CN102224171A - 抑制丙型肝炎病毒感染的单克隆抗紧密连接蛋白-1抗体 - Google Patents

Abstract

本发明提供了单克隆抗体，所述单克隆抗体与人细胞表面上的人紧密连接蛋白-1的细胞外域特异性结合，从而抑制HCV进入易感细胞并且防止HCV感染这些细胞。本发明还提供了制备所述单克隆抗体的杂交瘤细胞系。本发明还提供了包含了所述抗体的试剂以及包含所述抗体的药物组合物。本发明也公开了通过给予本发明单克隆抗体或其药物组合物治疗或防止HCV感染的方法。

Description

抑制丙型肝炎病毒感染的单克隆抗紧密连接蛋白-1抗体

相关申请

本申请要求于2008年9月25提交的欧洲专利申请EP 08 305 597.0的优先权。将该欧洲专利申请全部内容引入本文作为参考。

背景技术

丙型肝炎病毒(HCV)是全球性的重大健康问题，据估计在世界范围内有1.5-2亿人感染了丙型肝炎病毒，其中在欧盟国家内至少有500万感染个体(Pawlotsky，2004)。根据世界卫生组织(World Health Organization)报告，每年新增300-400万感染患者。该感染通常是无症状的，但是大多数HCV感染个体会发展成慢性感染(Hoofnagle，2002，Lauer，2001和Seeff，1995)。慢性HCV感染通常会导致严重的肝脏疾病，包括纤维化和脂肪变性(Chisari，2005)。约20％的慢性HCV感染患者会发展成为肝硬化，其中约5％的患者会恶化成为肝细胞癌。

慢性HCV感染是肝移植的主要适应症(Seeff，2002)。不幸的是，肝移植并不能治愈丙型肝炎。病毒的复发是必须面对的问题和移植失败的主要原因(Brown，2005)。还没有对抗HCV的疫苗。目前的治疗包括给予利巴韦林和/或α干扰素，这是两种非特异抗病毒剂。使用聚乙二醇化α干扰素和利巴韦林的组合治疗在约50％的慢性丙型肝炎患者中获得持久的清除率。但是大量患者对该组合中的一种成分有禁忌，不能耐受该治疗，对IFN治疗完全无反应或者在停止给药后发生复发。除了疗效有限、重大的副作用(例如中性粒细胞减少、溶血性贫血和严重的抑郁)外，当前的抗病毒治疗成本也很高。

直到最近，开发更有效的抗HCV感染的治疗由于缺少支持HCV复制的细胞培养系统而受到阻碍。目前已使用源自日本爆发性丙型肝炎患者血液的独特HCV基因组(JFH-I)实现了感染性HCV在细胞培养物中的稳定生产(Wakita，2005；Lindenbach，2005；Zhong，2005)。HCV的JFH-1株在细胞培养物中释放感染性颗粒(HCVcc)和产生逆转录HCV假颗粒(HCVpp)的能力(Bartosch，2003；Hsu，2003)使得能够对HCV的进入和复制机理进行研究，从而识别潜在的治疗靶标生物分子。

HCV是一种正链RNA病毒，属于黄病毒(列aviviridae)科的丙型肝炎病毒(Hepacivitus)属。HCV基因组的主要开放读码框的翻译导致产生了约3000个氨基酸长度的多聚蛋白，该蛋白质在细胞和病毒蛋白酶的协同作用下在翻译同时和翻译后切割成至少10个成熟蛋白质，包括两种包膜糖蛋白(E1和E2)。HCV通过附着到肝细胞表面的分子或受体而开始传染。目前的证据表明对于在体外的HCV进入，至少四种宿主细胞分子是重要的：四跨膜蛋白(tetraspanin)CD81(Pileri，1998)、B类I型清道夫受体(SB-RI)(Zeisel，2007；Bartosch，2003；Grove，2007；Kapadia，2007；Scarselli，2002)、闭锁蛋白(Occludin)(Ploss，2009)和紧密连接蛋白(Claudin)-1(CLDN1)(一种整合膜内在蛋白和紧密连接链的成分)(Evans，2007)。已报道HCV糖蛋白直接与CD81和SR-BI相互作用(Cocquerel，2006)。利用标记的CLDN1形式进行的诱变和抗体阻断研究表明第一胞外环参与了与HCV的相互作用(Evans，2007)。但是，各个受体所起的具体作用仍然不清楚。

对于这些HCV受体和共同受体(co-receptor)的识别为开发用于防止和/或治疗HCV感染的用作候选药物的治疗性和预防性试剂开创了新的途径。因此，例如Nicosia与其同事制备了抗天然人SR-BI的单克隆抗体，该单克隆抗体抑制HCV E2与SR-BI的结合，并能以剂量依赖的方式有效地阻断HCVcc感染肝细胞(Catanese，2007；WO 2006/005465)。欧洲专利申请EP1256348公开了抑制HCV E2与CD81结合的具有抗病毒作用的物质，例如抗体、蛋白质、硫酸化多糖和小分子化合物。国际专利申请WO 2007/130646描述了用于识别干扰HCV与紧密连接蛋白-1的相互作用从而防止HCV感染的试剂的体外和基于细胞的试验。由于开发新的对抗HCV的疗法仍然是高度优先的目标，这些研究是令人鼓舞的，因为它们证明了影响HCV进入易感细胞的试剂可以是当前HCV疗法的有效和安全的替代方案。

发明概述

本发明涉及用于预防和/或治疗HCV感染和HCV相关疾病的靶向系统和方案。具体地，本发明涉及抗体，该抗体通过与紧密连接蛋白-1(已知的HCV受体)的胞外域结合干扰与HCV-宿主细胞的相互作用。不希望受到理论约束，据信这种抗体与细胞表面上的紧密连接蛋白-1胞外域的结合会抑制或阻断HCV进入细胞，并因此防止细胞的HCV感染。申请人已经表明抗紧密连接蛋白抗体在不存在可检测的紧密连接蛋白-包膜糖蛋白E2相互作用的情况下抑制包膜糖蛋白E2和病毒颗粒与HCV受纳细胞系(permissive cell line)的结合。申请人已经证明该抗体通过降低包膜糖蛋白E2与细胞表面的结合和干扰CD-81-紧密连接蛋白-1的相互作用中和HCV感染性。该抗体可用于预防或治疗HCV感染(急性或慢性感染)和HCV相关的疾病或病症(例如肝炎、肝硬化及肝细胞癌和肝移植)。抑制HCV进入细胞的抗体(例如本文提供的那些)作为抗病毒治疗药物是特别有吸引力的。HCV进入的抑制剂不必跨越质膜或进行细胞内修饰。另外，由于病毒的进入由病毒和细胞膜的保守结构介导，病毒进入的抗体抑制剂可以是非常强效的，并且不易形成病毒耐受性。

更具体地，在一方面，本发明提供了分泌特异性结合人紧密连接蛋白-1细胞外域的单克隆抗体的杂交瘤细胞系。特别地，本发明申请人于2008年7月29日在DSMZ(德国微生物菌种保藏中心，Inhoffenstraβe7 B，38124 Braunschweig，Germany)保藏了8种这样的杂交瘤细胞系。其分配的保藏号为：DSM ACC2931、DSM ACC2932、DSM ACC2933、DSM ACC2934、DSM ACC2935、DSM ACC2936、DSM ACC2937和DSMACC2938。保藏按照布达佩斯条约关于国际承认用于专利程序的微生物保藏的规定(布达佩斯条约)进行。

在另一方面，本发明提供了由保藏号为DSM ACC2931、DSM ACC2932、DSM ACC2933、DSM ACC2934、DSM ACC2935、DSM ACC2936、DSM ACC2937和DSM ACC2938的任一杂交瘤细胞系分泌的单克隆抗体。该单克隆抗体可以是或不是从杂交瘤培养物中分离和/或纯化的。在某些实施方式中，单克隆抗体是rIgG2a重(H)链和κ轻(L)链同种型的免疫球蛋白。在其它实施方式中，单克隆抗体是rIgG2b重(H)链和κ轻(L)链同种型的免疫球蛋白。

如申请人所证明的，由保藏的杂交瘤细胞系分泌的单克隆抗体在体外特异性地结合人紧密连接蛋白-1的细胞外域，并且有效地抑制HCV感染。本发明也包括本发明单克隆抗体的任何生物活性片段，即任何保留了单克隆抗体下述能力的任何片段或部分：干扰HCV-宿主细胞相互作用和/或特异性结合人紧密连接蛋白-1细胞外域和/或抑制或阻断HCV进入HCV易感细胞和/或减少或防止易感细胞的HCV感染。

更一般而言，本发明包括任何包含本发明的抗紧密连接蛋白-1单克隆抗体或其片段(包括嵌合抗体、人源化抗体、去免疫化抗体和包含来自本发明的由杂交瘤细胞系分泌的抗紧密连接蛋白-1单克隆抗体的重链或轻链可变区域的至少一个互补决定区(CDR)的抗体源分子)的分子，包括例如Fab片段、F(ab′)₂片段、Fd片段、Sc抗体(单链抗体)、双功能抗体(diabody)、单独的抗体轻链单链、单独的抗体重链单链、抗体链与其它分子的嵌合融合体和抗体偶联物(例如与诊断剂(可检测部分)或治疗剂偶联的抗体)，只要这些抗体相关分子保留了其所源自的本发明单克隆抗体的至少一种生物相关的性质。生物相关的性质可以是干扰HCV-宿主细胞相互作用的能力、特异性结合人紧密连接蛋白-1细胞外域的能力、抑制或阻断HCV进入HCV易感细胞的能力和/或减少或防止易感细胞感染HCV的能力。在某些优选的实施方式中，本发明单克隆抗体的生物活性片段特异地与人紧密连接蛋白-1的细胞外域结合。

申请人已经证明由保藏的杂交瘤细胞系分泌的单克隆抗体识别受到人紧密连接蛋白-1第一胞外环的保守基序中的突变强烈影响的表位。该基序是：W(30)-GLW(51)-C(54)-C(64)。因此，在某些实施方式中，本发明的单克隆抗体或其生物活性片段识别依赖于紧密连接蛋白-1第一胞外环结构中的保守基序W(30)-GLW(51)-C(54)-C(64)结构的表位。

相似地，申请人已经证明由保藏的杂交瘤细胞系分泌的单克隆抗体不与鼠类紧密连接蛋白-1发生交叉反应，但是会与非人类灵长类食蟹猴(Macaca fascicularis)中其直系同源物发生交叉反应。因此，在某些实施方式中，本发明的单克隆抗体或其生物活性片段不与啮齿动物的紧密连接蛋白-1结合，但是与非人灵长动物的紧密连接蛋白-1结合。

通常，本发明的抗体抑制包膜糖蛋白E2或感染性病毒颗粒与HCV受纳细胞系的结合，并且抑制CD81-紧密连接蛋白-1的缔合。

本发明的单克隆抗体或抗体相关分子可应用于多种预防和治疗应用中。因此，在另一方面，本发明单克隆抗体和抗体相关分子提供用于防止细胞(例如易感细胞或易感细胞群)的HCV感染、防止或治疗受试者中的HCV感染或HCV-相关疾病、控制慢性HCV感染和防止肝移植患者的HCV复发。HCV感染可以是由于具有选自基因型1、基因型2、基因型3、基因型4、基因型5和基因型6的基因型的HCV造成的，或更具体地由具有选自亚型1a、亚型1b、亚型2a、亚型2b、亚型2c、亚型3a、亚型4a-f、亚型5a和亚型6a的亚型的HCV造成的。

在相关的方面，本发明提供了降低易感细胞由于接触HCV而感染HCV的可能性的方法，该方法包括使易感细胞与有效量的本发明抗体或抗体相关分子接触。本发明也提供了降低受试者的易感细胞由于与HCV接触而受到HCV感染的可能性，该方法包括给予受试者有效量的本发明抗体或抗体相关分子。本发明也提供了在需要的受试者中治疗或预防HCV感染或HCV相关疾病(例如肝疾病或病理状态)的方法，该方法包括给予受试者有效量的本发明单克隆抗体或抗体相关分子。本发明也提供了在需要的受试者中控制慢性HCV感染的方法，该方法包括给予受试者有效量的本发明单克隆抗体或抗体相关分子。

本发明也提供了防止肝移植患者的HCV复发的方法，该方法包括给予患者有效量的本发明单克隆抗体或抗体相关分子。将本发明的抗体或抗体相关分子给予受试者可以是任何合适的途径，包括例如肠胃外、气雾剂、口服和局部途径。本发明单克隆抗体或抗体相关分子可以单独给予或与例如抗病毒剂的治疗试剂结合给予。

本发明单克隆抗体和抗体相关分子可以以本来的形式给予或以药物组合物的形式给予。因此，在另一方面，本发明提供了将本发明单克隆抗体或抗体相关分子用于制备治疗和/或预防HCV感染和HCV相关疾病的药物、药物组合物、药物试剂盒的用途。

在相关的方面，本发明提供了包含有效量的本发明单克隆抗体或抗体相关分子以及至少一种可药用载体或赋形剂的药物组合物。在某些实施方式中，药物组合物适应于与另外的治疗剂(例如抗病毒剂)结合给药。在其它实施方式中，药物组合物还包含另外的治疗剂，例如抗病毒剂。适用于本发明方法和药物组合物中的抗病毒剂包括但不限于：干扰素(例如，α干扰素和聚乙二醇化的α干扰素)、利巴韦林、抗HCV(单克隆或多克隆)抗体、RNA聚合酶抑制剂、蛋白酶抑制剂、IRES抑制剂、解旋酶抑制剂、反义化合物、核酶及其任何组合。

当本发明单克隆抗体或抗体相关分子与可检测部分偶联时，其可应用于多种非治疗方法中，例如特定疾病的诊断和/或预后，例如癌症。事实上，已经证明紧密连接蛋白-1的表达水平可用作不同癌症的诊断或预后标志物。因此，在另一方面，本发明提供将本发明单克隆抗体或抗体相关分子用于制备用于某些癌症的诊断和/或预后的组合物或试剂盒的用途。

在相关的方面，本发明提供了检测生物样品中的紧密连接蛋白-1的方法，该方法包括：使生物样品在使得抗体和生物样品中存在的紧密连接蛋白-1形成抗体-紧密连接蛋白-1复合物的条件下与本发明抗体接触一定时间；并检测(和/或定量)任何形成的抗体-紧密连接蛋白-1复合物的存在。用于这一方法的本发明抗体(或抗体相关分子)优选与可检测部分偶联。在某些实施方式中，生物样品得自受试者，例如怀疑患有癌症的受试者。诊断和预后可基于形成的抗体-紧密连接蛋白-1复合物的存在、不存在或量来提供，例如与在相同的条件下从来自健康受试者的生物样品获得的结果进行比较后。

对于阅读了以下优选实施方式的详细说明的本领域普通技术人员，本发明的这些和其它目的、优势和特征将会变得明显。

附图简述

图1是说明了大鼠抗人CLDN-1血清与在CHO细胞中表达的CLDN-1特异性结合的一组(两幅)图。针对CLDN-1胞外域环的抗CLDN-1多克隆血清通过使用携带人CLDN-1 cDNA的质粒对Wistar大鼠进行基因免疫产生(参见实施例1)。CHO细胞以pcDNA-CLDN-1或对照载体(pcDNA)转染。CLDN-1或对照转染的非渗透化CHO细胞与大鼠抗人CLDN-1多克隆血清和PE-偶联的抗大鼠IgG一起孵育，该细胞的流式细胞分析证明了抗CLDN-1抗体与人CLDN-1的特异性相互作用(图1B)。相反，在以对照载体转染和与抗CLDN-1血清一起孵育的CHO细胞中未观察到相互作用(图1A)。

图2是证明抗CLDN-1抗体与Huh7.5.1人肝细胞瘤细胞(图2A)、人肝细胞(图2B)上的CLDN-1胞外域的相互作用的一组三幅图。CLDN-1的细胞表面表达使用大鼠抗人CLDN-1血清或对照预免疫血清(见实施例1)通过流式细胞法确定。对应于相应细胞表面分子的细胞表面表达的直方图(空白曲线)与以合适的同种型对照孵育的细胞的直方图(灰色阴影曲线)相重叠。大鼠抗人CLDN-1血清特异性地检测人肝细胞瘤Huh7.5.1细胞和人原代肝细胞的细胞表面上的CLDN-1。

图3是显示在Caco2(A)和Huh7.5.1(B)细胞中的CLDN1表达的一系列免疫荧光图像。图3A和图3B的下栏分别显示了使用针对CLDN1胞外域的抗CLDN1多克隆抗体(″anti-CLDN1 pAb″)、针对细胞内C末端域的市售抗CLDN1抗体(″anti-CLDN1 mAb″)对CLDN1进行染色，以及使用DAPI对细胞核进行染色的Caco2和Huh7.5.1细胞，如实施例1所述。图3A和3B中的上栏显示的是对照，其中Caco2和Huh7.5.1细胞分别与大鼠多克隆IgG(″对照pAb″)、小鼠单克隆IgG(″对照mAb″)和DAPI一起孵育。定标条代表10μm。

图4是显示抗CLDN-1抗体(大鼠多克隆抗CLDN-1抗血清)抑制HCV感染(Jc1 HCVcc感染)的一组(两幅)图。图4A显示了Huh7.5.1细胞的结果，其中该细胞在用Jc1 HCVcc感染前与抗CLDN-1大鼠血清(稀释1/50)或与对照血清(“pan大鼠”)一起在37℃下预孵育3小时。HCV感染通过在感染后72小时的感染Huh7.5.1细胞的裂解物中的HCV RNA定量来评估。分离总RNA，并通过pRT-PCR定量HCV RNA。图4B显示通过纯化的抗CLDN-1免疫球蛋白抑制Jc1 HCVcc感染。如实施例1所述，抗CLDN-1 IgG从No.2血清中纯化，并添加到Huh7.5.1细胞(CTRL-对照IgG)。HCV感染按照如上所述通过HCV RNA的定量来评估。结果以至少两个独立的实验中的一个的重复测定的平均％HCVcc感染力±SD表示。

图5(A)显示了抗SR-BI、抗CD81和抗CLDN1抗体对Luc-Jc1 HCVcc感染的剂量依赖性的抑制。使用次最大地(sub-maximally)阻断HCV感染的抗体浓度使得能够观察到累加或协同效应。Huh7.5.1细胞在37℃下用Luc-Jc1 HCVcc感染4小时前与抗CD81 mAb(0.1和0.05μg/mL)、对照小鼠mAb(mIgG：0.1和0.05μg/mL)、大鼠抗SR-BI血清(1/200、1/400和1/800)、大鼠抗CLDN1血清(1/100、1/200、1/400)或对照大鼠预免疫血清(CTRL：1/200)在37℃下一起预孵育4小时。HCV感染通过测量感染后48小时的荧光素酶活性来评价。数据以不存在抗体的情况下的Luc-Jc1 HCVcc感染力的百分比表示。显示了重复进行两次的四个独立实验的平均值±SD。图5(B)-(D)是显示抗SR-BI、抗CD81和抗CLDN1抗体抑制HCVcc进入的累加效应的一组(四幅)图。Huh7.5.1细胞在37℃下用Luc-Jc1 HCVcc感染4小时前在37℃下与大鼠抗SR-BI(1/400、1/800)、大鼠抗CLDN1(1/200、1/400)和小鼠抗CD81(0.05、0.1μg/mL)单独(黑色柱)或组合(灰色柱)预孵育1小时。HCVcc感染按照(A)中所述进行评价。数据以不存在抗体的情况下的Luc-Jc1 HCVcc感染力的百分比表示。显示了重复进行两次的四个独立实验的平均值±SD。

图6(B)显示了抗CD81 mAb(■)、大鼠抗SR-BI血清(◆)、大鼠抗CLDN1血清(▲)或对照大鼠血清(△)抑制HCVcc进入人肝细胞瘤细胞的动力学。大鼠抗CLDN1血清(1/100)、大鼠抗SR-BI血清(1/100)、大鼠对照血清(1/100)或抗CD81单克隆抗体(5μg/mL)对Luc-Jc1 HCVcc进入Huh7.5.1细胞的抑制按照图6(A)中列出的实验设置的示意图所示进行。在病毒与靶细胞结合后，洗涤细胞，在120分钟内在37℃下每20分钟加入抑制剂以使得发生进入。虚线表示存在抑制剂存在的时间间隔。48小时后测量荧光素酶活性，并相对于以相同的方法但是不加入抑制剂进行的对照感染来表示。(B)的结果表示为不存在抗体的情况下的Luc-Jc1 HCVcc感染力的百分比。显示了重复进行两次的三个独立实验中的一个的平均值±SD。

图7是显示来自5只以人紧密连接蛋白-1免疫(如实施例2所述)的大鼠的血清的流式细胞分析结果的一组(五幅)图。黑色曲线显示了以人紧密连接蛋白-1表达载体瞬时转染的哺乳动物细胞(BOSC23)的结果，红色曲线显示了以无关cDNA瞬时转染的哺乳动物细胞(BOSC23)的结果。黑色曲线向右偏移表示阳性。抗体以PE标记的抗大鼠IgG抗体(FL2)检测。

图8显示了以含有抗CLDN-1抗体的杂交瘤上清液(其名称在x轴上指明)抑制重组的感染性HCV(HCVcc Luc-Jc1)感染的分析结果。杂交瘤上清液按照实施例2的描述获得。结果以在存在或不存在杂交瘤上清液时HCVcc Luc-Jc1感染的百分比来表示(在存在PBS时的感染＝100％)。OM-3E5、OM-6D9、OM-7C11、OM-4A4、OM-6E1、OM-7D3、OM-7D4、OM-7C8和OM-8A9显示出对HCV感染的显著抑制，但是OM-5A1、OM-6G10和OM-5A8显示没有作用。阴性对照对应于未感染的细胞。

图9的一组(八幅)图显示了从来自以人紧密连接蛋白-1免疫的大鼠(如实施例2所述)的合并淋巴细胞获得的单克隆抗体上清液的流式细胞分析的结果。黑色曲线显示用人紧密连接蛋白-1表达载体(pCMV-SPORT6-CLDN1)瞬时转染的哺乳动物细胞的结果，红色曲线显示用无关cDNA(pCMV-SPORT6)瞬时转染的哺乳动物细胞的结果。黑色曲线向右偏移表示阳性。抗体以PE标记的抗大鼠IgG抗体(FL2)检测。x和y轴分别显示平均荧光强度和染色细胞的相对数量。图9(B)显示了通过流式细胞方法研究的六种单克隆抗人CLDN1抗体与转染的CHO细胞表面上表达的CLND1的特异性结合。CHO细胞以pCMV-SPORT6-CLDN1(条纹柱)或对照载体(pCMV-SPORT6，黑色柱)转染。图9(C)显示了六种单克隆抗体与Huh7.5.1肝细胞瘤细胞和原代肝细胞上的细胞表面表达CLDN1的结合，以及作为阴性对照与在BOSC23细胞上的细胞表面表达CLDN1的结合。结果以对于重复进行两次的各个实验计算的平均相对荧光单位(RFU)表示。图9(D)显示了通过抗CLDN1单克隆抗体在活的非渗透性Huh7.5.1细胞上的细胞表面CLDN1成像。Huh7.5.1细胞与大鼠同种型对照或抗CLDN1 OM-7D3-A3抗体(10μg/mL)、Cy5-偶联的抗大鼠第二抗体一起孵育，并按照实施例2所述进行分析。细胞核以DAPI染色。图9(E)显示了通过流式细胞方法研究的六种单克隆抗体与食蟹猴原代肝细胞上的细胞表面表达CLDN1的结合。

图10是显示抗CLDN1 mAb与HCV受纳细胞系Huh7.5.1的结合性质的一组(两幅)图。如实施例2所述，Huh7.5.1细胞与浓度增大的抗CLDN1 MAb一起孵育。Mab的结合使用PE-偶联的抗大鼠IgG mAb通过流式细胞法显示。同种型匹配的人IgG2用作对照。

图11显示了使用含有HCV基因型2a J6株(Luc-Jc1)和基因型1b Con1株(Luc-Con1)的结构蛋白的感染性病毒颗粒通过抗CLDN1抗体剂量依赖性地抑制HCVcc感染。(A)Huh7.5.1细胞在用Luc-Jc1 HCVcc(基因型2a)感染前与浓度增大的大鼠抗CLDN1或同种型对照抗体(CTRL IgI)在37℃下预孵育1小时；(B)Huh7.5.1细胞在与HCVcc Luc-Con1一起在37℃下孵育4小时前与大鼠抗CLDN1(10μg/μL的抗体OM6E1-B5、OM-7D3-B3、OM-8A9-A3)、抗CD81(10μg/μL)或同种型对照抗体(CTRL IgG，10μg/μL)或者在不存在抗体的情况下在预孵育。HCVcc Luc-Con 1含有基因型1b株Con1的HCV结构蛋白。如实施例2所述，HCV感染通过测量感染后48小时的荧光素酶活性来评价。显示了重复进行三次的代表性实验的平均值±SD。

图12为显示抗CLDN1单克隆抗体交叉中和携带源自主要HCV基因型的包膜糖蛋白的HCVpp的一组图。带有H77(基因型1a)HCV-J(基因型1b)、JFH1(基因型2a)、UKN3a 1.28(基因型3)、UKN4a 21.16(基因型4)、UKN 5.14.4(基因型5)和UKN 6.5.340(基因型6)株的包膜糖蛋白的基于MLV的HCVpp的不同株。VSV拟颗粒用作对照。HCVpp和VSVpp按照实施例2的说明制备。在以HCVpp或VSVpp在37℃下感染4小时前，Huh7细胞与浓度增大的大鼠抗CLDN1或大鼠同种型对照抗体在37℃下预孵育1小时。如实施例2所述，HCVpp和VSV感染通过测量感染后72小时的荧光素酶活性来评价。显示了重复进行三次的代表性实验的平均值±SD。

图13是显示人原代肝细胞中HCVpp感染的抑制的一组图。按照实施例2的描述制备了带有HCV H77株(基因型1a)、HCV-J株(基因型1b)、JFH-1株(基因型2a)、UKN3A.1.28株(基因型3)的包膜糖蛋白的基于HIV的HCVpp。在以HCVpp在37摄氏度下感染4小时前，人原代肝细胞与大鼠抗CLDN1或大鼠同种型对照抗体(10μg/mL)在37℃下预孵育1小时。如实施例2所述，HCVpp感染通过测量感染后72小时的荧光素酶活性来评价。显示了重复进行三次的代表性实验的平均值±SD。

图14显示了在两位患有慢性HCV感染的个体患者中，抗CLDN1单克隆抗体交叉中和HCV准种(quasispecies)的感染(见实施例2)。图14(A)显示了基于HVR1序列比对在首次HCV感染患者中的被称为VJ、VI、VK的三种变异(亚型1b)的相对分布。包膜糖蛋白的选定域的推测氨基酸显示在右方。氨基酸变化以红色加粗字母表示。图14(B)-(C)为显示了在Huh7.5.1细胞(B)和人原代肝细胞(C)中，抗CLDN1 OM-7D3(25μg/mL)抑制带有这一患者中的病毒准种的包膜糖蛋白的HCVpp感染的一组(两幅)图。图14(D)显示了基于完全E1E2序列的比对患有慢性HCV感染的第二名患者中的变异(称为VA-VY，亚型1b)的相对分布。图14(E)-(F)显示了带有患慢性丙型肝炎的第二名患者的病毒准种的包膜糖蛋白的HCVpp感染Huh7.5.1细胞(D)，以及抗CLDN1 OM-7D3(25μg/mL)中和该感染(E)的一组(两幅)图。HCVpp的感染按照实施例2的描述分析。抗CLDN1抗体的中和仅对于具有可检测的感染力的源自准种的HCVpp进行评价。含有终止密码子的病毒变异体以星号(asterix)表示。显示了重复进行三次的代表性实验的平均值±SD。ND-未进行；CTRL IgG-大鼠同种型对照抗体。

图15是显示防止带有来自具有宿主中和应答免除和肝移植物再感染的患者的包膜糖蛋白的HCVpp的HCV感染的一组(两幅)图。按照实施例2的描述制备带有来自三名不同的具有宿主中和应答免除和肝移植物再感染的患者的包膜糖蛋白的HCVpp(称为VD、VH、VK株)。防止HCVpp感染通过在用HCVpp在37℃下感染4小时前，将人原代肝细胞与抗CLDN1抗体OM-7D3(25μg/ml)或抗CD81或同种型对照(CTRL)抗体(25μg/ml)一起在37℃下预孵育1小时进行评价。感染按照实施例2的描述进行分析。显示了重复进行三次的代表性实验的平均值±SD。

图16的一组图显示在Huh7.5.1细胞和人原代肝细胞(PHH)中抗CLDN1单克隆抗体不具有毒性。对细胞的毒性作用通过MTT代谢评价，重复进行三次。将Huh7.5.1细胞(A)和来自三个不同供体的人原代肝细胞(B-D)与大鼠单克隆抗体、抗CLDN1 OM-7D3-B3(10μg/mL)、夫拉平度(flavopiridol)(10μM)或化合物C(20μM)一起孵育48小时，并通过MTT代谢进行分析。相对细胞活力与模拟孵育的人原代肝细胞或Huh7.5.1细胞(＝100％)(D)对比进行评价。化合物C(0.01-100μM)、抗CLDN1 OM-7D3抗体(0.01-100μM)或同种型对照抗体以增大的剂量加入人原代肝细胞中，并且按照图(B)和(C)中的描述进行毒性评价。

图17的一组图显示了两种抗CLDN1单克隆抗体在结合和感染研究中的交叉竞争。图17(A)：抗CLDN1 Mab间的竞争使用基于细胞的ELISA测量。Huh7.5.1细胞与0.1μg/mL的生物素化的抗CLDN1 mAb(OM-8A9-A3-上图或OM-7D3-B3-下图)一起孵育，并且以浓度逐渐升高的未标记的抗CLDN1 MAb作为竞争者。在PBS中洗涤细胞后，生物素化抗体的结合通过与以辣根过氧化物酶标记的抗生蛋白链菌素一起孵育进行检测。结合以相对荧光单位(RFU)进行测量。通过在同种型匹配的对照(阴性对照mAb)存在下测量结合而确定的曲线与在竞争抗体存在下测量的相比较。图17(B)：抗CLDN1单克隆抗体的整个组间的交叉竞争。交叉竞争如图A所示地使用0.1μg/mL的生物素化抗CLDN1 mAb(在x轴上显示)和10μg/ml竞争性未标记的抗CLDN1或同种型对照mAb(无关对照抗体)(在y轴上显示)进行分析。生物素化的抗CLDN1 mAb的结合仅在同种型对照抗体存在时发生。图17(C)：感染研究中抗体的交叉竞争。按照实施例2的描述，在以Luc-Jc1 HCVcc感染之前，将Huh7.5.1细胞与大鼠抗CLDN1或同种型对照抗体在37℃下预孵育1小时。为研究交叉竞争，在HCV感染之前同时加入低浓度的抗CLDN1 mAb(0.5μg/ml)。使用次最大阻断HCV感染的抗体浓度使得能够观察到累加或协同效应。抗体组合的效应以“+”表示(最终浓度为1μg/ml)(条纹柱)。

图18的一组图显示了单克隆抗CLDN1抗体与强烈依赖于高度保守的紧密连接蛋白基序：W(30)-GLW(51)-C(54)-C(64)的保守性的表位结合。抗体结合按照实施例2的描述使用编码野生型CLDN1或含有如在x轴上所指示的确定突变的CLDN1的pQCXIN-hClaudinl质粒进行。显示了相对于与野生型CLDN1的结合的单克隆抗CLDN1抗体(OM-7D3-B3(A)和OM-8A9-A3(B))与突变的CLDN1的结合(黑色柱)。在瞬时转染的Bosc细胞中野生型和突变的CLDN1的适当表达通过HA标签表达水平和抗HA抗体(除不存在HA标签的情况下的突变体I32A外)(空心柱)的流式细胞分析确认，并评价CLDN1的表达。相对于野生型CLDN1的HA，抗HA抗体与突变CLDN1的HA的结合显示为突变CLDN1的表达的内部对照(空心柱)。

图19显示通过流式细胞方法研究的六种单克隆抗体与人Huh7.5.1肝细胞瘤细胞和小鼠Hepa 1.6肝细胞瘤细胞上CLDN1的细胞表面表达的结合。结果以平均相对荧光显示，且各实验重复进行两次。抗CD81单克隆抗体用作阳性对照。

图20的一组图显示了抗CLDN1抗体以剂量依赖性地抑制E2与受纳细胞系的结合。(A)重组E2糖蛋白与受纳Huh7.5.1细胞的结合。Huh7.5.1细胞与1/100稀释的对照大鼠预免疫血清(CTRL：左图)或大鼠抗CLDN1抗体(右图)一起在室温下预孵育1小时。E2的结合通过流式细胞法检测。在不存在抗体和E2时孵育的细胞(PBS)用作阴性对照(NC-浅色阴影直方图)。显示了代表性的实验。(B)重组E2糖蛋白与受纳Huh7.5.1细胞的结合。Huh7.5.1细胞与大鼠抗CD81、大鼠抗SR-BI和大鼠抗CLDN1抗体或对照大鼠预免疫血清(均1/100稀释)在室温下预孵育1小时。E2的结合通过流式细胞法检测。结果表示为在不存在抗体时(PBS)的E2结合的百分比。显示了重复进行两次的四个独立实验的平均值±SD。(C)抗CLDN1对E2与Huh7.5.1细胞结合的剂量依赖性抑制。Huh7.5.1细胞与不同稀释度的多克隆大鼠抗CLDN1(灰色正方形)抗体或对照大鼠预免疫血清(黑色菱形)一起预孵育。结果表示为在不存在抗体时的E2结合的百分比。显示了重复进行两次的四个独立实验的平均值±SD。(D)重组E1糖蛋白与受纳Huh7.5.1细胞的结合。Huh7.5.1细胞与肝素、小鼠抗CD81(JS-81；5μg/mL)、对照(CTRL)小鼠IgG(5μg/mL)、大鼠抗CLDN1(1/100)、大鼠预免疫血清(1/100)在室温下预孵育1小时。E1的结合通过流式细胞法检测。结果表示为在不存在抗体时(PBS)的E1结合的百分比。显示了重复进行两次的两个独立实验的平均值±SD。结果表示为在不存在抗体时(PBS)的E2结合的百分比。显示了重复进行两次的两个独立实验的平均值±SD。^***P＜0.0001(t检验)。(E)HCVcc与受纳Huh7.5.1细胞的结合。在与使用梯度超离心从细胞培养物上清液中部分纯化的HCVcc(Jc1株)一起孵育前，将Huh7.5.1细胞与肝素、大鼠抗CLDN1、大鼠抗SR-BI或对照大鼠预免疫血清(PI)(均以1/100稀释)一起在室温下预孵育1小时。在与HCVcc一起孵育后，通过以PBS洗涤细胞除去未结合的HCVcc。然后通过细胞结合的HCV RNA的RT-PCR来定量HCVcc的结合，其在y轴上表示。

图21的一组图显示了包膜糖蛋白E2与表达CD81和SR-BI的CHO细胞的细胞结合，但是不与表达CLDN1的细胞结合。(A)在转染的CHO细胞中人进入因子(entry factor)的表达。按照实施例3的描述，以编码人CLDN1、SR-BI或CD81的表达质粒转染CHO细胞。转染的CHO细胞使用大鼠对照(CTRL)、大鼠抗CLDN1(左图)、大鼠抗SR-BI(中图)或小鼠对照IgG和抗CD81(JS-81；右图)通过流式细胞法进行分析。(B)包膜糖蛋白E2与表达人HCV进入因子的CHO细胞的结合。CHO细胞以所示的编码人CLDN1、SR-BI或CD81的单个表达质粒转染。细胞的E2结合通过流式细胞法分析。显示了重复进行两次的代表性实验。

图22的一组(两幅)图使用FRET分析显示了CD81-CLDN1共同受体缔合的抗CLDN1抑制。共转染以表达AcGFP、CD81和DsRED.CD81、AcGFP.CLDN1和DsRED.CD81或AcGFP.CLDN1和DsRED.CLDN1的HEK293T细胞接种于玻璃盖玻片上，并以预免疫的或抗CLDN1血清处理1小时。固定细胞，以激光扫描共聚焦显微镜成像，并且测量AcGFP供体和DsRED受体蛋白之间的FRET。FRET百分比被定义为在10个细胞的质膜上显示FRET的像素相对于所分析的像素的总数的频率。^***P＜0.0001，^**P＜0.01(t检验)。对未处理的和抗CLDN1处理的细胞中位于细胞内(黑色)和质膜处(白色)的AcGFP.CLDN1和DsRED.CLDN1进行定量，并且确定各位置处的CLDN1的百分比。

图23的一组图显示了通过抗CLDN1单克隆抗体抑制HCV的细胞-细胞间传播。在不存在抗体(A)或在阻断HCV的无细胞传播的抗CD81(10mg/mL)抗体的存在下(B)或在阻断HCV的无细胞和细胞间传播的抗CD81和抗CLDN1存在下(C)，Jc1电穿孔的Huh7.5.1生产者细胞(producer cell)与Huh7.5GFP+受体细胞一起共培养24小时。在各图中，下象限含有未感染的细胞(左下代表GFP-HCV-细胞，右下代表GFP+HCV-细胞)；左上代表GFP- HCV+感染的生产者细胞；和右上代表新感染的GFP+ HCV+受体细胞。在点位图中，FL1-高度(FL1-H)表示GFP的荧光强度，FL2-高度(FL2-H)表示抗-核抗体/PE的荧光强度(A-C)。GFP+ HCV+受体细胞在不同处理下的相对频率在(D)中说明。显示了代表性实验的结果。细胞与大鼠同种型对照抗体一起孵育显示出对HCV感染水平没有作用(数据未显示)。

图24显示了在感染后添加的抗CLDN1单克隆抗体(7D3)抑制HCV感染。Huh7.5.1细胞以HCVcc Luc-Jc1感染。在感染后4小时，将抗CLDN1单克隆抗体(7D3)或大鼠同种型对照单克隆抗体(50μg/mL)加入细胞。在感染后第3、5、7和9天通过荧光素酶报告基因的表达定量HCV感染，并且描述为病毒载量(Log₁₀ RLU)。每2天更换具有新鲜的抗体(50μg/mL)的培养基。在该测试中，病毒载量的阳性检测阈值为800RLU(虚线)。显示了代表性实验的结果。显示值是两次重复的平均值。缩略语：RLU-相对光单位。

定义

在整个说明书中使用了一些术语，这些术语在下文中定义。

当用于本文时，术语“受试者”是指可以成为丙型肝炎病毒(HCV)宿主的人或其它的哺乳动物，例如灵长类、狗、猫、山羊、马、猪、小鼠、大鼠、兔等，但是可以受到或未受到该病毒的感染和/或患上或未患上HCV相关的疾病。非人类受试者可以是转基因的或用其它方法改变的动物。在本发明的许多实施方式中，受试者是人类。在这样的实施方式中，受试者常被称为“个体”。术语“个体”不表示特定的年龄，并因此包括新生儿、儿童、青少年和成年人。

当用于本文时，术语“HCV”是指任何主要的HCV基因型、亚型、分离物和/或准种。HCV基因型包括但不限于基因型1、2、3、4、5和6；HCV亚型包括但不限于亚型1a、1b、2a、2b、2c、3a、4a-f、5a和6a。

术语“患有HCV”或“感染HCV”在本文中可互换使用。当这两个术语用于受试者时，是指患者的至少一个细胞被HCV感染。术语“HCV感染”是指例如通过靶细胞膜与HCV或HCV包膜糖蛋白阳性细胞的融合将HCV的遗传信息引入靶细胞中。

术语“HCV相关的疾病”和“与HCV有关的疾病”在本文中可互换使用。其是指已知或怀疑与HCV有关的和/或直接或间接地由HCV引起的疾病或病症。HCV相关(或与HCV有关)的疾病包括但不限于众多的肝脏疾病，例如急性肝炎的亚临床携带者状态(subclinical carrier state)、慢性肝炎、肝硬化和肝细胞癌。该术语包括任何HCV感染的症状和副作用，包括潜伏的、持续的和亚临床的感染，无论感染是否是临床显性的。

术语“治疗”在本文中用于表示目的在于(1)延缓或防止疾病或病症(例如HCV感染或HCV相关疾病)的发作；(2)减慢或阻止疾病或病症的症状的发展、恶化或劣化；(3)促进疾病或病症的症状的改善；或(4)治愈疾病或病症的方法或过程。治疗可以在疾病或病症发作前进行，以发挥预防或防止作用。可选择地或另外地，治疗可在疾病或病症开始后进行以发挥治疗作用。

“药物组合物”在本文中定义为包含有效量的至少一种本发明的抗体(或其片段)和至少一种可药用载体或赋形剂。

当用于本文时，术语“有效量”是指足以实现其预期的目的(例如在细胞、组织、系统或受试者中期望的生物或医学反应)的化合物、试剂、抗体或组合物的任何量。例如，在本发明某些实施方式中，所述目的可以是：防止HCV感染，防止HCV相关疾病的发作，减慢、减轻或阻止HCV相关疾病(例如慢性丙型肝炎、肝硬化等)的症状的发展、恶化或劣化，促进疾病症状的改善或治愈HCV相关的疾病。

术语“可药用载体或赋形剂”是指不会干扰活性成分生物活性的效力并且在所施用的浓度下对宿主没有过度的毒性的载体介质。该术语包括溶剂、分散体、介质、涂料、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延缓剂等。将这类介质和试剂用于药物活性物质在本领域中是公知的(见例如″Remington′s Pharmaceutical Sciences″，E.W.Martin，第18版，1990，Mack Publishing Co.：Easton，PA，将该文献全部内容通过引用并入本文)。

当用于本文是，术语“抗体”是指任何与特定表位结合的免疫球蛋白(即完整免疫球蛋白分子、免疫球蛋白分子的活性部分等)。该术语包括单克隆抗体和多克隆抗体。保持特异性结合活性的其所有衍生物和活性片段也包括在该术语中。该术语也涵盖了具有与免疫球蛋白-结合结构域同源或基本上同源的结合结构域的蛋白质。这些蛋白质可以是天然来源的或部分或完全合成制备的。

当术语“特异性结合”用于抗体时，是指抗体与预定抗原结合。通常，抗体以至少1×10⁷M^-1的亲和力结合，并且其与预定抗原的亲和力比与非特异性抗原(例如BSA、酪蛋白)亲和力高至少两倍。

术语“人紧密连接蛋白-1”或“人CLDN1”是指具有NCBI登录号NP_066924所示序列的蛋白质，或HCV易感人群中常见的任何天然存在的变异体。术语紧密连接蛋白-1的“细胞外域”或“胞外域”是指紧密连接蛋白-1序列延伸到细胞外空间(即细胞外侧的空间)的区域。

术语“易感细胞”和“HCV易感细胞”可互换使用。它们是指可被HCV感染的任何细胞。易感细胞包括但不限于：肝脏或肝细胞、原代细胞、肝细胞瘤细胞、CaCo2细胞、树突细胞、胎盘细胞、子宫内膜细胞、淋巴结细胞、淋巴样细胞(B和T细胞)、外周血单核细胞和单核细胞/巨噬细胞。

当术语“防止、抑制或阻断HCV感染”用于本发明抗体或抗体相关分子时，是指与不存在抗体或抗体相关分子的情况下将引入的HCV遗传信息的量相比，减少引入易感细胞或易感细胞群中的HCV遗传信息的量。

当术语“分离的”在本文中用于蛋白质或多肽时表示该蛋白质或多肽借助于其来源或操作与其天然相关或初始获得时相关的至少一些组分分离。术语“分离的”可选择地或另外地表示该感兴趣的蛋白质或多肽由人制备或合成。

术语“蛋白质”、“多肽”和“肽”在本文中可互换使用，这些术语是指各种长度氨基酸序列，其为中性(不带电的)形式或盐形式，且可以是未修饰的或通过糖基化、侧链氧化或磷酸化修饰的。在某些实施方式中，氨基酸序列是全长的天然蛋白质。在其它实施方式中，氨基酸序列是全长蛋白质的较小的片段。在又一些其它的实施方式中，氨基酸序列通过连接至氨基酸侧链的其它取代基修饰，例如糖单元、脂或例如磷酸根的无机离子，以及涉及链的化学转化的修饰，例如巯基的氧化。因此，术语“蛋白质”(或与其等同的术语)意图包括经受不会显著改变其特定性质的修饰的全长蛋白质或其片段的氨基酸序列。特别地，术语“蛋白质”包括蛋白质同种型，即由相同的基因编码但是其pI或MW或该两者都不同的变异体。这种同种型可在其氨基酸序列上不同(例如，由等位基因变异、可变剪接或限制性蛋白水解造成)，或者可选择地由差异的翻译后修饰(例如糖基化、酰基化、磷酸化)产生。

当术语“类似物”在本文中用于蛋白质时是指与蛋白质具有相似或相同的功能，但是不必然包含与蛋白质的氨基酸序列相似或相同的氨基酸序列或与蛋白质的结构相似或相同的结构的多肽。优选地，在本发明的情况中，蛋白质类似物的氨基酸序列至少30％与蛋白质的氨基酸序列等同，更优选地至少35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％等同。

当术语“片段”或术语“部分”在本文中用于蛋白质时是指包含蛋白质氨基酸序列的至少5个连续的氨基酸残基(优选地至少约10、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200、250或更多的氨基酸残基)的氨基酸序列的多肽。蛋白质片段可以具有或不具有蛋白质的功能活性。

当术语“生物活性的”在本文中用于表征蛋白质变异体、类似物或片段时，是指与蛋白质具有足够的氨基酸序列同一性或同源性以表现出与蛋白质相似或相同的性质的分子。例如，在本发明的许多实施方式中，本发明抗体的生物活性片段是保留了抗体与紧密连接蛋白-1细胞外域结合的能力的片段。

当用于本文时，术语“同源的”(或“同源性”)与术语“同一性”是同义的，其是指两个多肽分子之间或两个核酸分子之间的序列相似性。当两个比较序列中的位置被相同的碱基或相同的氨基酸残基占据时，则相应的分子在该位置处是同源的。两个序列间的同源性百分比对应于两个序列共有的匹配的或同源的位置的数目除以比较位置的数目再乘以100。通常在将两序列对齐以得到最大同源性时做出比较。同源氨基酸序列共有相同或相似的氨基酸序列。相似残基是对照序列中相应氨基酸残基的保守置换或“允许的点突变”。对照序列中残基的“保守置换”是与相应的对照残基物理或功能(例如具有相似大小、形状、电荷、化学性质，包括形成共价键或氢键的能力等)相似的置换。特别优选的保守置换是满足了由Dayhoff等人(″Atlas of Protein Sequence and Structure″，1978，Nat.Biomed.Res.Foundation，Washington，DC，Suppl.3，22：354-352)所述的对“可接受的点突变”定义的标准的置换。

术语“标记的”、“以可检测试剂标记的”和“以可检测部分标记的”在本文中可互换使用。这些术语用于说明实体(例如抗体)可以例如在与另一实体(例如抗原)结合后可可视化。优选地，选择可检测试剂或部分以使得能够产生可以被测量的信号并且信号强度与结合的实体的量相关。标记蛋白质或多肽(包括抗体)的方法在本领域中是公知的。标记的多肽可通过掺入通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学、电学、光学或化学方法或任何其它合适的方法直接或间接地检测的标记或与该标记偶联而制备。合适的可检测试剂包括但不限于各种配体、放射性核素、荧光染料、化学发光试剂、微颗粒、酶、比色标记、磁性标记和半抗原。

当术语“大约”和“约”在本文中用于数值时，除非另外指明或从上下文中另外证明的外，通常包括落入该值沿任一方向(大于或小于该值)的10％范围内的值(除了所述值超过可能值的100％的情况)。

发明详述

如上所述，本发明提供了通过干扰HCV-宿主细胞相互作用而防止HCV感染的单克隆抗体，还提供了分泌这种单克隆抗体的杂交瘤细胞系。

I、杂交瘤和抗紧密连接蛋白-1单克隆抗体

如下述实施例部分中所示，本申请申请人已经通过使用含有全长CLDN1基因的表达载体的基因免疫制备了针对人紧密连接蛋白-1细胞外域的多克隆抗体。使用基于HCVcc和HCVpp的系统发现，如此制备的多克隆抗体有效地抑制HCV感染(见实施例1)。由于这些令人鼓舞的结果，申请人已经使用大鼠的基因免疫和筛选方法产生了分泌与人紧密连接蛋白-1细胞外域特异性结合并有效抑制HCV感染的单克隆抗体的杂交瘤细胞系(见实施例2)。

A、杂交瘤细胞系和抗紧密连接蛋白-1单克隆抗体

相应地，本发明提供了分泌与人紧密连接蛋白-1细胞外域，特别是与W(30)-GLW(51)-C(54)-C(64)(位于紧密连接蛋白-1的第一细胞外环中的保守基序)特异性结合的单克隆抗体的杂交瘤细胞系。更具体地，本发明提供了通过按照实施例2中所述的基因免疫生成的8种这样的杂交瘤细胞系(Lohrmann，2003)。这些杂交瘤细胞系被称为OM-4A4-D4、OM-7C8-A8、OM-6D9-A6、OM-7D4-C1、OM-6E1-B5、OM-3E5-B6、OM-8A9-A3和OM-7D3-B3，于2008年7月29日保藏于DSMZ(德国微生物菌种保藏中心，Inhoffenstraβe7 B，38124 Braunschweig，Germany)，分配的保藏号分别为DSM ACC2931、DSM ACC2932、DSM ACC2933、DSM ACC2934、DSM ACC2935、DSM ACC2936、DSM ACC2937和DSM ACC2938。

本发明也提供了由这些杂交瘤细胞系中的任意一种分泌的单克隆抗体。本领域中熟知从杂交瘤培养物中制备和分离单克隆抗体的方法。杂交瘤细胞使用标准的方法在合适的培养基中生长，例如D-MEM和RPMI-1640培养基。抗紧密连接蛋白-1单克隆抗体可通过如下方法从杂交瘤细胞培养物中回收和纯化：蛋白A纯化、硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴离子和阳离子交换色谱法、磷酸纤维素色谱法、疏水相互作用色谱法、亲和色谱法(例如蛋白A柱)、羟磷灰石色谱法、凝集素色谱法或这些方法的任何合适的组合。高效液相色谱(HPLC)也可用于纯化。

本发明杂交瘤细胞系分泌的各种抗紧密连接蛋白-1单克隆抗体确定为rIgG2b重(H)链和κ轻(L)链同种型的免疫球蛋白或rIgG2a重(H)链和κ轻(L)链同种型的免疫球蛋白。但是，本发明的单克隆抗体更一般地包含由本发明杂交瘤细胞系(或衍生化的细胞系)分泌的并与人紧密连接蛋白-1细胞外域特异性结合的任何单克隆抗体(或其片段)。不期望受到任何理论的约束，据信单克隆抗体与易感细胞上的紧密连接蛋白-1细胞外域的结合干扰了HCV-宿主细胞相互作用，从而防止、抑制或阻止HCV进入细胞和感染细胞。

除了使用本文所述的杂交瘤作为抗体的来源外，单克隆抗体可通过本领域已知的任何其它合适的方法制备。例如本发明抗紧密连接蛋白-1单克隆抗体可通过重组DNA方法制备。这些方法通常包括分离编码期望抗体的基因，将基因转移至合适的载体中，并在细胞培养体系中大量表达。编码期望的单克隆抗体的基因或DNA可使用常规的方法容易地分离和测序(例如通过使用能与编码鼠类抗体的重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)。本发明提供的杂交瘤细胞系用作这种DNA的优选来源。用于重组产生单克隆抗体的合适的宿主细胞包括但不限于合适的哺乳动物宿主细胞，例如CHO、HeLa或CV1。合适的表达质粒包括但不限于pcDNA3.1 Zeo、pIND(SP1)、pREP8(均可从Invitrogen，Carlsboad，CA，USA购得)等。抗体基因可经由病毒或逆转录病毒载体表达，包括基于MLV的载体、基于牛痘病毒的载体等。本发明抗体可以以单链抗体形式表达。重组制备的单克隆抗体可按照上述进行分离和纯化。

B.抗体片段

在某些实施方式中，本发明单克隆抗体以其天然形式使用。在其它实施方式中，单克隆抗体可以被截断(例如经酶切割或其它合适的方法)以提供免疫球蛋白片段或部分，特别是具有生物活性的片段或部分。本发明单克隆抗体的生物活性片段或部分包括保留了单克隆抗体下述能力的片段或部分：干扰HCV-宿主细胞相互作用和/或特异性结合人紧密连接蛋白-1细胞外域和/或抑制或阻断HCV进入易感细胞和/或减少或防止易感细胞的HCV感染。本文所述的单克隆抗体的生物活性片段或部分包括在本发明之内。

本发明单克隆抗体的生物活性片段或部分可以是抗体的Fab片段或部分、F(ab′)₂片段或部分、可变域或一个或多个CDR(互补决定区)。或者，本发明单克隆抗体的生物活性片段或部分可衍生自抗体蛋白的羧基部分或末端，并且可包含Fc片段、Fd片段或Fv片段。

本发明的抗体片段可通过本领域中已知的任何合适的方法制备，这些方法包括但不限于酶切割(例如完整抗体的蛋白水解消化)或合成或重组技术。F(ab′)₂、Fab、Fv和ScFv(单链Fv)抗体片段可以例如在哺乳动物宿主细胞或大肠杆菌中表达和分泌。抗体也可使用其中将一个或多个终止密码子引入天然终止位点上游的抗体基因以各种截短的形式制备。抗体的各个部分可通过常规的方法化学连接在一起，或可以使用遗传工程技术制备成连续的蛋白质。

C.融合蛋白

本发明抗体(或其片段)可以以修饰的形式制备，例如融合蛋白(即与多肽实体连接的免疫球蛋白分子或部分)。优选地，本发明的融合蛋白保留了单克隆抗体与人紧密连接蛋白-1细胞外域的结合能力。可选择与本发明单克隆抗体或其片段融合的多肽实体以将多种有益性质中的任何性质赋予所得的融合蛋白。例如，可选择多肽实体以使重组融合蛋白的表达增加。可选择地或另外地，多肽实体可通过例如在亲和纯化中用作配体来帮助融合蛋白的纯化。蛋白水解切割位点可加入重组蛋白中以使得在纯化后期望的序列最终可与多肽实体分离。当以稳定性为目标时，也可选择多肽实体以赋予融合蛋白改善的稳定性。合适的多肽实体的实例包括例如使得所得的融合蛋白易于在镍螯合柱上纯化的聚组氨酸标签。其它的合适的多肽实体的实例是谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、麦芽糖B结合蛋白或蛋白A。

取决于预期的用途，本发明抗体可重建(re-engineer)以优化稳定性、溶解性、体内半衰期(half-like)或与其它靶标结合的能力。获得任何一种或所有这些性质变化的遗传工程方法以及化学修饰在本领域中是公知的。例如已知增加、除去和/或修饰抗体的恒定区在治疗性给予抗体的生物利用度、分布和半衰期方面发挥着特别重要的作用。由抗体的Fc或恒定区(其介导效应器功能)确定的抗体类和亚类(当存在时)赋予其它重要的性质。因此本发明包括具有重新改装、重新设计或另外地改变的恒定区的抗紧密连接蛋白-1抗体。

本发明其它的融合蛋白可通过本领域熟知的DNA改组(DNA shuffling)技术生成(见例如美国专利No.5,605,793、5,811,238、5,830,721、5,834,252和5,837,458)。DNA改组可用于调节抗体或其片段的活性，例如获得亲和力更高并且解离速率更低的抗体。在这类方法中，编码本发明抗体的多核苷酸可通过错配PCR的随机诱变、随机核苷酸插入或其它重组前的方法改变。或者，编码本发明抗体的多聚核苷酸的一个或多个部分可与一个或多个异源分子的一个或多个组分、基序、节段(section)、部分、域、片段等重新组合。

或者，本发明抗体可与另一抗体连接，以例如得到双特异性或多特异性的抗体。例如，本发明的抗紧密连接蛋白-1单克隆抗体或其生物活性片段可与易感细胞上HCV的另一受体(例如CD81和SR-BI)特异性结合的抗体或其片段连接。本领域已知制备双特异性和多特异性抗体的方法，包括例如涉及通过可还原的二硫键或不可还原的硫醚键的交联的化学合成以及重组方法。

D.嵌合的/人源化的或去免疫化的抗体

本发明的抗紧密连接蛋白-1单克隆抗体也可以是“人源化的”：啮齿动物抗体和人类序列的序列差异可通过单个残基的定点突变或接枝整个区域或通过化学合成替换与人序列中的残基不同的残基而降至最低。人源化抗体也可使用重组方法制备。在人源化形式的抗体中，CDR区域外的一些、大部分或所有的氨基酸以来自人免疫球蛋白分子的氨基酸代替，而在CDR区域内的一些、大部分或所有氨基酸不变。对氨基酸的小的增加、删除、插入、置换或修饰是可允许的，只要其不消除所得抗体与人紧密连接蛋白-1细胞外域结合的能力。合适的人“替代”免疫球蛋白分子包括IgG1、IgG2、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgD或IgE分子及其片段。或者，在啮齿动物抗体中存在的T细胞表位可通过突变(去免疫化)修饰以产生可用于人的治疗目的的非免疫原性啮齿动物抗体(见www.accurobio.com)。

E.抗体偶联物

本发明单克隆抗体或其生物活性变异体或其片段可与一种或多种其它分子实体功能性连接(例如通过化学偶联、基因融合、非共价缔合等)。这类修饰的抗体(或偶联的抗体)的制备方法在本领域中是已知的(见例如“Affinity Techniques.Enzyme Purification：Part B”，Methods in Enzymol，1974，Vol.34，W.B.Jakoby和M.Wilneck(Eds.)，Academic Press：New York，NY；以及M.Wilchek和E.A.Bayer，Anal.Biochem.，1988，171：1-32)。优选地，分子实体结合在抗体分子上的不干扰所得偶联物的结合性质的位置，即不参与抗体与人紧密连接蛋白-1细胞外域的特异性结合的位置。

在某些实施方式中，抗体分子和分子实体彼此通过共价键直接相连。直接的共价结合可通过例如酰胺键、酯键、碳-碳键、二硫键、氨基甲酸酯键、醚键、硫醚键、脲键、胺键或碳酸酯键。共价结合可通过利用抗体和分子实体上存在的官能团实现。活化试剂，例如碳二亚胺可用于形成直接连接。在其它实施方式中，抗体分子和分子实体通过连接基团互相共价连接。这可通过使用本领域熟知的多种稳定的双官能团试剂完成，包括同官能性和异官能性连接体。

在某些实施方式中，本发明抗体(或其生物活性片段)与治疗性部分偶联。多种治疗部分中的任何一种可适用于实施本发明，其包括但不限于细胞毒素(例如细胞生长抑制剂和杀细胞剂)、治疗剂和放射性金属离子(例如α发射体以及与大环螯合剂(例如DOTA)相连的α发射体)。细胞毒素或细胞毒性剂包括任何对细胞有害的试剂。其实例包括但不限于：紫杉醇、细胞松驰素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、吐根碱、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷(tenoposide)、长春新碱、长春花碱、秋水仙素、阿霉素、道诺红菌素、二羟基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光神霉素、放线菌素D、1-脱氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔、胸苷激酶、核酸内切酶、核糖核酸酶、和嘌呤霉素及其片段、以及它们的变异体或同系物。治疗剂包括但不限于：抗代谢物(例如甲氨蝶呤、6-疏基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶、氮烯咪胺(decarbazine))，烷化剂(例如氮芥、塞替哌(thioepa)、苯丁酸氮芥、苯丙氨酸氮芥、卡氮芥(BSNU)和环己亚硝脲(CCNU)、环磷酰胺(cyclothosphamide)、白消安、二溴甘露糖醇、链脲菌素、丝裂霉素C和顺式二氯二胺铂(II)(DDP)(顺铂)，蒽环类抗生素(例如道诺红菌素和阿霉素)、抗生素(例如放线菌素D、博来霉素、光神霉素、安曲霉素)、和抗有丝分裂剂(例如长春新碱和长春花碱)。所得抗体偶联物可应用于与HCV感染相关的肝癌(见下文)。

其它治疗部分包括具有期望的生物活性的蛋白质和多肽。所述蛋白质包括但不限于毒素(例如相思豆毒素、蓖麻毒素A、α毒素、假单胞菌外毒素、白喉毒素、皂草素(saporin)、木鳖子皂苷、白树毒素(gelonin)、美洲商陆抗病毒蛋白、α-帚曲菌素和霍乱毒素)；如肿瘤坏死因子、α-干扰素、β-干扰素、神经生长因子、血小板源生长因子、组织纤溶酶原激活物的蛋白质；细胞凋亡剂(例如TNF-α、TNF-β)或生物反应调节剂(例如淋巴因子、白细胞介素-1(IL-1)、白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-6(IL-6)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)或其它生长因子)。

可选择地或另外地，本发明抗体(或其生物活性片段)可与可检测部分偶联。多种可检测试剂中的任何一种可用于实施本发明，包括但不限于各种配体、放射性核素(例如³H、¹²⁵I、¹³¹I等)、荧光染料(例如异硫氰酸荧光素、罗丹明、藻红素(phycoerytherin)、藻青素、别藻蓝蛋白、邻苯二醛和荧光胺)、化学发光试剂(例如萤光素、萤光素酶和水母发光蛋白)、微颗粒(例如量子点(quantum dot)、纳米晶体、磷光体等)、酶(例如用于ELISA的酶，即辣根过氧物酶、β-半乳糖苷酶、萤光素酶、碱性磷酸酯酶)、比色标记、磁性标记和生物素、dioxigenin或其它可得到抗血清或单克隆抗体的半抗原和蛋白质。所得的可检测抗体可用于诊断和/或预后方法(见下文)。

可与本发明抗体(或其生物活性片段)偶联的其它分子实体包括但不限于线性或分链的亲水性聚合物基团、脂肪酸基团或脂肪酸酯基团。

因此，除了本文公开的杂交瘤细胞系分泌的抗紧密连接蛋白-1单克隆抗体以及其任何生物活性变异体或片段外，本发明还包括嵌合的抗体、人源化的抗体和包含本发明抗紧密连接蛋白-1单克隆抗体重链或轻链可变区的至少一个互补决定区(CDR)的抗体衍生分子，其包括例如如下的分子：Fab片段、F(ab′)₂片段、Fd片段、Fabc片段、Sc抗体(单链抗体)、双功能抗体、单个的抗体轻单链、单个的抗体重链、抗体链与其它分子的嵌合融合体和抗体偶联物，例如与诊断或治疗剂偶联的抗体。本发明包括的所有的这些抗体和抗体相关分子都保持与人紧密连接蛋白-1细胞外域特异性地结合。

F.本发明单克隆抗体和相关分子的活性和特异性

在实施例2中所描述的各个本发明的抗紧密连接蛋白-1单克隆抗体由本文提供的杂交瘤细胞系产生，并且按照其抑制Huh7.5.1细胞的HCVcc感染的能力进行选择。本领域技术人员应该理解的是，本发明的其它抗体和抗体相关分子的HCV感染抑制作用也可以使用HCVcc感染系统进行评价。可选择地和另外地，抗体和抗体相关分子对HCV感染的抑制作用可使用本领域已知的逆转录HCV假型(pseudotyped)颗粒(HCVpp)进行评价。优选地，本发明抗体或抗体相关分子将显示出以剂量依赖性的方式抑制HCVcc或HCVpp对易感细胞的HCV感染。

可用于测试本发明抗体和试剂的特异性的其它方法包括但不限于：流式细胞分析、蛋白印迹分析、ELISA和涉及配体/受体结合的抗体结合抑制测试。这些方法可用于测试产生抗体的杂交瘤的上清液、测试分离的/纯化的抗体的活性和/或测试修饰抗体(抗体相关分子)的活性。结合特异性测试可使用针对一组细胞的抗体或抗体相关分子进行，例如人细胞，包括但不限于肝细胞系(例如Huh7、Hep3b或HepG2)、胚肾细胞(293T)、成纤维细胞(HeLa)、B细胞、T细胞(例如Molt-4、Sup-TI或Hut-78)，单核细胞(THP-I)、星形胶质细胞(U87)、肝细胞瘤细胞(PLC/PRF：5)或其它类型的肝细胞，例如肝腺癌SkHepI、人外周血单核细胞及其各种分级亚型，包括淋巴细胞和单核细胞或包括CaCo2细胞的其它细胞系。流式细胞分析可反映抗体或抗体相关分子对各种细胞类型上的紧密连接蛋白-1的结合特异性。来自非人类哺乳动物的细胞也可用于这种测试。

使用这种测试，可确定本发明抗体和抗体相关分子的IC₅₀值。这些值表明了抑制50％病毒感染力所需的抗体或抗体相关分子的浓度，提供了有意义的和重要的定量标准，并且使得可以比较不同的抗体和抗体相关分子的感染抑制活性。

据发现在实施例2中描述的本发明抗紧密连接蛋白-1单克隆抗体高效地交叉中和所有主要基因型以及来自两个HCV慢性感染患者的整个准种群的所有分离体的HCV感染。如实施例2所述，本发明其它抗体和抗体相关分子交叉中和主要HCV基因型和患者个体的准种的分离体的HCV感染的能力可使用任何合适的方法进行评价，例如使用带有来自特定HCV基因型的HCV包膜糖蛋白的HCV假型颗粒(HCVpp)，或使用带有来自单个慢性HCV感染患者的HCV包膜糖蛋白的HCVpp。优选地，本发明抗体或抗体相关分子将显示出以剂量依赖性的方式抑制主要HCV基因型和HCV感染患者的准种的HCV感染。

相似地，本发明抗体或抗体相关的分子已经显示不与啮齿动物紧密连接蛋白-1(例如鼠类紧密连接蛋白-1)交叉反应，但是与非人类灵长动物紧密连接蛋白-1(例如食蟹猴紧密连接蛋白-1)特异性结合。

II、HCV感染和HCV相关疾病的治疗或预防

A.适应症

本发明抗紧密连接蛋白-1抗体可用于治疗和/或预防HCV感染或治疗和/或预防肝疾病或影响HCV-易感细胞(例如肝细胞、淋巴细胞或单核细胞/巨噬细胞)的病理状态的治疗和预防方法。本发明抗紧密连接蛋白-1抗体通过与细胞表面上的紧密连接蛋白-1细胞外域结合干扰HCV-宿主细胞的相互作用，从而减少、抑制、阻断或防止HCV进入细胞和/或细胞的HCV感染。

本发明治疗方法可使用本发明抗体或含有本发明抗体的药物组合物(见下文)完成。这些方法通常包括给予需要的受试者有效量的至少一种本发明抗紧密连接蛋白-1抗体或其药物组合物。给药可使用本领域技术人员已知的任何方法进行。具体的，抗体或组合物可通过各种途径给予，包括但不限于气溶胶、肠胃外、口服或局部途径。

通常，本发明抗体或组合物以有效量给予，即足以达到其预定目的的量。根据待治疗的受试者的年龄、性别、体重、总体健康状况、期望的生物或医学反应(例如防止HCV感染或治疗HCV相关的肝疾病)等，给予的抗体和药物组合物的精确量将不同。在许多实施方式中，有效量是抑制或防止HCV进入受试者易感细胞和/或感染受试者细胞从而防止HCV感染、治疗或防止受试者肝疾病或另外的HCV相关的病理状况的量。

本发明抗体和组合物可用于多种治疗或预防方法。具体地，本发明提供了治疗或预防受试者肝疾病或病理状况的方法，该方法包括给予受试者有效量的抑制HCV进入或感染受试者细胞的本发明抗体(或其组合物)，从而治疗或预防受试者的肝疾病或病理状况。肝疾病或病理状况可以是与HCV感染相关的肝的炎症、肝纤维化、硬化和/或肝细胞癌(即肝癌)。

本发明也提供了治疗或预防受试者的HCV相关的疾病或病症(包括肝疾病)的方法，该方法包括给予受试者有效量的抑制HCV进入或感染受试者细胞的本发明抗体(或其组合物)，从而治疗或预防受试者的HCV相关的疾病或病症。在本发明的某些实施方式中，抗体或组合物给予诊断为患有急性丙型肝炎的受试者。在本发明的其它实施方式中，抗体或组合物给予到诊断为患有慢性丙型肝炎的受试者。

根据该方法给予本发明的抗体或组合物可导致患者遭受的至少一种症状得到改善，包括但不限于，急性丙型肝炎症状例如食欲下降、疲劳、腹痛、黄疸、瘙痒和流感样症状；慢性丙型肝炎症状例如疲劳、体重明显降低、流感样症状、肌肉痛、关节痛、间歇性的低度发烧、瘙痒、睡眠障碍、腹痛、食欲改变、恶心、腹泻、消化不良、认知改变、抑郁、头痛和情绪不稳；肝硬化症状例如腹水、擦伤和流血倾向、骨痛、脉管曲张(特别是胃和食道中)、脂肪痢、黄疸和肝性脑病；和与HCV相关的肝外表现症状例如甲状腺炎、迟发性皮肤卟啉病、冷球蛋白血症、肾小球肾炎、干燥综合征、血小板减少症、扁平苔藓、糖尿病和B-细胞淋巴增殖性疾病。

可选择地或另外地，根据这类方法给给予本发明的抗体或组合物可减缓、降低、停止或减轻HCV感染或HCV-相关疾病的进展，或逆转该进程至消除感染或疾病的点。根据这类方法给予本发明的抗体或组合物也可导致病毒感染数量减少、感染性病毒颗粒数目的减少和/或病毒感染细胞的数目减少。

根据本发明的治疗的效果可使用本领域已知用于诊断HCV感染和/或肝病的任意分析方法来监测。这类分析包括但不限于，血清学血液测试、肝功能检测，以测定一种或多种白蛋白、丙氨酸转氨酶(ALT)、碱性磷酸酶(ALP)、天冬氨酸转氨酶(AST)和γ-谷氨酰转肽酶(GGT)，及使用不同技术的分子核酸检测，例如聚合酶链式反应(PCR)、转录介导的扩增(TMA)或分支DNA(bDNA)。

本发明的抗体和组合物也可使用免疫疗法。相应地，本发明提供降低由于与HCV接触而使易感细胞被HCV感染的可能性的方法。该方法包括将易感细胞与有效量的本发明的抗体或组合物接触，该抗体或组合物抑制HCV进入或感染易感细胞，因此降低由于与HCV接触而使细胞被HCV感染的可能性。本发明也提供降低受试者的易感细胞由于与HCV接触而被HCV感染的可能性的方法。在该方法中，可通过给予受试者本发明的抗体或组合物来使易感细胞与本发明的抗体或组合物接触。

降低易感细胞或受试者被HCV感染的可能性意味着降低易感细胞由于与HCV接触而被HCV感染的机率。该降低可为任何有意义的量，例如，至少2倍的降低，多于2倍的降低，至少10倍的降低，多于10倍的降低，至少100倍的降低或多于100倍的降低。

在某些实施方式中，受试者在给予本发明的抗体或组合物之前感染HCV。在其它实施方式中，受试者在给予本发明的抗体或组合物之前未被HCV感染。在再其它的实施方式中，受试者没被HCV感染，但是暴露于HCV。在某些实施方式中，受试者可能被HIV或HBV感染。

例如，本发明的方法可以用于降低受试者的易感细胞由于肝移植而被HCV感染的可能性。如上面已提及的，当患病的肝从感染HCV的患者摘除时，血清病毒水平直线下降。然而，在接受健康的肝移植后，病毒水平反弹并且可以在几天内超过移植前的水平(Powers，2006)。肝移植患者可以受益于给予结合肝细胞表面上的紧密连接蛋白1胞外域并因此降低、抑制、阻止或防止HCV进入细胞的本发明抗体。可在肝移植前、肝移植过程中和/或肝移植后进行给药。

其它可受益于给予本发明的抗体或组合物的受试者包括但不限于，感染HCV的母亲生产的婴儿，特别是母亲也为HIV-阳性的情况；已经与被HCV污染的血液或血液污染的医疗器械接触的卫生保健工作者；通过共享注射或以其它方式施用药物的设备而暴露于HCV的药物使用者；和通过感染控制不良的程序纹身、耳/体穿孔和针灸而暴露于HCV的人。

可受益于给予本发明的抗体或组合物的其它受试者包括但不限于，表现出一种或多种已知增加HCV疾病进展速率的因素的受试者。这些因素包括，特别是，年龄、性别(男性通常比女性显示更快的疾病进展)、饮酒、HIV协同感染(与显著增加的疾病进展速率有关)和脂肪肝。

在某些实施方式中，根据本发明的治疗方法单独给予本发明的抗体或组合物。在其它实施方式中，本发明的抗体或组合物与至少一种另外的治疗剂组合给药。本发明的抗体或组合物可在给予治疗剂前给药、与治疗剂同时给药和/或给予治疗剂后给药。

可与发明的抗体或组合物组合给药的治疗剂可选自众多的已知有益于治疗或预防HCV感染或HCV相关的疾病或状态的生物活性化合物。这类治疗剂包括特别是抗病毒剂，包括但不限于干扰素(例如，α干扰素和聚乙二醇化的α干扰素)、利巴韦林、抗HCV(单克隆或多克隆)抗体、RNA聚合酶抑制剂、蛋白酶抑制剂、IRES抑制剂、解旋酶抑制剂、反义化合物、核酶及其任何组合。

B.给药

希望剂量的本发明的抗体(任选地与一种或多种合适的可药用载体或赋形剂配制后)可以以任何合适的方式给予需要的受试者。各种不同的递送系统是已知的且可用于给予本发明的抗体，包括片剂、胶囊、注射溶液、脂质体胶囊、微粒、微胶囊等。给药方法包括但不限于，表皮、皮内、肌内、腹膜内、病灶内、静脉内、皮下、鼻内、经肺、硬膜外、经眼和口服途径。本发明的抗体或组合物可以通过任何方便或另外合适的途径给药，例如，通过输注或快速注射(bolus injection)、通过上皮或皮肤粘膜内层(例如，口腔、粘膜、直肠和肠粘膜等)的吸收。可全身性或局部给药。肠胃外给药优先指向患者的肝，例如通过插管到肝动脉或到胆管中。如本领域的技术人员所理解的，在本发明的抗体与另外的治疗剂联合给药的实施方式中，该抗体和治疗剂可通过同样的途径(例如，静脉内)或不同的途径(例如，静脉内或口服)给药。

C.剂量

本发明的抗体(或组合物)的给药剂量为使得输送的量有效达到预期的目的。给药途径、剂型和给药剂量取决于所需的治疗效果、需要治疗的HCV-相关病症(如果已经存在)的严重程度、任何感染的存在、患者的年龄、性别、体重和总体健康状况以及取决于使用的抗体或组合物的效力、生物利用度和体内半衰期、伴随治疗的使用(或未使用)和其它临床因素。这些因素可容易地在治疗过程中由主治医生确定。可选择地或另外地，给药剂量可通过使用动物模型(例如，猩猩或小鼠)的研究确定。基于这些或其它方法调整剂量以达到最大效果是本领域熟知的，并且在训练有素的医生的能力内。随着使用本发明的单克隆抗体的研究的进行，将会给出与合适的剂量水平和治疗进程相关的进一步信息。

根据本发明的治疗可由单剂或多剂组成。因此，给予本发明的抗体，或其组合物，可在某段时间内或定期的和以特定的间隔例如，每小时、每天、每周(或按照其它多天的间隔)、每月、每年(例如，以延时释放的形式)持续。可选择地，在给定的时间段内可进行多次给药，例如，每周两次或更多次；每月两次或更多次等。给药可以是一段时间内的持续给药，例如，静脉内给药。

总的说来，优选单克隆抗体的给药量在约1ng/kg至约100mg/kg受试者体重的范围内，例如，在约100ng/kg和约50mg/kg受试者体重之间，或者在约1μg/kg和约10mg/kg受试者体重之间，或者在约100μg/kg和约1mg/kg受试者体重之间。

III-药物组合物

如上所述，本发明的抗紧密连接蛋白-1抗体(和相关的分子)可以以自身形式给药或以药物组合物的形式给药。相应地，本发明提供含有有效量的本文所述的本发明抗体和至少一种可药用的载体或赋形剂的药物组合物。在一些实施方式中，组合物进一步包含一种或多种另外的生物活性剂。

本发明的抗体和药物组合物可以以任何量和使用任何给药途径给药以有效地达到所需的预防和/或治疗效果。最佳的药物剂型可根据给药途径和所需的剂量变化。这类剂型可影响给予的活性成分的物理状态、稳定性、体内释放速率和体内清除速率。

本发明的药物组合物可以配制成单位剂量形式以易于给药和达到剂量均匀性。此处使用的表述“单位剂量形式”指用于需要治疗的患者的本发明抗紧密连接蛋白-1抗体的物理分散单元。然而，应理解的是组合物的总的日剂量可由主治医生在合理的医学判断的范围内决定。

A.剂型

注射用制剂，例如无菌的注射用水性的或油性的悬浮液可根据已知的技术使用合适的分散剂或湿润剂和悬浮剂配制。无菌的注射制剂也可为在无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌注射溶液、悬浮液或乳液，例如，作为2，3-丁二醇中的溶液。可使用的可接受载体和溶剂为水、林格氏溶液(Ringer′s solution)、U.S.P.和等渗氯化钠溶液。另外，通常使用无菌的非挥发油作为溶液或悬浮介质。出于该目的，可使用任何温和的非挥发油，包括合成的单-或二-甘油酯。脂肪酸例如油酸也可用于注射制剂的制备。无菌的液体载体用于在肠胃外给药的无菌液体形式的组合物中。

注射用制剂可以是灭菌的，例如，通过阻挡细菌的过滤器过滤，或通过引入无菌固体组合物形式的灭菌剂，该固体组合物可在使用前溶解或分散到无菌水或其它无菌的注射介质中。作为无菌溶液或悬浮液的液体药物组合物可通过，例如静脉内、肌内、腹膜内或皮下注射给药。注射可通过单次推注或逐步输注进行。当必要或希望时，组合物可包括局部麻醉剂以减轻注射部位的疼痛。

为延长活性成分(本处指发明的抗紧密连接蛋白-1抗体)的作用，通常希望减慢从皮下或肌内注射的成分的吸收。延迟肠胃外给药的活性成分的吸收可通过溶解或悬浮该成分在油性载体中达到。可注射的储库形式通过在可生物降解的聚合物例如聚丙交酯-聚乙交酯中形成活性成分的微胶囊化基质来制备。根据活性成分与聚合物的比率和使用的具体聚合物的性质，成分释放的速率可得到控制。其他的可生物降解的聚合物的实例包括聚(原酸酯)和聚(酸酐)。可注射的储库制剂也可通过将活性成分捕获在脂质体或与人体组织相容的微乳液中来制备。

口服给药的液体剂型包括但不限于，可药用乳液、微乳液、溶液、悬浮液、糖浆剂、酏剂和加压组合物。除抗紧密连接蛋白-1抗体外，液体剂型可包含本领域通常使用的惰性稀释剂，例如，水或其他溶剂、增溶剂和乳化剂如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1，3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油(特别是，棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇和山梨聚糖的脂肪酸酯及其混合物。除了惰性稀释剂外，口服组合物也可包括助剂例如湿润剂、悬浮剂、防腐剂、甜味剂、调味剂、和芳香剂、增稠剂、着色剂、粘度调节剂、稳定剂或渗透调节剂。适合口服给药的液体载体的实例包括水(可能含有上述添加剂如纤维素衍生物，例如羧甲基纤维素钠溶液)、醇(包括一元醇和多元醇例如二醇类)及其衍生物和油(例如，分馏椰子油和花生油)。对于加压组合物，液体载体可为卤代烃或其他可药用推进剂。

口服给药的固体剂型包括，例如，胶囊、片剂、丸剂、粉末剂和颗粒剂。在这些固体剂型中，本发明的抗紧密连接蛋白-1抗体可与至少一种惰性的、生理可接受的赋形剂或载体(例如柠檬酸钠或磷酸二钙)和一种或多种以下成分混合：(a)填充剂或扩充剂，例如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇(mannital)和硅酸；(b)粘合剂，例如羧甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶；(c)保湿剂，例如甘油；(d)崩解剂，例如琼脂-琼脂、碳酸钙、土豆或木薯淀粉、藻酸、某些硅酸盐和碳酸钠；(e)溶液缓凝剂(solution retarding agent)，例如石蜡；吸收加速剂例，如季铵化合物；(g)湿润剂，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；(h)吸收剂，例如高岭土和膨润土；和(i)润滑剂例如滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠及其混合物。其他适合于固体制剂的赋形剂包括表面改性剂例如非离子和阴离子表面改性剂。表面改性剂的代表性实例包括但不限于，泊洛沙姆188、苯扎氯铵、硬脂酸钙、十八醇十六醇混合物、聚西托醇(cetomacrogol)乳化蜡、山梨糖醇酯、胶体二氧化硅、磷酸盐、十二烷基硫酸钠、硅酸镁铝和三乙醇胺。在胶囊、片剂和丸剂的情况，该剂型也可含有缓冲剂。

在使用赋形剂例如乳糖和高分子量聚乙二醇等的软和硬填充明胶胶囊中，类似类型的固体组合物也可作为填充剂使用。片剂、锭剂、胶囊、丸剂和颗粒剂的固体剂型可具有包衣和壳例如肠溶包衣、控释包衣和其它在药物制剂领域熟知的包衣。它们可任选地含有遮光剂且也可为使得仅释放一种活性成分，或优选地在肠道内的特定部位任选地以延释的方式释放活性成分的组合物。可使用的包埋组合物的实例包括聚合物质和蜡。

在某些实施方式中，可能希望的是局部地给予本发明的组合物到需要治疗的区域(例如，肝)。这可通过，例如但不限于手术(例如，肝移植)过程中的局部灌注、局部施用、通过注射、通过插管的方式、通过栓剂的方式或通过皮肤贴片或支架或其它植入物的方式来达到。

对于局部给药，组合物优选配制为凝胶、软膏、洗剂或乳膏，其可含有载体例如水、甘油、醇、丙二醇、脂肪醇、甘油三酯、脂肪酸酯或矿物油。其它局部载体包括液体石油、棕榈酸异丙酯、聚乙二醇、乙醇(95％)、聚氧乙烯单月桂酸酯(5％)的水溶液或十二烷基硫酸钠(5％)的水溶液。必要时可添加其他物质例如抗氧化剂、保湿剂、粘度稳定剂和类似试剂。

另外，在某些情况下，本发明的组合物预期可布置在置于皮肤上、皮肤中和皮肤下的透皮装置内。这类装置包括通过被动或主动释放机制释放活性成分的贴片、植入物和注射装置。透皮给药包括跨越体表和身体通道的内衬(包括上皮和粘膜组织)的所有给药。这种给药可使用洗剂、乳膏、泡沫、贴片、悬浮液、溶液和栓剂(直肠和阴道)中的本发明组合物实施。

透皮给药可通过使用含有活性成分(即，本发明的抗紧密连接蛋白-1抗体)和对皮肤无毒并使得用于系统性吸收的成分经由皮肤递送到血流中的载体的透皮贴片来实现。载体可采用多种形式，例如乳膏和软膏、浆料、凝胶和封闭装置。乳膏和软膏可为粘性液体或水包油或油包水型的半固体乳液。由分散在含有活性成分的石油或亲水石油中的吸收性粉末组成的浆料可能是适合的。多种封闭装置可用于释放活性成分到血流中，例如覆盖包含具有或没有载体的活性成分的储库的半渗透膜，或含有活性组分的基质。

栓剂可由传统材料制备，包括可可脂(添加或不添加蜡以改变栓剂的熔点)和甘油。也可使用水溶性栓剂基质，例如具有不同分子量的聚乙二醇。

当本发明的药物组合物用作防止HCV易感细胞被HCV感染的“疫苗”时，药物组合物可进一步包含本领域已知的疫苗载体，例如，甲状腺球蛋白、白蛋白、破伤风类毒素和聚氨基酸例如D-赖氨酸和D-谷氨酸的聚合物。该疫苗也可包括多种公知的佐剂中的任何一种，例如，不完全弗氏佐剂、明矾、磷酸铝、氢氧化铝、单磷酰脂质A(MPL，GlaxoSmithKline)、皂苷、CpG寡核苷酸、Montanide、维生素A和由可生物降解的油(例如角鲨烯和/或生育酚)制备的各种油包水乳液、Quil A、Ribi Detox、CRL-1005、L-121及其组合。

制备各种不同制剂的材料和方法为本领域已知，且可适用于实施本发明。合适的用于递送抗体的制剂可在，例如，″Remington′s Pharmaceutical Sciences″，E.W.Martin，18^th Ed.，1990，Mack Publishing Co.：Easton，PA.B.Additional Biologically Active Agents中发现。

B.另外的生物活性剂

在某些实施方式中，本发明的抗紧密连接蛋白-1抗体为本发明的药物组合物中仅有的活性成分。在其它实施方式中，药物组合物进一步包括一种或多种生物活性剂。合适的生物活性剂的实例包括但不限于，疫苗佐剂和治疗剂例如抗病毒剂(如上所述)、抗炎剂、免疫调节剂、镇痛剂、抗微生物剂、抗菌剂、抗生素、抗氧化剂、防腐剂及其组合。

在这样的药物组合物中，抗紧密连接蛋白-1抗体和另外的治疗剂可结合在用于同时、分别或顺序给予抗紧密连接蛋白-1抗体和治疗剂的一种或多种制剂中。更具体地，本发明的组合物可以配制为使得抗体和治疗剂可以一起给药或彼此独立地给药。例如，抗紧密连接蛋白-1抗体和治疗剂可一起配制在单一组合物中。可选地，它们可单独地保持(例如在不同的组合物中和/或容器中)和给药。

C.药物包装或试剂盒

在另一方面，本发明提供了包含含有本发明药物组合物的一种或多种组分的一个或多个容器(例如小瓶、安剖瓶、试管、烧瓶或窄颈瓶)的药物包装或试剂盒，使得可以给予本发明的抗紧密连接蛋白-1抗体。

药物包装或试剂盒的不同组分可以以固体(例如冻干的)或液体形式提供。各成分通常适当地作为在各自容器中的等分试样或以浓缩的形式提供。药物包装或试剂盒可以包括用于冻干成分重构的介质。试剂盒的单个容器优选保持在封闭空间中以用于商业销售。

在某些实施方式中，药物包装或试剂包含一种或多种另外的治疗剂(例如一种或多种抗病毒剂，如上所述)。任选地，在容器上有管理药物或生物制品的生产、使用或销售政府部门规定的形式的告示或者包装插页，该告示表明了管理部门对生产、使用或销售的批准以用于人类施用。告示或包装插页可含有根据本文公开的治疗方法使用药物组合物的使用说明。

例如条形码、无线射频、ID标签等的标识物可存在于试剂盒内或试剂盒上。标识物可用于例如唯一地识别试剂盒以达到质量控制、库存控制、工作区之间的跟踪运动等的目的。

IV.抗紧密连接蛋白-1抗体的非治疗用途

本发明的抗体(例如由本文提供的杂交瘤细胞系产生的抗紧密连接蛋白-1单克隆抗体)可用于多种非治疗应用，例如纯化、筛选和诊断方法。

A.纯化方法

因此，本发明的抗体可用作亲和纯化试剂。在此应用中，使用本领域熟知的方法将本发明的抗体固定在固相(例如Sephadex树脂或滤纸)上。固定的抗体与待纯化的含有人紧密连接蛋白-1(或其片段)的样品接触，随后以合适的溶剂洗涤载体以除去样品中除了与固定化的抗体结合的紧密连接蛋白-1外的基本上所有物质。最后，以将紧密连接蛋白-1从抗体释放的另一种合适的溶剂洗涤载体。

B.筛选方法

本发明的抗紧密连接蛋白-1抗体也可用于基于竞争结合试验的药物筛选方法。这种方法可以包括以下步骤：使样品中的测试化合物(例如测试抗体)与已知量的本发明抗紧密连接蛋白-1单克隆抗体之间竞争结合与本发明抗体结合的细胞，并测量结合的已知单克隆抗体的量。本发明单克隆抗体以例如酶的、化学发光的或荧光的标记适当地标记。

C.诊断方法

本发明的抗紧密连接蛋白-1抗体也可以用于诊断和/或预后分析，特别是用于不同癌症的诊断和/或预后，例如通过检测特定细胞、组织或血清中紧密连接蛋白-1的表达。因此，例如，紧密连接蛋白-1表达降低已经表明为结肠癌复发和II期结肠癌患者存活较差的强指标(Resnick，2005)；紧密连接蛋白-1的表达增加是用于检测宫颈上皮内瘤样病变的良好诊断标志物(Sobel，2005)，并且已报道为可用于子宫颈鳞状细胞恶性转化的有用标志物(Lee，2005)；紧密连接蛋白-1表达的降低与前列腺腺癌的高肿瘤级别和生化疾病复发相关(Sheeban，2007)；紧密连接蛋白-1表达的降低已经证明与乳腺癌的复发状态和恶性潜力相关(Morohashi，2007)。

本发明的诊断和/或预后分析通常包括：将得自患者的生物样品与本发明抗紧密连接蛋白-1抗体在使得抗体和生物样品中的紧密连接蛋白-1之间形成抗体-紧密连接蛋白-1复合物的条件下接触一段时间；并检测(和/或定量)任何形成的抗体-紧密连接蛋白-1复合物的存在或不存在。测定的存在或量可以用作给定病症(例如癌症)存在的指示。在某些方法中，将测定的量与从健康受试者获得的生物样品(或从大量健康受试者获得的一系列生物样品)在相同条件下形成的抗体-紧密连接蛋白-1复合物的量进行比较。

这些方法可用于研究任何类型的生物样品。合适的生物样品的实例包括但不限于：全血、尿液、血清、血浆、唾液、滑膜液、精液、淋巴液、脑脊髓液、腹膜液以及宫颈、尿道、直肠和阴道样品。生物样品可包括组织切片(例如乳腺活组织样品)、冰冻切片和已知诊断、治疗和/或结果历史的归档样品。生物样品可通过任何非侵入性方式收集，例如从受试者抽血或使用细针抽吸或活组织检查。

诊断方法可在未经样品处理或经有限的样品处理的生物样品本身上进行。或者，诊断方法可在生物样品处理之后进行。生物样品的处理可涉及一个或多个下述步骤：过滤、蒸馏、离心、萃取、浓缩、稀释、纯化、干扰组分的灭活、试剂的添加等。例如，诊断方法可在由生物样品制备的蛋白质提取物上进行。蛋白质提取的方法为本领域所熟知。

在上述的诊断方法中，可通过任何合适的方法(见，例如，E.Harlow和A.Lane，″Antibodies：A Laboratories Manual″，1988，Cold Spring Harbor Laboratory：Cold Spring Harbor，NY)进行抗体-紧密连接蛋白-1复合物的检测。例如，可使用免疫测定法进行抗体-紧密连接蛋白-1的检测。现有多种免疫分析技术，包括放射免疫分析法、酶免疫分析法(EIA)、酶联免疫吸附法(ELISA)和免疫荧光免疫沉淀法。免疫分析为本领域所熟知。实施这类分析的方法以及实际应用和过程在教材(见，例如，P.Tijssen，In：Practice and theory of enzyme immunoassays，eds.R.H.Burdon和v.P.H.Knippenberg，Elsevier，Amsterdam(1990)，pp.221-278和Methods in Enzymology中各卷，Eds.S.P.Colowick等，Academic Press，关于免疫学检测方法，特别见卷70，73，74，84，92和121)中进行了总结。免疫分析可为竞争性的或非竞争性的。

在某些实施方式中，本发明的抗体通过共价或被动地结合到固体载体或支持体的表面上而固定。固体载体为抗体能够可操作地固定于其上的本领域已知的任何固体载体；可操作地固定指抗体以允许固定的抗体与紧密连接蛋白-1的细胞外域之间形成复合物的方式固定。合适的载体或支持体材料的实例包括但不限于，琼脂糖、纤维素、硝基纤维素、葡聚糖、交联葡聚糖、琼脂糖凝胶、羧甲基纤维素、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚丙烯、辉长岩(gabbros)、磁体、离子交换树脂、玻璃、聚胺-甲基-乙烯基-醚-马来酸共聚物、氨基酸共聚物、乙烯-马来酸共聚物、尼龙、丝绸等。抗体在固体载体或支持体上的固定可涉及使用本领域公知的方法进行交联、共价结合或物理吸附。固体载体或支持体可以珠、微粒、微孔板、阵列、小杯、试管、膜或任何其它适于免疫分析的条件的形状。在一些实施方式中，抗原固定到固体载体或支持体上包括凝胶电泳，然后在本领域所熟知的称为蛋白质印迹法(或免疫印迹)的过程中转移到膜(通常为硝基纤维素或PVDF)上。

D.诊断试剂盒

本发明也提供包含包括至少一种可用于进行上述的筛选或诊断方法的本发明抗紧密连接蛋白-1单克隆抗体的材料的试剂盒。优选地，该试剂盒包括预定量的试剂组合和实施一种该方法的说明。在抗体用酶标记的实施方式中，试剂盒将包括酶所需的底物和辅助因子(例如，提供可检测的发色团或荧光团的底物前体)。另外，其它添加剂可包括例如稳定剂、缓冲剂(例如，封闭缓冲液或裂解缓冲液)等。各种不同试剂的相对量可大范围地变化以提供实质地优化分析灵敏度的试剂溶液浓度。特别地，试剂可以以包括赋形剂的干粉提供，通常为冻干粉，其溶解时提供具有合适浓度的试剂溶液。抗体可以固定或不固定在基底表面(例如，珠，阵列等)上。该试剂盒也可包含按照管理医药或生物产品的生产、使用或销售的政府机关规定的形式的告示。

实施例

以下实施例描述了一些实现和实施本发明的优选方式。但是，应该理解的是这些实施例仅是出于说明目的，并不意图限制本发明的范围。另外，除非实施例中的说明以过去形式呈现，该表述如说明书其它部分一样，并不意图表明实验事实上已经实施或者数据实际上已经得到。

下面报告的一些多克隆抗血清的结果已经在第15届丙型肝炎病毒和相关病毒国际研讨会(15^th International Symposium on Hepatitis C Virus and Related Viruses，Antonio，Texas，USA，5-9October，2008)上介绍，并且由S.Krieger等人在标题为“Production of anti-claudinl antibodies potently inhibiting HCV infection reveals that Claudin-1is required for an entry step closely linked to SR-BI and CD81”的摘要中对其进行了概述。其它结果在“Inhibition of hepatitis C virus infection by anti-Claudin antibodies is mediated by inhibition of E2-CD81-CLDN1 association”(已于2009年8月提交出版，S.Krieger等)以及“Monoclonal anti-claudin-1 antibodies for prevention and treatment of hepatitis C virus infection”(将于2009年10月提交出版，S.Krieger等)中给出。

实施例1：抗人紧密连接蛋白1的多克隆抗体

材料和方法

细胞。用于本研究中的中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、BOSC23细胞和Huh7.5.1肝细胞瘤细胞已经被描述(Barth，2005；Barth，2003；Bartosch，2003；Blight，2002)。BOSC23细胞是不表达内源性CLDN的源自HEK293的亲嗜性包装细胞(Pear，1993)。人原代肝细胞按照David的描述，1998(将其全部内容通过引用并入本文)分离和培养。

抗CLDN1多克隆抗体的制备。针对人紧密连接蛋白-1细胞外环的抗体使用含有全长人CLDN-1 cDNA的pcCMVSport 6-表达载体(pcDNA CLDN-1)，通过Wistar大鼠的基因免疫生成。简言之，动物以2周的间隔皮内接受了5次pcDNA CLDN-1。在免疫前从相同的动物血液中收集免疫前的对照血清。为分析所产生的抗CLDN-1多克隆血清的特异性，按照制造商的方案使用脂质体介导的基因转移(Lipofectamine；Invitrogen，Karlsruhe，Germany)以pcDNA(对照载体)或pcDNA CLDN-1转染BOSC23或CHO细胞。然后BOSC23或CHO细胞与抗CLDN-1多克隆血清或免疫前的对照血清一起孵育，并按照前述(Barth，2005)通过流式细胞法分析细胞表面的CLDN-1的表达。

通过免疫荧光鉴定抗CLDN1多克隆抗体。将Caco2细胞和Huh7.5.1细胞接种于玻璃盖玻片上，以PBS中的3％多聚甲醛固定20分钟，并使用针对CLDN1胞外域的抗CLDN-1抗体(即本发明的多克隆抗体，″抗CLDN1 pAb″，50μg/mL的大鼠抗CLDN1 IgG)、针对细胞内C末端域的抗CLDN1抗体(″抗CLDN1 mAb″，克隆1C5-D9，Abnova)对CLDN1进行染色，并且使用DAPI(4′，6′-二脒基-2-苯基吲哚)对细胞核进行染色。对照大鼠多克隆IgG(“对照pAb”)和小鼠单克隆IgG(“对照mAb”)用作对照。结合的初级抗体使用抗大鼠-Cy5和抗小鼠Alexa Fluor

第二抗体以及Zeiss Axio Observer显微镜(Carl Zeiss S.A.S，Le Pecq，法国)可视化。

重组HCV的制备及感染分析。质粒pFK-Jc1(Pietschmann，2006)编码全长HCV JFH1 cDNA或由H6CF和JFH1片段组成的嵌合HCV基因组(称为Jc1)。体外HCV RNA合成和RNA转染按照Wakita的描述(2005)进行。转染细胞的培养物上清液按照前述使用Amicon Ultra 15(Millipore，Billerica，MA，USA)清洗和浓缩，并直接使用或在4℃或-80℃下储存。病毒通过使用具有几处较小改变的在Huh7.5.1细胞上的有限稀释分析法滴定，且TCID50(50％组织培养感染剂量)基于Lindenbach(2005)所描述的方法计算。Huh7.5.1细胞与抗CLDN-1或对照血清(起始浓度为5μg/mL至100μg/mL)混合并在37℃下预孵育1小时。加入HCVcc并在37℃下孵育16小时。除去上清液，并将细胞在常规培养基中在37℃下孵育72小时，并且HCV感染按照说明通过细胞内HCV RNA的qRT-PCR测定。抗体介导的中和通过特异性感染力评价。

逆转录HCV拟颗粒(pseudoparticle)的制备和HCVpp感染的抗体介导的抑制。按照Bartosch(2003)的说明生成带有来自H77株或其它株的包膜糖蛋白的HCVpp及VSVpp。不含有包膜糖蛋白的HCVpp(对照pp)用作阴性对照。为了研究抗体介导的中和，将Huh7.5.1细胞在感染测试之前的一天接种于96孔板中，接种密度为0.5×10⁴细胞/孔。将Huh7.5.1细胞与抗CLDN-1或对照血清(开始时为1/20的稀释)混合，并在37℃下预孵育1小时。除去上清液，并将细胞在37℃下在常规培养基中孵育72小时。HCV的进入按照所述通过荧光素酶报告基因表达的分析确定。抗体介导的中和通过在抗紧密连接蛋白1血清或预免疫血清存在时HCVpp的特异性感染力来评价。

结果：

针对在表达紧密连接蛋白-1的BOSC23或CHO细胞上表达的紧密连接蛋白-1的细胞外环的多克隆抗体的产生。为评价CLDN-1在启动HCV感染中的功能作用，通过上述的基因免疫首次生成了针对CLDN-1细胞外环的多克隆抗CLDN-1血清。在免疫完成后，依据与在非渗透性的转染BOSC23或CHO细胞表面上表达的人CLDN-1的结合能力选择抗体。如图1所示，表达人CLDN-1的CHO细胞与大鼠多克隆抗CLDN-1抗体一起孵育导致了血清与CLDN-1细胞外的胞外域的特异性相互作用(图1B)。相反，在用pcDNA3.1对照载体转染并与大鼠抗CLDN-1血清一起孵育的CHO细胞中或在表达cDNA的与人CLDN-1一起孵育和与大鼠预免疫血清一起孵育的CHO细胞中未发现相互作用(图1A)。

为研究抗人CLDN-1是否识别易感HCV感染的细胞上的CLDN-1，将人肝细胞和Huh7.5.1肝细胞瘤细胞与血清一起孵育，并通过流式细胞法进行分析。如图2所示，人Huh7.5.1细胞(图2A)和人肝细胞(图2B)与大鼠多克隆抗CLDN-1抗体一起孵育证明抗体识别在HCV靶细胞(包括人肝细胞)上表达的CLDN-1。总之，这些数据证明了通过基因免疫产生的抗CLDN1多克隆抗体与人肝细胞以及人肝细胞瘤细胞上表达的人CLDN1的胞外域结合。

通过免疫荧光鉴定抗CLDN-1多克隆抗体。通过免疫荧光获得的结果如图3所示。这些结果如预期的证明了结合的抗CLDN1多克隆抗体定位于细胞表面。

抗CLDN-1多克隆抗体对HCV感染的抑制。为评价CLDN-1对HCV感染的作用，在针对CLDN-1细胞外环的表位的抗CLDN-1抗体存在下对Huh7.5.1细胞的JFH1 HCVcc感染进行研究。图4A显示抗CLDN-1大鼠血清以100μg/mL的浓度对JC1 HCVcc感染的抑制高于80％。相反，对照预免疫血清对HCVcc感染没有作用(图4A)。总之，这些数据证明针对CLDN1胞外域的抗体有效地抑制HCV感染。

为确认JFH1 HCVcc感染的抑制确实是通过抗CLDN-1抗体介导的，从大鼠抗CLDN-1血清和对照血清纯化IgG。如图4B所示，抗紧密连接蛋白-1纯化的IgG以与抗CLDN-1血清相似的方式显著地抑制Huh7.5.1细胞的HCVcc感染。相反地，从预免疫血清纯化的对照IgG(100μg/mL)不抑制HCVcc感染(图4B)。这些数据清楚地证明了抗CLDN-1血清的抑制作用是通过抗CLDN-1抗体介导的，而不是通过血清中存在的其它物质(例如潜在地干扰CLDN-1功能的CLDN-1配体)。

而且，纯化的抗紧密连接蛋白-1抗体对HCV感染的抑制作用使用逆转录HCV假型颗粒(HCVpp)确认。抗紧密连接蛋白-1抗体而不是对照抗体以剂量依赖性的方式抑制通过HCVpp对Huh7细胞的感染(数据未显示)。

总之，这些结果证明了抗紧密连接蛋白-1多克隆抗体有效地抑制HCV感染。

使用如上所获得的抗CD81单克隆抗体、大鼠抗SR-BI血清和大鼠抗CLDN1血清，申请人已经表明阻断CLDN1和CD81，或者CLDN1和SR-BI，或者CLDN1、CD81和SR-BI对HCVcc感染的抑制比阻断各单独的进入因子更加有效(见图5(A)-(D))。总之，这些数据表明CLDN1与CD81和SR-BI合作介导HCV进入。也发现抗CD81单克隆抗体、大鼠抗SR-BI血清和大鼠抗CLDN1血清以相似的动力学抑制Huh7.5.1细胞的HCVcc感染，这表明在HCV进入Huh7.5.1细胞的过程中CLDN1、SR-BI和CD81几乎同时发挥作用(见图6)。

实施例2：抗紧密连接蛋白-1单克隆抗体

材料和方法

细胞系和原代肝细胞。人Huh7(Steinmann，2004)、Huh7.5.1(Zhong，2005)、293T(Pestka，2007)、BOSC23(Pear，1993)、仓鼠CHO(Barth，2005)和鼠类Hepa1.6细胞(Steinmann，2004)已经在以前进行了说明。按照Codran(2006)、Lan(2008)、Zeisel(2007)所述分离和培养人和小鼠原代肝细胞。食蟹猴原代肝细胞购自PRIMACYT Cell Culture Technology GmbH(德国)。

抗CLDN1单克隆抗体与人原代肝细胞的结合和交叉竞争分析。将Huh7.5.1细胞或者人或食蟹猴原代肝细胞(2×10⁵细胞/孔)在室温下在磷酸盐缓冲盐水(PBS)-3％胎牛血清(FCS)中与浓度升高的抗CLDN1单克隆抗体一起孵育30分钟。单克隆抗体(mAb)的结合通过与PE偶联的抗大鼠IgG mAb(Southern Biotechnology Associates)一起孵育揭示。同种型匹配的大鼠IgG2b(Genovac)用作对照。使用FACScan(Beckton Dickinson)和CellQuest软件进行FACS数据获取和分析。抗CLDN1 mAb间的竞争通过基于细胞的ELISA测量。将Huh7.5.1人肝细胞瘤细胞(2×10⁵细胞/孔)接种于96孔板中。在封闭孔后，将细胞与0.1μg/mL的生物素化的抗CLDN1 mAb一起并与作为竞争者的浓度升高的未标记的抗CLDN1 mAb一起孵育60分钟。在PBS洗涤细胞后了，生物素化的抗体的结合通过与辣根过氧化物酶(BD)标记的抗生蛋白链菌素一起孵育进行检测。在洗涤和以Amplex Red试剂显色后，结合以相对荧光单位(590nm)进行测量。通过在同种型匹配的对照存在下的结合测量而确定的曲线与在竞争抗体存在下确定的曲线相比较。根据制造商的建议使用Sulfo-NHS-LC-Biotin(Thermo Scientific)进行生物素标记。

细胞表面CLDN1的成像研究。在不存在渗透试剂的情况下，将Huh7.5.1活细胞与大鼠同种型对照或大鼠抗CLDN1 OM-7D3-B3(10μg/mL)和Cy5偶联的抗大鼠第二抗体(1/300；Jackson Immunoresearch)一起孵育。染色后，使用Leica LSR2CLSM(IGBMC Imaging Center，Illkirch，法国)固定、装载和观察细胞。

抗CLDN1 mAb靶向的表位的定位。使用编码野生型CLDN1或含有由定点突变引入的确定突变的CLDN1的pQCXIN-hClaudinl质粒进行表位定位。这些CLDN1突变的质粒由Tanya Dragic博士(Department of Microbiology and Immunology，Albert Einstein College of Medicine，Bronx，New York)热心提供。野生型和突变的CLDN1含有胞质N端血球凝集素(HA)-标签，使得可以定量转染效率和蛋白表达(Cukierman，2009)。为研究抗CLDN1 mAb与突变CLDN1的结合，以CLDN1表达构建体(0.05μg DNA；Lipofectamine)瞬时转染CLDN1阴性的BOSC23细胞。48小时后，通过流式细胞方法确定单克隆抗体OM-7D3-B3或OM-8A9-A3与瞬时转染了pQCXIN-hClaudinl质粒的BOSC23细胞的结合。使用用作内部对照的抗HA抗体以流式细胞法定量HA-标签的表达。将转染的细胞用Cytoperm/Cytofix(BD)渗透以分析细胞质HA标签的表达，或者不进行处理以分析抗CLDN1-突变CLDN1的相互作用。对于FACS分析，转染细胞与抗CLDN1 mAb或抗HA(Covance)一起孵育30分钟，然后与10μg/mL的抗大鼠IgG mAb(针对抗CLDN1)或10μg/mL以藻红素标记的抗小鼠IgG mAb(针对HA)一起孵育。

HCVcc的制备和感染。HCVcc(Jc1、Luc-Jc1、Luc-Con1株)按照前述(Haberstroh，2008；Koutsoudakis，2006；Pietschmann，2006；Wakita，2005和Zeisel，2007)生成。对于感染试验，将Huh7.5.1细胞接种于48孔组织培养板中，密度为2×10⁴细胞/孔。在抗体存在或不存在下将细胞在37℃下预孵育1小时，然后以Jc1 HCVcc或Luc-Jc1 HCVcc在37℃下感染4小时。48小时后，按照前述(Haberstroh，2008；Koutsoudakis，2006；Tscherne，2006和Zeisel，2007)通过使用RT-PCR或荧光素酶活性定量细胞内HCV RNA来分析细胞裂解物中的HCV感染。

HCV拟颗粒(HCVpp)的制备和感染。按照Lavilette(2005)、Bartosch(2003)、Pietschmann(2006)、Zeisel(2007)、Fafi-Kremer(2009)的描述制备基于MLV或基于HIV的HCVpp(H77、HCV-J、JFH-1、UKN3A.1.28、UKN4A.21.16、UKN5.14.4、UKN6.5.340、VI、VJ、VD、VH、VK和VA-VY株)。对于感染试验，按照前述(Haberstroh，2008)在动力学试验前一天，将HEK293T、293T/CLDN1+和Huh7.5细胞置于24孔板中。72小时后，按照Koutsoudakis(2006)的描述，裂解细胞，并且通过荧光素酶报告基因表达的定量来分析HCVpp的进入。

毒性测试。对细胞的毒性作用通过一式三份地分析其代谢溴化3-(4，5-二甲基噻唑基-2-基)-2，5-二苯基-四唑(MTT)的能力进行评价(Mosmann，1983)。将来自三个不同供体的Huh7.5.1细胞和人原代肝细胞与大鼠单克隆抗体、抗CLDN1 OM-7D3-B3(0.01-100μg/mL)、夫拉平度(10μM，Sigma)或化合物C(0.01-100μM，Sigma)一起孵育。MTT的最终浓度为0.6mg/mL。按照Mosmann(1983)的描述，溶解和测量由该细胞产生的甲臜(formazan)晶体。

统计分析。结果表示为平均值±标准偏差(SD)。统计分析使用Stuent’s t检验进行，P值小于0.05时被认为有统计学显著性。

结果：

对细胞表面CLDN1的细胞外域特异的单克隆抗体的制备。5只大鼠使用在它处(Lohrmann，2003，将其全部内容通过引用并入本文)总结的由Genovac GmbH采用的标准基因免疫方案以哺乳动物表达载体中的全长人紧密连接蛋白-1 cDNA(NCBI登录号：NM_021101)进行免疫，并且基于在德国专利No.DE 198 52 800(将其全部内容通过引用并入本文)中描述的Genovac系统进行筛选。简言之，对于该筛选，血清和杂交瘤上清液针对以表达抗体针对其生成的靶标的标记cDNA构建体转染的哺乳动物细胞进行测试。DNA载体如此设计以使得所得的蛋白质分泌并且暂时地附着在质膜上。这使得可使用流式细胞方法或基于细胞的ELISA进行基于细胞的筛选分析。

在数轮DNA扩增(boost)后，处死动物，并从单个动物收集血清和淋巴细胞。来自各动物的血清通过流式细胞法测试对人紧密连接蛋白-1蛋白的识别，然后将紧密连接蛋白-1cDNA瞬时转染到哺乳动物细胞中(图7)。

移除来自大鼠3的淋巴细胞并且使用标准的PEG条件使其与SP2/0/Ag14小鼠骨髓瘤细胞(ATCC号：CRL-1581)融合，所得的杂交瘤在标准选择条件下接种于96孔板上(见例如E.Harlow和D.Lane，于″Antibodies，A Laboratory Manual″中，第6章，1988，Cold Spring Harbor)。2周后，杂交瘤上清液在针对瞬时转染了人紧密连接蛋白-1 cDNA的哺乳动物细胞和转染了作为阴性表达对照的无关cDNA的细胞的基于细胞的ELISA中进行测试。该预选择使得能够鉴别阳性杂交瘤，这些杂交瘤经转移在24孔板上扩增，随后在6孔板上扩增，且其上清液通过流式细胞方法针对以与用于基于细胞的ELISA相同的阳性和阴性cDNA构建体瞬时转染的哺乳动物细胞重新进行测试。

然后分析含有抗CLDN-1抗体的杂交瘤上清液对重组的感染性HCV(HCVcc Luc-Jc1)的感染的抑制。更具体地，Huh7细胞与100μL含有抗体的杂交瘤上清液一起在37℃下孵育1小时。然后，在37℃下3小时加入感染性HCVcc(TCID 10⁵/mL，源自含有荧光素酶报告元件的Luc-Jc1株)。然后除去上清液，并以新鲜的培养基(DMEM，10％FBS)代替。2天或3天后，病毒感染通过细胞裂解产物中荧光素酶报告基因的表达来定量(Zeisel，2007)。获得的结果表示为在存在或不存在杂交瘤上清液的情况下HCVcc Luc-Jc1感染的百分比(在PBS存在下的感染＝100％)，该结果在图8中示出。从图8中可以看出，OM-3E5、OM-6D9、OM-7C11、OM-4A4、OM-6E1、OM-7D3、OM-7D4、OM-7C8和OM-8A9显示出对HCV感染的显著抑制，而OM-5A1、OM-6G10和OM-5A8未显示出作用。

在分析其阻断活性后，如下母克隆(mother clone)OM-3E5、OM-6D9、OM-7C11、OM-4A4、OM-6E1、OM-7D3、OM-7D4、OM-7C8和OM-8A9通过接种于半固体培养基中进行分种，挑取所得的亚克隆集落并将其转移至96孔板中(OM7C11显示出阻断活性，但是由于其不是抗体的有效生产者，所以未分种)。挑取所得亚克隆，并再次测试其与转染的非渗透人BOSC23以及转染的仓鼠CHO细胞表面上表达的人CLDN1结合的能力。人BOSC23细胞是不表达内源性CLDN的源自HEK293的亲嗜性包装细胞(Pear，1993)(数据未显示)。这些分析的结果在图9中显示。选择如下亚克隆物：OM-3E5-B6、OM-6D9-A6、OM-4A4-D4、OM-6E1-B5、OM-7D3-B3、OM-7D4-C1、OM-7C8-A8和OM-8A9-A3。

将表达人CLDN1的BOSC23和CHO细胞与导致与人CLDN1的特异性相互作用的大鼠单克隆抗人CLDN1抗体一起孵育(图9A和图9B)。

为了研究抗人CLDN1抗体是否与HCV受纳Huh7.5.1细胞和人肝原代细胞的细胞表面上的CLDN1细胞外环结合，将细胞和抗CLDN1抗体一起孵育，并在没有透过试剂存在的条件下通过流式细胞法进行分析。以单克隆抗体对天然的人Huh7.5.1肝细胞瘤细胞和人肝细胞的阳性染色证明这些抗体与在原代肝细胞和HCV受纳细胞系的细胞表面上表达的CLDN1结合(图9C)。相反，与抗CLDN mAb或Huh7.5.1一起孵育的人CLDN1缺陷BOSC23细胞(图9A)、与同型对照抗体一起孵育的CHO/CLDN+细胞或人原代肝细胞(图9B)未观察到染色。单克隆抗体对天然细胞表面CLDN1的染色也通过对活的、非渗透Huh7.5.1细胞的免疫荧光证实(图9D)。总之，这些数据证明由基因免疫产生的单克隆抗CLDN1抗体特异性地与HCV受纳细胞系和人肝细胞表面上表达的天然CLDN1的细胞外环结合。

为了研究抗人CLDN1抗体是否与鼠类CLDN1有交叉反应，研究了单克隆抗体与鼠类肝源细胞系上表达的鼠类CLDN1的结合。有趣的是，单克隆抗CLDN1抗体不与在小鼠肝细胞瘤细胞系Hepa1.6上表达的鼠类CLDN1相互作用。另外，如图9所示，抗CLDN1抗体没有使仓鼠细胞系CHO染色。这些发现表明抗人CLDN1抗体没有与鼠类或仓鼠CLDN1的细胞外环的交叉反应性(图9和图19)。相反，大鼠单克隆抗CLDN1显示出与非人类灵长动物食蟹猴(Macaca fascicularis)的原代肝细胞的交叉反应性(图9E)。这些数据表明抗体靶向的表位在灵长类动物中是保守的，但是在啮齿类动物如小鼠和仓鼠中有差异。

各亚克隆物被冷冻并且一部分在无血清的ISF-I培养基中(Biochrom AG，Catalogue Number：9061-01)扩增。抗体在蛋白G柱上纯化并在PBS缓冲液中测定其浓度。通过购自BD-Pharmingen的市售的ELISA测试(Catalogue Number：557081)测定各克隆的同种型。轻链的性质也用同样的市售ELISA试剂盒测定。这些分析的结果在表1中显示。

表1.所选择的杂交瘤细胞系分泌的单克隆抗体的特征

抗CLDN1单克隆抗体与HCV受纳细胞和人原代肝细胞结合性质的表征。用流式细胞法对抗CLDN1单克隆抗体与HCV受纳细胞和人原代肝细胞的结合性质进行表征。如图10所示，与Huh7.5.1细胞的测定的半饱和浓度(其对应于抗体的表观K_D)如下：7D3-B3 4nM；7D4-C1 5nM；8A9-A3 2nM；4A4-D4 9nM，6D9-A6 8nM，6E1-B5 3nM，7C8-A8 7nM(图10A)。对于抗体与人原代肝细胞的结合获得类似的半饱和浓度和表观KD(数据未显示)。这些结果证明抗CDLN1抗体与HCV受纳细胞系和人肝细胞以高亲和力结合。

抗CLDN1抗体与所有主要基因型和单个准种的HCV分离体的交叉中和。为了探索基因免疫产生的抗体能否抑制HCV感染，在抗CLDN1或同种型对照抗体存在的情况下用嵌合的J6/CF-JFH1萤火虫荧光素酶报道病毒Luc-J1(Koutsoudakis，2006)感染Huh7.5.1细胞。图11显示单克隆抗CLDN1抗体剂量以剂量依赖性的方式抑制Luc-Jc1和Luc-Con1病毒对Huh7.5.1细胞的HCV感染，而同种型对照抗体没有抑制作用。总之，这些数据证明针对CLDN1的细胞外环的抗体抑制HCV感染。为解决抗CLDN1抗体是否能够交叉中和所有主要基因型的HCV感染，分析了抗体对带有HCV包膜糖蛋白(来自HCV基因型1-6)的HCV假型颗粒(HCVpp)进入的影响。如图12所示，单克隆抗CLDN1抗体有效地并且剂量依赖地抑制基因型1-6的HCVpp对Huh7.5.1细胞的感染，对HCV感染抑制的IC₅₀范围为从0.1到5μg/mL。在人原代肝细胞的感染中发现了类似的结果(图13)。

病毒的高变异性是抗病毒和免疫抑制策略开发的主要挑战。HCV具有很高的复制率且高度易错的病毒聚合酶使得快速产生被称为“准种”的较小病毒变异体，这些病毒变异体会超出(outspace)体液和细胞免疫反应(Aurora，2009；Farci，2006；Ray，2005；Uebelhoer，2008)。这些变异体在被感染的宿主中处于恒定的免疫压力下，因而选择过程导致能够逃避免疫识别或赋予对抗病毒疗法的抗性的最适病毒取得病毒准种的统治地位。

为了解决抗CLDN1抗体是否有效地抑制个体患者中的准种群，两个慢性HCV感染的个体患者的包膜糖蛋白被克隆、测序和表达。如图14所示，抗CLDN1抗体广泛地中和带有来自两个个体患者的包膜糖蛋白的HCVpp的HCV感染。这些数据证明了抗CLDN1抗体交叉中和所有主要基因型以及个体患者的准种群分离体的HCV感染。

HCV准种和避过宿主中和抗体的病毒株的中和及肝移植体再感染。由慢性HCV感染导致的末期肝脏疾病是肝移植的主要原因。由于病毒避过宿主免疫反应和缺乏预防性的抗病毒策略，移植体的再感染十分普遍并以肝病的加速发展为特征。申请人先前用人原代肝细胞和带有源自进行肝移植的HCV感染患者的病毒包膜糖蛋白的逆转录HCV假型证明，增强的病毒进入和避过抗体介导的中和是肝移植体的HCV再感染过程中病毒变异体选择的决定性因素(Fafi-Kremer，2009，提交出版)。

在本研究中，呈现来自进行肝移植和发生HCV再感染的患者的包膜糖蛋白的HCVpp用于评价抗CLDN1抗体是否能抑制避过了宿主中和反应并且导致肝移植体的再感染的病毒分离体对人原代肝细胞的感染。为达到此目的，申请人研究了抗CLDN1抗体对带有来自在移植和肝移植体再感染期间选择的HCV株(HCV株VD、VH、VK)的包膜糖蛋白的HCVpp进入的作用。如图15所示，细胞与抗CLDN1抗体预孵育显著地抑制了人原代肝细胞中源自患者的HCVpp的进入。这些数据清楚地证明了抗CLDN1特异性地抑制再感染肝移植体的患者来源的分离体的HCV进入。

为考察抗CLDN1抗体的潜在毒性作用，进行了基于MTT测试的细胞生存力分析。即使在高剂量抗CLDN1抗体下，在基于MTT测试的细胞生存力并列(side-by-side)分析中未观察到毒性作用(图16)。相反，化合物C(已知具有毒性的良好表征的AMPK抑制剂)产生了很易检测到的毒性(图16)。

单克隆抗CLDN1抗体的结合依赖于CLDN1细胞外环中高度保守基序W(30)-GLW(51)-C(54)-C(64)的保守性。最后，申请人目的在于定位单克隆抗CLDN1抗体靶向的表位。为研究抗CLDN1单克隆抗体是否识别相似的或不同的无关表位，使用六种单克隆抗体进行了交叉竞争实验。与浓度增加的对照同种型配对IgG或抗CLDN1单克隆抗体进行预孵育后，对标记的OM-8A9-A3或OM-7D3-B3与Huh7.5.1细胞的结合进行测量。与所有抗CLDN1单克隆抗体的共孵育降低了8A9-A3与细胞表面呈现的抗CLDN1的结合将近80％，然而对照IgG并没有减弱Huh7.5.1细胞的识别(图17A)。不仅对OM-8A9-A3或者OM-7D3-B3，而且对所有使用抑制单克隆抗体的饱和浓度证明的标记OM单克隆抗体均获得类似的结果(图17B)。结合分析得到的结果通过在感染实验中进行交叉竞争实验确认。如图17C所示，不同抗CLDN1抗体的组合在HCV感染抑制的程度上并没有明显的累加或者协同效应。除了确认了结合实验获得的结果外，这些结果还说明所有六个抗CLDN1抗体识别CLDN1细胞外环上类似的或者密切相关的基序。但是，两个单克隆抗体的临时测序数据表明其重链和轻链的序列均有改变(数据未显示)。

为了进一步明确抗体靶向的基序，研究了六种单克隆抗体与Cukierman及其同事描述的一组CLDN1突变型(Cukierman，2009)的相互作用。采用丙氨酸扫描诱变方法，Cukierman及其同事确认CLDN1第一细胞外环中对于由六个不同亚型提取的HCV分离体的进入关键的七个残基。大多数的关键残基属于W(30)-GLW(51)-C(54)-C(64)基序，该基序在所有人紧密连接蛋白中是高度保守(Cukierman，2009)。使用表达野生型和突变型CLDN1分子的瞬时转染BOSC23细胞，申请人证明CLDN1的30，35，49，50，51，54和64位的氨基酸残基被丙氨酸替换急剧降低了单克隆抗体OM-7D3-B3的结合，而其他突变对抗体的相互作用没有影响(图18A)。

先前的研究表明残基I32对于进入是重要的(Evans，2007)且远端D38残基(Cukierman，2009)对于病毒进入同等重要。有趣的是，这些残基的诱变依然使得抗CLDN1抗体能够部分结合(图18)，这说明这些残基对于抗CLDN1-CLDN1的相互作用发挥着较不重要的作用。另外，抗CLDN1与突变CLDN1结合的分析表明Y35残基表现为被抗CLDN1单克隆抗体识别(图18A和B)。对HA-标签表达水平和抗HA抗体(图18AB)的流式细胞分析确认野生型和突变型CLDN1在瞬时转染的BOSC23细胞中的适当表达，除I32A突变体外，该突变体的情况中不存在HA-标签(图18AB)，还采用针对未突变CLDN1C末端域的不相关抗体(突变体I32A：数据未显示)的流式细胞分析评价了CLDN1的表达。对于抗体OM-8A9-A3观察到类似的模式(图18B)。这些结果表明单克隆抗体识别受W(30)-GLW(51)-C(54)-C(64)基序影响的构象依赖性表位，其被确认为HCV进入的关键共残基(Cukierman，2009)。

讨论

首次得到了抗紧密连接蛋白1的细胞外环的单克隆抗体，该抗体有效地交叉中和所有主要基因型的HCV感染。识别强烈依赖于人CLDN1细胞外环1的W(30)-GLW(51)-C(54)-C(64)基序的保守性。该基序是否代表表位或者影响识别的突变是否引起导致该表位丧失或者掩藏的构象改变仍有待确定。抗CLDN1抗体交叉抑制患者个体中的HCV分离体的进入以及使用带有来自四个肝移植过程中HCV再感染的患者的患者来源的包膜糖蛋白的HCVpp选择得到的主要HCV变异体的进入。

目前的和正在研发的靶向于病毒的抗病毒治疗的主要局限在于病毒抗性的迅速产生。在抗病毒和免疫预防策略的开发中的主要挑战是病毒的高度变异性。HCV具有很高的复制率且高度易错的病毒聚合酶使得能够快速产生称为“准种”的小病毒变异体，其可以超出体液免疫和细胞免疫反应并产生赋予对传统抗病毒疗法的抗性的病毒分离体(Aurora，2009)。靶向的关键宿主因子可以是互补性的替代选择。如果发生病毒逃逸，它将由不同的机制和病毒因子组成。抗CLDN1抗体类似地抑制所有基因型和患者个体中的准种的病毒分离体的HCV感染的事实表明不存在抵抗抗CLDN1抗体的预存突变体或基因型。

通过产生有效地交叉中和HCV感染的抗CLDN1抗体，申请人已经证明CLDN1可以作为新型抗病毒策略的靶点的概念验证。因为HCV进入是病毒-宿主相互作用的第一步并且是宿主中和反应的主要靶标，它代表了可以增强以HCV蛋白酶和聚合酶的抑制剂阻断细胞内复制的正在进行的努力的一个很有希望的抗病毒治疗靶点(Stamataki，2008；Timpe和McKeating，2008；Zeisel，2008)。其他病毒感染例如HIV(Este和Telenti，2007)的进入抑制剂的成功临床开发支持了对将病毒进入步骤作为治疗或者预防靶点的重要意义。

单克隆抗体的重要应用可以是预防肝移植后的HCV再感染。肝移植(LT)当前主要的限制在于在移植体的普遍HCV再感染，随之是加速的HCV诱导肝疾病过程(Brown，2005)。目前缺乏防止再感染的预防策略，并且基于干扰素的抗病毒治疗在LT受体中具有有限的疗效和可耐受性(Brown，2005)。由于病毒避开宿主免疫反应并且没有预防性的抗病毒策略，因此移植体的再感染是普遍存在的，并且以加速的肝疾病进程为特征(Brown，2005)。使用人原代肝细胞和带有源自接受肝移植的HCV感染患者的病毒包膜糖蛋白的逆转录HCV假型，申请人之一的小组已经证明了增强的病毒进入和避开抗体介导的中和是肝移植体的HCV再感染过程中病毒变异体选择的关键决定因素(Fafi-Kremer，2009，提交出版)。

在本研究中，申请人已经证明抗CLDN1单克隆抗体有效地抑制在肝移植期间避开了宿主细胞免疫反应的分离体对人原代肝细胞的HCV感染。通过交叉中和的抗CLDN1抗体对避开了患者的中和反应的病毒变异体的有效中和证明了HCV进入是防止移植体再感染的抗病毒策略的可行靶点。该发现进一步得到了最近的HCV感染的人化小鼠模型中的研究的支持，证明了单克隆抗E2和抗CD81抗体能中和遗传多样化的HCV分离体并对抗异源性HCV准种的激发(Meuleman，2008；Law，2008)。因此，给予单克隆的交叉中和抗CLDN1抗体(具有或不具有伴随的抗病毒治疗)可以为防止移植的肝的HCV再感染提供可行的和大有希望的选择。

毒性可以是使用抗受体抗体预防或者治疗HCV感染的潜在限制因素。宿主细胞因子具有可能与病毒的进入机制相关的重要功能。因此，抗体与HCV进入因子的结合可能改变受体的功能或者表达，从而引起副作用。有趣的是，基于MTT测试的细胞生存力并列分析中即使在高剂量的抗CLDN1抗体下也未检测到毒性效应(图16)。在这方面，有趣的是申请人先前已经证明多克隆抗CLDN1抗血清对极化HepG2肝细胞瘤细胞中紧密连接的通透性和完整性无影响(Krieger，2009，提交手稿)。尽管还需要进一步的研究以明确体内毒性，申请人在HCV受纳细胞和人肝细胞上进行的先导毒性研究表明抗CLDN1抗体可以很好地耐受。

抗CLDN1单克隆抗体对HCV感染的中和作用机制是什么？CLDN是紧密连接的关键组成部分，并具有存在四个跨膜结构域、两个细胞外环和一个细胞内环及N末端和C末端胞质域的四跨膜蛋白拓扑结构(Van Itallie和Anderson，2006)。CLDN1细胞外环1(EL1)已证明对于HCV进入是必需的(Evans，2007)，且涉及细胞的屏障功能和影响极化细胞间的孔形成(Krause，2008)。非极化HEK293T细胞的诱变研究证明细胞-细胞接触处的CLDN1的富集可能对于HCV的进入是重要的(Cukierman，2009)。使用多种成像技术和生物化学技术，多个实验室报道了CLDN1与CD81相关。申请人所在实验室最新的数据表明CLDN1通过形成包括有HCV E2、CD81和CLDN1的病毒/共受体复合体介导HCV的进入，这对于病毒进入是必需的(见实施例3)。申请人还证明抗CLDN1抗体通过降低E2与细胞表面的缔合和破坏CD81-CLDN1相互作用中和HCV感染力(见实施例3)。

有趣的是，尽管对于HCVcc(图11)和HCVpp(图12)对Huh7.5.1细胞的感染表现相似的抑制程度，但对HCVpp感染的抑制程度在人原代肝细胞中比Huh7.5.1细胞更为显著(图13-15和数据未显示)。这可能是因为部分极化的人原代肝细胞与非极化的Huh7肝细胞瘤细胞系相比在受体或者共受体复合物的表达有所不同的事实。

交叉竞争抗体结合和感染研究清楚地表明单克隆抗体靶向于密切相关的表位结构域(图17)。使用一组良好表征的CLDN1突变体，申请人证明了用丙氨酸代替在CLDN1 EL1的30、35、49、50、51、54和64位的氨基酸急剧降低单克隆抗体OM-7D3-B3与CLDN1的结合，然而抗体与其他突变体的相互作用完全不受影响或者受影响的程度相对降低(图19)。

这些数据表明单克隆抗体识别存在于包含CLDN1 EL1的W(30)-GLW(51)-C(54)-C(64)的氨基酸残基簇中的表位或者可以通过结构改变造成丧失或掩藏的表位。在前一种情况中，因为这些保守的氨基酸在结构上并非组合在一起，因此很可能识别的表位是构象依赖的。抗体与编码CLDN1 EL1的氨基酸的线性多肽预孵育并不能逆转抗体介导的感染抑制(数据未显示)的发现进一步支持这一假说。另外，通过基因免疫产生的抗CLDN1抗体与线性CLDN1多肽在ELISA检测中未显示出容易检测到的相互作用(数据未显示)。

CLDN1第一细胞外环中鉴别的且为单克隆抗体靶向的残基已证明对于从六个不同亚型提取的HCV分离体的进入是至关重要的(Cukierman，2009)。靶向该表位的抗CLDN1单克隆抗体有效的交叉中和来自六种不同分离体的HCV分离体的进入的事实进一步支持这些CLDN1残基对于HCV进入的重要意义。有趣的是这些残基的丙氨酸替代并不会损害CLDN1的细胞表面表达(Cukierman，2009)。由于通过同样方法产生的多克隆抗体已证明破坏包括HCV E2、CD81和CLDN1的病毒/共受体复合体(实施例3)，可想象的是EL1中的被靶向氨基酸残基在对于病毒进入至关重要的E2-CD81-CLDN1共受体复合体的形成中发挥重要作用。为了解决这一问题，进一步的研究在进行中。

综上所述，已经制备了交叉中和HCV感染的依赖于CLDN1 EL1中的W(30)-GLW(51)-C(54)-C(64)基序的保守性的单克隆抗体。这些结果确定CLDN1 EL1中对于HCV进入至关重要并且可用于阻断病毒感染的抗体的残基。最后，数据显示使用抗-CLDN1单克隆抗体靶向于CLDN1 EL1是一种新颖的预防原发性HCV感染(例如肝脏移植后)的抗病毒方法，并且还可以抑制病毒在慢性感染患者中的扩散。

实施例3：抗CLDN1单克隆抗体的作用机理

材料和方法

细胞系。如实施例2所述。HEK293T/CLDN1+细胞(克隆IIIA6)通过以编码CLDN1 cDNA的pcDNA3.1载体稳定地转染HEK293T细胞而获得。

抗体。如实施例2所述。另外，多克隆大鼠抗SR-BI或CD81抗体按照Zeisel(2007)的描述通过基因免疫获得。R-藻红素偶联的山羊抗大鼠IgG来自Jackson ImmunoResearch Laboratories，小鼠IgG来自Caltag，小鼠抗CD81(JS-81)来自BD Biosciences。

HCV包膜糖蛋白和感染性病毒颗粒的细胞结合。C末端截断的包膜糖蛋白E1和E2的制备以及与靶细胞的结合已经有说明(Haberstroh，2008；Dreux，2009)。对于E2进入因子相互作用的研究，CHO细胞瞬时转染编码SR-BI、CD81或CLDN1的基于pcDNA3的表达载体(Barth，2005)。进入因子的表达按照以前的描述(Barth，2005)使用抗受体抗体通过流式细胞法评价。对于在抗受体抗体存在下包膜糖蛋白结合的研究，将Huh7.5.1细胞(Zhong，2005)与大鼠抗SR-BI、抗CLDN1和抗CD81血清(1/100)或小鼠抗人CD81(JS-81，5μg/mL)或对照抗体(1/100或5μg/mL)一起在室温下预孵育1小时。向细胞中加入重组的E2(30μL浓缩的细胞培养物上清液)或E1(10μg/mL)，在室温下孵育1小时。以PBS洗涤后，使用流式细胞方法和人抗E1(IGH526；Haberstroh，2008)或小鼠抗His(RGS-His，Qiagen)和PE偶联的第二抗体(Dreux，2009；Barth，2008)检测结合的包膜糖蛋白。对于HCVcc与受纳Huh7.5.1细胞的结合研究，在与使用梯度超离心从细胞培养物上清液部分纯化的HCVcc(Jc1株)孵育前，将Huh7.5.1细胞与肝素、大鼠抗CLDN1、大鼠抗SR-BI或对照大鼠预免疫血清(PI)(均稀释1/100)一起在室温下预孵育1小时。在与HCVcc一起孵育后，通过以PBS洗涤细胞除去未结合的HCVcc。然后按照Ploss等人(2009)的描述通过细胞结合HCV-RNA的RT-PCR定量HCVcc的结合。

使用荧光共振能量转移(FRET)的受体缔合。CD81和CLDN1的同型和异型相互作用按照描述的(Harris，2008；Mee，2009)进行分析。简要而言，经转导以表达AcGFP和DsRED标记的CD81和CLDN1的HEK293T细胞在玻璃盖玻片上生长，并以冰冻的甲醇固定。细胞在Zeiss meta头LSCM上成像，采用对于各荧光蛋白优化的显微镜设置以获得最高的信噪比。对于FRET分析，使用FRET的渐进受体光漂白方法，这需要随着时间逐渐光漂白DsRED荧光体，同时监测AcGFP的荧光强度(Harris，2008)。在背景和串扰校正后，在DsRED光漂白后的AcGFP强度的增加是由于蛋白间的FRET，从而暗示小于10nm的距离。FRET百分比定义为显示FRET的像素的数量与细胞质膜上分析的像素的总数量的比(Harris，2008)。质膜处AcGFP和DsRED标记的CD81和CLDN1(任意的荧光单位/像素)的强度提供了每细胞500至1000个测量。来自10个细胞的数据进行标准化并且计算局部性表达。

结果：

在不存在CLDN1-E2相互作用的情况下抗CLDN1抑制包膜糖蛋白E2和感染性病毒颗粒与HCV受纳细胞的结合。为研究抗CLDN1抗体是否可以干扰E2与受纳细胞系的结合，在抗受体或对照抗体存在的情况下使用重组E1和E2糖蛋白进行结合研究。如图20B所示，抗CD81、抗CD81及抗SR-BI和抗CLDN1抑制E2与Huh7.5.1细胞的结合。相反，预免疫的或不相关的对照血清无作用(图20A-C)。有趣的是，E2与Huh7.5.1细胞结合的抑制强度(图20C)与HCV感染的抑制强度相关，这表明对E2-细胞表面相互作用的结合的抑制提供了抗CLDN1抗体的中和活性的作用机理。感染性病毒颗粒的这些观察的重要意义进一步通过使用HCVcc的结合研究确认(图20E)。相反，E1的结合不受抗CLDN1的影响(图20D)。

为研究E2与受纳细胞系结合的抗体抑制是否可归因于CLDN1与E2的相互作用，申请人研究了CLDN1是否能够结合重组的截短糖蛋白E2。为解决这个问题，CHO细胞经工程化以表达人CLDN1、SR-BI或CD81(图21A)。人CD81或人SR-BI的细胞表面表达使得E2与CHO细胞结合(图21B)，而CLDN1的表达没有作用(图21B)。这些数据表明CLDN1不直接与HCV包膜糖蛋白E2相互作用，且E2-细胞表面相互作用的抗体阻断可以通过间接机制介导。

抗CLDN1抗体抑制CLDN1-CD81共受体的缔合。由于抗CLDN1抗体在不存在直接的CLDN1-E2相互作用的情况下抑制E2与HCV受纳细胞的结合(图21B)，申请人假设抗CLDN1抗体可干扰CD81-CLDN1共受体复合物。为评价抗CLDN1抗体是否改变CLDN1-CD81的缔合，将HEK293T细胞转染以表达Ac-GFP-CD81和DsRED-CD81或者AcGFP-CLDN1和DsRED-CD81或者AcGFP-CLDN1和DsRED-CLDN1，与预免疫血清和抗CLDN1血清(1/100和1/400)一起孵育，并通过FRET分析共受体的相互作用。如图22所示，抗CLDN1抗体以剂量依赖的方式显著地降低CD81和CLDN1之间的FRET。细胞与对照血清一起预孵育不改变CD81-CLDN1共受体的相互作用。如与抗CLDN1血清一起预孵育后CD81-CD81和CLDN1-CLDN1间未变化FRET显示的，CD81-CLDN1共受体相互作用的抑制是特异性的。总之，这些数据表明抗CLDN1抗体干扰CD81-CLDN异二聚体的缔合。

讨论

CLDN1是导致HCV进入的重要的辅因子。但是，CLDN1在多步骤进入过程中的准确作用仍然所知甚少。申请人使用表达人HCV进入因子的转染CHO细胞，证明了CLDN1与CD81和SR-BI相反，其不与细胞表面上的包膜糖蛋白直接相互作用。使用基于FRET的系统来研究CD81-CLDN1共受体的缔合，中和本发明的抗CLDN1抗体显示出特异性地扰乱CD81-CLDN1 FRET(图22)。

这些数据表明靶向CLDN1的抗体通过减少E2与细胞表面的缔合以及减少CD81-CLDN1的相互作用中和HCV感染力。CD81-CLDN1共受体复合物对于HCV进入是关键的，且CLDN1可以经E2相互作用增强CD81与HCV颗粒的缔合。这也提供了针对E2-CD81-CLDN1相互作用的抗病毒策略的新途径。

实施例4：在感染后加入时，抗CLDN1单克隆抗体抑制HCV细胞-细胞传播和阻断病毒播散

材料和方法

细胞-细胞传播分析。Huh7.5.1细胞由F.Chisari博士(The Scripps Research Institute，USA；Zhong，2005)提供，并且按照Zeisel(2007)、Barth(2008)和Dimitrova(2008)的描述培养。Huh7 GFP细胞由Patel博士(University of Glasgow，UK；Witteveldt，2009)提供。源自Huh7的细胞系通过如下获得：用携带有增强的绿色荧光蛋白(EGFP)的逆转录病毒载体转导，然后在补充有300μg G418/mL的培养基中进行选择(Witteveldt，2009)。为检测HCV的细胞-细胞传播，接种新电穿孔的Huh7.5.1细胞并且孵育24小时，然后在加入含有10μg/mL的抗CLDN1抗体的EGFP表达受体细胞前，以培养基洗涤以除去残留的细胞-表面结合HCV。共培养的细胞生长到汇合(confluency)，胰蛋白酶化，以1％的多聚甲醛固定并以0.1％的皂苷渗透化以进行FACS分析。细胞使用小鼠抗核抗体染色，然后以藻红素(PE)-偶联的第二抗体染色以进行FACS分析，如之前对于SR-BI所述(Barth，2006；Barth，2008)。

结果和讨论

一般而言，病毒可以在宿主内通过两种机制播散，包括无细胞病毒颗粒的释放及感染的细胞和未感染细胞之间的直接传递。直接的细胞-细胞传递由于消除了病毒生命循环中的限速早期步骤，例如病毒颗粒的附着，因此被认为比无细胞扩散更加快速和有效。而且，病毒感染力的细胞-细胞传递可使得病毒避开免疫反应元素，例如中和抗体。

最近的研究显示肝细胞瘤细胞的HCV感染导致了通过细胞-细胞接触强化的感染聚焦区域，这显示了临近细胞间的局部传播。事实上，使用标记的生产者或受体细胞，两个实验室已经证明HCV可通过无细胞病毒感染和细胞间的直接转移两种方式在体外传播，后一方式提供了避开中和抗体的新途径(Timpe，2008；Witteveldt，2009)。

为评价抗CLDN1单克隆抗体抑制细胞-细胞间的传播的能力，基于表达绿色荧光蛋白(GFP)的标记受体细胞建立了HCV细胞-细胞传播分析。在该分析中，HCV生产者细胞在存在或不存在抗受体抗体的情况下与GFP标记的受体细胞共培养。该分析通过以抗CD81抗体阻断无细胞病毒传播(Timpe，2008；Witteveldt，2009)，使得能够通过在FACS分析中定量HCV+、GFP+受体细胞研究抗病毒剂对细胞-细胞传播的特异性作用。

生产者和受体细胞在不存在抗体(或对照抗体)的情况下共培养24小时后，所有细胞的43.6％对应于HCV+GFP+受体细胞(图23A)。当通过抗CD81抗体阻断无细胞传播时(图23B)，HCV GFP+受体细胞的数量降低至6.20％。这些细胞对应于专门地由细胞-细胞间传播所感染的细胞，如另外两个实验室(Timpe，2008；Witteveltd，2009)和申请人的实验室(Baumert，未公开的实验结果)之前所显示的。如图23C所示，抗CLDN1单克隆抗体显著地降低了HCV+，GFP+受体细胞的数量。加入抗CLDN1单克隆抗体7D3将HCV感染的GFP+受体细胞的百分比从6.20％降低至2.98％，这表明抗CLDN1单克隆抗体能降低由细胞-细胞传播的感染超过50％。相反，同种型对照抗体没有作用(数据未显示)。这些结果表明抗CLDN1单克隆抗体抑制HCV细胞-细胞间的传播。

为确定这一发现对于感染性组织培养系统中的病毒扩散的意义，申请人在Huh7.5.1细胞中进行了时程实验。为研究单克隆抗CLDN1抗体对病毒扩散的作用，在细胞以无细胞病毒感染后4小时加入抗CLDN1单克隆抗体OM-7D3。如图24所示，抗CLDN1单克隆抗体有效地抑制病毒扩散。然而感染后Huh7.5.1细胞与同种型对照抗体一起孵育导致病毒载量在7天的时间内以时间依赖性的方式增加(＞10⁶相对光单位)，加入感染后抗CLDN1导致病毒载量接近于检测限的低水平(大约10³相对光单位)。这些数据进一步表明了抗CLDN1抗体对感染性细胞培养系统中病毒扩散的细胞-细胞传播的作用的重要意义，并且表明本发明抗CLDN1单克隆抗体不但可以用于防止HCV感染，而且可以用于控制慢性病毒感染。

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其它实施方式

本发明的其它实施方式在考虑了本文公开的本发明的说明或实施本发明后对于本领域技术人员将会是明显的。说明书和实施例意图被视为仅是示例性的，本发明的真实范围由下述权利要求指明。

Claims (24)

1.杂交瘤细胞系，于2008年7月29日保藏于DSMZ，保藏号选自：DSM ACC2931、DSM ACC2932、DSM ACC2933、DSM ACC2934、DSM ACC2935、DSM ACC2936、DSM ACC2937和DSM ACC2938。

2.由于2008年7月29日保藏于DSMZ的保藏号选自：DSM ACC2931、DSM ACC2932、DSM ACC2933、DSM ACC2934、DSM ACC2935、DSM ACC2936、DSM ACC2937和DSM ACC2938的杂交瘤细胞系分泌的单克隆抗体或与紧密连接蛋白1细胞外域结合的其生物活性片段。

3.根据权利要求2所述的单克隆抗体或其生物活性片段，其中所述单克隆抗体或生物活性片段与强烈地依赖于紧密连接蛋白1第一胞外环中的保守基序W(30)-GLW(51)-C(54)-C(64)的保守性的表位结合。

4.根据权利要求2或3所述的单克隆抗体或其生物活性片段，其中所述单克隆抗体或其生物活性片段不与啮齿动物的紧密连接蛋白1结合，但是与非人类灵长动物紧密连接蛋白1结合。

5.根据权利要求2-4中任一项所述的单克隆抗体或其生物活性片段，其中所述单克隆抗体是人源化的、去免疫化的或嵌合的。

6.根据权利要求2-4中任一项所述的单克隆抗体或其生物活性片段，其中所述单克隆抗体是人源化的、去免疫化的或嵌合的，并且包含源自所述分泌的单克隆抗体的互补决定区(CDR)或其部分。

7.根据权利要求2-6中任一项所述的单克隆抗体或其生物活性片段，其中所述单克隆抗体或其片段抑制HCV包膜糖蛋白E2或感染性病毒颗粒与HCV受纳细胞系结合。

8.根据权利要求2-7中任一项所述的单克隆抗体或其生物活性片段，其中所述单克隆抗体或其片段抑制CD81-紧密连接蛋白-1的缔合或多重缔合。

9.根据权利要求2-8中任一项所述的单克隆抗体或其生物活性片段，其中所述单克隆抗体或其片段抑制HCV的细胞间传播以及病毒播散。

10.包含权利要求2-9中任一项所述的单克隆抗体或其生物活性片段的分子，其中任选地将所述单克隆抗体或其片段与可检测部分或治疗剂连接。

11.根据权利要求2-9中任一项所述的单克隆抗体或其生物活性片段或根据权利要求10所述的分子，用于防止细胞的HCV感染。

12.根据权利要求2-9中任一项所述的单克隆抗体或其生物活性片段或根据权利要求10所述的分子，用于在受试者中防止或治疗HCV感染或HCV相关疾病。

13.根据权利要求12所述的单克隆抗体或其生物活性片段，用于控制慢性HCV感染。

14.根据权利要求12所述的单克隆抗体或其生物活性片段，用于抑制HCV慢性感染患者中存在的整个准种群的感染。

15.根据权利要求12-13中任一项所述的单克隆抗体或其生物活性片段，其中HCV感染是由于具有选自基因型1、基因型2、基因型3、基因型4、基因型5和基因型6的表型的HCV。

16.根据权利要求15所述的单克隆抗体或其生物活性片段，其中HCV感染是由于具有选自亚型1a、亚型1b、亚型2a、亚型2b、亚型2c、亚型3a、亚型4a-f、亚型5a和亚型6a的亚型的HCV。

17.根据权利要求2-9中任一项所述的单克隆抗体或其生物活性片段或根据权利要求10所述的分子，用于防止肝移植患者中的HCV再感染和复发。

18.药物组合物，包含有效量的根据权利要求2-9中任一项所述的单克隆抗体或其生物活性片段或根据权利要求10所述的分子，以及至少一种可药用载体或赋形剂。

19.根据权利要求18所述的药物组合物，其适应于与至少一种抗病毒剂组合使用。

20.根据权利要求18所述的药物组合物，其还包含至少一种抗病毒剂。

21.根据权利要求19或20所述的药物组合物，其中所述抗病毒剂选自：干扰素、利巴韦林、抗丙型肝炎病毒单克隆抗体、抗丙型肝炎病毒多克隆抗体、RNA聚合酶抑制剂、蛋白酶抑制剂、IRES抑制剂、解旋酶抑制剂、反义化合物、核酶及其任何组合。

22.药物试剂盒，包含根据权利要求2-9中任一项所述的单克隆抗体或其生物活性片段或根据权利要求10所述的分子。

23.用于检测生物样品中的紧密连接蛋白-1的试剂盒，包含根据权利要求2-9中任一项所述的单克隆抗体或其生物活性片段的分子，其中所述单克隆抗体或其片段与可检测部分连接。

24.用于检测生物样品中紧密连接蛋白-1的试剂盒，包含根据权利要求10所述的分子，其中所述单克隆抗体或其片段与可检测部分连接。

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