圧衝撃を利用して調製し、Ｍａｒｋｓ等（１９９１年）によるバクテリアＥ．ｃｏｌｉＳＦ１１０ｆ’の細胞膜周辺腔からｓｃＦｖを抽出した。抽出後、ｓｃＦｖプレップ（ＴＥＳプレップ）を、４℃で、５リットルのＰＢＳに対して４時間、３回透析した。ヒトグラウィッツ腫瘍および同じ腎臓の健康な部分の凍結切片をＳｉｌａｎ（シグマ）被覆ガラススライドに載せ、室温で一晩乾燥した。この凍結切片をＰＢＳ中で再び水分を与え、２０分間ＰＢＳ４％ＢＳＡ（ＩＣＮ）でブロックした。その後、断片を未希釈ｓｃＦｖプレップでインキュベートした。これは上記のようにして、あるいは内皮細胞染色に対するポジティブコントロールとしてＰＢＳ＋１％ＢＳＡ中で４５分間ＣＤ３１に対抗するＥＮ４モノクローナル抗体（Ｍｏｎｏｓａｎ）（希釈１：２００）におけるように調製した。その後、断片を、ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０中で５分、３回洗浄し、３０分間、抗Ｍｙｃエピトープ抗体（ベーリンガーマンハイム）またはラビット抗−マウス抗血清（ＲＡＭＰＯ，ＤＡＫＯ，ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ中で１：２５０に希釈）を含有する９Ｅ１０細胞株からの培養培地でインサートした。ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄した後、ｓｃＦｖ染色物をＲＡＭＰＯを用いてインキュベートし、ＥＮ４断片をブタ抗−ラビット抗血清（ＳＷＡＲＰＯ，ＤＡＫＯ，ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ中１：２５０希釈）を用いてインキュベートした。次に、ＥＮ４染色を有する断片をＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で５分を３回およびＰＢＳで５分を３回洗浄した。ｓｃＦｖ染色を有する断片をＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で５分を３回洗浄し、ＳＷＡＲＰＯで３０分インキュベートした。このＳＷＡＲＰＯ培養の後、断片を再び、ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で５分を３回およびＰＢＳで３回洗浄した。これらの手順の後、染色をＰＢＳ（シグマ）に溶解したＤＡＢタブレットを使用して行い、全断片をヘマトキシリン（メルク）を使用して３０秒間対比染色し、光学顕微鏡を使用して分析した。
【００２６】
包含される健康な腎臓組織およびグラウィッツ腫瘍細胞について記載したものと同じプロトコルを使用して分析した他の腫瘍組織としては、乳癌、前立腺癌、結腸癌、肺癌、メラノーマ細胞、膵臓癌、膀胱癌、頭頸部癌細胞がある。さらに、同じ組織からの健康な細胞をもＦｉｂＭａｂ反応性を試験した（ただし、健康な肺組織を除く）。健康な組織はＦｉｂＭａｂの染色を示さなかった。図６ＡおよびＢは種々のヒト腫瘍組織および健康な組織におけるｓｃＦｖＦｉｂＭａｂまたは抗ＣＤ３１ｓｃＦｖ（ＥＮ４）いずれかの免疫組織化学染色を示す。
＃１−５ＦｉｂＭａｂを有する肺癌（ポジティブ領域）
＃６ＦｉｂＭａｂを有する肺癌（ネガティブ領域）
＃７−９ＦｉｂＭａｂを有する乳癌
＃１０−１１ＦｉｂＭａｂを有するメラノーマ（ポジティブ領域）
＃１２ＦｉｂＭａｂを有するメラノーマ（ネガティブ領域）
＃１３−１５ＦｉｂＭａｂを有するグラウィッツ腎臓腫瘍
＃１６ＦｉｂＭａｂを有する健康な腎臓組織
＃１７ＦｉｂＭａｂを有する移植腎臓
＃１８抗−ＣＤ３１を有する移植腎臓
＃１９ＦｉｂＭａｂを有する健康な膵臓
＃２０ＦｉｂＭａｂを有する膵臓腫瘍
＃２１ＦｉｂＭａｂを有する膀胱腫瘍
＃２２−２４ＦｉｂＭａｂを有する頭頸部腫瘍
＃２５ＦｉｂＭａｂを有する健康な結腸
＃２６ＦｉｂＭａｂを有する結腸癌
＃２７ＦｉｂＭａｂを有する前立腺腫瘍
＃２８ＦｉｂＭａｂを有する健康な前立腺
【００２７】
図６の写真１〜５において、肺癌はｓｃＦｖＦｉｂＭａｂで染色される。腫瘍組織におけるポジティブ（ＦｉｂＭａｂにより染色された）およびネガティブ（ＦｉｂＭａｂにより染色されない）領域が別々に存在することが明確に示されている。写真２は腫瘍における明確なストローマの染色を示し、内皮細胞または血管／毛細血管は観察できない。写真３はＦｉｂＭａｂに対するネガティブで腫瘍ストローマの大きい領域を示し、ＦｉｂＭａｂのみが肺癌組織における腫瘍ストローマの部分を認識することを示す。写真４および５は大きい倍率でポジティブ領域を示す。写真７および８は乳癌におけるポジティブ染色を示し、ここにおいて血管または毛細血管構造を認めることができるが、ストローマ染色も存在する。写真９は腫瘍組織のネガティブ領域を示し、腫瘍の一部のみがｓｃＦｖＦｉｂＭａｂにより認識されることを再び示す。写真番号１０、１１および１２において、メラノーマ腫瘍はｓｃＦｖＦｉｂＭａｂで染色され、写真１２はｓｃＦｖＦｉｂＭａｂにより認識されない腫瘍の比較的「正常および健康な」部分を示す。再び明確なストローマ染色がこのメラノーマ組織において観察可能である。写真１３、１４および１５は種々の倍率におけるグラウィッツ（腎臓）腫瘍におけるｓｃＦｖＦｉｂＭａｂを有する染色を示す。この組織において血管または毛細血管は明確にみることができる。腫瘍は高度に血管新生化する。写真１６および１７は移植腎臓におけるＦｉｂＭａｂを有する染色であり、これは健康な腎臓として見なされる。健康な腎臓組織では染色が見られない。写真１８は移植腎臓におけるモノクローナル抗体ＥＮ４（ＣＤ３１を認識）を有するポジティブ内皮染色を示し、管状領域における血管および腎臓の糸球体における毛細血管のポジティブ染色が明確に目視できる。写真１９はｓｃＦｖＦｉｂＭａｂで染色された健康な膵臓を示し、染色は観察されず、写真２０の膵臓腫瘍はｓｃＦｖＦｉｂＭａｂを有する明確なストローマ染色を示す。写真２１は膀胱腫瘍におけるポジティブ染色を示し、ここでは毛細血管または血管構造が観察される。写真２２および２４はｓｃＦｖＦｉｂＭａｂを有する頭頸部腫瘍における明確なポジティブ染色を示し、写真２２はｓｃＦｖＦｉｂＭａｂと反応しない同じ組織の比較的健康な部分を示す。ｓｃＦｖＦｉｂＭａｂを有する染色は健康な結腸では見られない（写真２５）が、結腸癌はこの組織の腫瘍ストローマにおけるｓｃＦｖＦｉｂＭａｂと強く反応する。写真２７は膵臓腫瘍におけるｓｃＦｖＦｉｂＭａｂを有する染色のようなポジティブストローマおよび血管を示し、健康な組織コントロールはｓｃＦｖＦｉｂＭａｂ結合に対してネガティブである。
【００２８】
結論として、ｓｃＦｖＦｉｂＭａｂはこれまで試験した全腫瘍組織と反応するが、健康な組織コントロールには反応性をしめさない。ｓｃＦｖＦｉｂＭａｂはこれらの全腫瘍におけるいずれのストロマ因子も認識し、ポジティブ染色は、これらの腫瘍に部分的に脈管構造を見いだすことができる。
【００２９】
実施例６：認識した抗原を分析するための、免疫沈降実験におけるＦｉｂＭａｂの使用
Ｈｉｓ−Ｍｙｃ構築物からのｓｃＦｖＴＥＳプレップ（上記のように調製）を免疫沈降のために使用した。免疫沈降はプラズマ細胞株ＲＰＭＩ８２２６について実施され、これはＦＡＣＳ分析におけるＦｉｂＭａｂに対してポジティブに染色された。細胞を、ＲＰＭＩ１６４０培地＋２５ｍＭヘペス、Ｌ−グルタミンおよび５％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ）中で培養した。ＲＰＭＩ８２２６は半粘着性プラズマ細胞株であり、細胞は緩く振ることで容易にプレートから外れる。Ｂ細胞は扁桃腺患者材料から得られ、ファンデアウルストでウィリエス（Ｖａｎ ｄｅｒ Ｖｕｕｒｓｔ ｄｅ Ｖｒｉｅｓ）等（１９９９ａ）に従って調製し、ＦｉｂＭａｂに対するこれらの実験におけるネガティブコントロール細胞株として機能した。使用したｓｃＦｖはＲＰＭＩ８２２６細胞上のＦｉｂＭａｂおよびＰ９（異なる発現パターンを有する内皮細胞を認識するｓｃＦｖは同じ選択手順にしたがって単離された）であり、ＩＩＩ−１（２回）およびＩ−１（Ｂ細胞特異的ｓｃＦｖ，ファンデアウルストでウィリエス１９９９ｂ）は扁桃腺Ｂ細胞（ファンデアウルストでウィリエス、１９９９ｂ）における免疫沈降手順に対するポジティブコントロールとして使用した。ＴｇおよびＤＮＡはＤｅ Ｋｒｕｉｆ等（１９９５年）にしたがってペプチドに対して選択したｓｃＦｖであり、ＲＰＭＩ８２２６細胞におけるネガティブコントロールとしておよびプレクリアリングｓｃＦｖとしてそれぞれ機能する。ＩＩＩ−１を、沈降した蛋白質に対するネガティブコントロールとして機能するＲＰＭＩ８２２６細胞において使用した。プレクリアリングｓｃＦｖを上記のようにＰＢＳに対して透析した。全ｓｃＦｖを、セファロースビーズをキレート化するために結合した（アマシャム）。
【００３０】
セファロースビーズの調製
セファロースビーズを調製してｓｃＦｖに以下のようにして結合した。５００μｌのセファロースビーズを１ｍｌのＢｉｄｅｓｔ水で２回、次に１ｍｌの５０ｍＭＥＤＴＡで２回、２ｍｌの１００ｍＭＣｏＣｌ_２で１回、２ｍｌのＢｉｄｅｓｔ水で１回、および１ｍｌのＰＢＳで２回洗浄した。その後、ビーズを１０ｍｌのｓｃＦｖプレップで、ロッキングプラットフォームで３０分間振動することによりインキュベートし、その後、４ｍｌのＰＢＳで２回洗浄した。これらのｓｃＦｖ結合ビーズを室温で２時間振動下でＰＢＳ＋０．０３％のＨ_２Ｏ_２でインキュベートし、続いて、２ｍｌのＰＢＳで２回洗浄した。その後、ビーズ２ｍｌのＰＢＳ＋５０ｍＭのＥＤＴＡで１回洗浄し、２ｍｌのＰＢＳで２回洗浄した。その後、ビーズを２ｍｌのＰＢＳ＋０．５Ｍのイミダゾールで洗浄し、再び２ｍｌのＰＢＳで２回洗浄し、４℃で使用時まで貯蔵した。これは典型的には２４時間である。
【００３１】
細胞の調製
ＨＤＭＥＣ−１細胞を上記のようにして成長させた。各別の免疫沈降の対して、２×１０^６Ｂ細胞を使用して全工程を４℃で実施した。細胞を３回２０ｍｌのＰＢＳで３回洗浄し、次に１ｍｌのＰＢＳで再懸濁した。１０μｌの正常なヒト血清（ＮＨＳ）スルホ−ビオチン（ｓｕｌｐｈｏ−ｂｉｏｔｉｎ）（ＤＭＳＯ中２００ｍｇ／ｍｌ）を細胞に添加し、時々ゆるやかに攪拌して３０分間インキュベートした。その後、１０μｌのＰＢＳ中１Ｍ、ＮＨ_４Ｃｌを細胞に添加して２ｍｌの１０ｍＭ，ＮＨ_４Ｃｌで２回洗浄した。細胞を再びＰＢＳで２回洗浄し、その後、１ｍｌのリシスバッファー（１％トリトン×１００）＋プロテアーゼ阻害剤（ベーリンガーマンハイム社製カクテルタブレット）で溶解した。
【００３２】
免疫沈降
細胞ライセートを１４，０００ｒｐｍで１分間回転し、ｓｃＦｖＤＮＰに結合した１００μｌビーズを用いて４℃で１時間３回プレクリアした。これらのプレクリアしたライセートを異なる免疫沈降に対して分割し、一晩振動下で４℃でそれぞれ４０μｌのビーズと共にインキュベートした。その後、ビーズを１０回１０分間リセスを用いて洗浄し、１０回１０分ＰＢＳで洗浄した。ビーズを４０μｌＰＢＳで再懸濁し、４μｌの１０×Ｌａｅｍｍｌｉサンプルバッファーを添加した。サンプルを１分間ボイルし、７％−ＳＤＳ／ＰＡＧＥゲルを使用して分離した。その後、分離した蛋白質をＰＶＤＦ膜（ベーリンガーマンハイム）にブロットし２％のゼラチン中で一晩ブロックした。その後、この膜を３０分間ストレプトアビジンＨＲＰ（アマシャム）でインキュベートし、１０回、５分間ＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄し、３回、５分間ＰＢＳで洗浄した。ブロットの展開のために、化学（ｃｈｅｍｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）ブロッティング基体（ベーリンガーマンハイム）を製造者の指示にしたがって使用し、ハイパーフィルム（ハイパーフィルムエムピー）を生産された信号を検出するために使用した。図７は扁桃腺Ｂ細胞およびプラズマ細胞株ＲＰＭＩ８２２６における種々のｓｃＦｖのＳＤＳ／Ｐａｇｅ分離免疫沈降のブロットを示す。結合ビオチン化膜蛋白質をストレプトアビジンＨＲＰをスーパーシグナル（Ｐｉｅｒｃｅ）と組み合わせて使用して可視化した。その結果はｓｃＦｖのＩＩＩ−１およびＩ−１に対する扁桃腺Ｂ細胞について予想どおりポジティブシグナルを示す。ｓｃＦｖＦｉｂＭａｂは高分子量の特異的バンドを示し、Ｐ９は使用した条件下では蛋白質を沈降しない。コントロールＩ−１およびＴｇは扁桃腺Ｂ細胞およびＲＰＭＩ８２２６細胞についてそれぞれネガティブであった。
【００３３】
蛋白質配列
ＦｉｂＭａｂによって認識される、充分な量の抗原を得るために、全体量を１０倍にスケールアップし、特異的ＦｉｂＭａｂＩＰバンドをＳＤＳ／ＰＡＧＥゲルから切り取り、氷上で貯蔵した。認識された抗原内の幾つかのアミノ酸配列を決定したＴＯＰＬＡＢ（ドイツ、ハンブルグ）に送った。配列した３つのペプチドストレッチをフィブロネクチンのフラグメントであることを確認した。これらの同定ペプチドは以下のとおりである。
１）ＡＦＴＤＶＤＶＤ
２）ＩＰＧＨＬＮＳＹＴＩＫ
３）ＳＳＰＶＴＧＹＲＶＴ
ＮＣＢＩデータベースを使用した分析の後、全ペプチドタグは、未スプライスフィブロネクチンであるフィブロネクチン前躯体との相同性を示すことがわかった。ペプチドタグ１）はＥＤ−Ａフィブロネクチンスプライス変異体と相同性を示した。
【００３４】
実施例７：ＦｉｂＭａｂｓｃＦｖから完全なヒトＩｇＧ１モノクローナル抗体を得るためのクローニング手順
完全なヒトＩｇＧ１モノクローナル抗体のクローニングへの手順はＢｏｅｌ等（２０００年）に記載されている。
プライマー
１．ＨＡＶＴ＋ＨｉｎｄＩＩＩ：５’−ＡＡＧ ＣＴＴ ＣＣＣ ＡＴＡ ＡＧＧ ＡＡＴ ＴＣＧ ＧＡＴ ＣＣＣ ＡＣＧ ＡＴＧ ＧＣＡ ＴＧＣ ＣＣＴ ＧＧ−３’
２．Ｍ１３：５’−ＧＴ ＡＡＡ ＡＣＧ ＡＣＧ ＧＣＣ ＡＧＴ−３’
３．Ｖκｌａ：５’−ＴＧＴ ＧＡＣ ＡＴＣ ＧＡＧ ＣＴＣ ＡＣＣ ＣＡＧ ＴＣＴ ＣＣＡ ＴＣＣ−３’
４．Ｊκｐａｎ：５’−ＴＴＣ ＴＣＧ ＡＣＴ ＴＧＣ ＧＧＣ ＣＧＣ ＡＡＡ ＧＴＧ ＣＡＣ ＴＴＡ ＣＧＴ ＴＴＧ ＡＴＧ ＴＣＣ ＡＣＣ ＴＴＧ ＧＴＣ ＣＣ−３’
【００３５】
Ｖｈフラグメントのクローニング
Ｖｈフラグメントを、ｓｃＦｖＦｉｂＭａｂをコード化する遺伝子を含んでいるｐＰＶＴベクターから、ＮｃｏＩおよびＸｈｏＩ制限酵素を用いて切り取り、ゲルで精製し、ｐＬｅａｄｅｒに結合した。これはＮｃｏＩおよびＳａｌＩで消化されゲルで精製されたドナースプライスおよびコザック（Ｋｏｚａｋ）配列を含むベクターである。これにより、ｐＬｅａｄｅｒＶｈＦｉｂＭａｂというプラスミドを得た。続いて、クローン化インサートをＰＣＲで増幅した。すなわち、９６℃で５分間、その後、１）９６℃で３０秒、２）５８℃で３０秒、３）７２℃で１分、を２８回、最後に７２℃で７分。その後、反応生成物を４℃に冷却した。ＰＣＲに対して使用されたプライマーはＭ１３であり、５’−末端のＨｉｎｄＩＩＩの導入に対して“ＨＡＶＴ＋ＨｉｎｄＩＩＩ”であった。さらに、ＨＡＶＴ２０リーダー配列を、翻訳開始配列を５’−ＣＣＡＣＧＡＴＧＧ−３’に変えることにより僅かに変化させた。ｐｃＤＮＡ３．１ＺＥＯ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を多重クローニング部位（ｐｃＤＮＡ３．１δＮｏｔＩＺＥＯ）においてＮｏｔＩを除去することにより変異させた。その理由はＮｏｔＩはさらに下流のクローニングを妨害する可能性があるからである。この変異はｐｃＤＮＡＺＥＯをＮｏｔＩで消化し、その後、クレノー酵素およびフリーヌクレオチドを使用して粘着端部において充填することにより導入された。別のｓｃＦｖのＶｈ（ヒトＥｐ−Ｃａｍに対するＵＢＳ−５４）を有するヒトＩｇＧ（Ｃγ１）フラグメントの構築物重領域をＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＶ制限部位を使用して挿入した。その後、ＶｈＦｉｂＭａｂのＰＣＲ生成物をＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｏｔＩを用いてｐｃＤＮＡ３．１ＺＥＯδＮｏｔＩ＋Ｃγ１にスワップした。図８ＢはＶｈについて説明したクローニング手順の模式図を示す。ｐｃＤＮＡ＋ＶｈＦｉｂＭａｂＣｇ１で表される、得られたプラスミドを受入番号０２０１１５１９下で２００２年１月１５日にＥＣＡＣＣに寄託した。
【００３６】
Ｖｌフラグメントのクローニング
Ｖｌフラグメントを、プライマー“Ｖκｌａ”および“Ｊκｐａｎ”を用いてｐＰＶＴベクターからＶｈフラグメントのクローニングにいて説明したのと同じＰＣＲプロトコルを使用してＰＣＲにより増幅した。この段階において、ＮｏｔＩ部位を除去して、ドナースプライス部位から３’部位に再導入し、プライマーＪκｐａｎにより導入された。ＰＣＲ生成物をＳａｃＩおよびＮｏｔＩで消化し、コザック配列およびＳａｃＩおよびＮｏｔＩを用いたドナースプライス部位を含むベクターであるｐＬｅａｄｅｒベクターにクローン化し、ｐＬｅａｄｅｒＶｌＦｉｂＭａｂを得た。このフラグメントを再び、５’−末端におけるＨｉｎｄＩＩＩ部位導入のＶｈクローニングにおけると同じ提案のためにプライマー“ＨＡＶＴ＋ＨｉｎｄＩＩＩ”および“Ｍ１３”で増幅した。さらに、ＨＡＶＴ２０リーダー配列を、翻訳開始配列を５’−ＣＣＡＣＧＡＴＧＧ−３’に変えることにより僅かに変えた。ＩｇＧ１（Ｃκ）の軽鎖の定常領域を有する、異なるｓｃＦｖ（ＵＢＳ−５４）のＶｌをＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩを使用してｐｃＤＮＡ３．１δＮｏｔＩＺＥＯにクローン化した。その後、ＦｉｂＭａｂのＶｌをＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｏｔＩを使用してスワップした。図８ＡはＶｌに対して説明したクローニング手順の模式的表示を示す。ｐｃＤＮＡ＋ＶｌＦｉｂＭａｂ Ｃｋとして表す、得られたプラスミドを受入番号０２０１１５２０の下で２００２年１月１５日にＥＣＡＣＣに寄託した。ヒトＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１，ＩｇＡ２，ＩｇＭ、およびＩｇＥを作ることができるベクターにｓｃＦｖＦｉｂＭａｂをクローニングする場合に同じ手順を続けた。これらの種々の抗体および潜在的なフュージョン蛋白質をｉｎ ｖｉｖｏ，ｅｘ−ｖｉｂｏ，ｉｎ ｖｉｔｒｏで腫瘍モデルに使用し、診断し、および／または脈管形成、マトリックス形成、および腫瘍の減少または除去を、ブロックしまたは阻害するために、その能力を試験した。
【００３７】
実施例８：ＦｉｂＭａｂエピトープの特徴
プラスチックに直接塗布されたフィブロネクチンへのＦｉｂＭａｂの結合
フィブロネクチンへのＦｉｂＭａｂ結合を確認するために、精製したプラズマフィブロネクチンをマキシソーププレートに１００μｇ／ｍｌの濃度で１時間１／３の連続希釈で直接塗布した。最後のレーンを連続希釈から外してＰＢＳでインキュベートした。その後、プレートをＰＢＳ＋４％のＢＳＡで１時間、室温でブロックした。ｓｃＦｖプレップ（未希釈）またはモノクローナル抗体（ＦＮ３０−８、１：１０００）を、フィブロネクチンを有する前記プレートに室温で１時間添加した。その後、プレートを６回、ＰＢＳ ０、１％ｔｗｅｅｎ２０で洗浄し、ｓｃＦｖウェルを９Ｅ１０ｓｕｂでインキュベートした。モノクローナル抗体染色をＰＢＳ１％ＢＳＡでインキュベートした。このプレートを再びＰＢＳ ０、１％ｔｗｅｅｎ２０で洗浄した。ｓｃＦｖおよびモノクローナル抗体の検出のために、ラビット抗マウスＨＲＰ（ＲＡＭＰＯ １：１０００、ＤＡＫＯ）を使用した。ＨＲＰに対して使用した基体はＡＢＴＳ（ベーリンガーマンハイム）であった。得られた吸光度は４０５ｎｍであった。結果を図９に示す。プラスチック被覆フィブロネクチンへのＦｉｂＭａｂの非常に弱い結合のみ、このアッセイで使用したポジティブコントロール（ＦＮ３０−８）に比較して検出された。
【００３８】
精製したフィブロネクチンのゼラチン／コラーゲン結合
配列データは、ＦｉｂＭａｂに対するリガンドがフィブロネクチンであることを示した。しかし、上記ＥＬＩＳＡにおいて、我々はＥＬＩＳＡにおいてプラスチック被覆精製プラズマ誘導フィブロネクチンへのＦｉｂＭａｂの強い結合を示すことができなかった。ＦｉｂＭａｂが細胞株ＨＤＭＥＣで生成したことは、我々がフィブロネクチンの細胞結合形態を処理していることを示唆した。この形態は、コラーゲンおよびプロテオグリカン等の他のマトリックス成分との相互作用により不溶性ネットワークを形成する、細胞外マトリックスに存在し、これにより、細胞移動および組織一体性の保持を助ける（ＭａｇｎｕｓｓｏｎおよびＭｏｓｈｅｒによる検討、１９９８年）。マトリックス関連フィブロネクチンを模倣するために、フィブロネクチンをプレコートコラーゲンおよびウシゼラチン（細胞培養等級）に結合することを介して固定化した。ゼラチンはコラーゲンの分解形態であり、コラーゲンの異なる形態に対する代替物として通常使用される。さらに、この抗体を生成するために使用された細胞株ＨＤＭＥＣをゼラチン上で培養した。
マキシソーププレートを１００μｇ／ｍｌゼラチン（メルク）または１００μｇ／ｍｌコラーゲン（細胞培養のために精製されたコラーゲン）で、ＰＢＳ中で２時間室温で被覆した（１００μｌ／ウェル）。プレートをＰＢＳ＋４％ＢＳＡで１時間ブロックした。フィブロネクチンを開始濃度７５μｇ／ｍｌで連続希釈にて前記プレートに添加し、室温で１時間ウェル中でインキュベートした。最後のウェルは連続希釈でインキュベートせず、フィブロネクチンを含まなかった。インキュベートした後、各レーンをｓｃＦｖプレップまたはフィブロネクチンに対するモノクローナル抗体と共にインキュベートした。このプレートを６回、ＰＢＳ ０、１％ｔｗｅｅｎ２０で洗浄し、ｓｃＦｖレーンを９Ｅ１０ｓｕｐ（抗Ｍｙｃモノクローナル抗体含有、ベーリンガーマンハイム）で４５分間室温でインキュベートした。モノクローナル抗体を有するレーンをＰＢＳ＋１％ＢＳＡでインキュベートした。その後、このプレートを再びＰＢＳ＋０、１％ｔｗｅｅｎ２０で洗浄し、全ウェルをラビット抗マウスＨＲＰで４５分間室温でインキュベートした。モノクローナル抗体ＦＮ９−１をポジティブコントロールとして使用し、異なるＥＬＩＳＡに存在するフィブロネクチンの量における相違がなかったことを示す。結果を図１０に示す。
図１０は、全ての場合（フィブロネクチン直接被覆またはゼラチンまたはコラーゲンを介した結合）に、等しい量のフィブロネクチンをウェルに固定化した。図１０Ｂは、ＦｉｂＭａｂは殆ど直接被覆フィブロネクチンを認識しないが、ゼラチン結合フィブロネクチンはＦｉｂＭａｂエピトープ発現または露出の強い増加／誘導を示したことを示している。プレコートコラーゲンへのフィブロネクチンの結合がほんの僅かＦｉｂＭａｂエピトープの発現を誘導した。このような滴定実験を使用して、フィブロネクチンへのＦｉｂＭａｂの結合がゼラチンとの相互作用により増強される因子を決定する。本実施例では、前記因子は、プラスチックに直接結合したフィブロネクチンをゼラチンを介して結合したフィブロネクチンと比較した場合に２０より高い。
【００３９】
図１０Ｂは、精製したプラズマ誘導フィブロネクチンによる結合がＦｉｂＭａｂエピトープ発現を誘導することを示した。プラスチック結合を原因とするフィブロネクチンの潜在的な人工的な立体配座の変化を回避するために、サンドイッチＥＬＩＳＡを以下のように実施した。ポリクローナル抗フィブロネクチンを補足抗体（Ｃａｐｅｌ）として使用し、その後、精製プラズマフィブロネクチンを添加し、フィブロネクチンの結合をモノクローナル抗体（ＦＮ３０−８）、続いてＲＡＭＰＯおよびＰＯ−基体ＡＢＴＳを用いて，検出した。ゼラチン結合フィブロネクチンの認識を同時に測定した。図１１Ａは、最も自然な立体配座にフィブロネクチンを保つ、ポリクローナル抗体によるプラズマ誘導精製フィブロネクチンの固定化がＦｉｂＭａｂエピトープの発現を示さないことを示している。しかし、同じフィブロネクチンバッチを、ゼラチン結合を介して固定した場合、ＦｉｂＭａｂエピトープの非常に明白な発現が観察された。これらのデータは、ＦｉｂＭａｂエピトープ発現が、溶解性フィブロネクチンには存在せず、プラスチック結合およびコラーゲン結合フィブロネクチンにおいて僅かに誘導され、ゼラチン結合フィブロネクチンでは非常に明白であることを示す。
このフィブロネクチンエピトープの発現が精製手順に原因があるという可能性を排除するために、ヒト血清およびプラズマ（上記実験において使用したフィブロネクチン濃度と同じ濃度を得るために、１：３に希釈）を“ゼラチンサンドイッチ”ＥＬＩＳＡにおいてフィブロネクチン源として使用し、本質的に上記と同じ結果を得、ＦｉｂＭａｂエピトープ発現が、プラズマからフィブロネクチンを精製する間誘導されないことを示している。
【００４０】
ＦｉｂＭａｂエピトープの位置のマッピング
ＦｉｂＭａｂエピトープの位置を位置付けするために、我々は、フィブロネクチンのフラグメントを試験した（ディー．モーシャーによる供給された）。完全長のフィブロネクチンにおけるこのフラグメント（蛋白質分解開裂により得られた）の位置を図１２に示す。フラグメント（１０μｇ／ｍｌ）および完全長フィブロネクチンをプラスチックに直接被覆し、ＦｉｂＭａｂまたはコントロールｓｃＦｖ（Ｔｈｙｒｏ）の結合をＥＬＩＳＡに対して上記したと同じようにして測定した。固定化したフラグメントの全量をフィブロネクチンに対するポリクローナル抗体（Ｐｏａｂ）で定量した。抗体の結合を適当な第２抗体で検出した（ｓｃＦｖ抗−ｍｙｃモノクローナル抗体、続いてＲＡＭＰＯおよびポリクローナル抗体ＳＷＡＲＰＯ、共にＤＡＫＯから購入）。
その結果を図１３に示す。完全長フィブロネクチンのように、４０および７０ｋＤａフラグメントはＦｉｂＭａｂの中程度の結合を示すが、２７および１６０ｋＤａは全く結合を示さなかった。これらのデータはＦｉｂＭａｂエピトープを含有する最小フラグメントがゼラチン結合セグメントに位置することを示している。この結果を検証するために、より多量（５０μｇ／ｍｌ）の４０および７０ｋＤａフラグメントをプラスチックに三重のウェルで直接被覆し、ＦｉｂＭａｂｓｃＦｖまたはコントロールｓｃＦｖ（Ｔｈｙｒｏ）の濃度範囲の結合を上記のように試験した。ｓｃＦｖＦｉｂＭａｂの結合はコントロールｓｃＦｖＴｈｙｒｏに比較し、両方のフラグメントとも有意により高かった。これらのデータは、フィブロネクチンの４０ｋＤａフラグメントは、ゼラチン結合ドメインを有し、ＦｉｂＭａｂに対するエピトープを少なくとも部分的に含むことを確認した。
【００４１】
上記のデータが示すように、ＦｉｂＭａｂは、従来技術で既知のフィブロネクチンに結合する抗体に比較した新しい抗体として規定する特徴を有する。ゼラチンに結合したプラズマ誘導フィブロネクチンを認識するＦｉｂＭａｂは、ＦｉｂＭａｂがＥＤ−ＡまたはＥＤ−Ｂドメインと相互作用しないことを示す。なぜなら、これらのドメインはプラズマフィブロネクチンにおいて発現しないからである。これにより、ＦｉｂＭａｂが、Ｌ１９（ビルヒラー等、１９９９年）、ＢＣ１（Ｍｉｄｕｌｌａ等、２０００年）、ＴＳＴ４（ファンフリート等、２００１年）、ＩＳＴ−６（カチュマレク等、１９９４年），ＥＤ−Ｂに対する全部またはＥＤ−Ａ（スカルピーノ等、１９９９年）に対するＩＳＴ−９等の腫瘍特異的組織分布を示す、従来技術において知られている抗体より異なる抗体となる。ＦｉｂＭａｂはフィブロネクチンにおける立体配座エピトープを認識する。従来技術は、ＦＤＣ−６（米国特許第４，８９４，３２６号；米国特許第５，２４３，０２９号；マツウラ等、１９８５年；マツウラ等、１９８８年、マンデル等、１９９５年）という抗フィブロネクチン抗体を開示し、これは、立体配座エピトープを認識できるが、このエピトープはＦＮ（ＩＩＩＣＳ）のＣ−末端領域における癌関連ノボ（ｎｏｖｏ）グリコシル化部位であり、これにより、ＦＤＣ−６エピトープはＦｉｂＭａｂにより認識されるエピトープと異なる。従来技術で知られるＦｉｂＭａｂと同じ領域においてエピトープを認識する抗体のみがＬ８であり、ＦｉｂＭａｂと異なる。Ｌ８抗体の結合は、フィブロネクチンがゼラチン（Ｃｈｅｒｎｏｕｓｏｖ等、１９９１年）に結合した場合非常に減少し、その抗体とそのエピトープが同じではないことを示す。
【００４２】
［参考文献１−１］

［参考文献１−２］

［参考文献１−３］

【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】ＦｉｂＭａｂと共にインキュベートしたＨＤＭＥＣ−１細胞のＦＡＣＳ染色。ＴｈｙｒｏｓｃＦｖは実施例５におけると同じであり、Ｄｅ Ｋｒｕｉｆ等（１９９５年）により確認され、ネガティブコントロールとして機能した。Ｐ９はＦｉｂＭａｂｓｃＦｖと共に確認されたｓｃＦｖであり、染色に対してポジティブコントロールとして機能した。
【図２】ＲＰＭＩ８２２６細胞におけるＦｉｂＭａｂのＦＡＣＳ染色。
【図３】末梢血白血球（ＰＢＬ）におけるＦｉｂＭａｂのＦｉｂＭａｂ染色。Ｂ細胞を確認するために、マウス抗ＣＤ２０（ＣＬＢ、アムステルダム）を用いたダブル染色ＰＢＬによるＢ細胞の同定。
【図４】単球コンパートメントのＰＢＬにおけるＦｉｂＭａｂのＦＡＣＳ染色。
【図５】顆粒球コンパートメントのＰＢＬにおけるＦｉｂＭａｂのＦＡＣＳ染色。
【図６Ａ】異なるヒトの腫瘍組織および健康なヒトの組織におけるｓｃＦｖＦｉｂＭａｂの免疫組織化学染色（詳細は明細書参照）。
【図６Ｂ】異なるヒトの腫瘍組織および健康なヒトの組織におけるｓｃＦｖＦｉｂＭａｂの免疫組織化学染色（詳細は明細書参照）。
【図７】本明細書に記載のように、扁桃腺Ｂ細胞およびＲＰＭＩ８２２６細胞における、多くのコントロールｓｃＦｖおよびＦｉｂＭａｂｓｃＦｖにより免疫沈降された蛋白質。その蛋白質の分子量（ＭＷ）を右に示す。矢印は、ＦｉｂＭａｂｓｃＦｖにより特異的に免疫沈降された高分子量バンドを示す。
【図８Ａ】ＶｌＦｉｂＭａｂベクターのクローニングの模式図。
【図８Ｂ】ＶｈＦｉｂＭａｂベクターのクローニングの模式図。
【図９】フィブロネクチンにおける直接ＥＬＩＳＡ。
【図１０】ゼラチンまたはコラーゲンを介して結合したフィブロネクチンを用いたＥＬＩＳＡ。
【図１１】サンドイッチＥＬＩＳＡ。
【図１２】エピトープの位置を位置付けるために使用されるフィブロネクチンおよびそのフラグメント。
【図１３】フィブロネクチンフラグメントＦｉｂＭａｂエピトープのマッピング。
【図１４】ＦｉｂＭａｂ希釈物の、４０ｋＤａおよび７０ｋＤａフィブロネクチンフラグメントへの結合。

Claims (41)

1. フィブロネクチンと１以上のゼラチン、フラグメントコラーゲン、および変性コラーゲンとの間の相互作用の際にフィブロネクチンに結合可能な蛋白質性分子。
2. フィブロネクチンに結合可能な蛋白質性分子であって、前記結合がフィブロネクチンと１以上のゼラチン、フラグメントコラーゲン、および変性コラーゲンとの間の相互作用により増強される、フィブロネクチンに結合可能な蛋白質性分子。
3. 前記結合が少なくとも２つの因子により増強される、請求項２記載の蛋白質性分子。
4. 前記結合が少なくとも２０の因子により増強される、請求項３記載の蛋白質性分子。
5. 前記分子が、フィブロネクチンと１以上のゼラチン、フラグメントコラーゲン、および変性コラーゲンとの間の相互作用により誘導されるエピトープに結合する、請求項１から４のうちいずれか１項に記載の蛋白質性分子。
6. 前記エピトープが腫瘍特異性である、請求項５記載の蛋白質性分子。
7. 前記エピトープの誘導が脈管形成と同時である、請求項５記載の蛋白質性分子。
8. フィブロネクチンにおけるマトリ潜在的エピトープに結合可能な蛋白質性分子。
9. 前記マトリ潜在的エピトープがフィブロネクチンと１以上のゼラチン、フラグメントコラーゲン、または変性コラーゲンとの間の相互作用に際して誘導される、請求項８記載の蛋白質性分子。
10. 前記マトリ潜在的エピトープが腫瘍特異的である、請求項８または９に記載の蛋白質性分子。
11. 前記エピトープがフィブロネクチンのゼラチン結合ドメインのうち少なくとも一部である請求項５〜１０のうちいずれか１項に記載の蛋白質性分子。
12. 前記フィブロネクチンが細胞外マトリックスの一部である請求項１〜１１のうちいずれか１項に記載の蛋白質性分子。
13. 前記細胞外マトリックスが腫瘍細胞の近辺にある請求項１２記載の蛋白質性分子。
14. 腫瘍細胞に結合可能である請求項１〜１３のうちいずれか１項に記載の蛋白質性分子。
15. 前記腫瘍細胞が乳房細胞、前立腺細胞、結腸細胞、肺細胞、皮膚細胞、膵臓細胞、膀胱細胞、頭部細胞、または頸部細胞から由来している請求項１４記載の蛋白質性分子。
16. 微細血管におけるフィブロネクチンに結合可能である請求項１〜１５のうちいずれか１項に記載の蛋白質性分子。
17. 微小血管内皮細胞に結合可能である請求項１〜１６のうちいずれか１項に記載の蛋白質性分子。
18. 前記分子が抗体またはその機能的部分またはその誘導体である、請求項１〜１７のうちいずれか１項に記載の蛋白質性分子。
19. 前記分子が単鎖Ｆｖフラグメントである請求項１〜１８のうちいずれか１項に記載の蛋白質性分子。
20. 受入番号０２０１１５１８の下でＥＣＡＣＣにて寄託した、プラスミド表示Ｆｉｂｍａｂ−Ｈｉｓ／ｍｙｃからの発現により得られる、請求項１〜１９のうちいずれか１項に記載の蛋白質性分子。
21. 前記抗体がヒト的であるかまたはヒト化される、請求項１８または１９に記の蛋白質性分子。
22. さらに、タグを含む、請求項１〜２１のうちいずれか１項に記載の蛋白質性分子。
23. 前記タグが毒および／または放射性物質を含む、請求項２２記載の蛋白質性分子。
24. ＣＤＲ３領域を有する重鎖を含み、このＣＤＲ３領域が配列ＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ ＮＰＦＱＳＳ ＦＤＹＷＧＱまたはその誘導体および／またはその機能的類似物を含む、請求項１〜２３のうちいずれか１項に記載の蛋白質性分子。
25. ＣＤＲ３領域を有する軽鎖を含み、このＣＤＲ３領域が配列ＥＤＦＡＴＹＹＣ ＳＱＦＳＴＭＰＧＧＦＧＱＧＴＫ ＶＥＩＫまたはその誘導体および／またはその機能的類似物を含む、請求項１〜２４のうちいずれか１項に記載の蛋白質性分子。
26. 疾病を患うまたは疾病を患う危険を有する個体を治療する方法であって、請求項１〜２５のうちいずれか１項に記載の蛋白質性分子を治療に有効な量で前記個体に投与することを含む方法。
27. 前記疾病が腫瘍性疾病である、請求項２６記載の方法。
28. 薬剤調製のための、請求項１〜２５のうちいずれか１項に記載の蛋白質性分子の使用法。
29. 腫瘍性疾病の治療のための、請求項２８記載の使用法。
30. 前記細胞が、請求項１〜２５のうちいずれか１項に記載の蛋白質性分種に特異的に結合するか否かを決定することを含む、細胞の分離法。
31. 腫瘍性細胞のためのマーカーとしてフィブロネクチン発現細胞のサブセットに発現されるエピトープの使用法であって、前記エピトープが腫瘍特異的マトリ潜在的エピトープである、使用法。
32. 請求項１〜２５のうちいずれか１項に記載の蛋白質性分子、または前記分子のフィブロネクチン結合に必要なその分子の一部をコード化する核酸。
33. 請求項３２記載の核酸を含む細胞。
34. 前記細胞が霊長類、ゲッ歯類、鳥類、または植物細胞である請求項３３記載の細胞。
35. 前記細胞がヒト細胞である請求項３３または３４記載の細胞。
36. 前記細胞が、アデノウイルスの初期蛋白質、またはその機能的部分、誘導体および／または類似物をコード化する核酸を含み、アデノウイルスの前記初期蛋白質がＥ１またはＥ２Ａである、請求項３３〜３５のうちいずれか１項に記載の細胞。
37. 請求項３３〜３６のうちいずれか１項に記載の細胞を含む植物または非ヒト動物。
38. 請求項３２記載の核酸についてトランスジェニックした、請求項３７記載の植物または非ヒト動物。
39. 前記細胞がフィブロネクチンにおける少なくとも１つのマトリ潜在的エピトープを露出する、請求項１〜２５のうちいずれか１項に記載の蛋白質性分子により認識される細胞。
40. 脈管形成の検出、画像化、阻害のための、請求項１〜２５のうちいずれか１項に記載の蛋白質性分子の使用法。
41. 脈管形成の開始および／またはヒト患者における脈管形成に関連する物理的条件を検出するための請求項１〜２５のうちいずれか１項に記載の蛋白質性分子の使用法。

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