CN107614527A - 抗人膜类型adam28抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明提供由SEQ ID NO:2代表的氨基酸序列中第524个至第659个氨基酸的区域中的表位处特异性结合人膜锚定型ADAM28的活性的抗体。本发明还提供了用于递送药物至可以表达人膜类型ADAM28的细胞或组织的药物递送介质，所述药物递送介质包含抗体。

Description

抗人膜类型ADAM28抗体
[技术领域]
本发明涉及抗人膜锚定型ADAM28抗体及其用途。
[背景技术]
导弹疗法，其包括将抗肿瘤化合物诸如化疗剂、放射性同位素、毒素等结合至针对特异性表达于癌细胞中的抗原的单克隆抗体，并选择性将其递送至靶标已进入实践阶段。在导弹疗法中，期望抗肿瘤化合物的副作用降低，因为可以选择性攻击癌组织同时抑制正常细胞摄入抗肿瘤化合物。作为靶向癌症的导弹疗法中所用的抗体，KADCYLA（曲妥珠单抗Emtansine）等是已知的。由于存在多种癌细胞，因此希望拥有许多可用于导弹疗法的抗体的变种以能够应对靶癌细胞的抗原表达模式。
ADAM蛋白（ADAM：解聚素和金属蛋白酶）是参与跨膜蛋白的胞外域脱落、细胞粘附和浸润的多功能性蛋白（非专利文献1、2）。人基因组含有25个ADAM（包括四个假基因），且21种的ADAM包括13种展示蛋白水解活性的蛋白水解ADAM以及8种非蛋白水解ADAM（非专利文献1、3）。蛋白水解ADAM具有基质金属蛋白酶（MMP）的金属蛋白酶结构域，并且典型的蛋白水解ADAM蛋白包含前肽、金属蛋白酶、解聚素样、富含半胱氨酸、表皮生长因子样、跨膜和胞质结构域（非专利文献3-9）。许多蛋白水解ADAM（包括ADAM8、ADAM9、ADAM12、ADAM15、ADAM17、ADAM9和ADAM28）在人癌症中过表达并且与肿瘤生长和进展相关（非专利文献5、9）。本发明人的前期研究已表明ADAM28（也称为ADAM金属蛋白酶结构域28）在人非小细胞肺癌和乳腺癌中大量表达（非专利文献12、13），所述ADAM28具有两个可选的同种型，包括原型膜锚定形式（ADAM28m）和短的分泌形式（ADAM28s）（非专利文献5、10、11）。通过原位杂交和免疫组织化学，本发明人已证实ADAM28主要表达于包含在癌组织中的癌细胞内，并且ADAM28 mRNA表达水平与乳腺癌的细胞增殖（非专利文献13）和非小细胞肺癌中的癌细胞的增殖和浸润（非专利文献12）相关。在平行研究中，本发明人显示非小细胞肺癌患者中的血清ADAM28水平实质上随肿瘤进展、淋巴结转移和癌复发而增加（非专利文献14）。这些数据暗示ADAM28参与特别是人癌症中的细胞增殖和转移。本发明人已证实ADAM28通过选择性消化IGF-I/IGFBP-3复合体中的IGF结合蛋白-3(IGFBP-3)经胰岛素样生长因子I（IGF-I）的生物利用率增加而促进癌细胞增殖（非专利文献13）和通过消化乳腺癌中的结缔组织生长因子而促进血管发生（非专利文献15）。
本发明人获得了抗人ADAM28抗体，其显示针对癌细胞的优异的增殖抑制作用和癌转移抑制作用（专利文献1）。
[文献列表]
[专利文献]
[专利文献1]WO 2014/073292 A1
[非专利文献]
[非专利文献1]Mol Aspects Med.2008; 29 (5):258-289
[非专利文献2]Semin Cell Dev Biol.2009; 20 (2):138-145
[非专利文献3]Pathol Int. 2010; 60 (7):477-496
[非专利文献4]Genes Dev.2003; 17 (1):7-30
[非专利文献5]Cancer Sci.2007; 98 (5):621-628
[非专利文献6]Nat Rev Mol Cell Biol.2005; 6 (1):32-43
[非专利文献7]Kelley’s Textbook of Rheumatology.8th ed. Philadelphia, PA:Elsevier Saunders; 2009:115-134
[非专利文献8]Curr Opin Cell Biol.2003; 15 (5):598-606
[非专利文献9]Nat Rev Cancer.2008; 8 (12):929-941
[非专利文献10]J Biol Chem.1999; 274 (41):29251-29259
[非专利文献11]Curr Pharm Des.2009; 15 (20):2349-2358
[非专利文献12]Int J Cancer.2006; 118 (2):263-273
[非专利文献13]Cancer Res.2006; 66 (20):9913-9920
[非专利文献14]Int J Cancer.2010; 127 (8):1844-1856
[非专利文献15]Biochem Biophys Res Commun.2010; 402 (4):651-657。
[发明概述]
[本发明待解决问题]
本发明人研究了之前获得的抗ADAM28抗体（专利文献1）在导弹疗法中的有用性。结果是，证实抗人ADAM28抗体结合表达膜锚定型ADAM28（ADAM28m）的癌细胞并且可用于导弹疗法中作为递送抗肿瘤化合物至癌细胞的载体，而表达膜锚定型ADAM28的癌细胞在许多情况下也同时表达分泌型ADAM28（ADAM28s），并且该分泌型ADAM28与膜锚定型ADAM28竞争结合抗ADAM28抗体，并且可以抑制抗ADAM28抗体与癌细胞的结合。包含抗ADAM28抗体和抗肿瘤化合物的缀合物与血流中的分泌型ADAM28的结合不仅使得缀合物无法递送抗肿瘤化合物至靶癌细胞，而且还产生了诱导副作用的风险，因为抗肿瘤化合物被掺入到正常细胞中。
本发明的目标是提供可用于表达膜锚定型ADAM28的癌细胞的导弹疗法的抗ADAM28抗体。
[解决问题的方法]
本发明人已经进行了大量研究尝试解决上述问题并且通过用对于人膜锚定型ADAM28特异性的结构域的重组蛋白免疫小鼠、从免疫的淋巴细胞中建立杂交瘤并选择特异性与免疫原反应的克隆而成功建立了这样的单克隆抗体，所述抗体特异性结合人膜锚定型ADAM28，且不结合人分泌型ADAM28。所获得的单克隆抗体对人膜锚定型ADAM28具有高结合活性，并且可用作靶向表达人膜锚定型ADAM28的癌细胞的导弹疗法中的递送媒介物。本发明人基于以上发现已进一步研究并完成本发明。
即，本发明涉及以下内容。
[1] 抗体，其具有在SEQ ID NO: 2中显示的氨基酸序列中第524个至第659个氨基酸的区域中的表位处特异性结合人膜锚定型ADAM28的活性。
[2] [1]的抗体，其中所述表位在SEQ ID NO: 2中显示的氨基酸序列中的第536个至第543个氨基酸的区域中。
[3] [1]或[2]的抗体，其不具有结合人分泌型ADAM28的活性。
[4] [1]-[3]的抗体，其包含轻链可变区和重链可变区，其中
（1）所述轻链可变区包含含有SEQ ID NO: 5中显示的氨基酸序列的CDR1、含有SEQ IDNO: 6中显示的氨基酸序列的CDR2和含有SEQ ID NO: 7中显示的氨基酸序列的CDR3，和
所述重链可变区包含含有SEQ ID NO: 8中显示的氨基酸序列的CDR1、含有SEQ ID NO:9中显示的氨基酸序列的CDR2和含有SEQ ID NO: 10中显示的氨基酸序列的CDR3，或
（2）所述轻链可变区包含含有SEQ ID NO: 5中显示的氨基酸序列的CDR1、含有SEQ IDNO: 6中显示的氨基酸序列的CDR2和含有SEQ ID NO: 7中显示的氨基酸序列的CDR3，和
所述重链可变区包含含有SEQ ID NO: 8中显示的氨基酸序列的CDR1、含有SEQ ID NO:9中显示的氨基酸序列的CDR2和含有SEQ ID NO: 10中显示的氨基酸序列的CDR3，
除了选自SEQ ID NOs: 5、6和7中显示的氨基酸序列的至少一个氨基酸序列中取代、缺失、插入和/或添加1-3个氨基酸，和/或
选自SEQ ID NOs: 8、9和10中显示的氨基酸序列的至少一个氨基酸序列中取代、缺失、插入和/或添加1-3个氨基酸。
[5] [4]的抗体，其中所述轻链可变区包含SEQ ID NO: 11中显示的氨基酸序列，并且所述重链可变区包含SEQ ID NO: 12中显示的氨基酸序列。
[6] 包含[1]-[5]中任一项的抗体的药物组合物。
[7] 用于递送药物至表达人膜锚定型ADAM28的细胞或组织的药物递送媒介物，其包含[1]-[5]中任一项的抗体。
[8] [7]的药物递送媒介物，其中所述细胞或组织进一步表达人分泌型ADAM28。
[9] [7]或[8]的药物递送媒介物，其中所述细胞或组织是癌细胞或癌组织。
[10] 组合物，其包含含有药物和[1]-[5]中任一项的抗体的免疫复合体，用于递送药物至表达人膜锚定型ADAM28的细胞或组织。
[11] [10]的组合物，其中所述细胞或组织进一步表达人分泌型ADAM28。
[12] [10]或[11]的组合物，其中所述细胞或组织是癌细胞或癌组织。
[13] 递送药物至人中表达人膜锚定型ADAM28的细胞或组织的方法，其包括施用含有药物和[1]-[5]中任一项的抗体的免疫复合体至人。
[14] [1]-[5]中任一项的抗体，其用于介导递送药物至表达人膜锚定型ADAM28的细胞或组织。
[15] [1]-[5]中任一项的抗体用于制备递送药物至表达人膜锚定型ADAM28的细胞或组织的药物递送媒介物的用途。
[16] 多核苷酸，其编码[1]-[5]中任一项的抗体。
[17] 载体，其包含[16]的多核苷酸。
[18] 转化体，其包含[17]的载体。
[发明效果]
根据本发明，提供了特异性结合人膜锚定型ADAM28且可用于表达膜锚定型ADAM28的癌细胞的导弹疗法的抗ADAM28抗体。
[附图简述]
图1显示转染有人膜锚定型ADAM28的CHO-K1细胞的2B6D10抗体染色图像。
图2显示转染有人膜锚定型ADAM28的CHO-K1细胞的2B6D10抗体染色图像。
图3显示转染有小鼠膜锚定型ADAM28的CHO-K1细胞的2B6D10抗体染色图像。
图4显示通过ELISA的2B6D10抗体与人膜锚定型ADAM28和小鼠膜锚定型ADAM28的反应性的比较。
实施方案描述
本发明提供具有特异性结合人膜锚定型ADAM28的活性的抗体。
ADAM28是已知蛋白，并且其氨基酸序列和其cDNA序列也是已知的。ADAM28包括膜型（ADAM28m）和分泌型（ADAM28s）两种。人膜锚定型ADAM28的代表性氨基酸序列显示于SEQID NO: 2，人膜锚定型ADAM28的代表性cDNA序列显示于SEQ ID NO: 1，人分泌型ADAM28的代表性氨基酸序列显示于SEQ ID NO: 4，并且人分泌型ADAM28的代表性cDNA序列显示于SEQ ID NO: 3。人膜锚定型ADAM28（成熟形式）的代表性氨基酸序列显示于SEQ ID NO: 22，人膜锚定型ADAM28（成熟形式）的代表性cDNA序列显示于SEQ ID NO: 21，人分泌型ADAM28（成熟形式）的代表性氨基酸序列显示于SEQ ID NO: 24，并且人分泌型ADAM28（成熟形式）的代表性cDNA序列显示于SEQ ID NO: 23。SEQ ID NO: 22对应于SEQ ID NO: 2的第199个至第775个氨基酸。
“人膜锚定型ADAM28”意指膜锚定型ADAM28的氨基酸序列或核苷酸序列具有与天然表达于人中的膜锚定型ADAM28的氨基酸序列或核苷酸序列相同或实质上相同的氨基酸序列或核苷酸序列。“实质上相同”意指目标氨基酸序列或核苷酸序列与天然表达于人中的膜锚定型ADAM28的氨基酸序列或核苷酸序列具有不少于70%（优选不少于80%、更优选不少于90%、更优选不少于95%、最优选不少于99%）的同一性，并且具有人膜锚定型ADAM28的功能。除人之外的生物物种、除膜锚定型ADAM28之外的蛋白和基因以及其片段的术语也以相同方式进行解释。
抗体与抗原X的“特异性结合”意指抗原与抗原X在抗原-抗体反应中的结合亲和力高于与非特异性抗原（例如，牛血清白蛋白（BSA））的结合亲和力。
在一个实施方案中，本发明的抗体与人膜锚定型ADAM28在抗原-抗体反应中的结合亲和力的KD 值不超过1×10-7 M (例如，不超过1×10-8 M，不超过1×10-9 M，不超过1×10-10 M，不超过1×10-11 M)。
本发明的抗体在SEQ ID NO: 2中显示的氨基酸序列中第524个至第659个氨基酸的区域中的表位处特异性结合人膜锚定型ADAM28。本发明的抗体优选在SEQ ID NO: 2中显示的氨基酸序列中第536个至第543个氨基酸的区域中的表位处特异性结合人膜锚定型ADAM28。SEQ ID NO: 2中显示的氨基酸序列中的第524个至第659个氨基酸的区域和SEQ IDNO: 2中显示的氨基酸序列中的第536个至第543个氨基酸的区域存在于人膜锚定型ADAM28中，但不存在于人分泌型ADAM28中。因此，本发明的抗体不具有结合人分泌型ADAM28的活性。在一个实施方案中，本发明的抗体与人分泌型ADAM28在抗原-抗体反应中的结合亲和力的KD 值不小于1×10-5 M (例如，不小于1×10-4 M，不小于1×10-3 M，不小于1×10-2 M，不小于1×10-1 M)。
本发明的抗体任选具有特异性结合小鼠膜锚定型ADAM28的活性。具有与小鼠膜锚定型ADAM28的交叉反应性，通过使用小鼠的涉及本发明的抗体的药效和安全性的实验结果可以容易地推广到人中。SEQ ID NO: 2中显示的氨基酸序列的第524个至第659个氨基酸的区域在人ADAM28和小鼠ADAM28之间高度保守。因此，本领域普通技术人员可以从本发明的抗体获得具有与小鼠膜锚定型ADAM28的交叉反应性的抗体而无需过度实验。当本发明的抗体具有与小鼠膜锚定型ADAM28的交叉反应性时，本发明的抗体与小鼠膜锚定型ADAM28在抗原-抗体反应中的结合亲和力的KD 值不超过1×10-7 M (例如，不超过1×10-8 M，不超过1×10-9 M，不超过1×10-10 M，不超过1×10-11 M)。小鼠膜锚定型ADAM28的代表性氨基酸序列显示于SEQ ID NO: 26，并且小鼠锚定型ADAM28的代表性cDNA序列显示于SEQ ID NO: 25。
在一个实施方案中，当本发明的抗体具有与小鼠膜锚定型ADAM28的交叉反应性时，本发明的抗体与人膜锚定型ADAM28在抗原-抗体反应中的结合亲和力的KD值不超过1×10-7 M (例如，不超过1×10-8 M，不超过1×10-9 M，不超过1×10-10 M，不超过1×10-11 M)，并且本发明的抗体与小鼠膜锚定型ADAM28在抗原-抗体反应中的结合亲和力的KD值不超过1×10-7 M (例如，不超过1×10-8 M，不超过1×10-9 M，不超过1×10-10 M，不超过1×10-11M)。
抗体与抗原（例如，人膜锚定型ADAM28、小鼠膜锚定型ADAM28）在抗原-抗体反应中的结合亲和力的KD值可以例如通过用BIAcore 3000 (GE Healthcare Life Sciences)的表面等离子共振通过测量Ka值和Kd值，并从获得的Ka值和Kd值计算来获得。在KD值的测量中，不仅可以使用全长抗原，而且还可能使用含有表位的抗原片段、其他蛋白和抗原或其含有表位的片段的融合蛋白。例如，当测量抗体针对人膜锚定型ADAM28和小鼠膜锚定型ADAM28的KD值时，将其中人膜锚定型ADAM28 (SEQ ID NO: 2)的524-659的区域与MBP的C末端融合的融合蛋白(MBP-人ADAM28m 524-659)和其中小鼠膜锚定型ADAM28 (SEQ ID NO:26)的527-622的区域与MBP的C末端融合的融合蛋白(MBP-小鼠ADAM28m 527-622)各自通过胺偶联固定在CM5传感器芯片(GE Healthcare Life Sciences, Buckinghamshire, UK)上，将评价靶抗体通过使用BIAcore 3000注射至流通池，测量Ka和Kd值，从获得Ka和Kd值计算KD值，并将这些作为评价靶抗体针对人膜锚定型ADAM28和小鼠膜锚定型ADAM28的KD值。
SEQ ID NO: 2中显示的氨基酸序列中的第536个至第543个氨基酸的区域对应于小鼠膜锚定型ADAM28 (SEQ ID NO: 26)的第539个至第546个氨基酸的区域。在该区域中，人膜锚定型ADAM28和小鼠膜锚定型ADAM28之间所有氨基酸均相同，除了丝氨酸（人膜锚定型ADAM28 (SEQ ID NO: 2)的第539个氨基酸）被苏氨酸（小鼠膜锚定型ADAM28 (SEQ IDNO: 26)的第541个氨基酸）的保守取代。因此，具有在SEQ ID NO: 2中显示的氨基酸序列中第536个至第543个氨基酸的区域中的表位处特异性结合人膜锚定型ADAM28的活性的抗体可以具有与小鼠膜锚定型ADAM28的交叉反应性。
在本说明书中，将“抗体”用作涵盖全长抗体和其任何抗原结合片段（即，“抗原结合部分”）或其单链的抗体。“抗体”指含有至少两条重链（H）和两条轻链（L）（其通过二硫键连接）的糖蛋白或其抗原结合部分。每一重链由重链可变区（本文缩写为VH）和重链恒定区构成。重链恒定区由三个结构域CH1、CH2和CH3构成。每一轻链由轻链可变区（本文缩写为VL）和轻链恒定区构成。轻链恒定区由单一结构域CL构成。VH和VL区进一步细分为称为互补决定区（CDR）的具有更高可变性的区域，其含有散布于期间的称为框架区（FR）的更加保守的区域。每一VH和VL 由3个CDR和4个FR构成，其以以下次序排列，即，从氨基端至羧基端为FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。所述重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子包括免疫系统的各种细胞（例如，效应细胞）和经典补体系统的第一组分（Clq）的结合。
在本说明书中，抗体的“抗原结合部分”用于指保留特异性结合抗原（例如，人膜锚定型ADAM28）的能力的抗体的一个或多个片段。已经阐明抗体的抗原结合功能由全长抗体的该片段行使。包括在术语抗体的“抗原结合部分”中的结合片段的实例包括（i）Fab片段，由VL、VH、CL 和CH1结构域构成的单价片段，(ii) F(ab’)2片段，含有在铰链区中通过二硫键连接的两个Fab片段的二价片段，(iii) Fab’片段，具有铰链区部分的内在Fab (参见FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY, Paul编辑，第三版， 1993), (iv) Fd片段，由VH和CH1结构域构成，(v) Fv片段，由在抗体的单臂中的VL和VH结构域构成，(vi) dAb片段，其由VH结构域构成(Ward 等人, (1989) Nature 341:544-546), (vii)分离的互补决定区（CDR）和(viii)纳米抗体，其为含有单一可变结构域和两个恒定结构域的重链可变区。尽管VL 和 VH（其为Fv片段的两个结构域）由不同基因编码，但它们可以通过合成接头连接以通过重组技术由其产生单一蛋白链，其中，在该链中，VL和VH区彼此配对以形成单价分子(称为单链Fv (scFv);参见，例如，Bird 等人(1988) Science 242:423-426; 和Huston 等人, (1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883)。此类单链抗体也包括在抗体的“抗原结合部分”中。此类抗体片段由本领域普通技术人员通过已知的常规技术获得并且以如未修饰抗体的相同方式筛选有用性。
本发明的抗体可以是多克隆抗体（抗血清）和单克隆抗体的任一种并且优选为单克隆抗体。“单克隆抗体”指单一分子组成的抗体分子的制备物。单克隆抗体组成显示对特定表位的单一结合特异性和亲和力。抗体可以是IgG、IgM、IgA、IgD或IgE等的任何同种型，且优选为IgG或IgM。
单克隆抗体可以通过细胞融合方法产生。例如，含有SEQ ID NO: 2中显示的氨基酸序列的第524个至第659个氨基酸的区域或第536个至第543个氨基酸的区域的分离的多肽作为抗原连同佐剂皮下或腹膜内施用于小鼠2-4次，最后一次施用后3天收集脾或淋巴结，并且回收淋巴细胞（B细胞）。将淋巴细胞（B细胞）和骨髓瘤细胞（例如NS-1、P3X63Ag8等）融合以得到产生针对该抗原的单克隆抗体的杂交瘤。细胞融合可以通过PEG方法或电压脉动方法(voltage pulsation method)来进行。产生目标单克隆抗体的杂交瘤可以通过众所周知的EIA或RIA方法等通过从培养上清液中检测特异性结合抗原的抗体来选择。产生单克隆抗体的杂交瘤可以体外、或在小鼠或大鼠体内、优选在小鼠腹水等中培养，并且可以从杂交瘤的培养上清液和动物的腹水中获得抗体。
本发明的抗体可以是人源化抗体。在本说明书中，此外，“人源化抗体”是通过遗传工程产生的单克隆抗体，其表示这样的单克隆抗体，其中其可变区中的互补决定区部分或全部来源于除了人之外的动物物种（例如小鼠）的免疫球蛋白且可变区的其框架区和恒定区来源于人免疫球蛋白。换言之，例如，其表示其中除了部分或全部小鼠单克隆抗体的可变区中的互补决定区之外的全部区域均被人免疫球蛋白的相应部分替代的单克隆抗体。
人源化抗体可以根据本身已知的方法来产生。例如，来源于小鼠单克隆抗体的重组人源化抗体可以根据之前报道（例如，国际专利申请号4-506458和JP-A-62-296890的国家公开）来产生。具体地，对应于小鼠H链CDR基因的至少一个小鼠H链CDR基因和至少一个小鼠L链CDR基因分离自产生小鼠单克隆抗体的杂交瘤，并且编码除了对应于上述小鼠H链CDR的人H链CDR之外的所有区域的人H链基因和编码除了对应于小鼠L链CDR的人L链CDR之外的所有区域的人L链基因分离自人免疫球蛋白基因。将分离的小鼠H链CDR基因和人H链基因引入合适的表达载体以允许表达，并且类似地，将小鼠L链CDR基因和人L链基因引入另一合适的表达载体以允许表达。可选地，也可以将小鼠H链CDR基因/人H链基因和小鼠L链CDR基因/人L链基因引入相同表达载体以允许表达。将宿主细胞用因此产生的表达载体传化以得到人源化抗体生产细胞，并将细胞培养以从培养上清液中产生目标人源化抗体。
本发明的抗体可以是人抗体。“人抗体”指在框架区和CDR区两者中均具有来源于人种系免疫球蛋白序列的可变区的抗体。此外，当抗体含有恒定区，则恒定区也来源于人种系免疫球蛋白序列。在本说明书中，“人抗体”也涵盖甚至包括不是由人种系免疫球蛋白序列所编码的氨基酸残基（例如，通过随机或基因定点诱变体外引入的突变或体内的体细胞突变）的实施方案。
人抗体可以根据本身已知的方法来产生。例如，人抗体可以通过用抗原免疫通过将至少一个人免疫球蛋白基因引入除人之外的哺乳动物诸如小鼠等的基因座中而产生的转基因动物并且以如上述多克隆抗体或单克隆抗体的产生方法相同的方式处理动物来产生。例如，产生人抗体的转基因小鼠可以根据之前报道来产生(Nature Genetics, Vol.15, p. 146-156, 1997; Nature Genetics, Vol. 7, p. 13-21, 1994; 国际专利申请号4-504365的国家公开; WO 94/25585; Nature, Vol. 368, p. 856-859, 1994; 和国际专利申请号6-500233的国家公开)。
在本说明书中，人抗体涵盖“重组人抗体(reconstituted human antibody)”。重组人抗体指修饰的抗体，其中包含在第一人供体抗体中的至少一个CDR用于第二人受体抗体中，其代替第二人受体抗体的CDR。优选地，所有六个CDR被替代。更优选地，使用第一人供体抗体的整个抗原结合区（例如Fv、Fab 或F(ab’)2）替代第二人受体抗体中的相应区域。更优选地，将第一人供体抗体的Fab区域可操作地连接至第二人受体抗体的合适恒定区以形成全长抗体。
重组人抗体可以通过公开于例如EP125023、WO 96/02576等中的常规基因重组技术来产生。具体而言，例如，设计连接供体人抗体中的期望的CDR和受体人抗体中的期望的框架区（FR）的DNA序列通过PCR方法使用被产生以具有与CDR和FR两者的末端区域重叠的区域的数个寡核苷酸作为引物来合成（参见描述于WO 98/13388的方法）。获得的DNA连接至编码人抗体恒定区或人抗体恒定区变体的DNA，将其并入表达载体并将载体引入宿主以允许产生，由此可以获得重组人抗体（参见EP125023、WO 96/02576）。
在本说明书中，此外，人抗体涵盖“人工人抗体”。人工人抗体可以通过公开于以下的常规基因重组技术来产生：例如，Rothe, C. 等人J. Mol.Biol.2008; 376:1182-1200等。
本发明的抗体还包括融合蛋白，其中上述抗体或其他肽或蛋白融合。融合蛋白的产生方法包括连接编码本发明的抗体的多核苷酸与编码其他肽或多肽的多核苷酸以匹配框，将其引入表达载体，并允许其在宿主中表达，以及可以使用本领域普通技术人员已知的技术。作为将与本发明的抗体融合的其他肽，可以使用已知肽诸如FLAG (Hopp, T.P. 等人, BioTechnology (1988) 6, 1204-1210)、由六个His（组氨酸）残基构成的6×His、10×His、人c-myc片段、VSV-GP片段、p18HIV片段、T7-标签、HSV-标签、E-标签、SV40T抗原片段、lck标签、α-微管蛋白片段、B-标签、蛋白C片段等。将与本发明的抗体融合的其他多肽的实例包括GST（谷胱甘肽-S-转移酶）、HA（流感血凝素）、免疫球蛋白恒定区、β-半乳糖苷酶、MBP（麦芽糖结合蛋白）等。将编码此类肽或多肽的可商购多核苷酸与编码本发明的抗体的多核苷酸融合，并且表达由此制备的融合多核苷酸，从而可以制备融合多肽。
本发明的抗体优选是分离的或纯化的。“分离的或纯化的”意指去除目标组分之外的组分的操作已应用至天然存在的状态。本发明的分离的或纯化的抗体的纯度（本发明的抗体重量与总蛋白重量的比例）通常为50%或更多，优选70%或更多，更优选90%或更多，最优选95%或更多（例如，实质上100%）。
作为本发明的抗体的优选实施方案，可以提及以下（1）和（2）中所述的抗体：
（1）包含轻链可变区和重链可变区的抗体，
其中所述轻链可变区包含含有SEQ ID NO: 5中所示的氨基酸序列的CDR1、含有SEQ IDNO: 6中所示的氨基酸序列的CDR2和含有SEQ ID NO: 7中所示的氨基酸序列的CDR3，和所述重链可变区包含含有SEQ ID NO: 8中所示的氨基酸序列的CDR1、含有SEQ ID NO: 9中所示的氨基酸序列的CDR2和含有SEQ ID NO: 10中所示的氨基酸序列的CDR3；和
（2）包含轻链可变区和重链可变区的抗体，
其中所述轻链可变区包含含有SEQ ID NO: 5中所示的氨基酸序列的CDR1、含有SEQ IDNO: 6中所示的氨基酸序列的CDR2和含有SEQ ID NO: 7中所示的氨基酸序列的CDR3，和所述重链可变区包含含有SEQ ID NO: 8中所示的氨基酸序列的CDR1、含有SEQ ID NO: 9中所示的氨基酸序列的CDR2和含有SEQ ID NO: 10中所示的氨基酸序列的CDR3，
除了选自SEQ ID NOs: 5、6和7中显示的氨基酸序列的至少一个氨基酸序列中取代、缺失、插入和/或添加1-3个氨基酸，和/或
选自SEQ ID NOs: 8、9和10中显示的氨基酸序列的至少一个氨基酸序列中取代、缺失、插入和/或添加1-3个氨基酸。
在（2）的实施方案中，待取代、缺失、插入和/或添加的氨基酸的数目并无具体限制，只要抗体具有在SEQ ID NO: 2中所示的氨基酸序列中的第524个至第659个氨基酸的区域中的表位（优选地，在SEQ ID NO: 2中所示的氨基酸序列中的第536个至第543个氨基酸的区域中的表位）处特异性结合人膜锚定型ADAM28的活性。其优选每一CDR序列在2个氨基酸内，更优选一个氨基酸。同时其中取代、缺失、插入和/或添加氨基酸的CDR序列的数目并无具体限制，只要抗体具有在SEQ ID NO: 2中所示的氨基酸序列中的第524个至第659个氨基酸的区域中的表位（优选地，在SEQ ID NO: 2中所示的氨基酸序列中的第536个至第543个氨基酸的区域中的表位）处特异性结合人膜锚定型ADAM28的活性。其优选每一轻链可变区在2个之内、更优选一个，并且优选每一重链可变区在2个之内、更优选1个。氨基酸的取代、缺失、插入和/或添加可以在轻链可变区和重链可变区两者或它们之一中进行。
在（2）的实施方案中，1-3个（优选1个或2个，更优选1个）氨基酸优选仅在轻链可变区的CDR3的氨基酸序列中被取代、缺失、插入和/或添加。
用于用其他期望的氨基酸取代一个或多个氨基酸残基的方法的实例包括基因定点诱变方法(Hashimoto-Gotoh, T, Mizuno, T, Ogasahara, Y, 和Nakagawa, M. (1995)An oligodeoxyribonucleotide-directed dual amber method for site-directedmutagenesis. Gene 152, 271-275; Zoller, MJ, 和Smith, M. (1983)Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13vectors. Methods Enzymol. 100, 468-500; Kramer, W, Drutsa, V, Jansen, HW,Kramer, B, Pflugfelder, M, 和Fritz, HJ (1984) The gapped duplex DNA approachto oligonucleotide-directed mutation construction. Nucleic Acids Res. 12,9441-9456; Kramer W, 和Fritz HJ (1987) Oligonucleotide-directed constructionof mutations via gapped duplex DNA Methods. Enzymol. 154, 350-367, Kunkel, TA(1985) Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypicselection. Proc Natl Acad Sci U S A. 82, 488-492)。使用这些方法，抗体中期望的氨基酸可以被其他目标氨基酸所取代。此外，使用文库技术诸如框架改组(Mol Immunol.2007 Apr; 44(11):3049-60)和CDR修复(US2006/0122377)等，框架或CDR中的氨基酸也可以被其他合适氨基酸所取代。
在本发明的抗体中，作为待与CDR连接的抗体的框架区（FR），选择使得CDR能够形成良好抗原结合位点的框架。尽管待用于本发明的抗体的FR没有具体限制并且可以使用任何FR，但优选使用小鼠或人抗体的FR。作为人抗体的FR，可以使用具有天然序列的FR，或者具有天然序列的框架区中的一个或多个氨基酸可以在必要时被取代、缺失、添加和/或插入等，使得CDR将形成合适的抗原结合位点。例如，具有期望特性的突变体FR序列可以通过测量和评价具有取代的氨基酸的FR的抗体与抗原的结合活性来选择(Sato, K. 等人,Cancer Res. (1993)53, 851-856)。
用于本发明的抗体的恒定区没有具体限制，并且可以使用任何恒定区。用于本发明的抗体的恒定区的优选实例包括小鼠或人抗体的恒定区（来源于IgG1, IgG2, IgG3,IgG4, IgA, IgM等的恒定区）。例如，Cγ1, Cγ2, Cγ3, Cγ4, Cμ, Cδ, Cα1, Cα2, Cε可用于H链中，并且Cκ, Cλ 可用于L链中。
在一个实施方案中，在（1）的抗体中，将小鼠抗体的κ恒定区用作轻链，并将小鼠抗体的IgG2a恒定区用作重链。
本发明的优选抗体包括以下：
（1’）包含轻链可变区和重链可变区的抗体，其中所述轻链可变区包含SEQ ID NO: 11中显示的氨基酸序列，并且所述重链可变区包含SEQ ID NO: 12中显示的氨基酸序列。
上述（1'）的抗体对应于上述（1）的抗体的优选实施方案。
本发明提供包含编码本发明的上述抗体的核苷酸序列的多核苷酸。多核苷酸可以是DNA或RNA或DNA/RNA嵌合体。多核苷酸可以是双链的或单链的。当多核苷酸是双链时，它可以是双链DNA、双链RNA或DNA:RNA杂化物。
本发明的多核苷酸包含含有编码本发明的抗体的重链可变区和轻链可变区的核苷酸序列的多核苷酸、以及含有编码本发明的抗体的重链可变区的核苷酸序列的多核苷酸和含有编码本发明的抗体的轻链可变区的核苷酸序列的多核苷酸的组合。
本发明的多核苷酸可以基于本发明的抗体的氨基酸序列的信息、已知序列信息和本说明书中序列表中所述的序列信息并通过利用已知基因重组技术来容易地产生。例如，基于序列信息设计合适引物，通过PCR反应扩增编码构成本发明的抗体的元件的DNA，通过合适酶诸如连接酶等连接DNA片段，由此可以产生本发明的多核苷酸。可选地，编码每一元件的多核苷酸可以通过多核苷酸合成仪基于本发明的抗体的氨基酸序列的信息来合成。
取决于目标，所获得的编码本发明的抗体的多核苷酸可以直接使用，或者需要时用限制酶消化后使用或添加接头后使用。多核苷酸可以具有ATG作为5'末端侧的翻译起始密码子，并且可以具有TAA、TGA或TAG作为3'末端侧的翻译终止密码子。这些翻译起始密码子和翻译终止密码子可以使用合适的合成的DNA适配子添加。
本发明的多核苷酸优选是分离的或纯化的。本发明的分离的或纯化的多核苷酸具有通常为50%或更多，优选70%或更多，更优选90%或更多，最优选95%或更多（例如，实质上100%）的纯度（本发明的多核苷酸重量与总多核苷酸重量的比例）。
本发明提供包含本发明的上述多核苷酸的载体。本发明的载体涵盖以下：包含含有编码本发明的抗体的重链可变区和轻链可变区的核苷酸序列的多核苷酸的载体，以及包含含有编码本发明的抗体的重链可变区的核苷酸序列的多核苷酸的载体和包含含有编码本发明的抗体的轻链可变区的核苷酸序列的多核苷酸的载体的组合。载体优选是分离的或纯化的。载体的实例包括表达载体、克隆载体等，其可以根据目标进行选择。优选地，载体是表达载体。表达载体可以表达本发明的抗体。表达载体可以通过将本发明的多核苷酸可操作地连接至合适表达载体的启动子下游来产生。载体的类型包括例如质粒载体、病毒载体等，其可以根据所用的宿主来合适地选择。
作为宿主，使用属埃希氏杆菌属（大肠杆菌(Escherichia coli)等）、属芽孢杆菌（枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)等）、酵母（酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)等）、昆虫细胞（来源于甘蓝夜蛾(Mamestra brassicae)的幼虫的建立的细胞系（草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞；Sf细胞）等）、昆虫（家蚕(Bombyx mori)等的幼虫）、哺乳动物细胞（大鼠神经细胞、猴细胞（COS-7等）、中国仓鼠细胞（CHO细胞等）等）等等。
哺乳动物的实例包括但不限于啮齿动物如小鼠、大鼠、仓鼠和豚鼠等，兔等，家畜如猪、牛、山羊、马、绵羊、貂等，伴侣动物诸如狗、猫等，灵长类动物如人、猴、食蟹猴（Macacafascicularis）、猕猴（Macaca mulatta）、狨猴、猩猩、黑猩猩等，等等。
质粒载体的实例包括来源于大肠杆菌的质粒载体（例如pBR322, pBR325, pUC12,pUC13）、来源于枯草芽孢杆菌的质粒载体（例如pUB110, pTP5, pC194）、来源于酵母的质粒载体（例如pSH19, pSH15）等，其可以根据待使用的宿主种类和使用目标来合适地选择。
病毒载体的种类可以根据待使用的宿主种类和使用目标来合适地选择。例如，当使用昆虫细胞作为宿主时，可以使用杆状病毒载体等。当使用哺乳动物细胞作为载体时，可以使用逆转录病毒载体诸如莫洛尼鼠白血病病毒载体、慢病毒载体、辛德毕斯病毒载体等、腺病毒载体、疱疹病毒载体、腺相关病毒载体、细小病毒载体、牛痘病毒载体、仙台病毒载体等。
启动子可以根据待使用的宿主种类进行选择，并且可以选择能够在宿主中起始转录的启动子。例如，当宿主是属埃希氏杆菌属时，优选trp启动子、lac启动子、T7启动子等。当宿主是属芽孢杆菌属时，优选SPO1启动子、SPO2启动子、penP启动子等。当宿主是酵母时，优选PHO5启动子、PGK启动子等。当宿主是昆虫细胞时，优选多角体蛋白启动子、P10启动子等。当宿主是哺乳动物细胞时，优选亚基因组（26S）启动子、CMV启动子、SRα 启动子等。
本发明的载体可以包含用于抗体分泌的信号序列。作为用于抗体分泌的信号序列，当其产生于大肠杆菌的周质中时，可以使用pelB信号序列(Lei, S. P. 等人 J.Bacteriol. (1987) 169, 4379)。
需要时，本发明的载体可以各自以可操作方式包含增强子、剪切信号、聚A添加信号、选择标志物、SV40复制起点（下文有时缩写为SV40ori）等。选择标志物的实例包括二氢叶酸还原酶（下文有时缩写为dhfr）基因[甲氨蝶呤(MTX)抗性]、氨苄青霉素抗性基因（有时缩写为Ampr）、新霉素抗性基因（有时缩写为Neor, G418抗性）等。
通过将本发明的上述载体通过本身已知的基因转移方法（例如，脂转染方法、磷酸钙方法、纤维注射方法、原生质体融合方法、通过基因枪的电穿孔方法等）引入上述宿主，可以产生其中引入载体的转化体（本发明的转化体）。当将表达载体用作待引入的载体时，转化体可以表达本发明的抗体。本发明的转化体可用于产生本发明的抗体等。
本发明的抗体可以通过根据宿主类型的本身已知的方法通过培养本发明的转化体，并从培养物中分离本发明的抗体来产生。当宿主是属埃希氏杆菌属时，将转化体在合适的培养基诸如LB培养基、M9培养基等中通常在约15 - 43℃下培养约3-24小时。当宿主是属芽孢杆菌属时，将转化体在合适的培养基中通常在约30 - 40℃下培养约6-24小时。当宿主是酵母时，将转化体在合适的培养基诸如Burkholder氏培养基等中通常在约20℃ - 35℃下培养约24-72小时。当宿主是昆虫细胞或昆虫时，将转化体在合适的培养基诸如Grace氏昆虫培养基（添加有约10%牛血清）等中通常在约27℃下培养约3-5天。当宿主是动物细胞时，将转化体在合适的培养基诸如MEM培养基（添加有约10%牛血清）等中通常在约30℃ -40℃下培养约15-60小时。在任何培养中，按需要可以进行通气和搅拌。
关于通过遗传工程的抗体生产方法，例如，可以参考Co, M. S. 等人, J.Immunol.(1994) 152, 2968-2976; Better, M.和Horwitz, A. H., Methods Enzymol.(1989) 178, 476-496; Pluckthun, A. and Skerra, A., Methods Enzymol.(1989)178, 497-515; Lamoyi, E., Methods Enzymol.(1986) 121, 652-663; Rousseaux, J.等人, Methods Enzymol.(1986) 121, 663-669; Bird, R. E. 和Walker, B. W.,Trends Biotechnol.(1991) 9, 132-137等。
从培养物中分离和纯化本发明的抗体不受任何方式限制，并且可以采用通常用于纯化抗体的分离和纯化方法。例如，抗体可以通过合适地选择并组合层析柱、滤器、超滤、盐析、溶剂沉淀、溶剂提取、蒸馏、免疫沉淀、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦、透析、再结晶等来分离和纯化。
层析的实例包括亲和层析、离子交换层析、疏水层析、凝胶过滤、反向层析、吸附层析等(Strategies for Protein Purification and Characterization:A LaboratoryCourse Manual.编辑Daniel R. Marshak 等人, Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1996)。这些层析可以通过使用液相层析，例如，液相层析诸如HPLC、FPLC等来进行。待用于亲和层析的柱的实例包括蛋白A柱和蛋白G柱。例如，作为使用蛋白A的柱，可以提及Hyper D、POROS、Sepharose FF (由GE Amersham Biosciences制造)等。本发明还涵盖通过这些纯化方法高度纯化的抗体。
此外，本发明提供含有本发明的上述抗体作为活性组分的药物组合物。本发明的抗体和药物组合物可用作用于递送药物至表达人膜锚定型ADAM28的细胞或组织的药物递送媒介物。药物递送媒介物意指介导期望药物递送至靶细胞或组织的载体。表达人膜锚定型ADAM28的细胞或组织优选为癌细胞或癌组织。尽管癌症类型并无具体限制，只要其表达人膜锚定型ADAM28，但可以提及肝癌、结肠直肠癌、肾癌、黑素瘤、胰腺癌、甲状腺癌、胃癌、肺癌（小细胞肺癌、非小细胞肺癌）、脑肿瘤、子宫癌、乳腺癌、多发性骨肉瘤、卵巢癌、慢性白血病、前列腺癌、急性淋巴细胞性白血病、生殖细胞瘤、急性骨髓性白血病、恶性淋巴瘤、绒毛癌、小儿恶性肿瘤、胆囊或胆管癌等。细胞或组织是否表达人膜锚定型ADAM28可以通过流式细胞术、免疫组织化学染色、蛋白质印迹（使用本发明的抗体或特异性识别人ADAM28的抗体）、RT-PCR等来评价。
当通过使用本发明的抗体将期望药物递送至表达人膜锚定型ADAM28的细胞或组织时，将含有药物和本发明的抗体的免疫复合体（免疫缀合物）施用于具有表达人膜锚定型ADAM28的细胞或组织（例如，癌细胞、癌组织）的人。待与本发明的抗体缀合的药物类型没有具体限制，并且例如，可以提及用于损伤表达人膜锚定型ADAM28的细胞或组织（例如癌细胞或癌组织）由此治疗由该细胞或组织引起的疾病的化合物（例如，抗癌剂诸如化疗剂等、放射性同位素、毒素）；用于检测和成像表达人膜锚定型ADAM28的细胞或组织的标记剂（例如，放射性同位素、荧光物质、发光物质、酶）等。通过施用包含用于损伤表达人膜锚定型ADAM28的细胞或组织（例如，癌细胞或癌组织）以治疗由所述细胞或组织引起的疾病的化合物和本发明的抗体的免疫复合体至人，所述化合物选择性递送至人中表达人膜锚定型ADAM28的细胞或组织（例如，癌细胞或癌组织），在人中所述细胞或组织（例如，癌细胞或癌组织）受到损伤，并且可以治疗由所述细胞或组织引起的疾病（例如癌症）。而且，通过施用包含用于检测和成像表达人膜锚定型ADAM28的细胞或组织的标记剂和本发明的抗体的免疫复合体至人，所述标记剂选择性递送至人中表达人膜锚定型ADAM28的细胞或组织（例如，癌细胞或癌组织），并且所述表达人膜锚定型ADAM28的细胞或组织可以被特异性地检测和成像。本发明的抗体可以与聚合物物质诸如聚乙二醇（PEG）、透明质酸等缀合以改善体内稳定性。
本发明的药物和抗体的偶联方案没有具体限制，只要免疫复合体稳定存在于体内，并且药物可以递送至表达人膜锚定型ADAM28的细胞或组织。例如，可以提及药物与本发明的抗体的直接缀合、药物与本发明的抗体经间隔物的缀合、药物与本发明的抗体经中间支持物（葡聚糖、白蛋白等）的缀合、包封药物的载体诸如脂质体等与本发明的抗体的缀合等等。此类免疫复合体的生产方法已经在本技术领域中建立(例如US5057313、US5156840)。
许多表达人膜锚定型ADAM28的癌细胞也表达人分泌型ADAM28。由于常规已知的抗ADAM28抗体（专利文献1）结合两者，当该抗体用于导弹疗法中时，分泌型ADAM28可以以与膜锚定型ADAM28竞争方式结合该抗体从而抑制抗ADAM28抗体与癌细胞的结合。相反，本发明的抗体具有特异性结合人膜锚定型ADAM28的活性并且不结合人分泌型ADAM28，因为该抗体的表位在对于人膜锚定型ADAM28特异性的区域中。因此，本发明的抗体结合人膜锚定型ADAM28而不受分泌型ADAM28的抑制，并且可以递送期望的药物至表达人膜锚定型ADAM28的细胞或组织。因此，本发明的抗体作为针对除人膜锚定型ADAM28外还表达人分泌型ADAM28的细胞或组织的药物递送媒介物是优秀的。细胞或组织是否表达分泌型ADAM28可以通过免疫组织化学染色、蛋白质印迹（使用特异性识别人分泌型ADAM28的抗体）、RT-PCR等来评价。已知分泌型ADAM28在血清中的浓度在一些癌症中伴随癌症的进展、转移和复发等而增加。使用本发明的抗体作为在作为施用对象的在血清中检测到分泌型ADAM28的人或在血清中显示比健康个体更高的分泌型ADAM28的浓度的人中的药物递送媒介物是有利的，因为期望的药物可以递送至表达人膜锚定型ADAM28的细胞或组织（例如，癌细胞或癌组织），而不受血流中分泌型ADAM28的抑制。
本发明的抗体和上述免疫复合体可以根据常规方法进行配制（例如，Remington’sPharmaceutical Science, latest edition, Mark Publishing Company, Easton,U.S.A.）。此外，必要时，其可以含有药学上可接受的载体和/或添加剂。例如，其可以含有表面活性剂（PEG、Tween等）、赋形剂、抗氧化剂（抗坏血酸等）、着色剂、香料、防腐剂、稳定剂、缓冲剂（磷酸盐、柠檬酸盐、其他有机酸等）、螯合剂（EDTA等）、悬浮剂、等渗剂、粘合剂、去污剂、润滑剂、助流剂、矫味剂等。不限于此，合适时，本发明的药物组合物还可以包含其他常规载体。具体实例包括轻质无水硅酸、乳糖、结晶纤维素、甘露醇、淀粉、羧甲纤维素钙、羧甲基纤维素钠、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯醇缩醛二乙基氨基乙酸酯(polyvinyl acetaldiethylaminoacetate)、聚乙烯吡咯烷酮、明胶、中链脂肪酸甘油三酯、聚氧乙烯氢化蓖麻油60、蔗糖、羧甲基纤维素、玉米淀粉、无机盐等。其还可以包含其他低分子量多肽、蛋白诸如血清白蛋白、明胶和免疫球蛋白等，以及氨基酸。当配制用于注射的水溶液时，本发明的抗体或上述免疫复合体例如溶解于含有盐水、葡萄糖或其他助剂的等渗溶液中。助剂的实例包括D-山梨醇、D-甘露糖、D-甘露醇和氯化钠，并且可以与合适的溶解剂例如醇（乙醇等）、多元醇（丙二醇、PEG等）、非离子表面活性剂（聚山梨醇酯80、HCO-50）等组合使用。
必要时，多肽也可以包封在微胶囊中（由羟甲基纤维素、明胶、聚[甲基丙烯酸甲酯]等制成的微胶囊），或者配制为胶体药物递送系统（脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米颗粒和纳米囊等）（参见Remington’s Pharmaceutical Science 第16版 &, Oslo 编辑(1980) 等）。此外，配制药物作为缓释药剂的方法也是已知的，并且可应用于多肽(Langer等人, J. Biomed.Mater.Res.(1981)15:167-277; Langer, Chem.Tech.(1982)12:98-105; 美国专利号3,773,919; EP-A-58,481; Sidman 等人, Biopolymers (1983) 22:547-56; EP号133,988)。此外，还可以通过添加透明质酸酶至本发明的试剂或将透明质酸酶与其掺合来增加同时施用的液体量（例如WO 2004/078140等）。
药物组合物中的本发明的抗体或上述的免疫复合体例如为总药物组合物的约0.01-100wt%，优选0.1-99.9wt%。
尽管本发明的药物组合物可以口服和肠胃外使用，但其优选肠胃外施用。具体而言，通过注射或经皮施用将其施用于患者。作为注射剂型的实例，其可以全身或局部通过静脉内注射、肌内注射、皮下注射等来施用。其还可以通过局部注射特别是肌内注射施用至治疗部位或在其附近。经皮施用的剂型的实例包括膏剂、凝胶、霜剂、膏药(plaster)、贴剂等，其可以全身或局部施用。此外，施用方法可以根据患者年龄和症状合适地选择。剂量可以例如作为本发明的抗体或免疫复合体选自0.5 mg – 10 mg/kg体重的范围。然而，本发明的药物组合物不限于这些剂量。
本说明书中引用的所有参考文献包括出版物、专利文件等均以其整体已明确地公开于本文的程度单独地并明确地通过引用并入本文。
[实施例]
本发明通过参考实施例在下文中更详尽地解释，其不应解释为限制性的。实施例中各种基因操作参照Molecular cloning第三版(Cold Spring Harbor Lab. Press, 2001)中所述的方法。
[实施例1]
特异性识别人膜锚定型ADAM28的抗体的制备
将小鼠用融合蛋白免疫，在所述融合蛋白中人ADAM28的膜锚定型特异性区域（SEQ IDNO: 2中所示的氨基酸序列中第524个至第659个氨基酸的区域）与MBP的C末端融合，通过髂淋巴结方法建立杂交瘤，并且通过流式细胞术选择仅与人膜锚定型ADAM28反应的克隆2B6D10。
(1) ELISA
将融合蛋白（免疫原）用作抗原，将2B6D10的培养上清液用作一级抗体，并且将抗小鼠IgG-HRP抗体(1:100000)用作二级抗体。结果显示于下表中。
[表1]
。
(2) 组织染色
将用人膜锚定型ADAM28和EGFP共转染的CHO-K1细胞用2B6D10抗体(5 μg/ml)在4℃下处理1.5小时。将细胞洗涤，并用抗小鼠IgG-Alexa555 (1:300)在4℃下处理1小时。将细胞洗涤，并在37℃孵育0分钟或90分钟，固定并观察。结果显示于图1中。
2B6D10抗体结合转染有人膜锚定型ADAM28的CHO-K1细胞。抗体染色后，将细胞在37℃下孵育，结果是观察到抗体的内化。胞内定位与溶酶体标志物Lamp1-EGFP相同（图2）。
(3) 与小鼠ADAM28的交叉反应性
将用小鼠膜锚定型ADAM28和EGFP共转染的CHO-K1细胞用2B6D10抗体(5 μg/ml)在4℃下处理1.5小时。将细胞洗涤，并用抗小鼠IgG-Alexa555 (1:300)在4℃下处理1小时。将细胞洗涤，固定并观察。结果显示于图3中。
2B6D10抗体与小鼠膜锚定型ADAM28交叉反应。
(4) 可变区的序列分析
从2B6D10的杂交瘤中提取总RNA，通过RT-PCR扩增抗体的轻链和重链可变区的cDNA，并分析cDNA序列。从cDNA序列推断2B6D10抗体的轻链和重链可变区的氨基酸序列。结果显示于下表中。
[表2]
[表3]
2B6D10抗体的轻链和重链可变区的全长氨基酸序列分别显示于SEQ ID NOs: 11和12。
[表4]
2B6D10轻链可变区：
2B6D10重链可变区：
。
[实施例2]
分别制备包含添加至MBP的C末端的人膜锚定型ADAM28s (SEQ ID NO: 2)的以下区域的部分序列的融合蛋白。
（每个值显示SEQ ID NO: 2中所示的氨基酸序列中的氨基酸编号）
抗人膜锚定型ADAM28抗体2B6C10与上述融合蛋白的反应性通过蛋白质印迹评价。结果是，2B6D10强烈结合含有区域536-543 (524-562、524-543、534-553、536-545和536-543)的部分序列的融合蛋白。结果表明2B6D10的表位包含于人膜锚定型ADAM28 (SEQ ID NO: 2)的536-543区域(EGGSKYGY, SEQ ID NO: 27)中。
[实施例3]
通过ELISA的2B6D10抗体与人膜锚定型ADAM28的反应性和其与小鼠膜锚定型ADAM28的 反应性的比较
制备其中人膜锚定型ADAM28 (SEQ ID NO: 2)的524-659区域添加至MBP的C末端(MBP-人ADAM28m 524-659)的融合蛋白和其中小鼠膜锚定型ADAM28 (SEQ ID NO: 26)的527-622区域 (对应于人膜锚定型ADAM28的524-659区域)添加至MBP的C末端(MBP-小鼠ADAM28m527-622)的融合蛋白并将其用于ELISA。将每种抗原以5 μg/ml固定在ELISA板上，并与稀释的2B6D10抗体反应用于测量。随后，将样品与二级抗体（1:10000-稀释的抗小鼠 IgG‐HRP(Jackson ImmunoResearch Laboratories)）反应。通过用TMB显色进行检测。
结果显示于图4中。结果已阐明2B6D10抗体具有与人膜锚定型ADAM28和小鼠膜锚定型ADAM28等同的反应性。
[实施例4]
通过表面等离子共振（SPR）的蛋白相互作用分析
将其中人膜锚定型ADAM28 (SEQ ID NO: 2)的524-659区域添加至MBP的C末端(MBP-人ADAM28m 524-659)的融合蛋白和其中小鼠膜锚定型ADAM28 (SEQ ID NO: 26)的527-622区域添加至MBP的C末端(MBP-小鼠ADAM28m 527-622)的融合蛋白通过胺偶联各自固定在CM5传感器芯片(GE Healthcare Life Sciences, Buckinghamshire, UK)上，并通过使用BIAcore 3000 (GE Healthcare Life Sciences)将2B6D10抗体注射至流通池。从测量的Ka和Kd值计算KD值。
结果显示于下表中。
[表5]
分析物 配体 KD值
2B6D10 MBP-人ADAM28m 524-659 9.35E-11 (M)
2B6D10 MBP-小鼠ADAM28m 527-622 2.36E-10 (M)
结果是，2B6D10抗体针对人膜锚定型ADAM28和小鼠膜锚定型ADAM28的KD值分别为9.35×10-11 M和2.36×10-10 M，因此显示对两者等同的高亲和力。
[产业实用性]
根据本发明，提供特异性结合人膜锚定型ADAM28且可用于表达膜锚定型ADAM28的癌细胞的导弹疗法的抗人ADAM28抗体。
本文中引用的任何公开中公开的内容包括专利和专利申请，均以其整体通过引用并入本文至它们已在本文中公开的程度。
本申请基于在日本提交的专利申请号2015-045244（申请日：2015年3月6日），其内容完整并入本文。

Claims (18)

1.一种抗体，其具有在SEQ ID NO: 2中显示的氨基酸序列中第524个至第659个氨基酸的区域中的表位处特异性结合人膜锚定型ADAM28的活性。
2.权利要求1的抗体，其中所述表位在SEQ ID NO: 2中显示的氨基酸序列中的第536个至第543个氨基酸的区域中。
3.权利要求1或2的抗体，其不具有结合人分泌型ADAM28的活性。
4.权利要求1-3中任一项的抗体，其包含轻链可变区和重链可变区，其中
（1）所述轻链可变区包含含有SEQ ID NO: 5中显示的氨基酸序列的CDR1、含有SEQ IDNO: 6中显示的氨基酸序列的CDR2和含有SEQ ID NO: 7中显示的氨基酸序列的CDR3，和
所述重链可变区包含含有SEQ ID NO: 8中显示的氨基酸序列的CDR1、含有SEQ ID NO:9中显示的氨基酸序列的CDR2和含有SEQ ID NO: 10中显示的氨基酸序列的CDR3，或
（2）所述轻链可变区包含含有SEQ ID NO: 5中显示的氨基酸序列的CDR1、含有SEQ IDNO: 6中显示的氨基酸序列的CDR2和含有SEQ ID NO: 7中显示的氨基酸序列的CDR3，和
所述重链可变区包含含有SEQ ID NO: 8中显示的氨基酸序列的CDR1、含有SEQ ID NO:9中显示的氨基酸序列的CDR2和含有SEQ ID NO: 10中显示的氨基酸序列的CDR3，
除了选自SEQ ID NOs: 5、6和7中显示的氨基酸序列的至少一个氨基酸序列中取代、缺失、插入和/或添加1-3个氨基酸，和/或
选自SEQ ID NOs: 8、9和10中显示的氨基酸序列的至少一个氨基酸序列中取代、缺失、插入和/或添加1-3个氨基酸。
5.权利要求4的抗体，其中所述轻链可变区包含SEQ ID NO: 11中显示的氨基酸序列，并且所述重链可变区包含SEQ ID NO: 12中显示的氨基酸序列。
6.一种药物组合物，其包含权利要求1-5中任一项的抗体。
7.一种用于递送药物至表达人膜锚定型ADAM28的细胞或组织的药物递送媒介物，其包含权利要求1-5中任一项的抗体。
8.权利要求7的药物递送媒介物，其中所述细胞或组织进一步表达人分泌型ADAM28。
9.权利要求7或8的药物递送媒介物，其中所述细胞或组织是癌细胞或癌组织。
10.一种组合物，其包含含有药物和权利要求1-5中任一项的抗体的免疫复合体，用于递送药物至表达人膜锚定型ADAM28的细胞或组织。
11.权利要求10的药物组合物，其中所述细胞或组织进一步表达人分泌型ADAM28。
12.权利要求10或11的药物组合物，其中所述细胞或组织是癌细胞或癌组织。
13.一种递送药物至人中表达人膜锚定型ADAM28的细胞或组织的方法，其包括施用含有药物和权利要求1-5中任一项的抗体的免疫复合体至人。
14.权利要求1-5中任一项的抗体，其用于介导递送药物至表达人膜锚定型ADAM28的细胞或组织。
15.权利要求1-5中任一项的抗体用于制备递送药物至表达人膜锚定型ADAM28的细胞或组织的药物递送媒介物的用途。
16.一种多核苷酸，其编码权利要求1-5中任一项的抗体。
17.一种载体，其包含权利要求16的多核苷酸。
18.一种转化体，其包含权利要求17的载体。
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