KR100692336B1 - Ｔｉｅ 리간드 상동체 - Google Patents

Abstract

본 발명은 TIE 리간드 NL1, NL5, NL8 및 NL4를 코딩하는 단리된 핵산 분자, 상기의 핵산 분자에 의해 코딩되는 단백질, 또한 상기한 핵산 및 단백질 분자를 제조하고 이용하기 위한 방법과 수단에 관한 것이다.

TIE 리간드, NL1, NL5, NL8, NL4, TIE 리간드의 핵산 분자, TIE 리간드 단백질, TIE 리간드 항체

Description

ＴＩＥ 리간드 상동체{TIE Ligand Homologues}

도 1a 및 1b는 FLS139(SEQ.ID.NO:16)의 뉴클레오티드 서열이다.

도 1c 및 1d는 FLS139(SEQ.ID.NO:17)의 아미노산 서열이다.

도 2는 TIE 리간드 NL1의 뉴클레오티드 서열(SEQ.ID.NO:1)(DNA 22779)이다.

도 3은 TIE 리간드 NL1의 아미노산 서열(SEQ.ID.NO:2)이다.

도 4는 TIE 리간드 NL5의 뉴클레오티드 서열(SEQ.ID.NO:3)(DNA 28497)이다.

도 5는 TIE 리간드 NL5의 아미노산 서열(SEQ.ID.NO:4)이다.

도 6은 TIE 리간드 NL8의 뉴클레오티드 서열(SEQ.ID.NO:5)(DNA 23339)이다.

도 7은 TIE 리간드 NL8의 아미노산 서열(SEQ.ID.NO:6)이다.

도 8a 및 도 8b는 세포 RNA에 대한 계내(in situ) 혼성화에 의해 결정된 여러 조직에서 NL1의 발현을 보여준다.

도 9a 및 도 9b는 세포 RNA에 대한 계내 혼성화에 의해 결정된 여러 조직에서 NL5의 발현을 보여준다.

도 10a 및 도 10b는 세포 RNA에 대한 계내 혼성화에 의해 결정된 여러 조직에서 NL8의 발현을 보여준다.

도 11 및 12는 여러 조직에서 TIE 리간드 NL1 및 NL5의 mRNA의 발현을 보여 주는 노던 블롯이다.

도 13은 TIE 리간드 NL4의 뉴클레오티드 서열(SEQ.ID.NO:18)이다.

도 14는 TIE 리간드 NL4의 아미노산 서열(SEQ.ID.NO:19)이다.

도 15는 TIE 리간드 NL4의 아미노산 서열과 pBluescript KS 클론으로부터 유도된 인간 TIE-2 리간드 2의 아미노산 서열과의 배열(SEQ.ID.NO:20)이다.

도 16는 TIE 리간드 NL4의 아미노산 서열과 람다-gt10 클론으로부터 유도된 인간 TIE-2 리간드 1의 아미노산 서열과의 배열(SEQ.ID.NO:21)이다.

도 17은 1% 희석된 폴리-his에 결합된 NL1 폴리펩티드 및 1% 희석된 완충액(10 mM HEPES/0.14 M NaCl/4% 만니톨, pH 6.8) 대조군의 HUVEC 튜브 형성에 대한 효과를 나타낸 것이다. IgG 융합체로서 시험된, 다른 신규한 TIE 리간드 동족체(NL6) 및 두 개의 공지된 TIE 리간드 TIE-1 및 TIE-2의 비교 결과가 도 17에 제시되어 있다.

본 발명은 신규의 TIE 리간드 상동체를 코딩하는 단리된 핵산 분자, 상기의 핵산 분자에 의해 코딩되는 TIE 리간드 상동체 단백질, 또한 상기 핵산 분자와 단백질 및 TIE 리간드 상동체에 결합하는 항체의 제조 및 이용을 위한 방법 및 수단에 관한 것이다.

"TIE" 또는 "tie"는 "Ig 및 EGF 상동성 도메인을 포함하는 티로신 키나아제 (tyrosin kinase containing Ig and EGF homology domains)"를 나타내는 약자이며 대부분 혈관 내피세포와 초기 조혈 세포에서만 발현되며, EGF-유사 도메인과 일반적으로 "면역글로블린(IG)-유사" 폴딩으로 불리는 쇄내의 디설피드 결합으로 안정화되는 세포외 폴딩 단위를 갖는 것을 특징으로 하는 수용체 티로신 키나아제의 새로운 패밀리를 나타내기 위해 만들어진 용어이다. Partanen 등은 인간의 백혈병 세포의 티로신 키나아제 상동성 cDNA 절편(tie)에 대해 기술하였다(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 8913-8917(1991)). 상기의 인간 "tie" 수용체의 mRNA는 모든 인간의 태아 및 마우스의 배 조직에서 검출되었으며 심장 및 혈관의 내피세포에 위치한다고 보고되었다[Korhonen et al., Blood 80, 2548-2555(1992): PCT 출원공개 번호 WO 93/14124 (1993.7.22에 공개됨)]. "tie-1"이라는 인간 tie의 랫트의 상동체는 Maisonpierre 등에 의해 확인되었다[Oncogene 8. 1631-1637(1993)]. 또 다른 tie 수용체인 "tie-2"는 원래 랫트에서 발견되었으며 [Dumont et al., Oncogene 8, 1293-1301(1993)], 반면에 "ork"라는 tie-2의 인간의 상동체는 미국 특허 제 5,447,860호(Ziegler)에 기재되어 있다. tie-2의 쥐의 상동체는 원래 "tek"이라고 불리웠다. PCT 출원 공개 번호 WO 95/13387(1995.5.18 공개)는 뇌의 모세혈관 cDNA 라이브러리로부터 마우스 tie-2 수용체의 클로닝을 기재하고 있다. TIE 수용체는 혈관형성에 적극적으로 관여할 것으로 생각되며, 조혈과정에도 역할을 수행할 것으로 생각된다.

PCT 출원 공개 번호 WO96/11269(1996. 4.18 공개)와 미국 특허 제 5,521,073호(1996. 5.28 공개)는 인간 TIE-2 리간드의 발현 클로닝에 대해 기술하고 있다. "htie-2 리간드 1" 또는 "hTL1"로 명명된 TIE-2 리간드를 코딩하는 λgt10으로 표시된 벡터가 ATCC 기탁 번호 75928로 기탁되었다. "htie-2 2" 또는 "hTL2"로 나타내는 또다른 TIE-2 리간드를 코딩하는 플라스미드는 ATCC 기탁 번호 75928로 이용 가능하다. 상기 두번째 리간드는 TAI-2 수용체의 길항제로서 기재되어 있다. Davis 등[Cell 87, 1161-1169(1996)]은 TIE-2 수용체에 대한 인간 및 마우스의 분비되는 리간드를 동정하였다고 보고하였다. 혈관형성 및 조혈과정의 효과적 작용에 있어서의 역할을 반영하는 "안지오포이에틴-1(angiopoietin-1)"으로 명명된 인간의 리간드는 WO 96/11269에서 "htie-2 1" 또는 "hTL-1"으로 다양하게 나타내는 리간드와 동일한 리간드이다. 안지오포이에틴-1은 나중에 혈관형성에 역할을 수행하며 VEGF와는 다른 것이라고 기재되었다[Suri et al., Cell 97, 1171-1180(1996)]. TIE-2는 명백하게 종양 성장에 필요한 병리학적 혈관형성 과정에서 상승 조절되기 때문에[Kaipainen et al., Cancer Res. 54. 6571-6577(1994)], 안지오포이에틴-1은 종양의 혈관구조를 특이적으로 표적화하는데도 유용할 것으로 제안되어졌다(Davis et al., 상기 문헌).

본 발명은 혈관구조에 강력한 효과를 갖는 신규의 인간 TIE 리간드 상동체에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기의 리간드 상동체 또는 그의 기능적인 유도체들을 코딩하는 단리된 핵산 분자 및 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공하는 것이다. 나아가, 본 발명은 신규의 TIE 리간드 상동체 또는 그의 기능적인 유도체를 생산하는 상기의 핵산으로 형질전환된 숙주 세포에 관한 것이다. 신규의 리 간드 상동체는 공지된 또는 본원에서 발견된 TIE 수용체의 작용제 또는 길항제가 될 수 있다. 또한, 다른 치료 또는 진단제를 각각의 TIE 수용체를 발현하는 세포로의 전달을 포함하는 그들의 치료 또는 진단 용도도 본 발명의 범위에 포함된다.

또한, 본 발명은 TIE 리간드 상동체에 특이적으로 결합하는 작용제 또는 길항제의 항체 및 상기 항체의 진단 및 치료 용도를 제공한다.

다른 면에서, 본 발명은 신규의 리간드 상동체 또는 항체를 포함하는 조성물에 관한 것이다.

다른 면에서는, 본 발명은 다른 치료제 또는 세포 독성제와 본 발명의 신규의 TIE 리간드 상동체의 접합체 및 상기 접합체를 포함하는 조성물에 관한 것이다. TIE-2 수용체는 종양 성장에 필요한 병리학적 혈관형성 과정에서 상승조절된다고 보고되었기 때문에, 본 발명의 TIE 리간드 상동체와 세포 독성제 또는 다른 항종양제의 접합체는 종양의 혈관 구조를 특이적으로 표적화하는데에 유용할 것이다.

또한, 본원에서 하나 이상의 TIE 리간드 상동체(NL8)를 코딩하는 유전자는 특정 종양 세포에서 증폭된다. 따라서, 종양의 진단과 치료를 위한 조성물 및 방법도 본 발명의 범위에 속한다.

또 다른 면에서, 본 발명은 TIE 수용체를 발현하는 세포를 확인하기 위한 방법을 제공한다. 상기 방법은 TIE 리간드 상동체가 TIE 수용체에 결합하게 하는 조건하에서, 검출 가능하게 표지된 본 발명의 TIE 리간드 상동체와 세포를 접촉시키고 이들의 결합이 실제로 일어나는 지를 결정하는 것을 포함한다.

또한, 본 발명은 생물학적 시료를 TIE 리간드 상동체와 특이적으로 결합하는 하나 이상의 항체와 접촉시킴으로써, 생물학적 시료 내의 본 발명의 TIE 리간드 상동체의 양 및 TIE 리간드 상동체-항체 복합체가 형성된 양을 측정하는 방법에 관한 것이다.

또다른 실시 태양에서, 본 발명은 내피 세포를 본원의 TIE 리간드 상동체의 유효량으로 처리하는 단계를 포함하는, 내피 세포 증식을 억제하기 위한 방법에 관한 것이다.

다른 실시 태양에서, 본 발명은 내피 세포를 본원의 TIE 리간드 상동체의 유효량으로 처리하는 단계를 포함하는, 내피세포의 세포사멸을 유도하기 위한 방법에 관한 것이다.

다른 실시 태양에서, 본 발명은 TIE 리간드 상동체를 포함하고 있다고 예상되는 세포를 항-TIE 리간드 상동체 항체에 노출시키고 세포에 대한 항체의 결합을 측정함으로써 TIE 리간드 상동체의 존재를 결정하기 위한 방법에 관한 것이다.

본 발명은 특히 a) 포유 동물로부터 얻은 조직 세포의 시험 시료 내에서, 및 b) 동일한 세포 종류의 공지된 정상 조직 세포의 대조군 시료에서 본원의 TIE 리간드 상동체를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 검출하는 단계를 포함하는, 포유동물 내의 종양을 진단하는 방법에 관한 것이다. 상기에서 시험 시료 내에서 높은 발현은 시험 조직 세포가 유래된 포유 동물에 종양이 존재한다는 것을 나타낸다. 특정 실시 태양에서, 본 발명은 a) 항-TIE 리간드 상동체 항체를 포유 동물로부터 얻은 조직 세포의 시험 시료와 접촉시키고, b) 시험 시료 내에서 항-TIE 리간드 상동체 항체와 TIE 리간드 상동체 사이의 복합체 형성을 검출함으로써 포유동물 내의 종양 을 진단하는 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 NL8 폴리펩티드를 과잉 발현하는 세포를 NL8 폴리펩티드의 발현 및(또는) 활성 억제제의 유효량에 노출시키는 단계를 포함하는, 종양 세포 성장을 억제시키기 위한 방법에 관한 것이다.

또다른 실시 태양에서, 본 발명은 a) 용기; b) 용기상의 라벨 및 c) 용기 내에 포함된 활성 성분을 포함하는 제조품에 관한 것이다. 상기에서 조성물은 종양 세포의 성장 억제에 효과적이며, 용기상의 라벨은 조성물이 NL8 폴리펩티드의 과잉 발현의 특징을 갖는 질병의 치료에 이용될 수 있다는 것을 나타내며, 조성물 내의 활성 성분은 NL8 폴리펩티드의 발현 및(또는) 활성의 억제제이다.

나아가, 본 발명은, 대응하는 TIE 수용체에 결합하기 위해 본 발명의 천연 또는 변이체 TIE 리간드 상동체와 경쟁할 수 있는 능력을 기초로 하여 폴리펩티드 또는 TIE 수용체의 작은 작용제 또는 길항제 분자를 동정하기 위한 스크리닝 방법에 관한 것이다.

본 발명은 상처 치유, 염증 또는 인간 환자의 종양에서 혈관형성의 존재를 영상화 하기 위한 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 검출 가능하게 표지된 본 발명의 TIE 리간드 상동체 또는 작용제 항체를 투여하고, 혈관형성을 검출하는 것을 포함한다.

또 다른 면에서, 약제학적으로 적합한 비히클 중의 본 발명의 TIE 리간드 상동체의 유효량을 투여하여 환자의 혈관신생을 촉진 또는 억제시키는 방법에 관한 것이다. 바람직한 실시 태양에서, 본 발명은 상처 치유를 촉진하기 위한 방법에 관한 것이다. 다른 실시 태양에서, 본 발명은 허혈성 심장 및 사지에서 부측 혈관형성과 같이, 혈관 형성 과정을 촉진시키기 위한 방법에 관한 것이다. 더 바람직한 실시 태양에서, 본 발명은 종양 성장의 억제 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 약제학적으로 적합한 비히클 중의 본 발명의 TIE 리간드 상동체의 유효량을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 환자의 뼈의 발생 및(또는) 성숙 및(또는) 성장을 촉진시키기 위한 방법에 관한 것이다.

나아가, 본 발명은 약제학적으로 적합한 비히클 중의 본 발명의 TIE 리간드 상동체의 유효량을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 근육 성장 및 발달을 촉진시키는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 TIE 리간드 상동체는 단독으로, 또는 서로 조합하고(하거나) VEGF 패밀리의 구성원을 포함한 다른 치료제 또는 진단제와 함께 투여될 수 있다. 조합 치료법은 혈관 신생, 근육의 성장 및 발육을 촉진 또는 억제를 위한 새로운 방법에 이용될 수 있다.

A. 리간드 상동체와 이를 코딩하는 핵산 분자

본 발명의 TIE 리간드 상동체는 NL1(SEQ.ID.NO:2), NL5(SEQ.ID.NO:4) NL8(SEQ.ID.NO:6) 및 NL4(SEQ.ID.NO:19)로 나타내지는 천연 인간 리간드 상동체, 원숭이와 같은 고등 포유동물; 마우스, 랫, 햄스터와 같은 설치류; 돼지; 말; 소를 포함하는 (이에 한정되지 않음) 비인간 포유동물 종에서의 그의 상동체, 천연 TL-1 또는 TL-2 리간드와 다른, 천연 분자의 아미노산 서열 변이체와 같은 자연적으로 발생하는 대립 및 스플라이싱 변이체 및 생물학적으로 활성인(기능적인) 유도체를 포함한다. 예를 들어, NL4는 hTL-2와는 34%, hTL-1과는 32% 가량의 아미노산 서열 동일성을 갖는다. 본 발명의 천연 TIE 리간드 상동체에는 그의 천연 환경에서 결합되는 다른 단백질이 실질적으로 존재하지 않는다. 상기의 정의는 본 발명의 TIE 리간드 상동체를 획득하는 방법에 의해서 한정되는 것이 아니며, 천연 공급원으로부터 정제되거나, 재조합 DNA 기술에 의해 얻거나, 합성되거나 또는 이들 및(또는) 다른 기술의 조합에 의해 준비되는, 상기 정의 범위에 포함되는 모든 리간드 상동체를 포함한다. 본 발명의 천연 TIE 리간드 상동체의 아미노산 서열 변이체는 전체 길이의 본 발명의 천연 인간 TIE 리간드 상동체 또는 본 발명의 천연 인간 TIE 리간드 상동의 피브리노겐 유사 도메인과 약 90% 이상, 바람직하게는 약 95% 이상, 더욱 바람직하게는 약 98% 이상, 가장 바람직하게는 약 99%의 서열 동일성을 갖는다. 상기의 아미노산 서열 변이체는 바람직하게는 천연 TIE 리간드 상동체의 생물학적 활성을 보이거나 또는 억제한다.

"피브리노겐 도메인" 또는 "피브리노겐 유사 도메인"은 공지된 hTL-1의 아미노산 서열에서 대략 278 내지 498번 위치의 아미노산; 공지된 hTL-2의 아미노산 서열에서 대략 276 내지 496번 위치의 아미노산: NL-1의 아미노산 서열에서 대략 270 내지 493번 위치의 아미노산; NL-5의 아미노산 서열에서 대략 272 내지 491번 위치의 아미노산; NL8의 아미노산 서열에서 대략 252 내지 470번 위치의 아미노산; NL4의 아미노산 서열에서 대략 130 내지 346번 위치의 아미노산 및 다른 TIE 리간드 상동체의 상동성 도메인을 언급하는데 사용된다. NL4의 피브리노겐 도메인은 hTL- 1 및 hTL-2와 44% 가량의 동일성을 갖는다.

"핵산 분자"는 RNA, DNA 및 cDNA를 포함한다. 유전자 코드의 다의성으로 인해, 주어진 TIE 리간드 상동체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 다수 생산될 수 있다. 모든 가능한 코돈 선택을 기초로 하여, 본 발명은 특히 본 발명의 TIE 리간드 상동체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 모든 가능한 변이를 포함한다. 엄격한 조건하에서, 본원의 TIE 리간드 상동체를 코딩하는 핵산 분자가 천연 TIE 리간드 상동체 유전자에 바람직하게 혼성화할 수 있지만, 실질적으로 다른 코돈을 사용하는 TIE 리간드 상동체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 제조하는 것이 유리하다. 예를 들어, 숙주 세포에서 특정 코돈의 사용 빈도에 따라 특정 원핵 또는 진핵 숙주 세포에서 폴리펩티드가 발현되는 비율을 증가시킬 수 있는 코돈을 선택할 수 있다. 또한, 주어진 TIE 리간드 상동체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 적절한 선택에 따라 반감기와 같은 향상된 특성을 갖는 RNA 전사체가 생산될 수 있다.

"서열 동일성"은 레이저진(Lasergene) 바이오컴퓨팅 소프트웨어(DNASTAR, Inc., Madison, Wisconsin)의 1.6 버전 또는 업데이트 버전 또는 이 소프트웨어의 균등물에 통합된 다수의 서열을 정렬하는 클러스탈 방법(Higgins et al., Comput. Appl. Biosci. 5. 151-153(1989) 및 Higgins et al., Gene 73, 237-244(1988))에 따라 비교할 두 개의 서열을 정렬함으로써 결정될 수 있다.

혼성화 반응의 "엄격성"은 당업자에 의해 쉽게 결정될수 있으며, 일반적으로 프로브의 길이, 세척 온도 및 염의 농도에 따라 실험적으로 계산된다. 일반적으로, 프로브의 길이가 길수록 적절한 어닐링을 하기 위해 더 높은 온도가 요구되는 반면, 짧은 프로브일수록 낮은 온도가 요구된다. 상보적인 가닥이 융해 온도보다 낮은 환경에 존재할 때, 혼성화는 일반적으로 변성된 DNA가 재어닐링하는 능력에 따라 결정된다. 프로브와 혼성화될 서열 사이에 요구되는 상동성의 정도가 높을수록 적용될 수 있는 상대적인 온도도 높다. 따라서, 상대적인 온도가 높을수록 반응 조건은 더 엄격해지는 반면, 낮은 온도일수록 엄격성은 낮아진다. 혼성화 반응의 엄격성에 관한 더 자세한 내용은 문헌[Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers,(1995)]을 참조한다.

본원에서 정의된 바와 같이, "엄격 조건" 또는 "높은 엄격 조건"은 다음 조건으로 확인될 수 있다: (1) 이온 세기가 낮고 세척 온도가 높은 조건, 예를 들면 0.015 염화나트륨/0.0015 M 시트르산나트륨/0.1 % 나트륨 도데실 술페이트를 50 ℃에서 사용하는 조건, 또는; (2) 42 ℃에서 0.1 % 소혈청 알부민/0.1 % 피콜/0.1 % 폴리비닐피롤리돈/750 mM 염화나트륨, 75 mM 시트르산나트륨이 함유된 50 mM 인산나트륨 완충액 (pH 6.5)이 함유된 50 % (vol/vol) 포름아미드 등의 포름아미드와 같은 변성제를 혼성화시에 사용하는 조건; (3) 50 % 포름아미드, 5 x SSC (0.75 M NaCl, 0.075 M 시트르산나트륨), 50 mM 인산나트륨 (pH 6.8), 0.1 % 피로인산나트륨, 5 x 덴하르트(Denhardt) 용액, 초음파 처리된 연어 정자 DNA (50 ㎍/ml), 0.1 % SDS 및 10 % 덱스트란 술페이트를 42 ℃에서 사용하고, 0.2 x SSC (염화나트륨/시트르산나트륨)로 42 ℃에서 세척 및 55 ℃에서 50% 포름아미드로 세척한 후, 55 ℃에서 EDTA를 포함하는 0.1 X SSC로 구성된 매우 엄격한 조건으로 세척한다.

"적당한 엄격 조건"은 Sambrook 등(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989)에 의해 기술된 바와 같이 확인될 수 있으며 세척 용액과 혼성화 조건(예, 온도, 이온 세기 및 % SDS)이 상기에서 언급한 것보다는 엄격성이 낮다. 적당한 엄격 조건의 예는 20% 포름아미드, 5 x SSC(150 mM NaCl, 15 mM 시트르산 삼나트륨), 50 mM 인산 나트륨(pH 7.6), 5 x 덴하르트 용액, 10% 덱스트란 술페이트 및 분쇄된 변성 연어 정자 DNA 20 ㎎/㎖를 포함하는 37 ℃의 용액 내에서 밤새 인큐베이션한 후, 37 내지 50℃에서 1 x SSC에서 필터를 세척하는 것이다. 숙련된 기술자라면 프로브 길이 등과 같은 인자들에 따라 온도, 이온 세기 등을 조정하는 방법을 알고 있을 것이다.

본원에서 사용되는 용어 "에피토프 태그를 단(tagged)"은 "태그 폴리펩티드"에 융합된 TIE 리간드 상동체 폴리펩티드를 포함하는 키메라 폴리펩티드를 나타낸다. 태그 폴리펩티드는 항체가 제조될 수 있는 에피토프를 제공하기에는 충분한 잔기를 갖지만, 그에 융합되는 폴리펩티드의 활성을 저해하지 않도록 충분히 짧다. 태그 폴리펩티드는 바람직하게는 그에 대한 항체가 다른 에피토프와 실질적으로 교차반응하지 않도록 충분히 특이적이다. 적합한 태그 폴리펩티드는 일반적으로 6개 이상의 아미노산 잔기, 보통 약 8 내지 50개의 아미노산 잔기 (바람직하게는 약 10 내지 20개의 잔기)를 갖는다.

본 발명의 TIE 리간드 상동체에 대한 "생물학 활성" 및 "생물학적으로 활성인"은 분자가 공지된 또는 본원에서 발견한 TIE 리간드의 천연 수용체(이하에서는 "TIE 수용체"라고 함) 예를 들어 천연 TIE-2 수용체에 특이적으로 결합하여 그를 통해 신호전달을 할 수 있거나 천연 TIE 수용체(예, TIE-2)가 신호 전달 경로에 참 여하는 것을 막을 수 있다는 것을 언급한다. 따라서, 본 발명의 (천연 또는 변이체) TIE 리간드는 천연 TIE, 예를 들어 TIE-2 수용체의 작용제 및 길항제를 포함한다. 본 발명의 TIE 리간드의 바람직한 생물학적 활성은 혈관형성의 유발능 또는 억제능을 포함한다. 혈관형성의 유발능은 상처 치유, 허혈 및 당뇨와 같은 혈관형성을 필요로 하는 생물학적 증상 및 질병의 치료에 유용할 것이다. 반면에, 혈관형성의 억제 및 방지능은 예를 들어 종양 성장을 방지하거나 약화시키는 데 유용할 것이다. 또다른 바람직한 생물학적 활성은 근육 성장 및 발생에 영향을 줄 수 있는 능력이다. 또한, 뼈의 발생, 성숙 또는 성장에 영향을 줄 수 있으며 암, 예를 들어 유방암의 병인에 관여하며 내피 세포 성장의 억제 및(또는) 세포 사멸을 유발할 수 있는 능력이다.

본원에서 사용되는 "천연 TIE 수용체"는 인간, 원숭이와 같은 다른 고등 영장류, 랫트 및 마우스와 같은 설치류를 포함하는, 그러나 이에 한정되지 않는 모든 동물의 TIE 수용체를 의미한다. 특히 이 정의는 예를 들어 PCT 출원 공개 번호 WO 95/13387(1995. 5.18 공개)에서 기재한 TIE-2 및 PCT 출원 공개 번호 WO 93/14124(1993. 7.22 공개)에서 "TIE"라는 내피 세포 수용체 티로신 키나아제를 포함하며, 바람직하게는 TIE-2를 말한다.

"기능적인 유도체"라는 용어는 유기 유도체화제와 반응하여 얻어지는 유도체, 번역 후 변형 및 비단백질의 중합체 및 면역어드헤신(immunoadhesin)을 갖는 유도체를 포함하는 공유의 변형뿐만 아니라 생물학적 활성을 갖는 본 발명의 천연 TIE 리간드 상동체의 아미노산 서열 변이체를 정의하는 데 사용된다.

"혈관 내피 성장 인자"/"혈관 투과능 인자"(VEGF/VPF)는 최근에 저산소증에 의해 자극되고 종양 혈관 생성에 필요할 것[Senger et. al., Cancer 46: 5629-5632 (1986); Kim et al.,Nature 362: 841-844 (1993); Schweiki et al., Nature 359: 843-845 (1992); Plate et al., Nature 359: 845-848 (1992)]으로 밝혀진 내피 세포 특이적 분열유발인자(mitogen)이다. 이것은 여러 종양 및 정상 세포에서 합성 분비되는 34-43 kDa(우세한 종류는 약 45 kDa)의 디설피드로 연결된 이량체의 당단백질이다. 또한, 색소 상피 세포 및 혈관 주위 세포와 같이 배양된 인간 망막 세포도 VEGF를 분비하고 저산소증에 반응하여 VEGF 유전자 발현을 증가시키는 것으로 증명되었다 [Adamis et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 193: 631-638 (1993); Plouet et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 34: 900 (1992); Adamis et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 34: 1440 (1993); Aiello et al., Invest Opthalmol. Vis. Sci. 35: 1868 (1994); Simorre-pinatel et al., Invest Opthalmol. Vis. Sci. 35: 3393-3400 (1994)]. 반면, 정상 조직에서 VEGF는 상대적으로 낮다. 따라서 VEGF는 혈관 신생과 관련된 많은 병리학적 상태 및 과정에서 중요한 역할을 하리라 예상된다. 상기에서 기재된 여러 조건에 의해 영향받은 조직 내에서 VEGF의 발현 조절은 저산소증과 관련된 치료 또는 예방 요법에 있어 중요할 수 있다.

본원에서 기술된 여러 폴리펩티드를 기술할 때 사용되는 "단리된"이라는 용어는 자연 환경의 구성성분으로부터 동정 및 분리 및(또는) 회수된 폴리펩티드를 의미한다. 자연 환경에서 오염 성분은 폴리펩티드의 진단 또는 치료 용도의 사용 을 방해하는 물질들이며, 효소, 호르몬 및 기타 단백질의 또는 비단백질의 용질을 포함한다. 바람직한 실시 태양에서, 폴리펩티드는 (1) 스피닝컵(spinning cup) 서열 결정기의 사용으로 N-말단 또는 내부의 아미노산 서열의 15 잔기 이상을 얻기에 충분한 정도로, 또는(2) 쿠마시 블루 또는 바람직하게 은 염색을 이용하는 비-환원 또는 환원 조건하에서 SDS-PAGE로 균질할 정도로 정제되어야 한다. 자연 환경에는 TIE 리간드 상동체의 하나 이상의 성분이 존재하지 않을 것이기 때문에 단리된 폴리펩티드는 재조합 세포 내에 존재하는 폴리펩티드를 포함한다. 그러나, 통상적으로 단리된 폴리펩티드는 한 단계 이상의 정제 단계를 거쳐 준비된다.

"작용제"는 고유 TIE 수용체(예, TIE-2)를 통해 신호전달을 할 수 있는 본 발명의 천연 TIE 리간드 상동체의 펩티드 및 비펩티드 유사체 및 이러한 천연 TIE 리간드 상동체에 특이적으로 결합하는 항체를 나타내는 데 사용된다. 다시말해, 작용제는 TIE 수용체의 생물학적 역할 내에서 정의되며, 상기에서 지적한 바와 같이 천연 TIE 수용체의 생물학적 기능에 대한 작용제 또는 길항제가 될 수 있는 천연 TIE 리간드 상동체의 생물학적 역할과 관련하여 정의되지는 않는다. 바람직한 작용제는 혈관 형성의 프로모터이거나 뼈 형성 성숙 또는 성장에서 역할을 수행한다. 다른 바람직한 작용제는 근육 성장 및(또는) 발육를 증진시킨다.

"길항제"는 천연 TIE 수용체(예, TIE-2)의 생물학적 기능을 억제할 수 있는, 본 발명의 천연 TIE 리간드 상동체의 펩티드 및 비펩티드 유사체 및 이러한 천연 TIE 리간드 상동체에 특이적으로 결합하는 항체를 나타내는 데 사용된다. 다시말해, 길항제는 TIE 수용체의 생물학적 역할 내에서 정의되며, 천연 TIE 수용체의 생 물학적 기능의 작용제 또는 길항제가 될 수 있는 천연 TIE 리간드 상동체의 생물학적 역할과 관련하여 정의되지는 않는다. 바람직한 길항제는 혈관 형성 또는 병리학적 뼈 또는 근육 발달 또는 성장의 억제제이다.

"유전자 증폭" 및 "유전자 복제"는 상호 교환적으로 사용되며 특정 세포 또는 세포주에서 유전자 또는 유전자 단편의 다수의 카피가 형성되는 과정을 나타낸다. 복제된 영역(증폭된 DNA 스트레치)은 흔히 "앰플리콘"으로 언급된다. 일반적으로, 생산된 mRNA의 양, 즉 유전자 발현의 수준은 또한 발현된 특정 유전자로 구성된 카피수에 비례하여 증가한다.

본원에서 사용되는 "종양"은 악성 또는 양성에 관계없이 모든 종양의 세포 성장 및 증식 및 모든 전암성(pre-cancerous) 및 암성의 세포 및 조직을 언급한다.

용어 "암" 및 "암성의"는 통상 비조절된 세포 성장이라는 특징을 갖는 포유동물의 생리학적 상태를 의미하거나 설명한다. 암의 예로는 암종, 임파종, 아세포종, 육종 및 백혈병이 있지만, 이에 제한되지는 않는다. 그러한 암의 더욱 특정의 예로는 유방암, 전립선암, 결장암, 편평상피 세포 암, 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 위암, 췌장암, 신경교아종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간종양, 결장직장암, 자궁내막암, 타액선암, 신장암, 외음부암, 갑상선암, 간암종 및 각종 유형의 두부암 및 목암을 들 수가 있다.

"처치"는 질환 발생의 억제, 질환 병리의 변경을 위해 수행되는 행위이다. 따라서, "처치"는 치료 조치와 예방 또는 방지 조치를 모두 나타낸다. 처치를 요하는 대상은 이미 질환을 갖고 있는 대상 뿐만 아니라 질환을 방지하고자 하는 대 상을 포함한다. 종양(예, 암) 치료에서 치료제는 직접 종양 세포의 병리를 감소시킬 수도 있고 또는 종양 세포가 방사선 및(또는) 화학 요법과 같은 다른 치료제의 처리에 더 영향받기 쉽도록 만들 수도 있다.

암의 "병리"는 환자의 건강을 손상시키는 모든 현상을 포함한다. 이는 제한없이 비정상적 또는 조절할 수 없는 세포 성장, 전이, 이웃 세포의 정상 기능의 방해, 사이토카인 또는 다른 분비물의 비정상적 수준으로의 방출, 염증 또는 면역학적 반응을 억제 또는 악화 등을 포함한다.

처치를 위한 "포유동물"은 인간, 가축과 사육 동물, 비인간 영장동물 및 동물원용, 경기용 또는 애완용 동물, 예를 들면, 개, 말, 고양이, 소 등을 포함하는 포유동물로서 분류되는 모든 동물을 의미한다. 바람직하게는 포유류는 인간이다.

한 가지 이상의 치료제와 "조합하여" 투여하는 것은 동시 및 일정 순서의 연속 투여를 포함한다.

"화학요법제"는 암 치료에 유용한 화학적 화합물이다. 화학요법제의 예로는 아드리아마이신, 독소루비신, 에피루비신, 5-플루오로우라실, 사이토신 아라비노시드 ("Ara-C"), 시클로포스파미드, 티오테파, 부술판, 사이톡신, 패클리택셀(Taxol, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ) 및 독세탁셀(Taxotere, Rhone-Poulence Rorer, Antony, Rnace)과 같은 탁소이드, 톡소테레, 메토트렉세이트, 시스플라틴, 멜팔란, 빈블라스틴, 블레오마이신, 에토포시드, 이포스파미드, 미토마이신 C, 미톡산트론, 빈크리스틴, 비노렐빈, 카르보플라틴, 테니포시드, 다우노마이신, 카르미노마이신, 아미노프테린, 닥티노마이신, 미토마이신, 에스페라미신 ( 미국 특허 제4,675,187호 참조), 멜팔란 및 다른 관련 질소 머스타드를 포함한다. 또한, 이 정의에 타목시펜 및 오나프리스톤과 같이 종양에 호르몬 활성을 조절 또는 억제하는 기능을 하는 호르몬제도 포함된다.

본원에서 사용되는 "성장 억제제"는 세포, 특히 본원에서 동정된 유전자를 시험관 내 또는 생체 내에서 과잉생산하는 암세포의 성장을 억제하는 화합물 또는 조성물을 의미한다. 따라서, 성장 억제제는 S 단계에서 상기 유전자를 과잉 생산하는 세포의 비율을 크게 감소시킨다. 성장억제제의 예에는 G1 정지 및 M-단계 정지를 유도하는 제제와 같이 세포 주기(S 단계를 제외) 진행을 차단하는 제제가 포함된다. 전형적인 M-단계 차단제로 빈카스(빈크리스틴 및 빈블라스틴), 택솔 및 독소루비신, 에피루비신, 다우노루비신, 에토포시드 및 블레오마이신과 같은 토포 II 억제제가 포함된다. G1을 정지시키는 제제는 또한 S-단계 정지를 유도하는데, 그 예로는, 타목시펜, 프레드니손, 다카르바진, 메클로레타민, 시스플라틴, 메토트렉세이트, 5-플루오로우라실 및 아라-C와 같은 DNA 알킬화제가 있다. 추가적인 정보는 Murakami 등의 문헌["Cell cycle regulation, oncogens, and antineoplastic drugs" 제목의 The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn and Israel, eds., Chapter 1 (WB Saunders:Philadelphia, 1995), 특히 p13)]에서 얻을 수 있다.

"독소루비신"은 아트라시클린 항생제이다. 독소루비신의 원래 화학명은 (8S-시스)-10-[(3-아미노-2,3,6-트리데옥시-α-L-릭소-헥사피라노실)옥시]-7,8,9,10-테트라히드로-6,8,11-트리히드록시-8-(히드록시아세틸)-1-메톡시-5,12-나프타센디온이다.

"사이토카인"은 세포간 매개체로서 다른 세포에 작용하는 세포군이 방출하는 단백질의 일반 용어이다. 이러한 사이토카인의 예에는 림포카인, 모노카인 및 전형적인 폴리펩티드 호르몬이 있다. 사이토카인에는 인간 성장 호르몬, N-메티오닐 인간 성장 호르몬 및 소 성장 호르몬 같은 성장 호르몬: 부갑상선 호르몬; 티록신; 인슐린; 프로인슐린; 릴락신; 프로릴락신; 난포 자극 호른몬(FSH), 갑상선 자극 호르몬(TSH) 및 황체 형성 호르몬(LH)과 같은 당단백질 호르몬; 간 성장 인자; 섬유아세포 성장 인자; 프로락틴; 태반의 락토겐; 종양 괴사 인자-α 및 β; 뮐러의 억제 물질; 마우스 고나도트로핀-연관 펩티드; 인히빈; 액티빈; 혈관 내피 성장 인자; 인테그린; 트롬보포이에틴(TPO); NGF-β와 같은 신경 성장 인자; 혈소판-성장 인자; TGF-α 및 TGF-β와 같은 전환 성장 인자(TGF); 인슐린 유사 성장 인자-I 및 II; 에리트로포이에틴 (EPO); 골유도 인자; 인터페론-α,-β 및 -γ와 같은 인터페론; 대식세포-CSF(M-CSF)와 같은 콜로니 자극 인자(CSF); 과립세포-대식세포-CSF(GM-CSF); 및 과립세포-CSF(G-CSF); IL-1, IL-1α, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12과 같은 인터루킨(IL); TNF-α 및 TNF-β와 같은 종양 괴사 인자; 및 LIF 및 kit 리간드(KL)를 포함하는 기타 폴리펩티드가 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 사이토카인은 천연 공급원으로부터 또는 재조합 세포 배양액으로부터의 단백질 및 고유 서열의 사이토카인의 생물학적으로 활성인 균등물을 포함한다.

"단리된" 핵산 분자는 보통 핵산의 천연 공급원에서 함께 결합되어 있는 하나 이상의 오염물 핵산 분자로부터 동정되고 분리된 핵산 분자이다. 단리된 핵산 분자는 천연적으로 발견되는 형태 또는 상태가 아니다. 따라서, 단리된 핵산 분자는 천연 세포 내에 존재하는 핵산 분자와 구별된다. 그러나, 단리된 핵산 분자는 통상 본 발명의 TIE 리간드를 발현하는 세포에 함유된 핵산 분자를 포함하고, 여기에서 예를 들면 핵산 분자는 천연 세포의 핵산과 상이한 염색체 위치에 존재한다.

"아미노산 서열 변이체"는 천연 아미노산 서열과 비교하여 아미노산 서열에서 약간의 차이를 보이는 분자를 나타낸다.

"치환" 변이체는 천연 서열 내의 1개 이상의 아미노산 잔기가 제거되고 그 동일한 위치에서 그 자리에 다른 아미노산이 삽입된 변이체이다. 치환은 분자 내에 하나의 아미노산만이 치환된 단일 치환일 수 있거나, 또는 2개 이상의 아미노산이 동일한 분자 내에서 치환된 다중 치환일 수 있다.

"삽입" 변이체는 천연 서열 내의 특정한 위치의 아미노산에 1개 이상의 아미노산이 바로 인접하여 삽입된 변이체이다. 아미노산에 바로 인접한 것은 아미노산의 α-카르복실 또는 α-아미노 작용기에 연결된 것을 의미한다.

"결실" 변이체는 천연 아미노산 서열 내에서 1개 이상의 아미노산이 제거된 변이체이다. 통상적으로, 결실 변이체는 분자의 특정 영역에서 1개 또는 2개의 아미노산이 결실될 것이다. 결실 변이체는 하나 이상의 내부 결실뿐 아니라 C- 및(또는) N-말단 결실(말단 절단(truncations))을 갖는 변이체를 포함한다. 본 발명의 바람직한 결실 변이체는 본 발명의 천연 TIE 리간드 상동체의 피브리노 유사 도메인 외부에서 결실을 포함하는 것이다.

본 발명의 아미노산 서열 변이체는 최적의 특성을 갖는 분자를 생산하기 위 해 아미노산 치환, 삽입 및(또는) 결실의 여러가지 조합을 포함한다.

아미노산은 그의 측쇄의 화학적 조성 및 특성에 따라 분류될 수 있다. 넓게는 하전 및 비하전의 두 그룹으로 분류할 수 있다. 각 그룹은 더 정확하게 분류하기 위해 소그룹으로 나뉜다.

I. 하전 아미노산

산성 잔기 : 아스파르트산, 글루탐산

염기성 잔기 : 리이신, 아르기닌, 히스티딘

II. 비하전 아미노산

친수성 잔기 : 세린, 트레오닌, 아스파라긴, 글루타민

지방족 잔기 : 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신

비극성 잔기 : 시스테인, 메티오닌, 프롤린

방향족 잔기 : 페닐알라닌, 티로신, 트립토판

보존적 치환은 동일한 그룹에 속하는 구성 성분이 같은 그룹 내의 다른 구성 성분으로 전환되는 반면, 비보존적 치환은 한 그룹의 구성 성분을 다른 그룹의 것으로 교환시킬 것이다. 비보존적 치환에 의해 얻어진 변이체는 그 생물학적 특성/기능에 있어 큰 변화를 가져오리라 예상된다.

아미노산 서열 결실은 대개 약 1 내지 30개 잔기의 범위이며, 더 바람직하게는 1 내지 10 개의 잔기의 범위이고, 전형적으로 인접해 있다. 결실은 천연 TIE 수용체와의 상호작용에 직접적 관련이 없는 영역에 도입된다. 바람직하게는, 본 발명의 TIE 리간드 상동체의 C-말단의 피브리노겐 유사 영역 외부에서 결실된다.

아미노산 삽입은 단일 또는 다수의 아미노산 잔기의 서열내 삽입 뿐아니라 하나의 잔기에서 백 개 이상의 잔기를 포함하는 폴리펩티드의 아미노 및(또는) 카르복실 말단에 대한 융합도 포함한다. 서열내 삽입(즉, TIE 리간드 상동체 아미노산 서열 내의 삽입)은 보통 1 내지 10개의 잔기의 범위이며, 바람직하게는 1 내지 5, 더 바람직하게는 1 내지 3 개의 잔기이다. 말단 삽입의 예는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 TIE 리간드 상동체, 세균 재조합 세포 배양에서 그의 직접적 발현의 인공 산물 및 재조합 숙주 세포로부터 성숙 TIE 리간드 상동체의 분비를 촉진하기 위해 이종성 N-말단 시그날 서열을 TIE 리간드 상동체의 N-말단에 융합시킨 것도 포함한다. 이러한 시그날 서열은 일반적으로 의도하는 숙주 세포 종으로부터 얻기 때문에 숙주 세포에 동종성이다. 적합한 서열로 예를 들어 이. 콜라이의 STII Ipp, 효모의 알파 인자 및 포유동물 세포의 헤르퍼스 gD와 같은 바이러스의 시그날을 포함한다. 천연 TIE 리간드 분자의 다른 삽입 변이체에는 예를 들어 베타-락타마아제 또는 이. 콜라이 trp 좌위에 의해 코딩되는 효소와 같은 세균의 폴리펩티드 또는 효모 단백질과 같은 면역원성의 폴리펩티드에 대한 TIE 리간드 상동체 분자의 N-또는 C-말단 융합체 및 1989. 4. 6에 공개된 WO 89/02922에 기재된 면역글로블린 영역(바람직하게는 면역글로블린의 불변 부위), 알부민 또는 페리틴과 같은 반감기가 긴 단백질과의 C-말단 융합체가 포함된다. 변이체 TIE 리간드 상동체의 특성을 미리 예측하기가 어렵기 때문에 가장 적합한 변이체를 선택하기 위해서는 스크리닝이 필요하리라 생각된다.

본 발명의 천연 TIE 리간드 상동체의 아미노산 서열 변이체는 천연 또는 변 이 TIE 리간드 상동체 DNA로 적당한 뉴클레오티드 변화를 도입하거나 원하는 폴리펩티드를 시험관 내에서 합성하는 당업계에 공지된 방법으로 준비한다. 아미노산 서열 변이체를 제작하는 데에는 변이 부위의 위치 선정 및 변이의 특성이라는 두가지 중요한 변수가 있다. TIE 리간드 상동체를 코딩하는 DNA 서열의 조작을 필요로 하지 않는 자연 발생적 대립유전자를 제외하고, 자연에 존재하지 않는 대립유전자 또는 아미노산 서열 변이체가 되도록 DNA를 변이시킴으로써 TIE 리간드 상동체의 아미노산 서열 변이체를 바람직하게 제조할 수 있다.

돌연변이의 한 그룹은 TIE-1 또는 TIE-2와 같은 TIE 수용체와의 상호작용에 관련있는 것으로 확인된 본 발명의 TIE 리간드 상동체의 도메인(들) 내에 만들어질 수 있다.

또한, 얻고자하는 목적에 따라 여러 종으로부터 TIE 리간드 상동체와 다른 위치, 보존도가 높은 영역 내의 아미노산이 변형될 수 있다.

그러한 위치에 있는 부위는 일반적으로 일련의 과정 즉 (1) 우선 보존적 그룹으로 치환한 후 얻어진 결과에 따라 더 가변적인 그룹으로 치환, (2) 목적하는 잔기(들)의 제거 또는 (3) 위치선정된 부위에 인접한 동일 또는 상이한 그룹의 잔기의 삽입 또는 1 내지 3의 조합을 통해 변형된다.

"알라닌 스캐닝"[Cunningham and Wells Science, 244: 1081-1085 (1989)]이라는 유용한 기술이 있다. 이 기술은 목적하는 잔기 또는 그룹을 확인하고 알라닌 또는 폴리알라닌으로 치환한다. 이어서, 알라닌 치환 부위에서 또는 그 부위에 대해 추가적인 또는 다른 치환기를 도입함으로써 알라닌 치환에 기능적 감수성을 나 타내는 도메인을 확인한다.

원하는 돌연변이를 동정한 후 TIE 리간드의 아미노산 서열 변이체를 코딩하는 유전자를 예를 들어 상기에 기술된 화학합성에 의해 얻을 수 있다.

더욱 바람직하게는, 미리 준비된 리간드의 변이체 또는 비변이 리간드를 코딩하는 DNA의 부위 지정 변이 유발법에 의해 TIE 리간드 상동체 아미노산 서열 변이체를 코딩하는 DNA가 제조된다. 부위 지정(부위 특이적) 변이 유발법은 원하는 돌연변이의 DNA 서열을 코딩하는 특정 올리고뉴클레오티드 서열 및 가로지르는 결실 접합부 양쪽에 안정한 이중 가닥을 형성하기에 충분한 크기와 서열 복합성을 갖는 프라이머 서열을 제공하기에 충분한 인접 뉴클레오티드를 이용하여 리간드 변이체를 생성시킬 수 있다. 통상적으로, 서열 접합부의 양쪽에 약 5 내지 10 개의 변형된 잔기를 갖는 약 20 내지 25 뉴클레오티드 길이의 프라이머가 바람직하다. 일반적으로, 부위 특이적 변이 유발법은 예를 들어 Edelman 등의 문헌[DNA 2, 183(1983)]에 의해 매우 잘 알려진 기술이다. 일반적으로 부위 특이적 변이 유발법은 단일 가닥 및 이중 가닥 형태로 모두 존재하는 파아지 벡터를 이용한다. 부위 지정 변이에서 유용한 통상적인 벡터에는 예를 들어 Messing 등[Third Cleveland Symposium on Macromolecules and Recombinant DNA, A. Walton, ed., Elsevier, Amsterdam(1981)]이 기술한 M13 파아지가 포함된다. 이들 및 다른 파아지 벡터는 상업적으로 이용 가능하며, 그의 사용 방법도 당업계의 숙련자들에게 공지되어 있다. M13 유도 벡터를 이용하여 DNA 단편 내에 올리고뉴클레오티드 지정 부위 특이적 변이를 제조하는 매우 효과적인 방법은 Zoller, M.J 및 Smith, M [Nucleic Acids Res. 10 6487-6500(1982)]에 의해 발표되었다. 또한, 단일 가닥 파아지 복제 기점을 포함하는 플라스미드 벡터[Veira et al., Meth. Enzymol. 153, 3(1987)]는 단일 가닥 DNA를 얻는데에 이용된다. 별법으로 시험관 내에서 적절한 DNA 단편을 합성하고 공지된 PCR 방법으로 합성된 DNA를 증폭시켜 뉴클레오티드 치환을 유도할 수 있다.

일반적으로, 부위 특이적 변이 유발법에서 우선 관련 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 자신의 서열 내에 포함하는 단일 가닥 벡터를 얻어야 한다. 일반적으로, 목적하는 돌연변이 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 예를 들어 Crea 등의 방법[Proc. Natl, Acad. Sci. USA 75: 5765 (1978)]으로 합성하여 준비한다. 이어서, 이 프라이머를 단일 가닥 단백질 서열을 포함하는 벡터에 어닐링하고, DNA 중합 효소, 예를 들어 이. 콜라이 폴리머라아제 I 클레나우 단편에 의해 돌연변이를 포함하는 가닥을 합성한다. 따라서, 한 가닥은 본래의 돌연변이되지 않은 서열을 코딩하고, 다른 가닥은 원하는 돌연변이를 갖는 이종의 이중가닥이 형성된다. 이 이종의 이중가닥 벡터를 JP101 세포와 같은 적합한 숙주 세포를 형질 전환시키는 데 사용하여 돌연변이된 서열 배열을 포함하는 재조합 벡터를 포함하는 클론을 선별한다. 이어서, 돌연변이된 부위를 회수하여 단백질 생산에 적합한 발현 벡터에 넣어준다.

또한 PCR 기술은 TIE 리간드 상동체의 아미노산 변이체를 만드는 데에도 이용된다. PCR 출발 물질로서 소량의 DNA 주형이 사용될 때, 프라이머가 주형과 다른 위치에서만 주형 서열과 다른 특정 DNA 단편을 상대적으로 다량으로 생성하기 위해 주형 DNA 내의 대응하는 부위와 약간 다른 서열의 프라이머가 사용된다. 플라스미드 DNA에 돌연변이를 유발시키기 위해 한 프라이머는 돌연변이 위치와 중복되고 돌연변이를 포함하도록 고안하고 또다른 프라이머의 서열은 플라스미드의 반대 가닥의 서열 스트레치와 동일해야만 하지만, 이 서열은 플라스미드 DNA의 어디에든 위치할 수 있다. 그러나, 프라이머가 결합하는 DNA의 증폭되는 전체 영역이 쉽게 서열분석될 수 있도록 두번째 프라이머 서열은 첫번째 프라이머로부터 200 뉴클레오티드 내에 위치하는 것이 바람직하다. 주형 복제가 다소 오류를 범하기 쉽기 때문에, 바로 앞에서 기술된 프라이머쌍을 이용하는 PCR 증폭 결과, 프라이머에 의해 특정화된 돌연변이 위치 및 그외 다른 위치에서 다른 DNA 단편 집단이 생성된다

주형 대 생성 물질의 비가 매우 낮을 경우에, 생성된 대부분의 DNA 단편이 원하는 돌연변이(들)를 포함한다. 상기의 산물을 표준 DNA 기술을 이용하여 PCR 주형으로 기능하는 플라스미드 내의 해당 위치를 치환시키는데 사용한다. 제 2변이 프라이머를 이용하거나 다른 돌연변이 프라이머로 2차 PCR을 수행하고, 두개의 생성 PCR 단편을 세 부분(이상)의 라이게이션에 의해 벡터 단편에 동시에 라이게이션시킴으로써 돌연변이를 동시에 별개 위치에 도입할 수 있다.

PCR 변이 유발법의 구체적인 예로, 주형 플라스미드 DNA (1 ㎍)을 증폭될 영역 외부에 플라스미드 DAN 내의 고유 인지 부위를 갖는 제한 엔도뉴클레아제로 절단하여 선형화한다. 선형화된 물질 100 ng을 GeneAmp

키트(Norwalk, CT and Emeryville, CA에 소재한 Perkin-Elmer Cetus에서 구입) 내에 포함된, 4개의 데옥 시뉴클레오티드 트리포스페이트 올리고뉴클레오티드를 포함하는 PCR 완충액 및 각각의 올리고뉴클레오티드 프라이머 25 pmole를 포함하는 PCR 혼합물에 첨가하여 최종 부피 50 ㎕가 되도록 한다. 35 ㎕의 미네랄 오일로 반응 혼합물을 덮고, 반응 혼합물을 100℃에서 5분간 변성시켜 빠르게 빙상에 위치시킨다. 이어서, Perkin-Elmer Cetus(Norwalk, CT and Emeryville, CA 소재)에서 구입한 써무스 아쿠아티쿠스(Thermus aquaticus)(Taq) DNA 폴리머라아제 (5 단위/ℓ) 1 ㎕ 를 미네랄 오일 층 아래에 첨가한다. 반응 혼합물을 다음과 같이 프로그래밍된 DNA 열 순환기 (Perkin-Elmer Cetus에서 구입)에 넣었다.

2분. 55℃

30초. 72℃, 이어서 다음을 19 반복한다:

30초. 94℃

30초. 55℃, 및

30초. 72℃

프로그램이 끝난 후, 반응 바이알을 열 순환기로부터 꺼내어 액상층을 새로운 바이알로 옮겨 페놀/클로로포름(50:50)으로 추출, 에탄올로 침전시키고, 표준 방법에 따라 DNA를 회수하였다. 이어서, 벡터에 삽입하기 위한 적절한 처리를 하였다.

변이체를 제조하는 별법인, 카세트 변이 유발법은 Well 등[(Gene 34, 315(1985)]이 기재된 방법에 기초한다. 출발 물질은 돌연변이될 유전자인 TIE 리간드 상동체 DNA를 포함하는 플라스미드 (또는 벡터)이다. 돌연변이될 TIE 리간드 상동체 내의 코돈(들)을 확인한다. 확인된 돌연변이 부위(들)의 각 측면 상에 특유한 제한 엔도뉴클레아제 부위가 있어야 한다. 그러한 제한 부위가 존재하지 않는 경우, 그것은 TIE 리간드 상동체를 코딩하는 DNA 내의 적절한 위치에서 제한 부위를 도입하는 상기한 올리고뉴클레오티드 매개 변이 유발법을 이용하여 형성될 수 있다. 제한 부위가 플라스미드에 도입된 후에, 플라스미드는 이 부위에서 절단되어 선형화된다. 제한 부위 사이에 DNA의 서열을 코딩하지만 원하는 돌연변이(들)을 포함하는 이중 가닥 올리고뉴클레오티드는 표준 절차를 이용하여 합성된다. 두개의 가닥은 표준 기술을 이용하여 개별적으로 합성되며 함께 혼성화된다. 이 두가닥 올리고뉴클레오티드는 카세트로서 불리운다. 이 카세트는 그것이 플라스미드에 직접 라이게이션될 수 있도록 선형화된 플라스미드의 말단에 적합성인 3' 및 5' 말단을 갖도록 디자인된다. 이 플라스미드는 이제 돌연변이된 TIE 리간드 상동체 DNA 서열을 포함한다.

또한, 일명 파지미드 디스플레이 방법은 천연 또는 변이된 TIE 리간드 상동체의 아미노산 서열 변이체를 만드는데 유용하다. 이 방법은 a) 돌연변이될 수용체를 코딩하는 제1 유전자, 천연 또는 야생형 파지 외피 단백질의 적어도 일부를 코딩하는, 제1 유전자와 이종성인 제2 유전자, 및 제1 및 제2 유전자에 작동가능하게 연결된 전사 조절 인자를 포함하는 복제가능한 발현 벡터를 제조하여 융합 단백질을 코딩하는 유전자 융합체를 형성하고; b) 제1 유전자 내의 하나 이상의 선택된 위치에서 벡터를 돌연변이시켜 관련 플라스미드 패밀리를 형성하고; c) 적합한 숙주 세포를 플라스미드로 형질전환시키고; d) 형질전환된 숙주 세포를 파지 외피 단 백질을 코딩하는 유전자를 갖는 헬퍼 파지로 감염시키고; e) 플라스미드의 적어도 일부를 함유하고 숙주를 형질전환시킬 수 있는 재조합 파지미드 입자를 형성하기에 적합하며, 미량 이하의 파지미드 입자가 입자의 표면 상에 융합 단백질의 2 이상의카피를 나타내도록 조절된 조건하에서 형질전환된 감염 숙주 세포를 배양하고; f) 파지미드 입자의 적어도 일부가 항원에 결합하도록 파지미드 입자와 적합한 항원을 접촉시키고; g) 결합하지 않는 파지미드 입자로부터 결합한 파지미드 입자를 분리하는 것을 수반한다. (d)에서 (g) 단계는 한차례 이상 반복될 수 있다. 이 방법에서는 플라스미드는 전사 조절 인자의 엄격한 조건 하에 있으며 배양 조건은 입자 표면에 상에 융합 단백질의 2 이상의 디스플레이하는 파지미드의 입자의 양 또는 수가 1% 미만이 되도록 조절하는 것이 바람직하다. 또한, 바람직하게는 융합 단백질의 2 이상의 카피를 디스플레이하는 파지미드 입자의 양은 융합 단백질의 단일 카피를 디스플레이하는 파지미드 입자의 양의 10% 미만이다. 가장 바람직하게는 그 양은 20% 미만이다. 일반적으로, 본 발명의 방법에서 발현 벡터는 폴리펩티드의 각 서브유닛을 코딩하는 DNA에 융합된 분비 시그날 서열을 추가로 포함할 것이며, 전사 조절 인자는 프로모터 시스템일 것이다. 바람직한 프로모터 시스템은 LacZ, λ_PL, tac, T7 폴리머라제, 트립토판 및 알칼리 포스파타제 프로모터 및 이들의 조합체로부터 선택된다. 또한 본 방법은 M13K07, M13R408, M13-VCS 및 Phi X 174로부터 선택된 헬퍼 파아지를 이용하는 것이 일반적이다. 바람직한 헬퍼 파아지는 M13K07이며, 바람직한 외피 단백질은 M13 파아지 유전자 III 외피 단백질이 다. 바람직한 숙주는 이. 콜라이 및 프로테아제 결핍된 이 콜라이 균주이다.

상기의 유사한 변이 유발법에 대한 자세한 내용은 예를 들어 Sambrook 등의 문헌(Molecular Cloning: A laborabory Manual(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) 및 Ausubel 등의 문헌(Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., eds., Wiley Interscience, 1991)과 같은 일반 교과서에서 찾아볼 수 있다.

"면역어드헤신"은 통상적으로 적합한 면역글로블린 불변 도메인 서열에 연결된 수용체 서열(면역어드헤신)로부터 제조된 키메라이다. 그의 구조는 업계에 공지되어있다. 문헌에 보고된 면역어드헤신은 T-세포 수용체^*[Gascoigne et. al., Proc. Natl. Acd. Sci. USA 84, 2936-2940 (1987)];CD4^*[Capon et al., Nature 337, 525-531 (1989); Traunecker et al., Nature 339, 68-70(1989); Zettmeissl et al., DNA Cell Biol. USA 9, 347-353 (1990); Byrn et al., Nature 344, 667-670(1990)]; L-셀렉틴(회귀성(homing) 수용체)[Watson et al., J. Cell. Biol. 110, 2221-2229 (1990); Watson et al., Nature 349, 164-167(1991)]; CD44^*[Aruffo et al., Cell 61, 1303-1313 (1990)]; CD28^* 및 B7^*[Linsley et al., J. Exp. Med. 173, 721-730(1991)]; CTLA-4^*[Lisley et al., J. Exp. Med. 174, 561-569 (1991)]; CD22^*[Stamenkovic et al., Cell 66. 1133-1144 (1991)]; TNF 수용체[Ashkenazi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 10535-10539 (1991); Lesslauer bet al., Eur. J. Immunol. 27, 2883-2886 (1991); Peppel et al., J. Exp. Med. 174, 1483-1489(1991)]; NP 수용체[Bennett et al., J. Biol. Chem 266, 23060-23067 (1991)]; IgE 수용체 α쇄^*[Ridgway 및 Gorman, J. Cell. Biol. 115, abstr. 1448 (1991); HGF 수용체[Mark, M. R. et al., 1992, J. Biol. Chem. submitted]의 융합체를 포함한다(^*표는 면역글로블린의 수퍼 패밀리의 일원을 나타냄).

또한, 리간드-면역글로블린 키메라는 예를 들어 미국 특허 제 5,304,640(L-셀렉틴 리간드); 5,316,921호 및 5,328,837호(HGF 변이체)에 공지되고 기재되어 있다. 이들 키메라는 수용체-면역글로블린 키메라를 제조와 유사한 방법으로 만들 수 있다.

본 발명의 TIE 리간드 상동체의 공유적 변형은 본원의 범위에 포함된다. 통상적으로, TIE 리간드 상동체의 표적 아미노산 잔기를 선택된 측쇄 또는 말단 잔기와 반응할 수 있는 유기 유도체화제와 반응시키거나, 선택된 재조합 숙주 세포내에서 기능을 하는 번역후 변형 기작을 작용하도록 함으로써 공유적 변형을 도입할 수 있다. 생성된 공유 유도체는 생물학적 활성, 면역분석법 또는 재조합체의 면역 친화 정제를 위한 항-TIE 리간드 상동체 제조에 중요한 잔기를 확인하는 프로그램에 유용하다. 예를 들어 닌히드린 반응후에 단백질의 생물학적 활성의 완전한 억제는 하나 이상의 아르기닐 또는 리이실 잔기가 활성에 중요하다는 것을 암시하며, 그 후에 선택된 조건하에서 변형된 개개의 잔기는 변형된 아미노산을 포함하는 펩티드 단편을 단리하여 확인된다. 이같은 변형은 업계에서는 일반적인 기술이며 과도한 실험없이 실행된다.

시스테이닐 잔기는 가장 통상적으로는 클로로아세트산 또는 클로로아세트아미드와 같은 α-할로아세테이트 (및 대응하는 아민)과 반응하여 카르복시메틸 또는 카르복시아미도메틸 유도체를 생성시킨다. 또한, 시스테이닐 잔기는 브로모트리플루오로아세톤, α-브로모-β-(5-이미도조일)프로피온산, 클로로아세틸 포스페이트, N-알킬말레이미드, 3-니트로-2-피리딜 이황화물, 메틸 2-피리딜 이황화물, p-클로로머큐리벤조에이트, 2-클로로머큐라-4-니트로페놀 또는 클로로-7-니트로벤조-2-옥사-1,3-디아졸과 반응하여 유도체화된다.

히스티딜 잔기는 디에틸피로카르보네이트가 히스티딜 측쇄에 비교적 특이적이기 때문에 이 물질과 pH 5.5-7.0에서 반응하여 유도체화된다. 파라-브로모펜아실 브로마이드도 유용하고, 반응은 pH 6.0에서 0.1 M 소듐 카코딜레이트 중에서 수행하는 것이 바람직하다.

리이시닐 및 아미노 말단 잔기는 숙신산 또는 다른 카르복실산 무수물과 반응한다. 이들 물질을 사용한 유도체화는 리이시닐 잔기의 전하를 역전시키는 효과를 갖는다. α-아미노 함유 잔기의 유도체화에 적합한 다른 시약은 이미도에스테르, 예를 들어 메틸 피콜린이미데이트, 피리독살 포스페이트, 피리독살, 클로로보로히드라이드, 트리니트로벤젠술폰산, O-메틸이소우레아, 2,4-펜탄디온 및 글리옥실레이트와의 트랜스아미나제-촉매화 반응을 포함한다.

아르기닐 잔기는 1개 또는 수개의 통상의 시약, 예를 들면 페닐글리옥살, 2,3-부탄디온, 1,2-시클로헥산디온 및 닌히드린과의 반응에 의해 변형된다. 아르기닌 잔기의 유도체화는 구아니딘 작용기의 높은 pKa 때문에 알칼리 조건에서 반응을 수행할 것을 필요로 한다. 또한, 이들 시약은 아르기닌 엡실론-아미노기 뿐만 아니라 리이신의 기들과 반응할 수 있다.

티로실 잔기의 특이적인 변형은 방향족 디아조늄 화합물 또는 테트라니트로메탄과 반응시켜 분광 표지를 티로실 잔기에 도입시킬 때 특히 만들어질 수 있다. 가장 일반적으로는, N-아세틸이미디졸 및 테트라니트로메탄을 사용하여 각각 O-아세틸 티로실 종 및 3-니트로 유도체를 형성한다. 티로실 잔기는 ¹²⁵I 또는 ¹³¹I를 사용하여 요오드화시켜 방사성면역 분석에 사용하기 위한 표지된 단백질을 제조한다.

카르복실 측쇄 (아스파르틸 또는 글루타밀)는 카르보디이미드 (R-N=C=N-R', 여기서 R 및 R'는 상이한 알킬기임), 예를 들어 1-시클로헥실-3-(2-모르폴리닐-4-에틸) 카르보디이미드 또는 1-에틸-3-(4-아조니아-4,4-디메틸펜틸)카르보디이미드와 반응시켜 선택적으로 변형된다. 또한, 아스파르틸 및 글루타밀 잔기는 암모늄 이온과의 반응에 의해 아스파라기닐 및 글루타미닐 잔기로 전환된다.

글루타미닐 및 아스파라기닐 잔기는 각각 대응하는 글루타밀 및 아스파르틸 잔기로 종종 탈아미드화된다. 별법으로, 이들 잔기는 약산성 조건 하에서 탈아미드화된다. 이들 잔기의 탈아미드화 형태는 본 발명의 범위에 포함된다.

다른 변형은 프롤린 및 리이신의 히드록실화, 세릴, 트레오닐 또는 티로실 잔기의 히드록실기의 인산화, 라이신, 아르기닌 및 히스티딘 측쇄의 α-아미노기의 메틸화 [T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)], N-말단 아민의 아세틸화 및 C-말단 카르복실기의 아미드화를 포함한다. 또한, 분자는 미국 특허 출원 제 07/275,296호 또는 미국 특허 제4,640,835호, 제4,496,689호, 제4,301,144호, 제4,670,417호, 제4,791,192호 또는 제4,179,337호에 개시된 방법으로 다양한 비단백질성 중합체, 예를 들면 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜 또는 폴리옥시알킬렌에 공유 결합될 수 있다.

이관능기 제제를 이용한 유도체화는 분석법 또는 친화도 정제시에 사용되는 수불용성 지지 매트릭스 또는 표면에 TIE 리간드 폴리펩티드를 가교결합시킬 때 뿐아니라 폴리펩티드와 TIE 리간드의 분자내 응집체를 제조하는 데에도 유용하다. 또한, 쇄간 가교 결합의 연구는 배열 구조에 대한 직접적인 정보를 제공한다. 일반적으로 사용되는 가교 결합제는 1,1-비스(디아조아세틸)-2-페닐에탄, 글루타르알데히드, N-히드록시숙신이미드 에스테르, 동종이관능기 이미도에스테르 및 이관능기 말레이미드가 있다. 메틸-3-[(p-아지도페닐)디티오]프로피오이미데이트와 같은 유도체화제는 빛이 존재할 경우 가교 결합을 형성할 수 있는 광활성화 가능한 중간체를 생성한다. 별법으로, 시아노겐 브로마이드 활성화된 탄수화물과 같은 반응성의 수불용성 매트릭스 및 미국 특허 제 3,959,642호; 3,969,287호; 3,691,016호; 4,195,128호; 4,247,642호; 4,229,537호; 4,055,635호; 및 4,330,440호에 기재된 시스템 반응성 기질은 단백질 고정화 및 가교 결합에 이용된다.

특정 번역후 변형은 발현된 폴리펩티드에 대한 재조합 숙주 세포의 작용의 결과이다. 글루타미닐 및 아스파라기닐 잔기는 번역 후에 각각 대응하는 글루타밀 및 아스파르틸 잔기로 종종 탈아미드화된다. 별법으로 이들 잔기는 약산성 조건하에서 탈아미드화된다. 이들 잔기의 탈아미드화 형태는 본 발명의 범위에 포함된다.

다른 번역 후 변형은 프롤린 및 리신의 히드록실화, 세릴, 트레오닐 또는 티로실 잔기의 히드록시기의 인산화, 리이신, 아르기닌 및 히스티딘 측쇄의 α-아미노기의 메틸화[T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)]가 있다.

다른 유도체는 비단백질성 중합체에 공유 결합된 본발명의 신규의 펩티드를 포함한다. 비단백질성 중합체는 대개 친수성의 합성 중합체, 즉 자연에서 발견되지 않는 중합체이다. 그러나 자연에 존재하면서 재조합 또는 시험관 내 방법으로 생산되는 중합체는 자연에서 단리된 중합체만큼 유용하다. 폴리비닐알콜 및 폴리비닐 피롤리돈과 같은 친수성의 폴리비닐 중합체는 본 발명의 범위에 속한다. 특히 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜과 같은 폴리비닐알킬렌 에테르가 유용하다.

TIE 리간드 상동체는 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리프로필렌 글리콜 또는 폴리옥시알킬렌과 같이 여러 비단백질성 중합체에 미국 특허 제4,640,835호, 제4,496,689호, 제4,301,144호, 제4,670,417호, 제4,791,192호 또는 제4,179,337호에 개시된 방법으로 결합될 수 있다. 본 발명의 면역어드헤신과 같은 이러한 변이체는 대응하는 천연 TIE 리간드보다 더 긴 반감기를 갖을 것으로 기대된다.

또한, TIE 리간드 상동체는 예를 들어 코아세르베이션(coascervation) 기술 또는 계면 중합, 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들어 리포좀, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐)에 또는 마크로에멀젼 중에 봉입될 수도 있다. 상기 기술은 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol A. Ed. (1980)]에 개시되어 있다.

B. 항 TIE 리간드 상동체 항체

본 발명은 TIE 리간드 상동체에 특이적으로 결합하는 작용제 및 길항제 항체를 포함한다. 항체는 단클론항체 또는 다클론항체일 수 있으며, 성숙 항체, 항체 단편(즉, Fab, F(ab')₂, Fv 등), 단쇄 항체 및 다양한 사슬의 조합(이에 제한되지 않음)을 포함한다.

용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되고, 구체적으로는 본 발명의 TIE 리간드 상동체에 특이적으로 결합하는 단일의 단클론항체(작용제, 길항제 및 중화 항체 포함)와 폴리에피토프 특이성을 갖는 항체 조성물을 포함한다.

본원에서 사용되는 용어 "단클론 항체"는 실질적으로 동종 항체들의 집단으로부터 얻은 항체를 의미하며, 즉, 집단을 이루는 개별적인 항체들은 소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연발생적 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 단클론 항체는 단일 항원 부위에 대해 유도되어 큰 특이성을 갖는다. 또한, 전형적으로 상이한 항원 결정기(에피토프)에 대해 유도되는 상이한 항체들을 포함하는 통상의 (다클론) 항체 제제와 대조적으로, 각각의 단클론 항체는 항원 상의 단일 결정기에 대해 유도된다.

본원에서 단클론 항체는 항체 단편(즉, Fab, F(ab')₂, Fv 등) 뿐만 아니라 기원이 되는 종 또는 면역 글로블린 종류 및 하위 종류에 관계없이, 항-TIE 리간드 상동체 항체의 가변(초가변 포함) 도메인을 불변 도메인 (예, "인간화(humanized)" 항체) 또는 중쇄를 포함한 경쇄 또는 다른 종의 사슬을 포함한 특정 종의 사슬 또는 이종 단백질과의 융합체로 스플라이싱하여 생성되는 하이브리드 및 재조합 항체를 포함한다[미국 특허 제 4,816,567 및 Mage et al., in Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp79-97(Marcel Dekker, Inc.: New York, (1987) 참조].

"단클론"은 항체의 특성이 실질적으로 항체들의 동종 집단으로부터 얻어지는 것을 나타내며, 어떠한 특정 방법으로 항체를 생산하는 것을 요구하는 것으로 해석되지 않는다. 예를 들면, 본 발명에 따라 사용되는 단클론 항체는 문헌 [Kohler and Milstein, Nature 256: 495 (1975)]에 처음 기재된 하이브리도마 방법에 의해 제조할 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법 (예를 들면, 미국 특허 제4,816,567호 참조)에 의해 제조할 수 있다. "단클론항체"는 또한 예를 들어 문헌 [McCafferty et al., Nature, 348: 552-554 (1990)]에 기재된 기술을 이용하여 생성된 파지 라이브러리로부터 단리할 수도 있다.

비인간 (예를 들면, 쥐) 항체의 "인간화" 형태는 비인간 면역글로블린으로부터 유래된 최소 서열을 포함하는 특이적 키메라 면역글로블린, 면역글로블린 사슬 또는 그의 단편 (예를 들면, Fv, Fab, Fab', F(ab')₂ 또는 항체의 다른 항원 결합 서열)이다. 대부분, 인간화 항체는 수여자의 상보성 결정 영역 (CDR)로부터의 잔기가 원하는 특이성, 친화도 및 능력을 갖는 마우스, 쥐 또는 토끼와 같은 비인간 종 (공여자 항체)의 CDR로부터의 잔기로 교체된 인간 면역글로블린 (수여자 항체)이다. 몇몇 경우, 인간 면역글로블린의 Fv 프레임워크 영역(FR) 잔기가 상응하는 비인간 잔기로 교체된다. 더욱이, 인간화 항체는 수여자 항체 또는 도입된 CDR 또는 프레임워크 서열에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수도 있다. 항체 성능을 더욱 개선시키고 최적화하기 위해 상기 변형을 실시할 수 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 영역이 비인간 면역글로블린에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역이 인간 면역글로블린 컨센서스 서열의 것인 하나 이상, 전형적으로 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이다. 또한, 인간화 항체는 최선으로 면역글로블린 불변 영역 또는 도메인(Fc), 전형적으로 인간 면역글로블린의 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 것이다.

본 발명의 TIE 리간드 상동체의 다클론 항체는 일반적으로 TIE 리간드 상동체 및 보조제를 다중 피하 (sc) 또는 복강내 (ip) 주사하여 동물 내에서 생성시킨다. TIE 리간드 상동체 또는 표적 아미노산 서열을 포함하는 단편을, 면역시키고자 하는 종에서 면역원성인 단백질, 예를 들면, 키홀 삿갓조개 (keyhole limpet) 헤모시아닌, 혈청 알부민, 소 타이로글로블린 또는 대두 트립신 억제제에, 이관능성 물질 또는 유도체화제, 예를 들면 말레이미도벤조일 술포숙신이미드 에스테르 ( 시스테인 잔기를 통해 결합), N-히드록시숙신이미드 (리이신 잔기를 통해), 글루타르알데히드, 숙신산 무수물, 티오닐 클로라이드 또는 R¹N=C=NR (여기서, R 및 R¹은 상이한 알킬기임)를 사용하여 결합시키는 것이 유용할 수 있다.

동물을, 예를 들면 1 ㎎ 또는 1 ㎍의 접합체 (각각 토끼 또는 쥐에 대해)를 3 부피의 프로인드 (Freund) 완전 보조액과 혼합하고, 그 용액을 다수 부위에 피내 주사함으로써 면역원성 접합체 또는 유도체에 대해 면역화시킨다. 1개월 후에, 동물을 원래의 양의 1/5 내지 1/10의 프로인드 완전 보조액 중의 접합체로 다수 부위에 피하 주사함으로써 부스팅시켰다. 7일 내지 14일 후, 동물을 출혈시키고, 혈청을 TIE 리간드 상동체 항체 역가에 대해 분석하였다. 역가가 정체 (plateau)될 때까지 동물을 부스팅시킨다. 바람직하게는, 동물을 상이한 단백질에 및(또는) 상이한 가교결합제를 통해 접합된, 동일 TIE 리간드 상동체의 접합체로 부스팅시킨다. 접합체는 또한 단백질 융합물로서 재조합 세포 배양에서 제조할 수 있다. 또한, 명반 (alum)과 같은 응집제는 면역 반응을 증진시키는데 적합하게 사용된다.

단클론 항체는 실질적으로 동종 항체들의 집단으로부터 얻으며, 즉, 집단을 이루는 개개의 항체들은 소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연발생적 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 따라서, "단일클론"이라는 수식어는 다른 항체와 혼합되지 않은 항체의 특성을 말한다. 예를 들어, 본 발명의 항-TIE 리간드 상동체 단클론 항체는 문헌 [Kohler & Milstein, Nature, 256: 495 (1975)]에서 처음 기술된 하이브리도마 방법을 사용하여 제조할 수 있거나, 재조합 DNA 방법 (Cabilly et al., 미국 특허 제4,816,567호)을 이용하여 제조할 수 있다.

하이브리도마 방법에서, 면역화를 위해 사용된 단백질에 특이적으로 결합할 항체를 생산하거나 생산할 수 있는 임파구를 유도하도록 마우스, 또는 햄스터와 같은 다른 적절한 숙주 동물을 상기한 바와 같이 면역화시킨다. 별법으로, 임파구를 시험관 내에서 면역화시킬 수 있다. 이어서, 임파구를 폴리에틸렌 글리콜과 같은 적합한 융합제를 사용하여 골수종 세포와 융합시켜 하이브리도마 세포를 형성시킨다 [Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)].

이렇게 제조한 하이브리도마 세포를 바람직하게는 비융합 골수종 모세포의 성장 또는 생존을 억제시키는 1종 이상의 물질을 함유하는 적합한 배지 중에 접종하고 배양시킨다. 예를 들면, 골수종 모세포가 하이포잔틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제 (HGPRT 또는 HPRT) 효소가 결핍된 경우, 하이브리도마용 배지는 전형적으로 하이포잔틴, 아미노프테린 및 티미딘 (HAT 배지)을 포함할 것이며, 이들 물질은 HGPRT-결핍 세포의 성장을 억제시킨다.

바람직한 골수종 세포는 효율적으로 융합하고, 선택된 항체 생산 세포에 의한 항체의 높은 수준의 안정한 생산을 지지하며, HAT 배지와 같은 배지에 감수성인 있는 것이다. 이들 중, 바람직한 골수종 세포주는 쥐 골수종 세포주, 예를 들면 솔크 인스티튜트 셀 디스트리뷰션 센터 (Salk Institute Cell Distribution Center; 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재)로부터 입수가능한 MOPC-21 및 MPC-11 마우스 종양 및 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (American Type Culture Collection, 미국 매릴랜드주 록빌)으로부터 입수가능한 SP-2 세포로부터 유래된 것이다. 인간 골수종 및 마우스-인간 헤테로골수종 세포주가 또한 인간 단클론 항체의 생산에 대해 기술되었다 [Kozbar, J. Immunol. 133: 3001 (1984); 및 Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)].

하이브리도마 세포가 성장하고 있는 배지를 TIE 리간드 상동체에 의해 유도된 단클론 항체의 생산에 대해 분석하였다. 바람직하게는, 하이브리도마 세포에 의해 생산된 단클론 항체의 결합 특이성을 면역침전법에 의해 또는 방사성면역분석법 (RIA) 또는 효소결합 면역흡수 분석법 (ELISA)과 같은 시험관내 결합 분석에 의해 측정하였다.

단클론 항체의 결합 친화도는 예를 들어 Munson & Pollard[Anal. Biochem.107:220 (1980)]의 스캐차드 분석법으로 결정된다.

원하는 특이성, 친화도 및(또는) 활성을 갖는 항체를 생산하는 하이브리도마 세포를 동정한 후, 한계 희석 절차에 의해 클론을 서브클로닝시키고 표준 방법으로 배양시켰다 [Goding, Monoclonal Antibodies: Principless and Practice, pp. 59-104 (Academic Press, 1986)]. 이러한 목적에 적합한 배지는 예를 들면, 둘베코 개질 이글 배지 또는 RPMI-1640 배지를 포함한다. 또한, 하이브리도마 세포는 동물에서 복수 종양으로서 생체내 배양시킬 수 있다.

서브클론에 의해 분비된 단클론 항체는 예를 들면, 단백질 A-세파로오스 (Sepharose), 히드록시아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 또는 친화도 크로마토그래피와 같은 통상의 면역글로블린 정제 절차에 의해 배지, 복수액 또는 혈청으로부터 적합하게 분리시킨다.

본 발명의 단클론 항체를 코딩하는 DNA는 통상의 절차를 이용하여 (예를 들면, 쥐의 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 이용하여) 쉽게 단리되고 서열결정된다. 본 발명의 하이브리도마 세포는 상기 DNA의 바람직한 공급원으로서 작용한다. 일단 단리되면, DNA는 발현 벡터 내로 넣을 수 있고, 이어서 면역글로블린 단백질을 생산하지 않는 원숭이 COS 세포, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포, 또는 골수종 세포와 같은 숙주 세포 내로 도입되어 재조합 숙주 세포에서 단클론 항체를 합성시킨다. DNA는 또한 예를 들어 상동성 쥐 서열을 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인 코딩 서열로 대체하거나 [Morrison et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 81: 6851 (1984)] 또는 비 면역 글로블린 폴리펩티드를 코딩하는 서열의 전체 또는 일부를 면역글로블린 코딩 서열에 공유적으로 연결시킴으로써 변형될 수 있다. 이러한 방법으로 항-TIE 리간드 단일클론 항체에 결합 특이성을 갖는 "키메라" 또는 "하이브리드" 항체가 제조된다.

일반적으로, 상기 비면역글로블린 폴리펩티드는 본 발명의 항체의 불변 도메인 대신에 대체되거나 또는 본 발명의 항체의 한 항원 결합 부위의 가변 도메인 대신에 대체되어 본 발명의 TIE 리간드 상동체에 대한 특이성을 갖는 하나의 항원 결합 부위 및 다른 항원에 대한 특이성을 갖는 다른 항원 결합 부위를 포함하는 키메라 이가 항체를 형성한다.

가교결합제와 관련된 방법을 비롯한 합성 단백질 화학에서 공지된 방법을 이용하여 시험관 내에서 키메라 또는 하이브리드의 항체를 제조할 수 있다. 예를 들어, 면역 독소는 디술피드 교환 반응을 이용하거나 티오에테르 결합을 형성하여 제조할 수 있다. 이러한 목적에 적합한 시약으로 이미노티올레이트 및 메틸-4-머캅토부티리미데이트가 있다.

진단에 적용하기 위해서, 본 발명의 항체는 전형적으로 검출 가능한 잔기로 표지된다. 검출 가능한 잔기는 직접 또는 간접적으로 검출 가능한 시그날을 만들 수 있는 것이면 무엇이든 될 수 있다. 예를 들어, ³H, ¹⁴C, ³²P, ³⁵S 또는 ¹²⁵I와 같은 방사선 동위원소, 플루오레신 이소티오시아네이트, 로다민 또는 루시페린과 같은 형광 또는 화학 발광성 화합물; 비오틴:¹²⁵I,³²P ,¹⁴C 또는 ³H와 같은 방사능 동위원소 표지; 또는 알칼리 포스파타아제, 베타-갈락토시다아제 또는 호스래디쉬 퍼옥시다아제와 같은 효소가 있다.

검출 가능한 잔기에 항체를 개별적으로 결합시키기 위한 방법으로, Hunter등[Nature 144:945(1962)] David 등[Biochemistry 13:1014(1974)], Pain 등[J. Immunol. Meth. 40:219(1981)] 및 Nygren등[J. Histochem. and Cytochem. 30: 407(1982)]이 기술한 방법을 포함한 모든 공지된 방법이 이용될 수 있다.

본 발명의 항체는 공지의 분석법, 예를 들어 경쟁적 결합 분석, 직접 및 간접 샌드위치 분석법 및 면역침전 분석법에 이용될 수 있다 [Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp. 147-158 (CRC Press, Inc. 1987)].

경쟁적 결합 분석은 제한된 양의 항체와 결합하기 위해 피검 시료 분석물(TIE 리간드 상동체)과 경쟁하는 표지된 표준물질(TIE 리간드 상동체 또는 그의 면역학적 활성 단편일 수 있음)의 능력에 좌우된다. 피검 시료 내의 TIE 리간드 상동체의 양은 항체에 결합하게 되는 표준물질의 양에 반비례한다. 결합되는 표준물질의 양의 결정을 용이하게 하기 위하여, 항체는 일반적으로 경쟁 전후에 불용화된다. 그 결과, 항체에 결합되는 표준물질과 피검 시료는 결합되지 않고 남아있는 표준물질과 피검 시료로부터 편리하게 분리될 수 있다.

샌드위치 분석법은 검출될 단백질의 상이한 면역원성 부분 또는 에피토프에 각각 결합할 수 있는 2개의 항체의 사용을 수반한다. 샌드위치 분석법에서, 분석될 피검 시료는 고상 지지체 상에 고정된 제1 항체에 의해 결합되고, 이어서 제2 항체는 피검 시료에 결합하여 불용성 3부분 복합체를 형성하게 된다 (Daivid & Greene, 미국 특허 제4,376,110호 참조). 제2 항체 자체는 검출가능한 잔기로 표지될 수 있거나 (직접 샌드위치 분석) 또는 검출가능한 잔기로 표지된 항-면역글로블린 항체를 사용하여 측정될 수 있다 (간접 샌드위치 분석). 예를 들어, 샌드위치 분석의 한 종류는 ELISA 분석법으로서, 이 경우 검출가능한 잔기는 효소이다.

비인간 항체를 인간화시키는 방법도 업계에 공지되어 있다. 일반적으로 인간화된 항체는 비인간인 공급원으로부터 도입된 1개 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 이러한 비인간 아미노산 잔기는 일반적으로 "수입" 가변 도메인으로부터 취한 "수입" 잔기로 종종 불리운다. 인간화는 본질적으로 Winter 및 공동 작업자의 방법 [Jones et al., Nature 321: 522-525 (1986); Riechman et al., Nature 332: 323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science 239: 1534-1536 (1988)]에 따라 인간 항체의 상응하는 서열을 설치류 CDR 또는 CDR 서열로 치환함으로써 행해질 수 있다. 따라서, 그러한 "인간화" 항체는 실질적으로 완전하지 않은 인간 가변 도메인을 비인간 종으로부터 얻은 상응하는 서열로 치환한 키메라 항체이다 (Cabilly, 상기 문헌). 실제로, 인간화된 항체는 전형적으로 설치류 항체 내의 유사 부위로부터 얻은 잔기로 치환된 몇몇 CDR 잔기 및 가능한 몇몇 FR 잔기를 갖는 인간의 항체이다.

항체는 항원에 대한 고친화도 및 다른 바람직한 생물학적 특성을 보유하도록 인간화되는 것이 더욱 중요하다. 이 목표를 위하여, 바람직한 방법에 따라서 인간화된 항체를 모서열 및 인간화된 서열의 3차원적 모델을 이용하는 모서열 및 각종 개념상의 인간화된 생성물의 분석 방법에 의해 제조한다. 3차원적 면역글로블린 모델은 당업계의 숙련인에게 일반적으로 이용가능하다. 선택된 후보 면역글로블린 서열의 3차원적 형태 구조를 추정적으로 예시하고 디스플레이하는 컴퓨터 프로그램을 이용할 수 있다. 이 디스플레이의 검사는 후보 면역글로블린 서열의 기능화에서의 잔기의 역할의 분석, 즉 그의 항원에 결합하는 후보 면역글로블린의 능력에 영향을 미치는 잔기의 분석을 가능하게 한다. 이 방법으로, FR 잔기는 켄센서스 및 수입 서열로부터 선택 및 결합될수 있으므로 표적 항원에 대한 증가된 친화도와 같이 원하는 항체 특성을 얻는다. 일반적으로, CDR 잔기는 직접적이고 가장 실질적으로 항원 결합에 영향을 주는데 관여한다. 더 자세한 내용은 1991. 6.14자 미국 출원 제 07/715.272호의 1992. 8.21자 일부 계속 출원인 미국 출원 제 07/934,373호를 참조한다.

또한, 이제는 면역화시에 내인성 면역글로블린 생성의 부재하에 완전한 레퍼토리의 인간 항체를 생산할 수 있는 유전자도입 동물 (예를 들어, 쥐)를 만들 수 있다. 예를 들면, 키메릭 및 세균 주 돌연변이 마우스 내의 항체 중쇄 연결 영역 (J_H) 유전자의 호모접합성 결실의 결과 내인성 항체 생산의 완전한 억제가 일어난다고 설명되어 있다. 그러한 세균 주 돌연변이 마우스 내의 인간 세균주 면역글로블린 유전자 배열을 이입한 결과로 항원 공격 시에 인간 항체가 생산될 것이다 [Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2551-255 (1993); Jakobovits et al., Nature 362: 255-258 (1993) 참조].

이중 특이성 항체는 바람직하게 인간 또는 인간화된, 두가지 이상의 다른 항원에 대해 결합 특이성을 갖는 단클론 항체를 말한다. 본 발명의 경우, 한 결합 특이성은 특정 TIE 리간드 상동체이고, 다른 하나는 그외의 항원, 바람직하게는 또다른 리간드이다. 예를 들어, 두가지 다른 TIE 리간드 상동체에 특이적으로 결합하는 이중 특이성 항체는 본 발명의 범위에 속한다.

이중특이적 항체의 제조 방법은 당업계에 공지되어 있다. 이중특이적 항체의 전통적인 재조합 제조 방법은 두 개의 중쇄가 다른 특이성을 갖는, 2개의 면역글로블린 중쇄-경쇄 쌍의 동시 발현에 기초한다 [Millstein and Cuello, Nature 305: 537-539 (1983)]. 면역글로블린 중쇄 및 경쇄의 무작위 분류 때문에, 이 하이브리도마 (콰드로마)는 그 중에서 하나만이 정확한 이중특이적 구조를 갖는 10가 지의 다른 항체 분자의 잠재적 혼합물을 생산한다. 일반적으로 친화도 크로마토그래피 단계에 의해 행해지는 정확한 분자의 정제는 오히려 번거럽고 생산율은 낮다. 유사한 절차는 국제 특허 출원 공개 WO 93/08829호 및 문헌 [Traunecker et al., EMBO J. 10: 3655-3659 (1991)]에 기술되어 있다.

더 바람직한 다른 방법에 따라서, 원하는 결합 특이성 (항체-항원 결합 부위)를 갖는 항체 가변 도메인은 면역글로블린 불변 도메인 서열에 융합된다. 융합은 바람직하게는 힌지의 적어도 일부를 포함하는 면역글로블린 중쇄 불변 도메인, CH2 및 CH3 영역과 이루어진다. 적어도 하나의 융합물에 존재하는, 경쇄 결합에 필수적인 부위를 포함하는 제1 중쇄 불변 영역 (CH1)을 갖는 것이 바람직하다. 면역글로블린 중쇄 융합물을 코딩하는 DNA 및 필요시에 면역글로블린 경쇄는 개별 발현 벡터에 삽입되고, 적합한 숙주 생물에 동시 형질감염된다. 이는 제조에 사용된 다른 비율의 3가지 폴리펩티드 사슬이 최적 수율을 제공할 때 실시 태양에서 3가지 폴리펩티드 단편의 상호 비율을 조절하는데 있어서 많은 유연성을 제공한다. 그러나, 동일한 비율의 2가지 이상의 폴리펩티드 사슬의 발현이 높은 수율을 나타내거나 또는 그 비율이 특별히 중요하지 않을 때 한 발현 벡터내에 2가지 또는 3가지 모두의 폴리펩티드 사슬에 대한 코딩 서열을 삽입할 수 있다. 이 방법의 바람직한 실시태양에서, 이중특이적 항체는 한 아암 내의 제1 결합 특이성을 갖는 하이브리드 면역글로블린 중쇄 및 다른 아암 내의 혼성 면역글로블린 중쇄-경쇄 쌍 (제2 결합 특이성을 제공함)으로 이루어진다. 이 비대칭 구조는 이중특이적 분자의 ½ 내에만 존재하는 면역글로블린 경쇄가 용이한 분리 방식을 제공하기 때문에 원하지 않는 면역글로블린 사슬 조합물로부터 원하는 이중특이적 화합물의 분리를 용이하게 하는 것으로 밝혀졌다. 이같은 접근은 1992. 8.17자 계속 출원 제07/931,811호에 기재되있다.

이중특이적 항체의 생산에 대한 더 상세한 내용은 문헌 [Suresh et al., Methods in Enzymology 121: 210 (1986)]을 참조하면 된다.

용어 "디아바디"는 동일한 폴리페티드 사슬 (V_H-V_L) 내의 경쇄 가변 도메인 (V_L)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (V_H)을 포함하는, 2개의 항원 결합 부위를 갖는 작은 항체 단편을 나타낸다. 동일한 사슬 상의 2개의 도메인 사이의 페어링을 허용하기에는 너무 짧은 링커를 사용하여, 도메인을 다른 사슬의 상보적인 도메인과 강제로 페어링시켜 2개의 항원 결합 부위를 생성시킨다. 디아바디는 예를 들면, 유럽 특허 제404,097호; 국제 특허 출원 공개 WO 93/11161호; 및 문헌 [Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993)]에 보다 상세하게 기재되어 있다.

"단리된" 항체는 위에서 정의된 단리된 폴리펩티드와 유사하게 정의된다. 특히 "단리된" 항체는 자연 환경의 성분으로부터 동정되고 분리 및(또는) 회수된 항체이다. 그의 자연 환경의 오염 성분은 항체의 진단 또는 치료 용도를 저해하는 물질이며, 효소, 호르몬 및 다른 단백성 또는 비단백성 용질을 포함할 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 항체는 1) 라우리 (Lowry)법으로 측정할 때 95 중량% 초과, 가장 바람직하게는 99 중량% 초과 항체 수준으로, 2) 스피닝 컵 (spinning cup) 서열 결정기를 사용하여 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 15 잔기 이상을 얻기에 충분한 정도로, 또는 3) 쿠마시 블루, 또는 바람직하게는 은 염색을 이용하여 환원 또는 비환원 조건 하에서 SDS-PAGE에 의해 균일하게 정제될 것이다. 단리된 항체는, 항체의 천연 환경의 하나 이상의 성분이 존재하지 않을 것이므로 재조합 세포 내에서 동일계내 항체를 포함한다. 그러나, 통상적으로 단리된 항체는 1회 이상의 정제 단계로 제조될 것이다.

본원에서 사용되는 용어 "표지"는 항체에 직접 또는 간접적으로 결합되는 검출가능한 화합물 또는 조성물을 의미한다. 표지는 자체로 검출될 수 있거나 (예를 들면, 방사성 동위원소 표지 또는 형광 표지), 또는 효소 표지의 경우, 검출가능한 기질 화합물 또는 조성물의 화학적 변형을 촉매할 수 있다.

본원에서 사용되는 "고상"은 본 발명의 항체가 부착할 수 있는 비수성 매트릭스를 의미한다. 본원에 포함되는 고상의 예는 부분적으로 또는 전체가 유리 (예를 들면, 조절된 다공성 유리), 다당류 (예를 들면, 아가로스), 폴리아크릴아미드, 폴리스티렌, 폴리비닐 알콜 및 실리콘으로 형성된 것을 포함한다. 문맥에 따라 몇몇 실시태양에서, 고체 상은 분석 플레이트의 웰을 포함할 수 있고; 다른 경우에 그것은 정제 컬럼 (예를 들면, 친화도 크로마토그래피 컬럼)이다. 이 용어는 또한 미국 특허 제4,275,149호에 기재된 바와 같은 별개 입자의 불연속 고체 상을 포함한다.

"리포좀"은 약물 (예를 들면, 본원에 기재된 항-ErbB2 항체 및 임의로 화학요법제)을 포유동물에 전달시키는데 유용한 다양한 유형의 지질, 인지질 및(또는) 계면활성제로 이루어진 작은 소낭(vesicle)이다. 리포좀의 성분들은 통상 생물학적 막의 지질 배열과 유사한, 이중막 구조로 배열된다.

항체 "작용제" 및 "길항제"는 위에서 정의된 바와 같다.

이종결합 항체 또한 본 발명의 범위에 속한다. 이종결합 항체는 공유결합된 두 개의 항체로 구성된다. 이러한 항체는 예를 들어 원하지 않는 세포에 대한 면역 체계 세포의 표적화(미국 특허 제 4,676,980호) 및 HIV 감염 치료(PCT 출원 공개 WO 91/00360 및 WO92/200373; EP 03089)를 위해 제안되었다. 이종결합 항체는 간편한 가교 결합 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 적합한 가교결합제는 업계에 공지되어 있으며 많은 가교 결합 기술과 함께 미국 특허 제 4,565,980호에 기재되어 있다.

"단쇄 Fv" 또는 "sFv" 항체 단편은 도메인이 단일 폴리펩티드 사슬에 존재하는, 항체의 V_H 및 V_L 도메인을 포함한다. 바람직하게, Fv 폴리펩티드는 sFv가 항원 결합을 위한 바람직한 구조를 형성하도록 하는 V_H 및 V_L 도메인 사이의 폴리펩티드 링커를 추가로 포함한다. sFv에 대한 내용은 문헌 [Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg 및 Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)]을 참조하면 된다.

C. TIE 리간드 상동체의 클로닝 및 발현

용어 "세포", "세포주" 및 "세포 배양물"은 상호교환가능하게 사용되고, 그러한 모든 명칭은 자손을 포함한다. 또한 모든 자손은 인위적 또는 우연적 돌연변 이로 인해 DNA 함량이 정확하게 동일하지 않을 수 있으리라 이해된다. 처음 형질전환된 세포에서 스크리닝되는 바와 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이 자손이 포함된다.

용어 "복제가능한 발현 벡터" 및 "발현 벡터"는 외래 DNA의 단편이 그것에 삽입될 수 있는, 일반적으로 이중 가닥의 DNA의 단편을 의미한다. 외래 DNA는 숙주 세포에서 천연적으로 발견되지 않는 DNA인 이종 DNA로서 정의된다. 발현 벡터는 적합한 숙주 세포로 외래 또는 이종 DNA를 수송하는데 이용된다. 일단 숙주 세포내에 있으면, 벡터는 숙주 염색체 DNA와 독립적으로 복제할 수 있으며 벡터의 몇개의 카피 및 그의 삽입된 (외래) DNA가 생성될 수 있다. 또한, 벡터는 외래 DNA를 폴리펩티드로 번역되도록 하는 필수적인 성분을 포함한다. 따라서, 외래 DNA에 의해 코딩되는 많은 폴리펩티드 분자가 빠르게 합성될 수 있다.

발현 및 클로닝 벡터는 업계에 공지되어 있으며 벡터가 하나 이상의 선택 숙주 세포에서 복제할 수 있는 핵산 서열을 포함한다. 1) DNA 증폭 또는 DNA 발현을 위해 사용되는지의 여부, 2) 벡터에 삽입될 DNA의 크기, 3) 벡터로 형질전환시킬 숙주 세포에 따라 적합한 벡터가 선정된다. 각 벡터는 그 기능(DNA 증폭 또는 DNA 발현)과 적합한 숙주 세포에 따라 여러 구성 요소를 포함한다. 일반적으로, 벡터 성분은 시그날 서열, 복제 기점, 하나 이상의 마커 유전자, 인핸서 성분, 프로모터 및 전사 종결 서열 중 하나 이상을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.

(i) 시그날 서열 성분

일반적으로, 신호서열은 벡터의 성분이거나, 벡터에 삽입될 TIE 리간드 상동 체 분자의 일부분일 수 있다. 신호서열이 이종일 경우에는, 숙주 세포에 의해 인지되고 처리(시그날 펩티다아제에 의해 절단)될 수 있는 것으로 선택되야 한다.

원핵의 숙주 세포에 적합한 이종의 신호 서열은 α-아밀라아제, ompA, ompC, ompE, ompF, 알카리 포스파타아제, 페니실리나아제, lpp 또는 열안정한 엔테로톡신 II 리더와 같은 원핵 신호 서열이 바람직하다. 효모 분비의 경우, 예를 들어 효모 인버타아제, 아밀라아제, 알파 인자 또는 산 포스파타아제 리더가 사용될 수 있다. 포유 동물 세포 발현의 경우 포유동물의 신호 서열이 가장 적합하다. 열거된 신호 서열은 단지 예시일 뿐, 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

(ii) 복제 기점 성분

발현 및 클로닝 벡터 모두는 벡터가 1종 이상의 선택된 숙주 세포에서 복제가능하도록 만드는 핵산 서열을 함유한다. 일반적으로, 클로닝 벡터에서 상기 서열은 벡터가 숙주 세포의 염색체 DNA와 독립적으로 복제할 수 있도록 만드는 서열이고, 복제 기점 또는 자동 복제 서열을 포함한다. 이러한 서열은 다양한 세균, 효모 및 바이러스에 대해 공지되어 있다. 잘 알려진 플라스미드 pBR322로부터의 복제 기점은 대부분의 그람 음성 세균에 적합하고, 2μ 플라스미드 기점은 효모에 적합하고, 다양한 바이러스 기점 (SV40, 폴리오마, 아데노바이러스, VSV 또는 BPV)은 포유동물 세포의 클로닝 벡터에 유용하다. 복제 기점은 포유동물 발현 벡터에 필요하지 않다 (SV40 기점은 단지 초기 프로모터를 함유하기 때문에 일반적으로 사용될 수 있다). 대부분의 발현 벡터는 "셔틀(shuttle)" 벡터, 즉 한 분류이상의 유기체에서 복제할 수 있으나 발현시 또다른 유기체에 형질감염될 수 있는 벡터이 다. 예를 들어, 벡터는 이. 콜라이에 클로닝되고, 발현시에 숙주 세포 염색체와 독립적으로 복제할 수 없다고 하더라도 같은 벡터가 효모 또는 표유 동물 세포로 형질감염된다.

DNA를 숙주 게놈으로 삽입시켜 클로닝할 수 있다. 이 방법은 숙주세포로 바실러스 균주를 이용하여, 예를 들어 벡터 DNA 내에 바실러스 게놈 DNA에서 발견되는 서열과 상보적인 DNA 서열을 포함시킴으로써 가능하다. 이 벡터를 바실러스에 형질감염시키면 게놈과 동종의 재조합을 통해 원하는 이종의 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 삽입시킬 수 있다. 그러나, 코딩되는 폴리펩티드 분자를 절단하기 위해서는 제한 효소 절단이 필요하기 때문에, 게놈 DNA의 회수는 외재적으로 복제하는 벡터를 회수하는 것보다 복잡하다.

(iii) 선택 유전자 성분

발현 및 클로닝 벡터는 선택가능한 마커로도 불리우는 선택 유전자를 함유해야만 한다. 이것은 벡터로 형질전환된 숙주세포의 생존 또는 성장을 위해 필요한 단백질을 코딩하는 유전자이다. 이같은 유전자의 존재는 벡터를 갖지 않은 숙주 세포가 형질 전환된 숙주에 비해 성장 또는 번식하는 데 잇점을 얻지 못하도록 한다. 대표적인 선택 유전자, 예를 들어 바실러스 (Bacillus)의 경우 D-알라닌 라세마제를 코딩하는 유전자는 (a) 항생제 또는 다른 독소, 예를 들어 암피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트 또는 테트라사이클린에 내성을 부여하는 단백질, (b) 영양요구성 결함을 보완하는 단백질 또는 (c) 예를 들어 바실러스의 D-알라닌 라세마아제를 코딩하는 유전자와 같이 복합 배지로부터 이용할 수 없는 중요한 영양물질을 공급하는 단백질을 코딩한다.

선택 개요의 일례는 숙주 세포의 성장을 정지시키는 약물을 이용한다. 이종의 유전자로 성공적으로 형질전환된 세포는 약물 내성을 부여하는 단백질을 발현하여 선택 과정에서 생존하게 된다. 이러한 우성 선택의 예는 약물 네오마이신[Southern et al.,J. Molec. Appl. Genet. 1, 327(1982)], 마이코페놀산[Mulligan et al., Science 209, 1422(1980)] 및 하이그로마이신[Sudgen et al., Mol.Cel. Biol. 5, 410-413(1985)]을 사용한다. 위에서 언급한 세가지 예는 적합한 약제 G418 또는 네오마이신(제네티신), xgpt(마이코페놀산) 또는 하이그로마이신 각각에 대해 저항성을 전달하기 위해서 진핵의 조절하에서 세균의 유전자를 이용한다. 포유 동물 세포에 적합한 선택 마커는 디히드로폴레이트 러덕타아제(DHFR) 또는 티미딘 키나아제이다. 이들 마커로 원하는 핵산을 수용할 수 있는 세포를 동정할 수 있다. 포유 동물세포 형질 전환체는 마커를 받아들인 형질 전환체만이 살아남도록 하는 선택 조건하에 놓이게 된다. 배지내의 선택제의 농도가 연속적으로 변화되는 조건하에서 배양함으로써 선택 유전자와 목적하는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA의 증폭을 유도하도록 하는 선택조건을 부과시킨다. 성장에 중요한 단백질 생산이 더 많이 요구되어지는 유전자가 재조합 세포의 연속되는 세대의 염색체 내에서 일렬로 반복되어지는 과정을 증폭이라고 한다. 목적하는 폴피펩티드의 증가는 증폭된 DNA로 부터 합성된다.

예를 들어, DHFR 선택 유전자로 형질전환된 세포는 하이포잔틴, 글리신 및 티미딘이 결핍된 배양 배지에서 모든 형질전환체를 배양함으로써 우선 동정된다. 이 경우 적합한 숙주 세포는 Urlaub 및 Chasin[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4216 (1980)]의 기재에 따라 제조되고 증식된 DHFR 활성이 결여된 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포주이다. 특히 유용한 DHFR은 MTX에 높은 저항성을 갖는 변이 DHFR(EP 117,060)이다. 이 선택제는 다른 적합한 숙주, 예를 들어 ATCC No. CCL61 CHO-K1 에 내인성 DHFR의 존재와 무관하게 사용될 수 있다. 이어서, 각각의 DHFR 및 목적하는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA는 DHFR을 불활성화시키는 약제(메토트렉세이트, 또는 MTX)에 노출시킴으로써 증폭된다. 세포는 계속적으로 더 높은 MTX 농도에서 성장할 수 있는 세포만을 선택함으로써 더 많은 양의 DHFR을 요구(결과적으로 모든 내인성 DNA를 증폭한다)한다는 것이 확인될 것이다. 별법으로, 목적하는 폴리펩티드, 야생형 DHFR 단백질 및 다른 선택가능한 마커, 예를 들어 네오 유전자로 동시 형질전환된 숙주 세포는 G418와 같은 선택 가능한 마커를 선택제로 이용하여 동정될 수 있으며 내인성 DHFR을 포함하는 야생형 숙주세포에 메토트렉세이트를 이용하여 선택, 증폭될 수 있다 (미국 특허 제4,965,199호).

효모에 사용하기 적합한 선택 유전자는 효모 플라스미드 Yrp7에 존재하는 trp1 유전자이다 [Stinchcomb et al., Nature, 282: 39 (1979), Kingsma et al., Gene 7:141: 또는 Tschemper et al., 1980, Gene 10: 157]. trp1 유전자는 트립토판 중에서의 성장능이 결여된 효모의 변이주, 예를 들어 ATCC 44076 또는 PEP4-1에 대한 선택 마커를 제공한다 [Jones, Genetics, 85: 12 (1977)]. 효모 숙주 세포 게놈내의 trp1 손상의 존재는 트립토판 부재하의 성장에 의해 형질전환을 검출하기에 효과적인 환경을 제공한다. 이와 유사하게, Leu2-결여 효모 균주 (ATCC 20,622 또는 38,626)는 Leu2 유전자를 함유하는 공지의 플라스미드로 보완된다.

(iv) 프로모터 성분

클로닝 벡터와는 다르게 발현벡터는 숙주 생물에 의해 인식되고 목적하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 프로모터를 함유한다. 프로모터는 구조 유전자의 개시코돈의 상류(일반적으로 약 100 내지 1000 bp 내에)에 위치하는 서열로 이들의 조절하에 있는 핵산의 전사 및 번역을 조절하는 비번역 서열이다. 이들은 대표적으로 두가지 종류, 유도 가능한 프로모터와 구성 프로모터가 있다. 유도 가능한 프로모터는 배양 조건 예를 들어 영양소의 유무에 있어서 또는 온도의 변화에 반응하여 그들의 조절하에 있는 DNA의 전사 수준을 증가를 개시할 수 있는 프로모터이다. 이때에 다양한 효과있는 숙주세포에 의해 인지되는 많은 프로모터가 공지되어 있다. 이들 프로모터를 제한 효소 절단으로 기점의 유전자로부터 분리하고, 발현될 폴리펩티드의 개시코돈의 5'에 삽입하여 목적하는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA에 작동 가능하게 연결할 수 있다. TIE 리간드 상동체의 게놈의 프로모터가 사용 가능하지 않은 것은 아니다. 그러나, 일반적으로 이종의 프로모터가 천연 TIE 리간드 프로모터에 비해 더 많은 양의 전사와 발현된 TIE 리간드 상동체의 고수율을 가져올 것이다.

원핵생물 숙주에 사용하기에 적합한 프로모터는 β-락타마제 및 락토스 프로모터 시스템[Chang et al., Nature 275:615 (1978); 및 Goeddel et al., Nature 281, 544 (1979)], 알카리 포스파타아제, 트립토판(trp) 프로모터 시스템[Goeddel, Nucleic Acids Res. 8 : 4057 (1980) 및 EPO Appln. Publ. No. 36776] 및 혼성 프 로모터, 예를 들어 tac 프로모터[H. de Boer et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 80: 21-25 (1983)]. 그러나, 다른 공지의 세균 프로모터도 적합하다. 이들 뉴클레오티드 서열은 공지되었으며, 따라서 숙련자가 그들과 TIE 리간드 상동체를 코딩하는 DNA를 원하는 제한 효소 위치를 제공하는 링커 또는 아댑터를 이용하여 라이게이션할 수 있다[Siebenlist et al., Cell 20: 269 (1980)]. 또한, 세균계에 사용하기 위한 프로모터는 TIE 리간드 상동체를 코딩하는 DNA에 작동가능하게 연결된 샤인-달가노 (S.D.) 서열을 포함할 것이다.

효모 숙주에 사용하기 적합한 프로모터 서열의 예는 3-포스포글리세레이트 키나제[Hitzeman et al. J. Biol. Chem. 255: 2073 (1980)] 또는 다른 당분해 효소[Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7: 149 (1978); 및 Hollan, Biochemistry 17: 4900 (1978)], 예를 들어 에놀라제, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제, 헥소키나제, 피루베이트 데카르복실라제, 포스포프럭토키나제, 글루코스-6-포스페이트 이소머라제, 3-포스포글리세레이트 뮤타제, 피루베이트 키나제, 트리오스포스페이트 이소머라제, 포스포글루코스 이소머라제 및 글루코키나제에 대한 프로모터를 포함한다.

성장 조건에 의해 조절되는 추가의 전사 잇점을 갖는 유도가능한 프로모터인 다른 효모 프로모터는 알코올 데히드로게나제 2, 이소시토크롬 C, 산 포스파타제, 질소 대사에 관련된 분해 효소, 메탈로티오네인, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제 및 말토스 및 갈락토스 이용에 작용하는 효소에 대한 프로모터 영역이다. 효모 발현에 사용하기에 적합한 벡터 및 프로모터는 추가로 EP 73,657호 (Hitzeman et al.)에 기재되어 있다. 또한, 효모 인핸서는 효모 프로모터와 함께 유리하게 사용된다.

진핵생물을 위한 프로모터 서열도 공지되어 있다. 실질적으로, 모든 진핵세포 유전자는 전사 개시 부위로부터 약 25 내지 30 염기 상류에 위치한 AT 풍부 영역을 갖는다. 많은 유전자의 전사 개시 부위로부터 70 내지 80 염기 상류에서 발견되는 다른 서열은 CXCAAT 영역 (여기서 X은 임의의 뉴클레오티드일 수 있음)이다. 대부분의 진핵세포 유전자의 3' 말단에서 폴리 A 테일의 코딩 서열 3' 말단으로의 부가를 위한 시그날일 수 있는 AATAAA 서열이 존재한다. 이들 모든 서열은 포유동물 발현 벡터에 적합하게 삽입된다.

포유동물 숙주 세포에서의 벡터로부터의 TIE 리간드 상동체 전사는 바이러스, 예를 들어 폴리오마 바이러스, 계두 바이러스(1989. 7. 5 공보된 UK 2,211,504) 아데노바이러스 (예를 들어 아데노바이러스 2), 소 유두종 바이러스, 조류 육종 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 레트로바이러스, B형 간염 바이러스, 가장 바람직하게는 원숭이 바이러스 40 (SV40)의 게놈으로부터, 이종 포유동물 프로모터, 예를 들어 액틴 프로모터 또는 면역글로블린 프로모터로부터, 열 충격 프로모터로부터 얻어진, 숙주 세포계에 적합성인 프로모터에 의해 조절된다.

SV40 바이러스의 초기 및 후기 프로모터는 SV40 바이러스 복제 기점을 포함하는 SV40 제한 단편으로서 편리하게 얻어진다[Fiers et al., Nature 273: 113 (1978), Mulligan and Berg, Science 209, 1422-1427 (1980); Pavlakis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 7398-7402 (1981)]. 인간 사이토메갈로바이러스 의 즉시 초기 프로모터는 HindIII E 제한 단편으로서 편리하게 얻어진다[Greenaway et al., Gene 18, 355-360 (1982)]. 소 유두종 바이러스를 벡터로서 사용하여 포유동물 숙주에서 DNA를 발현하기 위한 시스템은 미국 특허 제4,419,446호에 개시되어 있다. 상기 시스템의 변형은 미국 특허 제4,601,978호에 기재되어 있다. 또한, 인간 면역 인터페론을 코딩하는 cDNA는 원숭이 세포에서 발현[Gray et al., Nature 295, 503-508 (1982)]되며, 인간 β-인터페론 cDNA는 단순 포진 바이러스로부터의 티미딘 키나제 프로모터의 조절 하에 마우스 세포에서 발현된다[Reyes et al., Nature 297, 598-601 (1982)]. 또한, 인간 인터페론 β1 유전자는 배양된 마우스 및 토끼 세포에서 발현[Canaani and Berg, Proc. NAtl. Acad. Sci. USA 79, 5166-5170 (1982)]되며, 라우스(Rous) 육종 바이러스의 긴 말단 반복체를 프로모터로서 사용하여 CV-1 원숭이 신장 세포, 닭의 배 섬유아세포, 차이니즈 햄스터 난소 세포, 헬라 세포 및 마우스 HIN-3T3 세포에서 세균의 CAT 서열이 발현[Gorman et al., Proc Natl. Acad. Sci., USA 79, 6777-6781 (1982)]된다.

(v) 인핸서 인자 성분

고등 진핵세포에 의한 본 발명의 TIE 리간드 상동체를 코딩하는 DNA의 전사는 인핸서 서열을 벡터에 삽입함으로써 종종 증가된다. 인핸서는 전사를 증가시키는 프로모터에 작용하는 대개 10 내지 300 bp의 시스-액팅(cis-acting) 인자이다. 인핸서는 전사 단위의 5'[Laimins et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 993 (1981)] 및 3'[Lasky et al., Mol. Cel. Biol. 3, 1108 (1983)], 코딩 서열 자체 내[Osborne et al., Mol. Cel. Biol. 4, 1293 (1984)]뿐만 아니라 인트론 내 [Banerji et al., Cell 33, 729 (1983)]에 상대적으로 관계없는 방향 및 위치에서 발견된다. 이제는, 많은 인핸서 서열이 포유동물 유전자 (글로빈, 엘라스타제, 알부민, α-페토단백질 및 인슐린)로부터 알려져 있다. 그러나, 일반적으로 진핵세포 바이러스로부터 유래한 인핸서를 사용할 것이다. 그 예는 복제 기점의 뒷부분 상의 SV40 인핸서 (bp 100-270), 사이토메갈로바이러스 초기 프로모터 인핸서, 복제 기점의 뒷부분 상의 폴리오마 인핸서 및 아데노바이러스 인핸서를 포함한다. 진핵세포 프로모터의 활성화를 위한 인핸서 성분에 대해서는 문헌 [Yaniv, Nature, 297: 17-18 (1982)]을 참조하면 된다. 인핸서는 항체 코딩 서열에 5' 또는 3' 위치에서 벡터에 스플라이싱될 수 있지만, 프로모터로부터 5' 부위에 위치하는 것이 바람직하다.

(vi) 전사 종결 성분

진핵 숙주 세포 (효모, 진균, 곤충, 식물, 동물, 인간 또는 다른 다세포 생물로부터 유래한 응집 세포)에 사용되는 발현 벡터는 전사 종결 및 mRNA 안정화에 필요한 서열을 포함할 것이다. 이들 서열은 통상적으로 진핵세포 또는 바이러스 DNA 또는 cDNA의 5' 및 때로는 3' 비번역 영역으로부터 확보된다. 이들 영역은 TIE 리간드 상동체를 코딩하는 mRNA의 비번역 부분에서 폴리아데닐화 단편으로서 전사되는 뉴클레오티드 세그먼트를 함유한다. 또한, 3' 비번역 영역은 전사 종료 부위를 포함한다.

앞에서 열거된 성분중 하나 이상, 목적하는 코딩 및 조절 서열을 포함하는 적합한 벡터의 제조는 표준 라이게이션 기술을 이용한다. 단리된 플라스미드 또는 DNA 단편은 필요한 플라스미드를 만들기에 필요한 형태로 절단되고, 맞추어지고 다시 라이게이션된다.

제조된 플라스미드 내에 정확한 서열을 확인하기 위한 분석법으로, 라이게이션 혼합물을 이용하여 이. 콜라이 K12 균주 294 (ATCC 31,446)를 형질전환시켜 암피실린 또는 테트라사이클린 저항성으로 성공적인 형질전환체를 선별한다. 형질전환체로 터 플라스미드를 제조하여 제한 엔도뉴클리아제 절단 분석 및(또는) Messing 등[Nucleic Acids Res. 9: 309 (1981)] 또는 Maxam 등[Meth. Enzymol. 65: 499 (1980)]에 의해 기재된 방법에 의해 염기서열 분석을 수행한다.

본 발명을 실시하는 데 있어서, TIE 리간드 상동체를 코딩하는 DNA를 포유동물 세포에서 일시적으로 발현을 제공하는 발현벡터가 특히 유용하다. 일반적으로, 일시적인 발현은 숙주 세포내에서 효율적으로 복제할수 있는 숙주세포와 관련된다. 따라서, 숙주세포는 많은 카피의 발현 벡터를 축적하여 발현 벡터에 의해 코딩되는 목적하는 폴리펩티드를 고수준으로 합성한다. 적합한 발현 벡터와 숙주 세포를 포함하는 일시적인 시스템은 생물학적으로 또는 생리학적인 특성을 갖는 목적하는 폴리펩티드의 빠른 스크리닝과 클론 DNA에 의해 코딩되는 폴리펩티드의 간편한 양성 동정을 가능하게 한다. 따라서, 일시적인 발현 시스템은 특히 TIE 리간드 상동체의 유사체와 변이체의 동정을 목적으로하는 발명에 특히 유용하다.

재조합 척추 동물 세포 배양에서 TIE 폴리펩티드의 합성에 적응하기 위해 적합합 다른 방법, 벡터 및 숙주 세포는 문헌[Getting et al., Nature 293, 620-625 (1981); Mantel et al., Nature 281, 40-46 (1979); Levinson et al.; EP 117,060 및 EP 117,058]에 기재되어 있다. TIE 리간드 폴리펩티드의 포유 동물 세포 배양 발현을 위해 특히 유용한 플라스미드는 pRK5(EP 307,247) 및 그의 유도체 예를 들어 sp6 전사 개시 위치에 이어 SfiI 제한 효소 부위, Xho/NotII cDNA 클로닝 위치를 갖는 pRK5D 및 SFiI 위치를 포함하지 않는 pRK5D의 전구체인 pRD5B이다[Holmes et al., Science 253, 1278-1280 (1991) 참조].

(vii) 벡터의 제조 및 분석

앞에서 열거된 성분중 하나 이상을 포함하는 적합한 벡터의 제조에 표준 라이게이션 기술을 이용한다. 단리된 플라스미드 또는 DNA 단편은 필요한 플라스미드를 만들기에 필요한 형태로 절단되고, 맞추어지고 다시 라이게이션된다.

제조된 플라스미드 내에 정확한 서열을 확이하기 위한 분석법으로, 라이게이션 혼합물을 이용하여 이. 콜라이 K12 균주 294 (ATCC 31,446)를 형질전환시켜 암피실린 또는 테트라사이클린 저항성으로 성공적인 형질전환체를 선별한다. 형질전환체로 부터 플라스미드를 제조하여 제한 엔도뉴클리아제 절단 분석 및(또는) Messing 등[Nucleic Acids Res. 9: 309 (1981)] 또는 Maxam 등[Meth. Enzymol. 65: 499 (1980)]에 의해 기재된 방법에 의해 염기서열 분석을 수행한다.

(viii) 일시적인 발현 벡터

본 발명을 실시하는 데 있어서, TIE 리간드를 코딩하는 DNA를 포유동물 세포에서 일시적으로 발현하는 발현벡터가 특히 유용하다. 일반적으로, 일시적인 발현은 숙주 세포 내에서 효율적으로 복제할 수 있는 발현 벡터의 사용을 포함한다. 따라서, 숙주 세포는 많은 카피의 발현 벡터를 축적하여 발현 벡터에 의해 코딩되 는 목적하는 폴리펩티드를 고수준으로 합성한다(Sambrook et al., 동문헌. pp 16.17-16.22). 적합한 발현 벡터와 숙주 세포를 포함하는 일시적인 발현 시스템은 목적하는 생물학적 또는 생리학적 특성을 갖는 폴리펩티드의 간편한 양성 스크리닝 가능하게 한다. 따라서, 일시적인 발현 시스템은 원하는 생물학적 활성을 갖는 천연 TIE 리간드 상동체의 유사체와 변이체의 동정을 목적으로 하는 본 발명에 특히 유용하다.

(xi) 척추 동물 세포 벡터의 적합한 예

재조합 척추 동물 세포 배양에서 TIE 리간드 상동체(천연 단백질의 기능적 유도체 포함)의 합성에 적용하기 적합한 다른 방법, 벡터 및 숙주 세포는 문헌[Getting et al., Nature 293, 620-625 (1981); Mantei et al., Nature 281, 40-46 (1979); Levinson et al.; EP 117,060 및 EP 117,058]에 기재되어 있다. TIE 리간드 상동체의 포유 동물 세포 배양 발현을 위해 특히 유용한 플라스미드는 pRK5(EP 307,247) 및 pSV16B (PCT Publication No. WO 91/08291)이다.

본원에서 벡터의 클로닝 또는 발현에 적합한 숙주 세포는 원핵 세포, 효모 또는 상기에서 기재된 고등 진핵 세포이다. 적합한 원핵 생물은 그람 음성 또는 그람 양성 유기체, 예를 들어 이. 콜라이 또는 바실러스이다. 이. 콜라이 B, 이. 콜라이 X1776 (ATCC 31,537), 이. 콜라이 W3110(ATCC 27,325), 슈도모나스 종 또는 세라티아 마르세산스(Serratia marcesans)과 같은 다른 그람 음성 또는 양성 원핵 생물도 적합하지만, 이. 콜라이 294 (ATCC 31,446)가 바람직한 클로닝 숙주이다.

원핵세포 외에, 섬유상 진균 또는 효모와 같은 진핵 미생물이 본원의 벡터의 클로닝 또는 발현 숙주로서 적합하다. 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae) 또는 통상의 제빵 효모가 하등 진핵 숙주 미생물 중에서 가장 일반적으로 사용된다. 그러나, 많은 다른 속, 종 및 균주, 예를 들어 에스. 폼베 (S. pombe) [Beach and Nurse, Nature 290, 140 (1981)]; 클루이베로마이세스 락티스 (Kluyveromyces lactis) [Louvencourt et al., J. Bacteriol. 737 (1983)]; 야로위아 (yarrowia) (EP 402,226); 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris) (EP 183,070); 트리코데르마 레에시아(Trichoderma reesia) (EP 244,234); 뉴로스포라 크라사 (Neurospora crassa)[Case et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 5259-5263 (1979)]; 및 아스퍼길러스 (Aspergillus) 숙주, 예를 들어 에이. 니둘란스 (Nidulans)[Ballance et al., Biochem. Biophy. Res. Commun. 112, 284-289 (1983)]; Tilburn et al., Gene 26, 205-221 (1983); Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 1470-1474 (1984)] 및 에이. 니게르 (niger)[Kelly and Hynes, EMBO J. 4, 475-479 (1985)]가 본원에서 통상 유용하게 사용된다.

또한 적합한 숙주세포는 다세포 생물로부터 유래된다. 이들 숙주 세포는 복잡한 프로세싱과 글리코실화 활성을 갖고 있다. 인간과 같은 포유동물 유래 세포가 바람직하기는 하나, 기본적으로 척추 동물 배양물이든 또는 무척추동물 배양물이든, 임의의 고등 진핵세포 배양물을 사용할 수 있다. 무척추동물 세포의 예는 식물 및 곤충 세포이다. 많은 바큘로바이러스 균주 및 변이체 및 숙주, 예를 들어 스포돕테라 프루기페르다 (Spodoptera frugiperda) (모충), 애데스 애깁티 (Aedes aegypti) (모기), 애데스 알보픽투스 (Aedes albopictus) (모기), 드로소필라 멜라 노가스터 (Drosophila melanogaster) (과일파리) 및 봄빅스 모리 (Bombyx mori)로부터 유래한 대응하는 허용되는 곤충 숙주 세포가 동정되었다 [Luckow et al., Bio/Technology 6, 47-55 (1988); Miller et al., Genetic Engineering, Setlow J.K. eds. Vol. 8, pp. 277-279 (Plenam Publishing 1986); Maeda et al., Nature 315, 592-594 (1985)]. 형질감염을 위한 다양한 바이러스 균주, 예를 들어 오토그라파 칼리포르니카 (Autographa californica) NPV의 L-1 변이체를 구입할 수 있고, 상기 바이러스는 본 발명에 따라 본원의 바이러스로서, 특히 스포돕테라 프루기페르다 세포의 형질감염을 위해 사용될 수 있다.

일반적으로, 식물 세포는 앞에서 TIE 리간드 DNA를 포함하도록 조작된 세균 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 특정 균주와 인큐베이션함으로써 형질감염될 수 있다. 에이. 투메파시엔스와 식물세포 배양물을 인큐베이션하는 동안, TIE 리간드를 코딩하는 DNA는 식물세포 숙주로 이동되어 알맞은 조건하에서 형질감염되어 TIE 리간드 DNA를 발현할 것이다. 또한, 식물 세포에 적합한 조절 및 시그날 서열, 예를 들어 노팔린 신타아제 프로모터 및 폴리아데닐화 시그날 서열이 이용 가능하다[Depicker et al., J. Mol. Appl. Gen. 1, 561 (1982)]. 또한 T-DNA 780 유전자의 상류 영역으로부터 단리된 DNA 세그먼트는 재조합 DNA를 포함하는 식물 조직에서 식물 발현가능한 유전자의 전사 수준을 활성화 또는 증가시킬 수 있다(1989. 6.21 공개된 EP 321,196 참조).

그러나, 척추동물 세포에 대한 관심이 가장 크고, 척추동물 세포의 배양 (조직 배양)에서의 증식이 일반적인 방법으로 되었다 [Tissue Culture, Academic Press, Kruse and Patterson, editors. (1973)]. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 예는 SV40로 형질전환된 원숭이 신장 CV1 주 (COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배(胚) 신장 세포주 (293 또는 현탁 배양에서 성장을 위해 서브클로닝된 293 세포, Graham et al., J. Gen. Virol., 36: 59 (1977)); 베이비 햄스터 신장 세포 (BHK, ATCC CCL 10); 차이니즈 햄스터 난소 세포/-DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4216 (1980)); 마우스 세르톨리 세포 (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23: 243-251 (1980)); 원숭이 신장 세포 (CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 그린 원숭이 세포 (VERO-76, ATCC CRL 1587); 인간 경부암 세포 (HELA, ATCC CCL 2); 개 신장 세포 (MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 쥐 간 세포 (BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐 세포 (W138, ATCC CCL 75); 인간 간 세포 (Hep G2, HB 8065); 마우스 유방 종양 (MMT 060562, ATCC CCL 51); TRI 세포 [Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383: 44068 (1982)]; MRC 5 세포; FS4 세포; 및 인간 간종양 세포주 (Hep G2)이다. 바람직한 숙주세포는 인간 배 신장 293 및 차이니즈 햄스터 난소 세포이다.

본 발명의 목적에 특히 적합한 숙주 세포는 본 발명의 TIE 리간드 상동체를 생산하는 척추동물 세포이다.

숙주 세포는 상기에 기술된 발현 또는 클로닝 벡터로 형질감염 및 바람직하게 형질전환되고, 프로모터 유도 또는 증폭된 유전자를 포함하는 형질전환체 선택을 위해 적합하게 개질된 통상의 영양 배지 중에서 배양된다.

본 발명의 TIE 리간드 상동체를 생산하기 위해 사용되는 원핵 세포는 일반적으로 Sambrook 등(동 문헌)에 기재된 적합한 배지에서 배양된다.

포유동물 세포는 여러 배지 중에서 배양될 수 있다. 상업적으로 사용가능한 배지, 예를 들어 Ham F10 (Sigma), 최소 필수 배지 (MEM, Sigma), RPMI-1640 (Sigma), 및 둘베코 개질 이글 배지 (DMEM, Sigma)가 숙주 세포의 배양에 적합하다. 또한, 문헌 [Ham and Wallace, Meth. Enzymol. 58: 44 (1979); Barnes and Sato, Anal. Biochem. 102: 255 (1980), 미국 특허 제4,767,704호; 제4,657,866호, 제4,927,762호 또는 제4,560,655호; WO 90/03430; WO 87/00195호 또는 미국 특허 등록 제30,985호]에 기재된 배지를 숙주 세포를 위한 배지로서 사용할 수 있다. 이들 배지는 호르몬 및(또는) 다른 성장 인자 (예를 들어 인슐린, 트랜스페린, 또는 상피 세포 성장 인자), 염 (예를 들어, 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘 및 인산염), 완충액 (예를 들어 HEPES), 뉴클레오시드 (예를 들어 아데노신 및 티미딘), 항생제 (예를 들어 GENTAMYCIN (등록상표) 약물), 미량 원소 (통상적으로 마이크로몰 범위의 최종 농도로 존재하는 무기 화합물로서 정의됨) 및 글루코스 및 동등한 에너지 공급원으로 필요에 따라 보충될 수 있다. 임의의 다른 필요한 보충물이 당업계의 숙련인에게 공지된 적절한 농도로 포함될 수도 있다. 온도, pH 등과 같은 배양 조건은 클로닝 또는 발현을 위해 선택된 숙주 세포에 대해 이전에 사용된 조건이고, 당업계의 숙련인에게 자명할 것이다.

본원에서 언급된 숙주 세포는 숙주 동물 또는 식물 내에 있는 세포뿐 아니라 시험관 내 배양된 세포를 포함한다.

나아가 본 발명의 TIE 리간드 상동체는 상동성 재조합 또는 특정 TIE 리간드를 코딩하는 DNA를 이미 포함하는 세포에 도입된 조절 성분을 이용하는 재조합 생 산 방법으로 생산될 수 있다는 것을 알 수 있다.

유전자 증폭 및(또는) 발현은 본원에서 제공된 서열을 기초로 하여 적당하게 표지된 프로브를 이용하여, 예를 들어 mRNA의 전사를 정량하기 위한 통상의 서던 블롯팅, 노던 블롯팅, 도트 블롯팅(DNA 분석) 또는 생체내 혼성화(in situ hybridization)에 의해 시료에서 직접적으로 측정할 수 있다. 여러 표지가 이용될 수 있으며 가장 통상적으로 동위원소, 특히 ³²P가 사용된다. 그러나, 다른 기술 예를 들어 비오틴-수식된 뉴클레오티드를 폴리뉴클레오티드에 도입하는 것을 이용하는 방법도 이용된다. 비오틴은 광범위하고 다양한 표지, 예를 들어 방사선 핵종, 형광체, 효소 등으로 표지된 아비딘 또는 항체에 결합하는 부위로 작용한다. 별법으로 DNA 이중체, RNA 이중체 및 DNA-RNA 혼성 이중체 또는 DNA-단백질 이중체를 포함하는 특이적 이중체를 인지하는 항체가 이용될 수 있다. 항체를 표지하고 이중체가 표면에 결합되는 부위에서 분석을 수행할 수 있다. 따라서 표면에 이중체가 형성되면 이중체에 결합한 항체가 검출될 수 있다.

또한 유전자 발현은 직접적으로 유전자 산물의 발현을 정량화하는 면역학적 방법, 예를 들어 조직 절편의 면역조직화학적 염색 및 세포 배양 또는 체액의 분석법에 의해 측정될 수 있다. 면역조직화학적 염색 방법에 따라, 세포 시료는 일반적으로 탈수 및 고정된 다음, 결합된 유전자 산물에 특이적인 표지된 항체와의 반응에 의해 준비된다. 여기서 표지는 일반적으로 가시적으로 검출 가능한, 예를 들어 효소 표지, 형광 표지, 발광 표지 등이다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 특 히 민감한 염색법은 문헌[Hse et al., Am. J. Clin. Pharm. 75, 734-738 (1980)]에 기재되어 있다.

면역조직화학적 염색 및(또는) 시료액의 분석법에 유용한 항체는 단클론 또는 다클론항체이며 임의의 동물에서 제조될 수 있다. 용이하게, 본 발명의 천연 TIE 리간드 상동체 폴리펩티드 또는 아래서 기술할 내용과 같이 본원에서 제공하는 DNA 서열을 기초로 한 합성 펩티드에 대한 항체를 제조할 수 있다.

TIE 리간드 상동체는 봉입체(inclusion body) 형태로 숙주 세포 내에서 생산되거나 주변 세포질 간격 또는 배지로 분비되거나, 전형적으로 세포 용균체로부터 회수된다. 재조합 리간드 상동체는 이어서 안정된 단백질을 형성할 수 있는 기술에 의해 정제된다.

TIE 리간드 상동체가 인간에서 기원하지 않은 재조합 세포에서 발현된 경우는 인간 기원의 단백질 또는 폴리펩티드는 전혀 존재하지 않는다. 그러나, 실질적으로 리간드에 동질한 제조물을 얻기위해서 재조합 세포 단백질 또는 폴리펩티드로부터 TIE 리간드 상동체를 정제할 필요가 있다. 제1단계로서 배양 배지 또는 용균체는 원심분리하여 세포 파쇄 입자를 제거한다. 이어서 세포막과 가용성 단백질 분획을 분리하고 TIE 리간드 상동체를 가용성 단백질 분획으로부터 정제한다. 적합한 정제 과정의 예는 면역친화도 또는 이온 교환 칼럼에서 분획화; 에탄올 침전; 역상 HPLC; 실리카 또는 DEAE와 같은 양이온 교환 수지 크로마토그래피; 크로마토포커싱; SDS-PAGE; 황산 암모늄 침전; 예를 들어 세파덱스 G-75를 이용한 겔 여과; 및 IgG와 같은 오염물을 제거하기 위한 단백질 A 세파로즈 칼럼이다.

잔기가 결실, 삽입 및(또는) 치환된 TIE 리간드 상동체의 기능적인 유도체는 변형에 의해서 발생하는 특성상의 실질적 변화를 고려하여 천연 리간드와 같은 방법으로 회수할 수 있다. TIE 리간드 상동체와 또다른 단백질 또는 폴리펩티드, 예를 들어 세균 또는 바이러스의 항원의 융합은 정제를 용이하게 한다. 항원에 대한 항체를 포함하는 면역친화도 칼럼이 융합체를 흡착하는데 사용될 수 있다. 면역친화도 칼럼, 예를 들어 토끼 다클론 항-TIE 리간드 상동체 칼럼이 하나 이상의 나머지 면역 에피토프에 결합함으로써 TIE 리간드 상동체 변이체를 흡착하는데 이용될 수 있다. 페닐 메틸 술포닐 플루오리드(PMSF)와 같은 프로테아제 억제제는 정제과정에서 단백질분해를 억제하기 위해 유용하며, 항생제는 외래 오염물의 성장을 억제하기 위해 포함될 수 있다. 본 발명의 TIE 리간드 상동체는 TIE 수용체, 예를 들어 TIE-2에 결합할 수 있는 친화도 크로마토그래피를 이용하여 편리하게 정제될 수 있다.

당업계에 숙련자는 재조합 세포 배양에서 발현되는 천연 TIE 리간드 상동체 또는 그들의 변이체의 특성의 변화에 따라 천연 TIE 리간드 상동체에 적합한 정제 방법을 변경할 필요가 있다는 것을 인식하고 있을 것이다.

D. TIE 리간드 상동체, 핵산 분자 및 항체의 이용

본 발명의 TIE 리간드 상동체는 세포배양에 있어 TIE 수용체를 발현하는 세포의 생존 및(또는) 성장 및(또는) 분화를 촉진시키는 데 유용하리라 기대된다.

또한, TIE 리간드 상동체는 천연 TIE 수용체를 발현하는 세포를 확인하는데 사용될 수 있다. 이러한 목적으로, 리간드와 TIE 수용체가 결합하도록 하는 조건 하에서 검출 가능하게 표지된 리간드를 표적 세포와 접촉하게 하여 그 결합을 확인한다.

예를 들어, 본원의 TIE 리간드 상동체를 발현하는 세포를 시험 분자에 노출시키고, TIE 수용체에 시험 분자의 특이적 결합을 직접적인 검출법 또는 2차적인 생물학적 효과에 근거하여 검출함으로써, 본원의 TIE 리간드 상동체는 TIE 리간드 상동체의 생물학적 활성을 보이는 분자를 확인하는 데 또한 사용될 수 있다. 이러한 방법은 특히 TIE 리간드 패밀리의 새로운 일원을 확인하거나, 펩티드 또는 비 펩티드의 작은 분자 라이브러리를 스크리닝하는데 적합하다.

또한, 본원에 기재된 TIE 리간드 상동체는 뼈의 발생, 성숙 또는 성장, 또는 근육 성장 또는 발육 및(또는) 혈관형성의 촉진 또는 억제시에 중요한 역할을 하는 천연 TIE 수용체의 작용제 또는 길항제를 동정하기 위해 고안된 스크리닝법에 유용하다. 예를 들어, BiAcore biosensor 기술(BIAcore; Pharmacia Biosensor, Midscataway, N.J.)을 이용하거나 또는 생물학적으로 활성인 TIE 리간드 상동체에 의한 생물학적 반응을 차단하는 능력을 모니터하는 등의 방법에 의해 측정된 바와 같이, 본 발명의 TIE 리간드 상동체의 천연 TIE 수용체에 대한 결합을 차단하는 능력을 기초로 하여 TIE 수용체의 길항제가 동정될 수 있다. 모니터될 수 있는 생물학적 반응은 예를 들어 TIE 수용체 또는 TIE 신호 전달 경로의 하류 성분의 인산화, 또는 TIE 수용체를 발현하는 세포의 생존, 성장 또는 분화 등이다. 정상적으로 TIE 수용체를 발현하지 못하는 세포를 이용하거나, 이 수용체를 발현하도록 조작되거나 또는 TIE 수용체와 본 발명의 TIE 리간드 상동체를 함께 발현하도록 조작 된 세포를 기초로한 분석법이 특히 이용하기 편리하다.

특정 실시 태양에서, TIE 리간드/TIE 수용체 상호작용을 방해하는 능력을 기초로 하여 천연 TIE 수용체의 작은 분자 작용제와 길항제가 동정될 수 있다. TIE 수용체를 발현하는 완전한 세포 표면에 결합되거나 세포 용균액 내의 TIE 수용체에 가교 결합되거나 또는 시험관 내에서 TIE 수용체에 결합된 시험 분자의 양을 검출하거나 측정하는 것(이에 한정되지 않음)을 포함하여 시험 분자의 TIE 수용체에 대한 특이적 결합을 측정하는 여러가지 방법이 있다.

검출 가능하게 표지된 TIE 리간드 상동체는 예를 들어 방사능 물질, 예를 들어 ¹²⁵I, 형광 물질, 효소 활성을 갖는 물질(발색 검출에 적합한 것이 바람직), 효소의 기질(발색 검출에 적합한 것이 바람직) 또는 (검출 가능하게 표지된) 항체 분자에 의해 인지될 수 있는 물질에 공유결합되어 있거나 비공유결합되어 있는 TIE 리간드를 포함한다.

본 발명의 측정법은 1996. 4.18에 공개된 PCT 공개 WO/96/11269에 기재된 것과 비슷한 방법으로 수행될 수 있다.

또한, TIE 리간드 상동체 또는 그의 TIE 수용체 결합 부위가 면역글로블린 중쇄 또는 경쇄의 불변 영역에 융합된 면역어드헤신 형태로 선택적으로 사용되는 본 발명의 TIE 리간드 상동체는 TIE 수용체를 정제하는 데에 유용하다.

본원의 TIE 리간드 상동체, 특히 NL8 및 그의 기능적 유도체는 내피 세포 성장의 억제 및(또는) 내피 세포 사멸을 유도하는 데 또한 유용하다.

본 발명의 핵산 분자는 세포 또는 조직 절편에서 TIE 리간드의 발현을 검출하는 데 유용하다. 세포 또는 조직 절편은 혼성화 조건하에서 본발명의 TIE 수용체 상동체를 코딩하는 검출 가능하게 표지된 핵산 분자와 접촉하고, 핵산 분자에 혼성화하는 mRNA의 존재를 확인함으로써 TIE 리간드 상동체의 발현을 검출할 수 있다. 또한, 종양(암) 세포에서 증폭된 본원의 TIE 리간드 상동체를 코딩하는 핵산은 종양(암)을 진단하는 데 유용하다.

본 발명의 항체는 예를 들어 생물학 시료에서 TIE 리간드 상동체의 양을 측정하는 면역분석법에 이용될 수 있다. 생물학 시료는 본 발명의 TIE 리간드 상동체에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 혼합물과 접촉하며 시험 시료에 존재하는 리간드와 함께 형성된 복합체의 양이 측정된다.

또한, TIE 리간드 상동체에 대한 항체는 대응하는 TIE 수용체를 발현하는 세포에 방사선 동위원소 또는 독소와 같은 세포 독성 분자 또는 치료제를 운반하는데 사용될 수 있다. 치료제는 예를 들어 TIE-2 리간드, 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 패밀리의 일원 또는 공지된 항 종양제 및 근육 성장 또는 발달, 또는 뼈의 발생, 성숙 또는 성장과 연관된다고 공지된 제제를 포함하는 다른 TIE 리간드일 수 있다.

항-TIE 리간드 상동체 항체는 TIE 수용체의 발현과 연관된 질병 상태를 검출하기 위한 진단제로 적합하다. 따라서, TIE 수용체의 검출 가능하게 표지된 TIE 리간드 상동체와 항체 작용제가 혈관형성의 존재를 영상화하는 데 유용하다.

게다가, 본원의 새로운 TIE 리간드 상동체는 혈관신생의 촉진에 사용될 수 있으며 종양 성장을 억제하는데 유용할 것이다.

본원의 TIE 리간드 상동체의 길항제 즉 항-TIE 리간드 상동체 항체는 또한 각각의 TIE 리간드 상동체를 코딩하는 유전자의 증폭과 관련된 종양(암)의 진단 및 처치에 유용하다.

추가적으로 효과적인 치료 용도에는 근육 및 뼈의 발생, 성숙 또는 성장의 조절이 포함된다.

치료 용도로, 본 발명의 TIE 리간드 상동체 또는 항-TIE 리간드 상동체 항체는 활성성분을 전신 또는 국부용으로 적합한 약학적으로 적합한 담체와의 혼합물로서 포함하는 치료용 조성물로 제제화될 수 있다. 원하는 정도의 순도를 갖는 활성성분과 생물학적으로 적합한 임의의 담체, 부형제 또는 안정화제와 혼합함으로 본 발명의 약학 조성물은 동결건조 제제 또는 수용액의 형태로 제조되어 저장된다 (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)). 적합한 담체, 부형제 또는 안정화제는 투여량 및 농도에서 수여자에게 비독성이어야 하며 인산, 시트르산 및 다른 유기산과 같은 완충액; 아스코르브산을 포함하는 항산화제; 저분자량(10개 이하의 잔기) 폴리펩티드; 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역 글로블린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 폴리머, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 리이신과 같은 아미노산; 글루코스, 만노오스 또는 덱스트린과 같은 단당류, 이당류 및 다른 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이팅제; 만니톨 또는 소르비톨과 같은 당 알콜; 나트륨과 같은 염 생성 카운터 이온; 및(또는) 트윈, 플루로닉 또는 PEG 비이온성 계면활성제를 포함한다.

또한, 활성 성분은 예를 들어 코아세르베이션 기술 또는 계면 중합반응에 의 해 제조되는 마이크로 캡슐, 예를 들어 히드록시메틸셀룰로오즈 또는 젤라틴 마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로 캡슐에, 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들어 리포좀, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐)에 또는 마크로에멀젼 중에 봉입될 수도 있다. 상기 기술은 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 개시되어 있다.

체내 투여에 사용되는 제제는 멸균처리되어야 한다. 이는 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 용이하게 수행된다.

치료 조성물은 일반적으로 멸균된 입구를 갖는 용기, 예를 들어 정맥 용액 주머니 또는 피하주사 바늘이 관통될 수 있는 마개를 갖는 유리병에 보관된다.

투여 경로는 공지된 방법, 예를 들어 정맥내, 복강내, 뇌내, 근육내, 안내의, 동맥내 또는 병소내 주사 또는 주입, 국소 투여 또는 서방성 시스템에 따른다.

서방성 제제의 적합한 예는 성형품, 예를 들어 필름 또는 마이크로 캡슐 형태의 반투과성 중합체 매트릭스를 포함한다. 서방성 매트릭스는 폴리에스테르, 히드로겔, 폴리락티드(미국 특허 제 3,773,919, EP 58,481), L-글루탐산과 감마-에틸-글루타메이트의 공중합체(U. Sidman et al., 1983, "Biopolymers" 22(1):547-556), 폴리 (2-히드록시에틸-메타크릴레이트)(R. Langer et al., 1981, "J. Biomed. Mater. Res." 15: 167-277 및 Langer, 1982, "Chem. Tech." 12: 98-105), 에틸렌 비닐 아세테이트 (R. Langer et al., 동문헌) 또는 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산 (EP133,988A)을 포함한다. 서방성 조성물은 또한 리포좀도 포함한다. 본 발명의 범위 내에 분자를 포함하는 리포좀은 공지된 방법(DE 3,218,121A; Epstein et al., 1985, "Proc. Natl. Acad. Sci. USA" 82: 3688-3692; Hwang et al., 1980,"Proc. Natl. Acd. Sci. USA" 77: 4030-4034; EP 52322A; EP 36676A; EP 88046A; EP 14949A; EP 142641A: 일본 특허 출원 83-118008; 미국 특허 4,485,045 및 4,544,545; 및 EP 102,324A)으로 제조된다. 보통 리포좀은 최적 NT-4 치료법에 맞추어 선택된 비율인 약 30 mol% 콜레스테롤의 지질 함유량을 갖는 작은(약 200 내지 800 Å) 단층 형태이다.

치료에 적용되는 본 발명 분자의 효과적인 양은 예를 들어 치료 목적, 투여 경로 및 환자의 상태에 따라 결정된다. 따라서, 의사가 투여량을 결정하고 최고의 치료 효과를 얻기위해 필요한 투여 경로를 조절할 필요가 있다. 전형적인 1일 투여량은 상기 요인에 따라 약 1 ㎍/㎏ 내지 100 ㎎/㎏ 이상의 범위이다. 전형적으로, 임상의는 원하는 생물학적 효과를 제공할 수 있는 투여량에 도달할 때까지 본 발명의 분자를 투여할 것이다. 이런 치료 과정은 통상적인 측정법으로 쉽게 모니터된다.

E. 종양 조직 및 세포주에서 TIE 리간드 상동체를 코딩하는 유전자의 증폭

원핵 및 진핵 생물의 게놈은 외관상 상반되는 두 가지 요건을 따른다. 한 가지는 여러 세대를 통하여 안정적인 유전을 보장하는 고유 형태의 유전적 정보로서 DNA의 보존 및 증폭이다. 한편으로, 세포 또는 유기체는 계속되는 환경 변화에 적응할 수 있어야 한다. 적응 기작은 유전 물질의 질적 또는 양적인 변형을 포함할 수 있다. 양적인 변형은 코딩 서열의 변형으로 구조 및(또는) 기능적으로 다른 단백질을 생성하는 DNA 돌연변이를 포함한다. 유전자 증폭은 양적인 변형으로 전체 코딩 서열, 즉 유전자의 실제 수를 증가시키고 전사 가능한 주형의 수 및 번역 가능한 전사체의 수의 증가, 결국 증폭된 유전자에 의해 코딩되는 단백질 양의 증가를 가져온다.

유전자 증폭 현상 및 그의 기본 기작은 시험관 내의 여러 원핵 및 진핵 세포 배양 시스템에서 조사되었다. 유전자 증폭의 특성을 가장 잘 나타낸 예로 세포 독성 약물인 메토트렉세이트(MTX)의 여러 농도를 포함하는 배지에서 원핵 생물의 배양을 수반한다. MTX는 폴린산 유사체로 디히드로폴레이트 리덕타아제(DHFR)를 차단함으로써 DNA 합성을 방해한다. 저농도의 MTX에 대한 초기 노출시 대부분의 세포(>99.9%)가 죽을 것이다. 소수의 세포가 생존하고, DHFR-RNA 및 단백질을 다량 생산함으로써 MTX 농도 증가시에도 자랄수 있다. 이러한 과다 생산의 기초는 단일 DHFR 유전자의 증폭이다. 유전자의 추가적인 카피는 작은, 다수의 염색체(두배) 형태의 염색체외 카피로서 발견되거나 통합된 염색체 카피로서 발견된다.

유전자 증폭은 세포 독성 약물(세균의 경우 항생제 및 진핵 생물의 경우 화학 치료제)에 대한 내성의 발생 및 종양의 형질 전환 시에 가장 흔하게 볼 수 있다. 자발적 현상 또는 바이러스 또는 화학 물질/환경 손상으로 일어나는 진핵 세포의 형질 전환은 일반적으로 그 세포의 유전 물질의 변화와 관련된다. 인간의 악성 종양에서 발견되는 가장 흔한 유전 변형의 한 예는 p53 단백질의 돌연변이이다. p53은 세포의 휴지기(G1)에서 복제기(S)로의 전환을 조절하고 DNA 손상이 존재할 때 이 전환을 억제한다. 다시 말해서, p53 불능화 돌연변이의 주요한 결과 중의 하나는 DNA 손상, 즉 유전적 변화의 축적 및 증식이다. 종양 세포의 유전적 변화의 일반적인 종류는 점 돌연변이 뿐만 아니라 증폭 및 큰 구조적인 변형, 예를 들어 전좌이다.

DNA 서열의 증폭은 DHFR 실험 시스템에서 예시된 바와 같이 특이적인 기능을 요구할 수 있다. 그러므로, 악성 종양에서 특정 암유전자의 증폭은 악성 형질 전환 과정 및 형질전환된 표현형의 유지 과정에서 이들 유전자의 원인적 역할을 나타낸다. 이 가설은 최근에 지지를 얻고 있다. 예를 들어 bcl-2 단백질은 비하지킨 림프종의 특정 형에서 증폭된다고 밝혀졌다. 이 단백질은 세포사멸을 억제하고 종양세포의 점진적인 축적을 야기시킨다. 성장 인자 수용체의 유전자 패밀리의 구성원이 여러 암에서 증폭되는 것이 발견되었으며 이는 이들 수용체의 과다 생산에 의해 종양 세포가 이용 가능한 성장 인자의 제한된 양에 영향을 덜 받는다는 것을 의미한다. 그 예로 안드로겐 제거 치료후 재발되는 전립선 암에서의 안드로겐 수용체의 증폭, 유방암에서 성장 인자 수용체 상동체 ERB2의 증폭을 들 수 있다. 마지막으로 세포내 신호전달 및 세포 주기 진행의 조절에 관계하는 유전자는 악성 형질 전환시 증폭될 수 있다. 이것은 여러 상피세포 또는 림프계 종양에서 bcl-I 및 ras 유전자의 증폭에서 입증된다.

이들 초기 연구는 종양에서 증폭된 DNA 서열의 확인 가능성을 제시하였는데 그 이유는 이러한 방법으로 악성의 형질 전환에 중요한 유전자를 동정할 수 있기 때문이다. 형질 전환 단백질이 종양 치료법을 위한 신규한 특이적 표적을 나타낼 수 있기 때문에, 치료적 측면에서 ERB2의 경우에도 사용 가능성을 증명하였다.

증폭된 게놈 서열을 제시하기 위해 여러가지 다른 기술을 이용할 수 있다. 암 세포로부터 준비된 염색체 스프레드(spreads)의 고전적인 세포 유전학 분석은 큰 구조적인 변형, 예를 들어 전좌, 결실 및 역위를 확인하기에 적합하다. 증폭된 게놈 부위가 높은 카피 수를 갖는 큰 부위와 관계가 있거나 염색체외 물질로 존재하게 될 때, 그 증폭된 게놈 부위는 가시화될 수 있다. 세포 유전학이 특정 종양세포와 특이적 염색체의 변화의 일치하는 연관성을 증명하기 위한 최초의 기술이었지만, 다루기 쉬운 DNA 서열의 동정 및 단리에는 부적합하다. 비교 게놈 혼성화(CGH)의 더욱 최근에 발전된 기술로 종양 세포 내에 널리 존재하는 게놈 증폭 현상을 설명하게 되었다. 종양 및 정상 DNA를 정상 세포의 중기에 동시에 혼성화하고 증가된 빈도로 종양에 존재하는 DNA 서열을 이미지 분석함으로써 전체 게놈을 스크리닝할 수 있다[(WO 93/18,186; Gray et al., Radiation Res. 137, 275-289{1994)]. 스크리닝 방법으로서, 이러한 분석법은 다양한 인간 종양 세포에서 반복되는 많은 수의 앰플리콘(증폭된 DNA 스트레치)을 밝혔다. CGH가 증폭된 DNA 스프레치를 동정하는 데 있어 고전적인 세포 유전자 분석법보다 민감하다고 하더라도, 표준 분자 유전 기술에 의한 애플리콘 내의 코딩 서열의 빠른 동정 및 단리를 허락하지는 않는다.

유전자 증폭을 검출하기 위한 가장 민감한 방법은 폴리머라아제 사슬 반응(PCR) 기초 분석법이다. 본 측정법은 개시 물질로서 종양 DNA의 매우 소량을 이용하며, 매우 민감하며, 서열 분석과 같은 추가로 분석할 수 있는 DNA를 제공하며, 분석시 대용량 분석에 적합하다.

상기에 언급된 분석법은 상호 배타적이지 않고, 종양 내에서 증폭을 확인하기 위해 흔히 조합하여 사용된다. 세포유전학 분석 및 CGH는 증폭된 부위를 대해 전체 게놈을 조사하는 스크리닝 방법을 나타내는 반면, PCR 기초 분석법은 코딩 서열 예를 들어 증폭 부위의 유전자를 최종 확인하는데에 가장 적합하다.

본 발명에 의하면, 증폭된 유전자가 가슴, 폐, 결장, 전립선, 뇌, 간, 신장, 췌장, 비장, 흉선, 고환, 난소, 자궁 등의 종양 또는 종양 세포주를 포함하는 여러 1차 종양 DNA와 건강한 공여자로부터 회수한 DNA를 비교함으로써 정량 PCR[S.Gelmini et al., Clin. Chem, 43, 752 (1997)]에 의해 확인되었다. 정량 PCR은 Taqman 장치(ABI)를 이용하여 수행되었다. 유전자 특이적 프라이머 및 형광 프로브를 DNA의 코딩 서열을 기초로 하여 디자인하였다.

인간 폐 암 세포주는 ATCC로부터 이용가능한 A549 (SRCC768), Calu-1 (SRCC769), Calu-6 (SRCC770), H157 (SRCC771), H441 (SRCC772), H460 (SRCC773), SKMES-1 (SRCC774) 및 SW900 (SRCC775)를 포함한다. 1차 인간 폐 종양 세포는 일반적으로 선암, 편평상피암, 대세포암, 비소세포암, 소세포암 및 기관지폐포암으로부터 유도되었으며 예를 들어 SRCC724(편평상피암의 약자-"SqCCa"), SRCC725(비소세포암의 약자-"NSCCa"), SRCC726(선암의 약자-"AdenoCa"), SRCC727(선암), SRCC728(편평상피암), SRCC729(선암), SRCC730(선/편평상피암), SRCC731(선암), SRCC732(편평상피암), SRCC733(선암), SRCC734(선암), SRCC735(기관지폐포암의 약자-"BAC"),SRCC736(편평상피암), SRCC738(편평상피암), SRCC739(편평상피암), SRCC740(편평상피암), SRCC740(폐세포암의 약자-"LCCa")를 포함한다.

결장 암 세포주는 예를 들어 ATCC 세포주 SW480(선암, SRCC776), SW620(결장 선암의 림프절 전이, SRCC777), COL0320(선암, SRCC778), HT29(선암, SRCC779), HM7(암종, SRCC780), CaWiDr(선암, srcc781), HCT116(암종, SRCC782), SKCO1(선암, SRCC783), SW403(선암, SRCC784), LS174T(암종, SRCC785) 및 HM7(ATCC 결장 선암 세포주 LS 174T의 고 뮤신 생산 변이체, Dr. Robert Warren, UCSF로부터 얻음)를 포함한다. 일차 결장 종양은 CT2 (SRCC742), CT3(SRCC743), CT8(SRCC744), CT10(SRCC745), CT12(SRCC746), CT14(SRCC747), CT15(SRCC748), CT17(SRCC750), CT1(SRCC751), CT4(SRCC752), CT5 (SRCC753), CT6(SRCC754), CT7(SRCC755), CT9(SRCC756), CT11(SRCC757), CT18(SRCC758) 및 DcR3, BACrev, BACfwd, T160 및 T159로 나타내는 결장 선암을 포함한다.

인간 심장 암 세포주는 예를 들어 HBLIOO(SRCC759), MB435s(SRCC760), T47D(SRCC761), MB468(SRCC762), MB175(SRCC763), MB361(SRCC764), BT20(SRCC765), MCF7 (SRCC766), SKBR3 (SRCC767)을 포함한다.

1. 조직 분배

본원에서 유전자 증폭 분석법의 결과는 추가적인 연구, 예를 들어 여러 인간 조직에서 mRNA 발현을 측정함으로써 확인될 수 있다.

상기에서 지적했듯이, 여러 조직 내에서 유전자 증폭 및(또는) 유전자 발현은 본원에서 제공하는 서열을 기초로 하여 적합하게 표지된 프로브를 이용하여 통상적인 서던 블롯팅, mRNA 전사를 정량화하기 위한 노던 블롯팅[Thomas, Proc, Natl. Acad. Sci. USA, 77: 5201-5205 (1980)], 도트 블롯팅(DNA 분석) 또는 계내 혼성화에 의해 측정될 수 있다. 별법으로 DNA 이중체, RNA 이중체 및 DNA-RNA 혼성 이중체 또는 DNA-단백질 이중체를 포함하는 특이적 이중체를 인지할 수 있는 항체를 이용할 수 있다.

별법으로, 여러 조직 내의 유전자 발현은 직접적으로 유전자 산물의 발현을 정량화하는 면역학적 방법, 예를 들어 조직 절편의 면역조직화학적 염색 및 세포 배양 또는 체액의 분석법에 의해 측정될 수 있다. 면역조직화학적 염색 및(또는) 시료액의 분석법에 유용한 항체는 단클론 또는 다클론 항체이며 임의의 동물에서 제조될 수 있다. 용이하게, 항체는 천연 서열 TIE 리간드 상동체 폴리펩티드 또는 본원에서 제공하는 DNA 서열을 기초한 합성 펩티드 또는 TIE 리간드 상동체 DNA에 융합되고 특정 항체 에피토프를 코딩하는 외인성 서열에 대해서 제조될 수 있다. 항체를 생산하기 위한 일반적 기술 및 노던 블롯팅 및 계내 혼성화를 위한 특별한 실험방법은 본원의 하기에 제공된다.

2. 염색체 맵핑

주어진 유전자의 증폭이 기능적으로 적절한 경우 그 유전자는 종양 생존에 중요하지 않는 이웃하는 게놈 부위보다 더 많이 증폭되야 한다. 이것을 시험하기위해 유전자는 특정 염색체에, 예를 들어 방사능-혼성 분석(radiation-hybrid analysis)에 의해 맵핑될 수 있다. 이어서 확인된 위치 및 이웃 게놈 부위에서 증폭 수준을 결정한다. 맵핑된 유전자의 게놈 위치에서 선택적인 또는 우선적인 증폭은 관찰된 유전자 증폭이 종양 성장 또는 생존을 촉진시킬 수 있다는 것과 일치한다.

3. 항체 결합 연구

또한, 유전자 증폭 연구의 결과는 종양(암) 세포에 대한 TIE 리간드 상동체 폴리펩티드의 효과를 억제하는 항-TIE 리간드 상동체 항체의 능력을 시험하는 항체 결합 연구에 의해 확인될 수 있다. 전형적인 항체에는 후술되는 다클론, 단클론, 인간화, 이중특이적 및 이종융합 항체등이 포함된다.

항체 결합 연구는 공지의 분석법, 예를 들어 경쟁적 결합 분석, 직접 및 간접 샌드위치 분석법 및 면역침전 분석법에 수행될 수 있다 [Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp. 147-158 (CRC Press, Inc. 1987)].

경쟁적 결합 분석은 제한된 양의 항체와 결합하기 위해 피검 시료 분석물과 경쟁하는 표지된 표준물질의 능력에 좌우된다. 피검 시료 내의 표적 단백질(종양세포내에서 증폭되는 유전자에 의해 코딩된)의 양은 항체에 결합되는 표준물질의 양에 반비례한다. 결합하게 되는 표준물질의 양의 결정을 용이하게 하기 위하여, 항체는 일반적으로 경쟁 전후에 불용화된다. 그 결과, 항체에 결합되는 표준물질과 피검 시료는 결합되지 않고 남아있는 표준물질과 피검 시료로부터 편리하게 분리될 수 있다.

샌드위치 분석법은 검출될 단백질의 상이한 면역원성 부분 또는 에피토프에 각각 결합할 수 있는 2개의 항체의 사용을 수반한다. 샌드위치 분석법에서, 분석될 피검 시료는 고상 지지체 상에 고정된 제1 항체에 의해 결합되고, 이어서 제2 항체는 피검 시료에 결합하여 불용성 3부분 복합체를 형성하게 된다 (Daivid & Greene, 미국 특허 제4,376,110호 참조). 제2 항체 자체는 검출가능한 잔기로 표 지될 수 있거나 (직접 샌드위치 분석) 또는 검출가능한 잔기로 표지된 항-면역글로블린 항체를 사용하여 측정될 수 있다 (간접 샌드위치 분석). 예를 들어, 샌드위치 분석의 한 종류는 ELISA 분석법으로서, 이 경우 검출가능한 잔기는 효소이다.

면역조직 화학에서, 종양 시료는 신선하거나 또는 동결될 수 있으며, 또는 파라핀에 함침되어 방부제, 예를 들어 포르말린에 고정될 수 있다.

4. 세포 기초 종양 분석법 (Cell-Based Tumor Assays)

종양에 대한 세포 기초 종양 분석법 및 동물 모델은 유전자 증폭 분석법의 발견을 확인하는 데 이용될 수 있으며, 또한 본원에서 동정된 유전자와 종양 세포 성장의 발달 및 병인 사이의 관계를 이해하는 데도 이용될 수 있다. 종양 또는 암의 발생 및 병리에 있어 본원에서 동정된 유전자 산물의 역할은 본원의 유전자를 증폭하는데 확인된 1차 종양 세포 또는 세포주를 이용하여 검사될 수 있다. 이같은 세포는 예를 들어 유방, 결장 및 폐 암 세포 및 상기에서 열거한 세포주를 포함한다.

다른 접근법으로, 특정 종양에 관련된다고 공지된 종류의 세포를 본원의 cDNA로 형질 감염시켜, 이들 cDNA의 과다 성장 유도능을 분석한다. 적합한 세포에, 예를 들어 B104-1-1 세포주(neu 전발암유전자로 형질 감염된 안정한 NIH-3T3 세포주) 및 목적하는 유전자로 형질 감염되어 종양원성 성장이 모니터될 수 있는 ras-형질 감염된 NIH-3T3 세포가 포함된다. 이어서, 상기의 형질 감염된 세포주는 형질 전환된 세포의 성장에 대한 세포증식 억제성 또는 세포 독성 활성을 나타내거나 항체 의존적 세포의 세포독성(ADCC)을 매개함으로써 종양원성의 세포성장을 억 제하는 다클론 또는 단클론 항체 또는 항체 조성물의 능력을 시험하는 데에 사용될 수 있다. 또한, 본원에서 동정된 유전자의 코딩 서열로 형질 감염된 세포는 암치료를 위한 약물 후보물질의 동정에도 또한 사용될 수 있다.

또한, 안정한 세포주가 바람직하지만, 트랜스제닉(transgenic) 동물(후술되는)의 종양으로부터 유래된 1차 배양물을 본원의 세포 기초 종양 분석법에 이용할 수 있다. 트랜스제닉 동물로부터 연속되는 세포주를 유도하는 기술은 업계에 공지되어 있다[Small et al. Mol. Cell. Biol. 5, 642-648(1985)].

5. 동물 모델

공지된 여러 동물 모델을 사용하여 종양의 발생 및 병인에 있어 본원에서 동정된 유전자의 역할을 이해하고 항체 및 작은 분자 길항제를 포함하여 천연 폴리펩티드의 다른 길항제를 포함한 후보 치료제의 효능을 시험하는데 이용될 수 있다. 이같은 모델의 생체 내 특성을 통하여 인간 환자에서 반응을 예측할 수 있다. 종양 및 암의 동물 모델(예, 유방암, 결장암, 전립선암, 폐암 등)은 비재조합 및 재조합(트랜스제닉) 동물 모두를 포함한다. 비재조합 동물 모델은 예를 들어 설치류, 즉 쥐 모델을 포함한다. 이같은 모델은 종양 세포를 표준 방법, 예를 들어 피하 주사, 꼬리 정맥 주사, 비장 이식, 복강내 이식, 신피막하 이식 또는 오르토핀 이식, 예를 들어 결장 조직이 이식된 결장 암 세포를 이용하여 동계의 마우스로 도입시켜 만들 수 있다(1977. 9.18 공개된 PCT 공개 No. WO97/33551 참조).

종양학 연구에 가장 흔히 사용되는 동물 종은 면역 결핍 마우스, 특히 누드 마우스이다. 저발육증/발육부전증을 갖는 누드 마우스는 인간 종양 이종 이식을 위한 숙주로서 성공적으로 사용할 수 있다는 발견은 상기의 목적으로 누드 마우스의 넓은 사용을 가져왔다. 상염색체의 열성 nu 유전자는 누드 마우스의 많은 다른 유사유전자형 예를 들어 ASW, A/He, AKR, BALB/C, B10.LP,C17,C3H,C57BL, C57, CBA, DBA, DDD, I/st, NC, NFR, NFS, NFS/N, NZB, NZC, NZW, P, RIII 및 SJL에 도입되었다. 또한, 누드 마우스 외에 유전된 면역학적 결핍을 갖는 여러 다양한 다른 동물들은 교배되어 종양 이종 이식의 수여자로 사용되었다. 더 자세한 내용은 문헌(The Nude Mouse in Oncology Research, E. Boven 및 Winograd, eds., CRC Press, Inc., 1991)을 참조한다.

상기의 동물에 도입된 세포는 상기에 열거된 종양 세포주와 같은 공지의 종양/암 세포주, 예를 들어 B104-1-1 세포주(neu 전발암성 유전자로 형질 감염된 안정한 NIH-3T3 세포주); ras-형질감염된 NIH-3 세포; Caco-2(ATCC HTB-37); 적당히 잘 분화된 II 급 인간 결장 선암 세포주, HT-29(ATCC HTB-38) 또는 종양 및 암으로부터 유도될 수 있다. 종양 및 암 세포의 시료는 냉동 및 액체 질소 내의 보관을 수반하는 표준 조건[Karmali et al., Br. J. Cancer 48, 689-696(1983)]을 이용하여 외과수술을 받는 환자로부터 얻을 수 있다.

종양 세포는 동물 예를 들어 누드 마우스에 여러가지 방법으로 도입될 수 있다. 마우스의 피하(s.c.) 공간은 종양 이식에 매우 적합하다. 종양은 고체 덩어리로, 투관침을 이용한 바늘 생체검사법 또는 세포 현탁액으로 피하 이식될 수 있다. 고체 덩어리 또는 투관침 이식의 경우, 적합한 크기의 종양 조직 단편이 피하 공간으로 도입된다. 세포 현탁액은 1차 종양 또는 안정한 종양 세포주로부터 새롭 게 준비하여 피하주사한다. 또한, 종양 세포는 피하이식된다. 접종물은 피부 결합조직의 아래 부부과 피하조직 사이에 넣는다(Boven 및 Winograd, 동문헌).

유방암의 동물 모델도 예를 들어 랫트 신경아세포종 세포(neu 발암유전자가 처음 단리된) 또는 neu-형질 전환된 NIH-3T3 세포를 문헌[Drebin et al., PNAS USA 83, 9129-9133(1986)] 기재된 바와 같이 누드 마우스에 이식함으로써 만들어질 수 있다

유사하게, 결장 암의 동물 모델은 동물, 예를 들어 누드 마우스 내에 결장 암 세포를 계대하여 이 동물내에 종양이 나타나도록 함으로써 만들어질 수 있다. 누드 마우스에서 인간 결장 암의 정상위 이식 모델은 예를 들어 문헌[Wang et al., Cancer Research 54, 4726-4728(1994) 및 Too et al., Cancer Research 55, 681-684(1995)]에 기재되어 있다. 이 모델은 AntiCancer사(캘리포니아 샌디에고 소재)가 판매하는 소위 "메타마우스"에 기초한 것이다.

동물 내에 생기는 종양은 제거되어 시험관 내에서 배양될 수 있다. 이어서 시험관 내 배양 세포는 동물에 계대될 수 있다. 이같은 종양은 추가의 시험 또는 약제 스크리닝을 위한 표적의 역할을 할 수 있다. 별법으로, 계대로부터 생성된 종양은 단리될 수 있으며 전계대 세포 및 계대 1 이상의 세대 후에 단리된 세포로부터의 RNA를 목적하는 유전자의 상이한 발현을 위해 분석될 수 있다. 이같은 계대 기술은 임의의 공지된 종양 또는 암 세포주에서 수행될 수 있다.

예를 들어 Meth A, CMS4, CMS5, CMS21 및 WEHI-164는 BALB/c 마우스 암컷의 화학적으로 유도된 섬유육종으로서 여러 제제의 항 종양활성을 연구하기 위해 조 절가능한 모델 시스템을 제공한다[Palladino et al., J. Immunol. 138, 4023-4032(1987)]. 간략하게, 종양 세포는 시험관에서 세포 배양으로 증식된다. 동물주사전에 세포주를 세척하고 10 X 10⁶ 내지 10 X 10⁷ 세포/㎖의 세포 밀도로 완충액에 재현탁시킨다. 이어서 동물에 10 내지 100 ㎕의 세포 현탁액을 피하주사하여 종양이 생기도록 1 내지 3주를 방치한다.

또한, 가장 완전하게 연구된 실험 종양인 마우스의 루이스 폐(3LL) 암은 종양 연구 모델로서 이용될 수 있다. 이 종양 모델의 효능은 폐 소세포암(SCLL)으로 진단된 인간 환자의 치료에서 유리한 효과와 관련이 있다. 이 종양은 이환된 마우스 또는 배양에서 유지된 세포로부터의 종양 단편을 주사하여 정상 마우스에 유도될 수 있으며[Zupi et al., Br. J. Cancer 41, suppl. 4, 309 (1980)], 종양은 심지어 단일 세포의 주사로부터 시작될 수 있으며 감염된 종양세포의 많은 부분이 생존하는 것을 나타내는 증거가 된다. 이 종양 모델의 추가적인 정보는 문헌[Zacharski, Haemostasis 16, 300-320(1986)]참조한다.

동물 모델에서 시험 화합물의 효능을 평가하는 한 방법은 처리 전후의 이식된 종양의 크기를 측정하는 것이다. 전형적으로, 이식된 종양의 크기는 2 또는 3차원으로 슬라이드 캘리퍼스로 측정한다. 이차원으로 한정된 측정은 종양의 정확한 크기를 반영하지 못하므로 일반적으로 수학적 수식을 이용하여 해당하는 부피로 환산된다. 그러나, 종양 크기의 측정은 매우 비정확하다. 약물 후보 물질의 치료 효과는 처리시 유도된 성장 지연 및 특이적 성장 지연으로 더 잘 나타낼 수 있다. 종양 성장을 나타내는 또다른 중요한 변수는 종양 부피 배가 시간이다. Rygaard 및 Spang-Thomson(Proc. 6th Int. Workshop on Immune-Deficient Animals), Wu 및 Sheng eds.(Basel, 1989, 301)가 보고한 프로그램과 같이 종양 성장의 계산 및 표시를 위한 컴퓨터 프로그램이용이 가능하다. 그러나, 치료에 따른 괴사 및 염증 반응은 실제로 적어도 초기에 종양 크기의 증가를 가져온다. 그러므로 이러한 변화는 형태 측정 방법 및 유동 세포 측정법을 조합하여 주의있게 모니터하여야 한다.

재조합(트랜스제닉) 동물 모델은 트랜스제닉 동물을 생산하기 위한 표준 기술을 이용하여 본원에서 동정된 유전자의 코딩 부위를 목적하는 동물의 게놈에 도입시킴으로써 조작될 수 있다. 트랜스제닉 조작을 위한 표적으로 마우스, 랫트, 토끼, 기니아 피그, 양, 염소, 돼지 및 비인간 영장류, 즉 개코 원숭이, 침팬지 및 원숭이 등에 제한없이 사용될 수 있다. 트랜스진을 상기의 동물에 도입하는 공지된 기술은 전핵 마이크로 주사(Hippe 및 Wanger, 미국 특허 제 4,873,191호); 배주로의 레트로 바이러스 매개된 유전자 전이[예, Van der Putten et al., Proc. natl. Acad. Sci. USA 82, 6148-615(1985)]; 배주세포에서의 유전자 표적화[Thompson et al., Cell 56, 313-32(1989)]; 배의 일렉트로포레이션[Lo, Mol. Cel., Bio. 3, 1803-1814(1983)]; 정자 매개된 유전자 전이[Lavitrano et al., Cell 57, 717-7391989)]가 포함된다. 더 많은 정보를 위해서 예를 들어 미국 특허 제 4,736,866호를 참조한다.

본 발명의 목적을 위해, 트랜스제닉 동물은 세포의 일부에만 트랜스진을 지 니고 있는 동물("모자이크 동물")을 포함한다. 트랜스진은 단일 트랜스진 또는 콘카타머, 즉 머리-머리 또는 머리-꼬리 배열로 통합될 수 있다. 트랜스진의 특정 세포종으로의 선택적인 도입은 예를 들어 Lasko등[Proc. Natl. Acd. Sci. USA 89, 6232-636(1992)]의 기술에 의해 또한 가능하다.

트랜스제닉 동물 내에서 트랜스진의 발현은 표준 기술에 의해 모니터될 수 있다. 예를 들어 서던 블롯 분석 또는 PCR 증폭이 트랜스진의 융합을 확인하는 데 사용될 수 있다. 이어서 mRNA 발현 수준은 계내 혼성화, 노던 블롯 분석, PCR 또는 면역세포화학과 같은 기술을 이용하여 분석될 수 있다. 또한 동물들은 종양 또는 암의 발생의 징후에 대해 조사될 수 있다.

별법으로, 폴리펩티드를 코딩하는 내인성 유전자와 동물의 배 세포로 도입된 동일한 폴리펩티드를 코딩하는 변형된 게놈 DNA의 상동 재조합의 결과로 생성되는, 본원에서 동정된 폴리펩티드를 코딩하는 결함이 있거나 변형된 유전자를 갖는 "낙 아웃(knock-out)" 동물이 제조될 수 있다. 예를 들어, 특정 폴리펩티드를 코딩하는 cDNA는 확립된 기술에 따라 그 폴리펩티드를 코딩하는 게놈 DNA를 클로닝하는데 이용될 수 있다. 특정 폴리펩티드를 코딩하는 게놈 DNA의 일부는 결실되거나 또는 다른 유전자, 예를 들어 통합을 모니터하는 데 사용될 수 있는 선택 마커를 코딩하는 유전자로 치환될 수 있다. 일반적으로, 수천개의 염기의 비변형된 플랭킹 DNA (5' 및 3' 말단 모두에서)가 벡터에 포함된다 [예를 들어 상동성 재조합 벡터에 대해서는 Thomas and Capecchi, Cell, 51:503 (1987) 참조]. 벡터는 배 간세포주 (예를 들어 일렉트로포레이션에 의해)에 도입되고, 도입된 DNA가 내인성 DNA와 상동 재조합된 세포가 선택된다 (Li et al., Cell, 69:915 (1992) 참조). 선택된 세포는 이어서 동물 (예를 들어 마우스 또는 래트)의 포배낭에 주입되어 응집 키메라를 형성한다 (예를 들어 Bradley, Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E.J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987), pp. 113-152). 이어서, 키메라 배를 적합한 가임신 대리모 동물에 이식하여 "낙 아웃" 동물을 생성시켰다. 생식세포 내에 상동 재조합 DNA를 보유하는 자손체를 표준 기술로 확인하여 동물의 모든 세포가 상동성 재조합 DNA를 함유하는 동물의 번식에 사용할 수 있다. 낙 아웃 동물은 예를 들어 특정 병리학적 상태에 대한 방어 능력 및 FIZZ 폴리펩티드의 부재에 의한 병리학적 상태의 발생에 대해 특성화할 수 있다.

본원에서 동정한 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체 및 다른 약제 후보의 효능은 또한 자연발생적 동물 종양의 처치에서 시험될 수 있다. 이같은 연구의 적합한 표적은 고양이의 구강 편평상피 세포암(SCC)이다. 고양이 구강 SCC는 이 종에서 보고된 구강 종양의 60%를 차지하는 것이 설명해 주듯이 가장 흔한 고양이의 구강 악성 종양으로 매우 공격적이고, 악성 종양이다. 낮은 전이 발생률은 단지 이 종양을 갖는 고양이의 생존 기간이 짧은 것을 반영한다고 하더라도, 이것은 멀리 떨어진 곳으로 거의 전이되지 않는다. 주로 고양이 구강의 해부로 인해 이들 종양에 대해 일반적으로 외과 수술을 실시할 수 없다. 현재, 이 종양의 효과적인 치료법은 없다. 연구에 도입하기에 앞서, 각 고양이는 완벽한 임상 검사, 생체 검사를 받고 컴퓨터 단층 촬영받는다. 설하 구강 편평상피 세포 종양으로 진단된 고양이는 연구에서 제외한다. 이같은 종양으로 혀가 마비될 수 있으며 처치로 종양 을 제거한다고 해도 동물은 스스로 음식을 섭취할 수가 없다. 각 고양이를 반복적으로 오랜 기간에 걸쳐 처치한다. 치료 기간 동안 매일 및 이후의 재검토시에 종양의 사진을 촬영한다. 치료후 각 고양이를 컴퓨터 단층 촬영하고, 그 후 8주마다 컴퓨터 단층 촬영 및 흉부 라디오그램을 평가한다. 자료를 대조군과 비교하여 생존, 반응 및 독성에 있어서 차이에 대해 평가한다. 양성 반응은 바람직하게는 삶의 질의 향상 및(또는) 증가된 수명의 증가와 함께 종양의 퇴화의 증거를 필요로 한다.

또한, 다른 자연 발생 동물 종양, 예를 들어 개, 고양이 및 비비의 섬유육종, 선암, 림프종, 연공종, 평활근육종이 실험될 수 있다. 이들 포유류 중에 개 및 고양이의 유선암은 인간과 매우 비슷한 형태와 반응을 보이기 때문에 바람직한 모델이다. 그러나, 이들 모델의 사용은 동물에서 이 종류의 종양의 드문 발생으로 제한된다.

6. 처치 방법

본 발명의 항체 및 다른 항종양 화합물은 본원에서 동정되어 증폭된 유전자의 과다 발현 및(또는) 활성화의 특징을 갖는 질병을 포함하여 여러 질병을 처치하는 데 사용될 수 있다고 생각된다. 상기의 항체 및 작은 유기 및 무기 분자, 펩티드, 안티센스 분자등을 포함하는 (이에 제한되지는 않음) 다른 화합물로 치료되는 질병 또는 질환의 예는 양성 또는 악성 종양(예, 신암, 간암, 신장암, 방광암, 유방암, 위암, 난소암, 결장직장암, 전립선암, 췌장암, 설암, 외음부암, 갑상선암, 간암; 육종; 신경교아종, 각종 유형의 두부 및 경부 종양); 백혈병 및 림프계의 악 성 종양; 신경 질환 예를 들어 신경 질환, 신경교 질환, 성상교세포 질환, 시상하부 질환 및 기타 선질환, 대식세포 질환, 상피 질환, 간질 및 배강 질환; 및 염증, 혈관 형성 및 면역학적 질환을 포함한다.

본 발명의 항 종양제, 예를 들어 항체는 공지된 방법, 예를 들어 정맥내 볼러스 투입 또는 일정 기간의 계속적인 주입, 근육내, 복강내, 척수내, 피하, 관절내, 활액내, 수막강내, 구강, 국부 또는 흡입 경로로 포유 동물, 바람직하게는 인간에 투여된다. 항체의 정맥내 투여가 바람직하다.

다른 치료법이 항암제 즉 본 발명의 항체의 투여와 조합하여 투여될 수 있다. 예를 들어 항암제로 치료되는 환자는 방사선 치료를 받는다. 선택적으로 또는 추가적으로, 화학치료제가 환자에게 투여될 수 있다. 그러한 화학치료제의 제조 및 투여 계획은 제조자의 지시에 따라 또는 숙련된 실무자에 의해 경험적으로 정해진 방법에 따라 사용될 수 있다. 이와 같은 화학치료제의 준비와 투여 계획은 또한 문헌[Chemotherapy Service Ed., M.C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, MD91992)]에 기재되어 있다. 항종양제 즉, 항체의 투여 전후에 화학치료제를 사용하거나 동시에 사용될 수 있다. 항체는 카목시펜 또는 항프로게스테론, 예를 들어 오나프리스톤과 같은 항오에스트론과 상기 화합물의 공지된 투여량으로 함께 사용될 수 있다(EP616812 참조).

또한, ErbB2, EGFR, ErbB3, ErB4 또는 혈관 내피 인자(VEGF)에 결합하는 다른 종양과 관련된 항원에 대한 항체를 투여하는 것도 바람직하다. 선택적으로 또는 추가적으로, 본 발명에서 개시된 같은 또는 두 개 이상의 다른 항체에 결합하는 두 개 이상의 항체를 환자에게 동시에 투여할 수 있다. 경우에 따라 환자에게 하나 이상의 사이토카인을 투여하는 것이 유리할 수도 있다. 바람직한 실시 태양에서, 본 발명의 항종양 화합물은 추가적인 성장 억제제와 함께 투여된다. 예를 들어, 성장 억제제를 먼저 투여한 후, 본 발명의 항체를 나중에 투여할 수 있다. 그러나 동시 투여 또는 본 발명을 먼저 투여하는 것도 고려된다. 성장 억제제의 적합한 투여량은 현재 사용되는 양이고 성장 억제제와 본원의 항체의 조합 작용(시너지 효과)에 의해 낮아질 수도 있다.

질병의 예방과 치료를 위해서는 위에서 언급했듯이, 본 발명의 항체와 같은 항종양제의 적절한 투여량은 치료될 질병의 형태, 질병의 정도 및 경로, 약제의 예방 또는 치료 목적여부, 기실시된 치료법, 환자의 임상 내역 및 약제에 대한 반응, 및 담당의사의 판단에 따라 결정된다. 약제는 한번에 또는 수회에 걸쳐 환자에 적절하게 투여된다.

예를 들어, 질병의 종류 및 심도에 따라, 예를 들어 하나 이상 개별 투여 또는 계속적인 주입 방법으로 항체 약 1 ㎍/㎏ 내지 15 ㎎/㎏(즉, 0.1 내지 20 ㎎/㎏) 가량이 환자에 대한 초기 후보 투여량이다. 전형적인 1일 투여량은 상기에서 언급한 요인에 따라 1 ㎍/㎏ 내지 100 ㎎/㎏ 이상의 범위이다. 수 일 또는 그 이상의 반복되는 투여의 경우, 상태에 따라 질병의 징후가 원하는 만큼 억제될 때까지 처치를 유지한다. 그러나, 다른 투여법도 유용할 수 있다. 이런 치료 과정은 통상적인 측정법으로 용이하게 모니터된다.

7. 제조품

본 발명의 또다른 실시 태양에서, 상기에서 기술한 질병의 진단 또는 처치에 유용한 물질을 포함하는 제조품을 제공한다. 제조품은 용기 및 표지를 포함한다. 적합한 용기는 예를 들어 병, 바이알, 주사기 및 시험관을 포함한다. 용기는 여러 물질, 예를 들어 유리 또는 플라스틱으로 만들어질 수 있다. 용기는 질병의 진단 또는 치료에 효과적인 조성물을 담고 있으며 멸균된 입구를 가지고 있다(예를 들어 용기는 정맥 용액 주머니 또는 피하 주사 바늘이 침투할 수 있는 마개를 갖는 바이알이 될 수 있다). 조성물의 활성 성분은 일반적으로 본원에서 동정한 유전자 산물즉, 항체의 활성을 저해할 수 있는 항종양제이다. 용기상의 라벨은 조성물이 선택된 질병을 진단 또는 치료하는데 사용됨을 나타낸다. 제조품은 또한 제약상 허용가능한 완충액, 예를 들어 인산염 완충 염수, 링거 용액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제2 용기를 포함할 수 있다. 또한, 다른 완충액, 희석액, 필터, 바늘, 주사기 및 사용 설명서를 갖는 포장 내용물을 포함하여 상업상 및 이용자의 입장에서 요구되는 다른 물질을 포함할 수 있다.

F. 약제 후보물질의 스크리닝 분석법

약제 후보물질의 스크리닝 분석법은 본원에서 동정된 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩티드와 결합하거나 복합체를 형성하는 화합물 또는 다른 세포 단백질과 코딩되는 폴리펩티드의 상호 작용을 저해하는 화합물을 동정하기 위해 디자인된다. 상기의 스크리닝 분석법은 화합물 라이브러리의 많은 양을 처리하는 스크리닝하는 분석법을 포함하며, 작은 분자의 약제 후보물질을 동정하기에 특히 적합하다. 예상되는 작은 분자는 합성의 유기 또는 무기 화합물로서 펩티드, 바람직하게는 가용 성 펩티드, (폴리)펩티드-면역글로블린 융합체, 특히 다클론 또는 단클론 항체 및 항체 단편, 단일쇄 항체, 항-이디오타입 항체 및 상기 항체 또는 단편의 키메라 또는 인간화 항체, 또한 인간 항체 및 항체 단편을 포함하는(제한하지 않음) 항체를 포함한다. 분석법은 업계에 잘 알려진 단백질-단백질 결합 분석법, 생화학적 스크리닝 분석법, 면역 분석법 및 세포 기초 분석법을 포함한 여러 형태로 수행될 수있다.

모든 측정법은 약제 후보물질을 본원에서 동정된 핵산에 의해 코딩되는 폴리펩티드와, 두 화합물이 상호 작용하기에 충분한 조건 및 시간 동안 접촉하도록 하는 것을 통상 요구한다.

결합 분석법에서 상호 작용은 결합이며 형성된 복합체는 반응 혼합물에서 단리 또는 검출될 수 있다. 특정 실시 태양에서, 본원에서 동정된 유전자에 의해 코딩된 폴리펩티드 또는 약제 후보물질은 고상, 예를 들어 마이크로타이터 플레이트에 공유 또는 비공유 부착으로 고정된다. 비공유 부착은 일반적으로 폴리펩티드 용액으로 고체 표면을 코팅하여 건조시켜 얻을 수 있다. 별법으로, 고정된 항체, 예를 들어 고정된 폴리펩티드에 특이적인 단클론 항체는 폴리펩티드가 고체 표면에 고정되도록 만드는데 사용될 수 있다. 분석법은 검출가능한 표지로 표지될 수 있는 비고정 성분을 고정된 성분, 예를 들어 고정된 성분을 포함하는 피막 표면에 첨가함으로써 수행될 수 있다. 반응이 끝나면, 비반응 성분은 예를 들어 세척에 의해 제거되고 고체 표면에 고정된 복합체가 검출된다. 원래 비고정된 성분이 검출가능한 표지를 갖고 있을 때 표면에 고정된 표지의 검출은 복합체 형성이 일어났음 을 나타낸다. 원래 비고정화된 요소가 표지를 갖지 않을 때는 예를 들어 고정된 복합체에 특이적으로 결합하는 표지된 항체를 이용하여 복합체 형성을 검출할 수 있다.

후보 화합물이 본원에서 동정된 유전자에 의해 코딩된 특정 단백질과 상호작용은 하지만 결합하지 않는 경우, 단백질과의 상호작용은 단백질-단백질 상호 작용을 검출하는 공지된 방법으로 분석할 수 있다. 이같은 분석법은 전통적인 방법, 예를 들어 가교 결합, 동시 면역 침전 및 구배 또는 크로마토그래피 칼럼을 통한 동시 정제를 포함한다. 또한, 단백질-단백질 상호작용은 Chevary 및 Nathans[Proc. Natl. Acd. Sci. USA 89, 5789-5792(1991)]에 의해 기재된 바와 같이 문헌[Fields and Songs, Nature(London)340, 245-246(1989); Chien et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 9578-9582(1991)]에 기재된 효모 기초 유전 시스템을 이용하여 모니터할 수 있다. 많은 전사 활성화제, 예를 들어 효모 GAL4는 물리적으로 분리된 두개의 단위 도메인으로 구성되었으며, 한 도메인은 DNA-결합 도메인으로, 다른 하나는 전사 활성화 도메인으로 작용한다. 상기 문헌에 기재된 효모 발현 시스템(일반적으로 "이혼성(two-hybrid) 시스템"으로 언급됨)은 상기 특성을 이용하며, 하나는 표적 단백질이 GAL4의 DNA 결합 도메인에 융합하고 다른 하나는 후보 활성화 단백질이 활성화 도메인에 융합된 것인 두개의 혼성 단백질을 이용한다. GAL4-활성화 프로모터의 조절 하에서 GAL1-lacZ 리포터 유전자의 발현은 단백질-단백질 상호작용을 통한 GAL4의 재구성에 의존한다. 상호작용하는 폴리펩티드를 포함하는 콜로니는 β-갈락토시다아제의 발색 기질을 사용하여 검출된다. 이혼성 기술을 이용하는 두개의 특이적 단백질 사이의 단백질-단백질 상호작용을 확인하기 위한 완전 키트(MATCHMAKER)를 클론테크로부터 구입할 수 있다. 이 시스템은 단백질의 상호 작용에 중요한 아미노산 잔기의 위치를 정확히 찾아낼 수 있을 뿐 아니라 특이적 단백질 상호 작용에 관련된 단백질 도메인을 맵핑하는 데에도 사용될 수 있다.

본원에서 동정된 유전자와 다른 세포내 또는 세포외 성분의 상호작용을 저해하는 화합물을 찾기 위해서, 두 산물의 상호작용과 결합이 일어나도록 하는 조건과 시간 동안 증폭 유전자 산물 및 세포내 또는 세포외 성분의 산물을 포함하는 반응 혼합물을 준비한다. 결합을 저해하는 시험 화합물의 능력을 시험하기 위해서 시험 화합물이 존재하는 경우와 존재하지 않는 경우의 반응을 실시한다. 또한, 위약을 제3 반응 혼합물에 첨가하여 양성 대조군으로 사용할 수 있다. 혼합물에 존재하는 시험 화합물과 세포내 또는 세포외 성분 사이의 결합(복합체 형성)은 상기에서 기술된 바와 같이 모니터된다. 시험 화합물을 포함하는 반응 혼합물이 아닌 대조군 반응에서 복합체의 형성은 시험 화합물이 시험 화합물과 시험 화합물의 반응 파트너와의 상호작용을 저해한다는 것을 나타낸다. 발명의 더 자세한 내용은 다음 비제한 실시예에 제시할 것이다.

<참고 실시예 1>

FLS139 리간드의 확인

Clontech Laboratories, Inc.(미국 캘리포니아 팔로 알토, catalog no. 64018-1)로부터 구입한 인간 태아 간 mRNA로부터 준비한 cDNA 라이브러리에서 FLS139를 확인하였다. 본원의 참고문헌인 Life Technologies사(미국 메릴랜드주 개더버그)의 "Instruction Manual:Superscript

Lambda System for cDNA Synthesis and λ cloning"(cat. No. 19643-014)에 기재되어 있는 실험방법을 이용하였다. 다른 지시가 없다면 모든 시약은 Life Technologies사로부터 구입하였다. 전체 실험 과정은 (1) 1차 가닥의 합성; (2) 2차 가닥의 합성; (3) 어댑터 첨가; (4) 효소에 의한 분해; (5) cDNA의 겔 분리; (6) 벡터와 cDNA의 라이게이션; 및 (7) 형질전환의 단계들로 요약될 수 있다.

1차 가닥의 합성

Not I 프라이머-어댑터(Life Tech., 2 ㎕, 0.5 ㎍/㎕)를 폴리 A+ mRNA(7 ㎕, 5㎍)이 첨가된 멸균된 1.5 ㎖ 미세 원심분리 튜브에 첨가하였다. 반응 튜브를 70℃에서 5분간 또는 mRNA의 2차구조가 변성되기에 충분한 시간 동안 가열하였다. 이어서, 반응물을 빙상에서 냉각시키고 5 x 1차 가닥 완충액(Life Tech., 4 ㎕), 0.1 M DTT(2 ㎕) 및 10 mM dNTP 혼합물(Life Tech., 1 ㎕)을 첨가하고 온도 평형을 이루도록 37℃에서 2분간 가열하였다. 수퍼스크립트(Superscript) II

역전사효소 (Life Tech., 5 ㎕)를 첨가하고 반응 튜브를 잘 섞어 37℃에서 1분간 인큐베이션하고 나서 얼음에 넣어 반응을 종결시켰다. 반응물의 최종 농도는 50 mM Tris-HCl(pH 8.3); 75 mM KCl; 3 mM MgCl₂; 10 mM DTT; 각각의 500 μM dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP; 50 ㎍/㎖ Not I 프라이머-어댑터; 5 ㎍(250 ㎍/㎖) mRNA; 50,000 U/㎖ 수퍼스크립트II

역전사효소였다.

2차 가닥의 합성

얼음상에서 증류수(93 ㎕); 5 x 2차 가닥 완충액(30 ㎕); dNTP 혼합물(3 ㎕); 10 U/㎕ 이. 콜라이 DNA 리가아제(1㎕); 10 U/㎕ 이. 콜라이 DNA 폴리머라아제 I (4 ㎕); 2 U/㎕ 이. 콜라이 RNAase H(1 ㎕)를 1차 가닥 합성 반응 튜브에 첨가하고 반응물을 잘 혼합한 후, 온도가 16℃를 넘지 않도록 주의하면서 16℃에서 2시간 동안 반응하도록 두었다. 10 U T4 DNA 폴리머라아제(2 ㎕)를 첨가하고 계속하여 16℃에서 5분간 추가로 인큐베이션하였다. 반응물의 최종 농도는 25 mM Tris-HCl (pH 7.5); 100 mM KCl; 5 mM MgCl₂; 10 mM (NH₄)₂SO₄; 0.15 mM β-NAD+; 각각의 250 μM dATP, dCTP, dGTP, dTTP; 1.2 mM DTT; 65 U/㎖ DNA 리가아제; 250 U/㎖ DNA 폴리머라아제 I; 13 U/㎖ RNase H 였다. 반응물은 얼음에 두고 0.5 M EDTA (10 ㎕)를 첨가하여 반응을 중지시킨 후, 페놀:클로로포름:이소아밀알콜(25:24:1, 150 ㎕)으로 추출하였다. 액상층을 분리 회수하여 5 M NaCl(15 ㎕) 및 순수 에탄올(-20℃, 400 ㎕)로 희석하여 14,000 x g 에서 2분간 원심 분리하였다. 생성된 DNA 펠렛으로부터 상층액을 조심스럽게 제거하고, 펠렛을 70 % 에탄올(0.5 ㎖)에 재현탁시켜, 14,000 x g에서 2분간 다시 원심분리하였다. 상층액을 다시 제거하고 펠렛을 스피드백에서 건조시켰다.

어댑터 첨가

상기의 이차 가닥 합성단계에서 얻어진 cDNA 펠렛에 증류수(25 ㎕); 5 x T4 DNA 리가아제 완충액(10 ㎕); Sal I 어댑터(10 ㎕); T4 DNA 리가아제(5 ㎕)를 첨가 하고, 반응물을 부드럽게 혼합하고 16℃에서 16시간 동안 인큐베이션하였다. 반응물의 최종 조성은 50 mM Tris-HCl (pH 7.6); 10 mM MgCl₂; 1 mM ATP; 5 %(w/v) PEG 8000; 1 mM DTT; 200 ㎍/㎖ Sal I 어댑터; 100 U/㎖ T4 DNA 리가아제이다. 반응물을 페놀:클로로포름:이소아밀알콜(25:24:1)로 추출하여, 액상층을 분리 회수하여 5 M NaCl(8 ㎕) 및 순수 에탄올(-20℃, 250 ㎕)로 희석하여 14,000 x g 에서 20분간 원심 분리하였다. 상층액을 조심스럽게 제거하고, 펠렛을 0.5 ㎖ 70 % 에탄올에 재현탁시켜, 14,000 x g에서 2분간 원심분리하였다. 상층액을 다시 제거하고 생성 펠렛을 스피드백에서 건조시켜 다음 과정을 진행하였다.

효소에 의한 분해

상기에서 얻은 Sal I 어댑터를 갖는 cDNA에 DEPC-처리수 (41 ㎕); Not I 제한 완충액(REACT, Life Tech., 5 ㎕); Not I (4 ㎕)을 첨가하여, 혼합물을 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 이 반응물의 최종 조성은 50 mM Tris-HCl (pH 8.0); 10 mM MgCl₂; 100 mM NaCl; 1,200 U/㎖ Not I이다.

cDNA의 겔 분리

cDNA를 5 % 아크릴아마이드 겔 전기영동법으로 크기에 따라 분획화하여, 분자량 마커와 비교하여 1 Kb보다 큰 절편을 겔로부터 절단하였다. 이어서 cDNA를 겔로부터 0.1 x TBE 완충액(200 ㎕)내로 전기용출시키고, 페놀:클로로포름:이소아밀알콜 (25:24:1, 200 ㎕)로 추출하였다. 액상층을 분리 회수하여 14,000 x g 에서 20분간 원심 분리하였다. 상층액을 제거하고, DNA 펠렛을 70 % 에탄올(0.5 ㎖) 에 재현탁시켜 14,000 x g에서 2분간 원심분리하였다. 상층액을 다시 제거하고 DNA 펠렛을 스피드백에서 건조시켜 증류수(15 ㎕)에 재현탁시켰다.

pRK5 벡터와 cDNA의 라이게이션

5 x T4 DNA 리가아제 완충액(3 ㎕); Xho I 및 Not I으로 절단된 pRK5 벡터(0.5 ㎍, 1 ㎕); 상기에서 준비한 cDNA(5 ㎕) 및 증류수(6 ㎕)를 함께 첨가하여 16℃에서 16시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 추가적으로 증류수(70 ㎕) 및 10 ㎎/㎕ tRNA(0.1 ㎕)를 첨가하고 전체 반응물을 페놀:클로로포름:이소아밀알콜(25:24:1)로 추출하였다. 액상층을 분리 회수하여 5 M NaCl(10 ㎕) 및 순수 에탄올(-20℃, 250 ㎕)로 희석하였다. 그리고, 14,000 x g에서 20분간 원심 분리하고, DNA 펠렛을 70 % 에탄올(0.5 ㎖)에 재현탁시켜, 14,000 x g에서 2분간 원심분리하였다. 이어서, DNA 펠렛을 스피드백에서 건조시켜 다음 과정에서 사용하도록 증류수(3 ㎕)내에 용출시켰다.

라이게이션된 라이브러리를 사용항 세균의 형질전환

상기에서 준비한 라이게이션시킨 cDNA/pRK5 벡터 DNA를 얼음상에서 냉각시켜 전기 수용성 DH10B 세균(Life Tech., 20 ㎕)에 첨가하였다. 이어서, 세균 벡터 혼합물을 제조업자의 지시에 따라 일렉트로포레이션시켰다. 이어서, SOC 배지(1 ㎖)를 첨가하여, 혼합물을 37℃에서 30분간 인큐베이션하였다. 형질전환체를 앰피실린을 포함하는 20 표준 150 ㎜ LB 플레이트에 도말하고 콜로니가 성장하도록 16시간 동안(37℃) 배양하였다. 양성 콜로니를 긁어내어 표준 CsCl-구배법을 이용하여 세균 펠렛으로부터 DNA를 단리하였다(예를 들어 Ausubel 등, 2.3.1 참조).

FLS139 의 확인

Klein R.D 등[(1996), Proc. Natl. Acad. Sci. 93, 7108-7113)과 Jacobs(1996. 7.16 공표된 미국 특허 제 5,563,637 호]가 보고한 방법들을 포함한 당업계에서 공지된 표준 방법으로 인간 태아 간의 라이브러리로부터 FLS139를 동정할 수 있다. Klein등과 Jacobs에 의하면, 효모 인버타아제 유전자를 리포터 시스템으로 이용하여 분비 리더 서열을 검출함으로써 신규의 분비 및 막 결합 포유동물 단백질을 코딩하는 cDNA를 동정하였다. 효소 인버타아제는 슈크로오스와 멜리바이오스로의 라피노오스의 분해 및 글루코오스와 프럭토오스로의 슈크로오스의 분해를 촉매한다. 인버타아제의 분비 형태는 효모(사카로마이세스 세레비지애)가 슈크로즈를 이용하는데 필요하기 때문에, 분비 인버타아제를 생산할 수 없는 효모 세포는 탄소 및 에너지원으로 슈크로오스만을 포함하는 배지에서 거의 성장하지 못한다. 상기 문헌에서 Klein R.D.와 Jacobs은 포유동물의 시그날 서열이 효모의 인버타아제의 천연 시그날 서열을 기능적으로 대신할 수 있는 공지된 능력을 이용하였다. 포유동물의 cDNA 라이브러리를 비분비되는 효모 인버타아제를 코딩하는 DNA에 라이게이션시키고, 라이게이션된 DNA를 단리하여 인버타아제 유전자를 포함하지 않는 효모 세포를 형질전환시켰다. 탄소원으로 슈크로오스 또는 라피노오스만을 포함하는 배지에서의 성장능을 기초로 하여, 포유동물의 시그날 서열에 라이게이션된 비분비되는 효모 인버타아제 유전자를 포함하는 재조합체들을 확인하였다. 이어서 동정된 포유동물의 시그날 서열은 대응하는 분비되는 단백질을 코딩하는 전체 길이의 클론을 단리하기 위해 전체 길이의 2차 cDNA 라이브러리를 스크리닝하는 데 사용하였다.

FLS139의 뉴클레오티드 서열(SEQ.ID.NO:16)은 도 1a 및 1b에, FLS139의 아미노산 서열(SEQ.ID.NO: 17)은 도 1c 및 1d에 도시되어 있다. FLS139는 TIE-2 수용체(h-TIE2L1 및 h-TIE2L2)의 두가지 공지된 인간 리간드와 높은 서열 상동성을 보이는 피브리노겐 유사 도메인을 포함하고 있다. 따라서 FLS139는 TIE 리간드 패밀리의 신규 일원으로 확인되었다.

FLS139 클론은 부다페스트 조약에 의거하여 1997. 9. 18자로 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(ATCC, 미국 20852 메릴랜드주 락빌 파크론 드라이브 12301 소재)에 기탁되어, 기탁번호 ATCC 209281을 부여받았다.

실시예 1 : 인간 NL1 을 코딩하는 cDNA의 단리

NL1을 BLAST 컴퓨터 프로그램을 이용한 젠뱅크 데이타 베이스를 스크리닝하여 동정하였다[Altshul et al., Methods in Enzymology 266: 460-480(1996)]. NL1 서열은 공지된 EST서열 T35448, T11442 및 W77823과 상동성을 보였다. 전체 길이의 서열로 확인되거나 또는 TIE 수용체와 결합하는 리간드로 기재된 공지된 EST 서열은 존재하지 않았다.

NL1을 동정한 후, Clontech, Inc(Palo Alto, CA, USA)(catalog #6528-1)로부터 구입한 mRNA로부터 준비된 인간 태아 폐의 라이브러리로부터 제조업자의 지시에 따라 NL1을 클로닝하였다. 라이브러리를 SFiI 부위를 포함하지 않는 pRK5D의 전구체인 pRK5B 벡터에 라이게이션시켰다. pRK5D는 폴리링커 서열 내에 약간의 차이를 갖는 pRK5(1989. 3.15자 공개된 EP 307,247)의 유도체이다. 라이브러리는 젠뱅크 데이타베이스에서 확인된 EST를 기초로 한, 다음과 같은 합성 올리고 뉴클레오 티드 프로브로 혼성화하여 스크링닝하였다. cDNA 서열은 완전한 형태의 서열이었다.

NL1.5-1 5'-GCTGACGAACCAAGGCAACTACAAACTCCTGGT SEQ.ID.NO:7

NL1.3-1 5'-TGCGGCCGGACCAGTCCTCCATGGTCACCAGGACCTTGTAG SEQ.ID.NO:8

NL1.3-2 5'-GGTGGTGAACTGCTTGCCGTTGTGCCATGTAAA SEO.ID.NO:9

NL1 뉴클레오티드 서열과 아미노산 서열은 도 2(SEQ.ID NO:1)와 도 3 (SEQ.ID NO:2)에 각각 도시되어 있다.

NL1은 TIE1 리간드 및 TIE2 리간드와 23%의 서열 동일성을 보인다.

NL1의 클론은 부다페스트 조약에 의거하여 1997. 9. 18자로 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(ATCC, 미국 20852 메릴랜드주 파크론 드라이브 락빌 12301 소재)에 기탁되어, 기탁번호 ATCC 209280을 부여받았다.

NL1은 염색체 9, 밴드암 q13-q21에 맵핑되었다.

실시예 2 : 인간 NL5 및 NL8 을 코딩하는 cDNA의 단리

발현된 서열 태그(EST) DNA 데이타베이스(LIFESEQ™, Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA)를 검색하여 참고 실시예 1의 FLS139 단백질과 상동성을 보이는 EST를 확인하였다. NL5 및 NL8을 클로닝하기 위해 Clontech, Inc(Palo Alto, CA, USA)(catalog #6528-1)로부터 구입한 mRNA로부터 준비된 인간 태아 폐의 라이브러리를 제조업자의 지시에 따라 이용하였다. 라이브러리는 젠뱅크 데이타베이스에서 확인된 EST를 기초로 한, 다음과 같은 합성 올리고 뉴클레오티드 프로브로 혼성화하여 스크링닝하였다. cDNA 서열은 완전한 형태의 서열이었 다.

NL5 경우

NL5.5-1 5'-CAGGTTATCCCAGAGATTTAATGCCACCA SEQ.ID.NO:10

NL5.3-1 5'-TTGGTGGGAGAAGTTGCCAGATCAGGTGGTGGCA SEQ.ID.NO:11

NL5.3-2 5'-TTCACACCATAACTGCATTGGTCCA SEQ.ID.NO:12

NL8 경우

NL8.5-1 5'-ACGTAGTTCCAGTATGGTGTGAGCAGCAACTGGA SEQ.ID.NO:13

NL8.3-1 5'-AGTCCAGCCTCCACCCTCCAGTTGCT SEQ.ID.NO:14

NL8.3-2 5'-CCCCAGTCCTCCAGGAGAACCAGCA SEQ.ID.NO:15

NL5의 전체 뉴클레오티드 서열과 추측되는 아미노산 서열은 도 4 및 5(SEQ.ID.NOs:3 및 4)에 각각 도시되어 있다. NL8의 전체 뉴클레오티드 서열과 추측되는 아미노산 서열은 도 6 및 7(SEQ.ID.NOs:5 및 6)에 각각 도시되어 있다.

전체 길이 서열의 BLAST 및 Fast A 서열 배열 분석법(ALIGN 프로그램)에 의하면, NL5은 TIE2 수용체의 리간드 1 및 리간드 2와 24%의 서열 동일성을 보이며, NL8은 TIE2 수용체의 리간드 1 및 리간드 2와 23%의 서열 동일성을 보인다.

TIE 리간드 NL1, NL5 및 NL8의 피브리노겐 도메인은 64 내지 74%의 동일성을 보인다. 더 구체적으로, TIE 리간드 NL1의 피브리노겐 도메인은 NL5의 피브리노겐 도메인과는 74%의 동일성을, NL8의 피브리노겐 도메인과는 63%의 동일성을 갖는다. 반면에, NL5의 피브리노겐 도메인은 N8의 피브리노겐 도메인과 57% 동일성을 보인다. TI-2 수용체의 리간드 1 및 리간드 2는 64%의 동일성을 가지며 NL1, NL5 및 NL8와는 40 내지 43%의 동일성을 갖는다.

NL5은 염색체 1, 밴드암 q23에 맵핑되었으며 NL8은 염색체 19, 밴드암 p13.3 내지 p13.21, p13.3 내지 p12.14 및 p13.3 내지 p12.15에 맵핑되었다.

실시예 3 : 인간 NL4 를 코딩하는 cDNA의 단리

EST DNA 데이타베이스(LIFESEQ™, Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA)를 검색하여 TIE-1 L1 및 TIE-2 L2와 상동성을 보이는 EST(#2939340)를 확인하였다. EST를 기초로 하여 PCR 프라이머쌍(정방향 및 역방향) 및 프로브를 합성하였다.

NL4.5-1 TTCAGCACCAAGGACAAGGACAATGACAACT SEQ.ID.NO:22

NL4.3-1 TGTGCACACTTGTCCAAGCAGTTGTCATTGTC SEQ.ID.NO:23

NL4.3-3 GTAGTACACTCCATTGAGGTTGG SEQ.ID.NO:24

올리고 dT 프라임된 cDNA 라이브러리를 Life Technologies, Gaithersburg, MD(SuperScript Plasmid System)의 시약과 실험방법을 이용하여 pRK5D 내에 Clontech, Inc(Palo Alto, CA, USA)(catalog #6528-1)에서 구입한 자궁 mRNA로터 제조하였다. pRK5D는 sp6 전사 개시 부위, SfiI 제한 부위, XhoI/NotI cDNA 클로닝 부위를 차례로 갖는 벡터이다. cDNA를 NotI 부위를 포함하는 올리고 dT로 시작되게 하여 SalI 헤미키나아제화된 어댑터에 블런트로 연결시키고, NotI으로 절단하여 겔 전기영동시켜 약 1000 bp 이상의 크기를 분리하여 XhoI/NotI-절단된 pRK5D에 정해진 방향으로 클로닝하였다.

전체 길이의 클론을 얻기 위해 여러가지 라이브러리를 스크리닝하기 위해 라 이브러리의 DNA를 상기에 확인되 PCR 프라이머 쌍으로 PCR 증폭시켜 스크리닝하였다. 이어서 양성 라이브러리를 프로브 올리고뉴클레오티드 및 한개의 PCR 프라이머를 이용하여 NL4 유전자를 코딩하는 클론을 단리하기 위해 이용하였다.

상기에 기재된 바와 같이 단리된 클론의 DNA 서열 분석은 NL4에 대한 전체 길이의 DNA 서열 및 유도된 단백질 서열을 제공하였다.

NL4의 전체 뉴클레오티드 서열은 도 13(SEQ.ID.NO:18)에 도시되어 있다. 클론 DNA 47470은 뉴클레오티드 위치 215 내지 217의 분명한 전사 개시 부위를 갖는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함한다(도 13에서 밑줄이 ATG 개시 코돈). 도 13에서, 뉴클레오티드 위치 1039 내지 1041위치의 TAA 종결 코돈은 박스로 표시되어 있다. 예상되는 폴리펩티드는 346 아미노산 길이이다. 클론 DNA47470은 ATCC에 기탁되어, 기탁번호 ATCC 209422를 부여받았다.

전체 길이 서열의 BLAST 및 Fast A 서열 배열 분석법(ALIGN 프로그램)에 의하면, NL4는 TIE2L1(32%) 및 TIE2L2(34%)와 아미노산 서열 동일성을 보인다.

실시예 4 : 노던 블롯 분석 및 계내 RNA 혼성화 결과

NL1 및 NL5 mRNA의 인간 조직에서의 발현을 노던 블롯 분석법으로 확인하였다. 인간 mRNA 블롯을 전체 길이의 cDNA를 기초로 한 ³²P-표지 DNA 프로브에 혼성화시켰다. 프로브는 cDNA 삽입체를 절단하고 정제하여 준비하였다. 인간 태아의 RNA 블롯 MTN(ClonTech) 및 인간 어른의 RNA 블롯 MTN-II(Clontech)를 DNA 프로브와 인큐베이션하였다. 블롯은 혼성화 완충액(5 x SSPE; 2 덴하르트 용액; 100 ㎎/ ㎖ 변성 분쇄된 연어 정자 DNA; 50% 포름아미드; 2% SDS)내에서 60시간 동안 42℃에서 프로브와 함께 인큐베이션하였다. 블롯을 2 x SSC, 0.055 SDS로 상온에서 1시간씩 수차례 세척하고, 0.1 x SSC; 0.1% SDS로 50℃에서 30분간 세척하였다. 블롯을 밤새 노출시킨 후 포스포이미저 분석기(Fuji)로 현상하였다.

도 11 및 12에서와 같이, NL1 및 NL5 mRNA 전사체가 확인되었다. NL1 mRNA의 강한 발현은 심장 및 골격근 조직 및 췌장에서 검출되었다. NL5 mRNA는 골격근에서 강하게 발현되며 더 적은 정도로 심장, 태반 및 췌장에서 발현되었다.

또한, PCR-합성된 ³³P 표지된 리보프로브를 이용한 최적화된 실험 방법[Lu and Gillett, Cell Vision 1: 169-176(1994)]을 이용하여, NL1, NL5, NL8 및 NL4의 조직 발현 형태를 계내 혼성화(세포 RNA에 대한 혼성화를 관찰)로 결정하였다. 포르말린 고정된 파라핀에 삽입된 인간 태아 및 성인의 조직을 절편화하고, 파라핀을 제거하고, 프로테이나제 K(20 g/㎖)로 37℃에서 15분간 단백질을 제거한 후 Lu 와 Gillett(1994)가 기재한 방법으로 계내 혼성화를 진행하였다. [³³P] UTP-표지 안티센스 리보프로브는 PCR 산물로부터 얻어 55℃에서 밤새 혼성화하였다. 슬라이드를 KODAK NTB2 뉴클리어 트랙 에멀전에 침지시키고 4주 동안 노출시켰다.

³³ P- 리보프로브 합성

6.0 ㎕ (125 mCi)의 ³³P-UTP(Amersham BF 1002, SA < 2000 Ci/mmole)를 스피드 백에서 건조시켰다. 건조된 ³³P-UTP를 포함하는 각 튜브에 다음 성분들을 첨가 하였다.

2.0 ㎕ 5 x 전사 완충액

1.0 ㎕ DTT (100 mM)

2.0 ㎕ NTP 혼합물 (2.5 mM:10μ;각각의 10 mM GTP, CTP & ATP + 10 ㎕ H₂O)

1.0 ㎕ UTP (50 μM)

1.0 ㎕ Rnasin

1.0 ㎕ DNA 주형 (1 ㎍)

1.0 ㎕ H₂O

1.0 ㎕ RNA 폴리머라아제 (일반적으로, PCR 산물용 T3=AS, T7=S)

튜브를 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 1.0 ㎕ RQ1 DNase를 첨가하고 혼합물을 37℃에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 90 ㎕ TE(10 mM Tris pH 7.6/1 mM EDTA pH 8.0)를 첨가하고 혼합물을 DE81 종이 위에 피펫으로 옮겼다. 남은 용액은 Microcon-50 한외여과 장치(ultrafiltration unit)에 넣고 프로그램 10(6분)을 이용하여 회전시켰다. 여과 장치를 두 번째 튜브 상에 놓고 프로그램 2(3분)을 이용하여 회전시켰다. 최종적으로 회수하기 위해 회전시킨 후, 100 ㎕ TE를 첨가하였다. 최종 산물 1 ㎕를 DE81 종이 위에 피펫으로 옮기고 6 ㎖ 바이오플루오르 II(Biofluor II)에서 계수하였다.

프로브를 TBE/우레아 겔에서 전기영동시켰다. 프로브 1 내지 3 ㎕ 또는 RNA MrkIII 5 ㎕를 로딩 완충액 3 ㎕에 첨가하였다. 95℃ 가열 블록에서 3분간 가열한 후에 즉시 얼음에 넣었다. 겔의 웰을 세척하고 시료를 넣고 180 내지 250 V에서 45분간 전기영동하였다. 겔을 사란랩으로 싸고 -70℃ 냉동실에서 1시간 내지 밤새도록 강화 스크린이 있는 XAR 필름에 노출시켰다.

³³ P- 혼성화

냉동절편의 전처리 슬라이드를 냉동실에서 꺼내어 알루미늄 접시에 놓고 상온에서 5분간 녹였다. 응축을 감소시키기 위해 접시를 55℃ 배양기에서 5분간 두었다. 연기 배출기에서 빙상의 4% 파라포름알데하이드 내에 슬라이드를 10분간 고정시키고 나서 상온에서 5분간 0.5 x SSC(25 ㎖ 20 x SSC + 975 ㎖ SQ H₂O)로 세척하였다. 37℃에서 10분간 0.5 ㎍/㎖ 프로테이나제 K(250 ㎖의 미리 가온시킨 RNase 부재 RNAse 완충액 내의 10 ㎎/㎖ 원액 12.5 ㎕)로 단백질을 제거하고 나서 절편들을 상온에서 10분간 0.5 x SSC로 세척하였다. 절편은 70%, 95%, 100% 에탄올로 각각 2분간 탈수시켰다.

파라핀에 삽입된 절편의 전처리 슬라이드에서 파라핀을 제거하고 SQ H₂O에 넣고, 상온에서 각각 2분간 2 x SSC로 두차례 세척하였다. 인간의 배의 경우 절편을 20 ㎍/㎖ 프로테아제 K(250 ㎖의 RNase 부재 RNAse 완충액 내의 10 ㎎/㎖의 500 ㎕, 37℃, 15분) 또는 포르말린 조직의 경우 8 x 프로테아제 K(250 ㎖ RNAse 완충액 내의 100 ㎕, 37℃, 30분)으로 단백질을 제거하였다. 이어서 절편들을 상기한 바와 같이 0.5 x SSC로 세척하고 탈수하였다.

전혼성화 슬라이드를 박스 완충액(4 x SSC, 50% 포름아마이드)-포화된 여 과지로 충전된 플라스틱 박스에 슬라이드를 놓았다. 조직을 혼성화 완충액 50 ㎕(3.75 g 덱스트란 설페이트 + 6 ㎖ SQ H₂O)로 덮고, 섞어준 후 마개를 느슨하게 하여 마이크로파로 2분간 가열하였다. 빙상에 냉각시킨 후, 18.75 ㎖ 포름아미드, 3.75 ㎖ 20 x SSC 및 9 ㎖ SQ H₂0 를 첨가하고 조직을 잘 섞어준 후 42℃에서 1 내지 4시간 동안 인큐베이션하였다.

혼성화 슬라이드 당 1.0 x 10⁶ cpm 프로브 및 1.0 ㎕ tRNA(50 ㎎/㎖ 원액)를 95℃에서 3분간 가열하였다. 슬라이드를 빙상에서 식히고 48 ㎕ 혼성화 완충액을 각 슬라이드에 첨가하였다. 잘 섞어준 후 50 ㎕ ³³P 혼합물을 슬라이드 상의 전혼성화물에 첨가하였다. 슬라이를 55℃에서 밤새 인큐베이션하였다.

세척 2 x SSC, EDTA(400 ㎖ 20 x SSC +16 ㎖ 0.25 M EDTA, V_f=4L)로 상온에서 10분 동안 2회 세척하고, 37℃에서 30분간 RNase A(250 ㎖ Rnase 완충액 내의 10 ㎎/㎖ 용액 500 ㎕ = 20 ㎍/㎖)를 처리하였다. 슬라이드를 2 x SSC, EDTA로 상온에서 10분간 2회 세척하였다. 엄격 세척 조건은 2시간, 55℃, 0.1 x SSC, EDTA(20 ㎖ 20 x SSC + 16 ㎖ EDTA, V_f=4L)이었다.

올리고 뉴클레오타이드:

NL1: 46mer GGA TTC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC CGG GTT CAC GGT GCC ATC T (SEQ ID NO:25)

48mer CTA TGA AAT TAA CCC TCA CTA AAG GGA TGC GGT TGT AGG TGG GTG GTT (SEQ ID NO:26)

NL5: 47mer GGA TTC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC CAA CAC CAA GGG GCA AGA TG (SEQ ID NO:27)

48mer CTA TGA AAT TAA CCC TCA CTA AAG GGA GGG CTT TTG GTG GGA GAA GTT (SEQ ID NO:28)

NL4: 48mer GGA TTC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC GCT CCG CAA AGG TGG CTA CTG (SEQ ID NO:29)

47mer CTA TGA AAT TAA CCC TCA CTA AAG GGA TTT CCT CCC CGC AAG TCC AG (SEQ ID NO:30)

NL8: GGA TTC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC GGC CGC CAC GAG GAG CTG TTA (SEQ ID NO:31)

CTA TGA AAT TAA CCC TCA CTA AAG GGA TGC GGG GCT CTG GGG CTG GGT C (SEQ ID NO:32)

계내 혼성화 결과는 NL1이 장골 발생의 연골내 및 분화하는 골아세포에 인접한 골막에서 발현된다는 것을 보여준다. 또한 건, 활액 관절 형성 부위의 결합조직, 결합조직 중막, 태아 체벽의 골막 내에서 발현된다.

계내 혼성화 결과는 NL5 mRNA가 성인의 양성 유방 상피위의 유방암 세포, 아포크린 화생 지역 및 경화성 선질환에서 발현된다는 것을 보여주었다. 또한, 침윤하는 유관암종 세포에서도 발현된다. 태아 하지 조직에서, 연골내 골형성 부위, 골아세포 및 발생하는 뼈의 골막/연골막에서 발현된다. NL5 mRNA는 또한 골아세포 및 태아 체벽 조직의 발생하는 뼈의 골막/연골막에서 고수준으로 발현된다. 이러한 분포는 뼈 형성 및 분화에서의 역할을 암시한다(도 9a 및 도 9b)

NL8의 계내 혼성화는 발생하는 사지, 장 및 체벽의 고도로 조직화된 발현 형태를 보여주며, 이는 이들 부위에서 특징적인 기능적 역할 및 혈관 생성 및 형태화에 관련이 있음을 암시한다(도 10a 및 도 10b). 이같은 발현 형태는 NL1 및 NL5와는 구분되는 것이다.

NL4의 계내 혼성화는 붉은털 원숭이 뇌의 깊은 백질내의 소혈관 발현을 보여준다.

실시예 5 : 이. 콜라이에서 NL1 , NL5 , NL8 및 NL4 의 발현

본 실시예는 이. 콜라이에서 본 발명의 TIE 리간드의 글리코실화되지 않은 형태를 제조 방법을 나타낸다. NL1, NL5, NL8 또는 NL4 리간드를 코딩하는 DNA서열(각각 SEQ.ID.NOs:1,3, 5 및 18)를 선택된 PCR 프라이머를 이용하여 증폭하였다. 프라이머는 선택된 발현 벡터 상의 제한효소 부위에 해당하는 제한 효소 부위를 포함해야만 한다. 여러 발현 벡터가 사용될 수 있다. 바람직하게, 벡터는 항생제 내성 유전자, 복제 기점, e 프로모터 및 리보자임 결합 부위를 코딩할 것이다. 적합한 벡터의 예로는 앰피실린과 테트라사이클린 내성 유전자를 포함하는 pBR322[이. 콜라이로부터 유도됨; Bolivar et al., Gene 2:95(1977)]이다. 벡터를 제한효소로 절단하고 탈인산화시켰다. 이어서, PCR 증폭된 서열을 벡터에 라이게이션하였다.

이어서, Sambrook 등(상기 문헌)이 기재한 방법을 이용하여 라이게이션 혼합 물을 선택된 이. 콜라이 균주를 형질전환하는데 사용하였다. LB 배지에서 성장할 수 있는 형질전환체를 확인하고 항생제 내성을 갖는 콜로니를 선택하였다. 플라스미드 DNA를 제한 분석법을 이용하여 선택, 확인하였다.

선택된 클론을 항생제가 보충된 LB 브로스와 같은 액체 배양 배지에서 밤새 배양하였다. 이 배양액을 다음 단계의 배양 접종에 사용하였다. 이어서, 세포를 원하는 광학 밀도까지 배양시켰다. IPTG와 같은 유발제를 첨가할 수 있다.

수시간 동안 세포를 배양한 후에 원심분리로 세포를 회수할 수 있다. 원심분리로 얻어진 세포 펠렛을 본 기술에 공지된 여러가지 시약을 이용하여 용해시키고, 단백질이 강하게 결합하는 조건하에서 금속 킬레이팅 칼럼을 이용하여 용해된 단백질을 정제하였다.

실시예 6 : 포유동물 세포에서 NL1 , NL5 , NL8 및 NL4 의 발현

본 실시예는 포유동물세포에서의 재조합 발현에 의해 NL1, NL5, NL8 및 NL4 리간드 상동체의 글리코실화된 형태를 제조하는 방법을 예시한다.

벡터 pRK5(1989. 3.15 공개된 EP 307,247 참조)를 발현 벡터로 사용한다. 임의로, Sambrook 등(상기 문헌)이 기재한 라이게이션 방법을 이용하여 NL1, NL5, NL8 또는 NL4 DNA를 선택된 제한 효소를 사용하여 pRK5에 라이게이션시켜, NL1, NL5, NL8 및 NL4 DNA를 삽입하였다. 생성 벡터를 각각 pRK5-FLS139,-NL2 및 -NL3로 명명하였다.

한 실시 태양에서, 숙주세포로서 293 세포를 선택할 수 있다. 인간 293 세포(ATCC CCL 1573)를 태아 송아지 혈청 및 임의로 영양소 및(또는) 항생제가 보충 된 DMEM와 같은 배지에서 조직 배양 플레이트에 응집하도록 배양한다. 약 10 ㎍ pRK5-NL1, NL5, NL8 또는 NL4 DNA를 VA RNA 유전자를 코딩하는 DNA[Thimmappaya et al., Cell, 31: 543(1982)] 약 1 ㎍과 혼합하여, 500 ㎕의 1 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA 및 0.227 M CaCl₂에 용해시킨다. 이 혼합물에 500 ㎕의 50 mM HEPES(pH 7.35), 280 mM NaCl, 1.5 mM NaPO₄를 적가하여 25℃에서 10분간 침전물을 형성시킨다. 침전물을 현탁시키고 293 세포에 첨가하여 37℃에서 4시간 가량을 정치시킨다. 배지를 흡인 제거하고 PBS 내의 20% 글리세롤 2 ㎖를 30초 동안 첨가한다. 이어서, 293세포를 혈청 무첨가 배지로 세척하고 새로운 배지를 첨가하여 5일간 세포를 배양한다.

형질감염 24시간 후에 배지를 제거하고 배지(만으로) 또는 200 μCi/㎖ ³⁵S-시스테인 및 200 μCi/㎖ ³⁵S-메티오닌을 포함하는 배지로 대체한다. 12시간 배양 후, 조건화된 배지를 회수하고 회전 필터에서 농축시켜 15% SDS 겔에 로딩한다. 처리된 겔을 건조시키고 NL1, NL5 및 NL8폴리펩티드의 존재를 확인하기 위해 일정 기간동안 필름에 노출시킨다. 형질감염된 세포를 포함하는 배양액을 추가로 배양시키고(혈청 무첨가 배지), 배지를 선택된 생물분석법으로 시험한다.

별법으로, Soparyac 등[Proc. Natl. Acad. Sci., 12:7575(1981)]이 기재한 덱스트란 술페이트 방법을 이용하여 일시적으로 NL1, NL5, NL8 또는 NL4를 293 세포에 도입시킬 수 있다. 293 세포는 회전 플라스크에서 최고 밀도가 되도록 배양 하고 700 ㎍ pRK5-NL1, NL5, NL8 또는 NL4 DNA를 첨가한다. 세포를 우선 원심분리하여 회전 플라스크로부터 농축하고 PBS로 세척한다. DNA-덱스트란 침전물을 4시간 동안 세포 펠렛 상에서 인큐베이션한다. 세포를 20% 글리세롤로 90초간 처리하고 조직 배양 배지로 세척한 후 다시 조직 배양 배지, 5 ㎍/㎖ 소의 인슐린 및 0.1 ㎍/㎖ 소의 트랜스페린을 회전 플라스크에 넣는다. 약 4일 후에 조건화된 배지를 원심분리하고 여과시켜 세포와 파쇄물을 제거한다. 발현된 NL1, NL5, NL8 또는 NL4를 포함하는 시료를 농축시키고 투석 및(또는) 칼럼 크로마토그래피와 같이 선택된 방법으로 정제한다.

다른 실시 태양으로, NL1, NL5, NL8 또는 NL4를 CHO 세포에 발현시킬 수 있다. pRK5-NL1, NL5, NL8 또는 NL4를 CaPO₄ 또는 DEAE 덱스트란과 함께 공지된 시약을 이용하여 CHO 세포에 형질감염시킬 수 있다. 상기에서 언급한 것과 같이, 세포를 배양하고, 배지만으로 또는 ³⁵S-메티오닌과 같은 방사선 표지를 포함하는 배지로 배양액을 대체한다. 발현된 폴리펩티드의 존재를 확인하고 나서, 배양 배지를 혈청 무첨가 배지로 대체한다. 바람직하게는, 6일 가량 배양물을 인큐베이션 하고 조건화된 배지를 회수한다. 발현된 NL1, NL5, NL8 또는 NL4를 포함하는 배지를 농축하여 선택된 방법으로 정제한다.

또한, 에피토프 태그가 부가된 NL1, NL5, NL8 또는 NL4는 CHO 숙주세포에서 발현될 수 있다. NL1, NL5, NL8 또는 NL4는 pRK5로부터 서브클로닝될 수 있다. 서브클론의 삽입은 PCR을 통해 폴리-his 태그와 같은 선택된 에피토프 태그를 갖는 형태로 바큘로바이러스 발현 벡터에 융합될 수 있다. 폴리-his 태그가 부가된 NL1, NL5, NL8 또는 NL4 삽입은 안정한 클론의 선택을 위해 DHFR과 같은 선택 마커를 포함하는 SV40 유도 벡터로 서브클로닝될 수 있다. 결국, CHO 세포는 (상기에서와 같이) SV40 유도 벡터로 형질감염될 수 있다. 발현을 확인하기 위해서 상기와 같은 방법으로 표지될 수 있다. 이어서, 발현된 폴리-His 부가된 NL1, NL5, NL8 또는 NL4를 포함하는 배양 배지는 농축하여 Ni^{2 +}-킬레이트 친화도 크로마토그래피와 같이 선택된 방법으로 정제할 수 있다.

NL1, NL5 및 NL8의 글리코실화된 형태는 폴리-His 태그가 부가된 형태로 포유 동물 세포에서 실제로 발현되었다. NL1은 NL1 단백질 세포외 영역이 힌지, CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 IgG1 불변 영역 서열에 융합된 IgG 구조체(NL1-IgG 면역어드헤신)로서 발현되었다. NL5 및 NL8은 폴리-His 태그가 부가된 형태로 발현되었다.

이어서 PCR 증폭을 통해 NL1 DNA를 Ausubel 등[Current Protocols of Molecular Biology, Unit 3.16, Johnn Wiley and Sons(1997)]에 의해 기재된 표준 방법을 이용하여 CHO 발현 벡터에 서브클로닝 하였다. CHO 발현 벡터는 목적하는 DNA의 5' 및 3'에 적합한 제한 부위를 갖도록 제조되어 cDNA의 제한 위치가 편리하게 셔틀링될 수 있게 된다. CHO 세포에서 NL1 DNA의 발현에 사용되는 벡터는 Lucas 등[Nucl. Acids Res. 24:9(1774-1779(1996)]에 의해 기재된 바와 같으며, 목 적하는 cDNA와 디히드로폴레이트 리덕타아제(DHFR)를 발현시키기 위해 SV40 초기 프로모터/인핸서를 사용한다. DHFR 발현을 통해 형질감염된 플라스미드의 안정적 유지를 선별할 수 있다.

NL1를 코딩하는 플라스미드 DNA 12 ㎍을 상업적으로 이용가능한 형질감염 시약 Superfect

(Qiagen), Dosper

또는 Fugene

(Boehringer Mannheim)을 이용하여 약 1000만개의 CHO 세포에 도입하였다. 상기의 Lucas 등의 기재 방법에 따라 세포를 배양하였다. 추후에 세포를 배양 및 생산하기 위해 약 3 x 10^-7 세포를 아래에서 기재된 방법에 따라 앰플에 동결시켰다.

NL1 플라스미드 DNA를 포함하는 앰플을 수조에 넣어 녹인후 잘 혼합하였다. 내용물을 배지 10 ㎖를 포함하는 원심분리 튜브에 피펫으로 넣어 1000 rpm에서 5분간 원심분리하였다. 상층액을 흡입해 내고 세포를 10 ㎖ 선택 배지(0.2 ㎛ 투석 여과된 5% 소 태아 혈장을 포함하는 0.2 ㎛ 여과된 PS20)에 현탁시켰다. 세포를 90 ㎖ 선택 배지를 포함하는 100 ㎖ 스피너에 분주하였다. 1 내지 2일 후 세포를 150 ㎖ 선택 배지로 채워진 250 ㎖ 스피너로 옮겨 37℃에서 배양하였다. 2 내지 3일 후에 250 ㎖, 500 ㎖ 및 2000 ㎖ 스피너에 3 x 10⁵ 세포/㎖를 접종하였다. 세포를 원심 분리하여 신선한 배지로 교환하고 생산 배지에 재현탁하였다. 1992. 6. 16에 공개된 미국 특허 제 5,122,469호에 기재된 바와 같이 적합한 CHO 배지를 이용하였다. 3 ℓ 생산 스피너에 1.2 x 10⁶ 세포/㎖ 되도록 접종하였다. 제0일에 세 포 수와 pH를 측정하였다. 제1일에 스피너에서 시료를 취해 여과된 공기의 살포를 개시하였다. 제2일에 스피너에서 시료를 취해 온도를 33℃로 바꾸고 500 g/L-글루코스 30 ㎖ 및 10% 발포억제제 0.6 ㎖(예, 35% 폴리디메틸 실록산 에멀젼, Dow Corning 365 Medical Grade Emulsion) 첨가하였다. 생산하는 동안, pH를 약 7.2에서 유지시켜야만 한다. 10일 후 또는 생존률이 70% 미만으로 떨어질 즈음 세포 배양액을 원심분리로 회수하고 0.22 ㎛ 필터로 여과하였다. 여과액을 정제 칼럼에 로딩하기 전까지 4℃에 보관하였다.

NL1-IgG 면역어드헤신은 다음과 같이 조건화된 배지로부터 정제되었다. 조건화된 배지를 20 mM 인산 나트륨 완충액(pH 6.8)로 평형화된 5 ㎖ 단백질 A 칼럼(Pharmacia)에 주입하였다. 로딩후, 평형화 완충용액으로 세척하고 100 mM 시트르산(pH 3.5)으로 용출하였다. 용출된 단백질을 275 ㎕의 1 M Tris 완충액(pH 9)을 포함하는 튜브에 1 ㎖ 분획으로 회수하여 즉시 중화시켰다. 이어서 고도로 정제된 단백질을 25 ㎖의 G25 수퍼파인 (Pharmacia) 칼럼으로 10 mM Hepes, 0.14 M NaCl 및 4% 만니톨을 함유하는 저장 완충액(pH6.8)에서 염을 제거하고 -80℃에서 보관하였다.

정제된 NL1-IgG 단백질을 SDS-PAGE로 확인하고 에드만 분해법으로 수행되는 N-말단 아미노산 서열 분석으로 확인하였다. 단백질은 약 37 내지 38 kD의 분자량을 갖는 것으로 확인되었다.

NL5 및 NL8의 발현은 상기에 기재된 바와 같이 수행되었다. 이들 폴리-His 태그가 부가된 구조은 Ni-NTA 칼럼(Qiagen)을 이용하여 정제하였다. 정제하기 전 에 이미다졸을 5 mM 농도로 조건화된 배지에 첨가하였다. 조건화된 배지를 0.3 M NaCl 및 5 mM 이미다졸을 포함하는 20 mM Hepes, pH 7.4 완충액으로 평형화된 6 ㎖ Ni-NTA 칼럼에 4℃에서 4 내지 5 ㎖/분의 유속으로 주입하였다. 로딩 후에 칼럼을 추가의 평형 완충액으로 세척하고 단잭질을 0.25 M 이미다졸을 포함하는 평형 완충액으로 용출하였다. 이어서 정제된 단백질을 25 ㎖의 G25 수퍼파인 (Pharmacia) 칼럼으로 10 mM Hepes, 0.14 M NaCl 및 4% 만니톨을 함유하는 전장 완충액(pH6.8)에서 염을 제거하고 -80℃에서 보관하였다.

정제된 단백질의 동질성은 SDS-PAGE 및 에드만 분해법으로 수행되는 N-말단 아미노산 서열 분석으로 확인하였다.

실시예 7 : NL1 , NL5 , NL8 및 NL4 의 효모에서의 발현

우선, ADH2/GAPDH 프로모터로부터 NL1, NL5, NL8 또는 NL4의 세포내 생산 또는 분비를 위한 효모 발현 벡터를 제조한다. NL1, NL5, NL8 또는 NL4를 코딩하는 DNA, 선택된 시그날 펩티드 및 프로모터를 NL1, NL5, NL8 또는 NL4를 세포내 발현시키기 위해 선택된 플라스미드 내의 적합한 제한 효소 부위에 삽입한다. 분비를 위해, NL1, NL5, NL8 또는 NL4를 코딩하는 DNA를 ADH2/GAPDH 프로모터, 효모 알파-인자 분비 시그날/리더 서열 및 링커 서열(필요한 경우)를 코딩하는 DNA와 함께 선택된 플라스미드에 클로닝할 수 있다.

이어서, 효모 세포, 예를 들어 효모 균주 AB110을 상기에서 기재된 발현 플라스미드로 형질전환 시키고 선택된 발효 배지에서 배양할 수 있다. 형질 전환된 효모 상층액을 10% 트리클로로아세트산으로 침전시키고 SDS-PAGE로 분리한 후 겔을 쿠마시 블루로 염색하여 분석할 수 있다.

계속해서, 원심분리로 발효 배지로부터 효모 세포를 회수하고 선택된 카트리지 필터를 이용하여 배지를 농축시킴으로써 재조합 NL1, NL5, NL8 또는 NL4를 단리하고 정제할 수 있다. NL1, NL5, NL8 또는 NL4를 포함하는 농축액을 선택된 칼럼 크로마토그래피 수지를 이용하여 추가로 정제할 수 있다.

실시예 8 : NL1 , NL5 , NL8 또는 NL4 의 바큘로바이러스 발현 시스템

다음 방법은 바큘로바이러스 발현 시스템에서 NL1, NL5, NL8 또는 NL4의 재조합 발현에 대하여 기재하고 있다.

NL1, NL5, NL8 또는 NL4를 바큘로바이러스 발현 벡터에 포함된 에피토프 태그의 상류에 융합시킨다. 상기의 에피토프 태그는 폴리-his 태그 및 면역글로블린 태그(IgG의 Fc 영역과 같이)를 포함하고 있다. 상업적으로 이용 가능한 플라스미드, 예를 들어 pVL1393(Novagen)으로부터 유도된 플라스미드를 포함하여 여러 플라스미드를 사용할 수 있다. 간략하게, NL1, NL5, NL8 또는 NL4 또는 NL1, NL5, NL8 또는 NL4의 원하는 부분(예, 트랜스멤브레인 단백질의 세포외 도메인을 코딩하는 서열)을 코딩하는 DNA를 5' 및 3' 영역에 상보적인 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭한다. 이어서 생산물을 선택된 제한 효소로 절단하여 발현 벡터에 서브클로닝한다.

리포펙틴(GIBCO-BRL로부터 상업적으로 이용 가능)으로 상기의 플라스미드 및 BaculoGold™ 바이러스 DNA(Phamingen)를 스포돕테라 프루기페르다(Sf9) 세포(ATCC CRL 1711)에 동시에 형질감염시켜 재조합 바큘로바이러스를 생성한다. 28℃에서 4 내지 5일 배양 후에, 방출된 바이러스를 회수하여 이후의 증폭에 사용한다. 바이러스 감염 및 단백질 발현은 문헌[O'Reilley et al., Baculovirus expression vectors: A laboratory Manual, Oxford: Oxford University Press (1994)]에 기재되어 있는 대로 수행한다.

이어서, 발현된 폴리-his 태그가 부가된 NL1, NL5, NL8 또는 NL4는 예를 들어 Ni^{2 +}-킬레이트 친화도 크로마토그래피로 다음과 같이 정제될 수 있다. 문헌[Rupert et al., Nature, 362: 175-179(1993)]에 따라 추출액을 재조합 바이러스-감염된 Sf9 세포로부터 제조한다. 간략하게, Sf9 세포를 세척하여 초음파 처리 완충액 (25 ㎖ Hepes, pH 7.9; 12.5 mM MgCl₂; 0.1 mM EDTA; 10% 글리세롤; 0.1% NP-40; 0.4 M KCl)에 재현탁시키고 빙상에서 20초간 두차례 초음파 처리한다. 초음파 처리물을 원심분리로 제거하고 상층액을 로딩 완충액(50 mM 인산, 300 mM NaCl, 10% 글리세롤, pH 7.8)에 50배 희석하여 0.45 ㎛ 필터로 여과시킨다. Ni^{2 +}-NTA 아가로즈 칼럼(Quiagen으로부터 상업적 이용 가능)을 5 ㎖ 베드 부피로 준비하여 물 25 ㎖로 세척하고 로딩 완충액 25 ㎖로 평형화시킨다. 여과시킨 세포 추출물을 분당 0.5 ㎖로 칼럼에 로딩한다. 점 분획 회수를 개시할 때 칼럼을 로딩 완충액으로 A₂₈₀ 기준선까지 세척한다. 다음에, 2차 세척 완충액(50 mM 인산; 300 mM NaCl, 10% 글리세롤, pH 6.0)으로 칼럼을 세척하여 비특이적으로 결합된 단백질을 용출시킨다. A₂₈₀이 기준선에 다시 도달하면, 칼럼을 2차 세척 완충액에서 0 내지 500 mM 이미다졸로 구배로 전개시킨다. 1 ㎖ 분획을 회수하여 SDS-PAGE 및 은 염색 또는 알카리 포스파타아제에 결합된 Ni^{2 +}-NTA(Qiagen)로 웨스턴 블롯팅하여 분석한다. 용출된 His₁₀ 태그가 부가된 NL1, NL5 및 NL8을 포함하는 분획을 모아 로딩 완충액에 대해 투석한다.

별법으로, IgG 태그가 부가된 (또는 Fc 태그가 부가된) NL1, NL5 및 NL8의 정제는 공지된 크로마토그래피 기술, 예를 들어 단백질 A 또는 단백질 G 칼럼 크로마토그래피를 이용하여 수행한다.

NL1, NL5 및 NL8은 바큘로바이러스 감염된 Sf9 세포에서 발현되었다. 발현은 실제 0.5 내지 2ℓ 규모로 실시되었지만 더 큰 규모(8ℓ)로 생산하기 위해 스케일 업시킬 수 있다. NL1은 NL1 단백질 세포외 영역이 힌지, CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 IgG1 불변 영역 서열에 융합된 IgG 구조체(NL1-IgG 면역어드헤신)로서 발현되었다. NL5 및 NL8은 폴리-His 태그가 부가된 형태로 발현되었다.

이어서 각각의 코딩 서열의 PCR 증폭 후에 바큘로바이러스 발현 벡터(IgG 융합체의 경우 pb.PH.IgG 및 폴리-His 태그가 부가된 단백질의 경우 pb.PH.His.c)에 서브클로닝하였으며, 리포펙틴(GIBCO-BRL)을 이용하여 벡터 및 BaculoGold™ 바이러스 DNA(Phamingen)를 105 스포돕테라 프르기페르다(Sf9) 세포(ATCC CRL 1711)에 동시에 형질감염시켰다. pb.PH.IgG 및 pb.PH.His는 His 서열 또는 Fc 태그 서열을 포함시키기 위해 변형된 폴리링커 부위를 포함시킨 상업적으로 이용 가능한 바큘로바이러스 발현 벡터 pVL1393(Pharmingen)이다. 세포를 10% FBS(Hyclone)가 보충된 Hink's TNM-FH 배지에서 세포를 배양하였다. 세포를 28℃에서 3일간 배양하였다. 상층액을 회수하고 계속해서 10% FBS로 보충된 Hink's TNM-FH 배지 중의 Sf9 세포를 감염시켜 감염 배수(MOI)가 약 10이 되도록 하는 제1 바이러스 증폭에 사용하였다. 세포를 28℃에서 3일간 배양하였다. 상층액을 회수하여, 히스티딘 태그가 부가된 단백질의 경우 25 ㎖ Ni-NTA 비드(QIAGEN)에 또는 IgG 부가된 단백질의 경우 단백질 A 세파로스 CL-4B 비드(Pharmacia)에 상층액 1 ㎖를 배치 결합시켜 SDS-PAGE 분석을 실시하여 쿠마시 블루 염색으로 이미 공지된 농도의 단백질과 비교하여 바큘로바이러스 발현 벡터 내의 NL1, NL5 및 NL8 구조물의 발현을 측정하였다.

제1 바이러스 증폭 상층액을 ESF-921 배지(Expression Systems LLC)에서 MOI가 약 0.1이 되도록 배양된 Sf9 세포의 스피너 배양액(500 ㎖)을 감염시키는데 사용하였다. 세포를 28℃에서 3일간 배양하였다. 상층액을 회수하여 여과하였다. 스피너 배양액의 발현이 확인될 때까지 필요한 만큼 배치 결합 및 SDS-PAGE 분석을 반복하였다.

형질감염된 세포(0.5 내지 3 ℓ)의 조건화된 배지를 원심분리하여 세포를 제거하고 0.22 ㎛ 필터로 여과하였다. 폴리-His 태그가 부가된 구조물은 Ni-NTA 칼럼(Qiagen)을 이용하여 정제하였다. 정제하기 전에 이미다졸을 5 mM 농도로 조건화된 배지에 첨가하였다. 조건화된 배지를 0.3 M NaCl 및 5 mM 이미다졸을 포함하는 20 mM Hepes 완충액(pH 7.4)으로 평형화된 6 ㎖ Ni-NTA 칼럼에 4℃에서 4 내지 5 ㎖/분의 유속으로 주입하였다. 로딩 후에 칼럼을 추가의 평형 완충액으로 세척하고 단백질을 0.25 M 이미다졸을 포함하는 평형 완충액으로 용출하였다. 이어서 고도로 정제된 단백질을 25 ㎖ G25 수퍼파인(Pharmacia) 칼럼으로 10 mM Hepes, 0.14 M NaCl 및 4% 만니톨을 포함하는 저장 완충액(pH6.8)에서 염을 제거하고 -80℃에서 보관하였다.

단백질의 면역어드헤신(Fc 포함) 구조체는 다음과 같이 조건화된 배지로부터 정제되었다. 조건화된 배질를 20 mM 인산 나트륨 완충액(pH 6.8)로 평형화된 5 ㎖ 단백질 A 칼럼(Pharmacia)에 주입하였다. 로딩후, 평형화 완충용액으로 세척하고 100 mM 시트르산(pH 3.5)으로 용출하였다. 용출된 단백질을 275 ㎖의 1 M Tris 완충액(pH 9)을 포함하는 튜브에 1 ㎖ 분획으로 회수하여 즉시 중화시켰다. 이어서 고도로 정제된 단백질을 상기에 기재된 폴리-His 태그가 부가된 단백질의 경우와 같이 저장 완충액(pH6.8)에서 염을 제거하였다. NL1, NL5 및 NL8 단백질의 동질성을 SDS-PAGE로 확인하고 에드만 분해법으로 수행되는 N-말단 아미노산 서열 분석으로 확인하였다.

실시예 9 : NL1 , NL5 , NL8 또는 NL4 에 결합하는 항체의 제조

본 실시예는 NL1, NL5, NL8 또는 NL4에 특이적으로 결합할 수 있는 단클론 항체를 제조하는 방법이다.

단클론 항체를 생산하는 기술은 당업계에 공지되어 있으며 예를 들어 상기의 문헌(Goding)에 기재되어 있다. 사용될 수 있는 면역원은 본 발명의 정제된 리간드 상동체, 이러한 리간드 상동체를 포함하는 융합 단백질 및 세포 표면에 재조합 리간드 상동체를 발현하는 세포를 포함한다. 숙련자는 부적당한 실험을 실시하지 않고도 면역원을 선택할 수 있다.

마우스, 예를 들어 Balb/c를 프로인드 완전 보조액에 유화된 면역원 1 내지 100 ㎍을 피하 또는 복강내 주사하여 면역화시킨다. 별법으로, 면역원을 MPL-TDM 보조액(Ribi Immunochemical Research, Hamilton, MT)에 유화시켜 동물의 뒷발바닥에 주사하여 면역화시킨다. 이어서 면역화된 마우스를 10 내지 12 일 후에 선택된 보조제 내에 유화된 추가의 면역원으로 부스팅한다. 그 이후, 수주 동안 마우스를 추가 면역 주사로 부스팅할 수 있다. 항체를 검출하기 위한 ELISA 분석법을 시험하기 위해 주기적으로 역회전 출혈법으로 마우스로부터 혈청 시료를 채취한다.

적합한 항체 역가가 검출되면, 항체에 대해 "양성"인 동물에 대해 주어진 리간드를 최종 정맥주사한다. 3 내지 4일 후에 마우스를 희생시켜 비장 세포를 회수한다. 이어서, 비장 세포를 선택된 쥐의 골수종 세포주, 예를 들어 ATCC No. CRL 1597로부터 이용 가능한 P3X63AgU.1와 융합시킨다(35% 폴리에틸렌 글리콜 이용). 융합체는 비 융합 세포, 골수종 하이브리드 및 비장세포 하이브리드의 증식을 억제하는 HAT(하이포잔틴, 아미노프테린 및 티미딘) 배지를 포함하는 96 웰 조직 배양 플레이트에 플레이팅될 수 있는 하이브리도마 세포를 생성한다.

하이브리도마 세포는 항원에 대한 반응성에 대해 ELISA로 스크리닝될 수 있다. 본원의 TIE 리간드 상동체에 대한 목적하는 단클론 항체를 분비하는 "양성" 하이브리도마 세포를 결정하는 방법은 당업계의 숙련자에게 잘 알려져 있다.

양성 하이브리도마 세포는 동계의 Balb/c 마우스가 항-TIE 리간드 상동체 단클론 항체를 포함하는 복수를 생산하도록 복강 내에 주사될 수 있다. 별법으로, 하이브리도마 세포는 조직 배양 플라스크 또는 롤러병에서 배양될 수 있다. 복수 내에서 생성된 단클론 항체는 황산 암모늄 침전, 이어서 겔 배제 크로마토그래피를 이용하여 정제될 수 있다. 별법으로, 항체의 단백질 A 또는 단백질 G 결합을 기초로 하는 친화도 크로마토그래피를 이용할 수도 있다.

실시예 10: 혼합된 림프구 반응( MLR )의 자극 및 억제

혼합된 림프구 반응(MLR) 분석법은 CD4+ T 림프구 기능, 구체적으로 T 림프구의 알로-항원 제시에 반응하여 대한 증식하는 능력을 측정하는 것이다. MLR 분석법의 한가지 방법에서는, 말초혈 단핵 세포(PBMC)의 공여군이 PBMC의 방사선 조사된 자극제군으로 공격받는다. T 림프구가 반응하는 항원은 자극제군의 항원 제시 세포에 의해 발현되고 제시되는 미스매치된 MHC 분자이다. 본 분석법은 제시된 알로-항원의 자극에 반응하는 반응자 T 림프구의 증식을 상승 또는 억제하는 분자를 확인하는 것이다.

MLR 반응을 상승(촉진)시키는 분자는 항원에 대한 면역 반응을 상승시키거나 강화시킨다. 따라서, 상기 분자(또는 그 분자의 작은 분자 또는 항체 작용제)는 면역 반응 상승이 유리한 질병의 치료를 위한 후보가 된다. 또한, 상기 자극 분자의 억제제는 면역 반응의 억제가 유리한 경우에 유용하게 이용될 수 있다. 예를 들어, MLR에서 자극 활성을 갖는 분자를 억제하는 중화 항체 또는 작은 분자 길항제의 이용은 면역 매개된 염증 질환의 치료에 유리할 수 있다. MLR(또는 그의 작은 분자 또는 항체 작용제)를 억제하는 분자는 면역 반응의 억제 및 면역 매개 질병을 약화시키는 데 유용하다.

본 실험에서, 동결된 PBMC를 녹여 RPMI + 10% FBS에 밤새 배양하고 세척하였 다. 세포를 3 x 10⁶ 세포/㎖의 농도로 RPMI + 10% FBS에 재현탁시켰다. 세포 현탁액 100 ㎕를 NL5 및 NL4 시험 시료 100 ㎕와 37℃, 5% CO에서 배양하였다. 제5일에 세포를 6시간 동안 펄스를 인가한 후 회수하였다.

본 분석법에서 NL5는 림프구 증식을 억제하며 NL4는 림프구 증식을 자극한다고 확인되었다.

실시예 11: 유전자 증폭 분석법

본 실시예는 NL8을 코딩하는 유전자가 특정 인간 암의 게놈에서 증폭된다는 것을 보여준다. 증폭은 유전자 산물의 과다 발현과 관련되며, 이는 NL8 단백질이 특정 암, 예를 들어 폐암 및 가능한 다른 암, 예를 들어 직장암, 유방암 및/또는 전립선암의 치료의 유용한 표적이라는 것을 나타낸다. 치료제는 NL8을 코딩하는 유전자의 길항제 형태, 예를 들어 NL8에 대한 쥐-인간 키메라, 인간화 항체 또는 인간 항체 또는 천연 폴리펩티드의 작은 분자 또는 펩티드 길항제가 될 수 있다.

스크리닝을 위한 출발 물질은 여러 암으로부터 단리된 게놈 DNA이다. DNA는 정확하게, 예를 들어 형광측정으로 정량된다. 음성 대조군으로, DNA는 정상의 10명의 건강한 사람의 세포로부터 단리되어 건강한 사람에서의 유전자 카피의 분석 대조군으로 사용되었다. 5' 뉴클레아제 분석법(예, TaqMan™) 및 실시간 정량 PCR(예, ABIPrism7700 Sequence Detection System™(Perkin Elmer, Applied Biosystems Division, Foster City, CA))이 특정 암에서 증폭될 가능성 있는 유전자를 발견하는 데 이용되었다. 결과는 NL8을 코딩하는 DNA가 스크리닝되는 임의의 1차 폐암에서 과잉발현되었는가를 결정하는 데 이용되었다. 결과는 델타(△) CT 단위로 나타낸다. 1 단위는 PCR 1 싸이클 또는 정상에 비해 약 2 배 증폭에 해당하며, 2 단위는 4 배, 3 단위는 8 배 증폭에 해당한다. 정량에는 NL8로부터 유도된 프라이머 및 TaqMan™ 형광을 이용하였다. 고유의 핵산 서열을 포함 가능성이 가장 크고 인트론을 스플라이싱할 가능성이 가장 작은 NL8 유전자 영역, 예를 들어 3' 비번역 부위가 프라이머 유도에 바람직하다. NL8에 사용될 프라이머 및 프로브(정방향 및 역방향 프로브)의 서열은

23339.tm.5 G TCAGCAGGAG CCCAAGTTG (SEQ.ID.NO:33)

23339.tm.3 ACG GTTACACAGG GTGTCTT (SEQ.ID.NO:34)

23339.tm.p TCTGGCCACACCTTCTTTGT GGCTC (SEQ.ID.NO:35)

5' 뉴클레아제 분석 반응은 실시간 동안 증폭을 모니터하기 위해 Taq DNA 폴리머라제의 5' 엑소뉴클레아제 활성을 이용하는 형광 PCR계 기술이다. 두 개의 올리고뉴클레오티드 프라이머는 PCR 반응에 전형적인 앰플리콘을 생산하는데 이용된다. 제3 올리고뉴클레오티드 또는 프로브는 두개의 PCR 프라이머 사이에 위치한 뉴클레오티드 서열을 검출하도록 디자인된다. 프로브는 Taq DNA 폴리머라제 효소에 의해 신장되지 않으며 리포터 형광 염료 및 억제제 형광 염료로 표지된다. 리포터 염료로부터 레이저 유도된 방출은 두개의 염료가 프로브 상에 함께 가까이 위치할 때 억제 염료에 의해 억제된다. 증폭 반응 동안, TAQ DNA 폴리머라제 효소는 주형 의존적 방법으로 프로브를 절단한다. 생성되는 프로브 단편은 용액에서 분리되고 방출된 염료의 시그날은 2차 형광단의 억제 효과를 받지 않는다. 리포터 염 료의 한 분자는 각각의 합성된 신규 분자에 대해 방출되고 억제되지 않은 리포터 염료의 검출은 데이타의 정량적 해석의 기초를 제공한다.

5' 뉴클레아제 실험은 실시간 정량 PCR 장비, 예를 들어 ABI Prism 7700TM Sequence Detection에서 실시된다. 본 시스템은 열 순환기, 레이저, 하전-커플 장비(CCD) 카메라 및 컴퓨터로 구성된다. 본 시스템은 열 순환기에서 96 웰 형식으로 시료를 증폭시킨다. 증폭하는 동안, 레이저 유발된 형광 시그날을 96웰에 광섬유를 통해 실시간으로 모아져 CCD에서 검출된다. 본 시스템은 장치를 작동하고 분석을 위한 소프트웨어를 포함하고 있다.

5' 뉴클레아제 분석 자료는 초기에는 Ct 또는 스레스홀드 사이클로 표현된다. 이것은 리포터 시그날이 형광의 기본 수준 이상으로 축적될 때의 사이클로서 정의된다. △Ct 측정값은 핵산 시료 내의 특정 표적 서열의 출발 카피에 대한 상대적 수치의 양적인 측정치로서 이용된다.

실험방법

DNA 준비

DNA는 1차 종양 및 정상 인간 혈액(대조군)으로부터 준비되었다. Qiagen으로부터 구입한 정제 키트 #13362(각각 400 ㎍ 게놈 DNA 용량에 대한 10개 정제 팁을 포함한다), 완충액 세트 #1960 및 프로테아제 #19155 및 #19101을 이용하여 제조자의 지시에 따라 다음과 같이 단리하였다.

세포 배양액 용해

세포를 세척하고 팁당 7.5 x 10⁸의 농도로 트립신 처리하고 1000 rpm, 4℃에서 5분간 원심분리하고 PBS 재원심분리의 1/2 부피로 다시 세척하였다. 펠렛을 세번 세척하고 재현탁된 세포를 회수하여 PBS로 두차례 세척하였다. 이어서 세포를 10 ㎖ PBS에 재현탁시켰다. 완충액 C1을 4℃에 평형화시켰다. Qiagen 프로테아제 #19155를 차가운 ddH₂O 6.25 ㎖로 희석하여 20 ㎎/㎖의 농도로 만들어 4℃로 평형화하였다. Qiagen RNAse A 원액(100 ㎎/㎖)을 최종 농도 200 ㎍/㎖이 되도록 희석하여 G2 완충액 10 ㎖를 제조하였다.

이어서 완충액 C1(10 ㎖, 4℃) 및 ddH₂O(40 ㎖, 4℃)를 세포 현탁액 10 ㎖에 첨가하여 혼합하고 10분간 빙상에서 인큐베이션하였다. 세포 핵을 Beckman swinging bucket rotor에서 2500 rpm, 4℃로 원심분리하여 펠렛화하였다. 상층액을 제거하고 핵을 2 ㎖ 완충액 C1(4℃) 및 6 ㎖ ddH₂O에 재현탁시키고 2500 rpm, 4℃에서 5분간 원심분리하였다. 이어서 핵을 팁당 200 ㎕를 이용하여 잔여 완충액에 재현탁하였다. G2 완충액(10 ㎖)를 현탁된 핵에 부드럽게 혼합하면서 첨가하였다. 완충액 첨가가 끝나면, 30초 동안 격렬하게 혼합하였다. Qiagen 프로타아제(상기와 같이 준비된 200 ㎕)를 첨가하고 50℃에서 60분간 인큐베이션하였다. 인큐베이션과 원심분리를 용해액이 투명해질 때까지 반복하였다(예를 들어, 추가로 30 내지 60분간 인큐베이션하고 3000 x g, 4℃에서 10분간 원심분리).

고체 인간 종양 시료 준비 및 용해

종양 시료의 무게를 재고 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 넣어 얼음상에 두었다. 프로 세싱은 제제 당 조직이 250 ㎎(1 팁/제제)이 넘지 않도록 제한하였다. 프로테아제 용액을 6.25 ㎖의 차가운 ddH₂O로 최종 농도 20 ㎎/㎖이 되도록 희석하여 4℃에 보관하였다. G2 완충액(20 ㎖)으로 DNAse A를 최종 농도 200 ㎎/㎖(100 ㎎/㎖ 원액으로부터)가 되도록 희석하였다. 에어로졸의 흡입을 피하기 위해 층류 TC 후드 내에서 폴리트론의 큰 팁을 이용하여 종양 조직을 G2 완충액 19 ㎖ 중에서 60초 동안 균질화하고 상온을 유지하였다. 시료 사이에서 폴리트론을 2 ℓ ddH₂O에서, 이어서 G2 완충액(50 ㎖)에서 각각 30초간 2회 회전시켜 세척하였다.

Qiagen 프로테아제(상기 지시대로 준비됨. 1.0 ㎖)를 첨가하고 잘 혼합한 후 50℃에서 3 시간동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션과 원심분리를 용해체가 투명해질 때까지 반복하였다(예를 들어, 추가로 30 내지 60분간 인큐베이션하고 3000 x g, 4℃에서 10분간 원심분리).

인간 혈액 준비 및 용해:

표준 전염성 시약 실험 방법을 이용하여 건강한 지원자로부터 혈액을 채취하여 팁당 10 ㎖ 시료에 시트레이트화하였다. Qiagen 프로테아제를 차가운 ddH₂O 6.25 ㎖로 희석하여 20 ㎎/㎖의 최종 농도로 만들어 4℃에 보관하였다. 10 ㎎/㎖ 원액으로부터 으로 Qiagen RNAse A를 최종 농도 200 ㎍/㎖이 되도록 희석하여 G2 완충액을 제조하였다. 혈액(10 ㎖)을 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 넣고 10 ㎖ C1 및 30 ㎖ ddH₂O(둘다 사전에 4℃로 평형화시킴)을 첨가하고 조성물을 혼합하고 10분간 얼음에 둔다. 세포 핵을 Beckman swinging bucket 회전기에서 2500 rpm, 4℃로 원심 분리하여 펠렛화하고 상층액을 제거하였다. 혼합하면서 핵을 2 ㎖ C1 완충액(4℃) 및 6 ㎖ ddH₂O(4℃)에 재현탁시켰다. 펠렛이 백색이 될때까지 혼합하였다. 이어서 200 ㎕ 팁을 이용하여 잔여 완충액에 핵을 재현탁하였다. G2 완충액(10 ㎖)를 현탁된 핵에 부드럽게 혼합하면서 첨가하고, 30초 동안 격렬하게 혼합하였다. Qiagen 프로타아제(상기와 같이 준비된 200 ㎕)를 첨가하고 50℃에서 60분간 인큐베이션하였다. 인큐베이션과 원심분리를 용해체가 투명해질 때까지 반복하였다(예를 들어, 추가로 30 내지 60분간 인큐베이션하고 3000 x g, 4℃에서 10분간 원심분리).

투명한 용해체의 정제

게놈 DNA를 10 ㎖ QBT 완충액으로 평형화하였다(최대 팁 제제당 1 시료). QF 용출 완충액을 50℃로 평형화하였다. 시료를 30초 동안 혼합시키고 평형화된 팁에 로딩하고 중력에 의해 배수시켰다. 팁을 QC 완충액 15 ㎖로 두차례 세척하였다. QF 완충액(50℃) 15 ㎖로 DNA를 30 ㎖의 멸균시킨 실란된 Corex 튜브로 용출시켰다. 이소프로판올(10.5 ㎖)를 각 시료에 첨가하고, 튜브를 파라핀으로 덮고 DNA가 침전되도록 위 아래로 혼합하였다. 시료를 SS-34 회전기에서 15000 rpm 4℃에서 10분간 원심분리하였다. 펠렛의 위치를 표시하고 상층액을 제거하였다. 이어서 건조 선반에 튜브를 같은 쪽으로 놓고 37℃에서 10분간 건조시키며 시료를 지나치게 건조되지 않도록 주의하였다.

건조후, 펠렛을 1.0 ㎖ TE(pH 8.5)에 녹이고 50℃에서 1 내지 2시간 정치시 켰다. 시료를 4℃에 밤새 두어 계속 용해시켰다. 이어서 DNA 용액을 튜베르큘린 주사기의 26 게이지 바늘로 1.5 ㎖ 튜브로 옮겼다. 이것을 DNA가 분쇄되지 않도록 5회 반복하였다. 이어서 시료를 50℃에서 1 내지 2시간 정치시켰다.

게놈 DNA 정량 및 유전자 증폭 분석법 준비

각 튜브의 DNA 수준은 Beckman DU640 분광계에서 0.1 ㎖ 석영 큐벳을 이용하여 1:20 희석액(5 ㎕ DNA + 95 ㎕ ddH₂O)에 대해 표준 A260, A280 분광측정법으로 정량하였다. A260/A280 비는 1.8 내지 1.9범위였다. 이어서 각 DNA 시료를 약 200 ng/㎖이 되도록 TE(pH 8.5)로 희석하였다. 본래 물질이 고농도(700 ng/㎕)일 경우 물질을 50℃에 1 내지 2 시간 정치시켰다.

희석된 물질(20 내지 600 ng/㎖)에 대해 DNA 형광측정법을 제조사의 지시에 따라 다음과 같이 변형하여 수행하였다. Hoeffer DyDA Quant 200 형광측정계를 약 15분간 예열한다. Hoechst 염료 작용 용액(사용 12시간 전에 준비된 #H33258, 10 ㎕)을 100 ㎖ 1 x TNE 완충액으로 희석하였다. 2 ㎖ 큐벳에 형광측정계 용액을 채우고 장치에 도입한 후, 장치를 0으로 맞춘다. pGEM 3ZF(+)(2 ㎕, 로트 #360851026)을 2 ㎖ 형광측정계 용액에 첨가하고 200 단위로 보정하였다. 이어서 2차로 2 ㎕의 pGEM 3ZF(+) DNA를 시험하고 400 +/- 10 단위가 표시되는지 확인하였다. 이어서 각 시료를 최소한 3회에 걸쳐 측정하였다. 3 시료가 서로 10% 내에 존재할 경우 평균을 계산하여 정량치로 사용하였다.

형광측정법으로 측정된 농도를, 각 시료를 10 ng/㎕가 되도록 ddH₂O로 희석하 는데 사용하였다. 이를 500 내지 1000회 분석에 충분한 양이 되도록 단일 TaqMan 플레이트 분석법을 위한 모든 주형 시료에 대해 동시에 실시하였다. 정상 인간 DNA 및 주형 무첨가 대조군과 함께 단일 플레이트상의 B-액틴 및 GAPDH로 시료를 3회 시험하였다. 시험 DNA의 CT 값에서 뺀 정상 인간 DNA의 CT 값이 +/- 1 CT일 경우에 희석된 시료를 사용하였다. 희석되어 분배된 게놈 DNA를 1㎖ 분액 중에 -80℃에서 보관하였다. 이어서 유전자 증폭 분석법에 이용할 분액을 4℃에 보관하였다. 각각의 1 ㎖ 분액은 8 내지 9 플레이트 또는 64회 시험에 충분하다.

유전자 증폭 결과

유전자 증폭 분석법의 결과는 다음 표에 나타낸다(△Ct 값으로서).

1차 종양	△Ct
인간 폐 SqCCa(LT1)	0.58
인간 폐 NSCCa(LT1a)	1.13
인간 폐 AdenoCa(LT2)	0.13
인간 폐 AdenoCa(LT3)	1.59
인간 폐 SqCCa(LT4)	0.06
인간 폐 AdenoCa(LT6)	0.88
인간 폐 Adeno/SqCCa(LT7)	0.77
인간 폐 AdenoCa(LT9)	1.14
인간 폐 SqCCa(LT10)	1.44
인간 폐 AdenoCa(LT11)	2.05; 1.88; 2.25
인간 폐 AdenoCa(LT12)	1.84
인간 폐 Bac(LT13)	2.36; 1.88; 2.02
인간 폐 SqCCa(LT15)	2.25; 1.97; 2.57
인간 폐 SqCCa(LT16)	0.74; 0.85; 1.23
인간 폐 SqCCa(LT17)	2.37;2.04;2.76
인간 폐 SqCCa(LT18)	-0.08; -0.38; -0.48
인간 폐 SqCCa(LT19)	2.66; -13.56; 3.12
인간 폐 LCCa(LT21)	0.86; 0.45; 1.44

표에 사용된 약자의 설명은 상기에 제시되어있다.

일반적으로, 유전자 카피의 배가(doubling)를 나타내기 때문에 △Ct > 1을 증폭 스코어의 역치로 사용되었다. 상기 표는 여러가지 1차 폐 종양에서 발생하는 NL8의 DNA의 큰 증폭을 나타내며, 이는 이 분자가 암 치료요법에 중요한 표적이라는 것을 의미한다. 특히, NL8 단백질에 대한 길항제(예, 항체)는 암 치료요법에 유용하리라 기대된다.

다른 (예, 직장, 유방, 전립선, 자궁 등) 암 및(또는)암 세포주에서 증폭이 일어나는 지를 결정하기 위해 추가적인 실험이 요구된다. 본 결과는 프레임워크 및 에피센터(epicenter) 맵핑 및 아래에 기술될 추가적인 세포 기초 분석법 및 동물 모델에 의해 수정되고 보충될 수 있다.

실시예 12: 종양 혈관 생성

본 분석법은 VEGF에 의해 CHO 세포의 성장이 직접적 영향을 받지 않음에도 VEGF를 발현하도록 형질 감염된 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포가 누드 마우스의 종양 형성 능력을 획득하였다는 실험적 발견[Ferraa et al., J. Clin. Invest. 91:160(1993)]에 기초하고 있다. 따라서, 정상 CHO 세포는 적당한 증식능을 갖고 있으나 종양 형성능은 이 세포의 혈관 형성 불능에 의해 제한받고 있다. 본 분석법은 다른 분자가 CHO 세포를 종양을 형성하도록 만드는데 있어서 VEGF와 같이 기능을 할 수 있는 지를 확인하는 것이다. 혈관 공급이 없을 때에 영양분의 확산이 종양 소절의 크기를 약 1 ㎜ 직경으로 제한하기 때문에, 이러한 분자의 억제제는 암 치료요법에 이용될 수 있다.

CHO 세포는 NL1을 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터로 안정적으로 형질감염되었다. VEGF를 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터 또는 삽입되지 않은 벡터로 형질감염된 CHO 세포를 양성 및 음성 대조군으로 사용하였다. 세포를 누드 마우스 암컷의 옆구리에 피하주사하였다(10⁶ 세포/마우스, 형질감염체 당 5 마우스). 주사 부위의 종양 소절이 나타나는지 매주 조사하였다. 발생된 소절에 대해 조직학적 평가를 수행하였다.

종양 소절은 NL1을 발현하는 CHO 세포를 갖는 마우스에서 관찰되었으며, 이것은 VEGF와 같이 NL1도 CHO 세포를 종양 발생원으로 만들 수 있다는 것을 의미한다.

실시예 13: 내피 관 형성의 자극

본 분석법은 다음과 같이 Davis 및 Camarillo[Experimental Cell Research 224:39-51(1996)]가 기재한 방법 또는 그로부터 변형한 방법을 따랐다.

실험방법:

HUVE 세포(1차로부터 8 미만의 계대)를 타입 I 랫트 꼬리 콜라겐과 혼합하여 6 x 10⁵ 세포/㎖의 밀도에 최종 농도 2.6 ㎎/㎖이 되도록 하여 96웰 플레이트에 웰 당 50 ㎕를 플레이팅한다. 겔이 고체화되도록 37℃에서 1시간 동안 방치한 후 1% FBS 및 NL6 폴리펩티드 시료(각각 1%, 0.1% 및 0.01% 희석)가 보충된 M199 배양 배지를 웰당 50 ㎕씩 1 μM 6-FAM-FITC 염료와 함께 첨가하여 액포가 형성될 때 염색되도록 한다. 세포를 37℃/5% CO₂에서 48 시간 동안 배양하고 상온에서 10분간 3.7% 포르말린으로 고정하고 PBS로 5차례 세척하였다. 이어서 Rh-팔로이딘으로 4℃에서 밤새 염색한 후 4 μM DAPI로 핵염색을 하였다.

1. 세포사멸 분석법

본 분석법은 외인성 성장 인자(VEGF, bFGF, PMA 부재) 존재시 3 차원 매트릭스에서 세포 생존을 촉진하는 인자를 동정하는 방법이다.

양성 결과는 1 이하이며, 0은 세포사멸이 없고, 1은 20% 미만의 세포가, 2는 50% 미만의 세포가, 3은 50% 이상의 세포가 사멸한 것이다. 이 시스템에서 세포사멸의 자극제가 사포사멸 인자로 예상되며 억제제는 세포사멸을 방지 또는 약화시킨다고 예상된다.

2. 액포 분석법

이 분석법은 bFGF 및 VEGF(40 ng/㎖) 존재시 내피 액포 형성 및 내강 형성을 자극하는 인자를 동정하는 방법이다.

양성 결과는 2 이상인 경우이며, 1은 20% 미만의 세포, 2는 20 내지 50%로 액포 존재, 3은 50% 초과의 세포에 액포가 존재한다. 본 분석법은 세포 흡수, 이온 펌핑, 투과성 및 접합부 형성을 자극하는데 관계하는 인자를 확인하기 위해 디자인된 것이다.

3. 관 형성 분석법

본 분석법은 3 차원 매트릭스에서 내피 관 형성을 자극하는 인자를 확인하기 위한 것이다. 본 분석법은 외인성 성장 인자(VEGF, bFGF)의 존재시 3 차원 매트릭스 내에서 관 유사 구조로 분화되도록 내피세포를 자극하는 인자를 확인하는 것이다.

양성 결과는 2이상인 경우이고, 1은 세포가 모두 둥근 경우, 2는 세포가 모두 신장된 경우, 3은 세포가 약간의 연접 결부와 함께 관을 형성한 경우, 4는 복잡한 관형 망상조직을 형성한 것이다. 본 분석법은 추적, 화학주성, 또는 내피 형태 변형을 자극하는 데 관련된 인자를 확인하는 것이다.

도 17은 1% 희석된 폴리-his에 결합된 NL1 폴리펩티드 및 1% 희석된 완충액 대조군(10 mM HEPES/0.14 M NaCl/4% 만니톨, pH 6.8)의 HUVEC 관 형성에 대한 효과를 보여준다. 또한 IgG 융합체로 시험된 또다른 신규의 TIE 리간드 상동체(NL6) 및 두개의 공지된 TIE 리간드 TIE-1 및 TIE-2의 비교 결과가 도 17에 제시되어 있다.

물질의 기탁

상기에서 지시된 바와 같이 다음 물질들은 미국 메릴랜드 락빌 파그론 드라이브 12301에 소재하는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(ATCC)에 기탁되어 있다.

물질 ATCC 기탁 번호 기탁일

NL-1 DNA 22779-1130 209280 97/9/18

NL-5 DNA 28497-1130 209279 97/9/18

NL-8 DNA 23339-1130 209282 97/9/18

NL-4 DNA 47470-1130P1 209422 97/10/28

이들 기탁은 특허 절차상 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약 및 그의 규칙 (부다페스트 조약 (Budapest Treaty))의 규정 하에 이루어졌다. 이는 기탁일로부터 30년 동안 기탁물의 생존 배양물의 유지를 보장한다. 기탁물은 부다페스트 조약의 협약 하에 ATCC로부터 제넨테크 인크와 ATCC 사이 협정에 따라 분양될 것이며, 이는 관련 미국 특허의 허여시 또는 미국 또는 외국 특허 출원의 공개시 (이 중 먼저인 때) 공공에 대한 기탁물의 배양 프로제니의 영구적이고 비제한적인 분양을 보장하고, 미국 특허 및 상표청장에 의해 35 USC §122 및 그에 따른 미국 특허 및 상표청장의 규칙 (37 CFR §1.14 포함, 특히 886 OG 638 참조)에 따라 권리가 있는 것으로 결정한 이에게 프로제니의 분양을 보장한다.

본 출원의 양수인은 적합한 조건 하에 배양할 때 기탁 물질의 배양물이 사멸하거나 손실되거나 파손된 경우, 그 통지시 물질을 다른 동일한 물질로 즉시 교체할 것임을 동의하였다. 기탁 물질의 분양은 각국 정부의 권한으로 그 특허법에 따라 승인된 권리에 위배하여 본 발명을 실시하도록 허가하는 것으로서 해석되어서는 안된다.

앞서 기술한 명세서는 당업계의 숙련인이 본 발명을 실시할 수 있도록 하기에 충분한 것으로 생각된다. 본 발명은 기탁된 실시태양은 본 발명의 특정 측면의 한 예시로서 의도되는 것이므로 기탁된 구조물의 범위에 제한되지 않고, 기능적으로 동등한 임의의 구조물은 본 발명의 범위 내에 있다. 본원에서 물질의 기탁은 본원에 포함된 기재 내용이 본 발명의 최선의 양식을 포함한 임의의 측면을 실시하기에 부적절하다는 것을 의미하지는 않으며, 특허 청구 범위의 범위를 명세서에서 나타내는 구체적인 설명에 제한하려는 것으로 해석되어서는 안된다. 실제로, 앞서의 상세한 설명으로부터 본원에 나타내고 기술된 것 이외에 본 발명의 다양한 변형이 당업계의 숙련인에게는 명백하고, 이는 첨부된 특허 청구의 범위 내에 있을 것이다.

본 발명은 TIE 리간드 NL1, NL5, NL8 및 NL4를 코딩하는 단리된 핵산 분자, 상기의 핵산 분자에 의해 코딩되는 단백질, 또한 상기한 핵산 및 단백질 분자를 제조하고 이용하기 위한 방법과 수단을 제공하며, 이로써 각종 질병 치료 또는 예방용 조성물 및 이를 위한 방법이 제공된다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims (17)

1. SEQ.ID.NO:4의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 단리된 핵산 분자.
2. 제1항에 있어서, SEQ.ID.NO:3의 코딩 영역 서열을 갖는 단리된 핵산 분자.
3. 제1항에 있어서, SEQ.ID.NO:3의 피브리노겐 유사 도메인 코딩 서열을 갖는 단리된 핵산 분자.
4. 제1 내지 3항 중 어느 한 항의 핵산 분자를 포함하는 벡터.
5. 제1 내지 3항 중 어느 한 항의 핵산 분자로 형질 전환된 재조합 숙주 세포.
6. 제5항에 있어서, 원핵세포인 재조합 숙주 세포.
7. 제5항에 있어서, 진핵세포인 재조합 숙주 세포.
8. SEQ.ID.NO:4의 아미노산 서열을 갖는 단리된 폴리펩티드.
9. 제8항의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체.
10. 제9항에 있어서, 단클론 항체인 항체.
11. 제10항에 있어서, 비인간의 상보성 결정 영역(CDR) 잔기 및 인간의 프레임워크(FR) 잔기를 갖는 항체.
12. 제9항에 있어서, 표지된 항체.
13. SEQ.ID.NO:4의 아미노산 서열을 갖는 단리된 폴리펩티드 및 담체를 포함하는, 면역 매개된 염증 질환 치료용 제약 조성물.
14. TIE 수용체를 발현하는지 여부를 확인할 세포를, SEQ.ID.NO:4의 아미노산 서열을 갖는 검출가능하게 표지된 폴리펩티드와, 상기 폴리펩티드가 상기 수용체에 결합하는 것을 허용하는 조건하에서 접촉시키는 단계, 및

    그 결합을 모니터링하는 단계

    를 포함하는, TIE 수용체를 발현하는 세포를 확인하는 방법.
15. 제8항의 폴리펩티드를 포함하는 것으로 추정되는 세포를 상기의 폴리펩티드에 대한 항체에 노출시키는 단계, 및

    상기 항체의 상기 세포에 대한 결합을 측정하는 단계

    를 포함하는, 제8항의 폴리펩티드의 존재를 결정하는 방법.
16. SEQ.ID.NO:4의 아미노산 서열을 갖는 단리된 폴리펩티드 및 담체를 포함하는 제약 조성물을 인간을 제외한 대상체에게 투여하는 단계

    를 포함하는, 인간을 제외한 대상체에서 면역 매개된 염증 질환을 치료하는 방법.
17. (a) 용기;

    (b) 용기상의 라벨; 및

    (c) 상기 용기 내에 포함된 활성제를 포함하는 조성물

    을 포함하는 제조품으로서, 상기 조성물은 면역 매개된 염증 질환의 치료에 효과적이고, 상기 용기상의 라벨은 상기 조성물이 면역 매개된 염증 질환을 치료하는데 사용될 수 있음을 나타내며, 상기 조성물 중의 활성제는 SEQ.ID.NO:4의 아미노산 서열을 갖는 단리된 폴리펩티드인 제조품.

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