JP2000217585A - 転移性ヒトメラノ―マ細胞において減少調節される新遺伝子及びそのタンパク質、その生産方法、並びに使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 本発明の目的は、腫瘍転移において発現が減
少調節されている新規な遺伝子を提供することである。 【解決手段】 本発明では、腫瘍の進行及び／又は転移
において、その発現が減少調節されている、配列番号１
の核酸配列を有する核酸分子TM7XM1を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、転移において減少
調節される新規な遺伝子TM7XN1、それによってコードさ
れるタンパク質、診断及び治療のためのその使用、特に
ガン分野における使用に関する。特に本発明は、哺乳動
物細胞、特にメラノーマ細胞における本遺伝子TM7XN1の
診断、及び腫瘍細胞におけるTM7XN1の機能を回復する遺
伝子治療法に関する。

【０００２】

【従来の技術】メラノーマは、最も攻撃性の高いヒトの
悪性腫瘍の１つである。この型の皮膚ガンは、あまり頻
繁には見られないが、発症率の増加が、憂慮されてい
る。これまで、根治的切除が、治療として選択されてい
るが、この腫瘍が拡散していない場合にのみ成功するも
のである。従って、早期の診断と進行度の評価が、非常
に重要となる。このための分類法を改善するために、分
子マーカーが必要である。

【０００３】これまで、メラニン細胞腫瘍の進行中に発
現差が生じる多数の遺伝子及び遺伝子産物が同定されて
きた(Weterman,M.A.,et al.,Lab.Invest.70(1994)593-6
08)。それらの変化を同定するために、DNA 、mRNA及び
タンパク質レベルにおいて、いくつかの方法論が使われ
た。最近10年間では、発現差が生じるmRNAの検出に、多
くの関心が集まっている。増加又は減少調節される配列
を同定するための方法論の中では、差異的ハイブリダイ
ゼーション、減法的ハイブリダイゼーション、mRNA差異
表示法(Differential Display)、及び遺伝子発現の連続
分析(Velculescu,V.E.,et al.,Science 270(1995)484-4
87) が最も普通である。腫瘍学では、これらの方法を用
いて、いくつかの型の腫瘍（メラノーマを含む）におい
て、発現差が生じる遺伝子を同定及び単離することに成
功した(Shen,R.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA92(199
5)6778-6782; Lee,J.H.,et al.,Int.J.Cancer71(1997)1
035-1044; Zhang,L.,et al.,Science276(1997)1268-127
2; van Groningen,J.J.,etal.,Cancer Res.55(1995)623
7-6243; Yeatman,T.J.,et al.,Nucleic Acids23(1995)4
007-4008; Jiang,H.,et al.,Oncogene11(1995)2477-248
6; Francia,G.,etal.,Cancer Res.56(1996)3855-3858;
Duncan,L.M.,et al.,Cancer Res.58(1998)1515-1520)。

【０００４】メラニン細胞腫瘍の進行に関与すると思わ
れる遺伝子産物を同定及び単離するために、mRNA差異表
示法が行われた。この方法は、Liang and Pardeeによっ
て最初に報告されたものである(Liang,P., and Pardee,
A.B., Science 257(1992)967-971) 。

【０００５】ガンの転移現象は、いくつかの障壁、例え
ば、細胞外マトリックス及び基底膜の分解、血管及びリ
ンパ管内への浸入及び外への浸出、免疫系攻撃からの逃
避、並びに、離れた臓器への定着及びコロニー形成など
を克服する必要がある(Pardee,A.B.,Advances in Cance
r Res.65(1994)213-227; Ponta,H.,et al.,Biochem.Bio
phys.Acta 1198(1994)1-10) 。異なる型のガンの転移で
は、異なる分子機構が利用されること、更に異なる転移
親和性が見られることから、この現象は更に複雑化す
る。

【０００６】細胞接着分子は、腫瘍細胞の浸入、拡散、
浸出及び定着において重要な役割を果たす。拡散した腫
瘍細胞の内皮及び組織支質との相互作用は、腫瘍の進行
及び転移形成における必須過程の１つであると考えられ
る(Ebnet,K.,et al.,Annu.Rev.Immunol.14(1996)155-17
7; Varner,J.A.,and Cheresh,D.A.,Curr.Opin.Cell Bio
l.8(1996)724-730; Albelda,S.M.,Lab.Invest.68(1993)
4-17) 。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、転移
に関与する新規な遺伝子を提供することである。本発明
では、転移性ガン細胞、特にメラノーマ細胞において、
その非転移性の対応細胞に比べて減少調節されているタ
ンパク質TM7XM1のクローニングを記載する。TM7XM1は、
その減少調節のために、転移カスケードのいくつかの過
程を促進することに関与するだろう。

【０００８】

【発明の内容】従って、本発明は、転移性の腫瘍細胞、
好ましくはメラノーマ細胞において、その発現が減少調
節され、且つ、特に悪性メラノーマ細胞において、腫瘍
の進行及び／又は転移の誘導に関わる、単離された核酸
分子(TM7XM1)に関する。本核酸は、下記群中から選択さ
れる： ａ）配列番号１の配列を有する核酸、 ｂ）ストリンジェントな条件下で、ａ）の核酸内のアミ
ノ酸2-315 をコードする核酸断片又はその相補的断片と
ハイブリダイズする核酸、あるいは、 ｃ）上記の核酸の１つによってコードされるポリペプチ
ドをコードするもので、遺伝子コードの縮重を有する核
酸。

【０００９】更に本発明は、本発明の核酸配列、好まし
くは配列番号１のDNA 配列によってコードされる組換え
ポリペプチド、並びに、この様な核酸分子自体に関す
る。

【００１０】本ポリペプチドは、そのDNA 配列、及びそ
れから導かれるアミノ酸配列によって規定される。好ま
しくは、これは、配列番号２のアミノ酸配列、又はその
断片、好ましくはそのアミノ酸1-315 を有する断片であ
る。単離されたTM7XM1ポリペプチドには、個体間で異な
る天然の対立遺伝子性の変異体が存在する。このアミノ
酸の変異は、普通はアミノ酸置換による。しかし、この
変異は、全配列中におけるアミノ酸の欠失、挿入又は付
加でもよい。本発明のTM7XM1タンパク質は、発現される
細胞及び細胞型に応じて、その程度及び種類の両方の点
から、グリコシル化された形又はグリコシル化されてい
ない形と成りうる。TM7XM1を有さない転移性メラノーマ
細胞に、TM7XM1の発現ベクターをトランスフェクション
して、その安定な形質転換体を確立し、そしてマトリゲ
ル浸入検査によるインビトロ浸入性、及びヌードマウス
への異種移植後の転移能を評価することによって、抗転
移活性を有するポリペプチド、及びそれをコードする核
酸を同定できる。

【００１１】「TM7XM1活性を有するポリペプチド、又は
TM7XM1」とは、アミノ酸の微小な変異を有するが、実質
的に同一のTM7XM1活性を有するタンパク質を意味する。
「実質的に同一である」とは、当活性が、同一の生物特
性から成ること、及び、当ポリペプチドのアミノ酸配列
の相同性（同一性）が少なくとも75% であることを意味
する。このアミノ酸の配列同一性は、少なくとも90% で
あることが、より好ましい。

【００１２】「核酸分子又は核酸」とは、例えばDNA, R
NA, PNA 、又はDNA 若しくはRNA の活性誘導体などであ
るポリヌクレオチド分子を意味する。DNA 及び／又はRN
A 分子が好ましい。

【００１３】「ストリンジェントな条件下にハイブリダ
イズする」とは、標準的なハイブリダイゼーション条件
下に、２つの核酸断片が互いにハイブリダイズできるこ
とを意味し、この条件は、Sambrook et al., Molecular
Cloning: A laboratory manual(1989) Cold Spring Ha
rbor Laboratory Press,New York,USAに記載されてい
る。

【００１４】詳しくは、「ストリンジェントな条件」と
は、6.0x SSC中で、約45℃にてハイブリダイゼーション
を行い、そして2.0x SSCによって50℃にて洗浄すること
を意味する。ストリンジェント性を選択する場合、洗浄
過程での塩濃度を選択でき、例えば、低ストリンジェン
ト性のために50℃で約2.0x SSCから、高ストリンジェン
ト性のために約50℃で約0.2x SSCまでの範囲から選択で
きる。更に、洗浄過程での温度を、低ストリンジェント
性のために室温、約22℃から、高ストリンジェント性の
ために約65℃までの範囲で上げることができる。

【００１５】「単離された」とは、TM7XM1活性を有する
核酸又はポリペプチドであって、組換えDNA 法によって
生産する場合には、細胞性の物質又は培地を、あるいは
化学合成する場合には、前駆化学物質又は他の化学物質
を、実質的に含まないことを意味する。この単離された
核酸は、当核酸が得られた生物体において、天然におい
て当核酸を挟んでいる配列（すなわち当核酸の5'及び3'
に位置する配列）を含まないことが好ましい。

【００１６】組換え法によって生産した後、既存のタン
パク質精製法、例えば、親和性クロマトグラフィー、免
疫沈降、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、等
電点クロマトグラフィー、等電点電気泳動、選択沈殿、
又は電気泳動などを利用して、TM7XM1を精製できる。

【００１７】組換え法を用いて、又は合成的に、本発明
のポリペプチドを生産できる。原核生物中で組換え法に
よって生産すれば、未グリコシル化のTM7XM1ポリペプチ
ドが得られる。本発明の核酸配列を利用すると、任意の
希望の細胞（例えば、ヒトの細胞の他に、他の哺乳動物
の細胞）のゲノムにおいて、TM7XM1遺伝子又はその変異
体を検索し、同定し、そしてTM7XM1タンパク質をコード
する希望の遺伝子を単離できる。このための方法及び適
当なハイブリダイゼーション条件は、当業者に周知であ
り、例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A
laboratory manual(1989) Cold Spring Harbor Laborat
ory Press,New York,USA、及びHames,B.D.,Higgins,S.
G., Nucleic acid hybridisation - a practical appro
ach(1985)IRL Press,Oxford,Englandに記載されてい
る。本発明の実験のために、通常は、前記文献に記載さ
れた標準的な方法を使用する。

【００１８】組換えDNA 技術を利用すると、多数のTM7X
N1の活性誘導体を作成できる。この様な誘導体には、例
えば、その単個又は数個のアミノ酸において、置換、欠
失又は付加によって修飾されたものがある。この誘導体
化は、例えば、部位特異的変異法によって達成できる。
この様な多様化は、当業者によって容易に実行される
(J.Sambrook, B.D.Hames, 前記引用文献）。ただし、確
実にTM7XN1の特性が保存されなければならない。従って
また、本発明は、本発明の外来性核酸分子を原核生物又
は真核生物で発現させたTM7XN1ポリペプチドの生産物に
も関する。

【００１９】TM7XM1タンパク質をコードする核酸を利用
して、再現性のある方法で、且つ大容量に、本発明のタ
ンパク質を生産できる。原核生物又は真核生物体中で、
例えば原核宿主細胞又は真核宿主細胞中で、発現するた
めに、当業者に周知の方法に従って、本核酸を適当な発
現ベクターに組み込む。この発現ベクターは、調節性／
誘導性のプロモーターを有することが好ましい。発現の
ために、これらの組換えベクターを、適当な宿主細胞
に、例えば、原核宿主生物としては大腸菌、あるいは真
核宿主生物としてはサッカロミセス・セレビシエ、テラ
トカルシノーマ細胞株PA-1 sc 9117(Buttner et al.,Mo
l.Cell.Biol.11(1991)3573-3583)、昆虫細胞、CHO 又は
COS 細胞に導入し、そしてこの形質転換又は形質導入さ
れた宿主細胞を、この異種遺伝子を発現させる条件下で
培養する。既存の方法に従って、この宿主細胞から、又
は宿主細胞の培養上清から、発現タンパク質を単離でき
る。このための方法は、例えばAusubel I.,Frederick
M., Current Protocols in Mol.Biol.(1992), John Wil
ey and Sons,New York に記載されている。このタンパ
ク質が、細胞培養において可溶性でない場合には、イン
ビトロでのタンパク質の再活性化も必要となる。

【００２０】本発明は、更に、TM7XM1の発現に適する組
換え発現ベクター、この発現ベクターをトランスフェク
ションした組換え宿主細胞、並びに、TM7XM1遺伝子によ
ってコードされるタンパク質を組換え法で生産する方法
にも関する。

【００２１】本発明は、更に、TM7XM1遺伝子の核酸分子
を検出する方法に関し、この方法は、サンプル（例え
ば、血液などの体液、細胞溶解物）を、本発明の単離さ
れた核酸分子とインキュベーションすること、そしてTM
7XM1遺伝子である核酸分子の存在を決定するために、ス
トリンジェントな条件下に、前記の単離された核酸分子
と標的核酸分子とのハイブリダイゼーションを測定する
ことを含んで成り、更に、腫瘍細胞、好ましくはメラノ
ーマ細胞の転移能及び／又は進行を同定する方法にも関
する。

【００２２】本発明の核酸に基づいて、転移性ヒト腫瘍
細胞において、発現が減少調節される核酸を検出するた
めの検査法を提供できる。この様な検査を、核酸診断用
の方法を利用して行うことができる。この場合、検査す
るサンプル、好ましくはメラノーマ細胞を、すなわちメ
ラノーマ細胞からの抽出物中の核酸を、 ａ）配列番号２のポリペプチドをコードする核酸、又は
それに相補的な配列の核酸、あるいは、 ｂ）ストリンジェントな条件下で、ａ）の核酸内のアミ
ノ酸2-315 をコードする核酸断片又はその相補的断片
と、ハイブリダイズする核酸、の群中から選択されるプ
ローブと接触させる。この方法では、前記核酸プローブ
を、サンプル中の核酸とインキュベーションし、そし
て、生じたハイブリダイゼーションを、場合によって
は、サンプル中の核酸及び／又は前記核酸プローブに対
する別の結合体を利用して、検出する。

【００２３】好ましくは、前記ポリペプチド断片2-315
の部分又は全部をコードする核酸断片を、プローブとし
て用いる。

【００２４】前記プローブとサンプル中の核酸とのハイ
ブリダイゼーションは、本タンパク質をコードするRNA
が存在することを意味する。この様な方法は、当業者に
周知であり、例えばWO89/06698, EP-A0200362, USP2915
082, EP-A0063879, EP-A0173251, EP-A0128018に記載さ
れている。

【００２５】好ましい態様では、前記検査の前に、例え
ば既存のPCR 法によって、サンプル中のコード核酸を増
幅する。一般的には、核酸診断の範囲内で、誘導化（標
識化）された核酸プローブを用いる。このプローブを、
担体に結合したサンプル中の変性DNA 又はRNA と接触さ
せる。この時、この標識DNA 又はRNA が、相同なDNA又
はRNA に結合する様に、温度、イオン強度、pH及びその
他の緩衝液条件を、核酸プローブの長さと組成、及び期
待されるハイブリッドの融解温度に応じて選択する(Wah
l,G.M.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA76(1979)3683-3
687)。担体としては、ニトロセルロースを基にした膜又
は担体物質（例えばSchleicher and Schull,BA85; Amer
sham,Hybond C)、強化又は結合されたニトロセルロース
粉末、あるいは種々の官能基（例えばニトロ基）によっ
て誘導化されたナイロン膜（例えばSchleicher and Sch
ull,Nytran; NEN,Gene Screen; Amersham,Hybond M; Pa
ll,Biodyne) が適当である。

【００２６】次に、前記担体を十分に洗浄し、非特異的
結合を抑えるために、その様な結合部位を飽和させた後
に、抗体又は抗体断片とインキュベーションすることに
よって、ハイブリダイズしたDNA 又はRNA を検出する。
この抗体又は抗体断片は、誘導化の際に核酸プローブに
導入した物質に対するものである。抗体とのインキュベ
ーション後に、特異的に結合した抗体複合体を検出する
ために、再度前記担体を洗浄する。抗体又は抗体断片上
の標識を利用して、既存の方法に従って識別を行う。

【００２７】発現の検出を、例えば以下の方法で行うこ
とができる：固定化細胞、固定化組織標本及び単離した
中期染色体のin situ ハイブリダイゼーション；コロニ
ーハイブリダイゼーション（細胞の場合）及びプラーク
ハイブリダイゼーション（ファージ及びウイルスの場
合）；サザンハイブリダイゼーション（DNA 検出）；ノ
ーザンハイブリダイゼーション（RNA 検出）；血清分析
（例えばスロットブロット分析による血清中の細胞種の
分析）；増幅（例えばPCR 法）。

【００２８】従って本発明は、メラノーマ細胞の転移能
を検出する方法にも関し、この方法は、 ａ）ガン特にメラノーマの患者の体液、患者のメラノー
マ細胞、又はこのメラノーマ細胞の細胞抽出液若しくは
細胞培養上清に由来する、核酸を含有するサンプルを、
(i) 配列番号１の核酸、又はそれに相補的な核酸、及
び、(ii)ストリンジェントな条件下で、(i) の核酸内の
アミノ酸2-315 をコードする核酸断片又はその相補的核
酸と、ハイブリダイズする核酸、の群中から選択された
核酸プローブとインキュベーションすること、並びに、 ｂ）サンプル中の核酸及び／又は前記核酸プローブに対
する別の結合体を利用するか、あるいはＸ線写真によっ
て、ハイブリダイゼーションを検出すること、を含んで
成る。

【００２９】好ましくは、前記核酸プローブを、サンプ
ル中の核酸とインキュベーションし、そして、場合によ
ってはサンプル中の核酸及び／又は核酸プローブに対す
る別の結合体を利用して、ハイブリダイゼーションを検
出する。

【００３０】従って、本発明の核酸は、患者の腫瘍細
胞、好ましくはメラノーマ細胞の転移能及び進行能の診
断において、貴重な予測マーカーとなる。

【００３１】更に本発明は、その発現が腫瘍の転移性と
相関するタンパク質を生産する方法に関する。このタン
パク質は、本発明の核酸分子、好ましくは配列番号１の
DNA配列によってコードされるものであり、本方法は、
原核又は真核宿主細胞中で外来DNA を発現させ、そして
そのタンパク質を単離することに依る。

【００３２】本タンパク質を、前記細胞又は細胞培養上
清から単離でき、そしてクロマトグラフィー法、好まし
くはイオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグ
ラフィー及び／又は逆相クロマトグラフィーによって精
製できる。

【００３３】更に本発明は、本発明の核酸分子によっ
て、好ましくは配列番号１のヌクレオチド配列を有する
核酸によってコードされる、単離された本発明のタンパ
ク質に関する。

【００３４】本発明は、腫瘍の進行中に減少調節される
TM7XM1遺伝子のクローニング及び特性評価に関する。本
発明の遺伝子(TM7XM1)の機能は、腫瘍細胞の接触阻害及
び足場依存性を増強することであり、その減少調節によ
って、転移カスケードに必須な他の過程が促進される。
従って、TM7XM1遺伝子の減少調節は、腫瘍細胞の攻撃性
の強化、更に転移形成能に相関する。

【００３５】本発明では、インビボで、好ましくは体細
胞遺伝子治療によって、腫瘍の進行／転移、好ましくは
悪性メラノーマ及び乳ガンの進行／転移を抑制するため
に、TM7XM1の発現促進剤を利用できる。

【００３６】本発明の遺伝子は、ヌードマウスに皮下接
種した後の８種類の異なるヒトメラノーマ細胞株の転移
能と逆相関する。

【００３７】TM7XM1の3845塩基対のDNA は、687 アミノ
酸から成るタンパク質をコードする読み取り枠を有する
（配列番号２において、シグナルペプチド：-25--1；成
熟タンパク質：1-662)。ノーザン分析による推定値4.2k
b と、3845bpの完全長cDNAとの長さの差は、可変性ポリ
-A尾部によって説明される。TM7XM1は、N-末端に長い細
胞外ドメインを有する７回膜貫通組込み(TM7) 型の新規
なタンパク質であり、相同性の点から、G-タンパク質と
共役するペプチドホルモン受容体の急増中の一群、セク
レチン受容体群に分類され得る。この群内で、最近、EG
F-TM7 亜群が認められ(McKnight,A.J. and Gordon,S.,
Immunol.Today17(1996)283-287) 、その中で、EGF 結合
ドメインの数が異なるいくつかのスプライス変異体が報
告された(McKnight,A.J. and Gordon,S., J.Leukoc.Bio
l.63(1998)271-280)。更に、長いN-末端ドメインを有す
る他のセクレチン受容体様TM7 型分子がいくつか報告さ
れているが、全てEGF 結合ドメインを欠いたものである
(Tensen,C.P.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA91(1994)
4816-4820; Osterhoff,C.,et al.,DNA Cell Biol.16(19
97)379-389; Nishimori,H.,et al.,Oncogene15(1997)21
42-2150; Shiratsuchi,T.,et al.,Cytogenet.Cell Gene
t.79(1997)103-108; Lelianova,V.G.,et al.,J.Biol.Ch
em.272(1997)21504-21508)。これらの分子のいくつか
は、EGF 結合ドメインの代わりに、その長いN-末端に、
他のタンパク質結合ドメインを有する。これらの二重機
能性のタンパク質は、遺伝子再編成、例えばエクソンの
組換え混合によって、TM7 型タンパク質が、他の遺伝子
からタンパク質結合ドメインを獲得することによって、
生じたと思われる(Probst,W.C.,et al.,DNA Cell Biolo
gy11(1992)1-20; van Lier,R.A.,et al.,Immunol.Lett.
54(1996)185-187; Hamann,J.,et al.,Genomics32(1996)
144-147)。

【００３８】TM7XM1タンパク質は、いくつかのドメイン
から成る（図２〜５）。シグナル配列(aa -25- -1)の後
には、数個のシステインによって主に決定される三次構
造をとるドメインが続く。この領域の後に、ムチン様
の、システインの無い高度にグリコシル化された間隙部
位が続く。最初のTMの直前には、いわゆるシステインボ
ックスが位置する(aa 321-364)。このシステインボック
スを含むN-末端ドメインは、アミノ酸2-379 に亘る。C-
末端には、７つの膜貫通ドメイン(aa 380-402; 414-43
3; 444-467; 485-506; 540-563; 578-599; 609-631)と
細胞質尾部(aa 632-662)が位置する。この細胞質尾部に
は、AMP 結合部位があり、これは、リン酸化部位と共
に、細胞内シグナル経路に関与する構成要素と相互作用
することが示唆されている。TM7XM1と他の相同遺伝子と
の関係を明らかにするために、TM7XM1を、セクレチン受
容体群に属する２つのタンパク質、EGF-TM7 群に属する
報告された全タンパク質、非EGF 結合ドメインを含有す
る長いN-末端を有する以前に報告された全てのセクレチ
ン受容体相同物、及び、相同性検索の際に見つかった他
のいくつかの相同物と、整列及び比較した。この比較に
基づいて、G-タンパク質に共役する受容体であるセクレ
チン受容体群において、新規なLN-TM7亜群を設定でき
る。この分子群は、C-末端のTM7 ドメイン、セクレチン
受容体との相同性、更に少なくとも300bp の長さのN-末
端細胞外ドメインという観点から同定される。対照的
に、セクレチン様ペプチドホルモン受容体のN-末端は、
200bp よりも短い。この長いN-末端が、リガンドを捉
え、そしてそのリガンドをTM7 構造内に位置する結合孔
に提示すると推定されている。ペプチドホルモン受容体
は、ペプチド性リガンドの短さから、前記の様に長いN-
末端を必要としない(Tensen,C.P.,etal.,Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA91(1994)4816-4820)。セクレチン群に属する
元々のペプチドホルモン受容体には存在しない、高度に
保存されたシステインボックス(C-x₂-W-x_6-14-G-x-W-x₃
-GC-x₉-T-x-C-x-C-x-HL-x₂-FAVLM) 、及び、LN-TM7特異
的な前記保存残基から、これらのタンパク質の役割及び
配置を指摘する付加的情報を得ることができる。このシ
ステインボックスは、非TM7 タンパク質、例えば可溶性
のrho 結合性シトロン(citron)(Madaule,P.,et al.,FEB
S Lett.377(1995)243-248)、及びF31D5.4 にも見つかっ
ている。F31D5.4 は、TM7XN1相同物のF31D5.5 と同様
に、C.エレガンスのコスミドF31D5 に由来するタンパク
質である。BOSS及びGRL101の相同性の低さは、進化上の
距離の長さを意味しているのだろう。

【００３９】しかしながら、本分子のTM7 部分で、約30
％程度の相同性が認められるだけである。システインボ
ックス外のN-末端部分、アミノ酸1-315 又は25-315（シ
グナルペプチドを含まない場合）、及び／又はC-末端尾
部(638-652) は、独特であり、本発明のタンパク質に特
有であり、他のヒトタンパク質との相同性を示さない。
従って、好ましいTM7XN1ポリペプチド断片は、アミノ酸
１〜25の中から始まり、アミノ酸315 付近で終わるもの
である。膜貫通による結合を望む場合には、このポリペ
プチドは、更に、適当な膜貫通ドメインと、好ましくは
細胞質ドメインを有する。

【００４０】最も研究されているEGF-TM7 の発現は、主
に、造血系細胞と固形腫瘍由来の細胞株に限られている
(McKnight,A.J. and Gordon,S., Immunol.Today17(199
6)283-287) 。それらは、免疫上の役割を有する白血球
抗原として記載されている。最近、CD97の発現が、甲状
腺腫瘍においても報告された(Aust,G.,et al.,Cancer R
es.57(1997)1798-1806) 。LN-TM7は、いくらか広範な発
現パターンを示す。CD97に関しては、甲状腺（上皮小
体）腫瘍において、KIAA0279(AA843289;EMBL) の発現と
しても認められる。これは、TM7XN1と同様に、主に精
巣、脳、腎臓及び前立腺で発現している(Hamann,J.,et
al.,J.Immunol.155(1995)1942-1950) 。ラトロフィリン
(Latrophilin) のヒトEST 相同物が、精巣で(AA778576;
EMBL) 、そしてまた上皮小体で(AA843854/AA705981;EMB
L)見つかっている。ラットでは、ラトロフィリンは脳で
も発現していた(Lelianova,V.J.,et al.,J.Biol.Chem.2
72(1997)21504-21508)。BAI 遺伝子は、脳で発現してい
て、心臓ではより低量で発現している。GRL101の発現パ
ターンは、BAI と類似していて、中枢神経系の神経で、
そしてまた心臓でも活性を示す。HE6 は、これまで精巣
上体管でのみ検出されている(Osterhoff,C.,et al.,DNA
Cell Biol.16(1997)379-389) 。

【００４１】16q13 上に位置することから、TM7XN1遺伝
子は、円柱腫に関与する腫瘍抑制因子遺伝子cyld1 の候
補となる。円柱腫は、稀な常染色体優性皮膚疾患であ
り、皮膚付属器の良性新生物を形成する。このcyld1 遺
伝子は、染色体16q12-q13 に位置している(Biggs,P.J.,
et al.,Oncogene12(1996)1375-1377) 。

【００４２】結論として、TM7XN1は、長いN-末端ドメイ
ンを有する７回膜貫通型タンパク質から成る新規なLN-T
M7群に分類される新規なタンパク質である。LN-TM7群の
分子は、G-タンパク質と共役し、長い細胞外尾部を有す
る膜結合型のタンパク質である。ほとんどがタンパク質
結合ドメインである機能性ドメインが、長い棒状のグリ
コシル化間隙部位を介して、外部環境に提示されてい
る。全細胞外ドメインは、土台として機能するシステイ
ンボックスによって保持且つ安定化されていると思われ
る。この様にして、接着活性が、細胞内シグナル伝達に
共役し得る。

【００４３】更に本発明は、TM7XM1のアゴニスト又はTM
7XM1の発現促進剤を同定及び単離する方法を提供する。
インビボで、好ましくは体細胞遺伝子治療によって、腫
瘍の進行又は転移を抑制し、且つ腫瘍細胞の大量アポト
ーシスを誘導するために、この様なアゴニスト及び促進
剤を利用できる。

【００４４】本発明では、ガンを治療する際に、特に転
移及びそれに関連する疾患を抑制する際に利用される化
合物を同定及び単離する方法が提供される。本方法に
は、本発明のポリペプチドの発現を調節する方法、本ポ
リペプチドに選択的に結合する化合物を同定する方法、
及び、本ポリペプチドの活性を調節する化合物を同定す
る方法が含まれる。更に本方法には、TM7XM1遺伝子のmR
NAへの転写を調節する方法、好ましくはこの転写を誘導
する方法があり、好ましくは、この方法によって、腫瘍
細胞の転移能を減少調節する。これらの方法はインビト
ロ及びインビボで行われ、更にこの方法では、本発明に
関する細胞株及びトランスジェニック動物を確立して利
用できる。

【００４５】TM7XM1アゴニストとは、TM7XM1ポリペプチ
ドの生物活性を増加し、及び／又はTM7XM1遺伝子の転写
又は翻訳を活性化する物質又は化合物のことである。一
般的には、TM7XM1アゴニストのスクリーニング法は、TM
7XM1の発現減少を介して浸潤性を呈する宿主細胞に、候
補物質を接触させることを含んで成り、TM7XM1活性を測
定するために、及び／又は、抗TM7XM1抗体及び／又はTM
7XM1タンパク質若しくはそのタンパク質断片を用いた免
疫的検査(ELISA) を行うために好ましい条件で行う。

【００４６】いくつかの方法で、TM7XM1活性を測定でき
る。典型的には、細胞の生理学的変化、例えばインビト
ロでの運動性及び浸潤性の低下、又は分化速度の変化、
又は増殖を低下させる細胞代謝の変化から、その活性が
判明する。

【００４７】腫瘍細胞の増殖及び拡散を阻害する薬剤を
同定及び設計するために、本発明のTM7XM1遺伝子及びタ
ンパク質を利用できる。

【００４８】TM7XM1タンパク質の精製は、好ましくは、
抗TM7XM1抗体を用いた親和性クロマトグラフィーによっ
て行われる。この抗体は、本タンパク質を抗原又は免疫
原として用いて、既存の方法に従って容易に得られる。
従って、本発明は、抗体生産のためにTM7XM1タンパク質
を使用することにも関する。抗TM7XM1抗体は、適当な脊
椎動物に、精製したTM7XM1又はそのポリペプチド断片
を、好ましくはアジュバントと共に免疫接種することに
よって作成される。このペプチド断片は、好ましくはTM
7XM1に特有なタンパク質領域に由来する断片であり、５
〜300 個のアミノ酸から成るもので、アミノ酸1-315 及
びアミノ酸638-652 が好ましい。この様な方法は周知で
あり、文献、例えばHarlow and Lane eds., Antibodie
s:A laboratory manual(1988), Cold Spring Harbor La
boratories Press に記載されている。

【００４９】この目的のために通常用いられる動物、例
えば、特にヒツジ、ウサギ又はマウスを、本発明のタン
パク質又は好ましい断片によって免疫化し、そして、既
存の方法に従って、免疫化された動物から抗血清を単離
するか、又は、Kohler and Milstein,Nature256(1975)4
95-497に記載された方法に従って、免疫化された動物の
脾臓細胞を、不死化された細胞、例えばミエローマ細胞
と融合する。この様にして得たハイブリドーマ細胞か
ら、TM7XM1タンパク質に対するモノクローナル抗体を生
産する細胞を選択してクローン化する。TM7XM1を免疫吸
着的に精製するために、得られたモノクローナル又はポ
リクローナル抗体を、支持物質、例えばセルロースに結
合する。更に、サンプル中、例えば組織断片又は体液中
のTM7XM1を検出するために、好ましくは悪性疾患の診断
のために、最も好ましくは腫瘍細胞の転移能を決定する
ために、この抗体を利用できる。この様な検査では、特
定の過程において、TM7XM1がその抗体と免疫的に結合す
る。従って、本発明は、TM7XM1タンパク質によって動物
を免疫化し、そしてその動物の血清又は脾臓細胞から抗
体を単離することによって得られる、TM7XM1タンパク質
に特異的な抗体に関し、更に、TM7XM1の検出のための、
その使用に関する。

【００５０】本発明の抗体は、好ましくは、陰性及び陽
性のメラノーマ細胞に対する免疫組織化学法及びウエス
タンブロット法に用いられる。

【００５１】本発明をより理解するために、以下の実施
例、参考、配列表及び図を提供するが、本発明の範囲
は、請求の範囲に示されたものである。本発明の趣旨か
ら外れることなく、前記の態様に従って改変が可能であ
る。

【００５２】

【実施例】材料と方法 メラノーマ細胞株 23種類のヒトメラノーマ細胞株を用いた。検査群の８種
類のメラノーマ細胞株には、530, 1F6, M14, Mel57, BL
M, MV3, MV1,及び1F6 の転移性亜株である1F6mが含まれ
る(Westphal,J.R.,et al.,Br.J.Cancer76(1997)561-57
0) 。この細胞株の検査群では、530 及び1F6 は、転移
性の低い細胞株であり、一方MV3 及びBLMは、転移性の
高い細胞株である。MV1, M14及びMel57 は、中間の転移
性を有する細胞株である。1F6mは、前記の転移性の高い
細胞株と中間の転移性の細胞株との間に位置する。用い
た他のヒトメラノーマ細胞株は、451Lu, 518A2, 603, A
375m, A375p, Bowes, BRO, E10, M24met, MKR, OCM1, O
MM1, SKmel28, WM164 及びZKR であった。非メラノーマ
細胞株として、種々の腫瘍由来の細胞株A431, CaCo2,Da
udi, HepG2, HT29, HT1080, Jurkat, K562, Molt4, U93
7, Umscc2及びU2OSを用いた。これらの多くの細胞株の
起源は、de Vries,T.J.,et al.,Cancer Res.57(1997)32
23-3229 に記載されている。A431, HepG2, HT29, HT108
0, K562 及びU937(Quax,P.H.,et al.,Cancer Res.50(19
90)1488-1494) 、BRO(Lockshin,A.,et al.,Cancer Res.
45(1985)345-450)、OCM1(Danen,E.H.,et al.,Melanoma
Res.6(1996)31-35) 及びOMM1(Luyten,G.P.,et al.,Int.
J.Cancer66(1996)380-387)は、他の文献に記載されてい
る。細胞株451Lu 及びWM164(Juhasz,I.,et al.,Am.J.Pa
thol.143(1993)528-537)、並びに、MKR 及びZKR(Scheib
enbogen,C.,et al.,Int.J.Cancer54(1993)494-498)は、
これらの細胞を樹立した研究所から提供された。細胞株
A375m, A375p, A431, Bowes, CaCo2, Daudi, Jurkat, M
olt4及びSKmel28 は、American Type Culture Collecti
on(Rockville,MD,US) から入手した。

【００５３】全ての細胞株を、10%FCS（ウシ胎児血清）
(BioWhittaker,Walkersville,MD,US) 及び抗生物質を補
充したダルベッコ改変イーグル培地(BioWhittaker)又は
RPMI(BioWhittaker)中で培養した。5%CO₂ の保湿大気中
で、37℃にて培養細胞を維持した。

【００５４】初代培養細胞、例えばメラノサイト、母斑
細胞、線維芽細胞、ケラチノサイト、内皮細胞、周皮細
胞、平滑筋細胞及び樹状細胞を、それらに特異的な条件
下にインビトロで培養した。線維芽細胞を、20% ヒト血
清、10%FCS、及び抗生物質を補充したイーグル最小必須
培地(BioWhittaker)中で培養した。ケラチノサイトを、
50mg/Lのウシ下垂体エキス(Gibco,Grant Island,NY,U
S)、５μg/L のヒトEGF(表皮増殖因子)(Gibco)、２mMグ
ルタミン、１mMピルビン酸塩及び抗生物質を補充した無
血清培地(Gibco) 中で培養した。メラノサイト及び母斑
細胞を、2%Ultroser-G合成血清(Gibco) 、0.1mM IBMX
(3'-イソブチル-1- メチル- キサンチン)(Sigma,St.Lou
is,MO)、10ng/L PMA( ホルボール-12-ミリステート-14-
アセテート)(Sigma)、２mMグルタミン、１mMピルビン酸
塩及び抗生物質を補充したHAM のF10培地(BioWhittake
r)中で培養した。

【００５５】ヒトメラノサイト病巣 Nijmegen大学病院（オランダ）で、患者から、メラノサ
イト腫瘍の進行の全ステージで、その病巣を切り出し
た。切り出した各病巣から、その中心付近を取り出し、
周囲の皮膚及び脂肪のほとんどを取り除いた後、液体窒
素中でスナップ式に凍結し、そして使用まで -80℃で保
存した。

【００５６】RNA の単離 RNeasyキット(Qiagen,Hilden,DE)を用いて、その説明書
に従って、培養細胞から総RNA を単離した。乳棒を用い
て、１mlのRNAzolB(TM)(Campro,Veenendaal,NL) 中で、
厚さ20μm の約25個の凍結サンプルを破砕することによ
って、組織サンプルから総RNA を単離した。RNAzolB の
方法完了後、RNeasyキットによってメラニン（色素）及
びDNA を除き、RNA サンプルを精製した。

【００５７】mRNA差異表示法 差異表示法のPCR 開始前に、MessageClean(TM)キット(G
enHunter Corp.,Brookline,US)によって、RNA サンプル
にDNアーゼＩ処理を施した。差異表示法のために、いく
つかの微小の変更を加えたRNAmap(TM)の方法を利用し
た。要するに、DNアーゼ処理した総RNA200ng (1xRT緩衝
液:125mM Tris-HCl pH8.3, 188mM KCl, 7.5mM MgCl₂, 2
5mM ジチオスレイトール）に対して、１μM のT₁₂MN プ
ライマー、20μM のdNTP混合物、及び100 単位のMoMLV
逆転写酵素(Life Technologies,Rockville,MD,US) の存
在下で、RT-PCR（逆転写酵素-PCR）を行った。このcDNA
の10分の１を、１μM のT₁₂MN プライマー、20μM のdN
TP-dATP 混合物、500nM の任意プライマー(AP)、１単位
のAmpliTaq(TM)DNA ポリメラーゼ(Perkin-Elmer,Branch
burg,NJ,US) 及び５μCi [α-³²P]-dATP(3000mCi/mmol;
Amersham,Little Chalfont,UK) の存在下で、PCR(1xPC
R 緩衝液:10mM Tris-HCl pH9.0, 1.5mM MgCl₂)によって
増幅した。元々の方法とは異なり、[³⁵S]-dATPの代わり
に[³²P]-dATPを用いた。このPCR では、４つのT₁₂MN プ
ライマーと６つの任意プライマーAP_{1,2, 6,7,11}及び₁₂(B
auer,D.,et al.,Nucleic Acids Res.21(1993)4272-428
0) との組合せを用いた。全てのPCR 反応を、Thermocyc
ler480(Perkin-Elmer,Branchburg,NJ,US)を用いて行っ
た。94℃５分間の変性後に、40回のPCR 反応（94℃30秒
間、40℃２分間、及び72℃30秒間）を行い、そして72℃
５分間の伸長を行った。このPCR 産物3.5 μl を添加用
緩衝液と混ぜ、そして、6%の配列決定用の変性条件のゲ
ル上で分離した。ゲルを乾燥し、Kodak Xomat-S フィル
ムを用いてオートラジオグラフィーを行った。

【００５８】cDNAの単離及び増幅 このゲルから、発現差のあるcDNAバンドを切り出し、そ
のcDNAをゲルから抽出し、そして再度増幅した。再PCR
の条件は、非放射性dATPを加えること、且つ標準のdNTP
混合液を用いること以外は、差異表示法のPCR の条件と
同じである。再増幅されたcDNAを、臭化エチジウム含有
の2%アガロースゲルで検定した。予想した大きさのPCR
産物を、DNA Clean-upキット(Promega,Madison,WI)を用
いて、そのゲルから精製し、そしてノーザンブロット分
析のためのプローブとして用いた。

【００５９】cDNAのクローニング及び選別 発現差のあるcDNAを、pCRII-TAクローニングベクター(I
nvitrogen,Madison,WI) にクローン化し、そして、ドッ
トブロット選別法(Callard,D.,et al.,Biotechniques16
(1994)1096-1097; Callard,D.,et al.,Biotechniques16
(1994)1100-1103)を用いて、偽陽性を同定した。この様
にして、最も陽性の、発現差のあるcDNAを選んだ。挿入
DNA の長さを調べるために、コントロール制限分析（挿
入部位はEcoRI に挟まれている）を行った。

【００６０】ノーザンブロット分析 10μg の総RNA を、グリオキサール/DMSO で処理し(Sam
brook et al.,Molecular Cloning:A laboratory manual
(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press,New Yor
k,USA) 、1.2%アガロースゲルで分離し、そしてHybondN
+膜(Amersham,Aylesbury,UK) に転写した。ランダムプ
ライマーによるDNA 標識キット(Boehringer Mannheim G
mbH,Mannheim,DE)を用いて、cDNAプローブを[³²P]-dATP
で放射性標識した。この膜を、ハイブリダイゼーション
混合液(0.25Mリン酸ナトリウム緩衝液pH7.2, 7%SDS, 1%
BSA, 1mMEDTA, 0.1mg/ml単鎖のサーモン精子DNA)中で、
65℃で標識プローブによって一晩ハイブリダイズした。
その後、この膜を、洗浄緩衝液(1%SDS, 1mMEDTA, 0.25-
0.05M リン酸ナトリウムpH7.2)によって、その塩濃度を
下げながら、65℃で洗浄し、そしてKodak Xomat-S フィ
ルム上でオートラジオグラフィーを行った。

【００６１】cDNAライブラリーのスクリーニング 前記通りcDNAプローブを標識し、そしてヒトメラノーマ
細胞株530 のλZAP によるcDNAライブラリーとハイブリ
ダイズした(Sambrook et al.,Molecular Cloning:A lab
oratory manual(1989)Cold Spring Harbor Laboratory
Press,New York,USA) 。

【００６２】RT-PCR 種々のヒトの細胞、腫瘍細胞株において、そしてヒトメ
ラノサイト病巣において、前記の単離クローンのmRNAの
発現を調べるために、RT-PCRを行った。0.5-1.0 μg の
総RNA から、AMVRT キット(Boehringer Mannheim GmbH,
Penzberg,DE)を用いて、cDNA合成を行った(25 ℃10分間
後、42℃59分間) 。反応液に、0.04単位のランダムヘキ
サデオキシヌクレオチドプライマー、２μl の25mM MgC
l₂、１μl の10mM dNTPs、１μl のRT緩衝液(100mM Tri
s/HCl pH8.3, 500μM KCl)、25単位のRNasin、10単位の
AMV 逆転写酵素、及び、最終容量10μl までの水を添加
した。増幅するために、このcDNAの10分の１に、2.5 μ
l のPCR 緩衝液(200mM (NH ₄)₂SO₄, 750mM Tris/HCl pH
9, 0.1%Tween), 5 μl の1M dNTPs、10pmolesの各プラ
イマー、2.5 μl の15mM MgCl₂、0.15単位のThermoperf
ectplus(TM)DNAポリメラーゼ(Integro,Zaandam,NL)、及
び、最終容量25μl までの水を添加した。このPCR で
は、94℃45秒間、59℃１分間及び72℃１分30秒間の反応
を30サイクル行った。この反応前に94℃３分間の変性を
行い、反応後に72℃５分間の伸長を行った。全ての増幅
を、Eppendorf Mastercycler5330(Eppendorf,Hamburg,D
E)で行った。プライマー組及びPCR 産物の長さを以下に
示す： β₂-ミクログロブリン： センス： 5′-CTCGCGCTACTCTCTCTTTCT-3′（配列番号３） アンチセンス： 5′-TGTCGGATTGATGAAACCCAG-3′（配列番号４） cDNA産物長：136bp TM7XN1 cDNA: センス： 5′-CCATCTTTCTGGTGACGC-3 ′（配列番号５） アンチセンス： 5′-GAGCTGATGGGGAGCCTG-3 ′（配列番号６） cDNA産物長：474bp

【００６３】染色体上の位置 対応する遺伝子の染色体上の位置を、ハムスター／ヒト
及びマウス／ヒトのハイブリッド細胞株の一群を用い
て、ゲノムPCR によって決定した(Geurts van Kessel,
A.H.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA80(1983)3478-375
2) 。ヒトの１つの染色体に特異的である前記細胞株のD
NA は、Dr.A.Simons(Department of HumanGenetics, Un
iversity Hospital Nijmegen,The Netherlands) から提
供された。このPCR の条件は、前記のcDNAプライマーの
組合せのために用いられた条件と同じであった。イント
ロンに広がる下記のプライマーを用いた： TM7XN1 DNA: センス： 5′-GCTCTGTCTCTCGTGGTC-3 ′（配列番号７） アンチセンス： 5′-GCATGGTCCACAGTTCTTG-3′（配列番号８） cDNA産物長：528bp

【００６４】DNA 配列の決定及び相同性検索 トランスフェクションした大腸菌JM109 細胞を培養した
後、クローン化され、再増幅されたPCR 断片を、Wizard
miniprep キット(Promega,Madison,WI)によって精製
し、そしてAmpliCycle(TM)配列決定キット(Perkin-Elme
r,Branchburg,US)を用いて、その配列を決定した。BLAS
T(Altschul,S.F.,et al.,J.Mol.Biol.(1990)403-410)、
並びにインターネット上の全公的サイトのDNA 及びタン
パク質データベースに関する他のプログラム(http://ww
w.genome.ad.jp/; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/; htt
p://expasy.hcuge.ch/; http://dot.imgen.bcm.tmc.ed
u:9331/; http://www.genome.wi.mit.edu/)によって、
相同検索を行った。

【００６５】実施例１ 発現差の生じたcDNAの単離 ヒトメラノーマ細胞株1F6 とその転移性変種1F6mとの間
で発現差があるmRNAを探索するために、差異表示法にお
いて24組のプライマー対（４つのT12MN 及び６つのAP）
を用いた。約30個の差異のあるcDNAが検出された（図1
A）。その全てのcDNAを、TAクローニングベクターにク
ローン化した。異なった転移能を有するヒトメラノーマ
細胞株の検査群のRNA を転写したノーザンブロット膜を
ハイブリダイズした結果、３個の発現差のあるクローン
が残った。そのcDNAの１つであるクローン25を用いた場
合、4.2kb 及び1.0kb の２つのバンドが判明した（図1
B）。この4.2kb 転写産物は、転移性が低い、及び中間
の細胞株である530, 1F6, MV1及びM14 でのみ顕著に発
現していた。Mel57 ではmRNAの分解が見られ、一方転移
性の高い細胞株MV3 及びBLM では、その発現は検出され
なかった。非常に弱い発現が、1F6m細胞で認められた。
弱い方の1.0kb バンドは、相同なmRNAであるか、又は代
替転写産物であるかもしれない。あるいはそれは非特異
的ハイブリダイゼーションであるかもしれない。3'ポリ
A-尾部を含む250bp の部分cDNAの配列を決定し、そして
相同検索した結果、いくつかのヒトのEST と有意に相同
であった。

【００６６】実施例２ 完全長のcDNAのクローニング 250bp の部分的cDNAをプローブとして、ヒトメラノーマ
細胞株530 のλZAP によるcDNAライブラリーをスクリー
ニングした。この細胞株は、ノーザンブロット分析から
4.2kb の転写産物の発現が検出されたものである。3845
bpの完全長のcDNAを単離し、その配列を決定した（図２
〜５）。このcDNAには、687 アミノ酸から成る読み取り
枠(ORF) が含まれ、その中にはC-末端の７つの膜貫通ド
メイン及びN-末端のシグナルペプチドが存在した。本タ
ンパク質では、ロイシンとセリンの含量が非常に高く、
各々14.8と11.1% 含まれる。その細胞外部分には、７つ
のN-結合型グリコシル化部位も含まれる。いくつかのイ
ンターネットサイトにある全種類のデータベース及びプ
ログラムによって、相同検索及びドメイン検索を行った
ところ、いくつかの種類の正常及び腫瘍組織に由来する
多数のヒトEST と完全に相同であることが分かった。最
も相同な既知の遺伝子は、G-タンパク質共役型受容体の
セクレチン／カルシトニン群、特にEGF-TM7 亜群に属す
るものであった。既知のドメインとの相同性からは、長
いN-末端部分の機能に関する情報は得られなかった。EG
F-TM7 群分子との相同性から、本分子をTM7XN1と名付け
た。

【００６７】相同検索 C-末端の膜貫通ドメインでの高い相同性から、本遺伝子
は、G-タンパク質共役型受容体のセクレチン／カルシト
ニン群に分類され得る。TM7XN1は、EGF-TM7 群のCD97と
EMR1に最も相同であった。C-末端部分での30％の同一性
の次に、長い細胞外N-末端部分での相同性があるが、そ
の部分は、EGF-TM7 群に特徴的なEGF 結合ドメインを欠
いている。その他の興味あるドメインを調べるために、
MOTIFFINDER(http://www.motif.genome.ad.jp)を用い
た。いくつかのリン酸化部位の他に、７つのN-グリコシ
ル化部位が、細胞外部分に見つかった。細胞内部分で
は、いくつかのリン酸化部位の次に、推定上のAMP 結合
ドメイン(aa675-686) が予想された（図２〜５）。PSOR
T II(http://psort.nibb.ac.jp) を利用したところ、TM
7XN1は、小胞体膜又は細胞膜中に存在することが予想さ
れた。

【００６８】TM7XN1と、セクレチン受容体及びEGF-TM7
分子との関係について更に情報を得るために、TM7XN1
を、以前に見つかった他の群構成物と、更に、TM7XN1の
部分の相同検索中に見つかった他のタンパク質と比較し
た。ヒトの相同物が知られていない場合には、ヒト以外
の起源に由来するタンパク質を用いた。用いたヒト由来
の分子は、カルシトニン受容体 (Gorn,A.H.,et al.,J.C
lin.Invest.90(1992)1726-1735) 、セクレチン受容体
(Jiang,H.,et al.,Oncogene 11(1995)2477-2486),HE6
(ヒト精巣上体遺伝子産物６）(Osterhoff,C.,et al.,DN
A Cell Biol.16(1997)379-389),BAI-1(脳特異的血管形
成阻害因子１）(Nishimori,H.,et al.,Oncogene 15(199
7)2145-2150),BAI-2及びBAI-3(Shiratsuchi,T.,et al.,
Cytogenet.CellGenet.79(1997)103-108),CD97(Hamann,
J.,et al.,J.Immunol.155(1995)1942-1950),EMR1(EGF様
領域含有ムチン様ホルモン受容体様配列１）(Baud,V.,e
t al.,Genomics 26(1995)334-344),KIAA0279(Nagase,
T.,et al.,DNA Res.3(1996)341-354) 、並びにR29368.2
(Mohrenweiser,H.,et al.,Cytogenet.Cell Genet.74(19
96)161-186) である。BO457.1 及びF31D5.5(Wilson,R.,
et al.,Nature 368(1994)32-38),BOSS(bride of sevenl
ess)(Hart,A.C.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(19
93)5047-5051) 、並びにBO286.2(Wilson,R.,et al.,Nat
ure 368(1994)32-38)は、Drosophila melanogaster 由
来の遺伝子であり、更にラット由来のラトロフィリン
(Lelianova,V.G.,et al.,J.Biol.Chem.272(1997)21504-
21508) と、軟体動物由来のGRL101(Tensen,C.P.,et a
l.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91(1994)4816-4820) があ
る。

【００６９】整列させた全配列に、７つのC-末端の膜貫
通ドメインが存在する。これらのタンパク質の長さは著
しく異なり、セクレチン及びカルシトニン受容体（G-タ
ンパク質共役型受容体群２）は、その他のタンパク質よ
りも短い。ペプチドホルモン受容体、例えばセクレチン
及びカルシトニン受容体は、ホルモン結合ドメインを含
んだ比較的短いN-末端(<200aa)を有する。最近報告され
たEGF-TM7 群（CD97及びEMR1）は、セクレチン受容体群
に非常に相同なものであるが、いくつかのEGF結合ドメ
インを含んだ非常に長い細胞外ドメインを有する(McKni
ght,A.J.,and Gordon,S.,Immunol.Today17(1996)283-28
7)。CD97は、RGD モチーフ(Arg-Gly-Asp)(Hamann,J.,et
al.,J.Immunol.155(1995)1942-1950)も有する。TM7XN1
は、セクレチン受容体、並びにCD97及びEMR1に非常に相
同であるが、その長いN-末端には、既知のドメインが存
在しない。約25アミノ酸から成る切断されるシグナルペ
プチドが、B0286.2 以外の翻訳開始部位が判明している
全タンパク質において見つかっている(von Heijne,G.,E
ur.J.Biochem.133(1983)17-21)。全ての整列されたEGF-
及びLN-TM7は、ペプチドホルモン受容体よりも実質的に
長い。それらのN-末端は、300bp よりも長く、そのほと
んどのタンパク質は、いわゆるシステインボックス: C-
x_16-18-C-x₁₁-C-x-C(Osterhoff,C.,et al.,DNA Cell Bi
ol.16(1997)379-389) を有する。新しいEGF-TM7 分子
に、KIAA0279及びR29368.2がある。KIAA0279は、６つの
EGF 結合ドメイン、ロイシンジッパーモチーフ、及び４
つのカドヘリン結合タンパク質を有する。B0286.2 は、
EGF 結合ドメインの無い相同物として以前に報告された
が、MOTIFFINDER プログラム(http://www.motif.genom
e.ad.jp) を用いたところ、EGF ドメインが１つ同定さ
れた。またB0286.2 は、そのN-末端の中間にもう１つ膜
貫通ドメインを有する。R29368.2は、部分的なcDNAであ
り、システインボックス及びTM7 ドメインを含む読み取
り枠の一部分のみが既知である。EMR1との同一性が50%
であり、そして19p13 上に位置することから、CD97及び
EMR1と同様に、この遺伝子は、EGF-TM7 群に属する可能
性がある。EGF結合ドメインを欠く「新規な」LN-TM7群
の中で、いくつかのタンパク質が、他の既知のドメイン
を有する。BAI-1 及びF31D5.5 は、RGD モチーフを有
し、一方BAI-2 は、ロイシンジッパーモチーフと更に２
つのTMドメインを有する。全てのBAI 遺伝子は、５つの
１型スロンボスポンジンの反復配列を有する。このドメ
インは、血管形成の阻害に関与すると考えられている(S
hiratsuchi,T.,et al.,Cytogenet.Cell Genet.79(1997)
103-108; Nishimori,H.,et al.,Oncogene15(1997)2145-
2150) 。GRL101は、低密度リポタンパク質に存在する12
個のクラスA の多システインのモチーフ(LDL-RA)と、６
つの多ロイシンの反復配列(LRR) を有する。ほとんど全
てのLN- 及びEGF-TM7 分子は、膜貫通ドメインとタンパ
ク質結合ドメインとの間のN-末端細胞外部分域に、高度
にグルコシル化されたムチン様領域を有する。この領域
では、しばしばシステイン残基が欠失している。

【００７０】７つの膜貫通ドメイン、及び最初の膜ドメ
インの前のシステインボックスを整列させると、全ての
タンパク質において、G-タンパク質共役型受容体の膜貫
通領域の立体構造の安定化に必要と考えられているルー
プ２及びループ４内に、システインが特徴的に保存され
る(Watson,S.,and Arkinstall,S.(1994)"The G-protein
Linked Receptor Facts Book",Academic Press,Londo
n) 。システインボックスの整列から、LN-TM7タンパク
質に特異的なシステインボックスの共通配列: C-x₂-W-x
_4-16-W-x₄-C-x₁₁-C-x-C を得ることができる。先に記載
した共通配列(Osterhoff,C.,et al.,DNA Cell Biol.16
(1997)379-389) の他に、数個の非常に保存されたトリ
プトファン残基も存在する。このシステインボックスの
最後の部分には、保存性がいくらか低いが、非常に頻繁
に見られるアミノ酸配列、例えばFAVLM 、が見つかって
いる。カルシトニン受容体、セクレチン受容体、F31D5.
5, BOSS 及びGRL101には、明白なシステインボックスは
存在しない。膜貫通ドメインの総合的な共通配列は、TM
1: G-x₈-L; TM2:L; TM3:C-x₁₆-W-x₃-E; TM4:G-x₃-P; TM
5:-; TM6:W; TM7:F-x₆-QG である。BOSS及びGRL101は、
他のLN- 及びEGF-TM7 遺伝子に比べて、相同性がとても
低い。LN-TM7に特異的な膜貫通ドメインの共通配列は、
TM1: G-x₇-CL; TM2:LC-x₉-FL-x-G; TM3:C-x₃-A-x₂-LH-x
₃-L-x₂-F-x-W-x₃-E; TM4:G-x₃-P; TM5:-; TM6:TW; TM7:
LF-x₃-N-x₂-QG-x₂-IF である。LN-TM7群に存在しないEG
F-TM7 特異的な保存アミノ酸は無かった。BAI-2 は、TM
5 とTM6 との間に余分な膜貫通ドメインを有する。

【００７１】TM7XN1の発現様式 多数の細胞種及び腫瘍細胞株におけるTM7XN1の発現を、
RT-PCRを用いて検査した。転移能が判明しているメラノ
ーマ細胞株の検査群では、転移性が高い細胞株MV3 及び
BLM において、攻撃性が無い、及び中間的である細胞株
の大部分に比較して、顕著な発現の減少調節が認められ
た（図６）。530, 1F6, MV1 及びMel57での強い発現に
比べて、M14 及び1F6mでの発現は、いくらか低い。ノー
ザンブロット分析では、MV3 及びBLM での発現は観察さ
れなかったが（図1B）、RT-PCRを用いた場合、いくらか
の弱い発現が検出された。前記検査群の細胞を異種移植
して、そこから単離したRNA を用いてRT-PCRした結果
も、前記の培養細胞の結果と完全に一致した。検査した
全ての培養細胞及び細胞株、並びに、いくつかのヒト組
織におけるTM7XN1の発現をRT-PCRによって調べた結果
を、表１に示す。

【００７２】

【表１】

【００７３】その他全てのヒトメラノーマ細胞株での発
現は多様であった。検査した全メラノーマ細胞株の内４
つだけ(MV3, SKmel28, BLM及びその親株BRO)で、弱い発
現が認められた。更に、他の種類の腫瘍に由来する細胞
株の大部分で、TM7XN1が発現していた。Daudi, Jurkat,
K562 及びU937だけが陰性を示した。種々のヒト組織の
RNA を用いてRT-PCRを行ったところ、腎臓、前立腺及び
精巣で、最も高い発現が示された。膀胱、脳、肺、子宮
及び甲状腺では、弱い発現が見られた。骨髄、大腸、心
臓、回腸、肝臓、リンパ節、膵臓、脾臓及び胃では、発
現は認められなかった。

【００７４】全ての進行度のヒトメラノサイト腫瘍の病
巣でも、発現を調べた。検査した全ての病巣が陽性を示
した。これらの病巣の発現が、メラノサイト細胞に特異
的な発現によるのか、それとも皮膚中に存在する他の細
胞での発現によるのかに関して見解を得るために、いく
つかの初代培養細胞を検査した。ケラチノサイト、メラ
ノサイト、母斑細胞及び内皮細胞で、強い発現が観察さ
れた（表１）。線維芽細胞、平滑筋細胞、周皮細胞、及
び単離した末梢血単核細胞(PBMCs) では、いくらかの発
現があった。樹状細胞（未刺激）は、陰性を示した。

【００７５】染色体上の位置 ヒトゲノム上の既知の部位と相同性があるか調べるため
に、ヒトゲノム地図(NCBI)を探索した結果、TM7XN1は、
未同定の転写産物と完全に相同であることが判った。こ
のSTS(Sequence Tagged Site) は、STSG1704と呼ばれる
もので、16q13上のマイクロサテライトマーカーD16S419
とD16S408 との間(65-72cM) に位置する。TM7XN1が16
番染色体上に位置することを確かめるために、ヒト染色
体特異的ハイブリッド細胞（ハムスター／ヒト又はマウ
ス／ヒト）の検査群のDNA を用いて、イントロン領域の
PCR を行った。16番染色体特異的ハイブリッド細胞株の
DNA サンプルにおいてのみ、528bp の特異的産物が検出
された。

【００７６】実施例３ 抗TM7XN1抗体 アミノ酸638-652 から成るポリペプチドを合成し、BSA
に結合した。アミノ酸2-315 から成るポリペプチドを、
GST 融合タンパク質として、大腸菌で組換え法によって
生産した。初回免疫接種において、各免疫原(500μg 免
疫原、フロイントアジュバント）を、ウサギの皮間に接
種し、更に増強のために静脈内投与した(500μg 免疫
原、フロイントアジュバント）。増強投与後１週間目
に、試験的に血液を採取し、各免疫原及び完全なTM7XN1
タンパク質（シグナルペプチド有り、及び無し）との結
合を検査した。

【００７７】参考文献 Albelda,S.M.,Lab.Invest.68(1993)4-17 Altschul,S.F.,et al.,J.Mol.Biol.(1990)403-410 Aust,G.et al.,Cancer Res.57(1997)1798-1806 Ausubel I.,Frederick M.,Current Protocols in Mol.B
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8 Zhang,L.,et al.,Sciene 276(1997)1268-1272

【００７８】

【配列表】 <210> 1 <211> 3845 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> 5'UTR <222> (1)..(316) <220> <221> sig ＿peptide <222> (317)..(391) <220> <221> CDS <222> (317)..(2380) <220> <221> mat ＿peptide <222> (392)..(2377) <223> TM7XN1 protein <220> <221> protein ＿bind <222> (1949)..(1972) <220> <221> misc＿binding <222> (2339)..(2371) <220> <221> polyA ＿signal <222> (3793)..(3798) <220> <221> polyA ＿site <222> (3811) <400> 1 gggtaccggg ccccccctcg actctagcat gcgcacagcg ggcgcagcaa cacgctggca 60 ggttaagcct ctgggggtgg atcctgaaag gtggtccagc cgcctggccc tgcgtgggac 120 cctccacctg gcagcaggta cccaaacaag ggctggacag cagggtctcg ctctgtcaca 180 caggctggag tgcagtggtg tgatcttggc tcatcgtaac ctccacctcc cgggttcaag 240 tgattctcat gcctcagcct cccgagtagc tgggattaca ggtggtgact tccaagagtg 300 actccgtcgg aggaaa atg act ccc cag tcg ctg ctg cag acg aca ctg ttc 352 Met Thr Pro Gln Ser Leu Leu Gln Thr Thr Leu Phe -25 -20 -15 ctg ctg agt ctg ctc ttc ctg gtc caa ggt gcc cac ggc agg ggc cac 400 Leu Leu Ser Leu Leu Phe Leu Val Gln Gly Ala His Gly Arg Gly His -10 -5 -1 1 agg gaa gac ttt cgc ttc tgc agc cag cgg aac cag aca cac agg agc 448 Arg Glu Asp Phe Arg Phe Cys Ser Gln Arg Asn Gln Thr His Arg Ser 5 10 15 agc ctc cac tac aaa ccc aca cca gac ctg cgc atc tcc atc gag aac 496 Ser Leu His Tyr Lys Pro Thr Pro Asp Leu Arg Ile Ser Ile Glu Asn 20 25 30 35 tcc gaa gag gcc ctc aca gtc cat gcc cct ttc cct gca gcc cac cct 544 Ser Glu Glu Ala Leu Thr Val His Ala Pro Phe Pro Ala Ala His Pro 40 45 50 gct tcc cga tcc ttc cct gac ccc agg ggc ctc tac cac ttc tgc ctc 592 Ala Ser Arg Ser Phe Pro Asp Pro Arg Gly Leu Tyr His Phe Cys Leu 55 60 65 tac tgg aac cga cat gct ggg aga tta cat ctt ctc tat ggc aag cgt 640 Tyr Trp Asn Arg His Ala Gly Arg Leu His Leu Leu Tyr Gly Lys Arg 70 75 80 gac ttc ttg ctg agt gac aaa gcc tct agc ctc ctc tgc ttc cag cac 688 Asp Phe Leu Leu Ser Asp Lys Ala Ser Ser Leu Leu Cys Phe Gln His 85 90 95 cag gag gag agc ctg gct cag ggc ccc ccg ctg tta gcc act tct gtc 736 Gln Glu Glu Ser Leu Ala Gln Gly Pro Pro Leu Leu Ala Thr Ser Val 100 105 110 115 acc tcc tgg tgg agc cct cag aac atc agc ctg ccc agt gcc gcc agc 784 Thr Ser Trp Trp Ser Pro Gln Asn Ile Ser Leu Pro Ser Ala Ala Ser 120 125 130 ttc acc ttc tcc ttc cac agt cct ccc cac acg gcc gct cac aat gcc 832 Phe Thr Phe Ser Phe His Ser Pro Pro His Thr Ala Ala His Asn Ala 135 140 145 tcg gtg gac atg tgc gag ctc aaa agg gac ctc cag ctg ctc agc cag 880 Ser Val Asp Met Cys Glu Leu Lys Arg Asp Leu Gln Leu Leu Ser Gln 150 155 160 ttc ctg aag cat ccc cag aag gcc tca agg agg ccc tcg gct gcc ccc 928 Phe Leu Lys His Pro Gln Lys Ala Ser Arg Arg Pro Ser Ala Ala Pro 165 170 175 gcc agc cag cag ttg cag agc ctg gag tcg aaa ctg acc tct gtg aga 976 Ala Ser Gln Gln Leu Gln Ser Leu Glu Ser Lys Leu Thr Ser Val Arg 180 185 190 195 ttc atg ggg gac atg gtg tcc ttc gag gag gac cgg atc aac gcc acg 1024 Phe Met Gly Asp Met Val Ser Phe Glu Glu Asp Arg Ile Asn Ala Thr 200 205 210 gtg tgg aag ctc cag ccc aca gcc ggc ctc cag gac ctg cac atc cac 1072 Val Trp Lys Leu Gln Pro Thr Ala Gly Leu Gln Asp Leu His Ile His 215 220 225 tcc cgg cag gag gag gag cag agc gag atc atg gag tac tcg gtg ctg 1120 Ser Arg Gln Glu Glu Glu Gln Ser Glu Ile Met Glu Tyr Ser Val Leu 230 235 240 ctg cct cga aca ctc ttc cag agg acg aaa ggc cgg agg ggg gag gct 1168 Leu Pro Arg Thr Leu Phe Gln Arg Thr Lys Gly Arg Arg Gly Glu Ala 245 250 255 gag aag aga ctc ctc ctg gtg gac ttc agc agc caa gcc ctg ttc cag 1216 Glu Lys Arg Leu Leu Leu Val Asp Phe Ser Ser Gln Ala Leu Phe Gln 260 265 270 275 gac aag aat tcc agc cac gtc ctg ggt gag aag gtc ttg ggg att gtg 1264 Asp Lys Asn Ser Ser His Val Leu Gly Glu Lys Val Leu Gly Ile Val 280 285 290 gta cag aac acc aaa gta gcc aac ctc acg gag ccc gtg gtg ctc acc 1312 Val Gln Asn Thr Lys Val Ala Asn Leu Thr Glu Pro Val Val Leu Thr 295 300 305 ttc cag cac cag cta cag ccg aag aat gtg act ctg caa tgt gtg ttc 1360 Phe Gln His Gln Leu Gln Pro Lys Asn Val Thr Leu Gln Cys Val Phe 310 315 320 tgg gtt gaa gac ccc aca ttg agc agc ccg ggg cat tgg agc agt gct 1408 Trp Val Glu Asp Pro Thr Leu Ser Ser Pro Gly His Trp Ser Ser Ala 325 330 335 ggg tgt gag acc gtc agg aga gaa acc caa aca tcc tgc ttc tgc aac 1456 Gly Cys Glu Thr Val Arg Arg Glu Thr Gln Thr Ser Cys Phe Cys Asn 340 345 350 355 cac ttg acc tac ttt gca gtg ctg atg gtc tcc tcg gtg gag gtg gac 1504 His Leu Thr Tyr Phe Ala Val Leu Met Val Ser Ser Val Glu Val Asp 360 365 370 gcc gtg cac aag cac tac ctg agc ctc ctc tcc tac gtg ggc tgt gtc 1552 Ala Val His Lys His Tyr Leu Ser Leu Leu Ser Tyr Val Gly Cys Val 375 380 385 gtc tct gcc ctg gcc tgc ctt gtc acc att gcc gcc tac ctc tgc tcc 1600 Val Ser Ala Leu Ala Cys Leu Val Thr Ile Ala Ala Tyr Leu Cys Ser 390 395 400 agg agg aaa cct cgg gac tac acc atc aag gtg cac atg aac ctg ctg 1648 Arg Arg Lys Pro Arg Asp Tyr Thr Ile Lys Val His Met Asn Leu Leu 405 410 415 ctg gcc gtc ttc ctg ctg gac acg agc ttc ctg ctc agc gag ccg gtg 1696 Leu Ala Val Phe Leu Leu Asp Thr Ser Phe Leu Leu Ser Glu Pro Val 420 425 430 435 gcc ctg aca ggc tct gag gct ggc tgc cga gcc agt gcc atc ttc ctg 1744 Ala Leu Thr Gly Ser Glu Ala Gly Cys Arg Ala Ser Ala Ile Phe Leu 440 445 450 cac ttc tcc ctg ctc acc tgc ctt tcc tgg atg ggc ctc gag ggg tac 1792 His Phe Ser Leu Leu Thr Cys Leu Ser Trp Met Gly Leu Glu Gly Tyr 455 460 465 aac ctc tac cga ctc gtg gtg gag gtc ttt ggc acc tat gtc cct ggc 1840 Asn Leu Tyr Arg Leu Val Val Glu Val Phe Gly Thr Tyr Val Pro Gly 470 475 480 tac cta ctc aag ctg agc gcc atg ggc tgg ggc ttc ccc atc ttt ctg 1888 Tyr Leu Leu Lys Leu Ser Ala Met Gly Trp Gly Phe Pro Ile Phe Leu 485 490 495 gtg acg ctg gtg gcc ctg gtg gat gtg gac aac tat ggc ccc atc atc 1936 Val Thr Leu Val Ala Leu Val Asp Val Asp Asn Tyr Gly Pro Ile Ile 500 505 510 515 ttg gct gtg cat agg act cca gag ggc gtc atc tac cct tcc atg tgc 1984 Leu Ala Val His Arg Thr Pro Glu Gly Val Ile Tyr Pro Ser Met Cys 520 525 530 tgg atc cgg gac tcc ctg gtc agc tac atc acc aac ctg ggc ctc ttc 2032 Trp Ile Arg Asp Ser Leu Val Ser Tyr Ile Thr Asn Leu Gly Leu Phe 535 540 545 agc ctg gtg ttt ctg ttc aac atg gcc atg cta gcc acc atg gtg gtg 2080 Ser Leu Val Phe Leu Phe Asn Met Ala Met Leu Ala Thr Met Val Val 550 555 560 cag atc ctg cgg ctg cgc ccc cac acc caa aag tgg tca cat gtg ctg 2128 Gln Ile Leu Arg Leu Arg Pro His Thr Gln Lys Trp Ser His Val Leu 565 570 575 aca ctg ctg ggc ctc agc ctg gtc ctt ggc ctg ccc tgg gcc ttg atc 2176 Thr Leu Leu Gly Leu Ser Leu Val Leu Gly Leu Pro Trp Ala Leu Ile 580 585 590 595 ttc ttc tcc ttt gct tct ggc acc ttc cag ctt gtc gtc ctc tac ctt 2224 Phe Phe Ser Phe Ala Ser Gly Thr Phe Gln Leu Val Val Leu Tyr Leu 600 605 610 ttc agc atc atc acc tcc ttc caa ggc ttc ctc atc ttc atc tgg tac 2272 Phe Ser Ile Ile Thr Ser Phe Gln Gly Phe Leu Ile Phe Ile Trp Tyr 615 620 625 tgg tcc atg cgg ctg cag gcc cgg ggt ggc ccc tcc cct ctg aag agc 2320 Trp Ser Met Arg Leu Gln Ala Arg Gly Gly Pro Ser Pro Leu Lys Ser 630 635 640 aac tca gac agc gcc agg ctc ccc atc agc tcg ggc agc acc tcg tcc 2368 Asn Ser Asp Ser Ala Arg Leu Pro Ile Ser Ser Gly Ser Thr Ser Ser 645 650 655 agc cgc atc tag gcctccagcc cacctgccca tgtgatgaag cagagatgcg 2420 Ser Arg Ile 660 gcctcgtcgc acactgcctg tggcccccga gccaggccca gccccaggcc agtcagccgc 2480 agactttgga aagcccaacg accatggaga gatgggccgt tgccatggtg gacggactcc 2540 cgggctgggc ttttgaattg gccttgggga ctactcggct ctcactcagc tcccacggga 2600 ctcagaagtg cgccgccatg ctgcctaggg tactgtcccc acatctgtcc caacccagct 2660 ggaggcctgg tctctcctta caacccctgg gcccagccct cattgctggg ggccaggcct 2720 tggatcttga gggtctggca catccttaat cctgtgcccc tgcctgggac agaaatgtgg 2780 ctccagttgc tctgtctctc gtggtcaccc tgagggcact ctgcatcctc tgtcatttta 2840 acctcaggtg gcacccaggg cgaatggggc ccagggcaga ccttcagggc cagagccctg 2900 gcggaggaga ggccctttgc caggagcaca gcagcagctc gcctacctct gagcccaggc 2960 cccctccctc cctcagcccc ccagtcctcc ctccatcttc cctggggttc tcctcctctc 3020 ccagggcctc cttgctcctt cgttcacagc tgggggtccc cgattccaat gctgtttttt 3080 ggggagtggt ttccaggagc tgcctggtgt ctgctgtaaa tgtttgtcta ctgcacaagc 3140 ctcggcctgc ccctgagcca ggctcggtac cgatgcgtgg gctgggctag gtccctctgt 3200 ccatctgggc ctttgtatga gctgcattgc ccttgctcac cctgaccaag cacacgcctc 3260 agaggggccc tcagcctctc ctgaagccct cttgtggcaa gaactgtgga ccatgccagt 3320 cccgtctggt ttccatccca ccactccaag gactgagact gacctcctct ggtgacactg 3380 gcctagagcc tgacactctc ctaagaggtt ctctccaagc ccccaaatag ctccaggcgc 3440 cctcggccgc ccatcatggt taattctgtc caacaaacac acacgggtag attgctggcc 3500 tgttgtaggt ggtagggaca cagatgaccg acctggtcac tcctcctgcc aacattcagt 3560 ctggtatgtg aggcgtgcgt gaagcaagaa ctcctggagc tacagggaca gggagccatc 3620 attcctgcct gggaatcctg gaagacttcc tgcaggagtc agcgttcaat cttgaccttg 3680 aagatgggaa ggatgttctt tttacgtacc aattcttttg tcttttgata ttaaaaagaa 3740 gtacatgttc attgtagaga atttggaaac tgtagaagag aatcaagaag aaaaataaaa 3800 atcagctgtt gtaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 3845 <210> 2 <211> 687 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Thr Pro Gln Ser Leu Leu Gln Thr Thr Leu Phe Leu Leu Ser Leu 1 5 10 15 Leu Phe Leu Val Gln Gly Ala His Gly Arg Gly His Arg Glu Asp Phe 20 25 30 Arg Phe Cys Ser Gln Arg Asn Gln Thr His Arg Ser Ser Leu His Tyr 35 40 45 Lys Pro Thr Pro Asp Leu Arg Ile Ser Ile Glu Asn Ser Glu Glu Ala 50 55 60 Leu Thr Val His Ala Pro Phe Pro Ala Ala His Pro Ala Ser Arg Ser 65 70 75 80 Phe Pro Asp Pro Arg Gly Leu Tyr His Phe Cys Leu Tyr Trp Asn Arg 85 90 95 His Ala Gly Arg Leu His Leu Leu Tyr Gly Lys Arg Asp Phe Leu Leu 100 105 110 Ser Asp Lys Ala Ser Ser Leu Leu Cys Phe Gln His Gln Glu Glu Ser 115 120 125 Leu Ala Gln Gly Pro Pro Leu Leu Ala Thr Ser Val Thr Ser Trp Trp 130 135 140 Ser Pro Gln Asn Ile Ser Leu Pro Ser Ala Ala Ser Phe Thr Phe Ser 145 150 155 160 Phe His Ser Pro Pro His Thr Ala Ala His Asn Ala Ser Val Asp Met 165 170 175 Cys Glu Leu Lys Arg Asp Leu Gln Leu Leu Ser Gln Phe Leu Lys His 180 185 190 Pro Gln Lys Ala Ser Arg Arg Pro Ser Ala Ala Pro Ala Ser Gln Gln 195 200 205 Leu Gln Ser Leu Glu Ser Lys Leu Thr Ser Val Arg Phe Met Gly Asp 210 215 220 Met Val Ser Phe Glu Glu Asp Arg Ile Asn Ala Thr Val Trp Lys Leu 225 230 235 240 Gln Pro Thr Ala Gly Leu Gln Asp Leu His Ile His Ser Arg Gln Glu 245 250 255 Glu Glu Gln Ser Glu Ile Met Glu Tyr Ser Val Leu Leu Pro Arg Thr 260 265 270 Leu Phe Gln Arg Thr Lys Gly Arg Arg Gly Glu Ala Glu Lys Arg Leu 275 280 285 Leu Leu Val Asp Phe Ser Ser Gln Ala Leu Phe Gln Asp Lys Asn Ser 290 295 300 Ser His Val Leu Gly Glu Lys Val Leu Gly Ile Val Val Gln Asn Thr 305 310 315 320 Lys Val Ala Asn Leu Thr Glu Pro Val Val Leu Thr Phe Gln His Gln 325 330 335 Leu Gln Pro Lys Asn Val Thr Leu Gln Cys Val Phe Trp Val Glu Asp 340 345 350 Pro Thr Leu Ser Ser Pro Gly His Trp Ser Ser Ala Gly Cys Glu Thr 355 360 365 Val Arg Arg Glu Thr Gln Thr Ser Cys Phe Cys Asn His Leu Thr Tyr 370 375 380 Phe Ala Val Leu Met Val Ser Ser Val Glu Val Asp Ala Val His Lys 385 390 395 400 His Tyr Leu Ser Leu Leu Ser Tyr Val Gly Cys Val Val Ser Ala Leu 405 410 415 Ala Cys Leu Val Thr Ile Ala Ala Tyr Leu Cys Ser Arg Arg Lys Pro 420 425 430 Arg Asp Tyr Thr Ile Lys Val His Met Asn Leu Leu Leu Ala Val Phe 435 440 445 Leu Leu Asp Thr Ser Phe Leu Leu Ser Glu Pro Val Ala Leu Thr Gly 450 455 460 Ser Glu Ala Gly Cys Arg Ala Ser Ala Ile Phe Leu His Phe Ser Leu 465 470 475 480 Leu Thr Cys Leu Ser Trp Met Gly Leu Glu Gly Tyr Asn Leu Tyr Arg 485 490 495 Leu Val Val Glu Val Phe Gly Thr Tyr Val Pro Gly Tyr Leu Leu Lys 500 505 510 Leu Ser Ala Met Gly Trp Gly Phe Pro Ile Phe Leu Val Thr Leu Val 515 520 525 Ala Leu Val Asp Val Asp Asn Tyr Gly Pro Ile Ile Leu Ala Val His 530 535 540 Arg Thr Pro Glu Gly Val Ile Tyr Pro Ser Met Cys Trp Ile Arg Asp 545 550 555 560 Ser Leu Val Ser Tyr Ile Thr Asn Leu Gly Leu Phe Ser Leu Val Phe 565 570 575 Leu Phe Asn Met Ala Met Leu Ala Thr Met Val Val Gln Ile Leu Arg 580 585 590 Leu Arg Pro His Thr Gln Lys Trp Ser His Val Leu Thr Leu Leu Gly 595 600 605 Leu Ser Leu Val Leu Gly Leu Pro Trp Ala Leu Ile Phe Phe Ser Phe 610 615 620 Ala Ser Gly Thr Phe Gln Leu Val Val Leu Tyr Leu Phe Ser Ile Ile 625 630 635 640 Thr Ser Phe Gln Gly Phe Leu Ile Phe Ile Trp Tyr Trp Ser Met Arg 645 650 655 Leu Gln Ala Arg Gly Gly Pro Ser Pro Leu Lys Ser Asn Ser Asp Ser 660 665 670 Ala Arg Leu Pro Ile Ser Ser Gly Ser Thr Ser Ser Ser Arg Ile 675 680 685 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:beta2-microglobulin : sense primer <400> 3 ctcgcgctac tctctctttc t 21 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:beta2-microglobulin : antisense primer <400> 4 tgtcggattg atgaaaccca g 21 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:TM7XN1 cDNA : sense primer <400> 5 ccatctttct ggtgacgc 18 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:TM7XN1 cDNA : antisense primer <400> 6 gagctgatgg ggagcctg 18 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:TM7XN1 DNA : sense primer <400> 7 gctctgtctc tcgtggtc 18 <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:TM7XN1 DNA : antisense primer <400> 8 gcatggtcca cagttcttg 19 <210> 9 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:AP7 : primer <400> 9 tcgatacagg 10

【図面の簡単な説明】

【図１】A:プライマー組T₁₂MG 及びAP7(5'-TCGATACAGG-
3': 配列番号9)を用いて、細胞株1F6 と1F6mとの間で差
異表示法を行った結果のゲル。250bp のcDNAであるクロ
ーン25（矢印）が、1F6 において非常により豊富であ
る。（このバンドの周囲の４つの切断目印も依然として
視認できる。）B:ヌードマウスへの皮下注射後に異なる
転移能を示す８種類のヒトメラノーマ細胞株(Westphal,
J.R.,et al.,Br.J.Cancer76(1997)561-570) の検査群に
おけるクローン25のノーザンブロット分析。

【図２】TM7XM1（クローン25）の完全長のcDNA（配列番
号１）及び推定のアミノ酸配列（配列番号２）。本タン
パク質は、シグナル配列（太字）とその切断部位（太矢
印）、いくつかのN-結合グリコシル化部位（N ）、シス
テインボックス（白枠）、７つの膜貫通ドメイン（灰色
枠）、AMP 結合部位(####)、及び停止コドン（星印）を
有する。ポリアデニル化配列（二重下線）、cDNAプライ
マー（太矢印）、及びイントロン域プライマー（細矢
印）も示す。

【図３】TM7XM1（クローン25）の完全長のcDNA（配列番
号１）及び推定のアミノ酸配列（配列番号２）。本タン
パク質は、シグナル配列（太字）とその切断部位（太矢
印）、いくつかのN-結合グリコシル化部位（N ）、シス
テインボックス（白枠）、７つの膜貫通ドメイン（灰色
枠）、AMP 結合部位(####)、及び停止コドン（星印）を
有する。ポリアデニル化配列（二重下線）、cDNAプライ
マー（太矢印）、及びイントロン域プライマー（細矢
印）も示す。

【図４】TM7XM1（クローン25）の完全長のcDNA（配列番
号１）及び推定のアミノ酸配列（配列番号２）。本タン
パク質は、シグナル配列（太字）とその切断部位（太矢
印）、いくつかのN-結合グリコシル化部位（N ）、シス
テインボックス（白枠）、７つの膜貫通ドメイン（灰色
枠）、AMP 結合部位(####)、及び停止コドン（星印）を
有する。ポリアデニル化配列（二重下線）、cDNAプライ
マー（太矢印）、及びイントロン域プライマー（細矢
印）も示す。

【図５】TM7XM1（クローン25）の完全長のcDNA（配列番
号１）及び推定のアミノ酸配列（配列番号２）。本タン
パク質は、シグナル配列（太字）とその切断部位（太矢
印）、いくつかのN-結合グリコシル化部位（N ）、シス
テインボックス（白枠）、７つの膜貫通ドメイン（灰色
枠）、AMP 結合部位(####)、及び停止コドン（星印）を
有する。ポリアデニル化配列（二重下線）、cDNAプライ
マー（太矢印）、及びイントロン域プライマー（細矢
印）も示す。

【図６】A:転移能の異なる８種類のヒトメラノーマ細胞
株の検査群におけるTM7XM1の発現のRT-PCR分析。最初の
レーンは、DNA 分子量マーカーXIV(100bp ラダー、Boeh
ringer Mannheim GmbH,DE)である。B:コントロールとし
てのβ₂-ミクログロブリンのRT-PCR分析。

【図７】TM7XM1タンパク質におけるドメインの概略図。 ＜配列の説明＞ 配列番号１：TM7XM1のcDNA配列及びアミノ酸配列 配列番号２：TM7XM1のアミノ酸配列 配列番号３〜９：プライマー配列

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/566 Ｇ０１Ｎ 33/566 33/574 33/574 Ａ 33/577 33/577 Ｂ (72)発明者 ホーセン エヌ．ペー．ファン ミュイエ ン オランダ国，エヌエル−6525 ヘーベー ニェメヘン，サント．アナーストラート 309 (72)発明者 アルベルト イェー．ウェー．ゼンドマン オランダ国，エヌエル−6641 エーカー ボエニンヘン，ネッテンクノペル 37

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記群中から選択されるもので、腫瘍の
   進行及び／又は転移の間に減少調節される単離された核
   酸分子(TM7XM1)： ａ）配列番号１の配列を有する核酸、 ｂ）ａ）の核酸内のアミノ酸2-315 をコードする核酸断
   片又はその相補的断片と、ストリンジェントな条件下で
   ハイブリダイズする核酸、あるいは、 ｃ）上記の核酸の１つによってコードされるポリペプチ
   ドをコードするもので、遺伝子コードの縮重を有する核
   酸。
2. 【請求項２】 腫瘍の進行及び／又は転移を誘導するも
   のである配列番号２のポリペプチド又は配列番号２のア
   ミノ酸2-315 を含有するその断片をコードする、単離さ
   れた核酸分子。
3. 【請求項３】 請求項１又は２の核酸分子の発現のため
   に適する、組換え発現ベクター。
4. 【請求項４】 腫瘍の進行及び／又は転移の間に減少調
   節され、且つ、 ａ）配列番号１のDNA 配列によってコードされるか、あ
   るいは、 ｂ）配列番号１内のアミノ酸2-315 をコードするDNA 断
   片又はその相補的配列と、ストリンジェントな条件下で
   ハイブリダイズするDNA 配列によってコードされる、組
   換えポリペプチド。
5. 【請求項５】 腫瘍の進行及び／又は転移の間に減少調
   節されるポリペプチドを生産する方法であって、このポ
   リペプチドが、 ａ）配列番号１のDNA 配列によってコードされるか、あ
   るいは、 ｂ）配列番号１内のアミノ酸2-315 をコードするDNA 断
   片又はその相補的配列と、ストリンジェントな条件下で
   ハイブリダイズするDNA 配列によってコードされるもの
   であり、原核又は真核生物の宿主細胞中で外来DNA を発
   現させること、及び前記の希望ポリペプチドを単離する
   ことに依る方法。
6. 【請求項６】 腫瘍細胞の転移能を検出する方法であっ
   て、 ａ）ガン患者の体液、メラノーマガン細胞、又はメラノ
   ーマガン細胞の細胞抽出液若しくは細胞培養上清に由来
   する、核酸を含有するサンプルを、(i) 配列番号１の核
   酸、又はそれに相補的な核酸、及び、(ii)(i) の核酸の
   １つとハイブリダイズする核酸、の群中から選択された
   核酸プローブとインキュベーションすること、並びに、
   ｂ）サンプル中の核酸及び／又は前記核酸プローブに対
   する別の結合体を利用して、ハイブリダイゼーションを
   検出すること、を含んで成る方法。
7. 【請求項７】 検出する前に、検出しようとする核酸を
   増幅する、請求項６の方法。
8. 【請求項８】 腫瘍の進行及び／又は転移の間に減少調
   節されるポリペプチド(TM7XN1)に対する抗体を生産する
   方法であって、請求項４のポリペプチド又はその断片を
   免疫原と結合し、その融合免疫原によって動物を免疫化
   し、そしてその動物の体液から、TM7XN1と特異的に結合
   する抗体を単離すること、を含んで成る方法。