KR101698015B1 - Ｃ형 간염 바이러스의 감염 억제용 모노클로날 항-클라우딘 １ 항체 - Google Patents

Abstract

본 발명은, 세포 표면에서 인간 클라우딘-1의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하고 이에 따라 감수성 세포로의 HCV 진입을 억제하고 상기 세포의 HCV 감염을 예방하는 모노클로날 항체; 및 상기 모노클로날 항체를 생성하는 하이브리도마 세포주를 제공한다. 또한, 상기 항체를 포함하는 시약, 및 상기 항체를 포함하는 약학적 조성물이 제공된다. 또한, 본 발명의 모노클로날 항체, 또는 이의 약학적 조성물의 투여에 의한 HCV 감염의 치료 또는 예방 방법이 제공된다.

Description

Ｃ형 간염 바이러스의 감염 억제용 모노클로날 항-클라우딘 １ 항체{MONOCLONAL ANTI-CLAUDIN 1 ANTIBODIES FOR THE INHIBITION OF HEPATITIS C VIRUS INFECTION}

본 출원은 2008년 9월 25일에 출원된 유럽특허출원 EP 08 305 597.0을 우선권으로 주장한다. 상기 유럽특허출원은 전체로서 본원에 참조로 삽입된다.

C형 간염 바이러스(HCV)는 세계적으로 중요한 건강 문제로서, 유럽연합 내의 5백만명 이상의 감염자를 포함하여 전세계적으로 1억 5천만명 내지 2억명의 감염자가 추산된다(Pawlotsky, 2004). 세계 보건 기구에 따르면, 3백만명 내지 4백만명의 신규한 감염자가 매년 발생하고 있다. 상기 감염은 종종 증상이 없지만; HCV-감염된 자의 대부분에게서 만성 감염이 진행된다(Hoofnagle, 2002; Lauer, 2001; 및 Seeff, 1995). 만성 HCV 감염은 섬유증 및 지방증을 포함하는 심각한 간 질환을 종종 유발한다(Chisari, 2005). 만성 HCV 감염 환자의 약 20%는 간경변이 진행되며, 이 경우의 5%는 간세포 암종으로 진행된다(Hoofnagle, 2002).

만성 HCV 감염은 간 이식에 대한 선행 지표이다(Seeff, 2002). 불행하게도, 간 이식은 C형 간염에 대한 치료법이 아니며; 바이러스의 재발은 변함없는 문제가 되며 이식 손상의 원인이 된다(Brown, 2005). HCV에 대해 보호하는 백신은 유효하지 않다. 현재 치료법에는 두 개의 비특이적 항바이러스제, 리바비린 및/또는 인터페론-알파(IFN-α)의 투여가 포함된다. 페길화된 IFN-α 및 리바비린의 조합 치료를 사용하여, 만성 C형 간염을 앓는 환자의 약 50%에서 지속적인 청소율이 달성된다. 그러나, 다수의 환자들은 상기 조합 중 하나의 성분에 대해 사용이 금지되는 사유를 가지거나, 상기 치료를 견딜 수 없거나, IFN 치료법에 전혀 반응하지 않거나, 또는 투여가 중단될 때 재발을 나타낸다. 제한된 유효성 및 실질적인 부작용, 예컨대 호중구감소증, 용혈성 빈혈 및 중증 우울증 외에, 현재 항바이러스 요법의 특징은 또한 높은 비용이다.

최근까지, HCV 감염을 방지하기 위해 더 효과적인 치료법의 개발은 HCV 복제를 지지하는 세포 배양계의 결핍에 의해 제한되었다. 세포 배양에서 감염성 HCV의 왕성한 생성은 C형 전격 간염(JFH-1)을 앓는 일본인 환자의 혈액으로부터 유래된 특유의 HCV 게놈을 사용하여 이제 달성되었다(Wakita, 2005; Lindenbach, 2005; Zhong, 2005). 세포 배양에서 감염성 입자를 배출하는 HCV(HCVcc)의 JFH-1 균주의 능력 및 레트로바이러스의 HCV 위형 입자(HCVpp)의 발달(Bartosch, 2003; Hsu, 2003)은 HCV 진입 및 복제의 메카니즘에 대한 연구를 가능하게 하였으며, 이는 잠재적인 치료 표적 생체분자의 동정을 야기하였다.

HCV는 플라비비리대 과 중에서 헤파시바이러스 속으로 분류되는 양성 가닥 RNA 바이러스이다. HCV 게놈의 주요 오픈 리딩 프레임의 번역은 대략 3000개의 아미노산의 길다란 다단백질을 생성하며, 이는 세포 및 바이러스의 프로테아제의 공동 작용에 의해 번역과 동시에 그리고 번역 이후에 두 개의 엔벨로프 당단백질(E1 및 E2)을 포함하는 10개 이상의 성숙 단백질로 분할된다. HCV는 간세포의 표면에서 분자 또는 수용체에 부착됨으로써 감염을 개시한다. 현재 증거에 따르면, 네 개 이상의 숙주세포 분자들이 시험관내 HCV 진입에 중요하다고 제안되고 있다: 테트라스파닌 CD81(Pileri, 1998), 스캐빈저 수용체 클래스 B 타입 I(SB-RI)(Zeisel, 2007; Bartosch, 2003; Grove, 2007; Kapadia, 2007; Scarselli, 2002), 오클루딘(Ploss, 2009) 및 클라우딘-1(CLDN1), 내재 막 단백질 및 밀착연접 가닥의 성분(Evans, 2007). HCV 당단백질은 CD81 및 SR-BI와 직접적으로 상호작용한다고 보고되었다(Cocquerel, 2006). CLDN1의 태그(tag)된 버전에 의한 돌연변이생성 및 항체-차단 연구에 따르면, 제1 세포외 루프가 HCV와의 상호작용에 관여한다고 제안된다(Evans, 2007). 그러나, 각각의 수용체에 의해 수행되는 정확한 역할은 불명확하다.

HCV에 대한 상기 수용체 또는 공-수용체의 동정은 HCV 감염의 예방 및/또는 치료를 위한 후보 약물로서 치료 및 예방 제제를 개발하기 위한 새로운 길을 열었다. 따라서, 예를 들어 Nicosia 등은 용량-의존적 방식으로 간종양 세포의 HCVcc 감염을 효과적으로 차단하고, SR-BI에 결합하는 HCV E2를 억제하는, 자연적 인간 SR-BI에 대한 모노클로날 항체를 제조하였다(Catanese, 2007; WO 2006/005465). 유럽특허출원 EP 1 256 348에는 HCV E2 및 CD81의 결합을 억제하는 항바이러스 효과를 갖는 물질(예컨대, 항체, 단백질, 황산화 다당류 및 저분자 화합물)이 개시되어 있다. 국제특허출원 WO 2007/130646에는 HCV 감염을 예방하는 클라우딘(Claudin)-1 치료법과의 HCV 상호작용에 개입하는 제제를 동정하기 위한, 시험관내 및 세포-기초 어세이가 개시되어 있다. HCV에 대해 신규한 치료적 접근법의 개발은 매우 우선적인 목표로 남아있기 때문에, 감수성 세포로의 HCV 진입에 영향을 미치는 제제가 현재 HCV 요법에 대해 효과적이고 안정적인 대안을 구성할 수 있다는 점이 입증될 때, 이러한 연구는 고무적이다.

본 발명의 요약

본 발명은 HCV 감염 및 HCV-관련 질환의 예방 및/또는 치료를 위한 표적 시스템 및 전략에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 HCV의 공지된 수용체인 클라우딘-1의 세포외 도메인에 결합함으로써 HCV-숙주세포의 상호작용을 저해하는 항체에 관한 것이다. 이론에 얽매이지 않을 때, 세포 표면에서 클라우딘-1의 세포외 도메인에 상기 항체가 결합되는 것은 세포에 대한 HCV의 진입을 억제하거나 차단하고, 이에 따라 세포의 HCV 감염을 예방하는 것으로 여겨진다. 본 출원인은, 항-클라우딘 항체는 검출가능한 클라우딘-E2 상호작용의 부재하에서 엔벨로프 당단백질 E2 및 비리온이 HCV 허용 세포주에 결합되는 것을 억제한다는 점을 입증하였다. 본 출원인은, 상기 항체는 엔벨로프 당단백질 E2와 세포 표면이 연관되는 것을 감소시키고, CD81-클라우딘-1 상호작용을 방해함으로써, HCV 감염성을 중화시킨다는 점을 입증하였다. 상기 항체는 HCV 감염(급성 또는 만성 HCV 감염) 및 HCV-관련 질환 또는 장애(예컨대, 간 염증, 간경변, 및 간세포 암종 및 간 이식)의 예방 또는 치료에 사용될 수 있다. 본원에서 제공되는 것과 같이 세포내로 HCV의 진입을 억제하는 항체는 특히 항바이러스 치료법으로서 매력적이다. HCV 진입의 억제제는 원형질막을 가로지르거나 또는 세포내에서 변이될 필요가 없다. 또한, 바이러스의 진입은 바이러스 막과 세포 막의 보존적 구조에 의해 매개되기 때문에, 바이러스 진입의 항체 억제제는 매우 효과적이며 바이러스의 내성의 발달에 대해 덜 민감할 수 있다.

보다 구체적인 일 측면에서, 본 발명은 인간 클라우딘-1의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체를 분비하는 하이브리도마(hybridoma) 세포주를 제공한다. 특히, 본 출원인은 2008년 7월 29일에 DSMZ(Deutsche Sammlung von Mikro-organismen und Zellkuturen GmbH, Inhoffenstraße 7 B, 38124 Braunschweig, 독일)에 상기 하이브리도마 세포주 8개를 기탁하였다. 이 세포주들에는 접근번호 DSM ACC2931, DSM ACC2932, DSM ACC2933, DSM ACC2934, DSM ACC2935, DSM ACC2936, DSM ACC2937 및 DSM ACC2938이 배정되었다. 상기 기탁은 특허절차상 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약(부다페스트 조약)의 규정에 따라 이루어졌다.

또다른 측면에서, 본 발명은 접근번호 DSM ACC2931, DSM ACC2932, DSM ACC2933, DSM ACC2934, DSM ACC2935, DSM ACC2936, DSM ACC2937 및 DSM ACC2938로 기탁된 하이브리도마 세포주 중 어느 하나에 의해 분비되는 모노클로날 항체를 제공한다. 상기 모노클로날 항체는 하이브리도마 배양물로부터 분리 및/또는 정제가 될 수도 있으며, 그렇지 않을 수도 있다. 특정 구현예에서, 상기 모노클로날 항체는 rIgG2a 중(H)쇄 및 카파(kappa) 경(L)쇄 이소타입(isotype)의 면역글로불린이다. 또다른 구현예에서, 상기 모노클로날 항체는 rIgG2b 중(H)쇄 및 카파 경(L)쇄 이소타입의 면역글로불린이다.

본 출원인에 의해 입증된 바와 같이, 상기 기탁된 하이브리도마 세포주에 의해 분비된 모노클로날 항체는 인간 클라우딘-1의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하고, 시험관내 HCV 감염을 효과적으로 억제한다. 또한, 본 발명은 본 발명의 모노클로날 항체의 생물학적으로 활성인 임의의 단편, 즉 HCV-숙주세포의 상호작용의 저해, 및/또는 인간 클라우딘-1의 세포외 도메인에 특이적으로 결합, 및/또는 HCV-감수성 세포에 대한 HCV 진입의 억제 또는 차단, 및/또는 감수성 세포의 HCV 감염의 예방 또는 감소를 하는, 모노클로날 항체의 기능을 보유하는 임의의 단편 또는 절편을 포함한다.

보다 일반적으로, 본 발명에는 본 발명의 항-클라우딘-1 모노클로날 항체 또는 이의 단편을 포함하는 임의의 분자가 포함되며, 또한 항체-관련 분자들이 "유래된" 본 발명의 모노클로날 항체의 하나 이상의 생물학적으로 관련되는 성질을 보유하는 한, 키메라(chimeric) 항체, 인간화 항체, 탈면역 항체, 및 하이브리도마 세포주에 의해 분비되는 것과 같은 본 발명의 항-클라우딘-1 모노클로날 항체의 중쇄 또는 경쇄 가변 영역의 하나 이상의 상보적 결정 영역(CDR)을 포함하는 항체-유래 분자가 포함되며, 또한 Fab 단편, F(ab')₂ 단편, Fd 단편, Sc 항체(단쇄 항체), 디아체(diabody), 각각의 항체 단일 경쇄, 각각의 항체 중쇄, 항체 사슬과 다른 분자 사이의 키메라 융합, 및 항체 컨쥬게이트(conjugate), 예컨대 진단제(검출가능부) 또는 치료제에 컨쥬게이트된 항체와 같은 분자들이 포함된다. 생물학적으로 관련되는 성질은 HCV-숙주세포의 상호작용의 저해, 인간 클라우딘-1의 세포외 도메인에 대한 특이적인 결합, HCV-감수성 세포에 대한 HCV 진입의 억제 또는 차단, 및/또는 감수성 세포의 HCV 감염의 예방 또는 감소를 시키는 능력일 수 있다. 바람직한 일부 구현예에서, 본 발명의 모노클로날 항체의 생물학적으로 활성인 단편은 인간 클라우딘-1의 세포외 도메인에 특이적으로 결합한다.

본 출원인은 상기 기탁된 하이브리도마 세포주에 의해 분비된 모노클로날 항체가 인간 클라우딘-1 제1 세포외 루프에서 보존 모티프(motif)의 돌연변이에 의해 강하게 영향을 받는 에피토프를 인식한다는 것을 입증하였다. 상기 모티프는 W(30)-GLW(51)-C(54)-C(64)이다. 따라서, 특정 구현예에서, 본 발명에 따른 모노클로날 항체 또는 이의 생물학적으로 활성인 단편은 클라우딘-1 제1 세포외 루프에서 보존 모티프 W(30)-GLW(51)-C(54)-C(64) 구조에 의존하는 에피토프를 인식한다.

이와 유사하게, 본 출원인은 상기 기탁된 하이브리도마 세포주에 의해 분비된 모노클로날 항체가 뮤린(murine) 클라우딘-1과 교차반응하지는 않지만, 비인간 영장류 시노몰구스 원숭이(마카카 파시쿨라리스)에서 그의 상동체(orthologue)와 교차반응한다는 점을 입증하였다. 따라서, 특정 구현예에서, 본 발명에 따른 모노클로날 항체 또는 이의 생물학적으로 활성인 단편은 설치류의 클라우딘-1에 결합하지 않지만, 비인간 영장류의 클라우딘-1에 결합한다.

일반적으로, 본 발명의 항체는 HCV 허용 세포주에 대한 엔벨로프 당단백질 E2 또는 감염성 비리온의 결합을 억제하며; CD81-클라우딘-1의 연합(들)을 억제한다.

본 발명의 모노클로날 항체 및 항체-관련 분자는 다양한 예방 및 치료적 요법에 적용될 수 있다. 따라서, 또다른 측면에서, 본 발명의 모노클로날 및 항체-관련 분자는 세포(예컨대, 감수성 세포 또는 감수성 세포들의 군)의 HCV 감염을 예방하기 위해; 대상체에서 HCV 감염 또는 HCV-관련 질환을 예방 또는 치료하기 위해; 만성 HCV 감염을 제어하기 위해; 및 간 이식 환자에게서 HCV 재발을 예방하기 위해 제공된다. HCV 감염은 유전자형 1, 유전자형 2, 유전자형 3, 유전자형 4, 유전자형 5 및 유전자형 6으로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자형의 HCV, 특히 아형 1a, 아형 1b, 아형 2a, 아형 2b, 아형 2c, 아형 3a, 아형 4a-f, 아형 5a 및 아형 6a로 이루어진 군으로부터 선택된 아형의 HCV에 기인할 수 있다.

이와 관련된 측면에서, 본 발명은 감수성 세포를 본 발명의 유효량의 항체 또는 항체-관련 분자와 접촉시키는 단계를 포함하는, HCV와의 접촉의 결과로서 감수성 세포가 HCV로 감염될 가능성을 감소시키기 위한 방법을 제공한다. 또한, 본 발명의 유효량의 항체 또는 항체-관련 분자를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, HCV와의 접촉의 결과로서 대상체의 감수성 세포가 HCV로 감염될 가능성을 감소시키기 위한 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 본 발명의 유효량의 모노클로날 항체 또는 항체-관련 분자를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 HCV 감염 또는 HCV-연관 질환(예컨대, 간 질환 또는 병리학)을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 본 발명의 유효량의 모노클로날 항체 또는 항체-관련 분자를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 만성 HCV 감염을 제어하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명의 유효량의 모노클로날 항체 또는 항체-관련 분자를 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 간 이식 환자에게서 HCV의 재발을 예방하는 방법을 제공한다. 대상체에게 본 발명의 항체 또는 항체-관련 분자를 투여하는 것은, 예를 들어, 비경구, 에어로졸, 경구 및 국부 경로를 포함하는 임의의 적합한 경로에 의해 수행될 수 있다. 본 발명의 모노클로날 항체 또는 항체-관련 분자는 단독으로 투여될 수도 있으며, 항바이러스제와 같은 치료제와 조합하여 투여될 수도 있다.

본 발명의 모노클로날 항체 및 항체-관련 분자는 그 자체로 투여될 수도 있고, 약학적 조성물로서 투여될 수도 있다. 따라서, 또다른 측면에서, 본 발명은 HCV 감염 및 HCV-연관 질환의 치료 및/또는 예방을 위한 약제, 약학적 조성물 또는 약학적 키트를 제조하는데 있어서, 본 발명의 모노클로날 항체 또는 항체-관련 분자의 용도를 제공한다.

이와 관련된 측면에서, 본 발명은 유효량의 본 발명의 모노클로날 항체 또는 항체-관련 분자 및 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 특정 구현예에서, 상기 약학적 조성물은 항바이러스제와 같은 부가적 치료제와 조합하여 투여하기 위해 적용된다. 또다른 구현예에서, 상기 약학적 조성물은 또한 항바이러스제와 같은 부가적 치료제를 포함한다. 본 발명의 약학적 조성물 및 방법에 사용하는데 적합한 항바이러스제에는 인터페론(예컨대, 인터페론-알파, 페길화 인터페론-알파), 리바비린, 항-HCV (모노클로날 또는 폴리클로날) 항체, RNA 폴리머라제 억제제, 프로테아제 억제제, IRES 억제제, 헬리카제 억제제, 안티센스 화합물, 리보자임, 및 이들의 임의의 조합이 포함되지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

검출가능부에 컨쥬게이트될 때, 본 발명의 모노클로날 항체 또는 항체-관련 분자는 다양한 비치료적 방법, 예를 들어 암과 같은 특정 질환의 진단 및/또는 예측에 적용될 수 있다. 실제로, 클라우딘-1의 발현 수준은 다양한 암에 대해 유용한 진단 또는 예측 마커인 것으로 입증되었다. 따라서, 또다른 측면에서, 본 발명은 특정 암의 진단 및/또는 예측을 위한 조성물 또는 키트를 제조하는데 있어서, 본 발명의 모노클로날 항체 또는 항체-관련 분자의 용도를 제공한다.

이와 관련된 측면에서, 본 발명은 생물학적 샘플에서 클라우딘-1을 검출하는 방법으로서, 생물학적 샘플에 존재하는 항체와 클라우딘-1 사이에 항체-클라우딘-1 복합체가 형성되도록 하는 시간 및 조건 하에서 생물학적 샘플을 본 발명의 항체와 접촉시키는 단계; 및 형성된 임의의 항체-클라우딘-1 복합체의 존재를 검출(및/또는 정량화)하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 상기 방법에서 사용되는 본 발명의 항체(또는 항체-관련 분자)는 바람직하게는 검출가능부에 컨쥬게이트된다. 특정 구현예에서, 상기 생물학적 샘플은 대상체, 예를 들어 암을 갖는 것으로 의심되는 대상체로부터 수득된다. 진단 또는 예측은, 형성된 항체-클라우딘-1 복합체의 존재, 부재 또는 양에 기초하여, 예를 들어 건강한 대상체로부터 수득된 생물학적 샘플에 대해 동일한 조건하에서 수득된 결과와 비교한 후에 제공될 수 있다.

하기의 바람직한 구현예들의 상세한 설명을 읽은 당업계의 통상의 지식을 가진 자라면, 본 발명의 여러가지의 목적, 이점 및 특징들을 명확하게 알 수 있을 것이다.

정의

본 명세서에서 사용되는 용어들은 하기에서 정의된다.

본원에서, "대상체"는 C형 간염 바이러스(HCV)의 숙주일 수 있지만, 바이러스로 감염되거나 감염되지 않을 수 있으며 및/또는 HCV-관련 질환을 앓거나 앓지 않을 수 있는, 인간 또는 다른 포유류(예컨대, 영장류, 개, 고양이, 염소, 말, 돼지, 마우스, 래트, 토끼 등)을 나타낸다. 비인간 대상체는 형질전환되거나 변이된 동물일 수 있다. 본 발명의 다수의 구현예에서, 대상체는 인간이다. 이러한 구현예에서, 상기 대상체는 종종 "개체"로서 나타낸다. "개체"라는 용어는 특정 연령을 지칭하는 것이 아니므로, 신생아, 유아, 청소년 및 성인을 포함한다.

본원에서, "HCV"는 임의의 주요 HCV 유전자형(genotype), 아형(subtype), 분리주(isolate) 및/또는 유사종(quasispecies)을 나타낸다. HCV 유전자형에는 유전자형 1, 2, 3, 4, 5 및 6이 포함되지만, 이에 한정되지 않으며; HCV 아형에는 아형 1a, 1b, 2a, 2b, 2c, 3a, 4a-f, 5a 및 6a가 포함되지만, 이에 한정되지 않는다.

"HCV로 고통받는"과 "HCV로 감염된"이라는 용어는 본원에서 상호교환되어 사용된다. 상기 용어가 대상체와 관련하여 사용될 때, 이는 HCV에 의해 감염된 하나 이상의 세포를 갖는 대상체를 나타낸다. "HCV 감염"은 HCV 또는 HCV 엔벨로프 당단백질-양성 세포와 표적 세포막의 융합과 같은 방식에 의해 표적 세포로 HCV 유전 정보가 도입되는 것을 나타낸다.

"HCV-관련 질환"과 "HCV-연관 질환"이라는 용어는 본원에서 상호교환되어 사용된다. 이는 HCV에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 야기되거나 및/또는 연관되는 것으로 알려지거나 의심되는 임의의 질환 또는 장애를 나타낸다. HCV-관련(또는 HCV-연관) 질환에는 다양한 간 질환, 예컨대 급성 간염, 만성 간염, 간경변 및 간세포 암종의 무증상 보균 상태가 포함되지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 용어에는, 감염이 임상적으로 나타나는지 여부에 관계없이 잠재적, 지속적 및 무증상 감염을 포함하는 임의의 HCV 감염의 징후 및 부작용들이 포함된다.

"치료"는 본원에서 (1) 질환 또는 상태(예컨대, HCV 감염 또는 HCV-관련 질환)의 개시의 지연 또는 예방; (2) 질환 또는 상태의 징후의 진행, 중대화 또는 악화의 둔화 또는 중지; (3) 질환 또는 상태의 징후의 개선; 또는 (4) 질환 또는 상태의 치료를 목적으로 하는 방법 또는 과정을 나타내기 위해 사용된다. 예방적 또는 예비적인 작용을 위해, 질환 또는 상태가 개시되기 전에 치료가 수행될 수 있다. 선택적으로 또는 부가적으로는, 치료적인 작용을 위해 질환 또는 상태가 개시된 후에 치료가 수행될 수 있다.

본원에서, "약학적 조성물"은 본 발명의 유효량의 하나 이상의 항체(또는 이의 단편), 및 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 것으로 정의된다.

본원에서, "유효량"은 의도한 목적(들), 예컨대 세포, 조직, 기관계 또는 대상체에서 원하는 생물학적 또는 의학적 반응을 충족시키기에 충분한 화합물, 제제, 항체 또는 조성물의 양을 나타낸다. 예를 들어, 본 발명의 특정 구현예에서, 상기 목적(들)은 HCV 감염의 예방; HCV-관련 질환의 개시의 예방; HCV-관련 질환(예컨대, 만성 C형 간염, 간경변 등)의 징후의 진행, 중대화 또는 악화의 둔화, 경감 또는 중지; 상기 질환의 징후의 개선; 또는 HCV-관련 질환의 치료일 수 있다.

"약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제"는, 유효성분(들)의 생물학적 활성의 유효성을 간섭하지 않고, 투여되는 농도에서 숙주에 과도하게 독성을 나타내지 않는, 매개체를 나타낸다. 상기 용어에는 용매, 분산제, 매질, 코팅제, 항균제 및 항진균제, 등장제 및 흡착 지연제 등이 포함된다. 약학적으로 활성인 물질을 위한 상기 매질 및 제제의 사용은 당업계에 잘 알려져 있다(예를 들어 "Remington's Pharmaceutical Sciences", E.W. Martin, 제18판, 1990, Mack Publishing Co.: Easton, PA, 이는 전체로서 본원에 참조로 삽입됨).

"항체"는 본원에서 특이적 에피토프에 결합하는 임의의 면역글로불린(즉, 온전한 면역글로불린 분자, 면역글로불린 분자의 활성 부분 등)을 나타낸다. 상기 용어에는 모노클로날 항체 및 폴리클로날 항체가 포함된다. 특이적 결합 능력을 유지하는 항체의 모든 유도체 및 단편들은 상기 용어에 또한 포함된다. 상기 용어는 또한 면역글로불린-결합 도메인에 상동성이거나 매우 상동성인 결합 도메인을 갖는 임의의 단백질도 포함한다. 이러한 단백질은 천연원으로부터 유래될 수 있거나, 부분적으로 또는 전체적으로 합성하여 제조될 수 있다.

"특이적 결합"은 항체와 관련하여 사용될 때, 예정된 항원에 결합하는 항체를 나타낸다. 통상적으로, 항체는 1x10⁷ M^-1 이상의 친화력을 가지고 결합하며, 비특이적 항원(예컨대, BSA, 카세인)에 결합하기 위한 친화력보다 2배 이상 더 큰 친화력으로 예정된 항원에 결합한다.

"인간 클라우딘-1 또는 인간 CLDN1"은 NCBI 접근번호 NP_066924의 서열을 갖는 단백질, 또는 HCV 허용 인간 군에서 통상적으로 발견되는 임의의 자연발생 변이체를 나타낸다. 클라우딘-1의 "세포외 도메인" 또는 "엑토도메인(ectodomain)"은 세포외 공간(즉, 세포 밖의 공간)으로 연장된 클라우딘-1 서열의 영역을 나타낸다.

"감수성(susceptible) 세포"와 "HCV-감수성 세포"라는 용어는 상호교환되어 사용된다. 이는 HCV로 감염될 수 있는 임의의 세포를 나타낸다. 감수성 세포에는 간장 또는 간 세포, 일차 세포, 간종양 세포, CaCo2 세포, 수상돌기 세포, 태반 세포, 자궁내막 세포, 림프절 세포, 림프계 세포(B 세포 및 T 세포), 말초혈액단핵 세포 및 단핵백혈구/대식세포가 포함되지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

"HCV 감염의 예방, 억제 또는 차단"이 본 발명의 항체 또는 항체-관련 분자와 관련하여 사용될 때, 감수성 세포 또는 감수성 세포군으로 도입되는 HCV 유전 정보의 양을 항체 또는 항체-관련 분자의 부재하에서 도입되는 양보다 감소시키는 것을 의미한다.

"분리된"이라는 용어가 단백질 또는 폴리펩티드와 관련하여 본원에서 사용될 때, 단백질 또는 폴리펩티드의 기원 또는 조작이 천연적으로 결합되어 있거나 또는 초기에 수득될 때 결합되어 있는 성분들의 적어도 일부로부터 떨어져나간 단백질 또는 폴리펩티드를 의미한다. 선택적으로 또는 부가적으로는, "분리된"은 관심대상인 단백질 또는 폴리펩티드가 사람의 힘으로 생성되거나 합성된 것을 의미한다.

"단백질", "폴리펩티드" 및 "펩티드"라는 용어는 본원에서 상호교환되어 사용되며, 이는 다양한 길이의 아미노산 서열로서, 그의 형태가 중성(비전하)이거나 염이며, 글리코실화 반응, 측쇄 산화 반응 또는 인산화 반응에 의해 변이되거나 변이되지 않은 것을 나타낸다. 특정 구현예에서, 상기 아미노산 서열은 전장길이(full-length)의 천연 단백질이다. 또다른 구현예에서, 상기 아미노산 서열은 전장길이 단백질의 더 작은 단편이다. 또다른 구현예에서, 상기 아미노산 서열은 아미노산 측쇄에 부착된 부가적 치환체, 예컨대 글리코실 단위, 지질, 또는 무기 이온, 예컨대 인산염, 뿐만 아니라 설피드릴기의 산화와 같은 사슬의 화학적 변환과 관련된 변형에 의해 변이된다. 따라서, "단백질"이라는 용어(또는 이에 상당하는 용어)에는 전장길이의 천연 단백질, 또는 이의 단편, 이의 특이적 성질을 유의적으로 변화시키지 않는 변이가 된 대상체의 아미노산 서열이 포함되는 것으로 여겨진다. 특히, "단백질"에는 단백질 이소형, 즉 동일한 유전자에 의해 인코딩되지만 pI 또는 MW, 또는 이들 모두가 상이한 변이형이 포함된다. 상기 이소형은 (예컨대, 대립형질 변형, 선택적 스플라이싱 또는 한정 단백질가수분해의 결과로서) 그의 아미노산 서열이 다를 수 있거나, 또다르게는 차별된 번역후 변이(예컨대, 글리코실화 반응, 아실화 반응, 인산화 반응)에 의해 발생할 수 있다.

"유사체"가 단백질과 관련하여 본원에서 사용될 때, 단백질과 동일하거나 유사한 기능을 갖지만, 단백질의 아미노산 서열과 동일하거나 유사한 아미노산 서열, 또는 단백질의 구조와 동일하거나 유사한 구조를 반드시 포함할 필요가 없는 폴리펩티드를 나타낸다. 바람직하게는, 본 발명에서 단백질 유사체는 단백질의 아미노산 서열과 적어도 30%, 더 바람직하게는 적어도 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%가 동일한 아미노산 서열을 갖는다.

"단편" 또는 "절편"이 단백질과 관련하여 사용될 때, 단백질의 아미노산 서열의 적어도 5개의 연속 아미노산 잔기(바람직하게는, 적어도 약 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 250 또는 그 이상의 아미노산 잔기)의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 나타낸다. 단백질의 단편은 단백질의 기능적 활성을 가질 수도 있고 갖지 않을 수도 있다.

"생물학적으로 활성인"이라는 용어가 단백질 변이체, 유사체 또는 단편을 특징짓기 위해 본원에서 사용될 때, 상기 단백질과 동일하거나 유사한 성질을 나타내는 단백질과 충부한 아미노산 서열의 동일성 또는 상동성을 공유하는 분자를 나타낸다. 예를 들어, 본 발명의 다수의 구현예에서 본 발명의 항체의 생물학적으로 활성인 단편은 클라우딘-1의 세포외 도메인에 결합하는 항체의 능력을 보유하는 단편을 나타낸다.

본원에서, "상동성"(또는 "상동")은 "동일성"이라는 용어와 같은 뜻을 가지며, 이는 두 개의 폴리펩티드 분자 또는 두 개의 핵산 분자 사이의 서열의 유사성을 나타낸다. 두 개의 비교되는 서열의 위치에 동일한 염기 또는 동일한 아미노산 잔기가 있을 때, 각각의 분자는 그 위치에서 상동성이다. 두 개의 서열 사이의 상동성의 퍼센트는, 두 개의 서열에 의해 공유되는 매칭 또는 상동 위치의 수를 비교되는 위치의 수로 나누고 100을 곱한 값에 대응한다. 일반적으로, 두 개의 서열이 최대의 상동성을 나타내도록 배열될 때 비교된다. 상동의 아미노산 서열은 동일하거나 유사한 아미노산 서열을 공유한다. 유사한 잔기는 참조 서열에서 대응하는 아미노산 잔기에 대한 보존적 치환 또는 "허용된 점 돌연변이"이다. 참조 서열에서 잔기의 "보존적 치환"은, 대응하는 참조 잔기와 물리적으로 또는 기능적으로 유사한 치환, 예컨대 공유결합 또는 수소결합 등을 형성하는 능력을 포함하여 크기, 형태, 전기 전하, 화학적 성질이 유사한 치환이다. 특히 바람직한 보존적 치환은 Dayhoff 등의 문헌 ["Atlas of Protein Sequence and Structure", 1978, Nat. Biomed. Res. Foundation, Washington, DC, Suppl. 3, 22: 354-352]에 기재되어 있는 "허용된 점 돌연변이"에 대해 규정된 기준을 충족시키는 것이다.

"표지된", "검출가능 제제로 표지된" 및 "검출가능부에 의해 표지된"이라는 용어는 본원에서 상호교환되어 사용된다. 상기 용어는 개체(예컨대, 항체)가 예를 들어 다른 개체(예컨대, 항원)에 결합한 후에 시각화될 수 있다는 것을 명시하기 위해 사용된다. 바람직하게는, 검출가능 제제 또는 검출가능부는 측정될 수 있는 신호를 생성하고 그 신호의 강도가 결합된 개체의 양과 관련되는 것이 선택된다. 항체를 포함하는 단백질 및 폴리펩티드를 표지하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 표지된 폴리펩티드는 분광학적 수단, 광화학적 수단, 생화학적 수단, 면역화학적 수단, 전기적 수단, 광학적 수단, 화학적 수단 또는 임의의 다른 적합한 수단들에 의해 직접적 또는 간접적으로 검출될 수 있는 표지를 도입하거나 접합시킴으로써 제조될 수 있다. 적합한 검출가능 제제에는 다양한 리간드, 방사성 핵종, 형광색소, 화학발광제, 미세입자, 효소, 비색 표지, 자성 표지 및 합텐이 포함되지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

"대략" 및 "약"이라는 용어가 수치와 관련하여 본원에서 사용될 때, 명세서에서 달리 진술되지 않거나 달리 명백하지 않다면(상기 수치가 가능한 값의 100%를 초과하는 경우는 제외함), 일반적으로 (상기 수치보다 더 크거나 더 작은) 수치의 10% 내외의 범위에 있는 수치를 포함한다.

바람직한 특정 구현예들의 상세한 설명

전술한 바와 같이, 본 발명은 HCV-숙주세포 상호작용에 개입함으로써 HCV 감염을 예방하는 모노클로날 항체, 및 상기 모노클로날 항체를 분비하는 하이브리도마(hybridoma) 세포주를 제공한다.

I - 하이브리도마 및 항-클라우딘-1 모노클로날 항체

하기의 실시예에 나타낸 바와 같이, 본 출원인은 전장길이의 CLDN1 유전자를 포함하는 발현 벡터를 사용한 유전 면역법에 의해 인간 클라우딘-1의 세포외 도메인에 대한 폴리클로날 항체를 제조하였다. 이에 따라 제조된 폴리클로날 항체는 HCVcc 및 HCVpp 기초 시스템을 사용하여 HCV 감염을 효과적으로 억제하는 것으로 발견되었다(실시예 1 참조). 이러한 고무적인 결과의 측면에서, 본 출원인은 인간 클라우딘-1의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하고 HCV 감염을 효과적으로 억제하는 모노클로날 항체를 분비하는 하이브리도마 세포주를 제조하기 위해 래트의 유전 면역법 및 스크리닝 방법을 사용하였다(실시예 2 참조).

A. 하이브리도마 세포주 및 항-클라우딘-1 모노클로날 항체

따라서, 본 발명은 인간 클라우딘-1의 세포외 도메인, 특히 클라우딘-1의 제1 세포외 루프에 위치하는 보존 모티프인 W(30)-GLW(51)-C(54)-C(64)에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체를 분비하는 하이브리도마 세포주를 제공한다. 보다 구체적으로, 본 발명은 실시예 2에 기재되어 있는 유전 면역법(Lohrmann, 2003)에 의해 제조된 상기 하이브리도마 세포주의 8개를 제공한다. 상기 하이브리도마 세포주들은 OM-4A4-D4, OM-7C8-A8, OM-6D9-A6, OM-7D4-C1, OM-6E1-B5, OM-3E5-B6, OM-8A9-A3 및 OM-7D3-B3이라고 지칭되며, 2008년 7월 29일에 DSMZ(Deutsche Sammlung von Mikro-organismen und Zellkuturen GmbH, Inhoffenstraße 7 B, 38124 Braunschweig, 독일)에 각각 접근번호 DSM ACC2931, DSM ACC2932, DSM ACC2933, DSM ACC2934, DSM ACC2935, DSM ACC2936, DSM ACC2937 및 DSM ACC2938로 기탁되었다.

또한, 본 발명은 상기 하이브리도마 세포주들 중 어느 하나에 의해 분비된 모노클로날 항체를 제공한다. 하이브리도마 배양물로부터 모노클로날 항체를 제조하고 분리하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 하이브리도마 세포는 예를 들어 D-MEM 및 RPMI-1640 배지와 같은 적합한 배양 배지에서 표준 방법에 의해 성장된다. 항-클라우딘-1 모노클로날 항체는 단백질 A 정제, 황산암모늄 또는 에탄올 침전, 산 추출, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포셀룰로스 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 예컨대 단백질 A 컬럼, 히드록시아파타이트 크로마토그래피, 렉틴 크로마토그래피, 또는 이들 방법의 임의의 적합한 조합에 의해 하이브리도마 세포 배양물로부터 회수되고 정제될 수 있다. 또한, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)가 정제를 위해 이용될 수 있다.

본 발명의 하이브리도마 세포주에 의해 분비된 항-클라우딘-1 모노클로날 항체 각각은, rIgG2b 중(H)쇄 및 카파 경(L)쇄 이소타입의 면역글로불린, 또는 rIgG2a 중(H)쇄 및 카파 경(L)쇄 이소타입의 면역글로불린인 것으로 밝혀졌다. 그러나, 본 발명의 모노클로날 항체는 더 일반적으로는, 본 발명의 하이브리도마 세포주(또는 유도된 세포주)에 의해 분비되고 인간 클라우딘-1의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는, 임의의 모노클로날 항체(또는 이의 단편)를 포함한다. 어떠한 이론에도 얽매이지 않을 때, 감수성 세포에서 클라우딘-1의 세포외 도메인에 모노클로날 항체가 결합하는 것은 HCV-숙주세포의 상호작용을 저해하며, 이에 따라 HCV가 상기 세포에 진입하고 세포를 감염하는 것을 예방, 억제 또는 차단한다고 여겨진다.

항체의 출처로서 본원에 기재된 하이브리도마를 사용하는 대신에, 당업계에 알려진 임의의 다른 적합한 방법에 의해 모노클로날 항체가 제조될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항-클라우딘-1 모노클로날 항체는 재조합 DNA 방법에 의해 제조될 수 있다. 이러한 방법들에는 일반적으로 원하는 항체를 인코딩하는 유전자의 분리, 유전자를 적합한 벡터로 이동, 및 세포 배양 시스템에서 대량 발현이 포함된다. 원하는 모노클로날 항체를 인코딩하는 유전자 또는 DNA는 통상적인 절차를 사용하여(예컨대, 뮤린 항체의 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여) 용이하게 분리되고 서열이 밝혀질 수 있다. 본원에서 제공되는 하이브리도마 세포주는 상기 DNA의 바람직한 원천으로 제공된다. 모노클로날 항체의 재조합 생성에 적합한 숙주세포에는 적절한 포유류의 숙주 세포, 예컨대 CHO, HeLa 또는 CV1이 포함되지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 적합한 발현 플라스미드에는 pcDNA3.1 Zeo, pIND(SP1), pREP8(이들은 Invitrogen, Carlsboad, CA, USA에서 모두 구입가능함) 등이 포함되지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 항체 유전자들은 바이러스 벡터 또는 레트로바이러스 벡터, 예컨대 MLV-기재 벡터, 우두 바이러스-기재 벡터 등을 통해 발현될 수 있다. 본 발명의 항체는 단쇄 항체로서 발현될 수 있다. 재조합에 의해 생성된 모노클로날 항체의 분리 및 정제는 상기 기재된 바와 같이 실시될 수 있다.

B. 항체 단편

특정 구현예에서, 본 발명의 모노클로날 항체는 그의 천연의 형태로 사용된다. 또다른 구현예에서, 상기 항체는 절단되어(예컨대, 효소적 분할 또는 다른 적합한 방법에 의함) 면역글로불린 단편 또는 절편, 특히 생물학적으로 활성인 단편 또는 절편을 제공할 수 있다. 본 발명의 모노클로날 항체의 생물학적으로 활성인 단편 또는 절편에는, HCV-숙주세포의 상호작용을 저해, 및/또는 인간 클라우딘-1의 세포외 도메인에 특이적으로 결합, 및/또는 감수성 세포에 대한 HCV 진입을 억제 또는 차단, 및/또는 감수성 세포의 HCV 감염의 예방 또는 감소를 시키는, 모노클로날 항체의 기능을 보유하는 단편 또는 절편이 포함된다. 본원에 기재된 본 발명의 모노클로날 항체의 생물학적으로 활성인 단편 또는 절편은 본 발명에 포함된다.

본 발명의 모노클로날 항체의 생물학적으로 활성인 단편 또는 절편은 항체의 Fab 단편 또는 절편, F(ab')₂ 단편 또는 절편, 가변 도메인, 또는 하나 이상의 CDR(상보적 결정 영역)일 수 있다. 또다르게는, 본 발명의 모노클로날 항체의 생물학적으로 활성인 단편 또는 절편은 항체 단백질의 카르복실 부분 또는 말단으로부터 유래될 수 있으며, Fc 단편, Fd 단편 또는 Fv 단편을 포함할 수 있다.

본 발명의 항체 단편은 당업계에 알려진 임의의 적합한 방법, 예를 들어 효소적 분할(예컨대, 온전한 항체의 단백질가수분해 소화), 합성 기법 또는 재조합 기법에 의해 제조될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다. F(ab')₂, Fab, Fv 및 ScFv(단쇄 Fv) 항체 단편은 예를 들어 포유류의 숙주세포 또는 대장균에서 발현되고 이로부터 분비될 수 있다. 항체는 또한 하나 이상의 종결 코돈이 자연적 종결 위치의 업스트림에 도입된 항체 유전자를 사용하여 다양한 절단 형태로 제조될 수 있다. 항체의 다양한 절편들은 통상의 기법에 의해 화학적으로 함께 접합될 수 있거나, 또는 유전공학 기법을 사용하여 인접 단백질로서 제조될 수 있다.

C. 융합 단백질

본 발명의 항체(또는 이의 단편)는 융합 단백질(즉, 폴리펩티드 개체에 연결된 면역글로불린 분자 또는 절편)과 같은 변형된 형태로 제조될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 융합 단백질은 인간 클라우딘-1의 세포외 도메인에 대한 모노클로날 항체의 결합 능력을 보유한다. 본 발명의 모노클로날 항체 또는 이의 단편에 융합된 폴리펩티드 개체는 생성된 융합 단백질에 임의의 다수의 유리한 성질들을 부여하기 위해 선택될 수 있다. 예를 들어, 상기 폴리펩티드 개체는 재조합 융합 단백질의 발현의 증가를 제공하기 위해 선택될 수 있다. 선택적으로 또는 부가적으로, 상기 폴리펩티드 개체는 예를 들어 친화성 정제에서 리간드로 작용함으로써 융합 단백질의 정제를 촉진시킬 수 있다. 단백질가수분해 분열 위치를 재조합 단백질에 부가함으로써, 정제 이후에 폴리펩티드 개체로부터 원하는 서열이 궁극적으로 분리되게 할 수 있다. 또한, 안정성이 목표일 때, 상기 폴리펩티드 개체는 융합 단백질에 개선된 안정성을 부여하기 위해 선택될 수도 있다. 적합한 폴리펩티드 개체에는 예를 들어 니켈 킬레이트 컬럼에서 생성된 융합 단백질의 용이한 정제를 가능하게 하는 폴리히스티딘 태그(tag)가 포함된다. 적합한 폴리펩티드 개체의 또다른 예는 글루타티온-S-전이효소(GST), 말토오스 B 결합 단백질 또는 단백질 A이다.

의도한 용도에 따라, 본 발명의 항체는 안정성, 가용성, 생체내 반감기, 또는 부가적 표적을 결합하는 능력을 최적화하기 위하여 재조작될 수 있다. 이러한 성질들의 변화를 일부 또는 모두 달성하기 위한 화학적 변형 뿐만 아니라 유전공학적 접근은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 항체의 보존 영역의 부가, 제거 및/또는 변이는 치료적으로 투여되는 항체의 생물학적 이용가능성, 분배 및 반감기에 특히 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. (효과기 기능을 매개하는) 항체의 Fc 또는 보존 영역이 존재할 때, 이에 의해 결정되는 항체의 클래스 및 서브클래스는 중요한 부가적 성질들을 부여한다. 따라서, 변경, 재설계 또는 변형된 보존 도메인을 갖는 항-클라우딘-1 항체는 본 발명에 포함된다.

본 발명의 부가적 융합 단백질은 당업계에 잘 알려진 DNA 셔플링의 기법을 통해 제조될 수 있다(예를 들어, 미국특허 5,605,793; 5,811,238; 5,830,721; 5,834,252; 및 5,837,458 참조). DNA 셔플링은 항체 또는 이의 단편의 활성을 조절하기 위해, 예를 들어 친화성이 더 높고 분리 속도가 더 낮은 항체를 수득하기 위해 이용될 수 있다. 이러한 방법에서, 본 발명의 항체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 재조합 이전에 에러-유발 PCR, 무작위 뉴클레오티드 삽입 또는 다른 방법들에 의한 무작위 돌연변이 생성을 통해 개조될 수 있다. 또다르게는, 본 발명의 항체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 하나 이상의 절편은 하나 이상의 이종성 분자의 하나 이상의 성분, 모티프, 분획, 부분, 도메인, 단편 등과 재조합될 수 있다.

또다르게는, 본 발명의 항체는 다른 항체와 연결되어, 예컨대 이특이적 항체 또는 다특이적 항체를 생성할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항-클라우딘-1 모노클로날 항체, 또는 이의 생물학적으로 활성인 단편은, CD81 및 SR-BI과 같은 감수성 세포의 HCV의 다른 수용체에 특이적으로 결합하는 항체(또는 이의 단편)에 연결될 수 있다. 이특이적 및 다특이적 항체를 제조하는 방법들은 당업계에 알려져 있으며, 여기에는 예를 들어 재조합 방법, 및 환원성 이황화 결합 또는 또는 비환원성 티오에테르 결합에 의한 가교결합을 포함하는 화학적 합성법이 포함된다.

D. 키메라/인간화 또는 탈면역(de-immunized) 항체

본 발명의 항-클라우딘-1 모노클로날 항체는 또한 "인간화" 될 수 있다: 설치류 항체와 인간 서열 사이의 서열 차이점은, 각 잔기의 부위 특이적 돌연변이생성에 의해, 전영역의 이식에 의해, 또는 화학적 합성에 의해 인간 서열과 상이한 잔기들을 치환함으로써, 최소화시킬 수 있다. 또한, 인간화 항체는 재조합 방법을 사용하여 제조될 수도 있다. 항체의 인간화된 형태에서, CDR 영역 외부의 아미노산의 일부, 대부분 또는 전부가 인간 면역글로불린 분자의 아미노산으로 치환되는 반면, 하나 이상의 CDR 영역 내의 아미노산의 일부, 대부분 또는 전부는 변화되지 않는다. 생성된 항체가 인간 클라우딘-1의 세포외 도메인에 결합하는 능력을 없애지 않는 한, 일부 아미노산의 부가, 삭제, 삽입, 치환 또는 변형은 허용된다. 적합한 인간 "대체(replacement)" 면역글로불린 분자에는 IgG1, IgG2, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgG4, IgA, IgM, IgD 또는 IgE 분자, 및 이들의 단편이 포함된다. 또다르게는, 설치류 항체에 존재하는 T-세포 에피토프는 돌연변이에 의해 변형되어(탈면역), 인간의 치료 목적을 위해 적용될 수 있는 비면역 설치류 항체를 생성할 수 있다(www.accurobio.com 참조).

E. 항체 컨쥬게이트(conjugate)

본 발명의 모노클로날 항체, 또는 이의 생물학적으로 활성인 변이체 또는 단편은 하나 이상의 다른 분자체에 기능적으로 연결될 수 있다(예컨대, 화학적 커플링, 유전적 융합, 비공유 결합 등에 의함). 상기 변형된 항체(또는 컨쥬게이트된 항체)의 제조 방법은 당업계에 알려져 있다(예를 들어, "Affinity Techniques. Enzyme Purification: Part B", Methods in Enzymol., 1974, Vol. 34, W.B. Jakoby and M. Wilneck (Eds.), Academic Press: New York, NY; 및 M. Wilchek and E. A. Bayer, Anal. Biochem., 1988, 171: 1-32 참조). 바람직하게는, 분자체는 생성된 컨쥬게이트의 결합 성질을 저해하지 않는 항체 분자의 위치, 즉 인간 클라우딘-1의 세포외 도메인에서 항체의 특이적 결합에 관여하지 않는 위치에 부착된다.

특정 구현예에서, 상기 항체 분자와 분자체는 상호간에 공유적으로 직접 연결된다. 직접적인 공유결합은 아미드, 에스테르, 탄소-탄소, 이황화, 카바메이트, 에테르, 티오에테르, 요소, 아민 또는 카보네이트 결합과 같은 연결을 통해 이루어질 수 있다. 공유결합은 항체와 분자체에 존재하는 관능기를 이용하여 달성될 수 있다. 카보디이미드와 같은 활성제가 사용되어, 직접적인 결합을 형성할 수 있다. 또다른 구현예에서, 상기 항체 분자와 상기 분자체는 연결기를 통해 상호간에 공유 결합된다. 이는 당업계에 잘 알려진 임의의 다양한 안정한 이관능성 제제, 예컨대 동종관능 및 이종관능 연결기를 사용하여 달성될 수 있다.

특정 구현예에서, 본 발명의 항체(또는 이의 생물학적으로 활성인 단편)는 치료부(therapeutic moiety)에 컨쥬게이트된다. 임의의 다양한 치료부가 본 발명을 실시하기 위한 사용에 적합할 수 있으며, 여기에는 세포독소(예컨대, 세포분열억제제 또는 세포파괴제), 치료제, 및 방사성 금속 이온(예컨대, 알파-방출체, 및 DOTA와 같은 마크로시클릭 킬레이터에 부착된 알파-방출체)이 포함되지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 세포독소 또는 세포독성 제제에는 세포에 손해를 입히는 임의의 제제가 포함된다. 이러한 예에는, 파클리탁솔, 시토칼라신 B, 그라미시딘 D, 브롬화 에티듐, 에머틴, 미토마이신, 에토포시드, 테노포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜히친, 독소루비신, 다우노루비신, 디히드록시 안트라신 디온, 미톡산트론, 미트라마이신, 악티노마이신 D, 1-데히드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀롤, 티미딘 키나제, 엔도뉴클레아제, RNA아제 및 퓨로마이신, 및 이의 단편, 변이체 또는 상동체가 포함되지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 치료제에는 항대사물질(예컨대, 메토트렉세이트, 6-메르캅토푸린, 6-티오구아닌, 시타라빈, 5-플루오로우라실 다카르바진), 알킬화제(예컨대, 메클로레타민, 티오에파 클로람부실, 멜팔란, 카르무스틴(BSNU) 및 로무스틴(CCNU), 시클로포스파미드, 부설판, 디브로모만니톨, 스트렙토조토신, 미토마이신 C 및 시스디클로로디아민 백금(II) (DDP) 시스플라틴), 안트라시클린(예컨대, 다우노루비신 및 독소루비신), 항생제(예컨대, 닥티노마이신, 블레오마이신, 미트라마이신 및 안트라마이신) 및 항분열제(예컨대, 빈크리스틴 및 빈블라스틴)가 포함되지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 생성된 항체 컨쥬게이트는 HCV 감염과 연관된 간암의 치료에 적용할 수 있다(하기 참조).

다른 치료부에는, 원하는 생물학적 활성을 보유하는 단백질 또는 폴리펩티드가 포함된다. 상기 단백질에는 독소(예컨대, 아브린, 리신 A, 알파 독소, 슈도모나스 외독소, 디프테리아 독소, 사포린, 모모르딘, 겔로닌, 포케위드 항바이러스 단백질, 알파-사르신 및 콜레라 독소); 단백질, 예컨대 종양 괴사 인자, 알파-인터페론, 베타-인터페론, 신경 성장인자, 혈소판 유래 성장인자, 조직 플라스미노겐 활성제; 세포자멸 제제(예컨대, TNF-α, TNF-β), 또는 생체반응 조절물질(예컨대, 림포킨, 인터루킨-1(IL-1), 인터루킨-2(IL-2), 인터루킨-6(IL-6), 과립 대식세포 콜로니 자극인자(GM-CSF), 과립 콜로니 자극인자(G-CSF) 또는 다른 성장인자들)이 포함되지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

선택적으로 또는 부가적으로, 본 발명의 항체(또는 이의 생물학적으로 활성인 단편)는 검출가능 제제에 컨쥬게이트될 수 있다. 임의의 다양한 검출가능 제제가 본 발명을 실시하는데 사용될 수 있으며, 여기에는 다양한 리간드, 방사성 핵종(예컨대, ³H, ¹²⁵I, ¹³¹I 등), 형광염료(예컨대, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리트린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈알데히드 및 플루오레스카민), 화학발광제(예컨대, 루시페린, 루시페라제 및 에쿼린), 미립자(예컨대, 양자점, 나노결정, 인광체 등), 효소(예컨대, ELISA에서 사용되는 것들, 즉 고추냉이 페록시다제, 베타-갈락토시다제, 루시페라제, 알칼리 포스파타제), 비색 표지, 자성 표지, 및 비오틴, 디곡시제닌, 또는 항혈청 또는 모노클로날 항체가 이용할 수 있는 다른 합텐 및 단백질들이 포함되지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 생성된 검출가능한 항체는 진단 및/또는 예측 방법에 사용될 수 있다(하기 참조).

본 발명의 항체(또는 이의 생물학적으로 활성인 단편)에 컨쥬게이트될 수 있는 또다른 분자체에는 선형 또는 분지형 친수성 중합성 기, 지방산 기 또는 지방 에스테르 기가 포함되지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

따라서, 본원에 기재된 하이브리도마 세포주에 의해 분비되는 항-클라우딘-1 모노클로날 항체, 및 이의 임의의 생물학적으로 활성인 변이체 또는 단편 외에, 본 발명은 또한 키메라 항체, 인간화 항체, 및 본 발명의 항-클라우딘-1 모노클로날 항체의 중쇄 또는 경쇄 가변 영역의 하나 이상의 상보적 결정 영역(CDR)을 포함하는 항체-유래 분자를 포함하며, 또한 Fab 단편, F(ab')₂ 단편, Fd 단편, Fabc 단편, Sc 항체(단쇄 항체), 디아체, 각각의 항체 단일 경쇄, 각각의 항체 중쇄, 항체 사슬과 다른 분자 사이의 키메라 융합, 및 항체 컨쥬게이트, 예컨대 진단제 또는 치료제에 컨쥬게이트된 항체와 같은 분자들이 포함된다. 본 발명에 포함되는 이러한 모든 항체 및 항체-관련 분자들은 인간 클라우딘-1의 세포외 도메인에 대한 특이적인 결합을 갖는다.

F. 본 발명의 모노클로날 항체 및 관련 분자의 활성 및 특이성

실시예 2에 기재되어 있는 본 발명의 항-클라우딘-1 모노클로날 항체 각각은 본원에서 제공되는 하이브리도마 세포주로부터 생성되었으며, Huh7.5.1 세포의 HCVcc 감염을 억제하는 능력을 위해 선택되었다. 당업계의 통상의 기술자에 의해 인식될 수 있듯이, 본 발명의 다른 항체 및 항체-관련 분자의 HCV 감염 억제 효과도 HCVcc 감염계를 사용하여 평가될 수 있다. HCV 감염에 대한 항체 및 항체-관련 분자의 억제 효과는, 선택적으로 또는 부가적으로, 당업계에 알려진 레트로바이러스의 HCV 위형 입자(pseudotyped particle)(HCVpp)를 사용하여 평가될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 항체 또는 항체-관련 분자는 용량-의존적 방법에서 HCVcc 또는 HCVpp에 의한 감수성 세포의 HCV 감염을 억제하는 것으로 나타날 것이다.

본 발명의 항체 및 시약의 특이성을 테스트하기 위해 사용될 수 있는 다른 방법에는 유동세포계수법 분석, 웨스턴 블로팅 분석, ELISA 및 항체에 의한 리간드/수용체 결합을 포함하는 억제 결합 어세이가 포함되지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 이러한 방법들은 항체를 생성하는 하이브리도마의 상청액을 테스트하기 위해, 분리된/정제된 항체의 활성을 테스트하기 위해, 및/또는 변형된 항체(항체-관련 분자)의 활성을 테스트하기 위해, 사용될 수 있다. 결합 특이성 테스트는 세포의 군(panel)에 대한 항체 또는 항체-관련 분자를 사용하여 수행될 수 있다. 상기 세포에는 예를 들어 인간 세포, 예컨대 간 세포주(예컨대, Huh7, Hep3b 또는 HepG2), 배아 신장 세포(293T), 섬유아세포(HeLa), B 세포, T 세포(예컨대, Molt-4, Sup-TI 또는 Hut-78), 단구 세포(THP-I), 성상 세포(U87), 간종양 세포(PLC/PRF:5) 또는 다른 간 세포 유형, 예컨대 간 선암종 SkHepI, 인간 말초혈액 세포 및 다양한 이의 분별된 아형들, 예컨대 림프구 및 단핵백혈구 또는 다른 세포주들, 예컨대 CaCo2 세포가 포함되며, 이에 한정되는 것은 아니다. 유동세포계수법 분석은 다양한 세포 유형에 대해 클라우딘-1에 대한 항체 또는 항체-관련 분자의 결합 특이성을 나타낼 수 있다. 또한, 비인간 포유류의 세포도 상기 어세이에 사용될 수 있다.

상기 어세이를 사용하여, 본 발명의 항체 및 항체-관련 분자에 대해 IC50 값이 결정될 수 있다. 바이러스의 감염성의 50% 억제에 필요한 항체 또는 항체-관련 분자의 농도의 지표를 제공하는 상기 값은 중요하고 유의적인 정량 기준을 제공하며, 다양한 항체 및 항체-관련 분자의 감염 억제 활성을 비교할 수 있게 한다.

실시예 2에 기재된 본 발명의 항-클라우딘-1 모노클로날 항체는 모든 주요 유전자형들 뿐만 아니라 2명의 만성 HCV 감염 환자들의 전체 유사종 군의 모든 분리주들로부터 HCV 감염을 강하게 교차-중화시키는 것으로 발견되었다. 개별 환자의 주요 HCV 유전자형의 HCV 감염과 유사종의 분리주의 HCV 감염을 교차-중화시키는 본 발명의 다른 항체 및 항체-관련 분자의 능력은 임의의 적합한 방법들을 사용하여, 예컨대 실시예 2에 기재된 바와 같이 특이적 HCV 유전자형의 HCV 엔벨로프 당단백질을 갖는 HCV 위형 입자(HCVpp)를 사용하여, 또는 HCV로 만성적으로 감염된 개별 환자의 HCV 엔벨로프 당단백질을 갖는 HCVpp를 사용하여 평가될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 항체 또는 항체-관련 분자는 용량-의존적 방식으로 주요 HCV 유전자형 및 HCV-감염 환자의 유사종으로부터 HCV 감염되는 것을 억제하는 것으로 보여질 것이다.

유사하게, 본 발명의 항체 또는 항체-관련 분자는 설치류 클라우딘-1(예컨대, 뮤린 클라우딘-1)와 교차-반응하지 않지만, 비인간 영장류 클라우딘-1(예컨대, 시노몰구스 원숭이 클라우딘-1)에 특이적으로 결합하는 것으로 입증되었다.

II - HCV 감염 및 HCV-연관 질환의 치료 또는 예방

A. 지표

본 발명의 항-클라우딘-1 항체는 HCV 감염의 치료 및/또는 예방을 위한, 또는 간 질환 또는 HCV-감수성 세포, 예컨대 간 세포, 림프계 세포 또는 단핵백혈구/대식세포에 영향을 미치는 병리학적 상태의 치료 및/또는 예방을 위한, 치료 및 예방 방법에 사용될 수 있다. 본 발명의 항-클라우딘-1 항체는 세포 표면에서 클라우딘-1의 세포외 도메인에 결합함으로써 HCV-숙주세포의 상호작용을 저해하며, 이에 따라 세포로의 HCV 진입 및/또는 세포의 HCV 감염을 감소, 억제, 차단 또는 예방한다.

본 발명의 치료 방법은 본 발명의 항체 또는 본 발명의 항체를 포함하는 약학적 조성물을 사용하여 달성될 수 있다(하기 참조). 상기 방법에는 일반적으로 유효량의 하나 이상의 본 발명의 항-클라우딘-1 항체 또는 이의 약학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계가 포함된다. 상기 투여는 당업계의 기술자에게 알려진 임의의 방법들을 사용하여 수행될 수 있다. 특히, 상기 항체 또는 조성물은 에어로졸, 비경구, 경구 또는 국부 경로를 포함한 다양한 경로들에 의해 투여될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

일반적으로, 본 발명의 항체 또는 조성물은 유효량, 즉 의도된 목적을 충족시키는데 충분한 양으로 투여될 것이다. 투여되는 항체 또는 약학적 조성물의 정확한 양은 대상체마다 다양하며, 이는 치료대상인 대상체의 연령, 성별, 체중 및 일반 건강 상태, 원하는 생물학적 또는 의료적 반응(예컨대, HCV 감염의 예방 또는 HCV-연관 간 질환의 치료) 등에 따른다. 다수의 구현예에서, 유효량은 HCV가 대상체의 감수성 세포에 진입하거나, 및/또는 HCV가 대상체의 세포를 감염하는 것을 억제 또는 예방함으로써 HCV 감염을 예방하거나 대상체의 간 질환 또는 다른 HCV-연관 병적 상태를 치료 또는 예방하는 양이다.

본 발명의 항체 및 조성물은 다양한 치료적 또는 예방적 방법들에 사용될 수 있다. 특히, 본 발명은 대상체의 간 질환 또는 병적 상태를 치료 또는 예방하기 위한 방법을 제공하며, 상기 방법에는 대상체의 간 질환 또는 병적 상태를 치료 또는 예방하기 위하여 HCV가 대상체의 세포에 진입하거나 대상체의 세포를 감염하는 것을 억제하는 유효량의 본 발명의 항체(또는 이의 조성물)를 대상체에 투여하는 단계가 포함된다. 상기 간 질환 또는 병적 상태는 HCV 감염과 연관된 간 염증, 간 섬유증, 간경변, 및/또는 간세포 암종(즉, 간암)일 수 있다.

또한, 본 발명은 대상체의 HCV-연관 질환 또는 상태(간 질환 포함)를 치료 또는 예방하기 위한 방법을 제공하며, 상기 방법에는 대상체의 HCV-연관 질환 또는 상태를 치료 또는 예방하기 위하여 HCV가 대상체의 세포에 진입하거나 대상체의 세포를 감염하는 것을 억제하는 유효량의 본 발명의 항체(또는 이의 조성물)를 대상체에 투여하는 단계가 포함된다. 본 발명의 특정 구현예에서, 상기 항체 또는 조성물은 급성 C형 간염으로 진단된 대상체에 투여된다. 본 발명의 또다른 구현예에서, 상기 항체 또는 조성물은 만성 C형 간염으로 진단된 대상체에 투여된다.

상기 방법에 따른 본 발명의 항체 또는 조성물의 투여는 개체가 받는 하나 이상의 징후의 개선을 가져올 수 있으며, 상기 징후에는 급성 C형 간염의 징후, 예컨대 식욕감퇴, 피로, 복통, 황달, 소양증, 및 독감 유사 징후; 만성 C형 간염의 징후, 예컨대 피로, 현저한 체중 손실, 독감 유사 징후, 근육통, 관절통, 간헐적인 낮은 정도의 열, 소양증, 수면 장애, 복통, 식욕의 변화, 구역질, 설사, 소화불량, 인지 변화, 우울증, 두통, 및 감정의 기복; 간경변의 징후, 예컨대 복수, 타박 및 출혈 성향, 골통증, 정맥류(특히, 위 및 식도), 지방 변증, 황달 및 간 뇌증; 및 HCV와 연관된 간장외 발현 증상, 예컨대 갑상선염, 만발성 피부 포르피린증, 한랭글로불린혈증, 사구체신염, 건조 증후군, 혈소판감소증, 편평태선, 진성 당뇨병 및 B-세포 림프증식 장애가 포함되지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

선택적으로 또는 부가적으로, 상기 방법에 따른 본 발명의 항체 또는 조성물의 투여는 HCV 감염 또는 HCV-연관 질환의 진행을 둔화, 감소, 중지 또는 완화시키거나, 또는 상기 감염 또는 질환의 진행을 뒤집어 제거할 수 있다. 또한, 상기 방법에 따른 본 발명의 항체 또는 조성물의 투여는 바이러스 감염의 횟수 감소, 감염성 바이러스 입자의 개수의 감소, 및/또는 바이러스에 의해 감염된 세포의 수의 감소를 가져올 수 있다.

본 발명에 따른 치료의 효과는 HCV 감염 및/또는 간 질환의 진단을 위해 당업계에 알려진 임의의 어세이를 사용하여 모니터될 수 있다. 상기 어세이에는 혈청학적 혈액 테스트, 알부민, 알라닌 아미노기전이효소(ALT), 알칼리 포스파타제(ALP), 아스파르테이트 아미노기 전이효소(AST) 및 감마 글루타밀 펩티드전이효소(GGT)의 하나 이상을 측정하기 위한 간 기능 테스트, 및 폴리머라제 연쇄 반응(PCR), 전사 매개 증폭(TMA) 또는 분지형 DNA(bDNA)와 같은 다른 기법들을 이용한 분자 핵산 테스트가 포함되지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 항체 및 조성물은 면역 요법에 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 HCV와 접촉된 결과로서 감수성 세포가 HCV로 감염될 가능성을 감소시키는 방법을 제공한다. 상기 방법에는, HCV와 접촉된 결과로서 세포가 HCV로 감염될 가능성을 감소시키기 위하여, HCV가 감수성 세포에 진입하거나 감수성 세포를 감염시키는 것을 억제하는 유효량의 본 발명의 항체 또는 조성물을 감수성 세포와 접촉시키는 단계가 포함된다. 또한, 본 발명은 HCV와 접촉된 결과로서 대상체의 감수성 세포가 HCV로 감염될 가능성을 감소시키는 방법을 제공한다. 이러한 방법에서, 본 발명의 항체 또는 조성물을 감수성 세포와 접촉시키는 것은 항체 또는 조성물을 대상체에 투여함으로써 수행될 수 있다.

감수성 세포 또는 대상체가 HCV로 감염될 가능성을 감소시킨다는 것은 HCV와 접촉된 결과로서 감수성 세포 또는 대상체가 HCV로 감염될 확률의 감소를 의미한다. 상기 감소는 임의의 유의적인 양, 예컨대, 2배 감소 이상, 2배 감소 초과, 10배 감소 이상, 10배 감소 초과, 100배 감소 이상, 또는 100배 감소 초과일 수 있다.

특정 구현예에서, 상기 대상체는 본 발명의 항체 또는 조성물의 투여에 앞서 HCV로 감염된다. 또다른 구현예에서, 상기 대상체는 본 발명의 항체 또는 조성물의 투여에 앞서 HCV로 감염되지 않는다. 또다른 구현예에서, 상기 대상체는 HCV로 감염되지 않지만, HCV에 노출된다. 특정 구현예에서, 상기 대상체는 HIV 또는 HBV로 감염될 수 있다.

예를 들어, 본 발명의 방법은 간 이식의 결과로서 대상체의 감수성 세포가 HCV로 감염될 가능성을 감소시키기 위해 사용될 수 있다. 이미 전술한 바와 같이, HCV-감염 환자에게서 질병에 걸린 간이 제거될 때, 혈청 바이러스의 수준은 격감한다. 그러나, 건강한 간을 이식받은 후에, 바이러스의 수준은 반등하여 수일 내에 이식하기 전의 수준을 뛰어넘을 수 있다(Powers, 2006). 간 이식 환자는 간세포의 표면에서 클라우딘-1의 엑토도메인에 결합하는 본 발명의 항체를 투여받음에 따라, 세포로의 HCV 진입을 감소, 억제, 차단 또는 예방하는 이점을 얻을 수 있다. 상기 투여는 간 이식 이전에 수행되거나, 간 이식 동안 수행되거나, 및/또는 간 이식 이후에 수행될 수 있다.

본 발명의 항체 또는 조성물의 투여에 의해 이점을 얻을 수 있는 다른 대상체들에는, HCV-감염 모친, 특히 HIV-양성인 모친에게서 태어난 아기; HCV-오염된 혈액 또는 혈액으로 오염된 의료장치와 접촉하게 되는 헬쓰케어 근무자; 약물을 주사하거나 투여하기 위한 장비들을 공유함으로써 HCV에 노출되는 약물 사용자; 및 감염 제어 과정이 열악한 문신, 귀/신체 피어싱 및 침술을 통해 HCV에 노출되는 사람들이 포함되지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 항체 또는 조성물의 투여에 의해 이점을 얻을 수 있는 다른 대상체들에는, HCV 질환 진행의 속도를 증가시키는 것으로 알려진 하나 이상의 인자들을 나타내는 대상체가 포함되지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 인자에는 특히 연령, 성별(수컷이 일반적으로 암컷보다 질환 진행을 더 빠르게 나타냄), 알코올 소비, HIV 동시 감염(질환 진행의 속도를 현저하게 증가시키는 것과 연관됨) 및 지방 간이 포함된다.

특정 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 조성물은 본 발명의 치료 방법에 따라 단독으로 투여된다. 또다른 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 조성물은 하나 이상의 부가적 치료제와 조합하여 투여된다. 본 발명의 항체 또는 조성물은 상기 치료제의 투여 이전에, 상기 치료제와 동시에, 및/또는 상기 치료제의 투여 이후에 투여될 수 있다.

본 발명의 항체 또는 조성물과 조합하여 투여될 수 있는 치료제는 HCV 감염 또는 HCV-연관 질환 또는 상태의 치료 또는 예방에 이로운 효과를 갖는 것으로 알려진 매우 다양한 생물학적으로 활성인 화합물들 중에서 선택될 수있다. 상기 제제에는 특히 항바이러스제, 예를 들어 인터페론(예컨대, 인터페론-알파, 페길화 인터페론-알파), 리바비린, 항-HCV (모노클로날 또는 폴리클로날) 항체, RNA 폴리머라제 억제제, 프로테아제 억제제, IRES 억제제, 헬리카제 억제제, 안티센스 화합물, 리보자임, 및 이들의 임의의 조합이 포함되지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

B. 투여

본 발명의 항체는 (선택적으로는, 하나 이상의 적합한 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제로 제형화한 후에) 원하는 용량으로 임의의 적합한 경로를 통해 이를 필요로 하는 대상체에 투여될 수 있다. 다양한 운반계가 알려져 있고 본 발명의 항체를 투여하는데 사용될 수 있으며, 여기에는 정제, 캡슐, 주사액, 리포솜내 캡슐화, 미립자, 마이크로캡슐 등이 포함된다. 투여 방법에는 진피, 피부내, 근육내, 복강내, 병변내, 정맥내, 피하, 비강내, 폐, 경막외, 안구 및 경구 경로가 포함되지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 항체 또는 조성물은 임의의 편리하거나 적합한 경로, 예를 들어 투입 또는 볼루스 주사, 상피 또는 점막피부의 내벽(예컨대, 구강, 점막, 직장 및 장점막 등)을 통한 흡수에 의해 투여될 수 있다. 투여는 전신적 또는 국북적으로 수행될 수 있다. 특히, 비경구적 투여는 간동맥 또는 담관에 카테터를 삽입하는 것과 같이 환자의 간을 향해 유도될 수 있다. 당업계의 통상의 기술자에 의해 인식되는 바와 같이, 본 발명의 항체가 부가적 치료제와 조합하여 투여되는 구현예에서, 상기 항체 및 치료제는 동일한 경로(예컨대, 정맥내) 또는 다른 경로(예컨대, 정맥내와 경구)에 의해 투여될 수 있다.

C. 용량

본 발명의 항체(또는 조성물)의 투여는 의도된 목적에 대해 효과적인 용량으로 이루어질 것이다. 투여 경로, 투여되는 제형 및 용량은, 원하는 치료 효과, 만일 치료하려는 HCV-관련 상태가 이미 존재한다면 그 상태의 중증도, 임의의 감염의 존재, 환자의 연령, 성별, 체중 및 일반 건강 상태에 의존할 뿐만 아니라, 사용되는 항체 또는 조성물의 역가, 생체 이용가능성, 생체내 반감기, 수반되는 요법의 사용(또는 불사용), 및 다른 임상적 인자들에 의존할 것이다. 상기 인자들은 치료 과정에 참여하는 의사에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 선택적으로 또는 부가적으로, 상기 투여되는 용량은 동물 모델(예컨대, 침팬지 또는 마우스)을 이용한 연구로부터 결정될 수 있다. 여러가지 방법들에 기초한 효과를 최대로 달성할 수 있는 용량을 적용하는 것은 당업계에 잘 알려져 있으며, 이는 숙련된 의사의 역량 내에 있다. 본 발명의 모노클로날 항체를 이용하여 연구들이 수행됨에 따라, 적합한 용량 수준 및 치료 기간과 관련하여 추가 정보가 발견될 것이다.

본 발명에 따른 치료는 단회 투여 또는 복수 투여로 이루어질 수 있다. 따라서, 본 발명의 항체 또는 이의 조성물의 투여는 일정한 시간 또는 기간 동안 유지될 수 있으며, 특정 간격, 예컨대 매시간, 매일, 매주(또는 수일 간격), 매월, 매년(예컨대 서방형)으로 투여될 수 있다. 또다르게는, 상기 투여는 주어진 시간 동안 복수회, 예컨대 매주 2회 이상, 매월 2회 이상 등으로 수행될 수 있다. 상기 투여는 예컨대 정맥내 투여 기간 동안 지속적으로 투여될 수 있다.

일반적으로, 투여되는 모노클로날 항체의 양은 바람직하게는 약 1 ng/kg 내지 약 100 mg/kg 체중의 대상체, 예를 들어 약 100 ng/kg 내지 약 50 mg/kg 체중의 대상체; 또는 약 1 μg/kg 내지 약 10 mg/kg 체중의 대상체, 또는 약 100 μg/kg 내지 약 1 mg/kg 체중의 대상체일 것이다.

III - 약학적 조성물

전술한 바와 같이, 본 발명의 항-클라우딘-1 항체(및 관련 분자)는 그 자체로 또는 약학적 조성물로서 투여될 수 있다. 따라서, 본 발명은 유효량의 본 발명의 항체 및 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 또한 하나 이상의 부가적인 생물학적으로 활성인 제제를 포함한다.

본 발명의 항체 및 약학적 조성물은 원하는 예방 및/또는 치료 효과를 달성하는데 효과적인 임의의 양으로 투여될 수 있고 임의의 경로를 사용하여 투여될 수 있다. 적합한 약학적 제형은 투여 경로 및 원하는 용량에 따라 달라질 수 있다. 이러한 제형은 투여되는 유효성분의 물리적 상태, 안정성, 생체내 방출 속도, 생체내 클리어런스(clearance)의 속도에 영향을 미칠 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 투여를 용이하게 하고 용량을 균일화하기 위하여 용량 단위 형태로 제형화될 수 있다. 본원에서 "단위 용량 형태(unit dosage form)"라는 표현은 치료 대상인 환자에 대해 본 발명의 항-클라우딘-1 항체의 물리적으로 분리된 단위를 나타낸다. 그러나, 조성물의 전체 일일 용량은 정상적인 의료적 판단 범위 내에서 의사에 의해 결정될 것이다.

A. 제형

주사가능 제제, 예를 들어 멸균 주사액 또는 유성 현탁액은 적합한 분산제 또는 습윤제, 및 현탁제를 사용하여 당업계에 알려진 방법에 따라 제형화될 수 있다. 또한, 멸균 주사가능 제제는 무독성이고 비경구적인 허용가능한 희석액 또는 용매 중 멸균 주사액, 현탁액 또는 에멀젼, 예를 들어 2,3-부탄디올 중 용액일 수 있다. 이용할 수 있는 허용가능한 담체 및 용매는 물, 링거액, U.S.P. 및 염화나트륨 등장액일 수 있다. 또한, 멸균 고정유가 용액 또는 현탁 매질로서 통상적으로 이용된다. 이러한 목적을 위해, 합성 모노글리세리드 또는 디글리세리드를 포함한 임의의 완하성 지방유가 이용될 수 있다. 또한, 올레산과 같은 지방산이 주사가능 제형의 제제에 사용될 수 있다. 멸균 액체 담체가 비경구 투여를 위한 멸균 액체 형태의 조성물에 사용될 수 있다.

주사가능 제제는 예를 들어 박테리아 보유 필터를 통해 여과시킴으로써, 또는 사용하기 전에 멸균수 또는 다른 멸균 주사가능 매질에 용해되거나 분산될 수 있는 멸균 고체 조성물의 형태의 멸균제를 혼입시킴으로써, 멸균될 수 있다. 멸균 용액 또는 현탁액인 액체 약학적 조성물은 예를 들어 정맥내, 근육내, 복강내 또는 피하 주사에 의해 투여될 수 있다. 주사는 단회 주입 또는 점진적 투입에 의해 수행될 수 있다. 필요하거나 원하는 경우, 상기 조성물은 주사 부위의 통증을 완화시키기 위하여 국소 마취제를 포함할 수 있다.

유효성분(본원에서는, 본 발명의 항-클라우딘-1 항체)의 효과를 연장하기 위하여, 피하 또는 근육내 주사로부터 유효성분의 흡수를 늦추는 것이 종종 요구된다. 비경구적으로 투여되는 유효성분의 흡수를 지연시키는 것은 오일 담체에 유효성분을 용해 또는 현탁시킴으로써 달성될 수 있다. 주사가능 저장 형태는 폴리락티드-폴리글리콜리드와 같은 생분해성 중합체에서 유효성분의 마이크로캡슐화된 기질을 형성함으로써 제조될 수 있다. 유효성분 대 중합체의 비율과 이용되는 특정 중합체의 성질에 따라, 유효성분의 방출 속도는 제어될 수 있다. 다른 생분해성 중합체의 예에는 폴리(오르토에스테르) 및 폴리(무수물)이 포함된다. 또한, 주사가능 저장 제형은 신체 조직에 적합한 리포솜 또는 마이크로에멀젼에 유효성분을 포획함으로써 제조될 수도 있다.

경구 투여를 위한 액체 제형에는 약학적으로 허용가능한 에멀젼, 마이크로에멀젼, 용액, 현탁액, 시럽, 엘릭시르, 및 가압된 조성물이 포함되지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 항-클라우딘-1 항체 외에, 액체 제형에는 당업계에서 통상적으로 사용되는 불활성 희석제, 예를 들어 물 또는 다른 용매, 가용화제 및 유화제, 예컨대 에틸 알코올, 이소프로필 알코올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸렌 글리콜, 디메틸포름아미드, 오일(특히, 목화씨 오일, 땅콩 오일, 옥수수 오일, 배아 오일, 올리브 오일, 피마자 오일 및 참기름), 글리세롤, 테트라히드로푸르푸릴 알코올, 폴리에틸렌 글리콜, 소르비탄 지방산 에스테르, 및 이들의 조합이 포함될 수 있다. 불활성 희석제 외에, 경구 조성물은 또한 아쥬반트, 예컨대 습윤제, 현탁제, 보존제, 감미료, 향료 및 향수, 증점제, 안료, 점도 조절제, 안정화제 또는 삼투조절제를 포함할 수 있다. 경구 투여를 위해 적합한 액체 담체의 예에는 물(상기 기재된 첨가제를 포함할 수 있음, 예컨대 소듐 카르복시메틸 셀룰로스 용액과 같은 셀룰로스 유도체), 알코올(예컨대, 일가 알코올 및 글리콜과 같은 다가 알코올) 및 이의 유도체, 및 오일(예컨대, 분별된 코코넛 오일 및 땅콩 오일)이 포함된다. 가압된 조성물을 위해, 상기 액체 담체는 할로겐화된 탄화수소 또는 다른 약학적으로 허용가능한 압축가스일 수 있다.

경구 투여용 고체 제형에는 예를 들어 캡슐, 정제, 알약, 분말 및 과립이 포함된다. 상기 고체 제형에서, 본 발명의 항-클라우딘-1 항체는 하나 이상의 불활성의 생리학적으로 허용가능한 부형제 또는 담체, 예컨대 시트르산 나트륨 또는 인산 이칼슘, 및 하나 이상의 하기 성분과 혼합될 수 있다: (a) 충전제 또는 증량제, 예컨대 전분, 락토오스, 수크로스, 글루코스, 만니톨 및 살리실산; (b) 결합제, 예컨대 카르복시메틸셀룰로스, 알긴산염, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈, 수크로스 및 아카시아; (c) 보습제, 예컨대 글리세롤; (d) 붕해제, 예컨대 한천, 탄산칼슘, 감자 또는 타피오카 전분, 알긴산, 특정 규산염 및 탄산나트륨; (e) 용액 지연제, 예컨대 파라핀; 흡수 촉진제, 예컨대 사차 암모늄 화합물; (g) 습윤제, 예컨대 세틸 알코올 및 글리세롤 모노스테아레이트; (h) 흡수제, 예컨대 카올린 및 벤토나이트 점토; 및 (i) 윤활제, 예컨대 탈크, 칼슘 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 고체 폴리에틸렌 글리콜, 소듐 라우릴 설페이트, 및 이들의 조합. 고체 제형에 적합한 다른 부형제에는 계면 조절제, 예컨대 비이온성 계면 조절제와 음이온성 계면 조절제가 포함된다. 상기 계면 조절제의 대표적인 예에는 폴록사머 188, 염화 벤즈알코늄, 칼슘 스테아레이트, 세토스테아릴 알코올, 세토마크로골 에멀젼화 왁스, 소르비탄 에스테르, 콜로이드 이산화규소, 인산염, 소듐 도데실설페이트, 마그네슘 알루미늄 실리케이트 및 트리에탄올아민이 포함되지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 캡슐, 정제 및 알약의 경우, 제형은 또한 완충제를 포함할 수 있다.

또한, 유사한 형태의 고체 조성물은 락토오스 또는 유당 뿐만 아니라 고분자량의 폴리에틸렌 글리콜 등과 같은 부형제를 사용하여 연질 및 경질의 충전된 젤라틴 캡슐의 충전제로서 이용될 수 있다. 정제, 당과, 캡슐, 알약 및 과립의 고체 제형은 장용성 코팅, 방출 제어형 코팅, 및 약학적 제형 분야에 잘 알려진 다른 코팅들과 같은 코팅 및 셸에 의해 제조될 수 있다. 이는 선택적으로 불투명화제를 포함할 수 있으며, 또한 유효성분(들)만 방출하거나, 또는 바람직하게는 장관의 특정부에서 방출하거나, 선택적으로는 지연시키는 방법으로 방출하는 조성물의 형태일 수 있다. 사용될 수 있는 포매 조성물의 예에는 중합체성 물질 및 왁스가 포함된다.

특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 치료를 필요로 하는 부위(예컨대, 간)에 국소적으로 투여하는 것이 요구될 수 있다. 이는 예를 들어 수술(예컨대, 간 이식) 동안 국부 투입에 의해, 국소적 적용에 의해, 주사에 의해, 카테터에 의해, 좌약에 의해, 또는 피부 패치 또는 스텐트 또는 다른 임플란트에 의해 달성될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

국부 투여를 위해, 상기 조성물은 바람직하게는 물, 글리세롤, 알코올, 프로필렌 글리콜, 지방알코올, 트리글리세리드, 지방산 에스테르 또는 광유와 같은 담체를 포함할 수 있는 겔, 연고, 로션 또는 크림으로서 제형화된다. 다른 국부적 담체에는 석유 액체, 이소프로필 팔미테이트, 폴리에틸렌 글리콜, 에탄올(95%), 수 중 폴리옥시에틸렌모노라우레이트(5%), 또는 수 중 소듐 라우릴 설페이트(5%)가 포함된다. 항산화제, 보습제, 점성 안정화제, 및 유사한 제제와 같은 다른 물질들이 필요에 따라 부가될 수 있다.

또한, 특정의 경우에, 본 발명의 조성물은 피부 내에 또는 피부 아래에 위치한 경피 수단에 배치될 수 있다. 상기 수단에는 수동 방출 메카니즘 또는 능동 방출 메카니즘에 의해 유효성분을 방출하는 패치, 임플람트 및 주사가 포함된다. 경피 투여에는 신체 표면 및 상피 조직과 점막 조직을 포함한 신체 통로의 내부 판을 통한 모든 투여가 포함된다. 상기 투여는 로션, 크림, 거품, 패치, 현탁액, 용액 및 좌약(직장 및 질)에 존재하는 조성물을 사용하여 수행될 수 있다.

경피 투여는 유효성분(즉, 본 발명의 항-클라우딘-1 항체)과 피부에 무독성인 담체를 포함하는 경피 패치를 사용함으로써 달성될 수 있으며, 피부를 통해 혈류 내로 전신적 흡수를 위한 성분의 투여를 가능하게 한다. 상기 담체는 크림 및 연고, 페이스트, 겔 및 폐색 장치와 같은 형태를 임의의 개수로 이용할 수 있다. 크림 및 연고는 점성의 액체 또는 반고체의 에멀젼의 수중유 형태 또는 유중수 형태일 수 있다. 유효성분을 포함하는 석유 또는 친수성 석유에 분산된 흡수 분말로 구성된 페이스트가 적합할 수 있다. 다양한 폐색 장치들이, 담체의 존재 또는 부재하에 유효성분을 포함하는 저장소, 또는 유효성분을 포함하는 기질을 커버하는 반투과성막과 같이, 유효성분을 혈류로 방출하기 위해 사용될 수 있다.

좌약 제형은 전통적인 물질, 예컨대 코코아 버터 및 글리세린으로 제조될 수 있으며, 이는 좌약의 용융점을 변경시키기 위해 왁스가 첨가되거나 첨가되지 않을 수도 있다. 수용성 좌약 기재, 예컨대 다양한 분자량의 폴리에틸렌 글리콜이 또한 사용될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물이 HCV-감수성 세포가 HCV로 감염되는 것을 예방하는 "백신"으로 사용될 때, 약학적 조성물은 당업계에 알려진 백신 담체, 예를 들어 티로글로불린, 알부민, 파상풍 변독소, 및 폴리아미노산, 예컨대 D-리신 및 D-글루타메이트의 중합체를 부가적으로 포함할 수 있다. 상기 백신은 또한 잘 알려진 임의의 다양한 아쥬반트, 예를 들어 불완전 프로이드 아쥬반트, 명반, 인산 알루미늄, 수산화 알루미늄, 모노포스포릴 지질 A(MPL, GlaxoSmithKline), 사포닌, CpG 올리고뉴클레오티드, 몬타나이드, 비타민 A 및 생분해성 오일로부터 제조된 다양한 유중수 에멀젼, 예컨대 스콸렌 및/또는 토코페롤, 퀼 A, 리비 데톡스, CRL-1005, L-121, 및 이들의 조합을 포함할 수 있다.

다양한 제형들을 제조하기 위한 재료 및 방법은 당업계에 알려져 있으며, 이는 본 발명을 실시하기 위해 조정될 수 있다. 항체의 투여를 위한 적합한 제형들은 예를 들어 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences", E.W. Martin, 제18판, 1990, Mack Publishing Co.: Easton, PA]에서 파악할 수 있다.

B. 부가적인 생물학적 활성제

특정 구현예에서, 본 발명의 항-클라우딘-1 항체는 본 발명의 약학적 조성물에서 유일한 유효성분이다. 또다른 구현예에서, 상기 약학적 조성물은 하나 이상의 생물학적 활성제를 부가적으로 포함한다. 적합한 생물학적 활성제의 예에는 백신 아쥬반트 및 치료제, 예컨대 항바이러스제(상기 기재된 것들), 항염증제, 면역조절제, 진통제, 항균제, 항진균제, 항생제, 항산화제, 방부제, 및 이들의 조합이 포함되지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 약학적 조성물에서, 항-클라우딘-1 항체 및 부가적 치료제(들)는 항-클라우딘-1 항체 및 치료제(들)의 동시 투여, 별도 투여 또는 순차적 투여를 위해 하나 이상의 제제 내에 조합될 수 있다. 보다 구체적으로, 본 발명의 조성물은 항체 및 치료제(들)가 함께 투여되거나 서로 독립적으로 투여될 수 있는 방식으로 제형화될 수 있다. 예를 들어, 항-클라우딘-1 항체 및 치료제는 단일 조성물 내에 함께 제형화될 수 있다. 선택적으로는, 이들은 별도로 유지(예컨대, 다른 조성물 및/또는 용기)되고 투여될 수 있다.

C. 키트의 약학 팩(pack)

또다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 약학적 조성물의 하나 이상의 성분을 함유하는 하나 이상의 용기(예컨대, 유리병, 앰플, 시험관, 플라스크 또는 병)를 포함하는 약학 팩 또는 키트를 제공하며, 이는 본 발명의 항-클라우딘-1 항체의 투여를 가능하게 한다.

약학 팩 또는 키트의 다른 성분들은 고체 형태(예컨대, 동결건조된 형태) 또는 액체 형태로 공급될 수 있다. 일반적으로, 각 성분은 각각의 용기에 나누어져 제공되거나 또는 농축된 형태로 제공되는 것이 적합할 수 있다. 약학 팩 또는 키트는 동결건조 성분의 복원을 위한 매질을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 키트의 각 용기는 상업적 판매를 위해 폐쇄 제한되어 유지될 수 있다.

특정 구현예에서, 약학 팩 또는 키트에는 하나 이상의 부가적 치료제(들)(예컨대, 전술한 하나 이상의 항바이러스제)이 포함된다. 제조사를 규제하는 정부기관에 의해 규정된 형태의 안내문 또는 패키지 인서트, 제조사 대리점에 의한 승인이 안내문에 반영된 약학적 또는 생물학적 제품의 사용 또는 판매가 기재된 안내문 또는 패키지 인서트, 인간 투여를 위한 사용 또는 판매가 기재된 안내문 또는 패키지 인서트가 상기 용기(들)에 선택적으로 포함될 수 있다. 패키지 인서트의 내용은 본원에 개시된 치료 방법에 따라 약학적 조성물을 사용하기 위한 지시를 포함할 수 있다.

식별자, 예컨대 바코드, 무선 주파수, ID 태그 등이 키트 내부에 또는 키트 표면에 존재할 수 있다. 상기 식별자는 예를 들어 품질 관리, 재고 관리, 워크스테이션 사이의 추적 이동 등의 목적을 위해 키트를 고유하게 식별하기 위해 사용될 수 있다.

IV - 항-클라우딘-1 모노클로날 항체의 비치료적 사용

본 발명의 항체, 예컨대 본원에서 제공되는 하이브리도마 세포주에 의해 생성된 항-클라우딘-1 모노클로날 항체는 다양한 비치료적 적용, 예컨대 정제 방법, 스크리닝 방법 및 진단 방법에 이용될 수 있다.

A. 정제 방법

따라서, 본 발명의 항체는 친화성 정제 제제로서 사용될 수 있다. 이러한 적용에서, 본 발명의 항체는 당업계에 잘 알려진 방법들을 사용하여 세파덱스 수지 또는 여과지와 같은 고체상에 고정된다. 고정된 항체는 정제 대상인 인간 클라우딘-1(또는 이의 단편)을 포함하는 샘플과 접촉하게 되며, 그 후 지지체는 상기 고정된 항체에 결합되는 클라우딘-1 단백질을 제외한 거의 모든 샘플의 물질을 제거하는 적합한 용매에 의해 세척된다. 마지막으로, 상기 지지체는 항체로부터 클라우딘-1 단백질을 방출시키는 다른 적합한 용매에 의해 세척된다.

B. 스크리닝 방법

또한, 본 발명의 항-클라우딘-1 항체는 경쟁적 결합 어세이에 기초한 약물 스크리닝 방법에 사용될 수 있다. 상기 방법에는, 본 발명의 항체가 결합하는 세포에 결합시키기 위해, 샘플의 시험 화합물(예컨대, 시험 항체)과 양을 알고 있는 본 발명의 항-클라우딘-1 모노클로날 항체 사이에 경쟁적 결합을 시키는 단계, 및 알려진 모노클로날 항체 결합의 양을 측정하는 단계가 포함될 수 있다. 본 발명의 모노클로날 항체는 예를 들어 효소 표지, 화학발광 표지 또는 형광 표지로 적절하게 표지된다.

C. 진단 방법

또한, 본 발명의 항-클라우딘-1 항체는 진단 및/또는 예측 어세이에 유용할 수 있으며, 예컨대 특이적 세포, 조직 또는 혈청에서 클라우딘-1의 발현을 검출함으로써 특히 다양한 암의 진단 및/또는 예측에 유용할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 클라우딘-1의 발현 감소는 대장암 재발 및 제II 단계의 대장암 환자의 낮은 생존율의 강한 예측변수인 것으로 입증되었으며(Resnick, 2005); 클라우딘-1의 발현 증가는 자궁 상피 종양 형성을 검출하기 위한 우수한 진단 마커이며(Sobel, 2005) 자궁 편평상피 세포의 악성 변환에 대해 유용한 마커인 것으로 보고되었으며(Lee, 2005); 클라우딘-1의 발현 감소는 전립선 선암종에서 높은 종양 등급 및 생화학적 질환 재발과 연관되며(Sheeban, 2007); 클라우딘-1의 발현 감소는 유방암의 재발 상태 및 악성 잠재력과 연관된다고 입증되었다(Morohashi, 2007).

일반적으로, 본 발명의 진단 및/또는 예측 어세이에는, 생물학적 샘플에 존재하는 클라우딘-1과 항체 사이에 항체-클라우딘-1 복합체가 형성되도록 하는 시간 및 조건 하에서 환자로부터 획득한 생물학적 샘플을 본 발명의 항-클라우딘-1 항체와 접촉시키는 단계; 및 형성된 임의의 항체-클라우딘-1 복합체의 존재 또는 부재를 검출(및/또는 정량화)하는 단계가 포함된다. 결정된 존재 또는 양은 특정 상태(예컨대, 암)의 존재의 지표로서 사용될 수 있다. 특정 방법에서, 측정된 양은 건강한 대상체로부터 획득한 생물학적 샘플(또는 유의적인 수의 건강한 대상체로부터 획득한 일련의 생물학적 샘플)에 대해 동일한 조건하에서 형성된 항체-클라우딘-1 복합체의 양과 비교된다.

상기 방법은 임의 유형의 생물학적 샘플의 연구에 적용될 수 있다. 적합한 생물학적 샘플의 예에는 전혈, 소변, 혈청, 혈장, 침, 윤활액, 정액, 림프액, 뇌척수액, 복막액, 뿐만 아니라 자궁경관내, 요관, 직장, 질 샘플이 포함되지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 생물학적 샘플에는 조직의 절편(예컨대, 유방 생검 샘플), 동결 절편, 및 알려진 진단, 치료 및/또는 결과 이력을 갖는 기록 샘플이 포함될 수 있다. 생물학적 샘플은 임의의 비침습적 수단에 의해, 예를 들어 대상체로부터 혈액을 뽑아냄으로써, 또는 미세바늘 흡입 또는 생검을 사용함으로써, 수집될 수 있다.

상기 진단 방법은 생물학적 샘플을 가공하지 않은 그 자체에 대해 수행되거나, 또는 제한적으로 가공한 생물학적 샘플에 대해 수행될 수 있다. 또다르게는, 상기 진단 방법은 생물학적 샘플을 가공한 이후에 수행될 수도 있다. 생물학적 샘플의 가공에는 여과, 증류, 원심분리, 추출, 농축, 희석, 정제, 저해 성분의 불활성화, 시약의 첨가 등의 하나 이상이 포함될 수 있다. 예를 들어, 상기 진단 방법은 생물학적 샘플로부터 제조된 단백질 추출물에 대해 수행될 수 있다. 단백질 추출 방법은 당업계에 잘 알려져 있다.

전술한 진단 방법에서, 항체-클라우딘-1 복합체의 검출은 임의의 적합한 방법에 의해 수행될 수 있다(예를 들어, E. Harlow and A. Lane, "Antibodies: A Laboratories Manual", 1988, Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NY 참조). 예를 들어, 항체-클라우딘-1 복합체의 검출은 면역 어세이를 사용하여 수행될 수 있다. 다양한 범위의 면역 어세이 기법들이 이용가능하며, 여기에는 방사면역 어세이, 효소면역 어세이(EIA), 효소결합 면역흡착 어세이(ELISA), 및 면역형광 면역침강이 포함된다. 면역 어세이는 당업계에 잘 알려져 있다. 상기 어세이들을 수행하기 위한 방법 뿐만 아니라 실제 적용 및 절차는 교본에 요약되어 있다(예를 들어, P. Tijssen, In: Practice and theory of enzyme immunoassays, eds. R.H. Burdon and v. P.H. Knippenberg, Elsevier, Amsterdam (1990), pp. 221-278 및 various volumes of Methods in Enzymology, Eds. S.P. Colowick et al., Academic Press, dealing with immunological detection methods, 특히 제70, 73, 74, 84, 92 및 121권 참조). 면역 어세이는 경쟁적이거나 또는 비경쟁적일 수 있다.

특정 구현예에서, 본 발명의 항체는 고체 담체 또는 지지체의 표면에 공유적으로 또는 수동적으로 결합됨으로써 고정된다. 상기 고체 지지체는 항체가 실시가능하게 부착될 수 있는 당업계에 알려진 임의의 고체 지지체이며; 실시가능하게 부착되는 것은, 클라우딘-1의 세포외 도메인과 부착된 항체 사이에 복합체를 형성시킬 수 있도록 항체가 부착되는 것을 나타낸다. 적합한 담체 또는 지지체 물질의 예에는 아가로스, 셀룰로스, 니트로셀룰로스, 덱스트란, 세파덱스, 세파로스, 카르복시메틸 셀룰로스, 폴리아크릴아미드, 폴리스티렌, 폴리비닐 클로라이드, 폴리프로필렌, 반려암, 자성, 이온-교환 수지, 유리, 폴리아민-메틸-비닐-에테르-말레인산 공중합체, 아미노산 공중합체, 에틸렌-말레인산 공중합체, 나일론, 실크 등이 포함되지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 고체 담체 또는 지지체의 표면상에 항체를 고정하는 것은 당업계에 잘 알려진 방법들을 사용하여 가교 결합, 공유 결합 또는 물리적 흡착을 포함할 수 있다. 고체 담체 또는 지지체의 형태는 비드, 입자, 마이크로플레이트 웰, 어레이, 크벳, 튜브, 막 또는 면역 어세이를 조건화하는데 적합한 임의의 다른 형태일 수 있다. 특정 구현예에서, 고체 담체 또는 지지체에 대한 항원의 고정에는, 겔 전기 영동법 이후에 당업계에 잘 알려진 소위 웨스턴 블로팅(또는 면역블로팅) 방법에서 막(통상적으로 니트로셀룰로스 또는 PVDF)으로 이동시키는 것이 포함된다.

D. 진단 키트

또한, 본 발명은 전술한 스크리닝 방법 또는 진단 방법을 수행하는데 유용한, 하나 이상의 본 발명의 항-클라우딘-1 모노클로날 항체를 포함하는 물질을 포함하는 키트를 제공한다. 바람직하게는, 상기 키트에는 상기 방법들 중 하나를 수행하기 위한 지시와 함께 예정된 양의 시약의 조합이 포함된다. 항체가 효소에 의해 표지되는 구현예에서, 키트는 효소에 의해 요구되는 기질과 보조인자들(예컨대, 검출가능한 형광단 또는 발색단을 제공하는 기질 전구체)을 포함할 것이다. 또한, 다른 첨가제들, 예컨대 안정화제, 완충제(예컨대 블록 완충 또는 용균 완충) 등이 포함될 수 있다. 다양한 시약들의 상대적인 양은 어세이의 민감도를 실질적으로 최적화시키는 시약의 용액에서의 농도를 제공하기 위하여 다양하게 달라질 수 있다. 특히, 상기 시약은 일반적으로 동결건조된 건조 분말로서 제공될 수 있으며, 용해에 따라 적합한 농도의 시약 용액이 제공되는 제공되게 되는 부형제가 포함된다. 상기 항체는 기질 표면(예컨대, 비드, 어레이 등)에 고정될 수도 있고 고정되지 않을 수도 있다. 또한, 상기 키트는 제조사를 규제하는 정부기관에 의해 규정된 형태의 안내문, 약학적 또는 생물학적 제품의 사용 또는 판매가 기재된 안내문을 포함할 수 있다.

도 1은 CHO 세포에서 발현된 CLDN-1에 래트 항-인간 CLDN-1 혈청이 특이적으로 결합되는 것을 나타내는 2개 그래프의 세트이다. CLDN-1 엑토도메인 루프에 대한 항-CLDN-1 폴리클로날 혈청은 인간 CLDN-1 cDNA를 함유하는 플라스미드를 사용하여 위스타(Wistar) 래트의 유전 면역법에 의해 생성되었다(실시예 1 참조). CHO 세포는 pcDNA-CLDN-1 또는 대조 벡터(pcDNA)로 감염되었다. 래트 항-인간 CLDN-1 폴리클로날 혈청 및 PE-컨쥬게이트된 항-래트 IgG와 배양된 CLDN-1 또는 대조 감염된 비투과성(non-permeabilized) CHO 세포의 유동세포계수법은, 인간 CLDN-1과 항-CLDN-1 항체의 특이적 상호작용을 입증하였다(도 1b). 반면, 대조 벡터로 감염되고 항-CLDN-1 혈청으로 인큐베이트된 CHO 세포에서는 어떠한 상호작용도 관찰되지 않았다(도 1a).
도 2는 Huh7.5.1 인간 간종양 세포(도 2a), 인간 간세포(도 2b)에서 CLDN-1 엑토도메인과 항-CLDN-1 항체의 상호작용을 입증하는 3개 그래프의 세트이다. CLDN-1의 세포 표면 발현은 래트 항-인간 CLDN-1 혈청 또는 대조 전-면역(pre-immune) 혈청을 사용하여 유동세포계수법에 의해 결정되었다(실시예 1 참조). 각 세포 표면 분자의 세포 표면 발현에 대응하는 히스토그램(오픈(open) 곡선)은 적절한 이소타입 대조군과 배양된 세포의 히스토그램(회색 음영의 곡선)과 중첩된다. 래트 항-인간 CLDN-1 혈청은 인간 간종양 Huh7.5.1 세포, 및 인간 일차 간세포의 세포 표면에서 CLDN-1을 특이적으로 검출하였다.
도 3은 Caco2 세포(a) 및 Huh7.5.1 세포(b)에서 CLDN1 발현을 보여주는 면역형광 이미지의 세트이다. 도 3a 및 도 3b의 하단부는 Caco2 세포와 Huh7.5.1 세포를 각각 나타내며, 실시예 1에 기재된 바와 같이, CLDN1 엑토도메인에 대한 항-CLDN1 폴리클로날 항체("항-CLDN1 pAb") 및 세포내 C-말단 도메인에 대한 시판되는 항-CLDN1 항체("항-CLDN1 mAb")가 사용되어 CLDN1이 염색되었으며, DAPI가 사용되어 핵이 염색되었다. 대조군은 도 3a 및 도 3b의 상단부에서 보여지며, Caco2 세포와 Huh7.5.1 세포는 각각 래트 폴리클로날 IgG("대조 pAb"), 마우스 모노클로날 IgG ("대조 mAb") 및 DAPI와 배양되었다. 스케일 바(scale bar)는 10 μm를 나타낸다.
도 4는 항-CLDN-1 항체(래트 폴리클로날 항-CLDN-1 항혈청)에 의한 HCV 감염(Jc1 HCVcc 감염)의 억제를 나타내는 2개 그래프의 세트이다. 도 4a는 37℃에서 3시간 동안 JC1 HCVcc로 감염되기 전에 항-CLDN-1 래트 혈청(희석 1/50) 또는 대조 혈청("판 래트(pan rat)")과 37℃에서 1시간 동안 사전 배양된 Huh7.5.1 세포에 대해 수득한 결과를 나타낸다. HCV 감염은 감염한지 72시간 후에 감염된 Huh7.5.1 세포의 용해물에서 HCV RNA 정량화에 의해 평가되었다. 전체 RNA가 분리되었으며, HCV RNA는 pRT-PCR에 의해 정량화되었다. 도 4b는 정제된 항-CLDN-1 면역글로불린에 의한 Jc1 HCVcc 감염의 억제를 나타낸다. 항-CLDN-1 IgG는 혈청 제2번으로부터 정제되었으며, 실시예 1에 기재된 바와 같이 Huh7.5.1 세포에 부가되었다(CTRL - 대조 IgG). HCV 감염은 전술한 바와 같이 HCV RNA 정량화에 의해 평가되었다. 그 결과는 2회 이상의 독립적인 실험들 중 하나의 중복 결정(duplicate determination)으로부터 평균 % HCVcc 감염성±SD로 나타낸다.
도 5a는 항-SR-BI, 항-CD81 및 항-CLDN1 항체에 의한 Luc-Jc1 HCVcc 감염의 용량-의존적 억제를 나타낸다. HCV 감염을 최대에 준하게 차단하는 항체 농도의 사용에 의해 부가적 또는 상승적 효과가 관찰될 수 있었다. Huh7.5.1 세포는 37℃에서 4시간 동안 Luc-Jc1 HCVcc로 감염되기 전에, 항-CD81 mAb(0.1 및 0.05 μg/mL), 대조 마우스 mAb(mIgG: 0.1 및 0.05 μg/mL), 래트-항-SR-BI 혈청(1/200, 1/400 및 1/800), 래트 항-CLDN1 혈청(1/100, 1/200, 1/400) 또는 대조 래트-전-면역 혈청(CTRL: 1/200)과 37℃에서 1시간 동안 사전 배양되었다. HCV 감염은 감염된지 48시간 후에 루시페라제 활성을 측정함으로써 평가되었다. 그 데이터는 항체의 부재하에서 Luc-Jc1 HCVcc 감염성 퍼센트로 나타낸다. 두 번 수행된 4개의 독립적인 실험들의 평균±SD가 도시된다. 도 5b 내지 5d는 HCVcc 진입의 억제에서 항-SR-BI, 항-CD81 및 항-CLDN1 항체의 부가적인 효과를 보여주는 4개 그래프의 세트이다. Huh7.5.1 세포는 37℃에서 4시간 동안 Luc-Jc1 HCVcc로 감염되기 전에, 래트 항-SR-BI(1/400, 1/800), 래트 항-CLDN1(1/200, 1/400) 및 마우스 항-CD81(0.05, 0.1 μg/mL) 단독으로(검정 바) 또는 조합하여(회색 바), 37℃에서 1시간 동안 사전 배양되었다. HCVcc 감염은 도 5a에 기재된 바에 따라 평가되었다. 그 데이터는 항체의 부재하에서 Luc-Jc1 HCVcc 감염성 퍼센트로 나타낸다. 두 번 수행된 4개의 독립적인 실험들의 평균±SD가 도시된다.
도 6b는 항-CD81 mAb(■), 래트 항-SR-BI 혈청(◆), 래트 항-CLDN1 혈청(▲) 또는 대조 래트 혈청(Δ)에 의한 인간 간종양 세포로의 HCVcc 진입 억제의 속도(kinetics)를 나타낸다. 래트 항-CLDN1 혈청(1/100), 래트 항-SR-BI 혈청(1/100), 래트 대조 혈청(1/100) 또는 항-CD81 모노클로날 항체(5 μg/mL)에 의한 Huh7.5.1 세포로의 Luc-JC1 HCVcc 진입 억제는 도 6a에 나타낸 실험 셋업의 도식도에서 보여지는 바와 같이 수행되었다. 표적 세포에 대한 바이러스 결합 후에, 세포는 세척되었으며, 억제제는 37℃에서 120분 동안 20분마다 부가되어, 진입이 진행되도록 하였다. 대시 선은 억제제가 존재했던 시간 간격을 나타낸다. 루시페라제 활성은 48시간 후에 결정되었으며, 동일한 방식으로 수행하되 억제제를 부가하지 않고 수행된 대조 감염에 대해 상대적으로 나타낸다. 도 6b의 결과는 항체의 부재하에서 Luc-JC1 HCVcc 감염성 퍼센트로 나타낸다. 두 번 수행된 3개의 독립적인 실험들 중 하나의 평균±SD가 도시된다.
도 7은 인간 클라우딘-1에 대해 면역화된 5마리의 래트로부터 획득한 혈청에 대한 유동세포계수법 분석 결과를 나타내는 5개 그래프의 세트이다(실시예 2에 기재된 바와 같음). 흑색 곡선은 인간 클라우딘-1 발현 벡터로 일시적 감염된 포유류의 세포(BOSC23)에 대한 결과를 나타내며, 적색 곡선은 무관한 cDNA에 대한 결과를 나타낸다. 흑색 곡선의 우측으로 이동은 양성(positivity)을 나타낸다. 항체들은 PE-표지된 항-래트 IgG 항체(FL2)에 의해 검출되었다.
도 8은 항-CLDN-1 항체를 포함하는 하이브리도마 상청액(x축에 표시한 명칭)에 의한 재조합 감염성 HCV(HCVcc Luc-JC1)의 감염 억제의 분석 결과를 나타내는 그래프이다. 상기 하이브리도마 상청액은 실시예 2에 기재된 바와 같이 수득되었다. 그 결과는 하이브리도마 상청액의 존재 또는 부재 하에서 HCVcc Luc-JC1 감염 퍼센트로 나타낸다(PBS의 존재하에서 감염=100%). OM-3E5, OM-6D9, 0M-7C11, OM-4A4, 0M-6E1, OM-7D3, OM-7D4, OM-7C8 및 OM-8A9는 HCV 감염의 현저한 억제를 나타낸 반면, 0M-5A1, OM-6G10 및 OM-5A8은 어떠한 효과도 나타내지 않았다. 음성 대조군은 감염되지 않은 세포에 대응한다.
도 9a는 인간 클라우딘-1에 대해 면역화된 래트로부터 수집된 림프구로부터 획득한 모노클로날 항체 상청액에 대한 유동세포계수법 분석 결과를 나타내는 8개 그래프의 세트이다(실시예 2에 기재된 바와 같음). 흑색 곡선은 인간 클라우딘-1 발현 벡터(pCMV-SPORT6-CLDN1)로 일시적 감염된 포유류의 세포에 대한 결과를 나타내며, 적색 곡선은 무관한 cDNA(pCMV-SPORT6)에 대한 결과를 나타낸다. 흑색 곡선의 우측으로 이동은 양성(positivity)을 나타낸다. 항체들은 PE-표지된 항-래트 IgG 항체(FL2)에 의해 검출되었다. x축 및 y축은 각각 평균 형광 강도 및 염색된 세포의 상대적 수를 나타낸다. 도 9b는 유동세포계수법에 의해 연구된 감염된 CHO 세포의 세포 표면에서 발현된 CLDN1에 대한 6개의 모노클로날 항-인간 CLDN1 항체의 특이적 결합을 나타내는 그래프이다. CHO 세포는 pCMV-SPORT6-CLDN1(줄무늬 바) 또는 대조 벡터(pCMV-SPORT6; 흑색 바)로 감염되었다. 도 9c는 Huh7.5.1 간종양 세포 및 일차 인간 간세포(PHH)와 음성 대조군으로서 BOSC23 세포에서, 세포 표면 발현된 CLDN1에 대한 6개의 모노클로날 항체의 결합을 나타내는 그래프이다. 그 결과는 2회 수행된 각각의 실험에 대해 계산된 평균 상대적 형광 단위(RFU: relative fluorescent unit)로서 나타낸다. 도 9d는 항-CLDN1 모노클로날 항체에 의한 살아있는 비투과성 Huh7.5.1 세포에서 세포 표면 CLDN1의 이미지를 나타낸다. Huh7.5.1 세포는 래트 이소타입 대조 또는 항-CLDN1 OM-7D3-A3 항체(10 μg/mL), Cy5-컨쥬게이트된 항-래트 이차 항체와 함께 배양되었으며, 실시예 2에 기재된 바와 같이 분석되었다. 세포 핵은 DAPI로 염색되었다. 도 9e는 유동세포계수법에 의해 연구된 일차 시노몰구스 간세포에서 세포 표면 발현 CLDN1에 대한 6개의 모노클로날 항체의 결합을 나타내는 그래프이다.
도 10은 HCV 허용 세포주 Huh7.5.1에 대한 항-CLDN1 mAb의 결합 특징을 나타내는 2개 그래프의 세트이다. Huh7.5.1 세포는 실시예 2에 기재된 바와 같이 항-CLDN1 mAb의 농도를 증가시키면서 배양되었다. mAb 결합은 PE-컨쥬게이트된 항-래트 IgG mAb를 사용하여 유동세포계수법에 의해 밝혀졌다. 대조군으로서, 이소타입-매치된(matched) 인간 IgG2가 사용되었다.
도 11은 HCV 유전자형 2a J6 균주(Luc-JC1) 및 유전자형 1b Con1 균주(Luc-Con1)의 구조 단백질을 포함하는 감염성 비리온을 사용하여 항-CLDN1 항체에 의한 HCVcc 감염의 용량-의존적 억제를 나타내는 그래프이다. 도 11a: Huh7.5.1 세포는 Luc-JC1 HCVcc(유전자형 2a)로 감염되기 전에, 37℃에서 1시간 동안 래트 항-CLDN1 또는 이소타입 대조 항체(CTRL IgI)의 농도를 증가시키면서 사전 배양되었다. 도 11b: Huh7.5.1 세포는 37℃에서 4시간 동안 HCVcc Luc-Con1로 배양되기 전에, 래트 항-CLDN1(10μg/μL의 항체 OM6E1-B5; OM-7D3-B3; OM-8A9-A3), 항-CD81(10μg/μL) 또는 이소타입 대조 항체(CTRL IgG; 10μg/μL)와 사전 배양되거나, 또는 항체의 부재하에서(CTRL) 배양되었다. HCVcc Luc-Con1은 유전자형 1b 균주 Con1의 HCV 구조 단백질을 포함한다. HCV 감염은 실시예 2에 기재된 바와 같이 감염한지 48시간 후에 루시페라제 활성을 측정함으로써 평가되었다. 세 번 수행된 대표적인 실험의 평균±SD가 도시된다.
도 12는 항-CLDN1 모노클로날 항체가 주요 HCV 유전자형으로부터 유래된 엔벨로프 당단백질을 갖는 HCVpp를 교차-중화시킨다는 것을 보여주는 그래프들의 세트이다. 균주 H77(유전자형 1a), HCV-J(유전자형 1b), JFH1(유전자형 2a), UKN3a 1.28(유전자형 3), UKN4a 21.16(유전자형 4), UKN 5.14.4(유전자형 5), 및 UKN 6.5.340(유전자형 6)의 엔벨로프 당단백질을 갖는 MLV-기재 HCVpp의 다양한 균주들. VSV 위형 입자가 대조군으로 사용되었다. HCVpp 및 VSVpp는 실시예 2에 기재된 바와 같이 생성되었다. Huh7 세포는 37℃에서 4시간 동안 HCVpp 또는 VSVpp로 감염되기 전에, 37℃에서 1시간 동안 래트 항-CLDN1 또는 래트 이소타입 대조 항체의 농도를 증가시키면서 사전 배양되었다. HCVpp 및 VSV 감염은 실시예 2에 기재된 바와 같이 감염된지 72시간 후에 루시페라제 활성을 측정함으로써 평가되었다. 세 번 수행된 대표적인 실험의 평균±SD가 도시된다.
도 13은 일차 인간 간세포에서 HCVpp 감염의 억제를 나타내는 그래프들의 세트이다. 균주 HCV H77(유전자형 1a), HCV-J(유전자형 1b), JFH-1(유전자형 2a), UKN3A.1.28(유전자형 3)의 엔벨로프 당단백질을 갖는 HIV-기재 HCVpp가 실시예 2에 기재된 바와 같이 생성되었다. 일차 인간 간세포는 37℃에서 4시간 동안 HCVpp로 감염되기 전에, 37℃에서 1시간 동안 래트 항-CLDN1 또는 래트 이소타입 대조 항체(10 μg/mL)와 사전 배양되었다. HCVpp 감염은 실시예 2에 기재된 바와 같이 감염된지 72시간 후에 루시페라제 활성을 측정함으로써 평가되었다. 세 번 수행된 대표적인 실험의 평균±SD가 도시된다.
도 14는 항-CLDN1 모노클로날 항체가 만성 HCV 감염된 2명의 개별 환자에서 HCV-유사종에 의한 감염을 교차-중화시킨다는 것을 나타낸다(실시예 2 참조). 도 14a는 HVR1 서열의 배열에 기초하여 첫번째 HCV-감염된 환자에서 VJ, VI, VK(아형 1b)로 언급되는 3개의 변이체의 상대적인 분포를 나타낸다. 엔벨로프 당단백질의 선택된 도메인의 추정되는 아미노산은 우측에 나타낸다. 아미노산의 변화는 굵은 적색으로 표시된다. 도 14b 및 14c는 Huh7.5.1 세포(도 14b) 및 일차 인간 간세포(도 14c)에서 항-CLDN1 OM-7D3(25μg/mL)에 의한 상기 환자의 바이러스 유사종의 엔벨로프 당단백질을 갖는 HCVpp의 감염 억제를 나타내는 2개의 그래프의 세트이다. 도 14d는 완전한 E1E2 서열의 배열에 기초하여 만성 HCV 감염된 두번째 환자에서 변이체(termed VA-VY; 아형 1b)의 상대적인 분포를 나타낸다. 도 14e 및 14f는 만성 C형 간염을 앓는 두번째 환자의 바이러스의 유사종의 엔벨로프 당단백질을 갖는 HCVpp에 의한 Huh7.5.1 세포의 감염(도 14e) 및 항-CLDN1 OM-7D3(25μg/mL)에 의한 그의 중화(도 14f)를 나타내는 2개의 그래프의 세트이다. HCVpp의 감염은 실시예 2에 기재된 바와 같이 분석되었다. 항-CLDN1 항체에 의한 중화는 검출가능한 감염성을 갖는 유사종으로부터 유래된 HCVpp에 대해서만 평가되었다. 종결 코돈을 포함하는 바이러스 변이체들은 별표로 표시된다. 세 번 수행된 대표적인 실험의 평균±SD가 도시된다. ND - 수행되지 않음(not done); CTRL IgG - 래트 이소타입 대조 항체.
도 15는 숙주의 중화 반응으로부터 회피하고 간 이식편을 재감염시키는 환자의 엔벨로프 당단백질을 갖는 HCVpp의 HCV 감염의 예방을 나타내는 2개의 그래프의 세트이다. 숙주의 중화 반응으로부터 회피하고 간 이식편을 재감염시키는 3명의 다른 환자들의 엔벨로프 당단백질을 갖는 HCVpp(VD, VH, VK로 지칭되는 균주)는 실시예 2에 기재된 바와 같이 제조되었다(HCV 아형 1b). HCVpp 감염의 예방은 37℃에서 4시간 동안 HCVpp로 감염되기 전에, 37℃에서 1시간 동안 항-CLDN1 항체 OM-7D3(25μg/ml) 또는 항-CD81 또는 이소타입 대조(CTRL) 항체(25μg/ml)와 일차 인간 간세포를 사전 배양함으로써 평가되었다. 감염은 실시예 2에 기재된 바와 같이 분석되었다. 세 번 수행된 대표적인 실험의 평균±SD가 도시된다.
도 16은 Huh7.5.1 세포 및 일차 인간 간세포(PHH)에서 항-CLDN1 모노클로날 항체의 독성의 결핍을 나타내는 그래프들의 세트이다. 세포에 대한 세포독성 효과는 MTT의 대사에 의해 세 번 평가되었다. Huh7.5.1 세포(도 16a) 및 3명의 다른 공여체의 일차 인간 간세포(도 16b 내지 16d)는 48시간 동안 래트 모노클로날 항체, 항-CLDN1 OM-7D3-B3(10μg/ml), 플라보피리돌(10μM) 또는 화합물 C(20μM)와 배양되었으며, MTT 대사에 의해 분석되었다. 상대적 세포 생존도는 모의 배양된 일차 인간 간세포 또는 Huh7.5.1 세포(=100%)와 비교하여 평가되었다. 도 16d: 화합물 C(0.01-100 μM), 항-CLDN1 OM-7D3 항체(0.01-100 μM) 또는 이소타입 대조 항체가 도 16b 및 c에 기재된 바와 같이 평가된 독성 및 용량을 증가시키면서 일차 인간 간세포에 부가되었다.
도 17은 결합 및 감염 연구에서 2개의 항-CLDN1 모노클로날 항체의 교차-경쟁을 나타내는 그래프들의 세트이다. 도 17a: 항-CLDN1 mAb 사이의 경쟁은 세포-기재 ELISA를 사용하여 측정되었다. Huh7.5.1 세포는 경쟁자로서 표지되지 않은 항-CLDN1 mAb의 농도를 증가시키면서 0.1 μg/mL 비오틴화 항-CLDN1 mAb(OM-8A9-A3 - 상단부 또는 OM-7D3-B3 - 하단부)와 배양되었다. PBS에서 세포를 세척한 후에, 비오틴화 항체의 결합이 고추냉이 페록시다제로 표지된 스트렙트아비딘과의 배양에 의해 검출되었다. 결합은 상대적 형광 단위(RFU: relative fluorescence unit)로 측정되었다. 이소타입-매치된 대조(음성 대조 mAb)의 존재하에서 결합을 측정함으로써 결정된 곡선은 경쟁 항체의 존재하에서 결정된 것과 비교되었다. 도 17b: 항-CLDN1 모노클로날 항체의 전체 군 사이의 교차-경쟁. 0.1 μg/mL의 비오틴화 항-CLDN1 mAb(x축에서 보여짐) 및 10 μg/ml의 표지되지 않은 경쟁 항-CLDN1 또는 이소타입 대조 mAb(irr 대조 항체)(y축에서 보여짐)를 사용하여, 도 17a에서 보여진 바와 같이 교차-경쟁이 분석되었다. 비오틴화 항-CLDN1 mAb의 결합은 이소타입 대조 항체의 존재하에서만 발생되었다. 도 17c: 감염 연구에서 항체의 교차-경쟁. Huh7.5.1 세포는 실시예 2에 기재된 바와 같이 Luc-Jc1 HCVcc로 감염되기 전에 37℃에서 1시간 동안 래트 항-CLDN1 또는 이소타입 대조 항체와 사전 배양되었다. 교차-경쟁을 연구하기 위해, 저농도의 항-CLDN1 mAb(0.5 μg/ml)가 HCV 감염에 앞서 동시에 부가되었다. HCV 감염을 최대에 준하게 차단하는 항체 농도의 사용에 의해 부가적 또는 상승적 효과가 관찰될 수 있었다. 항체 조합의 효과는 "+"에 의해 표시된다(최종 농도 1μg/ml)(줄무늬 바).
도 18은 모노클로날 항-CLDN1 항체가 고도로 보존된 클라우딘 모티프: W(30)-GLW(51)-C(54)-C(64)의 보존에 강하게 의존하는 에피토프에 결합하는 것을 보여주는 그래프들의 세트이다. 항체 결합은 x축에 나타낸 야생형 CLDN1 또는 한정 돌연변이(defined mutation)를 포함하는 CLDN1에 대해 인코딩하는 pQCXIN-h클라우딘1 플라스미드를 사용하여 실시예 2에 기재된 바와 같이 수행되었다. 야생형 CLDN1에 대한 결합에 상대적으로 돌연변이 CLDN1에 대한 모노클로날 항-CLDN1 항체(OM-7D3-B3(도 18a) 및 OM-8A9-A3 (도 18b))의 결합이 보여진다(흑색 바). 일시적 감염된 Bosc 세포에서 야생형 및 돌연변이 CLDN1의 적절한 발현은 HA 태그가 없는 돌연변이 I32A를 제외하고 HA-태그 발현 수준 및 항-HA 항체의 유동세포계수법 분석에 의해 확인되었으며(오픈 바), CLDN1의 발현이 평가되었다. 야생형 CLDN1의 HA에 상대적으로 돌연변이 CLDN1의 HA에 대한 항-HA 항체의 결합은 돌연변이 CLDN1의 발현에 대한 내부 대조군으로서 보여진다(오픈 바).
도 19는 유동세포계수법에 의해 연구된 인간 Huh7.5.1 간종양 세포 및 마우스 Hepa 1.6 간종양 세포에서 CLDN1의 세포 표면 발현에 대한 6개의 모노클로날 항체의 결합을 나타내는 그래프이다. 그 결과는 평균 상대적 형광으로서 나타내며, 각 실험은 두 번 수행되었다. 항-CD81 모노클로날 항체는 양성 대조군으로 사용되었다.
도 20은 항-CLDN1 항체에 의한 허용 세포주에 대한 E2 결합의 용량-의존적 억제를 나타내는 그래프들의 세트이다. 도 20a: 허용 Huh7.5.1 세포에 대한 재조합 E2 당단백질의 결합. Huh7.5.1 세포는 실온에서 1시간 동안 1/100로 희석된 대조 래트 전-면역 혈청(CTRL: 좌측) 또는 래트 항-CLDN1 항체(우측)와 사전 배양되었다. E2의 결합은 유동세포계수법에 의해 검출되었다. 항체의 부재하에서 배양된 세포 및 E2(PBS)는 음성 대조군으로서 제공되었다(NC - 엷은 음영의 히스토그램). 대표적인 실험을 나타낸다. 도 20b: 허용 Huh7.5.1 세포에 대한 재조합 E2 당단백질의 결합. Huh7.5.1 세포는 실온에서 1시간 동안 래트 항-CD81, 래트 항-SR-BI 및 래트 항-CLDN1 항체 또는 대조 래트 전-면역 혈청(모두 1/100로 희석됨)과 사전 배양되었다. E2의 결합은 유동세포계수법에 의해 검출되었다. 그 결과는 항체의 부재하에서 퍼센트 E2 결합으로 나타낸다(PBS). 두 번 수행된 4개의 독립적인 실험들의 평균±SD가 도시된다. 도 20c: 항-CLDN1에 의한 Huh7.5.1 세포에 대한 E2 결합의 용량-의존적 억제. Huh7.5.1 세포는 다양한 희석의 폴리클로날 래트 항-CLDN1(회색 사각형) 항체 또는 대조 래트 전-면역 혈청(흑색 다이아몬드)과 사전 배양되었다. 그 결과는 항체의 부재하에서 퍼센트 E2 결합으로 나타낸다. 두 번 수행된 4개의 독립적인 실험들의 평균±SD가 도시된다. 도 20d: 허용 Huh7.5.1 세포에 대한 재조합 E1 당단백질의 결합. Huh7.5.1 세포는 실온에서 1시간 동안 헤파린, 마우스 항-CD81(JS-81; 5μg/mL), 대조(CTRL) 마우스 IgG(5μg/mL), 래트 항-CLDN1(1/100), 래트 전-면역 혈청(1/100)과 사전 배양되었다. E1의 결합은 유동세포계수법에 의해 검출되었다. 그 결과는 항체의 부재하에서 퍼센트 E1 결합으로 나타낸다(PBS). 두 번 수행된 2개의 독립적인 실험들의 평균±SD가 도시된다. 그 결과는 항체의 부재하에서 퍼센트 E2 결합으로 나타낸다(PBS). 두 번 수행된 2개의 독립적인 실험들의 평균±SD가 도시된다. ^*** P<0.0001(t 테스트). 도 20e: 허용 Huh7.5.1 세포에 대한 HCVcc의 결합. Huh7.5.1 세포는 구배 초원심분리를 사용하여 세포 배양 상청액으로부터 부분적으로 정제된 HCVcc(Jc1 균주)와 배양하기 이전에, 헤파린, 래트 항-CLDN1, 래트 항-SR-BI 또는 대조 래트 전-면역 혈청(PI)(모두 1/100으로 희석됨)과 실온에서 1시간 동안 사전 배양되었다. HCVcc와 배양한 후에, 결합되지 않은 HCVcc는 PBS로 세포를 세척함으로써 제거되었다. 그 후, HCVcc의 결합은 세포 결합된 HCV RNA의 RT-PCR에 의해 정량화되었으며, 이는 y축에 나타낸다.
도 21은 세포 발현 CLDN1이 아닌 CHO 세포 발현 CD81 및 SR-BI에 대한 엔벨로프 당단백질 E2의 세포의 결합을 나타내는 그래프들의 세트이다. 도 21a: 감염된 CHO 세포에서 인간 진입 인자의 발현. CHO 세포는 실시예 3에 기재된 바와 같이 인간 CLDN1, SR-BI 또는 CD81을 인코딩하는 발현 플라스미드로 감염되었다. 감염된 CHO 세포는 래트 대조(CTRL), 래트 항-CLDN1(좌측), 래트 항-SR-BI(중간) 또는 마우스 대조 IgG 및 항-CD81(JS-81; 우측)을 사용하여 유동세포계수법에 의해 분석되었다. 도 21b: CHO 세포 발현 인간 HCV 진입 인자에 대한 엔벨로프 당단백질 E2의 결합. CHO 세포는 나타낸 바와 같이 인간 CLDN1, SR-BI 또는 CD81을 인코딩하는 개별 발현 플라스미드로 감염되었다. 세포의 E2 결합은 유동세포계수법에 의해 분석되었다. 두 번 수행된 대표적인 실험이 보여진다.
도 22는 FRET 분석을 사용하여 CD81-CLDN1 공-수용체 결합의 항-CLDN1 억제를 나타내는 2개의 그래프의 세트이다. AcGFP, CD81 및 DsRED.CD81, AcGFP.CLDN1 및 DsRED.CD81, 또는 AcGFP.CLDN1 및 DsRED.CLDN1을 발현하도록 공-감염된 HEK293T 세포가 유리 커버슬립에 파종되었으며, 1시간 동안 전-면역 또는 항-CLDN1 혈청으로 처치되었다. 세포는 고정되고, 레이저 주사 공초점 현미경으로 이미지화되었으며, AcGFP 공여체 단백질과 DsRED 수용체 단백질 사이에 FRET가 측정되었다. 퍼센트 FRET는 세포의 원형질막에서 분석되는 픽셀의 총 수에 대한 FRET를 나타내는 픽셀의 수로 정의된다. ^*** P<0.0001, ^** P<0.01(t 테스트). 비처치된 세포 및 항-CLDN1 처치된 세포에서 세포내(흑색) 및 원형질막(백색) 위치에서 AcGFP.CLDN1 및 DsRED.CLDN1이 정량화되었으며, 각 위치에서 CLDN1의 퍼센트가 결정되었다.
도 23은 항-CLDN1 모노클로날 항체에 의한 HCV 세포 대 세포 전달의 억제를 나타내는 그래프들의 세트이다. Jc1 전기천공된(electroporated) Huh7.5.1 생성 세포는 항체의 부재하에서(도 23a), 또는 HCV 무세포 전달을 차단하는 항-CD81(10 mg/mL) 항체의 존재하에서(도 23b), 또는 HCV 무세포 및 세포-세포 전달을 차단하는 항-CD81 및 항-CLDN1의 존재하에서(도 23c), Huh7.5 GFP+ 수용 세포와 24시간 동안 공배양되었다. 각 판넬에서, 하단부는 감염되지 않은 세포를 포함하며 (하단부의 좌측은 GFP- HCV- 세포를 나타내며, 하단부의 우측은 GFP+ HCV- 세포를 나타냄); 상단부의 좌측은 GFP- HCV+ 감염된 생성 세포를 나타내며; 상단부의 우측은 새롭게 감염된 GFP+ HCV+ 수용 세포를 나타낸다. 점 플롯(dot plot)에서, FL1-높이(FL1-H)는 GFP의 형광 강도를 나타내며, FL2-높이(FL2-H)는 항-코어(core) 항체/PE의 형광 강도를 나타낸다(도 23a-c). 다른 처치하에서 GFP+ HCV+ 수용 세포의 상대 도수는 도 23d에 도시된다. 대표적인 실험 결과가 보여진다. 래트 이소타입 대조 항체와 세포의 배양은 HCV 감염의 수준에 대해 어떠한 효과도 나타내지 않는다는 것을 보여주었다(이 데이터는 나타내지 않음).
도 24는 감염 후 부가된 항-CLDN1 모노클로날 항체(7D3)에 의해 HCV 감염의 억제를 나타내는 그래프이다. Huh7.5.1 세포는 HCVcc Luc-JC1로 감염되었다. 감염한지 4시간 후에, 항-CLDN1 모노클로날 항체(7D3) 또는 래트 이소타입 대조 모노클로날 항체(50μg/mL)가 세포에 부가되었다. HCV 감염은 감염으로부터 3일, 5일, 7일 및 9일 후에 루시페라제 리포터 발현에 의해 정량화되었으며, 바이러스 로드(Log₁₀ RLU)로 나타낸다. 배지는 새로운 항체로 대체되어 2일마다 바뀌었다(50μg/mL). 상기 어세이에서 바이러스 로드의 양성 검출에 대한 역가는 800 RLU이다(점선). 대표적인 실험 결과가 보여진다. 값은 2회의 평균이다. 약자: RLU - 상대적 광 단위(relative light unit).

하기의 실시예는 본 발명을 구성하고 실시하는 바람직한 방법의 일부를 기재한 것이다. 그러나, 본 실시예는 설명적인 목적을 위해서만 기재된 것이고 본 발명의 범위를 제한하려는 의도가 아님이 이해되어야 한다. 또한, 실시예의 기재가 과거형이 아니라면, 명세서의 다른 부분과 마찬가지로 실험이 실제로 수행되었거나 데이터가 실제로 수득된다는 것을 언급하려는 것은 아니다.

폴리클로날 항혈청에 대해 하기에 보고된 결과의 일부는 C형 간염 바이러스 및 관련 바이러스에 대한 제15회 국제 심포지엄(San Antonio, Texas, USA, 2008년 10월 5-9일)에서 발표되었으며, S. Krieger 등의 "Production of anti-claudin1 antibodies potently inhibiting HCV infection reveals that Claudin-1 is required for an entry step closely linked to SR-BI and CD81"의 초록에 요약되어 있다. 다른 결과들은 2009년 8월에 공개를 위해 제출된 S. Krieger 등의 "Inhibition of hepatitis C virus infection by anti-Claudin antibodies is mediated by inhibition of E2-CD81-CLDN1 association" 뿐만 아니라, 2009년 10월에 공개를 위해 제출될 예정인 S. Krieger 등의 "Monoclonal anti-claudin-1 antibodies for prevention and treatment of hepatitis C virus infection"에 나타나 있다.

실시예 1: 인간 클라우딘 1에 대한 폴리클로날 항체

재료 및 방법

세포. 본 연구에서 사용된 중국 햄스터 난소 세포(CHO), BOSC23 세포, 및 Huh7.5.1 간종양 세포는 [Barth, 2005; Barth, 2003; Bartosch, 2003; Blight, 2002]에 기재되어 있다. BOSC23 세포는 내인성 CLDN1을 발현하지 않는 HEK293-유래 자기지향성(ecotropic) 패키징(packaging) 세포이다(Pear, 1993). 일차 인간 간세포는 [David, 1998]에 기재된 바(본원에 전체로서 참조로 삽입됨)에 따라 분리되고 배양되었다.

항-CLDN1 폴리클로날 항체의 제조. 인간 클라우딘-1의 세포외 루프에 대한 항체는 전장길이의 인간 CLDN-1 cDNA(pcDNA CLDN-1)을 함유하는 pcCMVSport 6-발현 벡터를 사용하여 위스타(Wistar) 래트의 유전 면역법에 의해 생성되었다. 요약하면, 동물들은 2주 간격으로 피부 내에 pcDNA CLDN-1의 5번의 적용을 받았다. 전-면역(pre-immune) 대조 혈청은 면역 이전에 같은 동물의 출혈로부터 수집되었다. 상기 생성된 항-CLDN-1 폴리클로날 혈청의 특이성을 분석하기 위하여, BOSC23 또는 CHO 세포는 제조사의 프로토콜에 따라 리포솜-매개 유전자 전달(Lipofectamine; Invitrogen, Karlsruhe, 독일)을 이용하여 pcDNA(대조 벡터) 또는 pcDNA CLDN-1로 감염되었다. 그 후, BOSC23 또는 CHO 세포는 항-CLDN-1 폴리클로날 혈청 또는 전-면역 대조 혈청과 배양되었으며, 이미 전술한 유동세포계수법(Barth, 2005)에 의해 세포 표면 CLDN-1 발현이 분석되었다.

면역형광에 의한 항-CLDN1 폴리클로날 항체의 특징화. Caco2 세포 및 Huh7.5.1 세포는 유리 커버슬립 위에 파종되었으며, 20분 동안 PBS에서 3% 파라포름알데히드로 고정되었으며, CLDN1 엑토도메인에 대한 항-CLDN1 항체(즉, 본 발명의 폴리클로날 항체, "항-CLDN1 pAb", 50 μg/mL의 래트 항-CLDN1 IgG), 세포내 C-말단 도메인에 대한 항-CLDN1 항체("항-CLDN1 mAb", 클론 1C5-D9, Abnova)가 사용되어 CLDN1이 염색되었으며, DAPI(4',6'-디아미디노-2-페닐인돌)가 사용되어 핵이 염색되었다. 대조 래트 폴리클로날 IgG("대조 pAb")와 마우스 모노클로날 IgG("대조 mAb")는 대조군으로서 사용되었다. 결합된 일차 항체는 항-래트-Cy5 및 항-마우스 Alexa Fluor^® 488 이차 항체 및 Zeiss Axio Observer 현미경(Carl Zeiss S.A.S, Le Pecq, 프랑스)을 사용하여 시각화되었다.

재조합 HCV의 제조 및 감염 어세이. 플라스미드 pFK-Jc1(Pietschmann, 2006)은 전장길이의 HCV JFH1 cDNA 또는 H6CF 및 JFH1 단편들로 이루어진 키메라 HCV 게놈 설계된 Jc1을 인코딩한다. 시험관내 HCV RNA 합성 및 RNA 감염은 [Wakita, 2005]에 기재된 바에 따라 수행되었다. 감염된 세포로부터 배양 상청액이 클리어(clear)되었으며, Amicon Ultra 15(Millipore, Billerica, MA, 미국)가 사용되어 전술한 바에 따라 농축되었으며, 직접 사용되거나 4℃ 또는 -80℃에서 저장되었다. 약간의 작은 변형과 함께 Huh7.5.1 세포에 대해 한계 희석 어세이가 사용되어 바이러스가 적정되었으며, TCID50(50% 조직 배양 감염 용량)는 [Lindenbach, 2005]에 기재된 방법에 기초하여 계산되었다. Huh7.5.1 세포는 항-CLDN-1 또는 대조 혈청(5 μg/mL 내지 100 μg/mL의 농도에서 시작함)과 혼합되었으며, 37℃에서 1시간 동안 사전 배양되었다. HCVcc가 부가되고, 37℃에서 16시간 동안 배양되었다. 상청액이 제거되었으며, 세포는 37℃에서 72시간 동안 정기적인 배지(regular medium)에서 배양되었으며, HCV 감염은 개시된 바와 같이 세포내 HCV RNA의 qRT-PCR에 의해 결정되었다. 항체-매개 중화(neutralization)는 특이적 감염성에 의해 평가되었다.

레트로바이러스의 HCV 위형 입자의 제조 및 HCVpp 감염의 항체-매개 억제. 균주 H77 또는 다른 균주의 엔벨로프 단백질을 갖는 HCVpp 및 VSVpp는 [Bartosch, 2003]에 기재된 바에 따라 생성되었다. 엔벨로프 당단백질이 없는 HCVpp(대조 pp)는 음성 대조군으로서 주어졌다. 항체-매개 중화를 연구하기 위해, Huh7.5.1 세포는 0.5 x 10⁴ 세포/웰의 밀도로 96-웰 플레이트에서 감염 어세이를 하기 전날에 파종되었다. Huh7.5.1 세포는 항-CLDN-1 또는 대조 혈청(1/20의 희석에서 시작함)과 혼합되었으며, 37℃에서 1시간 동안 사전 배양되었다. 상청액이 제거되었으며, 세포는 37℃에서 72시간 동안 정기적인 배지에서 배양되었다. HCV 진입은 개시된 바와 같이 루시페라제 리포터 유전자 발현의 분석에 의해 결정되었다. 항체-매개 중화는 항-클라우딘1 혈청 또는 전-면역 혈청의 존재하에서 HCVpp의 특이적 감염성에 의해 평가되었다.

결과

클라우딘-1을 발현하는 BOSC23 또는 CHO 세포에서 발현된 클라우딘-1의 세포외 루프에 대한 폴리클로날 항체의 제조. HCV 감염이 개시될 때 CLDN-1의 기능적 역할을 평가하기 위하여, CLDN-1의 세포외 루프에 대한 래트 폴리클로날 항-CLDN-1 혈청이 전술한 바와 같이 유전 면역법에 의해 먼저 제조되었다. 면역이 완결된 후에, 항체는 비투과성(non-permeabilized) 감염된 BOSC23 또는 CHO 세포의 세포 표면에서 발현되는 인간 CLDN-1에 결합하는 능력을 위해 선택되었다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 래트 폴리클로날 항-CLDN-1 항체에 의한, 인간 CLDN-1을 발현하는 CHO 세포의 배양은, CLDN-1의 세포외 엑토도메인과 혈청의 특이적 상호작용을 야기하였다(도 1b). 반면, pcDNA3.1 대조 벡터로 감염되고 래트 항-CLDN-1 혈청에 의해 배양된 CHO 세포, 또는 cDNA를 발현하는 인간 CLDN-1에 의해 배양되고 래트 전-면역 혈청에 의해 배양된 CHO 세포에서는, 어떠한 상호작용도 관찰되지 않았다(도 1a).

항-인간 CLDN-1이 HCV 감염에 감수성인 세포에서 CLDN-1을 인식하는지 여부를 연구하기 위해, 인간 간세포 및 Huh7.5.1 간종양 세포가 혈청과 함께 배양되었으며, 유동세포계수법에 의해 분석되었다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 래트 폴리클로날 항-CLDN-1 항체와 함께 인간 Huh7.5.1 세포(도 2a) 및 인간 간세포(도 2b)의 배양은, 상기 항체가 인간 간세포를 포함하는 HCV 표적 세포에서 발현되는 CLDN-1을 인식하였다는 점을 입증하였다. 이를 함께 고려할 때, 상기 데이터는 유전 면역법에 의해 제조된 항-CLDN1 폴리클로날 항체가 인간 간세포 뿐만 아니라 인간 간종양 세포에서 발현되는 인간 CLDN1의 엑토도메인에 결합한다는 것을 입증한다.

면역형광에 의한 항-CLDN-1 폴리클로날 항체의 특징화. 면역형광에 의해 획득한 결과는 도 3에 나타낸다. 이는 예상된 바와 같이 결합된 항-CLDN1 폴리클로날 항체가 세포 표면에 편재한다는 것을 입증한다.

항-CLDN-1 폴리클로날 항체에 의한 HCV 감염의 억제. HCV 감염에 대한 CLDN-1의 역할을 평가하기 위하여, Huh7.5.1 세포의 JFH1 HCVcc 감염은 CLDN-1 세포외 루프의 에피토프에 대한 항-CLDN-1 항체의 존재하에서 연구되었다. 도 4a는 항-CLDN-1 래트 혈청이 100 μg/mL의 농도에서 JC1 HCVcc 감염을 80%를 초과하는 정도로 억제하였음을 보여준다. 반면, 대조 전-면역 혈청은 HCVcc 감염에 대해 어떠한 효과도 나타내지 않았다(도 4a). 이를 함께 고려할 때, 상기 데이터는 CLDN1 엑토도메인에 대한 항체가 HCV 감염을 효과적으로 억제한다는 것을 입증한다.

JFH1 HCVcc 감염의 억제가 실제로 항-CLDN-1 항체에 의해 매개되었는지를 확인하기 위하여, IgG가 래트 항-CLDN-1 혈청으로부터 정제되었으며, 대조 혈청으로부터 정제되었다. 도 4b에 나타낸 바와 같이, 항-클라우딘-1 정제 IgG는 항-CLDN-1 혈청과 유사한 방식으로 Huh7.5.1 세포의 HCVcc 감염을 현저하게 억제하였다. 반면, 전-면역 혈청으로부터 정제된 대조 IgG(100 μg/mL)는 HCVcc 감염을 억제하지 않았다(도 4b). 상기 데이터는 항-CLDN-1 혈청의 억제 효과가 항-CLDN1 항체에 의해 매개되는 것이고, 혈청에 존재하는 다른 물질들(예컨대, CLDN-1 기능을 잠재적으로 저해하는 CLDN-1 리간드)에 의해 매개되는 것이 아니라는 것을 명백하게 입증한다.

또한, HCV 감염에 대한 정제된 항-클라우딘-1 항체의 억제 효과는 레트로바이러스의 HCV 위형 입자(pseudotyped particle)(HCVpp)를 사용하여 확인되었다. 항-클라우딘-1 항체는 용량-의존적 방법에서 HCVpp에 의해 Huh7 세포의 감염을 억제하였으나, 대조 항체는 억제하지 않았다(이 데이터는 나타내지 않음).

그 결과, 상기 데이터는 항-클라우딘-1 폴리클로날 항체가 HCV 감염을 효과적으로 억제한다는 것을 입증한다.

전술한 바와 같이 수득한 항-CD81 모노클로날 항체, 래트-항-SR-BI 혈청, 및 래트 항-CLDN1 혈청을 사용하여, 본 출원인은 CLDN1 및 CD81, 또는 CLDN1 및 SR-BI, 또는 CLDN1, CD81 및 SR-BI를 차단하는 것이 각각의 진입 인자 단독을 차단하는 것보다 HCVcc 감염을 더 강하게 억제하였다는 점을 입증하였다(도 5a-d 참조). 이를 함께 고려할 때, 상기 데이터는 CLDN1은 CD81 및 SR-BI와 공동으로 HCV 진입을 매개한다는 것을 시사한다. 또한, 항-CD81 모노클로날 항체, 래트-항-SR-BI 혈청, 및 래트 항-CLDN1 혈청은 운동학적(kinetics) 측면에서 유사하게 Huh7.5.1 세포의 HCVcc 감염을 억제한다는 것이 발견되었으며, 이는 CLDN1, SR-BI 및 CD81이 Huh7.5.1 세포에서 HCV가 진입하는 동안 거의 동시에 작용한다는 것을 시사한다(도 6 참조).

실시예 2: 항-클라우딘-1 모노클로날 항체

재료 및 방법

세포주 및 일차 간세포. 인간 Huh7(Steinmann, 2004), Huh7.5.1(Zhong, 2005), 293T(Pestka, 2007), BOSC23(Pear, 1993), 햄스터 CHO(Barth, 2005) 및 뮤린 Hepa1.6 세포(Steinmann, 2004)의 배양에 대해서는 전술되었다. 일차 인간 및 마우스 간세포는 [Codran, 2006; Lan, 2008; Zeisel, 2007]에 기재된 바에 따라 분리되고 배양되었다. 일차 시노몰구스 간세포는 독일의 PRIMACYT Cell Culture Technology GmbH에서 구입되었다.

일차 인간 간세포에 대한 항-CLDN1 mAb의 결합 및 교차-경쟁(cross-competition) 분석. 인산완충식염수(PBS) - 3% 소태아혈청(FCS)에서 항-CLDN1 mAb의 농도를 증가시키면서, Huh7.5.1 세포 또는 일차 인간 또는 시노몰구스 간세포(2 x 10⁵ 세포/웰)가 실온에서 30분 동안 배양되었다. mAb 결합은 PE-컨쥬게이트 항-래트 IgG mAb(Southern Biotechnology Associates)와의 배양에 의해 나타났다. 대조군으로서, 이소타입-매치된(matched) 래트 IgG2b(Genovac)가 사용되었다. FACS 획득 및 분석은 FACScan(Beckton Dickinson) 및 CellQuest 소프트웨어에 의해 수행되었다. 항-CLDN1 mAb 사이의 경쟁은 세포-기재 ELISA에 의해 측정되었다. Huh7.5.1 인간 간종양 세포(2 x 10⁵ 세포/웰)는 96-웰 플레이트에 파종되었다. 웰을 차단한 후에, 상기 세포는 경쟁자로서 표지되지 않은 항-CLDN1 mAb의 농도를 증가시키면서 0.1 μg/mL 비오틴화 항-CLDN1 mAb와 함께 60분 동안 배양되었다. PBS에서 세포를 세척한 후에, 비오틴화 항체의 결합이 고추냉이 페록시다제(BD)로 표지된 스트렙트아비딘과 함께 배양에 의해 검출되었다. 결합은 세척 및 Amplex Red 시약에 의한 전개 후에 상대적 형광 단위(590 nm)로 측정되었다. 이소타입-매치된 대조군의 존재하에서 결합을 측정함으로써 결정된 곡선은 경쟁 항체의 존재하에서 결정된 곡선과 비교되었다. 비오틴 표지화는 제조사의 권고에 따라 Sulfo-NHS-LC-비오틴(Thermo Scientific)을 사용하여 수행되었다.

세포 표면 CLDN1의 영상 연구. 살아있는 Huh7.5.1 세포가 투과 시약(permeabilization reagent)의 부재하에서 래트 이소타입 대조군 또는 래트 항-CLDN1 OM-7D3-B3(10 μg/mL) 및 Cy5-컨쥬게이트 항-래트 이차 항체(1/300; Jackson Immunoresearch)와 함께 배양되었다. 염색 이후에, 상기 세포는 고정되고, 마운트(mount)되었으며, Leica LSR2 CLSM(IGBMC Imaging Center, Illkirch, 프랑스)를 사용하여 관찰되었다.

항-CLDN1 mAb에 의해 표적화된 에피토프의 매핑(mapping). 에피토프 매핑은 야생형 CLDN1 또는 부위 특이적 돌연변이생성(Cukierman, 2009)에 의해 도입된 한정 돌연변이(defined mutation)를 포함하는 CLDN1에 대해 인코딩하는 pQCXIN-h클라우딘1 플라스미드가 사용되어 수행되었다. 상기 CLDN1-돌연변이 플라스미드는 Tanya Dragic 박사에 의해 제공되었다(Department of Microbiology and Immunology, Albert Einstein College of Medicine, Bronx, New York). 야생형 및 돌연변이 CLDN1은 세포질의 N-말단 헤마글루티닌(HA)-태그를 포함하며, 이는 감염 효율 및 단백질 발현의 정량화를 가능하게 한다(Cukierman, 2009). 돌연변이 CLDN1에 대한 항-CLDN1 mAb의 결합을 연구하기 위하여, CLDN1-음성 BOSC23 세포는 CLDN1 발현 구축물(0.05 μg DNA; Lipofectamine)에 의해 일시적으로 감염되었다. 48시간 후에, pQCXIN-h클라우딘1 플라스미드로 일시적으로 감염된 BOSC23-세포에 대한 모노클로날 항체 OM-7D3-B3 또는 OM-8A9-A3의 결합이 유동세포계수법에 의해 결정되었다. 항-HA 항체를 사용한 HA-tag 발현의 유동세포계수법 정량화가 내부 대조군으로서 제공되었다. 감염된 세포는 세포질의 HA-태그 발현의 분석을 위해 Cytoperm/Cytofix(BD)에 의해 투과되거나, 또는 항-CLDN1-돌연변이 CLDN1의 상호작용의 분석을 위해 비처리되었다. FACS 분석을 위해, 감염된 세포는 30분 동안 항-CLDN1 mAb 또는 항-HA(Covance)와 함께 배양되었으며, 그 후 10 μg/mL 항-래트 IgG mAb와 함께 배양되거나(항-CLDN1의 경우) 또는 피코에리트린으로 표지된 10 μg/mL 항-마우스 IgG mAb와 함께 배양되었다(항-HA의 경우).

HCVcc 제조 및 감염. HCVcc(균주 Jc1, Luc-JC1, Luc-Con1)가 이미 기재된 바와 같이 제조되었다(Haberstroh, 2008; Koutsoudakis, 2006; Pietschmann, 2006; Wakita, 2005; 및 Zeisel, 2007). 감염 실험을 위해, Huh7.5.1 세포는 2 x 10⁴ 세포/웰의 밀도로 48-웰 조직 배양 플레이트에 파종되었다. 세포는 37℃에서 1시간 동안 항체의 존재 또는 부재 하에서 사전 배양되었으며, 그 후 Jc1 HCVcc 또는 Luc-JC1 HCVcc와 함께 4시간 동안 37℃에서 배양되었다. 48시간 후에, HCV 감염은 [Haberstroh, 2008; Koutsoudakis, 2006; Tscherne, 2006; 및 Zeisel, 2007]에 기재된 바와 같이 루시페라제 활성 또는 RT-PCR을 사용한 세포내 HCV RNA의 정량화에 의해 세포 용해물에서 분석되었다.

HCV 위형 입자(HCVpp)의 제조 및 감염. MLV-기재 또는 HIV-기재 HCVpp(균주 H77, HCV-J, JFH-1, UKN3A.1.28, UKN4A.21.16, UKN5.14.4, UKN6.5.340, VI, VJ, VD, VH, VK 및 VA-VY) 및 VSVpp가 [Lavilette, 2005; Bartosch, 2003; Pietschmann, 2006; Zeisel, 2007; Fafi-Kremer, 2009]에 기재된 바에 따라 제조되었다. 감염 실험을 위해, HEK293T, 293T/CLDN1+ 및 Huh7.5 세포가 [Haberstroh, 2008]에 기재된 바와 같이 운동학적 실험 전날에 24-웰 플레이트에 플레이팅되었다. 72시간 후에, 상기 세포는 용해되었으며, HCVpp 진입은 [Koutsoudakis, 2006]에 기재된 바와 같이 루시페라제 리포터 유전자 발현의 정량화에 의해 분석되었다.

독성 어세이. 세포에 대해 세포독성 효과는 3-(4,5-디메틸티아조일-2-일)-2,5-디페닐-테트라졸륨 브로마이드(MTT)를 물질대사시키는 능력을 분석함으로써 3회 평가되었다(Mosmann, 1983). 3개의 다른 공여체(donor)의 Huh7.5.1 세포 및 일차 인간 간세포가 래트 모노클로날 항체, 항-CLDN1 OM-7D3-B3(0.01-100 μg/mL), 플라보피리돌(10 μM, Sigma) 또는 화합물 C(0.01-100 μM, Sigma)와 함께 배양되었다. MTT의 최종 농도는 0.6 mg/mL였다. 세포에 의해 생성된 포르마잔 결정이 [Mosmann, 1983]에 기재된 바에 따라 가용화되고 측정되었다.

통계적 분석. 결과들은 평균±표준편차(SD)로 나타내었다. 통계적 분석은 스튜던트 t 테스트를 사용하여 수행되었으며, 0.05 미만의 P 값은 통계상 유의적인 것으로 고려되었다.

결과

세포 표면 CLDN1의 세포외 도메인에 대해 특이적인 모노클로날 항체의 제조. 5마리의 래트는, 독일 특허 DE 198 52 800(이는 본원에 전체로서 참조로 삽입됨)에 기재된 Genovac 시스템에 기초한 스크리닝과 함께, [Lohrmann, 2003, 이는 본원에 전체로서 참조로 삽입됨]에 요약된 바와 같이 Genovac GmbH에서 사용되는 표준 유전 면역법 프로토콜을 적용하여 포유류의 발현 벡터에서 전장길이의 인간 클라우딘-1 cDNA(NCBI 접근번호: NM_021101)로 면역화되었다. 요약하면, 상기 스크리닝을 위해, 혈청 및 하이브리도마 상청액은 항체가 생성되는 표적을 발현하는 태그된 cDNA 구축물로 감염된 포유류의 세포에 대해 테스트된다. DNA 벡터는 생성된 단백질이 분비되고 원형질막에 일시적으로 부착되도록 설계된다. 이는 세포-기재 ELISA 또는 유동세포계수법을 사용한 세포-기재 스크리닝 어세이를 가능하게 한다.

수개의 DNA 증가 후에, 상기 동물은 희생되었으며, 혈청 및 림프구가 각각의 동물로부터 수집되었다. 각 동물의 혈청은 클라우딘-1 cDNA를 포유류의 세포로 일시적 감염시킨 후, 인간 클라우딘-1 단백질의 인식을 위해 유동세포계수법을 사용하여 테스트되었다(도 7).

래트 3의 림프구는 제거되고, 표준 PEG 조건을 사용하여 SP2/0/Agl4 마우스 골수종 세포(ATCC 번호: CRL-1581)와 융합되었으며, 생성된 하이브리도마는 표준 선택 조건하에서 96-웰 플레이트에 플레이팅되었다(예를 들어, E. Harlow 및 D. Lane, "Antibodies, A Laboratory Manual", Chapter 6, 1988, Cold Spring Harbor 참조). 2주 후에, 하이브리도마 상청액은 클라우딘-1 cDNA로 일시적 감염된 포유류의 세포와 음성 발현 대조군으로서 무관한 cDNA로 감염된 세포에 대해 세포-기재 ELISA에서 테스트되었다. 이러한 사전 선택은 24-웰 플레이트 후에 6-웰 플레이트로 확장을 위해 이동된 양성 하이브리도마의 동정을 가능하게 하였으며, 이의 상청액은 세포-기재 ELISA를 위해 사용된 것과 동일한 양성 및 음성 cDNA 구축물로 일시적 감염된 포유류의 세포에 대해 유동세포계수법을 사용하여 재테스트되었다.

그 후, 항-CLDN-1 항체를 포함하는 하이브리도마 상청액에 의한 재조합 감염성 HCV(HCVcc Luc-JC1) 감염의 억제 분석이 수행되었다. 보다 구체적으로, Huh7 세포는 37℃에서 1시간 동안 항체를 포함하는 100 μL의 하이브리도마 상청액과 함께 배양되었다. 그 후, 감염성 HCVcc(TCID 10⁵/mL; 루시페라제 리포터 성분을 포함하는 Luc-JC1 균주로부터 유래됨)가 37℃에서 3시간 동안 부가되었다. 그 후, 상청액은 제거되고, 새로운 배지(DMEM, 10% FBS)로 대체되었다. 2일 또는 3일 후에, 바이러스의 감염은 세포 용해물에서 루시페라제 리포터 유전자의 발현에 의해 정량화되었다 (Zeisel, 2007). 수득된 결과는 하이브리도마 상청액의 존재 또는 부재 하에서 HCVcc Luc-JC1 감염 %로 나타내며(PBS의 존재하에서 감염=100%), 이는 도 8에서 보여진다. 상기 도에서 볼 수 있듯이, OM-3E5, OM-6D9, OM-7C11, OM-4A4, OM-6E1, OM-7D3, OM-7D4, OM-7C8 및 OM-8A9는 HCV 감염의 현저한 억제를 나타낸 반면, 0M-5A1, OM-6G10 및 OM-5A8은 어떠한 효과도 나타내지 않았다.

이의 차단 활성을 분석한 후에, 모 클론(mother clone) OM-3E5, OM-6D9, OM-7C11, OM-4A4, OM-6E1, OM-7D3, OM-7D4, OM-7C8 및 OM-8A9는 반고체 배지로 플레이팅함으로써 서브클론(subclone)되고, 생성된 서브클론 콜로니가 선택되어, 96-웰 플레이트로 이동되었다(OM7C11은 차단 활성을 나타내었지만, 이는 항체의 비효율적인 생성체였기 때문에 서브클론되지 않았음). 생성된 서브클론이 선택되고, 감염된 비투과성 인간 BOSC23 세포 뿐만 아니라 감염된 햄스터 CHO 세포의 세포 표면에서 발현되는 인간 CLDN1에 결합하는 능력에 대해 재테스트되었다. 인간 BOSC23 세포는 내인성 CLDN1을 발현하지 않는 HEK293-유래 자기지향성 패키징 세포이다(Pear, 1993)(이 데이터는 나타내지 않음). 이러한 분석의 결과는 도 9에 나타낸다. 하기의 서브클론이 선택되었다: OM-3E5-B6, OM-6D9-A6, OM-4A4-D4, OM-6E1-B5, OM-7D3-B3, OM-7D4-C1, OM-7C8-A8 및 OM-8A9-A3.

인간 CLDN1을 발현하는 BOSC23 세포 및 CHO 세포와 래트 모노클로날 항-인간 CLDN1 항체의 배양은 인간 CLDN1와의 특이적 상호작용을 야기하였다(도 9a 및 도 9b).

항-인간 CLDN1 항체가 HCV 허용 Huh7.5.1 세포 및 일차 인간 간세포의 세포 표면에서 CLDN1의 세포외 루프에 결합하는지 여부를 연구하기 위하여, 세포는 항-CLDN1 항체와 함께 배양되고, 투과 시약(permeabilization reagent)의 부재하에서 유동세포계수법을 사용하여 분석되었다. 모노클로날 항-CLDN1 항체에 의한 천연의 인간 Huh7.5.1 간종양 세포 및 인간 간세포의 양성 염색은, 상기 항체가 일차 간세포 및 HCV 허용 세포주의 세포 표면에서 발현되는 CLDN1에 결합하는 것을 입증하였다(도 9c). 반면, 항-CLDN mAb와 함께 배양된 인간 CLDN1-결핍 BOSC23 세포(도 9a) 또는 이소타입 대조 항체와 함께 배양된 Huh7.5.1, CHO/CLDN+ 세포 또는 일차 인간 간세포(도 9b)에서는 어떠한 염색도 관찰되지 않았다. 또한, 모노클로날 항체에 의한 천연의 세포 표면 CLDN1의 염색은 살아있는 비투과성 Huh7.5.1 세포에 대한 면역형광에 의해 확인되었다(도 9d). 이를 함께 고려할 때, 상기 데이터는 유전 면역법에 의해 제조된 모노클로날 항-CLDN 1 항체가 HCV 허용 세포주 및 인간 간세포의 세포 표면에 대해 발현되는 천연 CLDN1의 세포외 루프에 특이적으로 결합한다는 것을 입증한다.

항-인간 CLDN1 항체가 뮤린 CLDN1과 교차반응하는지 여부를 조사하기 위하여, 뮤린 간-유래 세포주에 대해 발현되는 뮤린 CLDN1에 mAb의 결합이 연구되었다. 흥미롭게도, 모노클로날 항-CLDN 1 항체는 마우스 간종양 세포주 Hepa1.6에서 발현되는 뮤린 CLDN1과 상호작용하지 않았다. 또한, 도 9에 나타낸 바와 같이, 항-CLDN 1 항체는 햄스터 세포주 CHO를 염색하지 않았다. 이러한 발견은 항-인간 CLDN1 항체와 뮤린 또는 햄스터 CLDN1의 세포외 루프의 교차반응성이 없다는 것을 시사한다(도 9 및 도 19). 반면, 래트 모노클로날 항-CLDN1은 비인간 영장류 시노몰구스 원숭이(마카카 파시쿨라리스)의 일차 간세포와의 교차반응성을 나타내었다(도 9e). 상기 데이터는 항체에 의해 표적화된 에피토프(들)가 영장류 중에서는 보존되지만 마우스 또는 햄스터와 같은 설치류에서는 다르다는 것을 시사한다.

각각의 서브클론은 정착되었으며, 일부분은 무혈청 ISF-1 배지(Biochrom AG, 목록 번호: 9061-01)에서 확장되었다. 상기 항체는 단백질 G 컬럼에서 정제되었으며, 이의 농도는 PBS 완충액에서 결정되었다. 이소타입은 BD-Pharmingen(목록 번호: 557081)의 시판 ELISA 테스트를 사용하여 각 클론에 대해 결정되었다. 또한, 경쇄의 특징은 동일한 시판 ELISA 키트를 사용하여 결정되었다. 이러한 분석의 결과는 하기 표 1에 나타낸다.

선택된 하이브리도마 세포주에 의해 분비된 모노클로날 항체의 특징

하이브리도마 세포주	분비된 모노클로날 항체
	이소타입	경쇄
OM-6E1-B5	rIgG2b	카파(kappa)
OM-8A9-A3	rIgG2b	카파(kappa)
OM-6D9-A6	rIgG2b	카파(kappa)
OM-7D4-C1	rIgG2b	카파(kappa)
OM-3E5-B6	rIgG2a	카파(kappa)
OM-7C8-A8	rIgG2b	카파(kappa)
OM-4A4-D4	rIgG2a	카파(kappa)
OM-7D3-B3	rIgG2b	카파(kappa)

HCV-허용 세포 및 일차 인간 간세포에 대한 항-CLDN1 mAb의 결합 성질의 특징화. HCV 허용 세포 및 일차 인간 간세포에 대한 항-CLDN1 mAb의 결합 성질은 유동세포계수법을 사용하여 특징화되었다. 도 10에 나타낸 바와 같이, Huh7.5.1 세포에 결합하기 위한 측정된 반포화 농도는 항체의 분명한 K_D에 대응하며, 이는 다음과 같았다: 7D3-B3 4nM; 7D4-C1 5nM; 8A9-A3 2nM; 4A4-D4 9nM, 6D9-A6 8nM, 6E1-B5 3nM, 7C8-A8 7nM(도 10a). 유사한 반포화 농도 및 항체의 분명한 KD는 일차 인간 간세포에 결합하는 항체에 대해 수득되었다(이 데이터는 나타내지 않음). 상기 결과는 항-CLDN1 항체가 HCV 허용 세포주 및 인간 간세포에 높은 친화력으로 결합한다는 것을 입증한다.

항-CLDN1 항체에 의한 모든 주요 유전자형 및 각 유사종들(quasispecies)의 HCV 분리주(isolate)의 교차-중화(cross-neutralization). 유전 면역법에 의해 제조된 항체가 HCV 감염을 억제할 수 있었는지를 조사하기 위하여, Huh7.5.1 세포는 항-CLDN1 또는 이소타입 대조 항체의 존재하에서 키메라 J6/CF-JFH1 반딧불이 루시페라제 리포터 바이러스 Luc-J1로 감염되었다(Koutsoudakis, 2006). 도 11은 모노클로날 항-CLDN1 항체가 용량-의존적 방법에서 Luc-JC1 및 Luc-Con1 바이러스에 의한 Huh7.5.1 세포의 HCV 감염을 억제한 반면, 이소타입 대조 항체는 억제 효과를 나타내지 않았음을 보여준다. 이를 함께 고려할 때, 상기 데이터는 CLDN1 세포외 루프에 대한 항체가 HCV 감염을 억제한다는 것을 입증한다. 항-CLDN1 항체가 모든 주요 유전자형들의 HCV 감염을 교차-중화할 수 있었는지 여부를 연구하기 위하여, HCV 유전자형 1-6의 HCV 엔벨로프 당단백질을 갖는 HCV 위형 입자(HCVpp)의 진입에 대한 항체의 영향이 분석되었다. 도 12에 나타낸 바와 같이, 모노클로날 항-CLDN1 항체는 유전자형 1-6의 HCVpp에 의한 Huh7.5.1 세포의 감염을 효과적이고 용량의존적으로 억제하였으며, HCV 감염의 억제에 대한 IC₅₀은 0.1 내지 5 μg/mL의 범위를 갖는다. 유사한 결과가 일차 인간 간세포의 감염에서 발견되었다(도 13).

항바이러스 및 면역억제 전략을 개발하기 위한 주요 과제는 바이러스의 높은 가변성이다. HCV는 복제 속도가 매우 높으며, 높은 에러 유발 바이러스의 폴리머라제는 체액성 및 세포성 면역 반응에 차이가 있을 수 있는 "유사종(quasispecies)"이라고 불리우는 사소한 바이러스 변이체들을 빠르게 생성시킬 수 있다(Aurora, 2009; Farci, 2006; Ray, 2005; Uebelhoer, 2008). 상기 변이체는 감염된 숙주에서 일정한 면역 압력 하에 놓이며, 선택 과정은 면역 인식을 피하거나 항바이러스 요법에 대해 내성을 부여할 수 있는 가장 적합한 바이러스가 바이러스의 유사종에서 우세하게 되도록 한다.

항-CLDN1 항체가 각 환자들에게서 유사종 군을 효과적으로 억제하였는지 여부를 연구하기 위하여, HCV에 의해 만성적으로 감염된 2명의 개별 환자의 엔벨로프 당단백질이 클로닝되고, 서열화되었으며, 발현되었다. 도 14에 나타낸 바와 같이, 항-CLDN1 항체는 2명의 개별 환자의 유사종의 엔벨로프 당단백질을 갖는 HCVpp의 HCV 감염을 광범위하게 중화시켰다. 상기 데이터는 항-CLDN1 항체가 개별 환자의 모든 주요 유전자형 뿐만 아니라 유사종 군의 분리주의 HCV 감염을 교차-중화시킨다는 것을 입증한다.

숙주의 중화 항체를 회피하고 간 이식편을 재감염시키는 HCV 유사종 및 바이러스 균주의 중화. 만성 HCV 감염에 기인한 말기의 간 질환은 간 이식을 하는 주된 원인이다. 숙주의 면역 반응으로부터 바이러스의 회피 및 예방적 항바이러스 전략의 부재 때문에, 이식편의 재감염은 일반적이며, 이는 간 질환의 진행이 촉진되는 것을 특징으로 한다. 일차 인간 간세포 및 간 이식을 받은 HCV-감염 환자로부터 유래된 바이러스의 엔벨로프 당단백질을 갖는 레트로바이러스의 HCV 위형을 사용하여, 본 출원인은 증대된 바이러스의 진입 및 항체-매개 중화로부터의 도피가 간 이식편의 HCV 재감염 동안 바이러스 변이체들의 선택을 위한 중요한 결정요인이라는 점을 이미 입증하였다(Fafi-Kremer, 2009, 공개를 위해 제출되었음).

본 연구에서, 항-CLDN1 항체가 숙주의 중화 반응을 피하고 간 이식편의 재감염을 유발하는 바이러스의 분리주에 의해 일차 인간 간세포가 감염되는 것을 억제할 수 있는지 여부를 평가하기 위하여, 간 이식을 받은 환자의 엔벨로프 당단백질을 나타내는 HCVpp 및 HCV 재감염이 사용되었다. 상기 목표를 달성하기 위하여, 본 출원인은 이식하는 동안 선택된 HCV 균주의 엔벨로프 당단백질을 갖는 HCVpp의 진입 및 간 이식편의 재감염에 대한 항-CLDN1 항체의 효과를 연구하였다(HCV 균주 VD, VH, VK). 도 15에 나타낸 바와 같이, 항-CLDN1 항체와의 세포의 사전 배양은 일차 인간 간세포에서 환자-유래 HCVpp의 진입을 현저하게 억제하였다. 상기 데이터는 항-CLDN1이 간 이식편을 재감염시키는 환자-유래 분리주의 HCV 진입을 특이적으로 억제한다는 것을 분명하게 입증한다.

MTT 테스트에 기초한 세포 생존도 분석은 항-CLDN1 항체의 잠재적인 독성 효과를 연구하기 위하여 수행되었다. 항-CLDN1은 고용량을 사용하더라도, MTT 테스트에 기초한 세포 생존도의 병렬적 분석에서 어떠한 독성 효과도 관찰되지 않았다(도 16). 반면, 알려진 독성으로 잘 특징화된 AMPK-억제제인 화합물 C는 독성이 쉽게 검출될 수 있었다(도 16).

모노클로날 항-CLDN1 항체 결합은 CLDN1 세포외 루프에서 고도로 보존된 모티프 W(30)-GLW(51)-C(54)-C(64)의 보존에 의존한다. 마지막으로, 본 출원인은 모노클로날 항-CLDN1 항체에 의해 표적화된 에피토프(들)을 매핑하는 것을 목적으로 하였다. 항-CLDN1 mAb가 유사하거나 다른 무관한 에피토프를 인식하는지 여부를 조사하기 위하여, 교차-경쟁(cross-competition) 실험이 6개의 모노클로날 항체를 사용하여 수행되었다. Huh7.5.1 세포에 대한 표지된 OM-8A9-A3 또는 OM-7D3-B3의 결합은 대조 이소타입-매치된 IgG 또는 항-CLDN1 mAb의 농도를 증가시키면서 사전 배양한 후에 측정되었다. 모든 항-CLDN1 mAb와의 공배양은 세포 표면에 나타나는 항-CLDN1에 대한 8A9-A3의 결합을 거의 80%까지 감소시킨 반면, 대조 IgG는 Huh7.5.1 세포의 인식을 손상시키지 않았다(도 17a). OM-8A9-A3 또는 OM-7D3-B3에 대해서 뿐만 아니라, mAb를 억제하는 포화 농도를 사용하여 입증된 표지된 모든 OM mAb에 대해서도 유사한 결과가 얻어졌다(도 17b). 결합 어세이에서 획득한 결과는 감염 실험에서 교차-경쟁 연구를 수행함으로써 확인되었다. 도 17c에 나타낸 바와 같이, 다른 항-CLDN1 항체들의 조합은 HCV 감염의 억제 정도에 대해 뚜렷하게 부가적이거나 상승적인 효과를 보여주지 않았다. 결합 연구에서 획득한 결과를 확인하는 것 외에, 상기 결과는 6개의 모든 항-CDLN1 항체들이 CLDN1 세포외 루프에서 유사하거나 밀접하게 관련된 모티프를 인식한다는 것을 시사한다. 그러나, 모노클로날 항체의 2개에 대한 잠정적인 서열 데이터는 중쇄와 경쇄 모두에 대한 서열에서 달라진다는 것을 보여준다(이 데이터는 나타내지 않음).

상기 6개의 모노클로날 항체들과 Cukierman 등의 [Cukierman, 2009]에 기재된 CLDN1 돌연변이의 군의 상호작용은 항체에 의해 표적화된 모티프를 더욱 분명하게 하기 위하여 연구되었다. 알라닌 스캐닝 돌연변이생성 접근법을 사용하여, Cukierman 등은 6개의 다른 아형들로부터 도출된 HCV 분리주의 진입에 중요한 CLDN1 제1 세포외 루프의 7개의 잔기들을 동정하였다. 중요한 잔기들의 대부분은 모티프 W(30)-GLW(51)-C(54)-C(64)에 속하며, 이는 모든 인간 클라우딘 중에서 고도로 보존된 것이다(Cukierman, 2009). 야생형 및 돌연변이 CLDN1 분자를 발현하는 일시적 감염된 BOSC23 세포를 사용하여, 본 출원인은 CLDN1의 위치 30, 35, 49, 50, 51, 54 및 64에서 아미노산 잔기를 알라닌으로 치환하는 것은 모노클로날 항체 OM-7D3-B3의 결합을 급격하게 감소시킨 반면, 다른 돌연변이들은 항체의 상호작용에 영향을 미치지 않았다는 것을 입증하였다(도 18a).

이전의 연구들은 잔기 132가 진입에 중요하며(Evans, 2007), 근위(proximal)의 D38 잔기가 바이러스의 진입에 동일하게 중요하다(Cukierman, 2009)는 점을 보여주었다. 흥미롭게도, 상기 잔기들의 돌연변이생성은 항-CLDN1 항체의 부분 결합을 여전히 허용하였으며(도 18), 이는 상기 잔기들이 항-CLDN1-CLDN1 상호작용에 대해 덜 중요한 역할을 한다는 것을 시사한다. 또한, 돌연변이 CLDN1에 대한 항-CLDN1 결합의 분석은 잔기 Y35가 모노클로날 항-CLDN1 항체에 의해 인식되는 것으로 보여지는 것을 입증한다(도 18a 및 18b). 일시적 감염된 BOSC23 세포에서 야생형 및 돌연변이 CLDN1의 적절한 발현은 HA 태그가 없는 돌연변이 I32A(도 18a 및 18b)를 제외하고 HA-태그 발현 수준 및 항-HA 항체의 유동세포계수법 분석에 의해 확인되었으며(도 18a 및 18b), CLDN1의 발현은 돌연변이되지 않은 CLDN1 C-말단 도메인에 대한 무관한 항체를 사용하여 FACS 분석에 의해 평가되었다(돌연변이 I32A: 이 데이터는 나타내지 않음). 유사한 패턴이 항체 OM-8A9-A3에 대해 관찰되었다(도 18b). 상기 결과는 상기 mAb가 HCV 진입에 대해 필수적인 공-잔기로서 동정된 W(30)-GLW(51)-C(54)-C(64) 모티프에 의해 영향받는 형태-의존적 에피토프를 인식한다는 것을 시사한다(Cukierman, 2009).

논의

처음으로, 모든 주요 유전자형들의 HCV 감염을 강하게 교차-중화시키는 클라우딘 1의 세포외 루프에 대한 모노클로날 항체가 제조되었다. 인식은 인간 CLDN1 세포외 루프 1의 모티프 W(30)-GLW(51)-C(54)-C(64)의 보존에 크게 의존한다. 상기 모티프가 에피토프를 나타내는지 여부, 또는 인식에 영향을 미치는 돌연변이가 상기 에피토프의 손실 또는 차폐를 유발하는 형태적 변화를 야기하는지 여부가 결정되기 위해 남아있다. 항-CLDN1 항체는, 간을 이식하는 동안 HCV 재감염된 4명의 환자로부터 유래된 엔벨로프 당단백질을 갖는 HCVpp를 사용하여, 개별 환자에서 HCV 분리주의 진입 뿐만 아니라 간을 이식하는 동안 선택된 주요 HCV 변이체의 진입을 교차 억제한다.

바이러스를 표적으로 하는 현재 및 개발중인 항바이러스 요법의 주된 한계점은 바이러스의 내성의 빠른 발달이다. 항바이러스 및 면역예방 전략을 개발하기 위한 주요 과제는 바이러스의 높은 가변성이다. HCV는 복제 속도가 매우 높으며, 높은 에러 유발 바이러스의 폴리머라제는 체액성 및 세포성 면역 반응에 차이가 있고 통상적인 항바이러스 요법에 대해 바이러스 내성을 부여하는 바이러스의 분리주를 야기할 수 있는 "유사종(quasispecies)"이라고 불리우는 사소한 바이러스 변이체들을 빠르게 생성시킬 수 있다(Aurora, 2009). 필수적인 숙주 인자들을 표적으로 하는 것은 상보적 대안을 나타낼 수 있다. 만일 바이러스의 탈출이 발생한다면, 이는 다양한 메카니즘 및 바이러스 인자들로 이루어질 것이다. 항-CLDN1 항체가 개별 환자에서 모든 유전자형 및 유사종의 바이러스 분리주의 HCV 감염을 유사하게 억제한다는 사실은, 이전부터 존재하는 항-CLDN1 항체에 내성인 유전자형 또는 변이체의 부재를 나타낸다.

HCV 감염을 효과적으로 교차-중화시키는 항-CLDN1 항체를 개발함으로써, 본 출원인은 새로운 항바이러스 전략을 위한 목표로서 CLDN1에 대한 개념증명(proof-of-concept)을 보여주었다. HCV 진입은 바이러스-숙주의 상호작용의 제1단계이고 숙주의 중화 반응의 주요 표적이기 때문에, 이는 HCV 프로테아제 및 폴리머라제의 억제제의 경우 세포내 복제를 차단하기 위해 계속되고 있는 노력을 보완할 수 있는 항바이러스 요법에 대해 유망한 목표를 나타낸다(Stamataki, 2008; Timpe and McKeating, 2008; Zeisel, 2008). HIV와 같은 다른 바이러스의 감염에 대한 진입 억제제의 임상 개발의 성공은 치료 또는 예방 목표로서 바이러스의 진입 단계의 관련성에 중점이 있다(Este and Telenti, 2007).

모노클로날 항체의 중요한 적용은 간을 이식한 이후에 HCV 재감염의 예방에 있을 수 있다. 간 이식(LT)의 현재 주요한 한계점은 이식편의 일반적인 HCV 재감염과 그 후의 HCV-유도 간 질환의 진행의 촉진이다(Brown, 2005). 재감염을 방지하기 위한 예방 전략은 결핍되어 있으며, 인터페론-기재 항바이러스 요법은 LT 수용자에게서 효능 및 내약성이 제한된다(Brown, 2005). 숙주의 면역 반응으로부터 바이러스의 회피 및 예방적 항바이러스 전략의 부재 때문에, 이식편의 재감염은 일반적이며, 이는 간 질환의 진행이 촉진되는 것을 특징으로 한다(Brown, 2005). 일차 인간 간세포와 간 이식을 받은 HCV-감염 환자로부터 유래된 바이러스의 엔벨로프 당단백질을 갖는 레트로바이러스의 HCV 위형을 사용하여, 본 출원인은 증대된 바이러스의 진입 및 항체-매개 중화로부터의 도피가 간 이식편의 HCV 재감염 동안 바이러스 변이체들을 선택하기 위한 중요한 결정요인이라는 점을 이미 입증하였다(Fafi-Kremer, 2009, 공개를 위해 제출되었음).

본 연구에서, 본 출원인은 항-CLDN1 모노클로날 항체가 간을 이식하는 동안 숙주세포 면역 반응을 회피한 분리주에 의해 일차 인간 간세포가 HCV 감염되는 것을 효과적으로 억제하였음을 보여주었다. 항-CLDN1 항체를 교차-중화시킴으로써 환자의 중화 반응을 회피한 바이러스 변이체들을 효과적으로 중화시키는 것은, HCV 진입이 이식편의 재감염을 예방하는 항바이러스 전략을 위한 실현가능한 목표라는 점을 입증한다. 이러한 발견은 또한 HCV 감염에 대한 인간화 마우스 모델에서 최근의 연구에 의해 지지되며, 이는 모노클로날 항-E2 및 항-CD81 항체가 유전적으로 다양한 HCV 분리주들 및 이종성 HCV 유사종에 대한 보호를 중화시킬 수 있었다는 것을 입증한다(Meuleman, 2008; Law, 2008). 따라서, 항-CLDN1 항체를 교차-중화시키는 모노클로날의 투여는 부수적인 항바이러스 요법과 조합되거나 조합되지 않고, 이식된 간의 HCV 재감염을 예방하기 위해 실현가능하고 유망한 옵션을 제공할 수 있다.

HCV 감염의 예방 또는 치료를 위한 항-수용체 항체의 사용의 잠재적인 한계점은 독성일 수 있다. 숙주세포 인자는 바이러스의 진입의 메카니즘과 연결될 수 있는 중요한 기능을 갖는다. 따라서, HCV 진입 인자에 대한 항체 결합은 수용체의 기능 또는 발현을 변경시켜 부작용을 가져올 수 있다. 흥미롭게도, 항-CLDN1은 고용량을 사용하더라도, MTT 테스트에 기초한 세포 생존도의 병렬적 분석에서 어떠한 독성 효과도 관찰되지 않았다(도 16). 이와 관련하여, 본 출원인이 분극된 HepG2 간종양 세포에서 밀착연접 투과성 및 온전성에 대해 폴리클로날 항-CLDN1 항혈청이 효과를 나타내지 않았다는 점을 이미 입증하였다는 것이 흥미롭게도 주목된다(Krieger, 2009, 사본이 제출되었음). 추가적인 연구들이 생체내 독성을 확인하기 위해 요구될지라도, HCV 허용 세포 및 인간 간세포에서 본 출원인이 수행한 예비 독성 연구들은 항-CLDN1 항체가 잘 허용될 수 있다는 것을 나타낸다.

모노클로날 항-CLDN1 항체에 의한 HCV 감염의 중화 메카니즘은 무엇인가? CLDN은 밀착연접의 중요한 성분이며, 4개의 막관통 도메인들, 2개의 세포외 루프 및 1개의 세포내 루프, 및 N-말단 및 C-말단 세포질 도메인의 테트라스파닌 토폴로지를 갖는다(Van Itallie and Anderson, 2006). CLDN1 세포외 루프 1(EL1)은 HCV 진입에 필요한 것으로 나타났으며(Evans, 2007) 장벽 기능에 관여하며 분극된 세포 사이에서 구멍을 형성하는데 기여한다(Krause, 2008). 무극성 HEK293T 세포에서 돌연변이생성 연구는 세포-세포 접촉에서 CLDN1의 풍부가 HCV 진입에 중요할 수 있다는 것을 입증하였다(Cukierman, 2009). 다양한 영상 및 생화학적 기법을 사용하여, 수개의 연구소에서 CLDN1이 CD81과 연관된다는 것이 보고되었다. 본 출원인의 연구소의 가장 최근 데이터에 따르면, CLDN1은 바이러스의 진입에 요구되는, HCV E2, CD81 및 CLDN1을 포함하는 바이러스/공-수용체 복합체를 형성함으로써 HCV 진입을 매개한다는 것이 입증되었다(실시예 3 참조). 또한, 본 출원인은 항-CLDN1 항체가 세포 표면과의 E2 연관을 감소시키고 CD81-CLDN1의 상호작용을 방해함으로써 HCV 감염성을 중화시킨다는 것을 입증하였다(실시예 3 참조).

흥미롭게도, 억제의 정도가 HCVcc(도 11) 및 HCVpp(도 12)에 의한 Huh7.5.1 세포의 감염에 대해 유사하게 나타난 반면, HCVpp 감염의 억제 정도는 Huh7.5.1 세포에 비해 일차 인간 간세포에서 더욱 현저하게 나타났다(도 13-15 및 데이터는 나타내지 않음). 이는, 수용체 또는 공-수용체 복합체의 발현은 무극성 Huh7 간종양 세포주에 비해 부분적으로 분극된 일차 인간 간세포에서 다를 수 있다는 사실에 기인한 것일 수 있다.

교차-경쟁 항체 결합 및 감염 연구는 모노클로날 항체가 밀접하게 관련된 에피토프 도메인을 표적으로 하였다는 점을 명백하게 보여주었다(도 17). 잘 특징화된 CLDN1 돌연변이의 군을 사용하여, 본 출원인은 CLDN1 EL1의 위치 30, 35, 49, 50, 51, 54 및 64에서 아미노산을 알라닌으로 치환하는 것은 CLDN1에 대한 모노클로날 항체 OM-7D3-B3의 결합을 급격하게 감소시킨 반면, 다른 돌연변이들과 항체의 상호작용은 전혀 영향을 받지 않았거나 더 작은 정도로 영향을 받았다는 것을 입증하였다(도 19).

상기 데이터는 CLDN1 EL1의 W(30)-GLW(51)-C(54)-C(64)를 포함하는 아미노산 잔기의 무리내에 존재하는 에피토프 또는 구조적 변화를 통해 손실되거나 차폐될 수 있는 에피토프를 인식한다는 것을 나타낸다. 앞의 경우에, 이러한 보존된 아미노산들은 구조적으로 함께 그룹을 형성하지 않기 때문에, 상기 인식된 에피토프는 형태 의존적인 것으로 여겨진다. 또한, 이러한 가정은 CLDN1 EL1의 아미노산에 대해 인코딩한 선형 펩티드와의 항체의 사전 배양이 감염의 항체-매개 억제를 되돌릴 수 없었다는 점에 의해서도 뒷받침된다(이 데이터는 나타내지 않음). 또한, 유전 면역법에 의해 제조된 항-CLDN1 항체는 ELISA에서 항원으로서 선형 CLDN1 펩티드와의 용이하게 검출가능한 상호작용을 나타내지 않았다(이 데이터는 나타내지 않음).

모노클로날 항체에 의해 표적화되는 CLDN1 제1 세포외 루프의 동정된 잔기들은 6개의 다른 아형들로부터 도출된 HCV 분리주의 진입에 중요한 것으로 입증되었다(Cukierman, 2009). 상기 에피토프를 표적으로 하는 모노클로날 항-CLDN1 항체가 6개의 다른 분리주의 HCV 분리주의 진입을 효과적으로 교차-중화시킨다는 사실은, HCV 진입에 대한 상기 CLDN1 잔기의 관련성에 또한 중점을 둔다. 상기 잔기들의 알라닌 치환은 CLDN1 세포 표면 발현을 손상시키지 않았다는 것이 흥미롭게도 주목된다(Cukierman, 2009). 동일한 접근법에 의해 제조된 폴리클로날 항체는 HCV E2, CD81 및 CLDN1을 포함하는 바이러스/공-수용체 복합체를 분열시키는 것으로 나타났기 때문에(실시예 3), EL1에서 표적화된 아미노산 잔기들은 바이러스의 진입에 필수적인 E2-CD81-CLDN1 공-수용체 복합체의 형성에 중요한 역할을 하는 것으로 여겨진다. 추가의 연구들이 상기 사안을 확인하기 위하여 진행 중에 있다.

결론적으로, CLDN1 EL1에서 W(30)-GLW(51)-C(54)-C(64) 모티프의 보존에 의존적인 모노클로날 항체가 제조되었으며, 이는 HCV 감염을 교차-중화시킨다. 상기 결과는 HCV 진입에 중요하고 HCV 감염을 차단하는 항체에 대해 접근이 가능한 CLDN1 EL1의 잔기를 규정한다. 마지막으로, 상기 데이터는, 모노클로날 항-CLDN1 항체를 사용하여 CLDN1 EL1을 표적화하는 것이, 예컨대 간을 이식한 후에 일차 HCV 감염을 예방하고 만성적으로 감염된 환자에게서 바이러스의 확산을 억제할 수도 있는 신규한 항바이러스 접근법을 구성한다는 것을 나타낸다.

실시예 3: 항-CLDN1 모노클로날 항체의 작용 메카니즘

재료 및 방법

세포주. 실시예 2에 기재된 바와 같음. HEK293T/CLDN1+ 세포(클론 IIIA6)는 CLDN1 cDNA를 인코딩하는 pcDNA3.1 벡터에 의한 HEK293T 세포의 안정한 감염으로부터 수득되었다.

항체. 실시예 2에 기재된 바와 같음. 또한, 폴리클로날 래트 항-SR-BI 또는 CD81 항체는 [Zeisel, 2007]에 기재된 바와 같이 유전 면역법에 의해 수득되었다. R-피코에리트린-컨쥬게이트된 염소 항-래트 IgG는 Jackson ImmunoResearch Laboratories에서 구입되었으며, 마우스 IgG는 Caltag에서 구입되었으며, 마우스 항-CD81(JS-81)은 BD Biosciences에서 구입되었다.

HCV 엔벨로프 당단백질 및 감염성 비리온의 세포성 결합(cellular binding). 표적 세포에 대한 C-말단이 절단된 엔벨로프 당단백질 E1 및 E2의 제조 및 결합에 대해서는 [Haberstroh, 2008; Dreux, 2009]에 기재되어 있다. E2-진입 인자의 상호작용을 연구하기 위하여, CHO 세포는 SR-BI; CD81 또는 CLDN1을 인코딩하는 pcDNA3 기재 발현 벡터로 일시적으로 감염되었다(Barth, 2005). 진입 인자의 발현은 [Barth, 2005]에 기재된 바와 같이 항-수용체 항체를 사용하여 유동세포계수법에 의해 평가되었다. 항-수용체 항체의 존재하에서 엔벨로프 당단백질 결합을 연구하기 위하여, Huh7.5.1 세포(Zhong, 2005)가 실온에서 1시간 동안 래트 항-SR-BI, 항-CLDN1, 및 항-CD81 혈청(1/100) 또는 마우스 항-인간 CD81(JS-81, 5 μg/mL) 또는 대조 항체(1/100 또는 5 μg/mL)와 사전 배양되었다. 재조합 E2(30 μL의 농축된 세포 배양 상청액) 또는 E1(10 μg/mL)이 실온에서 1시간 동안 세포에 첨가되었다. PBS로 세척한 후에, 결합된 엔벨로프 당단백질이 유동세포계수법 및 인간 항-E1(IGH526; Haberstroh, 2008) 또는 마우스 항-His(RGS-His, Qiagen) 및 PE-컨쥬게이트된 이차 항체(Dreux, 2009; Barth, 2008)를 사용하여 검출되었다. 허용 Huh7.5.1 세포에 대한 HCVcc의 결합을 연구하기 위해, Huh7.5.1 세포는 구배 초원심분리를 사용하여 세포 배양 상청액으로부터 부분적으로 정제된 HCVcc(Jc1 균주)와 배양하기 이전에, 헤파린, 래트 항-CLDN1, 래트 항-SR-BI 또는 대조 래트 전-면역 혈청(PI)(모두 1/100으로 희석됨)과 실온에서 1시간 동안 사전 배양되었다. HCVcc와 배양한 후에, 결합되지 않은 HCVcc는 PBS로 세포를 세척함으로써 제거되었다. 그 후, HCVcc의 결합은 [Ploss et al., 2009]에 기재된 바와 같이 세포 결합된 HCV-RNA의 RT-PCR에 의해 정량화되었다.

형광 공명 에너지 전이(FRET)를 사용한 수용체 결합. CD81과 CLDN1의 동형 및 이형 상호작용은 [Harris, 2008; Mee, 2009]에 기재된 바에 따라 분석되었다. 요약하면, AcGFP 및 DsRED 태그된 CD81 및 CLDN1을 발현하도록 형질도입된 HEK293T 세포가 유리 커버슬립에서 성장되었으며, 얼음처럼 차가운 메탄올에 고정되었다. 상기 세포는 가장 높은 신호 대 잡음비(signal-to-noise ratio)를 얻기 위하여 각각의 형광 단백질에 대해 최적화된 세팅의 현미경으로, Zeiss meta head LSCM에 이미징되었다. FRET 분석을 위해, FRET의 점진적 수용 광퇴색 방법이 사용되었으며, AcGFP 형광 강도를 모니터링하면서 시간에 따라 점진적으로 DsRED 형광단을 광퇴색하는 것이 수반되었다(Harris, 2008). 배경 및 혼선을 보정한 후에, DsRED 광퇴색에 따른 AcGFP 강도의 증가는 단백질 사이의 FRET에 기인하며, 이는 10 nm 미만의 거리를 나타낸다. 퍼센트 FRET는 세포의 원형질막에서 분석되는 픽셀의 총 수에 대해 FRET를 나타내는 픽셀의 수로 정의된다(Harris, 2008). 원형질막에서 AcGFP 및 DsRED 태그된 CD81 및 CLDN1의 강도(임의적 형광 단위/픽셀)는 세포 당 500 내지 1000의 측정치를 제공한다. 10개의 세포들의 데이터는 표준화되었으며, 국소화된 발현이 계산되었다.

결과

항-CLDN1은 CLDN1-E2 상호작용의 부재하에서 HCV 허용 세포에 대한 엔벨로프 당단백질 E2 및 감염성 비리온의 결합을 억제한다. 항-CLDN1 항체가 허용 세포주에 대한 E2 결합을 저해할 수 있는지 여부를 조사하기 위하여, 결합 연구들이 항-수용체 또는 대조 항체의 존재하에서 재조합 E1 및 E2 당단백질을 사용하여 수행되었다. 도 20b에 나타낸 바와 같이, 항-CD81, 항-CD81, 및 항-SR-BI 및 항-CLDN1 항체는 Huh7.5.1 세포에 대한 E2의 결합을 억제하였다. 반면, 전-면역 또는 무관한 대조 혈청은 어떠한 효과도 나타내지 않았다(도 20a-c). 흥미롭게도, Huh7.5.1 세포에 대한 E2 결합의 억제 정도(도 20c)는 HCV 감염의 억제 정도와 연관되었으며, 이는 E2-세포 표면 상호작용의 결합 억제가 항-CLDN1 항체의 중화 활성에 대한 작용 메카니즘을 제공한다는 것을 나타낸다. 감염성 비리온에 대한 상기 관찰들의 연관성은 HCVcc를 사용한 결합 연구에 의해 추가적으로 확인되었다(도 20e). 반면, E1 결합은 항-CLDN1에 의해 영향을 받지 않았다(도 20d).

허용 세포주에 대한 E2 결합의 항체 억제가 E2와의 CLDN1 상호작용에 기여하였는지 여부를 연구하기 위하여, 본 출원인은 CLDN1이 재조합 절단된 당단백질 E2를 결합할 수 있었는지 여부를 조사하였다. 이러한 질문에 답하기 위하여, CHO 세포는 인간 CLDN1, SR-BI 또는 CD81을 발현하도록 가공되었다(도 21a). 인간 CD81 또는 인간 SR-BI의 세포 표면 발현이 CHO 세포에 대한 E2 결합을 부여한 반면(도 21b), CLDN1 발현은 어떠한 효과도 나타내지 않았다(도 21b). 상기 데이터는, CLDN1이 HCV 엔벨로프 당단백질 E2와 직접적으로 상호작용하지 않으며, E2-세포 표면 상호작용의 항체 차단이 간접적인 메카니즘에 의해 매개될 수 있다는 점을 나타낸다.

항-CLDN1 항체는 CLDN1-CD81 공-수용체 결합(들)을 억제한다. 항-CLDN1 항체는 직접적인 CLDN1-E2 상호작용의 부재하에서 HCV 허용 세포에 대한 E2 결합을 억제하기 때문에(도 21b), 본 출원인은 항-CLDN1 항체가 CD81-CLDN1 공-수용체 복합체를 저해할 수 있다는 점을 가설로 세웠다. 항-CLDN1 항체가 CLDN1-CD81 결합을 변형시키는지 여부를 평가하기 위하여, HEK293T 세포는 Ac-GFP-CD81 및 DsRED-CD81 또는 AcGFP-CLDN1 및 DsRED-CD81 또는 AcGFP-CLDN1 및 DsRED-CLDN1을 발현하도록 감염되었으며, FRET에 의해 분석되는 전-면역 및 항-CLDN1 혈청(1/100 및 1/400) 및 공-수용체 상호작용(들)과 함께 배양되었다. 도 22에 나타낸 바와 같이, 항-CLDN1 항체는 용량-의존적 방식으로 CD81과 CLDN1 사이의 FRET를 유의적으로 감소시켰다. 대조 혈청과의 세포의 사전 배양은 CD81-CLDN1 공-수용체 상호작용(들)을 변경하지 않았다. CD81-CLDN1 공-수용체 상호작용의 억제는, 항-CLDN1 혈청과의 사전 배양 이후에 CD81-CD81과 CLDN1-CLDN1 사이의 변화되지 않은 FRET에 의해 보여진 바와 같이, 특이적이었다. 이를 함께 고려할 때, 상기 데이터는 항-CLDN1 항체가 CD81-CLDN1 헤테로다이머(heterodimer) 결합을 저해한다는 것을 나타낸다.

논의

CLDN1은 HCV 진입을 가져오는 필수적인 공-인자이다. 그러나, 다단계 진입 과정에서 CLDN1의 정확한 역할은 아직 이해가 불충분하다. 인간 HCV 진입 인자를 발현하는 감염된 CHO 세포를 사용하여, 본 출원인은 CD81 및 SR-BI와 대조적으로 CLDN1이 세포 표면에서 엔벨로프 당단백질 E2와 직접적으로 상호작용하지 않는다는 것을 입증하였다. CD81-CLDN1 공-수용체 결합을 연구하기 위해 FRET-기재 시스템을 사용하여, 본 발명의 중화 항-CLDN1 항체가 특이적으로 CD81-CLDN1 FRET를 방해한다는 것을 입증하였다(도 22).

상기 데이터는, CLDN1을 표적으로 하는 항체가 E2의 세포 표면과의 결합을 감소시키고 CD81-CLDN1 상호작용을 감소시킴으로써 HCV 감염성을 중화시킨다는 것을 나타낸다. CD81-CLDN1 공-수용체 복합체는 HCV 진입에 있어서 중요하고, CLDN1은 E2 상호작용을 통해 HCV 입자와의 CD81 결합을 가능하게 할 수 있다. 이는 또한 E2-CD81-CLDN1 상호작용을 표적으로 하는 항바이러스 전략에 대한 새로운 길을 제공한다.

실시예 4: 항-CLDN1 모노클로날 항체는 감염 후 첨가될 때 HCV 세포-세포 전달을 억제하고 바이러스의 전파를 차단한다.

재료 및 방법

세포-세포 전달 어세이. Huh7.5.1 세포는 F. Chisari 박사에 의해 제공되었으며(The Scripps Research Institute, 미국; Zhong, 2005), 참조문헌 [Zeisel, 2007; Barth, 2008; Dimitrova, 2008]에 기재된 바에 따라 배양되었다. Huh7 GFP 세포는 Patel 박사에 의해 제공되었다(University of Glasgow, 영국; Witteveldt, 2009). Huh7 유래 세포주는 증강된 녹색 형광 단백질(EGFP)을 갖는 레트로바이러스 벡터에 의해 형질도입한 후 300μg G418/mL로 보충된 배지에서 선택에 의해 얻어졌다(Witteveldt, 2009). HCV의 세포-세포 전달을 검출하기 위하여, 새롭게 전기천공된(electroporated) Huh7.5.1 세포가 파종되고 24시간 동안 배양되었으며, 그 후 10μg/mL 항-CLDN1 항체와 EGFP-발현 수용체 세포를 부가하기 전에 남아있는 세포-표면 결합된 HCV를 제거하기 위해 배지와 함께 세척되었다. 공배양된 세포는 합류지점(confluency)까지 성장되고, 트립신화되고, 1% 파라포름알데히드로 고정되고, FACS 분석을 위해 0.1% 사포닌으로 투과되었다. 상기 세포는 마우스 항-코어(core) 항체를 사용하고 그 후 SR-BI에 대해 이미 기재된 바와 같이 FACS 분석을 위한 피코에리트린(PE)-컨쥬게이트된 이차 항체를 사용하여 염색되었다(Barth, 2006; Barth, 2008).

결과 및 논의

일반적으로, 바이러스는 무세포 비리온의 방출 및 감염된 세포와 감염되지 않은 세포 사이의 직접적인 통과를 포함하는 2개의 메카니즘에 의해 숙주 내에서 확산될 수 있다. 직접적인 세포-세포 전달이 무세포 확산보다 더 빠르고 더 효과적인 것으로 여겨지는데, 그 이유는 비리온의 부착과 같이 바이러스의 라이프 사이클에서 속도-제한 초기 단계가 배제되기 때문이다. 또한, 바이러스의 감염성의 세포-세포 전달은 바이러스가 중화 항체와 같은 면역 반응의 요소들을 회피하도록 할 수 있다.

최근의 연구에서는, 간종양 세포의 HCV 감염이 세포-세포 접촉에 의해 강화된 감염의 초점 영역을 야기한다는 것이 입증되었으며, 이는 인접한 세포 사이에 국소화된 전달을 나타낸다. 실제로, 표지된 생성 세포 또는 수용 세포를 사용하여, 2개의 실험실에서는 HCV는 시험관내에서 무세포 바이러스 감염과 세포 사이의 직접 전달 모두에 의해 전달될 수 있으며, 상기 세포 사이의 직접 전달은 중화 항체를 회피하기 위한 새로운 경로를 제공한다는 것이 입증되었다(Timpe, 2008; Witteveldt, 2009).

세포-세포 전달을 억제하는 항-CLDN1 모노클로날 항체의 능력을 평가하기 위하여, HCV 세포-세포 전달 어세이가 녹색 형광 단백질(GFP)을 발현하는 표지된 수용 세포에 기초하여 설정되었다. 상기 어세이에서, HCV 생성 세포는 항-수용체 항체의 존재 또는 부재 하에서 GFP-표지된 수용 세포와 공배양된다. 항-CD81 항체에 의해 무세포 바이러스 전달을 차단함으로써(Timpe, 2008; Witteveldt, 2009), 상기 어세이는 FACS 분석에서 HCV+, GFP+ 수용 세포를 정량화함으로써 세포-세포 전달에 대한 항바이러스의 특이적 효과를 연구할 수 있게 한다.

항체(또는 대조 항체)의 부재하에서 생성 및 수용 세포의 24시간의 공배양 후에, 모든 세포들의 43.6%가 HCV+ GFP+ 수용 세포에 대응한다(도 23a). 항-CD81 항체에 의해 세포-세포 전달을 차단할 때(도 23b), HCV GFP+ 수용 세포의 수는 6.20%까지 감소되었다. 상기 세포는 2개의 다른 연구소(Timpe, 2008; Witteveltd, 2009)와 본 출원인의 연구소(Baumert, unpublished observations)에서 입증된 바와 같이 세포 대 세포 전달에 의해서만 감염된 세포에 대응한다. 도 23c에 나타낸 바와 같이, 항-CLDN1 모노클로날 항체는 HCV+, GFP+ 수용 세포의 수를 현저하게 감소시켰다. 항-CLDN1 모노클로날 항체 7D3의 부가는 HCV 감염된 GFP+ 수용 세포의 퍼센트를 6.20%에서 2.98%로 감소시켰으며, 이는 항-CLDN1 모노클로날 항체가 세포-세포 전달에 의한 감염을 50%보다 더 큰 정도로 감소시킬 수 있었다는 것을 나타낸다. 반면, 이소타입 대조 항체는 어떠한 효과도 나타내지 않았다(이 데이터는 나타내지 않음). 상기 결과들은 항-CLDN1 모노클로날 항체가 HCV 세포-세포 전달을 억제한다는 것을 보여준다.

감염 조직 배양계에서 바이러스의 확산에 대한 이러한 발견의 관련성을 확인하기 위하여, 본 출원인은 Huh7.5.1 세포에서 시간 경과 실험을 수행하였다. 바이러스의 확산에 대한 모노클로날 항-CLDN1 항체의 효과를 연구하기 위하여, 항-CLDN1 모노클로날 항체 OM-7D3은 무세포 바이러스에 의한 세포 감염의 4시간 후에 부가되었다. 도 24에 나타낸 바와 같이, 항-CLDN1 모노클로날 항체는 바이러스의 확산을 효과적으로 억제하였다. 이소타입 대조 항체와의 감염 후 Huh7.5.1 세포의 배양은 7일의 기간에 걸쳐 바이러스 로드(viral load)의 시간-의존적 증가를 가져온 반면(> 10⁶의 상대적 광 단위(relative light unit)), 감염 후 항-CLDN1의 부가는 검출 한계에 가까운 낮은 수준의 바이러스 로드를 야기하였다(대략 10³의 상대적 광 단위). 상기 데이터는 또한 감염 세포 배양계에서 바이러스의 확산의 세포-세포 전달에 대한 항-CLDN1 항체의 효과의 관련성을 나타내며, 이는 본 발명의 항-CLDN1 모노클로날 항체가 HCV 감염의 예방에 유용할 뿐만 아니라 만성 바이러스의 감염의 제어에 유용하다는 것을 보여준다.

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다른 구현예

본 발명의 다른 구현예들은 본원에 개시된 본 발명의 실시 또는 명세서를 고려하여 당업계의 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 본 발명의 범위는 하기 청구항들에 의해 나타나지만, 본원의 명세서 및 실시예들은 단지 예시로서만 고려되어야 할 것이다.

Deutsche Sammlung von Mikro-organismen und Zellkuturen GmbH DSMACC02931 20080729 Deutsche Sammlung von Mikro-organismen und Zellkuturen GmbH DSMACC02932 20080729 Deutsche Sammlung von Mikro-organismen und Zellkuturen GmbH DSMACC02933 20080729 Deutsche Sammlung von Mikro-organismen und Zellkuturen GmbH DSMACC02934 20080729 Deutsche Sammlung von Mikro-organismen und Zellkuturen GmbH DSMACC02935 20080729 Deutsche Sammlung von Mikro-organismen und Zellkuturen GmbH DSMACC02936 20080729 Deutsche Sammlung von Mikro-organismen und Zellkuturen GmbH DSMACC02937 20080729 Deutsche Sammlung von Mikro-organismen und Zellkuturen GmbH DSMACC02938 20080729

SEQUENCE LISTING <110> INSERM (Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale) GENOVAC Universite de Strasbourg <120> Monoclonal anti-Claudin 1 antibodies for the inhibition of hepatitis C virus infection <130> IP20111719/FR <150> EP 08305597.0 <151> 2008-09-25 <160> 9 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 1 Asn Ser Ser Ile Val Tyr Glu Ala Glu Asp Met Ile Met His Thr Pro 1 5 10 15 Gly Cys Val Pro 20 <210> 2 <211> 20 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 2 Asn Ser Ser Ile Val Tyr Glu Ala Glu Asp Met Ile Met His Thr Pro 1 5 10 15 Gly Cys Val Pro 20 <210> 3 <211> 20 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 3 Asn Ser Ser Ile Val Tyr Glu Thr Val Asp Met Ile Met His Thr Pro 1 5 10 15 Gly Cys Val Pro 20 <210> 4 <211> 29 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 4 Glu Thr Thr Val Ser Gly Gly Ala Ala Ala Lys Asp Val Phe Arg Phe 1 5 10 15 Ala Gly Ile Phe Ser Thr Gly Pro Ala Gln Glu Ile Lys 20 25 <210> 5 <211> 10 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 5 Tyr Ile Val Gln Leu Phe Leu Leu Leu Ala 1 5 10 <210> 6 <211> 29 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 6 Glu Thr Thr Val Ser Gly Gly Ala Ala Ala Lys Asp Val Phe Arg Phe 1 5 10 15 Thr Gly Ile Phe Ser Ser Gly Pro Thr Gln Asn Ile Lys 20 25 <210> 7 <211> 10 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 7 Tyr Ile Val Leu Leu Phe Leu Leu Leu Ala 1 5 10 <210> 8 <211> 29 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 8 Glu Thr Thr Val Ser Gly Gly Ala Ala Ala Arg Asp Val Phe Arg Phe 1 5 10 15 Ala Gly Ile Phe Ser Thr Gly Pro Ala Gln Glu Ile Lys 20 25 <210> 9 <211> 10 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 9 Tyr Ile Val Leu Leu Phe Leu Leu Leu Ala 1 5 10

Claims (38)

1. DSM ACC2931, DSM ACC2932, DSM ACC2933, DSM ACC2934, DSM ACC2935, DSM ACC2936, DSM ACC2937 및 DSM ACC2938로 이루어진 군으로부터 선택된 접근번호로 2008년 7월 29일에 DSMZ에 기탁된 하이브리도마 세포주.
2. DSM ACC2931, DSM ACC2932, DSM ACC2933, DSM ACC2934, DSM ACC2935, DSM ACC2936, DSM ACC2937 및 DSM ACC2938로 이루어진 군으로부터 선택된 접근번호로 2008년 7월 29일에 DSMZ에 기탁된 하이브리도마 세포주에 의해 분비된 모노클로날 항체 또는 이의 생물학적으로 활성인 단편으로서,
   클라우딘(Claudin) 1 세포외 도메인에 결합하는 모노클로날 항체 또는 이의 생물학적으로 활성인 단편.
3. 제2항에 있어서,
   상기 모노클로날 항체 또는 이의 생물학적으로 활성인 단편이, 클라우딘 1 제1 세포 외 루프 내 보존된 모티프 W(30)-GLW(51)-C(54)-C(64)를 포함하는 에피토프에 결합하는 것을 특징으로 하는, 모노클로날 항체 또는 이의 생물학적으로 활성인 단편.
4. 제2항에 있어서,
   상기 모노클로날 항체 또는 이의 생물학적으로 활성인 단편이, 설치류 클라우딘 1에 결합하지 않고 비인간 영장류 클라우딘 1에 결합하는 것을 특징으로 하는, 모노클로날 항체 또는 이의 생물학적으로 활성인 단편.
5. 제2항에 있어서,
   상기 모노클로날 항체가 인간화 항체, 인간의 탈면역 항체 또는 키메라 항체인 것을 특징으로 하는, 모노클로날 항체 또는 이의 생물학적으로 활성인 단편.
6. 제2항에 있어서,
   상기 모노클로날 항체가 인간화 항체, 인간의 탈면역 항체 또는 키메라 항체이며 상기 분비된 모노클로날 항체로부터 유래된 상보적 결정 영역(CDR: complementary determining region) 또는 이의 부분을 포함하는 것을 특징으로 하는, 모노클로날 항체 또는 이의 생물학적으로 활성인 단편.
7. 제2항에 있어서,
   상기 모노클로날 항체 또는 이의 단편이, HCV 허용 세포주에 대한 HCV 엔벨로프 당단백질 E2 또는 감염성 비리온의 결합을 억제하는 것을 특징으로 하는, 모노클로날 항체 또는 이의 생물학적으로 활성인 단편.
8. 제2항에 있어서,
   상기 모노클로날 항체 또는 이의 단편이, CD81-클라우딘-1 결합을 억제하는 것을 특징으로 하는, 모노클로날 항체 또는 이의 생물학적으로 활성인 단편.
9. 제2항에 있어서,
   상기 모노클로날 항체 또는 이의 단편이, HCV 세포-세포 전달 및 바이러스의 확산을 억제하는 것을 특징으로 하는, 모노클로날 항체 또는 이의 생물학적으로 활성인 단편.
10. 제2항에 따른 모노클로날 항체 또는 이의 생물학적으로 활성인 단편을 포함하는 분자로서,
    상기 분자는 융합 단백질, 또는 항체 컨쥬게이트이고,
    상기 모노클로날 항체 또는 이의 단편이, 검출가능부 또는 치료제에 부착되고, 상기 검출가능부는 리간드, 방사성 핵종, 형광색소, 화학발광제, 미세입자, 효소, 비색 표지, 자성 표지 및 합텐으로부터 선택되는, 분자.
11. 제2항에 있어서,
    세포의 HCV 감염을 예방하기 위한, 모노클로날 항체 또는 이의 생물학적으로 활성인 단편.
12. 제2항에 있어서,
    대상체의 HCV 감염 또는 HCV-관련 질환을 예방 또는 치료하기 위한, 모노클로날 항체 또는 이의 생물학적으로 활성인 단편.
13. 제12항에 있어서,
    상기 HCV 감염이 유전자형 1, 유전자형 2, 유전자형 3, 유전자형 4, 유전자형 5 및 유전자형 6으로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자형(genotype)의 HCV에 기인하는 것을 특징으로 하는, 모노클로날 항체 또는 이의 생물학적으로 활성인 단편.
14. 제12항에 있어서,
    상기 HCV 감염이 아형 1a, 아형 1b, 아형 2a, 아형 2b, 아형 2c, 아형 3a, 아형 4a-f, 아형 5a 및 아형 6a로 이루어진 군으로부터 선택된 아형(subtype)의 HCV에 기인하는 것을 특징으로 하는, 모노클로날 항체 또는 이의 생물학적으로 활성인 단편.
15. 제12항에 있어서,
    만성 HCV 감염을 제어하기 위한, 모노클로날 항체 또는 이의 생물학적으로 활성인 단편.
16. 제12항에 있어서,
    HCV로 만성적으로 감염된 환자에 존재하는 전체 유사종(quasispecies) 군에 의한 감염을 억제하기 위한, 모노클로날 항체 또는 이의 생물학적으로 활성인 단편.
17. 제15항에 있어서,
    상기 HCV 감염이 유전자형 1, 유전자형 2, 유전자형 3, 유전자형 4, 유전자형 5 및 유전자형 6으로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자형(genotype)의 HCV에 기인하는 것을 특징으로 하는, 모노클로날 항체 또는 이의 생물학적으로 활성인 단편.
18. 제15항에 있어서,
    상기 HCV 감염이 아형 1a, 아형 1b, 아형 2a, 아형 2b, 아형 2c, 아형 3a, 아형 4a-f, 아형 5a 및 아형 6a로 이루어진 군으로부터 선택된 아형(subtype)의 HCV에 기인하는 것을 특징으로 하는, 모노클로날 항체 또는 이의 생물학적으로 활성인 단편.
19. 제2항에 있어서,
    간 이식 환자의 HCV 재감염 및 재발을 예방하기 위한, 모노클로날 항체 또는 이의 생물학적으로 활성인 단편.
20. 제10항에 있어서,
    세포의 HCV 감염을 예방하기 위한, 분자.
21. 제10항에 있어서,
    대상체의 HCV 감염 또는 HCV-관련 질환을 예방 또는 치료하기 위한, 분자.
22. 제21항에 있어서,
    상기 HCV 감염이 유전자형 1, 유전자형 2, 유전자형 3, 유전자형 4, 유전자형 5 및 유전자형 6으로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자형(genotype)의 HCV에 기인하는 것을 특징으로 하는, 분자.
23. 제21항에 있어서,
    상기 HCV 감염이 아형 1a, 아형 1b, 아형 2a, 아형 2b, 아형 2c, 아형 3a, 아형 4a-f, 아형 5a 및 아형 6a로 이루어진 군으로부터 선택된 아형(subtype)의 HCV에 기인하는 것을 특징으로 하는, 분자.
24. 제10항에 있어서,
    만성 HCV 감염을 제어하기 위한, 분자.
25. 제10항에 있어서,
    HCV로 만성적으로 감염된 환자에 존재하는 전체 유사종(quasispecies) 군에 의한 감염을 억제하기 위한, 분자.
26. 제24항에 있어서,
    상기 HCV 감염이 유전자형 1, 유전자형 2, 유전자형 3, 유전자형 4, 유전자형 5 및 유전자형 6으로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자형(genotype)의 HCV에 기인하는 것을 특징으로 하는, 분자.
27. 제24항에 있어서,
    상기 HCV 감염이 아형 1a, 아형 1b, 아형 2a, 아형 2b, 아형 2c, 아형 3a, 아형 4a-f, 아형 5a 및 아형 6a로 이루어진 군으로부터 선택된 아형(subtype)의 HCV에 기인하는 것을 특징으로 하는, 분자.
28. 제10항에 있어서,
    간 이식 환자의 HCV 재감염 및 재발을 예방하기 위한, 분자.
29. 유효량의 제2항에 따른 모노클로날 항체 또는 이의 생물학적으로 활성인 단편, 및 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 약학적 조성물로, 상기 약학적 조성물은, 대상체의 HCV 감염 또는 HCV-관련 질환을 예방 또는 치료하기 위한 것이거나, 만성 감염을 제어하기 위한 것이거나 또는 간 이식 환자의 HCV 재감염 및 재발을 예방하기 위한 것이고, 상기 HCV-관련 질환은 간염, 간경변 또는 간세포 암종(hepatocellular carcinoma)인, 약학적 조성물.
30. 제29항에 있어서,
    하나 이상의 항바이러스제와 조합하여 사용되는, 약학적 조성물.
31. 제29항에 있어서,
    하나 이상의 항바이러스제를 추가로 포함하는 약학적 조성물.
32. 제31항에 있어서,
    상기 항바이러스제가 인터페론, 리바비린, 항-C형 간염 바이러스 모노클로날 항체, 항-C형 간염 바이러스 폴리클로날 항체, RNA 폴리머라제 억제제, 프로테아제 억제제, IRES 억제제, 헬리카제 억제제, 안티센스 화합물, 리보자임, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
33. 유효량의 제10항에 따른 분자 및 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 약학적 조성물로, 상기 약학적 조성물은, 대상체의 HCV 감염 또는 HCV-관련 질환을 예방 또는 치료하기 위한 것이거나, 만성 감염을 제어하기 위한 것이거나 또는 간 이식 환자의 HCV 재감염 및 재발을 예방하기 위한 것이며, 상기 HCV-관련 질환은 간염, 간경변 또는 간세포 암종(hepatocellular carcinoma)인, 약학적 조성물.
34. 제33항에 있어서,
    하나 이상의 항바이러스제와 조합하여 사용되는, 약학적 조성물.
35. 제33항에 있어서,
    하나 이상의 항바이러스제를 추가로 포함하는 약학적 조성물.
36. 제35항에 있어서,
    상기 항바이러스제가 인터페론, 리바비린, 항-C형 간염 바이러스 모노클로날 항체, 항-C형 간염 바이러스 폴리클로날 항체, RNA 폴리머라제 억제제, 프로테아제 억제제, IRES 억제제, 헬리카제 억제제, 안티센스 화합물, 리보자임, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
37. 제2항에 따른 모노클로날 항체 또는 이의 생물학적으로 활성인 단편을 포함하는, 생물학적 샘플에서 클라우딘-1을 검출하기 위한 키트로서,
    상기 모노클로날 항체 또는 이의 단편이 검출가능부에 부착되고, 상기 검출가능부는 리간드, 방사성 핵종, 형광색소, 화학발광제, 미세입자, 효소, 비색 표지, 자성 표지 및 합텐으로부터 선택되는, 키트.
38. 제10항에 따른 분자를 포함하는, 생물학적 샘플에서 클라우딘-1을 검출하기 위한 키트로서, 상기 분자는 융합 단백질이고, 모노클로날 항체 또는 이의 단편이 리간드, 방사성 핵종, 형광색소, 화학발광제, 미세입자, 효소, 비색 표지, 자성 표지 및 합텐으로부터 선택되는 검출가능부에 부착된 키트.

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