HUT69792A - Tie, a nocel endothelial cell receptor tyrosine kinase - Google Patents

Description

A találmány tárgyát génsebészeti eljárások, közelebbről, receptor tirozin kináz gének, még közelebbről a “tie” elnevezésű, új receptor tirozin kináz génjének rekombináns DNS vektorokba történő inszertálása, valamint ezen géneknek megfelelő fehérjék megfelelő mikroorganizmus törzsekben, illetőleg megfelelő eukarióta sejtekben történő termeltetése képezi. A találmány tárgyát képezik, még közelebbről, a “tie” elnevezésű, új receptor tirozin kináz, a tie-t kódoló nukleotid szekvenciák, valamint azok az eljárások, melyek segítségével tie-t kódoló DNS fragmentumokat és ezek fehérje termékeit állíthatjuk elő. A tie eredetű szekvenciákat tartalmazó DNS fragmentumok, valamint a találmány tárgyát képező polipeptidek alkalmasak lehetnek bizonyos olyan betegségek diagnosztizálására és kezelésére, melyek kialakulásában az endotélsejtek és a hozzájuk tartozó tie receptorok valamilyen szerepet játszanak. Ilyenek lehetnek például a kóros szövetképzödéssel járó megbetegedések, mint például érdaganatok keletkezése, kóros sebhegedés, trombo-embóliás megbetegedések, arterioszklerózis és a gyulladásos megbetegedések.

A differenciálódott sejtek és szövetek kifejlődéséért, fennmaradásáért és kijavításáért felelős celluláris folyamatokat nagyrészt olyan intracelluláris jelzések szabályozzák, melyeket a növekedési faktorok és a hozzájuk hasonló egyéb ligandumok, valamint ezek receptorai közvetítenek. A receptorok a megfelelő jelzésre érzékeny sejtek külső felszínén helyezkednek el, és növekedési faktor néven ismert peptideket és polipeptideket, valamint egyéb hormonszerű ligandumokat kötnek. Ezen kölcsönhatások következtében gyors biokémiai változások jönnek létre a megfelelő sejtekben, és a celluláris génexpresszióban is gyors és tartós átállítódás következik be. Vannak olyan, specifikus növekedési faktorokat kötő receptorok, melyek több különböző sejt felszínén is megtalálhatóak.

-3A jelzések plazmamembránon keresztüli továbbításának egyik legfontosabb módja a tirozin foszforiláció. Néhány jelenleg ismert tirozin kináz gén olyan transzmembrán receptorokat kódol, melyek polipeptid növekedési faktorokat és olyan hormonokat kötnek, mint például az epidermális növekedési faktor (EGF), az inzulin, az I-es típusú inzulinszerű növekedési faktor (IGF-I), a trombocita eredetű növekedési faktor (PDGFA és PDGF-B) és a fibroblaszt növekedési faktorok (FGF-ek). Heldin és mtsai., Cell Reguládon, 1: 555-566 (1990); Ullrich és mtsai., Cell, 61: 24354 (1990). Az endotélsejtek növekedési faktor receptorai különleges érdeklődésnek örvendenek, annak a lehetőségnek köszönhetően, hogy a különböző növekedési faktoroknak, mint például az FGF-eknek, szerepük lehet bizonyos jelentős fiziológiás és patológiás folyamatok lejátszódásában, mint például a véredényrendszer kialakulása, az érdaganatok keletkezése, az arterioszklerózis, valamint a gyulladásos megbetegedések. Folkman és mtsai., Science, 235: 442-447 (1987). Bizonyos hematopoietikus növekedési faktorok receptorai szintén tirozin kinázok. Ezek közé tartozik a c-fms, amely az 1-es típusú kolónia stimuláló faktor receptora (Sherr és mtsai., Cell 41: 665-676, 1985), valamint a c-kit, ami egy egyszerű hematopoietikus növekedési faktor receptor, amelyről Huang és mtsai., számoltak be {Cell 63: 225-33, 1990).

A receptor tirozin kinázokat strukturális hasonlóságok alapján evolúciós alcsaládokba sorolhatjuk (Ullrich és mtsai., Cell, 61: 243-54, 1990). Ezek közé tartozik az EGF receptor típusú kinázok alcsaládja (I-es alosztály), valamint az inzulin receptor típusú kinázok alcsaládja (Il-es alosztály). Mindkét alcsalád tagjai ismétlődő, homológ, cisztein-gazdag szekvenciarészleteket tartalmaznak az extracelluláris doménjukban. Az eph típusú kinázok extracelluláris doménjában is található egy cisztein-gazdag szekvenciarészlet. Hirai és mtsai., Science 238: 1717-1720 (1987);

-4Lindberg és mtsai., Mól. Cell. Bioi., 10: 6316-24 (1990); Lhotak és mtsai.. Mól. Cell. Bioi., 11: 2496-2502 (1991). A PGDF receptorokat és a c-fms, valamint a c-kit receptor tirozin kinázokat a III-as alosztályba sorolhatjuk, míg a IV-es alosztályt az FGF receptorok alkotják. Ez utóbbi alosztályok tagjaira jellemző, hogy olyan extracelluláris folding egységeket tartalmaznak, melyeket láncon belüli diszulfidhidak stabilizálnak. Ezek az úgynevezett immunoglobulin-szerú folding egységek az immunoglobulin szupercsalád fehérjéire jellemzőek, amely családhoz egy egész sor különféle sejtfelszíni receptor tartozik, melyek ligandumai lehetnek mind sejthez kötöttek, mind pedig szolubilisak. Williams és mtsai., Ami. Rév. Immunoi., 6: 381-405 (1988).

A receptor tirozin kinázok különböznek egymástól mind specifttásukban, mind affinitásukban. Általánosságban a receptor tirozin kinázok olyan glikoproteinek, melyek a következő alegységekből állnak: (1) egy extracelluláris dómén, amely képes megkötni a specifikus növekedési faktor(oka)t; (2) egy transzmembrán dómén, amely általában a fehérje egyik alfa-helikális részlete; (3) egy membránközeli dómén, ahol a receptor szabályozása történhet, például protein foszforiláció útján; (4) egy tirozin kináz dómén, amely a receptor enzimatikus komponense; valamint (5) egy karboxiterminális farok, amely sok receptor esetében szerepet játszik a tirozin kináz szubsztrátjainak felismerésében és megkötésében.

A közelmúltban ismerték fel, hogy az olyan folyamatok, mint például az alternatív mRNS illesztés (splicing), vagy az alternatív poliadeniláció következtében egy bizonyos receptor génről több különböző polipeptid is keletkezhet. Az így keletkezett polipeptidek vagy tartalmazzák, vagy nem tartalmazzák a fent említett doménok némelyikét. E folyamatok következtében bizonyos extracelluláris doménok expresszálódhatnak önálló, szekretált fehérjék formájában, és a receptorok bizonyos formáiból

-5 hiányozhat a tirozin kináz dómén, mely receptorok ily módon csak egy transzmembrán dómén segítségével plazma membránba ágyazódott extracelluláris doménból, valamint egy rövid karboxiterminális farokból állnak.

A jelen találmány tárgyát új endoteliális eredetű receptor tirozin kináz képezi, melyet eredetileg Partanen és mtsai. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 8913-8917, 1990), egy ismeretlen, humán leukémia sejtekből származó, tirozin kináz homológiát mutató, PCR-cDNS fragmentumként azonosítottak. Ezt a gént, valamint az általa kódolt fehérjét “tie”-nak neveztük el, amely elnevezés az “immunoglobulin-, és EGF-szeru ismétlődéseket tartalmazó tirozin kináz” angol kifejezés rövidítéseként jött létre.

A találmány tárgyát képezi továbbá egy meghatározott struktúrával rendelkező DNS vagy RNS fragmentum, amely a tie receptor tirozin kinázt kódoló szekvenciarészletet tartalmaz. A találmány tárgyát képező DNS vagy RNS fragmentumokat előállíthatjuk szintetikusan, vagy izolálhatjuk őket természetes fonásokból is. Az előállított fragmentumokat felhasználhatjuk a kívánt rekombináns DNS vektorok előállítására, valamint homológ gének más forrásokból történő izolálására. A találmány tárgyát képezik továbbá olyan rekombináns DNS vektorok, amelyek tie receptor tirozin kinázt vagy azzal homológ fehérjét kódoló heterológ részletet is tartalmaznak, és amelyek alkalmasak arra, hogy mikroorganizmusokba, vagy eukarióta sejtekbe inszertálódva biztosítsák a kódolt fehérje expresszióját. A találmány tárgyát képezik továbbá olyan eukarióta sejtek, melyek képesek megfelelő mennyiségben tie receptor tirozin kinázt. valamint különböző fajokból származó, hasonló funkciójú fehérjéket előállítani. A találmány tárgyát képezik ezen felül olyan peptidek, melyeket előállíthatunk akár szintetikusan egy laboratóriumban, akár egy

-6mikroorganizmus segítségével, melyek funkcionálisan utánozzák a természetben előforduló tie receptor tirozin kináz fehérje aktivitását, és amelyek alkalmasak lehetnek a tie receptor tirozin kináz, vagy annak egy részletének eukarióta sejtekben történő reprodukálható és sztenderdizált termelésére. A találmány különösen előnyös megvalósítását jelenti a következő szekvenciákkal megadható peptidek bármelyike:

(a) az első szekvencia:

MetValTrpArgValProProPheLeuLeuProIleLeuPheLeuAlaSerHisValGly AlaAlaValAspLeuThrLeuLeuAlaAsnLeuArgLeuThrAspProGlnArgPhePhe LeuThrCysValSerGlyGIuAlaGlyAlaGlyArgGlySerAspAlaTrpGlyProPro LeuLeuLeuGluLysAspAspArglleValArgThrProProGlyProProLeuArgLeu AlaArgAsnGlySerHisGlnValThrLeuArgGlyPheSerLysProSerAspLeuVal GlyValPheSerCysValGlyGlyAlaGlyAlaArgArgThrArgValIleTyrValHis AsnSerProGlyAlaHisLeuLeuProAspLysValThrHisThrValAsnLysGlyAsp ThrAlaValLeuSerAlaArgValHisLysGluLysGlnThrAspValIleTrpLysSer AsnGlySerTyrPheTyrThrLeuAspTrpHisGluAlaGlnAspGlyArgPheLeuLeu GlnLeuProAsnValGlnProProSerSerGlylleTyrSerAlaThrTyrLeuGluAla SerProLeuGlySerAlaPhePheArgLeuIleValArgGlyCysGlyAlaGlyArgTrp GlyProGlyCysThrLysGluCysProGlyCysLeuHisGlyGlyValCysHisAspHis AspGlyGluCysValCysProProGlyPheThrGlyThrArgCysGluGlnAlaCysArg GluGlyArgPheGlyGlnSerCysGlnGluGlnCysProGlyl leSerGlyCysArgGly LeuThrPheCysLeuProAspProTyrGlyCysSerCysGlySerGlyTrpArgGlySer

GlnCysGlnGluAlaCysAlaProGlyHisPheGlyAlaAspCysArgLeuGlnCysGln CysGlnAsnGlyGlyThrCysAspArgPheSerGlyCysValCysProSerGlyTrpHis GlyValHisCysGluLysSerAspArglleProGlnlleLeuAsnMetAlaSerGluLeu GluPheAsnLeuGluThrMetProArglleAsnCysAlaAlaAlaGlyAsnProPhePro ValArgGlySerlleGluLeuArgLysProAspGlyThrValLeuLeuSerThrLysAla IleValGluProGluLysThrThrAlaGluPheGluValProArgLeuValLeuAlaAsp

- 7 SerGlyPheTrpGluCysArgValSerThrSerGlyGlyGlnAspSerArgArgPheLys ValAsnValLysValProProValProLeuAlaAlaProArgLeuLeuThrLysGlnSer ArgGlnLeuVa IVa 1 Ser ProLeuVal Ser PheSerGlyAspGly Proli eSerThrVal ArgLeuHisTyrArgProGlnAspSerThrMetAspTrpSerThrlleValValAspPro SerGluAsnVa IThrLeuMetAsnLeuArgProLysThrGlyTyrSerValArgValGin LeuSerArgProGlyGluGlyGlyGluGlyAlaTrpGlyProProThrLeuMetThrThr AspCysProGluProLeuLeuGlnProTrpLeuGluGlyTrpHisValGluGlyThrAsp ArgLeuArgValSerTrpSerLeuProLeuValProGlyProLeuValGlyAspGlyPhe LeuLeuArgLeuTrpAspGlyThrArgGlyGlnGluArgAraGluAsnValSerSerPro GlnAlaArgThrAlaLeuLeuThrGlyLeuThrProGlyThrHisTyrGlnLeuAspVal GlnLeuTyrHisCysThrLeuLeuGlyProAlaSerProProAlaHisValLeuLeuPro ProSerGlyProProAlaProArgHisLeuHisAlaG InAlaLeuSerAspSerGluI le GlnLeuThrTrpLysHisProGluAlaLeuProGlyProIleSerLysTyrValValGlu ValGlnValAlaGlyGlyAlaGlyAspProLeuTrpIleAspValAspArgProGluGlu ThrSerThrllelleArgGlyLeuAsnAlaSerThrArgTyrLeuPheArgMetArgAla Seri leGlnGlyLeuGlyAspTrpSerAsnThrValG luGluSerThrLeuGlyAsnGly LeuGlnAlaGluGlyProValGlnGluSerArgAlaAlaGluGluGlyLeuAspGlnGln LeuIleLeuAlaValValGlySerValSerAlaThrCysLeuThrlleLeuAlaAlaLeu LeuThrLeuValCysIleArgArgSerCysLeuHisArgArgArgThrPheThrTyrGln SerGlySerGlyGluGluThrlleLeuGlnPheSerSerGlyThrLeuThrLeuThrArg ArgProLysLeuC-lnProGluProLeuSerTyrProValLeuGluTrpGluAspIleThr PheGluAspLeuI leGlyGluGlyAsnPheGlyGlnVaIIleArgAlaMetlleLysLys AspGlyLeuLysMetAsnAlaAlal leLysMetLeuLysGluTyrAlaSerG luAsnAsp HisArgAspPheAlaGlyGluLeuGluValLeuCysLvsLeuGlyHisHisProAsnlle IleAsnLeuLeuGlyAlaCysLysAsnArgGlyTyrLeuTyrlleAlalleGluTyrAla ProTyrGlyAsnLeuLeuAspPheLeuArgLysSerArgValLeuGluThrAspProAla PheAlaArgGluHisGlyThrAlaSerThrLeuSerSerArgGlnLeuLeuArgPheAla SerAspAlaAlaAsnGlyMetGlnTyrLeuSerGluLysGlnPhelleHisArgAspLeu

981 AlaAlaArgAsnValLeuValGlyGluAsnLeuAlaSerLysI leAlaAspPheGlyLeu 1001 SerArgGlyGluGluValTyrValLysLysThrMetGlyArgLeuProValArgTrpMet

1021 AlalleGluSerLeuAsnTyrSerVa lTyrThrThrLysSerAspValTrpSerPheGly

104 1 ValLeuLeuTrpGluIleValSerLeuGlyGlyThrProTyrCysGlyMetThrCysAla

1061 GluLeuTyrGluLysLeuProGlnAlaAspArgMetGluGlnProArgAsnCysAspAsp

1081 GluValTyrGluLeuMetArgGlnCysTrpArgAspArgProTvrGluArgProProPhe

1101 AlaGlnl leAlaLeuGlnLeuGlyArgMetLeuGluAlaArgLysAlaTyrValAsnMet

112 1 SerLeuPheGluAsnPheThrTyrAlaGlylleAspAlaThrAlaGluGluAla;

(SZEKVENCIA AZONOSÍTÓSZÁM: 1.) és (b) a második szekvencia: lényegében azonos az első szekvenciával, azzal a különbséggel, hogy benne az első szekvenciában megadott 214-257. aminosavak hiányoznak.

A találmány tárgyát képezik továbbá a fenti peptidek bármelyikét kódoló DNS és RNS molekulák, rekombináns DNS vektorok, valamint mindazok a genetikailag módosított mikroorganizmusok és eukarióta sejtek, melyek bármilyen, a fenti peptideket kódoló nukleinsav fragmentumot hordoznak. A találmány különösen előnyös megvalósítási módjai közé tartoznak azok a nukleinsav fragmentumok, melyek részben vagy egészében hordozzák az alábbiakban megadott két DNS szekvenciát, azok komplementereit, vagy mindezek RNS megfelelőit:

az első szekvencia:

cgctcgtcct ggctggcctg ggtcggcctc tggagtatgg tctggcgggt gccccctttc ttgctcccca tcctcttctt ggcttctcat gtgggcgcgg

101 cggtggacct gacgctgctg gccaacctgc ggctcacgga cccccagcgc

151	ttcttcctga	cttgcgtgtc	tggggaggcc	ggggcgggga	ggggctcgga
201	cgcctggggc	ccgcccctgc	tgctggagaa	ggacgaccgt	atcgtgcgca
251	ccccgcccgg	gccacccctg	cgcctggcgc	gcaacggttc	gcaccaggtc
301	acgcttcgcg	gcttctccaa	gccctcggac	ctcgtgggcg	tcttctcctg
351	cgtgggcggt	gctggggcgc	ggcgcacgcg	cgtcatctac	gtgcacaaca
401	gccctggagc	ccacctgctt	ccagacaagg	tcacacacac	tgtgaacaaa
451	ggtgacaccg	ctgtactttc	tgcacgtgtg	cacaaggaga	agcagacaga
501	cgtgatctgg	aagagcaacg	gatcctactt	ctacaccctg	gactggcatg
551	aagcccagga	tgggcggttc	ct'gctgcagc	tcccaaatgt	gcagccacca
601	tcgagcggca	tctacagtgc	cacttacctg	gaagccagcc	ccctgggcag
651	cgccttcttt	cggctcatcg	tgcggggttg	tggggctggg	cgctgggggc
701	caggctgtac	caaggagtgc	ccaggttgcc	tacatggagg	tgtctgccac
751	gaccatgacg	gcgaatgtgt	atgcccccct	ggcttcactg	gcacccgctg
801	tgaacaggcc	tgcagagagg	gccgttttgg	gcagagctgc	caggagcagt
851	gcccaggcat	atcaggctgc	cggggcctca	ccttctgcct	cccagacccc
901	tatggctgct	cttgtggatc	tggctggaga	ggaagccagt	gccaagaagc
951	ttgtgcccct	ggtcattttg	gggctgattg	ccgactccag	tgccagtgtc
1001	agaatggtag	cacttgtgac	cggttcagtg	gttgtgtctg	cccctctggg
1051	tggcatggag	tgcactgtga	gaagtcagac	cggatccccc	agatcctcaa
1101	catggcctca	gaactggagt	tcaacttaga	gacgatgccc	cggatcaact
1151	gtgcagctgc	agggaacccc	ttccccgtgc	ggggcagcat	agagctacgc
1201	aagccagacg	gcactgtgct	cctgtccacc	aaggccattg	tggagccaga
1251	gaagaccaca	gctgagttcg	aggtgccccg	cttggttctt	gcggacagtg
1301	ggttctggga	gtgccgtgtg	tccacatctg	gcggccaaga	cagccggcgc
1351	ttcaaggtca	atgtgaaagt	gccccccgtg	cccctggctg	cacctcggct
1401	cctgaccaag	cagagccgcc	agcttgtggt	ctccccgctg	gtctcgttct
1451	ctggggatgg	acccatctcc	acfgtccgcc	tgcactaccg	gccccaggac

1501 agtaccatgg actggtcgac cattgtggtg gaccccagtg agaacgtgac

1551	gttaatgaac	ctgaggccaa	agacaggata	cagtgttcgt	gtgcagctga
1601	gccggccagg	ggaaggagga	gagggggcct	gggggcctcc	caccctcatg
1651	accacagact	gtcctgagcc	tttgttgcag	ccgtggttgg	agggctggca
1701	tgtggaaggc	actgaccggc	tgcgagtgag	ctggtccttg	cccttggtgc
1751	ccgggccact	ggtgggcgac	ggtttcctgc	tgcgcctgtg	ggacgggaca
1801	cgggggcagg	agcggcggga	gaacgtctca	tccccccagg	cccgcactgc
1851	cctcctgacg	ggactcacgc	ctggcaccca	ctaccagctg	gatgtgcagc
1901	tctaccactg	caccctcctg	ggcccggcct	cgccccctgc	acacgtgctt
1951	ctgcccccca	gtgggcctcc	agccccccga	cacctccacg	cccaggccct
2001	ctcagactcc	gagatccagc	tgacatggaa	gcacccggag	gctctgcctg
2051	ggccaatatc	caagtacgtt	gtggaggtgc	aggtggctgg	gggtgcagga
2101	gacccactgt	ggatagacgt	ggacaggcct	gaggagacaa	gcaccatcat
2151	ccgtggcctc	aacgccagca	cgcgctacct	cttccgcatg	cgggccagca
2201	ttcaggggct	cggggactgg	agcaacacag	tagaagagtc	caccctgggc
2251	aacgggctgc	aggctgaggg	cccagtccaa	gagagccggg	cagctgaaga
2301	gagcctggat	cagcagctga	tcctggcggt	ggtgggctcc	gtgtctgcca
2351	cctgcctcac	catcctggcc	gcccttttaa	ccctggtgtg	catccgcaga
2401	agctgcctgc	atcggagacg	caccttcacc	taccagtcag	gctcgggcga
2451	ggagaccatc	ctgcagttca	gctcagggac	cttgacactt	acccggcggc
2501	caaaactgca	gcccgagccc	ctgagctacc	cagtgctaga	gtgggaggac
2551	atcacctttg	aggacctcat	cggggagggg	aacttcggcc	aggtcatccg
2601	ggccatgatc	aagaaggacg	ggctgaagat	gaacgcagcc	atcaaaatgc
2651	tgaaagagta	tgcctctgaa	aatgaccatc	gtgactttgc	gggagaactg
2701	gaagttctgt	gcaaattggg	gcatcacccc	aacatcatca	acctcctggg
2751	ggcctgtaag	aaccgaggtt	acttgtatat	cgctattgaa	tatgccccct
2801	acgggaacct	gctagatttt	ctgcggaaaa	gccgggtcct	agagactgac
2851	ccagcttttg	ctcgagagca	tgggacagcc	tctaccctta	gctcccggca
2901	gctgctgcgt	ttcgccagtg	atgcggccaa	tggcatgcag	tacctgagtg

2951	agaagcagtt	catccacagg	gacctggctg	cccggaatgt	gccggtcgga
3001	gagaacctag	cctccaagat	tgcagacttc	ggcctttctc	ggggagagga
3051	ggtttatgtg	aagaagacga	tggggcgtct.	ccctgtgcgc	tggatggcca
3101	ttgagtccct	gaactacagt	gtctatacca	ccaagagtga	tgtctggtcc
3151	tttggagtcc	ttctttggga	gatagtgagc	cttggaggta	caccctactg
3201	tggcatgacc	tgtgccgagc	tctatgaaaa	gctgccccag	gctgaccgca
3251	tggagcagcc	tcgaaactgt	gacgatgaag	tgtacgagct	gatgcgtcag
3301	tgctggcggg	accgtcccta	tgagcgaccc	ccctttgccc	agattgcgct
3351	acagctaggc	cgcatgctgg	aagccaggaa	ggcctatgtg	aacatgtcgc
3401	tgtttgagaa	cttcacttac	gcgggcattg	atgccacagc	tgaggaggcc
3451	tgagctgcca	tccagccaga	acgtggctct	gctggccgga	gcaaactctg
3501	ctgtctaacc	tgtgaccagt	ctgaccctta	cagcctctga	cttaagcrgc
3551	crcaaggaat	ttttttaact	taagggagaa	aaaaagggat	ctggggatgg
3601	ggtgggctta	ggggaactgg	gttcccatgc	tttgtaggtg	tctcatagct
3651	atcctgggca	tccttctttc	tagttcagct	gccccacagg	tgtgtttccc
3701	atcccactgc	tcccccaaca	caaaccccca	ctccagctcc	ttcgcttaag
3751	ccagcactca	caccactaac	atgccctgtt	cagctactcc	cactcccggc
3801	ctgtcattca	gaaaaaaata	aargttctaa	taagctccaa	aaaaa

(SZEKVENCIA AZONOSÍTÓSZÁM: 2.) és a második szekvencia: amely lényegében azonos az első szekvenciával, azzal a különbséggel, hogy benne az első szekvenciában megadott 676-807. nukleotidok hiányoznak.

Azok a DNS és RNS molekulák, melyek a fent megadott hosszabb szekvencia bármely részletét tartalmazzák, felhasználhatóak a találmány előnyös megvalósítási módjai szerint az általuk kódolt peptidek előállítására, a génsebészeti és oligonukleotid próba előállítási módszerek alkalmazásával. Mivel a tie fehérjét kódoló DNS szekvencia teljes egészében ismertté vált, lehetőség van a teljes gén előállítására, például a • · ·

- 12polimeráz láncreakció (PCR) alkalmazásával, vagy az ismert szintetikus kémiai módszerek és a kereskedelemben beszerezhető felszerelések felhasználásával. Az ily módon előállított gén azután a sok hozzáférhető DNS vektor bármelyikébe inszertálható, az ismert rekombináns DNS technológiai módszerek alkalmazásával. Ezen felül hozzáférhetőek olyan automatikus berendezések is, melyek segítségével a találmány tárgyát képező peptiek bármelyikének szintézise könnyűszerrel megvalósítható. Ily módon a találmány megvalósítható kémiai reagensek, plazmidok és mikroorganizmusok segítségével, melyek szakember számára mind könnyen hozzáférhetőek.

A leíráshoz csatolt 1-13. ábrák a találmány pontosabb ismertetését szolgálják, anélkül, hogy igényünket azokra szándékoznánk korlátozni, hacsak nem történik erre külön utalás.

1. ábra. A tie cDNS nukleotid szekvenciája és belőle levezethető aminosav sorrend. A 3845 bázispár hosszúságú nukleoteid szekvencia, melyet két átfedő, HEL könyvtárból izolált cDNS klón megszekvenálásával határoztunk meg, tartalmaz egy 1138 aminosav hosszúságú nyitott leolvasási fázist {open reading fiamé). Az aminosav sorrendet az egybetus kód alkalmazásával tüntettük fel. A tie prekurzor molekula szekvenciája a 37-es sorszámú nukleotidnál kezdődik, az érett tie fehérje molekula első aminosava pedig megegyezik a prekurzor 22. aminosavával (100. nukleotidtól). A hidrofób szignál szekvenciát, valamint a feltételezett transzmembrán domént aláhúzással jelöltük (vastag vonalak), csakúgy mint a potenciális N-glikozilációs helyeket (vékony vonalak). Az érett tie fehérje extracelluláris doménjében található ciszteineket bekereteztük, a tirozin kináz domént vízszintes nyilakkal, a kináz inszertet pedig dőlt betűkkel jelöltük. A három cisztein-gazdag régiót, melyek homológiát mutatnak az • · ♦

- 13 EGF-szerű doménekkel (EGFH I-III), szintén bekeretezéssel jelöltük. Az említett régiókat a 2. ábrán láthatjuk homológ szakaszok szerint egymás alá illesztve. Az első EGF típusú ismétlődést, amely a 3a kiónból hiányzik, függőleges nyilakkal jelöltük. A megadott szekvenciát a GenBank/EMBLnél deponáltuk (azonosítószám: X60957). Az egybetűs kód értelmezése: A = alanin, C = cisztein, D = aszparagisav, E = glutaminsav, F = fenilalanin, G = glicin, H = hisztidin, I = izoleucin, K = lizin, L = Ieucin, M = metionin, N = aszparagin, P = prolin, Q = glutamin, R = arginin, S = szerin, T = treonin, V = valin, W = triptofán, Y = tirozin.

2A ábra. A tie fehérje EGF-szeru doménjeinek homólógia kiemelő elrendezése. A szekvenciákat összehasonlítottuk a humán EGF szekvenciával (1-44. aminosavak), valamint egyéb homológ szekvencia részletekkel a CRIPTO elnevezésű növekedési faktorból (67-108.), a laminin A láncból (1092-1 138.), a Drosophila melanogaster “Notch” (897945.) elnevezésű és a Caenorhabditis elegáns Lin-12 (204-246.) elnevezésű egyedfejlődést szabályozó fehérjéjéből, a humán IXa véralvadási faktorból (83-130.) és az egér urokináz típusú plazminogén aktivátorából (18-65.). A csillagok konzerválódott aminosavakat jelölnek, a homológ ciszteineket pedig · bekereteztük. A konszenzus S-hidroxilációs szekvenciáknak megfelelő aminosavakat a Notch és a IXa faktor ismétlődésben vastag betűkkel nyomtattuk.

2B ábra. A tie fehérje három fibronektin III-as típusú ismétlődésének összehasonlítása a humán LAR receptor foszfotirozin foszfatáz első három fibronektin III-as típusú ismétlődésével. A ciszteineket és néhány más immunoglobulin doménekre jellemző konszenzus aminosavat megjelöltünk a tie második fibronektin III-as típusú ismétlődő szekvenciája felett.

3. ábra. A tie cDNS expressziója COS sejtekben. COS sejteket fertőztünk SV-40 alapú tie és FGFR4 expressziós vektorokkal (SV14-1, SV14-2; C, Partanen, J., T. P. Makela, E. Eerola, J. Korhonen. H. Hirvonen, L. Claesson-Welsh és K. Alitalo, EMBO J. 10: 1347-1354, 1991), a sejteket ³⁵S-metioninnal jelöltük, lizáltattuk, majd immunoprecipitációnak vetettük alá, ahogy azt a 3. példa módszerei között részletesen leírtuk. Az ábrán a kicsapott fehérjék SDS-PAGE analízisének autoradiogramjait láthatjuk. A. A COS sejtekben expresszált tie polipeptidek kimutatása. Hl: s-gal-tie fúziós fehérje elleni antiszérum, HO: preimmun szérum. +: az antiszérumot antigénnel blokkoltuk. B. Tunicamycin hatása a tie protein molekulasúlyára. MI: a tie karboxiterminális peptidje ellen készített antiszérum; MO: preimmun szérum. +: a fertőzött sejttenyészeteket tunicamycin jelenlétében jelöltük. A molekulasúly markerek mobilitását baloldalon láthatjuk.

4. ábra. A tie proteint expresszáló sejtvonalak immunobiot analízise. Tie expressziós vektorral fertőzött (LTR14-2) és nem fertőzött (ΝΕΟΙ) NIH3T3 sejtek, valamint sertés aorta endotélsejtek lizátumát karboxiterminális tie peptid ellen készített antiszérummal immunoblotoltuk. A két jobboldali szélső sávban (aPY, IP) látható mintákat az immunobiot analízis előtt anti-foszfotirozin ellenanyaggal immunoprecipitáltuk.

5. ábra. A tie lókusz térképezése a kromoszómákon. Rádioaktívan jelzett JTK14 DNS-t hibridizáltunk normális humán férfi perifériás limfocita metafázis preparátumhoz; a filmeket expozíció után lemostuk és előhívtuk, majd G-band vizsgálatot végeztünk az egyes kromoszómák megkülönböztetése céljából. A szemcse lokalizálás eredményét a vázlatosan ábrázolt 1. kromoszóma mellett láthatjuk, ahol minden pont három szemcsének felel meg. Valamennyi aspecifikus háttér jelet más

- 15 - .....

kromoszómákon is detektáltunk, 12,6%-ot (40/317) az A csoporthoz tartozó egyéb kromoszómákon, 8,5%-ot (27/317) a B csoporthoz tartozó kromoszómákon és 14,8%-ot (47/317) a többi kromoszóma csoportokon.

6. ábra. A tie mRNS expressziója leukémia sejtvonalakban. A jelzett sejtvonalakból származó poli(A)⁺ RNS-t Northen biot analízisnek vetettük alá, hibridizációs próbaként tie cDNS-t alkalmazva. A gliceraldehid-3foszfát-dehidrogenáz (GAPDH) hibridizációs próbát belső kontrollként alkalmaztuk, annak eldöntésére, hogy egyenlő mennyiségű RNS-t vittünk-e fel a gél különböző starthelyeire.

7. ábra. A tie mRNS expressziója endoteliális sejtvonalakban. Az ábrán a tie mRNS PAE és EA hy926 jelű sejtvonalakban történő expressziójának Northem biot analízises képét látjuk. A Dami sejtekből származó poli(A)⁺ RNS-t tartalmazó sávot pozitív kontrollként használtuk.

8. ábra. A tie mRNS lokalizációja in situ hibridizációval vese vezeték endotéliumban. Az A jelű, sötét hátterű mezőn - az ábra felső részén láthatjuk a hibridizációs jelet. A megfelelő fázis-kontraszt mikroszkópos jelet az ábra alsó részén láthatjuk (B).

9. ábra. A tie fehérje szerkezetének összehasonlítása néhány más receptor tirozin kinázzal, melyek immunoglobulin és fibronektin III-as típusú ismétlődéseket tartalmaznak. A nyitott körök immunoglobulin hurkokat, az üres téglalapok fibronektin III-as típusú ismétlődéseket, a sötét ellipszisek pedig EGF homológ doméneket jelölnek. A vonalkázott téglalap az eph típusú kinázok cisztein-gazdag régióját jelenti. A sötét téglalapok a citoplazmikus tirozin kináz doméneket jelölik.

10. ábra. A humán tie receptor tirozin kináz szerkezeti vázlata, valamint levezetett aminosav sorrendjének összehasonlítása két egér tie cDNS kiónnal (1C1D és D10E5).

-16- ......

A tie receptor két immunoglobulin-szerű hurokból (lg), három (vagy két) epidermális növekedési faktor (EGF) doménból, ezeket követően három fibronektin III-as típusú doménból, egy transzmembrán régióból (TM) és két citoplazmikus tirozin kináz doménból (TK1 és TK2) áll. Az egér és a humán tie aminosavsorrendjének homológiája a megadott 1C1D és a D10E5 szekvenciarészletekre vonatkozóan sorrendben 96 és 95 %-os.

11. ábra. A tie mRNS expressziója emberi szövetekben. Az A ábrán 17-19 hetes magzati szövetekből izolált össz-RNS Northem biot analízises képét láthatjuk. A B ábra felnőtt emberi szövetekből izolált, poliadenilált RNS frakció hibridizációs képét mutatja. Az s-aktin és GAPDH hibridizációs próbákat belső kontrollként használtuk a felvitt RNS mennyiség meghatározására.

12. ábra. A tie mRNS expressziójának in situ hibridizációs analízise 12 napos egér embrióban.

Az ábrán 1C1D antiszensz (A. B) és szensz (C) próbákkal hibridizált szagittális metszetről készült világos hátterű (A) és sötét hátterű (B,C) mikroszkópos felvételeket láthatunk. A tie mRNS expressziója csak a vérerek endotéliumában figyelhető meg. A következő rövidítéseket használtuk: br (agy), mg (agyhártya), lg (tüdő), mb (állkapocs), ht (szív), vn (kamra), at (pitvar), se (gerincvelő), pv (gerinckezdemény), cv (hátsó fővéna).

13. ábra. A tie (A) és a VlII-as faktor (B) mRNS expressziójának összehasonlítása p.c. 8 napos egér placentában.

A VlII-as faktor mRNS-ének expresszióját sötét kicsapódásként láthatjuk a vérerek környékén (B), a tie mRNS expressziót pedig egy hasonló, de az előbbitől különböző metszeten fehér szemcsék jelzik (A).

- 17 Amint az ábrán megfigyelhető, mindkét szignál a labirintust alkotó véredények endotélsejtjeihez lokalizálható.

A találmány leírásának további részében sok rekombináns DNS (rDNS) technológiában használatos kifejezést fogunk folyamatosan alkalmazni. A leírás, az igénypontok, valamint a használt szakkifejezések tiszta és világos értelmezhetősége érdekében a következő meghatározásokat közöljük.

Gén: Olyan DNS szekvencia, amely valamely RNS polimeráz számára átírható templátfelszínt tartalmaz. Egy génről átíródott RNS vagy kódol fehérjét, vagy nem. Azt az RNS-t amely fehérjét kódol, hírvivő (messenger) RNS-nek (mRNS) nevezzük. Az mRNS-eket eukariótákban az RNS polimeráz II írja át. Ismeretes olyan eljárás is, miszerint létrehozunk egy RNS polimeráz II templátot tartalmazó gént, amelyről olyan RNS szekvencia íródik át, amely egy specifikus mRNS szekvenciájának komplementere, és általában nem transzlálódik. Az ilyen génkonstrukciókat a leírásban “antiszensz RNS gén”-eknek fogjuk nevezni, a róluk átíródó RNS-eket pedig “antiszensz RNS”-eknek. Az antiszensz RNS-ek általában nem transzlálódnak antiszensz RNS szekvenciákban előforduló transzlációs stop kódonok miatt. A “komplementer DNS”, illetve “cDNS” kifejezések olyan rekombináns géneket jelölnek, melyek a közbeékelődött szekvenciákat (intronokat) már nem tartalmazó mRNS-ek reverztranszkripciójával állítunk elő.

Klónozó vektor: Plazmid, fág, vagy egyéb eredetű DNS szekvencia, mely valamilyen gazdasejtben autonóm replikációra képes, és amely jellemzően tartalmaz egy, vagy több (nem túl sok) endonukleáz felismerési helyet, ahol az ilyen DNS szekvenciák előre meghatározható módon elhasíthatóak, anélkül, hogy a vektor bármely esszenciális biológiai

- 18♦ · · · • · · ♦·· • · · · · · · ·· ·· ·· funkciója elveszne, és amely helyekre egyéb DNS szekvenciák illeszthetők be annak érdekében, hogy azok replikációját, illetve klónozását a gazdasejtekben megvalósítsuk. A klónozó vektor tartalmazhat ezen felül biológiai markereket is, a vektorral transzformált sejtek azonosításának megkönnyítése érdekében. Ilyen biológiai markerek például a tetraciklin és az ampicillin rezisztencia. Esetenként a “klónozó vektor” elnevezés helyett egyszerűen a “vektor” kifejezést fogjuk használni.

Expressziós vektor: a klónozó vektorhoz hasonló vektor, azzal a különbséggel, hogy az expressziós vektor transzformáció után képes gondoskodni a bele klónozott gének gazdasejtben történő expressziójáról is. Az expressziós vektorba klónozott géneket általában valamilyen szabályozó szekvenciák, például promóterek szabályozása alá helyezzük (azaz funkcionálisan összekapcsoljuk őket). Hogy milyen expressziós szabályozó szekvenciákat kell alkalmaznunk, az attól függ, hogy a vektort a klónozott gének eukarióta, vagy prokarióta gazdasejtekben történő fehérje expressziójára akarjuk-e használni. Az expressziós vektorok tartalmazhatnak még additív transzkripciós szabályozó elemeket is, mint például enhanszereket, terminátorokat, szövetspecifikus szabályozó régiókat és/vagy transzlációs iniciációs és terminációs helyeket. Jelen találmány vonatkozik a rekombináns tie fehérje és funkcionális származékai expressziójára.

Funkcionális származék: A tie fehérje “funkcionális származék”-ai mindazok a fehérjék, melyek a nem rekombináns tie fehérje valamely biológiai aktivitásához alapvetően hasonló (funkcionális, vagy strukturális) biológiai aktivitással rendelkeznek. A tie fehérje funkcionális származékai vagy tartalmaznak poszt-transzlációs modifikációt - például kovalensen kötött szénhidrát oldalláncot -, vagy nem, attól függően, hogy egy adott ····

- 19• · · · • · • ·♦· • · • ·· · · specifikus funkció megnyilvánulásához szükséges-e az illető modifikáció. A “funkcionális származék” kifejezés az itt használt értelemben magában foglalja egy adott molekula “fragmentum”-ait, “variáns”-ait, “analóg”-jait és “kémiailag módosított változaf’-ait. Az itt használt értelemben egy molekulát akkor mondunk egy másik molekula “kémiailag módosított változat”-ának, ha az előbbi molekula additíve olyan kémiai csoportokat tartalmaz, amelyek normálisan nem részei az utóbbi molekulának. Az ilyen csoportok előnyösen befolyásolhatják a molekula oldhatóságát, abszorpciós tulajdonságait, biológiai féléletidejét, stb. Ezek a csoportok csökkenthetik továbbá a molekula toxicitását, és eliminálhatják, vagy csökkenthetik a molekula valamely káros mellékhatását, stb. Ilyen hatásokat kiváltani képes kémiai csoportok ismertetésre kerülnek a Remington által szerkesztett “Pharmaceutical Sciences”-ben. Azok az eljárások, amelyek segítségével ilyen kémiai csoportokat hozzákapcsolhatunk egy molekulához, szakember számára közismertek.

Fragmentum: Egy adott molekula, mint például a tie protein “fragmentum”-a alatt a molekula összes variánsát értjük, mint például a peptid központi egységét (core) és annak variánsait.

Variáns: Egy adott molekula, mint például a tie protein “variáns”-a alatt olyan molekulákat értünk, melyek az illető molekulához, vagy annak egy fragmentumához alapvetően hasonló struktúrával, vagy biológiai aktivitással rendelkeznek. Ily módon, amennyiben két molekula hasonló aktivitással rendelkezik, őket egymás variánsainak tekintjük, mivel a leírás vonatkozásában a variáns kifejezést akkor is alkalmazzuk két molekulára, ha azok összetétele, szekunder, tercier, vagy kvaterner szerkezete, illetve aminosav sorrendje nem teljesen azonos.

-20Analóg: A tie fehérje, vagy tie nukleinsav szekvencia “analógjáénak nevezzük azokat a fehérjéket, illetve nukleinsav szekvenciákat, amelyek funkcionálisan alapvetően hasonlítanak a leírásban megadott tie fehérjére, vagy nukleinsav szekvenciára.

Jelen találmány tárgyát a “tie” elnevezésű új receptor tirozin kináz képezi, valamint a tie-t kódoló nukleinsav molekulák (pl. cDNS-ek, genomi DNS-ek, RNS-ek, antiszensz RNS-ek, stb.), eljárások a tie peptidek és a tie fehérje előállítására a tie génből és annak termékéből, rekombináns tie expressziós vektorok, tie analógok és származékok, a tie és a vele rokon fehérjék diagnosztikai és/vagy terápiás felhasználását célzó eljárások, tie-t kódoló nukleinsav molekulák, tie ligandumok, tie antagonisták és anti-tie ellenanyagok.

A leírás következő részében a rekombináns tie fehérje előállításának részleteit ismertetjük.

Biológiailag aktív tie fehérjét oly módon állíthatunk elő, hogy egy tiet kódoló nukleotidot, vagy annak funkcionális ekvivalensét megfelelő gazdasejtben megklónozunk és expresszáltatunk. A tie fehérje rekombináns DNS technológia segítségével történő előállítását a könnyebb érthetőség kedvéért a következő lépésekben foglalhatjuk össze: (1) a kívánt tie fehérjét kódoló nukleinsav szekvencia (gén) izolálása, illetve előállítása; (2) olyan expressziós vektor előállítása, amely képes a kívánt tie fehérje szintézisét megvalósítani; (3) olyan replikációra képes gazdasejtek fertőzése, vagy transzformálása, melyek képesek a tie gént expresszálni és/vagy a génterméket processzálni és ezáltal a kívánt tie fehérjét előállítani; és (4) a kívánt tie fehérje azonosítása és tisztítása.

A) A következőkben a tie gén izolálásának lehetőségeit ismertetjük.

A tie-t kódoló nukleinsav szekvenciát és annak funkcionális ekvivalenseit felhasználhatjuk olyan rekombináns expressziós vektorok előállítására, melyek lehetővé teszik a kívánt tie fehérje expresszióját. A tiet kódoló nukleotid szekvenciát a leírásban az 1-es Szekvencia Azonosítószám alatt közöljük. A megadott nukleotid szekvencia, annak fragmentumai, valamint funkcionális ekvivalensei alkalmasak olyan rekombináns molekulák előállítására, melyek megfelelő gazdasejtekben képesek rekombináns tie fehérje expresszióját előidézni. A tie-t kódoló nukleinsav szekvenciához sok különféle sejt segítségével hozzájuthatunk, melyek tie-szerű aktivitással rendelkező fehérjéket szintetizálnak és/vagy tie-t kódoló mRNS-eket expresszálnak. Sok különböző emberi sejttípusban kimutattuk a tie fehérje jelenlétét, többek között endotélsejtekben, leukémia sejtekben, rhabdomyosarcoma (harántcsíkolt izom daganat) és fibrosarcoma (rostos elemeket tartalmazó daganat) sejtekben.

A tie-t kódoló szekvenciához hozzájuthatunk mind a fent említett sejtekből izolált és tisztított RNS mintákból kiinduló cDNS klónozás, mind pedig genomi klónozás segítségével. A tie szekvenciát amplifikálhatjuk például cDNS-ből vagy genomi DNS-ből kiindulva a polimeráz láncreakció (PCR) segítségével a szakember számára közismert eljárásokat alkalmazva. Mind cDNS, mind genomi klón-könyvtárakat készíthetünk a szakember számára közismert eljárásokat alkalmazva, és ezeket olyan DNS-próbákkal szkrínelhetjük (szkrínelés: sok klón egyidejű hibridizációs vizsgálata valamely nukleotid szekvencia jelenlétére vonatkozólag) tie eredetű DNS molekulák jelenlétére vonatkozólag, melyek alapvetően komplementerek a tie gén valamely részletével. A teljes hosszúságú kiónokat, azaz azokat a kiónokat amelyek a kívánt tie gén teljes kódoló régióját tartalmazzák, kiválaszthatjuk expressziós vektor előállítás céljára. A már említett • « lehetőségeken felül a tie-t kódoló DNS molekulákat részben, vagy egészben előállíthatjuk kémiai szintézis útján is, a közismert eljárásokat alkalmazva.

A genetikai kód degeneráltsága következtében a találmány megvalósítási módjait képezi az említetteken felül minden olyan DNS szekvencia, amely a fentiekkel alapvetően azonos, vagy funkcionálisan ekvivalens aminosav sorrendet kódol. A tie nukleotid szekvencia említett variánsai tartalmazhatnak deléciókat, addíciókat és különböző nukleotid szubsztitúciókat, azonban mind azonos, vagy funkcionálisan ekvivalens génterméket kódolnak. A keletkezett géntermék tartalmazhat deléciókat, addíciókat, vagy szubsztitúciókat az aminosav szekvenciában is, ezek azonban csak “csendes” változásokat jelentenek és így bioaktív tie származékot kapunk. Ilyen aminosav deléciókat, addíciókat, és szubsztitúciókat az érintett aminosavak következő tulajdonságainak valamelyikében megmutatkozó hasonlóság alapján végezhetünk: polaritás, töltés, oldhatóság, hidrofóbság, hidrofilség, és/vagy amfipatikus sajátságok. Például negatívan töltött aminosavak: aszparaginsav, glutaminsav; pozitívan töltött aminosavak: lizin, arginin; hasonló hidrofilitási értékekkel rendelkező töltetlen poláros, vagy apoláros oldalláncú aminosavak: leucin, izoleucin, valin; glicin, alanin; aszparagin, glutamin; szerin, treonin; fenilalanin, tirozin.

B) A következőkben a tie expressziós vektorok előállítási lehetőségeit ismertetjük.

Az eddigiekben ismertetett információk alapján egész sereg olyan rekombináns DNS vektor állítható elő, melyek képesek a tie receptor tirozin kinázt megfelelő mennyiségben expresszálni. A tie receptor tirozin kináz cDNS-ből kiindulva - a szokásos rekombináns DNS technikák felhasználásával - sok hasonló szerkezetű rekombináns DNS vektor • ·«·

- 23 állítható elő, melyek vagy olyan mesterséges fehérjéket kódolnak, melyek rendelkeznek a fentebb ismertetett kulcsfontosságú strukturális sajátságokkal, vagy az adott fehérjecsalád más forrásokból származó tagjait kódolják. Az ilyen eljárások illusztrálására bemutatunk egy példát tie receptor tirozin kinázt expresszáló transzformáns előállítására (lásd 3. és 4. példa). A leírásban ismertetett, újonnan felfedezett szekvencia és szerkezeti információ, eukarióta sejtek fertőzése útján, felhasználható tie receptor tirozin kináz és különböző tie receptor tirozin kináz domének biológiai célú előállítására.

C) A következőkben a tie génterméket expresszáló fertőzött, illetve transzformált gazdasejtek azonosítási lehetőségeit ismertetjük.

A rekombináns kódoló szekvenciát hordozó, biológiailag aktív, érett génterméket expresszáló gazdasejteket legalább négyféle, általánosan használt eljárás segítségével azonosíthatjuk: (a) DNS-DNS, DNS-RNS, vagy DNS - antiszensz RNS hibridizációval; (b) “marker” gén funkció jelenléte, vagy hiánya alapján; (c) a gazdasejtben expresszálódó tie mRNS transzkriptumok mennyiségének meghatározásával; és (d) az érett géntermék jelenlétének kimutatása által, immunoassay (immunoassay: egy vizsgált mintában igen kis mennyiségben jelenlévő, ellenanyagokkal specifikusan megköthető anyag érzékeny kimutatására szolgáló eljárás) segítségével, vagy pedig a géntermék biológiai aktivitása alapján.

Az említett első eljárás alapján, az expressziós vektorokba inszertált tie kódoló szekvencia jelenléte kimutatható például a tie kódoló szekvenciával homológ szekvenciát tartalmazó hibridizációs próbával végrehajtott DNS-DNS hibridizáció segítségével.

A második eljárás szerint a rekombináns expressziós vektor / gazdasejt rendszert azonosíthatjuk és választhatjuk ki, bizonyos “marker” • ·

- 24 gén funkciók jelenléte, illetve hiánya alapján (pl. timidin kináz aktivitás, antibiotikum rezisztenciák, metotrexát rezisztencia, transzformálódott fenotípus, elzáró test (occlusion body) kialakulása baculovírus esetén, stb.). Amennyiben például a tie kódoló szekvenciát egy vektor marker gén szekvenciájába inszertáljuk, a kódoló szekvenciát hordozó rekombináns vektorok azonosíthatók a marker gén funkciójának gazdasejtbeli hiánya alapján. Más stratégiát választva úgy is eljárhatunk, hogy a marker gént a tie szekvenciával tandem elrendezésben helyezzük el a vektorban, a tie kódoló szekvencia átíródását szabályozó, vagy egy attól különböző promóter szabályozása alatt. Ez esetben a marker gén indukcióra bekövetkező, vagy szelekciós hatással detektálható expressziója jelzi a tie kódoló szekvencia expresszióját.

A harmadik eljárás szerint a tie kódoló szekvencia transzkripciós aktivitását hibridizációs vizsgálatok alapján is meghatározhatjuk. Vizsgálhatjuk például az izolált, poliadenilált RNS frakciót Northem biot analízis segítségével, a tie kódoló szekvenciával, vagy annak egy részletével homológ hibridizációs próbát alkalmazva. Eljárhatunk úgy is, hogy izoláljuk a sejt teljes nukleinsav tartalmát, és a fent leirt próbával hibridizáljuk.

A negyedik megoldás szerint a tie gén expresszióját detektálhatjuk immunológiailag is, például Western biot analízis, immunoassay (mint például a radioimmunoprecipitáció), enzimmel jelzett immunoassay és hasonló eljárások segítségével. A végső megoldás azonban, amely az expressziós rendszer sikeres működését minden tekintetben igazolni képes, a tie géntermék biológiai aktivitásának detektálása. Amennyiben a génterméket szekretáltatjuk, a fertőzött gazdasejt tenyészetből kinyert, sejtmentes táptalaj tie aktivitását vizsgálhatjuk. Ha a génterméket nem

- 25 ! ··*!»· • · · • ···· ·»* szekretáltatjuk, a gazdasejtek lizátumában kell a tie aktivitást detektálnunk. Mindkét esetben olyan eljárásokat alkalmazhatunk, amelyek valamely ligandum tie fehérjéhez való kötődésén alapulnak, vagy pedig a tie fehérje egyéb biológiai aktivitását detektálják.

D) A következőkben a tie fehérje származékainak, analógjainak és peptid részleteinek előállítási lehetőségeit ismertetjük.

A tie fehérje származékainak, analógjainak, és peptid részleteinek előállítása és felhasználása szintén a találmány tárgyát képezi. Az ilyen származékok, analógok, és peptidek a természetes tie fehérjéhez viszonyítva rendelkezhetnek mind megnövekedett, mind csökkent biológiai aktivitással. A találmány tárgyát képező, tie eredetű származékok, analógok, és peptidek elöállíthatóak különböző, szakember számára jól ismert eljárások segítségével. A találmány felöleli a tie fehérje megváltoztatását célzó manipulációs eljárásokat mind nukleinsav, mind fehérje szinten. A szakirodalomból közismert szintetikus peptid előállítási eljárások alkalmasak tie peptidek előállítására is. Fehérje szinten sokféle kémiai módosítást hajthatunk végre, szakember számára jól ismert eljárások alapján, annak érdekében, hogy a tie fehérje különböző származékait, analógjait, vagy peptid részleteit előállítsuk. Ilyen eljárásként megemlíthetjük például, anélkül hogy igényünket az ismertetettekre kívánnánk korlátozni, az endopeptidázokkal végrehajtott specifikus hasítási eljárásokat (pl. tripszines, kimotripszines, V8 proteázos és hasonló hasítások), a brómciános hasítást, az exopeptidázos hasításokat, acetilezést, formilezést, oxidációt, stb.

E) A következőkben az anti-tie ellenanyagok előállítási lehetőségeit ismertetjük.

··· • · ·

-26A tie fehérjét és származékait felismerő poliklonális és monoklonális ellenanyagok szintén a találmány tárgyát képezik. Szakember számára sok különféle eljárás ismeretes melyek segítségével a tie fehérje különböző epitópjai ellen poliklonális ellenanyagot termeltethetünk. Különböző állatokat immunizálhatunk tie fehérje, vagy szintetikus tie peptidek beinjektálása útján, ellenanyag előállítás céljából. Ilyen állatok lehetnek például, igényünk korlátozása nélkül, nyulak, egerek és patkányok. Az immunizált állat fajtájától függően különféle adjuvánsokat alkalmazhatunk az immunválasz erősítése érdekében. Ilyen adjuvánsok lehetnek például, anélkül, hogy igényünket az ismertetettekre kívánnánk korlátozni, a (komplett és nem komplett) Freund adjuváns, szervetlen eredetű gélek, mint például az alumínium hidroxid gél, olyan felületaktív anyagok, mint például a lizolecitin, a pluron polialkoholok, polianionok, olaj emulziók, kulcslyuk kagyló (keyhole limpet) hemocianinok, dinitrofenol, valamint potenciálisan hasznos humán adjuvánsok, mint például a BCG (Bacillus CalmetteGuerin) és a Coiynebacterium parvum.

A tie fehérje epitópjai ellen termeltethetünk monoklonális ellenanyagot minden olyan eljárás segítségével, amely lehetővé teszi ellenanyag molekulák termeltetését tenyészetben fenntartott folytonos sejtvonalak segítségével. Ilyen eljárásként megemlíthetjük például, igényünket nem korlátozva, a hibridóma technikát, melyet elsőként Kohler és Milstein írt le (Natúré, 256: 495-497, 1975), az újabban, Kosbor és munkatársai által kifejlesztett humán B-sejtes hibridóma technikát (Immunology Today, 4: 72, 1983), valamint a Colé és munkatársai által kifejlesztett EBV-hibridóma technikát (Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, 77-96. Alán R. Liss, Inc. 1985).

• ·

- 27 Az ismert eljárások alapján előállíthatunk olyan ellenanyag fragmentumokat is, melyek a tie molekula idiotípusait tartalmazzák. Ilyen fragmentumok lehetnek például, anélkül hogy igényünket az ismertetettekre korlátoznánk, az F(ab’)2 fragmentum, amelyet az ellenanyag molekula pepszines emésztése útján állíthatunk elő; az Fab’ fragmentum, amelyet az F(ab’)2 fragmentum diszulfidhídjainak szétredukálásával állíthatunk elő; valamint a két Fab fragmentum, melyeket az ellenanyag molekula egyidejű papainos és redukálószeres kezelése útján állíthatunk elő.

A tie molekulát felismerő ellenanyagokat felhasználhatjuk az érett tie molekula, a tie prekurzor, valamint a tie szubkomponensek kvalitatív és kvantitatív kimutatására, ezen polipeptidek affinitás kromatográfiás tisztítására, valamint a tie fehérje bioszintézisének, metabolizmusának és funkciójának kutatására. Az ilyen vizsgálati eljárásokban a tie-specifikus szignál előállítására és amplifikálására felhasználhatjuk a tie tirozin kináz biológiai aktivitásának detektálását is. A tie fehérjét felismerő ellenanyagokat felhasználhatjuk diagnosztikai és terápiás célokra is.

F) A következőkben a tie fehérje, a tie-t kódoló nukleinsav molekulák és az anti-tie ellenanyagok felhasználási lehetőségeit ismertetjük.

A jelen találmány tárgyát képező készítmények számos eljárásban alkalmazhatóak, ezek közé tartoznak a tie fehérje, a tie analógok és származékok, a tie-t kódoló nukleinsav molekulák, antiszensz nukleinsav molekulák és az anti-tie ellenanyagok diagnosztikai és/vagy terápiás felhasználását célzó eljárások.

A tie-t kódoló nukleinsav molekulák, és ezek fragmentumai felhasználhatóak hibridizációs próbaként, tie mRNS-ek detektálására és mennyiségi meghatározására. A valamely ismert gén szekvenciájának, vagy szekvencia részletének kimutatását célzó, nukleinsav hibridizációs próbák • · · · · • ♦ · · • · · · · · • · · · · » • · ·· · ··

-28alkalmazásával járó vizsgálati eljárások szakember számára jól ismertek. A tie mRNS mennyisége indikatív lehet kezdődő és/vagy folyamatban levő neopláziával, és egyéb emberi megbetegedések kialakulásával és/vagy előrehaladásával kapcsolatosan. Éppen ezért, mindazok a vizsgálati eljárások, melyek képesek a tie mRNS detektálására és mennyiségi meghatározására, komoly diagnosztikai jelentőséggel bírhatnak.

Az antiszensz tie RNS molekulák hasznosak lehetnek tie mRNS-ek transzlációjának terápiás inhibíciójára olyan esetekben, mikor a terápiás célok között szerepel a tie aktivitás eliminációja, vagy csökkentése. A tie antiszensz RNS-t ennek értelmében felhasználhatjuk például tie antagonistaként, olyan betegségek kezelésénél, melyekben a tie fehérje, például túltermelése következtében, kór okként szerepel.

Ezen felül a tie antiszensz RNS-ek hasznosak lehetnek a tie hatásmechanizmusának felderítésében is. A tie-t kódoló nukleinsav molekulákat, ahogy azt a leírás egyéb helyein is tárgyaljuk, felhasználhatjuk rekombináns tie fehérjék és származékaik előállítására.

Az anti-tie ellenanyagokat a legkülönbözőbb eljárásokban használhatjuk fel a tie fehérje kimutatására és mennyiségi meghatározására. A tie fehérje különböző doménjait felismerő ellenanyagokat felhasználhatjuk például tie immunoassay-k kifejlesztésére, illetőleg a tie fehérje mennyiségének immunohisztokémiai meghatározására. Az ilyen vizsgálati eljárásoknál a tie fehérje tirozin kináz aktivitását enzimatikus amplifikációs reakcióként használhatjuk a tie specifikus szignál kialakításakor. Az anti-tie ellenanyagok hasznosak lehetnek a sejtfelszíni tie fehérjemennyiség meghatározásához is.

Olyan ellenanyagokat is előállíthatunk, amelyek tie ligandum agonistaként, vagy antagonistaként viselkednek. Ezek segítségével lehetővé

- 29válik a tie aktivitás szabályozása. Mivel megállapítható, hogy a tie fehérje az erek belső endotélfelszínére lokalizálódik, a tie fehérje extracelluláris doménjének, fragmentumainak, vagy analógjainak, ligandumainak, vagy anti-tie extracelluláris dómén ellenanyagoknak a véráramba juttatása révén lehetőség nyílik a tie aktivitás és funkció in vivő megváltoztatására, ami hatással lehet az endotél sejtek viselkedésére és bizonyos betegségek kialakulására és/vagy lefolyására.

Gének in vivő endotélsejtekbe juttatása és expressziója is elképzelhető, ami a tie aktivitás további módosítását teszi lehetővé olyan expressziós vektorok alkalmazásával, amelyek gondoskodnak a tie fehérje és különböző funkcionális származékai endotélsejtekben történő termelődéséről. Amennyiben például olyan receptor tirozin kinázokat. melyekben a tirozin kináz domént in vitro mutagenézis segítségével specifikusan inaktiváltuk, kellő mértékben túltermeltetünk, ezek a receptor funkció domináns inhibitoraiként viselkednek. A tie promóterének és szabályozó régióinak megklónozása lehetővé teszi, hogy a tie gént in vivő főleg az endotél sejtekben expresszáltassuk.

G) A következőkben a tie fehérje molekuláris biológiájával kapcsolatos ismereteket adunk közre.

A tie fehérje egyszerre négy különböző gén szupercsaládhoz tartozik, mivel mind EGF-szeru, mind immunoglobulinszeru, mind fibronektinszeru, mind pedig tirozin kináz domént tartalmaz. Az ismert receptor tirozin kinázok között a tie egyedülálló abban a tekintetben, hogy az extracelluláris doménjében tartalmaz mind az immunoglobulin, mind a fibronektin, mind pedig az EGF homológia szupercsaládokra jellemző szekvencia motívumokat.

-30Az EGF-szerű dómén a fehérje-fehérje külcsönhatásokban résztvevő sejtfelszíni és extracelluláris fehérjék általánosan meglévő szerkezeti sajátsága (Davis, The New Biologist, 2: 410-419, 1990). Sok - mind oldott, mind sejthez kötött ligandummal rendelkező - transzmembrán receptor tartalmaz EGF-szerű ismétlődéseket. Ezen felül, a trombomodulin nevű endoteliális sejtfelszíni glikoprotein hat EGF-szerű ismétlődése közül kettőről kimutatták hogy a trombin megkötéséért felelősek (Steams és mtsai., J. Bioi. Chem., 264: 3352-3356, 1989), valamint azt is kimutatták, hogy' a nyirokcsomó vezérlő receptor EGF-szerű doménje részt vesz a limfociták fokozottan endoteliális vékony erekhez történő tapadásában (Siegelman, és mtsai., Cell, 61: 611-22, 1990). Ehhez hasonlóan bizonyos homeotikus gének, mint például a Drosophila melanogaster Notch, delta és crumbs elnevezésű génjei (Wharton és mtsai., Cell, 43: 567-581, 1985; Vissin és mtsai., EMBO J., 6: 3431-3440. 1987; Tepass, és mtsai.. Cell, 61: 787-799, 1990), valamint a Caenorhabditis elegáns linl2 és glp-1 elnevezésű génjei (Yochem és mtsai., Natúré, 335: 547-550, 1988: Yochem és Greenvald, Cell, 58: 553-563, 1989) olyan nagy transzmembrán fehérjéket kódolnak, melyek tartalmaznak néhány EGF-szerű ismétlődést. Ezek a fehérjék részt vesznek bizonyos sejtek közötti kommunikációt igénylő, a sejtek sorsát alapvetően befolyásoló döntésekben. Vannak arra utaló további genetikai bizonyítékok is. hogy a különböző EGF-szerű fehérje részletek részt vesznek különböző fehérje-fehérje kölcsönhatásokban (Kelley és mtsai., Cell, 51: 539-548, 1987). Sokszoros EGF-szerű ismétlődéseket találhatunk különböző extracelluláris mátrix fehérjékben is, melyek közreműködnek a sejtek összetapadásában. Ilyenek például a laminin és a tenascin. Ezen felül, az EGF-szerű ismétlődések általános szekvencia motívumok a véralvadásban szerepet játszó szekretált

- 31 fehérjék esetében, mint például a VH-es, IX-es és a X-es véralvadási faktor, a protein C és S, valamint a szöveti és az urokináz típusú plazminogén aktivátorok (Fürié és Fürié, Cell, 53: 505-518, 1988). Az urokináz típusú plazminogén aktivátorról kimutatták, hogy receptorhoz való kötődéséért EGF-szerű doménje a felelős Apella és mtsai., J. Bioi. Chem.. 262: 44374440, 1987).

A tie fehérje EGF-szerű ismétlődései a szokásos hat cisztein helyett nyolcat tartalmaznak. Igaz ugyan, hogy a laminin EGF-szerű ismétlődéseiben is nyolc ciszteint találhatunk, mégis a tie ismétlődések nyilvánvalóan egymásra hasonlítanak a leginkább. A tie ismétlődéseinek egyike sem tartalmaz aszparagin/aszparaginsav s-hidroxilációra, vagy kálciumkötésre utaló konszenzus szekvencia elemeket. Az a tény, hogy sikerült izolálni olyan tie cDNS kiónt, amely egy olyan fehérjét kódol, melyből az első EGF-szeru ismétlődés hiányzik, ama utal, hogy ezek a domének különböző exonokon helyezkednek el, valamint azt is valószínűsíti, hogy a gén ismétlődéses szerkezete a tie receptor tirozin kináz molekuláris evolúciója során exon duplikációval keletkezett. Ezen felül, az EAhy926 sejtekben megfigyelt különböző tie mRNS formák jelenléte is arra utal, hogy a szervezetben, valószínűleg az alternatív mRNS illesztési mechanizmusnak köszönhetően, a receptor több különböző formában termelődik.

Az immunoglobulin és a fibronektin szupercsalád szintén tartalmaz olyan glikoproteineket, amelyek részt vesznek az extracelluláris fehérjefehérje kölcsönhatásokban, mind oldott, mind pedig sejthez kötött molekulák vonatkozásában (Williams és Barclay, Ann. Rév. Immunoi., 6: 381-405, 1988). Sok receptor tirozin kináz, mint például a PDGF, a CSF-1 receptorok, a c-kit proto-onkogén, valamint az FGF receptorok

- 32 tartalmaznak immunoglobulin-szerű (Ig-szerű) hurkokat (Ullrich és Schlessinger, Cell, 61: 243-54, 1990). sok esetben egy bizonyos fehérjében található mind immunoglobulin, mind III-as típusú fibronektin dómén. Újabban fedezték fel, hogy ez a multidomén szerkezet jellemző néhány receptor tirozin kinázra is (O’Bryan és mtsai., Mól. Cell. Bioi., 11: 50165031, 1991; Rescigno és mtsai., Oncogene, 6: 1909-1913, 1991). Mivel feltételezések szerint az immunoglobulin és az FN III ismétlődések közös evolúciós eredetűek (Bazan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 6934-6938, 1990), érdekes megjegyezni, hogy a tie fehérje ismétlődéses régiója hordozza mindkét említett osztály jellemzőit. Az EGF, az immunoglobulin és a fibronektin-szerű szerkezeti motívumok együttes jelenléte a tie fehérje extracelluláris doménjében arra utal, hogy a tie receptor több különböző extracelluláris molekulával is képes lehet kölcsönhatásba lépni.

A tie gén lokalizációja az Ip33-p34-es régióban arra utal, hogy a tie lókusz a jun lókuszhoz képest telomerikus elhelyezkedésű, mivel a PB5-5 jelű hibrid tie negatív és jun pozitív (Haluska és mtsai.. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 2215-2218, 1988). Az Ip33-p34-es kromoszóma régió érintve van különböző rákos megbetegedésekkel kapcsolatos deléciókban, ilyenek például a neuroblasztóma, malignus limfóma, glióma és mások (Trent és mtsai., Cytogenet. Cell Génét., 51: 533-562, 1989).

Korábbi és legújabb kísérleteink egyaránt arra utalnak, hogy a tie receptor mRNS-e szövettenyészetben csak néhány tumoros sejtvonalban expresszálódik. Ezzel szemben, valamennyi vizsgált egér és emberi magzati szövetben sikerült egyértelműen expressziót igazolni, Northem biot technika alkalmazásával. Ez az expressziós specificitás összhangban van azzal a feltételezéssel, hogy a szövetekben detektált expresszió endotél sejtekből származik. Erre utal a tie mRNS kimutatása az EA.hy926 és a

-33 PAEC endoteliális sejtvonalakban, valamint humán endotélsejtek elsődleges tenyészetében. Ezen felül emberi és egér szövetek in sitii hibridizációs analízise is megerősíti a tie mRNS jelenlétét az endotélsejtekben.

A tie mRNS expressziójával kapcsolatos fent ismertetett megfigyelések arra utalnak, hogy a tie géntermék jelenléte jellemző egyrészt a bipotenciális hematopoietikus sejtvonalakra, amelyek rendelkeznek mind az eritroid, mind pedig a megakarioblasztikus differenciáció képességével, másrészt pedig az endoteliális eredetű sejtekre. Már több differenciációval kapcsolatos antigénről kimutatták, hogy jelen vannak mind megakarioblaszt, mind pedig endoteliális eredetű sejtekben. Az egyik ilyen antigén a vérlemezke glikoprotein Illa (Blood, 72: 14781486, 1988; Kieffer és mtsai., Blood 72: 1209-1215, 1988; Berridge és mtsai., Blood 66: 76-85, 1985). A tie mRNS expressziójának specificitása meglehetősen elgondolkodtató, mivel az EGF-szerű szekvencia motívumok általánosak a hemosztázist szabályozó fehérjéknél, csakúgy, mint az endotéliumhoz való kapcsolódást előidéző fehérjék esetében.

A találmányt a következő példákkal kívánjuk megvilágítani.

1. példa

Az első példában a tie fehérjét kódoló cDNS kiónok izolálását és jellemzését írjuk le.

Egy oligo-dT láncindításos módszenei, emberi HEL sejtekből lgtll bakteriofágban készített (oligo-dT prímed) cDNS könyvtárat (esetünkben Dr. Mortimer Poncz ajándéka, Childrens Hospital of Philadelphia, PA; Poncz és mtsai., Blood 69: 219-223, 1987), valamint egy statisztikus láncindításos módszerrel készített (random prímed), humán endotélsejt • · · · • ♦·· • · · ···· « · · -34cDNS könyvtárat (pl. Clontech Cat. #1070b) szkrínelünk a JTK14 cDNS fragmentummal, melyet K.562 leukémia sejtekből izolált, poliadenilált RNS reverz-transzkripciója utáni PCR-es amplifikációval állíthatunk elő (Partanen és mtsai., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 8913-8917, 1990). A pozitív plakkokat a Sambrook és mtsai. által szerkesztett kézikönyben (Molecular cloning - a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) leírtak alapján azonosítjuk és tisztítjuk. A lambda bakteriofágokból a cDNS inszerteket EcoRl fragmentumként hasítjuk ki, majd a GEM3Zf(+) plazmádba (Promega) szubklónozzuk őket. A teljes tie kódoló régiót izoláljuk mindkét könyvtárból. A HEL könyvtárból származó átfedő kiónokat (esetünkben a HE 11-1 jelűt, amely az 1. ábrán látható szekvenciából a 62-3845. nukleotidokat; és a 12a jelűt, amely az 1-2446. nukleotidokat tartalmazta) didezoxi láncterminációs módszerrel megszekvenáljuk, a kapott szekvencia adatok alapján tervezett láncindító oligonukleotidok {primerek} segítségével. A vizsgált cDNS-ek minden részletét mindkét szálon megszekvenáljuk. A kapott szekvenciákat például a GCG programcsomag (Devereux és mtsai., Nucleic Acids Rés., 12: 387395, 1984) és az Apple Maclntosh-ra írt Prosite program segítségével analizáljuk.

Egy PCR alapú klónozási eljárással, K.562 sejtekből származó cDNSből izolált 200 bázispár (továbbiakban: bp) hosszúságú tie cDNS fragmentumot hibridizációs próbaként használva szkrínelünk egy oligo-dTvel indított, humán eritroleukémia cDNS könyvtárat és egy statisztikus láncindításos módszerrel készített, humán endotélsejt cDNS könyvtárat. A HEL könyvtárból izolált kiónok (esetünkben a HE11-1 és a 12a jelzésűek) szekvencia analízise alapján egy 1138 aminosav hosszúságú nyitott leolvasási fázisra bukkanhatunk (1. ábra). Az 1. ábrán megjelölt • · · ·

- 35 ·· · · • · ♦ • » · · • · · • ••· ·· transzlációs iniciátor metionin kódont tipikus konszenzus szekvencia veszi körül (Kozák, Nucleic Acids Rés., 12: 857-872, 1984), és hidrofób aminosavak kódonjainak sorozata követi, ami az endoplazmatikus retikulumba történő transzlokációért felelős szignál peptid szekvenciákra jellemző. A leolvasási fázis 214. aminosavát követően egy olyan 130 aminosavból álló régiót találunk, amely 24 ciszteint tartalmaz. Ezt a régiót három ismétlődő homológ doménre oszthatjuk fel, melyek mindegyike nyolc-nyolc ciszteint tartalmaz (2A. ábra). A 2A. ábrán láthatjuk még a cisztein-gazdag tie domének összehasonlítását az epidermális növekedési faktor (EGF) és a CRIPTO elnevezésű növekedési faktor fehérjékkel, valamint a következő fehérjék EGF-szerű ismétlődéseivel: laminin (A lánc), Notch {Drosophila melanogaster) és Linl2 (Caenorhabditis elegáns') egyedfejlődés szabályozó fehérjék, valamint a IXa véralvadási faktor. A tie és az EGF család között megfigyelhető szignifikáns szerkezeti hasonlóságok lehetővé teszik, hogy a tie cisztein-gazdag ismétlődéseit besoroljuk az EGF-szerű ismétlődések családjába. Mindazáltal a tie ismétlődések jobban hasonlítanak egymásra, mint az EGF-szerű ismétlődések családjának többi tagjára. Ez különösen szembeötlő, ha az ismétlődések aminoterminális végét vizsgáljuk, mivel a tie ismétlődésekben itt található három-három cisztein más EGF ismétlődésekben nem konzervált (2A. ábra). Az olyan cDNS kiónok mellett, amelyek három EGF ismétlődést tartalmaznak, izolálhatunk a HEL sejtekből készített cDNS könyvtárból olyan tie cDNS kiónt is (egy ilyen kiónt izoláltunk), amelyből az első EGF ismétlődés hiányzik (az 1. ábrán a nyílhegyek közé eső szakasz), anélkül, hogy a leolvasási fázis megváltozna. A tie fehérje extracelluláris doménjének aminoterminális régiója gyenge, ámde szignifikáns homológiát mutat a csirke N-CAM fehérje aminoterminális

-36• · ···· • · ♦ • ··· • · • · * · · végével (Cunningham és mtsai., Science, 236: 799-806, 1987). Csakúgy, mint az N-CAM esetén, találunk az említett régióban egy olyan cisztein párt, melyet az immunoglobulin szupercsaládra jellemző konszenzus szekvencia motívumok vesznek körül (Williams és Barclay. Ann. Rév. Immunoi., 6: 381-405, 1988; az 1. ábrán az Igl-es régió). Ezen felül, a három EGF ismétlődéstől karboxiterminális irányban, találhatunk még két pár ciszteint. Az első cisztein pár körüli aminosav szekvencia további homológiát mutat az immunoglobulinszeru doménekkel (az 1. ábrán az Ig2 régió). Az Ig2 domént követő extracelluláris régiót (amely az egyik említett cisztein párt is magába foglalja) három ismétlődésre oszthatjuk fel, melyek homológiát mutatnak a III-as típusú fibronektin (FNIII) ismétlődésekkel. A 2B ábrán láthatjuk a tie fehérje három FNIII ismétlődését, valamint azok összehasonlítását a humán LAR foszfotirozin foszfatáz FNIII ismétlődéseivel (Streuli és mtsai., J. Exp. Med., 168: 1553-1562, 1988). Érdekes módon, az említett három ismétlődés közül a második (FN2) tartalmaz egy cisztein párt, csakúgy mint néhány egyéb, immunoglobulin doménokra emlékeztető sajátságot (2B. ábra), és ily módon az FNIII ismétlődés és az immunoglobulin dómén közötti átmenetnek tekinthető.

Az extracelluláris doménben találhatunk öt potenciális N-glikolizációs konszenzus helyet (NXS/T, ahol X= bármely aminosav). Ezek egyike sem helyezkedik el EGF ismétlődésben. A 761-787. aminosavak hidrofób régiót alkotnak a szekvencián belül, ami feltehetőleg a receptor fehérje transzmembrán doménjének felel meg. Ezt a régiót, feltételezhetően már a polipeptid citoplazmatikus oldalán, néhány bázisos aminosav követi. A membránközeli dómén 50 aminosav hosszúságú, majd ezt követi a tirozin kináz homológiát mutató szekvenciarészlet, a 837. aminosavtól kezdődően. A tirozin kináz homológiát egy 14 aminosav terjedelmű kináz inszert * 4

-37szekvencia rövid időre megszakítja (az 1. ábrán ezt a részletet dőlt betűkkel jelöltük), majd a homológia tovább folytatódik, egészen a receptor 31 aminosav hosszúságú karboxiterminális végződéséig. Az aminosav szekvencia adatbankokban (Swissport és NBRF) folytatott keresés alapján kiderült, hogy a tie fehérje legközelebbi homológjai a következő tirozin kinázok: FGFR-1, rét, c-fms, PDGFR és c-kit (a tirozin kináz doménon belül kb. 40%-ban azonos az aminosav sorrend).

2. példa

A második példában a tie ellenes antiszérum előállítását írjuk le.

Egy 196 karboxiterminális aminosavat kódoló tie cDNS fragmentumot a pEX2 jelű, bakteriális expressziós vektorba (Stanley és Luzio, EMBO J., 3: 1429-1434, 1984) inszertálunk, belső Xhol hasítási helyet használva. Az eredményül kapott s-galaktozidáz fúziós fehérjét baktériumokkal termeltetjük, és preparatív SDS-poliakrilamid gél elektoforézises eljárással részlegesen tisztítjuk. A polipeptid csíkokat kivágjuk a gélből, felaprítjuk, majd Freund adjuvánssal keverve nyulak immunizálására használjuk őket. A harmadik ráimmunizálás utáni antiszérumot használjuk. A nukleinsav szekvencia alapján megjósolt tie aminosav szekvencia 15 aminosav hosszúságú karboxiterminális szakaszának megfelelő pepiidet megszintetizáljuk, majd glutáraldehid segítségével, kulcslyuk kagyló hemocianinnal (KLH, Calbiochem) keresztkötjük. Az immunizálást a fent leírtak szerint végezzük. Röviden: 7,5 mg hordozó fehérjét oldunk 0,5 ml; 0,1 M-os; pH 8,0-as foszfát pufferben, majd ehhez 7,5 mg pepiidet és azután 5 ml 20 mM-os glutáraldehidet adunk. Az oldatot keverés után szobahőmérsékleten, 15 percig állni hagyjuk, majd ismételten hozzáadunk

2,5 ml glutáraldehidet és megismételjük a 15 perces inkubációt szoba- 38 - ί . · · ’ ·· • · · ··» · • »*«· ·· ««« hőmérsékleten. Ezután az elegyhez hozzáadunk 0,1 ml; 1 M-os; pH 6,0-os glicin puffért, a feleslegben maradt glutáraldehid elreagáltatásának céljából, és további 10 percig kevertetjük a reakcióelegyet. A terméket kimerítően dializáljuk foszfáttal puffereit sóoldattal szemben. Az immunizáláshoz a szintetikus peptid-KLH konjugátum 1,25 mg-ját - 0,5 ml; pH 7,5-es PBSben oldva - 0,5 ml komplett Freund adjuvánssal elkeverjük. A kapott emulziót 0,1 ml-es adagokban, 10 helyre, szubkután beinjektáljuk 3 hónapos, új-zélandi fehér nyulakba. Az immunizálást azonos mennyiségű immunogénnel, kéthetenként megismételjük. A szérumot a második és az azt követő ráimmunizálásokat követően, egy-egy hét elteltével, füli vénából levett vérmintákból állítjuk elő.

3. példa

A harmadik példában a tie fehérje COS sejtekben történő expresszióját írjuk le.

A tie fehérje teljes kódoló szakaszát tartalmazó DNS fragmentumot (amelyet jelen esetben két átfedő klónból kiindulva szerkesztettünk össze) egy SV eredetű, poliemlős expressziós vektor EcoRI hasítási helyére inszertáljuk (esetünkben: SV14-2 jelű konstrukció; lásd: Stacey és Schnieke, Nucleic Acids Rés., 18: 1829, 1990). Az SV14-1 jelű konstrukciónkban hiányzik a tie szignál szekvencia első hét aminosavja, a transzláció azonban az SV-poly vektorból származó ATG kódonon iniciálódik. Az előállított expressziós vektorokat (esetünkben: SV14-2, SV14-1) a DEAE-dextrános fertőzési eljárás alkalmazásával (McCuthan és Pagano, J. Natl. Cancer Inst., 41: 351-357, 1968) COS-1 sejtekbe juttatjuk. A fertőzés után két nappal a sejteket 4 órán keresztül jelöljük ^3?Smetioninnal, 10 g/ml tunicamycin jelenlétében, illetve anélkül. A sejteket ···

-39 ezután PBS-sel mossuk és immunoprecipitációs pufferbe (10 mM Tris, pH 7,5; 50 mM NaCl; 0,5% nátrium dezoxikolát; 0,5% nonidet P40; 0,1% SDS; 0,1 TlU/ml aprotinin) kaparjuk. A lizátumokat ultrahangos kezelésnek vetjük alá, 15 percig 10.000 g-vel centrifugáljuk, majd 3 ml antiszérum hozzáadása után egy éjszakán át jégen állni hagyjuk. Ezután Protein A sepharose-t (Pharmacia) adunk az elegyhez, majd további 30 percig inkubáljuk, ázatás mellett. A keletkezett csapadékokat négyszer mossuk immunoprecipitációs pufferrel, egyszer PBS-sel, majd egyszer vízzel, az SDS-PAGE analízist megelőzően.

A tie cDNS szekvencia alapján levont strukturális következtetéseket úgy ellenőrizhetjük le, hogy a tie fehérje teljes hosszúságú kódoló régióját a pSVpoly expressziós vektor EcoRI hasítási helyére klónozzuk (esetünkben: pSV14-2 és pSV14-l jelű konstrukciók), majd ezekkel az expressziós vektor konstrukciókkal COS sejteket fertőzünk. Jelen esetben a két különböző, említett konstrukció által termelt fehérje, amint arra már utaltunk, szignál szekvenciájában ugyan különbözik egymástól, de a prekurzorokból keletkező érett fehérjék várható szerkezete azonos. Két nap elteltével a sejteket metabolikusan jelöljük, majd immunoprecipitációnak vetjük alá, vagy a várható tie aminosav szekvencia 195 karboxiterminális aminosavát tartalmazó s-galaktozidáz-tie fúziós fehérje ellen termeltetett ellenanyagokkal (esetünkben: Hl jelű antiszérum), vagy pedig a tie karboxiterminális végének megfelelő szekvenciájú 15 aminosav hosszúságú peptid ellen termeltetett ellenanyagokkal (esetünkben: MI jelű antiszérum). A 3. ábrán az immunoprecipitációval kicsapott, rádioaktív polipeptidek SDS-poliakrilamid gél elektroforézises analízisét láthatjuk. A 3A. ábrán láthatjuk, hogy a Hl immun szérum kicsapott néhány gyengén jelölt polipeptidet a nem fertőzött COS sejtek lizátumából. Ezek a polipeptidek

-40 valószínűleg nem tie eredetűek, mivel a tie mRNS nem expresszálódik COS sejtekben.

A pSV14 expressziós vektorral fertőzött sejtek esetén láthatunk ezen felül egy specifikus, 117 kD molekulatömegű polipeptidet (a 3. ábrán “tie” jelöléssel láttuk el). Ezt a tie polipeptidet a preimmun szérum és az immunogénnel blokkolt antiszérum nem csapja ki. Ezt a 117 kD-os polipeptidet a karboxiterminális peptid ellen készített MI antiszérum is felismeri (3B. ábra).

A fehérjék N-glikozilációját gátló tunikamicin jelenlétében, metabolikusan jelölt, fertőzött COS sejtek lizátumából végzett tie immunoprecipitáció kb. 105 kD látszólagos molekulatömegnél ad egy specifikus polipeptidet (a 3B. ábrán “tie*”-al jelöltük).

4. példa

A negyedik példában a tie fehérje NIH3T3 sejtekben történő expresszióját írjuk le.

A teljes hosszúságú tie cDNS-t Moloney egér leukémia vírus hosszú terminális ismétlődés promóterének szabályozása alá szubklónozzuk. Ezzel az expressziós vektorral és a pSVneol marker plazmiddal együttesen fertőzünk NIH3T3 sejteket, majd a G418 rezisztens sejtekben vizsgáljuk a tie expressziót. Egy összefolyós tálcán lévő sejteket immunobiot analízis céljából a következő pufferben lizáltatunk: 2,5% SDS; 125 mM Tris, pH

6.5. A sejt lizátumokat SDS-PAGE eljárással elektroforetizáljuk, majd nitrocellulóz membránra elektroblotoljuk. A membránt a tie karboxiterminális peptid ellen készített anti-peptid antiszérummal inkubáljuk, majd a megkötött ellenanyagokat torma peroxidázzal jelzett, sertés anti-nyúl antiszérummal (Dako) és ECL reagenssel (Amersham) • · tesszük láthatóvá. A tirozin-foszforilált fehérjéket a szakirodalomból ismert eljárással immunoprecipitáltatjuk (Frackelton és mtsai., 1991, Protein phosphorilation part B, Meth. Enzymol., 201: 79-91, Szerk.: T. Hunterand és B. M. Sefton). Röviden: egy összefolyós tálcán lévő sejteket extrakciós pufferben lizáltatunk (1% Triton X-100; 10 mM Tris, pH 7,6; 5 mM EDTA; 50 mM NaCl; 100 mM Na-ortovanadát; 1 mM PMSF), majd a lizátumokat két órán keresztül, rázatás közben, jégen inkubáljuk, agarózhoz konjugált anti-foszfotirozin ellenanyagok jelenlétében (1G2-A, Oncogene Science). Az immuno-precipitátumokat négyszer mossuk extrakciós pufferrel, majd a tirozin-foszforilált fehérjéket ImM fenil-foszfáttal eluáljuk. Az eluált fehérjéket, a fent leírtak szerint, immunobiot analízisnek vetjük alá.

A 117 kD-os tie fehérje detektálható a tie karboxiterminálisának megfelelő peptid ellen előállított antiszérummal végzett immunobiot kísérletben (4. ábra). Ezen felül, hasonló molekula tömegű, endogén tie fehérjét is kimutatható PAE (sertés aorta endoteliális) sejtekből. A tie fehérje jelenléte kimutatható a tie vektorokkal fertőzött sejtek antifoszfotirozinos immunoprecipitátumaiban is.

5. példa

Az ötödik példában a tie lókusz kromoszómális térképezését írjuk le.

Metafázisos keneteket készítünk normális humán férfi perifériális vérből származó álhártyás (buffy coat) leukocitákból, és hibridizáljuk őket, lényegében a következő publikációban leírtak szerint: Harper és Saunders, Chromosoma, 83: 431-439, 1981. Az in situ hibridizációhoz kb. 1 mg HE11-1 cDNS inszertet jelölünk nick-transzlációval, négy ³H-jelzett nukleotid-trifoszfátot (NTP) használva, 4-8x10 cpm/mg specifikus aktivitást elérve. A hibridizáció végrehajtása után a tárgylemezeket 39 °C-

-42on mossuk, 50% formamidot tartalmazó 2xSSC pufferben, majd Kodak NTB2 nuclear track emulzióval, 12 napig, 4 °C-on exponáljuk őket. A tárgylemezeket Kodak Dektol előhívóval hívjuk elő és Kodafix oldattal fixáljuk. A kromoszómákat először Wright-Giemsa festékkel G-sávozzuk (G-banding', Cannizarro és Emanuel, Cytogenet. Cell Génét., 38: 308-309), és amennyiben szükséges, újra sávozzuk a tripszin-Giemsa (GTG) módszerrel.

A radioaktívan jelzett tie hibridizációs próba normál humán metafázisos kromoszómákhoz történő in situ hibridizációja segítségével a tie gént az 1. kromoszómára lokalizálhatjuk. Jelen esetben a vizsgált 145 metafázisos keneten összesen 317 darab kromoszómákon lokálizálódott szemcsét figyeltünk meg. Az azonosított szemcsék harmincnégy százaléka (109/317) volt az 1. kromoszómára lokalizálható, az 1. kromoszómára lokalizált szemcsék közül pedig 69%-ot (75/109) az lp33-34 régióba lokalizáltuk. Az 1. kromoszómán végrehajtott szemcse lokalizáció eredményét az 5. ábra szemlélteti, ahol minden feltüntetett pont három szemcsének felel meg. A kapott eredmény tovább szűkíti a tie gén lokalizációját az 1 p33-34 régióba, ezen belül is a szemcsék előfordulásának sűrűsége az lp33 és 34-es sávok határának közelében volt a legmagasabb. A megfelelően kiválasztott ember-egér szomatikus hibrid sejtvonalak segítségével végzett kromoszómális lokalizáció szintén az 1. kromoszómára lokalizálja a tie lókuszt.

6. példa

A hatodik példában leukémia sejtvonalakban és endotélsejtekben végrehajtott tie mRNS expressziós kísérleteket mutatunk be.

• · ·

-43 A példában leírt kísérletekhez használt leukémia sejtvonalakat már megelőző publikációkban leírták; K562 (Lozzio és Lozzio, Blood, 45: 321334, 1975), HL-60 (Collins és mtsai., Natúré, 270: 347-349, 1977), HEL (Martin és Papayannopoulou, Science, 216: 1233-1235, 1982), Dami (Greenberg és mtsai., Blood, 72: 1968-1977, 1988), MOLT-4 (Minowada és mtsai., J. Natl. Cancer Inst., 49: 891-895, 1972), Jurkat (Schwenk és Schneider, Blut, 31: 299-306, 1975), U937 (Sundstrom és Nilsson, Int. J. Cancer, 17: 565-577, 1976), KG-1 (Koeffler és Golde, Science, 200: 11531154, 1978), JOK-1 (Andersson és mtsai., Expression of differentiated functions in cancer cells, 239-245, Raven Press, New York, szerk: R. F. Revoltella, 1982), ML-2 (Gahmberg és mtsai., Gene expression during normál and malignant differentiation, 107-123, Academic Press, London, szerk.: L. C. Andersson és mtsai., 1985), valamint RC-2A (Bradley és mtsai., Br. J. Haemat., 51: 595, 1982). A leukémia sejteket 10% FCS-t és antibiotikumokat tartalmazó RPMI táptalajban tenyésztjük. A Dami sejteket 10% lószérumot tartalmazó Iscoves módosított DMEM táptalajban tenyésztjük. Jelen esetben egy első passzálású humán köldök véna endotélsejtek és A549 jelű tüdő karcinóma sejtek (Edgell és mtsai., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 50: 3734-3737) fúziójával előállított, permanens hibrid sejtvonalat (EA.hy926) 10% FCS-t és antibiotikumokat tartalmazó DMEM-HAT táptalajban tenyésztettünk. A PAE sejteket (esetünkben Dr. Léna Claesson-Welsh ajándéka, Ludwig Institut fór Cancer Research, Uppsala, Svédország) 10% FCS-t tartalmazó, Ham-féle FI2 táptalajban növesztjük. A poli(A)⁺ RNS frakciót a Sambrook és mtsai. által szerkesztett “Molecular cloning - a laboratory manual”-ban (Cold Spring Harbor Laboratory Press) leírtak szerint izoláljuk a különböző sejtvonalakból. A poli(A)⁺ RNS mintákból öt-öt grammot formaldehid tartalmú agaróz gélen • ·

-44elektroforetizálunk és a szokásos körülmények között blotoljuk (lásd Sambrook és mtsai., fent). A megfelelő hibridizációs próbát, esetünkben a HE11-1 cDNS klón inszertjét a statisztikus láncindításos módszenei megjelöljük, és a biotokhoz hibridizáljuk. A következő hibridizációs elegyet alkalmazzuk: 50% formamid; 5xDenhardt oldat (a lOOxDenhardt oldat a következő összetevőket tartalmazza: Ficoll, polivinilpirrolidon, marha szérum albumin, mindegyik 2%-os koncentrációban); 5xSSPE (3 M NaCl; 200 mM NaH₂PO₄.H₂O; 20 mM EDTA; pH 7,0); 0,1% SDS (nátrium-dodecilszulfát); valamint 0,1 mg/ml ultrahangozott lazac sperma DNS. A hibridizációt 42 °C-on végezzük, 18-24 órán keresztül. A filtereket ezután lxSSC-ben (150 mM NaCl; 15 mM Na-citrát; pH 7,0) és 0,1% SDSben, 65 °C-on mossuk, majd Kodak XAR-5 filmmel exponáljunk.

A 6. ábrán a tie mRNS tíz leukémia sejtvonalbeli expressziójának analízisét láthatjuk. Csak a HEL eritroleukémia sejtek, a KG-1 mieloid leukémia sejtek, valamint a Dami megakarioblaszt leukémia sejtek expresszálják a 3,8 kb hosszúságú tie cDNS próbával detektált 4,4 kb hosszúságú tie mRNS-t. A Jurkat és MOLT-4 T-sejt leukémia, a HL60 promielocita leukémia, az U937 és RC-2A monocita leukémia, a JOK-1 hajas sejt leukémia, és az ML-2 mieloid leukémia sejtek tie mRNS-re nézve negatívnak bizonyultak. A tie mRNS indukciója TPA kezelés után aminek következtében a sejtek megakarioblasztoid differenciáción mennek keresztül - K562 sejtek esetén is megfigyelhető. Érdekes módon a sertés aorta endotélsejtek (PAE) és a hibrid humán endotélsejtek (EA.hy926), melyekről leírták, hogy több endoteliális markert is expresszálnak in vitro (Edgell és mtsai., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 50: 3734-3737, 1983; Emeis és Edgell, Blood, 71: 1669-1675, 1988), a tie mRNS-t nagy mennyiségben expresszálják (7. ábra). Az EA.hy926 sejtvonalat humán köldök véna

-45 endotélsejtek és A549 jelű tüdő karcinóma sejtek fúziójával állították elő. Az A549 sejtek tie mRNS expresszióra nézve negatívnak bizonyultak. Az EA.hy926 sejtek a 4,4 kb-os mRNS-en kívül expresszálnak még 3,9; 4,2 és

4,7 kb hosszúságú tie mRNS származékokat is. A tie mRNS expresszió különböző sejtvonalakban végzett Northem biot analízises vizsgálatának eredményeit az 1. táblázat foglalja össze.

7. példa

A hetedik példában tie mRNS expressziójának vérerekben történő, in situ detektálását írjuk le.

A klónozott humán tie cDNS - tirozin kináz doménen kívüli, más receptor tirozin kinázokkal csekély homológiát mutató - kiválasztott fragmentumait használjuk in situ hibridizációs próbaként, a tie mRNS jelenlétének kimutatására. Jelen esetben a teljes hosszúságú cDNS klón egyik Smal fragmentumát használtuk (a 268-1767. nukleotidokat tartalmazta), amely a tie fehérje extracelluláris doménjét kódolja, majd ezt tovább emésztettük kisebb DNS fragmentumokká, PstI és Sáli endonukleázokkal. Az in situ hibridizációhoz használt próbákat Sdeoxy(tio)ATP-vel jelöljük (Feinberg és Vogelstein, Anal. Biochem., 132: 6-13, 1983). Hasonlóképpen megjelölünk lambda fág DNS BglI-es emésztésével előállított 100-790 bp hosszúságú DNS fragmentumokat is, és negatív kontroll próbaként használjuk őket. Esetünkben az abortált magzati eredetű mintákat a Központi Egyetemi Kórház és a Turkui Egyetem (Turku, Finnország) által létrehozott közös etikai bizottság engedélyével szereztük be. Az in situ hibridizációs kísérleteket a korábbiakban leírtak szerint végezzük (Sandberg és Vuorio, J. Cell Bio!., 104: 1077-1084). Röviden: terápiás abortuszból származó, 15-19 hetes humán magzati szövetmintákat ’ · · ·» • · · · , • · · · · · •··· · · ,

-461. táblázat A tie mRNS expressziója különböző' sejtvonalakban

Sejtvonal

Expresszió mértéke

Endoteliális sejtvonalak

EA-hy926 endoteliális hibrid sejtvonal PAE sertés aorta endoteliális sejtek

Leukémiás sejtvonalak

Dami megakarioblasztos leukémia

HEL eritroleukémia

KG-1 akkut mielogén leukémia

K582 CML

K582 + TPA

HL-60 promielocitikus leukémia

U-937 monocitikus leukémia

MOLT-1 T-sejtes leukémia

Jurkat limfóma

JOK-1 hajas sejt leukémia

ML-2 mieloid leukémia

RC-2A monocitikus leukémia

Egyéb sejtvonalak

A549 tüdő karcinóma

U1690 kis sejtes tüdő karcinóma

G358 kis sejtes tüdő karcinóma

MCF-7 mell adenokarcinóma

Y79 retinoblasztóma

SK-NEP-1 Wilms tumor

Kelly neuroblasztóma

PA-1 petefészek teratokarcinóma

RD rabdomioszarkóma

A204 rabdomioszarkóma

NIH3T3 egér fibroblaszt sejtvonal

COS-1 majom vese fibroblaszt sejtvonal • · • ·

-47formaldehiddel fixálunk, majd metszet készítéshez paraffinba ágyazzuk őket. A metszeteket proteináz K-val és sósavval előkezeljük, majd megacetiláljuk. A hibridizációkat 24 órán keresztül, 42 °C-on, ³⁵Sdezoxi(tio)ATP-vel jelzett próbákkal végezzük, majd a metszeteket mossuk és 5-25 napon keresztül, +4 °C-on autoradiografáljuk. Ezt követően a metszeteket hematoxilinnel megfestjük.

A tie mRNS expresszióját a különböző szövetekben például 15-19 hetes humán magzati szöveteken, in situ hibridizációval tanulmányozhatjuk. Az endotél sejtvonalakban tapasztalt tie expresszióval összhangban, a tie mRNS jelenléte a vese közepes és nagy csatornáinak falai mentén figyelhető meg (8. ábra). A negatív kontrollként használt, jelzett lambda DNS nem ad a háttértől megkülönböztethető hibridizációs jelet.

8. példa

A nyolcadik példában tie mRNS expressziójának egér embriókban történő vizsgálatát írjuk le.

Két - post coitum (p.c.) 10, illetve 11 napos, egér embrionális mRNSből készített - lgtlO-es cDNS könyvtárból (esetünkben Dr. Brigitte Galliot ajándéka, Zentrum für Molekularbiologie Heidelberg, Németország) származó, kb. 100 plakkot szkrínelünk a humán tie receptor cDNS egyik Smal fragmentumával (pl. a 155-1765. nukleotidokat tartalmazó fragmentummal; ez a cDNS fragmentum a tie receptor extracelluláris részének első immunoglobulin doménjét és az I-III-as EGF-szerű doménjeit kódolja), valamint a 3,8 kb-os EcoRI tie cDNS fragmentummal (Partanen és mtsai., Mól. Cell. Bioi., nyomtatás alatt). Ezek a cDNS fragmentumok csak csekély homológiát mutatnak más ismert génekkel. A hibridizációs próbát (a- P)dCTP-vel jelöljük, a statisztikus láncindításos módszert • · · ··· · » ·······« • ···· ·· ...

-48 alkalmazva. A fágfertőzött lemezekről készített nitrocellulóz replikátumokat a következő összetételű elegyben hibridizáljuk: 50% ioncserélt formamid; 5xDenhardt oldat; 5xSSPE; 0,1% SDS; 100 mg/ml egy szálú DNS. Megfelelő számú (esetünkben: hét) pozitív kiónt izolálunk, ezek közül néhányat (esetünkben: négyet) szubklónozunk pGEM 3Zf(+) (Promega) vektorba és megszekvenáljuk őket. A DNS szekvenálást Sanger és mtsai. didezoxi láncterminációs módszere alapján végezzük (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74: 5463-5467, 1977). A szekvenciákat mindkét irányból haladva határozzuk meg, az univerzális pGEM szekvenáló láncindító oligonukleotidokat használva. A nagy fragmentumok belsejében található szekvenciákat, valamint az összes fragmentum komplementer szálainak szekvenciáit oly módon határozzuk meg, hogy az előzőleg leolvasott szekvenciákból kapott információ alapján szintetizáltatjuk meg a szükséges láncindító oligonukleotidokat. Jelen esetben hibridizációs próbaként a D10E5 és a 1C1D jelű egér tie cDNS plazmid kiónok, két nem átfedő inszertjét használtuk (10. ábra). A vizsgált p.c. 8-14 napos egér embriók CBA és NMR egérfajták keresztezéséből származtak. Az embriók korát úgy határozzuk meg, hogy azt a napot tekintjük a 0. napnak, amikor a kopulációs dugó megjelenését észleljük (a kopuláció becsült ideje hajnali 2 óra volt). A terhes egereket cervikális diszlokáció útján öljük meg, az embriókat kivesszük, majd azonnal foszfát puffereit sóoldatba (PBS), onnan pedig 4% paraformaldehidet tartalmazó, pH 7,2-es PBS-be helyezzük őket. Az embriókat 18 órán keresztül 4 °C-on fixáljuk, dehidratáljuk, majd viaszba ágyazzuk (Fisher Scientific Co.) és 5-6 mm-es metszeteket készítünk belőlük. Az izolált egér szerveket hasonlóképpen kezeljük. Az össz-RNS frakciót felnőtt egér szervekből és fejlődő embriókból Chirgwin és mtsai. eljárása alapján izoláljuk {Biochemistry, 18: 5294-5299). A

-49poli(A)⁺RNS (5 g) és az össz-RNS (20 g) frakciókat formaldehidet is tartalmazó, 0,8%-os agaróz gélben elektroforetizáljuk, majd Hybond-N (Amersham) filterekre biotoljuk, a szokásos körülmények között. A transzfert követően a filtereket ultraibolya fénnyel 4 percen keresztül megvilágítjuk, hibridizálunk, majd a filtereket sztringens körülmények között mossuk (Sambrook és mtsai., Molecular Cloning - a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). A metszetek in situ hibridizálását Wilkinson és mtsai. eljárása alapján (Development, 99: 493500, 1987), a következő módosításokkal végezzük: 1) a paraffinos beágyazást megelőzően toluol helyett xilolt használunk, 2) 5-6 mm-es metszeteket vágunk, és azokat 2% 3-trietoxiszilil-propilaminnnal (TESPA) előkezelt tárgylemezek felszínén lévő, dietil-pirokarbonáttal (DEPC) kezelt vízrétegre helyezzük, 3) a hibridizációs próbák lúgos hidrolízisét kihagyjuk,

4) a hibridizációs elegy 60% ioncserélt formamidet tartalmaz, 5) a magas sztringencitású mosást 80 percig, 65 °C-on végezzük, 50 mM DTT-t és lxSSC-t tartalmazó oldatban, 6) a metszeteket NTB-2 emulzióval fedjük le (Kodak) és 4 °C-on tároljuk. Körülbelül 14 nap expozíciós idő után a tárgylemezeket 2,5 percig, Kodak D-19 előhívóban hívjuk elő, majd 5 percig, Unifix-szel (Kodak) fixáljuk. A metszeteket toluidine kék 0,02%-os vizes oldatával festjük meg. A szensz hibridizációs próbákkal, valamint az RNáz A enzimmel kezelt metszeteken végrehajtott hibridizációs kontroll kísérletek nem adnak a háttértől megkülönböztethető jelet. Az immunoperoxidáz festést humán monoklonális anti- VlII-as faktor antitestek felhasználásával, a szokásos eljárás szerint végezzük.

Az egér szövetekhez hasonlóan, különböző humán embrionális és felnőtt szövetekből is készítünk össz-RNS és poliadenilált RNS iozolátumokat, és Northem blotolás után tie cDNS próbákkal hibridizáljuk • « ·

-50őket. A 11A ábrán láthatjuk, hogy valamennyi vizsgált humán embrionális szövet tartalmazza a 4,4 kb-os tie mRNS-t. A humán felnőtt szövetekből származó poliadenilált RNS mintákban a tie szignál a magas értartalmú tüdő, placenta és szív esetében a legkifejezettebb, gyengébb jeleket azonban egyéb szövetekben is megfigyelhetünk, különösen a hosszabban exponált autoradiogramokon (11B. ábra). A tie gén expressziója nagyon korán megindul; a terhesség 9-10. napjától kezdődően a tie gén már gyengén expresszálódik, ezután a tie transzkriptumok száma növekszik (maximum: a terhesség 14. napján). Az újszülött és néhány napos egerekben a tie mRNS szintje alacsonyabb. P.c. 12 napos egér embriók szagittális metszeteit hibridizáljuk az 1C1D jelű plazmid iszertjéről átírt antiszensz és szensz RNS-ekkel. A 12A ábrán egy ilyen jellegzetes metszet világos hátterű felvételét láthatjuk, amelyet antiszensz RNS-sel hibridizáltunk. A 12A ábrán jól látszik, hogy az autoradiográfíás szemcsék a nagyobb vérerek belső oldalát rajzolják ki. Ugyanezeket a hibridizációs jeleket azonban jobban megfigyelhetjük a metszet sötéthátterű mikroszkópos felvételén (12B ábra). Ezek az eredmények azt bizonyítják, hogy a tie mRNS kivétel nélkül expresszálódik minden vérérben. A tie expresszióért az endotélsejtek felelősek, amint azt a VlII-as faktorral végzett immunfestés is mutatja, ami egy endotélsejt-specifikus eljárás. A szensz hibridizációs próba nem ad a háttértől megkülönböztethető jelet, amint azt a 12C. ábra is mutatja. Egy p.c. 8 napos egér placenta metszeten előállított tie hibridizációs szignál mintázat (13A. ábra) oly mértékben hasonlónak bizonyult a szomszédos metszeten, VlII-as faktor immunfestéssel láthatóvá tett mintázathoz (13B. ábra), hogy azok egymással gyakorlatilag fedésbe hozhatóak.

A következőkben a találmány szerinti szekvenciák adatait ismertetjük.

AZ 1. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

• · ·

- 51 • · ·· β • · · · ·

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 1138 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egyszálú

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: cDNS

EREDETI FORRÁSA:

ÉLŐLÉNY: Homo sapiens

A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: AZONOSÍTÓSZÁM: 1:

Met

Val

Trp

Arg

Val

Pro

Pro

Phe

Leu

Leu

Pro Ile

Leu

Phe

Leu

Alá

1

5

10

15

Ser

His

Val

Gly

Alá

Alá

Val

Asp

Leu

Thr

Leu Leu

Alá

Asn

Leu

Arg

20

25

30

Leu

Thr

Asp

Pro

Gin

Arg

Phe

Phe

Leu

Thr

Cys Val

Ser

Gly

Glu

Alá

35

40

45

Gly

Alá

Gly

Arg

Gly

Ser

Asp

Alá

Trp

Gly

Pro Pro

Leu

Leu

Leu

Glu

50

55

60

Lys

Asp

Asp

Arg

Ile

Val

Arg

Thr

Pro

Pro

Gly Pro

Pro

Leu

Arg

Leu

65

70

75

80

Alá

Arg

Asn

Gly'

Ser

His

Gin

Val

Thr

Leu

Arg Gly

Phe

Ser

Lys

Pro

£5

90

95

Ser

Asp

Leu

Val

Gly

Val

Phe

Ser

Cys

Val

Gly Gly

Alá

Gly

Alá

Arg

100

105

110

Arg

Thr

Arg

Val

I le

Tyr

Val

His

Asn

Ser

Pro Gly

Alá

His

Leu

Leu

115

120

125

Pro

Asp

Lys

Val

Thr

His

Thr

Val

Asn

Lys

Gly Asp

Thr

Alá

Val

Leu

130

135

140

Ser

Alá

Arg

Val

His

Lys

G lu

Lys

Gin

Thr

Asp Val

Ile

Trp

Lys

Ser

145

150

155

160

Asn Gly Ser Tyr

Phe Tyr Thr Leu Asp Trp His Glu Alá Gin Asp Gly

165

170

175

Arg

Phe

Leu

Leu

Gin 1

Leu F

*ro <

&sn '

Val

Gin

Pro

Pro

Ser :

Ser ι

Gly

Ile

180

185

190

Tyr

Ser

Alá

Thr

Tyr :

Leu Glu .

Alá

Ser

Pro

Leu

Gly

Ser

Alá

Phe

Phe

195

200

205

Arg

Leu

Ile

Val

Arg

Gly

Cys

Gly

Alá

Gly

Arg

Trp

Gly

Pro

Gly

Cys

210

215

220

Thr

Lys

Glu

Cys

Pro

Gly

Cys

Leu

His

Gly

Gly

Val

Cys

His

Asp

His

225

230

235

240

Asp

Gly

Glu

Cys

Val

Cys

Pro

Pro

Gly

Phe

Thr

Gly

Thr

Arg

Cys

Glu

245

250

255

Gin

Alá

Cys

Arg

Glu

Gly

Arg

Phe

Gly

Gin

Ser

Cys

Gin

Glu

Gin

Cys

260

265

270

Pro

Gly

Ile

Ser

Gly

Cys

Arg

Gly

Leu

Thr

Phe

Cys

Leu

Pro

Asp

Pro

275

280

285

Tyr

Gly

Cys

Ser

Cys

Gly

Ser

Gly

Trp

Arg

Gly

Ser

Gin

Cys

Gin

Glu

290

295

300

Alá

Cys

Alá

Pro

Gly

His

Phe

Gly

Alá

Asp

Cys

Arg

Leu

Gin

Cys

Gin

305

310

315

320

Cys

Gin

Asn

Gly

Gly

Thr

Cys

Asp

Arg

Phe

Ser

Gly

Cys

Val

Cys

Pro

325

330

335

Ser

Gly

Trp

His

Gly

Val

His

Cys

Glu

Lys

Ser

Asp

Arg

Ile

Pro

Gin

340

345

350

Ile

Leu

Asn

Hét

Alá

Ser

Glu

Leu

Glu

Phe

Asn

Leu

Glu

Thr

Met

Pro

355

360

365

Arg

Ile

Asn

Cys

Alá

Alá

Alá

Gly

Asn

Pro

Phe

Pro

Val

Arg

Gly

Ser

370

375

380

Ile

Glu

Leu

Arg

Lys

Pro

Asp

Gly

Thr

Val

Leu

Leu

Ser

Thr

Lys

Alá

385

390

395

400

I le

Val

Glu

Pro

Glu 405

Lys

Thr

Thr

Alá

Glu 410

Phe

Glu

Val

Pro

Arg 415

Leu

Val

Leu

Alá

Asp

Ser

Gly

Phe

Trp

Glu

Cys

Arg

Val

Ser

Thr

Ser

Gly

420

425

430

Gly

Gin

Asp

Ser

Arg

Arg

Phe

Lys

Val

Asn

Val

Lys

Val

Pro

Pro

Val

435

440

445

Pro

Leu

Alá

Alá

Pro

Arg

Leu

Leu

Thr

Lys

Gin

Ser

Arg

Gin

Leu

Val

450

455

460

Val

Ser

Pro

Leu

Val

Ser

Phe

Ser

Gly

Asp

Gly

Pro

Ile

Ser

Thr

Val

465

470

475

480

Arg

Leu

His

Tyr

Arg

Pro

Cin

Asp

Ser

Thr

Met

Asp

Trp

Ser

Thr

Ile

485

490

495

Val

Val

Asp

Pro

Ser

Glu

Asn

Val

Thr

Leu

Met

Asn

Leu

Arg

Pro

Lys

500

505

510

Thr

Gly

Tyr

Ser

Val

Arg

Val

Gin

Leu

Ser

Arg

Pro

Gly

Glu

Gly

Gly

515

520

525

Glu

Gly

Alá

Trp

Gly

Pro

Pro

Thr

Leu

Met

Thr

Thr

Asp

Cys

Pro

Glu

530

535

540

Pro

Leu

Leu

Gin

Pro

Trp

Leu

Glu

Gly

Trp

His

Val

Glu

Gly

Thr

Asp

545

550

555

560

Arg

Leu

Arg

Val

Ser

Trp

Ser

Leu

Pro

Leu

Val

Pro

Gly

Pro

Leu

Val

565

570

575

Gly

Asp

Gly

Phe

Leu

Leu

Arg

Leu

Trp

Asp

Gly

Thr

Arg

Gly

Gin

Glu

580

5es

590

Arg

Arg

Glu

Asn

Val

Ser

Ser

Pro

Gin

Alá

Arg

Thr

Alá

Leu

Leu

Thr

595

600

605

Gly

Leu

Thr

Pro

Gly

Thr

His

Tyr

Gin

Leu

Asp

Val

Gin

Leu

Tyr

His

610

615

620

Cys

Thr

Leu

Leu

Gly

Pro

Alá

Ser

Pro

Pro

Alá

His

Val

Leu

Leu

Pro

625

630

635

640

·*«

Pro

Ser

Gly

Pro

Pro 645

Alá

- 54 Pro Arg

His

Leu 650

HiS

Alá

Gin

Alá

Leu 655

Ser

Asp

Ser

Glu

lle

Gin

Leu

Thr

Trp

Lys

His

Pro

Glu

Alá

Leu

Pro

Gly

660

665

670

Pro

He

Ser

Lys

Tyr

Val

Val

Glu

Val

Gin

Val

Alá

Gly

Gly

Alá

Gly

675

680

685

Asp

Pro

Leu

Trp

lle

Asp

Val

Asp

Arg

Pro

Glu

Glu

Thr

Ser

Thr

lle

690

695

700

He

Arg

Gly

Leu

Asn

Alá

Ser

Thr

Arg

Tyr

Leu

Phe

Arg

Met

Arg

Alá

705

710

715

720

Ser

lle

Gin

Gly

Leu

Gly

Asp

Trp

Ser

Asn

Thr

Val

Glu

Glu

Ser

Thr

725

730

735

Leu

Gly

Asn

Gly

Leu

Gin

Alá

Glu

Gly

Pro

Val

Gin

Glu

Ser

Arg

Alá

740

745

750

Alá

Glu

Glu

Gly

Leu

Asp

Gin

Gin

Leu

He

Leu

Alá

Val

Val

Gly

Ser

755

760

765

Val

Ser

Alá

Thr

Cys

Leu

Thr

lle

Leu

Alá

Alá

Leu

Leu

Thr

Leu

Val

770

775

780

Cys

lle

Arg

Arg

Ser

Cys

Leu

His

Arg

Arg

Arg

Thr

Phe

Thr

Tyr

Gin

785

790

795

800

Ser

Gly

Ser

Gly

Glu

Glu

Thr

lle

Leu

Gin

Phe

Ser

Ser

Gly

Thr

Leu

805

810

815

Thr

Leu

Thr

Arg

Arg

Pro

Lys

Leu

Gin

Pro

Glu

Pro

Leu

Ser

Tyr

Pro

820

825

830

Val

Leu

Glu

Trp

Glu

Asp

He

Thr

Phe

Glu

Asp

Leu

He

Gly

Glu

Gly

835

840

845

Asn

Phe

Gly

Gin

Val

He

Arg

Alá

Met

lle

Lys

Lys

Asp

Gly

Leu

Lys

850

855

860

Met

Asn

Alá

Alá

lle

Lys

Met

Leu

Lys

Glu

Tyr

Alá

Ser

Glu

Asn

Asp

865

870

875

880

His

Arg

Asp

Phe

Alá 885

Gly Glu

Leu

Glu

Val 890

Leu Cys

Lys

Leu

Gly 895

His

His

Pro

Asn

Ile

Ile

Asn

Leu

Leu

Gly

Alá

Cys

Lys

Asn

Arg

Gly

Tyr

900

905

910

Leu

Tyr

Ile

Alá

Ile

Glu

Tyr

Alá

Pro

Tyr

Gly

Asn

Leu

Leu

Asp

Phe

915

920

925

Leu

Arg

Lys

Ser

Arg

Val

Leu

Glu

Thr

Asp

Pro

Alá

Phe

Alá

Arg

Glu

930

935

940

His

Gly

Thr

Alá

Ser

Thr

Leu

Ser

Ser

Arg

Gin

Leu

Leu

Arg

Phe

Alá

945

950

955

960

Ser

Asp

Alá

Alá

Asn

Gly

Met

Gin

Tyr

Leu

Ser

Glu

Lys

Gin

Phe

Ile

965

970

975

His

Arg

Asp

Leu

Alá

Alá

Arg

Asn

Val

Leu

Val

Gly

Glu

Asn

Leu

Alá

980

985

990

Ser

Lys

Ile

Alá

Asp

Phe

Gly

Leu

Ser

Arg

Gly

Glu

Glu

Val

Tyr

Val

995

1000

1005

Lys

Lys

Thr

Met

Gly

Arg

Leu

Pro

Val

Arg

Trp

Met

Alá

Ile

Glu

Ser

1010

1015

1020

Leu

Asn

Tyr

Ser

Val

Tyr

Thr

Thr

Lys

Ser

Asp

Val

Trp

Ser

Phe

Gly

1025

1030

1035

1040

Val

Leu

Leu

Trp

Glu

Ile

Val

Ser

Leu

Gly

Gly

Thr

Pro

Tyr

Cys

Gly

1045

1050

1055

Met

Thr

Cys

Alá

Glu

Leu

Tyr

Glu

Lys

Leu

Pro

Gin

Alá

Asp

Arg

Met

1060

1065

1070

Glu

Gin

Pro

Arg

Asn

Cys

Asp

Asp

Glu

Val

Tyr

Glu

Leu

Met

Arg

Gin

1075

1080

1085

Cys

Trp

Arg

Asp

Arg

Pro

Tyr

Glu

Arg

Pro

Pro

Phe

Alá

Gin

Ile

Alá

1090

1095

1100

Leu

Gin

Leu

Gly

Arg

Met

Leu

Glu

Alá

Arg

Lys

Alá

Tyr

Val

Asn

Met

1105

1110

1115

1120

• · · • · · ·

Ser Leu Phe Glu Asn Phe Thr Tyr Alá Gly Ile Asp Alá Thr Alá Glu 1125 1130 1135

Glu Alá

A 2. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 1094 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egyszálú

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: cDNS

EREDETI FORRÁSA:

ÉLŐLÉNY: Homo sapiens

A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: AZONOSÍTÓSZÁM: 2:

Met 1

Val

Trp

Arg

Val 5

Pro

Pro

Phe

Leu

Leu 10

Pro

Ile

Leu

Phe

Leu 15

Alá

Ser

His

Val

Gly

Alá

Alá

Val

Asp

Leu

Thr

Leu

Leu

Alá

Asn

Leu

Arg

20

25

30

Leu

Thr

Asp

Pro

Gin

Arg

Phe

Phe

Leu

Thr

Cys

Val

Ser

Gly

Glu

Alá

35

40

45

Gly

Alá

Gly

Arg

Gly

Ser

Asp

Alá

Trp

Gly

Pro

Pro

Leu

Leu

Leu

Glu

50

55

60

Lys

Asp

Asp

Arg

Ile

Val

Arg

Thr

Pro

Pro

Gly

Pro

Pro

Leu

Arg

Leu

65

70

75

80

Alá

Arg

Asn

Gly

Ser

His

Gin

Val

Thr

Leu

Arg

Gly

Phe

Ser

Lys

Pro

85

90

95

Ser

Asp

Leu

Val

Gly

Val

Phe

Ser

Cys

Val

Gly

Gly

Alá

Gly

Alá

Arg

100

105

110

Arg

Thr

Arg

Val

Ile

Tyr

Val

His

Asn

Ser

Pro

Gly

Alá

His

Leu

Leu

115

120

125

• · ·

Pro Asp Lys

Val Thr

His

Thr Val 135

Asn

Lys

Gly

Asp 140

Thr

Alá Val

Leu

130

Ser

Alá

Arg

Val

His

Lys

Glu

Lys

Gin

Thr

Asp

Val

Ile

Trp

Lys

Ser

145

150

155

160

Asn

Gly

Ser

Tyr

Phe

Tyr

Thr

Leu

Asp

Trp

His

Glu

Alá

Gin

Asp

Gly

165 170 175

Arg

Phe Leu

Leu 180

Gin

Leu

Pro

Asn

Val 135

Gin Pro

Pro

Ser

Ser 190

Gly

Ile

Tyr

Ser

Alá

Thr

Tyr

Leu

Glu

Alá

Ser

Pro

Leu

Gly

Ser

Alá

Phe

Phe

195

200

205

Arg

Leu

Ile

Val

Arg

Alá

Cys

Arg

Glu

Gly

Arg

Phe

Gly

Gin

Ser

Cys

210

215

220

Gin

Glu

Gin

Cys

Pro

Gly

Ile

Ser

Gly

Cys

Arg

Gly

Leu

Thr

Phe

Cys

225

230

235

240

Leu

Pro

Asp

Pro

Tyr

Gly

Cys

Ser

Cys

Gly

Ser

Gly

Trp

Arg

Gly

Ser

245

250

255

Gin

Cys

Gin

Glu

Alá

Cys

Alá

Pro

Gly

His

Phe

Gly

Alá

Asp

Cys

Arg

260

265

270

Leu

Gin

Cys

Gin

Cys

Gin

Asn

Gly

Gly

Thr

Cys

Asp

Arg

Phe

Ser

Gly

275

280

285

Cys

Val

Cys

Pro

Ser

Gly

Trp

His

Gly

Val

His

Cys

Glu

Lys

Ser

Asp

290

295

300

Arg

Ile

Pro

Gin

Ile

Leu

Asn

Met

Alá

Ser

Glu

Leu

Glu

Phe

Asn

Leu

305

310

315

320

Glu

Thr

Hét

Pro

Arg

Ile

Asn

Cys

Alá

Alá

Alá

Gly

Asn

Pro

Phe

Pro

325

330

335

Val

Arg

Gly

Ser

Ile

Glu

Leu

Arg

Lys

Pro

Asp

Gly

Thr

Val

Leu

Leu

340

345

350

Ser

Thr

Lys

Alá

Ile

Val

Glu

Pro

Glu

Lys

Thr

Thr

Alá

Glu

Phe

Glu

355

360

365

Val

Pro 370

Arg

Leu

Val

Leu

Alá 375

Asp

Ser

Gly

Phe

Trp 380

Glu

Cys

Arg

Val

Ser 385

Thr

Ser

Gly

Gly

Gin 390

Asp

Ser

Arg

Arg

Phe 395

Lys

Val

Asn

Val

Lys 400

Val

Pro

Pro

Val

Pro

Leu

Alá

Alá

Pro

Arg

Leu

Leu

Thr

Lys

Gin

Ser

405 410 415

Arg

Gin

Leu

Val 420

Val

Ser

Pro

Leu

Val 425

Ser

Phe

Ser

Gly

Asp 430

Gly

Pro

He

Ser

Thr

Val

Arg

Leu

His

Tyr

Arg

Pro

Gin

Asp

Ser

Thr

Met

Asp

435

440

445

Trp

Ser

Thr

He

Val

Val

Asp

Pro

Ser

Glu

Asn

Val

Thr

Leu

Met

Asn

450

455

460

Leu

Arg

Pro

Lys

Thr

Gly

Tyr

Ser

Val

Arg

Val

Gin

Leu

Ser

Arg

Pro

465

470

475

480

Gly

Glu

Gly

Gly

Glu

Gly

Alá

Trp

Gly

Pro

Pro

Thr

Leu

Met

Thr

Thr

485

490

495

Asp

Cys

Pro

Glu

Pro

Leu

Leu

Gin

Pro

Trp

Leu

Glu

Gly

Trp

His

Val

500

505

510

Glu

Gly

Thr

Asp

Arg

Leu

Arg

Val

Ser

Trp

Ser

Leu

Pro

Leu

Val

Pro

515

520

525

Gly

Pro

Leu

Val

Gly

Asp

Gly

Phe

Leu

Leu

Arg

Leu

Trp

Asp

Gly

Thr

530

535

540

Arg

Gly

Gin

Glu

Arg

Arg

Glu

Asn

Val

Ser

Ser

Pro

Gin

Alá

Arg

Thr

545

550

555

560

Alá

Leu

Leu

Thr

Gly

Leu

Thr

Pro

Gly

Thr

His

Tyr

Gin

Leu

Asp

Val

565

570

575

Gin

Leu

Tyr

His

Cys

Thr

Leu

Leu

Gly

Pro

Alá

Ser

Pro

Pro

Alá

His

580

585

590

Val

Leu

Leu

Pro

Pro

Ser

Gly

Pro

Pro

Alá

Pro

Arg

His

Leu

His

Alá

595

600

605

Gin

Alá 610

Leu

Ser

Asp Ser Glu 615

Ile Gin

Leu

Thr

Trp 620

Lys

His

Pro

Glu

Alá

Leu

Pro

Gly

Pro

Ile

Ser

Lys

Tyr

Val

Val

Glu

Val

Gin

Val

Alá

625

630

635

640

Gly

Gly

Alá

Gly

Asp

Pro

Leu

Trp

Ile

Asp

Val

Asp

Arg

Pro

Glu

Glu

645 650 655

Thr

Ser

Thr

Ile 660

Ile

Arg

Gly

Leu

Asn 665

Alá

Ser

Thr Arg

Tyr 670

Leu

Phe

Arg

Met

Arg

Alá

Ser

Ile

Gin

Gly

Leu

Gly

Asp

Trp

Ser

Asn

Thr

Val

675

680

685

Glu

Glu

Ser

Thr

Leu

Gly

Asn

Gly

Leu

Gin

Alá

Glu

Gly

Pro

Val

Gin

690

695

700

Glu

Ser

Arg

Alá

Alá

Glu

Glu

Gly

Leu

Asp

Gin

Gin

Leu

Ile

Leu

Alá

705

710

715

720

Val

Val

Gly

Ser

Val

Ser

Alá

Thr

Cys

Leu

Thr

Ile

Leu

Alá

Alá

Leu

725

730

735

Leu

Thr

Leu

Val

Cys

Ile

Arg

Arg

Ser

Cys

Leu

His

Arg

Arg

Arg

Thr

740

745

750

Phe

Thr

Tyr

Gin

Ser

Gly

Ser

Gly

Glu

Glu

Thr

Ile

Leu

Gin

Phe

Ser

755

760

765

Ser

Gly

Thr

Leu

Thr

Leu

Thr

Arg

Arg

Pro

Lys

Leu

Gin

Pro

Glu

Pro

770

775

780

Leu

Ser

Tyr

Pro

Val

Leu

Glu

Trp

Glu

Asp

Ile

Thr

Phe

Glu

Asp

Leu

785

790

795

800

Ile

Gly

Glu

Gly

Asn

Phe

Gly

Gin

Val

Ile

Arg

Alá

Met

Ile

Lys

Lys

80S

810

815

Asp

Gly

Leu

Lys

Met

Asn

Alá

Alá

Ile

Lys

Met

Leu

Lys

Glu

Tyr

Alá

820

825

830

Ser

Glu

Asn

Asp

His

Arg

Asp

Phe

Alá

Gly

Glu

Leu

Glu

Val

Leu

Cys

835

840

845

Lys

Leu Gly 850

His

His

Pro

Asn 855

Ile

Ile

Asn

Leu

Leu 860

Gly

Alá

Cys

Lys

Asn

Arg Gly

Tyr

Leu

Tyr

Ile

Alá

Ile

Glu

Tyr

Alá

Pro

Tyr

Gly

Asn

865

870

875

880

Leu

Leu Asp

Phe

Leu

Arg

Lys

Ser

Arg

Val

Leu

Glu

Thr

Asp

Pro

Alá

885

890

895

Phe

Alá Arg

Glu

His

Gly

Thr

Alá

Ser

Thr

Leu

Ser

Ser

Arg

Gin

Leu

900

905

910

Leu

Arg Phe

Alá

Ser

Asp

Alá

Alá

Asn

Gly

Met

Gin

Tyr

Leu

Ser

Glu

91S

920

925

Lys

Gin Phe

Ile

His

Arg

Asp

Leu

Alá

Alá

Arg

Asn

Val

Leu

Val

Gly

930

935

940

Glu

Asn Leu

Alá

Ser

Lys

Ile

Alá

Asp

Phe

Gly

Leu

Ser

Arg

Gly

Glu

945

950

955

960

Glu

Val Tyr

Val

Lys

Lys

Thr

Met

Gly

Arg

Leu

Pro

Val

Arg

Trp

Met

965

970

975

Alá

Ile Glu

Ser

Leu

Asn

Tyr

Ser

Val

Tyr

Thr

Thr

Lys

Ser

Asp

Val

980

985

990

Trp

Ser Phe

Gly

Val

Leu

Leu

Trp

Glu

Ile

Val

Ser

Leu

Gly

Gly

Thr

995

1000

1005

Pro

Tyr Cys

Gly

Met

Thr

Cys

Alá

Glu

Leu

Tyr

Glu

Lys

Leu

Pro

Gin

1010

1015

1020

Alá

Asp Arg

Met

Glu

Gin

Pro

Arg

Asn

Cys

Asp

Asp

Glu

Val

Tyr

Glu

1025

1030 ·

1035

1040

Leu

Met Arg

Gin

Cys

Trp

Arg

Asp

Arg

Pro

Tyr

Glu

Arg

Pro

Pro

Phe

1045

1050

1055

Alá Gin Ile Alá Leu Gin Leu Gly Arg Met Leu Glu Alá Arg Lys Alá

1060 1065 1070 • · · · · * · · · · · • · · · · · · • · · · · ·· ·

Tyr Val Asn Met Ser Leu Phe Glu Asn Phe Thr Tyr Alá Gly Ile Asp ^1O75 1080 1085

Alá Thr Alá Glu Glu Alá

1090

A 3. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 3845 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy szálú

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: cDNS

EREDETI FORRÁSA:

ÉLŐLÉNY: Homo sapiens

A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: AZONOSÍTÓSZÁM: 3:

CGCTCGTCCT	GGCTGGCCTG	GGTCGGCCTC	TGGAGTATGG	TCTGGCGGGT	GCCCCCTTTC	60
TTGCTCCCCA	TCCTCTTCTT	GGCTTCTCAT	GTGGGCGCGG	CGGTGGACCT	GACGCTGCTG	120
GCCAACCTGC	GGCTCACGGA	CCCCCAGCGC	TTCTTCCTGA	CTTGCGTGTC	TGGGGAGGCC	180
GGGGCGGGGA	GGGGCTCGGA	CGCCTGGGGC	CCGCCCCTGC	TGCTGGAGAA	GGACGACCGT	240
ATCGTGCGCA	CCCCGCCCGG	GCCACCCCTG	CGCCTGGCGC	GCAACGGTTC	GCACCAGGTC	300
ACGCTTCGCG	GCTTCTCCAA	GCCCTCGGAC	CTCGTGGGCG	TCTTCTCCTG	CGTGGGCGGT	360
GCTGGGGCGC	GGCGCACGCG	CGTCATCTAC	GTGCACAACA	GCCCTGGAGC	CCACCTGCTT	420
CCAGACAAGG	TCACACACAC	TGTGAACAAA	GGTGACACCG	CTGTACTTTC	TGCACGTGTG	480
CACAAGGAGA	AGCAGACAGA	CGTGATCTGG	AAGAGCAACG	GATCCTACTT	CTACACCCTG	540
GACTGGCATG	AAGCCCAGGA	TGGGCGGTTC	CTGCTGCAGC	TCCCAAATGT	GCAGCCACCA	600
TCGAGCGGCA	TCTACAGTGC	CACTTACCTG	GAAGCCAGCC	CCCTGGGCAG	CGCCTTCTTT	660
CGGCTCATCG	TGCGGGGTTG	TGGGGCTGGG	CGCTGGGGGC	CAGGCTGTAC	CAAGGAGTGC	720

CCAGGTTGCC	TACATGGAGG	TGTCTGCCAC	GACCATGACG	GCGAATGTGT	ATGCCCCCCT	780
GGCTTCACTG	GCACCCGCTG	TGAACAGGCC	TGCAGAGAGG	GCCGTTTTGG	GCAGAGCTGC	840
CAGGAGCAGT	GCCCAGGCAT	ATCAGGCTGC	CGGGGCCTCA	CCTTCTGCCT	CCCAGACCCC	900
TATGGCTGCT	CTTGTGGATC	TGGCTGGAGA	GGAAGCCAGT	GCCAAGAAGC	TTGTGCCCCT	960
GGTCATTTTG	GGGCTGATTG	CCGACTCCAG	TGCCAGTGTC	AGAATGGTGG	CACTTGTGAC	1020
CGGTTCAGTG	GTTGTGTCTG	CCCCTCTGGG	TGGCATGGAG	TGCACTGTGA	GAAGTCAGAC	1080
CGGATCCCCC	AGATCCTCAA	CATGGCCTCA	GAACTGGAGT	TCAACTTAGA	GACGATGCCC	1140
CGGATCAACT	GTGCAGCTGC	AGGGAACCCC	TTCCCCGTGC	GGGGCAGCAT	AGAGCTACGC	1200
AAGCCAGACG	GCACTGTGCT	CCTGTCCACC	AAGGCCATTG	TGGAGCCAGA	GAAGACCACA	1260
GCTGAGTTCG	AGGTGCCCCG	CTTGGTTCTT	GCGGACAGTG	GGTTCTGGGA	GTGCCGTGTG	1320
TCCACATCTG	GCGGCCAAGA	CAGCCGGCGC	TTCAAGGTCA	ATGTGAAAGT	GCCCCCCGTG	1380
CCCCTGGCTG	CACCTCGGCT	CCTGACCAAG	CAGAGCCGCC	AGCTTGTGGT	CTCCCCGCTG	1440
GTCTCGTTCT	CTGGGGATGG	ACCCATCTCC	ACTGTCCGCC	TGCACTACCG	GCCCCAGGAC	1500
AGTACCATGG	ACTGGTCGAC	CATTGTGGTG	GACCCCAGTG	AGAACGTGAC	GTTAATGAAC	1560
CTGAGGCCAA	AGACAGGATA	CAGTGTTCGT	GTGCAGCTGA	GCCGGCCAGG	GGAAGGAGGA	1620
GAGGGGGCCT	GGGGGCCTCC	CACCCTCATG	ACCACAGACT	GTCCTGAGCC	TTTGTTGCAG	1680
CCGTGGTTGG	AGGGCTGGCA	TGTGGAAGGC	ACTGACCGGC	TGCGAGTGAG	CTGGTCCTTG	1740
CCCTTGGTGC	CCGGGCCACT	GGTGGGCGAC	GGTTTCCTGC	TGCGCCTGTG	GGACGGGACA	1800
CGGGGGCAGG	AGCGGCGGGA	GAACGTCTCA	TCCCCCCAGG	CCCGCACTGC	CCTCCTGACG	1860
GGACTCACGC	CTGGCACCCA	CTACCAGCTG	GATGTGCAGC	TCTACCACTG	CACCCTCCTG	1920
GGCCCGGCCT	CGCCCCCTGC	ACACGTGCTT	CTGCCCCCCA	GTGGGCCTCC	AGCCCCCCGA	1980
CACCTCCACG	CCCAGGCCCT	CTCAGACTCC	GAGATCCAGC	TGACATGGAA	GCACCCGGAG	2040
GCTCTGCCTG	GGCCAATATC	CAAGTACGTT	GTGGAGGTGC	AGGTGGCTGG	GGGTGCAGGA	2100

GACCCACTGT	GGATAGACGT	GGACAGGCCT	GAGGAGACAA	GCACCATCAT	CCGTGGCCTC	2160
AACGCCAGCA	CGCGCTACCT	CTTCCGCATG	CGGGCCAGCA	TTCAGGGGCT	CGGGGACTGG	2220
AGCAACACAG	TAGAAGAGTC	CACCCTGGGC	AACGGGCTGC	AGGCTGAGGG	CCCAGTCCAA	2280
GAGAGCCGGG	CAGCTGAAGA	GGGCCTGGAT	CAGCAGCTGA	TCCTGGCGGT	GGTGGGCTCC	2340
GTGTCTGCCA	CCTGCCTCAC	CATCCTGGCC	gcccttttaa	CCCTGGTGTG	CATCCGCAGA	2400
AGCTGCCTGC	ATCCGAGACG	CACCTTCACC	TACCAGTCAG	GCTCGGGCGA	GGAGACCATC	2460
CTGCAGTTCA	GCTCAGGGAC	CTTGACACTT	ACCCGGCGGC	CAAAACTGCA	GCCCGAGCCC	2520
CTGAGCTACC	CAGTGCTAGA	GTGGGAGGAC	ATCACCTTTG	AGGACCTCAT	CGGGGAGGGG	2580
AACTTCGGCC	AGGTCATCCG	GGCCATGATC	AAGAAGGACG	GGCTGAAGAT	GAACGCAGCC	2640
ATCAAAATGC	TGAAAGAGTA	TGCCTCTGAA	AATGACCATC	GTGACTTTGC	GGGAGAACTG	2700
GAAGTTCTGT	GCAAATTGGG	GCATCACCCC	AACATCATCA	ACCTCCTGGG	GGCCTGTAAG	2760
AACCGAGGTT	ACTTGTATAT	CGCTATTGAA	TATGCCCCCT	ACGGGAACCT	GCTAGATTTT	2820
CTGCGGAAAA	GCCGGGTCCT	AGAGACTGAC	CCAGCTTTTG	CTCGAGAGCA	TGGGACAGCC	2880
TCTACCCTTA	GCTCCCGGCA	GCTGCTGCGT	TTCGCCAGTG	ATGCGGCCAA	TGGCATGCAG	2940
TACCTGAGTG	AGAAGCAGTT	CATCCACAGG	GACCTGGCTG	CCCGGAATGT	GCTGGTCGGA	3000
GAGAACCTAG	CCTCCAAGAT	TGCAGACTTC	GGCCTTTCTC	GGGGAGAGGA	GGTTTATGTG	3060
AAGAAGACGA	TGGGGCGTCT	CCCTGTGCGC	TGGATGGCCA	TTGAGTCCCT	GAACTACAGT	3120
GTCTATACCA	CCAAGAGTGA	TGTCTGGTCC	TTTGGAGTCC	TTCTTTGGGA	GATAGTGAGC	3180
CTTGGAGGTA	CACCCTACTG	TGGCATGACC	TGTGCCGAGC	TCTATGAAAA	GCTGCCCCAG	3240
GCTGACCGCA	TGGAGCAGCC	TCGAAACTGT	GACGATGAAG	TGTACGAGCT	GATGCGTCAG	3300
TGCTGGCGGG	ACCGTCCCTA	TGAGCGACCC	CCCTTTGCCC	AGATTGCGCT	ACAGCTAGGC	3360
CGCATGCTGG	AAGCCAGGAA	GGCCTATGTG	AACATGTCGC	TGTTTGAGAA	CTTCACTTAC	3420
GCGGGCATTG	ATGCCACAGC	TGAGGAGGCC	TGAGCTGCCA	TCCAGCCAGA	ACGTGGCTCT	3480

• 9 • · V

GCTGGCCGGA	GCAAACTCTG	CTGTCTAACC	TGTGACCAGT	CTGACCCTTA	CAGCCTCTGA	3540
CTTAAGCTGC	CTCAAGGAAT	TTTTTTAACT	TAAGGGAGAA	AAAAAGGGAT	CTGGGGATGG	3600
GGTGGGCTTA	GGGGAACTGG	GTTCCCATGC	TTTGTAGGTG	TCTCATAGCT	ATCCTGGGCA	3660
TCCTTCTTTC	TAGTTCAGCT	GCCCCACAGG	TGTGTTTCCC	ATCCCACTGC	TCCCCCAACA	3720
CAAACCCCCA	CTCCAGCTCC	TTCGCTTAAG	CCAGCACTCA	CACCACTAAC	ATGCCCTGTT	3780
CAGCTACTCC	CACTCCCGGC	CTGTCATTCA	GAAAAAAATA	AATGTTCTAA	TAAGCTCCAA	3840

ΑΑΑΑΑ 3845

A 4. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 3713 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egyszálú

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: cDNS

EREDETI FORRÁSA:

ÉLŐLÉNY: Homo sapiens

A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: AZONOSÍTÓSZÁM: 4:

CGCTCGTCCT	GGCTGGCCTG	GGTCGGCCTC	TGGAGTATGG	TCTGGCGGGT	GCCCCCTTTC	60
TTGCTCCCCA	TCCTCTTCTT	GGCTTCTCAT	GTGGGCGCGG	CGGTGGACCT	GACGCTGCTG	120
GCCAACCTGC	GGCTCACGGA	CCCCCAGCGC	TTCTTCCTGA	CTTGCGTGTC	TGGGGAGGCC	180
GGGGCGGGGA	GGGGCTCGGA	CGCCTGGGGC	CCGCCCCTGC	T.GCTGGAGAA	GGACGACCGT	240
ATCGTGCGCA	CCCCGCCCGG	GCCACCCCTG	CGCCTGGCGC	GCAACGGTTC	GCACCAGGTC	300
ACGCTTCGCG	gcttctccaa	GCCCTCGGAC	CTCGTGGGCG	TCTTCTCCTG	CGTGGGCGGT	360
GCTGGGGCGC	GGCGCACGCG	CGTCATCTAC	GTGCACAACA	GCCCTGGAGC	CCACCTGCTT	420
CCAGACAAGG	TCACACACAC	TGTGAACAAA	GGTGACACCG	CTGTACTTTC	TGCACGTGTG	480

• · · ·

CACAAGGAGA	AGCAGACAGA	CGTGATCTGG	AAGAGCAACG	GATCCTACTT	CTACACCCTG	540
GACTGGCATG	AAGCCCAGGA	TGGGCGGTTC	CTGCTGCAGC	TCCCAAATGT	GCAGCCACCA	600
TCGAGCGGCA	TCTACAGTGC	CACTTACCTG	GAAGCCAGCC	CCCTGGGCAG	CGCCTTCTTT	660
CGGCTCATCG	TGCGGGCCTG	CAGAGAGGGC	CGTTTTGGGC	AGAGCTGCCA	GGAGCAGTGC	720
CCAGGCATAT	CAGGCTGCCG	GGGCCTCACC	TTCTGCCTCC	CAGACCCCTA	TGGCTGCTCT	780
TGTGGATCTG	GCTCGAGAGG	AAGCCAGTGC	CAAGAAGCTT	GTGCCCCTGG	TCATTTTGGC	840
GCTGATTGCC	GACTCCAGTG	CCAGTGTCAG	AATGGTGGCA	CTTGTGACCG	GTTCAGTGGT	900
TGTGTCTGCC	CCTCTGGGTG	GCATGGAGTG	CACTGTGAGA	AGTCAGACCG	GATCCCCCAG	960
ATCCTCAACA	TGGCCTCAGA	ACTGGAGTTC	AACTTAGAGA	CGATGCCCCG	GATCAACTGT	1020
GCAGCTGCAG	GGAACCCCTT	CCCCGTGCGG	GGCAGCATAG	AGCTACGCAA	GCCAGACGGC	1080
ACTGTGCTCC	TGTCCACCAA	GGCCATTGTG	GAGCCAGAGA	AGACCACAGC	TGAGTTCGAG	1140
GTGCCCCGCT	TGGTTCTTGC	GGACAGTGGG	TTCTGGGAGT	GCCGTGTGTC	CACATCTGGC	1200
GGCCAAGACA	GCCGGCGCTT	CAAGGTCAAT	GTGAAAGTGC	CCCCCGTGCC	CCTGGCTGCA	1260
CCTCGGCTCC	TGACCAAGCA	GAGCCGCCAG	CTTGTGGTCT	CCCCGCTGGT	CTCGTTCTC7	1320
GGGGATGGAC	CCATCTCCAC	TGTCCGCCTG	CACTACCGGC	CCCAGGACAG	TACCATGGAC	1380
TGGTCGACCA	TTGTGGTGGA	CCCCAGTGAG	AACGTGACGT	TAATGAACCT	GAGGCCAAAG	1440
ACAGGATACA	GTGTTCGTGT	GCAGCTGAGC	CGGCCAGGGG	AAGGAGGAGA	GGGGGCCTGG	1500
GGGCCTCCCA	CCCTCATGAC	CACAGACTGT	CCTGAGCCTT	TGTTGCAGCC	GTGGTTGGAG	1560
GGCTGGCATG	TGGAAGGCAC	TGACCGGCTG	CGAGTGAGCT	GGTCCTTGCC	CTTGGTGCCC	1620
GGGCCACTGG	TGGGCGACGG	TTTCCTGCTG	CGCCTGTGGG	ACGGGACACG	GGGGCAGGAG	1680
CGGCGGGAGA	ACGTCTCATC	CCCCCAGGCC	CGCACTGCCC	TCCTGACGGG	ACTCACGCCT	1740
GGCACCCACT	ACCAGCTGGA	TGTGCAGCTC	TACCACTGCA	CCCTCCTGGG	CCCGGCCTCG	1800

» · • · · ♦ a · • · · · * · · ···♦· · · « • «·«· «« «4·

CCCCCTGCAC	ACGTGCTTCT	GCCCCCCAGT	GGGCCTCCAG	CCCCCCGACA	CCTCCACGCC	1860
CAGGCCCTCT	CAGACTCCGA	GATCCAGCTG	ACATGGAAGC	ACCCGGAGGC	TCTGCCTGGG	1920
CCAATATCCA	AGTACGTTGT	GGAGGTGCAG	GTGGCTGGGG	GTGCAGGAGA	CCCACTGTGG	1980
ATAGACGTGG	ACAGGCCTGA	GGAGACAAGC	ACCATCATCC	GTGGCCTCAA	CGCCAGCACG	2040
CGCTACCTCT	TCCGCATGCG	GGCCAGCATT	CAGGGGCTCG	GGGACTGGAG	CAACACAGTA	2100
GAAGAGTCCA	CCCTGGGCAA	CGGGCTGCAG	GCTGAGGGCC	CAGTCCAAGA	GAGCCGGGCA	2160
GCTGAAGAGG	GCCTGGATCA	GCAGCTGATC	CTGGCGGTGG	TGGGCTCCGT	GTCTGCCACC	2220
TGCCTCACCA	TCCTGGCCGC	CCTTTTAACC	CTGGTGTGCA	TCCGCAGAAG	CTGCCTGCAT	2280
CGGAGACGCA	CCTTCACCTA	CCAGTCAGGC	TCGGGCGAGG	AGACCATCCT	GCAGTTCAGC	2340
TCAGGGACCT	TGACACTTAC	CCGGCGGCCA	AAACTGCAGC	CCGAGCCCCT	GAGCTACCCA	2400
GTGCTAGAGT	GGGAGGACAT	CACCTTTGAG	GACCTCATCG	GGGAGGGGAA	CTTCGGCCAG	2460
GTCATCCGGG	CCATGATCAA	GAAGGACGGG	CTGAAGATGA	ACGCAGCCAT	CAAAATGCTG	2520
AAAGAGTATG	CCTCTGAAAA	TGACCATCGT	GACTTTGCGG	GAGAACTGGA	AGTTCTGTGC	2580
AAATTGGGGC	ATCACCCCAA	CATCATCAAC	CTCCTGGGGG	CCTGTAAGAA	CCGAGGTTAC	2640
TTGTATATCG	CTATTGAATA	TGCCCCCTAC	GGGAACCTGC	TAGATTTTCT	GCGGAAAAGC	2700
CGGGTCCTAG	AGACTGACCC	AGCTTTTGCT	CGAGAGCATG	GGACAGCCTC	TACCCTTAGC	2760
TCCCGGCAGC	TGCTGCGTTT	CGCCAGTGAT	GCGGCCAATG	GCATGCAGTA	CCTGAGTGAG	2820
AAGCAGTTCA	TCCACAGGGA	CCTGGCTGCC	CGGAATGTGC	TGGTCGGAGA	GAACCTAGCC	2880
TCCAAGATTG	CAGACTTCGG	CCTTTCTCGG	GGAGAGGAGG	TTTATGTGAA	GAAGACGATG	2940
GGGCGTCTCC	CTGTGCGCTG	GATGGCCATT	GAGTCCCTGA	ACTACAGTGT	CTATACCACC	3000
AAGAGTGATG	TCTGGTCCTT	TGGAGTCCTT	CTTTGGGAGA	TAGTGAGCCT	TGGAGGTACA	3060
CCCTACTGTG	GCATGACCTG	TGCCGAGCTC	TATGAAAAGC	TGCCCCAGGC	TGACCGCATG	3120
GAGCAGCCTC	GAAACTGTGA	CGATGAAGTG	TACGAGCTGA	TGCGTCAGTG	CTGGCGGGAC	3180

• ·♦ ·»4 • * w ·a · • ♦ « · · v· «··· · · ·4 • ♦··· ··«·μ

CGTCCCTATG	AGCGACCCCC	CTTTGCCCAG	ATTGCGCTAC	AGCTAGGCCG	CATGCTGGAA	3240
GCCAGGAAGG	CCTATGTGAA	CATGTCGCTG	TTTGAGAACT	TCACTTACGC	GGGCATTGAT	3300
GCCACAGCTG	AGGAGGCCTG	AGCTGCCATC	CAGCCAGAAC	GTGGCTCTGC	TGGCCGGAGC	3360
AAACTCTGCT	GTCTAACCTG	TGACCAGTCT	GACCCTTACA	GCCTCTGACT	TAAGCTGCCT	3420
CAAGGAATTT	TTTTAACTTA	AGGGAGAAAA	AAAGGGATCT	GGGGATGGGG	TGGGCTTAGG	3480
GGAACTGGGT	TCCCATGCTT	TGTAGGTGTC	TCATAGCTAT	CCTGGGCATC	CTTCTTTCTA	3540
GTTCAGCTGC	CCCACAGGTG	TGTTTCCCAT	CCCACTGCTC	CCCCAACACA	AACCCCCACT	3600
CCAGCTCCTT	CGCTTAAGCC	AGCACTCACA	CCACTAACAT	GCCCTGTTCA	GCTACTCCCA	3660
CTCCCGGCCT	GTCATTCAGA	AAAAAATAAA	TGTTCTAATA	AGCTCCAAAA	AAA	3713

Claims (5)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Izolált nukleotid fragmentum, amely olyan szekvenciarészletet tartalmaz, ami a tie receptor tirozin kináznak vagy egy funkcionális származékának, vagy ezek valamelyik fragmentumának az aminosav szekvenciáját kódolja.

   2. Az 1. igénypont szerinti izolált nukleotid fragmentum, azzal jellemezve, hogy tie prekurzort kódol, és kódoló régiója tartalmaz egy, a 3. SZEKVENCIA AZONOSÍTÓ SZÁM alatt megadott nukleotid szekvenciának körülbelül az 1. nukleotidjától körülbelül a 3845. nukleotidjáig terjedő részével alapvetően megegyező szekvenciarészletet.

   3. Az 1. igénypont szerinti izolált nukleotid fragmentum, azzal jellemezve, hogy tie prekurzort kódol, és kódoló régiója tartalmaz egy, a 3. SZEKVENCIA AZONOSÍTÓ SZÁM alatt megadott nukleotid szekvenciának körülbelül a 37. nukleotidjától körülbelül a 3845. nukleotidjáig terjedő részével alapvetően megegyező szekvenciarészletet.

   4. Az I. igénypont szerinti izolált nukleotid fragmentum, azzal jellemezve, hogy érett tie fehérjét kódol, és kódoló régiója tartalmaz egy, a 3. SZEKVENCIA AZONOSÍTÓ SZÁM alatt megadott nukleotid szekvenciának körülbelül a 100. nukleotidjától körülbelül a 3845. nukleotidjáig terjedő részével alapvetően megegyező szekvenciarészletet.

   5. Rekombináns DNS molekula, azzal jellemezve, hogy az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti nukleotid szekvenciarészletet tartalmaz.

   6. Az 5. igénypont szerinti rekombináns DNS molekula, azzal jellemezve, hogy a nukleotid szekvenciarészlet funkcionálisan hozzá van kapcsolva egy megfelelő expressziós szabályozó szekvenciarészlethez.

   7. A 6. igénypont szerinti rekombináns DNS molekula, azzal jellemezve, hogy az expressziós szabályozó szekvenciarészlet alkalmassá teszi a rekombináns DNS molekulát, hogy a nukleotid szekvenciarészletet expresszálja.

   8. A 6. igénypont szerinti rekombináns DNS molekula, azzal jellemezve, hogy az expressziós szabályozó szekvenciarészlet alkalmassá teszi a rekombináns DNS molekulát, hogy a nukleotid szekvenciarészlethez képest antiszensz RNS-t expresszáljon.

   9. Az 5. igénypont szerinti rekombináns DNS molekulával transzformált gazdasejt.

   10. A 9. igénypont szerinti gazdasejt, azzal jellemezve, hogy a gazdasejt eukarióta sejt.

   11. A 10. igénypont szerinti gazdasejt, azzal jellemezve, hogy a gazdasejt emlős sejt.

   12. Lényegében tiszta tie fehérje vagy annak funkcionális származéka, illetve fragmentuma.

   13. A 12. igénypont szerinti tie fehérje, azzal jellemezve, hogy a tie fehérje egy tie prekurzor, amely tartalmaz egy, az 1. SZEKVENCIA AZONOSÍTÓ SZÁM alatt megadott szekvenciának körülbelül az 1. aminosavjától körülbelül az 1138. aminosavjáig terjedő részével alapvetően megegyező aminosav szekvenciarészletet.

   14. A 12. igénypont szerinti tie fehérje, azzal jellemezve, hogy a tie fehérje érett tie fehérje, amely tartalmaz egy, az 1. SZEKVENCIA AZONOSÍTÓ SZÁM alatt megadott szekvenciának körülbelül a 22. aminosavjától körülbelül az 1138. aminosavjáig terjedő részével alapvetően megegyező aminosav szekvenciarészletet.

   15. A 12. igénypont szerinti tie fehérje, azzal jellemezve, hogy a fehérje emberi eredetű tie fehérje.

   16. A 12. igénypont szerinti tie fehérje, azzal jellemezve, hogy a fehérje rekombináns DNS eljárással előállított tie fehérje.

   -70* * · ·

   17. A 16. igénypont szerinti tie fehérje, azzal jellemezve, hogy a fehéije emlős eredetű sejttenyészetben előállított tie fehérje.

   18. Rekombináns tie fehéije előállítási eljárás, azzal jellemezve, hogy

   1) izoláljuk a tie fehérjét kódoló nukleotid fragmentumot,
2. 2) a nukleotid fragmentum megfelelő klónozó vektorba történő inszertálása útján expressziós vektort állítunk elő,
3. 3) az expressziós vektorral megfelelő gazdasejteket transzformálunk,
4. 4) a gazdasejteket tenyésztjük, és
5. 5) izoláljuk a tie fehérjeterméket.

   19. A 18. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy tie fehérjeként emberi eredetű tie-t használunk.

   20. A 18. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gazdasejtként emlős eredetű sejteket használunk.

   21. A 18. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy tie fehérjét kódoló nukleotid fragmentumként olyan fragmentumot használunk, amely tartalmaz egy, a 3. SZEKVENCIA AZONOSÍTÓ SZÁM alatt megadott nukleotid szekvenciának körülbelül az 1. nukleotidjától körülbelül a 3845. nukleotidjáig terjedő részével lényegében megegyező szekvenciarészletet.

   22. A 18. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy tie fehérjét kódoló nukleotid fragmentumként olyan fragmentumot használunk, amely tartalmaz egy, a 3. SZEKVENCIA AZONOSÍTÓ SZÁM alatt megadott nukleotid szekvenciának körülbelül a 37. nukleotidjától körülbelül a 3845. nukleotidjáig terjedő részével lényegében megegyező szekvenciarészletet.

   23. A 18. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy tie fehérjét kódoló nukleotid fragmentumként olyan fragmentumot használunk, amely tartalmaz egy, a 3. SZEKVENCIA AZONOSÍTÓ SZÁM alatt megadott

   -71 nukleotid szekvenciának körülbelül a 100. nukleotidjától körülbelül a 3845. nukleotidjáig terjedő részével lényegében megegyező szekvenciarészletet.