ES2268790T3

ES2268790T3 - Homologos de ligandos tie.

Info

Publication number: ES2268790T3
Application number: ES98946987T
Authority: ES
Inventors: Paul J. Godowski; Austin L. Gurney; Kenneth Hillan; David Botstein; Audrey Goddard; Margaret Roy; Napoleone Ferrara; Daniel Tumas; Ralph Schwall
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 1997-09-19
Filing date: 1998-09-14
Publication date: 2007-03-16
Anticipated expiration: 2018-09-14
Also published as: DE69834649T2; ATE327329T1; WO1999015653A2; KR100692333B1; KR20060060060A; JP2004129656A; DK1015585T3; IL134648A; US6551822B1; EP1015585A2; KR100692336B1; KR100692335B1; DE69834649D1; JP2004113239A; JP2004097224A; EP1724349A1; KR20060060061A; IL134648A0; AU756449B2; JP2001517437A

Abstract

Molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia nucleotídica que codifica un polipéptido que tiene al menos el 90% de identidad de secuencia con la secuencia aminoacídica SEC ID NO:2 del polipéptido NL1 humano nativo.

Description

Homólogos del ligando TIE.

Campo de la invención

La presente invención hace referencia a moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican homólogos del ligando de TIE, a las proteínas homólogas del ligando de TIE codificadas por dichas moléculas de ácido nucleico, así como los procedimientos y medios para generar y utilizar dichas moléculas de ácido nucleico y proteínas, y los anticuerpos que se unen a los homólogos de ligandos de TIE aquí descritos.

Antecedentes de la invención

Las abreviaciones "TIE" o "tie" son acrónimos, que hacen referencia a "tirosina quinasas que contienen dominios de homología con Ig y EGF" y designan una familia nueva de receptores tirosina quinasa que se expresan casi exclusivamente en las células endoteliales vasculares y en las células hematopoyéticas tempranas y se caracterizan por la presencia de un dominio de tipo EGF, y unidades de plegamiento extracelular estabilizadas por enlaces disulfuro intracatenarios, referidos generalmente como "plegamientos de tipo inmunoglobulina (Ig)". Partanen y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:8913-8917 (1990) describieron un fragmento de cDNA homólogo de tirosina quinasa. El mRNA de este receptor "tie" humano se ha detectado en todos los tejidos embrionales de ratón y se ha demostrado su localización en las células cardiacas y las endoteliales vasculares. Korhnonen y col., Blood 80, 2548-2555 (1992); patente internacional WO 93/14124 (publicada el 22 de Julio de 1993). El homólogo de rata del tie humano, referido como "tie-1" se identificó por Maisonpierre y col., Oncogene 8, 1631-1637 (1993)). Otro receptor, denominado "tie-2" se identificó originalmente en ratas (Dumont y col., Oncogene 8, 1293-1301 (1993)), mientras que el homólogo humano de tie-2, denominado como "ork" se describió en la patente americana U.S. 5.447.860 (Ziegler). El homólogo murino de tie-2 se denominó originalmente "tek". El clonaje de un receptor tie-2 de ratón de una librería de cDNA de cerebro se describe en la patente internacional WO 95/13387 (publicada el 18 de Mayo de 1995). Se cree que los receptores TIE están implicados activamente en la angiogénesis y que también podrían desempeñar un papel en la hematopoyesis.

El clonaje y la expresión de los ligandos de TIE-2 humanos se ha descrito en la patente internacional WO 96/11269 (publicada el 18 de Abril de 1996) y en la patente americana U.S. 5.521.073 (publicada ele 28 de Mayo de 1996). Un vector \lambdagt10 que codifica un ligando de TIE-2 denominado "htie-2 ligando 1" o "hTL1" se depositó en el ATCC con el número de acceso 75928. Un plásmido que codifica otro ligando de TIE-2 denominado "htie-2 2" o "hTL2" está disponible con el número de accesos ATCC 75928. Este segundo ligando se ha descrito como un antagonista del receptor TAI-2. La identificación de los ligandos secretados humanos y de ratón para el receptor TIE-2 se han publicado por Davis y col., Cell 87, 1161-1169 (1996). El ligando humano denominado "Angiotensina-1", con función en la angiogénesis y potencialmente durante la hematopoyesis, es el mismo ligando que el denominado como "htie-2 1" o "hTL-1" en la patente internacional WO 96/11269. La angiopoyetina-1 se ha descrito que desempeña un papel distinto y más tardío al del VEGF (Suri y col., Cell 87, 1171-1180 (1996)). Dado que TIE-2 está sobre-expresado aparentemente durante la angiogénesis patológica necesaria en el crecimiento tumoral (Kaipainen y col., Cancer Res. 54:6571-6577 (1994)), se ha sugerido que la angiopoyetina-1 es además útil para el marcaje específico de la vasculatura tumoral (Davis y col., supra).

Resumen de la invención

La presente invención hace referencia a homólogos humanos nuevos del ligando de TIE con efectos potentes en la vasculatura. La invención también proporciona las moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican diversos homólogos del ligando o sus derivados funcionales, y a los vectores que contienen dichas moléculas de ácido nucleico. La invención se refiere a a las células huésped transformadas con dicho ácido nucleico para producir homólogos nuevos del ligando de TIE o sus derivados funcionales. Los homólogos nuevos de ligando de TIE pueden ser agonistas o antagonistas de los receptores TIE, conocidos o por descubrir. Pueden utilizarse en la terapia o el diagnóstico, incluyendo la liberación de otros agentes terapéuticos o diagnósticos en las células que expresan los receptores TIE respectivos.

La presente invención proporciona además los anticuerpos que se unen específicamente a los homólogos de del ligando de TIE.

En otro aspecto, la invención hace referencia a los conjugados de homólogos del ligando de TIE de la presente invención o a los anticuerpos que se unen específicamente a dichos homólogos del ligando de TIE.

En otro aspecto, la invención hace referencia a los conjugados de los homólogos nuevos del ligando de TIE de la presente invención con otros agentes terapéuticos o citotóxicos, y a las composiciones que comprenden dichos conjugados. Ya que se ha publicado que el receptor TIE-2 se sobreexpresa durante la angiogénesis patológica que es necesaria para el crecimiento tumoral, los conjugados de los homólogos del ligando de TIE de la presente invención con agentes citotóxicos u otros agentes anti-tumorales pueden hallar utilidad en el marcaje específico de la vasculatura tumoral.

En otro aspecto más, la invención hace referencia a un procedimiento para la identificación de una célula que expresa un receptor TIE, en donde dicho procedimiento comprende (a) el contacto de una célula con un homólogo de ligando de la presente invención marcado de forma detectable en condiciones tales que permitan la unión de dicho homólogo de ligando de TIE con el receptor TIE, y (b) la determinación la existencia de dicha unión.

En otra realización, la invención describe un procedimiento para determinar (a) la presencia de un homólogo del ligando de TIE mediante exposición de una célula sospechosa de contener dicho homólogo con un anticuerpo anti-homólogo del ligando de TIE y (b) la determinación de la unión del anticuerpo con la célula.

La invención también concierne las composiciones para utilizar en un procedimiento para el análisis por la imagen de la presencia de angiogénesis en la curación de la herida, inflamación o en tumores de pacientes humanos; en donde dicho procedimiento comprende la administración de homólogos del ligando de TIE marcados de forma detectable o los anticuerpos agonistas de la presente invención, y la detección de la angiogénesis.

En otro aspecto, la invención concierne las composiciones para utilizar en un procedimiento para promover o inhibir la neovascularización en un paciente mediante la administración de una cantidad efectiva de un homólogo del ligando de TIE de la presente invención en un vehículo aceptable farmacéuticamente. En realizaciones preferidas, las composiciones son de utilidad en un procedimiento para promover la curación de la herida, en un procedimiento para promover los procesos angiogénicos, como por ejemplo la inducción de la vascularización colateral en un corazón isquémico o limb, o un procedimiento para inhibir el crecimiento del tumor.

Las composiciones descritas aquí son de utilidad en un procedimiento para promover el desarrollo y/o la maduración y/o el crecimiento en un paciente. Dicho procedimiento comprende la administración al paciente de una cantidad efectiva de un homólogo del ligando de TIE de la presente invención en un vehículo aceptable farmacéuticamente.

Las composiciones descritas aquí son de utilidad en un procedimiento para promover el crecimiento y el desarrollo del músculo. Dicho procedimiento comprende la administración a un paciente que necesite una cantidad efectiva de un homólogo del ligando de TIE de la presente invención en un vehículo aceptable farmacéuticamente.

Los homólogos del ligando de TIE de la presente invención pueden administrarse sólos, o en combinación unos con otros y/o con otros agentes terapéuticos o diagnósticos, incluyendo los miembros de la familia VEGF. Las terapias de combinación pueden representar nuevas aproximaciones de interés para promover o inhibir la neovascularización, y el crecimiento y desarrollo del músculo.

Descripción resumida de las figuras

La Figura 1 es la secuencia nucleotídica del ligando de TIE NL 1 (SEC ID NO:1) (DNA 22779).

La Figura 2 es la secuencia aminoacídica del ligando de TIE NL1 (SEC UD NO:2).

Las Figuras 3-A y 3-B muestran la expresión de NL1 en diversos tejidos tal como se determinó por hibridación in situ del RNA celular.

La Figura 4 muestra las transferencias de Northern de la expresión de los mRNAs del ligando de TIE NL1 en diversos tejidos.

La Figura 5 muestra el efecto de la formación de tubos HUVEC del polipéptido NL1 conjugado con poli-his a una dilución del 1% en un tampón control al 1% (HEPES 10 mM/NaCl 0,14 M/manitol 4%, pH 6,8). Los resultados comparativos con otro homólogo del ligando de TIE nuevo (NL6) y dos ligandos conocidos de TIE, TIE-1 y TIE-2, analizados como fusiones IgG, también se muestran en la Figura.

Descripción detallada de la invención A. Homólogos del ligando y moléculas de ácido nucleico que los codifican

Los homólogos del ligando de TIE de la presente invención incluyen la proteína humana nativa denominada NL1 (SEC ID NO.2). Los homólogos del ligando de TIE de la presente invención están esencialmente libres de otras proteínas con las que se asocian en su entorno natural. Esta definición no está limitada de ninguna manera por los procedimientos por los que se obtienen los homólogos del ligando de TIE de la presente invención, e incluye todos los homólogos del ligando de TIE de la definición, bien purificados de una fuente natural, obtenidos por tecnología del DNA recombinante, sintetizados o preparados mediante cualquier combinación de éstas y/o otras técnicas. Las variantes de secuencia aminoacídica de los homólogos del ligando de TIE nativos de la presente invención deben tener al menos un 90%, preferentemente un 95%, más preferentemente un 98% y todavía más preferentemente un 99% de identidad de secuencia con una secuencia de un homólogo del ligando de TIE humano nativo de longitud completa de la presente invención, o con el dominio de tipo fibrinógeno de un homólogo del ligando de TIE humano nativo de la presente invención. Dichas variantes de secuencia aminoacídica presentan preferentemente una actividad biológica cualitativamente idéntica a la de un homólogo del ligando de TIE nativo.

El término "dominio de fibrinógeno" o "dominio de tipo fibrinógeno" se utiliza para referirse a los aminoácidos desde la posición 278 a la 498 aproximadamente en la secuencia aminoacídica conocida de hTL-1; a los aminoácidos desde la posición 276 a la 496 aproximadamente en la secuencia aminoacídica conocida de hTL-2; a los aminoácidos desde la posición 270 a la 493 aproximadamente en la secuencia aminoacídica de NL1; a los aminoácidos desde la posición 272 a la 491 aproximadamente en la secuencia aminoacídica de NL5; a los aminoácidos desde la posición 252 a la 470 aproximadamente en la secuencia aminoacídica de NL8; a los aminoácidos desde la posición 130 a la 346 aproximadamente en la secuencia aminoacídica de NL4; y a los dominios homólogos en otros homólogos del ligando de TIE. La identidad de secuencia aminoacídica entre el dominio del fibrinógeno del NL-4 y los de hTL-1 y hTL-2 es de aproximadamente el 44%.

El término "molécula de ácido nucleico" incluye las moléculas de RNA, DNA y cDNA. Se entenderá que como resultado de la degeneración del código genético, pueden producirse múltiples secuencias nucleotídicas que codifiquen un homólogo del ligando de TIE dado. La presente invención contempla específicamente cada variación posible de las secuencias nucleotídicas que codifican los homólogos del ligando de TIE de la presente invención, según todas las posibles elecciones de codones. Aunque las moléculas de ácido nucleico que codifican los homólogos del ligando de TIE son capaces preferentemente de hibridar, en condiciones astringentes, con un gen de un homólogo del ligando de TIE natural, puede ser ventajoso producir secuencias nucleotídicas que codifiquen homólogos del ligando de TIE, que posean una utilización distinta del codón. Por ejemplo, los codones pueden seleccionarse para aumentar la tasa de expresión del polipéptido en células huéspedes procariotas o eucariotas determinadas, de acuerdo con la frecuencia con la que un determinado codón se utiliza por la célula. Además, pueden producirse transcritos de RNA con propiedades mejoradas, por ejemplo, la vida media, mediante la elección correcta de las secuencias nucleotídicas que codifican un homólogo del ligando de TIE.

El término "identidad de secuencia" determina el alineamiento de dos secuencias a comparar siguiendo el procedimiento de Clustal de alineamiento de secuencias múltiples (Higgins y col., Comput. Appl. Biosc. 5, 151-153 (1989), y Higgins y col., Gene 73:237-244 (1988)) que se incorpora aquí en la versión 1.6 del programa de biocomputación Lasergene (DNASTAR, Inc., Madison, Wisconsin), o cualquier versión actualizada o equivalente de dicho programa.

La "astringencia" de las reacciones de hibridación es de fácil determinación para un experto en la materia, y por lo general es un cálculo empírico dependiente de la longitud de la sonda, la temperatura de lavado y la concentración de sales. Por lo general, sondas más largas requieren temperaturas más elevadas para una hibridación adecuada, mientras que sondas más cortas necesitan temperaturas menores. La hibridación depende generalmente de la capacidad del DNA desnaturalizado para rehibridarse en presencia de las cadenas complementarias por debajo de la temperatura de fusión. Cuanto mayor es el grado de homología entre la sonda y la secuencia a hibridar, mayor es la temperatura relativa que se puede utilizar. En consecuencia, temperaturas relativamente superiores tenderán a generar las condiciones de reacción más astringentes, mientras que temperaturas menores generarán condiciones menos astringentes. Para detalles adicionales y una explicación de la astringencia de las reacciones de hibridación, véase Ausubel y col., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995).

"Condiciones astringentes" o "condiciones de astringencia alta", tal como se define aquí, pueden identificarse como aquellas que: (1) utilizan una fuerza iónica baja y elevada temperatura para el lavado, por ejemplo cloruro sódico 0,015 M/citrato sódico 0,0015 M/ sodio dodecil sulfato al 0,1% a 50ºC; (2) utilizan durante la hibridación un agente desnaturalizante, como la formamida, por ejemplo, formamida al 50% (v/v) con albúmina sérica bovina al 0,1%/ficoll al 0,1%/polivinilpirrolidona al 0,1%/tampón fosfato sódico 50 mM a pH 6,5 con cloruro sódico 750 mM, citrato sódico 75 mM a 42ºC; o (3) formamida al 50%, 5XSSC (NaCl 0,75 M, citrato sódico 0,075 M), fosfato sódico 50 mM (pH 6,8), pirofosfato sódico 0,1%, 5X solución de Denhardts, DNA de esperma de salmón sonicado (50 g/ml), SDS al 0,1%, y sulfato de dextrano al 10% a 42ºC, con lavados a 42ºC en 0,2XSSC (cloruro sódico/citrato sódico) y formamida al 50% a 55ºC, seguido de un lavado a alta astringencia que consiste en 0,1xSSC con EDTA a 55ºC.

"Condiciones de astringencia moderada" pueden identificarse como las descritas por Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New YorK: Cold Spring Harbor Press, 1989, e incluyen la utilización de una solución de lavado y las condiciones de hibridación (por ejemplo, temperatura, fuerza iónica y % de SDS) menos astringentes que las descritas más arriba. Un ejemplo de condiciones moderadamente astringentes es la incubación a 37ºC durante la noche en una solución que comprende: formamida al 20%, 5XSSC (NaCl 150 mM, citrato trisódico 15 mM (pH 7,6), 5X solución de Denhardts, sulfato de dextrano al 10% y DNA de esperma de salmón desmenuzado y desnaturalizado, seguido por el lavado de los filtros en 1XSSC a aproximadamente 37-50ºC. El experto en la materia reconocerá cómo ajustar la temperatura, la fuerza iónica, etc., según sea necesario para ajustarlos a factores tales como la longitud de la sonda y otros.

El término "etiquetado epitópicamente" cuando se utiliza aquí hace referencia a un polipéptido quimérico que comprende un polipéptido homólogo del ligando de TIE fusionado con un "polipéptido etiqueta". El polipéptido etiqueta tiene suficientes residuos para proporcionar un epitopo contra el que pueda generarse un anticuerpo y es suficientemente corto para que no interfiera con la actividad del polipéptido al que está fusionado. El polipéptido etiqueta también es preferentemente único, de modo que el anticuerpo no reaccione de forma cruzada con otros epitopos. Los polipéptidos etiqueta adecuados tiene generalmente por lo menos seis residuos aminoacídicos y generalmente entre 8 y 50 residuos aminoacídicos (preferentemente, entre 10 y 20 residuos aminoacídicos).

Los términos "actividad biológica" y "activo biológicamente" respecto al homólogo del ligando de TIE de la presente invención hacen referencia a la capacidad de una molécula para unirse específicamente a y señalizar a través de un receptor nativo de un ligando de TIE conocido o aquí descubierto, (referido aquí como un "receptor TIE"), por ejemplo, receptor TIE-2 nativo, o para bloquear la capacidad de un receptor TIE nativo (por ejemplo, TIE-2) para participar en la transducción de señal n. En consecuencia, los ligandos de TIE (nativos y variantes) de la presente invención incluyen los agonistas y antagonistas de un TIE nativo, por ejemplo, el receptor TIE-2. Las actividades biológicas preferidas de los ligandos de TIE de la presente invención incluyen la capacidad para inducir o inhibir la vascularización. La capacidad para inducir la vascularización será útil para el tratamiento te de condiciones biológicas y enfermedades, siendo la vascularización deseable en la curación de heridas, la isquemia y la diabetes. Por otra parte, la capacidad para inhibir o bloquear la vascularización puede, por ejemplo, ser útil en la prevención o atenuación del crecimiento tumoral. Otra actividad biológica preferida es la capacidad para afectar el crecimiento o desarrollo del músculo. Otra actividad biológica preferida es la capacidad para influenciar el desarrollo, la maduración o el crecimiento óseo. Otra actividad biológica preferida es su implicación en la patogénesis del cáncer, como el cáncer de mama. Otra actividad biológica preferida es la capacidad para inhibir el crecimiento celular y/o inducir la apoptosis.

El término "receptor TIE nativo" se utiliza aquí para referirse a un receptor TIE de cualquier especie animal, incluyendo, pero sin limitarse a, los humanos, otros primates superiores, por ejemplo, monos y roedores, por ejemplo, ratas y ratones. La definición incluye específicamente, pero no se limita a, el receptor TIE-2, descrito por ejemplo en la patente internacional WO 95/13387 (publicado el 18 de Mayo de 1995) y el receptor tirosina quinasa de células endoteliales denominado "TIE" en la patente internacional WO 93/14124 (publicada el 22 de Julio de 1993), y preferentemente es TIE-2.

El término "derivado funcional" se utiliza para definir las variantes de secuencia aminoacídica activas biológicamente de los homólogos del ligando de TIE de la presente invención, así como las modificaciones covalentes, incluyendo los derivados obtenidos por reacción con agentes modificadores orgánicos, las modificaciones post-traduccionales, los derivados con polímeros no-proteicos y las inmunoadhesinas.

"Factor de crecimiento endotelial vascular"/"factor de permeabilidad vascular" (VEGF/VPF) es un mitógeno específico de células endoteliales que recientemente se ha demostrado que se estimula por hipoxia y es necesario para la angiogénesis tumoral (Senger y col., Cancer 46:5629-5632 (1986); Kim y col., Nature 362:841-844 (1993); Schweiki y col., Nature 359:843-845 (1992); Plate y col., Nature 359:845-848 (1992)). Es una glicoproteína unida por puentes disulfuro, dimérica de 34-43 KDa (especie predominante de 45 KDz) que se sintetiza y secreta por diversas células normales y tumorales. Además, las células retinales en cultivo como las células epiteliales del pigmento y los pericitos han demostrado que secretan VEGF y que lo sobreexpresan en respuesta a hipoxia (Adamis y col., Biochem. Biophys. Res. Común. 193:631-638 (1993); Plouet y col., Invest. Ophtalmol. Vis.Sci. 34:900 (1992); Adamis y col., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 34:1440 (1993); Aiello y col., Invest. Ophtalmol. Vis. Sci. 35:1868 (1994); Simoree-pinatel y col., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 35:3393-3400 (1994)). Por el contrario, la expresión del VEGF en los tejidos normales es relativamente baja. En consecuencia, VEGF parece que desempeña un papel principal en muchos estados patológicos y procesos relacionados con la neovascularización. La regulación de la expresión de VEGF en los tejidos afectados por las condiciones diversas descritas más arriba podría ser clave en el tratamiento o las terapias preventivas asociadas con la hipoxia.

El término "aislado" cuando se utiliza para describir los polipéptidos diversos descritos aquí, hace referencia a los polipéptidos que se han identificado y separado y/o recuperado de un componente de su entorno natural. Los componentes contaminantes de su entorno natural son materiales que podrían interferir típicamente con las utilizaciones diagnósticas o terapéuticas del polipéptido, y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteicos o no proteicos. En realizaciones preferidas, el polipéptido se purificará (1) a un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de la secuencia aminoacídica N-terminal o interna utilizando un secuenciador spinning cup, o (2) a homogeneidad mediante SDS-PAGE en condiciones reductoras o no-reductoras y revelando con azul de Coomassie o, preferentemente tinción de plata. El polipéptido aislado incluye el polipéptido in situ dentro de las células recombinantes, ya que al menos un componente del entorno natural del homólogo del ligando de TIE no estará presente. Por lo general, sin embargo, el polipéptido aislado se preparará mediante al menos una etapa de purificación.

El término "agonista" se utiliza para referirse a los análogos peptídicos y no peptídicos de los homólogos del ligando de TIE nativo de la presente invención y a los anticuerpos de unión específica con dichos homólogos del ligando de TIE nativo, siempre que tengan la capacidad para transmitir la señal a través del receptor TIE (por ejemplo TIE-2). En otras palabras, el término "agonista" se define en el contexto del papel biológico del receptor de TIE, y no en relación con el papel biológico de un homólogo del ligando de TIE nativo, el cual, tal como se indica más adelante, puede ser un agonista o antagonista de la función biológica del receptor TIE. Los agonistas preferidos son los promotores de la vascularización o los que desempeñan un papel en la formación, maduración o crecimiento óseo. Otros agonistas promueven el crecimiento o desarrollo muscular.

El término "antagonista" se utiliza para referirse a los análogos peptídicos y no peptídicos de los homólogos del ligando de TIE nativo de la presente invención y a los anticuerpos que se unen específicamente a dichos homólogos del ligando de TIE nativo, siempre que tengan la capacidad para inhibir la función biológica de un receptor TIE nativo (por ejemplo, TIE-2). De nuevo, el término "antagonista" se define en el contexto del papel biológico del receptor TIE, y no en relación con la actividad biológica de un homólogo del ligando de TIE, el cual puede ser un agonista o un antagonista de la función biológica del receptor TIE. Los antagonistas preferidos son los inhibidores de la vasculogénesis, o del desarrollo o crecimiento patológico del hueso o del músculo.

Los términos "amplificación génica" y "duplicación génica" se utilizan de forma intercambiable y hacen referencia a un proceso mediante el cual se forman múltiples copias de un gen o fragmento génico en una célula o línea celular determinada. La región duplicada (un fragmento de DNA amplificado) a menudo es referida como "amplicón". Generalmente, la cantidad de RNA mensajero (mRNA) producido, es decir el nivel de expresión génica, también aumenta proporcionalmente al número de copias del gen determinado que se expresa.

"Tumor", tal como se utiliza aquí, hace referencia al crecimiento y proliferación de células neoplásicas, malignas o benignas, y a todas las células y tejidos precancerosos y cancerosos.

Los términos "cáncer" y "canceroso" hacen referencia a, o describen la condición fisiológica en los mamíferos que se caracteriza típicamente por el crecimiento celular descontrolado. Ejemplos de cáncer incluyen, pero no se limitan a, carcinomas, linfomas, blastomas, sarcomas y leucemias. Ejemplos más concretos de dichos cánceres incluyen el cáncer de mama, el cáncer de próstata, el cáncer de colon, el cáncer de células escamosas, el cáncer de pulmón de células pequeñas, el cáncer de pulmón de células no pequeñas, el cáncer gastrointestinal, el cáncer pancreático, el glioblastoma, el cáncer cervical, el cáncer de hígado, el cáncer de vejiga, el hepatoma, el cáncer colorectal, el carcinoma endometrial, el carcinoma de glándulas salivares, el cáncer de riñón, el cáncer de hígado, el cáncer de vulva, el cáncer de tiroides, el carcinoma hepático y diversos tipos de cáncer de cabeza y cuello.

El "tratamiento" es una intervención realizada con la intención de prevenir el desarrollo o de alterar la patología de un trastorno. Según ello, "tratamiento" hace referencia tanto al tratamiento terapéutico y profiláctico como a las medidas preventivas. En aquellos que necesitan el tratamiento se incluyen tanto los que ya han desarrollado el trastorno como en los que se intenta prevenir. En el tratamiento tumoral (por ejemplo, el cáncer), un agente terapéutico puede disminuir directamente la patología de las células tumorales, o convertir las células tumorales en susceptibles al tratamiento mediante la acción de otros agentes terapéuticos, por ejemplo, la radiación y/o la quimioterapia.

La "patología" del cáncer incluye todos los fenómenos que comprometen el bienestar del paciente. Esto incluye, sin limitación, el crecimiento anormal o descontrolado de las células, la metástasis, la interferencia con el funcionamiento normal de las células vecinas, la liberación de citoquinas u otros productos de secreción a niveles anómalos y la supresión o el empeoramiento de la respuesta inmunológica, etc.

El término "mamífero" para propósitos de tratamiento hace referencia a cualquier animal clasificado como un mamífero, incluyendo el hombre, los animales domésticos y de granja, del zoológico, los animales amaestrados para el deporte o de compañía, como perros, caballos, gatos, vacas, etc. Preferentemente, el mamífero es el hombre.

La administración "en combinación con" uno o más agentes terapéuticos incluye la administración simultánea (concurrente) y consecutiva en cualquier orden.

El término "agente citotóxico", tal como se utiliza aquí, hace referencia a una sustancia que inhibe o previene la función de las células y/o causa su destrucción. El término incluye los isótopos radioactivos (por ejemplo, I^{131}, I^{125}, Y^{90} y Re^{186}), agentes quimioterapéuticos, y las toxinas como las toxinas activas enzimáticamente de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, o fragmentos de lo mismo.

Un "agente quimioterapéutico" es un compuesto químico de utilidad en el tratamiento del cáncer. Ejemplos de agentes quimioterapéuticos son la adriamicina, la doxorubinicna, la epirubicina, el 5-fluorouracilo, la citosina arabinósido ("Ara"), la ciclofosfamida, la tiotepa, el busulfán, la citoxina, los taxoides, por ejemplo, el paclitaxel (Taxol, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ), y el doxetaxel (Taxotere, Rhône-Poulenc Rorer, Anthony, Francia), el toxotere, el metrotexato, la cisplatina, el melfalán, la vimblastina, la bleomicina, el etopósido, la ifosfamida, la mitomicina C, el mitoxantron, la vincristina, la vinorelbina, la carboplatina, el tenipósido, la daunomicina, la carminomicina, la aminopterina, la dactinomicina, las mitomicinas, las esperamicinas (véase la patente americana U:S.4.675.187), el melfalán y otras mostazas nitrogenadas relacionadas. También se incluyen en esta definición los agentes hormonales que actúan para regular o inhibir la acción hormonal sobre tumores como el tamoxifen y la onapristona.

Un "agente inhibidor del crecimiento", cuando se utiliza aquí, hace referencia a un compuesto o composición que inhibe el crecimiento de una célula, especialmente una célula cancerosa que sobre-exprese cualquiera de los genes identificados aquí, in vitro o in vivo. En consecuencia, el agente inhibidor del crecimiento es un agente que reduce de forma significativa el porcentaje de esas células que sobre-expresan dichos genes en la fase S. Ejemplos de agentes inhibidores del crecimiento incluyen los agentes que bloquean la progresión del ciclo celular (en un estadio distinto al de la fase S), como los agentes que inducen el paro en fase G1 y en M. Los bloqueantes en fase M incluyen las vincas (vincristina y vimblastina), el taxol, y los inhibidores de la topo II como la doxorubicina, la epirubicina, la daunorubicina, el etopósido y la bleomicina. Los agentes que producen un paro en G1 también lo producen en la fase S, por ejemplo, los agentes alquilantes del DNA como el tamoxifeno, la prednisona, la dacarbacina, la meclorotamina, la cisplatina, el metotrexato, el 5-fluorouracilo, y la ara-C. Información adicional puede hallarse en The Molecular Basis of Cancer, Mendelsonn y Israel, eds., Capítulo 1, titulado "Cell cycle regulation, oncogens and antineoplastic drugs" por Murakami y col., (WB Saunders: Philadelphia, 1995), especialmente la página 13.

La "Doxorubicina" es un antibiótico athraciclina. El nombre químico completo de la doxorubicina es (8S-cis)-10-[(3-amino-2,3,6-tridesoxi-\alpha-L-lixo-hexapiranosil)oxi]-7,8,9,10-tetrahidroxi-8-(hidroxiacetil)-1-metoxi-5,12-naftacenediona.

El término "citoquina" es un término genérico para las proteínas liberadas por una población celular que actúan sobre otra célula como mediadores intercelulares. Ejemplos de dichas citoquinas son las linfoquinas y las hormonas polipeptídicas tradicionales. Entre las citoquinas se incluyen la hormona de crecimiento como la hormona de crecimiento humano, la hormona de crecimiento humano N-metionil y la hormona de crecimiento bovino; la hormona paratifoidea; la tiroxina; la insulina; la proinsulina; la relaxina; la prorelaxina; las hormonas glicoproteicas como la hormona estimulante del folículo (FSH), la hormona estimulante del tiroides (TSH), y la hormona luteinizante (LH); el factor de crecimiento hepático; el factor de crecimiento de fibroblastos; la prolactina; el lactógeno placentario; el factor-\alpha y el \beta de necrosis tumoral; la sustancia inhibidora mülleriana; el péptido asociado a la gonadotropina de ratón; la inhibina; la activina; el factor de crecimiento endotelial vascular; la integrina; la trombopoyetina (TPO); los factores de crecimiento nervioso como el NGF-\beta; el factor de crecimiento plaquetario; los factores de crecimiento transformantes (TGFs) como el TGF-\alpha y el TGF-\beta; el factor-I y II de crecimiento de tipo insulina; la eritropoyetina (EPO); los factores osteoinductores; los interferones como el interferón-\alpha, -\beta y -\gamma, los factores estimuladores de colonias (CSFs) como el CSF de macrófagos (M-CSF); el CSF de granulocitos y macrófagos (GM-CSF); y el CSF de granulocitos (G-CSF); las interleuquinas (ILs) como la IL-1, IL-\alpha, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12; un factor de necrosis tumoral como el TNF-\alpha o el TNF-\beta; y otros factores polipeptídicos incluyendo el LIF y el ligando de kit (KL). Tal como se utiliza aquí, el término citoquina incluye las proteínas de fuentes naturales o del cultivo de células recombinantes y los equivalentes activos biológicamente de las citoquinas de secuencia nativa.

Una "molécula de ácido nucleico aislado" es una molécula de ácido nucleico que se ha identificado y separado de al menos una molécula de ácido nucleico contaminante con la que normalmente está asociada en la fuente natural del ácido nucleico. Una molécula de ácido nucleico aislada es distinta en la forma o el ajuste en la que se halla en la naturaleza. Las moléculas de ácido nucleico aisladas se distinguen en consecuencia de las moléculas de ácido nucleico que existen en las células naturales. Sin embargo, una molécula de ácido nucleico aislado incluye las moléculas de ácido nucleico que normalmente expresan un homólogo del ligando de TIE de la presente invención, si, por ejemplo, la molécula de ácido nucleico se halla en una localización cromosómica distinta a la de las células naturales.

El término "variante de secuencia aminoacídica" hace referencia a moléculas con algunas diferencias en sus secuencias aminoacídicas en comparación con una secuencia aminoacídica nativa.

Las variantes sustitucionales son aquellas en las que al menos se ha eliminado un residuo aminoacídico en una secuencia nativa y se ha reemplazado por un aminoácido diferente en su lugar y en la misma posición. Las sustituciones pueden ser sencillas, en donde sólo se ha sustituido un aminoácido en la molécula, o pueden ser múltiples, si se han sustituido dos o más aminoácidos en la misma molécula.

Las variantes de inserción son aquellas con uno o más aminoácidos insertados inmediatamente adyacentes a un aminoácido en una posición particular en una secuencia nativa. Inmediatamente adyacentes a un aminoácido quiere decir que está conectado con el grupo \alpha-carboxi o \alpha-amino del aminoácido.

Las variantes delecionales son aquellas en las que se ha eliminado uno o más aminoácidos en la secuencia aminoacídica nativa. Comúnmente, las variantes delecionales tendrán uno o dos aminoácidos delecionados en una región determinada de la molécula. Las variantes delecionales incluyen aquellas que presentan deleciones C- o N-terminal (truncaciones), así como las variantes con deleciones internas de uno o más aminoácidos. Las variantes delecionales de la presente invención contienen deleciones fuera del dominio de tipo fibrinógeno de un homólogo del ligando de TIE de la presente invención.

Las variantes de secuencia aminoacídica de la presente invención pueden contener combinaciones diversas de sustituciones, inserciones y/o deleciones aminoacídicas, para producir moléculas con características óptimas.

Los aminoácidos pueden clasificarse de acuerdo con la composición química y las propiedades de sus cadenas laterales. Estos se clasifican en dos grandes grupos, los cargados y los no cargados y cada uno de estos grupos se divide en subgrupos para una clasificación más precisa.

I. Aminoácidos cargados

: Residuos acídicos: ácido aspártico, ácido glutámico

: Residuos básicos: lisina, arginina, histidina

II. Aminoácidos no cargados

: Residuos hidrofílicos: serina, treonina, asparraguina, glutamina

: Residuos alifáticos: glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina

: Residuos no polares: cisteína, metionina, prolina

: Residuos aromáticos: fenilalanina, tirosina, triptófano

Las sustituciones conservadoras implican intercambiar un miembro de un grupo por otro del mismo grupo, mientras que las no conservadoras implican el intercambio de un miembro de una de estas clases por otra. Las variantes obtenidas mediante sustituciones no conservadoras se espera que produzcan como resultado cambios significativos en las propiedades/función de la variante obtenida.

Las deleciones de secuencia aminoacídica abarcan generalmente de 1 a 30 residuos, más preferentemente de 1 a 10 aproximadamente, y típicamente son contiguos. Las deleciones pueden introducirse en regiones no implicadas directamente en la interacción con un receptor TIE nativo. Las deleciones se generan preferentemente fuera de las regiones de tipo fibrinógeno en el extremo C-terminal de los homólogos del ligando de TIE de la presente invención.

Las inserciones aminoacídicas incluyen fusiones amino- y/o carboxi-terminales en un intervalos de longitudes que va desde un residuo a polipéptidos que contienen un centenar o más de residuos, así como inserciones intrasecuencia de residuos aminoacídicos sencillos o múltiples. Las inserciones intrasecuencia (es decir, inserciones dentro de la secuencia aminoacídica del homólogo del ligando de TIE) pueden variar desde aproximadamente 1 a 10 residuos, preferentemente de 1 a 5 residuos, más preferentemente de 1 a 3 residuos. Ejemplos de inserciones terminales incluyen los homólogos del ligando de TIE con un residuo metionil N-terminal, un artefacto de su expresión dirigida en el cultivo de células recombinantes, y la fusión de una secuencia señal N-terminal heteróloga con el extremo N-terminal de la molécula del homólogo del ligando de TIE para facilitar la secreción del homólogo del ligando de TIE a partir de células huésped recombinantes. Las secuencias señal se obtendrán generalmente de, y por tanto los homólogos de, las especies de células huéspedes deseadas. Las secuencias adecuadas incluyen, por ejemplo, STII o lpp para E. coli, el factor alfa para levaduras y las secuencias señal virales como gD del herpes para células de mamífero. Otras variantes insercionales de las moléculas del homólogo del ligando de TIE incluyen la fusión del extremo N- o C-terminal de la molécula homóloga del ligando de TIE con polipéptidos inmunogénicos, por ejemplo, polipéptidos bacterianos como la beta-lactamasa o una enzima codificada por el locus trp de E. coli, o la proteína de levadura, y las fusiones C-terminal con proteínas que tienen una vida media larga como las regiones de inmunoglobulina (preferentemente las regiones constantes de inmunoglobulina), la albúmina, o la ferritina, tal como se describe en la patente internacional WO 89/02922 publicada el 6 de Abril de 1989.

Ya que a menudo es difícil predecir con antelación las características de un homólogo del ligando de TIE variante, se entenderá que es necesario un cierto cribado para seleccionar la variante óptima.

Las variantes de secuencia aminoacídica de los homólogos del ligando de TIE de la presente invención se prepararon mediante procedimientos conocidos en la materia, introduciendo cambios nucleotídicos adecuados en un DNA homólogo del ligando de TIE nativo o variante, o mediante síntesis in vitro del polipéptido de interés. Existen dos variables principales en la construcción de las secuencias aminoacídicas variantes: la localización del sitio de mutación y la naturaleza de la mutación. Con la excepción de los alelos naturales, que no requieren la manipulación de la secuencia de DNA que codifica el homólogo del ligando de TIE, las variantes de secuencia aminoacídica de los homólogos del ligando de TIE se construyeron preferentemente mediante mutación del DNA, para lograr un alelo o una variante de secuencia aminoacídica que no ocurra en la naturaleza.

Un grupo de mutaciones se creará dentro del dominio o dominios de los homólogos del ligando de TIE de la presente invención que se han identificado como los implicados en la interacción con un receptor TIE, por ejemplo TIE-1 o TIE-2.

Alternativa o adicionalmente, las deleciones aminoacídicas pueden producirse en sitios que difieren en los homólogos del ligando de TIE de varias especies, o en regiones altamente conservadas, dependiendo del objetivo a alcanzar.

Los sitios en dichas localizaciones se modificarán generalmente por etapas, por ejemplo (1) sustituyendo primero con elecciones conservadoras y luego con selecciones más radicales dependiendo de los resultados logrados, (2) delecionando el residuo o los residuos diana, o (3) insertando los residuos de la misma o diferente clase adyacentes al sitio localizado, o mediante combinaciones de las opciones 1-3.

Una técnica útil es el "cribado de alaninas" (Cunningham y Wells, Science 244, 1081-1085 [1989]). En dicha técnica, se identifica un residuo o grupo de residuos diana y se sustituyen por alanina o polialanina. Aquellos dominios que demuestran una sensibilidad funcional a las sustituciones por alanina se reanalizan de nuevo introduciendo otras sustituciones o sustituyendo los sitios de alanina.

Después de identificar la(s) mutación(es) deseada(s), la variante de secuencia aminoacídica de un ligando de TIE puede obtenerse, por ejemplo, mediante síntesis química, tal como se describió anteriormente.

Más preferentemente, el DNA que codifica una variante de secuencia aminoacídica de homólogo del ligando de TIE se prepara mediante mutagénesis dirigida del DNA que codifica una variante preparada con antelación o una versión no variante del ligando. La mutagénesis dirigida (específica de sitio) permite la producción de variantes del ligando mediante la utilización de secuencias oligonucleotídicas específicas que codifican la secuencia de DNA con la mutación deseada, así como un número suficiente de nucleótidos adyacentes, para proporcionar una secuencia del cebador de tamaño y complejidad de secuencia suficientes para formar un dúplex estable a ambos lados del desapareamiento de bases en donde se localiza el cambio de interés. Por lo general, es preferible un cebador de aproximadamente 20 a 25 nucleótidos de longitud, con unos 5 a 10 residuos a ambos lados del sitio en donde se ha de alterar la secuencia. Las técnicas de mutagénesis dirigida son bien conocidas en la materia, tal como se especifican en las publicaciones de por ejemplo Edelman y col., DNA 2, 183 (1983). La técnica de la mutagénesis dirigida utiliza un vector de fago que existe en ambas formas, de cadena sencilla y doble. Los vectores típicos de utilidad en la mutagénesis dirigida incluyen los vectores como el fago M13, por ejemplo, descrito por Messing y col., Third Cleveland Symposium Macromolecules and Recombinant DNA, A. Walton, ed., Elsevier, Ámsterdam (1981). Este y otros vectores de fago están disponibles comercialmente y su utilización es bien conocida por los expertos en la materia. Un procedimiento versátil y eficaz para la construcción de mutaciones específicas de sitio dirigidas por oligodesoxiribonucleótidos en fragmentos de DNA utilizando vectores derivados de M13 se publicó por Zoller M.J. y Smith M., Nucleic Acids Res. 10, 6487-6500 [1982]). También, pueden utilizarse vectores plasmídicos que contienen un origen de replicación de fago de cadena sencilla (Veira y col., Meth. Enzymol. 153, 3 [1987]) para obtener un DNA de cadena sencilla. Alternativamente, las susti-
tuciones de nucleótidos se introducen sintetizando el fragmento de DNA adecuado in vitro, y amplificándolo por PCR.

Por lo general, la mutagénesis dirigida se realiza en primer lugar con la obtención de un vector de cadena sencilla que incluye dentro de su secuencia una secuencia de DNA que codifica la proteína relevante. A continuación, se prepara un cebador oligonucleotídico que contenga la mutación deseada, de forma sintética generalmente, por ejemplo mediante el procedimiento de Crea y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 5765 (1978). Este cebador se hibrida con el vector que contiene la secuencia proteica de cadena sencilla, y se somete a enzimas de polimerización del DNA como el fragmento Klenow de la polimerasa I de E. coli para completar la síntesis de la cadena que contiene la mutación. Como resultado se forma un heteroduplex en donde una cadena codifica la secuencia no mutada original y la segunda cadena contiene la mutación deseada. Este vector heteroduplex se utiliza a continuación para transformar células huésped como las células JP101, y se seleccionan los clones que incluyen los vectores que contienen la secuencia mutada. Por último, la región mutada puede extraerse y colocarse en un vector de expresión adecuado para la producción de proteína.

La técnica de PCR también puede utilizarse para generar variantes de secuencia de un homólogo del ligando de TIE. Cuando se utilizan cantidades pequeñas del DNA molde como material de partida en una PCR, pueden utilizarse cebadores que difieran ligeramente en la secuencia de la región correspondiente en el molde de DNA, con el fin de generar cantidades relativamente grandes de un fragmento de DNA específico que difiera de la secuencia molde únicamente en las posiciones en donde difieren los cebadores respecto al molde. Para la introducción de una mutación en un DNA plasmídico, uno de los cebadores se diseña para solapar la posición de la mutación y contener la mutación; la secuencia del otro cebador debe ser idéntica a un fragmento de secuencia de la cadena opuesta del plásmido, pero esta secuencia puede localizarse en cualquier sitio del DNA plasmídico. Sin embargo, es preferible que la secuencia del segundo cebador se localice a unos 200 nucleótidos del primer cebador, de modo que al final pueda secuenciarse fácilmente toda la región amplificada del DNA enmarcada por los cebadores. La amplificación por PCR utilizando un par de cebadores como los descritos da como resultado una población de fragmentos de DNA que difieren en la posición de la mutación especificada por el cebador, y posiblemente en otras posiciones ya que el copiado del molde puede producir errores.

Si el cociente de molde respecto al producto es extremadamente bajo, la gran mayoría de los fragmentos de DNA del producto incorporan la mutación(es) deseada(s). Este producto se utiliza para reemplazar la región correspondiente en el plásmido que sirvió como molde de la PCR con tecnología del DNA estándar. Las mutaciones en posiciones separadas pueden introducirse simultáneamente utilizando un segundo cebador o realizando una segunda PCR con cebadores mutantes distintos y ligando los dos fragmentos de PCR simultáneamente con el fragmento del vector en una ligación de tres partes (o más).

En un ejemplo específico de mutagénesis por PCR, el DNA del plásmido molde (1 \mug) se lineariza por digestión con una endonucleasa de restricción que tiene una diana única de reconocimiento en el DNA plasmídico fuera de la región a amplificar. De este material, se añaden 100 ng a una mezcla de PCR que contiene el tampón de PCR, que contiene los 4 desoxinucleótidos trifosfatos y se incluye en los equipos GeneAmp® (obtenido de Perkin-Elmer CETUR, CT y Emeryville, CA), y 25 pmol de cada cebador oligonucleotídico a un volumen final de 50 \mul. La mezcla de reacción se recubre con 35 \mul de aceite mineral. La reacción se desnaturaliza durante 5 minutos a 100ºC, se coloca brevemente en hielo, y luego se añade 1 \mul de la DNA polimerasa de Thermus aquaticus (Taq) (5 unidades/\mul), de Perkin Elmer CETUR, Norwalk, CT y Emeryville, CA) por debajo de la capa de aceite mineral. La mezcla de reacción se inserta en un termoclador de DNA (de Perkin-Elmer Cetus) y se programa de la manera siguiente:

2 mon a 55ºC

30 s a 72ºC, luego 19 ciclos de:

30 s a 94ºC

30 s a 55ºC y

30 s a 72ºC

Al término del programa, se extrae el vial de la reacción del termociclador y se transfiere la fase acuosa a un nuevo vial, se extrae con fenol/cloroformo (50:50 vol) y se precipita con etanol, el DNA se recupera mediante procedimientos estándares. Este material se somete a continuación a tratamientos adecuados para la inserción en un vector.

Otro procedimiento para la preparación de variantes, la mutagénesis por casete, se basa en la técnica descrita por Wells y col., [Gene 34, 315 (1985)]. El material de partida es el plásmido (o el vector) que comprende el DNA del homólogo del ligando de TIE a mutar. En primer lugar, se identifica el codón(es) dentro del homólogo del ligando de TIE a mutar. Debe existir una diana única de endonucleasa de restricción en cada lado de la mutación(es) identificada(s). Si no existieran dichas dianas, se generarían utilizando el procedimiento descrito más arriba de mutagénesis mediada por oligonucleótidos para introducir las localizaciones adecuadas en el DNA que codifica el homólogo del ligando de TIE. Después de introducir las dianas de restricción en el plásmido, éste se corta por dichas dianas para linearizarlo. Se sintetiza un oligonucleótido de doble cadena que codifica la secuencia del DNA entre las dos dianas pero que contiene la mutación(es) deseada(s) utilizando procedimientos estándares. Las dos cadenas se sintetizan separadamente y luego se hibridan juntas mediante técnicas estándares. Este oligonucleótidos de doble cadena se denomina casete. Este casete se diseña para tener extremos 3' y 5' compatibles con los extremos del plásmido linearizado, de modo que pueda ligarse directamente con el plásmido. Este plásmido contiene ahora la secuencia de DNA del homólogo del ligando de TIE mutado.

Adicionalmente, puede ser útil para generar las variantes de secuencia de los homólogos del ligando de TIE el procedimiento denominado de expresión en fagémidos. Este procedimiento implica (a) construir un vector de expresión replicable que comprende un primer gen que codifica un receptor a mutar, un segundo gen que codifica al menos una porción de una proteína de la cubierta del fago de tipo salvaje, en donde el primer y segundo gen son heterólogos, y un elemento regulador de la transcripción unido operativamente al primer y segundo gen, formando así un gen de fusión que codifica una proteína de fusión; (b) mutar el vector en una o más posiciones seleccionadas dentro del primer gen, formando así una familia de plásmidos relacionados; (c) transformar las células huésped adecuadas con los plásmidos; (d) infectar las células huésped transformadas con un fago auxiliar que tiene un gen que codifica la proteína de la cubierta del fago; (e) cultivar las células huésped transformadas en condiciones adecuadas para formar partículas de fagémidos recombinantes que contienen al menos una porción del plásmido y son capaces de transformar el huésped; y en donde las condiciones se ajustan para que no más de una pequeña cantidad de partículas de fagémidos expresen más de una copia de la proteína de fusión en la superficie de la partícula; (f) contactar las partículas de fagémidos con un antígeno adecuado para que al menos una porción de las partículas de fagémidos se una al antígeno; y (g) separar las partículas de fagémidos que se unen de las que no se unen. Las etapas (d) a (g) pueden repetirse una o más veces. Preferentemente, en este procedimiento el plásmido se halla bajo el control de un elemento regulador de la transcripción, y las condiciones de cultivo se ajustan para que la cantidad o el número de partículas de fagémido que expresen más de una copia de la proteína de fusión en la superficie de la partícula sea inferior al 1%. Preferentemente, la cantidad de partículas de fagémidos que expresan más de una copia de la proteína de fusión es inferior al 10% de la cantidad de partículas de fagémidos que expresan un sóla copia de la proteína de fusión. Y más preferentemente, la cantidad es inferior al 20%. De forma característica en este procedimiento, el vector de expresión contiene una secuencia señal secretora fusionada con el DNA que codifica cada una de las subunidades del polipéptido y el elemento regulador de la transcripción será un sistema de promotor. Los sistemas de promotor preferidos se seleccionan de entre los promotores lac Z, \lambda_{PL}, Tac, polimerasa T7, triptófano y la fosfatasa alcalina y combinaciones de éstos. Normalmente, el procedimiento utilizará un fago auxiliar seleccionado de entre M13K07, M13R408, M13-VCS y PhiX174. El fago auxiliar preferido es el M13K07 y la proteína de cubierta preferida es la proteína de cubierta del gen III del fago M13. El huésped preferido es E. coli y las cepas de E. coli deficientes en proteasas.

Detalles adicionales de las técnicas de mutagénesis descritas y otras similares se hallan en libros de texto generales, como por ejemplo, Sambrook y col., Molecular Cloning: A laboratory Manual (New York:Cold Spring Harbor, Laboreatory Press, 1989), y Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel y col., eds., Wiley-Interscience, 1991.

Las "inmunoadhesinas" son quimeras que tradicionalmente se construyen a partir de una secuencia de receptor unida a una secuencia de dominio constante de inmunoglobulina adecuada (inumnoadhesinas). Dichas estructuras son bien conocidas en la materia. Las inmunoadhesinas publicadas en la literatura incluyen las fusiones del receptor de célula T* [Gascoigne y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 2936-2940 (1987)]; CD4* [Capon y col., Nature 337, 525-531 (1989); Traunecker y col., Nature 339, 68-70 (1989); Zettmeissi y col., DNA Cell Biol USA 9, 347-353 (1990); Byrn y col., Nature 344, 667-670 (1990)]; L-selectina (receptor homing) [Watson y col., J. Cell Biol. 110:2221-2229 (1990); Watson y col., Nature 349, 164-167 (1991)]; CD44* [Aruffo y col., Cell 61, 1303-1313 (1990)]; C28* y B7* [Lindsey y col., J. Exp. Med. 173, 721-730 (1991)]; CTLA-4* [Lisley y col., J. Exp. Med. 174, 561-569 (1991)]; CD22* [Stamenkovic y col., Cell 66, 1133-1144 (1991)]; receptor del TNF [Ashkenazi y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 10535-10539 (1991); Lesslauer y col., Eur. J. Immunol. 27, 2883-2886 (1991); Peppel y col., J. Exp. Med. 174, 1483-1489 (1991)]; receptores de NP [Bennett y col., J. Biol. Chem. 266, 23060-23067 81991)]; cadena-\alpha del receptor de IgE* [Ridgway y Gorman, J. Cell. Biol. 115, abstr. 1448 81991)]; receptor HGF [Mark, M.R. y col., 1992, J. Biol. Chem. sometido a publicación], en donde el asterisco (*) indica que el receptor es un miembro de la superfamilia de inmunoglobulinas.

Las quimeras de ligando-inmunoglobulina también son conocidas y se describen en por ejemplo las patentes americanas U.S. 5.034.640 (para los ligandos de L-selectina); 5.316.921 y 5.328.837 (para las variantes de HGF). Estas quimeras pueden generarse de manera similar a la construcción de las quimeras receptor-inmunoglobulina.

Las modificaciones covalentes de los homólogos del ligando de TIE de la presente invención se incluyen dentro del ámbito de la misma. Dichas modificaciones se introducen generalmente haciendo reaccionar residuos aminoacídicos específicos del homólogo del ligando de TIE con un agente modificador orgánico que es capaz de reaccionar con residuos laterales o terminales seleccionados, o mediante mecanismos de harnessing o mediante modificaciones post-traduccionales que funcionan en células huésped recombinantes seleccionadas. Los derivados covalentes resultantes son útiles en los programas dirigidos a la identificación de residuos importantes para la actividad biológica, para los inmunoensayos o para la preparación de anticuerpos anti-homólogos del ligando de TIE para la purificación por inmunoafinidad del recombinante. Por ejemplo, la inactivación completa de la actividad biológica de la proteína después de la reacción con nihidrina sugiere que al menos un residuo arginil o lisil es crítico para su actividad, y posteriormente los residuos individuales que se modificaron en las condiciones seleccionadas se identifican por aislamiento de un fragmento peptídico que contiene el residuo aminoacídico modificado. Dichas modificaciones se hallan dentro de las competencias del experto en la materia y se realizan sin excesiva experimentación.

Los residuos cisteinil reaccionan comúnmente con \alpha-haloacetatos (y las correspondientes aminas), como el ácido cloroacético o la cloroacetamida, para generar derivados carboximetil o carboxiamidometil. Los residuos cisteinil también se derivan mediante reacción con bromotrifluoroacetona, \alpha-bromo-\beta(5-imidozoil)ácido propiónico, cloroacetil fosfato, N-alquilmaleimidas, 3-nitro-2-piridil disulfuro, metil 2-piridil disulfuro, p-colromercuribenzoato, 2-cloromercuri-4-nitrofenol, o cloro-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol.

Los residuos histidil se derivan mediante reacción con dietilpirocarbonato a pH 5,5-7,0 porque este agente es relativamente específico para la cadena lateral histidil. También es útil el para-bromofenacilbromuro; la reacción se realiza preferentemente en cacodilato sódico 0,1 M a pH 6,0.

Los residuos lisinil y amino-terminales se hacen reaccionar con ácido succínico u otros anhídridos de ácido carboxílico. La modificación con estos agentes tiene el efecto de invertir la carga de los residuos lisinil. Otros reactivos adecuados para la modificación de residuos que contienen \alpha-amino incluyen los imidoésteres como el metil picolinimidato; el fosfato de piridoxal; el piridoxal; el clorobrohidruro; el ácido trintrobencenosulfónico; O-metilisourea; 2,4-pentanediona; y la reacción catalizada por transaminasas con glioxilato.

Los residuos arginil se modifican mediante reacción con uno o más reactivos convencionales, entre los que se hallan el fenilglioxal, 2,3-butanediona, 1,2-ciclohexanediona y la nihidrina. La modificación de los residuos de arginina requiere que la reacción se realice en condiciones alcalinas debido al elevado pK_{a} del grupo funcional de la guanidina. Además, estos reactivos pueden reaccionar con los grupos de lisina así como con el grupo épsilon-amino de la arginina.

La modificación específica de los residuos de tirosil puede realizarse, con interés particular en la introducción de marcajes espectrales en residuos tirosil mediante reacción con compuestos aromáticos de diazonio o tetranitrometano. Más comúnmente, se utilizan el N-acetilimidizol y el tetranitrometano para formar especies de O-acetil tirosil y derivados 3-nitro, respectivamente. Los residuos tirosil se yodina utilizando I^{125} o I^{131} para preparar proteínas marcadas para utilizar en el radioinmunoensayo.

Los grupos laterales carboxil (aspartil o glutamil) se modifican selectivamente mediante reacción con carbodiimidas (R'-N=C=N-R') como la 1-ciclohexil-3-(2-morfolinil-4-etil) carbodiimida o 1-2til-3-(4-azonia-4,4-dimetilpentil) carbodiimida. Además, los residuos aspartil y glutamil se convierten en residuos asparraguinil y glutamil mediante reacción con iones de amoníaco.

Los residuos glutamil y asparraguinil se desaminan frecuentemente en los residuos correspondientes glutamil y aspartil. Alternativamente estos residuos se desaminan en condiciones ligeramente acídicas. Cualquier forma de estos residuos se halla dentro del ámbito de la presente invención.

Otras modificaciones incluyen la hidroxilación de prolina y lisina, la fosforilación de grupos hidroxilo de seril, treonil o tirosil, la metilación de los grupos \alpha-amino de las cadenas laterales de lisina, arginina e histidina (T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 [1983]), la acetilación del grupo amino N-terminal y la amidación del grupo carboxilo C-terminal. Las moléculas pueden posteriormente unirse covalentemente a polímeros no proteicos, por ejemplo el polietilén glicol, el propilén glicol o los polioxialquilenos, en la forma recogida en la patentes americanas U.S. 07/275.296 o 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144; 4. 670.417; 4.791.192 o 4.179.337.

La modificación con agentes bifuncionales es útil para preparar agregados intramoleculares del ligando de TIE con polipéptidos, así como la unión del polipéptido del ligando de TIE con una matriz o superficie de soporte insoluble en agua para utilizar en ensayos o purificación por afinidad. Además, el estudio de uniones intracatenarias proporcionará la información directa sobre la estructura conformacional. Los agentes de unión incluyen el 1,1-bis(diazoacetil)-2-feniletano, el glutaraldehido, ésteres de N-hidroxisuccinimido, imidoésteres homobifuncionales y maleimidas bifuncionales. Dichos agentes de modificación como el metil-3-[(p-azidofenil) ditio]propioimidiato rinden intermediarios fotoactivables capaces de formar uniones en presencia de luz. Alternativamente, las matrices reactivas insolubles en agua como los carbohidratos activados por bromuro de cianógeno y los sistemas que reactivan sustratos descritos en la patente americana U.S. 3.959.642; 3.959.642; 3.969.287; 3.691.16; 4.195.128; 4.247.642; 4.229.537; 4.055.635; y 4.330.440 se utilizan para la inmovilización y unión de proteínas.

Ciertas modificaciones post-traduccionales son el resultado de células huésped recombinantes sobre el polipéptido expresado. Los residuos glutaminil y asparraginil se desaminan frecuentemente post-traduccionalmente a los correspondientes residuos glutamil y aspartil. Alternativamente, estos residuos se desaminan en condiciones ligeramente acídicas. Cualquier forma de estos residuos se halla dentro del ámbito de la presente invención.

Otras modificaciones post-traduccionales incluyen la hidroxilación de prolina y lisina, la fosforilación de grupos hidroxil de seril, treonil o tirosil, la metilación de grupos \alpha-amino de las cadenas laterales de lisina, arginina e histidina (T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 [1983]).

Otros derivados comprenden los péptidos nuevos de la presente invención unidos covalentemente a un polímero no proteico. Dicho polímero es generalmente un polímero sintético hidrofílico, es decir un polímero que no se halla en la naturaleza. Sin embargo, los polímeros que existen en la naturaleza y se producen mediante procedimientos de recombinación o in vitro son también útiles, al igual que los polímeros aislados de la naturaleza. Los polímeros de polivinil hidrofílicos se hallan dentro del ámbito de la presente invención, por ejemplo el polivinil alcohol y la polivinilpirrolidona. Particularmente útiles son los éteres de polivinilalquileno como el polietilén glicol y el polipropilén glicol.

Los homólogos del ligando de TIE pueden unirse a diversos polímeros no proteicos, como el polietilén glicol (PEG), el polipropilén glicol o los poliaoxialquilenos, en la forma descrita en las patente americanas U.S. 4.640.835; 4.496.689;4.301.144; 4.670.417; 4.791.192 o 4.179.337. Estas variantes al igual que la inmunoadhesina de la presente invención se espera que tengan un vida media más prolongada que los correspondientes ligandos de TIE nativos.

Los homólogos del ligando de TIE pueden atraparse en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial, en sistemas de liberación de fármacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microsferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas), o en macroemulsiones. Dichas técnicas se describen en Remmington Pharmaceutical Sciences, 16ª Edición, Osol, A., Ed. (1980).

B. Anticuerpos anti-homólogos del ligando de TIE

La presente invención abarca los anticuerpos agonistas y antagonistas que se unen específicamente a homólogos del ligand de TIE. Los anticuerpos pueden ser monoclonales o policlonales, e incluyen, sin limitación, anticuerpos maduros, fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, Fab, F(ab')_{2}, Fv, etc.), anticuerpos de cadena sencilla y combinaciones de diversas cadenas.

El término "anticuerpo" se utiliza en el sentido más amplio y abarca específicamente los anticuerpos monoclonales (incluyendo los anticuerpos agonistas, antagonistas y los neutralizantes) que se unen específicamente a un homólogo del ligando de TIE de la presente invención y a las composiciones de anticuerpos con especificidad poliepitópica.

El término "anticuerpo monoclonal" tal como se utiliza aquí hace referencia a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos esencialmente homogéneos, es decir, anticuerpos individuales que comprenden una población idéntica excepto por posibles mutaciones que pueden estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos al estar dirigidos a un único sitio antigénico. Además, al contrario que las preparaciones de anticuerpos convencionales (policlonales) que incluyen generalmente anticuerpos distintos dirigidos contra determintes diferentes (epitopos), cada anticuerpo monoclonal está dirigido a un único determinante en el antígeno.

Los anticuerpos monoclonales incluyen anticuerpos híbridos y recombinantes producidos por ayuste de un dominio variable (incluyendo el hipervariable) de un anticuerpo anti-homólogo del ligando de TIE con un dominio constante (por ejemplo, anticuerpos "humanizados"), o una cadena ligera con una cadena pesada, o una cadena de una especie con una cadena de otra especie, o fusiones con proteínas heterólogas, independientemente de la especie de origen o la denominación de clase o subclase de inmunoglobulina, así como fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, Fab, F(ab')_{2}, y Fv), siempre que presenten la actividad biológica deseada. Véase, por ejemplo, la patente americana U.S. 4.816.567 y Mage y col., en Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 79-97 (Marcel Dekker, Inc., New Cork, 1987).

Según ello, el modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo como el obtenido de una población homogénea de anticuerpos, y no debe considerarse que se requiere una producción de anticuerpos mediante cualquier procedimiento en particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales a utilizar de acuerdo con la presente invención pueden generarse mediante el procedimiento del hibridoma descrito por primera vez por Kohler y Milstein, Nature, 256:495 (1975), o pueden generarse mediante procedimientos del DNA recombinante como los descritos en la patente americana U.S. 4.816.567. Los "anticuerpos monoclonales" también pueden aislarse de librerías de fagos generadas por técnicas descritas en McCafferty y col., Nature, 348:552-554 (1990), por ejemplo.

Las formas "humanizadas" de los anticuerpos no-humanos (por ejemplo los murinos) son inmunoglobulinas quiméricas específicas, cadenas de inmunoglobulinas, o fragmentos de lo mismo (como Fv, Fab, Fab', F(ab')_{2} u otras subsecuencia de unión antigénicas de anticuerpos) que contienen una secuencia mínima derivada de una inmunoglobulina no-humana. En su mayoría, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que se han sustituido residuos de una región de determinación de la complementariedad (CDR) del receptor por residuos de una CDR de especie no humana (anticuerpo donante) como el ratón, rata, o conejo y que tienen la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, se sustituyen residuos de la región de entramado (FR) de la inmunoglobulina humana por los residuos correspondientes no humanos. Además, el anticuerpo humanizado puede comprender residuos que no se hallen ni en el anticuerpo receptor ni en la CDR ni secuencias de entramado importadas. Estas modificaciones se realizan para posteriormente poder ajustar y optimizar el anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá esencialmente todos o al menos un dominio variable, típicamente dos, en el que todas o esencialmente todas las regiones CDR correspondan con las de una inmunoglobulina no humana y todas o esencialmente todas las regiones FR sean las una secuencia consenso de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado comprenderá óptimamente al menos una porción de una región constante o dominio (Fc) de inmunoglobulina, típicamente el de una inmunoglobulina humana.

Los anticuerpos policlonales contra el homólogo del ligando de TIE de la presente invención se generan generalmente en animales mediante inyecciones múltiples subcutáneas (sc) o intraperitoneales (ip) del homólogo del ligando de TIE y un adyuvante. Puede ser útil conjugar el homólogo del ligando de TIE o un fragmento del mismo que contenga la secuencia aminoacídica diana con una proteína que sea inmunogénica en las especies a inmunizar, por ejemplo, la hemocianina de la lapa, la seroalbúmina, la tiroglobulina bovina o el inhibidor de la tripsina de soja con un agente bifuncional o modificador, por ejemplo, el éster maelimidobenzoil sulfosuccinimida (conjugación a través de los residuos de cisterna), N-hidroxisuccinimida (a través de los residuos de lisina), glutaraldehido, anhídrido succínico, SOCl_{2}, o R^{1}N=C=NR, en donde R y R^{1} son grupos alquil distintos.

Los animales se inmunizan contra los conjugados inmunogénicos o los derivados mediante combinación de 1 mg o 1 \mug del conjugado (para conejos o ratones, respectivamente) con 3 volúmenes de adyuvante completo de Freund e inyección de la solución intradérmicamente en sitios múltiples. Un mes más tarde, los animales se estimulan de nuevo con 1/5 a 1/10 de la cantidad original del conjugado en adyuvante completo de Freund mediante inyección subcutánea en sitios múltiples. De 7 a 14 días más tarde, se sangran los animales y se analiza el suero para titular el anticuerpo anti-homólogo del ligando de TIE, pero conjugado a una proteína distinta y/o a través de un agente de unión. Los conjugados también pueden generarse en el cultivo de células recombinantes como proteínas de fusión. También pueden utilizarse agentes agregantes como el alumbre para aumentar la respuesta inmune.

Los anticuerpos monoclonales se obtienen de una población de anticuerpos esencialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales de la población son idénticos excepto por las posibles mutaciones que ocurren de forma natural y que pueden estar presentes en pequeñas cantidades. En consecuencia, el modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo como no perteneciente a una mezcla discreta de anticuerpos. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales anti-homólogo del ligando de TIE de la invención pueden generarse utilizando el procedimiento del hibridoma descrito por primera vez por Kohler & Milstein, Nature 256:495 (1975), o pueden generarse mediante procedimientos del DNA recombinante [Cabilly y col., patente americana U.S. 4.816.567].

En el procedimiento del hibridoma, un ratón u otro animal huésped adecuado, como el hámster se inmuniza tal como se describió anteriormente para generar los linfocitos que producirán o serán capaces de producir los anticuerpos que se unirán específicamente a la proteína utilizada para la inmunización. Alternativamente, los linfocitos pueden inmunizarse in vitro. Los linfocitos se fusionan a continuación con las células de mieloma utilizando un agente de fusión adecuado, como el polietilén glicol, para formar una células de hibridoma [Goding, Monoclonal Antibdies: Principle and Practice, pp. 59-103 (Academia Press, 1986)].

Las células de hibridoma así preparadas se siembran y crecen en un medio de cultivo adecuado que contiene preferentemente una o más sustancias que inhiben el crecimiento o la supervivencia de células de mieloma no fusionadas, parentales. Por ejemplo, si las células de mieloma parentales carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforribosil transferasa (HGPRTo HPRT), el medio de cultivo típico para los hibridomas incluirá hipoxantina, aminopterina y timidina (medio HAT), sustancias que evitan el crecimiento de las células deficientes en HGPRT.

Las células de mieloma preferidas son aquellas que se fusionan eficientemente, soportan elevados niveles de expresión del anticuerpo por las células productoras del anticuerpo seleccionado y son sensibles a un medio como el HAT. Entre las líneas celulares de mieloma preferidas están las líneas de mieloma murino, las derivadas de los tumores de ratón MOPC-21 y MOPC-11 disponibles por el Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California USA y las células SP-2 disponibles del American Type Culture Collection, Rockville, Maryland USA. También se han descrito para la producción de anticuerpos monoclonales las líneas celulares de mieloma humano y heteromieloma de ratón-humano [Kozbor, J. Immunol. 133:3001 (1984); Brodeur, y col., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc. New York, 1987)].

El medio de cultivo en el que se crecen las células de hibridoma se analiza para la producción de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el homólogo del ligando de TIE. Preferentemente, la especificidad de unión de los anticuerpos monoclonales producidos por las células de hibridoma mediante inmunoprecipitación o mediante un ensayo de unión in vitro, como el radioinmunoensayo (RIA) o el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA).

La afinidad de unión del anticuerpo monoclonal puede, por ejemplo, determinarse por el análisis de Scatchard de Munson & Pollard, Anal. Biochem. 107:220 (1980).

Después de identificar las células de hibridoma que producen anticuerpos con la especificidad, afinidad y/o actividad deseadas, los clones se pueden subclonar mediante procedimientos de dilución limitante y crecer mediante procedimientos estándares. Coding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-104 (Academia Press, 1986). Medios de cultivo adecuados para este propósito incluyen, el Medio Mínimo de Eagle Modificado por Dublbecco o el RPMI-1640. Además, las células de hibridoma pueden crecerse in vivo como tumores de ascitas en un animal.

Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones se separan de forma adecuada del medio de cultivo, fluido ascítico o del suero mediante procedimientos convencionales de purificación de inmunoglobulinas como, por ejemplo, proteína A-Sepharose, cromatografía en hidroxiapatita, electroforesis en gel, diálisis o cromatografía de afinidad.

El DNA que codifica los anticuerpos monoclonales de la invención se aísla fácilmente y se secuencia utilizando procedimientos convencionales (por ejemplo, sondas oligonucleotídicas que son capaces de unirse específicamente a genes que codifican las cadenas pesadas y ligeras de los anticuerpos murinos). Las células de hibridomas de la invención sirven como fuente preferida de dicho DNA. Una vez aislado, el DNA se puede colocar en vectores de expresión, que a continuación se transfectan en células huésped como las células COS de mono, células de ovario de hámster chino (CHO), o las células de mieloma que de otra manera no producirían proteína inmunoglobulínica, para obtener la síntesis de los anticuerpos monoclonales en las células huésped recombinantes. El DNA también puede modificarse, por ejemplo, sustituyendo la secuencia codificante de los dominios constantes de cadena ligera y pesada humanas en lugar de las secuencias murinas homólogas, Morrison y col., Proc. Natl. Acad. Sci. 81, 6851 (1984), o mediante unión covalente de toda o parte de la secuencia codificante de la inmunoglobulina con toda o parte de la secuencia codificante de un polipéptido no inmunoglobulínico. De esta manera, los anticuerpos "quiméricos" o "híbridos" se preparan para que tengan la especificidad de unión de un anticuerpo monoclonal anti- ligando de TIE de la presente invención.

De forma característica, dichos polipéptidos no-inmunoglobulínicos se sustituyen por los dominios constantes de un anticuerpo de la invención, o se sustituyen por los dominios variables de un sitio de combinación antigénica de un anticuerpo de la invención para crear un anticuerpo bivalente quimérico que comprende un sitio de combinación antigénica con la especificidad para un homólogo del ligando de TIE de la presente invención y otro sitio de combinación antigénica con especificidad para un antígeno distinto.

Los anticuerpos quiméricos o híbridos también pueden prepararse in vitro mediante procedimientos conocidos en la química de proteínas sintéticas, incluyendo aquellos que implican agentes de unión. Por ejemplo, las inmunotoxinas pueden construirse utilizando una reacción de intercambio de disulfuros o formando un enlace tioéter. Ejemplos de reactivos adecuados para este propósito incluyen el iminotiolato y el metil-4-mercaptobutirimidato.

Para aplicaciones diagnósticas, los anticuerpos de la invención se marcarán de forma característica con una porción detectable. Dicha porción detectable puede ser cualquiera capaz de producir, bien de forma directa o indirecta una señal detectable. Por ejemplo, la porción detectable puede ser un radioisótopo, como el H^{3}, C^{14}, P^{32}, S^{35} o I^{125}, un compuesto fluorescente o quimioluminiscente, como el isotiocianato de fluoresceína, la rodamina, o la luciferina; la biotina; marcajes isotópicos radioactivos, como por ejemplo I^{125}, P^{32}, C^{14}, o H^{3}, o una enzima como la fosfatasa alcalina, la beta-galactosidasa o la peroxidasa de rábano.

Para la conjugación separadamente del anticuerpo con la porción detectable, puede utilizarse cualquier procedimiento conocido en la materia, incluyendo los procedimientos descritos por Hunter y col., Nature 144:945 (1962); David y col., Biochemistry 13:1014 (1974); Pain y col., J. Immunol. Meth. 40:219 (1981); y Nygren, J. Histochem. And Cytochem. 30:407 (1982).

Los anticuerpos de la presente invención pueden utilizarse en cualquier procedimiento de ensayo conocido, como los ensayos de unión competitiva, los ensayos sandwich directos e indirectos y los ensayos de inmunoprecipitación. Zola, Monoclonal Antibodies:A Manual Techniques, pp. 147-158 (CRC Press, Inc. 1987).

Los ensayos de unión competitiva se basan en la capacidad de un estándar marcado (que puede ser un homólogo del ligando de TIE o una porción reactiva inmunológicamente del mismo) para competir con el analito de la muestra a analizar (homólogo del ligando de TIE) por la unión con una cantidad limitada de anticuerpo. La cantidad de homólogo del ligando de TIE en la muestra a analizar es inversamente proporcional a la cantidad estándar que se une a los anticuerpos. Para facilitar la determinación de la cantidad de estándar que se une, los anticuerpos se insolubilizan generalmente antes o después de la competición, de modo que el estándar y el analito que se unen a los anticuerpos pueden separarse de forma conveniente del estándar y el analito que permanecen sin unir.

Los ensayos sandwich implican la utilización de dos anticuerpos, cada uno capaz de unirse a una porción inmunogéncia distinta o epitopo, de la proteína a detectar. En un ensayo sandwich, el analito de la muestra a analizar se une por un primer anticuerpo que está inmovilizado en un soporte sólido, y a continuación se une un segundo anticuerpo al analito, formándose de esta manera un complejo de tres partes insoluble. David & Green, patente americana U.S. 4.376.110. El segundo anticuerpo puede marcarse con una porción detectable (ensayo sandwich directo) o puede cuantificarse con una anticuerpo anti-inmunoglobulina que está marcado con una porción detectable (ensayo sándwich indirecto). Por ejemplo, un tipo de ensayo sándwich es un ensayo ELISA, en el que la porción detectable es una enzima.

Los procedimientos para la humanización de anticuerpos no-humanos son bien conocidos en la materia. Por lo general, un anticuerpo humanizado tiene uno o más residuos aminoacídicos introducidos a partir de una fuente no humana. Estos residuos aminoacídicos no humanos a menudos son referidos como residuos de "importación", los cuales se obtienen generalmente de un dominio variable de "importación". La humanización puede realizarse esencialmente siguiendo el procedimiento de Winter y colaboradores [Jones y col., Nature 321, 522-525 (1986); Riechmann y col., Nature 332-327 (1988); Verhoeyen y col., Science 239, 1534-1536 (1988)], en donde las secuencias de CDRsCDRs o CDR de ratón sustituyen las correspondientes secuencias de un anticuerpo humano. Según ello, dichos anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos (Cabilly, supra), en donde esencialmente menos de un dominio variable humano intacto se ha sustituido por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son anticuerpos humanos en los que algunos residuos CDR y posiblemente algunos residuos FR se sustituyen por los residuos de sitios análogos en anticuerpos de roedor.

Es importante que los anticuerpos se humanicen con retención de una elevada afinidad por el antígeno y otras propiedades biológicas favorables. Para lograr dicho objetivo, según un procedimiento preferido, los anticuerpos humanizados se preparan mediante un proceso de análisis de las secuencias parentales y diversos productos humanizados conceptuales utilizando modelos tridimensionales de las secuencias humanizadas parentales. Los modelos de inmunoglobulina tridimensionales están por lo general disponibles y son familiares a los expertos en la materia. Existen programas informáticos que ilustran y muestran las estructuras conformacionales en tres dimensiones de las secuencias de inmunoglobulina candidatas seleccionadas. La inspección de estas estructuras permite analizar la posible función de los residuos de la secuencia de inmunoglobulina candidata, es decir, analizar los residuos que influencian la capacidad de la inmunoglobulina candidata a unirse a su antígeno. De este modo, los residuos FR pueden seleccionarse y combinarse a partir de la secuencia consenso y de importación con el fin de lograr las características del anticuerpo de interés, como por ejemplo una afinidad aumentada hacia el antígeno(s) diana(s). Por lo general, los residuos CDR están directa y más esencialmente implicados en influenciar la unión con el antígeno. Para otros detalles, véase la solicitud de patente americana U.S. 07/934.373 registrada el 21 de Agosto de 1992, la cual es una continuación de una parte de la solicitud 07/715.272, registrada el 14 de Junio de 1991.

Alternativamente, es posible producir animales transgenicos (por ejemplo ratones) que tras la inmunización sean capaces de producir un repertorio completo de anticuerpos humanos en ausencia de producción endógena de inmunoglobulina. Por ejemplo, se ha descrito que la deleción homocigota del gen de la región de unión de la cadena pesada del anticuerpo (JH) en ratones mutantes de línea germinal resulta en la inhibición completa de la producción endógena del anticuerpo. La transferencia de la serie de genes de inmunoglobulina de línea germinal en dichos ratones mutantes de línea germinal resultará en la producción de anticuerpos humanos tras el estímulo antigénico. Véase, por ejemplo, Jakobovits y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 2551-2555 (1993); Jakobovits y col., Nature 362, 255-258
(1993).

Los anticuerpos biespecíficos son anticuerpos monoclonales, preferentemente humanos o humanizados, que tienen especificidades para al menos dos antígenos distintos. En el caso actual, una de las especificidades es para un homólogo del ligando de TIE particular, la otra es para otro antígeno, y preferentemente para otro ligando. Por ejemplo, los anticuerpos biespecíficos se unen específicamente a dos homólogos del ligando de TIE distintos que se hallan dentro del ámbito de la presente invención.

Los procedimientos para los anticuerpos biespecíficos son conocidos en la materia.

Tradicionalmente, la producción recombinante de anticuerpos biespecíficos se basa en la coexpresión de dos parejas de cadena ligera-cadena pesada de inmunoglobulina, en donde las dos cadenas pesadas tienen especificidades distintas (Millstein y Cuello, Nature 305, 537-539 (1983)). Debido a la reordenación aleatoria de las cadenas de inmunoglobulina pesada y ligera, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de 10 moléculas de anticuerpo distintas, de las cuales sólo una tiene la estructura biespecífica correcta. La purificación de la molécula correcta, que generalmente se realiza por etapas de cromatografía de afinidad, es a menudo un proceso engorroso y de bajo rendimiento. Procedimientos similares se describen en la patente internacional WO 93/08829 (publicada el 13 de Mayo de 1993), y en Traunecker y col., EMBO 10, 3655-3659 (1991).

De acuerdo con una aproximación distinta y más preferida, los dominios variables del anticuerpo con las especificidades de unión deseadas (sitios de combinación anticuerpo-antígeno) se fusionan con las secuencias de dominio constante de inmunoglobulina. La fusión se realiza preferentemente con un dominio de cadena constante, que comprende al menos la bisagra, y segunda y la tercera región constante de una cadena pesada de inmunoglobulina (CH2 y CH3). Es preferible tener en al menos una de las fusiones la primera región constante de cadena pesada (CH1) con el sitio necesario para la unión con la cadena ligera. Los DNAs que codifican las fusiones de cadena pesada de inmunoglobulina y, si se desea la cadena ligera de inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresión por separado, y se cotransfectan en un organismo huésped adecuado. Esto facilita una gran flexibilidad para ajustar las proporciones mutuas de los tres fragmentos polipeptídicos en aquellas realizaciones que utilizan proporciones desiguales de las tres cadenas polipeptídicas en la construcción que proporcione rendimientos óptimos. Sin embargo, es posible insertar las secuencias codificantes para dos o tres cadenas polipeptídicas en un vector de expresión cuando la expresión de al menos dos cadenas polipeptídicas en iguales proporciones dé como resultado rendimientos elevados, o cuando las proporciones no sean relevantes. En una realización preferida de esta aproximación, los anticuerpos biespecíficos se componen de una cadena de inmunoglobulina híbrida con una especificidad de unión en un brazo, y una pareja de cadena ligera-cadena pesada de inmunoglobulina híbrida (la cual proporciona una segunda especificidad de unión) en el otro. Se halló que esta estructura asimétrica facilita la separación del compuesto biespecífico de interés de las combinaciones de cadenas de inmunoglobulina no deseadas, como por ejemplo la presencia de una cadena ligera de inmunoglobulina en sólo una mitad de la molécula biespecífica proporciona un medio de separación fácil. Esta aproximación se describe en la solicitud de patente 07/931.811, registrada el 17 de Agosto de 1992.

Para más detalles sobre la generación de anticuerpos véase, por ejemplo, Zurres y col., Methods in Enzymology 121, 210 (1986).

El término "diacuerpos" hace referencia a fragmentos de anticuerpos pequeños con dos sitios de unión antigénicos. Dichos fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado con un dominio variable de cadena ligera (VL) en la misma cadena polipeptídica (VH-VL). Mediante la utilización de un engarce que es demasiado corto para el apareamiento entre los dos dominios en la misma cadena, los dominios se fuerzan a emparejar con los dominios complementarios de otra cadena y crear así dos sitios de unión antigénicos. Los diacuerpos se describen más completamente en, por ejemplo, la patente europea EP 404.097; la patente internacional WO 93/11161; y Hollinger y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993).

Un anticuerpo "aislado" se define de forma similar a la utilizada más arriba para los polipéptidos aislados. Específicamente, un anticuerpo "aislado" es uno que se ha identificado y separado y/o recuperado de un componente de su entorno natural. Los componentes contaminantes de su entorno natural son materiales que podrían interferir con las utilizaciones diagnósticas o terapéuticas del anticuerpo, y pueden incluir enzimas, hormonas, y otros solutos proteicos o no proteicos. En realizaciones preferidas, el anticuerpo se purificará (1) a una pureza superior al 95% en peso del anticuerpo tal como se determina por el procedimiento de Lowry, y más preferentemente del 99% en peso, (2) a un nivel suficiente como para obtener al menos 15 residuos de la secuencia aminoacídica N-terminal o interna mediante la utilización de un secuenciador spinnging cup, o (3) a homogeneidad mediante SDS-PAGE en condiciones reductoras o no reductoras utilizando azul de Coomassie o, preferentemente, tinción de plata. El anticuerpo aislado incluye el anticuerpo in situ en las células recombinantes, ya que al menos un componente del entorno natural del anticuerpo no estará presente. Sin embargo, el anticuerpo aislado se preparará generalmente mediante al menos una etapa de purificación.

El término "marcaje" cuando se utiliza aquí hace referencia a un compuesto detectable o composición que se conjuga directa o indirectamente con el anticuerpo para generar un anticuerpo "marcado". El marcaje puede ser detectable por él mismo (por ejemplo, marcajes radioisotópicos o fluorescentes) o, en el caso de un marcaje enzimático, puede catalizar alteraciones químicas de un compuesto o composición de sustrato que sea detectable.

El término "fase sólida" hace referencia a una matriz no acuosa a la cual puede adherirse el anticuerpo de la presente invención. Ejemplos de fases sólidas abarcados aquí incluyen los formados total o parcialmente por vidrio (por ejemplo, vidrio de poro controlado), los polisacáridos (por ejemplo la agarosa), las poliacrilamidas, el poliestireno, el alcohol polivinílico y las siliconas. En algunas realizaciones, dependiendo del contexto, la fase sólida puede comprender el pocillo de una placa de ensayo; en otras es una columna de purificación (por ejemplo, una columna de cromatografía por afinidad). Este término también incluye una fase sólida discontinua de partículas discretas, como las descritas en la patente americana U.S. 4.275.149.

Un "liposoma" es una vesícula compuesta de diversos tipos de lípidos, fosfolípidos y/o tensoactivos útiles para la liberación de un fármaco (como los anticuerpos anti-ErbB2 descritos aquí y, opcionalmente, un agente quimioterapéutico) a un mamífero. Los componentes del liposoma se disponen generalmente en una formación en bicapa, similar a la disposición de las membranas biológicas.

Los "agonistas" y los "antagonistas" de anticuerpo son los descritos y definidos más arriba.

Los anticuerpos heteroconjugados se hallan también dentro del ámbito de la presente invención. Los anticuerpos heteroconjugados están compuestos por dos anticuerpos unidos covalentemente. Se ha propuesto que, por ejemplo, dichos anticuerpos dirijan las células del sistema inmune contra las células no deseadas (patente americana U.S. 4.676.980), y para el tratamiento de la infección por VIH (patentes internacionales WO 91/00360 y WO 92/200373; patente europea EP 03089). Los anticuerpos heteroconjugados pueden generarse utilizando procedimientos de unión adecuados. Agentes de unión adecuados son bien conocidos en la materia, y se describen en la patente americana U.S.4.676.980, junto con diversas técnicas de unión.

Los fragmentos de anticuerpos "Fv de cadena sencilla" o "sFv" comprenden los dominios VH y VL del anticuerpo, en donde estos dominios están presentes en una cadena polipeptídica sencilla. Preferentemente, el polipéptido FV comprende además un engarce polipeptídico entre los dominios VH y VL que permite que los sFV adopten la estructura deseada para la unión al antígeno. Para una revisión de sFv véase Plucthun en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg y Moore eds., Springer-Verlag, New Cork, pp. 269-315 (1994).

C. Clonaje y expresión de los homólogos del ligando de TIE

En el contexto de la presente invención, la expresión "célula", "línea celular", y "cultivo celular" se utilizan de forma intercambiable y todas las denominaciones incluyen la progenie. Se entenderá que toda la progenie no puede ser precisamente idéntica en el contenido de DNA, debido a mutaciones deliberadas o inadvertidas. En la progenie mutante se incluyen aquellas que tienen la misma función o propiedades biológicas, según se analizó en las células transformadas originalmente.

Los términos "vector de expresión replicable" y "vector de expresión" hacen referencia a un fragmento de DNA, generalmente de doble cadena, que puede permitir la inserción de un fragmento de DNA foráneo. El DNA foráneo se define como el DNA heterólogo, que es el DNA que no se halla de forma natural en la célula huésped. El vector se utiliza para transportar el DNA foráneo o heterólogo en una célula huésped. Una vez en el huésped, el vector puede replicarse independientemente del DNA cromosómico del huésped y de este modo se generan diversas copias del vector y el DNA insertado. Además, el vector contiene los elementos necesarios que permiten la traducción del DNA foráneo en un polipéptido. De esta manera, es posible sintetizar rápidamente muchas moléculas del polipéptido codificado por el DNA foráneo.

Los vectores de expresión y clonaje son bien conocidos en la materia y contienen una secuencia de ácido nucleico que permite que el vector se replique en una o más células huésped. La selección del vector adecuado dependerá de (1) si se ha de utilizar para la amplificación del DNA o para la expresión del mismo, 2) el tamaño del DNA a insertar en el vector, y 3) la célula huésped a transformar con el vector. Cada vector contiene diversos componentes dependiendo de su función (amplificación del DNA o expresión del DNA) y la célula huésped para la cual es compatible. Los componentes del vector incluyen generalmente, aunque no se limitan a, uno o más de los siguientes elementos: una secuencia señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un elemento intensificador, un promotor y una secuencia de finalización de la transcripción.

(i) Componente de secuencia señal

En general, la secuencia señal puede ser un componente del vector, o puede ser una parte de la molécula del homólogo del ligando de TIE que se inserta en el vector, si la secuencia señal es heteróloga, debería seleccionarse para que pueda ser reconocida y procesada (es decir, cortada por una peptidasa señal) por la células huésped.

Las secuencias señal heterólogas adecuadas para células huésped procariotas son preferentemente las secuencias señal de procariotas, como la \alpha-amilasa, ompA, ompC, ompE, ompF, la fosfatasa alcalina, la penicilinasa, Ipp, o líderes de la enterotoxina II estable al calor. Para la secreción en levaduras, pueden utilizarse, por ejemplo, los líderes de la invertasa, la amilasa, el factor alfa o la fosfatasa ácida de levaduras. Para la expresión en células de mamífero, las secuencias señal de mamíferos son las más adecuadas. Las secuencias señal enumeradas son únicamente un ejemplo, y no pretenden limitar el ámbito de la invención.

(ii) Componente de origen de replicación

Tanto los vectores de expresión como de clonaje contienen una secuencia de ácido nucleico que permite que el vector se replique en una o más células huésped. Por lo general, en los vectores de clonaje esta secuencia permite que el vector se replique independientemente de los cromosomas del huésped e incluye orígenes de replicación o secuencias de replicación autónomas. Dichas secuencias son bien conocidas para una gran variedad de bacterias, levaduras y virus. El origen de replicación del plásmido conocido pBR322 es adecuado para la mayoría de bacterias gram negativas, el origen de replicación del plásmido 2 \mu para levaduras, y otros orígenes de replicación virales (SV40, polioma, adenovirus, VSV o BPV) son útiles para vectores de clonaje en células de mamífero. Los orígenes de replicación no son necesarios para los vectores de expresión en mamíferos (el origen de SV40 puede utilizarse únicamente porque contiene el promotor temprano). La mayoría de los vectores de expresión son vectores "lanzadera", es decir, que son capaces de replicarse en al menos una clase de organismos pero pueden transfectarse en otro organismo para su expresión. Por ejemplo, se clona un vector en E. coli y luego el mismo vector se transfecta en células de levadura o mamífero para la expresión aún cuando no sea capaz de replicarse independientemente del cromosoma de la célula huésped.

El DNA también se clona por inserción en el genoma del huésped. Ello se logra utilizando como huéspedes la especie Bacillus, por ejemplo, incluyendo en el vector una secuencia de DNA que sea complementaria a una secuencia hallada en el DNA genómico de Bacillus. La transfección de Bacillus con este vector da como resultado la recombinación homóloga con el genoma y la inserción del DNA que codifica el polipéptido heterólogo de interés. Sin embargo, la recuperación del DNA genómico es más compleja que la de un vector replicado exógenamente porque se requiere la digestión con endonucleasas de restricción para extraer la molécula polipeptídica codificada.

(iii) Componente de gen de selección

Los vectores de expresión y clonaje deberían contener un gen de selección, también denominado un marcador seleccionable, es decir un gen que codifica una proteína necesaria para la supervivencia o crecimiento de una célula huésped transformada con el vector. La presencia de este gen asegura que cualquier célula huésped que no tenga el vector no obtendrá ninguna ventaja en el crecimiento o reproducción sobre los huéspedes transformados. Los genes de selección codifican generalmente proteínas que (a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, por ejemplo ampicilina, neomicina, metotrexato o tetraciclina, (b) complementan deficiencias autotróficas, o (b) aportan nutrientes críticos no disponibles a partir del medio complejo, por ejemplo, el gen que codifica la D-alanina racemasa de bacilli.

Un ejemplo de un esquema de selección utiliza un fármaco para parar el crecimiento de una célula huésped. Aquellas células que se transforman satisfactoriamente con un gen heterólogo que expresa una proteína que confiere resistencia a un fármaco y por tanto sobreviven al régimen de selección. Ejemplos de dicha selección dominante utilizan fármacos como la neomicina [Southern y col., J.Molec. Appl. Genet. 1, 327 (1982)], ácido micofenólico [Mulligan y col., Science 209, 1422 (1980)], o la higromicina [Sudgen y col., Mol. Cel. Biol. 5, 410-413 (1985)]. Los tres ejemplos proporcionados más arriba utilizan genes bacterianos bajo el control eucariótico para lograr la resistencia al fármaco adecuado G418 o neomicina (geneticina), xgpt (ácido micofenólico), o higromicina, respectivamente. Otros ejemplos de marcadores adecuados para las células de mamífero son el dihidrofolato reductasa (DHFR) o la timidina quinasa. Tales marcadores permiten la identificación de las células competentes para aceptar el ácido nucleico de interés. Los transformantes de células de mamíferos se colocan bajo la presión de selección a la que únicamente éstos se adaptan para sobrevivir en virtud de haber incorporado el marcador. La presión de selección se impone a los transformantes por su cultivo en condiciones en las que la concentración del agente de selección en el medio se cambia sucesivamente, de ese modo, se permite la amplificación tanto del gen de selección como del DNA que codifica para el polipéptido de interés. La amplificación es el proceso por el que genes con mayor exigencia de producción de una proteína crítica para el crecimiento, se repiten en tandem en los cromosomas de generaciones sucesivas de células recombinantes. Se sintetizan así, cantidades crecientes del polipéptido de interés a partir del DNA amplificado.

Por ejemplo, las células transformadas con el gen de selección DHFR se identifican primero por cultivo de todos los transformantes en un medio de cultivo sin hipoxantina, glicina y timidina. Un huésped celular apropiado en este caso es la línea celular de ovario de hámster chino (CHO) deficiente en actividad DHFR, preparada y propagada tal como describieron Urlaub y Chasin, Proc. Nat. Acad. USA 77, 4216 (1980). Un mutante de DHFR particularmente útil es el mutante de DHFR altamente resistente a MTX (EP 117.060). Este agente de selección puede utilizarse con otro huésped adecuado, por ejemplo: ATCC No. CCL61 CHO-K1, independientemente del DNA endógeno. El DNA que codifica DHFR y el polipéptido de interés, respectivamente, se amplifica a continuación por exposición a un agente (metotrexato, o MTX) que inactiva el DHFR. De este modo se asegura que la célula requiera más DHFR (y en consecuencia amplifica todo el DNA exógeno) seleccionando sólo células que puedan crecer en rondas sucesivas de concentración de MTX cada vez mayor. De forma alternativa, los huéspedes cotransformados con genes que codifican el polipéptido de interés, el DHFR de tipo salvaje, y otro marcador de selección tal como el gen neo pueden identificarse con un agente de selección para un marcador seleccionable tal como G418 y a continuación seleccionarse y amplificarse mediante metotrexato en un huésped de tipo salvaje que contiene el DHFR endógeno (Véase también la Patente U.S. No. 4.965.199).

Un gen de selección adecuado para utilizarse en levadura es el gen trp1 presente en el plásmido de levadura YRp7 (Stinchcom y col., 1979, Nature 282:39; Kingsman y col., 1979, Gene 7:141: o Tschemper et al., 1980, Gene 10: 157). El gen trp1 proporciona un marcador de selección para una cepa mutante de levadura sin la capacidad de crecimiento en triptófano, por ejemplo, ATCC No 44076 o PEP4-1 (Jones 1977, Genetics 85:12). La presencia de la lesión de trp1 en el genoma de las células huéspedes de levadura proporciona un ambiente efectivo para detectar la transformación por crecimiento en ausencia de triptófano. De forma similar, las cepas de levadura deficientes para Leu2 (ATCC 20.622 o 38.626) se complementan con plásmidos conocidos portadores del gen Leu2.

(iv) Componente de promotor

Los vectores de expresión, a diferencia de los vectores de clonaje, deben contener un promotor que sea reconocido por el organismo huésped y esté unido operativamente al ácido nucleico codificante del polipéptido de interés. Los promotores son secuencias no traducidas localizadas cadena arriba del codón de inicio de un gen estructural (generalmente de 100 a 1000 bp) que controlan la transcripción y la traducción del ácido nucleico bajo su control. Típicamente pueden ser de dos clases, inducibles y constitutivos. Los promotores inducibles son promotores que inician niveles aumentados de transcripción del DNA bajo su control en respuesta a algunos cambios de las condiciones de cultivo, por ejemplo la presencia o la ausencia de un nutriente o un cambio de temperatura. En la actualidad son bien conocidos un gran número de promotores reconocidos para una variedad de células huéspedes potenciales. Estos promotores están unidos operativamente al DNA que codifica un polipéptido de interés, extraído de su gen de origen por digestión con enzimas de restricción, seguido por la inserción de un codón de inicio en el extremo 5' para el polipéptido a ser expresado. Esto no significa que el promotor genómico para un homólogo del ligando de TIE no sea utilizable. Sin embargo, los promotores heterólogos resultan, generalmente, con una mejor transcripción y mayores cantidades expresadas de los homólogos del ligando de TIE si se comparan con los promotores homólogos del ligando de TIE nativo.

Los promotores adecuados para su uso en huéspedes eucariotas incluyen los sistemas de promotores de la \beta-lactamasa y la lactosa (Chang y col., Nature 275:615 (1978); y Goeddel y col., Nature 281:544 (1979), fosfatasa alcalina y triptófano (trp) (Goeddel, Nucleic Acids Res. 8:4057 (1980) y EPO Appln. Publ. No. 36.776) y los promotores híbridos como el promotor tac (H. de Boer y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:21-25 (983)). Sin embargo, se encuentran disponibles otros promotores bacterianos. Sus secuencias nucleotídicas han sido publicadas y por tanto permiten a un profesional experimentado conocedor de las técnicas, unirlas al DNA que codifica para el homólogo del ligando de TIE (Siebenlist y col., Cell 20:269 (1980)) utilizando conectores o adaptadores que aporten los lugares de restricción necesarios. Los promotores que se utilizan en los sistemas bacterianos también contienen una secuencia Shine-Dalgarno (S.D.) unida operativamente al DNA que codifica el homólogo del ligando de TIE.

Las secuencias promotoras adecuadas para su uso en huéspedes de levadura incluyen los promotores de la 3-fosfoglicerato quinasa (Hitzeman y col., J. Biol. Chem. 255:2073 (1980)) u otras enzimas glicolíticas (Hess y col., J. Adv. Enzyme Reg. 7:149 (1978); y Holland, Biochemistry 17;4900 (1978), como la enolasa, la gliceraldehido-3-fosfato dehidrogenasa, la hexoquinasa, la piruvato decarboxilasa, la fosfofructoquinasa, la glucosa-la 6-fosfato isomerasa, la 3-fosfoglicerato mutasa, la piruvato quinasa, la triosefosfato isomerasa, la fosfoglucosa isomerasa y la glucoquinasa.

Otros promotores de levadura, que son promotores inducibles con la ventaja adicional de tener un control de la transcripción por las condiciones de crecimiento, son las regiones promotoras de la alcohol dehidrogenasa 2, isocitocromo C, fosfatasa ácida, las enzimas degradantes asociadas al metabolismo del nitrógeno, la metalotioneina, la gliceraldehido-3-fosfato dehidrogenasa y las enzimas responsables de la utilización de maltosa y galactosa. Los vectores adecuados y los promotores para la expresión en levaduras se describen más extensamente en R. Hitzeman y col., EP 73.657A. Los intensificadores de la transcripción de levaduras se utilizan provechosamente junto con los promotores de levadura.

Son conocidas las secuencias promotoras para eucariotas. Prácticamente todos los genes de eucariotas tienen regiones ricas en A-T localizadas aproximadamente de 25 a 30 bases cadena arriba del lugar de iniciación de la transcripción. Otra secuencia que se encuentra de 70 a 80 bases cadena arriba del lugar de inicio de la transcripción en bastantes genes, es la región CXCAAT, donde X puede ser cualquier nucleótido. En el extremo 3' de la mayoría de los genes eucariotas, una secuencia AATAAA es la señal para la unión de la cola de poli A al extremo 3' de la secuencia codificante. Todas estas secuencias pueden insertarse en vectores de expresión de mamíferos.

La transcripción del homólogo del ligando de TIE a partir de los vectores para células huéspedes de mamíferos puede controlarse por promotores obtenidos de los genomas virales como son el virus del polioma, el de la viruela aviar (patente UK 2.211.504 publicada el 5 de julio de 1989), el adenovirus (como el Adenovirus 2), el virus del papiloma bovino, el virus del sarcoma aviar, el citomegalovirus, el retrovirus, el virus de la hepatitis B y preferiblemente el virus del simio 40 (SV40); por promotores heterólogos de mamífero, por ejemplo el promotor de la actina o el de una inmunoglobulina; por promotores de choque térmico, y por promotores normalmente asociados con la secuencia del ligando de TIE, siempre que estos promotores sean compatibles con los sistemas celulares huéspedes.

Los promotores tempranos o tardíos del virus SV40 se obtienen convenientemente como un fragmento de restricción del SV40 que contiene también el origen de replicación viral del SV40 [Fiers y col., Nature 273: 113 (1978), Mulligan y Berg, Science 209, 1422-1427 (1980); Pavlakis y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 7398-7402 (1981)]. El promotor temprano inmediato del citomegalovirus humano se obtiene convenientemente como un fragmento de restricción con HindIII [Greenaway y col., Gene 18, 355-360 (1982)]. Un sistema para expresar el DNA en un huésped mamífero con el papilomavirus bovino como vector se describe en la patente americana US 4.419.446. Una modificación de este sistema se describe en US 4.601.978. Véase también, Gray y col, Nature 295, 503-508 (1982) para la expresión de cDNA que codifica el interferón humano en células de mono; Reyes y col., Nature 297, 598-601 (1982) para la expresión del cDNA del \beta-interferón humano en células de ratón bajo el control del promotor de la timidina quinasa del virus herpex simple; Canaani y Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 5166-5170 (1982) para la expresión del gen del interferón \beta1 humano en cultivos de células de ratón y conejo; y Goman y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 6777-6781 (1982) para la expresión de secuencias bacterianas CAT en células de riñón de mono CV-1, fibroblastos de embrión de pollo, células de ovario de hámster chino, células HeLa, y células de ratón HIN-3T3 con la repetición terminal larga del virus del sarcoma de Rous como promotor.

(v) Componente de elemento intensificador de la transcripción

La transcripción del DNA que codifica los homólogos del ligando de TIE de la presente invención en eucariotas superiores se incrementa a menudo con la inserción en el vector de una secuencia intensificadora. Las secuencias intensificadoras son elementos de DNA de acción en cis, normalmente de 10 a 300 bp, que actúan sobre el promotor aumentando su transcripción. Los intensificadores están relativamente orientados y en una posición relativamente independiente encontrándose tanto en 5' [Laimins y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 993 (1981)] como en 3' [Lasky y col., Mol. Cel. Biol. 3, 1108 (1983)] respecto a la unidad de transcripción, dentro de un intrón [Banerji y col., Cell 33, 729 (1983)], así como en el interior de la misma secuencia codificante [Osborne y col., Mol. Cel. Biol. 4, 1293 (1984)]. Hoy se conocen muchas secuencias intensificadoras de genes de mamíferos (globina, elastasa, albúmina, \alpha-fetoproteína y insulina). Típicamente, sin embargo, se utilizan intensificadores procedentes de virus de células eucariotas. Los ejemplos incluyen el intensificador de SV40 en en el lugar tardío del origen de replicación (100-270 bp), el intensificador del promotor temprano del citomegalovirus, el intensificador del polioma en el lugar tardío del origen de replicación y los intensificador res de adenovirus. Véase también Yaniv, Nature 297, 17-18 (1982) para los elementos intensificadores de la activación de los promotores de eucariotas. El intensificador puede colocarse en el vector en posición 5' o 3' del DNA del ligando de TIE, pero preferentemente se localiza en 5' del promotor.

(vi) Componente de finalización de la transcripción

Los vectores de expresión en las células huéspedes de eucariotas (levaduras, hongos, insectos, plantas, animales, humanos o células nucleadas de otros organismos multicelulares) también contienen secuencias necesarias para la terminación de la transcripción y para la estabilización del mRNA. Tales secuencias se encuentran comúnmente disponibles en regiones no traducidas en 5' y, ocasionalmente en 3' de los DNAs o cDNAs eucariotas o virales. Estas regiones contienen segmentos de nucleótidos transcritos como fragmentos poliadenilados en la porción no traducida del mRNA que codifica el homólogo del ligando de TIE. Las regiones no traducidas en 3', también incluyen lugares de terminación de la transcripción.

La construcción de vectores adecuados que contengan uno o más de los componentes enumerados más arriba, las secuencias de interés codificantes y de control, se realiza mediante técnicas estándares de ligación. Los plásmidos aislados o los fragmentos de DNA, se cortan con endonucleasas de restricción, se adaptan sus extremos, y se unen en la forma deseada para generar el plásmido requerido.

Para confirmar la secuencia correcta en los plásmidos construidos, las mezclas de ligación se utilizan para la transformación de la cepa E.coli K12 294 (ATCC 31.446) y los transformantes obtenidos se seleccionan según su resistencia a ampicilina o tetraciclina, según sea apropiado. Los plásmidos de los transformantes se preparan y analizan por digestión con enzimas de restricción y/o se secuencian por el método de Messing y col., Nucleic Acids Res. 9, 309 (1981) o por el método de Maxam y col., Methods in Enzymology 65, 499 (1980).

En la práctica de la presente invención resulta particularmente útil la expresión de vectores que proporcionen una expresión transitoria del DNA que codifica para el homólogo del ligando de TIE en las célula de mamífero. En general, la expresión transitoria implica el uso de un vector de expresión que sea capaz de replicarse eficientemente en una célula huésped, de modo que la célula huésped acumule muchas copias del vector de expresión y a su vez sintetice niveles elevados del polipétido de interés codificado por el vector de expresión. Los sistemas transitorios, que incluyen un vector de expresión adecuado y una célula huésped, permiten la conveniente identificación positiva de los polipéptidos codificados por los DNAs de los clones, así como el cribado rápido de tales polipéptidos según sus propiedades biológicas o fisiológicas de interés. Por tanto, los sistemas de expresión transitoria son particularmente útiles en esta invención para propósitos de identificación de análogos y variantes del homólogo del ligando de TIE.

Otros métodos, vectores, y células huéspedes adecuadas para la adaptación de la síntesis de polipéptidos TIE en cultivos celulares de vertebrados recombinantes se describen en Getting y col., Nature 293, 620-625 (1981); Mantel y col., Nature 281;40-46 (1979); Levinson et al.,; EP 117.060 y 117.058. Un plásmido particularmente últil para la expresión de polipéptidos del ligando de TIE en cultivos celulares de mamíferos es el pRK5 (EP 307,247), junto con sus derivados, como, pRK5D que tiene un lugar de iniciación de la transcripción sp6 seguido por un lugar SfiI de restricción enzimática precediendo los lugares de clonado del cDNA, Xho/NotII, y pRK5B, un precursor de pRK5D que no contiene el lugar de restricción SfiI; véase, Holmes y col., Science 253, 1278-1280 (1991).

(vii) Construcción y análisis de vectores

En la construcción de los vectores de interés que contienen uno o más de los componentes enumerados más arriba, se emplean técnicas estándares de ligación. Se clonan plásmidos aislados o fragmentos de DNA, se cortan y ajustan, y se unen en la forma que se desee para generar el plásmido que se requiere.

Para confirmar las secuencias correctas en los plásmidos construidos, las mezclas de ligación se utilizan para transformar la cepa E. coli K12 294 (ATCC 31.446) y los transformantes obtenidos se seleccionan según su resistencia a ampicilina o tetraciclina, según sea apropiado. Los plásmidos de los transformantes se preparan, analizan por digestión con enzimas de restricción y/o se secuencian por los métodos de Messing y col., Nucleic Acids Res. 9. 309 (1981) o por el método de Maxam y col., Methods in Enzymology 65, 499 (1980).

(viii) Vectores de expresión transitoria

Los vectores de expresión que proporcionan la expresión transitoria en células de mamíferos del DNA que codifica un ligando de TIE son particularmente útiles para la práctica de la presente invención. En general, la expresión transitoria implica el uso de un vector de expresión que es capaz de replicarse eficientemente en una célula huésped, de este modo la célula huésped acumula muchas copias del vector de expresión y, a su vez, sintetiza un nivel elevado del polipéptido de interés codificado por el vector de expresión. Sambrook y col., supra, pp. 16.17-16.22. Los sistema de expresión transitoria, que comprenden un vector de expresión adecuado y una célula huésped, permiten el conveniente cribado positivo de los polipéptidos según sus propiedades biológicas o fisiológicas de interés. Por tanto, los sistemas de expresión transiente son particularmente útiles para la presente invención con el fin de identificar los análogos y las variantes de los homólogos del ligando de TIE nativo con la actividad biológica requerida.

(ix) Ejemplos de vectores adecuados para células de vertebrados

Otros métodos, vectores, y células huéspedes adecuadas para la adaptación de la síntesis de homólogos del ligando de TIE (que incluyen los derivados funcionales de las proteínas nativas) en cultivos celulares de vertebrados recombinantes se ha descrito en Gething y col., Nature 293, 620-625 (1981); Mantei y col., Nature 281, 40-46 (1979); Levinson y col., EP 117,060; y EP 117.058. Un plásmido particularmente útil para la expresión de homólogos del ligando de TIE en cultivos celulares de mamíferos es pRK5 (EP 307.247) o pSV16B (Publicación PCT de patente internacional WO 91/08291).

Las células huéspedes adecuadas para el clonaje y la expresión de vectores en la presente invención, pueden ser procariotas, levaduras o células de eucariotas superiores descritas más arriba. Los procariotas adecuados incluyen organismos gram negativos o gram positivos, por ejemplos E.coli o bacilli. Un huésped preferible para el clonaje es E. coli 294 (ATCC 31.446) aunque otros procariotas gram negativos o gram positivos son adecuados como E. coli B, E. coli X 1776 (ATCC 31.537). E. coli W3110 (ATCC 27.325), especies de Pseudomonas. o Serratia marcesans.

Además de los procariotas, también son huéspedes adecuados los microbios eucarióticos como los hongos filamentosos o las levaduras para los vectores en la presente invención. Saccharomyces cerevisiae, o la común levadura del pan, es el más comúnmente utilizado entre los microorganismos huéspedes eucariotas inferiores. Sin embargo, un número de otros géneros, especies y cepas, se encuentran ampliamente disponibles y son útiles en la presente invención, como S. pombe [Beach y Nurse, Nature 290, 140 (1981)], Kluvveromyces lactis [Louvencourt y col., J. Bacteriol. 737 (1983)]; varrowia (EP 402.226); Pichia pastoris (EP 183.070), Trichodemareesia (EP 244.234), Neurospora crassa [Case et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 5259-5263 (1979)]; y Aspergillus como A. nidulans [Ballance y col., Biochem. Biophys. Res. Commun. 112, 284-289 (1983); Tilburn y col., Gene 26, 205-221 (1983)]; Yelton y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 1470-1474 (1984)] y A. niger [Kelly y Hynes, EMBO J. 4, 475-479 (1985)].

La células huéspedes adecuadas pueden también derivar de organismos multicelulares. Tales células huéspedes son capaces de procesados complejos y actividades de glicosilación. En principio, es factible cualquier cultivo de células de eucariotas superiores, de vertebrados o invertebrados, aunque son preferibles las células de mamíferos como las humanas. Los ejemplos de células de invertebrados incluyen células de plantas e insectos. Se han identificado numerosas cepas de baculovirus y sus variantes y las correspondientes células huéspedes tolerantes de insecto como Spodoptera frugiperda (caterpillar), Aedes aegypti (mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila melanogaster (mosca de la fruta), y Bombyx mori. Véase, por ejemplo Luckow y col., Bio/Technology 6, 47-55 (1988); Miller y col., en Genetic Engineering, Setlow, J. K. y col., eds., Vol. 8 (Plenum Publishing, 1986), pp. 277-279; y Maeda y col., Nature 315, 592-594 (1985). Una variedad de estas cepas virales se encuentra disponible públicamente, por ejemplo la variante L-1 de Autographa californica NPV, y pueden utilizarse aquí de acuerdo con la presente invención, particularmente para la transfección de las células Spodoptera frugiperda.

Generalmente, las células vegetales se transfectan por incubación con ciertas cepas de la bacteria Agrobacterium tumefaciens, que ha sido previamente manipulada para contener el DNA del ligando de TIE. Durante la incubación de las células vegetales en cultivo con A. tumefaciens, el DNA que codifica para el ligando de TIE se transfiere a las células vegetales huéspedes de tal manera que se transfecta y bajo las condiciones adecuadas, expresa el DNA del ligando de TIE. Además, las secuencias señal y reguladoras compatibles con células vegetales se encuentran disponibles, como el promotor de la nopalina sintasa y las secuencias señal de poliadenilación. Depicker y col., J. Mol. App. Gen. 1, 561 (1982). Además, los segmentos aislados de DNA de la región cadena arriba del gen T-DNA 780 son capaces de activar o aumentar los niveles de transcripción de genes expresables tejidos vegetales que contienen el DNA recombinante. Véase la patente europea EP 321.196 publicada el 21 de Junio de 1989.

Es bien conocido el gran interés que existe por las células de vertebrados y su propagación de en cultivo (cultivos de tejidos). Véase Cultivo de Tejidos, Academic Press, Cruse y Patterson, editores (1973). Ejemplos de líneas celulares de huéspedes de mamíferos son la línea de riñón de mono CVI tranformada con SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); la línea celular embrionaria de riñón humano [293 o células suclonadas 293 para crecimiento en cultivo en suspensión, Graham y col.,J. Gen. Virol. 36, 59 (1977)]; las células de riñón de cría de hámster 9BHK, ATCC CCL 10); las células de ovario de hámster chino/-DFHR [CHO, Urlaub y Chasin; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77. 4216 (1980)]; las células de Sertoli de ratón [TM4. Mather, Biol. Reprod. 23, 243-251 (1980)]; las células de riñón de mono (CV 1 ATCC CCL 70); las células de riñón de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); las células humanas de carcinoma cervical (HELA, ATCC CCL. 2); las células de riñón canino (MDCK, ATCC CCL 34); las células de hígado de rata búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); las células humanas de pulmón (W138, ATCC CCL75); las células de hígado humano (Hep G2, HB 8065); las células de tumor mamario murino (MMT 060562, ATCC CCL51); las células TR1[Mather y col., Annals N.Y. Acad. Sci. 383, 44068 (1982)]; las células MRC5; células FS4, y una línea celular de hepatoma humano (Hep G2). Las células huéspedes preferidas son las embrionarias de riñón humano 293 y las células de ovario de hámster chino.

Las células huéspedes de vertebrados son las particularmente preferidas para los propósitos de producción de homólogos del ligando de TIE.

Las células huéspedes se transfectan y transforman preferentemente con los vectores de expresión o clonación descritos anteriormente y se cultivan en medios con los nutrientes convencionales modificados según sea apropiado para inducir promotores o seleccionar transformantes que contienen los genes amplificados.

Las células procariotas utilizadas para la producción de los homólogos del ligando de TIE de la presente invención se cultivan en el medio adecuado tal como en general se describe en Sambrook y col., supra.

Las células de mamífero pueden cultivarse en una variedad de medios. Los medios disponibles comercialmente como son el Ham's F10 (Sigma), el Medio Mínimo Esencial (MEM, Sigma), RPMI-1640 (Sigma) y el Medio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM, Sigma) son adecuados para el cultivo de las células huéspedes. Además, cualquier medio descrito en Ham y Wallace, Meth. Enzymol. 58, 44 (1979); Barnes y Sato, Anal. Biochem. 102, 255 (1980), las patentes americanas US 4.767.704, 4.657.866, 4.927.762 o 4.560.655; las patentes internacionales WO 90/03430, WO 87/00195 o la patente americana US Re. 30.985 puede utilizarse como medio de cultivo para las células huéspedes. Cualquiera de estos medios puede suplementarse, si es necesario, con hormonas y/o otros factores de crecimiento(como insulina, transferrina o factor de crecimiento epitelial), sales (como cloruro sódico, calcio, magnesio y fosfato), tampones (como HEPES), nucleósidos (como adenosina y timidina), antibióticos (como el fármaco Gentamicina ^{TM}), elementos traza (definidos como compuesto inorgánicos presentes normalmente en unas concentraciones finales de escala micromolar), y glucosa o un equivalente como fuente energética. Cualquier otro suplemento necesario puede también incluirse en las concentraciones adecuadas que conocen los expertos en la materia. Las condiciones adecuadas de cultivo, tales como temperatura, pH y similares, son aquellas previamente utilizadas con las células huéspedes seleccionadas en el clonaje o la expresión, según sea el caso, y resultan obvias para un experto en la
materia.

Las células huéspedes a las que se refiere la presente invención comprenden células en cultivo in vitro así como células de un huésped animal o planta.

Está previsto además, que los homólogos del ligando de TIE de la presente invención, puedan producirse por métodos de recombinación homóloga, o métodos de producción recombinante utilizando elementos de control introducidos en las células que ya contienen el DNA que codifica un particular homólogo del ligando de TIE.

La amplificación génica y/o la expresión puede medirse de una manera directa, por ejemplo, por transferencia de Southern convencional, la transferencia de Northern para cuantificar la transcripción del mRNA [Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 5201-5205 (1980)], transferencia de mancha (análisis de DNA), o hibridación in situ, mediante la sonda marcada adecuadamente, basada en las secuencias proporcionadas aquí. Pueden emplearse varios marcajes, más comúnmente los radioisótopos, particularmente P^{32}. Así mismo, pueden emplearse otras técnicas, como nucleótidos modificados con biotina, para el marcaje de polinucleótidos. La biotina a su vez sirve como lugar de unión de avidina o de anticuerpos, que pueden estar marcados a su vez con un amplia variedad de marcadores, como radionucleidos, fluorescentes, enzimas o similares. De forma alternativa, los anticuerpos que se emplean, pueden reconocer duplex específicos, incluyendo duplex de DNA, duplex de RNA, y duplex híbridos de DNA-RNA o dúplex de DNA y proteína. Los anticuerpos a su vez pueden marcarse y el ensayo puede realizarse con el duplex unido a una superficie donde pueda detectarse fácilmente la presencia de un anticuerpo unido al duplex.

La expresión génica, alternativamente, puede medirse por métodos inmunológicos, tales como la tinción inmunohisotquímica de secciones de tejido y como los ensayos de cultivo celular o fluídos corporales, para cuantificar directamente la expresión del producto génico. Con las técnicas de tinción inmunohistoquímica, una muestra celular se prepara, típicamente, por deshidratación y fijación, seguido por reacción con anticuerpos marcados específicos para el producto génico acoplado, siendo los marcajes detectables visualmente como son los marcadores enzimáticos, fluorescentes, luminiscentes y similares. Una técnica de tinción particularmente sensible y adecuada para utilizarse en la presente invención es la descrita por Hse y col., Am. J. Clin. Pham. 75, 734-738 (1980).

Los anticuerpos utilizados para la tinción inmunohistoquímica y/o ensayos de fluídos corporales pueden ser tanto monoclonales como policlonales, y pueden prepararse en cualquier animal. Convenientemente, los anticuerpos se preparan contra el polipéptido homólogo del ligando de TIE nativo de la presente invención o contra el péptido sintético que se basa en la secuencia de DNA proporcionada en la presente invención, tal como se describe más adelante.

El homólogo del ligando de TIE puede producirse en células huéspedes en forma de cuerpos de inclusión o secretado al especio periplasmático o del cultivo celular, y es recuperado de los lisados de la célula huésped. Los ligandos recombinantes pueden purificarse por cualquier técnica que permita la subsiguiente formación de la proteína estable.

Cuando el homólogo del ligando TIE se expresa en una célula huésped diferente de una de origen humano, está complementa libre de proteínas o polipéptidos de origen humano. Sin embargo, es necesario purificar el homólogo del ligando de TIE de las proteínas o polipéptidos recombinantes para obtener preparaciones esencialmente homogéneas como las del ligando. Como primer paso, el medio de cultivo o el lisado se centrifuga para extraer las partículas de desechos celulares. Después, se separan la membrana y las fracciones proteícas solubles. A continuación, el homólogo del ligando de TIE se puede purificar de la fracción de proteína soluble. Los siguientes procedimientos son un ejemplo de los procedimientos adecuados para la purificación: fraccionamiento en columnas de inmunoafinidad o de itercambio iónico; precipitación con etanol; HPLC de fase reversa; cromatrografía en sílice o en resina de intercambio iónico como DEAE; cromatoenfoque; SDS-PAGE; precipitación con sulfato amónico; filtración en gel mediante por ejemplo, Sephadex G-75; y columnas de Sepharose-proteína A para extraer contaminantes como las IgG.

Los derivados funcionales de los homólogos del ligando de TIE en los que los residuos han sido deleccionados, insertados y/o sustituídos son recuperados de la misma manera que los ligandos nativos, teniendo en cuenta cualquier cambio esencial en sus propiedades ocasionado por la alteración. Por ejemplo, la fusión del homólogo ligando de TIE con otra proteína o polipéptido, por ejemplo un antígeno bacteriano o vírico, facilita la purificación. Puede emplearse una columna de inmunoafinidad que contenga el anticuerpo contra el antígeno para absorber la variante del homólogo del ligando de TIE por la unión con al menos uno de los restantes epitopos inmunes. Durante la purificación, un inhibidor de proteasa, como el fenil metil sulfonil fluoruro (PMSF) puede ser útil para la inhibición de la degradación proteolítica y así mismo pueden incluirse antibióticos para prevenir el crecimiento de contaminantes fortuitos. Los homólogos del ligando de TIE en la presente invención se purifican convenientemente por cromatrografía de afinidad, según su capacidad para unirse al receptor de TIE, el conocido o el descubierto por la presente invención como por ejemplo TIE-2.

Un experto en la materia apreciará que los métodos de purificación adecuados para los homólogos del ligando de TIE nativo puedan requerir una modificación que tenga en cuenta los cambios en el carácter del homólogo del ligando de TIE nativo o sus variantes después de su expresión en un cultivo celular recombinante.

D. Uso del homólogo del ligando de TIE. Moléculas de ácidos nucleicos y anticuerpos

Los homólogos del ligando de TIE de la presente invención son útiles en la promoción de la supervivencia y/o el crecimiento y/o diferenciación de las células en cultivo celular que expresan el receptor TIE.

Los homólogos del ligando de TIE pueden utilizarse además para identificar células que expresan receptores nativos de TIE. Con este fin, un ligando marcado de forma estable se pone en contacto con una célula diana en condiciones que permitan su unión al receptor de TIE y a continuación se controla dicha unión.

Los homólogos del ligando de TIE de la presente invención, también pueden utilizarse para identificar moléculas que exhiban una actividad biológica similar a la de un homólogo del ligando de TIE, por ejemplo, mediante exposición de una célula que exprese el homólogo del ligando de TIE a una molécula a examen y la detección de la unión específica de la molécula a examen y el receptor TIE, tanto por detección directa o basada en su efecto sobre la actividad biológica. Este enfoque es particularmente adecuado para la identificación de nuevos miembro de la familia de ligandos de TIE, o para el cribado de péptidos o de librerías de pequeñas moléculas no peptídicas.

Los homólogos del ligando de TIE, descritos en la presente invención, son también útiles en los ensayos de cribado diseñados para identificar agonistas y antagonistas del receptor nativo de TIE que juega un papel importante en el desarrollo del hueso, o en el crecimiento del músculo o en el desarrollo y/o promoción o inhibición de la angiogénesis. Por ejemplo, los antagonistas del receptor de TIE puede identificarse basándose en su capacidad para bloquear la unión de un homólogo del ligando de TIE de la presente invención a un receptor TIE nativo, tal como se cuantifica por ejemplo mediante la tecnología de biosensores BiAcore (BIAcore; Pharmacia Biosensor, Miscataway, N.J.); o por el control de su capacidad para bloquear la respuesta biológica causada por un homólogo del ligando de TIE biológicamente activo. Las respuestas biológicas que pueden controlarse incluyen, por ejemplo, la fosforilación del receptor de TIE o los componentes por debajo de la la cadena de transducción de señal de TIE, o por la supervivencia, crecimiento o diferenciación de las células que expresan el receptor TIE. Resultan particularmente convenientes para su utilización, los ensayos celulares que utilizan células que normalmente no fabrican el receptor TIE y que han sido manipuladas para expresar el receptor, o para coexpresar el receptor TIE y un homólogo del ligando de TIE de la presente invención.

En una aplicación particular, pequeñas moléculas agonistas y antagonistas de un receptor TIE nativo pueden identificarse según su capacidad para interferir en la interacción entre el receptor/ligando de TIE. Existen numerosas maneras para medir la unión específica al receptor de TIE de una molécula a examen, que incluyen, pero no se limitan a, la detección o la cuantificación de la cantidad de moléculas a examen que se encuentran unidas a la superficie de la célula intacta que expresa el receptor TIE, las unidas con el receptor TIE en lisados celulares, o las unidas al receptor TIE in vitro.

Los homólogos del ligando de TIE marcados de forma detectable, incluyen por ejemplo, los homólogos del ligando de TIE covalente o no covalentemente unidos a sustancias radioactivas, por ejemplo I^{125}, una sustancia fluorescente, una sustancia con actividad enzimática (preferentemente es adecuada para la detección colorimétrica), un sustrato para una enzima (preferentemente es adecuada para la detección colorimétrica), o una sustancia que pueda ser reconocible por una molécula de anticuerpo (marcada de forma detectable).

Los ensayos de la presente invención pueden realizarse de forma similar a la descrita en la Publicación PCT WO 96/11269, del 18 de abril del 1996.

Los homólogos del ligando de TIE de la presente invención, son también útiles para purificar los receptores TIE que opcionalmente se utilizan como inmunoadhesinas, en las que el homólogo del ligando de TIE o su porción de unión al receptor TIE está fusionada a una región constante de la cadena de inmunoglobulina pesada o ligera.

Las moléculas de aminoácido de la presente invención, son útiles para la detección de la expresión de los ligandos de TIE en células o en secciones de tejidos. Las células o secciones de tejidos pueden ponerse en contacto con una molécula de ácido nucleico marcada de forma detectable que codifica el homólogo del ligando de TIE de la presente invención en condiciones de hibridación estipuladas. De esta manera, la presencia del mRNA hibridado con la molécula de ácido nucleico marcada demuestra la existencia de expresión del homólogo del ligando de TIE. Además, el ácido nucleico que codifica el homólogo del ligando de TIE que se amplifica en células tumorales (cancer), es útil en el diagnóstico de tumores (cáncer).

Los anticuerpos de la presente invención, pueden, por ejemplo, utilizarse en inmunoensayos que cuantifican la cantidad de homólogo del ligando de TIE en una muestra biológica. La muestra biológica se pone en contacto con un anticuerpo o mezcla de anticuerpos que se une específicamente al homólogo del ligando de TIE de la presente invención, y se cuantifica la cantidad del complejo formado con el ligando presente en la muestra examinada.

Los anticuerpos para homólogos del ligando de TIE aquí descritos, pueden además utilizarse para liberar moléculas citotóxicas, por ejemplo radioisótopos o toxinas, o agentes terapéuticos en las células que expresan el correspondiente receptor TIE. Como agentes terapéuticos, por ejemplo, pueden encontrarse otros ligandos de TIE, incluyendo el ligando de TIE-2, los miembros de la familia del factor de crecimiento endotelial (VEGF), o agentes anti-tumorales conocidos, y así mismo agentes conocidos por su asociación con el crecimiento muscular o su desarrollo, o el desarrollo del hueso, su maduración y crecimiento.

Los anticuerpos anti-homólogo del ligando de TIE son adecuados como agentes diagnósticos, para detectar estados de enfermedad asociados con la expresión del receptor TIE. Por tanto, los homólogos del ligando de TIE marcados de forma detectable pueden utilizarse para la obtención de imágenes que daten la presencia de angiogénesis.

Además, los homólogos del ligando de TIE de la presente invención, pueden utilizarse para promover la neovascularización, y pueden se útiles para inhibir el crecimiento tumoral.

Los antagonistas de los homólogos del ligando de TIE de la presente invención, por ejemplo, anticuerpos anti-homólogos del ligando de TIE, son útiles además para el diagnóstico y el tratamiento de tumores (cáncer) asociados con la amplificación de genes que codifican los respectivos homólogos del ligando de TIE.

Son usos adicionales con potencial terapéutico, la modulación del desarrollo del músculo y el hueso, su maduración y crecimiento.

Para el uso terapeútico, los homólogos del ligando de TIE o los anticuerpos anti-homólogos del ligando de TIE de la presente invención, se formulan con una composición terapéutica que comprende ingredientes activos mezclados con vehículos aceptables farmacológicamente, adecuados para su aplicación sistémica o tópica. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se preparan para su almacenamiento mediante la mezcla del ingrediente activo con el grado de pureza deseado con vehículos, excipientes o estabilizantes opcionales fisiológicamente aceptables (Remington's Pharmaceutical Sciencies 16^{th} edition, Osol, A. Ed (1980)), en la forma de formulaciones liofilizadas o en soluciones acuosas. Los vehículos, excipientes o estabilizantes adecuados no son tóxicos para los pacientes receptores en las dosis y concentraciones empleadas, e incluyen tampones como el fosfato, el citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes como al ácido ascórbico; polipéptidos de bajo peso molecular (menores de 10 residuos); proteínas, como la albúmina sérica, la gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos como la polivinilpirrolidona, amino ácidos como la glicina, la glutamina, la asparraguina, la arginina o la lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos como la glucosa, la manosa o las dextrinas; agentes quelantes como el EDTA; los alcoholes de azúcares, como el manitol o el sorbitol; los iones formadores de sales como el sodio; y/o tensoactivos no iónicos con el Tween, el Pluronics o el PEG.

Los ingredientes activos pueden también encerrarse en microcápsulas preparadas, por ejemplo, por técnicas de coacervación o por polimerización interfacial, por ejemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulosa o gelatina y microcápsulas de poli-(metil-metacilato), respectivamente, en sistemas de liberación de fármacos coloidales (por ejemplo liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nano-partículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Estas técnicas están descritas en Remington's Pharmaceutical Sciences, supra.

Las formulaciones utilizadas para la administración in vivo deben ser estériles. La esterilidad se consigue por filtración a través de membranas de filtración estériles, antes o seguidamente a la liofilización y reconstitución.

Las composiciones terapéuticas descritas aquí, se colocan generalmente en recipientes con un acceso por un puerto estéril, por ejemplo, una bolsa de solución intravenosa o un vial con un tapón agujereable por una aguja de inyección hipodérmica.

La ruta de administración está de acuerdo con los métodos conocidos, por ejemplo inyección o infusión por rutas intravenosa, intraperitoneal, intracerebral, intramuscular, intraocular, intraarterial o intralesional, tópica, o por un sistema de liberación sostenida.

Los ejemplos adecuados de las preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices de polímero semipermeable como artículos con diferentes formas, por ejemplo, películas o microcápsulas. Las matrices de liberación sostenida incluyen los poliésteres, los hidrogeles, los poliláctidos (patente americana U.S. 3.773.919, patente europea EP 58.481), los copolímeros del ácido L-glutámico y el gamma etil-L-glutamato (U. Sidman y col., 1983 "Biopolymers" 22 (1): 547-556), poli (2-hidroxietil-metacrilato) (R. Langer y col., 1981, "J. Biomed. Mater. Res" 15: 167-277 y R. Langer, 1982, Chem. Tech.'' 12: 98-105), etileno vinil acetato (R. Langer y col., Id.) ó el poli-D-(-) y el ácido 3-hidroxibutírico (patente europea EP 133.988A). Entre las composiciones de liberación sostenida también se incluyen los liposomas. Los liposomas que contienen una molécula en el ámbito de la presente invención se preparan por los método conocidos como: patente DE 3.218.121A; Epstein et al., 1985, "Proc. Natl. Acad. Sci. USA" 82:3688-3692; Hwang y col., 1980 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030-4034; patente EP52322A; patente EP 36676A; patente EP88046A; patente EP 143949A; patente EP 142641A; solicitud de patente japonesa 83-118008; patentes americanas U.S. 4.485.045 y 4.544.545; y patente EP 102.324A. Ordinariamente los liposomas son del tipo pequeño (alrededor de 200-800 Angstroms, unilamelares con un contenido lipídico superior a aproximadamente el 30% molar de colesterol, ajustándose la proporción seleccionada para una terapia NT-4 óptima.

Una cantidad efectiva de una molécula de la presente invención, para su empleo terapéutico dependerá, por ejemplo, de los objetivos terapéuticos, la ruta de administración y las condiciones de los pacientes. De acuerdo con ello, será necesario para el terapeuta la titulación de la dosis y la modificación de la ruta de administración que se requiera para obtener el efecto terapéutico óptimo. Una dosis típica diaria debe encontrarse en el intervalo de 1 \mug/kg a 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados más arriba. Generalmente, el clínico administrará una molécula de la presente invención hasta alcanzar la dosis que proporcione el efecto biológico requerido. El progreso de esta terapia es fácilmente controlable mediante ensayos convencionales.

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E. Amplificación de genes que codifican homólogos del ligando de TIE en tejidos tumorales y en líneas celulares

El genoma de organismos procariotas y eucariotas está sujeto a dos requerimientos aparentemente en conflicto. Por un lado la preservación y propagación en su forma original del DNA como información genética, para garantizar la herencia estable a través de múltiples generaciones. Y por otro lado, la capacidad de las células u organismos para adaptarse a los cambios ambientales continuos. Los mecanismos adaptativos pueden incluir modificaciones cualitativas o cuantitativas del material genético. Las modificaciones cualitativas incluyen mutaciones del DNA que alteran las secuencias codificantes y producen como resultado una proteína estructural o funcionalmente diferente. Las amplificaciones génicas son modificaciones cuantitativas, por tanto el número real completo de secuencias codificadoras, es decir un gen, se incrementa, llevando a un aumento del número de moldes disponibles para la transcripción, un aumento del número de tránscritos traducibles, y finalmente un aumento de la abundancia de la proteína codificada por dicho gen amplificado.

El fenómeno de la amplificación génica y sus mecanismos subyacentes ha sido investigado in vitro en sistemas de cultivos celulares de algunos procariotas y ecuariotas. El mejor ejemplo caracterizado de amplificación génica implica el cultivo de células eucariotas en medios que contienen concentraciones variables de compuestos citotóxicos como el metotrexato (MTX). El MTX es un análogo del ácido fólico e interfiere la síntesis de DNA mediante el bloqueo de la enzima dihidrofolato reductasa (DHFR). Durante la exposición inicial, a bajas concentraciones de MTX, la mayoría de las células mueren (>90%). Un pequeño número de células sobreviven, y son capaces de crecer en concentraciones crecientes de MTX y se producen mayores cantidades de RNA y proteína DHFR. La base de esta sobreproducción es la amplificación de un sólo gen, el DHFR. Las copias adicionales del gen se encuentran como copias extracromosomales en forma de pequeños cromosomas supernumerarios (double minutes) o integrados como copias
cromosomales.

La amplificación génica se encuentra más comúnmente en el desarrollo de la resistencia a fármacos citotóxicos (antibióticos para bacterias y agentes quimioterapéuticos para células eucariotas) y en la transformación neoplásica. La transformación de células de eucariotas es un evento espontáneo o debido a virus o a episodios de contaminación químico/ambiental y está generalmente asociado con los cambios en el material genético de las células. Uno de cambios genéticos comúnmente observados en los procesos malignos humanos es la mutación de la proteína p53. p53 controla la transición de las células de la fase estacionaria (G1) a la replicativa (S) y evita la transición en presencia de lesiones en el DNA. En otras, palabras, una de las consecuencias principales de las mutaciones de p53 es la acumulación y la propagación de las lesiones en el DNA, es decir cambios genéticos. En las células neoplásicas, son comunes los cambios genéticos que suponen además de mutaciones puntuales, amplificaciones y alteraciones estructurales importantes, como las translocaciones.

La amplificación de las secuencias de DNA puede indicar requerimientos específicos y funcionales tal como el ilustrado en el sistema experimental de DHFR. Por tanto, la amplificación de ciertos oncogenes en procesos malignos señala un papel causal de estos genes en el proceso de transformación maligna y en el mantenimiento del fenotipo transformado. Estudios recientes, han dado soporte a esta hipótesis. Por ejemplo, la proteína bcl-2 se ha encontrado amplificada en ciertos tipos de linfoma no-Hodgkin. Esta proteína inhibe la apoptosis y lleva a la acumulación progresiva de células neoplásicas. Miembros de la familia génica de receptores para factores de crecimiento se han encontrado amplificados en varios tipos de cánceres sugiriendo que la sobreexpresión de estos receptores puede hacer a las células neoplásicas más susceptibles a cantidades limitantes del factor de crecimiento disponible. Entre los ejemplos se incluye la amplificación del receptor de andrógenos en el cáncer de próstata recurrente durante la terapia de deprivación de andrógenos y la amplificación del receptor del factor de crecimiento homólogo ERB2 en cáncer de mama. Finalmente, los genes implicados en la señalización intracelular y el control de la progresión del ciclo celular pueden amplificarse durante la transformación maligna. Esto queda ilustrado por la amplificación de bcl-I y los genes ras en varios neoplasmas epiteliales y linfoides.

Los primeros estudios ilustran la posibilidad de identificar secuencias de DNA en neoplasmas, porque este enfoque puede identificar genes importantes en la trasformación maligna. El caso de ERB2 también demuestra la posibilidad, desde un punto de vista terapéutico, de que las proteínas transformantes puedan representar dianas nuevas y específicas para la terapia tumoral.

Los métodos más sensibles para la detección de la amplificación génica son los ensayos basados en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Estos ensayos utilizan cantidades muy pequeñas del DNA tumoral como material de partida, son muy sensibles, proporcionan DNA que es susceptible de ser empleado en otros análisis, como la secuenciación y son adecuados para el análisis en grandes volúmenes, con un gran rendimiento.

Los ensayos antes mencionados son mutuamente excluyentes, pero frecuentemente se utilizan en combinación para identificar las amplificaciones en neoplasmas. Mientras el análisis citogenético y el CGH representan métodos de cribado del genoma entero para las regiones amplificadas, los ensayos basados en la PCR son más adecuados para la identificación final de las secuencias codificantes, por ejemplo genes en regiones amplificadas.

De acuerdo con la presente invención, los genes amplificados han sido identificados por PCR cuantitativa (S. Gelmini y col., Clin. Chem. 43, 752 [1997]), por comparación del DNA de una variedad de tumores primarios, incluyendo tumores de mama, pulmón, colon,próstata, cerebro, hígado, riñón, páncreas, bazo, timo, testículo, ovario, útero, etc. o líneas celulares tumorales, con DNAs agrupados de donantes sanos. La PCR cuantitativa se realiza mediante un instrumento TaqMan (ABI), cebadores específicos del gen y sondas fluorogénicas que se diseñan según las secuencias codificadoras de sus DNAs.

Las líneas celulares de carcinoma humano de pulmón que incluyen A549 (SRCC768), Calu-1 (SRCC769), Calu-6 (SRCC770), H157 (SRCC771), H441 (SRCC772), H460 (SRCC773), SKMES-1 (SRCC774) y SW900 (SRC775), están todas disponibles en la ATCC. Las células tumorales primarias de pulmón humano derivan normalmente de adenocarcinomas, carcinomas de célula escamosa, carcinomas de célula grande, carcinomas de célula no pequeña, carcinomas de célula pequeña, y carcinomas bronco alveolares e incluyen, por ejemplo, el SRCC724 (carcinoma de célula escamosa, abreviado como "SqCCa"), el SRCC725 (carcinoma de célula no pequeña, abreviado "NSCCa"), el SRVCC726 (adenocarcinoma, abreviado como "AdenoCa"), el SRCC727 (adenocarcinoma), elSRCC728 (carcinoma de célula escamosa), el SRCC729 (adenocarcinoma), el SRCC730 (carcinoma de célula adeno/escamosa), el SRCC731 (adenocarcinoma), el SRCC732 (carcinoma de célula escamosa), el SRCC733 (adenocarcinoma), el SRCC734 (adenocarcinoma), el SRCC735 (carcinoma bronco alveolar, abreviado como "BAC"), el SRCC736 (carcinoma de célula escamosa), el SRCC738 (carcinoma de célula escamosa), el SRCC739 (carcinoma de célula escamosa), el SRCC740 (carcinoma de célula escamosa), el SRCC741 (carcinoma de célula de pulmón, abreviado como "LCCa").

Las líneas de células de cáncer de colon incluyen, por ejemplo, las líneas de la ATCC, SW480 (adenocarcinoma, SRCC776), SW620 (metástasis de nódulo linfático de adenocarcinoma de colon, SRC777), COLO320 (adenocarcinoma, SRC778), HT29 (adenocarcinoma, SRCC779), HM7 (carcinoma, SRCC780), CaWiDr (adenocarcinoma, srcc781), HCT116 (carcinoma, SRCC782), SKCO1 (adenomcarcinoma, SRCC783), SW403 (adenocarcinom, SRCC784), LS174T (carcinoma, SRC785), y HM7 (una variante mucinosa de la línea celular de adenocarcinoma de colon LS 174T de ATCC; obtenida del Dr. Robert Warren, UCSF). Los tumores primarios de colon incluyen adenocarcinomas de colon designados CT2 (SRCC742), CT3 (SRCC743), CT8 (SRCC744), CT10 (SRCC745), CT12 (SRCC746), CT14 (SRCC747), CT15 (SRCC748), CT17 (SRCC750), CT1 (SRCC751), CT4 (SRCC7552), CT5 (SRCC753), CT6 (SRCC754), CT7 (SRCC755), CT9 (SRCC756), CT11 (SRCC757), CT18 (SRCC758), y DcR3, BACrev, BACfwd, T160 y T159.

Las líneas de carcinoma de mama humano incluyen, por ejemplo, HBL 100 (SRCC759), MB435s (SRCC760), T47D (SRC761), MB468 (SRCC762), MB175 (SRCC763), MB361 (SRC764), BT20 (SRCC765), MCF7 (SRCC766), SKBR3 (SRCC767).

1. Distribución tisular

El resultado de estos ensayos de amplificación génica puede verificarse con estudios adicionales, como por ejemplo la determinación de la expresión del mRNA en diversos tejidos humanos.

Como se ha apuntado antes, la amplificación génica y/o la expresión génica en varios tejidos puede cuantificarse por transferencia de Southern convencional. La transferencia de Northen para la cuantificación de la transcripción del mRNA (Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 5201-5205 [1980]), la transferencia de mancha (análisis de DNA), o hibridación in situ, utilizando una sonda adecuada marcada, basada en las secuencias proporcionadas aquí. De forma alternativa, los anticuerpos pueden emplearse para el reconocimiento de duplex específicos, que incluyen DNA duplex, RNA duplex, y DNA-RNA duplex híbridos o DNA-proteína duplex.

La expresión génica en diversos tejidos, alternativamente, puede medirse por procedimientos inmunológicos, como la tinción inmunohistoquímica de secciones de tejidos y los ensayos de cultivo celular o fluidos corporales para la cuantificación directa de la expresión del producto génico. Los anticuerpos útiles para la tinción inmunohistoquímica y/o ensayo de fluídos corporales pueden ser mono o policlonales, y pueden prepararse en algún mamífero. Convenientemente, los anticuerpos pueden prepararse contra la secuencia nativa del polipéptido homólogo del ligando de TIE o contra un péptido sintético basado en la secuencia del DNA proporcionada aquí o contra la secuencia exógena fusionada a un DNA del homólogo del ligando de TIE y que codifica para un epitopo específico del anticuerpo. Las técnicas generales para generar anticuerpos, y los protocolos especiales para la transferencia de Northern y para hibridación in situ se proporcionan aquí, más adelante.

2. Localización en el mapa cromosómico

Si la amplificación de un gen dado es funcionalmente relevante, ese gen se encuentra más amplificado que sus regiones genómicas vecinas que no son importantes para la supervivencia del tumor. Para comprobar la anterior hipótesis, el gen puede localizarse en el mapa de un cromosoma particular, por ejemplo mediante el análisis de híbridos de radiación. El nivel de amplificación se determina entonces en la localización identificada en relación a las regiones genómicas vecinas. La amplificación selectiva o preferencial en la región genómica en la que el gen ha sido localizado es consistente con la posibilidad de que la amplificación génica observada promueva el crecimiento tumoral o la supervivencia.

3. Estudios de unión a anticuerpos

Los resultados del estudio de amplificación génica pueden verificarse además por estudios de unión a anticuerpos en los que se analizar la capacidad de los anticuerpos anti-homólogo del ligando de TIE para inhibir el efecto del polipéptido homólogo del ligando de TIE en las células (cáncer). Ejemplos de anticuerpos incluyen anticuerpos policlonales, monoclonales, humanizados, biespecíficos y heteroconjugados, la preparación de los cuales se describirá más adelante.

Los estudios de unión a anticuerpos pueden llevarse a cabo con cualquier método de ensayo conocido, como ensayos de unión competitiva, ensayos de sandwich directo o indirecto y ensayos de inmunoprecipitación. Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp. 147-158 (CRC Press, Inc. 1987).

Los ensayos de unión competitiva, se basan en la capacidad de un estándar marcado para competir con un analito de la muestra a examen según su unión relativa con una cantidad determinada de anticuerpo. La cantidad de proteína diana (codificada por un gen amplificado por una célula tumoral) en la muestra problema, es inversamente proporcional a la cantidad de estándar que permanece unida al anticuerpo. Para facilitar la determinación de la cantidad del estándar que permanece unido, los anticuerpos preferentemente se insolubilizan antes o después de la competición, por lo que el estándar y el analito que se unen a los anticuerpos pueden ser separados fácilmente del estándar y del analito que permanecen libres.

Los ensayos en sandwich implican el uso de dos anticuerpos, cada uno capaz de unirse a una porción diferente inmunogénica o epitopo de la proteína a ser detectada. En un ensayo en sandwich, el analito de la muestra a examen se une a un primer anticuerpo que está inmovilizado en un soporte sólido, y después un segundo anticuerpo se une al analito, formando un complejo insoluble ternario. Véase por ejemplo la patente americana US 4.376.110. El segundo anticuerpo puede estar marcado con una mitad detectable (ensayo de sandwich directo) o puede cuantificarse mediante unión con un anticuerpo anti-inmunoglobulina que está marcado con una porción detectable (ensayo de sandwich indirecto). Como ejemplo, uno de los tipos de ensayo de sandwich es el ensayo ELISA, en el que la porción detectable es una enzima.

Para inmunohistoquímica, la muestra tumoral puede ser fresca o congelada o puede estar incluída en parafina y fijada con un preservante como la formalina, por ejemplo.

4.Ensayos tumorales con base celular

Los ensayos con base celular y los modelos animales para tumores (por ejemplo los cánceres) pueden utilizarse para verificar los hallazgos de un ensayo de amplificación génica, y comprender además la relación entre los genes identificados y el desarrollo y patogénesis del crecimiento celular neoplásico. El papel de los productos génicos identificados en la presente invención en el desarrollo y la patología tumoral o el cáncer puede ser examinado utilizando células tumorales primarias y líneas celulares que han sido identificadas por presentar amplificación génica. Estas células
incluyen, por ejemplo, las células de cáncer de mama, colon y pulmón y las líneas celulares enumeradas más arriba.

En un enfoque diferente, las células de un tipo celular conocido de un tumor particular se transfectan con los cDNAs descritos aquí, y se analiza la capacidad de esos DNAs para inducir un crecimiento excesivo. Las células adecuadas incluyen, por ejemplo, líneas celulares tumorales estables como la línea celular B104-1-1 (la línea celular NIH-3T3 transfectada de forma estable con el protooncogen neu) y la línea celular NIH-3T3 transfectada con ras, las cuales pueden ser transfectadas con el gen de interés y controladas por su crecimiento tumoral. Tales líneas celulares transfectadas pueden utilizarse para examinar la capacidad de anticuerpos poli o monoclonales o composiciones de éstos para inhibir el crecimiento celular tumoral según su actividad citostática o citotóxica sobre el crecimiento de las células transformadas, o por la citotoxidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC). Las células transfectadas con las secuencias codificantes de los genes identificados en la presente invención pueden además utilizarse para la identificación de fármacos candidatos para el tratamiento del cáncer.

Además, los cultivos primarios derivados de tumores en animales transgenicos (tal como se describe más abajo) pueden utilizarse en ensayos con base celular, aunque es preferible utilizar líneas celulares estables. Las técnicas para derivar líneas celulares continuas de animales transgenicos son bien conocidas en la materia (véase, por ejemplo, Small y col., Mol. Cell. Biol. 5, 642-648 [985]).

5. Modelos animales

Una gran variedad de modelos animales bien conocidos pueden utilizarse para conocer además el papel de los genes identificados en la presente invención, en el desarrollo y la patogénesis de los tumores, y para examinar la eficacia de agentes terapéuticos candidatos, incluídos los anticuerpos, y otros antagonistas de los polipéptidos nativos, que incluyen antagonistas de pequeñas moléculas. La naturaleza in vivo de estos modelos los hace particularmente predictivos de las respuestas en pacientes humanos. Los modelos animales de tumores y cánceres (por ejemplo cáncer de mama, colon, próstata, pulmón, etc...) incluyen tanto animales no recombinantes como recombinantes (transgenicos). Los modelos animales no recombinantes incluyen, por ejemplo, los roedores, por ejemplo modelos murinos. Estos modelos pueden generarse por la introducción de células tumorales en un ratón singénico por técnicas estándares, por ejemplo inyección subcutánea, inyección en la vena de la cola, implantación en el bazo, intraperitoneal, en la cápsula renal o implantación ortópica, por ejemplo células de cáncer de colon implantadas en tejido colónico (véase, por ejemplo la publicación de patente internacional WO 97/33551, publicada el 18 de Septiembre de 1997).

Probablemente las especies animales más frecuentemente utilizadas en los estudios oncológicos sean los ratones inmunodeficientes y en particular, los ratones nude. La observación que los ratones nude con hipoaplasia pueden actuar como huéspedes para tumores humanos que son xenografiados con éxito, ha llevado a su uso generalizado para este propósito. El gen autosómico recesivo nu ha sido introducido en un gran número de distintas cepas congénitas distintas de ratones nude que incluyen por ejemplo, ASW, A/He, AKR, BALB/c, B10.LP, C17, C3H, C57BL, C57, CBA, CBA, DDD, 1/st, NC, NFR, NFS, NFS/N, NZB, NZC, NZW, P, RIII y SJL. Además, una amplia variedad de otros animales con defectos inmunológicos heredables diferentes que los ratones nude se crían y utilizan como receptores de tumores xenoinjertados. Para más detalles véase, por ejemplo The Nude Mouse in Oncology Research, E. Boven y B. Winograd, eds. CRC Press, Inc. 1991.

Las células introducidas en los animales pueden derivar de tumores conocidos/líneas celulares de cáncer, tal como cualquiera de las líneas celulares antes enumeradas, por ejemplo, la línea celular B104-1-1 (línea celular NIH-3T3 establementente transfectada con el protooncogene neu); las células NIH-3T3 transfectadas con ras; Caco-2 (ATCC-HTB-37); una línea celular de adenocarcinoma de colon moderadamente bien diferenciada de grado II; HT-29 (ATCC HTB-38), o a partir de tumores y cánceres. Las muestras de tumores o células cancerígenas pueden obtenerse de pacientes sometidos a cirugía, según condiciones estándares, que implican congelación y almacenamiento en nitrógeno líquido (Kammali y col., Br. J. Cancer, 48, 689-696 (1983)).

Las células tumorales pueden introducirse en animales, como los ratones nude mediante diversos procedimientos. El espacio subcutáneo (s.c.) en el ratón es muy adecuado para la implantación de tumores. Los tumores pueden transplantarse s.c. como bloques sólidos, como biopsias recogidas con un trócar, o como suspensiones celulares. Para bloques sólidos o para la implantación con un trócar, los fragmentos del tejido tumoral del tamaño adecuado se introducen en el espacio s.c., Las suspensiones celulares se preparan frescas a partir de tumores primarios o líneas celulares tumorales estables, y se inyectan subcutaneamente. Las células tumorales también pueden inyectarse como implantes subdermales. En esta localización, el inóculo se deposita entre la parte inferior del tejido dermal conectivo y el tejido s.c. Boven y Winograd, supra.

Los modelos animales de cáncer de mama pueden generarse, por ejemplo, por implantación de células de neuroblastoma de rata (de las cuales se aisló inicialmente el oncogen neu), o de células NIH-3T3 transformadas con neu en el ratón nude, esencialmente tal como describió Drebin y col., PNAS USA 83, 9129-9133 (1986).

De forma similar, los modelos animales de cáncer de colon pueden generarse mediante pases de las células de cáncer de colon a los animales, por ejemplo ratones nude, que lleva a la aparición del tumor en esos animales. Un modelo de transplante ortotópico de cáncer de colon humano en ratón nude ha sido descrito por ejemplo por Wang y col., Cancer Research 54, 4726-4728 (1994) y Too y col., Cancer Research 55, 681-684 (1995). Este modelo se basa en el llamado "METARRATÓN" vendido por AntiCancer, Inc. (San Diego, California).

Los tumores que aparecen en animales pueden ser extraídos y cultivados in vitro. Las células de estos cultivos in vitro pueden traspasarse a animales. Estos tumores pueden servir posteriormente para un examen más amplio o para la investigación con fármacos. De forma alternativa, se pueden aislar los tumores procedentes de los pases y analizar el RNA de las células pre-pase y de las células aisladas después de una o más rondas de pases por la expresión diferencial de los genes de interés. Estas técnicas de pases pueden realizarse con cualquier tumor conocido o líneas celulares de cáncer.

Por ejemplo, Meth A, CMS4, CMS5, CMS21 y WEHI-164 son fibrosarcomas inducidos químicamente de ratón hembra BALB/c (DeLeo et al., J. Exp. Med. 146, 720 (1977)), que proporcionan un sistema modelo altamente controlable para el estudio de las actividades anti-tumorales de varios agentes (Palladino et al., J. Immunol. 138, 4023-4032 (1987)). Brevemente, las células tumorales se propagan in vitro en cultivo celular. Antes de la inyección a los animales, las líneas celulares se lavan y resuspenden en tampón, a una densidad celular de alrededor de 10X10^{6} a 10X10^{7} células/ml. Los animales se infectan a continuación subcutáneamente con 100 a 100 ul de suspensión celular, y se espera de una a tres semanas hasta que aparezca el tumor.

Además, el carcinoma de pulmón de Lewis de pulmón (3LL) de ratón, que es uno de los tumores experimentales más minuciosamente estudiados, puede utilizarse como modelo tumoral de investigación. La eficacia de este modelo tumoral se ha correlacionado con los efectos benéficos en el tratamiento de pacientes humanos diagnosticados de carcinoma de células pequeñas de pulmón (SCCL). Este tumor puede ser introducido en un ratón normal por la inyección de fragmentos tumorales de un ratón afectado o de células mantenidas en cultivo (Zupi y col., Br. J. Cáncer 41, suppl. 4, 309 (1980)), y la evidencia indica que los tumores pueden iniciarse por inyección de incluso una única célula y que sobrevive una gran proporción de células tumorales infectadas. Para más información sobre este modelo tumoral véase Zacharski, Haemostasis 16, 300-320 (1986)).

Una manera de evaluar la eficacia de un fármaco a examen en un modelo animal consiste en medir el tamaño del tumor implantado, antes y después del tratamiento. Tradicionalmente, el tamaño de los tumores implantados se mide con un portaobjetos calibrado en dos o tres dimensiones. La medida limitada por las dos dimensiones no refleja de forma ajustada el tamaño del tumor, por tanto, normalmente se convierte en el volumen correspondiente utilizando una fórmula matemática. Sin embargo, la medición del tamaño tumoral no es muy ajustada. Los efectos terapéuticos de un fármaco candidato pueden describirse mejor si el tratamiento induce un retraso en el crecimiento del tumor. Otra variable importante en la descripción del crecimiento tumoral es el tiempo de duplicación del volumen tumoral. Se hallan disponibles programas informáticos para el cálculo y la descripción del crecimiento tumoral, tal como el programa descrito por Rygaard y Spang-Thomsem, Proc. 6^{th} Int. Workshop on Immune-Deficient Animals, Wu and Sheng eds., Basel, 1989, 301. Hay que señalar, sin embargo, que la necrosis y las respuestas inflamatorias seguidas al tratamiento pueden en realidad resultar en un aumento del tamaño tumoral, al menos inicialmente. Por tanto estos cambios necesitan ser controlados con cuidado y con la combinación de métodos morfométricos y de análisis por citometría de flujo.

Los modelos animales recombinantes (transgenicos) pueden construirse mediante la introducción de una porción codificante de los genes identificados aquí en el genoma de los animales de interés, mediante técnicas estándares de producción de animales trangénicos. Los animales que pueden servir como dianas para la manipulación transgenica incluyen sin limitación los ratones, las ratas, los conejos, los cobayas, las ovejas, las cabras, los cerdos, los primates no humanos, por ejemplo los babuinos, los chimpacés y los monos. Las técnicas conocidas en la materia para introducir un transgen en los animales incluyen la microinyección de un pronúcleo (Hoppean Wanger, patente americana U.S. Patente No. 4.873.191); la transferencia mediada por retrovirus en línea germinal (por ejemplo Van der Putten y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 6148-615 (1985)); la transferencia génica en células madre embrionarias (Thompson y col., Cell 56, 313-321 (1989)); la electroporación de embriones (Lo, Mol. Cel. Biol. 3, 1803-1814 (1983)); la transferencia génica a través de esperma (Lavitrano et al., Cell 57, 717-73 (1989)). Para revisión véase, por ejempleo, la patente americana U.S. 4.736.866.

Para el propósito de la presente invención, los animales transgenicos incluyen aquellos que llevan el transgen únicamente en parte de sus células ("animales mosaico"). El transgen puede integrarse como un transgen único, o en concatámeros, por ejemplo tándems en disposición cabeza-cola o cabeza-cabeza. La introducción selectiva de un transgen en un tipo celular particular también es posible siguiendo, por ejemplo, la técnia de Lasko et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 6232-636 (1992).

La expresión del transgen en animales transgenicos puede controlarse por técnicas estándares. Por ejemplo el análisis por transferencia de Southern o la amplificación por PCR pueden servir para verificar la integración del transgen. El nivel de expresión del mRNA puede analizarse mediante técnicas como la hibridación in situ, el análisis por transferencia de Northern, PCR o inmunohistoquímica. Además, los animales se examinan para reconocer posibles signos tumorales o de desarrollo del cáncer.

De forma alternativa, pueden construirse animales "knock out" que tengan un gen defectivo o alterado que codifique un polipéptido identificado en la presente invención, como resultado de la recombinación homóloga entre el gen endógeno que codifica el polipéptido y el DNA genómico alterado que codifica el mismo polipéptido introducido en la célula embrionaria del animal. Por ejemplo, el cDNA que codifica para un polipéptido particular puede utilizarse el clonaje de DNA genómico que codifica para un polipéptido de acuerdo con las técnicas establecidas. Una porción del DNA genómico que codifica para un polipéptido particular puede ser delecionado o sustituido por otro gen, por ejemplo puede utilizarse un gen que codifique un marcador seleccionable para controlar la integración. Generalmente, en el vector se incluyen algunas kilobases de DNA flanqueante sin alterar (en ambos extremos, 5' y 3'), (para la descripción de los vectores para la recombinación homóloga véase por ejemplo Thomas y Capecchi, Cell, 51:503 (1987). El vector se introduce en una línea celular madre embrionaria (por ejemplo mediante electroporación) y se seleccionan las células en las que el DNA introducido se ha recombinado de forma homóloga con el DNA endógeno (véase por ejemplo Li y col., Cell, 69:915 (1992)). Las células seleccionadas se inyectan a continuación en el blastocisto de un animal (por ejemplo, ratón o rata) para formar quimeras de agregación (véase por ejemplo, Bradley, in Teratocarcinomas y Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E.J. Robertson, etd. (IRL, Oxford, 1987), pp. 113-152). A continuación, se implanta un embrión quimérico en una hembra receptora pseudoembarazada y se deja crecer hasta el término del embarazo para conseguir el animal "knock out". La progenie que lleva el DNA recombinado en sus células germinales puede identificarse por técnicas estándares y utilizarse para generar animales en los que todas las células contengan el DNA recombinante. Los animales knockout pueden caracterizarse por su capacidad para defenderse contra ciertas condiciones patológicas y por el desarrollo de condiciones patológicas debido a la ausencia del polipéptido FIZZ.

La eficacia de los anticuerpos unidos específicamente a los polipéptidos identificados en la presente invención y otros fármacos candidatos, puede estudiarse también mediante tratamiento de tumores animales espontáneos. Una diana adecuada para estos estudios es el carcinoma oral de célula escamosa de felino (SCC). El SCC oral de felino es un tumor altamente invasivo, maligno y el más común de los procesos malignos en la cavidad oral de los gatos, siendo la causa de hasta el 60% de los tumores orales descritos en estas especies. Raramente metastatiza distalmente, aunque esta baja incidencia de metástasis puede reflejar simplemente los tiempos cortos de supervivencia en los gatos que presentan este tumor. Estos tumores no son normalmente susceptibles de cirugía, debido principalmente a la anatomía de la cavidad oral del felino. En este momento no existe un tratamiento efectivo para este tumor. Antes de entrar en este estudio, cada gato es sometido a una exploración clínica completa, biopsia, y escáner por tomografía computerizada (CT). Los gatos diagnosticados con tumores orales de células escamosas sublinguales se excluyen del estudio. La lengua puede paralizarse como resultado del tumor, e incluso aunque el tratamiento mate el tumor, los animales no son capaces de comer por sí mismos. Cada gato es tratado repetidamente durante un período de tiempo largo. Las fotografías de los tumores se toman diariamente durante el período de tratamiento y en cada reinspección subsiguiente. Después del tratamiento, cada gato es sometido a un nuevo escáner por CT. Los escáners por CT y los radiogramas torácicos se evaluan cada 8 semanas. Los datos se evaluan según diferencias en la supervivencia, la respuesta al tratamiento y la toxicidad en comparación con grupos control. La respuesta positiva requiere evidencias de la regresión tumoral, preferentemente con un aumento en la calidad de vida y/o un aumento de la expectativa de vida.

Además, otros tumores espontáneos de animales pueden también estudiarse, como el fibrosarcoma, adenocarcinoma, linfoma, condroma, leiomiosarcoma de perro, gato, y babuíno. De éstos, los adenocarcinomas mamarios de perros y gatos son el modelo preferido ya que por su apariencia y comportamiento es muy similar al de los humanos. Sin embargo, el uso de este modelo está limitado por la rara ocurrencia de este tipo de tumores en animales.

6. Métodos de tratamiento

Está contemplado que los anticuerpo y otros compuestos antitumorales de la presente invención puedan utilizarse para tratar diversas condiciones, incluidas aquellas caracterizadas por la sobreexpresión y/o activación de genes amplificados identificados en la presente invención. Un ejemplo de las condiciones o trastornos a tratar con los anticuerpos u otros compuestos incluyen, pero no se limitan a, pequeñas moléculas orgánicas e inorgánicas, péptidos, moléculas antisentido, etc., incluyendo tumores benignos o malignos (por ejemplo, los tumores renales, hepáticos, de la vejiga , de mama, gástricos, ováricos, colorectales, de la próstata, pancreáticos, vulvares, tiroideos, carcinomas hepáticos; sarcomas; glioblastomas; y varios tumores de cabeza y cuello); leucemias y patologías malignas linfoides; y otros trastornos como los neuronales, gliales, astrocitales, hipotalámicos y otros glandulares, macrofagales, epiteliales, estromales y trastornos blastocoélicos; inflamatorios, angiogénicos e inmunológicos.

Los agentes antitumorales de la presente invención, por ejemplo los anticuerpos, se administran a mamíferos, preferentemente humanos, de acuerdo con los métodos conocidos según diferentes vías de administración: intravenosa, como un bolo o por infusión continua durante un período de tiempo, intramuscular, intraperitoneal, intracerebroespinal, subcutánea, intra-articular, inrasinovial, intratecal, oral, tópica o por inhalación. Para los anticuerpos, es preferible la administración intravenosa.

Otros regímenes terapéuticos puede combinarse con la administración de agentes anticancerígenos, por ejemplo los anticuerpos de la presente invención. Por ejemplo, el paciente a ser tratado con algún agente anticancerígeno puede también recibir terapia por radiación. Alternativamente, o al mismo tiempo, puede administrarse un agente quimioterapéutico. La preparación y los horarios de las dosis para los agentes quimioterapéuticos puede seguir las instrucciones del fabricante o tal como se determine empíricamente por el profesional experimentado. La preparación de las dosis y horarios para la quimioterapia también se describen en Chemotherapy Service Ed., M.C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1992). El agente quimioterapéutico puede administrarse antes o después de un compuesto antiestrogénico, como puede ser el tamoxifen, o una antiprogesterona, como la onapristona (véase la patente europea EP 616812), en las dosis conocidas para estas moléculas.

Puede ser deseable administrar anticuerpos contra otros antígenos tumorales asociados, como los anticuerpos que se unen a ErbB2, EGFR, ErbB3, ErbB4, o al factor de crecimiento vascular endotelial (VEGF). De forma alternativa, o al mismo tiempo, pueden ser coadministrados al paciente dos o más anticuerpos que se unen al mismo, o a dos o más antígenos diferentes descritos en la presente invención. Algunas veces, puede ser beneficioso administrar una o más citoquinas al paciente. En una aplicación preferida, los anticuerpos aquí descritos se coadministran con un agente inhibidor del crecimiento. Por ejemplo, el agente inhibidor del crecimiento puede administrarse en primer lugar, seguido por un anticuerpo de la presente invención. En el ámbito de la presente invención se contemplan la administración simultánea o la administración en primer lugar del anticuerpo de la invención. Las dosis adecuadas para el agente inhibidor del crecimiento, son las utilizadas actualmente y pueden disminuirse debido a la acción combinada (sinergia) del agente inhibidor del crecimiento y del anticuerpo aquí descrito.

Para un tratamiento preventivo o terapéutico de la enfermedad, la dosis adecuada de un agente antitumoral, por ejemplo, un anticuerpo de los aquí descritos, dependerá del tipo de enfermedad a tratar, tal como se ha definido más arriba, de la severidad y del curso de la enfermedad, del propósito de administración del agente (si preventivo o terapéutico), de la historia clínica del paciente y de su respuesta al agente, y del criterio del médico responsable. De acuerdo con lo anterior, el agente se administrará al paciente en la forma adecuada en una sola vez o en tratamientos sucesivos.

Por ejemplo, dependiendo del tipo y la severidad de la enfermedad, una posible dosis inicial del anticuerpo podría ser de 1 \mug/kg hasta 25 mg/kg (e.g 0,1-20 mg/kg) aproximadamente, por ejemplo, en una o más administraciones separadas, o en infusión continua. Una dosis diaria típica puede estar en el intervalo de 1 \mug/kg a 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados más arriba. Para administraciones repetidas durante algunos o más días, dependiendo de la condición, el tratamiento se prolonga hasta que se manifieste la supresión deseada de los síntomas de la enfermedad. Sin embargo, otros regímenes de dosis también pueden ser útiles. El progreso de la terapia se controla fácilmente por técnicas y ensayos convencionales.

7. Artículos de fabricación

En otra realización de la presente invención, se proporciona un artículo fabricado que contiene materiales útiles para el diagnóstico o el tratamiento de los trastornos descritos anteriormente. El artículo fabricado comprende un envase y con una etiqueta. Entre los envases adecuados se incluyen por ejemplo: botellas, viales, jeringas y tubos de ensayos. Los envases pueden ser de de materiales diversos como el cristal o el plástico. El envase contiene una composición que es efectiva para el diagnóstico o tratamiento de la condición y al que se puede tener acceso por una vía estéril (por ejemplo, el envase puede ser una bolsa con una solución intravenosa o un vial con un tapón agujereable por una aguja de inyección hipodérmica). El agente activo en la composición es normalmente un agente antitumoral capaz de interferir en la actividad del producto génico identificado en la presente invención, por ejemplo un anticuerpo. En la etiqueta o en el envase se indica si la composición se utiliza para el diagnóstico o para el tratamiento de la condición. El artículo fabricado puede además contener un segundo envase con un tampón aceptable farmacéuticamente, como el tampón fosfato salino, la solución de Ringer y una solución de dextrosa. Puede además incluir otros materiales deseables para uso comercial, incluyendo otros tampones, diluyentes, filtros, agujas, jeringas y materiales de empaquetamiento con instrucciones para su uso.

F. Ensayos de cribado para fármacos candidatos

Los ensayos de cribado de fármacos candidatos se diseñan para identificar compuestos que se unen o forman complejos con polipéptidos codificados por los genes descritos en la presente invención; o que interfieren con la interacción de los polipéptidos codificados con otras proteínas celulares. Estos ensayos de cribado incluyen ensayos para cribado de alto rendimiento de librerías químicas, siendo particularmente adecuados para la identificación de pequeñas moléculas candidatas a fármacos. Las pequeñas moléculas contempladas incluyen compuestos sintéticos, orgánicos o inorgánicos, que incluyen péptidos, preferentemente péptidos solubles, fusiones de (poli)péptidos-inmunoglobulina y en particular, anticuerpos que incluyen, sin limitación, anticuerpos poli y monoclonales y fragmentos de anticuerpos, anticuerpos de cadena sencilla, anticuerpos anti-idiotípicos, y versiones quiméricas o humanizadas de estos anticuerpos y sus fragmentos, así como anticuerpos humanos y sus fragmentos. Los ensayos pueden realizarse en una variedad de formatos, que incluyen ensayos de unión proteína-proteína, ensayos de cribado bioquímico, inmunoensayos y ensayos celulares, que están bien caracterizados en la materia.

Todos los ensayos tienen en común el contacto del fármaco candidato con el polipéptido codificado por un ácido nucleico identificado aquí en las condiciones y tiempo suficiente para permitir la interacción de los dos componentes.

En los ensayos de unión, la interacción es la unión de las moléculas y a continuación, el complejo formado puede aislarse y detectarse en una mezcla de reacción. En una aplicación particular, el polipéptido que codifica un gen identificado aquí o el fármaco candidato se inmoviliza en una fase sólida, por ejemplo en una placa de microtitulación mediante enlaces covalentes o no covalentes. Los enlaces no convalentes se consiguen recubriendo la superficie sólida con una solución del polipéptido y secándola a continuación. Alternativamente puede utilizarse un anticuerpo inmovilizado, por ejemplo un anticuerpo monoclonal, específico para el polipéptido inmovilizado como anclaje en la superficie sólida. El ensayo se realiza añadiendo el componente no inmovilizado, que puede estar marcado de forma detectable, al componente inmovilizado, por ejemplo la superficie cubierta que contiene el componente anclado. Cuando se completa la reacción, extraen los componentes que no han reaccionado, por ejemplo mediante lavados, y se detectan los complejos anclados en la superficie sólida. Cuando los componentes originalmente no inmovilizados llevan un marcaje detectable, la detección de ese marcaje inmovilizado en la superficie indicará que se ha formado el complejo. Cuando un componente no inmovilizado originariamente no lleva marcaje, el complejo puede detectarse, por ejemplo, con el uso de un anticuerpo marcado específicamente que se une al complejo inmovilizado.

Si el compuesto candidato interacciona pero no se une a una proteína particular codificada por un gen identificado en la presente invención, su interacción con esa proteína puede estudiarse mediante métodos bien conocidos para la detección de las interacciones proteína-proteína. Estos ensayos incluyen enfoques tradicionales, como la unión, la coinmunoprecipitación y la copurificación a través de gradientes o columnas cromatográficas. Además, las interacciones proteína-proteína pueden estudiarse con un sistema genético de levadura descrito por Fields y colaboradores [Fields y Song, Nature (London) 340, 245-246 (1989); Chien y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 9578-9582 (1991)] descrito por Chevray y Nathans [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 5789-5793 (1991)]. Muchos activadores transcripcionales, como GAL4 de levadura, consisten en dos dominios modulares físicamente discretos, uno actúa como dominio de unión al DNA, mientras que el otro funciona como dominio de activación transcripcional. El sistema de expresión en levadura descrito en las publicaciones anteriores (en general se refieren a él como "sistema del doble-híbrido") tiene la ventaja de emplear dos proteínas híbridas, una en la que la proteína diana está fusionada al dominio de unión al DNA de GAL4, y otra, en donde las proteínas activadoras candidatas están fusionadas el con dominio de activación. La expresión del gen reportero GAL1-lacZ bajo el control del promotor activado de GAL-4 depende de la reconstitución de la actividad GAL4 gracias a la interacción proteína-proteína. Las colonias que contienen los polipéptidos que interaccionan se detectan con el sustrato cromogénico de la \beta-galactosidasa. Un equipo completo (MATCHMAKER^{TM}) para la identificación de las interacciones proteína-proteína entre dos proteínas específicas mediante la técnica del doble híbrido está disponible comercialmente por Clontech. Este sistema puede también extenderse para localizar en el mapa de cromosomas los dominios de proteína implicados en las interacciones específicas de proteína, así como para señalar los residuos cruciales para esas interacciones.

Con el fin de hallar compuestos que interfieran en la interacción de un gen identificado en la presente invención y otros componentes intra o extracelulares, es posible examinar una mezcla de reacción preparada que contenga el producto de un gen amplificado y el componente intra- o extracelular en las condiciones y tiempo necesarios para permitir la interacción y la unión de los dos productos. Para examinar la capacidad de un compuesto para inhibir la unión, la reacción se realiza en ausencia y en presencia del compuesto problema. Puede añadirse un placebo a una tercera mezcla de reacción, para servir como control positivo. La unión (formación del complejo) entre el compuesto a examen y el componente intra o extracelular presente en la mezcla se controla, tal como se ha descrito con anterioridad en la presente invención. La formación de un complejo en las reacciones control pero no en la reacción que contenga el compuesto es indicativo de que el componente interfiere en la interacción entre el gen y su pareja de reacción.

Detalles adicionales de la presente invención serán evidentes a partir de los ejemplos siguientes, sin ánimo de limitar el ámbito de la invención:

Ejemplo 1

Aislamiento de los clones de cDNA que codifican el NL1 humano

El NL1 se identificó mediante un cribado de bases de datos del GenBank utilizando el programa informático BLAST (Altshul y col., Methods in Enzymology 266:460-480 (1996)). La secuencia NL1 muestra homología con las secuencias diana expresadas (EST, del inglés expressed sequence tag) T35448, T11442 y W77823. Ninguno de las secuencias EST se han identificado como secuencias de tamaño completo, o se han descrito como ligandos que asocian 1d con los receptores TIE.

Según su identificación, el NL1 se clonó a partir de una librería de pulmón fetal humano preparada del mRNA obtenido de Clontech, Inc. (Palo Alto, CA, USA), catálogo #6528-1, según las instrucciones del fabricante.

La librería se ligó en el vector pRK5B, que es un precursor de RK5D que no contiene la diana SfiI, véase, Colmes y col., Science, 253:1278-1280 (1991). A su vez, pRK5D es un derivado de pRK5 (patente europea EP 307.247, publicada el 15 de Marzo de 1989), con pequeñas diferencias en su secuencia del poliengarce. La librería se cribó mediante hibridación con sondas oligonucleotídicas sintéticas:

: NL1.5-1 5'-GACGAACCAAGGCAACTACAAACTCCTGGT- SEC ID NO:7

: Nl1.3-1 5'TGCGGCCGGACCAGTCCTCCATGGTCACCAGGAGTTTGTAG SEC ID NO:8

: NL1.3-2 5'GGTGGTGAACTGCTTGCCGTTGTGCCATGTAA SEC ID NO:9

Basado en las ESTs halladas en el banco de bases de datos GenBank. Las secuencias de cDNA se secuenciaron completamente.

Las secuencias aminoacídicas y nucleotídicas de NL1 se muestran en la Figura 1 (SEC ID NO:1) y la Figura 2 (SEC ID NO:2), respectivamente.

NLI muestra una identidad de secuencia del 23% con el ligando de TIE-1 y con el de TIE-2.

Un clon NL1 se depositó en el American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, el 18 de Septiembre de 1997, de acuerdo con el Tratado de Budapest y se ha le asignado el número d depósito ATCC 209280.

NL1 se ha localizado en el cromosoma 9, banda q13-q21.

Ejemplo 2

Transferencia de Northern y análisis de Hibridación in situ del RNA

La expresión del mRNA de NL1 en tejidos humanos se examinó mediante análisis de transferencia de Northern. Las transferencias de mRNA humanos se hibridaron con una sonda de DNA marcada con P^{32} derivada del cDNA de tamaño completo; las sondas se generaron mediante digestión y purificación de los insertos de cDNA. La transferencia de RNA fetal adulto humano MTN (Clontench) y la transferencia de RNA humano MTN-II (Clontech) se incubaron con las sondas de DNA. Las transferencias se incubaron con las sondas en el tampón de hibridación (5XSSPE; solución 2XDenhardts; 100 mg/ml de DNA de esperma de salmón desmenuzado; formamida al 50%; SDS al 2%) durante 60 horas a 42ºC. Las transferencias se lavaron varias veces en 2XSSCM SDS al 0,05% durante 1 hora a temperatura ambiente, seguido de un lavado de 30 min en 0,1XSSC, SDS al 0,1% a 50ºC. Las transferencias se revelaron después de una exposición durante toda la noche mediante análisis con el Phosphoimager (Fuji).

Tal como se muestra en la 4, se detectaron transcritos del mRNA de NL1. Se detectó una fuerte expresión del mRNA de NL1 en el corazón y tejido del músculo esquelético y páncreas.

El patrón de expresión tisular de NL1 también se determinó mediante hibridación in situ (hibridación con el RNA celular), utilizando un protocolo optimizado que utiliza las ribosondas marcadas con P33 generadas por PCR. (Lu y Gillett, Cell Vision 1:169-176 (1994)). Los tejidos humanos fetales y adultos fijados en formaldehído y embebidos en parafina se seccionaron, desparafinaron, desproteinizaron en proteinasa K (20 mg/ml) durante 5 minutos a 37ºC y luego se procesaron para la hibridación in situ tal como describieron Lu y Gillett (1994). Se generó una ribosonda antisentido marcada con d-UTP a partir del producto de PCR y se hibridó a 55ºC durante toda la noche. Los portaobjetos se sumergieron en la emulsión nuclear NTB2 de Kodak y se expusieron durante 4 semanas.

Síntesis de las ribosondas-P^{33}

6,0 \mul (125 mCi) de UTP-P^{33} (Amersham BF 1002, SA<2000 Ci/mmol) se secaron al vacío. A cada tubo que contenía el UTP-P^{33} seco se añadieron los siguientes ingredientes:

: 2,0 \mul de tampón de transcripción 5X

: 1,0 \mul de DTT (100 mM)

: 2,0 \mul de mezcla de NTP (2,5 mM: 10p cada NTP 10 mM: GTP, CTP, ATP + 10 \mul H_{2}O)

: 1,0 \mul de UTP (50 \muM)

: 1,0 \mul de RNasin

: 1,0 \mul de molde de DNA (1 \mug)

: 1,0 \mul de H2O

: 1,0 \mul de RNA polimerasa (para productos de PCR T3=antisentido, T7=sentido)

Los tubos se incubaron a 37ºC durante 1 hora, y se añadió 1,0 de RQI DNasa, seguido de una incubación a 37ºC durante 15 minutos. A continuación, se añadieron 90 \mul de TE (Tris 10 mM a pH 7,6/EDTA 1 mM pH 8,0) y la mezcla se pipeteó en un papel DE81. La solución restante se cargó en un una unidad de ultrafiltración Microcon-50, se centrifugó con el programa 10 (6 minutos). La unidad de filtración se invirtió en un segundo tubo y se centrifugó en el programa 2 (3 minutos). Después de la recuperación final del centrifugado, se añadieron 100 \mul de TE. Se pipeteó 1 \mul del producto final en un papel DE81 y se realizó un contaje en 6 ml de Biofluor II.

La sonda se migró en un gel con TBE/urea. Se añadieron de 1-3 \mul o 5 \mul de MrkII de RNA a 3 \mul de tampón de carga. Después de calentar a 95ºC en termobloque durante 3 minutos, el gel se colocó inmediatamente en hielo. Los pocillos del gel se limpiaron, se aplicó la muestra y se migró a 180-250 voltios durante 45 minutos. El gel se envolvió en saran-wrap y se expuso a una película XAR con una pantalla intensificadora a -70ºC durante 1 toda una noche.

Hibridación con P^{33}

Pretratamiento de secciones congeladas. Los portaobjetos se extrajeron del congelador, se colocaron en bandejas de aluminio y descongelaron a temperatura ambiente durante 5 minutos. Las bandejas se colocaron en el incubador a 55ºC durante 5 minutos para reducir la condensación. Los portaobjetos se fijaron durante 10 minutos en paraformaldehído al 4% durante 10 minutos en hielo en la campana de extracción de gases y se lavaron con 0,5XSSC durante 5 min a temperatura ambiente (25 ml de 20XSSC + 975 ml de H_{2}O SQ). Después de la desproteinización en 0,5 \mug/ml de proteinasa K durante 10 minutos a 37ºC (12,5 \mul de 10 mg/ml en 250 ml de tampón sin RNasa precalentado), las secciones se lavaron en 0,5XSSC durante 10 minutos a temperatura ambiente. Las secciones se deshidrataron en series de etanol al 70%, 95% y 100%, durante 2 min cada una.

Pretratamiento de las secciones embebidas en parafinas. Los portaobjetos se desparafinaron, se colocaron en H_{2}O SQ y se lavaron dos veces en 2XSSC a temperatura ambiente, durante 5 minutos cada vez. Las secciones se desproteinizaron en 20 \mug/ml de proteinasa K (500 \mul de 10 mg/ml en 250 ml de tampón sin RNasa, 15 minutos) para los embriones humanos, o en 8Xproteinasa K (100 \mul en 250 ml de tampón sin RNasa, 37ºC, 30 minutos) para tejidos en formaldehído. Los lavados sucesivos en 0,5XSSC y la deshidratación se realizaron tal como se describió anteriormente.

Prehibridación. Los portaobjetos se dispusieron en una caja de plástico con papel de filtro saturado con tampón (4XSSC, formamida al 50%). El tejido se recubrió con 50 \mul de tampón de hibridación (3,75 g de sulfato de dextrano + 6 ml de H2O SQ), se mezcló con ayuda del vórtex y se calentó en un microondas durante 2 min con la tapa floja. Después de enfriar en hielo, se añadieron 18,75 ml de formamida, 3,75 ml de 20XSSC y 9 ml de H2O SQ, el tejido se mezcló con ayuda del vórtex, y se incubó a 42ºC durante 1-4 horas.

Hibridación. Se calentaron una sonda de 1,0x106 cpm y 1,0 \mul de tRNA (50 mg/ml de solución madre) por portaobjetos a 95ºC durante 3 minutos. Los portaobjetos se enfriaron en hielo, y se añadieron 48 \mul de tampón de hibridación por porta. Después de mezclar con ayuda del vórtex, se añadieron 50 \mul de la mezcla de P^{33} a 50 \mul de solución de prehibridación sobre el portaobjetos. Los portaobjetos se incubaron toda la noche a 55ºC.

Lavados. Se realizaron dos lavados de 10 minutos con 2XSSC, EDTA a temperatura ambiente (400 ml de 20XSSC + 16 ml EDTA 0,25 mM, Vf=4 l), seguido por un tratamiento con RNasa a 37ºC durante 30 min (500 \mul de 10 mg/ml en 250 ml de tampón sin RNasa = 20 \mug/ml). Los portaobjetos se lavaron dos veces 10 minutos con 2XSSC, EDTA a temperatura ambiente. La astringencia de los lavados fue la siguiente: 2 horas a 55ºC, 0,1XSSC, EDTa (20 ml 20XSSC + 16 ml EDTA, Vf=4 l).

Oligos

NL1: 46 mer GGA TTC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC CGG GTT CAC GGT GCC ATC T (SEC ID NO:25)

48 mer CTA TGA AAT TAA CCC TCA CTA AAG GGA TGC GGT TGT AGG TGG GTG GTT (SEC ID NO:26)

Los resultados de la hibridación in situ muestran que NL1 se expresa en el cartílago y los huesos largos en desarrollo y en los osteoblastos de diferenciación del periostio adyacente. La expresión también se observó en el tendón, en el tejido conectivo y en los sitios de formación de fluido sinovial, en el septo de tejido conectivo y en el periostio de la pared corporal del feto (Figuras 3A y 3B).

Ejemplo 3

Expresión de NL1 en E. coli

Este ejemplo muestra la preparación de una forma no glicosilada de ligandos de TIE de la presente invención en E. coli. La secuencia de DNA que codifica un ligando de NL1 (SEC ID NO: 1) se amplificó inicialmente con cebadores de PCR seleccionados. Los cebadores deberían contener dianas de restricción que correspondan con las dianas de restricción en el vector de expresión seleccionado. Es posible utilizar diversos vectores. El vector codificará preferentemente un gen de resistencia a antibióticos, un origen de replicación, un promotor y un sitio de unión a ribozima. Un ejemplo de vector adecuado es el pBR322 (derivado de E. coli, véase Bolivar y col., Gene 2:95 (1977)) que contiene genes para la resistencia a la ampicilina y tetraciclina. El vector se digiere con la enzima de restricción y se desfosforila. Las secuencias amplificadas por PCR se ligan a continuación en el vector.

La mezcla de reacción se utiliza para transformar una cepa de E. coli, mediante procedimientos descritos en Sambrook y col., supra. Los transformantes se identifican por su capacidad para crecer en placas de LB y se seleccionan las colonias resistentes a los antibióticos. A continuación puede aislarse el DNA plasmídico y confirmarse mediante análisis por restricción.

Los clones seleccionados pueden crecerse durante toda la noche en medio de cultivo como el LB suplementado con antibióticos. El cultivo de toda la noche puede a continuación utilizarse para inocular un cultivo a gran escala. Las células se crecen posteriormente a una densidad óptica deseada. También puede añadirse un inductor como el
IPTG.

Después de cultivar las células durante varias horas, éstas pueden recolectarse mediante centrifugación. El sedimento celular obtenido por centrifugación puede solubilizarse utilizando diversos agentes conocidos en la materia y la proteína solubilizada puede a continuación purificarse con una columna quelante de metales en condiciones que permitan la unión estrecha de la proteína.

Expresión de NL1 en células de mamífero

Este ejemplo ilustra la preparación de una forma glicosilada del homólogo del ligando de TIE NL1 mediante expresión recombinante en las células de mamífero.

El vector, pRK5 (véase la patente europea EP 307.247, publicada el 15 de Marzo de 1989), se utiliza como el vector de expresión. Opcionalmente, el DNA de NL1 se liga en el pRK5 en las dianas seleccionadas de enzimas de restricción para permitir la inserción del DNA de NL1 mediante procedimientos de ligación tal como se describe en Sambrook y col., supra. El vector resultante se denominó pRK5-NL1.

En una realización, las células huésped seleccionadas pueden ser las células 293. Las células humanas 293 (ATCC CCL 1573) se crecen a confluencia en placas de cultivo de tejidos en medio como el DMEM suplementado con suero de ternera fetal y opcionalmente componentes nutritivos y/o antibióticos. Aproximadamente, 10 \mug de DNA de pRK5-NL1 se mezclan con aproximadamente 1 \mug de DNA que codifica el gen del RNA VA [Thimmappaya y col., Cell, 31:543 (1982)] y se disuelven en 500 \mul de Tris-HCl 1 mM, EDTA 0,1 mM, Cl_{2}Ca 0,227 M. A esta mezcla se añaden, gota a gota, 500 \mul de HEPES (pH 7,35), NaCl 280 mM, NaPO_{4} 1,5 mM, y se permite formar un precipitado durante 10 minutos a 25ºC. El precipitado se resuspende y se añaden a las células 294 y se permite que sedimente durante aproximadamente cuatro horas a 37ºC. El medio de cultivo se aspira y se añaden 2 ml de glicerol al 20% en PBS durante 30 segundos. Las células 293 se lavan a continuación con medio sin suero, se añade medio fresco y se reincuban las células durante aproximadamente 5 días.

Aproximadamente, al cabo de 24 horas de las transfecciones, se retira el medio de cultivo y se reemplaza con medio sólo o con 200 \muCi/ml de cisterna-S^{35} y 200 \muCi/ml de metionina-S^{35}. Al cabo de 12 horas de incubación, se recoge el medio condicionado, se concentra en un filtro de centrifugación y se carga en un gel de SDS al 15%. El gel procesado puede secarse y exponerse a la película durante un período seleccionado de tiempo para revelar la presencia del polipéptido NL1. Los cultivos que contenían células transfectadas se pueden incubar posteriormente (en medio sin suero) y analizar el medio en bioensayos seleccionados.

En una técnica alternativa, el DNA de NL1 puede introducirse en las células 293 de forma transitoria con el procedimiento del sulfato de dextrano descrito por Somparyrac y col., Proc. Natl. Acad. Sci., 12:7575 (1981). Las células 293 se crecen a máxima densidad en un frasco de centrifugado y se añaden 700 \mug del DNA de pRK5-NL1, NLS, NL8 o NL4. En primer lugar, se concentran las células del frasco de centrifugado mediante centrifugación y se lavan con PBS. El precipitado de DNA-dextrano se incuba con el sedimento celular durante 4 horas. Las células se tratan con glicerol al 20% durante 90 segundos, se lavan con medio de cultivo de tejidos, y se re-introducen en el frasco de centrifugado que contiene el medio de cultivo de tejidos, 5 \mug/ml de insulina bovina y 0,1 \mug/ml de transferían bovina. Al cabo de 4 días, el medio condicionado se centrifuga y se filtra para eliminar las células y los restos celulares. La muestra que contiene el NL1 expresado puede a continuación concentrarse y purificarse mediante cualquier procedimiento seleccionado, como la diálisis y/o la cromatografía en columna.

En otra realización, NL1 puede expresarse en células CHO. El pRK5-NL1 puede transfectarse en células CHO con reactivos conocidos como el CaPO_{4} o el DEAE-dextrano. Tal como se describió anteriormente, los cultivos celulares pueden incubarse y el medio reemplazarse con medio de cultivo sólo o con radioisótopo como por ejemplo la metionina-^{35}. Después de determinar la presencia del polipéptido expresado, el medio de cultivo puede reemplazarse con medio sin suero. Preferentemente, los cultivos se incuban durante aproximadamente 6 días, y luego se recoge el medio condicionado. El medio que contiene NL1 expresado puede concentrarse y purificarse mediante cualquier procedimiento seleccionado.

El NL1 etiquetado epitópicamente también puede expresarse en células huésped CHO. El DNA de NL1 puede subclonarse fuera del vector pRK5. El inserto del subclon puede sufrir una PCR para fusionarse en la misma pauta de lectura con una etiqueta epitópica como una etiqueta poli-his en un vector de expresión de Baculovirus. El inserto de NL1 etiquetado con poli-his y a continuación puede subclonarse en un vector dirigido por SV40 que contenga un marcador de selección como el DHFR para la selección de clones estables. Por último, las células CHO pueden transfectarse (tal como se describió más arriba) con el vector dirigido por SV40. Puede realizarse un marcaje, tal como se indicó más arriba, para verificar la expresión. El medio de cultivo que contiene el NL1 etiquetado con poli-His expresado puede concentrarse y purificarse mediante cualquier procedimiento seleccionado como por ejemplo una cromatografía de afinidad con quelato de Ni^{2+}.

Las formas glicosiladas de NL1 se expresan también en células de mamífero. NL1 se expresó como una construcción IgG (NL1-IgG-inmunoadhesina), en la que la región extracelular de la proteína NL1 se fusionó a una secuencia de región constante de IgG que contiene la bisagra y los dominios CH2 y CH3.

Después de la amplificación por PCR, el DNA de NL1 se subclonó en un vector de expresión de CHO mediante técnicas estándares como las descritas por Ausubel y col., Current Protocols of Molecular Biology, Unit 3, 16, John Wiley and Sons (1997). Se construyeron vectores de expresión en CHO con dianas de restricción compatibles 5' y 3' con el DNA de interés para permitir el suclonaje de los cDNAs. El vector utilizado para la expresión en células CHO de NL1 es el descrito por Lucas y col., Nucl. Acids. Res. 24:9 (1774-1779) (1996) y las utilizaciones del promotor temprano/intensificador de SV40 para dirigir la expresión del cDNA de interés y la dihidrofolato reductasa (DHFR). La expresión de DHFR permite la selección para el mantenimiento estable del plásmido después de la transfección.

Se introdujeron 12 microgramos del DNA plasmídico que codifica NL1 en aproximadamente 10 millones de células CHO utilizando reactivos de transfección disponibles comercialmente Superfect® (Qiagen), Dosper® o Fugene® (Boerhinger Mannheim). Las células se crecieron tal como se describe en Lucas y col., supra. Aproximadamente 3x10^{7} células se congelaron en una ampolla para el posterior crecimiento y producción tal como se describió más arriba.

La ampolla que contenía el DNA plasmídico de NL1 se descongeló colocándola en un baño de agua y se mezcló con ayuda del vórtex. Los contenidos se pipetearon en un tubo de centrífuga que contenía 10 ml de medio y se centrifugaron a 1000 rpm durante 5 minutos. El sobrenadante se aspiró y las células se resuspendieron en 10 ml de medio selectivo (PS20 filtrado con 0,2 \mum y suero bovino fetal filtrado dos veces). Las células se alicuotaron en frascos de centrifugado de 100 ml con 90 ml de medio selectivo. Al cabo de 1-2 días, las células se transfirieron a frascos de 250 ml y se rellenaron con 150 ml de medio de crecimiento selectivo y se incubaron a 37ºC. Al cabo de 2-3 días, los frascos de 250, 500 y 2000 ml se sembraron con 3x10^{5} células/ml. El medio se renovó mediante centrifugación y resuspensión en medio de producción. Se puede utilizar cualquier medio adecuado para CHo, por ejemplo, el descrito en la patente americana U.S. 5.122.469, publicada el 16 de Junio de 1992. Un frasco de 3 l se sembró a una densidad de 1,2x10^{6} células/ml. Se determinó el número de células y el pH en el día 0. El día 1, se tomó una muestra del cultivo y se inició la administración de aire filtrado. El día 2, se tomó una muestra del cultivo y se aumentó la temperatura a 33ºC, se añadieron 30 ml de glucosa 500 g/l y 0,6 ml de anti-espumante al 10% (por ejemplo, emulsión de polidimetilsiloxano al 35%, Dow Comino 365 Medical Grade Emulsion). Durante la producción, se ajustó el pH si fue necesario para mantenerlo alrededor de 7,2. Al cabo de 10 días, o hasta que la viabilidad descendiera por debajo del 70%, se cosechó el cultivo por centrifugación y se filtró con una membrana de 0,22 \mum. El filtrado se guardó a 4ºC hasta su carga en una columna de purificación.

La NL1-IgG inmuoadhesina se purificó a partir del medio condicionado de la manera siguiente. El medio condicionadose bombeó en una columna de Proteína A de 5 ml (Pharmacia) que había sido equilibrada en tampón fosfato N 20 mM, pH 6,8. Después de la carga, se lavó la columna extensamente con tampón de equilibrio antes de la elusión con ácido cítrico 100 mM, pH 3,5. La proteína eluida se neutralizó inmediatamente recogiendo fracciones de 1 ml en tubos que contenían 275 \mul de tampón Tris 1 M, pH 9. La proteína altamente purificada se desaló a continuación en tampón de almacenamiento con Hepes 10 mM, NaCl 0,14 M y manitol al 4%, pH 6,8, con una columna de 25 ml de G25 Superfine (Pharmacia) y se guardó a -80ºC.

La homogeneidad de la proteína NL1-IgG purificada se verificó en una electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PEG) y se realizó una secuenciación aminoacídica N-terminal mediante degradación de Edman. La proteína presentó un peso molecular de aproximadamente 37-38 KD.

Ejemplo 4

Expresión de NL1 en levaduras

En primer lugar, se construyeron los vectores de expresión en levaduras para la producción o la secreción de NL1 a partir de ADAH2/promotor GAPDH. El DNA que codifica NL 1, la secuencia de un péptido señal y el promotor se insertan en las dianas de restricción adecuadas en el plásmido seleccionado para dirigir la expresión intracelular de NL1. Para la secreción, el DNA que codifica NL1 puede clonarse en el plásmido seleccionado, junto con el DNA que codifica ADH2/promotor GAPDH, la señal de secreción del factor alfa de levaduras/secuencia líder y secuencias engarce (si es necesario) para la expresión de NL1.

Las células de levadura como la cepa de levadura AB110, pueden transformarse con los plásmidos de expresión descritos más arriba en el medio de fermentación seleccionado. Los sobrenadantes de levadura transformadas pueden analizarse mediante precipitación con ácido tricloroacético al 10% y separación mediante SDS-PAGE, seguido de tinción de los geles con azul de Coomassie.

NL1 recombinantes pueden a continuación aislarse y purificarse eliminando las células de levaduras del medio de fermentación mediante centrifugación y luego concentración del medio utilizando filtros de cartucho seleccionados. El concentrado que contiene NL1 puede además purificarse utilizando resinas de cromatografía en columna.

Ejemplo 5

Expresión de NL1 en el sistema de expresión de Baculovirus

El siguiente procedimiento describe la expresión recombinante de NL1 en un sistema de expresión de Baculovirus.

El NL1 se fusionó cadena arriba de una etiqueta epitópica contenida en un vector de expresión de baculovirus. Dichas etiquetas epitópicas incluyen el poli-his e inmunoglobulinas (como las regiones Fc de la IgG). Se pueden utilizar diversos plásmidos incluyendo los plásmidos derivados de plásmidos disponibles comercialmente como el pVL1393 (Novagen). En resumen, el DNA que codifica NL1 o la porción deseada de NL1 (como la secuencia que codifica el dominio extracelular de una proteína transmembrana) se amplificó por PCR con cebadores complementarios con las regiones de los extremos 5' y 3'. El cebador 5' puede incorporar dianas de enzimas de restricción flanqueantes (seleccionadas). El producto se digiere a continuación con dichas enzimas de restricción y se subclona en el vector de expresión.

Los baculovirus recombinantes generados por co-transfección el plásmido anterior y el DNA del virus BaculoGold™ (Phamingen) en células de Spodoptera frugiperda ("Sf9") (ATCC CRL 1711) utilizado lipofectina (disponible comercialmente de GIBCO-BRL). Al cabo de 4-5 días de incubación a 28ºC, los virus liberados se cosechan y utilizan para posteriores amplificaciones. La infección viral y la expresión de proteínas se realiza tal como se describe por O'Reilly y col., Baculovirus expresión vectors: A laboratory manual, Oxford University Press (1994).

El NL1 etiquetado con poli-his puede purificarse, por ejemplo, mediante cromatografía de afinidad de quelato de Ni2+ de la manera siguiente. Se preparan extractos de células Sf9 infectadas con virus recombinantes tal como se describe por Rupert y col., Nature, 362:175-179 (1993). En resumen, las células Sf9 se lavan, se resuspenden en tampón de sonicación (25 ml de Hepes, pH 7,9; Cl2 Mg 12,5 mM, EDTA 0,1 mM, glicerol al 10%, NP40 al 0,1%; KCl 0,4 M) y se sonican dos veces durante 20 segundos en hielo. Los sonicados se aclaran por centrifugación y el sobrenadante se diluye 50 veces en tampón de carga (fosfato 50 mM, NaCl 300 mM, glicerol al 10%, pH 7,8) y se filtran a través de una membrana de 0,45 \mum. Se prepara una columna de Ni2+-NTA azarosa (disponible comercialmente de Qiagen) con un volumen de lecho de 5 ml, se lava con 25 ml de agua y se equilibra con 25 ml de tampón de carga. El extracto celular filtrado se carga en la columna a 0,5 ml por columna. La columna se lava hasta una absorbancia basal A_{280} con tampón de carga, y en dicho punto se inicia la recolección de las fracciones. A continuación, la columna se lava con un segundo tampón de lavado (fosfato 50 mM, NaCl 300 mM, glicerol al 10%, pH 6,0), que eluye una proteína unida inespecíficamente. Después de alcanzar el nivel basal A_{280}, la columna se revela con un gradiente de imidazol de 0 a 500 mM en el segundo tampón de lavado. Se recogen fracciones de 1 ml y se analizan en SDS-PAGE y tinción de plata o transferencia de western con Ni^{2+}-NTA-conjugado con la fosfatasa alcalina (Qiagen). Las fracciones que contienen el eluído de NL1 etiquetado con His_{10} se agrupan y se dializan contra un tampón de carga.

Alternativamente, la purificación de la IgG etiquetada (o la Fc etiquetada) puede realizarse utilizando técnicas de cromatografía conocidas, por ejemplo, la cromatografía de columna con Proteína A o proteína G.

El NL1 se expresó en células Sf9 infectadas con baculovirus. Mientras que la expresión se realizó en una escala de 0,5-2 l, puede escalarse a mayores volúmenes (por ejemplo, 8 l). El NL1 se expresó como una construcción IgG (NL1-IgG inmuoadhesina), en la que la región extracelular de la proteína NL1 se fusionó con una secuencia de región constante de IgG1 que contenía la bisagra, y los dominios CH1 y CH2.

Después de la amplificación por PCR de las secuencias codificantes respectivas se subclonaron en un vector de expresión en baculovirus (pb.PH.IgG para fusiones con IgG y pb.PH.His.c para proteínas etiquetadas con poli-His), y el vector y el DNA del baculovirus Baculogold® (Phamingen) se co-transfectaron en 10^{5} células de Spodoptera frugiperda ("Sf9") (ATCC CRL 171), con lipofectina (GibcoBRL). pb.PH.IgG y pb.PH.His son las modificaciones del vector de expresión en baculovirus disponible comercialmente pVL1393 (Phamingen), con regiones de poliengarce modificadas para incluir las secuencias de etiquetas His o Fc. Las células se crecieron en medio Hink's TNM-FH suplementado con FBS al 10% (Hyclone). Las células se incubaron durante 5 días a 28ºC. El sobrenadante se recogió y se utilizó para la primera amplificación viral mediante infección de células Sf9 en medio Hink's TNM FH suplementado con FBS al 10% a una multiplicidad de infección (MOI) de aproximadamente 10. Las células se incubaron durante 3 días a 28ºC. El sobrenadante se recogió y se determinó la expresión de las construcciones de NL1 en el vector de expresión de baculovirus mediante unión de lotes de 1 ml de sobrenadante a 25 ml de bolas de Ni-NTA (Qiagen) para proteínas etiquetadas con histidina o bolas CL-4B con Proteína-A-Sepharose (Pharmacia) para proteínas etiquetadas con IgG, seguido de un análisis por SDS-PAGE, comparando con una concentración conocida de proteína estándar mediante tinción con azul de Coomassie.

El primer sobrenadante de la amplificación viral se utilizó para infectar un cultivo en frasco de centrifugado (500 ml) de células Sf9 crecidas en medio ESF-921 (Sistemas de expresión LLC) a una MOI de aproximadamente 0,1. Las células se incubaron durante 3 días a 28ºC, los sobrenadantes se recogieron y se filtraron. Se repitieron los análisis de unión de lotes y geles de SDS-PAGE, según fue necesario, hasta confirmar la expresión del cultivo.

El medio condicionado de las células transfectadas (0,5 a 3 L) se recogió mediante centrifugación para eliminar las células y filtrarlas a través de filtros de 0,22 \mum. Las construcciones etiquetadas con poli-His se purificaron con una columna NI-NTA (Qiagen). Antes de la purificación, se añadió imidazol al medio condicionado a una concentración de 5 mM. El medio condicionado se bombeó en una columna Ni-NTA de 6 ml equilibrada con Hepes 20 mM, pH 7,4, tampón que contenía NaCl 0,3 M e imidazol 5 mM a una velocidad de flujo de 4-5 ml/min, a 4ºC. Después de la carga, la columna se lavó con tampón de equilibrado adicional y la proteína se eluyó con el tampón de equilibrado con imidazol 0,25 M. La proteína altamente purificada se desaló a continuación en un tampón de almacenamiento que contenía Hepes 10 mM, NaCl 0,14 M y manitol 4%, pH 6,8 con una columna Superfine G25 (Pharmacia) de 25 ml y se guardó a -80ºC.

Las construcciones de inmunoadhesina (que contenían Fc) de proteínas se purificaron a partir del medio condicionado de la manera siguiente. El medio condicionado se bombeó en una columna de Proteína A de 5 ml (Pharmacia9 que se había equilibrado con tampón fosfato Na 20 mM, pH 6,8. Después de la carga, la columna se lavó extensamente con tampón de equilibrado antes de eluirse con ácido cítrico 100 mM, pH 3,5. La proteína eluida se neutralizó inmediatamente recogiendo fracciones de 1 ml en tubos que contenían 275 ml de Tris 1 M, pH 9. La proteína altamente eluida se desaló a continuación en tampón de almacenamiento tal como se describió para las proteínas etiquetadas con poli-His. La homogeneidad de la proteína NL1 se verificó mediante electroforesis con SDS y poliacriamida (PEG) y secuenciación aminoacídica N-terminal mediante degradación de Edman.

Ejemplo 6

Preparación de anticuerpos que se unen a NL1

Este ejemplo ilustra la preparación de anticuerpos monoclonales que pueden unirse específicamente a NL1.

Las técnicas para la producción de anticuerpos monoclonales son conocidas en la materia y se describen, por ejemplo, en Goding, supra. Los inmunógenos que pueden utilizarse incluyen los ligandos purificados de la presente invención, las proteínas de fusión que contienen dichos ligandos, y las células que expresan los ligandos recombinantes en la superficie celular. La selección del inmunógeno puede realizarse por el experto en la materia sin excesiva experimentación.

Los ratones, como Balb/c, se inmunizan con el inmunógeno emulsionado en adyuvante completo de Freund e inyectado subcutánea o intraperitonealmente en una cantidad de 1-100 microgramos. Alternativamente, el inmunógeno se emulsiona en adyuvante MPL-TDM (Ribi Immunochemical Research, Hamilton, MT) y se inyectan en las almohadillas de las patas traseras. Los ratones inmunizados se reestimulan a los 10-12 días con inmunógeno emulsionado adicional en adyuvante seleccionado. Durante varias semanas, los ratones pueden ser reestimulados con inyecciones de inmunización adicionales. Las muestras de suero pueden obtenerse periódicamente de los ratones mediante sangrado retro-orbital para ensayos ELISA con el fin de detectar los anticuerpos.

Después de haber detectado un título de anticuerpo adecuado, los animales "positivos" para los anticuerpos pueden inyectarse con una inyección intravenosa final del ligando proporcionado. Al cabo de 3-4 días, se sacrifican los ratones y extraen las células del bazo. Estas células se fusionan (con polietilén glicol al 35%) con una línea de mieloma murino seleccionada, como por ejemplo P3X63AgU.1, disponible por ATCC CRL 1597. Las fusiones generan células de hibridomas que pueden plaquearse en placas de cultivo de tejidos de 96 pocillos que contienen medio HAT (hipoxantina, aminopterina y timidita) para inhibir la proliferación de las células no fusionadas, híbridos de mieloma e híbridos de células del bazo.

Las células de hibridomas se cribarán en un ELISA para su reactividad contra el antígeno. La determinación de células de hibridoma "positivas" que secretan los anticuerpos monoclonales de interés contra los homólogos del ligando de TIE se hallan dentro del ámbito de la presente invención.

Las células de hibridoma positivas pueden inyectarse intraperitonealmente en ratones Balb/c singénicos para producir ascitas que contengan los anticuerpos monoclonales anti-homólogo del ligando de TIE. Alternativamente, las células de hibridoma pueden crecerse en frascos de cultivo de tejidos o botellas para agitación. La purificación de los anticuerpos monoclonales en las ascitas puede lograrse mediante precipitación con sulfato de amonio, seguido por cromatografía de exclusión en gel. Alternativamente, puede utilizarse la cromatografía de afinidad basada en la unión del anticuerpo a la proteína A o la proteína G.

Ejemplo 7

Angiogénesis tumoral

Este ensayo se basa en los hallazgos experimentales de que células de ovario de hámster chino (CHO) transfectadas para expresar VEGF adquieren la capacidad para formar tumores en ratones nude aún cuando VEGF no tenga un efecto directo sobre el crecimiento de las células CHO (Ferrara y col., J. Clin. Invest. 91:160 [1993]). Las células normales CHO tienen una capacidad proliferativa adecuada pero su capacidad para formar tumores está limitada por su incapacidad para inducir la angiogénesis. Este ensayo intenta determinar si otras moléculas pueden tener una función similar al VEGF para convertir las células CHO en tumorigénicas. Los inhibidores de dichas moléculas podrían ser de utilidad en la terapia del cáncer, al igual que en ausencia de aporte vascular, la difusión de nutrientes se sabe que limita el tamaño del nódulo tumoral a aproximadamente 1 mm de diámetro.

Las células CHO se transfectaron establemente con un vector que contenía los genes que codifican NL1, las células CHO transfectadas con el mismo vector que contenían la secuencia codificante de VEGF o con un vector vacío sirvieron como controles positivos o negativos. Las células se inyectaron subcutáneamente en el flanco de ratones nude hembras (1 millón de células/ratón, 5 ratones por transfectante). El sitio de inyección se analizó semanalmente para la aparición de un nódulo tumoral. La evaluación histológica se realizó en cualquier nódulo que se desarrolló.

Se observaron nódulos tumorales en ratones que portaban el NL1 que expresaron las células CHO, indicando que NL1, al igual que el VEGF, es capaz de convertir las células CHO en tumorigénicas.

Ejemplo 8

Estimulación de la formación de tubos endoteliales

Este ensayo sigue el ensayo descrito por Davis y Camarillo, Experimental Cell Research, 224:39-51 81996), o uno modificado de la manera siguiente:

Protocolo: células HUVEC (número de pasaje inferior a 8 a partir del cultivo primario) se mezclan con colágeno de cola de rata de tipo I, a una concentración final de 2,6 mg/ml a una densidad de 6x10^{5} células/ml y se plaquearon a 50 \mul por pocillo en una placa de 96 pocillos. Se dejó solidificar el gel durante 1 h a 37ºC, luego se añadió 50 \mul por pocillo de medio de cultivo M199 suplementado con FBS al 1% y una muestra de polipéptido NL1 (a diluciones del 1%, 0,1%, y 0,01%, respectivamente) junto con 6-FAM-FITC 1 \muM para teñir las vacuolas cuando se formen. Las células se incubaron a 37ºC en atmósfera de CO2 al 5%, durante 48 hora, se fijaron con paraformaldehído al 3,7% a temperatura ambiente durante 10 minutos, se lavaron con PBS 5 veces y luego se tiñeron con Rh-Phalloidin a 4ºC durante toda la noche seguido por tinción nuclear con DAPI 4 \muM.

1. Ensayo de apoptosis

Este ensayo identificará los factores que facilitan la supervivencia en un matriz tridimensional en presencia de factores de crecimiento exógenos (VEGF, bGFG sin PMA).

Un resultado positivo es igual o inferior a 1. 0 = no apoptosis, 1 = menos del 20% de células son apoptóticas, 2 = menos del 50% de células son apoptóticas, 3 = más del 50% de células son apoptóticas. Los estimuladores de la apoptosis en este sistema se espera que sean factores apoptóticos y los inhibidores se espera que prevengan o disminuyan la apoptosis.

2. Ensayo de vacuolas

Este ensayo identificará los factores que estimulan la formación de vacuolas endoteliales y la formación del lumen en presencia de bFGF y VEGF (40 ng/ml).

Un resultado positivo es igual o superior a 2. 1 = vacuolas presentes en menos del 20% de células, 2 = vacuolas presentes en el 20-50% de células, 3 = vacuolas presentes en más del 50% de células. Este ensayo se diseña para identificar factores que están implicados en estimular la pinocitosis, el bombeo iónico, la permeabilidad y la formación de conexiones celulares.

3. Ensayo de formación de tubos

Este ensayo es para identificar factores que estimulan la formación de tubos endoteliales en una matriz tridimensional. Este ensayo identificará factores que estimulen las células endoteliales a diferenciarse en una estructura de tipo tubular en una matriz tridimensional en presencia de factores de crecimiento exógenos (VEGF, bFGF).

Un resultado positivo es igual o superior a 2. 1 = células redondas, 2 = células alargadas, 3 = células que forman tubos con algunas conexiones, 4 = células que forman redes tubulares complejas. Este ensayo identifica los factores que pueden estar implicados en estimular movilidad, la quimiotaxis o el cambio de forma de las células endoteliales.

La Figura 5 muestra el efecto sobre la formación de tubos por células HUVEC del polipéptido NL1 conjugado con poli-his a una dilución del 1% y de un tampón control (HEPES 10 mM/NaCl 0,14 M/manitol 4%, pH 6,8) a una dilución del 1%. Los resultados comparativos con otro homólogo del ligando de TIE (NL6) y dos ligandos de TIE conocidos, TIE-1 y TIE-2, analizados como fusiones IgG, también se muestran en la figura.

Depósito del material

Tal como se indicó más arriba, los materiales siguientes han sido depositados en el American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, USA (ATCC):

Material	Dep. ATCC	Fecha del depósito
NL1-DNA 22779-1130	209280	18 de Septiembre de 1997
NL5-DNA 28497-1130	209279	18 de Septiembre de 1997
NL8-DNA 23339-1130	209282	18 de Septiembre de 1997
NL4-DNA 47470-1130P1	209422	28 de Octubre de 1997

Estos depósitos se realizaron de acuerdo con las disposiciones del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos con el Propósito de Procedimiento de Patentes y sus Regulaciones (Tratado de Budadpest). Ello asegura el mantenimiento de un cultivo viable del depósito durante 30 años desde la fecha del depósito. Los depósitos estarán disponibles por el ATCC bajo los términos del tratado de Budapest y sometidos a un acuerdo entre Genentech, Inc. Y ATCC, que asegure la disponibilidad permanente y no restringida de la progenie del cultivo del depósito para el público tras la emisión de la patente americana pertinente o tras que sea accesible al público cualquier patente americana o extranjera, que la preceda, y asegure la disponibilidad de la progenie al responsable determinado por el Comisionado de Patentes y Marcas U.S. de acuerdo con el 35\NAK122 y las normas de dicho Comisionado de Patentes y Marcas (incluyendo 37 CFR\NAK1,14 con la referencia especial a 886 OG 638).

El beneficiario de la presente solicitud está de acuerdo que si el cultivo de los materiales en depósito perece, se pierde o se destruye cuando se cultiva en las condiciones adecuadas, los materiales se reemplazarán en la mayor prontitud posible con otro similar. La disponibilidad del material depositado no debe considerarse como una licencia para practicar la invención en contravención de los derechos garantizados bajo la autoridad de cualquier gobierno de acuerdo con sus leyes de patentes.

La especificación escrita en la presente invención se considera suficiente para que un experto en la materia ponga en práctica la invención. La presente invención no limita su ámbito por la construcción depositada, ya que la realización depositada se considera una ilustración de ciertos aspectos de la invención y cualquier construcción que sea equivalente funcionalmente se halla dentro del ámbito de la presente invención. El depósito de materiales no constituye una admisión de que la descripción aquí descrita sea inadecuada para permitir la práctica de cualquier aspecto de la invención, incluyendo el mejor modo de realización, tampoco debe considerarse como limitante del ámbito de las reivindicaciones con las ilustraciones específicas que aquí se representan.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): SOLICITANTE: Genentech, Inc.

\hskip3.9cm

Godowski, Paul

\hskip3.9cm

Gurney, Austin L.

\hskip3.9cm

Hillan, Kenneth

\hskip3.9cm

Botstein, David

\hskip3.9cm

Goddard, Audrey

\hskip3.9cm

Roy, Margaret

\hskip3.9cm

Ferrara, Napoleone

\hskip3.9cm

Tumas, Daniel

\hskip3.9cm

Schwall, Ralph

\vskip0.800000\baselineskip

(i): TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Homólogos del ligando de TIE

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): NÚMERO DE SECUENCIAS: 35

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): DIRECCIÓN POSTAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DIRECCIÓN: Genentech, Inc.

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CALLE, 1 DNA Way

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CIUDAD: South San Francisco

\vskip0.500000\baselineskip

(D): ESTADO: California

\vskip0.500000\baselineskip

(E): PAÍS: USA

\vskip0.500000\baselineskip

(F): CÓDIGO POSTAL: 94080

\vskip0.800000\baselineskip

(v): FORMATO LEGIBLE PARA ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): TIPO MEDIO: 3,5 pulgadas, 1,44 Mb disco blando

\vskip0.500000\baselineskip

(B): ORDENADOR: IBM PC compatible

\vskip0.500000\baselineskip

(C): SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D): PROGRAMA: WinPatin (Genentech)

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FECHA DE LA SOLICITUD ACTUAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NÚMERO DE SOLICITUD:

\vskip0.500000\baselineskip

(B): FECHA DE SOLICITUD:

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASIFICACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FECHA DE SOLICITUD ANTERIOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NÚMERO DE SOLICITUD: 08/933821

\vskip0.500000\baselineskip

(B): FECHA DE SOLICITUD: 19 de Septiembre de 1997

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FECHA DE SOLICITUD ANTERIOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE SOLICITUD: 08/960507

\vskip0.500000\baselineskip

(D): FECHA DE SOLICITUD: 29 de Octubre de 1997

\vskip0.800000\baselineskip

(viii): INFORMACIÓN DEL ABOGADO/AGENTE DE PATENTES:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE: Dreger, ginger R.

\vskip0.500000\baselineskip

(B): NÚMERO DE REGISTRO: 33.055

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE REFERENCIA/ARCHIVO: P1130P2PCT

\vskip0.800000\baselineskip

(IX): INFORMACIÓN SOBRE TELECOMUNICACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): TELÉFONO: 650/225-3216

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TELEFAX: 650/952-9881

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 1

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 2290 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: Sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:1

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 2

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 493 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: Aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:2

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 3

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 3355 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: Sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:3

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 4

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 491 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: Aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:4

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 5

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1780 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: Sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:5

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 6

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 470 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: Aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:6

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 7

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 33 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: Sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCTGACGAAC CAAGGCAACT ACAAACTCCT GGT

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 8

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 41 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: Sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGCGGCCGGA CCAGTCCTCC ATGGTCACCA GGAGTTTGTA G

\hfill

41

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 9

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 33 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: Sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGTGGTGAAC TGCTTGCCGT TGTGCCATGT AAA

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 10

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 29 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: Sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CAGGTTATCC CAGAGATTTA ATGCCACCA

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 11

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 34 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: Sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: Lineal

\newpage

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTGGTGGGAG AAGTTGCCAG ATCAGGTGGT GGCA

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 12

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 25 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: Sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTCACACCAT AACTGCATTG GTCCA

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 13

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 34 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: Sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ACGTAGTTCC AGTATGGTGT GAGCAGCAGCAAC TGGA

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 14

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 26 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: Sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGTCCAGCCT CCACCCTCCA GTTGCT

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 15

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 25 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: Sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCCCAGTCCT CCAGGAGAAC CAGCA

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 16

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 2042 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: Sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:16

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 17

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 460 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: Aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:17

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 18

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 2212 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: Sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:18

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 19

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 346 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: Aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:19

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 20

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 286 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: Aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 21

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 214 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: Aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 22

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 31 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: Sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTCAGCACCA AGGACAAGGA CAATGCAAC T

\hfill

31

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 23

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 32 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: Sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGTGCACACT TGTCCAAGCA GTTGTCATTG TC

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 24

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 23 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: Sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTAGTACACT CCATTGAGGT TGG

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 25

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 46 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: Sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGATTCTAAT ACGACTCACT ATAGGGCCGG GTTCACGGTG CCATCT

\hfill

46

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 26

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 48 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: Sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTATGAAATT AACCCTCACT AAAGGGATGC GGTTGTAGGT GGGTGGTT

\hfill

48

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 27

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 47 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: Sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGATTCTAAT ACGACTCACT ATAGGGCCAA CACCAAGGGG CAAGATG

\hfill

47

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 28

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 48 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: Sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTATGAAATT AACCCTCACT AAAGGGAGGG CTTTTGGTGG GAGAAGTT

\hfill

48

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 29

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 48 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: Sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.500000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGATTCTAAT ACGACTCACT ATAGGGCGCT CCGCAAAGGT GGCTACTG

\hfill

48

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 30

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 47 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: Sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTATGAAATT AACCCTCACT AAAGGGATTT CCTCCCCGCA AGTCCAG

\hfill

47

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 31

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 48 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: Sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: Lineal

\newpage

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGATTCTAAT ACGACTCACT ATAGGGCGGC CGCCACGAGG AGCTGTTA

\hfill

48

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 32

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 46 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: Sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTATGAAATT AACCCTCACT AAAGGGAGGG GCTCTGGGGC TGGGTC

\hfill

48

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 33

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: Sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTCAGCAGA GCCCAAGTTG

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 34

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: Sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ACGGTTACAC AGGGTGTCTT

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 35

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 25 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: Sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCTGGCCACA CCTTCTTTGT GGCTC

\hfill

25

Claims

1. Molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia nucleotídica que codifica un polipéptido que tiene al menos el 90% de identidad de secuencia con la secuencia aminoacídica SEC ID NO:2 del polipéptido NL1 humano nativo.

2. Molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1, en donde el polipéptido tiene al menos un 95% de identidad de secuencia con la SEC ID NO:2.

3. Molécula de ácido nucleico según la reivindicación 2, en donde el polipéptido tiene al menos un 98% de identidad de secuencia con la SEC ID NO:2.

4. Molécula de ácido nucleico según la reivindicación 3, en donde el polipéptido tiene al menos un 99% de identidad de secuencia con la SEC ID NO:2.

5. Molécula de ácido nucleico según la reivindicación 4, en donde el polipéptido comprende la secuencia SEC ID NO:2.

6. Molécula de ácido nucleico aislado según la reivindicación 5, que comprende la región codificante de la SEC ID NO:1.

7. Molécula de ácido nucleico aislado de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 5, que comprende el domino de tipo fibrinógeno que codifica la secuencia SEC ID NO:1.

8. Vector que comprende una molécula de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

9. Célula huésped recombinante transformada con una molécula de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.

10. Célula huésped recombinante según la reivindicación 9, la cual es una célula procariota.

11. Célula huésped recombinante según la reivindicación 9, la cual es una célula eucariota.

12. Polipéptido aislado que comprende una secuencia aminoacídica que tiene al menos un 90% de identidad de secuencia con la secuencia aminoacídica SEC ID NO:2 del polipéptido NL1 humano nativo.

13. Polipéptido según la reivindicación 12, en donde la secuencia aminoacídica tiene al menos un 95% de identidad de secuencia con la secuencia aminoacídica SEC ID NO:2.

14. Polipéptido según la reivindicación 13, en donde la secuencia aminoacídica tiene al menos un 98% de identidad de secuencia con la secuencia aminoacídica SEC ID NO:2.

15. Polipéptido según la reivindicación 14, en donde la secuencia aminoacídica tiene al menos un 99% de identidad de secuencia con la secuencia aminoacídica SEC ID NO:2.

16. Polipéptido según la reivindicación 15, que comprende la secuencia aminoacídica de la SEC ID NO:2.

17. Anticuerpo que se une específicamente con la secuencia NL1 del polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 12 a 16.

18. Anticuerpo según la reivindicación 17, el cual es un anticuerpo monoclonal.

19. Anticuerpo según la reivindicación 18, el cual contiene residuos de la región de determinación de la complementariedad (CDR) no humanos y residuos de la región de entramado (FR) humanos.

20. Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19 que está marcado.

21. Composición que comprende un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 16 en asociación con un vehículo.

22. Composición que comprende un anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 17 a 20 en asociación con un vehículo.

23. Composición según la reivindicación 22 que comprende una cantidad inhibidora del crecimiento de dicho anticuerpo.

\newpage

24. Composición según la reivindicación 22 o la reivindicación 23 que además comprende un segundo anticuerpo o un agente citotóxico o quimioterapéutico.

25. Conjugado que comprende un polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 12 a 16 o un anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 17 a 20, fusionado con un agente terapéutico o citotóxico.

26. Conjugado según la reivindicación 25, en donde el agente terapéutico es una toxina, un ligando de TIE distinto, o un miembro de la familia del factor l de crecimiento endotelial vascular (VEGF).

27. Procedimiento in vitro para identificar una célula que exprese un receptor TIE, en donde dicho procedimiento comprende (a) el contacto de la célula con un polipéptido del ligando de TIE que está marcado de forma detectable y tiene al menos un 90% de identidad de secuencia con la secuencia aminoacídica SEC ID NO:2 del polipéptido NL1 humano nativo en condiciones que permitan la unión de dicho polipéptido del ligando de TIE con el mencionado receptor, y (b) el control de dicha unión.

28. Procedimiento según la reivindicación 27, en donde el polipéptido tiene al menos un 95% de identidad de secuencia con la SEC ID NO:2.

29. Procedimiento según la reivindicación 28, en donde el polipéptido tiene al menos un 98% de identidad de secuencia con la SEC ID NO:2.

30. Procedimiento según la reivindicación 29, en donde el polipéptido tiene al menos un 99% de identidad de secuencia con la SEC ID NO:2.

31. Procedimiento según la reivindicación 30, en donde el polipéptido comprende la secuencia aminoacídica de la SEC ID NO:2.

32. Utilización de un polipéptido del ligando de TIE marcado de forma detectable según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 16 en la fabricación de una composición para el análisis por la imagen de la presencia de angiogénesis en un paciente.

33. Procedimiento in vitro para determinar la presencia de un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 16 que comprende (a) la exposición de una célula sospechosa de contener dicho polipéptido con un anticuerpo contra dicho polipéptido y (b) la determinación de la unión de dicho anticuerpo con la mencionada célula.