JP2004113239A

JP2004113239A - リガンドホモログ

Info

Publication number: JP2004113239A
Application number: JP2003318260A
Authority: JP
Inventors: Paul J Godowski; ゴドウスキ，　ポール　ジェイ．; Austin L Gurney; ガーニー，　オースティン　エル．; Kenneth Hillan; ヒラン，　ケネス; David Botstein; ボトステイン，　デイビッド; Audrey Goddard; ゴッダート，　オードリー; Margaret Roy; ロイ，　マーガレット; Napoleone Ferrara; フェッララ，　ナポレオン; Daniel Tumas; トゥーマス，　ダニエル; Ralph Schwall; シュウォール，　ラルフ
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 1997-09-19
Filing date: 2003-09-10
Publication date: 2004-04-15
Also published as: ES2268790T3; DE69834649T2; ATE327329T1; WO1999015653A2; KR100692333B1; KR20060060060A; JP2004129656A; DK1015585T3; IL134648A; US6551822B1; EP1015585A2; KR100692336B1; KR100692335B1; DE69834649D1; JP2004097224A; EP1724349A1; KR20060060061A; IL134648A0; AU756449B2; JP2001517437A

Abstract

【課題】血管新生等を誘発する新規な有用タンパク質を提供する。
【解決手段】本発明は、特定の配列によりコードされる単離された核酸分子、このような核酸分子によってコードされるＴＩＥホモログタンパク質、および関連抗体、ならびにこのような核酸およびタンパク質分子を製造および使用するための方法および手段に関する。
【選択図】　なし

Description

（発明の分野）
本発明は、新規ＴＩＥリガンドホモログをコードする単離された核酸分子、このような核酸分子によってコードされるＴＩＥリガンドホモログタンパク質、ならびにこのような核酸およびタンパク質分子を製造および使用するための方法および手段、ならびに開示されたＴＩＥリガンドホモログを結合する抗体に関する。

（背景技術）
略号「ＴＩＥ」または「ｔｉｅ」は頭字語であり、これらは、「チロシンキナーゼ含有ＩｇおよびＥＧＦ相同性ドメイン」を表し、そして血管内皮細胞および初期造血細胞でほぼ排他的に発現され、そしてＥＧＦ様ドメイン、および「免疫グロブリン（ＩＧ）様」折り畳みと一般にいわれる鎖内ジスルフィド結合によって安定化される細胞外折り畳みユニットの存在によって特徴づけられる、レセプターチロシンキナーゼの新しいファミリーを示すために新しく作り出された。ヒト白血病細胞からのチロシンキナーゼホモログｃＤＮＡフラグメント（ｔｉｅ）は、Ｐａｒｔａｎｅｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃｉＵＳＡ８７，８９１３−８９１７（１９９０）に記載された。このヒト「ｔｉｅ」レセプターのｍＲＮＡは、すべてのヒト胎児およびマウス胚組織で検出されており、そして心臓および血管内皮細胞に局在することが報告されている。Ｋｏｒｈｏｎｅｎら，Ｂｌｏｏｄ８０，２５４８−２５５５（１９９２）；ＰＣＴ出願公開公報第ＷＯ９３／１４１２４号（１９９３年７月２２日公開）。「ｔｉｅ−１」といわれるヒトｔｉｅのラットホモログは、Ｍａｉｓｏｎｐｉｅｒｒｅら，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ８，１６３１−１６３７（１９９３）によって同定された。「ｔｉｅ−２」と命名されたもう１つのｔｉｅレセプターは、もともとラットで同定されたが（Ｄｕｍｏｎｔら，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ８，１２９３−１３０１（１９９３））、「ｏｒｋ」といわれる、ｔｉｅ−２のヒトホモログは、米国特許第５，４４７，８６０号（Ｚｉｅｇｌｅｒ）に記載された。ｔｉｅ−２のマウスホモログは、もともと「ｔｅｋ」と称された。脳毛細管ｃＤＮＡライブラリーからのマウスｔｉｅ−２レセプターのクローニングは、ＰＣＴ出願公開公報第ＷＯ９５／１３３８７号（１９９５年５月１８日公開）に開示される。ＴＩＥレセプターは、新脈管形成に積極的に関与すると考えられ、そして造血においても役割を果たし得る。

ヒトＴＩＥ−２リガンドの発現クローニングは、ＰＣＴ出願公開公報第ＷＯ９６／１１２６９号（１９９６年４月１８日公開）および米国特許第５，５２１，０７３号（１９９６年５月２８日公開）に記載されている。「ｈｔｉｅ−２リガンド１」または「ｈＴＬ１」と命名されたＴＩＥ−２リガンドをコードするλｇｔ１０と命名されたベクターは、ＡＴＣＣ受託番号７５９２８で寄託されている。「ｈｔｉｅ−２２」または「ｈＴＬ２」と命名されたもう１つのＴＩＥ−２リガンドをコードするプラスミドは、ＡＴＣＣ受託番号７５９２８で入手可能である。この第２のリガンドは、ＴＡＩ−２レセプターのアンタゴニストとして記載されている。ＴＩＥ−２レセプターについての分泌されたヒトおよびマウスリガンドの同定は、Ｄａｖｉｓら，Ｃｅｌｌ８７，１１６１−１１６９（１９９６）によって報告されている。新脈管形成および造血中の可能性のある作用におけるその役割を反映するために、「アンジポエチン−１」と命名したヒトリガンドは、ＷＯ９６／１１２６９において「ｈｔｉｅ−２１」または「ｈＴＬ−１」と種々に命名されたリガンドと同じリガンドである。アンジオポエチン−１は、後で脈管形成役割を果たし、そしてＶＥＧＦの役割とは異なることが記載されている（Ｓｕｒｉら，Ｃｅｌｌ８７，１１７１−１１８０（１９９６））。ＴＩＥ−２は、腫瘍増殖に必要な病理的な脈管形成中に明らかにアップレギュレートされるので（Ｋａｉｐａｉｎｅｎら，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．５４，６５７１−６５７７（１９９４））、アンジオポエチン−１は、腫瘍脈管構造を特異的に標的するためにさらに有用であることが示唆されている（Ｄａｖｉｓら，前出）。

（発明の要旨）
本発明は、血管系に強力な効果を有する新規ヒトＴＩＥリガンドホモログに関する。本発明はまた、このようなリガンドホモログまたはその機能的誘導体をコードする単離された核酸分子、およびこのような核酸分子を含むベクターを提供する。本発明はさらに、新規ＴＩＥリガンドホモログまたはその機能的誘導体を産生するためにこのような核酸で形質転換された宿主細胞に関する。新規ＴＩＥリガンドホモログは、公知または以後に発見された、ＴＩＥレセプターのアゴニストまたはアンタゴニストであり得る。他の治療剤または診断剤のそれぞれのＴＩＥレセプターを発現する細胞への送達を含む、その治療または診断用途もまた、本発明の範囲内である。

本発明はさらに、本発明のＴＩＥリガンドホモログを特異的に結合するアゴニストまたはアンタゴニスト抗体、およびこのような抗体の診断または治療用途を提供する。

もう１つの局面では、本発明は、新規ＴＩＥリガンドホモログまたはこのようなＴＩＥリガンドホモログを特異的に結合する抗体を含む組成物に関する。

さらなる局面では、本発明は、本発明の新規ＴＩＥリガンドホモログと他の治療剤または細胞傷害性薬剤との結合体、およびこのような結合体を含む組成物に関する。ＴＩＥ−２レセプターは、腫瘍増殖に必要である病理的な脈管形成中にアップレギュレートされることが報告されるので、本発明のＴＩＥリガンドホモログの細胞傷害性または他の抗腫瘍薬剤への結合体は、腫瘍血管系を特異的に標的することにおける有用性を見いだし得る。

さらに、本発明の少なくとも１つのＴＩＥリガンドホモログ（ＮＬ８）をコードする遺伝子がある腫瘍細胞で増幅されることが見いだされている。したがって、腫瘍の診断および処置のための組成物および方法もまた、本発明の範囲内である。

さらにもう１つの局面では、本発明は、ＴＩＥレセプターを発現する細胞を同定するための方法に関し、これは、このようなＴＩＥリガンドホモログのＴＩＥレセプターへの結合を可能にする条件下で、本発明の検出可能に標識したＴＩＥリガンドホモログと細胞とを接触させる工程、およびこのような結合が実際に生じたかどうかを決定する工程を包含する。

異なる局面では、本発明は、ＴＩＥリガンドホモログを特異的に結合する少なくとも１つの抗体と生物学的試料を接触させる工程、および形成したＴＩＥリガンドホモログ−抗体複合体の量を測定する工程によって、生物学的試料中の本発明のＴＩＥリガンドホモログの量を測定するための方法に関する。

さらにもう１つの実施態様では、本発明は、本発明のＴＩＥリガンドホモログの有効量で内皮細胞を処理する工程を包含する、内皮細胞増殖の阻害のための方法に関する。

なおさらなる実施態様では、本発明は、本発明のＴＩＥリガンドホモログの有効量で内皮細胞を処理する工程を包含する、内皮細胞アポトーシスの誘導のための方法に関する。

もう１つの実施態様では、本発明は、このようなホモログを含む疑いのある細胞を抗ＴＩＥリガンドホモログ抗体に曝露する工程、および抗体の細胞への結合を決定する工程による、ＴＩＥリガンドホモログの存在を決定するための方法に関する。

本発明は、特に、哺乳動物において腫瘍を診断する方法に関し、（ａ）哺乳動物から得られた組織細胞のテスト試料において、および（ｂ）同じ細胞タイプの公知の正常組織細胞のコントロール試料において、本発明のＴＩＥリガンドホモログをコードする遺伝子の発現のレベルを検出する工程を包含し、ここで、テスト試料におけるより高い発現レベルは、テスト組織細胞が得られた哺乳動物における腫瘍の存在を示す。特定の実施態様では、本発明は、（ａ）抗ＴＩＥリガンドホモログ抗体を哺乳動物から得られた組織細胞のテスト試料と接触させる工程、および（ｂ）テスト試料における抗ＴＩＥリガンドホモログ抗体とＴＩＥリガンドホモログとの間の複合体の形成を検出する工程によって、哺乳動物における腫瘍を診断する方法に関する。

本発明は、さらに、腫瘍細胞増殖を阻害するための方法に関し、ＮＬ８ポリペプチドを過剰発現する細胞を、ＮＬ８ポリペプチドの発現および／または活性を阻害する有効量の薬剤に曝露する工程を包含する。

さらなる実施態様では、本発明は、製造の物品に関し、（ａ）容器；（ｂ）容器上のラベル；および（ｃ）容器内に含まれている活性薬剤を含む組成物を含み、ここで、組成物は、腫瘍細胞の増殖を阻害するために有効であり、容器上のラベルは、この組成物が、ＮＬ８ポリペプチドの過剰発現によって特徴づけられる症状を処置するために使用され得、そして組成物中の活性薬剤は、ＮＬ８ポリペプチドの発現および／または活性を阻害する薬剤であることを示す。

本発明はさらに、対応するＴＩＥレセプターに結合するために本発明のネイティブなまたは変異体ＴＩＥリガンドホモログと競合する能力に基づいて、ＴＩＥレセプターのポリペプチドまたは低分子アゴニストまたはアンタゴニストを同定するためのスクリーニング方法に関する。

本発明はまた、創傷治癒、炎症、またはヒト患者の腫瘍において新脈管形成の存在を画像化するための方法に関し、これは、本発明の検出可能に標識されたＴＩＥリガンドホモログまたはアゴニスト抗体を投与する工程、および新脈管形成を検出する工程を包含する。

もう１つの局面では、本発明は、薬学的に受容可能なベヒクル中の本発明のＴＩＥリガンドホモログの有効量を投与する工程による、患者において新生血管形成を促進または阻害する方法に関する。好ましい実施態様では、本発明は、創傷治癒の促進のための方法に関する。もう１つの実施態様では、本発明は、虚血性心臓または肢において側副血管新生を誘導するためのような、脈管形成プロセスを促進するための方法に関する。さらに好ましい実施態様では、本発明は、腫瘍増殖を阻害するための方法に関する。

さらにもう１つの局面では、本発明は、患者における骨発生および／または成熟および／または増殖を促進する方法に関し、薬学的に受容可能なベヒクル中の本発明のＴＩＥリガンドホモログの有効量を患者に投与する工程を包含する。

さらなる局面では、本発明は、筋肉増殖および発達を促進する方法に関し、これは、薬学的に受容可能なベヒクル中の本発明のＴＩＥリガンドホモログの有効を必要な患者に投与する工程を包含する。

本発明のＴＩＥリガンドホモログは、単独で、あるいは互いにおよび／またはＶＥＧＦファミリーのメンバーを含む他の治療剤もしくは診断剤と組み合わせて、投与され得る。組み合わせ治療は、新生血管形成、ならびに筋肉増殖および発達を促進または阻害するための新しいアプローチに導き得る。

［発明の詳細な説明］
（Ａ．リガンドホモログおよびそれをコードする核酸分子）
本発明のＴＩＥリガンドホモログは、ＮＬ１（配列番号２）、ＮＬ５（配列番号４）、ＮＬ８（配列番号６）、およびＮＬ４（配列番号１９）と命名したネイティブなヒトタンパク質、ならびに、サルのような高等哺乳動物；マウス、ラットハムスターのような齧歯類；ブタ；ウマ；ウシを含む（しかしこれらに限定されない）、他の非ヒト哺乳動物種におけるそのホモログ、天然に存在する対立遺伝子およびスプライス改変体、ならびに、ネイティブなＴＬ−１またはＴＬ−２リガンドとは異なる限り、このようなネイティブな分子のアミノ酸配列改変体のような、生物学的に活性な（機能的）誘導体を含む。例えば、ＮＬ４のアミノ酸配列は、ｈＴＬ２と約３４％同一およびｈＴＬ１と約３２％同一である。本発明のネイティブなＴＩＥリガンドホモログは、そのネイティブな環境に関連する他のタンパク質を実質的に含まない。この定義は、本発明のＴＩＥリガンドホモログが得られる方法によっていかなるようにも限定されず、そしてその他の点で定義内のすべてのＴＩＥリガンドホモログを含み、天然供給源から精製されるか、組換えＤＮＡ技術から得られるか、合成されるか、またはこれらおよび／もしくは他の技術の任意の組み合わせによって調製されるいずれかである。本発明のネイティブなＴＩＥリガンドホモログのアミノ酸配列改変体は、本発明の全長のネイティブなヒトＴＩＥリガンドホモログと、または本発明のネイティブなヒトＴＩＥリガンドホモログのフィブリノーゲン様ドメインと、少なくとも約９０％、好ましくは少なくとも約９５％、より好ましくは少なくとも約９８％、最も好ましくは少なくとも約９９％配列同一性を有する。このようなアミノ酸配列改変体は、好ましくは、ネイティブなＴＩＥリガンドホモログの定性的生物学的活性を提示または阻害する。

用語「フィブリノーゲンドメイン」または「フィブリノーゲン様ドメイン」は、公知のｈＴＬ−１アミノ酸配列における約２７８位〜約４９８位のアミノ酸；公知のｈＴＬ−２アミノ酸配列における約２７６位〜約４９６位のアミノ酸；ＮＬ１のアミノ酸配列における約２７０位〜約４９３位のアミノ酸；ＮＬ５のアミノ酸配列における約２７２位〜約４９１位のアミノ酸；ＮＬ８のアミノ酸配列における約２５２位〜約４７０位のアミノ酸；ＮＬ４のアミノ酸配列における約１３０位〜約３４６位のアミノ酸；および他のＴＩＥリガンドホモログにおけるホモログをいうために使用される。ＮＬ４のフィブリノーゲンドメインとｈＴＬ−１およびｈＴＬ−２のフィブリノーゲンドメインとの間のアミノ酸配列同一性は、約４４％である。

用語「核酸分子」は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、およびｃＤＮＡ分子を含む。遺伝コードの縮重の結果として、所定のＴＩＥリガンドホモログをコードする多数のヌクレオチド配列が産生され得ることが理解される。本発明は、すべての可能なコドン選択に基づいて、本発明のＴＩＥリガンドホモログをコードする、ヌクレオチド配列のあらゆる可能な改変体を特に意図する。本発明のＴＩＥリガンドホモログをコードする核酸分子は、好ましくは、ストリンジェント条件下で天然に存在するＴＩＥリガンドホモログ遺伝子にハイブリダイズし得るが、実質的に異なるコドン利用を有する、ＴＩＥリガンドホモログをコードするヌクレオチド配列を産生するために有利であり得る。例えば、コドンは、特定のコドンが宿主によって利用される頻度に従って、ポリペプチドの発現が特定の原核生物または真核生物宿主で起こる割合を増加させるように選択され得る。さらに、改良された特性（例えば、半減期）を有するＲＮＡ転写物は、所定のＴＩＥリガンドホモログをコードするヌクレオチド配列の適切な選択によって産生され得る。

「配列同一性」は、Ｌａｓｅｒｇｅｎｅｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇソフトウエア（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）のバージョン１．６、またはこのソフトウエアの任意のアップデート版もしくは等価物に組み込まれる、多配列アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ方法（ＨｉｇｇｉｎｓらＣｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．５，１５１−１５３（１９８９）およびＨｉｇｇｉｎｓら，Ｇｅｎｅ７３，２３７−２４４（１９８８））に従って比較されるべき２つの配列をアラインすることによって決定される。

ハイブリダイゼーション反応の「ストリンジェンシー」は、当業者によって容易に決定可能であり、そして一般に、プローブ長、洗浄温度、および塩濃度に依存的な経験的計算である。一般に、より長いプローブは、適切なアニーリングのためにより高い温度を必要とするが、より短いプローブはより低い温度を必要とする。ハイブリダイゼーションは、一般に、相補鎖が融解温度以下の環境に存在する場合に変性したＤＮＡが再アニールする能力に依存する。プローブとハイブリダイズ可能な配列との間の所望の相同性の程度が高いほど、使用され得る相対温度が高い。結果として、より高い相対温度が、反応条件をよりストリンジェントにする傾向があるが、より低い温度ではそうではないことになる。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーのさらなる詳細および説明については、Ａｕｓｕｂｅｌら，ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ＷｉｌｅｙＩｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅＰｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，（１９９５）を参照のこと。

本明細書で定義される「ストリンジェント条件」または「高ストリンジェンシー条件」は、（１）洗浄のための低イオン強度および高温、例えば、５０℃で０．０１５Ｍ塩化ナトリウム／０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム／０．１％ドデシル硫酸ナトリウムを用いる；（２）ホルムアルドのような変性剤、例えば、４２℃にて、０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％Ｆｉｃｏｌｌ／０．１％ポリビニルピロリドン／７５０ｍＭ塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウムを含むｐＨ６．５での５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）を含む５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド、をハイブリダイゼーション中に用いる；または（３）４２℃にて５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５ＭＮａＣｌ、０．０７５Ｍクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５×デンハート溶液、超音波処理したサケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳ、および１０％硫酸デキストランを用い、０．２×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）および５５℃で５０％ホルムアミド中で４２℃にて洗浄し、次いで５５℃にてＥＤＴＡを含む０．１×ＳＳＣからなる高ストリンジェンシー洗浄する、条件によって同定され得る。

「中程度のストリンジェント条件」は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＮｅｗＹｏｒｋ：ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ，１９８９に記載のように同定され得、そして上記よりもストリンジェントでない洗浄溶液およびハイブリダイゼーション条件（例えば、温度、イオン強度、および％ＳＤＳ）の使用を含む。中程度のストリンジェント条件の例は、２０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート溶液、１０％硫酸デキストラン、および２０ｍｇ／ｍＬ変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中で３７℃にての一晩インキュベート、次いで約３７〜５０℃にて１×ＳＳＣ中でフィルターを洗浄することである。当業者は、プローブ長などのような適切な因子に必要なように、温度、イオン強度などをどのように調節するかを認識する。

本明細書で使用する場合、用語「タグ化されたエピトープ」とは、「タグポリペプチド」に融合したＴＩＥリガンドホモログポリペプチドを含むキメラポリペプチドをいう。タグポリペプチドは、抗体が作製され得るエピトープを提供するために十分な残基を有するが、融合されるポリペプチドの活性を妨害しないように十分に短い。タグポリペプチドはまた、好ましくは、抗体が他のエピトープと実質的に交差反応しないかなり独特である。適切なタグポリペプチドは、一般に、少なくとも６アミノ酸残基、および通常は約８〜５０アミノ酸残基（好ましくは、約１０〜２０アミノ酸残基）を有する。

本発明のＴＩＥリガンドホモログに関して、用語「生物学的活性」および「生物学的に活性な」とは、分子が公知または本明細書中以降に発見されるＴＩＥリガンドのネイティブなレセプター（以降「ＴＩＥレセプター」という）、例えば、ネイティブなＴＩＥ−２レセプターに特異的に結合しそしてそれによってシグナルを出す能力、あるいはシグナル伝達に関与するネイティブなＴＩＥレセプター（例えば、ＴＩＥ−２）の能力をブロックする能力をいう。したがって、本発明の（ネイティブなおよび改変体）ＴＩＥリガンドは、ネイティブなＴＩＥ（例えば、ＴＩＥ−２）レセプターのアゴニストおよびアンタゴニストを含む。本発明のＴＩＥリガンドの好ましい生物学的活性は、新生血管形成を誘導または阻害する能力を含む。新生血管形成を誘導する能力は、生物学的症状および疾患（例えば、創傷治癒、虚血、および糖尿病）の処置に有用であり、ここでは、新生血管形成が望ましい。他方で、新生血管形成を阻害またはブロックする能力は、例えば、腫瘍増殖を予防または減弱することに有用であり得る。他の好ましい生物学的活性は、筋肉増殖または発達に影響を及ぼす能力である。さらに好ましい生物学的活性は、骨発生、成熟、または増殖に影響を与える能力である。さらにもう１つの好ましい生物学的活性は、乳ガンのようなガンの病理における関与である。なおさらに好ましい生物学的活性は、内皮細胞増殖を阻害および／またはアポトーシスを誘導する能力である。

用語「ネイティブなＴＩＥレセプター」は、ヒト、他の高等霊長類（例えば、サル）、ならびに齧歯類（例えば、ラットおよびマウス）を含むが、これらに限定されない任意の動物種のＴＩＥレセプターをいうために本明細書で使用される。この定義は、詳細には、例えば、ＰＣＴ出願第ＷＯ９５／１３３８７号（１９９５年５月１８日公開）に開示されるＴＩＥ−２レセプター、およびＰＣＴ出願公開公報第ＷＯ９３／１４１２４号（１９９３年７月２２日公開）で「ＴＩＥ」という内皮細胞レセプターチロシンキナーゼを含むが、これらに限定されず、そして好ましくはＴＩＥ−２である。

用語「機能的誘導体」は、本発明のネイティブなＴＩＥリガンドホモログの生物学的に活性なアミノ酸配列改変体、ならびに、誘起誘導体化薬剤との反応によって得られた誘導体、翻訳後修飾、非タンパク質性ポリマーを有する誘導体、およびイムノアドヘシンを含む共有改変を定義するために使用される。

「血管内皮増殖因子」／「血管透過因子」（ＶＥＧＦ／ＶＰＦ）は、低酸素症によって刺激されそして腫瘍脈管形成に必要とされることが最近示された、内皮細胞特異的マイトジェンである（Ｓｅｎｇｅｒら，Ｃａｎｃｅｒ４６：５６２９−５６３２（１９８６）；Ｋｉｍら，Ｎａｔｕｒｅ３６２：８４１−８４４（１９９３）；Ｓｃｈｗｅｉｋｉら，Ｎａｔｕｒｅ３５９：８４３−８４５（１９９２）；Ｐｌａｔｅら，Ｎａｔｕｒｅ３５９：８４５−８４８（１９９２））。これは、合成されそして種々の腫瘍および正常細胞によって分泌される３４〜４３ｋＤａ（約４５ｋＤａにて優勢な種を有する）ダイマーのジスルフィド結合した糖タンパク質である。さらに、色素上皮細胞および周皮細胞のような培養したヒト網膜細胞は、低酸素症に応答してＶＥＧＦを分泌しそしてＶＥＧＦ遺伝子発現を増加させることが証明された（Ａｄａｍｉｓら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９３：６３１−６３８（１９９３）；Ｐｌｏｕｅｔら，Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．３４：９００（１９９２）；Ａｄａｍｉｓら，Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．３４：１４４０（１９９３）；Ａｉｅｌｌｏら，Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．３５：１８６８（１９９４）；Ｓｉｍｏｒｒｅ−ｐｉｎａｔｅｌら，Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．３５：３３９３−３４００（１９９４））。逆に、正常組織におけるＶＥＧＦは比較的低い。したがって、ＶＥＧＦは、新生血管形成に関連する多くの病理学的状態およびプロセスにおいて主要な役割を果たすようである。したがって、上記の種々の症状によって影響を受ける組織におけるＶＥＧＦ発現の調節は、低酸素症に関連する処置または予防的治療に重要であり得る。

本明細書に記載される種々のポリペプチドを記載するために使用される場合、用語「単離された」とは、その天然環境の成分から同定および分離および／または回収されているポリペプチドを意味する。その天然の環境の夾雑成分は、代表的には、ポリペプチドについての診断または治療用途を妨害し、そして酵素、ホルモン、および他のタンパク質性または非タンパク質性溶質を含み得る物質である。好ましい実施態様では、ポリペプチドは、（１）スピニングカップシークエネーターの使用によるＮ末端または内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るために十分な程度まで、または（２）クーマシーブルーまたは好ましくは銀染色を使用して非還元または還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによる均一性まで、精製される。単離されたポリペプチドは、インサイチュで、組換え細胞内にポリペプチドを含む。なぜなら、ＴＩＥリガンドホモログの天然環境の少なくとも１つの成分が存在しないからである。しかし、通常、単離されたポリペプチドは、少なくとも１つの精製工程によって調製される。

用語「アゴニスト」は、ネイティブなＴＩＥレセプター（例えば、ＴＩＥ−２）によってシグナルを出す能力を有するならば、本発明のネイティブなＴＩＥリガンドホモログのペプチドおよび非ペプチドアナログ、ならびにこのようなネイティブなＴＩＥリガンドホモログを特異的に結合する抗体をいうために使用される。言い換えると、用語「アゴニスト」は、ＴＩＥレセプターの生物学的役割の状況において定義され、およびネイティブなＴＩＥリガンドホモログの生物学的役割に関して定義されず、これは、上述のように、ＴＩＥレセプター生物学的機能のアゴニストまたはアンタゴニストであり得る。好ましいアゴニストは、血管形成のプロモーターであるか、または骨形成成熟または増殖に役割を果たす。他の好ましいアゴニストは、筋肉増殖または発達を促進する。

用語「アンタゴニスト」は、ネイティブなＴＩＥレセプター（例えば、ＴＩＥ−２）の生物学的機能を阻害する能力を有するならば、本発明のネイティブなＴＩＥリガンドホモログのペプチドおよび非ペプチドアナログを、ならびにこのようなネイティブなＴＩＥリガンドホモログを特異的に結合する抗体をいうために使用される。また、用語「アンタゴニスト」は、ＴＩＥレセプターの生物学的役割に関して定義され、およびネイティブなＴＩＥリガンドホモログの生物学的役割に関して定義されず、これは、ＴＩＥレセプター生物学的機能のアゴニストまたはアンタゴニストのいずれかであり得る。好ましいアンタゴニストは、血管形成、あるいは病理学的骨格または筋肉の発達または増殖のインヒビターである。

句「遺伝子増幅」および「遺伝子重複」は、交換可能に使用され、そして遺伝子または遺伝子フラグメントの複数のコピーが、特定の細胞または細胞株で形成されるプロセスをいう。重複した領域（増幅したＤＮＡのストレッチ）は、しばしば「アンプリコン」といわれる。通常、産生されたメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の量、すなわち、遺伝子発現のレベルはまた、発現した特定の遺伝子から作成されるコピー数の割合で増加する。

本明細書で使用される場合、「腫瘍」とは、悪性または良性の、ならびにすべての前ガン性およびガン性の細胞および組織のいずれかの、全ての新形成細胞成長および増殖をいう。

用語「ガン」および「ガン性」とは、代表的には調節されない細胞増殖によって特徴づけられる、哺乳動物における生物学的症状をいうかまたは記載する。ガンの例には、ガン腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、および白血病が挙げられるが、これらに限定されない。このようなガンのより特定な例には、乳ガン、前立腺ガン、結腸ガン、扁平上皮ガン、小細胞肺ガン、非小細胞肺ガン、胃腸ガン、膵臓ガン、神経膠芽腫、子宮頚ガン、卵巣ガン、悪性肝ガン（ｈｅｐａｔｏｍａ）、膀胱ガン、肝腫瘍、結直腸ガン、子宮内膜ガン、唾液腺ガン、腎臓ガン、肝臓ガン、外陰部ガン、甲状腺ガン、肝ガン腫、ならびに種々のタイプの頭部および頚部ガンが挙げられる。

「処置」は、発生を抑制することまたは障害の病理を変更することを意図して行われる介入である。したがって、「処置」とは、治療処置および予防または防止尺度の両方をいう。処置を必要とするものには、既に障害を有するものならびに障害が予防されるべきものが挙げられる。腫瘍（例えば、ガン）処置では、治療薬剤は、腫瘍細胞の病理を直接減少し得るか、または腫瘍細胞が他の治療薬剤による処置、例えば、放射線照射および／または化学療法をより受けやすくし得る。

ガンの「病理」は、患者の安寧に欠陥を生じさせるすべての現象を含む。これには、異常または制御不能な細胞増殖、転移、隣接細胞の正常機能の妨害、サイトカインまたは他の分泌産物の異常レベルでの放出、炎症または免疫学的応答の抑制または悪化などが挙げられが、これらに限定されない。

処置の目的のための「哺乳動物」とは、ヒト、家畜および飼育動物、ならびにイヌ、ウマ、ネコ、ウシなどのような動物園、競技、またはペット動物を含む、哺乳動物として分類される任意の動物をいう。好ましくは、哺乳動物はヒトである。

１つ以上のさらなる治療薬剤「と組み合わせた」投与は、同時（共同して作用する（ｃｏｎｃｕｒｒｅｎｔ））および任意の順での連続投与を含む。

本明細書で使用される場合、用語「細胞傷害性薬剤」とは、細胞の機能を阻害または抑制するおよび／または細胞の破壊を引き起こす物質をいう。この用語は、放射性同位元素（例えば、Ｉ¹³¹、Ｉ¹²⁵、Ｙ⁹⁰、およびＲｅ¹⁸⁶）、化学療法剤、および細菌、真菌、植物、または動物起源の酵素的に活性な毒素またはそのフラグメントのようなトキシンを含むことを意図する。

「化学療法剤」は、ガンの処置に有用な化学化合物である。化学療法剤の例には、アドリアマイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、５−フルオロウラシル、シトシンアラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）、シクロホスファミド、チオテパ、ブスルファン、シトキシン、タキソイド類、例えば、パクリタキセル（Ｔａｘｏｌ，Ｂｒｉｓｔｏｌ−ＭｙｅｒｓＳｑｕｉｂｂＯｎｃｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，ＮＪ）、およびドキセタキセル（Ｔａｘｏｔｅｒｅ，Ｒｈｏｎｅ−ＰｏｕｌｅｎｃＲｏｒｅｒ，Ａｎｔｏｎｙ，Ｒｎａｃｅ）、トキソテレ、メトトレキセート、シスプラチン、メルファラン、ビンブラスチン、ブレオマイシン、エトポシド、イフォスファミド、マイトマイシンＣ、ミトキサントロン、ビンクリスチン、ビノレルビン、カルボプラチン、テニポシド、ダウノマイシン、カルミノマイシン、アミノプテリン、ダクチノマイシン、マイトマイシン類、エスペラミシン類（米国特許第４，６７５，１８７号を参照のこと）、メルファラン、および他の関連のナイトロジェンマスタードが挙げられる。この定義には、タモキシフェンおよびオナプリストンのような腫瘍においてホルモン作用を調節または阻害するように作用するホルモン性薬剤もまた含まれる。

本明細書で使用される場合、「増殖阻害薬剤」とは、インビトロまたはインビボのいずれかで、細胞、特に本明細書で同定された遺伝子のいずれかを過剰発現するガン細胞の増殖を阻害する化合物または組成物をいう。したがって、増殖阻害薬剤は、Ｓ期においてこのような遺伝子を過剰発現する細胞の割合を顕著に減少させるものである。増殖阻害薬剤の例には、Ｇ１期阻止およびＭ期阻止を誘導する薬剤のような、細胞周期進行（Ｓ期以外の期間で）をブロックする薬剤が挙げられる。古典的Ｍ期ブロッカーには、ビンカス（ビンクリスチンおよびビンブラスチン）、タキソール、ならびに、ドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシド、およびブレオマイシンのようなトポＩＩインヒビターが挙げられる。Ｇ１期を阻止する薬剤はまた、Ｓ期阻止にも及び、例えば、タモキシフェン、プレドニゾン、ダカルバジン、メクトレタミン、シスプラチン、メトトレキセート、５−フルオロウラシル、およびａｒａ−ＣのようなＤＮＡアルキル化剤である。さらなる情報が、Ｍｕｒａｋａｍｉらによる「Ｃｅｌｌｃｕｃｌｅｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，ｏｎｃｏｇｅｎｅｓ，ａｎｄａｎｔｉｎｅｏｐｌａｓｔｉｃｄｒｕｇｓ」という題の、ＴｈｅＭｏｌｅｃｕｌａｒＢａｓｉｓｏｆＣａｎｃｅｒ，ＭｅｎｄｅｌｓｏｈｎおよびＩｓｒａｅｌ編，Ｃｈａｐｔｅｒ１、特に１３頁で見られ得る。

「ドキソルビシン」は、アントラサイクリン系抗生物質である。ドキソルビシンの完全な化学物質名は、（８Ｓ−シス）−１０−［（３−アミノ−２，３，６−トリデオキシ−α−Ｌ−リソキシ−ヘキサピラノシル）オキシ］−７，８，９，１０−テトラヒドロ−６，８，１１−トリヒドロキシ−８−（ヒドロキシアセチル）−１−メトキシ−５，１２−ナフタセネジオンである。

用語「サイトカイン」は、細胞内メディエーターとしてもう１つの細胞で作用する１つの細胞集団によって放出されるタンパク質についての一般的な用語である。このようなサイトカインの例は、リンホカイン、モノカイン、および伝統的ポリペプチドホルモンである。サイトカインの中には、ヒト成長ホルモン、Ｎ−メチオニルヒト成長ホルモン、およびウシ成長ホルモンのような成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インスリン；プロインスリン；レラキシン；プロレラキシン；卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、および黄体形成ホルモン（ＬＨ）のような糖タンパク質ホルモン；肝臓増殖因子；繊維芽細胞増殖因子；胎盤性ラクトゲン；腫瘍壊死因子−αおよび−β；ミュラー管阻害因子；マウス性腺刺激ホルモン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮増殖因子；インテグリン；トロンボポエチン（ＴＰＯ）；ＮＦＧ−βのような神経増殖因子；血小板増殖因子；ＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−βのようなトランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）；インスリン様増殖因子−Ｉおよび−ＩＩ；エリスロポエチン（ＥＰＯ）；骨誘導性因子；インターフェロン−α、−β、および−γのようなインターフェロン；マクロファージ−ＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦ）のようなコロニー刺激因子（ＣＳＦ）；顆粒球−マクロファージ−ＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ）；および顆粒球−ＣＳＦ（Ｇ−ＣＳＦ）；ＩＬ−１、ＩＬ−１α、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２のようなインターロイキン（ＩＬ）；ＴＮＦ−αまたはＴＮＦ−βのような腫瘍壊死因子；およびＬＩＦおよびキットリガンド（ＫＬ）を含む他のポリペプチド因子が挙げられる。本明細書で使用される場合。用語サイトカインには、天然供給源からまたは組換え細胞培養物からのタンパク質およびネイティブな配列のサイトカインの生物学的に活性な等価物が挙げられる。

「単離された」核酸分子は、核酸の天然供給源中に普通に会合する少なくとも１つの夾雑核酸分子から同定および分離される核酸分子である。単離された核酸分子は、天然で見いだされる形態または配置以外である。単離された核酸分子は、したがって、天然細胞に存在するので、核酸分子とは区別される。しかし、単離された核酸分子には、例えば、核酸分子が天然細胞とは異なる染色体位置にある場合、本発明のＴＩＥリガンドホモログを普通に発現する細胞に含まれる核酸分子が含まれる。

用語「アミノ酸配列改変体」とは、ネイティブなアミノ酸配列と比較してそのアミノ酸配列にいくつかの差を有する分子をいう。

置換改変体は、除去されるネイティブな配列で少なくとも１つのアミノ酸残基および同じ位置で代わりに挿入される異なるアミノ酸を有するものである。置換は、分子中の１つのみのアミノ酸が置換される場合、単一であり得、あるいは、２つ以上のアミノ酸が同じ分子で置換される場合は、複数であり得る。

挿入改変体は、ネイティブな配列において特定の位置でアミノ酸に直接隣接して挿入される１つ以上のアミノ酸を有する改変体である。アミノ酸に直接隣接するとは、アミノ酸のα−カルボキシ官能基またはα−アミノ官能基のいずれかに接続されることを意味する。

欠失改変体は、ネイティブなアミノ酸配列に除去される１つ以上のアミノ酸を有する改変体である。通常、欠失改変体は、分子の特定の領域で欠失した１または２アミノ酸を有する。欠失改変体には、Ｃ−および／またはＮ−末端欠失（短縮）を有するもの、ならびに１つ以上のアミノ酸の内部欠失を有する改変体が挙げられる。本発明の好ましい欠失改変体は、本発明のネイティブなＴＩＥリガンドホモログのフィブリノーゲン様ドメインの外側の欠失を含む。

本発明のアミノ酸配列改変体は、最適の特徴を有する分子を産生するために、アミノ酸置換、挿入、および／または欠失の種々の組み合わせを含み得る。

アミノ酸は、化学組成およびその側鎖の特性に従って分類され得る。これらは、２つの群、荷電的および非荷電的に広く分類される。これらの群のそれぞれは、アミノ酸をより正確に分類するために下位集団に分割される。
Ｉ．荷電アミノ酸酸性残基：アスパラギン酸、グルタミン酸塩基性残基：リジン、アルギニン、ヒスチジンＩＩ．非荷電アミノ酸親水性残基：セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン脂肪族残基：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン非極性残基：システイン、メチオニン、プロリン芳香族残基：フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン保存的置換は、１つの群内のメンバーを同じ群内のもう１つのメンバーと交換することを含むが、非保存的置換は、これらのクラスの１つのメンバーをもう１つに交換することを伴う。非保存的置換によって得られる改変体は、得られた改変体の生物学的特性／機能の顕著な変化を生じることが予測される。

アミノ酸配列欠失は、一般に、約１〜３０残基、より好ましくは約１〜１０残基の範囲であり、そして代表的には隣接する。欠失は、ネイティブなＴＩＥレセプターとの相互作用に直接関連しない領域に導入され得る。欠失は、好ましくは、本発明のＴＩＥリガンドホモログのＣ末端のフィブリノーゲン様領域の外側で行われる。

アミノ酸挿入には、１残基から１００以上の残基を含むポリペプチドまでの長さの範囲のアミノおよび／またはカルボキシル末端融合、ならびに単一または複数アミノ酸残基の配列内挿入が挙げられる。配列内挿入（すなわち、ＴＩＥリガンドホモログアミノ酸配列内の挿入）は、一般に、約１〜１０残基、より好ましくは１〜５残基、より好ましくは１〜３残基の範囲であり得る。末端挿入の例には、Ｎ末端メチオニル残基を有するＴＩＥリガンドホモログ、細菌組換え細胞培養物中のその直接発現の人工産物、および組換え宿主細胞からの成熟ＴＩＥリガンドホモログの分泌を容易にするための異種Ｎ末端シグナル配列のＴＩＥリガンドホモログのＮ末端への融合物が挙げられる。このようなシグナル配列は、一般に、目的の宿主細胞種から得られ、したがって相同である。適切な配列には、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉについてはＳＴＩＩまたはＩｐｐ、酵母についてはα因子、および哺乳動物細胞についてはヘルペスｇＤのようなウイルスシグナルが挙げられる。ネイティブなＴＩＥリガンドホモログ分子の他の挿入改変体には、免疫原性ポリペプチド、例えば、β−ラクタマーゼまたはＥ．ｃｏｌｉによってコードされる酵素のような細菌ポリペプチド、または酵母タンパク質への、ＴＩＥリガンドホモログ分子のＮ末端またはＣ末端の融合物、ならびに、１９８９年４月６日に公開されたＷＯ８９／０２９２２に記載のように、免疫グロブリン領域（好ましくは、免疫グロブリン定常領域）、アルブミン、またはフェリチンのような長い半減期を有するタンパク質とのＣ末端融合物が挙げられる。

改変体ＴＩＥリガンドホモログの特徴を予め予測することがしばしば困難であるので、いくつかのスクリーニングが最適な改変体を選択するために必要とされることが理解される。

本発明のネイティブなＴＩＥリガンドホモログのアミノ酸配列改変体は、ネイティブなＴＩＥリガンドホモログのＤＮＡに適切なヌクレオチド変化を導入することによって、または所望のポリペプチドのインビトロ合成によって、当該技術分野で公知の方法によって調製される。アミノ酸配列改変体の構築における２つの主な変数がある：変異部位の位置および変異の性質。ＴＩＥリガンドホモログをコードするＤＮＡ配列の操作を必要としない、天然に存在する対立遺伝子を除いて、ＴＩＥリガンドホモログのアミノ酸配列改変体は、好ましくは、対立遺伝子または天然に存在しないアミノ酸配列改変体のいずれかを実現するために、DNAを変異することによって構築される。

変異の１つの群は、ＴＩＥレセプター、例えば、ＴＩＥ−１またはＴＩＥ−２との相互作用に関連すると同定された、本発明のＴＩＥリガンドホモログのドメイン内で生成される。

あるいはまたはさらに、アミノ酸の変更は、実現されるべき目的に依存して、種々の種からのＴＩＥリガンドホモログが異なる部位、または高度に保存された領域に作成され得る。

このような位置での部位は、代表的には、例えば、（１）最初に保存的選択で、次いで実現した結果に依存してより根本的選択で置換すること、（２）標的残基を欠失すること、または（３）位置した部位に隣接する同じまたは異なるクラスの残基を挿入すること、または選択肢１〜３の組み合わせによって連続して改変される。

１つの有用な技術は、「アラニンスキャンニング」と呼ばれる（ＣｕｎｎｉｎｇｈａｍおよびＷｅｌｌｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４４，１０８１−１０８５［１９８９］）。ここで、残基または標的残基の群は、アラニンまたはポリアラニンによって同定されそして置換される。次いで、アラニン置換に対する機能的感受性を証明するドメインは、アラニン置換の部位でまたは部位に対してさらにまたは他の置換基を導入することによって精錬される。

所望の変異を同定した後、ＴＩＥリガンドのアミノ酸配列改変体をコードする遺伝子は、例えば、上記のように化学合成によって得られ得る。

より好ましくは、ＴＩＥリガンドホモログのアミノ酸配列改変体をコードするＤＮＡは、より初期に調製されたリガンドの改変体または非改変型をコードするＤＮＡの部位特異的変異誘発によって調製される。部位特異的変異誘発は、所望の変異のＤＮＡ配列をコードする特異的オリゴヌクレオチド配列、ならびに横切った欠失連結部の両側で安定な二重鎖を形成するために十分なサイズおよび配列複雑性のプライマー配列を提供するために、隣接オリゴヌクレオチドの十分な数の使用によってリガンド改変体の産生を可能にする。代表的には、約２０〜２５ヌクレオチド長のプライマーが好ましく、配列の連結部の両側での約５〜１０残基が変更される。一般に、部位特異的変異誘発の技術は、当該分野で周知であり、Ｅｄｅｌｍａｎら，ＤＮＡ２，１８３（１９８３）のような刊行物に例示される。理解されるように、部位特異的変異誘発技術は、代表的には、一本鎖形態および二本鎖形態の両方で存在するファージベクターを用いる。部位特異的変異誘発に有用な代表的なベクターには、例えば、Ｍｅｓｓｉｎｇら，ＴｈｉｒｄＣｌｅｖｅｌａｎｄＳｙｍｐｏｓｉｕｍｏｎＭａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓａｎｄＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＤＮＡ，Ａ．Ｗａｌｔｏｎ編，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ（１９８１）に開示されるように、Ｍ１３ファージのようなベクターが挙げられる。これおよび他のファージベクターは市販されており、そしてその使用は、当業者に周知である。Ｍ１３由来ベクターを使用するＤＮＡフラグメントにおける部位特異的変異を指示するオリゴデオキシリボヌクレオチドの構築のための多才なおよび有効な手順は、Ｚｏｌｌｅｒ，Ｍ．Ｊ．およびＳｍｉｔｈ，Ｍ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１０，６４８７−６５００［１９８２］によって公開された。また、一本鎖ファージ複製起点を含むプラスミドベクター（Ｖｅｉｒａら，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３，３［１９８７］）は、一本鎖ＤＮＡを得るために用いられ得る。あるいは、ヌクレオチド置換は、インビトロで適切なＤＮＡフラグメントを合成することによって、および当該技術分野で公知のＰＣＲ手順によって増幅することによって導入される。

一般に、本願の部位特異的変異誘発は、関連タンパク質をコードするＤＮＡ配列をその配列内に含む一本鎖ベクターを最初に得ることによって行われる。所望に変異された配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーは、例えば、Ｃｒｅａら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃｉＵＳＡ７５，５７６５（１９７８）によって、一般に合成的に調製される。次いで、このプライマーは、一本鎖タンパク質配列含有ベクターとアニールし、そしてＥ．ｃｏｌｉポリメラーゼＩクレノウフラグメントのようなＤＮＡ重合化酵素を受けさせて、変異含有鎖の合成を完了させる。したがって、ヘテロ二重鎖は、１つの鎖が元の非変異配列をコードし、そして第２鎖が所望の変異を有する場合に形成される。次いで、このヘテロ二重鎖ベクターは、ＪＰ１０１細胞のような適切な宿主細胞を形質転換するために使用され、そして変異した配列アライメントを有する組換えベクターを含むクローンが選択される。その後、変異した領域は除去され、そしてタンパク質産生に適切な発現ベクター中に配置され得る。

ＰＣＲ技術はまた、ＴＩＥリガンドホモログのアミノ酸配列改変体を生成することに使用され得る。少量のテンプレートＤＮＡがＰＣＲにおける開始物質として使用される場合、テンプレートＤＮＡにおいて対応する領域とは配列がわずかに異なるプライマーは、プライマーがテンプレートと異なる位置のみでテンプレート配列とは異なる比較的大量の特異的ＤＮＡフラグメントを生成するために使用され得る。プラスミドＤＮＡへの変異の導入のために、プライマーの１つは、変異の位置を重複しそして変異を含むように設計され；他のプライマーの配列は、プラスミドの反対鎖の配列のストレッチと同一でなければならないが、この配列は、プラスミドＤＮＡに沿ってどこにでも位置し得る。しかし、第２プライマーの配列が、第１の配列から２００ヌクレオチド内に位置しそのため末端でプライマーに結合したＤＮＡの全体の増幅した領域が容易に配列決定され得ることが好ましい。まさに記載したもののようなプライマー対を使用するＰＣＲ増幅は、プライマーによって特定される変異の位置で異なるＤＮＡフラグメントの集団を生じ、そしておそらく他の位置では、テンプレートとしてコピーすることは、幾分誤る傾向がある。

物質を産生するためのテンプレートの比が非常に低いならば、大多数の産物ＤＮＡフラグメントは、所望の変異を組み込む。この産物物質は、標準的ＤＮＡ技術を使用してＰＣＲテンプレートとして用いたプラスミド中の対応する領域を置換するために使用される。別々の位置での変異は、変異体第２プライマーを使用するかまたは異なる変異体プライマーでの第２ＰＣＲを行うことのいずれか、および３つ（またはそれ以上）の部分的ライゲーションにおいてベクターフラグメントに２つの得られるＰＣＲフラグメントを同時にライゲートすることによって、同時に導入され得る。

ＰＣＲ変異誘発の特定の例では、テンプレートプラスミドＤＮＡ（１μｇ）は、増幅されるべき領域の外側でプラスミドＤＮＡ中に独特の認識部位を有する制限エンドヌクレアーゼによる切断によって直線化される。この物質のうち、１００ｎｇを、４つのデオキシヌクレオチド酸リン酸を含みそしてＧｅｎｅＡｍｐ（商標）キット（Ｐｅｒｋｉｎ−ＥｌｍｅｒＣｅｔｕｓ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴおよびＥｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＣＡより入手）、および２５ｐｍｏｌの各オリゴヌクレオチドプライマーに含まれるＰＣＲ緩衝液を含むＰＣＲ混合物に、５０μｌの最終容量まで添加する。反応混合物を、３５μｌ鉱油で重層する。反応物を、１００℃にて５分間変性し、氷上に簡単に置き、次いでＰｅｒｋｉｎ−ＥｌｍｅｒＣｅｔｕｓ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴおよびＥｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＣＡから購入した１μｌＴｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼ（５単位／ｌ）を、鉱油層の下に添加する。次いで、反応混合物を、以下のようにプログラムされたＤＮＡサーマルサイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ−ＥｌｍｅｒＣｅｔｕｓから購入した）に差し込む：２分、５５℃、３０秒、７２℃、次いで以下の１９サイクル：３０秒、９４℃、３０秒、５５℃、および３０秒、７２℃。

プログラムの最後に、反応バイアルを、サーマルサイクラーから取り出しそして水相を新しいバイアルに移し、フェノール／クロロホルム（５０：５０ｖｏｌ）で抽出し、そしてエタノール沈殿し、そしてＤＮＡを標準的手順によって回収する。この物質は、その後、ベクターへの挿入のために適切な処置にかける。

改変体を調製するためのもう１つの方法である、カセット変異誘発は、Ｗｅｌｌｓら，［Ｇｅｎｅ３４，３１５（１９８５）］に記載の技術に基づく。開始物質は、変異されるべきＴＩＥリガンドホモログＤＮＡを含むプラスミド（またはベクター）である。変異されるべきＴＩＥリガンドホモログ内のコドンが同定される。同定された変異部位の各側における独特の制限エンドヌクレアーゼがなければならない。このような制限部位が存在しないならば、これらは、ＴＩＥリガンドホモログをコードするＤＮＡにおいて適切な位置に導入するための上記のオリゴヌクレオチド媒介変異誘発方法を使用して生成され得る。制限部位がプラスミドに導入された後、プラスミドを、直線にするためにこれらの部位で切断する。制限部位間のＤＮＡの配列をコードするが所望の変異を含む二本鎖オリゴヌクレオチドを、標準的手順を使用して合成する。２つの鎖を別々に合成し、次いで標準的技術を使用してともにハイブリダイズする。この二本鎖オリゴヌクレオチドは、カセットという。このカセットを、プラスミドに直接連結され得るように、直線にしたプラスミドの末端と適合可能である３’および５’末端を有するように設計する。このプラスミドは、現在、変異したＴＩＥリガンドホモログＤＮＡ配列を含む。

さらに、いわゆるファージミド提示方法は、ネイティブか、または改変体ＴＩＥリガンドホモログのアミノ酸配列改変体を作成することに有用であり得る。この方法は、（ａ）変異させるべきレセプターをコードする第１の遺伝子、第１および第２の遺伝子が異種である天然または野生型ファージコートタンパク質の少なくとも一部をコードする第２の遺伝子、および融合タンパク質をコードする遺伝子融合物を形成する第１および第２の遺伝子に作動可能に連結される転写調節エレメントを含む、複製可能な発現ベクターを構築する工程；（ｂ）関連のプラスミドのファミリーを形成する第１の遺伝子内の１つ以上の選択された位置でベクターを変異する工程；（ｃ）プラスミドで適切な宿主細胞を形質転換する工程；（ｄ）ファージコートタンパク質をコードする遺伝子を有するヘルパーファージで、形質転換された宿主細胞を感染させる工程；（ｅ）プラスミドの少なくとも一部を含む組換えファージミド粒子を形成するために適切でありそして宿湯を形質転換し得る条件下で、形質転換し感染した宿主細胞を培養する工程であって、この条件が、ほんの少量のファージミド粒子が粒子の表面上に融合タンパク質の１つより多くのコピーを提示するように調節される、工程；（ｆ）ファージミド粒子の少なくとも一部が抗原に結合するように、適切な抗原とファージミド粒子とを接触させる工程；および（ｇ）結合するファージミド粒子を結合しないものと分離する工程、を包含する。工程（ｄ）〜（ｇ）は、１回以上繰り返され得る。好ましくは、この方法において、プラスミドは、転写調節エレメントの堅い制御下にあり、そして培養条件は、粒子の表面上に融合タンパク質の１つより多くのコピーを提示するファージミド粒子の量または数が、約１％以下であるように調節される。また、好ましくは、融合タンパク質の１つより多くのコピーを提示するファージミド粒子の量は、融合タンパク質の単一コピーを提示するファージミド粒子の量の１０％以下である。最も好ましくは、この量は２０％以下である。代表的には、この方法では、発現ベクターは、ポリペプチドの各サブユニットをコードするＤＮＡに融合した分泌シグナル配列をさらに含み、そして転写調節エレメントは、プロモーター系である。好ましいプロモーター系は、ｌａｃＺ、λ_PL、ｔａｃ、Ｔ７ポリメラーゼ、トリプトファン、およびアルカリホスファターゼプロモーター、ならびにその組み合わせから選択される。また、通常は、この方法は、Ｍ１３Ｋ０７、Ｍ１３Ｒ４０８、Ｍ１３−ＶＣＳ、およびＰｈｉＸ１７４から選択されるヘルパーファージを用いる。好ましいヘルパーファージは、Ｍ１３Ｋ０７であり、そして好ましいコートタンパク質は、Ｍ１３ファージ遺伝子ＩＩＩコートタンパク質である。好ましい宿主は、Ｅ．ｃｏｌｉ、およびＥ．ｃｏｌｉのプロテアーゼ欠失株である。

上記および類似の変異誘発技術のさらなる詳細は、例えば、ＳａｍｂｒｏｏｋらＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡｌａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（ＮｅｗＹｏｒｋ：ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，１９８９）、およびＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌら編，Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，１９９１のような、一般的教科書で見いだされる。

「イムノアドヘシン」は、適切な免疫グロブリン定常ドメイン配列に連結したレセプター配列から伝統的に構築されるキメラである（イムノアドヘシン）。このような構造は、当該技術分野で周知である。文献で報告されたイムノアドヘシンには、Ｔ細胞レセプター^*［Ｇａｓｃｏｉｇｎｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃｉＵＳＡ８４、２９３６−２９４０（１９８７）］；ＣＤ４^*［Ｃａｐｏｎら，Ｎａｔｕｒｅ３３７，５２５−５３１（１９８９）；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ３３９，６８−７０（１９８９）；Ｚｅｔｔｍｅｉｓｓｌら，ＤＮＡＣｅｌｌＢｉｏｌ．ＵＳＡ９，３４７−３５３（１９９０）；Ｂｙｒｎら，Ｎａｔｕｒｅ３４４，６６７−６７０（１９９０）］；Ｌ−セレクチン（ホーミングレセプター）［Ｗａｔｓｏｎら，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１１０，２２２１−２２２９（１９９０）；Ｗａｔｓｏｎら，Ｎａｔｕｒｅ３４９，１６４−１６７（１９９１）］；ＣＤ４４^*［Ａｒｕｆｆｏら，Ｃｅｌｌ６１，１３０３−１３１３（１９９０）］；ＣＤ２８^*およびＢ７^*［Ｌｉｎｓｌｅｙら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３，７２１−７３０（１９９１）］；ＣＴＬＡ−４^*［Ｌｉｎｓｌｅｙら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７４，５６１−５６９（１９９１）］；ＣＤ２２^*「Ｓｔａｍｅｎｋｏｖｉｃら，Ｃｅｌｌ６６，１１３３−１１４４（１９９１）］；ＴＮＦレセプター［Ａｓｈｋｅｎａｚｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃｉＵＳＡ８８，１０５３５−１０５３９（１９９１）；Ｌｅｓｓｌａｕｅｒら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７，２８８３−２８８６（１９９１）；Ｐｅｐｐｅｌら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７４，１４８３−１４８９（１９９１）］；ＮＰレセプター［Ｂｅｎｎｅｔｔら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６，２３０６０−２３０６７（１９９１）］；ＩｇＧレセプターα鎖^*［ＲｉｄｇｗａｙおよびＧｏｒｍａｎ，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１５，ａｂｓｔｒ．１４４８（１９９１）］；ＨＧＦレセプター［Ｍａｒｋ，Ｍ．Ｒ．ら，１９９２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，投稿中］の融合物が挙げられ、ここでアステリスク（^*）は、レセプターが免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーであることを示す。

リガンド−免疫グロブリンキメラもまた公知であり、そして例えば、米国特許第５，３０４，６４０号（Ｌ−セレクチンリガンドについて）；同第５，３１６，９２１号および同第５，３２８，８３７号（ＨＧＦ改変体について）に開示される。これらのキメラは、レセプター−免疫グロブリンキメラの構築と類似の方法で作成され得る。

本発明のＴＩＥリガンドホモログの共有改変は、本発明の範囲内に含まれる。このような改変は、ＴＩＥリガンドホモログの標的されたアミノ酸残基を、選択された側面または末端残基と反応し得る誘起誘導体化薬剤と反応させることによって、あるいは選択された宿主細胞で機能する翻訳後改変のメカニズムを利用することによって伝統的に導入される。得られる共有誘導体は、生物学的活性に、イムノアッセイに、または組換え体のイムノアフィニティー精製のための抗ＴＩＥリガンドホモログ抗体の調製に、重要な残基を同定することに関するプログラムで有用である。例えば、ニンヒドリンとの反応後のタンパク質の生物学的活性の完全不活化は、少なくとも１つのアルギニル残基またはリジル残基がその活性に重要であり、その後選択された条件下で改変された個々の残基が、改変したアミノ酸残基を含むペプチドフラグメントの単離によって同定されることを示唆する。このような改変は、当業者の範囲内であり、そして過度の実験を行うことなく行われる。

システニル残基は、最も普通には、クロロ酢酸またはクロロアセタミドのようなα−ハロ酢酸塩（および対応するアミン）と反応して、カルボキシメチルまたはカルボキシアミドメチル誘導体を得る。システニル残基はまた、ブロモトリフルオロアセトン、α−ブロモ−β−（５−イミドゾイル）プロピオン酸、クロロアセチルリン酸、Ｎ−アルキルマレイミド，３−ニトロ−２−ピリジルジスルフィド、メチル２−ピリジルジスルフィド、ｐ−クロロ水銀安息香酸、２−クロロ水銀−４−ニトロフェノール、またはクロロ−７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾールとの反応によって誘導体化される。

ヒスチジル残基は、この薬剤がヒスチジル側鎖に比較的特異的であるので、ｐＨ５．５〜７．０でのジエチルピロカーボネートとの反応によって誘導体化される。パラ−ブロモフェナシルブロミドも有用である；反応は、好ましくは、ｐＨ６．０にて０．１Ｍカコジル酸ナトリウム中で行われる。

リジニルおよびアミノ末端残基は、コハク酸または他のカルボン酸無水物と反応する。これらの薬剤の誘導体化は、リジニル残基の電荷を逆にする効果を有する。α−アミノ含有残基を誘導体化するための他の適切な試薬には、メチルピコリンイミデートのようなイミドエステル；ピリドキサルリン酸；ピリドキサール；クロロボロヒドリド；トリニトロベンゼンスルホン酸；Ｏ−メチルイソ尿素；２，４−ペンタンジオン；およびグリコキシレートとのトランスアミナーゼ触媒した反応物が挙げられる。

アルギニル残基は、１つまたはいくつかの従来の試薬、その中でもフェニルグリオキサール、２，３−ブタンジオン、１，２−シクロヘキサンジオン、およびニンヒドリンとの反応によって改変される。アルギニン残基の誘導体化は、グアニジン官能基の高いｐＫ_aのために、反応がアルカリ条件で行われることが必要とされる。さらに、これらの試薬は、リジン基およびアルギニンイプシロン−アミノ基と反応し得る。

チロシル残基の特定の改変は、芳香族ジアゾニウム化合物またはテトラニトロメタンとの反応によってチロシル残基にスペクトル標識を導入することにおいて、特定の目的で行われ得る。最も普通には、Ｎ−アセチルイミジゾールおよびテトラニトロメタンは、それぞれＯ−アセチルチロシル種および３−ニトロ誘導体を形成するために使用される。チロシル残基は、ラジオイムノアッセイでの使用のために標識されたタンパク質を調製するために¹²⁵Ｉまたは¹³¹Ｉを使用してヨード化される。

カルボキシル側基（アスパルチルまたはグルタミル）は、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−４−エチル）カルボジイミドまたは１−エチル−３−（４−アゾニア−４，４−ジメチルペンチル）カルボジイミドのようなカルボジイミド（Ｒ’−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−Ｒ’）との反応によって選択的に改変される。さらに、アスパルチル残基およびグルタミル残基は、アンモニウムイオンとの反応によってアスパラギニル残基およびグルタミニル残基に変換される。

グルタミニル残基およびアスパラギニル残基は、頻繁に、対応するグルタミルおよびアスパルチル残基に脱アミド化される。あるいは、これらの残基は、穏やかな酸性条件下で脱アミド化される。これらの残基のいずれかの形態は、本発明の範囲内にはいる。

他の改変には、プロリンおよびリジンのヒドロキシル化、セリル、トレオニル、またはチロシル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニン、およびヒスチジン側鎖のα−アミノ基のメチル化（Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：ＳｔｒｕｃｔｕｒｅａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．，ＳａｎＦｒａｎｃｉｓｃｏ，ｐｐ．７９−８６［１９８３］）、Ｎ−末端アミンのアセチル化、ならびに任意のＣ−末端カルボキシル基のアミド化が挙げられる。分子は、さらに、米国特許出願０７／２７５，２９６または米国特許４，６４０，８３５；４，４９６，６８９；４，３０１，１４４；４，６７０，４１７；４，７９１，１９２；または４，１７９，３３７に記載の方法で、非タンパク質性ポリマー、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、またはポリオキシアルキレンに共有結合され得る。

二官能性薬剤での誘導体化は、ＴＩＥリガンドのポリペプチドとの分子内凝集を調製するために、ならびにアッセイまたはアフィニティー精製での使用のために水不溶性支持体マトリクスまたは表面にＴＩＥリガンドポリペプチドを架橋するために、有用である。さらに、鎖間架橋の研究は、コンホメーション構造における直接情報を提供する。普通に使用される架橋剤には、１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、ホモ二官能性イミドエステル、および二官能性マレイミドが挙げられる。メチル−３−［（ｐ−アジドフェニル）ジチオ］プロピオイミデートのような誘導体化剤は、光の存在下で架橋を形成し得る光活性化可能中間体を得る。あるいは、臭化シアン活性化した炭化水素のような反応性水不溶性マトリクスならびに米国特許第３，９５９，６４２号；第３，９６９，２８７号；第３，６９１，０１６号；第４，１９５，１２８号；第４，２４７，６４２号；第４，２２９，５３７号；第４，０５５，６３５号；および第４，３３０，４４０号に記載の系反応性基質が、タンパク質固定化および架橋に用いられる。

ある翻訳後改変は、発現したポリペプチドにおける組換え宿主細胞の作用の結果である。グルタミンおよびアスパラギン残基は、頻繁に、対応するグルタミン酸およびアスパルギン酸残基に翻訳後脱アミド化される。あるいは、これらの残基は、穏やかな酸性条件下で脱アミド化される。これらの残基のいずれかの形態は、本発明の範囲内にはいる。

他の翻訳後改変には、プロリンおよびリジンのヒドロキシル化、セリン、トレオニン、またはチロシン残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニン、およびヒスチジン側鎖のα−アミノ基のメチル化［Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：ＳｔｒｕｃｔｕｒｅａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．，ＳａｎＦｒａｎｃｉｓｃｏ，ｐｐ．７９−８６（１９８３）］が挙げられる。

他の誘導体は、非タンパク質性ポリマーに共有結合した本発明の新規ペプチドを含む。非タンパク質性ポリマーは、通常は、親水性合成ポリマー、すなわち、天然で他には見いだされないポリマーである。しかし、天然に存在し、そして組換えまたはインビトロ方法によって産生されるポリマーは、天然から単離されるポリマーと同様に、有用である。親水性ポリビニルポリマー、例えば、ポリビニルアルコールおよびポリビニルピロリドンは、本発明の範囲にはいる。ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールのようなポリビニルアルキレンエーテルは、特に有用である。

ＴＩＥリガンドホモログは、米国特許第４，６４０，８３５号；第４，４９６，６８９号；第４，３０１，１４４号；第４，６７０，４１７号；第４，７９１，１９２号；または第４，１７９，３３７号に記載の様式で、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、またはポリオキシアルキレンのような種々の非タンパク質性ポリマーに連結され得る。まさに本発明のイムノアドヘシンのような、これらの改変体は、対応するネイティブなＴＩＥリガンドよりも長い半減期を有することが予測される。

ＴＩＥリガンドホモログは、例えば、コアセルベーション技術によってまたは界面重合化によって調製されるマイクロカプセル中に、コロイド薬物送達系（例えばリポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノパーティクル、およびナノカプセル）に、あるいはマクロエマルジョンに捕らえられ得る。このような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，１６版，Ｏｓｏｌ，Ａ．編（１９８０）に開示される。

（Ｂ．抗ＴＩＥリガンドホモログ抗体）
本発明は、ＴＩＥリガンドホモログを特異的に結合する、アゴニストおよびアンタゴニスト抗体をカバーする。この抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであり得、そして限定することなく、成熟抗体、抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）₂、Ｆ_Vなど）、単鎖抗体、および種々の鎖の組み合わせを含む。

用語「抗体」は、最も広い意味で使用され、そして具体的には本発明のＴＩＥリガンドホモログを特異的に結合する単一モノクローナル抗体（アゴニスト、アンタゴニスト、および中和抗体を含む）、ならびに多エピトープ特異性を有する抗体組成物をカバーする。

本明細書で使用される場合、用語「モノクローナル抗体」とは、実質的に均質の抗体の集団から得られる抗体をいい、すなわち、集団を含む個々の抗体は、少ない量で存在し得る潜在的な天然に存在する変異を除いては、同一である。モノクローナル抗体は、非常に特異的であり、単一抗原性部位に対して指向される。さらに、代表的には種々の決定基（エピトープ）に対して指向される種々の抗体を含む従来の（ポリクローナル）抗体調製物とは逆に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対して指向される。

本明細書におけるモノクローナル抗体には、起源の種または免疫グロブリンクラスもしくはサブクラスの指定にかかわりなく、定常ドメインを伴う、抗ＴＩＥリガンドホモログ抗体の可変（超可変を含む）ドメインをスプライシングすることによって産生されるハイブリッドおよび組換え抗体（例えば、「ヒト化」抗体）、または重鎖を伴う軽鎖、またはもう１つの種からの鎖を伴う１つの種からの鎖、または異種タンパク質を伴う融合物、ならびに所望の生物学的活性を示す限り抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）₂、およびＦｖ）が挙げられる。例えば、米国特許第４，８１６，５６７号およびＭａｇｅら，ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｙＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．７９−９７（ＭａｒｃｅｌＤｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．：ＮｅｗＹｏｒｋ，１９８７）を参照のこと。

したがって、修飾語「モノクローナル」は、抗体の実質的に均質な集団から得られるような抗体の特徴を示し、そして任意の特定の方法による抗体の産生を必要とすると解釈されない。例えば、本発明に従って使用されるべきモノクローナル抗体は、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）に最初に記載されたハイブリドーマ方法によって作製され得、または米国特許第４，８１６，５６７号に記載のような組換えＤＮＡ方法によって作製され得る。「モノクローナル抗体」はまた、例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら，Ｎａｔｕｒｅ，３４８：５５２−５５４（１９９０）に記載の技術を使用して生成されるファージライブラリーから単離され得る。

非ヒト（例えば、マウス）抗体の「ヒト化」形態は、特異的キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、またはそれらのフラグメント（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）₂、または抗体の他の抗原結合サブ配列）であり、これは非ヒト免疫グロブリンに由来する最小の配列を含む。ほとんどの部分について、ヒト化抗体は、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）であり、ここで、このレシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）からの残基は、所望の特異性、親和性、および能力を有するマウス、ラットまたはウサギのような非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲからの残基によって置換される。いくつかの場合、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体でも移入されたＣＤＲもしくはフレームワーク配列でも見られない残基を含み得る。これらの改変は、抗体性能をさらに精錬および最適化するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、および代表的には２つの可変ドメインの実質的にすべてを含み、このドメインにおいてＣＤＲ領域のすべてまたは実質的にすべては、非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域に対応し、そしてＦＲ領域のすべてまたは実質的にすべては、ヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のＦＲ領域である。ヒト化抗体はまた、最適には、免疫グロブリン定常領域またはドメイン（Ｆｃ）の少なくとも一部、代表的にはヒト免疫グロブリンの一部を含む。

本発明のＴＩＥリガンドホモログに対するポリクローナル抗体は、一般に、ＴＩＥリガンドホモログおよびアジュバントの複数回の皮下（ｓｃ）または腹腔内（ｉｐ）注射によって動物で惹起される。ＴＩＥリガンドホモログまたは標的アミノ酸配列を含むフラグメントを、免疫投与される種において免疫原性であるタンパク質、例えば、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシチログロブリン、またはダイズトリプシンインヒビターに対して、二官能性または誘導体化剤、例えば、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基を介した結合体）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リジン残基を介する）、グルタルアルデヒド、コハク酸無水物、ＳＯＣｌ₂、またはＲ¹Ｎ＝Ｃ＝ＮＲ（ここでＲおよびＲ¹は異なるアルキル基である）を用いて、結合体化するために有用であり得る。

動物は、１ｍｇまたは１μｇの結合体（それぞれ、ウサギまたはマウスに対して）を３容量のフロイント（Ｆｒｅｎｄ）完全アジュバントと合わせること、および複数の部位で皮内に溶液を注射することによって、免疫原性結合体または誘導体に対して免疫される。１カ月後、その動物に、複数の部位での皮下注射によってフロイント完全アジュバントの元の量の１／５〜１／１０をブーストする。７〜１４日後、動物から採血し、そしてその血清を抗ＴＩＥリガンドホモログ抗体力価についてアッセイする。動物に、その力価がプラトーになるまでブーストする。好ましくは、動物は、同じＴＩＥリガンドホモログであるが異なるタンパク質におよび／または異なる架橋試薬によって結合体化された結合体でブーストする。結合体はまた、タンパク質融合体として組換え細胞培養物中で作製され得る。また、ミョウバンのような凝集剤が、免疫応答を増強するために使用される。

モノクローナル抗体は、実質的に均質な抗体の集団から得られ、すなわち、この集団を含む個々の抗体は、少ない量で存在し得る潜在的な天然に存在する変異を除いては、同一である。したがって、修飾語「モノクローナル」は、異なる抗体の混合物ではないような抗体の特徴を示す。例えば、本発明の抗ＴＩＥリガンドホモログモノクローナル抗体は、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ２５６：４９５（１９７５）に最初に記載されたハイブリドーマ方法を使用して作製され得るか、または組換えＤＮＡ方法［Ｃａｂｉｌｌｙら，米国特許第４，８１６，５６７号］によって作製され得る。

ハイブリドーマ方法では、マウス、またはハムスターのような他の適切な宿主動物は、本明細書中上記のように免疫投与されて、免疫投与のために使用されるタンパク質に特異的に結合する抗体を産生または産生し得るリンパ球を誘起する。あるいは、リンパ球は、インビトロで免疫投与され得る。次いで、リンパ球は、ポリエチレングリコールのような適切な融合剤を使用してミエローマ細胞と融合されて、ハイブリドーマ細胞を形成する［Ｇｏｄｉｎｇ，ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ．５９−１０３（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，１９８６）］。

このように調製されたハイブリドーマ細胞を、融合していない親ミエローマ細胞の増殖または生存を阻害する好ましくは１つ以上の物質を含む、適切な培養培地中に播種し、そして増殖する。例えば、親ミエローマ細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠くならば、ハイブリドーマについての培養培地は、代表的には、ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジンを含み（ＨＡＴ培地）、これらの物質はＨＧＰＲＴ欠失細胞の増殖を抑制する。

好ましいミエローマ細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞によって抗体の安定な高いレベルの発現を支持し、そしてＨＡＴ培地のような培地に感受性である細胞である。これらのうち、好ましいミエローマ細胞株は、ｔｈｅＳａｌｋＩｎｓｔｉｔｕｔｅＣｅｌｌＤｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎＣｅｎｔｅｒ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣａｌｉｆｏｒｎｉａＵＳＡから入手可能なＭＯＰＣ−２１およびＭＰＣ−１１マウス腫瘍に由来するようなマウスミエローマ株、ならびにアメリカンタイプカルチャーコレクション，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭａｒｙｌａｎｄＵＳＡから入手可能なＳＰ−２細胞である。ヒトミエローマおよびマウス−ヒトヘテロミエローマ細胞株も、ヒトモノクローナル抗体の産生について記載されている［Ｋｏｚｂｏｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３３：３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒら，ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｙＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１−６３（ＭａｒｃｅｌＤｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９８７）］。

ハイブリドーマ細胞が増殖している培養培地は、ＴＩＥリガンドホモログに対して指向されるモノクローナル抗体の産生についてアッセイされる。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または固相酵素免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）のようなインビトロ結合アッセイにより免疫沈降剤によって決定される。

このモノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、ＭｕｎｓｏｎおよびＰｏｌｌａｒｄ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０７：２２０（１９８０）のスキャッチャード分析によって決定され得る。

所望の特異性、親和性、および／または活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞を同定した後、そのクローンは、限界希釈手順によってサブクローニングされ、そして標準的方法によって増殖され得る。Ｇｏｄｉｎｇ，ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ．５９−１０４（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，１９８６）。この目的に適切な培養培地には、例えば、ダルベッコの改変イーグル培地またはＲＰＭＩ−１６４０培地が挙げられる。さらに、ハイブリドーマ細胞は、動物における腹水腫瘍のようにインビボで増殖され得る。

このサブクローンによって分泌されるモノクローナル抗体は、例えば、プロテインＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティークロマトグラフィーのような従来の免疫グロブリン精製手順によって、培養培地、腹水液、または血清から適切に分離される。

本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を使用して（例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合し得るオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）容易に単離され、そして配列決定される。本発明のハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの好ましい供給源として用いる。一旦単離すると、ＤＮＡは、発現ベクター中に配置され得、このベクターは、次いでサルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または他に免疫グロブリンを産生しないミエローマ細胞のような宿主細胞にトランスフェクトされて、組換え宿主細胞中でのモノクローナル抗体の合成を得る。ＤＮＡはまた、例えば、同種マウス配列の代わりにヒト重鎖および軽鎖定常ドメインでコード配列を置換することによって（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１，６８５１（１９８４））、または非免疫グロブリンポリペプチドについてのコード配列のすべてまたは一部を免疫グロブリンコード配列に共有結合することによって、改変され得る。このように、本明細書における抗ＴＩＥリガンドモノクローナル抗体の結合特異性を有する「キメラ」または「ハイブリッド」抗体が調製される。

代表的には、このような非免疫グロブリンポリペプチドは、本発明の抗体の定常ドメインについて置換されるか、または本発明の抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインについて置換されて、本発明のＴＩＥリガンドホモログに対する特異性を有する１つの抗原結合部位および異なる抗原に対する特異性を有するもう１つの抗原結合部位を含むキメラ二価抗体を生成する。

キメラまたはハイブリッド抗体はまた、架橋剤を含む化学反応を含む、合成タンパク質化学で公知の方法を使用してインビトロで調製され得る。例えば、イムノトキシンは、ジスルフィド交換反応を使用して、またはチオエステル結合を形成することによって、構築され得る。この目的に適切な試薬の例には、イミノチオレートおよびメチル−４−メルカプトブチルイミデートが挙げられる。

診断適用のために、本発明の抗体は、代表的には、検出可能部分を用いて標識される。この検出可能部分は、直接的または間接的のいずれかで、検出可能シグナルを産生し得る任意の部分であり得る。例えば、この検出可能部分は、³Ｈ、¹⁴Ｃ、³²Ｐ、³⁵Ｓ、または¹²⁵Ｉのような放射性同位元素、フルオレセンイソチオシアネート、ローダミン、またはルシフェリンのような蛍光または化学発光化合物；ビオチン；例えば、¹²⁵Ｉ、³²Ｐ、¹⁴Ｃ、または³Ｈのような放射性同位元素標識、あるいは、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、または西洋ワサビペルオキシダーゼのような酵素であり得る。

抗体を検出可能部分に別々に結合するための当該技術分野で公知の任意の方法が用いられ得、これには、Ｈｕｎｔｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ１４４：９４５（１９６２）；Ｄａｖｉｄら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１３：１０１４（１９７４）；Ｐａｉｎら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．４０：２１９（１９８１）；およびＮｙｇｒｅｎ，Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．ａｎｄＣｙｔｏｃｈｅｍ．３０：４０７（１９８２）に記載の方法が挙げられる。

本発明の抗体は、競合結合アッセイ、直接および間接サンドイッチアッセイ、ならびに免疫沈降アッセイのような、任意の公知のアッセイ方法で用いられ得る。Ｚｏｌａ，ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＡＭａｎｕａｌｏｆＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ｐｐ．１４７−１５８（ＣＲＣＰｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８７）。

競合結合アッセイは、標識された標準（ＴＩＥリガンドホモログまたはその免疫学的反応性部分であり得る）が、限定された量の抗体との結合についてテスト試料分析物（ＴＩＥリガンドホモログ）と競合する能力に依存する。テスト試料中のＴＩＥリガンドホモログの量は、抗体に結合する標準の量に逆比例する。結合する標準の量を決定することを容易にするために、抗体は、一般に、競合前または後に不溶化され、そのため抗体に結合される標準および分析は、結合しないままの標準および分析から簡便に分離され得る。

サンドイッチアッセイは、２つの抗体の使用を含み、それぞれは、検出されるタンパク質の異なる免疫原性部分、またはエピトープに結合し得る。サンドイッチアッセイでは、テスト試料分析物は、固体支持体上に固定されている第一の抗体によって結合され、その後第二の抗体が分析物に結合し、したがって不溶性３部分複合体を形成する。ＤａｖｉｄおよびＧｒｅｅｎｅ，米国特許第４，３７６，１１０号。この第二の抗体は、それ自体が検出可能部分で標識され得るか（直接的サンドイッチアッセイ）、または検出可能部分で標識される抗免疫グロブリン抗体を使用して測定され得る（間接的サンドイッチアッセイ）。例えば、サンドイッチアッセイの１つのタイプは、ＥＬＩＳＡアッセイであり、この場合、検出可能部分は酵素である。

非ヒト抗体をヒト化するための方法は、当該技術分野で周知である。一般に、ヒト化抗体は、非ヒトである供給源から導入される１つ以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、「移入（ｉｍｐｏｒｔ）」残基といわれ、これは代表的には、「移入」可変ドメインから採用される。ヒト化は、本質的に、ヒト抗体の対応する配列で齧歯類ＣＤＲまたはＣＤＲ配列を置換することによって、Ｗｉｎｔｅｒおよび共同研究者［Ｊｏｎｅｓら，Ｎａｔｕｒｅ３２１，５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら，Ｎａｔｕｒｅ３３２，３２３−３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら，Ｓｃｉｎｅｃｅ２３９，１５３４−１５３６（１９８８）］の方法に従って行われ得る。したがって、このような「ヒト化」抗体は、キメラ抗体であり（Ｃａｂｉｌｌｙ，前出）、ここで、インタクトなヒト可変ドメインより実質的に少ないものが、非ヒト種からの対応する配列によって置換されている。実際に、ヒト化抗体は、代表的には、いくつかのＣＤＲ残基およびおそらくいくつかのＦＲ残基が、齧歯類抗体における類似部位からの残基によって置換されているヒト抗体である。

抗体が、抗原および他の好ましい生物学的特性についての高い親和性を保持しながらヒト化されることは重要である。この目的を達成するために、好ましい方法にしたがって、ヒト化抗体は、親およびヒト化配列の三次元モデルを使用して、親配列および種々の概念上のヒト化産物の分析のプロセスによって調製される。三次元免疫グロブリンモデルは、普通に利用可能であり、そして当業者は熟知している。選択された候補免疫グロブリン配列の有望な三次元コンホメーション構造を例示および提示するコンピュータプログラムは、利用可能である。これらの提示の検査は、候補免疫グロブリン配列の機能性における残基の有望な役割の分析、すなわち、候補免疫グロブリンがその抗原を結合する能力に影響を及ぼす残基の分析を可能にする。この方法で、ＦＲ残基が、標的抗原に対する増加した親和性のような所望の抗体特性が達成されるように、コンセンサスおよび移入配列から選択および組み合わせられ得る。一般に、ＣＤＲ残基は、抗原結合に影響を及ぼすことに、直接的およびほとんど実質的に関与する。さらに詳細には、１９９２年８月２１日に出願された米国特許出願第０７／９３４，３７３号を参照のこと、これは、１９９１年６月１４日に出願された出願番号第０７／７１５，２７２号の一部継続である。

あるいは、免疫投与の際に、内因性免疫グロブリン産生の不在下でヒト抗体の完全レパートリーを産生し得る、トランスジェニック動物（例えば、マウス）を産生することが、今や可能である。例えば、キメラおよび生殖細胞系変異体マウスにおける抗体重鎖連結領域（Ｊ_H）遺伝子のホモ接合欠損が、内因性抗体産生の完全阻害を生じることが記載されている。このような生殖細胞系変異体マウスへのヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子アレイの移入は、抗原チャレンジの際のヒト抗体の産生を生じる。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃｉＵＳＡ９０，２５５１−２５５（１９９３）；Ｊａｋｏｂｉｖｉｔｓら，Ｎａｔｕｒｅ３６２，２５５−２５８（１９９３）を参照のこと。

二特異的抗体は、少なくとも２つの異なる抗原に対する結合特異性を有する、モノクローナル、好ましくはヒトまたはヒト化、抗体である。本発明の場合では、結合特異性の１つは、特定のＴＩＥリガンドホモログに対してであり、他方は、任意の他の抗原に対して、および好ましくはもう１つのリガンドに対してである。例えば、２つの異なるＴＩＥリガンドホモログを特異的に結合する二特異的抗体は、本発明の範囲内である。

二特異的抗体を作成する方法は、当該技術分野で公知である。

伝統的には、二特異性抗体の組換え産生は、２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の同時発現に基づき、ここでこの２つの重鎖は異なる特異性を有する（ＭｉｌｌｓｔｅｉｎおよびＣｕｅｌｌｏ，Ｎａｔｕｒｅ３０５，５３７−５３９（１９８３））。免疫グロブリン重鎖および軽鎖のランダム類別のため、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は、１つのみが正しい二特異的構造を有する、１０の異なる抗体分子の潜在的混合物を産生する。アフィニティークロマトグラフィー工程によって通常行われる、正しい分子の精製は、むしろ煩わしく、そして産物収量は低い。類似の手順が、ＰＣＴ出願公開公報第ＷＯ９３／０８８２９号（１９９３年５月１３日に公開）およびＴｒａｕｎｅｃｋｅｒら，ＥＭＢＯ１０，３６５５−３６５９（１９９１）に開示される。

異なるおよびより好ましいアプローチよれば、所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン（抗体−抗原結合部位）は、免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合される。この融合物は、好ましくは、免疫グロブリン重鎖定常ドメインを有し、ヒンジの少なくとも一部、および免疫グロブリン重鎮の第２および第３の定常領域（ＣＨ２およびＣＨ３）を含む。この融合物の少なくとも１つに存在する軽鎖結合に必要な部位を含む第１の重鎖定常領域（ＣＨ１）を有することが好ましい。免疫グロブリン重鎖融合物、および所望であれば、免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡは、別々の発現ベクターに挿入され、そして適切な宿主生物に同時トランスフェクトされる。これは、構築に使用される３つのポリペプチド鎖の不同の比が最適収量を提供する場合の実施態様では、３つのポリペプチドフラグメントの相互の割合を調節することに、非常に柔軟性を提供する。しかし、少なくとも２つのポリペプチド鎖の等しい比での発現が、高い収量を得る場合または比が特に重要ではない場合、１つの発現ベクターにおける２つまたは３つすべてのポリペプチド鎖についてのコード配列を挿入することが可能である。このアプローチの好ましい実施態様では、二特異性抗体は、１つのアームにおける第１の結合特異性を有するハイブリッド免疫グロブリン重鎖、および他のアームにおける（第２の結合特性を提供する）ハイブリッド免疫グロブリン重鎖−軽鎖対から構成される。二特異性分子の半分のみでの免疫グロブリン軽鎖の存在が分離の容易な方法を提供するので、この非対称構造が、望ましくない免疫グロブリン鎖組み合わせからの所望の二特異性化合物の分離を容易にすることを見いだした。このアプローチは、１９９２年８月１７日に出願された同時係属出願第０７／９３１，８１１号に開示される。

二特異性抗体を生成することのさらに詳細については、例えば、Ｓｕｒｅｓｈら，ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ１２１，２１０（１９８６）を参照のこと。

用語「ダイアボディ」とは、２つの抗原結合部位を有する小抗体フラグメントをいい、このフラグメントは同じポリペプチド鎖中に軽鎖可変ドメイン（Ｖ_L）
に連結された重鎖可変ドメイン（Ｖ_H）を含む（Ｖ_H−Ｖ_L）。短すぎて同じ鎖における２つのドメイン間の対形成ができないリンカーを使用することによって、このドメインは、もう１つの鎖の相補ドメインと対形成させ、そして２つの抗原結合部位を生成する。ダイアボディは、例えば、ＥＰ４０４，０９７；ＷＯ９３／１１１６１；およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃｉＵＳＡ，９０：６４４４−６４４８（１９９３）に、より十分に記載される。

「単離された」抗体は、単離されたポリペプチドについて本明細書中上記で提供される定義と同様に定義される。詳細には、「単離された」抗体は、その天然環境の成分から同定および分離および／または回収されたものである。その天然環境の夾雑成分は、抗体のための診断または治療使用を妨害する物質であり、そして酵素、ホルモン、および他のタンパク質性または非タンパク質性溶質が挙げられ得る。好ましい実施態様では、抗体は、（１）Ｌｏｗｒｙ方法によって決定される場合９５％重量を越える抗体、および最も好ましくは９９％重量を越えるまで、（２）スピニングカップシークエネーターの使用によってＮ末端または内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るために十分な程度まで、または（３）クーマシーブルーまたは好ましくは銀染色を使用して還元または非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによる均一性まで、精製される。抗体の天然環境の少なくとも１つの成分が存在しないので、単離された抗体には、組換え細胞内でのインサイチュでの抗体が挙げられる。しかし、通常、単離された抗体は、少なくとも１つの精製工程によって調製される。

本明細書で使用される場合、用語「標識」とは、「標識された」抗体を生成するように抗体に直接または間接的に結合体化される検出可能な化合物または組成物をいう。この標識は、それ自体によって検出可能であるか（例えば、放射性同位元素標識または蛍光標識）、または酵素的標識の場合には、検出可能である基質化合物または組成物の化学変更を触媒し得る。

「固相」とは、本発明の抗体が付着し得る非水性マトリクスを意味する。本明細書において含まれる固相の例は、ガラス（例えば、制御された孔ガラス）、多糖類（例えば、アガロース）、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリビニルアルコール、およびシリコーンから部分的または全体が形成されるものを含む。ある実施態様では、状況に依存して、その固相は、アッセイプレートのウェルを含み得；他では、固相は精製カラム（例えば、アフィニティークロマトグラフィーカラム）である。この用語はまた、米国特許第４，２７５，１４９号に記載のような別々の粒子の不連続固相を含む。

「リポソーム」は、哺乳動物への薬物（例えば、本明細書で開示される抗ＥｒｂＢ２抗体、および必要に応じて、化学療法剤）の送達に有用である、種々のタイプの脂質、リン脂質、および／または界面活性剤から構成される小胞である。リポソームの成分は、生物学的膜の脂質整列に類似の、二層形成で普通に整列される。

抗体「アゴニスト」および「アンタゴニスト」は、上で定義されるとおりである。

ヘテロ結合体抗体はまた、本発明の範囲内である。ヘテロ結合体抗体は、２つの共有結合した抗体から構成される。このような抗体は、例えば、望ましくない細胞に免疫系細胞を標的するため（米国特許第４，６７６，９８０号）、およびＨＩＶ感染の処置のために（ＰＣＴ出願公開公報第ＷＯ９１／００３６０号および第ＷＯ９２／２００３７３号；ＥＰ０３０８９）提案されている。ヘテロ結合体抗体は、任意の便利な架橋方法を使用して作製され得る。適切な架橋剤は当該技術分野で周知であり、そして多くの架橋技術とともに米国特許第４，６７６，９８０号に開示される。

「単鎖Ｆｖ」または「ｓＦｖ」抗体フラグメントは、抗体のＶ_HおよびＶ_Lドメインを含み、ここでこれらのドメインは、単一のポリペプチド鎖に存在する。好ましくは、Ｆｖポリペプチドは、ｓＦｖが抗原結合に所望の構造を形成することを可能にするＶ_HおよびＶ_Lドメイン間にポリペプチドリンカーをさらに含む。ｓＦｖの総説については、ＰｌｕｃｋｔｈｕｎＴｈｅＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙｏｆＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，１１３巻，ＲｏｓｅｎｂｕｒｇおよびＭｏｏｒｅ編，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，ＮｅｗＹｏｒｋ，ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）を参照のこと。

（Ｃ．ＴＩＥリガンドホモログのクローニングおよび発現）
本発明の文脈では、表現「細胞」、「細胞株」、および「細胞培養物」は、交換可能に使用され、そしてすべてのこのような名称は子孫を含む。すべての子孫が、故意のまたは偶然の変異のため、ＤＮＡ含量が正確に同一であり得ないことも理解される。最初の形質転換された細胞についてスクリーニングした場合に、同じ機能または生物学的特性を有する変異体子孫が、含まれる。

用語「複製可能な発現ベクター」および「発現ベクター」とは、一片の外来ＤＮＡを挿入されている、通常二本鎖の、一片のＤＮＡをいう。外来ＤＮＡは、異種ＤＮＡと定義され、これは、宿主細胞中に天然に見いだされないＤＮＡである。このベクターは、適切な宿主細胞に外来または異種ＤＮＡを輸送するために使用される。一旦宿主細胞にはいると、ベクターは、宿主染色体ＤＮＡから独立して複製し得、そしてベクターおよびその挿入された（外来）ＤＮＡのいくつかのコピーが生成され得る。さらに、このベクターは、外来ＤＮＡをポリペプチドに翻訳することを可能にする必要なエレメントを含む。したがって、外来ＤＮＡによってコードされるポリペプチドの多くの分子は、迅速に合成され得る。

発現およびクローニングベクターは、当該技術分野で周知であり、そして１つ以上の選択された宿主細胞中でベクターが複製することを可能にする核酸配列を含む。適切なベクターの選択は、１）ＤＮＡ増幅またはＤＮＡ発現に使用されるべきかどうか、２）ベクターに挿入されるべきＤＮＡのサイズ、および３）ベクターで形質転換されるべき宿主細胞、に依存する。各ベクターは、その機能（ＤＮＡの発現のＤＮＡの増幅）および適合可能である宿主細胞に依存して、種々の成分を含む。ベクター成分は、一般に、１つ以上の以下のものを含むが、これらに限定されない：シグナル配列、複製起点、１つ以上のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、および転写終結配列。

（ｉ）シグナル配列成分一般に、シグナル配列は、ベクターの成分であり得るか、またはベクターに挿入されるＴＩＥリガンドホモログ分子の一部であり得る。シグナル配列が異種であるならば、宿主細胞によって認識およびプロセシング（すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断）されるように選択されるべきである。

原核生物宿主細胞に適切な異種シグナル配列は、好ましくは、α−アミラーゼ、ｏｍｐＡ、ｏｍｐＣ、ｏｍｐＥ、ｏｍｐＦ、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐ、または熱安定性エンテロトキシンＩＩのリーダーのような、原核生物シグナル配列である。酵母分泌については、例えば、酵母インベルターゼ、アミラーゼ、α因子、または酸性ホスファターゼのリーダーが使用され得る。哺乳動物細胞発現では、哺乳動物シグナル配列が最も適切である。リストしたシグナル配列は、例示のためのみであり、そしていかなるようにも本発明の範囲を限定しない。

（ｉｉ）複製起点成分発現ベクターおよびクローニングベクターの両方とも、１つ以上の選択された宿主細胞においてベクターが複製することを可能にした核酸配列を含む。一般に、クローニングベクターでは、この配列は、ベクターが宿主染色体から独立して複製することを可能にする配列であり、そして複製起点または自律複製する配列を含む。このような配列は、種々の細菌、酵母、およびウイルスに周知である。周知のプラスミドｐＢＲ３２２からの複製起点は、ほとんどのグラム陰性菌に適切であり、酵母についての２μプラスミド起点および種々のウイルス起点（ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶ、またはＢＰＶ）は、哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。複製起点は、哺乳動物発現ベクターに必要ではない（ＳＶ４０起点は、代表的には、初期プロモーターを含むので、単に使用され得る）。ほとんどの発現ベクターは、「シャトル」ベクターであり、すなわち、これらは、少なくとも１つのクラスの生物で複製し得るが、発現のために他の生物にトランスフェクトされ得る。例えば、ベクターはＥ．ｃｏｌｉにクローニングされ、次いで同じベクターが、たとえ宿主細胞染色体から独立して複製し得ないとしても、発現のために酵母または哺乳動物細胞にトランスフェクトされる。

ＤＮＡはまた、宿主ゲノムへの挿入によってクローニングされる。これは、例えば、ＢａｃｉｌｌｕｓゲノムＤＮＡで見いだされる配列に相補的であるＤＮＡ配列をベクターに含むことによって、宿主としてＢａｃｉｌｌｕｓ種を使用して、容易に達成される。このベクターでのＢａｃｉｌｌｕｓのトランスフェクションは、ゲノムとの相同組換えおよび所望の異種ポリペプチドをコードするＤＮＡの挿入を生じる。しかし、ゲノムＤＮＡの回収は、制限酵素切断が、コードされたポリペプチド分子を切り出すために必要とされるので、外因性の複製されたベクターの回収よりも複雑である。

（ｉｉｉ）選択遺伝子成分発現およびクローニングベクターは、選択可能マーカーとも称する、選択遺伝子を含むべきである。これは、このベクターで形質転換した宿主細胞の生存または増殖に必要なタンパク質をコードする遺伝子である。この遺伝子の存在は、そのベクターを欠失する任意の宿主細胞が、形質転換した宿主での増殖または再生で有利点を得ないことを確実にする。代表的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質または他のトキシン、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサート、またはテトラサイクリンに対する耐性を与える、（ｂ）相補的自己栄養欠損、または（ｃ）複合培地から利用可能でない重要な栄養を供給する（例えば、バチルス属についてのＤ−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子）、タンパク質をコードする。

選択スキームの１つの例は、宿主細胞の増殖を停止するために薬物を利用する。異種遺伝子でうまく形質転換される細胞は、薬物耐性を与えるタンパク質を発現し、したがって選択レジメを生存する。このような優勢選択の例は、薬物ネオマイシン［Ｓｏｕｔｈｅｒｎら，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１，３２７（１９８２）］、ミコフェノール酸［Ｍｕｌｌｉｇａｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ２０９，１４２２（１９８０）］、またはハイグロマイシン［Ｓｕｄｇｅｎら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌ．Ｂｉｏｌ．５，４１０−４１３（１９８５）］を使用する。上記の３つの例は、それぞれ、適切な薬物Ｇ４１８またはネオマイシン（ゲネチシン）、ｘｇｐｔ（ミコフェノール酸）、あるいはハイグロマイシンに対する耐性を与えるために真核生物制御下で細菌遺伝子を用いる。哺乳動物細胞に適切な選択可能マーカーの他の例は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）またはチミジンキナーゼである。このようなマーカーは、所望の核酸を取り込むためにコンピテントであった細胞の同定を可能にする。哺乳動物細胞形質転換体は、形質転換体のみが、そのマーカーを取り込むことによって生存するために独特に適合される選択圧下に、配置される。選択圧は、培地中の選択薬剤の濃度がうまく変化する条件下で形質転換体を培養することによって課され、それによって、選択遺伝子および所望のポリペプチドをコードするＤＮＡの両方の増幅を導く。増幅は、増殖に重要なタンパク質の産生に非常に需要がある遺伝子が、組換え細胞のうまくいった生成の染色体内で直列に繰り返されるプロセスである。所望のポリペプチドの増加した量は、増幅したＤＮＡから合成される。

例えば、ＤＨＦＲ選択遺伝子で形質転換した細胞は、ヒポキサンチン、グリシン、およびチミジンを含まない培養培地中ですべての形質転換体を培養することによって、最初に同定される。この場合に適切な宿主細胞は、ＤＨＦＲ活性を欠失するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株であり、ＵｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．ＳｃｉＵＳＡ７７、４２１６（１９８０）に記載のように調製および増殖される。特に有用なＤＨＦＲは、ＭＴＸ（ＥＰ１１７，０６０）に非常に耐性である、変異体ＤＨＦＲである。この選択薬剤は、内因性ＤＨＦＲの存在にもかかわらず、さもなければ適切な任意の宿主、例えば、ＡＴＣＣＮｏ．ＣＣＬ６１ＣＨＯ−Ｋ１とともに使用され得る。次いで、ＤＨＦＲおよび所望のポリペプチドをコードするＤＮＡは、それぞれ、ＤＨＦＲを不活化する薬剤（メトトレキサート、またはＭＴＸ）への曝露によって増幅される。細胞が、常に大きいＭＴＸ濃度のうまくいったラウンドで増殖し得る細胞についてのみ選択することによって、より多くのＤＨＦＲを必要とする（そして結果としてすべての外因性ＤＮＡを増幅する）ことを確実にする。あるいは、所望のポリペプチド、野生型ＤＨＦＲ、およびｎｅｏ遺伝子のようなもう１つの選択可能マーカーをコードする遺伝子で同時形質転換した宿主は、Ｇ４１８のような選択可能マーカーについての選択薬剤を使用して同定され得、次いで内因性ＤＨＦＲを含む野生型宿主中でメトトレキサートを使用して選択および増幅される（米国特許第４，９６５，１９９号も参照のこと）。

酵母における使用に適切な選択遺伝子は、酵母プラスミドＹＲｐ７に存在するｔｒｐ１遺伝子である（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂら，１９７９，Ｎａｔｕｒｅ２８２：３９；Ｋｉｎｇｓｍａｎら，１９７９，Ｇｅｎｅ７：１４１；またはＴｓｃｈｅｍｐｅｒら，１９８０，Ｇｅｎｅ１０：１５７）。ｔｒｐ１遺伝子は、トリプトファン中で増殖する能力のない酵母の変異体株、例えば、ＡＴＣＣＮｏ．４４０７６またはＰＥＰ４−１（Ｊｏｎｅｓ，１９７７，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ８５：１２）についての選択マーカーを提供する。次いで、酵母宿主細胞ゲノム中のｔｒｐ１障害の存在は、トリプトファンの不在下での増殖による形質転換を検出するために効果的な環境を提供する。同様に、Ｌｅｕ２欠失酵母株（ＡＴＣＣ２０，６２２または３８，６２６）は、Ｌｅｕ２遺伝子を有する公知のプラスミドによって補充される。

（ｉｖ）プロモーター成分発現ベクターは、クローニングベクターとは異なって、宿主生物によって認識されそして所望のポリペプチドをコードする核酸に作動可能に連結されるプロモーターを含むべきである。プロモーターは、その制御下で核酸の転写および翻訳を制御する、構造遺伝子（一般に約１００〜１０００ｂｐ以内）の開始コドンから上流に位置する非翻訳配列である。これらは、代表的には、２つのクラス、誘導性および構成性に分かれる。誘導性プロモーターは、培養条件のいくつかの変化、例えば、栄養の存在または不在あるいは温度変化に応じて、その制御下でＤＮＡからの転写のレベルの増加を開始するプロモーターである。この時、種々の可能性のある宿主細胞によって認識される多数のプロモーターが周知である。これらのプロモーターは、制限酵素切断によって起源の遺伝子から取り出され、次いで発現されるべきポリペプチドについての開始コドンの５’への挿入によって、所望のポリペプチドをコードするＤＮＡに作動可能に連結される。これは、ＴＩＥリガンドホモログについてのゲノムプロモーターが使用可能ではないことをいうのではない。しかし、異種プロモーターは、一般に、ネイティブなＴＩＥリガンドホモログプロモーターと比較した場合、発現したＴＩＥリガンドホモログのより大きい転写および高い収量を生じる。

原核生物宿主との使用に適切なプロモーターには、β−ラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系（Ｃｈａｎｇら，Ｎａｔｕｒｅ２７５：６１５（１９７８）；およびＧｏｅｄｄｅｌら，Ｎａｔｕｒｅ２８１：５４４（１９７９））、アルカリホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系（Ｇｏｅｄｄｅｌ，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．８：４０５７（１９８０）および欧州特許出願公開公報第３６，７７６号）、およびｔａｃプロモーターのようなハイブリッドプロモーター（Ｈ．ｄｅＢｏｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．ＳｃｉＵＳＡ８０：２１−２５（１９８３））が挙げられる。しかし、他の公知の細菌プロモーターが適切である。それらのヌクレオチド配列は公開されており、それによって、当業者は、任意の必要とされる制限部位を供給するためにリンカーまたはアダプターを使用してＴＩＥリガンドホモログをコードするＤＮＡに作動可能に連結することを可能にする（Ｓｉｅｂｅｎｌｉｓｔら，Ｃｅｌｌ２０：２６９（１９８０））。細菌系での使用のためのプロモーターはまた、ＴＩＥリガンドホモログをコードするＤＮＡに作動可能に連結されるシャイン・ダルガーノ（Ｓ．Ｄ．）配列を含む。

酵母宿主との使用に適切なプロモーター配列には、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＨｉｔｚｅｍａｎらＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５：２０７３（１９８０））または他の解糖系酵素（例えば、エノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、およびグルコキナーゼ）（Ｈｅｓｓら，Ｊ．Ａｄｖ．ＥｎｚｙｍｅＲｅｇ．７：１４９（１９７８）；およびＨｏｌｌａｎｄ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｏｒｙ１７：４９００（１９７８））のプロモーターが挙げられる。

増殖条件によって制御される転写のさらなる有利点を有する誘導性プロモーターである、他の酵母プロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソシトクロームＣ、酸性ホスファターゼ、窒素代謝に関連する分解酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ならびにマルトースおよびガラクトース利用に応答する酵素についてのプロモーター領域である。酵母発現における使用に適切なベクターおよびプロモーターは、さらに、Ｒ．Ｈｉｔｚｅｍａｎら，ＥＰ７３，６５７Ａに記載される。酵母エンハンサーはまた、酵母プロモーターと有利に使用される。

プロモーター配列は、真核生物について公知である。実際には、すべての真核生物遺伝子は、転写が開始される部位から約２５〜３０塩基上流に位置するＡＴリッチ領域を有する。多くの遺伝子の転写の開始から７０〜８０塩基上流に見いだされるもう１つの配列は、ＣＸＣＡＡＴ領域であり、ここでＸは任意のヌクレオチドであり得る。ほとんどの真核生物遺伝子の３’末端にはコード配列の３’末端へのポリＡテイルの付加のためのシグナルであり得るＡＡＴＡＡＡ配列が存在する。これらの配列のすべては、哺乳動物発現ベクターに適切に挿入される。

哺乳動物宿主細胞におけるベクターからのＴＩＥリガンドホモログ転写は、ポリオーマウイルス、トリポックスウイルス（１９８９年７月５日に公開された英国特許２，２１１，５０４）、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス２）、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、のようなウイルス、および最も好ましくはシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）のゲノムから、異種哺乳動物プロモーター、例えば、アクチンプロモーターまたは免疫グロブリンプロモーターから、熱ショックプロモーターから、ならびにこのようなプロモーターが宿主細胞系と適合可能であるならば、ＴＩＥリガンド配列に通常付随するプロモーターから、得られるプロモーターによって制御され得る。

ＳＶ４０ウイルスの初期および後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルス複製起点をも含むＳＶ４０制限フラグメントとして便利に得られる［Ｆｉｅｒｓら、Ｎａｔｕｒｅ２７３：１１３（１９７８）、ＭｕｌｌｉｇａｎおよびＢｅｒｇ，Ｓｃｉｅｎｃｅ２０９，１４２２−１４２７（１９８０）；Ｐａｖｌａｓｋｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃｉＵＳＡ７８，７３９８−７４０２（１９８１）］。ヒトサイトメガロウイルスの前初期プロモーターは、ＨｉｎｄＩＩＩＥ制限フラグメントとして便利に得られる［Ｇｒｅｅｎａｗａｙら，Ｇｅｎｅ１８，３５５−３６０（１９８２）］。ベクターとしてウシパピローマウイルスを使用して哺乳動物宿主中でＤＮＡを発現するための系は、ＵＳ４，４１９，４４６に開示される。この系の改変は、ＵＳ４，６０１，９７８に記載される。サル細胞中でヒト免疫インターフェロンをコードするｃＤＮＡを発現することにおいてはＧｒａｙら，Ｎａｔｕｒｅ２９５，５０３−５０８（１９８２）；単純ヘルペスウイルスからのチミジンキナーゼプロモーターの制御下で、マウス細胞におけるヒトβ−インターフェロンｃＤＮＡを発現することにおいてはＲｅｙｅｓら，Ｎａｔｕｒｅ２９７，５９８−６０１（１９８２）；培養したマウスおよびウサギ細胞におけるヒトインターフェロンβ１遺伝子の発現においてはＣａｎａａｎｉおよびＢｅｒｇ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃｉＵＳＡ７９，５１６６−５１７０（１９８２）；ならびにプロモーターとしてラウス肉腫ウイルス長末端反復を使用するＣＶ−１サル腎臓細胞、ニワトリ胚線維芽細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＨｅＬａ細胞、およびマウスＮＩＨ−３Ｔ３細胞における細菌ＣＡＴ配列の発現においてはＧｏｒｍａｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃｉＵＳＡ７９，６７７７−６７８１（１９８２）も参照のこと。

（ｖ）エンハンサーエレメント成分高等真核生物による本発明のＴＩＥリガンドホモログをコードするＤＮＡの転写は、しばしば、ベクターにエンハンサー配列を挿入することによって増加する。エンハンサーは、その転写を増加させるためにプロモーターで作用する、通常約１０〜３００ｂｐのＤＮＡのシス作用性エレメントである。エンハンサーは、転写ユニットに対して５’［Ｌａｉｍｉｎｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃｉＵＳＡ７８，９９３（１９８１）］および３’［Ｌａｓｋｙら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌ．Ｂｉｏｌ．３，１１０８（１９８３）］、イントロン内［Ｂａｎｅｒｊｉら，Ｃｅｌｌ３３，７２９（１９８３）］ならびにコード配列自体内［Ｏｓｂｏｒｎｅら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌ．Ｂｉｏｌ．４，１２９３（１９８４）］に見いだされており、比較的配向および位置非依存的である。多くのエンハンサー配列は、現在は、哺乳動物遺伝子（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテイン、およびインスリン）由来で公知である。しかし、代表的には、真核生物細胞ウイルスからのエンハンサーを使用する。例には、複製起点の後ろ側におけるＳＶ４０エンハンサー（ｂｐ１００〜２７０）、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後ろ側におけるポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。真核生物プロモーターの活性化のためのエレメントを増強することにおいてはＹａｎｉｖ，Ｎａｔｕｒｅ２９７，１７−１８（１９８２）も参照のこと。エンハンサーは、ＴＩＥリガンドＤＮＡの５’または３’の位置でベクターに組み込まれ得るが、好ましくは、プロモーターから５’の部位に位置する。

（ｖｉ）転写終結成分真核生物宿主細胞（酵母、真菌類、昆虫、植物、動物、ヒト、または他の多細胞生物からの核を形成した細胞）で使用される発現ベクターはまた、転写の終結およびｍＲＮＡを安定化するために必要な配列を含む。このような配列は、真核生物またはウイルスＤＮＡまたはｃＤＮＡの５’および時には３’非翻訳領域から一般に利用可能である。これらの領域は、ＴＩＥリガンドホモログをコードするｍＲＮＡの非翻訳部分においてポリアデニル化フラグメントとして転写されたヌクレオチドセグメントを含む。３’非翻訳領域はまた、転写終結部位を含む。

上記の成分、所望のコードおよび制御配列の１つ以上を含む適切なベクターの構築は、標準的ライゲーション技術を用いる。単離したプラスミドまたはＤＮＡフラグメントは、切断され、適合させられ、そして必要とされるプラスミドを生成することが所望される形態に再ライゲートされる。

構築したプラスミドにおいて正確な配列を確認するための分析のために、ライゲーション混合物は、Ｅ．ｃｏｌｉＫ１２株２９４（ＡＴＣＣ３１，４４６）を形質転換するために使用され、そして成功した形質転換体は、適切であるアンピシリンまたはテトラサイクリン耐性によって選択される。形質転換体からのプラスミドは、調製され、制限エンドヌクレアーゼ切断によって分析され、および／またはＭｅｓｓｉｎｇら，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．９，３０９（１９８１）の方法によってか、またはＭａｘａｍら，ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ６５，４９９（１９８０）の方法によって配列決定される。

ＴＩＥリガンドホモログをコードするＤＮＡの哺乳動物細胞における一過性発現を提供する発現ベクターは、本発明の実施に特に有用である。一般に、一過性発現は、宿主細胞に効率的に複製し得る発現ベクターの使用を含み、そのため、宿主細胞は、発現ベクターの多くのコピーを蓄積し、次に、発現ベクターによってコードされる高いレベルの所望のポリペプチドを合成する。適切な発現ベクターおよび宿主細胞を含む一過性の系は、クローンＤＮＡによってコードされるポリペプチドの便利な陽性同定、ならびに所望の生物学的または生理学的特性についてのこのようなポリペプチドの迅速なスクリーニングを可能にする。したがって、一過性発現系は、ＴＩＥリガンドホモログのアナログおよび改変体を同定する目的のために、本発明で特に有用である。

組換え脊椎動物細胞培養物におけるＴＩＥポリペプチドの合成への適合に適切な他の方法、ベクター、および宿主細胞は、Ｇｅｔｔｉｎｇら，Ｎａｔｕｒｅ２９３，６２０−６２５（１９８１）；Ｍａｎｔｅｌら，Ｎａｔｕｒｅ２８１，４０−４６（１９７９）；Ｌｅｖｉｎｓｏｎら；ＥＰ１１７，０６０およびＥＰ１１７，０５８に記載される。ＴＩＥリガンドポリペプチドの哺乳動物細胞培養物発現に特に有用なプラスミドは、ｐＲＫ５（ＥＰ３０７，２４７）、その他に、ｓｐ６転写開始部位、次いでＸｈｏ／ＮｏｔＩＩｃＤＮＡクローニング部位の前のＳｆｉＩ制限酵素部位を有するｐＲＫ５Ｄ、およびＳｆｉＩ部位を含まないｐＲＫ５Ｄの前駆体のｐＲＫ５Ｂのような、ｐＲＫ５の誘導体である；Ｈｏｌｍｅｓら，Ｓｃｉｅｎｃｅ２５３，１２７８−１２８０（１９９１）を参照のこと。

（ｖｉｉ）ベクターの構築および分析１つ以上の上記の成分を含む適切なベクターの構築は、標準的なライゲーション技術を用いる。単離されたプラスミドまたはＤＮＡフラグメントは、切断され、適合させられ、そして必要とされるプラスミドを生成することが所望される形態に再ライゲートされる。

（ｖｉｉｉ）一過性発現ベクターＴＩＥリガンドをコードするＤＮＡの哺乳動物細胞における一過性発現を提供する発現ベクターは、本発明の実施に特に有用である。一般に、一過性発現は、宿主細胞で効率的に複製し得る発現ベクターの使用を含み、そのため、宿主細胞は、発現ベクターの多くのコピーを蓄積し、次に、発現ベクターによってコードされる高いレベルの所望のポリペプチドを合成する。Ｓａｍｂｒｏｏｋら，前出，ｐｐ．１６．１７−１６．２２。適切な発現ベクターおよび宿主細胞を含む一過性発現系は、所望の生物学的または生理学的特性についてのこのようなポリペプチドの便利なポジティブスクリーニングを可能にする。したがって、一過性発現系は、必要な生物学的活性を有する天然のＴＩＥリガンドホモログのアナログおよび改変体を同定する目的のために、本発明で特に有用である。

（ｉｘ）適切な例示的脊椎動物細胞ベクター組換え脊椎動物細胞培養物におけるＴＩＥリガンドホモログ（天然のタンパク質の機能的誘導体を含む）の合成への適合に適切な他の方法、ベクター、および宿主細胞は、Ｇｅｔｈｉｎｇら，Ｎａｔｕｒｅ２９３，６２０−６２５（１９８１）；Ｍａｎｔｅｉら，Ｎａｔｕｒｅ２８１，４０−４６（１９７９）；Ｌｅｖｉｎｓｏｎら；ＥＰ１１７，０６０およびＥＰ１１７，０５８に記載される。ＴＩＥリガンドホモログの哺乳動物細胞培養物発現に特に有用なプラスミドは、ｐＲＫ５（ＥＰ３０７，２４７）またはｐＳＶ１６Ｂ（ＰＣＴ公開公報第ＷＯ９１／０８２９１号）である。

本発明のベクターをクローニングまたは発現するために適切な宿主細胞は、上記の原核生物、酵母、または高等真核生物細胞である。適切な原核生物には、グラム陰性またはグラム陽性生物、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉまたはバチルス属が挙げられる。好ましいクローニング宿主は、Ｅ．ｃｏｌｉ２９４（ＡＴＣＣ３１，４４６）であるが、Ｅ．ｃｏｌｉＢ、Ｅ．ｃｏｌｉＸ１７７６（ＡＴＣＣ３１，５３７）、Ｅ．ｃｏｌｉＷ３１１０（ＡＴＣＣ２７，３２５）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種のような他のグラム陰性またはグラム陽性原核生物、またはＳｅｒｒａｔｉａＭａｒｃｅｓａｎｓが適切である。

原核生物の他に、糸状真菌または酵母のような真核生物微生物は、本発明のベクターに適切な宿主である。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅまたは一般のパン酵母は、下等真核生物宿主微生物のうちで最も一般に使用される。しかし、多くの他の属、種、および株は一般に利用可能であり、そして本発明で有用であり、例えば、Ｓ．ｐｏｍｂｅ［ＢｅａｃｈおよびＮｕｒｓｅ，Ｎａｔｕｒｅ２９０，１４０（１９８１）］、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓｌａｃｔｉｓ［Ｌｏｕｖｅｎｃｏｕｒｔら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．７３７（１９８３）］；ｙａｒｒｏｗｉａ（ＥＰ４０２，２２６）；Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ（ＥＰ１８３，０７０）、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｉａ（ＥＰ２４４，２３４）、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａｃｒａｓｓａ［Ｃａｓｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃｉＵＳＡ７６，５２５９−５２６３（１９７９）］；およびＡ．ｎｉｄｕｌａｎｓ［Ｂａｌｌａｎｃｅら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１１２，２８４−２８９（１９８３）；Ｔｉｌｂｕｒｎら，Ｇｅｎｅ２６，２０５−２２１（１９８３）；Ｙｅｌｔｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃｉＵＳＡ８１，１４７０−１４７４（１９８４）］およびＡ．ｎｉｇｅｒ［ＫｅｌｌｅｙおよびＨｙｎｅｓ，ＥＭＢＯＪ．４，４７５−４７９（１９８５）］のようなＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ宿主である。

適切な宿主細胞はまた、多細胞生物に由来し得る。このような宿主細胞は、複雑なプロセシングおよびグリコシル化活性を行い得る。原則として、脊椎動物または無脊椎動物のいずれかからの、任意の高等真核生物培養物は作動可能であるが、ヒトのような哺乳動物からの細胞が好ましい。無脊椎動物の例には、植物および昆虫細胞が挙げられる。多くのバキュロウイルス株および改変体およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（イモムシ）、Ａｅｄｅｓａｅｇｙｐｔｉ（蚊）、Ａｅｄｅｓａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ（蚊）、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｍｅｌａｎｇａｓｔｅｒ（ショウジョウバエ）、およびＢｏｍｂｙｘｍｏｒｉ宿主細胞のような宿主からの対応する許容昆虫宿主細胞が同定されている。例えば、ＬｕｃｋｏｗらＢｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ６，４７−５５（１９８８）；Ｍｉｌｌｅｒら，ＧｅｎｅｔｉｃＥｎｇｉｎｎｅｒｉｎｇ，Ｓｅｔｌｏｗ，Ｊ．Ｋ．ら編Ｖｏｌ．８（ＰｌｅｎｕｍＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，１９８６），ｐｐ．２７７−２７９；およびＭａｅｄａら，Ｎａｔｕｒｅ３１５，５９２−５９４（１９８５）を参照のこと。種々のこのようなウイルス株は、例えば、ＡｕｔｏｇｒａｐｈａｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａＮＰＶのＬ−１改変体は、公衆に入手可能であり、そしてこのようなウイルスは、本発明による本発明のウイルスとして、特にＳｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞のトランスフェクションのために使用され得る。

一般に、植物細胞は、細菌Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓの特定の株（ＴＩＥリガンドＤＮＡを含むように既に操作されている）とのインキュベーションによってトランスフェクトされる。Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓとの植物細胞培養物のインキュベーション中、ＴＩＥリガンドをコードするＤＮＡは、トランスフェクトされるように植物細胞宿主に移入され、そして適切な条件下で、ＴＩＥリガンドＤＮＡを発現する。さらに、ノパリンシンターゼプロモーターおよびポリアデニル化シグナル配列のような植物細胞と適合可能な調節およびシグナル配列は、利用可能である。Ｄｅｐｉｃｋｅｒら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎ．１，５６１（１９８２）。さらに、Ｔ−ＤＮＡ７８０遺伝子の上流領域から単離されたＤＮＡセグメントは、組換えＤＮＡ含有植物組織において植物発現可能遺伝子の転写レベルを活性化または増加し得る。１９８９年６月２１日に公開されたＥＰ３２１，１９６を参照のこと。

しかし、脊椎動物細胞が最も興味深く、そして培養物（組織培養物）中での脊椎動物細胞の増殖はそれ自体周知である。ＴｉｓｓｕｅＣｕｌｔｕｒｅ，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＫｒｕｓｅおよびＰａｔｔｅｒｓｏｎ編（１９７３）を参照のこと。有用な哺乳宿主細胞株の例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣＣＲＬ１６５１）；ヒト胚腎臓細胞株［２９３細胞または、懸濁培養物中の増殖のためにサブクローニングした２９３細胞、Ｇｒａｈａｍら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６，５９（１９７７）］；ベビーハムスター腎臓細胞９ＢＨＫ（ＡＴＣＣＣＣＬ１０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ［ＣＨＯ、ＵｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃｉＵＳＡ７７，４２１６（１９８０）］；マウスセルトリ細胞［ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３，２４３−２５１（１９８０）］；サル腎臓細胞（ＣＶ１ＡＴＣＣＣＣＬ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頚部ガン腫細胞（ＨｅＬａ、ＡＴＣＣＣＣＬ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣＣＣＬ３４）；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ３Ａ、ＡＴＣＣＣＲＬ１４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣＣＣＬ７５）；ヒト肝臓細胞（ＨｅｐＧ２、ＨＢ８０６５）；マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２、ＡＴＣＣＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞［Ｍａｔｈｅｒら，ＡｎｎａｌｓＮ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３，４４０６８（１９８２）］；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；およびヒト肝ガン細胞株（ＨｅｐＧ２）である。好ましい宿主細胞は、ヒト胚腎臓２９３およびチャイニーズハムスター卵巣細胞である。

本発明の目的に特に好ましい宿主細胞は、本発明のＴＩＥリガンドホモログを産生する脊椎動物細胞である。

宿主細胞は、トランスフェクトされ、そして好ましくは上記の発現またはクローニングベクターで形質転換され、そしてプロモーターを誘導するかまたは増幅した遺伝子を含む形質転換体を選択するために適切であるように改変された従来の栄養培地中で培養される。

本発明のＴＩＥリガンドホモログを産生するために使用される原核生物細胞は、一般にＳａｍｂｒｏｏｋら，前出に記載のように適切な培地中で培養される。

哺乳動物細胞は、種々の培地中で培養され得る。Ｈａｍ’ｓＦ１０（Ｓｉｇｍａ）、最少必須培地（ＭＥＭ，Ｓｉｇｍａ）ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）、およびダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ，Ｓｉｇｍａ）のような市販の培地は、宿主細胞を培養するために適切である。さらに、ＨａｍおよびＷａｌｌａｃｅ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．５８，４４（１９７９）；ＢａｒｎｅｓおよびＳａｔｏ、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０２，２５５（１９８０）、ＵＳ４，７６７，７０４；４，６５７，８６６；４，９２７，７６２；または４，５６０，６５５；ＷＯ９０／０３４３０；ＷＯ８７／００１９５、または米国再特許３０，９８５に記載の培地のいずれかが、宿主細胞のための培養培地として使用され得る。これらの培地のいずれかは、ホルモンおよび／または他の増殖因子（例えば、インスリン、トランスフェリン、または上皮増殖因子）、塩（例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、およびリン酸）、緩衝液（例えば、ＨＥＰＥＳ）、ヌクレオチド（例えば、アデノシンおよびチミジン）、抗生物質（例えば、ゲンタマイシン^TM薬物）、微量元素（μモル範囲での最終濃度で通常存在する無機化合物として定義される）、およびグルコースまたは等価のエネルギー源が必要な場合に補充され得る。任意の他の必要な補充物はまた、当業者に公知である適切な濃度で含まれ得る。温度、ｐＨなどのような培養条件は、適切には、場合によっては、クローニングまたは発現のために選択される宿主とともにこれまで使用された条件であり、そして当業者には明らかである。

本開示でいわれる宿主細胞は、インビトロ細胞培養物中の細胞ならびに宿主動物または植物内にある細胞を含む。

本発明のＴＩＥリガンドホモログが、相同組換えによって、または特定のＴＩＥリガンドホモログをコードするＤＮＡを既に含む細胞に導入された制御エレメントを利用する組換え産生方法で、産生され得ることが、さらに想像される。

遺伝子増幅および／または発現は、例えば、本発明で提供される配列に基づく適切に標識されたプローブを使用する便利なサザンブロッティング、ｍＲＮＡの転写を定量するためのノーザンブロッティング［Ｔｈｏｍａｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃｉＵＳＡ７７，５２０１−５２０５（１９８０）］、ドットブロッティング（ＤＮＡ分析）、またはインサイチュハイブリダイゼーションによって、試料中で直接的に測定され得る。種々の標識が用いられ得、最も一般には、放射性同位体、特に³²Ｐである。しかし、ポリヌクレオチドへの導入のためにビオチン改変化ヌクレオチドを使用するような、他の技術も用いられ得る。次いで、ビオチンは、アビジンまたは抗体に結合するための部位として作用し、これは放射性同位元素、蛍光体、酵素などのような広範な標識で標識され得る。あるいは、ＤＮＡ二重鎖、ＲＮＡ二重鎖、およびＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二重鎖またはＤＮＡ−タンパク質二重鎖を含む、特異的二重鎖を認識し得る抗体が用いられ得る。抗体は、次に、標識され得、そしてアッセイは、二重鎖が表面に結合される場合に行われ得、そのため表面上での二重鎖の形成の際に、その二重鎖に結合した抗体の存在が検出され得る。

あるいは、遺伝子発現は、遺伝子産物の発現を直接的に定量するための、組織切片の免疫組織化学的染色および細胞培養物または体液のアッセイのような、免疫学的方法によって測定され得る。免疫組織化学的染色技術では、細胞試料は、代表的には、脱水および固定、次いで遺伝子産物に特異的な標識された抗体との結合反応によって調製され、ここで、酵素標識、蛍光標識、化学発光標識などのような標識は、通常、可視で検出可能である。本発明での使用に適切な特に感度の高い染色技術は、Ｈｓｅら，Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍ．７５，７３４−７３８（１９８０）に記載される。

試料液体の免疫組織化学的染色および／またはアッセイに有用な抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルのいずれかであり得、そして任意の動物で調製され得る。都合よく、その抗体は、本発明の天然のＴＩＥリガンドホモログポリペプチドに対して、または以下にさらに記載されるような本発明で提供されるＤＮＡ配列に基づく合成ペプチドに対して、調製され得る。

ＴＩＥリガンドホモログは、封入体の形態で宿主細胞中で産生され得るか、あるいはペリプラズム空間または培養培地中に分泌され得、そして、代表的には、宿主細胞ライセートから回収される。組換えリガンドは、安定なタンパク質のその後の形成を考慮して、任意の技術によって精製され得る。

ＴＩＥリガンドホモログがヒト起源の細胞以外の組換え細胞で発現される場合、ヒト起源のタンパク質またはポリペプチドを完全に含まない。しかし、リガンドについて実質的に均質である調製物を得るために組換え細胞タンパク質またはポリペプチドからＴＩＥリガンドホモログを精製することが必要である。第１の工程としては、培養培地またはライセートを遠心分離して、粒子状の細胞デブリを除去する。次いで、膜および可溶性タンパク質画分を分離する。次いで、ＴＩＥリガンドホモログは、可溶性タンパク質画分から精製され得る。以下の手順は、適切な精製手順の例である：イムノアフィニティーまたはイオン交換カラムでの分画；エタノール沈殿；逆相ＨＰＬＣ；シリカでまたはＤＥＡＥのような陽イオン交換樹脂でのクロマトグラフィー；クロマトフォーカシング；ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウム沈殿；例えば、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ−７５を使用するゲル濾過；およびＩｇＧのような夾雑物を除去するためのプロテインＡＳｅｐｈａｒｏｓｅカラム。

残基が欠失、挿入、および／または置換されているＴＩＥリガンドホモログの機能的誘導体は、変更によって生じた特性の任意の実質的変化を考慮して、天然のリガンドと同じ様式で回収される。例えば、ＴＩＥリガンドホモログと、もう１つのタンパク質またはポリペプチド、例えば、細菌またはウイルス抗原との融合物は、精製を容易にし；抗原に対する抗体を含むイムノアフィニティーカラムは、融合物を吸着するために使用され得る。ウサギポリクローナル抗ＴＩＥリガンドホモログカラムのようなイムノアフィニティーカラムは、少なくとも１つの残っている免疫エピトープに結合することによってＴＩＥリガンドホモログ改変体を吸着するために用いられ得る。フェニルメチルスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）のようなプロテアーゼインヒビターはまた、精製中のタンパク質分解を阻害するために有用であり得、そして抗生物質は、偶然の夾雑物の増殖を防ぐために含まれ得る。本発明のＴＩＥリガンドホモログは、公知または本発明以降に発見される、ＴＩＥレセプター、例えば、ＴＩＥ−２に結合する能力に基づいて、アフィニティークロマトグラフィーによって便利に精製される。

当業者は、天然のＴＩＥリガンドホモログに適切な精製方法が、改変を必要とし得ること、そしてこのことが組換え細胞培養物中での発現の際に天然のＴＩＥリガンドホモログまたはその改変体の特徴の変化を説明することを理解する。

（Ｄ．ＴＩＥリガンドホモログ、核酸分子、および抗体の使用）
本発明のＴＩＥリガンドホモログは、細胞培養物においてＴＩＥレセプターを発現する細胞の生存および／または増殖および／または分化を促進することに有用である。

ＴＩＥリガンドホモログは、天然のＴＩＥレセプターを発現する細胞を同定するためにさらに使用され得る。この目的ために、検出可能に標識されたリガンドを、ＴＩＥレセプターへの結合を可能にする条件下で標的細胞と接触させ、そして結合はモニターされる。

本発明のＴＩＥリガンドホモログはまた、例えば、本発明のＴＩＥリガンドホモログを発現する細胞をテスト分子に曝露すること、そして直接的検出によってまたは二次的生物学的効果に基づいてのいずれかで、テスト分子のＴＩＥレセプターへの特異的結合を検出することによって、ＴＩＥリガンドホモログの生物学的活性を提示する分子を同定するために使用され得る。このアプローチは、ＴＩＥリガンドファミリーの新しいメンバーを同定するために、あるいはペプチドまたは非ペプチド小分子ライブラリーをスクリーニングするために、特に適切である。

本発明で開示されたＴＩＥホモログリガンドはまた、骨発生、成熟、もしくは成長に、または筋肉増殖または発育に重要な役割を果たし、および／あるいは血管新生を促進または阻害する、天然のＴＩＥレセプターのアゴニストまたはアンタゴニストを同定するように設計されたスクリーニングアッセイで有用である。例えば、ＴＩＥレセプターのアンタゴニストは、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅバイオセンサー技術（ＢＩＡｃｏｒｅ；ＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｓｅｎｓｏｒ，Ｍｉｄｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）を使用することによって；または本発明の生物学的に活性なＴＩＥリガンドホモログによって引き起こされる生物学的応答をブロックする能力をモニターすることによって、測定されるように、天然のＴＩＥレセプターへの本発明のＴＩＥリガンドホモログの結合をブロックする能力に基づいて同定され得る。モニターされ得る生物学的応答には、例えば、ＴＩＥレセプターまたはＴＩＥシグナル伝達経路の下流の成分のリン酸化、あるいは、ＴＩＥレセプターを発現する細胞の生存、増殖、または分化が挙げられる。ＴＩＥレセプターを発現するようにか、またはＴＩＥレセプターおよび本発明のＴＩＥリガンドホモログを同時発現するように操作された、ＴＩＥレセプターを正常に発現しない細胞を利用する細胞ベースのアッセイは、使用に特に便利である。

特定の実施態様では、天然のＴＩＥレセプターの小分子アゴニストおよびアンタゴニストは、ＴＩＥリガンド／ＴＩＥレセプター相互作用を妨害する能力に基づいて、同定され得る。ＴＩＥレセプターへのテスト分子の特異的結合を測定するために多くの方法があり、これには、ＴＩＥレセプターを発現するインタクトな細胞の表面に結合したか、細胞ライセート中のＴＩＥレセプターに架橋したテスト分子の量か、またはインビトロでＴＩＥレセプターに結合した、テスト分子の量を検出または測定することが含まれ、これに限定されない。

検出可能に標識されたＴＩＥリガンドホモログには、例えば、放射活性物質、例えば、¹²⁵Ｉ、蛍光物質、酵素活性を有する物質（好ましくは、比色検出に適切な）、酵素のための基質（好ましくは、比色検出に適切な）、または（検出可能に標識された）抗体分子によって認識され得る物質に共有または非共有結合したＴＩＥリガンドホモログが挙げられる。

本発明のアッセイは、１９９６年４月１８日に公開された、ＰＣＴ公開公報ＷＯ９６／１１２６９に記載されるものと類似の方法で行われ得る。

本発明のＴＩＥリガンドホモログはまた、イムノアドヘシン（ｉｍｍｕｎｏａｄｈｅｓｉｎ）の形態で必要に応じて使用されるＴＩＥレセプターを精製するために有用であり、ＴＩＥリガンドホモログまたはそのＴＩＥレセプター結合部分は、免疫グロブリン重鎖または軽鎖定常領域に融合される。

本発明のＴＩＥリガンドホモログ、特に、ＮＬ５、ＮＬ８、およびそれらの機能的誘導体はまた、内皮細胞増殖を阻害することおよび／または内皮細胞アポトーシスを誘導することに有用である。

本発明の核酸分子は、細胞または組織切片においてＴＩＥリガンドの発現を検出することに有用である。細胞または組織切片は、ハイブリダイズ条件下で本発明のＴＩＥリガンドホモログをコードする検出可能に標識された核酸分子と接触され得、そして核酸分子にハイブリダイズしたｍＲＮＡの存在を決定し、それによってＴＩＥリガンドホモログの発現を検出する。さらに、腫瘍（ガン）細胞で増幅される本発明のＴＩＥリガンドホモログをコードする核酸は、腫瘍（ガン）の診断に有用である。

本発明の抗体は、例えば、生物学的試料においてＴＩＥリガンドホモログの量を測定するためにイムノアッセイで使用され得る。生物学的試料は、本発明のＴＩＥリガンドホモログを特異的に結合する抗体または抗体混合物と接触され、そしてテスト試料に存在するリガンドと形成された複合体の量が測定される。

本発明のＴＩＥリガンドホモログに対する抗体は、さらに、対応するＴＩＥレセプターを発現する細胞に対する、細胞傷害性分子、例えば、放射性同位元素またはトキシン、あるいは治療薬剤の送達に有用であり得る。治療薬剤は、例えば、ＴＩＥ−２リガンドを含む他のＴＩＥリガンド、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）ファミリーのメンバー、公知の抗腫瘍薬剤、および筋肉増殖または発育、あるいは骨発生、成熟、または増殖に関連することが公知の薬剤であり得る。

抗ＴＩＥリガンドホモログ抗体はまた、ＴＩＥレセプターの発現に関連する疾患状態を検出するために、診断薬剤として適切である。したがって、検出可能に標識されたＴＩＥリガンドホモログおよびＴＩＥレセプターの抗体アゴニストは、血管新生の存在をイメージングするために使用され得る。

さらに、本発明の新しいＴＩＥリガンドホモログは、新生血管形成を促進するために使用され得、そして腫瘍増殖を阻害するために有用であり得る。

本発明のＴＩＥリガンドホモログのアンタゴニスト、例えば、抗ＴＩＥリガンドホモログ抗体は、それぞれのＴＩＥリガンドホモログをコードする遺伝子の増幅に関連する腫瘍（ガン）の診断および処置にさらに有用である。

さらに可能性のある治療用途には、筋肉および骨の発生、成熟、または増殖の調節が挙げられる。

治療用途については、本発明のＴＩＥリガンドホモログまたは抗ＴＩＥリガンドホモログ抗体は、全身または局所適用に適切な、薬理学的に受容可能なベヒクルとの混合物中に活性成分を含む治療組成物として処方される。本発明の薬学的組成物は、凍結乾燥した処方物または水溶液の形態で、所望の程度の純度を有する活性成分を、必要に応じて生理学的に受容可能なキャリア、賦形剤、または安定化剤と混合することによって、貯蔵のために調製される（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ１６版，Ｏｓｏｌ，Ａ．編（１９８０））。受容可能なキャリア、賦形剤、または安定化剤は、用いられる投与量および濃度でレシピエントに非毒性であり、そしてリン酸、クエン酸、および他の有機酸のような緩衝剤；アスコルビン酸を含む抗酸化剤；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンのようなタンパク質；ポリビニルピロリドンのような親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、またはリジンのようなアミノ酸；グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む単糖類、二糖類、および他の炭水化物；ＥＤＴＡのようなキレート化剤；マンニトールまたはソルビトールのような糖アルコール；ナトリウムのような塩形成カウンターイオン；および／またはＴｗｅｅｎ、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ、またはＰＥＧのような非イオン性界面活性剤を含む。

活性成分はまた、例えば、コアセルベーション技術によって、または界面重合化、例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン−マイクロカプセルおよびポリ−（メチルメタクリレート（ｍｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｃｙｌａｔｅ））マイクロカプセルによって調製されるマイクロカプセル中に、コロイド薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノパーティクル、およびナノカプセル）に、またはマクロエマルジョンに捕らえられ得る。このような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｅｉｎｃｅｓ，前出に開示される。

インビボ投与に使用されるべき処方物は、滅菌でなければならない。これは、凍結乾燥および再構成の前または後に、滅菌濾過メンブランを通す濾過によって容易に行われる。

本発明の治療組成物は、一般に、滅菌アクセスポートを有する容器、例えば、皮下注射針によって貫通可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグまたはバイアル中に配置される。

投与の経路は、例えば、静脈内、腹腔内、大脳内、筋肉内、眼内、動脈内、または病巣内経路による注射または注入、局所投与、または持続放出システムによる、公知の方法に従う。

持続放出調製物の適切な例には、成形品の形態、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルでの、半透性ポリマーマトリクスが挙げられる。持続放出マトリクスには、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリラクチド（米国特許３，７７３，９１９、ＥＰ５８，４８１）、Ｌ−グルタミン酸とガンマエチル−Ｌ−グルタミン酸とのコポリマー（Ｕ．Ｓｉｄｍａｎら，１９８３，「Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ」２２（１）：５４７−５５６）、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）（Ｒ．Ｌａｎｇｅｒら，１９８１，「Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．」１５：１６７−２７７およびＲ．Ｌａｎｇｅｒ，１９８２，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８−１０５）、エチレンビニル酢酸（Ｒ．Ｌａｎｇｅｒら，同上）、またはポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸（ＥＰ１３３，９８８Ａ）が挙げられる。持続放出組成物はまた、リポソームを含む。本発明の範囲内の分子を含むリポソームは、それ自体公知の方法によって調製される：ＤＥ３，２１８，１２１Ａ；Ｅｐｓｔｅｉｎら，１９８５，「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃｉＵＳＡ」８２：３６８８−３６９２；Ｈｗａｎｇら，１９８０，「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃｉＵＳＡ」７７：４０３０−４０３４；ＥＰ５２３２２Ａ；ＥＰ３６６７６Ａ；ＥＰ８８０４６Ａ；ＥＰ１４３９４９Ａ；ＥＰ１４２６４１Ａ；日本国特許出願８３−１１８００８；米国特許４，４８５，０４５および４，５４４，５４５；およびＥＰ１０２，３２４Ａ。もともと、リポソームは、脂質含量が約３０ｍｏｌ．％を越えるコレステロールである小さい（約２００〜８００オングストローム）単層タイプであり、選択された割合は、最適なＮＴ−４治療に対して調節される。

治療的に用いられるべき本発明の分子の有効量は、例えば、治療対象、投与経路、および患者の症状に依存する。したがって、投与量を滴定し、そして最適な治療効果を得るために必要とされる投与経路を改変することが、治療医師には必要である。代表的な１日の用量は、上記の要素に依存して、約１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ以上の範囲であり得る。代表的には、臨床医は、必要とされる生物学的効果を提供する投与量に達するまで、本発明の分子を投与する。この治療の進捗は、従来のアッセイによって容易にモニターされる。

（Ｅ．腫瘍組織および細胞株におけるＴＩＥリガンドホモログをコードする遺伝子の増幅）
原核生物および真核生物のゲノムは、２つの一見相反することが求められる。１つは、複数世代を通じて安定な遺伝を保証するための、そのオリジナルな形態での遺伝情報としてのＤＮＡの保存および増殖である。他方、細胞または生物は、無限に続く環境変化に適応し得なければならない。適応機構は、遺伝物質の質的改変または量的改変を含み得る。質的改変はＤＮＡ変異を含み、このＤＮＡ変異によりコード配列が変えられ、構造的および／または機能的に異なるタンパク質をもたらす。遺伝子増幅は量的改変であり、これにより完全なコード配列（すなわち、遺伝子）の実数が増加し、これは、利用可能な転写鋳型数の増加、翻訳可能な転写物数の増加、そして最後に、増幅遺伝子によりコードされるタンパク質量の増加を導く。

遺伝子増幅の現象およびその基礎をなす機構は、いくつかの原核生物および真核生物の培養系においてインビトロで調べられてきた。遺伝子増幅の最もよく特徴付けられた例は、種々の濃度の細胞傷害薬物メトトレキサート（ＭＴＸ）を含む培地での真核生物細胞培養を含む。ＭＴＸは葉酸アナログであり、そして酵素ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）をブロックすることによりＤＮＡ合成を妨げる。低濃度のＭＴＸへの初期暴露間に、たいていの細胞（＞９９．９％）は死滅する。少数の細胞は生き残り、そして多量のＤＨＦＲ−ＲＮＡおよびタンパク質を生成することにより漸増濃度のＭＴＸにおいて増殖し得る。この過剰生成の基礎は、単一のＤＨＦＲ遺伝子の増幅である。この遺伝子のさらなるコピーは、小さく余分な染色体形態の染色体外コピー（二重微小（ｄｏｕｂｌｅｍｉｎｕｔｅ））として、または組込まれた染色体コピーとして見出される。

遺伝子増幅は、細胞傷害薬物（細菌に対する抗生物質および真核生物細胞に対する化学療法剤）耐性の発生、および悪性形質転換において最も一般的に遭遇する。自発的事象としての、またはウイルスもしくは化学的／環境的傷害による真核生物細胞の形質転換は、代表的に、その細胞の遺伝物質の変化と関連する。ヒト悪性腫瘍において観察される最も一般的な遺伝子変化の１つは、ｐ５３タンパク質の変異である。ｐ５３は、定常（Ｇ１）期から複製（Ｓ）期への細胞の移行を制御し、そしてＤＮＡ損傷の存在下でのこの移行を妨げる。言い換えれば、無力化ｐ５３変異の主な結果の１つは、ＤＮＡ損傷（すなわち遺伝子変化）の蓄積および増殖である。点変異に加えて、新生物細胞における遺伝子変化の一般的な型は、増幅および著しい構造的変化（例えば、転座）である。

ＤＮＡ配列の増幅は、ＤＨＦＲ実験系において例示されたように、特定の機能的要求を示し得る。従って、あるガン遺伝子の悪性腫瘍における増幅は、これらの遺伝子の、悪性形質転換プロセスおよび形質転換表現型維持における原因となる役割を示す。この仮説は、最近の研究において支持された。例えば、ｂｃｌ−２タンパク質は、ある型の非ホジキンリンパ腫において増幅されることが見出された。このタンパク質はアポトーシスを阻害し、そして新生物細胞の累進的な蓄積を導く。増殖因子レセプター遺伝子ファミリーのメンバーは、種々の型のガンにおいて増幅されることが見出され、これは、これらのレセプターの過剰発現により新生物細胞が、限定量の利用可能な増殖因子により非感受性になり得ることを示唆する。例は、アンドロゲン欠乏（ｄｅｐｒｉｖａｔｉｏｎ）治療間での再発前立腺ガンにおけるアンドロゲンレセプター増幅、および乳ガンにおける増殖因子レセプターホモログＥＲＢ２増幅を含む。最後に、細胞内シグナリングおよび細胞周期進行の制御に関与する遺伝子は、悪性形質転換間に増幅を受け得る。これは、種々の上皮新生物およびリンパ新生物におけるｂｃｌ−１およびｒａｓ遺伝子の増幅により例示される。

これらの初期の研究は、このアプローチが悪性形質転換に重要な遺伝子を同定し得るので、新生物における増幅ＤＮＡ配列を同定する実現可能性を例示する。ＥＲＢ２の場合もまた、トランスフォーミングタンパク質が腫瘍治療に対する新規かつ特異的な標的を示し得るので、治療上の見地から実現可能性を証明する。

いくつかの異なる技術を用いて、増幅されたゲノム配列を証明し得る。ガン細胞から調製した染色体スプレッドの古典的な細胞遺伝学的解析は、全体の構造変化（例えば、転座、欠失、および逆位）を同定するのに適する。増幅されたゲノム領域は、それらが高コピー数の大きな領域を含むか、または染色体外物質として存在する場合、視覚化することしかできない。細胞遺伝学は、特異的な染色体変化と特定の新生物との一致した関連を証明する最初の技術であったが、一方、処理可能なＤＮＡ配列の同定および単離には不適切である。より最近開発された比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）技術により、新生物におけるゲノム増幅の広範な現象が例証された。腫瘍ＤＮＡおよび正常ＤＮＡは、中期の正常細胞に同時にハイブリダイズされ、そして全ゲノムは、増大した頻度で腫瘍に存在するＤＮＡ配列の画像解析によりスクリーニングされ得る。（ＷＯ９３／１８，１８６；Ｇｒａｙら、ＲａｄｉａｔｉｏｎＲｅｓ，１３７，２７５−２８９（１９９４））。スクリーニング法として、この型の解析により、種々のヒト新生物において多数の繰返し発生するアンプリコン（増幅ＤＮＡの範囲）が明らかにされた。ＣＧＨは、ＤＮＡの増幅範囲の同定に関して古典的な細胞遺伝学的解析より感度が高いが、標準的な分子遺伝学的技術によるアンプリコン内のコード配列の迅速な同定および単離を可能にしない。

遺伝子増幅を検出するのに最も感度の高い方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づくアッセイである。これらのアッセイは、出発物質として非常に少量の腫瘍ＤＮＡを利用し、極めて感度が高く、さらなる分析（例えば、配列決定）を受け得るＤＮＡを提供し、そして高容量（ｈｉｇｈ−ｖｏｌｕｍｅ）スループット分析に適する。

上記のアッセイは互いに排他的ではないが、しばしば、新生物における増幅を同定するために組み合せて使用される。細胞遺伝学的解析およびＣＧＨは、増幅領域の全ゲノムを詳しく調べるためのスクリーニング法を表すが、一方、ＰＣＲに基づくアッセイは、コード配列（すなわち、増幅領域における遺伝子）の最終的な同定に最も適する。

本発明によれば、増幅遺伝子は、種々の一次腫瘍（乳房、肺、結腸、前立腺、脳、肝臓、腎臓、膵臓、脾臓、胸腺、精巣、卵巣、子宮などの腫瘍を含む）または腫瘍細胞株に由来するＤＮＡを、健康なドナーに由来するプールＤＮＡと比較することによる、定量的ＰＣＲ（Ｓ．Ｇｅｌｍｉｎｉら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ，４３，７５２（１９９７））により同定された。定量的ＰＣＲは、ＴａｑＭａｎ器具（ＡＢＩ）を用いて行われた。遺伝子特異的プライマーおよび蛍光原（ｆｌｕｏｒｏｇｅｎｉｃ）プローブは、ＤＮＡのコード配列に基づいて設計された。

ヒト肺ガン腫細胞株は、Ａ５４９（ＳＲＣＣ７６８）、Ｃａｌｕ−１（ＳＲＣＣ７６９）、Ｃａｌｕ−６（ＳＲＣＣ７７０）、Ｈ１５７（ＳＲＣＣ７７１）、Ｈ４４１（ＳＲＣＣ７７２）、Ｈ４６０（ＳＲＣＣ７７３）、ＳＫＭＥＳ−１（ＳＲＣＣ７７４）、およびＳＷ９００（ＳＲＣＣ７７５）を含み、全てＡＴＣＣから入手可能である。一次ヒト肺腫瘍細胞は、通常、腺ガン、扁平上皮ガン、大細胞ガン、非小細胞ガン、小細胞ガン、および気管支肺胞ガンに由来し、そして例えば、ＳＲＣＣ７２４（扁平上皮ガン、「ＳｑＣＣａ」と省略）、ＳＲＣＣ７２５（非小細胞ガン、「ＮＳＣＣａ」と省略）、ＳＲＣＣ７２６（腺ガン、「ＡｄｅｎｏＣａ」と省略）、ＳＲＣＣ７２７（腺ガン）、ＳＲＣＣ７２８（扁平上皮ガン）、ＳＲＣＣ７２９（腺ガン）、ＳＲＣＣ７３０（腺ガン／扁平上皮ガン）、ＳＲＣＣ７３１（腺ガン）、ＳＲＣＣ７３２（扁平上皮ガン）、ＳＲＣＣ７３３（腺ガン）、ＳＲＣＣ７３４（腺ガン）、ＳＲＣＣ７３５（気管支肺胞ガン、「ＢＡＣ」と省略）、ＳＲＣＣ７３６（扁平上皮ガン）、ＳＲＣＣ７３８（扁平上皮ガン）、ＳＲＣＣ７３９（扁平上皮ガン）、ＳＲＣＣ７４０（扁平上皮ガン）、ＳＲＣＣ７４０（肺細胞ガン、「ＬＣＣａ」と省略）を含む。

結腸ガン細胞株は、例えば、ＡＴＣＣ細胞株ＳＷ４８０（腺ガン、ＳＲＣＣ７７６）、ＳＷ６２０（結腸腺ガンのリンパ節転移、ＳＲＣＣ７７７）、ＣＯＬＯ３２０（腺ガン、ＳＲＣＣ７７８）、ＨＴ２９（腺ガン、ＳＲＣＣ７７９）、ＨＭ７（ガン腫、ＳＲＣＣ７８０）、ＣａＷｉＤｒ（腺ガン、ｓｒｃｃ７８１）、ＨＣＴ１１６（ガン腫、ＳＲＣＣ７８２）、ＳＫＣＯ１（腺ガン、ＳＲＣＣ７８３）、ＳＷ４０３（腺ガン、ＳＲＣＣ７８４）、ＬＳ１７４Ｔ（ガン腫、ＳＲＣＣ７８５）、およびＨＭ７（ＡＴＣＣ結腸腺ガン細胞株ＬＳ１７４Ｔの高ムチン産生改変体、ＲｏｂｅｒｔＷａｒｒｅｎ博士、ＵＣＳＦから得た）を含む。一次結腸腫瘍は、ＣＴ２（ＳＲＣＣ７４２）、ＣＴ３（ＳＲＣＣ７４３）、ＣＴ８（ＳＲＣＣ７４４）、ＣＴ１０（ＳＲＣＣ７４５）、ＣＴ１２（ＳＲＣＣ７４６）、ＣＴ１４（ＳＲＣＣ７４７）、ＣＴ１５（ＳＲＣＣ７４８）、ＣＴ１７（ＳＲＣＣ７５０）、ＣＴ１（ＳＲＣＣ７５１）、ＣＴ４（ＳＲＣＣ７５２）、ＣＴ５（ＳＲＣＣ７５３）、ＣＴ６（ＳＲＣＣ７５４）、ＣＴ７（ＳＲＣＣ７５５）、ＣＴ９（ＳＲＣＣ７５６）、ＣＴ１１（ＳＲＣＣ７５７）、ＣＴ１８（ＳＲＣＣ７５８）、ならびにＤｃＲ３、ＢＡＣｒｅｖ、ＢＡＣｆｗｄ、Ｔ１６０、およびＴ１５９と呼ばれる結腸腺ガンを含む。

ヒト乳房ガン腫細胞株は、例えば、ＨＢＬ１００（ＳＲＣＣ７５９）、ＭＢ４３５ｓ（ＳＲＣＣ７６０）、Ｔ４７Ｄ（ＳＲＣＣ７６１）、ＭＢ４６８（ＳＲＣＣ７６２）、ＭＢ１７５（ＳＲＣＣ７６３）、ＭＢ３６１（ＳＲＣＣ７６４）、ＢＴ２０（ＳＲＣＣ７６５）、ＭＣＦ７（ＳＲＣＣ７６６）、ＳＫＢＲ３（ＳＲＣＣ７６７）を含む。

（１．組織分布）
本明細書中での遺伝子増幅アッセイの結果は、さらなる研究により（例えば、種々のヒト組織におけるｍＲＮＡ発現を決定することにより）確かめられ得る。

前に言及したように、種々の組織における遺伝子増幅および／または遺伝子発現は、本明細書中に提供される配列に基づく適切に標識されたプローブを用いた、従来のサザンブロッティング、ｍＲＮＡ転写を定量するためのノーザンブロッティング（Ｔｈｏｍａｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：５２０１−５２０５（１９８０））、ドットブロッティング（ＤＮＡ分析）、またはインサイチュハイブリダイゼーションにより測定され得る。あるいは、特定の二重鎖（ＤＮＡ二重鎖、ＲＮＡ二重鎖、およびＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二重鎖もしくはＤＮＡ−タンパク質二重鎖を含む）を認識し得る抗体が使用され得る。

あるいは、種々の組織における遺伝子発現は、免疫学的方法（例えば、組織切片の免疫組織化学的染色、および遺伝子産物発現を直接定量するための細胞培養物または体液のアッセイ）により測定され得る。免疫組織化学的染色および／またはサンプル液のアッセイに有用な抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルのいずれかであり得、そして任意の哺乳動物において調製され得る。好都合なことに、抗体は、ネイティブな配列のＴＩＥリガンドホモログポリペプチドに対して、または本明細書中に提供されるＤＮＡ配列に基づく合成ペプチドに対して、またはＴＩＥリガンドホモログＤＮＡに融合し、かつ特定の抗体エピトープをコードする外因性配列に対して調製され得る。抗体産生のための一般的な技術、ならびにノーザンブロッティングおよびインサイチュハイブリダイゼーションの特別なプロトコルは、本明細書中以下に提供される。

（２．染色体マッピング）
所定の遺伝子の増幅が機能的に関連していれば、その遺伝子は、腫瘍生存に重要でない隣接ゲノム領域より多く増幅されているはずである。これを試験するために、遺伝子は、例えば、放射線ハイブリッド分析（ｒａｄｉａｔｉｏｎ−ｈｙｂｒｉｄａｎａｌｙｓｉｓ）により、特定の染色体にマップされ得る。次いで、増幅レベルが、同定された位置および隣接ゲノム領域で決定される。遺伝子がマップされたゲノム領域での選択的または優先的な増幅は、観察された遺伝子増幅が腫瘍増殖または生存を促進する可能性と一致する。

（３．抗体結合研究）
遺伝子増幅研究の結果は、抗体結合研究によりさらに確かめられ得、ここで抗ＴＩＥリガンドホモログ抗体の、腫瘍（ガン）細胞におけるＴＩＥリガンドホモログポリペプチドの効果を阻害する能力が試験される。例示的な抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、二重特異性抗体、およびヘテロ結合体（ｈｅｔｅｒｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）抗体を含み、これらの調製は本明細書中以下に記載される。

抗体結合研究は、任意の公知のアッセイ法（例えば、競合結合アッセイ、直接および間接サンドイッチアッセイ、ならびに免疫沈降アッセイ）で行われ得る。Ｚｏｌａ，ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＡＭａｎｕａｌｏｆＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１４７−１５８頁（ＣＲＣＰｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８７）。

競合結合アッセイは、標識された標準が、限定量の抗体との結合について試験サンプル分析物と競合する能力に依存する。試験サンプル中の（腫瘍細胞において増幅される遺伝子によりコードされる）標的タンパク質の量は、抗体に結合する標準の量と反比例する。結合する標準の量の決定を容易にするために、好ましくは、抗体は、抗体に結合した標準および分析物が、結合していない標準および分析物から都合良く分離され得るように、競合の前または後に不溶化される。

サンドイッチアッセイは２つの抗体の使用を必要とし、各々の抗体は、検出されるタンパク質の異なる免疫原部分またはエピトープに結合し得る。サンドイッチアッセイにおいて、試験サンプル分析物は、固体支持体上に固定化された第１の抗体に結合し、その後、第２の抗体が分析物に結合し、従って、不溶性３部分複合体を形成する。例えば、米国特許第４，３７６，１１０号を参照のこと。第２の抗体は、それ自体が検出可能な部分で標識され得るか（直接サンドイッチアッセイ）、または検出可能な部分で標識された抗免疫グロブリン抗体を用いて測定され得る（間接サンドイッチアッセイ）。例えば、サンドイッチアッセイの１つの型はＥＬＩＳＡアッセイであり、この場合、検出可能な部分は酵素である。

免疫組織化学のために、腫瘍サンプルは、生であるか、もしくは凍結され得るか、または例えば、パラフィンに包埋され、そして防腐剤（例えば、ホルマリン）で固定され得る。

（４．細胞に基づく腫瘍アッセイ）
腫瘍（例えば、ガン）についての細胞に基づくアッセイおよび動物モデルを使用して、遺伝子増幅アッセイの知見を確かめ、そして本明細書中で同定された遺伝子と新生物細胞増殖の発生および病原性との間の関係をさらに理解し得る。腫瘍またはガンの発生および病原性における本明細書中で同定された遺伝子産物の役割は、本明細書中の遺伝子を増幅することが同定された一次腫瘍細胞または細胞株を用いることにより試験され得る。このような細胞は、例えば、上記で列挙された乳ガン、結腸ガン、および肺ガンの細胞および細胞株を含む。

異なるアプローチにおいて、特定の腫瘍に関与することが知られている細胞型の細胞を、本明細書中のｃＤＮＡでトランスフェクトし、そしてこれらのｃＤＮＡが過剰な増殖を誘導する能力を分析する。適切な細胞は、例えば、安定腫瘍細胞株（例えば、Ｂ１０４−１−１細胞株（ｎｅｕ原ガン遺伝子でトランスフェクトされた安定ＮＩＨ−３Ｔ３細胞株）およびｒａｓトランスフェクトＮＩＨ−３Ｔ３細胞株）を含み、これは、所望の遺伝子でトランスフェクトし得、そして腫瘍形成増殖についてモニターし得る。次いで、このようなトランスフェクト細胞株を使用して、ポリクローナル抗体もしくはモノクローナル抗体または抗体組成物が、形質転換細胞の増殖に対して細胞増殖抑制（ｃｙｔｏｓｔｉｃ）活性もしくは細胞傷害活性を発揮することによるか、または抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介することにより、腫瘍形成細胞増殖を阻害する能力を試験し得る。本明細書中で同定された遺伝子のコード配列でトランスフェクトされた細胞をさらに使用して、ガン処置のための薬物候補を同定し得る。

さらに、トランスジェニック動物の腫瘍に由来する初代培養物（以下に記載）は、本明細書中の細胞に基づくアッセイにおいて使用され得るが、安定細胞株が好ましい。連続細胞株をトランスジェニック動物から得るための技術は、当該分野で周知である（例えば、Ｓｍａｌｌら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５，６４２−６４８（１９８５）を参照のこと）。

（５．動物モデル）
種々の周知の動物モデルを使用して、さらに、腫瘍の発生および病原性における本明細書中で同定された遺伝子の役割を理解し、そして候補治療薬剤（抗体、およびネイティブなポリペプチドの他のアンタゴニスト（小分子アンタゴニストを含む）を含む）の効力を試験し得る。このようなモデルのインビボ性質により、これらはヒト患者における応答を詳しく予測する。腫瘍およびガン（例えば、乳ガン、結腸ガン、前立腺ガン、肺ガンなど）の動物モデルは、非組換え動物および組換え（トランスジェニック）動物の両方を含む。非組換え動物モデルは、例えば、齧歯動物（例えば、マウスモデル）を含む。このようなモデルは、標準的な方法（例えば、皮下注射、尾静脈注射、脾臓移植、腹腔内移植、腎臓被膜下の移植、またはオルトピン（ｏｒｔｈｏｐｉｎ）移植（例えば、結腸ガン細胞を結腸組織に移植する））を用いて、腫瘍細胞を同系マウスに導入することにより産生され得る。（例えば、１９９７年９月１８に公開されたＰＣＴ公開番号ＷＯ９７／３３５５１を参照のこと）。

恐らく、腫瘍学研究において最もよく使用される動物種は、免役不全マウス（特に、ヌードマウス）である。低形成／形成不全を伴うヌードマウスが、ヒト腫瘍異種移植片の宿主として首尾良く機能し得るという観察により、この目的のためのその広範な使用が導かれた。常染色体劣性ｎｕ遺伝子は、非常に多数の別個のヌードマウスコンジェニック系統（例えば、ＡＳＷ、Ａ／Ｈｅ、ＡＫＲ、ＢＡＬＢ／ｃ、Ｂ１０．ＬＰ、Ｃ１７、Ｃ３Ｈ、Ｃ５７ＢＬ、Ｃ５７、ＣＢＡ、ＤＢＡ、ＤＤＤ、Ｉ／ｓｔ、ＮＣ、ＮＦＲ、ＮＦＳ、ＮＦＳ／Ｎ、ＮＺＢ、ＮＺＣ、ＮＺＷ、Ｐ、ＲＩＩＩ、およびＳＪＬ）に導入された。さらに、ヌードマウス以外の広範な種々の他の遺伝性免疫欠損を有する動物が繁殖され、そして腫瘍異種移植片のレシピエントとして使用されてきた。さらなる詳細については、例えば、ＴｈｅＮｕｄｅＭｏｕｓｅｉｎＯｎｃｏｌｏｇｙＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｅ．ＢｏｖｅｎおよびＢ．Ｗｉｎｏｇｒａｄ編、ＣＲＣＰｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，１９９１を参照のこと。

このような動物に導入される細胞は、公知の腫瘍／ガン細胞株（例えば、上記で列挙された腫瘍細胞株のいずれか、例えば、Ｂ１０４−１−１細胞株（ｎｅｕ原ガン遺伝子でトランスフェクトされた安定ＮＩＨ−３Ｔ３細胞株））；ｒａｓトランスフェクトＮＩＨ−３Ｔ３細胞；Ｃａｃｏ−２（ＡＴＣＣＨＴＢ−３７）；中程度に十分分化したグレードＩＩ（ｇｒａｄｅＩＩ）ヒト結腸腺ガンの細胞株であるＨＴ−２９（ＡＴＣＣＨＴＢ−３８））に由来するか、または腫瘍およびガンに由来し得る。腫瘍細胞またはガン細胞サンプルは、標準的な条件（液体窒素中での凍結および貯蔵を含む）を用いて、手術を受けている患者から得られ得る（Ｋａｒｍａｌｉら、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ４８，６８９−６９６（１９８３））。

腫瘍細胞は、種々の手順によって動物（例えば、ヌードマウス）に導入され得る。マウスの皮下（ｓ．ｃ．）空間は、腫瘍移植に非常に適する。腫瘍は、固形ブロックとして、トロカール使用による針生検材料として、または細胞懸濁物として皮下移植され得る。固形ブロックまたはトロカール移植については、適切なサイズの腫瘍組織断片が皮下空間に導入される。細胞懸濁物は、一次腫瘍または安定腫瘍細胞株から新たに調製され、そして皮下注射される。腫瘍細胞はまた、皮膚下（ｓｕｂｄｅｒｍａｌ）移植片として注射され得る。この位置で、接種物は、皮膚結合組織の下部と皮下組織との間に沈着される。ＢｏｖｅｎおよびＷｉｎｏｇｒａｄ、前出。

乳ガンの動物モデルは、例えば、Ｄｒｅｂｉｎら、ＰＮＡＳＵＳＡ８３，９１２９−９１３３（１９８６）により本質的に記載されるように、ラット神経芽細胞腫細胞（これからｎｅｕガン遺伝子が最初に単離された）またはｎｅｕ形質転換ＮＩＨ−３Ｔ３細胞をヌードマウスに移植することにより産生され得る。

同様に、結腸ガンの動物モデルは、動物（例えば、ヌードマウス）において結腸ガン細胞を継代し、これらの動物において腫瘍出現を導くことにより産生され得る。ヌードマウスにおけるヒト結腸ガンの正常位（ｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃ）移植モデルは、例えば、Ｗａｎｇら、ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ５４，４７２６−４７２８（１９９４）およびＴｏｏら、ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ５５，６８１−６８４（１９９５）により記載されている。このモデルは、ＡｎｔｉＣａｎｃｅｒ，Ｉｎｃ．（ＳａｎＤｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）により販売される、いわゆる「ＭＥＴＡＭＯＵＳＥ」に基づく。

動物において生じる腫瘍は取り出され、そしてインビトロで培養され得る。次いで、インビトロ培養物に由来する細胞は、動物へ継代され得る。このような腫瘍は、さらなる試験または薬物スクリーニングのための標的として役立ち得る。あるいは、継代から得られた腫瘍は単離され、そして前継代細胞および１回以上の継代の後に単離された細胞に由来するＲＮＡは、目的の遺伝子のディファレンシャルな発現について分析され得る。このような継代技術は、任意の公知の腫瘍またはガン細胞株を用いて行われ得る。

例えば、ＭｅｔｈＡ、ＣＭＳ４、ＣＭＳ５、ＣＭＳ２１、およびＷＥＨＩ−１６４は、ＢＡＬＢ／ｃ雌マウスの化学的に誘導された線維肉腫であり（ＤｅＬｅｏら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１４６，７２０（１９７７））、これらは、種々の薬剤の抗腫瘍活性を研究するための高度に制御可能なモデル系を提供する（Ｐａｌｌａｄｉｎｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３８，４０２３−４０３２（１９８７））。簡単には、腫瘍細胞は、細胞培養においてインビトロで増殖される。動物への注射前に、細胞株は洗浄され、そして緩衝液に、約１０×１０⁶〜１０×１０⁷個細胞／ｍｌの細胞密度で懸濁される。次いで、動物に、１００〜１００μｌの細胞懸濁物を皮下感染させ、腫瘍が出現するために１〜３週間放置する。

さらに、最も詳細に研究された実験的腫瘍の１つであるマウスルイス肺（３ＬＬ）ガン腫は、研究用腫瘍モデルとして使用され得る。この腫瘍モデルにおける効力は、肺小細胞ガン（ＳＣＣＬ）と診断されたヒト患者の処置における有益な効果と相関してきた。この腫瘍は、罹患マウス由来腫瘍断片または培養維持細胞の注射により正常マウスにおいて導入され得（Ｚｕｐｉら、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ４１，補遺４，３０９（１９８０））、そして証拠は、腫瘍が単一細胞の注射からでさえも生じ得、そして非常に高い割合の感染腫瘍細胞が生存することを示す。この腫瘍モデルについてのさらなる情報については、Ｚａｃｈａｒｓｋｉ，Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ１６，３００−３２０（１９８６）を参照のこと。

腫瘍が移植された動物モデルにおいて試験化合物の効力を評価する１つの方法は、処置前後の腫瘍サイズを測定することである。伝統的に、移植腫瘍のサイズは、二次元または三次元に関してノギスを用いて測定されてきた。二次元に限定される測定は、正確に腫瘍サイズを反映せず、従って、通常、数式を用いることにより対応する体積に変換される。しかし、腫瘍サイズの測定値は、非常に不正確である。薬物候補の治療効果は、処置誘導増殖遅延および特異的増殖遅延としてよりよく記載され得る。腫瘍増殖の記載における別の重要な変数は、腫瘍体積倍加時間である。腫瘍増殖の計算および記載のためのコンピュータープログラムもまた利用可能である（例えば、ＲｙｇａａｒｄおよびＳｐａｎｇ−Ｔｈｏｍｓｅｎ，Ｐｒｏｃ．６ｔｈＩｎｔ．ＷｏｒｋｓｈｏｐｏｎＩｍｍｕｎｅ−ＤｅｆｉｃｉｅｎｔＡｎｉｍａｌｓ，ＷｕおよびＳｈｅｎｇ編、Ｂａｓｅｌ，１９８９，３０１により報告されたプログラム）。しかし、処置後の壊死および炎症応答が、実際に、少なくとも初期に腫瘍サイズの増加をもたらし得ることに留意のこと。従って、これらの変化は、形態計測法およびフローサイトメトリー分析の組み合わせにより、注意深くモニターされる必要がある。

組換え（トランスジェニック）動物モデルは、トランスジェニック動物を作製するための標準的な技術を用いて、本明細書中で同定された遺伝子のコード部分を、目的の動物のゲノムに導入することにより操作され得る。トランスジェニック操作の標的として役立ち得る動物は、制限なく、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ヒツジ、ヤギ、ブタ、および非ヒト霊長類（例えば、ヒヒ、チンパンジー、およびサル）を含む。トランスジーンをこのような動物に導入するための当該分野で公知の技術は、前核マイクロインジェクション（ＨｏｐｐｅおよびＷａｎｇｅｒ，米国特許第４，８７３，１９１号）；生殖系列へのレトロウイルス媒介遺伝子導入（例えば、ＶａｎｄｅｒＰｕｔｔｅｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８２，６１４８−６１５（１９８５））；胚性幹細胞における遺伝子ターゲッティング（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｃｅｌｌ５６，３１３−３２１（１９８９））；胚のエレクトロポレーション（Ｌｏ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌ．Ｂｉｏｌ．３，１８０３−１８１４（１９８３））；精子媒介遺伝子導入（Ｌａｖｉｔｒａｎｏら、Ｃｅｌｌ５７，７１７−７３（１９８９））を含む。概説については、例えば、米国特許第４，７３６，８６６号を参照のこと。

本発明の目的のために、トランスジェニック動物は、それらの細胞の一部にのみトランスジーンを有する動物（「モザイク動物」）を含む。トランスジーンは、単一のトランスジーンとして、またはコンカテマー（ｃｏｎｃａｔａｍｅｒ）（例えば、頭部対頭部もしくは頭部対尾部タンデム）でのいずれかで組込まれ得る。トランスジーンの特定の細胞型への選択的導入はまた、例えば、Ｌａｓｋｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９，６２３２−６３６（１９９２）の技術に従うことにより可能である。

トランスジェニック動物におけるトランスジーンの発現は、標準的な技術によりモニターされ得る。例えば、サザンブロット分析またはＰＣＲ増幅を使用して、トランスジーンの組込みを確かめ得る。次いで、ｍＲＮＡ発現レベルは、インサイチュハイブリダイゼーション、ノーザンブロット分析、ＰＣＲ、または免疫細胞化学のような技術を用いて分析され得る。動物は、さらに、腫瘍またはガン発生の徴候について調べられる。

あるいは、本明細書中で同定されたポリペプチドをコードする内因性遺伝子と、動物の胚細胞に導入された、変えられた、同じポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡとの間の相同組換えの結果として、欠損または変えられた、このポリペプチドをコードする遺伝子を有する「ノックアウト」動物が構築され得る。例えば、特定のポリペプチドをコードするｃＤＮＡを使用して、確立した技術に従って、そのポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡをクローニングし得る。特定のポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡの一部は、欠失されるか、または別の遺伝子（例えば、組込みをモニターするために使用され得る選択マーカーをコードする遺伝子）で置換され得る。代表的に、数キロ塩基の変えられていない（５’末端および３’末端両方の）隣接ＤＮＡがベクターに含まれる（相同組換えベクターの記載については、例えば、ＴｈｏｍａｓおよびＣａｐｅｃｃｈｉ，Ｃｅｌｌ，５１：５０３（１９８７）を参照のこと）。ベクターは、胚性幹細胞株に（例えば、エレクトロポレーションにより）導入され、そして導入ＤＮＡが内因性ＤＮＡと相同組換えした細胞は選択される（例えば、Ｌｉら、Ｃｅｌｌ，６９：９１５（１９９２）を参照のこと）。次いで、選択された細胞は、動物（例えば、マウスまたはラット）の胚盤胞に注射されて、凝集キメラを形成する（例えば、Ｂｒａｄｌｅｙ，ＴｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓａｎｄＥｍｂｒｙｏｎｉｃＳｔｅｍＣｅｌｌｓ：ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ，Ｅ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ編（ＩＲＬ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８７），１１３−１５２頁を参照のこと）。次いで、キメラ胚は適切な偽妊娠雌里親動物（ｐｓｅｕｄｏｐｒｅｇｎａｎｔｆｅｍａｌｅｆｏｓｔｅｒａｎｉｍａｌ）に移植され、そして胚は、「ノックアウト」動物を作り出すために出産予定日まで育てられ得る。それらの生殖細胞に相同組換えＤＮＡを有する子孫は標準的な技術により同定され、そしてこの子孫を使用して、その動物の全細胞が相同組換えＤＮＡを含む動物を繁殖させ得る。ノックアウト動物は、例えば、ある病理学的状態から防御するそれらの能力について、およびＦＩＺＺポリペプチドの非存在によるそれらの病理学的状態の発生について特徴付けられ得る。

本明細書中で同定されたポリペプチドを特異的に結合する抗体および他の薬物候補の抗力はまた、自然発生動物腫瘍の処置において試験され得る。このような研究に適した標的は、ネコ口扁平上皮ガン（ＳＣＣ）である。ネコ口ＳＣＣは、この種で報告された口腫瘍の６０％以上を占める最も一般的なネコの口悪性腫瘍である、高度に侵襲性の悪性腫瘍である。これは、まれに離れた部位に転移するが、この少ない転移発生数は、単に、この腫瘍を有するネコの短い生存期間の反映であり得る。これらの腫瘍は、主にネコ口腔の解剖学的構造のために、通常、手術できない。目下、この腫瘍に対する効果的な処置はない。研究に入る前に、各々のネコは、完全な臨床検査、生検を受け、そしてコンピューター連動断層撮影（ＣＴ）によりスキャンされる。舌下口扁平上皮細胞ガンと診断されたネコは、研究から排除される。舌は、このような腫瘍の結果として麻痺するするようになり得、そして処置により腫瘍が殺傷されてさえも、動物は、自分自身で餌を食べることができないかもしれない。各々のネコは、長期間にわたって繰返し処置される。腫瘍の写真は、処置期間の間毎日および各々の後の再チェックで撮影される。処置後、各々のネコは別のＣＴスキャンを受ける。ＣＴスキャンおよび胸部Ｘ線写真は、その後８週間毎に評価される。データは、コントロール群と比較した、生存、応答、および毒性の差について評価される。陽性応答は、好ましくは、生活の質の改善および／または寿命の増加と共に、腫瘍の緩解の証拠を必要とし得る。

さらに、他の自然発生動物腫瘍（例えば、イヌ、ネコ、およびヒヒの線維肉腫、腺ガン、リンパ腫、軟骨腫（ｃｈｒｏｎｄｒｏｍａ）、平滑筋肉腫）もまた試験され得る。これらのうち、イヌおよびネコにおける哺乳動物腺ガンは、その出現および性質がヒトのものと非常に類似するので好ましいモデルである。しかし、このモデルの使用は、動物におけるこの型の腫瘍の稀な発生により制限される。

（６．処置方法）
本発明の抗体および他の抗腫瘍化合物は、種々の状態（本明細書中で同定された増幅遺伝子の過剰発現および／または活性化により特徴付けられる状態を含む）を処置するために使用され得ることが意図される。このような抗体および他の化合物（小有機分子および無機分子、ペプチド、アンチセンス分子などを含むが、それらに限定されない）を用いて処置される例示的な状態または障害は、良性腫瘍または悪性腫瘍（例えば、腎臓、肝臓、腎臓、膀胱、乳房、胃、卵巣、結腸直腸、前立腺、膵臓、肺（ｌｉｎｇ）、外陰部、甲状腺、肝臓のガン腫；肉腫；神経膠芽細胞腫；ならびに種々の頭部および頚部腫瘍）；白血病およびリンパ悪性腫瘍；他の障害（例えば、ニューロン、グリア、星状細胞、視床下部および他の腺、マクロファージ、上皮、支質、および分割腔の障害）；ならびに炎症障害、脈管形成障害、および免疫障害を含む。

本発明の抗腫瘍薬剤（例えば、抗体）は、公知の方法に従って（例えば、ボーラスとしての静脈内投与により、または一定期間にわたる連続注入により、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内（ｉｎｔｒａｃｅｒｏｂｒｏｓｐｉｎａｌ）、皮下、関節内、滑液内、クモ膜下腔内、経口、局所、もしくは吸入の経路により）、哺乳動物（好ましくは、ヒト）に投与される。抗体の静脈内投与が好ましい。

他の治療レジメが、抗ガン剤（例えば、本発明の抗体）投与と組み合わされ得る。例えば、このような抗ガン剤で処置される患者はまた、放射線治療を受け得る。あるいは、またはさらに、化学療法剤が患者に投与され得る。このような化学療法剤の調製および投薬スケジュールは、製造者の説明書に従って、または当業者により経験的に決定されるように使用され得る。このような化学療法の調製および投薬スケジュールはまた、ＣｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙＳｅｒｖｉｃｅ，Ｍ．Ｃ．Ｐｅｒｒｙ編、Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ（１９９２）において記載される。化学療法剤は、抗腫瘍薬剤（例えば、抗体）投与の前もしくは後で投与され得るか、またはそれと同時に与えられ得る。抗体は、抗エストロゲン化合物（例えば、タモキシフェン）または抗プロゲステロン（例えば、オナプリストン（ｏｎａｐｒｉｓｔｏｎｅ））（ＥＰ６１６８１２を参照のこと）と、このような分子について知られている投薬量で組み合わされ得る。

他の腫瘍関連抗原に対する抗体（例えば、ＥｒｂＢ２、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、または血管内皮因子（ＶＥＧＦ）に結合する抗体）を投与することもまた望ましくあり得る。あるいは、またはさらに、本明細書中で開示された同じまたは２つ以上の異なる抗原を結合する２つ以上の抗体は、患者に同時投与され得る。時々、１つ以上のサイトカインを患者に投与することもまた有益であり得る。好ましい実施態様において、本明細書中の抗体は、増殖阻害剤と同時投与される。例えば、最初に増殖阻害剤が投与され、それに続いて本発明の抗体が投与され得る。しかし、同時投与または本発明の抗体の最初の投与もまた意図される。増殖阻害剤の適切な投薬量は、現在使用される投薬量であり、そして増殖阻害剤および本明細書中の抗体の組み合わせ作用（相乗作用）のために減らされ得る。

疾患の予防または処置について、抗腫瘍薬剤（例えば、本明細書中の抗体）の適切な投薬量は、上記で定義された処置される疾患の型、疾患の重篤度および経過、この薬剤が予防目的で投与されるか治療目的で投与されるか、以前の治療、患者の病歴および薬剤に対する応答、ならびに主治医の裁量に依存する。この薬剤は、一度にまたは一連の処置にわたって適切に患者に投与される。

例えば、疾患の型および重篤度に依存して、例えば、１回以上の別々の投与によってもまたは連続注入によっても、約１μｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ）の抗体が、患者への投与のための最初の候補投薬量である。代表的な１日の投薬量は、上記の要因に依存して、約１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ以上の範囲に及ぶ。数日以上にわたる反復投与については、状態に依存して、処置は、疾患徴候の所望の抑制が現れるまで続けられる。しかし、他の投薬量レジメが有用であり得る。この治療の進行は、従来の技術およびアッセイにより容易にモニターされる。

（７．製造品）
本発明の別の実施態様において、上記の障害の診断または処置に有用な材料を含む製造品が提供される。製造品は、容器およびラベルを含む。適切な容器は、例えば、瓶、バイアル、注射器、および試験管を含む。容器は、種々の材料（例えば、ガラスまたはプラスチック）から形成され得る。容器は、状態の診断または処置に効果的である組成物を保持し、そして滅菌した入口（ａｃｃｅｓｓｐｏｒｔ）を有し得る（例えば、容器は、静脈内溶液バッグまたは皮下注射針で穴を開けることができる栓が付いたバイアルであり得る）。組成物中の活性薬剤は、通常、本明細書中で同定された遺伝子産物の活性を妨げ得る抗腫瘍薬剤（例えば、抗体）である。容器上のまたは容器に付随するラベルは、組成物が、選択した状態を診断または処置するために使用されることを示す。製造品は、さらに、薬学的に受容可能な緩衝液（例えば、リン酸緩衝化生理食塩水、リンガー液、およびデキストロース溶液）を含む第２の容器を含み得る。これは、さらに、商業的または使用者の観点から望ましい他の材料（他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、注射器、および使用のための説明書が付いたパッケージ挿入物を含む）を含み得る。

（Ｆ．薬物候補のためのスクリーニングアッセイ）
薬物候補のためのスクリーニングアッセイが、本明細書中で同定された遺伝子によりコードされるポリペプチドを結合するか、またはそれと複合体化するか、さもなければコードポリペプチドと他の細胞タンパク質との相互作用を妨げる、化合物を同定するように設計される。このようなスクリーニングアッセイは、それらを小分子薬物候補物を同定するために特に適切にする、化学薬品ライブラリーの高スループットスクリーニングを行い得るアッセイを含む。意図される小分子は、合成有機化合物または合成無機化合物（ペプチド、好ましくは可溶性ペプチドを含む）、（ポリ）ペプチド−免疫グロブリン融合物、および特に、抗体（制限なく、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体、ならびに抗体フラグメント、単鎖抗体、抗イディオタイプ抗体、ならびにこのような抗体またはフラグメントのキメラまたはヒト化バージョン、ならびにヒト抗体および抗体フラグメントを含む）を含む。アッセイは、タンパク質−タンパク質結合アッセイ、生化学的スクリーニングアッセイ、イムノアッセイ、および細胞に基づくアッセイを含む、種々の形式で行われ得、これらは当該分野で十分に特徴付けられている。

全てのアッセイは、それらが、薬物候補を、本明細書中で同定された核酸によりコードされるポリペプチドと、これらの２つの成分が相互作用し得るのに十分な条件下および時間で接触させることを必要とする点で共通する。

結合アッセイにおいて、相互作用は結合であり、そして形成される複合体は、単離されるか、または反応混合物中で検出され得る。特定の実施態様において、本明細書中で同定された遺伝子によりコードされるポリペプチドまたは薬物候補は、共有結合接着または非共有結合接着により、固相（例えば、マイクロタイタープレート）上に固定化される。非共有結合接着は、一般的に、固形表面をポリペプチド溶液でコートし、そして乾燥することにより達成される。あるいは、固定化されるポリペプチドに特異的な固定化抗体（例えば、モノクローナル抗体）を用いて、ポリペプチドを固形表面にアンカーし得る。このアッセイは、非固定化成分（これは検出可能な標識により標識され得る）を、固定化成分（例えば、アンカーされた成分を含むコート表面）に添加することにより行われ得る。反応が完了したら、反応しなかった成分は、例えば洗浄により除去され、そして固形表面上に固定化された複合体は検出される。もともと固定化されていなかった成分が検出可能な標識を有する場合、表面上に固定化された標識の検出は、複合体化が生じたことを示す。もともと固定化されていなかった成分が標識を有さない場合、複合体化は、例えば、固定化複合体を特異的に結合する標識抗体を使用することにより検出され得る。

候補化合物が、本明細書中で同定された遺伝子によりコードされる特定のタンパク質と相互作用するが、それに結合しない場合、そのタンパク質とのその相互作用は、タンパク質−タンパク質相互作用を検出するための周知の方法によりアッセイされ得る。このようなアッセイは、伝統的なアプローチ（例えば、架橋、同時免疫沈降、および勾配またはクロマトグラフィーカラムによる同時精製）を含む。さらに、タンパク質−タンパク質相互作用は、ＣｈｅｖｒａｙおよびＮａｔｈａｎｓ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９，５７８９−５７９３（１９９１））により開示されるような、Ｆｉｅｌｄｓおよび共同研究者（ＦｉｅｌｄｓおよびＳｏｎｇ，Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）３４０，２４５−２４６（１９８９）；Ｃｈｉｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８，９５７８−９５８２（１９９１））により記載される、酵母に基づく遺伝的システムを用いることによりモニターされ得る。多くの転写アクチベーター（例えば、酵母ＧＡＬ４）は、２つの物理的に分離したモジュラードメインからなり、一方はＤＮＡ結合ドメインとして機能するが、他方は転写活性化ドメインとして機能する。前述の刊行物に記載された酵母発現系（一般的に、「ツーハイブリッドシステム」と呼ばれる）はこの特性を利用し、そして２つのハイブリッドタンパク質を使用し、一方において標的タンパク質がＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインに融合され、そしてもう一方において候補活性化タンパク質が活性化ドメインに融合される。ＧＡＬ４活性化プロモーター制御下でのＧＡＬ１−ｌａｃＺリポーター遺伝子の発現は、タンパク質−タンパク質相互作用を介したＧＡＬ４活性の再構成に依存する。相互作用ポリペプチドを含むコロニーは、β−ガラクトシダーゼの発色基質を用いて検出される。ツーハイブリッド技術を用いて、２つの特異的タンパク質間のタンパク質−タンパク質相互作用を同定するための完全なキット（ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ^TM）は、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから市販されている。このシステムはまた、特異的なタンパク質相互作用に関与するタンパク質ドメインをマップするために、ならびにこれらの相互作用に重要なアミノ酸残基の位置を正確に示すために拡大され得る。

本明細書中で同定された遺伝子と、試験され得る他の細胞内成分または細胞外成分との相互作用を妨げる化合物を見出すために、通常、増幅遺伝子産物および細胞内成分または細胞外成分を含む反応混合物は、２つの産物の相互作用および結合を可能にする条件下および時間で調製される。試験化合物が結合を阻害する能力を試験するために、反応は、試験化合物の非存在下および存在下で行われる。さらに、偽薬が、陽性コントロールとして働くために、第３の反応混合物に添加され得る。混合物に存在する試験化合物と細胞内成分または細胞外成分との間の結合（複合体形成）は、本明細書中上記に記載したようにモニターされる。コントロール反応での複合体の形成は、試験化合物が試験化合物とその反応パートナーとの相互作用を妨げることを示すが、試験化合物を含む反応混合物での形成は、その相互作用を妨げることを示さない。

本発明のさらなる詳細は、以下の限定しない実施例から明らかである。

（参照実施例１）
（ＦＬＳ１３９リガンドの同定）
ＦＬＳ１３９を、本明細書中に参考として援用される「説明書マニュアル：ｃＤＮＡ合成およびλクローニングのためのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（登録商標）ＬａｍｂｄａＳｙｓｔｅｍ」、カタログ番号１９６４３−０１４、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ，ＵＳＡに記載のプロトコルに従って、ＣｌｏｎｔｅｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．ＰａｌｏＡｌｔｏ，ＣＡＵＳＡから得たヒト胎児肝臓ｍＲＮＡ、カタログ番号６４０１８−１から調製したｃＤＮＡライブラリーにおいて同定した。他に言及されない限り、全試薬もまた、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから得た。全手順は、以下の工程に要約され得る：（１）第１鎖合成；（２）第２鎖合成；（３）アダプター添加；（４）酵素消化；（５）ｃＤＮＡのゲル単離；（６）ベクターへの連結；および（７）形質転換。

（第１鎖合成：）
ＮｏｔＩプライマー−アダプター（ＬｉｆｅＴｅｃｈ．，２μｌ、０．５μｇ／μｌ）を滅菌１．５ｍｌ微量遠心管に添加し、これにポリＡ＋ｍＲＮＡ（７μｌ、５μｇ）を添加した。反応管を、７０℃まで、５分間、またはｍＲＮＡの２次構造を変成するのに十分な時間で加熱した。次いで、反応物を氷上で冷却し、そして５×第１鎖緩衝液（ＬｉｆｅＴｅｃｈ．，４μｌ）、０．１ＭＤＴＴ（２μｌ）、および１０ｍＭｄＮＴＰＭｉｘ（ＬｉｆｅＴｅｃｈ．，１μｌ）を添加し、次いで、３７℃まで２分間加熱して、温度を平衡化させた。次いで、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（登録商標）逆転写酵素（ＬｉｆｅＴｅｃｈ．，５μｌ）を添加し、反応管を十分に混合し、そして３７℃で１時間インキュベートし、そして氷上に置くことにより終結させた。反応物の最終組成は、以下の通りであった：５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）；７５ｍＭＫＣｌ；３ｍＭＭｇＣｌ₂；１０ｍＭＤＴＴ；５００μＭ各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰ；５０μｇ／ｍｌＮｏｔＩプライマー−アダプター；５μｇ（２５０μｇ／ｍｌ）ｍＲＮＡ；５０，０００Ｕ／ｍｌＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（登録商標）逆転写酵素。

（第２鎖合成）
氷上の間に、以下の試薬を、第１鎖合成からの反応管に添加し、反応物を十分に混合し、そして温度を１６℃より上にさせないように注意して、１６℃で２時間反応させた：蒸留水（９３μｌ）；５×第２鎖緩衝液（３０μｌ）；ｄＮＴＰ混合物（３μｌ）；１０Ｕ／μｌＥ．ＣｏｌｉＤＮＡリガーゼ（１μｌ）；１０Ｕ／μｌＥ．ＣｏｌｉＤＮＡポリメラーゼＩ（４μｌ）；２Ｕ／μｌＥ．ＣｏｌｉＲＮａｓｅＨ（１μｌ）。１０ＵＴ４ＤＮＡポリメラーゼ（２μｌ）を添加し、そして反応物を、もう５分間１６℃でインキュベートし続けた。反応物の最終組成は、以下の通りであった：２５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）；１００ｍＭＫＣｌ；５ｍＭＭｇＣｌ₂；１０ｍＭ（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄；０．１５ｍＭ β−ＮＡＤ＋；２５０μＭ各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰ；１．２ｍＭＤＴＴ；６５Ｕ／ｍｌＤＮＡリガーゼ；２５０Ｕ／ｍｌＤＮＡポリメラーゼＩ；１３Ｕ／ｍｌＲＮａｓｅＨ。反応を、氷上に置くことおよび０．５ＭＥＤＴＡ（１０μｌ）の添加により止め、次いで、フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１、１５０μｌ）により抽出した。水相を取り出し、収集し、そして５ＭＮａＣｌ（１５μｌ）および無水エタノール（−２０℃、４００μｌ）に希釈し、そして１４，０００×ｇで２分間遠心分離した。上清を、得られたＤＮＡペレットから注意深く除去し、ペレットを、７０％エタノール（０．５ｍｌ）に再懸濁し、そして１４，０００×ｇで２分間、再度遠心分離した。上清を再度除去し、そしてペレットをスピードバックで乾燥した。

（アダプター添加）
以下の試薬を、上記の第２鎖合成からのｃＤＮＡペレットに添加し、そして反応物を穏やかに混合し、そして１６℃で１６時間インキュベートした：蒸留水（２５μｌ）；５×Ｔ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液（１０μｌ）；ＳａｌＩアダプター（１０μｌ）；Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（５μｌ）。反応物の最終組成は、以下であった：５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）；１０ｍＭＭｇＣｌ₂；１ｍＭＡＴＰ；５％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ８０００；１ｍＭＤＴＴ；２００μｇ／ｍｌＳａｌＩアダプター；１００Ｕ／ｍｌＴ４ＤＮＡリガーゼ。反応物を、フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１、５０μｌ）により抽出し、水相を取り出し、収集し、そして５ＭＮａＣｌ（８μｌ）および無水エタノール（−２０℃、２５０μｌ）に希釈した。次いで、これを１４，０００×ｇで２０分間遠心分離し、上清を除去し、そしてペレットを０．５ｍｌの７０％エタノールに再懸濁し、そして１４，０００×ｇで２分間、再度遠心分離した。続いて、上清を除去し、そして得られたペレットをスピードバックにおいて乾燥し、そして次の手順へ続けた。

（酵素消化：）
以下の試薬を、前段落からのＳａｌＩアダプターを用いて調製したｃＤＮＡに添加し、そして混合物を３７℃で２時間インキュベートした：ＤＥＰＣ処理水（４１μｌ）；ＮｏｔＩ制限緩衝液（ＲＥＡＣＴ，ＬｉｆｅＴｅｃｈ．，５μｌ）、ＮｏｔＩ（４μｌ）。この反応物の最終組成は、以下であった：５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）；１０ｍＭＭｇＣｌ₂；１００ｍＭＮａＣｌ；１，２００Ｕ／ｍｌＮｏｔＩ。

（ｃＤＮＡのゲル単離：）
ｃＤＮＡを、５％アクリルアミドゲルでのアクリルアミドゲル電気泳動によりサイズ分画し、そして分子量マーカーとの比較により決定される、１ｋｂより長いいずれのフラグメントもゲルから切り出した。次いで、ｃＤＮＡを、ゲルから０．１×ＴＢＥ緩衝液（２００μｌ）に電気溶出させ、そしてフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１、２００μｌ）により抽出した。水相を取り出し、収集し、そして１４，０００×ｇで２０分間遠心分離した。上清をＤＮＡペレットから除去し、これを７０％エタノール（０．５ｍｌ）に再懸濁し、そして１４，０００×ｇで２分間、再度遠心分離した。上清を再度捨て、ペレットをスピードバックにおいて乾燥し、そして蒸留水（１５μｌ）に再懸濁した。

（ｃＤＮＡのｐＲＫ５ベクターへの連結：）
以下の試薬を共に添加し、そして１６℃で１６時間インキュベートした：５×Ｔ４リガーゼ緩衝液（３μｌ）；ｐＲＫ５、ＸｈｏＩ、ＮｏｔＩで消化したベクター、０．５μｇ、１μｌ）；前段落から調製したｃＤＮＡ（５μｌ）、および蒸留水（６μｌ）。続いて、さらなる蒸留水（７０μｌ）および１０ｍｇ／ｍｌｔＲＮＡ（０．１μｌ）を添加し、そして全反応物を、フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）により抽出した。水相を取り出し、収集し、そして５ＭＮａＣｌ（１０μｌ）および無水エタノール（−２０℃、２５０μｌ）に希釈した。次いで、これを、１４，０００×ｇで２０分間遠心分離し、デカントし、そしてペレットを７０％エタノール（０．５ｍｌ）に再懸濁し、そして１４，０００×ｇで２分間、再度遠心分離した。次いで、ＤＮＡペレットをスピードバックにおいて乾燥し、そして後の手順における使用のために蒸留水（３μｌ）に溶出した。

（ライブラリー連結物の細菌への形質転換：）
前で調製した連結ｃＤＮＡ／ｐＲＫ５ベクターＤＮＡを氷上で冷却し、これにエレクトロコンピテント（ｅｌｅｃｔｒｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）ＤＨ１０Ｂ細菌（ＬｉｆｅＴｅｃｈ．，２０μｌ）を添加した。次いで、細菌ベクター混合物を、製造者の推奨どおりにエレクトロポレーションした。続いて、ＳＯＣ培地（１ｍｌ）を添加し、そして混合物を、３７℃で３０分間インキュベートした。次いで、形質転換体を、２０個の標準的な、１５０ｍｍアンピシリン含有ＬＢプレートに配置し、そして１６時間（３７℃）インキュベートして、コロニーを増殖させた。次いで、陽性コロニーをこそぎ落とし、そしてＤＮＡを、標準的なＣｓＣｌ勾配プロトコルを用いて細菌ペレットから単離した。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、２．３．１。

（ＦＬＳ１３９のインキュベーション）
ＦＬＳ１３９は、当該分野で公知の任意の標準的な方法（ＫｌｅｉｎＲ．Ｄ．ら（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９３，７１０８−７１１３、およびＪａｃｏｂｓ（１９９６年７月１６日に発行された米国特許第５，５６３，６３７号）により報告された方法を含む）により、ヒト胎児肝臓ライブラリーにおいて同定され得る。Ｋｌｅｉｎら、およびＪａｃｏｂｓによれば、新規の分泌および膜結合哺乳動物タンパク質をコードするｃＤＮＡは、それらの分泌リーダー配列を、リポーター系として酵母インベルターゼ遺伝子を用いて検出することにより同定される。この酵素インベルターゼは、スクロースからグルコースおよびフルクトースへの分解、ならびにラフィノースからスクロースおよびメリビオースへの分解を触媒する。分泌形態のインベルターゼは、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）によるスクロース利用に必要とされ、その結果、分泌型インベルターゼを生成し得ない酵母細胞は、唯一の炭素源およびエネルギー源としてスクロースを含む培地上で十分に増殖しない。ＫｌｅｉｎＲ．Ｄ．、前出、およびＪａｃｏｂｓ、前出の両方は、哺乳動物シグナル配列が、機能的に、酵母インベルターゼのネイティブシグナル配列の代わりになるという既知の能力を利用する。哺乳動物ｃＤＮＡライブラリーを、非分泌型酵母インベルターゼをコードするＤＮＡに連結し、連結されたＤＮＡを単離し、そしてインベルターゼ遺伝子を含まない酵母細胞に形質転換する。哺乳動物シグナル配列に連結した非分泌型酵母インベルターゼ遺伝子を含む組換え体を、炭素源としてスクロースのみまたはラフィノースのみを含む培地上で増殖するそれらの能力に基づいて同定する。次いで、同定された哺乳動物シグナル配列を使用して、第２の完全長ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、対応する分泌型タンパク質をコードする完全長クローンを単離する。

ＦＬＳ１３９のヌクレオチド配列を図１−Ａ（配列番号１６）に示すが、一方、そのアミノ酸配列を図１−Ｂ（配列番号１７）に示す。ＦＬＳ１３９は、２つの既知のヒトＴＩＥ−２レセプターリガンド（ｈ−ＴＩＥ２Ｌ１およびｈ−ＴＩＥ２Ｌ２）と高度の配列相同性を示す、フィブリノーゲン様ドメインを含む。従って、ＦＬＳ１３９は、ＴＩＥリガンドファミリーの新規メンバーとして同定された。

ＦＬＳ１３９クローンは、ブタペスト条約により、１９９７年９月１８日に、ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），１２３０１ＰａｒｋｌａｗｎＤｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ２０８５２に寄託され、そして寄託番号ＡＴＣＣ２０９２８１を与えられている。

（実施例１：ヒトＮＬ１をコードするｃＤＮＡクローンの単離）
ＮＬ１を、コンピュータープログラムＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｈｕｌら、ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ２６６：４６０−４８０（１９９６））を用いて、ＧｅｎＢａｎｋデータベースをスクリーニングすることにより同定した。ＮＬ１配列は、既知の発現配列タグ（ｅｘｐｒｅｓｓｅｄｓｅｑｕｅｎｃｅｔａｇ）（ＥＳＴ）Ｔ３５４４８、Ｔ１１４４２、およびＷ７７８２３との相同性を示す。既知のＥＳＴ配列のいずれも、完全長配列として同定されておらず、ＴＩＥレセプターと結合するリガンドとして記載されてもいない。

その同定の後、ＮＬ１を、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．（ＰａｌｏＡｌｔｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）から購入したｍＲＮＡ、カタログ番号６５２８−１より調製したヒト胎児肺ライブラリーから、製造者の説明書に従ってクローニングした。

このライブラリーをｐＲＫ５Ｂベクターに連結した。ｐＲＫ５Ｂは、ＳｆｉＩ部位を含まない、ｐＲＫ５Ｄの前駆体である；Ｈｏｌｍｅｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５３：１２７８−１２８０（１９９１）を参照のこと。ｐＲＫ５Ｄはまた、ポリリンカー配列内でわずかな違いがある、ｐＲＫ５（ＥＰ３０７，２４７、１９８９年３月１５日公開）の誘導体である。このライブラリーを、ＧｅｎＢａｎｋデータベースにおいて見出されたＥＳＴに基づいて、以下の合成オリゴヌクレオチドプローブ：

とのハイブリダイゼーションによりスクリーニングした。ｃＤＮＡ配列を、完全に配列決定した。

ＮＬ１のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を、それぞれ、図２（配列番号１）および図３（配列番号２）に示す。

ＮＬ１は、ＴＩＥ１リガンドおよびＴＩＥ２リガンド両方と２３％の配列同一性を示す。

ＮＬ１クローンは、ブタペスト条約により、１９９７年９月１８日に、ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），１２３０１ＰａｒｋｌａｗｎＤｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ２０８５２に寄託され、そして寄託番号ＡＴＣＣ２０９２８０を与えられている。

ＮＬ１は、第９染色体、バンドアーム（ｂａｎｄａｒｍ）ｑ１３−ｑ２１にマップされた。

（実施例２：ヒトＮＬ５およびＮＬ８をコードするｃＤＮＡクローンの単離）
発現配列タグ（ＥＳＴ）ＤＮＡデータベース（ＬＩＦＥＳＥＱ^TM，ＩｎｃｙｔｅＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，ＰａｌｏＡｌｔｏ，ＣＡ）を検索し、そして参照実施例１のＦＬＳ１３９タンパク質と相同性を示すＥＳＴを同定した。ＮＬ５およびＮＬ８をクローニングするために、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．（ＰａｌｏＡｌｔｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）から購入したｍＲＮＡ、カタログ番号６５２８−１により調製したヒト胎児肺ライブラリーを、製造者の説明書に従って使用した。このライブラリーを、データベースにおいて見出されたＥＳＴに基づいて、以下の合成オリゴヌクレオチドプローブ：

とのハイブリダイゼーションによりスクリーニングした。ｃＤＮＡクローンを完全に配列決定した。ＮＬ５の全ヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を、図４および５（配列番号３および４）に示す。ＮＬ８の全ヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を、図６および７（配列番号５および６）に示す。

完全長配列のＢＬＡＳＴおよびＦａｓｔＡ配列アラインメント解析（ＡＬＩＧＮプログラムを用いる）に基づいて、ＮＬ５は、ＴＩＥ２レセプターのリガンド１およびリガンド２両方と２４％の配列同一性を示す。ＮＬ８は、ＴＩＥレセプターのリガンド１およびリガンド２両方と２３％の配列同一性を示す。

ＴＩＥリガンド、ＮＬ１、ＮＬ５、およびＮＬ８のフィブリノーゲンドメインは、６４〜７４％同一である。より詳細には、ＮＬ１のフィブリノーゲンドメインは、ＮＬ５のフィブリノーゲンドメインと７４％同一であり、そしてＮＬ８のフィブリノーゲンドメインと６３％同一であるが、一方、ＮＬ５のフィブリノーゲンドメインは、ＮＬ８のフィブリノーゲンドメインと５７％同一である。ＴＩＥ−２レセプターのリガンド１およびリガンド２は６４％同一であり、そしてＮＬ１、ＮＬ５、およびＮＬ８と４０〜４３％同一である。

ＮＬ５は、第１染色体、バンドアームｑ２３に局在した。

ＮＬ８は、第１９染色体、バンドアームｐ１３．３−ｐ１３．２１、ｐ１３．３−ｐ１２．１４、ｐ１３．３−ｐ１２．１５に局在した。

（実施例３：ヒトＮＬ４をコードするｃＤＮＡクローンの単離）
発現配列タグ（ＥＳＴ）ＤＮＡデータベース（ＬＩＦＥＳＥＱ^TM，ＩｎｃｙｔｅＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，ＰａｌｏＡｌｔｏ，ＣＡ）を検索し、そしてヒトＴＩＥ−２Ｌ１およびＴＩＥ−２Ｌ２と相同性を示すＥＳＴ（＃２９３９３４０）を同定した。

ＥＳＴに基づいて、以下のＰＣＲプライマー対（正および逆）ならびにプローブを合成した：

オリゴｄＴプライム（ｐｒｉｍｅｄ）ｃＤＮＡライブラリーを、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤからの試薬およびプロトコル（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＰｌａｓｍｉｄＳｙｓｔｅｍ）を用いて、ベクターｐＲＫ５Ｄ中に、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．（ＰａｌｏＡｌｔｏ，ＣＡ，ＵＳＡ，カタログ番号６５３７−１）より購入した子宮ｍＲＮＡから調製した。ｐＲＫ５Ｄは、ｓｐ６転写開始部位、それに続いてＳｆｉＩ制限酵素部位、次いでＸｈｏＩ／ＮｏｔＩｃＤＮＡクローニング部位を有する、クローニングベクターである。ｃＤＮＡを、ＮｏｔＩ部位を含むオリゴｄＴでプライムし、ＳａｌＩヘミキナーゼ処理（ｈｅｍｉｋｉｎａｓｅｄ）アダプターと平滑で連結し、ＮｏｔＩで切断し、ゲル電気泳動により１０００ｂｐより大きなサイズまで適切に分類し、そしてＸｈｏＩ／ＮｏｔＩ切断ｐＲＫ５Ｄに規定の方向でクローニングした。

完全長クローン供給源としていくつかのライブラリーをスクリーニングするために、このライブラリーに由来するＤＮＡを、上記で同定されたＰＣＲプライマー対を用いてＰＣＲ増幅によりスクリーニングした。次いで、陽性ライブラリーを使用して、プローブオリゴヌクレオチドおよびＰＣＲプライマーの１つを用いて、ＮＬ４遺伝子をコードするクローンを単離した。

上記のように単離されたクローンのＤＮＡ配列決定により、ＮＬ４の完全長ＤＮＡ配列および由来するタンパク質配列が得られた。

ＮＬ４の全ヌクレオチド配列を、図１３（配列番号１８）に示す。クローンＤＮＡ４７４７０は、ヌクレオチド位置２１５〜２１７に明らかな翻訳開始部位を有する単一オープンリーディングフレームを含む（図１３、ここでＡＴＧ開始コドンに下線を付す）。図１３において、ヌクレオチド位置１０３９〜１０４１のＴＡＡ停止コドンを四角で囲んだ。推定ポリペプチドは、３４６アミノ酸長である。クローンＤＮＡ４７４７０はＡＴＣＣに寄託され、そしてＡＴＣＣ寄託番号２０９４２２を与えられた。

完全長配列のＢＬＡＳＴおよびＦａｓｔＡ配列アラインメント解析に基づいて、ＮＬ４は、ＴＩＥ２Ｌ１（３２％）およびＴＩＥ２Ｌ２（３４％）とアミノ酸同一性を示す。

（実施例４：ノザンブロットおよびインサイチュＲＮＡハイブリダイゼーション分析）
ヒト組織におけるＮＬ１およびＮＬ５ｍＲＮＡの発現を、ノザンブロット分析により調べた。ヒトｍＲＮＡブロットを、完全長ｃＤＮＡに基づく³²Ｐ標識ＤＮＡプローブにハイブリダイズした；このプローブを、ｃＤＮＡ挿入物を消化および精製することにより作製した。ヒト胎児ＲＮＡブロットＭＴＮ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）およびヒト成人ＲＮＡブロットＭＴＮ−ＩＩ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を、ＤＮＡプローブとインキュベートした。ブロットを、ハイブリダイゼーション緩衝液（５×ＳＳＰＥ；２デンハルト液；１００ｍｇ／ｍＬ変性剪断サケ精子ＤＮＡ；５０％ホルムアミド；２％ＳＤＳ）中でプローブと、４２℃で６０時間インキュベートした。ブロットを、２×ＳＳＣ；０．０５％ＳＤＳで室温１時間、数回洗浄し、それに続いて０．１×ＳＳＣ；０．１％ＳＤＳで、５０℃で３０分間洗浄した。ブロットを、ホスホルイメージャー解析（ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒａｎａｌｙｓｉｓ）（Ｆｕｊｉ）による一晩曝露の後に現像した。

図１１および１２に示すように、ＮＬ１およびＮＬ５ｍＲＮＡ転写物を検出した。強いＮＬ１ｍＲＮＡ発現を、心臓および骨格筋組織において、ならびに膵臓において検出した。ＮＬ５ｍＲＮＡは、骨格筋において強く発現し、そしてより少ない程度で、心臓、胎盤、および膵臓において発現した。

また、ＮＬ１、ＮＬ５、ＮＬ８、およびＮＬ４の組織発現パターンを、ＰＣＲにより作製した³³Ｐ標識リボプローブを使用する最適化プロトコルを用いて、インサイチュハイブリダイゼーションにより決定した（細胞性ＲＮＡへのハイブリダイゼーションを観察する）。（ＬｕおよびＧｉｌｌｅｔｔ，ＣｅｌｌＶｉｓｉｏｎ１：１６９−１７６（１９９４））。ホルマリンで固定され、パラフィンに包埋されたヒト胎児および成人組織を切片にし、脱パラフィンし、そしてプロテイナーゼＫ（２０ｇ／ｍｌ）中で、３７℃で１５分間タンパク質除去し、そしてＬｕおよびＧｉｌｌｅｔｔ（１９９４）により記載されたようにインサイチュハイブリダイゼーションのためにさらに処理した。［³³Ｐ］ＵＴＰ標識アンチセンスリボプローブをＰＣＲ産物から作製し、そして５５℃で一晩ハイブリダイズした。スライドを、ＫｏｄａｋＮＴＢ２核追跡（ｎｕｃｌｅａｒｔｒａｃｋ）エマルジョンに浸し、そして４週間暴露した。

（³³Ｐ−リボプローブ合成）
６．０μｌ（１２５ｍＣｉ）の³³Ｐ−ＵＴＰ（ＡｍｅｒｓｈａｍＢＦ１００２，ＳＡ＜２０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）をスピードバック乾燥した。乾燥³³Ｐ−ＵＴＰを含む各々のチューブに、以下の成分を添加した：２．０μｌ５×転写緩衝液１．０μｌＤＴＴ（１００ｍＭ）
２．０μｌＮＴＰ混合物（２．５ｍＭ：１０μ：各１０ｍＭＧＴＰ、ＣＴＰ、およびＡＴＰ＋１０μｌＨ₂Ｏ）
１．０μｌＵＴＰ（５０μＭ）
１．０μｌＲｎａｓｉｎ１．０μｌＤＮＡ鋳型（１μｇ）
１．０μｌＨ₂Ｏ１．０μｌＲＮＡポリメラーゼ（ＰＣＲ産物についてはＴ３＝ＡＳ、通常、Ｔ７＝Ｓ）。

チューブを３７℃で１時間インキュベートした。１．０μｌのＲＱ１ＤＮａｓｅを添加し、それに続いて３７℃で１５分間インキュベートを行った。９０μｌのＴＥ（１０ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ７．６）／１ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ８．０））を添加し、そして混合物をＤＥ８１紙の上にピペットで移した。残っている溶液を、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ−５０限外濾過ユニットにロードし、そしてプログラム１０（６分）を用いてスピンをかけた。濾過ユニットを、２番目の上に逆さまにし、そしてプログラム２（３分）を用いてスピンをかけた。最後の回収スピンの後、１００μｌのＴＥを添加した。１μｌの最終産物をＤＥ８１紙の上にピペットで移し、そして６ｍｌのＢｉｏｆｌｕｏｒＩＩでカウントした。

プローブをＴＢＥ／尿素ゲルにおいて流した。１〜３μｌのプローブまたは５μｌのＲＮＡＭｒｋＩＩＩを、３μｌのローディング緩衝液に添加した。９５℃ヒートブロック上で３分間の加熱後、ゲルを直ぐに氷上に置いた。ゲルのウェルをフラッシュし、サンプルをロードし、そして１８０〜２５０ボルトで４５分間流した。ゲルをサランラップでくるみ、そして−７０℃フリーザー内で、１時間〜一晩、増強スクリーンと共にＸＡＲフィルムに曝露した。

（³³Ｐハイブリダイゼーション）
（凍結切片の前処理）スライドをフリーザーから取り出し、アルミニウムトレー上に置き、そして室温で５分間解凍した。トレーを５５℃のインキュベーターに５分間入れて、曇りを減少させた。スライドを、換気装置（ｆｕｍｅｈｏｏｄ）内で、氷上で、４％パラホルムアルデヒド中で１０分間固定し、そして０．５×ＳＳＣで、室温で５分間洗浄した（２５ｍｌ２０×ＳＳＣ＋９７５ｍｌＳＱＨ₂Ｏ）。０．５μｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ中で３７℃１０分のタンパク質除去（予め温めたＲＮａｓｅを含まないＲＮＡｓｅ緩衝液２５０ｍｌ中、１２．５μｌの１０ｍｇ／ｍｌストック）の後、切片を、０．５×ＳＳＣで、室温で１０分間洗浄した。切片を、７０％、９５％、１００％エタノール中で各々２分間脱水した。

（パラフィン包埋切片の前処理）スライドを脱パラフィンし、ＳＱＨ₂Ｏ中に置き、そして２×ＳＳＣで、室温で２回各時５分間リンスした。この切片を、ヒト胚−２０μｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ（ＲＮａｓｅを含まないＲＮａｓｅ緩衝液２５０ｍｌ中、５００μｌの１０ｍｇ／ｍｌ；３７℃、１５分）、またはホルマリン組織−８×プロテイナーゼＫ（ＲＮａｓｅ緩衝液２５０ｍｌ中、１００μｌ；３７℃、３０分）中でタンパク質除去した。その後の０．５×ＳＳＣでのリンスおよび脱水を、上記のように行った。

（プレハイブリダイゼーション）スライドを、Ｂｏｘ緩衝液（４×ＳＳＣ、５０％ホルムアミド）に浸した濾紙が並んだプラスチックの箱の中に置いた。組織を、５０μｌのハイブリダイゼーション緩衝液（３．７５ｇデキストラン硫酸＋６ｍｌＳＱＨ₂Ｏ）で覆い、ボルテックスし、そして蓋を緩めてマイクロ波で２分間加熱した。氷上で冷却した後、１８．７５ｍｌのホルムアミド、３．７５ｍｌの２０×ＳＳＣ、および９ｍｌのＳＱＨ₂Ｏを添加し、組織を十分にボルテックスし、そして４２℃で１〜４時間インキュベートした。

（ハイブリダイゼーション）スライド１枚あたり１．０×１０⁶ｃｐｍのプローブおよび１．０μｌのｔＲＮＡ（５０ｍｇ／ｍｌストック）を、９５℃で３分間加熱した。スライドを氷上で冷却し、そしてスライドあたり４８μｌのハイブリダイゼーション緩衝液を添加した。ボルテックスした後、５０μｌの³³Ｐ混合物を、５０μｌのプレハイブリダイゼーションスライドに添加した。スライドを、５５℃で一晩インキュベートした。

（洗浄）洗浄を、２×ＳＳＣ、ＥＤＴＡを用いて室温で、２×１０分で行い（４００ｍｌ２０×ＳＳＣ＋１６ｍｌ０．２５ＭＥＤＴＡ、Ｖ_f＝４Ｌ）、それに続いてＲＮａｓｅＡ処理を３７℃で３０分間行った（ＲＮａｓｅ緩衝液２５０ｍｌ中、５００μｌの１０ｍｇ／ｍｌ＝２０μｇ／ｍｌ）。スライドを、２×ＳＳＣ、ＥＤＴＡを用いて室温、２×１０分で洗浄した。ストリンジェンシーな洗浄条件は以下の通りであった：５５℃で２時間、０．１×ＳＳＣ、ＥＤＴＡ（２０ｍｌの２０×ＳＳＣ＋１６ｍｌのＥＤＴＡ、Ｖ_f＝４Ｌ）。

（オリゴ：）

インサイチュハイブリダイゼーションにより、ＮＬ１が、発生中の長骨の軟骨において、および分化している骨芽細胞に隣接する骨膜において発現することが示される。発現はまた、腱において、関節部位での結合組織において、結合組織の中隔において、および胎児体腔（ｂｏｄｙｗａｌｌ）の骨膜において観察された（図８−Ａおよび８−Ｂ）。

インサイチュハイブリダイゼーションにより、良性乳房上皮上の成人ヒト乳ガン細胞、アポクリン化生領域、および硬化性腺疾患におけるＮＬ５ｍＲＮＡ発現が示された。発現は、浸潤性乳腺管ガン腫細胞上でさらに観察された。胎児下肢組織において、軟骨内骨形成部位で、骨細胞において、および発生中の骨の骨膜／軟骨膜において高い発現が見出された。ＮＬ５ｍＲＮＡはまた、および胎児の体腔組織である発生中の骨の骨膜／軟骨膜の骨細胞において高度に発現した。この分布は、骨形成および分化における役割を示唆する（図９−Ａおよび９−Ｂ）。

ＮＬ８についてのインサイチュハイブリダイゼーションにより、発生中の四肢、腸、および体腔において高度に組織化された発現パターンが示され、これは、この部位での特有で機能的な役割、ならびに脈管形成およびパターン形成（ｐａｔｔｅｒｎｉｎｇ）における潜在的な関与を示唆する（図１０−Ａおよび１０−Ｂ）。この発現パターンは、ＮＬ１およびＮＬ５のものとは異なる。

ＮＬ４についてのインサイチュハイブリダイゼーションにより、アカゲザル脳の深部白質内の小血管上での明らかな発現が示された。

（実施例５：Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＮＬ１、ＮＬ５、ＮＬ８、およびＮＬ４の発現）
本実施例は、Ｅ．ｃｏｌｉにおける本発明のＴＩＥリガンドの非グリコシル化形態の調製を例示する。ＮＬ１、ＮＬ５、ＮＬ８、またはＮＬ４リガンドをコードするＤＮＡ配列（それぞれ、配列番号１、３、５および１８）を、選択したＰＣＲプライマーを用いて最初に増幅した。このプライマーは、選択した発現ベクター上の制限酵素部位と一致する制限酵素部位を含むべきである。種々の発現ベクターが使用され得る。ベクターは、好ましくは、抗生物質耐性遺伝子、複製起点、プロモーター、およびリボザイム結合部位をコードする。適切なベクターの例は、アンピシリンおよびテトラサイクリン耐性のための遺伝子を含む、ｐＢＲ３２２（Ｅ．ｃｏｌｉ由来；Ｂｏｌｉｖａｒら、Ｇｅｎｅ２：９５（１９７７）を参照のこと）である。ベクターを制限酵素で消化し、そして脱リン酸化する。次いで、ＰＣＲ増幅配列をベクターに連結する。

次いで、連結混合物を使用して、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出に記載の方法を用いて、選択したＥ．ｃｏｌｉ株を形質転換する。形質転換体を、ＬＢプレート上で増殖するそれらの能力により同定し、次いで、抗生物質耐性コロニーを選択する。プラスミドＤＮＡを単離し、そして制限分析により確認し得る。

選択したクローンを、液体培養培地（例えば、抗生物質を補充したｌＢブロス）中で一晩増殖し得る。続いて、一晩培養物を使用して、大規模（ｌａｔｅｒｓｃａｌｅ）培養物に接種し得る。次いで、細胞を、所望の光学密度まで増殖させる。誘導物質（例えば、ＩＰＴＧ）を添加し得る。

数時間以上細胞を培養した後、細胞を、遠心分離により採集し得る。遠心分離により得た細胞ペレットを、当該分野で公知の種々の薬剤を用いて可溶化し得、次いで、可溶化タンパク質を、タンパク質のしっかりとした結合を可能にする条件下で、金属キレート化カラムを用いて精製し得る。

（実施例６：哺乳動物細胞におけるＮＬ１、ＮＬ５、ＮＬ８、およびＮＬ４の発現）
本実施例は、哺乳動物細胞における組換え発現による、ＮＬ１、ＮＬ５、ＮＬ８、およびＮＬ４ＴＩＥリガンドホモログのグリコシル化形態の調製を例示する。

ベクター、ｐＲＫ５（１９８９年３月１５日に公開されたＥＰ３０７，２４７を参照のこと）を、発現ベクターとして使用する。必要に応じて、ＮＬ１、ＮＬ５、ＮＬ８、またはＮＬ４ＤＮＡを、連結方法（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出に記載）を用いて、ＮＬ１、ＮＬ５、ＮＬ８、およびＮＬ４ＤＮＡの挿入を可能にする、選択した制限酵素でｐＲＫ５に連結する。得られたベクターを、それぞれ、ｐＲＫ５−ＮＬ１、ＮＬ５、ＮＬ８、およびＮＬ４と呼ぶ。

１つの実施態様において、選択した宿主細胞は２９３細胞であり得る。ヒト２９３細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ１５７３）を、培地（例えば、ウシ胎仔血清、必要に応じて栄養成分および／または抗生物質を補充したＤＭＥＭ）中で組織培養プレートにおいてコンフルエンスまで増殖させる。約１０μｇのｐＲＫ５−ＮＬ１、ＮＬ５、ＮＬ４、またはＮＬ８ＤＮＡを、約１μｇのＶＡＲＮＡ遺伝子をコードするＤＮＡ（Ｔｈｉｍｍａｐｐａｙａら、Ｃｅｌｌ，３１：５４３（１９８２））と混合し、そして５００μｌの１ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１ｍＭＥＤＴＡ、０．２２７ＭＣａＣｌ₂に溶解する。この混合物に、５００μｌの５０ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３５）、２８０ｍＭＮａＣｌ、１．５ｍＭＮａＰＯ₄を滴下し、そして沈殿物を、２５℃で１０分間形成させる。沈殿物を再懸濁し、そして２９３細胞に添加し、そして３７℃で約４時間放置する。培養培地を吸引し、そしてＰＢＳ中２０％のグリセロール２ｍｌを３０秒間添加する。次いで、２９３細胞を無血清培地で洗浄し、新鮮な培地を添加し、そして細胞を約５日間インキュベートする。

トランスフェクションの約２４時間後、培養培地を除去し、そして培養培地（単独）、または２００μＣｉ／ｍｌ、³⁵Ｓ−システインおよび２００μＣｉ／ｍｌ、³⁵Ｓ−メチオニンを含む培養培地で置換する。１２時間のインキュベーション後、馴化培地を収集し、スピンフィルター上で濃縮し、そして１５％ＳＤＳゲル上にロードする。処理したゲルを乾燥し、そして選択した期間、フィルムに暴露して、ＮＬ１、ＮＬ５、およびＮＬ８ポリペプチドの存在を明らかにし得る。トランスフェクト細胞を含む培養物は、さらなるインキュベーション（無血清培地中で）を受け得、そして培地を、選択されたバイオアッセイで試験する。

代替の技術において、Ｓｏｍｐａｒｙｒａｃら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１２：７５７５（１９８１）により記載されたデキストラン硫酸法を用いて、ＮＬ１、ＮＬ５、ＮＬ８、またはＮＬ４ＤＮＡを、２９３細胞に一過的に導入し得る。２９３細胞を、スピナーフラスコ中で最大密度まで増殖させ、そして７００μｇのｐＲＫ５−ＮＬ１、ＮＬ５、ＮＬ８、またはＮＬ４ＤＮＡを添加する。細胞を、最初に、遠心分離によりスピナーフラスコから濃縮し、そしてＰＢＳで洗浄する。ＤＮＡ−デキストラン沈殿物を、細胞ペレット上で４時間インキュベートする。細胞を、２０％グリセロールで９０秒間処理し、組織培養培地で洗浄し、そして組織培養培地、５μｇ／ｍｌウシインシュリン、および０．１μｇ／ｍｌウシトランスフェリンを含むスピナーフラスコに再導入する。約４日後、馴化培地を遠心分離し、そして濾過して細胞および破片を除去する。次いで、発現ＮＬ１、ＮＬ５、ＮＬ８、またはＮＬ４を含むサンプルを濃縮し、そして任意の選択した方法（例えば、透析および／またはカラムクロマトグラフィー）により精製し得る。

別の実施態様において、ＮＬ１、ＮＬ５、ＮＬ８、またはＮＬ４を、ＣＨＯ細胞において発現し得る。ｐＲＫ５−ＮＬ１、ＮＬ５、ＮＬ８、またはＮＬ４を、既知の試薬（例えば、ＣａＰＯ₄またはＤＥＡＥ−デキストラン）を用いて、ＣＨＯ細胞にトランスフェクトし得る。上記のように、細胞培養物をインキュベートし、そして培地を、培養培地（単独）または放射性標識（例えば、³⁵Ｓ−メチオニン）を含む培養培地で置換し得る。発現ポリペプチドの存在を決定した後、培養培地を無血清培地で置換し得る。好ましくは、培養物を約６日間インキュベートし、次いで、馴化培地を回収する。次いで、発現ＮＬ１、ＮＬ５、ＮＬ８、またはＮＬ４を含む培地を濃縮し、そして任意の選択した方法により精製し得る。

エピトープタグ化ＮＬ１、ＮＬ５、ＮＬ８、またはＮＬ４もまた、宿主ＣＨＯ細胞において発現され得る。ＮＬ１、ＮＬ５、ＮＬ８、またはＮＬ４ＤＮＡを、ｐＲＫ５ベクターからサブクローニングし得る。サブクローン挿入物は、バキュロウイルス発現ベクターに、選択したエピトープタグ（例えば、ポリ−ｈｉｓタグ）とインフレームで融合するためにＰＣＲを受け得る。次いで、ポリ−ｈｉｓタグ化ＮＬ１、ＮＬ５、ＮＬ８、またはＮＬ４挿入物を、安定クローンの選択のための選択マーカー（例えば、ＤＨＦＲ）を含むＳＶ４０駆動ベクターにサブクローニングし得る。最後に、ＣＨＯ細胞を、ＳＶ４０駆動ベクターで（上記のように）トランスフェクトし得る。標識を上記のように行って、発現を確かめ得る。次いで、発現ポリ−Ｈｉｓタグ化ＮＬ１、ＮＬ５、ＮＬ８、またはＮＬ４を含む培養培地を濃縮し、そして任意の選択した方法（例えば、Ｎｉ²⁺キレートアフィニティークロマトグラフィー）により精製し得る。

ＮＬ１、ＮＬ５、およびＮＬ８のグリコシル化形態を、実際に哺乳動物細胞において発現した。ＮＬ１を、ＩｇＧ構築物（ＮＬ１−ＩｇＧ免疫接着（ｉｍｍｕｎｏａｄｈｅｓｉｏｎ））として発現し、ここでＮＬ１タンパク質細胞外領域を、ヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメインを含むＩｇＧ１定常領域配列に融合した。ＮＬ５およびＮＬ８を、ポリ−Ｈｉｓタグ化形態で発現した。

ＰＣＲ増幅後、ＮＬ１ＤＮＡを、Ａｕｓｕｂｅｌら、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，Ｕｎｉｔ３．１６，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙａｎｄＳｏｎｓ（１９９７）に記載のような標準的な技術を用いて、ＣＨＯ発現ベクターにサブクローニングした。ＣＨＯ発現ベクターを、目的のＤＮＡの５’および３’に適合制限性の部位を有して簡便なｃＤＮＡシャトリング（ｓｈｕｔｔｌｉｎｇ）を可能にするように構築する。ＣＨＯ細胞におけるＮＬ１発現のために使用されるベクターは、Ｌｕｃａｓら、Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．２４：９（１７７４−１７７９（１９９６）に記載の通りであり、そして目的のｃＤＮＡの発現を駆動するためにＳＶ４０初期プロモーター／エンハンサーおよびジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）を使用する。ＤＨＦＲ発現は、トランスフェクション後のプラスミドの安定維持のための選択を可能にする。

１２マイクログラムのＮＬ１コードプラスミドＤＮＡを、市販のトランスフェクション試薬Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ（登録商標）（Ｑｉａｇｅｎ），Ｄｏｓｐｅｒ（登録商標）、またはＦｕｇｅｎｅ（登録商標）（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ）を用いて、約１０００万個のＣＨＯ細胞に導入した。細胞を、Ｌｕｃａｓら、前出に記載のように増殖させた。約３×１０^-7個の細胞を、以下に記載のようなさらなる増殖および生成のためにアンプル中で凍結した。

ＮＬ１プラスミドＤＮＡを含むアンプルを、水浴に入れることにより解凍し、そしてボルテックスにより混合した。内容物を、１０ｍＬの培地を含む遠心管にピペットで移し、そして１０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上清を吸引し、そして細胞を、１０ｍＬの選択培地（５％０．２μｍダイアフィルトレーションしたウシ胎仔血清を含む０．２μｍ濾過ＰＳ２０）に再懸濁した。次いで、細胞を、９０ｍＬの選択培地を含む１００ｍＬスピナーにアリコートした。１〜２日後、細胞を、１５０ｍＬの選択増殖培地で満たした２５０ｍＬスピナーに移し、そして３７℃でインキュベートした。さらに２〜３日後、２５０ｍＬ、５００ｍＬ、および２０００ｍＬスピナーに３×１０⁵個細胞／ｍＬを播種した。培地を、遠心分離および生成培地中への再懸濁により新鮮な培地と交換した。任意の適切なＣＨＯ培地（例えば、１９９２年６月１６日に発行された、米国特許第５，１２２，４６９号に記載の培地）を、使用し得る。３Ｌ生成スピナーに、１．２×１０⁶個細胞／ｍＬで播種した。０日目に、細胞数およびｐＨを測定した。
１日目に、スピナーをサンプリングし、そして濾過空気の散布を開始した。２日目に、スピナーをサンプリングし、温度を３３℃に変え、そして３０ｍＬの５００ｇ／Ｌ−グルコースおよび０．６ｍＬの１０％消泡剤（例えば、３５％ポリジメチルシロキサンエマルジョン、ＤｏｗＣｏｒｎｉｎｇ３６５ＭｅｄｉｃａｌＧｒａｄｅＥｍｕｌｓｉｏｎ）を添加した。生成の間、ｐＨを、約７．２で保持するために必要なように調節した。１０日後、または生存率が７０％未満に下がるまで、遠心分離により細胞培養物を採集し、そして０．２２μｍフィルターに通して濾過した。濾過物を、精製カラムへのローディングまで４℃で貯蔵した。

ＮＬ１−ＩｇＧ免疫接着を、以下の通りに馴化培地から精製した。馴化培地を、２０ｍＭリン酸Ｎａ緩衝液（ｐＨ６．８）で平衡化した５ｍｌプロテインＡカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にポンプで注入した。ローディング後、１００ｍＭクエン酸（ｐＨ３．５）での溶出前に、カラムを平衡化緩衝液で大量に洗浄した。溶出タンパク質を、２７５μＬの１ＭＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ９）を含むチューブに１ｍｌ画分を収集することにより直ぐに中和した。続いて、高度に精製されたタンパク質を、１０ｍＭＨｅｐｅｓ、０．１４ＭＮａＣｌ、および４％マンニトールを含む貯蔵緩衝液（ｐＨ６．８）中で、２５ｍｌＧ２５Ｓｕｐｅｒｆｉｎｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラムを用いて脱塩し、そして−８０℃で貯蔵した。

精製ＮＬ１−ＩｇＧタンパク質の均質性を、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＥＧ）により確かめ、そしてＮ末端アミノ酸配列決定をエドマン分解により行った。このタンパク質は、約３７〜３８ｋＤの分子量を有することが見出された。

ＮＬ５およびＮＬ８の発現を、本質的に本明細書中上文に記載のように行った。これらのポリＨｉｓタグ化構築物については、精製を、Ｎｉ−ＮＴＡカラム（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて行った。精製前に、イミダゾールを、５ｍＭの濃度まで馴化培地に添加した。馴化培地を、流速４〜５ｍｌ／分、４℃で、０．３ＭＮａＣｌおよび５ｍＭイミダゾールを含む２０ｍＭＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）緩衝液で平衡化した６ｍｌＮｉ−ＮＴＡカラムにポンプで注入した。ローディング後、カラムをさらなる平衡化緩衝液で洗浄し、そしてタンパク質を、０．２５Ｍイミダゾールを含む平衡化緩衝液で溶出した。続いて、精製タンパク質を、１０ｍＭＨｅｐｅｓ、０．１４ＭＮａＣｌ、および４％マンニトールを含む貯蔵緩衝液（ｐＨ６．８）中で、２５ｍｌＧ２５Ｓｕｐｅｒｆｉｎｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラムを用いて脱塩し、そして−８０℃で貯蔵した。

精製タンパク質の均質性をＳＤＳ−ＰＥＧにより確かめ、そしてＮ末端アミノ酸配列決定をエドマン分解により行った。

（実施例７：酵母におけるＮＬ１、ＮＬ５、ＮＬ８およびＮＬ４の発現）
まず、ＮＬ１、ＮＬ５、ＮＬ８またはＮＬ４の細胞内産生または分泌のために、酵母発現ベクターを、ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーターから構築する。ＮＬ１、ＮＬ５、ＮＬ８またはＮＬ４をコードするＤＮＡ、選ばれたシグナルペプチドおよびプロモーターを、ＮＬ１、ＮＬ５、ＮＬ８またはＮＬ４の細胞内発現を指示するために、選ばれたプラスミド中の適切な制限酵素部位に挿入する。分泌に関しては、ＮＬ１、ＮＬ５、ＮＬ８またはＮＬ４の発現のための、ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーターをコードするＤＮＡ、酵母α因子分泌シグナル／リーダー配列、およびリンカー配列（もし必要なら）と共に、ＮＬ１、ＮＬ５、ＮＬ８またはＮＬ４をコードするＤＮＡを、選ばれたプラスミドにクローニングし得る。

酵母株ＡＢ１１０のような酵母細胞を、上記で述べられたような発現プラスミドで形質転換し、選ばれた発酵培地中で培養し得る。形質転換した酵母の上清を、１０％トリクロロ酢酸を用いた沈殿およびＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分離によって、次にゲルをクマシーブルー染料で染色することによって分析し得る。

次に、組換えＮＬ１、ＮＬ５、ＮＬ８およびＮＬ４を、遠心分離によって酵母細胞を発酵培地から除去すること、次に選ばれたカートリッジフィルターを用いてその培地を濃縮することによって、単離および精製し得る。ＮＬ１、ＮＬ５、ＮＬ８またはＮＬ４を含む濃縮液を、選ばれたカラムクロマトグラフィー樹脂を用いて、さらに精製し得る。

（実施例８：バキュロウイルス発現系におけるＮＬ１、ＮＬ２、ＮＬ８およびＮＬ４の発現）
次の方法はバキュロウイルス発現系におけるＮＬ１、ＮＬ５、ＮＬ８またはＮＬ４の組換え発現について述べる。

ＮＬ１、ＮＬ５、ＮＬ８またはＮＬ４を、バキュロウイルス発現ベクターと、含まれるエピトープタグの上流に融合する。そのようなエピトープタグはポリヒスチジンタグおよび免疫グロブリンタグ（ＩｇＧのＦｃ領域のような）を含む。ｐＶＬ１３９３（Ｎｏｖａｇｅｎ）のような、市販のプラスミド由来のプラスミドを含む、様々なプラスミドを利用し得る。簡単には、ＮＬ１、ＮＬ５、ＮＬ８またはＮＬ４をコードするＤＮＡ、またはＮＬ１、ＮＬ５、ＮＬ８またはＮＬ４の望ましい部分（膜貫通タンパク質の細胞外領域をコードする配列のような）を、５’および３’領域に相補的なプライマーを用いてＰＣＲで増幅する。５’プライマーを隣接する（選ばれた）制限酵素部位に組み込むことができる。産生物を次にそれらの選ばれた制限酵素で消化して、発現ベクターにサブクローニングする。

組換えバキュロウイルスを、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（「Ｓｆ９」）細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ１７１１）に、リポフェクチン（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬから市販）を用いて、上記のプラスミドおよびＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ^TMウイルスＤＮＡ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を同時にトランスフェクトすることによって産生する。２８℃で４−５日間インキュベートした後、放出されたウイルスを回収してさらに増幅するために使用する。ウイルス感染およびタンパク質の発現を、Ｏ’Ｒｅｉｌｌｅｙら、Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｓ：ＡｌａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、Ｏｘｆｏｒｄ：ＯｘｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ（１９９４）によって述べられたように、実施する。

次に、発現したポリヒスチジンタグのついたＮＬ１、ＮＬ５、ＮＬ８またはＮＬ４を、例えばＮｉ²⁺キレートアフィニティークロマトグラフィーによって、次のように精製し得る。Ｒｕｐｅｒｔら、Ｎａｔｕｒｅ、３６２：１７５−１７９（１９９３）によって述べられたように、組換えウイルスが感染したＳｆ９細胞から抽出物を調製する。簡単には、Ｓｆ９細胞を洗浄し、超音波処理緩衝液（２５ｍＬＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．９；１２．５ｍＭＭｇＣｌ₂；０．１ｍＭＥＤＴＡ；１０％グリセロール；０．１％ＮＰ−４０；０．４ＭＫＣｌ）に再懸濁し、氷上で２０秒間、２回超音波処理する。超音波処理したものを遠心分離により透明にし、上清をローディング緩衝液（５０ｍＭリン酸、３００ｍＭＮａＣｌ、１０％グリセロール、ｐＨ７．８）で５０倍に希釈し、０．４５μｍのフィルターで濾過する。Ｎｉ²⁺−ＮＴＡアガロースカラム（Ｑｉａｇｅｎから市販）を床容積５ｍＬで調製し、２５ｍＬの水で洗浄して２５ｍＬのローディング緩衝液で平衡化する。濾過した細胞抽出液を１分あたり０．５ｍＬカラムにロードする。カラムをＡ₂₈₀のベースラインになるまでローディング緩衝液で洗浄し、その時点から画分の回収を開始する。次に、非特異的に結合したタンパク質を溶出する２番目の洗浄緩衝液（５０ｍＭリン酸；３００ｍＭＮａＣｌ、１０％グリセロール、ｐＨ６．０）でカラムを洗浄する。再びＡ₂₈₀のベースラインに達した後、２番目の洗浄緩衝液中、０から５００ｍＭまでのイミダゾールの勾配でカラムを展開する。１ｍＬの画分を回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび、銀染色またはアルカリホスファターゼに結合したＮｉ²⁺−ＮＴＡを用いたウエスタンブロット（Ｑｉａｇｅｎ）によって分析する。溶出されたヒスチジン₁₀タグのついたＮＬ１、ＮＬ５およびＮＬ８を含む画分をプールし、ローディング緩衝液に対して透析する。

その代わりに、ＩｇＧタグ（またはＦｃタグ）のついたＮＬ１、ＮＬ５およびＮＬ８の精製を、例えばプロテインＡまたはプロテインＧカラムクロマトグラフィーを含む既知のクロマトグラフィー技術を用いて精製し得る。

ＮＬ１、ＮＬ５およびＮＬ８をバキュロウイルスが感染したＳｆ９細胞に発現させた。発現は実際には０．５−２Ｌの規模で実施したが、より大きな（例えば８Ｌ）調製法に簡単に規模を拡大することができる。ＮＬ１を、ＮＬ１タンパク質細胞外領域が、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含むＩｇＧ１の定常領域配列と融合している、ＩｇＧ構築物（ＮＬ１−ＩｇＧイムノアドヘシン）として発現させた。ＮＬ５およびＮＬ８もまたポリヒスチジンタグのついた形で発現させた。

それぞれのコード配列のＰＣＲ増幅物を、バキュロウイルス発現ベクター（ＩｇＧ融合物にはｐｂ．ＰＨ．ＩｇＧ、およびポリヒスチジンタグのついたタンパク質にはｐｂ．ＰＨ．Ｈｉｓ．ｃ）にサブクローニングした後、ベクターおよびＢａｃｕｌｏｇｏｌｄ（登録商標）バキュロウイルスＤＮＡ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を１０５Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（「Ｓｆ９」）細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ１７１１）に、リポフェクチン（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）を用いて、同時にトランスフェクトした。ｐｂ．ＰＨ．ＩｇＧおよびｐｂ．ＰＨ．Ｈｉｓは市販のバキュロウイルス発現ベクターｐＶＬ１３９３（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を修飾したものであり、ヒスチジンまたはＦｃタグ配列を含む修飾されたポリリンカー領域を持つ。その細胞を１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を追加したＨｉｎｋ’ｓＴＮＭ−ＦＨ培地中で増殖した。細胞を２８℃で５日間インキュベートした。上清を回収し、次に１０％ＦＢＳを追加したＨｉｎｋ’ｓＴＮＭ−ＦＨ培地中のＳｆ９細胞に、感染多重度（ＭＯＩ）約１０で感染させることにより、最初のウイルス増幅に使用した。細胞を２８℃で３日間インキュベートした。上清を回収し、バキュロウイルス発現ベクターにおけるＮＬ１、ＮＬ５およびＮＬ８構築物の発現を、１ｍｌの上清の、ヒスチジンタグのついたタンパク質については２５ｍＬのＮｉ−ＮＴＡビーズ（ＱＩＡＧＥＮ）、またはＩｇＧタグのついたタンパク質についてはプロテインＡセファロースＣＬ−４Ｂビーズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に対するバッチ結合によって決定し、次にＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析でクマーシーブルー染色によって既知の濃度の標準タンパク質と比較した。

最初のウイルス増幅上清を、ＥＳＦ−９２１培地（ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＳｙｓｔｅｍｓＬＬＣ）中で増殖された、Ｓｆ９細胞のスピナー培養物（５００ｍｌ）への感染に、約０．１のＭＯＩで使用した。細胞を２８℃で３日間インキュベートした。上清を回収し、濾過した。もし必要なら、スピナー培養物での発現が確認できるまで、バッチ結合とＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を繰り返した。

トランスフェクトされた細胞（０．５から３Ｌ）からの馴化培地を、遠心分離によって回収し細胞を除いて、０．２２ミクロンフィルターを通して濾過した。ポリヒスチジンタグのついた構築物については、タンパク質構築物をＮｉ−ＮＴＡカラム（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製した。精製の前に、イミダゾールを馴化培地に５ｍＭの濃度まで加えた。馴化培地を、０．３ＭＮａＣｌおよび５ｍＭイミダゾールを含む２０ｍＭＨｅｐｅｓ緩衝液、ｐＨ７．４で平衡化した６ｍｌのＮｉ−ＮＴＡカラムに、４℃、流速４−５ｍｌ／分で注入した。ロード後、カラムを追加の平衡化緩衝液で洗浄し、タンパク質を０．２５Ｍのイミダゾールを含む平衡化緩衝液で溶出した。高度に精製されたタンパク質を、１０ｍＭＨｅｐｅｓ、０．１４ＭＮａＣｌおよび４％マンニトールを含む、ｐＨ６．８の保存緩衝液に、２５ｍｌのＧ２５Ｓｕｐｅｒｆｉｎｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラムを用いて脱塩し、−８０℃で保存した。

タンパク質のイムノアドヘシン（Ｆｃを含む）構築物を次のように馴化培地から精製した。馴化培地を２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．８で平衡化した５ｍｌのプロテインＡカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に注入した。ロード後、カラムを平衡化緩衝液で徹底的に洗浄し、次に１００ｍＭクエン酸、ｐＨ３．５で溶出した。溶出したタンパク質を、２７５ｍＬの１ＭＴｒｉｓ緩衝液、ｐＨ９を含むチューブに１ｍｌの画分を回収することによって、すぐに中和した。高度に精製されたタンパク質を次に、上記でポリヒスチジンタグのついたタンパク質について述べられたように、保存緩衝液で脱塩した。ＮＬ１、ＮＬ５およびＮＬ８タンパク質の均質性を、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル（ＰＡＧ）電気泳動およびエドマン分解によるＮ末端アミノ酸配列決定によって実証した。

（実施例９：ＮＬ１、ＮＬ２、ＮＬ８またはＮＬ４に結合する抗体の調製）
この実施例はＮＬ１、ＮＬ２、ＮＬ８またはＮＬ４に特異的に結合し得るモノクローナル抗体の調製を説明する。

モノクローナル抗体の産生技術は当該分野において知られており、例えば、Ｇｏｄｉｎｇ、前出において述べられている。利用し得る免疫原は、本発明の精製されたリガンド、そのようなリガンドを含む融合タンパク質、および細胞表面に組換えリガンドを発現した細胞を含む。当業者は過度な実験をせずに免疫原を選択し得る。

Ｂａｌｂ／ｃのようなマウスを完全フロイントアジュバントに乳化した免疫原で免疫し、１−１００μｇの量を皮下または腹腔内に注射する。その代わりに、免疫原をＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント（ＲｉｂｉＩｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｈａｍｉｌｔｏｎ、ＭＴ）に乳化し、動物の後足肉趾内に注射する。免疫されたマウスに、次に１０から１２日後に選ばれたアジュバントに乳化した追加の免疫原で追加免疫する。その後、数週間、マウスを追加の免疫注射で追加免疫もし得る。抗体を検出するＥＬＩＳＡアッセイを実施するために、血清試料を定期的にマウスから眼窩後方の出血によって採取し得る。

適切な抗体力価を検出した後、抗体「陽性」の動物に、所定のリガンドを最終的に静脈内注射し得る。３日から４日後、マウスを屠殺し、脾臓細胞を回収する。次に脾臓細胞を、ＡＴＣＣ、Ｎｏ．ＣＲＬ１５９７より入手可能なＰ３Ｘ６３ＡｇＵ．１のような選ばれたマウスミエローマ細胞株と融合する（３５％ポリエチレングリコールを用いて）。融合したものはハイブリドーマ細胞を産生し、次にこれを、融合していない細胞、ミエローマハイブリッド、および脾臓細胞ハイブリッドの増殖を阻害するために、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジン）培地を含む９６ウェル組織培養プレートにプレートし得る。

ハイブリドーマ細胞を、抗原に対する反応性についてＥＬＩＳＡでスクリーニングする。本明細書中のＴＩＥリガンドホモログに対する望ましいモノクローナル抗体を分泌する「陽性」ハイブリドーマ細胞の決定は当業者に同知である。

抗ＴＩＥリガンドホモログモノクローナル抗体を含む腹水を産生するために、陽性ハイブリドーマ細胞を同系Ｂａｌｂ／ｃマウスの腹腔内に注射し得る。その代わりに、ハイブリドーマ細胞を組織培養フラスコまたはローラーボトル中で増殖させ得る。腹水中で産生されたモノクローナル抗体の精製を、硫酸アンモニウム沈殿、次にゲル排除クロマトグラフィーを用いて達成し得る。その代わりに、抗体のプロテインＡまたはプロテインＧへの結合に基づくアフィニティークロマトグラフィーを利用し得る。

（実施例１０：ＶＥＧＦ刺激による内皮細胞増殖の阻害）
ウシ副腎皮質毛細管内皮（ＡＣＥ）細胞（初代培養から最大１２−１４継代）を、９６ウェルマイクロタイタープレート（ＡｍｅｒｓｈａｍＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ）で、１００μＬあたり５００個の細胞／ウェルの密度で、３ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦを追加した低グルコースＤＭＥＭ、１０％仔ウシ血清、２ｍＭグルタミン、１×ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐｔおよびファンギゾン中にプレートした。コントロールを同じ方法でプレートしたが、いくつかはＶＥＧＦを含まなかった。ＮＬ８ポリペプチドのテスト試料を１００μｌ容量で加えて、最終的な容積を２００ｍｃＬ容量とした。細胞を３７℃で６−７日間インキュベートした。培地を吸引し、細胞をＰＢＳで１回洗浄した。酸性ホスファターゼ反応混合物（１００μＬ、０．１Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．５、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−１００、１０ｍＭｐ−ニトロフェニルリン酸）を加えた。３７℃で２時間インキュベートした後、１０ｍｃＬの１ＮＮａＯＨを加えて反応を止めた。マイクロタイタープレートリーダーで４０５ｎｍの光学密度を測定した。コントロールは細胞なし、細胞のみ、細胞＋ＦＧＦ（５ｎｇ／ｍＬ）、細胞＋ＶＥＧＦ（３ｎｇ／ｍＬ）、細胞＋ＶＥＧＦ（３ｎｇ／ｍｌ）＋ＴＧＦ−β（１ｎｇ／ｍｌ）、および細胞＋ＶＥＧＦ（３ｎｇ／ｍＬ）＋ＬＩＦ（５ｎｇ／ｍＬ）であった（１ｎｇ／ｍｌの濃度のＴＧＦ−βはＶＥＧＦ刺激による細胞増殖を７０−９０％阻害することが知られている）。

酸性ホスファターゼの活性をＯＤ４０５ｎｍで測定することによって決定する、ＶＥＧＦ（３ｎｇ／ｍｌ）刺激による細胞増殖の阻害の割合を計算することによって、（１）刺激なしの細胞と比較して、および（２）ＶＥＧＦ刺激活性の参照ＴＧＦ−β阻害と比較して、結果を評価した。阻害が３０％以上であれば、結果を陽性と判断する。ポリヒスチジンタグのついた形で試験されたＮＬ５はＶＥＧＦ刺激による内皮細胞の増殖を有意に阻害した。これらの結果はＮＬ５、および可能性のある関連ポリペプチドの、ガン治療および特に腫瘍血管形成の阻害における有用性を示している。

（実施例１１：内皮細胞のアポトーシス誘導）
ＮＬ５（ポリヒスチジンタグのついた形）の、内皮細胞にアポトーシスを誘導する能力を、９６ウェル形式で、１００ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦを追加した０％血清培地中で、ヒト静脈性臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ、ＣｅｌｌＳｙｓｔｅｍｓ）において試験した（ＨＵＶＥＣ細胞は容易にプレート表面から取り除かれるので、ウェル中のすべてのピペット操作はできる限り静かに行わなければならない）。

培地を吸引し、細胞を１回ＰＢＳで洗浄した。５ｍｌの１×トリプシンをＴ−１７５フラスコ中の細胞に加え、細胞がプレートから離れるまで（約５−１０分）静置した。５ｍｌの増殖培地を加えることにより、トリプシン処理を止めた。細胞を４℃、１０００ｒｐｍで５分間、回転（ｓｐｉｎ）した。培地を吸引し、細胞を１０ｍｌの１０％血清補充培地（ＣｅｌｌＳｙｓｔｅｍｓ）、１×ｐｅｎｎ／ｓｔｒｅｐに再懸濁した。

細胞を９６ウェルマイクロタイタープレート（ＡｍｅｒｓｈａｍＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ、ｃｙｔｏｓｔａｒ−Ｔｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｎｇｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ、ＲＰＮＱ１６０、滅菌、組織培養処理、個々に包装）で、１０％血清（ＣＳＧ培養液、ＣｅｌｌＳｙｓｔｅｍｓ）中で、総容積１００μｌ、ウェルあたり２×１０⁴個の細胞密度でプレートした。ＮＬ５およびＮＬ８ポリペプチドを１％、０．３３％、０．１１％の希釈で３組づつ加えた。細胞無しのウェルをブランクとして、細胞のみのウェルをネガティブコントロールとして使用した。ポジティブコントロールとして、５０μｌのスタウロスポリン３倍ストックを１：３に連続的に希釈したものを使用した。ＮＬ５ポリペプチドがアポトーシスを誘導する能力を、アポトーシスを検出するためにカルシウムおよびリン脂質結合タンパク質の１つであるアネキシンＶを用いて決定した。

０．２ｍｌのアネキシンＶ−ビオチンストック溶液（１００μｇ／ｍｌ）を４．６ｍｌの２×Ｃａ²⁺結合緩衝液および２．５％ＢＳＡに希釈した（１：２５希釈）。５０μｌの希釈したアネキシンＶ−ビオチン溶液を各ウェルに加え（コントロールを除いて）、最終的な濃度を１．０μｇ／ｍｌとした。³⁵Ｓ−ストレプトアビジンを直接加える前に、試料をアネキシン−ビオチンと共に１０−１５分間インキュベートした。³⁵Ｓ−ストレプトアビジンを２×Ｃａ²⁺結合緩衝液、２．５％ＢＳＡで希釈し、全てのウェルに最終的な濃度が３×１０⁴ｃｐｍ／ウェルになるように加えた。プレートに封をし、１０００ｒｐｍで１５分間遠心分離して軌道振盪機（ｏｒｂｉｔａｌｓｈａｋｅｒ）に２時間置いた。１４５０ＭｉｃｒｏｂｅｔａＴｒｉｌｕｘ（Ｗａｌｌａｃ）で分析を行った。

ＮＬ５はこのアッセイで陽性であった。この結果はこの分子、および潜在的に関連する分子の、ガン治療における潜在的な有用性をさらに確認している。

（実施例１２：混合リンパ球反応（ＭＬＲ）の刺激または阻害）
混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイはＣＤ４＋Ｔリンパ球の機能、より具体的にはＴリンパ球のアロ抗原の存在に反応して増殖する能力を評価する。一方向性ＭＬＲアッセイでは、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）のドナー細胞群が、照射を受けたＰＢＭＣの刺激細胞群でチャレンジされる。Ｔリンパ球が反応する抗原は、刺激細胞群中の抗原提示細胞に発現および提示されているミスマッチＭＨＣ分子である。このアッセイは提示されたアロ抗原での刺激に応じた反応Ｔリンパ球の増殖を、増強または阻害する分子を同定する。

ＭＬＲ反応を増強する（刺激する）分子は抗原に対する免疫反応を増強または強化する。よって、そのような分子（または低分子、またはそのような分子の抗体アゴンスト）は、免疫反応の増強が有益である状態の治療のための候補である。それに加えて、そのような刺激分子の阻害剤は免疫反応の抑制が有益である場合に有用であり得る。例えば、ＭＬＲにおいて刺激活性を持つ分子を阻害する、中和抗体または低分子のアンタゴニストを使用することは、免疫を介した炎症性疾患の処置に有益であり得る。ＭＬＲを阻害する分子（またはその低分子、または抗体アゴニスト）は免疫反応を阻害し免疫を介した疾患を改善するのに有用であり得る。

本実験においては、凍結ＰＢＭＣを洗浄の一晩前に解凍し、ＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ中で培養した。細胞をＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳに３×１０⁶個の細胞／ｍｌの濃度で再懸濁した。細胞懸濁液１００μｌを、ＮＬ５およびＮＬ４のテスト試料１００μｌと共に３７℃、５％ＣＯでインキュベートした。５日目に、細胞を６時間パルスラベルし、次に回収した。

このアッセイでは、ＮＬ４はリンパ球の増殖を刺激するが、ＮＬ５はリンパ球の増殖を阻害することが判明した。

（実施例１３：遺伝子増幅アッセイ）
この実施例はＮＬ８をコードする遺伝子が、特定のヒトガンのゲノム中で増幅されていることを示す。増幅は遺伝子産物の過剰発現を伴い、これはＮＬ８タンパク質が肺ガンのような、および可能性のある他の、結腸ガン、乳房ガン、および／または前立腺ガンのような、特定のガンにおける治療的介入の有用な標的であることを示している。治療剤は、ＮＬ８をコードする遺伝子のアンタゴニスト、例えば、ＮＬ８に対するマウス−ヒトキメラ、ヒト化、またはヒト抗体、または天然のポリペプチドの低分子またはペプチドアンタゴニストの形をとり得る。

スクリーニングのための開始材料は、様々なガンから単離されたゲノムＤＮＡであった。ＤＮＡを例えば蛍光測定によって正確に定量化する。ネガティブコントロールとして、１０人の正常健常個体の細胞からＤＮＡを単離し、それをプールして健常個体の遺伝子コピーのためのアッセイコントロールとして使用した（示さず）。５’ヌクレアーゼアッセイ（例えば、ＴａｑＭａｎ^TM）および同時定量ＰＣＲ（例えば、ＡＢＩＰｒｉｚｍ７７００ＳｅｑｕｅｎｃｅＤｅｔｅｃｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍ^TM（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＤｉｖｉｓｉｏｎ、ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ、ＣＡ））を、特定のガンで増幅された可能性のある遺伝子を発見するのに使用した。その結果を、ＮＬ８をコードするＤＮＡが、スクリーニングされたあらゆる原発性肺ガン中で過剰に発現しているかどうかを決定するのに使用した。その結果をデルタ（Δ）ＣＴ単位で報告する。１単位は１ＰＣＲサイクルまたは正常に比べて約２倍の増幅に対応し、２単位は４倍、３単位は８倍の増幅（以下同様）に対応する。プライマーおよびＮＬ８をコードする遺伝子由来のＴａｑｍａｎ^TM蛍光を用いて定量化した。特有の核酸配列を含む可能性が最も高く、スプライシングでイントロンを除いた可能性が最も低いＮＬ８遺伝子の領域がプライマー誘導に好ましい。それは例えば３−非翻訳領域である。ＮＬ８に使用したプライマーおよびプローブ（正方向、逆方向、およびプローブ）の配列は次の通りである：２３３３９．ｔｍ．５ＧＴＣＡＧＣＡＧＧＡＧＣＣＣＡＡＧＴＴＧ（配列番号３３）
２３３３９．ｔｍ．３ＡＣＧＧＴＴＡＣＡＣＡＧＧＧＴＧＴＣＴＴ（配列番号３４）
２３３３９．ｔｍ．ｐＴＣＴＧＧＣＣＡＣＡＣＣＴＴＣＴＴＴＧＴＧＧＣＴＣ（配列番号３５）。

５’ヌクレアーゼアッセイ反応は蛍光ＰＣＲを基礎とした技術であり、同時に増幅をモニタリングするためにＴａｑＤＮＡポリメラーゼ酵素の５’エキソヌクレアーゼ活性を利用する。２つのオリゴヌクレオチドプライマーをＰＣＲ反応に代表的なアンプリコンを産生するのに使用する。３番目のオリゴヌクレオチドまたはプローブを２つのＰＣＲプライマーの間に位置するヌクレオチド配列を検出するために設計する。プローブはＴａｑＤＮＡポリメラーゼ酵素によって伸長可能ではなく、リポーター蛍光色素および消光蛍光色素で標識する。レーザーによって誘起されるあらゆるリポーター色素からの発光は、２つの色素がプローブにあってお互いに近く位置する場合には、消光色素によって消光される。増幅反応の間、ＴＡＱＤＮＡポリメラーゼ酵素は鋳型依存的な方法でプローブを切断する。得られるプローブフラグメントは溶液中に解離し、放出されたリポーター色素からのシグナルは２番目の蛍光物質（ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ）の消光効果を受けない。１分子のリポーター分子が新しく分子が合成されるごとに遊離し、消光されないリポーター色素の検出はデータの定量的解釈の基礎を提供する。

ＡＢＩＰｒｉｓｍ７７００ＴＭＳｅｑｕｅｎｃｅＤｅｔｅｃｔｉｏｎのような同時定量ＰＣＲ装置で５’ヌクレアーゼ手順を実施する。この系はサーモサイクラー（ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ）、レーザー、電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラおよびコンピューターからなる。この系はサーモサイクラー上の９６ウェル形式で試料を増幅する。増幅の間、レーザーによって誘起された蛍光シグナルを、９６ウェル全てについて光ファイバーケーブルを通じて同時に集め、ＣＣＤで検出する。この系は器械の運転およびデータの分析のためのソフトウェアを含む。

５’ヌクレアーゼアッセイのデータを初めにＣｔ、または閾値サイクル（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄｃｙｃｌｅ）として表わす。リポーターシグナルがバックグラウンドの蛍光レベルを越えて蓄積するサイクルとしてこれを定義する。ΔＣｔの値を、核酸試料中に存在する特定の標的配列の、相対的な最初のコピー数の定量的な測定値として使用する。

（プロトコル）
（ＤＮＡの調製：）
ＤＮＡを原発性の腫瘍および正常ヒト血液（コントロール）から調製した。Ｑｉａｇｅｎの精製キット＃１３３６２（各４００μｇのゲノムＤＮＡの容量をもつ１０個の精製チップを含む）、緩衝液セット＃１９６０およびプロテアーゼ＃１９１５５および＃１９１０１を用いて、製造会社の使用説明書および以下の記述に従って単離を行った。

（培養細胞の溶解：）
細胞を洗浄して１チップあたり７．５×１０⁸の濃度でトリプシン処理し、４℃、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離することによりペレットを作った。次に１／２量のＰＢＳを用いて再遠心分離し再び洗浄した。ペレットを３回目に洗浄し、懸濁した細胞を回収しＰＢＳで２回洗浄した。次に細胞を１０ｍＬのＰＢＳに懸濁した。緩衝液Ｃ１を４℃で平衡化した。Ｑｉａｇｅｎプロテアーゼ＃１９１５５を６．２５ｍｌの冷却ｄｄＨ₂Ｏに最終的な濃度が２０ｍｇ／ｍｌになるように希釈し、４℃で平衡化した。１０ｍＬのＧ２緩衝液をＱｉａｇｅｎＲＮアーゼＡストック（１００ｍｇ／ｍｌ）を最終的な濃度が２００μｇ／ｍｌになるように希釈して調製した。

緩衝液Ｃ１（１０ｍＬ、４℃）およびｄｄＨ₂Ｏ（４０ｍＬ、４℃）を次に１０ｍＬの細胞懸濁液に加え、逆さにして混合し氷上で１０分間インキュベートした。細胞核をＢｅｃｋｍａｎスイングバケットローターで４℃、２５００ｒｐｍで１５分間遠心分離することによりペレットにした。上清を捨て、核を２ｍＬの緩衝液Ｃ１（４℃）および６ｍＬのｄｄＨ₂Ｏにボルテックスして懸濁した。次に２度目に４℃、２５００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。次に核を残りの緩衝液にチップあたり２００μｌを用いて再懸濁した。Ｇ２緩衝液（１０ｍｌ）を懸濁した核に静かにボルテックスしながら加えた。緩衝液を加え終わった後、３０秒間強くボルテックスした。Ｑｉａｇｅｎプロテアーゼ（２００μｌ、上記で述べられたように調製された）を加え、５０℃で６０分間インキュベートした。溶解物が透明になるまで、インキュベーションと遠心分離を繰り返した（例えば、さらに３０−６０分間のインキュベート、４℃、３０００×ｇで１０分間のペレット化）。

（固形ヒト腫瘍試料の調製および溶解：）
腫瘍試料を計量し、５０ｍｌのコニカルチューブに入れて氷上で保持した。処理は１調製あたり組織２５０ｍｇ以下に限った（１チップ／調製）。プロテアーゼ溶液を、６．２５ｍｌの冷ｄｄＨ₂Ｏに最終的な濃度が２０ｍｇ／ｍｌになるように希釈して新しく調製し、４℃で保存した。Ｇ２緩衝液（２０ｍｌ）を、ＤＮアーゼＡを最終的な濃度が２００ｍｇ／ｍｌになるように（１００ｍｇ／ｍｌのストックから）希釈して調製した。腫瘍組織を、エアロゾルの吸入を避けるために層流ＴＣフード（ｌａｍｉｎａｒ−ｆｌｏｗＴＣｈｏｏｄ）中で、ポリトロンの大きいチップを用いて、１９ｍｌのＧ２緩衝液中で６０秒間ホモジナイズし、室温で保持した。試料と試料の間には、ポリトロンを２ＬのｄｄＨ₂Ｏ、次にＧ２緩衝液（５０ｍｌ）中で２回３０秒間回転させることにより掃除した。組織がまだジェネレーターチップ（ｇｅｎｅｒａｔｏｒｔｉｐ）に存在する場合、器具を分解して掃除した。

Ｑｉａｇｅｎプロテアーゼ（上記で述べられたように調製した、１．０ｍｌ）を加え、次にボルテックスして５０℃で３時間インキュベートした。溶解物が透明になるまで、インキュベーションと遠心分離を繰り返した（例えば、さらに３０−６０分間のインキュベート、４℃、３０００×ｇで１０分間のペレット化）。

（ヒト血液の調製と溶解：）
標準的な感染因子プロトコールを用いて健常なボランティアから血液を採取し、チップあたり１０ｍｌの試料中に滴定した。Ｑｉａｇｅｎプロテアーゼを、６．２５ｍｌの冷ｄｄＨ₂Ｏに最終的な濃度が２０ｍｇ／ｍｌになるように希釈して新しく調製し、４℃で保存した。Ｇ２緩衝液を、ＲＮアーゼＡを最終的な濃度が２００μｇ／ｍｌになるように１００ｍｇ／ｍｌのストックから希釈して調製した。血液（１０ｍｌ）を５０ｍｌのコニカルチューブに入れ、１０ｍｌのＣ１緩衝液および３０ｍｌのｄｄＨ₂Ｏ（どちらも前もって４℃に平衡化された）を加えた。成分を逆さにして混合し、氷上で１０分間保持した。核を、Ｂｅｃｋｍａｎスイングバケットローターを用いて、４℃、２５００ｒｐｍで１５分間ペレット化し、上清を捨てた。ボルテックスして核を２ｍｌのＣ１緩衝液（４℃）および６ｍｌのｄｄＨ₂Ｏ（４℃）に懸濁した。ペレットが白くなるまでボルテックスを繰り返した。核を次に２００μｌのチップを用いて残りの緩衝液に懸濁した。Ｇ２緩衝液（１０ｍｌ）を静かにボルテックスしながら懸濁した核に加え、次に３０秒間強くボルテックスした。Ｑｉａｇｅｎプロテアーゼを加え（２００μｌ）、５０℃で６０分間インキュベートした。溶解物が透明になるまで、インキュベーションと遠心分離を繰り返した（例えば、さらに３０−６０分間のインキュベート、４℃、３０００×ｇで１０分間のペレット化）。

（透明になった溶解産物の精製：）
ゲノムＤＮＡを１０ｍｌのＱＢＴ緩衝液を用いて平衡化した（大きいチップでの調製あたり１試料）。ＱＦ溶出緩衝液を５０℃で平衡化した。試料を３０秒間ボルテックスし、次に平衡化したチップに添加し重力によって排出した。チップを２回１５ｍｌのＱＣ緩衝液で洗浄した。ＤＮＡを、１５ｍｌのＱＦ緩衝液（５０℃）を用いて、シラン処理し、オートクレーブにかけた３０ｍｌのＣｏｒｅｘチューブに溶出した。イソプロパノール（１０．５ｍｌ）を各試料に加え、チューブにパラフィンで封をして、ＤＮＡが沈殿するまで繰り返し逆さにして混合した。試料をＳＳ−３４ローターで、４℃、１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離してペレット化した。ペレットの位置に印をつけ、上清を捨て、１０ｍｌの７０％エタノール（４℃）を加えた。試料をＳＳ−３４ローターで、４℃、１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して再びペレット化した。ペレットの位置に印をつけ、上清を捨てた。チューブを次に乾燥棚において、試料が乾燥しすぎないように気をつけて３７℃で１０分間乾燥した。

乾燥後、ペレットを１．０ｍｌのＴＥ（ｐＨ８．５）に溶解し、５０℃で１−２時間置いた。溶解が続いている間、試料を１晩４℃で保持した。次にＤＮＡ溶液をツベルクリンシリンジ上の２６ゲージの針を持つ１．５ｍｌのチューブに移した。ＤＮＡを切断するために移動を５回繰り返した。試料を次に５０℃で１−２時間置いた。

ゲノムＤＮＡの定量化および遺伝子増幅アッセイのための調製：各チューブ内のＤＮＡレベルを、１：２０の希釈（５μｌのＤＮＡ＋９５μｌのｄｄＨ₂Ｏ）で、０．１ｍｌの石英キュベットを用いてＢｅｃｋｍａｎＤＵ６４０分光光度計で、標準的なＡ２６０、Ａ２８０分光光度法によって定量化した。Ａ２６０／Ａ２８０比は１．８−１．９の範囲であった。次に各ＤＮＡ試料をさらに、ＴＥ（ｐＨ８．５）に約２００ｎｇ／ｍｌまで希釈した。もしもとの材料の濃度が高い場合（＄７００ｎｇ／μｌ）、材料を５０℃で１−２時間置いた。

次に希釈した材料（２０−６００ｎｇ／ｍｌ）で、下記のように変更した製造業社の指針を用いて、蛍光測定によるＤＮＡの定量化を行った。これをＨｏｅｆｆｅｒＤｙＮＡＱｕａｎｔ２００蛍光計を約１５分間ウォームアップしておくことにより達成した。ヘキスト色素作用溶液（＃Ｈ３３２５８、１０μｌ、使用の１２時間以内に調製された）を１００ｍｌの１×ＴＮＥ緩衝液に希釈した。２ｍｌのキュベットを蛍光計溶液で満たし、器械に置き、器械を０の位置に合わせた。ｐＧＥＭ３Ｚｆ（＋）（２μｌ、ロット番号３６０８５１０２６）を２ｍｌの蛍光計溶液に加え、２００ユニットに目盛りを定めた。２回目の２μｌのｐＧＥＭ３Ｚｆ（＋）ＤＮＡを次に試験し、４００＋／−１０単位を示すことを確認した。次に各試料を少なくとも３つづつ測定した。３つの試料がお互いに１０％以内であった場合、その平均をとってこの値を定量化した値として使用した。

蛍光測定で決定された濃度を次に、各試料をｄｄＨ₂Ｏ中に１０ｎｇ／μｌまで希釈するために使用した。これを１回のＴａｑＭａｎプレートアッセイの全鋳型試料で、５００−１０００回のアッセイを行うのに十分な材料とともに、同時に行った。試料を３つづつ、正常ヒトＤＮＡおよび鋳型を含まないコントロールを持つ１つのプレート上で、Ｂ−アクチンおよびＧＡＰＤＨの両方で試験した。テストＤＮＡから引いた正常ヒトＤＮＡのＣＴ値が＋／−１ＣＴなら、希釈した試料を使用した。希釈した、よく検定を受けた（ｌｏｔ−ｑｕａｌｉｆｉｅｄ）ゲノムＤＮＡを１．０ｍｌのアリコートにして−８０℃で保存した。次に遺伝子増幅アッセイに使用するアリコートは４℃で保存した。各１ｍｌのアリコートは８−９プレートまたは６４回の試験に十分である。

（遺伝子増幅の結果：）
遺伝子増幅アッセイの結果を次の表で報告する（ΔＣｔ値として）：

表中で使用されている略語の説明は本明細書中で前に提供された。

１を超えるΔＣｔ値は遺伝子コピーが２倍であることを示すので、これを一般的に増幅得点（ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｓｃｏｒｉｎｇ）の閾値として使用した。上記の表はＮＬ８ＤＮＡの有意な増幅が様々な原発性肺腫瘍で起こっていることを示す。これはこの分子がガン治療の有益な標的であることを示している。特に、ＮＬ８タンパク質に対するアンタゴニスト（例えば抗体）がガン治療に有用であることが期待される。

増幅が他の（例えば結腸、乳房、前立腺、子宮等）ガンおよび／またはガン細胞株で起こっているかどうかを決定するためには、さらなる実験が必要である。本明細書中で前に述べられたように、枠組み構造および中心（ｅｐｉｃｅｎｔｅｒ）のマッピングおよびさらなる細胞を基礎とするアッセイ、または動物モデルによって、観察を補足し正確にすることができる。

（実施例１４：腫瘍の血管形成）
このアッセイは、ＶＥＧＦを発現するようにトランスフェクトされたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞が、ＶＥＧＦがＣＨＯ細胞の増殖に直接効果を持たないにも関わらず、ヌードマウスにおいて腫瘍を形成する能力を獲得するという実験的な発見に基づいている（Ｆｅｒｒａｒａら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９１：１６０[１９９３]）。従って、正常ＣＨＯ細胞は十分な増殖能力を持つが、腫瘍形成能力は、血管形成を誘発することができないことによって制限される。このアッセイは他の分子がＶＥＧＦのようにＣＨＯ細胞を腫瘍形成性にするように機能し得るかどうかを決定しようとするものである。血管の供給の非存在下で、栄養分の拡散は、腫瘍結節の大きさを直径約１ｍｍに制限することが知られているので、そのような分子のインヒビターは、ガン治療に有用であり得る。

ＣＨＯ細胞にＮＬ１およびＮＬ８をコードする遺伝子を含むベクターを安定にトランスフェクトした。ＶＥＧＦをコードする配列を含む同じベクター、または空のベクターでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を、ポジティブおよびネガティブコントロールとした。細胞を雌ヌードマウスの側腹部に皮下注射した（１００万個の細胞／マウス、形質転換体あたり５匹のマウス）。注射部位を毎週腫瘍結節の出現に関してチェックした。組織学的な評価を発生したあらゆる結節について行った。

ＮＬ１およびＮＬ８を発現するＣＨＯ細胞を持つマウスにおいて腫瘍結節を認めた。これはＮＬ１およびＮＬ８が、ＶＥＧＦのようにＣＨＯ細胞を腫瘍形成性にする能力があることを示している。

（実施例１５：内皮の管形成の刺激）
このアッセイはＤａｖｉｓおよびＣａｍａｒｉｌｌｏ、ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＣｅｌｌＲｅｓｅａｒｃｈ、２２４：３９−５１（１９９６）で述べられたアッセイまたは、次のようなその変形の１つに従う：プロトコール：ＨＵＶＥ細胞（継代回数が初代培養から８回未満）をＩ型ラットテイルコラーゲンと混合する。６×１０⁵個の細胞／ｍｌの密度で最終的な濃度は２．６ｍｇ／ｍｌ、９６ウェルプレート上でウェルあたり５０μｌをプレートした。ゲルを３７℃で１時間凝固させておいて、ウェルあたり５０μｌの１％ＦＢＳを追加したＭ１９９培養培地およびＮＬ１ポリペプチド試料（各１％、０．１％、０．０１％の希釈で）を、液胞が形成されているならそれを染色する１μＭの６−ＦＡＭ−ＦＩＴＣ色素と共に加える。細胞を３７℃／５％ＣＯ₂で４８時間インキュベートし、３．７％ホルマリンを用いて室温で１０分間固定し、ＰＢＳで５回洗浄した。次にＲｈ−ファロイジンを用いて４℃で１晩染色し、次に４μＭのＤＡＰＩで核を染色した。

（１．アポトーシスアッセイ）
このアッセイは３次元マトリックス中で、外来性の増殖因子（ＶＥＧＦ、ＰＭＡなしのｂＦＧＦ）存在下で、細胞の生存を促進する因子を同定する。

１以下の結果が陽性である。０＝アポトーシスなし、１＝２０％未満の細胞がアポトーシスをおこしている、２＝５０％未満の細胞がアポトーシスをおこしている、３＝５０％以上の細胞がアポトーシスをおこしている。この系でアポトーシスを刺激する物質はアポトーシス因子として期待され、インヒビターはアポトーシスを防止または抑制することが期待される。

（２．液胞アッセイ）
このアッセイは、ｂＦＧＦおよびＶＥＧＦ（４０ｎｇ／ｍｌ）の存在下で、内皮の液胞形成および管腔形成を刺激する因子を同定する。

２以上の結果が陽性である。１＝２０％未満の細胞に液胞が存在する、２＝２０−５０％の細胞に液胞が存在する、３＝５０％以上の細胞に液胞が存在する。このアッセイをピノサイトーシス、イオン輸送、透過性、および結合形成の刺激に関与する因子を同定するために設計する。

（３．管形成アッセイ）
このアッセイは３次元マトリックス中で内皮の管形成を刺激する因子を同定する。このアッセイは、３次元マトリックス中で外来性の成長因子（ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ）存在下で、内皮細胞の管様構造への分化を刺激する因子を同定する。

２以上の結果が陽性である。１＝細胞は全て丸い、２＝細胞は長くなっている、３＝細胞はいくらか結合した管を形成している、４＝細胞は複雑な管ネットワークを形成している。このアッセイはトラッキング、走化性、または内皮の形状変化の刺激に関与し得る因子を同定する。

　図１７はＨＵＶＥＣの管形成に対する、ポリヒスチジンに結合した１％希釈のＮＬ１ポリペプチド、および１％希釈の緩衝液コントロール（１０ｍＭＨＥＰＥＳ／０．１４ＭＮａＣｌ／４％マンニトール、ｐＨ６．８）の効果を示している。ＩｇＧ融合物として試験した、もう１つの新規のＴＩＥリガンドホモログ（ＮＬ６）および２つの既知のＴＩＥリガンドであるＴＩＥ−１およびＴＩＥ−２と比較した結果も図に示している。

（材料の寄託）
前に言及したように、次の材料をＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、１２３０１ＰａｒｋｌａｗｎＤｒｉｖｅ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ、ＵＳＡ（ＡＴＣＣ）に寄託した：

これらの寄託はＢｕｄａｐｅｓｔＴｒｅａｔｙｏｎｔｈｅＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＲｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎｏｆｔｈｅＤｅｐｏｓｉｔｏｆＭｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓｆｏｒｔｈｅＰｕｒｐｏｓｅｏｆＰａｔｅｎｔＰｒｏｃｅｄｕｒｅａｎｄｔｈｅＲｅｇｕｌａｔｉｏｎｓｔｈｅｒｅｕｎｄｅｒ（ブダペスト条約）の規定の下になされた。これは寄託の生存可能な培養物を寄託日から３０年間維持することを保証する。寄託物はブダペスト条約の条項の下で、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．およびＡＴＣＣ間の合意を条件として、ＡＴＣＣによって入手可能となり、これは、適切な米国特許が発行された時点、またはあらゆる米国または外国特許出願が公開された時点のどちらが先にきても、寄託物の培養物の子孫を、公衆が永続的に無制限に入手できることを保証する。そして、３５ＵＳＣ§１２２およびそれに準ずるＣｏｍｍｉｓｓｉｏｎｅｒ’ｓｒｕｌｅｓ（８８６ＯＧ６８３に特に言及している３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．１４を含む）によって、米国特許庁長官によってその権利があると決定されたものが子孫を入手できることを保証する。

本発明の受託人は、寄託した材料の培養物が適切な条件下で培養されている時に死滅または失われたまたは破壊された場合、通知に基づいて直ちにもう１つの同じものと交換することに同意した。寄託した材料の入手可能性は、あらゆる政府の権威のもとでその特許法に従って授与された権利に違反して本発明を実施するライセンスとは解釈されるべきではない。

本明細書は、当業者が発明を実施するのを可能にするのに十分であると判断される。寄託された実施態様は本発明の特定の局面の１つの例示として意図されており、機能的に等しいあらゆる構築物は本発明の範囲内であるので、本発明は寄託された構築物によって範囲が制限されるべきではない。本明細書中の材料の寄託は、書面の記述がその最上のものを含む本発明のあらゆる局面の実施を可能にするのに不適切であるという承認を構成しない。また請求の範囲をそれが表す特定の例示に制限するように解釈されるべきではない。実際に、本明細書中に示され記述されたものに加えて、本発明の様々な変形が、前述の記述から当業者に明らかになり、添付される請求の範囲の範囲内に入る。

（配列表）

ＦＬＳ１３９のヌクレオチド配列である（配列番号１６）。ＦＬＳ１３９のヌクレオチド配列である（配列番号１６）。ＦＬＳ１３９のアミノ酸配列である（配列番号１７）。ＦＬＳ１３９のアミノ酸配列である（配列番号１７）。ＴＩＥリガンドＮＬ１のヌクレオチド配列である（配列番号１）（ＤＮＡ２２７７９）。ＴＩＥリガンドＮＬ１のヌクレオチド配列である（配列番号１）（ＤＮＡ２２７７９）。ＴＩＥリガンドＮＬ１のアミノ酸配列である（配列番号２）。ＴＩＥリガンドＮＬ１のアミノ酸配列である（配列番号２）。ＴＩＥリガンドＮＬ５のヌクレオチド配列である（配列番号３）（ＤＮＡ２８４９７）。ＴＩＥリガンドＮＬ５のヌクレオチド配列である（配列番号３）（ＤＮＡ２８４９７）。ＴＩＥリガンドＮＬ５のヌクレオチド配列である（配列番号３）（ＤＮＡ２８４９７）。ＴＩＥリガンドＮＬ５のアミノ酸配列である（配列番号４）。ＴＩＥリガンドＮＬ５のアミノ酸配列である（配列番号４）。ＴＩＥリガンドＮＬ８のヌクレオチド配列である（配列番号５）（ＤＮＡ２３３３９）。ＴＩＥリガンドＮＬ８のヌクレオチド配列である（配列番号５）（ＤＮＡ２３３３９）。ＴＩＥリガンドＮＬ８のアミノ酸配列である（配列番号６）。ＴＩＥリガンドＮＬ８のアミノ酸配列である（配列番号６）。細胞性ＲＮＡへのインサイチュハイブリダイゼーションによって決定した場合の種々の組織におけるＮＬ１の発現を示す。細胞性ＲＮＡへのインサイチュハイブリダイゼーションによって決定した場合の種々の組織におけるＮＬ１の発現を示す。細胞性ＲＮＡへのインサイチュハイブリダイゼーションによって決定した場合の種々の組織におけるＮＬ５の発現を示す。細胞性ＲＮＡへのインサイチュハイブリダイゼーションによって決定した場合の種々の組織におけるＮＬ５の発現を示す。細胞性ＲＮＡへのインサイチュハイブリダイゼーションによって決定した場合の種々の組織におけるＮＬ８の発現を示す。細胞性ＲＮＡへのインサイチュハイブリダイゼーションによって決定した場合の種々の組織におけるＮＬ８の発現を示す。種々の組織においてＴＩＥリガンドＮＬ１およびＮＬ５のｍＲＮＡの発現を示すノーザンブロットである。種々の組織においてＴＩＥリガンドＮＬ１およびＮＬ５のｍＲＮＡの発現を示すノーザンブロットである。ＴＩＥリガンドＮＬ４のヌクレオチド配列である（配列番号１８）。ＴＩＥリガンドＮＬ４のヌクレオチド配列である（配列番号１８）。ＴＩＥリガンドＮＬ４のアミノ酸配列である（配列番号１９）。ＴＩＥリガンドＮＬ４のアミノ酸配列である（配列番号１９）。ＴＩＥリガンドＮＬ４のアミノ酸配列の、ｐＢｌｅｕｓｃｒｉｐｔＫＳクローンに由来するヒトＴＩＥ−２リガンド２のアミノ酸配列とのアラインメントである（配列番号２０）。ＴＩＥリガンドＮＬ４のアミノ酸配列の、λ−ｇｔ１０クローンに由来するヒトＴＩＥ−２リガンド１のアミノ酸配列とのアラインメントである（配列番号２１）。１％希釈でポリ−ｈｉｓに結合したＮＬ１ポリペプチドの、および１％希釈で緩衝液コントロール（１０ｍＭＨＥＰＥＳ／０．１４ＭＮａＣｌ／４％マンニトール、ｐＨ６．８）の、ＨＵＶＥＣチューブ形成における効果を示す。ＩｇＧ融合体としてテストした、もう１つの新規ＴＩＥリガンドホモログ（ＮＬ６）および２つの公知のＴＩＥリガンドＴＩＥ−１およびＴＩＥ−２との比較結果も、図中で示す。

Claims

配列番号４（ＮＬ５）と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、単離された核酸分子。
配列番号４のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、請求項１に記載の単離された核酸分子。
配列番号３のコード領域を含む、請求項１に記載の単離された核酸分子。
配列番号３のフィブリノーゲン様ドメインコード配列を含む、請求項１に記載の単離された核酸分子。
請求項１から４のいずれか一項に記載の核酸分子を含む、ベクター。
請求項１から４のいずれか一項に記載の核酸分子で形質転換した、組換え宿主細胞。
原核生物細胞である、請求項６に記載の組換え宿主細胞。
真核生物細胞である、請求項６に記載の組換え宿主細胞。
配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
配列番号４のアミノ酸配列を含む、請求項９に記載の単離されたポリペプチド。
請求項９に記載のポリペプチドを特異的に結合する、抗体。
モノクローナル抗体である、請求項１１に記載の抗体。
非ヒト相補性決定領域（ＣＤＲ）残基およびヒトフレームワーク（ＦＲ）残基を有する、請求項１２に記載の抗体。
内皮細胞の増殖を阻害する、請求項１１に記載の抗体。
前記細胞が腫瘍細胞である、請求項１４に記載の抗体。
細胞のアポトーシスを誘導する、請求項１１に記載の抗体。
前記細胞が腫瘍細胞である、請求項１６に記載の抗体。
腫瘍細胞の血管形成を阻害する、請求項１１に記載の抗体。
前記腫瘍細胞が、肺ガン、結腸ガン、乳ガン、または前立腺ガン細胞である、請求項１８に記載の抗体。
抗-ＮＬ５抗体である、請求項１１に記載の抗体。
標識されている、請求項１１に記載の抗体。
請求項９に記載のポリペプチドをキャリアとともに含む、組成物。
請求項１１に記載の抗体をキャリアとともに含む、組成物。
前記抗体を増殖阻害量で含む、請求項２３に記載の組成物。
前記抗体が、抗-ＮＬ５抗体である、請求項２４に記載の組成物。
細胞傷害性薬剤または化学療法剤の二次抗体をさらに含む、請求項２３に記載の組成物。
さらなる治療剤または細胞傷害性薬剤に融合された、請求項９に記載のポリペプチドまたは請求項１１に記載の抗体を含む、結合体。
前記さらなる治療剤が、トキシン、異なるＴＩＥリガンド、または血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）ファミリーのメンバーである、請求項２７に記載の結合体。
ＴＩＥレセプターを発現する細胞を同定するための方法であって、
請求項９に記載のポリペプチドを、該レセプターへの該ポリペプチドの結合を可能にする条件下で、細胞と接触させる工程、および該結合をモニタリングする工程、を包含する、方法。
非ヒト哺乳動物において血管新生の存在を画像化するための方法であって、検出可能に標識された請求項９に記載のポリペプチド、または請求項１１に記載のアゴニスト抗体を患者に投与する工程、および血管新生をモニタリングする工程、を包含する、方法。
非ヒト哺乳動物において血管形成を阻害するための方法であって、請求項９に記載のポリペプチドまたは請求項１１に記載のアゴニスト抗体の有効量を患者に投与する工程を包含する、方法。
非ヒト哺乳動物において内皮細胞増殖を阻害するための方法であって、請求項９に記載のポリペプチドの有効量で、該内皮細胞を処理する工程、を包含する、方法。
前記ポリペプチドがＮＬ５である、請求項３２に記載の方法。
非ヒト哺乳動物において内皮細胞アポトーシスを誘導するための方法であって、請求項９に記載のポリペプチドの有効量で該内皮細胞を処理する工程、を包含する、方法。
前記ポリペプチドがＮＬ５である、請求項３４に記載の方法。
請求項９に記載のポリペプチドの存在を決定するための方法であって、該ポリペプチドを含む疑いのある細胞を、該ポリペプチドに対する抗体に曝露する工程、および該細胞への該抗体の結合を決定する工程、を包含する、方法。
哺乳動物における腫瘍を診断する方法であって、（ａ）哺乳動物から得られる組織細胞のテスト試料において、および（ｂ）同じ細胞タイプの公知の正常組織細胞のコントロール試料において、請求項９に記載のポリペプチドをコードする遺伝子の発現のレベルを検出する工程を包含し、ここで、テスト試料におけるより高い発現レベルが、テスト組織細胞を得た哺乳動物における腫瘍の存在を示す、方法。
以下：
　容器；
　該容器上のラベル；および
　該容器内に含まれている、活性薬剤を含む組成物、
を含む製品であって、ここで、該組成物が、腫瘍細胞の増殖を阻害するために有効であり、概容器上のラベルは、該組成物が、請求項９に記載のポリペプチドの過剰発現によって特徴づけられる症状を処置するために使用され得、そして該組成物における活性薬剤が、該ポリペプチドの発現および／または活性を阻害することを示す、製品。
血管新生の存在を画像化するための組成物であって、検出可能に標識された請求項９に記載のポリペプチド、または請求項１１に記載のアゴニスト抗体を含む、組成物。
血管形成を阻害するための薬学的組成物であって、有効量の請求項９に記載のポリペプチド、または請求項１１に記載のアゴニスト抗体を含む、組成物。
内皮細胞増殖の阻害のための薬学的組成物であって、有効量の検出可能に標識された請求項９に記載のポリペプチドを含む、組成物。
前記ポリペプチドがＮＬ５である、請求項４１に記載の組成物。
内皮細胞増殖の阻害のための方法であって、請求項９に記載のポリペプチドの有効量で、該内皮細胞をインビトロにて処理する工程を包含する、方法。
前記ポリペプチドがＮＬ５である、請求項４３に記載の方法。
内皮細胞のアポトーシスを誘導するための方法であって、請求項９に記載のポリペプチドの有効量で該内皮細胞をインビトロにて処理する工程を包含する、方法。
前記ポリペプチドがＮＬ５である、請求項４５に記載の方法。
内皮細胞のアポトーシスを誘導するための組成物であって、有効量の請求項９に記載のポリペプチドを含む、組成物。
前記ポリペプチドがＮＬ５である、請求項４７に記載の方法。