WO2014132307A1 - 抗体、フラグメント、分子及び抗hcv治療剤 - Google Patents

抗体、フラグメント、分子及び抗hcv治療剤 Download PDF

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WO2014132307A1
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claudin
antibody
human
cells
monoclonal antibody
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昌夫 近藤
征義 深澤
明子 石井
稔 多田
八木　清仁
彰浩 渡利
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公益財団法人ヒューマンサイエンス振興財団
国立大学法人大阪大学
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Definitions

  • the present invention relates to a claudin 1 antibody, a fragment of the antibody, a molecule that binds to a claudin 1 epitope, and an anti-HCV therapeutic agent containing the antibody as an active ingredient.
  • Hepatitis C virus (hereinafter sometimes referred to as “HCV” in this specification) is one of the main causes of the development of chronic liver disease, and it is estimated that approximately 1.7 million people will be infected in Japan. . About 70% of HCV-infected people progress to chronic hepatitis, then about half of them develop cirrhosis over the next 20-30 years, about 10% lead to liver cancer, and about 80% of the annual deaths from liver cancer in Japan It has been attributed to HCV infection. The number of domestic HCV carriers is estimated to be over 2 million including virus carriers that do not show symptoms of hepatitis, which is mainly due to the absence of effective antiviral agents other than interferon. .
  • an enveloped virus such as HCV infects cells, it binds to a specific protein (virus receptor) on the cell surface, and then the virus membrane and cell membrane fuse to inject the virus gene into the cell. To do. Therefore, an antibody or the like that can prevent HCV from binding to and entering the viral receptor on the cell surface is required.
  • HCV E2 protein expressed in mammals specifically binds to CD81 present on the surface of human cells
  • this experimental system is used to inhibit the binding of E2 protein and CD81 from hepatitis C patients.
  • Antibodies that exhibit NOB (neutralisation of binding) activity have been developed.
  • an antibody gene library is prepared from bone marrow lymphocytes of genotype 1a chronic hepatitis C patients, and antibodies exhibiting NOB activity have been prepared using the phage display method (Patent Document 1).
  • Patent Document 1 a monoclonal antibody from the above-mentioned HCV-infected patient, it is limited to a patient having an HCV infection-inhibiting antibody, and the envelope protein is mutated at a high rate. It is difficult to find.
  • claudin is the main protein of tight junction and is responsible for strand formation in tight junction, creating an intercellular barrier.
  • claudin molecules There are currently 27 types of claudin molecules reported, and it is thought that claudin molecules bind to each other in a homophilic or heterophilic manner and function in cell-cell adhesion.
  • claudin 1 is one of HCV infection receptors, is highly expressed in colorectal cancer, etc., and is also involved in hepatocellular carcinogenesis.
  • rat monoclonal antibodies have been prepared as human claudin 1 antibodies (Patent Document 2, Non-Patent Document 1).
  • Claudin 1 is a small four-transmembrane protein in the extracellular region and the interspecies homology in the extracellular region is high, the creation of a binder for Claudin 1 including antibodies has been delayed.
  • the inhibitory activity of rat monoclonal antibodies against HCV infection is not satisfactory because no inhibitory activity against in vivo HCV infection has been reported.
  • the present invention has been made in view of such problems, and an anti-claudin 1 monoclonal antibody having sufficient HCV infection inhibitory activity, and an anti-HCV therapeutic agent having the anti-claudin 1 monoclonal antibody as an active ingredient
  • the purpose is to provide.
  • the anti-crowdin 1 monoclonal antibody according to the present invention is an anti-crowdin 1 monoclonal antibody that recognizes an epitope in the second extracellular loop of human claudin 1 and binds to human claudin 1.
  • the anti-crowdin 1 monoclonal antibody according to the present invention is a mouse anti-crowdin 1 monoclonal antibody, a human chimeric anti-crowdin 1 monoclonal antibody and a humanized anti-crowdin 1 monoclonal antibody.
  • the anti-HCV therapeutic agent according to the present invention includes the above-mentioned anti-claudin 1 monoclonal antibody, mouse anti-claudin 1 monoclonal antibody, human chimeric anti-claudin 1 monoclonal antibody, humanized anti-claudin 1 monoclonal antibody or a fragment thereof or an anti-antibody A molecule that binds to an epitope of a claudin 1 monoclonal antibody is used as an active ingredient.
  • an anti-claudin 1 monoclonal antibody having sufficient HCV infection inhibitory activity can be obtained.
  • the anti-HCV therapeutic agent according to the present invention has sufficient HCV infection inhibitory activity.
  • FIG. 3 is a view showing the binding of each mouse anti-crowdin 1 monoclonal antibody to cell surface claudin 1 by flow cytometry analysis. It is a figure which shows the claudin binding specificity analysis result of a mouse antibody. It is a figure which shows the western blotting analysis result by a mouse antibody. It is a figure which shows the homology analysis result of an extracellular region sequence, and analyzed the homology of the amino acid sequence of human claudin 1 and mouse
  • the anti-claudin 1 monoclonal antibodies according to the present invention are cells that infect HCV ( This is a mouse anti-crowdin 1 monoclonal antibody obtained by screening using endogenous cells (expressing claudin 1) and cells not infected with HCV established from this cell (specifically lacking claudin 1).
  • the anti-crowdin 1 monoclonal antibody according to the present invention specifically recognizes the three-dimensional structure of the extracellular region of the polypeptide encoded by the claudin 1 gene and binds to the extracellular region.
  • the extracellular region of claudin 1 includes, for example, both a ligand binding domain (Ligand binding domain) and first and second fibronectin domain (Fibronectin domain).
  • the monoclonal antibody, chimeric antibody, and humanized antibody can be of any isotype.
  • the antibody may be, for example, human IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, or a variant thereof, mouse IgM, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgA, IgD, IgE, or a variant thereof. Any heavy chain may be paired with a kappa or lambda type light chain.
  • Antibodies include Fab fragments, F (ab ') 2 fragments, or Fv fragments.
  • the present inventors have succeeded in producing four clones as mouse anti-Claudin 1 monoclonal antibodies, which are named 2C1, 3A2, 5F2, and 7A5, respectively.
  • the anti-crowdin 1 monoclonal antibody according to the present invention is an anti-crowdin 1 monoclonal antibody that binds to an epitope in the second extracellular loop of claudin 1.
  • recognition of 2C1, 3A2, and 5F2 is partially related to both the first and second extracellular regions of human claudin 1
  • recognition of 5F2 and 7A5 is related to human claudin 1 second extracellular region. Area is mandatory.
  • the epitope in the first extracellular loop is QWRIYSYAGDNIVTAQAMYEGLWMSCVSQSTGQIQCKVFDSLLNLSSTLQATR (Gln Trp Arg Ile Tyr Ser Tyr Ala Gly Asp Asn Ile Val Thr Ala GlnA Ile, Gln, Cys, Lys, Val, Phe, Asp, Ser, Leu, Leu, Asn, Leu, Ser, Ser, Thr, Leu, Gln, Ala, Thr, Arg) (SEQ ID NO: 1).
  • the epitope in the second extracellular loop is QEFYDPMTPVNARYE (Gln (Glu Phe Tyr Asp Pro Met Thr Pro Val Asn Ala Arg Tyr Glu) (SEQ ID NO: 2).
  • VH heavy chain variable regions
  • VL light chain variable regions
  • VH was QVQLRQPGTELIKTGASVKLSCKASGYSFSSYWMHWVKQRPGQGLEWVGMIHPNIGATNYNEKFKSKAILTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCATSGFDYWGQGTTLTVSS (sequence number 5).
  • VL was DIVLTQSPASLSVTPGDSVSLSCRATQSISNNLHWYRQKSHESPRPLIKYASQSISGIPSRFSGSGSGTVFTLNINSVETEDFGMYFCQQSNSWPFTFGSGTKLEIKR (SEQ ID NO: 6).
  • VH was EVQLQQSGPELVKPGASVTISCKVSGYTFTDYYMNWMKQSHGKSLEWIGDINPNNGDTNYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYFCAGRLVYWGQGTLVTVSA (sequence number 7).
  • VL was DPVLTQIPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLENSNGNTYLNWYLQKPGQSPQLLIYRVSNRFSGVQDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCLQVTHVPWTFGGGTKLEIKR (sequence number 8).
  • VH was QVQVHQSGAELARPGASVKLSCKASGNTFTNYGVNWVKQRAGQGLEWIGEIYPRSGDIFYNENFKGKATLTADKSSTTAYMELRSLTSGDSAVFFCARRENYYNYVGAMDDWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO: 9).
  • VL was DIVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQNLVHRSGNTYLHWYLQKPGQSPRLLIYKVSNRFSGVPVRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPWTFGGGTKLEIKR (sequence number 10).
  • VH and VL regions can be subdivided into complementarity determining regions (CDR), and framework regions (FR) are interspersed.
  • CDR complementarity determining regions
  • FR framework regions
  • the present inventors determined the nucleotide sequences of the VH region and VL region from the hybridoma mRNA by the RACE method (rapid amplification of cDNA ends), and analyzed the amino acid sequence. As a result, the sequence was as shown in FIG. .
  • the antibody according to the present embodiment can also include an antibody derivative modified or conjugated by a covalent bond between any kind of molecule and the antibody.
  • antibody derivatives include, for example, acetylation, glycosylation, amidation, PEGylation, phosphorylation, derivatization with known protecting / blocking groups, proteolytic cleavage, or intracellular ligands or other proteins Or the antibody modified by the coupling
  • a hybridoma that produces the antibody to be obtained can be cultured, and the antibody can be purified and obtained from the obtained culture supernatant by a conventional method.
  • the method for collecting the antibody from the obtained hybridoma is not particularly limited, and for example, a normal ascites formation method, a cell culture method, or the like can be used.
  • the ascites formation method for example, mineral oil such as pristane is administered into the abdominal cavity of an animal of the same kind as a mammal derived from myeloma cells, and then 1 hybridoma 1 ⁇ 10 6 to 1 ⁇ 10 9 is administered intraperitoneally.
  • the hybridoma is grown in large quantities.
  • the hybridoma is cultured in an animal cell culture medium such as IMDM containing 10-20% calf serum, RPMI-1640, MEM, E-RDF, or serum-free medium (eg, 37 ° C.). And 5% CO 2 concentration) for 3 to 14 days, and antibodies can be obtained from the culture supernatant.
  • Antibody purification includes, for example, ammonium sulfate salting out method, ion exchange chromatography using an anion exchanger such as DEAE cellulose, affinity chromatography using protein A sepharose, molecular sieve chromatography that screens according to molecular weight and structure, etc. It is possible to purify by appropriately selecting a known method.
  • Another method is to obtain a gene encoding an antibody from a hybridoma producing the antibody to be obtained, more specifically, a gene encoding an immunoglobulin heavy chain and light chain, and to express the gene.
  • a vector can be prepared and introduced into a host cell (mammalian cell, insect cell, microorganism, etc.) to produce the antibody.
  • the gene encoding immunoglobulin heavy chain and light chain is modified to introduce a desired trait, or a chimera having a human IgG skeleton using immunoglobulin heavy chain and light chain variable regions
  • a person skilled in the art can carry out the production of an antibody, a humanized antibody, a low molecular antibody or a scaffold antibody by using a known technique.
  • the present invention also relates to molecules that bind to the claudin 1 epitope.
  • An epitope is a specific structural unit of an antigen that is recognized and bound by an antibody. When an antibody binds to a pathogenic microorganism or a macromolecular substance, it does not recognize the whole, but recognizes and binds to an epitope, the epitope is the smallest unit for antigenicity, and the molecule that binds to the epitope is For example, organic synthetic compounds and peptides.
  • the anti-HCV therapeutic agent binds to the mouse anti-claudin 1 monoclonal antibody, the human chimeric anti-claudin 1 monoclonal antibody, the humanized anti-claudin 1 monoclonal antibody or fragment thereof or the claudin 1 epitope according to the present embodiment.
  • the active ingredient is the molecule to be used.
  • the effective dose of the anti-HCV therapeutic agent according to this embodiment is not particularly limited, and can be, for example, 0.001 to 1,000 mg / kg body weight per time. Alternatively, the dose may be 0.01 to 100,000 mg / body per patient. Moreover, the anti-HCV therapeutic agent concerning this embodiment can be administered regardless of before and after the clinical symptom of a disease arises as the administration time. The anti-HCV therapeutic agent according to this embodiment can be administered, for example, 1 to 3 times a day, 1 to 7 days a week.
  • the anti-HCV therapeutic agent according to this embodiment is usually administered parenterally, for example, by injection (subcutaneous injection, intravenous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, etc.), but is limited to this dosage form. Instead, for example, it may be administered transdermally, transmucosally, nasally, pulmonary, orally.
  • the anti-HCV therapeutic agent according to this embodiment may contain a preservative that suppresses the growth of microorganisms or a buffer that helps keep the pH within an acceptable range.
  • Preservatives include sodium azide, octadecyldimethylbenzylammonium chloride, hexamethonium chloride, benzalkonium chloride, benzethonium chloride, alkyl parabens such as phenol, butyl or benzyl alcohol, methyl or propylparaben, catechol, resorcinol, cyclohexanol, Such as 3-pentanol and m-cresol.
  • Buffering agents are phosphoric acid, citric acid, and other organic acids.
  • the anti-HCV therapeutic agent according to the present embodiment may include, for example, an excipient, a stabilizer, a chelating agent such as EDTA, a salt, or an antibacterial agent.
  • antioxidants such as ascorbic acid and methionine, polypeptides, proteins such as serum albumin, gelatin, or nonspecific immunoglobulins, polysorbates, hydrophilic polymers such as polyvinylpyrrolidone, glycine, glutamine, asparagine, histidine, It can contain amino acids such as arginine or lysine, monosaccharides such as glucose, mannose, or dextrin, disaccharides, and other carbohydrates, such as sucrose, mannitol, trehalose, or sorbitol.
  • the present invention binds to a mouse anti-crowdin 1 monoclonal antibody, a human chimeric anti-crowdin 1 monoclonal antibody, a humanized anti-crowdin 1 monoclonal antibody or a fragment thereof, or a claudin 1 epitope in an amount effective for the treatment of hepatitis C. It is also possible to construct a kit containing molecules to be used and instructions for use.
  • each genotype is known for HCV, all of the genotypes are involved in the infection of Claudin 1, so mouse anti-Claudin 1 monoclonal antibody, human chimeric anti-Claudin 1 monoclonal antibody, humanized anti-antibody Molecules that bind to the claudin 1 monoclonal antibody or fragment thereof or the claudin 1 epitope are available for the treatment of all genotypes of hepatitis C.
  • An antibody is also defined to include variants having essentially the same biological activity as the antibody and having one or more amino acid residue mutations in the amino acid sequence.
  • Huh7.5.1 cell is a well-differentiated human liver cancer-derived cell line, and is a sub-line of Huh7 cell isolated from liver cancer of a 57-year-old male patient showing high susceptibility to hepatitis C virus (HCV) infection .
  • Huh7.5 cells were isolated as a strain with higher HCV replication capacity than Huh7 cells, and the replicon was eliminated by interferon gamma treatment from a cell line established by introducing the HCV replication system into Huh7.5 cells (HCV replicon cell line).
  • Huh7.5.1 cells were established.
  • S7d6 cells are Cluhdin 1-deficient cells derived from Huh7.5.1 cells, also known as S7-A cells.
  • Hybridoma cells were collected from each well in which a positive shift was confirmed by FCM analysis, and each clone was seeded on a 96-well plate at 1.2 cells / well for 11 days in culture medium 1 *. The cells were cultured at 5 ° C. and 5% CO 2 . After culturing, 20-30 wells where single colony formation was observed under a microscope were selected per plate, and the hybridoma culture supernatant was collected. Hepatoma cells (Huh7.5.1 cells, S7d6 cells) were used, stained with the collected culture supernatant and PE-labeled anti-mouse IgG antibody, and subjected to FCM analysis.
  • a well having a strong shift intensity and a large number of cells was selected for each well, and each well was expanded to 75 cm 2 Flask at 37 ° C. under 5% CO 2 and cultured in a culture medium 2 *. After culturing for 3 to 5 days, the culture was expanded to 150 cm 2 -plate and cultured in culture medium 2 *. After culturing for 5 days, the culture supernatant was collected. Hepatoma cells (Huh7.5.1 cells, S7d6 cells) were used, stained with a portion of the collected culture supernatant and PE-labeled anti-mouse IgG antibody, and subjected to FCM analysis.
  • FIG. 2 shows the results of analyzing the binding of each antibody clone to the cell surface by FCM.
  • the area shown in gray on the right side is a staining pattern of Huh7.5.1 cells (Claudin 1 positive cells) by each hybridoma culture supernatant, and the unfilled area on the left side is each hybridoma. It is a staining pattern of S7d6 cells (Claudin 1 negative cells) by the culture supernatant. All clones showed high binding (positive shift) to Huh7.5.1 cells (Claudin 1 expressing cells). Further, a part of the culture supernatant was used to determine the class and subclass of the antibody in the culture supernatant using a Mouse immunoglobulin isotyping ELISA kit. The results are shown in Table 1.
  • Mouse antibody recognition region sequence analysis 4-1) Western blotting analysis using mouse anti-crowdin 1 antibody Huh7.5.1-8 cells and S7-A cells contain protease inhibitor (SIGMA) and 1% Triton-X A cell lysate was prepared by suspending in PBS and sonicating.
  • SIGMA protease inhibitor
  • PVDF polyvinylidene fluoride
  • T-TBS 5% skim milk
  • primary antibody Rabbit anti-Claudin 1 (Invitrogen), clone 2C1 , 3A2, 5F2, 7A5), mouse anti-GAPDH antibody (abcam) (room temperature, 2 hours), then secondary antibody (Goat anti-rabbit IgG HRP conjugated (Millipore or Jackson Immuno Research) or Goat anti-mouse IgG HRP conjugated (Millipore or Jackson Immuno Research)) Action (room temperature, 1 hour), after extensive washing, ECL Western Blotting Detection Reagents (GE Healthcare Bio-Sciences Corp) or ECL plus Western blotting detection system (GE Healthcare Bio-Sciences Corp.) and an antibody recognition band was detected using Image Quant LAS 4010 (GE Healthcare Bio-Sciences Corp) or by exposing an X-ray film.
  • FIG. 4 Binding analysis to claudin 1 mutant
  • Figure 5 shows the homology analysis of the extracellular region sequence. Analysis of the homology between the amino acid sequences of human claudin 1 and mouse claudin 1 using ClustalW2 It is a thing. Epitope in the first extracellular loop is QWRIYSYAGDNIVTAQAMYEGLWMSCVSQSTGQIQCKVFDSLLNLSSTLQATR (Gln Trp Arg Ile Tyr Ser Tyr Ala Gly Asp Asn Ile Val Thr Ala Gln Ala Met Tyr Glu Gly Leu Trp Met I Phe Asp Ser Leu Leu Asn Leu Ser Ser Thr Leu Gln Ala Thr Arg) (SEQ ID NO: 1). The epitope in the second extracellular loop was QEFYDPMTPVNARYE (Gln Glu Phe Tyr Asp Pro Met Thr Pro Val Asn Ala Arg Tyr Glu) (SEQ ID NO: 2).
  • FIG. 6 shows the results of analysis of five amino acids that differ between the extracellular regions of mouse claudin 1 and human claudin 1.
  • HT1080 cells expressing mouse claudin 1 or mutants (K31R, I46M, N74S, L152M, I155V) in which the extracellular region of mouse claudin 1 was replaced with a human amino acid were collected by trypsin treatment.
  • mice Claudin 1-expressing cells None of the clones bound to mouse Claudin 1-expressing cells, but did bind to human-type amino acid-substituted mouse Claudin 1 mutant (K31R, I46M, N74S, L152M, I155V) -expressing cells. Based on the above results, these 4 clones specifically recognize the human claudin 1 extracellular region, some or all of the amino acids of R31, M46, S74, M152, and V155, or these residues. The affected higher order structure is considered to be involved in recognition.
  • Fig. 7 shows the results of Western blotting analysis.
  • Clone 7A5 did not react with mouse claudin 1, but reacted with human amino acid-substituted mouse claudin 1 mutants (K31R, I46M, N74S, L152M, I155V). It is speculated that some or all of the amino acids of R31, M46, S74, M152 and V155 are involved.
  • the band seen in the lower part of the Claudin 1 band (arrow) in FIG. 7 is not observed in Rabbit anti-Claudin 1 (Invitrogen), so it is considered to be a non-specific band.
  • FIG. 8 shows the results of analysis using the first or second extracellular region mutant.
  • Human Claudin 1 a variant in which the amino acid in the first extracellular region of Human Claudin 1 is replaced with the mouse type (R31K, M46I, S74N), and the amino acid in the second extracellular region of Human Claudin 1 is replaced with the mouse type
  • the binding was analyzed by FCM analysis using 293T cells expressing the mutants (M152L, V155I).
  • Clone 2C1 and clone A 3A2 had reduced binding to human claudin 1 mutant 1 (R31K, M46I, S74N) and human claudin 1 mutant 2 (M152L, V155I) compared to human claudin 1.
  • Clone 5F2 has a weaker binding to human claudin 1 mutant 1 (R31K, M46I, S74N) than human claudin 1, and the binding to human claudin 1 mutant 2 (M152L, V155I) is lost. It was. Clone 7A5 had the same binding to human claudin 1 mutant 1 (R31K, M46I, S74N) as human claudin 1, and the binding to human claudin 1 mutant 2 (M152L, V155I) was lost.
  • FIGS. 9A and 9B are analysis results using a single amino acid variant in the second extracellular region.
  • the binding was analyzed by FCM analysis using 293T cells expressing a mutant in which each amino acid in human claudin 1 and the second extracellular region of human claudin 1 was substituted with alanine.
  • Clone2C1 has decreased binding in D150A mutant, M152A mutant, and V155A mutant expressing cells; clone3A2 has decreased binding in D150A mutant and V155A mutant expressing cells, and lost binding in M152A mutant expressing cells; clone5F2 Is reduced in binding in cells expressing P151A, V155A and Y159A, lost binding in cells expressing D150A and M152A; clone7A5 is binding in cells expressing D150A and M152A Disappearance was observed.
  • clone 7A5 which can detect a human claudin 1 band by Western blotting analysis, can also recognize denatured claudin 1. Therefore, when the Western blotting analysis using clone7A5 was performed using the lysate of cells expressing the above claudin 1 mutant, no band was seen in the D150A mutant, P151A mutant, or M152A mutant, and the E147A mutant, T153A mutant. P154A mutant, V155A mutant, and R158A mutant had significantly decreased band intensity (Fig. 10).
  • the three-dimensional structure constructed by D150, M152, V155 and these residues is involved in the recognition of the second extracellular region of human claudin 1 of clone 2C1 and clone 3A2.
  • the recognition of the second extracellular region of human claudin 1 of clone 5F2 is considered to involve the three-dimensional structure constructed by D150, P151, M152, V155, Y159 and these residues.
  • the recognition of the second extracellular region of non-denatured human claudin 1 involves the three-dimensional structure constructed by D150, M152 and these residues, It is inferred that D150, P151, M152 are essential for recognition, and E147, T153, P154, V155, and R158 are also involved.
  • Huh7.5.1 cells were seeded at 5 ⁇ 10 4 cells / 500 ⁇ L / well on a collagen type I-coated 48-well plate (Corning, NCO3548) and cultured at 37 ° C. for 1 day. The medium was removed, and a medium (200 ⁇ L) containing 0.1 to 5 ⁇ g of 4 types of Claudin 1 purified antibodies was added, followed by incubation at room temperature (25 ° C.) for 1 hour.
  • HCVcc (genotype 2a) (HCV core protein concentration 1.56 pmol / L, equivalent to MOI: 0.5) was added, and the mixture was infected at room temperature (25 ° C.) for 2 hours. After removing the medium containing HCV and washing the cells three times with 500 ⁇ L of medium, 400 ⁇ L of medium containing 0.1 to 5 ⁇ g of each Claudin 1 purified antibody was added and cultured for 4 days.
  • HCVcc solution was prepared according to Murakami Y. etal. Antiviral Res. 83, -112-117 (2009), and diluted to the concentration with the medium for the experiment.
  • HCV core protein concentration was measured by ELISA (Ortho Clinical Diagnostics, HCV antigen ELISA test 601002) to measure the HCV concentration in the culture supernatant.
  • the measurement method was in accordance with the attached manual.
  • FIG. 11 shows the results of the mouse anti-crowdin 1 monoclonal antibody (7A5).
  • the HCV infection inhibitory effect is improved in proportion to the amount of Clone7A5 added, and about 50% infection inhibitory activity is observed at 10 ⁇ 8 g / 0.4 mL, and it becomes saturated from about 10 ⁇ 6 g / 0.4 mL. It was.
  • FIG. 12 shows the results of mouse anti-crowdin 1 monoclonal antibody (2C1, 3A2, 5F2). Clone 2C1, 3A2, and 5F2 also showed HCV infection inhibitory activity depending on the amount added, and about 50% infection inhibitory activity was observed at 10 ⁇ 8 to 10 ⁇ 5 g / 0.4 mL.
  • mice In vivo HCV infection inhibition test of mouse claudin 1 antibody 6-1) In vivo infection inhibition activity
  • Human liver chimeric mice uPA-SCID mice transplanted with human hepatocytes, PXB mice
  • PXB mice Human liver chimeric mice transplanted with human hepatocytes, PXB mice
  • PXB mice Human liver chimeric mice transplanted with human hepatocytes, PXB mice
  • the mice were divided into 3 groups (4 animals each) in consideration of the average body weight and blood human albumin concentration.
  • Control antibody, clone 3A2 or clone 7A5 was intraperitoneally administered to mice.
  • the day of initial administration was day 0, and the antibody dose was 30 mg / kg on day 0, 20 mg / kg on day 3, 10 mg / kg on day 7, and 10 mg / kg on day 10.
  • PBS was used for dilution of the antibody administration solution.
  • mice were anesthetized with isoflurane 8 hours after the first antibody administration, and 100 ⁇ L of HCV (genotype 1b) adjusted to 1.0 ⁇ 10 5 copies / mL with physiological saline was inoculated from the orbital venous plexus.
  • Serum HCV genomic RNA levels were measured using blood collected on Day 0, day 7, day 14, day 21, day 28, day 35, and day 42.
  • RNA extraction was performed from 5 ⁇ L of collected serum using SepaGene® RV-R (Adeia Co., Ltd.), and 10 ⁇ L of Nuclease-free water (containing 1 ⁇ mM DTT® (Promega) and 0.4 ⁇ U / ⁇ L® ribonuclease® inhibitor (Takara® Bio)) Life (Technologies (Corporation)).
  • the PCR reaction solution was prepared using 2.5 ⁇ L of dissolved RNA stock solution or diluted RNA and TaqMan EZ RT-PCR Core Reagents (Life Technologies Corporation).
  • ABI Prism-7500 (Life Technologies Corporation) was used for PCR reaction and analysis.
  • the RT-PCR reaction was performed in 50 cycles of 50 ° C. for 2 minutes ⁇ 60 ° C. for 30 minutes ⁇ 95 ° C. for 5 minutes ⁇ (95 ° C. for 20 seconds ⁇ 62 ° C. for 1 minute).
  • Table 2 below shows In vivo HCV infection inhibitory activity.
  • HCVHC human liver chimeric mouse administered with HCVHC (genotype 1b)
  • Sera of mice administered with the control antibody, clone 3A2 or clone 7A5 were collected daily, and the HCV infection inhibitory activity was evaluated by measuring the amount of serum HCV RNA.
  • the serum HCV level was about 10 7 copies / mL in all individuals at day 28, and the HCV concentration reached a plateau.
  • HCV RNA was not detected in 3 out of 4 animals at day 42 and in 1 clone 4 in the clone 7A5 administration group. The rise of was significantly delayed. From the above results, the HCV infection inhibitory effect by the administration of anti-crowdin 1 antibody was recognized also in vivo. In addition, the difference between the clones in the infection inhibitory activity in vivo correlated with the difference in the HCV infection inhibitory activity in vitro.
  • mice were anesthetized with isoflurane and blood was collected from the orbital venous plexus before antibody administration.
  • the blood human albumin concentration was measured using blood collected on day 0, day 7, day 14, day 21, day 28, day 35, and day 42. 2 ⁇ L of blood was mixed with a buffer solution (LX reagent Eiken series shared buffer, Eiken Chemical Co., Ltd.), centrifuged at 370 g for 3 minutes, and then latex agglutination immunoturbidimetric method (LX reagent “Eiken”) Alb-II, Eiken Chemical Co., Ltd.) was used to measure with an absorption microplate reader (Vmax, Nippon Molecular Device Co., Ltd.).
  • a buffer solution LX reagent Eiken series shared buffer, Eiken Chemical Co., Ltd.
  • Liken latex agglutination immunoturbidimetric method
  • Serum ALT and AST activities were measured using blood collected on day 0, day 7, day 14, and day 21. Dilute 10 ⁇ L of the collected serum with physiological saline, and dry chem 3500 (Fuji Film) using the POP / POD / leuco dye method (the diarylimidazole leuco dye is colored blue with hydrogen peroxide and peroxidase generated by pyruvate oxidase). And measured.
  • FIG. 13 shows changes in body weight when various antibodies were administered to human liver chimeric mice administered with HCV (genotype 1b).
  • FIG. 14 shows the concentration of human albumin in blood when various antibodies were administered to human liver chimeric mice administered with HCV (genotype 1b).
  • FIG. 15 shows AST when various antibodies are administered to human liver chimera mice administered with HCV (genotype 1b).
  • FIG. 16 shows ALTs when various antibodies were administered to human liver chimeric mice administered with HCV (genotype-1b).
  • Clone 3A2 and clone 7A5 are safe and effective because there was no change in general condition, weight loss, decreased blood human albumin concentration, or significant increase in AST and ALT due to administration of anti-claudin 1 antibody. It is considered to be an infection-inhibiting molecule.
  • the clone c3A2 administration group one animal on day 7 showed an AST value higher than that of the other animals, but it showed a low value on day 14 and day 21, and uPA-SCID mice originally had liver dysfunction. It can be said that this change is not caused by administration of anti-crowdin 1 antibody.
  • FIG. 16 although an upward trend of ALT is observed in FIG. 16, since human liver chimeric mice are generally liver injury-induced mice, it is known that an increase in ALT is observed as a background. This is within the background level fluctuation range and is not caused by the administration of anti-claudin 1 antibody.
  • PFUSE2-CLIg-hk (Invivogen), which is a cloning vector having the amplified VL gene and human IgG kappa chain constant region, was treated with AgeI and BsiWI and then ligated.
  • PFUSE-CHIg-hG1 (Invivogen), which is a cloning vector having the amplified VH gene and the human IgG1 heavy chain constant region, was ligated after treatment with EcoRI and NheI. Transform each ligation product into competent cell DH-5 ⁇ , culture independent E. coli clones, collect plasmid DNA, confirm sequence, pFUSE2-CLIg-hk-anti-crowdin 1 and pFUSE-CHIg-hG1- Obtained anti-Claudin 1.
  • the collected supernatant was centrifuged at 100 g for 5 minutes and passed through a 0.45 ⁇ m filter. After washing HiTrap-Protein-G HP (GE-Healthcare) with Milli-Q 5 mL, the column was equilibrated with 10-mL 0.02 M phosphate buffer. After passing the sample through the column, it was washed with 20 mL of 0.02 M phosphate buffer and eluted with 5 mL of 0.1 M Glycine-HCl. At the time of elution, 0.5 mL each of 37.5 ⁇ L of 1 ⁇ M Tris-HCl was collected in an Eppen. The sample after elution was buffer-substituted with PBS using a PD-10 column (GE Healthcare).
  • the purification of the chimeric antibody was confirmed by SDS-PAGE.
  • the protein concentration was measured by an absorbance method.
  • FIG. 17 is a diagram showing the production results of human IgG1 chimeric antibody by SDS-PAGE.
  • the molecular weight of the purified product of the human IgG1 chimeric antibody was confirmed by SDS-PAGE under reducing conditions.
  • the arrow indicates the antibody heavy chain (about 50 kDa) or light chain (about 25 kDa).
  • FIG. 18 is a diagram showing a claudin binding specificity analysis of a human IgG1 chimeric antibody. FCM analysis using human claudin 1, human claudin 2, human claudin 3, human claudin 4, human claudin 6, human claudin 7, human claudin 9 expressing HT1080 cells and mouse claudin 1 expressing L cells Thus, all of the antibody clones showed binding properties to human claudin 2, human claudin 3, human claudin 4, human claudin 6, human claudin 7, human claudin 9, and mouse claudin 1 expressing cells. First, since it was specifically bound to human claudin 1-expressing cells, it was suggested that the CDR region of each clone is essential for human claudin 1 binding.
  • FIG. 19 shows the binding analysis of human IgG1 chimeric antibody to Huh7.5.1-8 cells.
  • the human IgG1 chimeric clone was also bound to Huh7.5.1-8 cells.
  • Huh7.5.1-8 cells were seeded on a 48-well plate at 1 ⁇ 10 5 cells / well / 500 ⁇ L and cultured overnight.
  • Anti-Claudin 1 mouse antibody and human IgG1 chimeric antibody were prepared in various concentrations in a medium, 200 ⁇ L / well antibody solution was added except for the cell culture medium that had been pre-cultured, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 30 minutes. Each antibody was allowed to act at 0 to 5 ⁇ g / well.
  • HCVcc human immunodeficiency virus
  • HCV genomic RNA quantification was performed by Taqman qRT-PCR (reagent: RNA-direct Realtime PCR Master Mix (Toyobo), instrument: LightCycler (Roche)). In addition, the reaction used the reaction solution adjusted according to the composition of Table 3.
  • Sense Primer is 5'-ACGGGGTTAATTATGCAACAGG-3 '(SEQ ID NO: 13)
  • Anitisense Primer is 5'-ACGGTGATGCAGGACAACAG-3' (SEQ ID NO: 14)
  • Taqman Probe is 5 '-[6-FAM] AGCAAGAAGATAGAAAAGGGGAAACCGGGTAG [TAMRA-6-FAM] -3 ′ (SEQ ID NO: 15).
  • FIG. 20 shows in vitro HCV infection inhibitory activity using HCVcco (genotype 2a), and is a quantitative result of intracellular HCV genomic RNA.
  • the HCV infection inhibitory activity of the human IgG1 chimeric antibody was analyzed.
  • the amount of HCV RNA in the cells and in the culture supernatant of all clones decreased depending on the addition concentration, which markedly inhibited infection.
  • the effect was recognized (FIGS. 20 and 21).
  • Huh7.5.1-8 cells were seeded on a 48-well plate at 1 ⁇ 10 5 cells / well / 500 ⁇ L and cultured overnight.
  • Anti-Claudin 1 mouse antibody and human IgG1 chimeric antibody were prepared in various concentrations in a medium, 200 ⁇ L / well antibody solution was added except for the cell culture medium that had been pre-cultured, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 30 minutes. Each antibody was allowed to act at 0 to 5 ⁇ g / well.
  • HCVpp Genotype 1b (TH strain) or 2a (JFH-1 strain), Microbe and Infection 15, 15, 45-55, prepared according to 2013
  • TH strain wild-type 1b
  • 2a JFH-1 strain
  • Microbe and Infection 15, 15, 45-55 prepared according to 2013
  • the plate was washed three times with 500 ⁇ L / well of a medium not containing serum, 400 ⁇ L of an antibody solution having a concentration half that of the pretreatment was added, and the mixture was cultured at 37 ° C. for 3 days.
  • Lysis buffer Promega was added at 100 ⁇ L / well, and the lysate was collected in an eppen, centrifuged at 10,000 ⁇ rpm for 1 minute, and placed on ice. 10 ⁇ L of this supernatant and 50 ⁇ L of luminescent substrate (Piccagene) were mixed and measured with Luminescencer-PSN.
  • the human IgG1 chimeric antibody showed the same addition amount-dependent infection inhibitory activity as the mouse antibody in both genotypes 1b and 2a.
  • PFUSE2-CLIg-hk (Invivogen), which is a cloning vector having the amplified VL gene and human IgG kappa chain constant region, was treated with AgeI and BsiWI and then ligated.
  • PFUSE-CHIg-hG4 (Invivogen), a cloning vector having an amplified VH gene and a human IgG4 heavy chain constant region, was ligated after treatment with EcoRI and NheI. Each ligation product is transformed into competent cell DH-5 ⁇ , the formed independent E. coli clone is cultured, plasmid DNA is recovered, and then pFUSE2-CLIg-hk-anti-crowdin 1 and pFUSE-CHIg- Obtained hG4-anti-Claudin 1.
  • FIG. 24 is a diagram showing a claudin binding analysis of a human IgG4 chimeric antibody. FCM analysis of the binding to human claudin 1 expressing HT1080 cells. A human IgG4 chimeric antibody was prepared for 2C1 and 3A2 having excellent HCV infection inhibitory activity, and all clones retained binding to human claudin 1.
  • FIG. 25 shows in vitro HCV infection inhibitory activity using HCVcc (genotype 2a), and is a quantitative result of intracellular HCV genomic RNA.
  • FIG. 26 shows in vitro HCV infection inhibitory activity using HCVcc (genotype 2a), and is a quantification result of HCV genomic RNA in the culture supernatant.
  • Diamonds indicate mouse antibodies, and squares indicate human IgG4 chimeric antibodies.
  • Anti-Claudin 1 mouse antibody and human IgG4 chimeric antibody were prepared in various concentrations in a medium, 200 ⁇ L / well of antibody solution was added to the precultured cell medium, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 30 minutes. Each antibody was allowed to act at 0 to 5 ⁇ g / well, and HCVpp infection inhibitory activity was analyzed in the same manner as in 8-3).
  • the human IgG4 chimeric antibody showed the same addition amount-dependent infection inhibitory activity as the mouse antibody in both genotypes 1b and 2a.
  • Preparation of human IgG4 mutant chimeric antibody 10-1) Preparation of expression vector IgG4 is known to improve in vivo stability by substituting Ser at position 228 in the heavy chain constant region with Pro (Immunology, 105, 9-19, 2002). Therefore, a primer was designed to replace 228th Ser with Pro, 682 bp between NheI site and BsrGI site was amplified by PCR using pFUSE-CHIg-hG4 (Invivogen) as a template, and the PCR product was electrophoresed. After separation, it was purified. The NheI site was added to the primer upstream of the mutation insertion site, and the BsrGI site was added to the downstream primer.
  • the PCR product inserted with the mutation and pFUSE-CHIg-hG4-anti-Claudin 1 were treated with NheI and BsrGI and then ligated. Each ligation product was transformed into competent cell DH-5 ⁇ , the formed independent E. coli clone was cultured, the plasmid DNA was recovered, the sequence was confirmed, and pFUSE-CHIg-hG4mutant-anti-crowdin 1 was obtained.
  • FIG. 29 is a diagram showing a claudin binding analysis of a human IgG4 mutant chimeric antibody.
  • FCM analysis of the binding to human claudin 1-expressing HT1080 cells revealed that all clones retained the binding to human claudin 1.
  • this human IgG4 mutant chimeric antibody also has HCV infection inhibitory activity.
  • It can be used as a therapeutic agent for hepatitis C.

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Abstract

　十分なHCV感染阻害活性を有する抗クラウディン１モノクローナル抗体を提供する。本発明にかかる抗体は、マウス抗クラウディン１モノクローナル抗体である。また、ヒトクラウディン１の第二細胞外ループ中のエピトープを認識してヒトクラウディン１に結合する抗クラウディン１モノクローナル抗体である。抗クラウディン１モノクローナル抗体、マウス抗クラウディン１モノクローナル抗体、ヒトキメラ抗クラウディン１モノクローナル抗体、ヒト化抗クラウディン１モノクローナル抗体を有効成分とする抗HCV治療剤が提供される。

Description

抗体、フラグメント、分子及び抗HCV治療剤
　本発明は、クラウディン１抗体、その抗体のフラグメント、クラウディン１エピトープに結合する分子、及びその抗体等を有効成分とする抗HCV治療剤に関する。
　C型肝炎ウイルス（以下、本明細書において「HCV」と記載する場合がある）は慢性肝疾患発症の主要因の一つであり、感染者は国内では約170万人に達すると推定される。HCV感染者の約７割は慢性肝炎に進行し、その後20～30年をかけて約半数が肝硬変に、約10％が肝癌に至り、国内の肝癌による年間死亡者数のうち約8割がHCV感染に起因するものとされている。国内のHCV保有者は肝炎の症状を示していないウイルスキャリアーを含めると200万人以上と推定されており、それはこれまでインターフェロン以外の有効な抗ウイルス剤が無かったことが主原因となっている。
　HCVのようにエンベロープを持ったウイルスが細胞に感染する際は、細胞表面の特異的なタンパク質（ウイルス受容体）に結合し、その後、ウイルス膜と細胞膜が融合してウイルス遺伝子を細胞内に注入する。そのため、HCVが細胞表面のウイルス受容体に結合し進入するのを阻止できる抗体等が求められる。
　哺乳動物で発現させたHCVのE2タンパク質がヒト細胞表面に存在するCD81に特異的に結合することが示され、この実験系を用いて、C型肝炎患者からE2タンパク質とCD81との結合を阻害するNOB（neutralisation of binding）活性を示す抗体の開発がなされている。例えば遺伝子型1aのC型慢性肝炎患者の骨髄リンパ球から抗体遺伝子ライブラリーを作製し、ファージディスプレイ法を用いて、NOB活性を示す抗体が作製されている（特許文献1）。しかし、上記のHCV感染患者からモノクローナル抗体を取得する方法では、HCV感染阻害抗体が存在する患者に限定されること、エンベロープタンパク質は高率に変異することなどから、抗HCV剤として有用な抗体を見出すことが困難である。
　一方、クラウディン(Claudin)は、タイトジャンクションの主要なタンパク質で、タイトジャンクションにおけるストランド形成を担っており、細胞間バリアーを作り出している。クラウディン分子は現在27種類のファミリー分子が報告されており、クラウディン分子同士がホモフィリック若しくはヘテロフィリックに結合し、細胞間接着に機能すると考えられている。そのうち、クラウディン1はHCVの感染受容体の一つであること、大腸癌等において高発現していること、肝細胞の癌化にも関与していることから、創薬ターゲットとして注目されており、例えば、ヒトクラウディン1抗体としてラットモノクローナル抗体が作製されている（特許文献2、非特許文献1）。
特表２００５－５３１２８６号公報 特表２０１２－５０３６３２号公報
Gastroenterology, 139,953,2010
　しかしながら、クラウディン1は細胞外領域の小さな4回膜貫通タンパク質であること、細胞外領域の種間ホモロジーが高いことから、抗体を含めてクラウディン1のバインダーの創製は立ち後れており、上記のラットモノクローナル抗体のHCV感染阻害活性はin vivo HCV感染阻害活性が報告されておらず十分なものとはいえない。
　本発明はかかる問題点に鑑みてなされたものであって、十分なHCV感染阻害活性を有する抗クラウディン1モノクローナル抗体、及びその抗クラウディン1モノクローナル抗体等を有効成分として有する抗HCV治療剤を提供することを目的とする。
　本発明にかかる抗クラウディン1モノクローナル抗体は、ヒトクラウディン1の第二細胞外ループ中のエピトープを認識してヒトクラウディン１に結合する抗クラウディン1モノクローナル抗体である。
　本発明にかかる抗クラウディン1モノクローナル抗体は、マウス抗クラウディン1モノクローナル抗体、ヒトキメラ抗クラウディン1モノクローナル抗体及びヒト化抗クラウディン1モノクローナル抗体である。
　また、本発明にかかる抗HCV治療剤は、上述の抗クラウディン1モノクローナル抗体、マウス抗クラウディン1モノクローナル抗体、ヒトキメラ抗クラウディン1モノクローナル抗体、ヒト化抗クラウディン1モノクローナル抗体若しくはそのフラグメント又は抗クラウディン1モノクローナル抗体のエピトープに結合する分子を有効成分とする。
　本発明によれば、十分なHCV感染阻害活性を有する抗クラウディン1モノクローナル抗体が得られる。また、本発明にかかる抗HCV治療剤は、十分なHCV感染阻害活性を有する。
各マウス抗クラウディン1モノクローナル抗体のVH及びVLのアミノ酸配列を示す図である。 細胞表面クラウディン1への各マウス抗クラウディン1モノクローナル抗体の結合をフローサイトメトリー解析により示した図である。 マウス抗体のクラウディン結合特異性解析結果を示す図である。 マウス抗体によるウエスタンブロッティング解析結果を示す図である。 細胞外領域配列の相同性解析結果を示す図であり、ClustalW2を用いて、ヒトクラウディン1とマウスクラウディン1のアミノ酸配列の相同性を解析したものである。 第一及び第二細胞外領域変異体を用いたフローサイトメトリー解析結果を示す図である。 マウス抗クラウディン1モノクローナル抗体7A5によるウエスタンブロッティング解析結果を示す図である。 第一若しくは第二細胞外領域変異体を用いたフローサイトメトリー解析結果を示す図である。 第二細胞外領域の1アミノ酸変異体を用いたフローサイトメトリー解析結果を示す図である。 第二細胞外領域の1アミノ酸変異体を用いたフローサイトメトリー解析結果を示す図である。 第二細胞外領域の1アミノ酸変異体を用いたマウス抗クラウディン1モノクローナル抗体7A5によるウエスタンブロッティング解析結果を示す図である。 マウス抗クラウディン１モノクローナル抗体7A5のHCV感染阻害効果(培養細胞レベル)を示す図である。 マウス抗クラウディン１モノクローナル抗体2C1、3A2及び5F2のHCV感染阻害効果(培養細胞レベル)を示す図である。 HCV (genotype 1b)を投与したヒト肝キメラマウスに各種抗体を投与した際の体重変化を示す図である。 HCV (genotype 1b)を投与したヒト肝キメラマウスに各種抗体を投与した際の血中のヒトアルブミン濃度を示す図である。 HCV (genotype 1b)を投与したヒト肝キメラマウスに各種抗体を投与した際のASTを示す図である。 HCV (genotype 1b)を投与したヒト肝キメラマウスに各種抗体を投与した際のALTを示す図である。 SDS-PAGEによるヒトIgG1キメラ抗体の作製結果を示す図である。 ヒトIgG1キメラ抗体のクラウディン結合特異性解析を示す図である。 ヒトIgG1キメラ抗体のHuh7.5.1-8細胞に対する結合性解析を示す図である。 HCVcc (genotype 2a)を用いたヒトIgG1キメラ抗体のin vitro HCV感染阻害活性であり、細胞内のHCVゲノムRNAの定量結果である。 HCVcc (genotype 2a)を用いたヒトIgG1キメラ抗体のin vitro HCV感染阻害活性であり、培養上清中のHCVゲノムRNAの定量結果である。 HCVpp（genotype 1b）を用いたヒトIgG1キメラ抗体のin vitro HCV感染阻害活性を示す図である。 HCVpp（genotype 2a）を用いたヒトIgG1キメラ抗体のin vitro HCV感染阻害活性を示す図である。 ヒトIgG4キメラ抗体のクラウディン結合性解析を示す図である。 HCVcc (genotype 2a)を用いたヒトIgG4キメラ抗体のin vitro HCV感染阻害活性であり、細胞内のHCVゲノムRNAの定量結果である。 HCVcc (genotype 2a)を用いたヒトIgG4キメラ抗体のin vitro HCV感染阻害活性であり、培養上清中のHCVゲノムRNAの定量結果である。 HCVpp（genotype 1b）を用いたヒトIgG4キメラ抗体のin vitro HCV感染阻害活性を示す図である。 HCVpp（genotype 2a）を用いたヒトIgG4キメラ抗体のin vitro HCV感染阻害活性を示す図である。 ヒトIgG4変異体キメラ抗体のクラウディン結合性解析を示す図である。
　以下、添付の図面を参照して本発明の実施形態について具体的に説明するが、当該実施形態は本発明の原理の理解を容易にするためのものであり、本発明の範囲は、下記の実施形態に限られるものではなく、当業者が以下の実施形態の構成を適宜置換した他の実施形態も、本発明の範囲に含まれる。
　（抗体）
　これまでにクラウディン1リガンド抗体としては、クラウディン1強制発現細胞を用いたスクリーニングによって得られたラットモノクローナル抗体しかないが、本発明にかかる抗クラウディン1モノクローナル抗体は、HCVに感染する細胞（内在性にクラウディン1を発現）と本細胞から樹立したHCVに感染しない細胞（クラウディン1を特異的に欠損）を用いたスクリーニングによって得られたマウス抗クラウディン1モノクローナル抗体である。本発明にかかる抗クラウディン1モノクローナル抗体は、クラウディン1遺伝子によりコードされるポリペプチドの細胞外領域の立体構造を特異的に認識し、且つ該細胞外領域に結合する。
　クラウディン1の細胞外領域には、例えばリガンド結合ドメイン（Ligand binding domain）、第一及び第二のフィブロネクチンドメイン（Fibronectin domain）のいずれも包含する。モノクローナル抗体、キメラ型抗体、ヒト化抗体は、任意のアイソタイプであることができる。抗体は、例えば、ヒトIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、あるいはそれらの改変体、マウスIgM、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgA、IgD、IgE、あるいはそれらの改変体であってもよい。任意の重鎖は、κ又はλ型の軽鎖と対形成してもよい。抗体にはFabフラグメント、F (ab’)2フラグメント、又はFvフラグメントが包含される。
　本発明者らは、マウス抗クラウディン1モノクローナル抗体として4つのクローンの作成に成功しており、それぞれ2C1、3A2、5F2、及び7A5と命名している。
　本発明にかかる抗クラウディン1モノクローナル抗体は、クラウディン1の第二細胞外ループ中のエピトープに結合する抗クラウディン1モノクローナル抗体である。
　具体的には、2C1、3A2及び5F2の認識にはヒトクラウディン1の第一、第二細胞外領域双方が部分的に関与し、5F2及び7A5の認識にはヒトクラウディン1第二細胞外領域が必須である。
　後述するように、第一細胞外ループ中のエピトープは、QWRIYSYAGDNIVTAQAMYEGLWMSCVSQSTGQIQCKVFDSLLNLSSTLQATR(Gln Trp Arg Ile Tyr Ser Tyr Ala Gly Asp Asn Ile Val Thr Ala Gln Ala Met Tyr Glu Gly Leu Trp Met Ser Cys Val Ser Gln Ser Thr Gly Gln Ile Gln Cys Lys Val Phe Asp Ser Leu Leu Asn Leu Ser Ser Thr Leu Gln Ala Thr Arg)(配列番号1)である。また、第二細胞外ループ中のエピトープは、QEFYDPMTPVNARYE(Gln Glu Phe Tyr Asp Pro Met Thr Pro Val Asn Ala Arg Tyr Glu)(配列番号2)である。
　完全な抗体分子は、2つの重（H）鎖可変領域（VH）及び2つの軽（L）鎖可変領域（VL）を有しているところ、2C1では、VHは、QVQLQQPGAELVKTGASVKLSCKASGYTFASYWMHWVKQRPGQGPEWIGMSHPNIGATKYNEKFKTKATLTVEKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCATSGFDYWGQGTTLTVSSであった（配列番号3）。また、2C1では、VLは、DIVLTQSPDTLSVTPGDSVSLSCRATQSISNNLHWYRQKSHESPRLLIKYASQSVSGIPSRFSGSGSGTDFTLNINSVETEDFGMYFCQQSNSWPFTFGSGTKLEIKRであった（配列番号4）。また、3A2では、VHは、QVQLRQPGTELIKTGASVKLSCKASGYSFSSYWMHWVKQRPGQGLEWVGMIHPNIGATNYNEKFKSKAILTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCATSGFDYWGQGTTLTVSSであった（配列番号5）。また、3A2では、VLは、DIVLTQSPASLSVTPGDSVSLSCRATQSISNNLHWYRQKSHESPRPLIKYASQSISGIPSRFSGSGSGTVFTLNINSVETEDFGMYFCQQSNSWPFTFGSGTKLEIKRであった（配列番号6）。また、5F2では、VHは、EVQLQQSGPELVKPGASVTISCKVSGYTFTDYYMNWMKQSHGKSLEWIGDINPNNGDTNYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYFCAGRLVYWGQGTLVTVSAであった（配列番号7）。また、5F2では、VLは、DPVLTQIPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLENSNGNTYLNWYLQKPGQSPQLLIYRVSNRFSGVQDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCLQVTHVPWTFGGGTKLEIKRであった（配列番号8）。また、7A5では、VHは、QVQVHQSGAELARPGASVKLSCKASGNTFTNYGVNWVKQRAGQGLEWIGEIYPRSGDIFYNENFKGKATLTADKSSTTAYMELRSLTSGDSAVFFCARRENYYNYVGAMDDWGQGTSVTVSSであった（配列番号9）。また、7A5では、VLは、DIVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQNLVHRSGNTYLHWYLQKPGQSPRLLIYKVSNRFSGVPVRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPWTFGGGTKLEIKRであった（配列番号10）。
　VH及びVL領域は、相補性決定領域（CDR）に細分することができ、フレームワーク領域（FR）が散在している。本発明者らは、ハイブリドーマmRNAからRACE法（rapid amplification of cDNA ends）にてVH領域及びVL領域の塩基配列を決定し、アミノ酸配列を解析したところ、図1に示されるとおりの配列であった。
　本実施形態にかかる抗体は、任意の種類の分子と抗体との共有結合により修飾又は複合化された、抗体誘導体を包含することも可能である。このような抗体誘導体として、例えば、アセチル化、グリコシル化、アミド化、PEG化、リン酸化、既知の保護基／ブロック基による誘導体化、タンパク質分解的開裂、又は細胞内配位子又は他のタンパク質あるいは低分子化合物への結合により修飾されている抗体が挙げられる。
　本実施形態にかかる抗体を取得する方法としては、取得したい抗体を産生するハイブリドーマを培養し、得られた培養上清から常法によって抗体を精製して取得することができる。取得したハイブリドーマから抗体を採取する方法は、特に限定されるものではないが、例えば通常の腹水形成法や細胞培養法等を用いることが可能である。腹水形成法においては、例えば、骨髄腫細胞由来の哺乳動物と同種の動物の腹腔内にプリスタン等の鉱物油を投与し、その後ハイブリドーマ1×10６～1×10９個を腹腔内に投与し、ハイブリドーマを大量に増殖させる。そして、1～4週間後に腹水又は血清を採集する。細胞培養法においては、例えば、ハイブリドーマを10～20％仔ウシ血清含有IMDM、RPMI-1640、MEM、E-RDF又は無血清培地等の動物細胞培養培地中で、通常の培養条件（例えば37 ℃、5％ CO2濃度）で3～14日間培養し、その培養上清から抗体を取得することができる。抗体の精製は、例えば、硫安塩析法、DEAEセルロース等の陰イオン交換体を利用するイオン交換クロマトグラフィー、プロテインAセファロース等を用いるアフィニティークロマトグラフィー、分子量や構造によってふるい分ける分子ふるいクロマトグラフィー等の公知の方法を適宜に選択して精製することが可能である。
　また、別の方法としては、取得したい抗体を産生するハイブリドーマから抗体をコードする遺伝子、より詳細には免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子を取得して、該遺伝子を発現するためのベクターを作成し、宿主細胞（哺乳類細胞、昆虫細胞、微生物等）に導入して、該抗体を産生させることも可能である。このとき、免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子について、望む形質を導入するための遺伝子改変を行ったり、免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖の可変領域を用いてヒトIgG骨格を有するキメラ抗体あるいはヒト化抗体、低分子抗体やスキャフォールド抗体を作成することは、公知の技術を用いることで、当業者であれば実施することができる。
　また、本発明は、クラウディン1エピトープ(epitope)に結合する分子にも関する。エピトープ(epitope)とは、抗体が認識して結合する抗原の特定の構造単位である。抗体は病原微生物や高分子物質等と結合する際、その全体を認識するわけではなく、エピトープを認識して結合し、エピトープは抗原性のための最小単位であり、エピトープに結合する分子は、例えば有機合成化合物やペプチド等である。
　（抗HCV治療剤）
　本実施形態にかかる抗HCV治療剤は、本実施形態にかかるマウス抗クラウディン1モノクローナル抗体、ヒトキメラ抗クラウディン1モノクローナル抗体、ヒト化抗クラウディン1モノクローナル抗体若しくはそのフラグメント又はクラウディン1エピトープに結合する分子を有効成分とする。
　本実施形態にかかる抗HCV治療剤の有効投与量は、特に限定されるものではないが、例えば、1回につき体重1 kgあたり0.001～1,000 mgとすることができる。又は、患者あたり0.01～100,000 mg/bodyの投与量とすることができる。また、本実施形態にかかる抗HCV治療剤は、その投与時期として、疾患の臨床症状が生ずる前後を問わず投与することができる。本実施形態にかかる抗HCV治療剤は、例えば、1日1～3回、1週間に1～7日投与することが可能である。
　本実施形態にかかる抗HCV治療剤は、通常、非経口投与で、例えば注射剤（皮下注、静注、筋注、腹腔内注など）で投与されるが、この投与形態に限定されるものではなく、例えば、経皮、経粘膜、経鼻、経肺、経口等で投与してもよい。
　本実施形態にかかる抗HCV治療剤は、微生物の増殖を抑制する防腐剤又はpHを許容範囲に保つのに役立つ緩衝剤を含んでもよい。防腐剤は、アジ化ナトリウム、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロライド、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチル若しくはベンジルアルコール、メチル若しくはプロピルパラベン等のアルキルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、3-ペンタノール、及びm-クレゾール等である。緩衝剤は、リン酸、クエン酸、及びその他の有機酸である。
　また、本実施形態にかかる抗HCV治療剤は、例えば、賦形剤、安定剤、EDTA等のキレート化剤、塩、又は抗菌剤を含んでもよい。他にも、アスコルビン酸及びメチオニン等の酸化防止剤、ポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチン、若しくは非特異的免疫グロブリン等のタンパク質、ポリソルベート、ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、若しくはリジン等のアミノ酸、グルコース、マンノース、若しくはデキストリン等の単糖類、二糖類、及びその他の炭水化物、スクロース、マンニトール、トレハロース、若しくはソルビトール等の糖類を含むことが可能である。
　なお、本発明は、C型肝炎の治療に有効な量のマウス抗クラウディン1モノクローナル抗体、ヒトキメラ抗クラウディン1モノクローナル抗体、ヒト化抗クラウディン1モノクローナル抗体若しくはそのフラグメント又はクラウディン1エピトープに結合する分子及び使用説明書を含む、キットを構成することも可能である。
　なお、HCVには各遺伝子型が知られるが、すべての遺伝子型でクラウディン1が感染に関与していることから、マウス抗クラウディン1モノクローナル抗体、ヒトキメラ抗クラウディン1モノクローナル抗体、ヒト化抗クラウディン1モノクローナル抗体若しくはそのフラグメント又はクラウディン1エピトープに結合する分子は、すべての遺伝子型のC型肝炎の治療に利用可能である。また、抗体には、該抗体と本質的に同等の生物学的活性をもち且つそのアミノ酸配列中1もしくは複数のアミノ酸残基の変異を有する変異体も含まれるものと定義する。
　１）細胞融合
　ヒトクラウディン1発現プラスミドをBXSBマウス皮下に免疫し、血清中の抗体価上昇が観察された個体に対し、最終免疫（ブースティング）を行った。最終免疫後、動物からリンパ細胞を回収し、マウスミエローマ細胞（P3U1）と細胞融合を行った。融合後の細胞を96-well plate 10枚に播種し、培養培地１*にて13日間、37 ℃、5% CO2下で培養した。
*培養培地1：D-MEM (Wako, 044-29765) + 10% FCS (Hyclone, Lot.FQF24009), 10% BM condimed H1 Hybridoma cloning supplement (Roche, 1088947), 1×HAT supplement (Invitrogen, 21060017), 50μg/mL Penicillin/Streptomycin (Invitrogen, 15140122), 4 mM L-Glutamine (Invitrogen, 25030081)
　２）特異モノクローナル抗体産生ハイブリドーマの樹立
　培養後、全てのプレートウェルから培養上清を回収した。Hepatoma細胞（Huh7.5.1細胞、S7d6細胞）を用い、上記で回収した培養上清、及びPE標識抗マウスIgG抗体で染色し、フローサイトメーター(FCM)解析を行った。
　ここで、Huh7.5.1細胞は、高分化型ヒト肝癌由来細胞株であり、高いC型肝炎ウイルス（HCV）感染感受性を示す、57歳男性患者の肝癌より分離されたHuh7細胞の亜株である。まずHuh7細胞よりHCV複製能の高い株としてHuh7.5細胞が分離され、更にHuh7.5細胞にHCV複製システムを導入して樹立した細胞株（HCVレプリコン細胞株）からインターフェロンガンマ処理によりレプリコンを排除することでHuh7.5.1細胞は樹立された。また、S7d6細胞は、Huh7.5.1細胞由来のクラウディン1欠損細胞であり、別名S7-A細胞である。Huh7.5.1細胞にヒトCD81（pcDNA3.1-hCD81）を発現させた細胞にHCVを感染させ、生き残ってくる（HCVに感染しない）細胞として樹立されたものである。遺伝子発現解析を行った結果、クラウディン1の発現が特異的に欠損していることが明らかとなった。イムノブロット解析、細胞免疫染色、FCM解析、ｍRNA定量解析等によってもクラウディン1の欠損が確認されている。
　FCM解析にて、陽性を示すシフトが確認されたウエルから、それぞれハイブリドーマ細胞を回収し、各クローンに関し1.2 cells/wellで96-well plate 1枚に撒き、培養培地1*にて11日間、37 ℃、5% CO2下で培養した。培養後、顕微鏡下でシングルコロニー形成の認められるウェルをプレートあたり20～30選択し、そのハイブリドーマ培養上清を回収した。Hepatoma細胞（Huh7.5.1細胞、S7d6細胞）を用い、回収した培養上清、及びPE標識抗マウスIgG抗体で染色し、FCM解析を行った。
　FCM陽性の確認された4クローン分のプレートから、シフト強度が強く、且つ細胞数の多いウェルを各クローン3 wellずつ選択し、24-well plateに37 ℃、5% CO2下で拡大し培養培地1*にて培養を行った。3日間培養後、全てのウェルを6-well plateに拡大し培養培地2*にて培養を行った。3日間培養後、培養上清を回収した。Hepatoma細胞（Huh7.5.1細胞、S7d6細胞）を用い、回収した培養上清、及びPE標識抗マウスIgG抗体で染色し、FCM解析を行った。
　この結果、全てのウェルにおいて、陽性を示すシフトが確認された。シフト強度が強く、且つ細胞数の多いウェルを各クローン1 wellずつ選択し、75 cm2 Flaskに37 ℃、5% CO2下で拡大し培養培地2*にて培養を行った。3～5日間培養後、150 cm2 -plateに拡大し培養培地2*にて培養を行った。5日間培養後、培養上清を回収した。Hepatoma細胞（Huh7.5.1細胞、S7d6細胞）を用い、回収した培養上清の一部、及びPE標識抗マウスIgG抗体で染色し、FCM解析を行った。この結果、図１に示される合計4クローンにおいて、各クローンで複数の陽性を示すシフトが確認された（図2）。図2は、各抗体クローンの細胞表面への結合をFCMにより解析した結果である。ここで図2において、右側の灰色で示されたエリアは、各ハイブリドーマ培養上清によるHuh7.5.1細胞（クラウディン１陽性細胞）の染色パターンであり、左側の塗りつぶされていないエリアは、各ハイブリドーマ培養上清によるS7d6細胞（クラウディン１陰性細胞）の染色パターンである。すべてのクローンはHuh7.5.1細胞（クラウディン１発現細胞）への高い結合性（陽性シフト）を示した。また、培養上清の一部を用いて、Mouse immunoglobulin isotyping ELISA kitを用いて培養上清中の抗体のクラス、サブクラス決定を行った。結果を表1に示す。
*培養培地2：D-MEM (Wako, 044-29765) + 10% FCS (Hyclone, Lot.FQF24009), 5% BM condimed H1 Hybridoma cloning supplement (Roche, 1088947), 1×HAT supplement (Invitrogen, 21060017), 50μg/mL Penicillin/Streptomycin (Invitrogen, 15140122), 4 mM L-Glutamine (Invitrogen, 25030081)
　３）マウス抗クラウディン1モノクローナル抗体の各種クラウディンに対する結合性解析
　ヒトクラウディン1（NP_066924.1）、ヒトクラウディン2（NP_001164563.1）、ヒトクラウディン4（NP_001296.1）、ヒトクラウディン5（NP_001124333.1）、ヒトクラウディン6（NP_067018.2）、ヒトクラウディン7（NP_001171952.1）、ヒトクラウディン9（NP_066192.1）発現HT1080細胞またはマウスクラウディン1（NP_057883.1）発現L細胞をトリプシン処理により回収した。5.0×105　cellsに対し、各抗体5μg/ mLを100 μL添加、撹拌後、氷上で1時間静置した。0.2% BSA-PBSにて1回洗浄後、1% BSA-PBSにて希釈したGoat anti-mouse IgG（H+L）-FITC抗体（ROCKLAND）を添加、撹拌後、氷上で遮光し30分静置した。0.2% BSA-PBSにて2回洗浄後、0.2% BSA-PBSにて終濃度5μg/mLとなるように希釈したPI（Miltenyi Biotec）を加え、FCM解析を行った。結果を図3に示す。いずれの抗体クローンも、ヒトクラウディン2、ヒトクラウディン4、ヒトクラウディン5、ヒトクラウディン6、ヒトクラウディン7、ヒトクラウディン9には結合せず、ヒトクラウディン1に対して特異的に結合していた。また、マウスクラウディン1にも結合性を示さなかった。
　４）マウス抗体の認識領域配列解析
　４－１）マウス抗クラウディン1抗体を用いたウエスタンブロッティング解析
　Huh7.5.1-8細胞及びS7-A細胞をprotease inhibitor（SIGMA）及び 1% Triton-Xを含むPBSで懸濁、超音波処理することで細胞溶解液を調製した。ポリアクリルアミド電気泳動後、polyvinylidene fluoride（PVDF）膜に転写、PVDF膜を5% スキムミルク含有T-TBS中でブロッキング（室温、2時間）、一次抗体（Rabbit anti-クラウディン１（Invitrogen）、clone 2C1、3A2、5F2、7A5）、mouse anti-GAPDH antibody（abcam）を作用（室温、2時間）、その後二次抗体（Goat anti-rabbit IgG HRP conjugated（MilliporeあるいはJackson Immuno Research）もしくはGoat anti-mouse IgG HRP conjugated（MilliporeあるいはJackson Immuno Research）） 作用（室温、1時間）、十分に洗浄した後に、ECL Western Blotting Detection Reagents(GE Healthcare Bio-Sciences Corp)またはECL plus Western blotting detection system（GE Healthcare Bio-Sciences Corp）を添加し、Image Quant LAS 4010（GE Healthcare Bio-Sciences Corp）を用いるもしくはX線フィルムを感光させることで抗体認識バンドを検出した。結果を図4に示す。クラウディン1を発現していないS7-A細胞の溶解液を用いた場合ではいずれの抗体でもバンドは検出されず、クラウディン1を発現しているHuh7.5.1-8細胞の溶解液を用いたところ、clone 2C1, 3A2, 5F2はいずれもクラウディン1と反応せず、clone 7A5のみクラウディン1との反応が観察された。このことから、clone 2C1, 3A2, 5F2はクラウディン1の立体構造を認識すること、clone 7A5は変性クラウディン1も認識することが示された。
　４－２）クラウディン1変異体に対する結合性解析
　図5は、細胞外領域配列の相同性解析であり、ClustalW2を用いて、ヒトクラウディン1とマウスクラウディン1のアミノ酸配列の相同性を解析したものである。第一細胞外ループ中のエピトープは、QWRIYSYAGDNIVTAQAMYEGLWMSCVSQSTGQIQCKVFDSLLNLSSTLQATR(Gln Trp Arg Ile Tyr Ser Tyr Ala Gly Asp Asn Ile Val Thr Ala Gln Ala Met Tyr Glu Gly Leu Trp Met Ser Cys Val Ser Gln Ser Thr Gly Gln Ile Gln Cys Lys Val Phe Asp Ser Leu Leu Asn Leu Ser Ser Thr Leu Gln Ala Thr Arg)(配列番号1)であった。また、第二細胞外ループ中のエピトープは、QEFYDPMTPVNARYE(Gln Glu Phe Tyr Asp Pro Met Thr Pro Val Asn Ala Arg Tyr Glu)(配列番号2)であった。
　図6は、マウスクラウディン1とヒトクラウディン1の細胞外領域間で異なる5アミノ酸について解析した結果である。マウスクラウディン1、またはマウスクラウディン1の細胞外領域をヒト型アミノ酸に置換した変異体（K31R、I46M、N74S、L152M、I155V）発現HT1080細胞をトリプシン処理により回収した。5.0×105cellsに対し、各抗体5μg/mLを100μL添加し、3）と同様の操作でFCM解析を行った（図6）。いずれのクローンもマウスクラウディン1発現細胞には結合せずヒト型アミノ酸置換マウスクラウディン1変異体（K31R、I46M、N74S、L152M、I155V）発現細胞には結合していた。以上の結果より、これら4クローンは、ヒトクラウディン1細胞外領域を特異的に認識していること、R31、M46、S74、M152、V155のアミノ酸の一部もしくは全て、あるいはこれらの残基によって影響を受ける高次構造が認識に関与していると考えられる。
　図7は、ウエスタンブロッティング解析結果である。４－１）と同様の方法で、各細胞の溶解液を調製しポリアクリルアミド電気泳動後、PVDF膜にタンパク質を転写し、各種一次抗体及び二次抗体を用いて、クラウディン1の検出を行った。Clone 7A5は、マウスクラウディン1には反応せず、ヒト型アミノ酸置換マウスクラウディン1変異体（K31R、I46M、N74S、L152M、I155V）に反応していたことから、clone 7A5の一次構造認識にもR31、M46、S74、M152、V155のアミノ酸の一部若しくは全てが関与していると推察される。尚、図7のクラウディン1のバンド（矢印）下部に見えるバンドはRabbit anti-クラウディン１（Invitrogen）では観察されないことから非特異的なバンドであると考えられる。
　図8は、第一若しくは第二細胞外領域変異体を用いた解析結果である。ヒトクラウディン1、ヒトクラウディン1の第一細胞外領域のアミノ酸をマウス型に置換した変異体（R31K、M46I、S74N）、ヒトクラウディン1の第二細胞外領域のアミノ酸をマウス型に置換した変異体（M152L、V155I）を発現させた293T細胞を用いてFCM解析により結合性を解析した。Clone 2C1及びclone 3A2はヒトクラウディン1に比してヒトクラウディン1変異体１（R31K、M46I、S74N）、ヒトクラウディン1変異体2（M152L、V155I）に対する結合性は減弱していた。Clone 5F2はヒトクラウディン1に比してヒトクラウディン1変異体１（R31K、M46I、S74N）に対する結合性は減弱し、ヒトクラウディン1変異体2（M152L, V155I）に対する結合性は消失していた。Clone 7A5はヒトクラウディン1変異体１（R31K、M46I、S74N）に対する結合性はヒトクラウディン1と変わらず、ヒトクラウディン1変異体2（M152L, V155I）に対する結合性は消失していた。
　このことから、clone 2C1、clone 3A2及びclone 5F2の認識にはヒトクラウディン1の第一、第二細胞外領域双方が部分的に関与し、clone 5F2及びclone 7A5の認識にはヒトクラウディン1第二細胞外領域が必須であると推察された。
　図9A及び9Bは、第二細胞外領域の1アミノ酸変異体を用いた解析結果である。ヒトクラウディン1、ヒトクラウディン1の第二細胞外領域の各1アミノ酸をアラニンに置換した変異体を発現させた293T細胞を用いてFCM解析により結合性を解析した。Clone2C1はD150A変異体、M152A変異体、V155A変異体発現細胞で結合性の低下；clone3A2はD150A変異体、V155A変異体発現細胞で結合性の低下、M152A変異体発現細胞で結合性の消失；clone5F2はP151A変異体、V155A変異体、Y159A変異体発現細胞で結合性の低下、D150A変異体、M152A変異体発現細胞で結合性の消失；clone7A5はD150A変異体、M152A変異体発現細胞で結合性の消失が観察された。
　また、先に図4で示したように、ウエスタンブロッティング解析でヒトクラウディン1のバンドが検出できるclone7A5については変性クラウディン1も認識できることがわかっている。そこで上記クラウディン1変異体発現細胞の溶解液を用い、clone7A5によるウエスタンブロッティング解析を行ったところ、D150A変異体, P151A変異体, M152A変異体ではバンドが見られなくなり、E147A変異体, T153A変異体, P154A変異体, V155A変異体, R158A変異体では有意にバンド強度が低下していた（図10）。
　このことから、clone 2C1、clone 3A2のヒトクラウディン1の第二細胞外領域の認識にはD150、M152、V155およびこれらの残基によって構築される立体構造が関与していると言える。また、clone 5F2のヒトクラウディン1の第二細胞外領域の認識にはD150、P151、M152、V155、Y159およびこれらの残基によって構築される立体構造が関与していると考えられる。さらに、clone 7A5については、非変性ヒトクラウディン1の第二細胞外領域の認識にはD150、M152およびこれらの残基によって構築される立体構造が関与していること、変性ヒトクラウディン1の認識にはD150, P151, M152が必須でありE147, T153, P154, V155, R158も関与すると推察される。
　先行技術（Gastroenterology, 139, 953-964, 2010）はヒトクラウディン1第一細胞外領域のN末を認識していることから、いずれの抗体クローンも先行技術とは異なったエピトープを認識している。
　５）マウスクラウディン1抗体のin vitro HCV感染阻害活性解析（Cell-cultured HCV (HCVcc)を用いた解析）
　培地には、10％ fetal bovine serum　(Cell Culture Bioscience, 171012 lot. 8E0582), non-essential amino acid (Hyclone SH30238.01)およびpenicillin/streptomycin(Wako, 168-23191)含有D-MEM（Wako, 044-29765）を用いた。
　コラーゲンタイプＩコート48-well plate（Corning, NCO3548）にHuh7.5.1細胞を5 × 104 cells/500 μL/wellで播種し、37 ℃、１日間培養した。培地を除き、4種のクラウディン1精製抗体を0.1～5μg含む培地（200μL）を添加し、室温 (25 ℃)で１時間培養した。
　その後、HCVcc（genotype 2a）（HCV coreタンパク質濃度として1.56 pmol/L, MOI:～0.5に相当）を含む培地（200μL）を加え、室温 (25 ℃)で2時間感染させた。HCVを含む培地を除き、500μLの培地で3回細胞を洗浄後、各クラウディン1精製抗体を0.1～5μg含む400μLの培地を加えて、4日間培養を行った。
　尚、HCVcc溶液は、Murakami Y. et al. Antiviral Res. 83, 112-117(2009)に従って調製し、当該濃度に培地で希釈して実験に供した。
　HCV coreタンパク質濃度をELISA法（Ortho Clinical Diagnostics,  HCV抗原ELISAテスト 601002）により測定することで、培養上清中のHCV濃度を測定した。尚、測定法は添付マニュアルに準じた。
　図11は、マウス抗クラウディン１モノクローナル抗体（7A5）の結果である。Clone7A5の添加量に比例してHCV感染阻害効果が向上しており、10-８g/0.4 mLで約50％の感染阻害活性がみられ、10-6g/0.4 mL程度から飽和状態となった。また、図12は、マウス抗クラウディン１モノクローナル抗体（2C1、3A2、5F2）の結果である。Clone 2C1, 3A2, 5F2も添加量依存的にHCV感染阻害活性を示し、10-８～10-5g/0.4 mLで約50％の感染阻害活性がみられた。
　６）マウスクラウディン1抗体のin vivo HCV感染阻害試験
　６－１）In vivo 感染阻害活性
　ヒト肝臓キメラマウス（uPA-SCIDマウスにヒト肝細胞を移植したもの、PXBマウス）は株式会社フェニックスバイオより入手した。雄性、12～16週齢、体重15 g以上、血中ヒトアルブミン7.0 mg/mL以上の個体を選択した。群編成では、体重及び血中ヒトアルブミン濃度の平均値を考慮してマウスを3群(各4匹)に振り分けた。
　Control抗体、clone 3A2またはclone 7A5を、マウスに腹腔内投与した。初回投与日をday0とし、抗体投与量はday0に30 mg/kg、day3に20 mg/kg、day7に10 mg/kg、day10に10 mg/kgとした。抗体投与液の希釈にはPBSを用いた。
　初回抗体投与の8時間後にマウスにイソフルラン麻酔を施し、生理食塩水で1.0×105copies/mLに調製したHCV（genotype 1b）100μLを眼窩静脈叢から接種した。
　Day0、day7、day14、day21、day28、day35、day42の採血液を用いて血清中HCVゲノムRNA量を測定した。採取した血清5μLからSepaGene RV-R（エーディア株式会社）を用いてRNA抽出を行い、RNAを1 mM DTT (Promega）と0.4 U/μL ribonuclease inhibitor（Takara Bio）を含む10μLのNuclease-free water（Life Technologies Corporation）に溶解した。PCR反応液は、溶解したRNA原液もしくは希釈したRNAを2.5μLとTaqMan EZ RT-PCR Core Reagents（Life Technologies Corporation）を用いて調製した。PCR反応と解析にはABI Prism 7500（Life Technologies Corporation）を用いた。RT-PCR反応は、50℃ 2分→60℃ 30分→95℃ 5分→（95℃ 20秒→62℃ 1分）の50サイクルで行った。
　下記表2は、In vivo HCV感染阻害活性を示すものである。HCV (genotype 1b)を投与したヒト肝キメラマウスを用いて、抗体のin vivo感染阻害活性を解析した。コントロール抗体、clone 3A2またはclone 7A5を投与したマウス血清を経日的に回収し、血清中HCV RNA量を測定することでHCV感染阻害活性を評価した。-は検出限界以下（PCR陰性）、+はウイルスが検出（PCR陽性）されたものの定量限界以下（4.0E+04 copies/mL未満）であることを示している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
  
　コントロール抗体投与群では、day28時点には全ての個体で血清中HCV量が約107 copies/mLを示し、HCV濃度はプラトーに達していた。一方、clone 3A2投与群ではday42時点で4匹中3匹、clone 7A5投与群では4匹中1匹でHCV RNAが検出されず、HCV RNAが検出された個体でもclone ７A5投与の2匹はウイルスの立ち上がりが有意に遅れていた。以上の結果から、in vivoにおいても抗クラウディン1抗体投与によるHCV感染阻害効果が認められた。尚、in vivoでの感染阻害活性のclone間の違いは、in vitroでのHCV感染阻害活性の違いと相関していた。
　６－２）マウスクラウディン1抗体投与による副作用解析
　Day-7、day-3、day-1、day0（抗体投与日）、day3、day7、day10、day14、day21、day28、day35、day42に、マウスの一般状態を観察し、体重を計測した。尚、day0、day3、day7、day10は抗体投与前に計測を実施した。
　Day0、day3、day7、day10、day14、day21、day28、day35、day42に採血を行った。尚、day0、day3、day7、day10は抗体投与前に、マウスにイソフルラン麻酔を施し、眼窩静脈叢より採血した。
　day0、day7、day14、day21、day28、day35、day42の採血液を用いて血中ヒトアルブミン濃度を測定した。血液2μLを緩衝液（LX試薬栄研シリーズ共用緩衝液、栄研化学株式会社）と混合し、370g、3分間の遠心分離を行った後、ラテックス凝集免疫比濁法（LX試薬’栄研’Alb-II、栄研化学株式会社）を用いて、吸光マイクロプレートリーダー（Vmax、日本モレキュラーデバイス株式会社）で測定した。
　day0、day7、day14、day21の採血液を用いて血清中ALT及びAST活性を測定した。採取した血清10μLを生理食塩液で希釈し、POP・POD・ロイコ色素法（ピルビン酸オキシダーゼにより発生する過酸化水素とペルオキシダーゼによりジアリールイミダゾールロイコ色素を青色に発色）により、ドライケム3500（富士フィルム）を用いて測定した。
　結果を図13～図16に示す。ここで図13は、HCV (genotype 1b)を投与したヒト肝キメラマウスに各種抗体を投与した際の体重変化である。図14は、HCV (genotype 1b)を投与したヒト肝キメラマウスに各種抗体を投与した際の血中のヒトアルブミン濃度である。図15は、HCV (genotype 1b)を投与したヒト肝キメラマウスに各種抗体を投与した際のASTである。図16は、HCV (genotype 1b)を投与したヒト肝キメラマウスに各種抗体を投与した際のALTである。
　抗クラウディン1抗体投与による一般状態の変化、体重減少、血中ヒトアルブミン濃度減少、AST、ALTの有意な増加などは認められなかったことから、clone 3A2及びclone 7A5は安全性及び有効性を兼ね備えた感染阻害分子であると考えられる。尚、clone 3A2投与群において、day7で1匹、他の個体より高いAST値を示した個体が存在したがday14、day21では低い値を示していたこと、uPA-SCIDマウスはもともと肝機能障害を示すマウスであることから、本変化は抗クラウディン1抗体投与に起因するものではないと言える。また、図16においてALTの上昇傾向が観察されているが、一般的にヒト肝キメラマウスは肝障害誘発マウスであるためバックグラウンドとしてALTの上昇が認められることが知られており、本変化はこのバックグランドレベルの変動範囲に入るものであり、抗クラウディン1抗体投与に起因するものではない。
　７）ヒトIgG1キメラ抗体の作製
　７－１）発現ベクター作製
　各抗体クローンの可変部領域のVL領域およびVH領域のアミノ酸をコードする遺伝子をPCR法により増幅した。なお、VL遺伝子の上流にAgeIサイト、下流にBsiWIサイト、VH遺伝子の上流にEcoRIサイト、下流にNheIサイトを付加した。PCR産物を電気泳動により分離・精製した。
　増幅したVL遺伝子及びヒトIgG kappa鎖定常領域をもつクローニングベクターであるpFUSE2-CLIg-hk （Invivogen）をAgeI及びBsiWIで処理後、ライゲーションした。増幅したVH遺伝子及びヒトIgG1重鎖定常領域をもつクローニングベクターであるpFUSE-CHIg-hG1 （Invivogen）をEcoRI及びNheIで処理後、ライゲーションした。各ライゲーション産物をコンピテントセルDH-5αにトランスフォーメーションし、独立大腸菌クローンを培養、プラスミドDNAを回収後、シークエンスを確認し、pFUSE2-CLIg-hk-anti-クラウディン1及びpFUSE-CHIg-hG１-anti-クラウディン1を得た。
　７－２）ヒトIgG1キメラ抗体の精製
　フラスコに5×105cells/mLに調製したCHO-S細胞を150 mL入れ、37 ℃、8% CO2環境下で一晩培養した。作製した発現ベクター187.5μg（VL：VH＝1：1）にOptiPRO SFMを加え3 mLに調製し撹拌した。別のエッペンにFreeStyleMAX Reagent (Invitrogen) 187.5μLとOptiPRO SFM 2812.5μLを加え転倒混和し、発現ベクターの溶液を加え、10分間常温静置した。CHO-S細胞の入ったフラスコに、本混合液を全量加えた。その後6日間、37 ℃、8% CO2環境下で培養し、上清を回収した。
　回収した上清を100 g、5分間遠心にかけ、0.45μm filterを通した。HiTrap Protein G HP（GE Healthcare）をMilli Q 5 mLで 洗浄後、0.02 M リン酸バッファー10 mLでカラムの平衡化を行った。サンプルをカラムに通した後、0.02 M リン酸バッファー20 mLで洗浄、5 mLの0.1 M Glycine-HClで溶出した。溶出の際は、あらかじめエッペンに37.5μLの1 M Tris-HClを入れておいたものに0.5 mLずつ回収した。溶出後のサンプルはPD-10カラム（GE Healthcare）を用いてPBSにバッファー置換した。
　SDS-PAGEによりキメラ抗体の精製を確認した。また、吸光度法によりタンパク質濃度を測定した。
　結果を図17に示す。ここで図17は、SDS-PAGEによるヒトIgG1キメラ抗体の作製結果を示す図である。還元条件下のSDS-PAGEにより、ヒトIgG1キメラ抗体の精製産物の分子量が確認された。矢印は抗体重鎖（約50 kDa）もしくは軽鎖（約25 kDa）を示している。
　７－３）各種クラウディンに対する結合性解析
　ヒトクラウディン1、ヒトクラウディン2、ヒトクラウディン3（NP_001297.1）、ヒトクラウディン4、ヒトクラウディン6、ヒトクラウディン7、ヒトクラウディン9発現HT1080細胞またはマウスクラウディン1発現L細胞をトリプシン処理により回収した。5.0×105cellsに対し、各抗体5μg/mLを100μL添加し、撹拌し氷上で1時間静置した。0.2% BSA-PBSにて1回洗浄後、1% BSA-PBSにて希釈したGoat anti-human IgG（H+L）-FITC抗体（Jackson Immuno Research）を添加、撹拌、氷上で遮光し30分静置した。0.2% BSA-PBSにて2回洗浄後、0.2% BSA-PBSにて終濃度5μg/mLとなるように希釈したPI （Miltenyi Biotec）を加え、FCM解析を行った。
　結果を図18に示す。ここで図18は、ヒトIgG1キメラ抗体のクラウディン結合特異性解析を示す図である。ヒトクラウディン1、ヒトクラウディン2、ヒトクラウディン3、ヒトクラウディン4、ヒトクラウディン6、ヒトクラウディン7、ヒトクラウディン9発現HT1080細胞及びマウスクラウディン1発現L細胞を用いたFCM解析により、いずれの抗体クローンも、ヒトクラウディン2、ヒトクラウディン3、ヒトクラウディン4、ヒトクラウディン6、ヒトクラウディン7、ヒトクラウディン9及びマウスクラウディン1発現細胞には結合性を示さず、ヒトクラウディン1発現細胞特異的に結合していたことから、それぞれのクローンのCDR領域がヒトクラウディン1結合に必須であることが示唆された。
　８）ヒトIgG1キメラ抗体のin vitro HCV感染阻害活性評価
　８－１）Huh7.5.1-8細胞に対する結合性評価
　Huh7.5.1-8細胞をトリプシン処理により回収した。5.0×105cells/sampleに対し、各抗体5μg/mLを100μL添加し、２）と同様の操作でFMC解析を行った。尚、2次抗体にはｇoat anti-human IgG (H+L)-FITC を使用した。
　結果を図19に示す。ここで図19は、ヒトIgG1キメラ抗体のHuh7.5.1-8細胞に対する結合性解析を示す図である。Huh7.5.1-8細胞に対する結合性をFCM解析した結果、ヒトIｇG1キメラクローンもHuh7.5.1-8細胞に結合していた。
　８－２）In vitro感染阻害実験（HCVccを用いた解析）
　Huh7.5.1-8細胞を1×105cells/well/500μLで48-well plateに播種し、一晩培養した。抗クラウディン1マウス抗体、ヒトIgG1キメラ抗体を培地で各濃度に調製し、前培養していた細胞の培地を除いて200μL/wellの抗体溶液を加え、室温で30分静置した。なお、各抗体は0～5μg/wellで作用させた。
　その後、HCVcc（genotype 2a)を50倍希釈したものをそれぞれ200μL/well添加し、室温で2時間培養した。血清を含まない培地500μL/wellで3回洗浄し、前処理の1/2の濃度にした抗体液400μLを加え、37 ℃で4日間培養した。
　培養上清を回収後、細胞をPBS 500μL/wellで3回洗浄し、Blood/Cultured Cell Total RNA Purification Mini Kit (FAVORGEN)を用いRNA抽出・精製を行い、滅菌水50μLで溶解し、-80℃で保存した。また、回収した培養上清150μLよりViral Nucleic Acid Extraction Kit（FAVORGEN）を用いてRNAを精製し、-80 ℃で保存した。尚、RNA濃度は、Nano Dropを用いて測定した、
　精製したRNAを用いて、Taqman qRT-PCR法（試薬はRNA-direct Realtime PCR Master Mix(Toyobo)、機器はLightCycler (Roche)）にてHCVゲノムRNA定量を行った。尚、反応は、表３の組成に準じて調整した反応溶液を使用した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
  
　尚、Sense Primerは5’-ACGGGGTTAATTATGCAACAGG-3’（配列番号13）であり、Anitisense Primerは5’-ACGGTGATGCAGGACAACAG-3’（配列番号14）であり、Taqman Probeは5’-[6-FAM]AGCAAGAAGATAGAAAAGGGGAAACCGGGTAG[TAMRA-6-FAM]-3’（配列番号15）であった。
　結果を図20及び図21に示す。ここで図20は、HCVcc (genotype 2a)を用いたin vitro HCV感染阻害活性であり、細胞内のHCVゲノムRNAの定量結果である。図21は、HCVcc (genotype 2a)を用いたin vitro HCV感染阻害活性であり、培養上清中のHCVゲノムRNAの定量結果である。データは抗体非添加群のHCV ゲノムRNAコピー数に対する割合（mean ± SD）で表記した（細胞内及び培養上清中ともにn=4）。ひし形がマウス抗体、四角がヒトIgG1キメラ抗体を示す。
　HCVcc感染系にて、ヒトIgG1キメラ抗体のHCV感染阻害活性を解析したところ、いずれのクローンも添加濃度依存的に細胞内及び培養上清中のHCV RNA量が低下しており、顕著な感染阻害作用が認められた（図20，図21）。尚、感染阻害活性は、マウス抗体と同様の傾向を示し、2C1=3A2>7A5>5F2の順であった。
　８－３）In vitro感染阻害活性（HCV pseudoparticles（HCVpp、genotype 1bおよび2a）を用いた解析）
　Huh7.5.1-8細胞を1×105cells/well/500μLで48-well plateに播種し、一晩培養した。抗クラウディン1マウス抗体、ヒトIgG1キメラ抗体を培地で各濃度に調製し、前培養していた細胞の培地を除いて200μL/wellの抗体溶液を加え、室温で30分静置した。なお、各抗体は0～5μg/wellで作用させた。
　HCVpp（genotype 1b(TH株)または2a（JFH-1株）、Microbe and Infection 15, 45-55 , 2013に従い調製）をそれぞれ200μL/well添加し、37 ℃で6時間培養した。血清を含まない培地500μL/wellで3回洗浄し、前処理の1/2の濃度にした抗体液400μLを加え、37 ℃で3日間培養した。
　培地を除去後、Lysis Buffer（Promega）を100μL/well加え、溶解液をエッペンに回収し、10,000 rpm、1分間遠心し、氷上に置いた。本上清10μLと発光基質(ピッカジーン)50μLを混ぜ、Luminescencer-PSNで測定を行った。
　結果を図22及び図23に示す。図22は、HCVpp（genotype 1b）、図23は、HCVpp（genotype 2a）を用いたin vitro HCV感染阻害活性を示す図である。データは抗体非添加群のルシフェラーゼ活性に対する割合（mean ± SD）で表記した（n=4）。ヒトIgG1キメラ抗体はgenotype 1b及び2a双方で、マウス抗体と同様の添加量依存的な感染阻害活性を示した。
　９）ヒトIgG4キメラ抗体の作製
　９－１）発現ベクター作製
　各抗体クローン（2C1、3A2）の可変部領域のVL領域およびVH領域のアミノ酸をコードする遺伝子をPCR法により増幅した。なお、VL遺伝子の上流にAgeIサイト、下流にBsiWIサイト、VH遺伝子の上流にEcoRIサイト、下流にNheIサイトを付加した。PCR産物を電気泳動により分離・精製した。
　増幅したVL遺伝子及びヒトIgG kappa鎖定常領域をもつクローニングベクターであるpFUSE2-CLIg-hk （Invivogen）をAgeI及びBsiWIで処理後、ライゲーションした。増幅したVH遺伝子及びヒトIgG4重鎖定常領域をもつクローニングベクターであるpFUSE-CHIg-hG4 (Invivogen)をEcoRI及びNheIで処理後、ライゲーションした。各ライゲーション産物をコンピテントセルDH-5αにトランスフォーメーションし、形成した独立大腸菌クローンを培養し、プラスミドDNAを回収した後、シークエンス解析によりpFUSE2-CLIg-hk-anti-クラウディン1及びpFUSE-CHIg-hG4-anti-クラウディン1を得た。
　９－２）ヒトIgG4キメラ抗体の精製
　培養用6- wellプレートに2×105 cells/wellのCHO-K1細胞を播種し、37 ℃、5% CO2環境下でサブコンフルエントになるまで培養した。作製した発現ベクター2μg（pFUSE2-CLIg-hk-anti-クラウディン1を1.2μg、pFUSE-CHIg-hG4-anti-クラウディン1を0.8μg）をOpti-MEM1 (GIBCO) 100μLとFuGENE(登録商標)HD Transfection Reagent (Roche) 4μLと混合し、15分間常温静置した。CHO細胞の培地を交換し、上記の混合液をウェルに全量加えた。その後、2日間、37 ℃、5% CO2環境下で培養し、上清を回収した。
　９－３）ヒトIgG4キメラ抗体の結合性解析
　ヒトクラウディン1発現HT1080細胞をトリプシン処理により回収した。5.0×105 cells/sampleに対し、ヒトIgG4キメラ抗体を含む培養上清を100μL添加し、撹拌し氷上で1時間静置した。0.2% BSA-PBSにて1回洗浄後、1% BSA-PBSにて希釈したGoat anti-human IgG（H+L）-FITC抗体（Jackson Immuno Research）を添加、撹拌、氷上で遮光、30分静置した。0.2% BSA-PBSにて2回洗浄後、0.2% BSA-PBSにて終濃度5μg/mLとなるように希釈したPI （Miltenyi Biotec）を加え、FCM解析を行った。
　結果を図24に示す。ここで図24は、ヒトIgG4キメラ抗体のクラウディン結合性解析を示す図である。ヒトクラウディン1発現HT1080細胞に対する結合性をFCM解析した。HCV感染阻害活性に優れた2C1及び3A2について、ヒトIgG4キメラ抗体を作製したところ、いずれのクローンもヒトクラウディン1に対する結合性を保持していた。
　９－４）In vitro感染阻害実験（HCVccを用いた解析）
　Huh7.5.1-8細胞を1×105cells/well/500μLで48-well plateに播種し、一晩培養した。抗クラウディン1マウス抗体、ヒトIgG4キメラ抗体を培地で各濃度に調製し、前培養していた細胞の培地を除いて200μL/wellの抗体溶液を加え、室温で30分静置した。なお、各抗体は0～5μg/wellで作用させ、８－２）と同様の方法でHCVcc感染阻害活性を解析した。
　結果を図25及び図26に示す。ここで図25は、HCVcc (genotype 2a)を用いたin vitro HCV感染阻害活性であり、細胞内のHCVゲノムRNAの定量結果である。図26は、HCVcc (genotype 2a)を用いたin vitro HCV感染阻害活性であり、培養上清中のHCVゲノムRNAの定量結果である。データは抗体非添加群のHCV ゲノムRNAコピー数に対する割合（mean ± SD）で表記した（細胞内及び培養上清中ともに抗体添加群はn=4、抗体未添加群はn=3）。ひし形がマウス抗体、四角がヒトIgG4キメラ抗体を示す。HCVcc感染系にて、ヒトIgG4キメラ抗体のHCV感染阻害活性を解析したところ、いずれのクローンも添加濃度依存的に細胞内及び培養上清中のHCV RNA量が低下しており、顕著な感染阻害作用が認められた（図25，図26）。
９－５）In vitro感染阻害活性（HCV pseudoparticles（HCVpp、genotype 1bおよび2a）を用いた解析）
　Huh7.5.1-8細胞を1×105cells/well/500μLで48-well plateに播種し、一晩培養した。抗クラウディン1マウス抗体、ヒトIgG4キメラ抗体を培地で各濃度に調製し、前培養していた細胞の培地を除いて200μL/wellの抗体溶液を加え、室温で30分静置した。なお、各抗体は0～5μg/wellで作用させ、８－３）と同様の方法でHCVpp感染阻害活性を解析した。
　結果を図27及び図28に示す。図27は、HCVpp（genotype 1b）、図28は、HCVpp（genotype 2a）を用いたin vitro HCV感染阻害活性を示す図である。データは抗体非添加群のルシフェラーゼ活性に対する割合（mean ± SD）で表記した（n=4）。ヒトIgG4キメラ抗体はgenotype 1b及び2a双方で、マウス抗体と同様の添加量依存的な感染阻害活性を示した。
　１０）ヒトIgG4変異体キメラ抗体の作製
　１０－１）発現ベクター作製
IgG4は、重鎖定常領域内にある228番目のSerをProに置換することで生体内安定性が向上することが知られている（Immunology, 105, 9-19, 2002）。そこで、228番目のSerをProに置換するようにプライマーを設計し、pFUSE-CHIg-hG4 （Invivogen）を鋳型にNheIサイト及びBsrGIサイト間の682 bpをPCR法により増幅、PCR産物を電気泳動により分離後、精製した。尚、変異挿入部上流のプライマーにはNheIサイト、下流のプライマーにはBsrGIサイトを付加した。
　変異を挿入したPCR産物及びpFUSE-CHIg-hG4-anti-クラウディン1をNheI及びBsｒGIで処理後、ライゲーションした。各ライゲーション産物をコンピテントセルDH-5αにトランスフォーメーションし、形成した独立大腸菌クローンを培養、プラスミドDNAを回収、シークエンスを確認し、pFUSE-CHIg-hG4mutant-anti-クラウディン1を得た。
　１０－２）ヒトIgG4変異体キメラ抗体の精製
　培養用6 wellプレートに2× 105 cells/wellのCHO-K1細胞を播種し、37 ℃、5% CO2環境下でサブコンフルエントになるまで培養した。作製した発現ベクター2μg（pFUSE2-CLIg-hk-anti-クラウディン1を1.2μg、pFUSE-CHIg-hG4mutant-anti-クラウディン1を0.8μg）をOpti-MEM1 (GIBCO) 100μL及びFuGENE(登録商標)HD Transfection Reagent (Roche) 4μLと混合し、15分間常温静置した。CHO細胞の培地を交換し、上記の混合液をウェルに全量加えた。その後、2日間、37 ℃、5% CO2環境下で培養し、上清を回収した。
　１０－３）ヒトIgG4変異体キメラ抗体の結合性解析
　ヒトクラウディン1発現HT1080細胞をトリプシン処理により回収した。5.0×105 cells/sampleに対し、ヒトIgG4変異体キメラ抗体を含む培養上清を100μL添加し、撹拌し氷上で1時間静置した。0.2% BSA-PBSにて1回洗浄後、1% BSA-PBSにて希釈したgoat anti-human IgG（H+L）-FITC抗体（Jackson Immuno Research）を添加、撹拌し氷上で遮光し30分静置した。0.2% BSA-PBSにて2回洗浄後、0.2% BSA-PBSにて終濃度5μg/mLとなるように希釈したPI （Miltenyi Biotec）を加え、FCM解析を行った。
　結果を図29に示す。ここで図29は、ヒトIgG4変異体キメラ抗体のクラウディン結合性解析を示す図である。ヒトクラウディン1発現HT1080細胞に対する結合性をFCM解析したところ、いずれのクローンもヒトクラウディン1に対する結合性を保持していた。マウス抗体、ヒトIgG1キメラ抗体、ヒトIgG4キメラ抗体の結果を踏まえると、本ヒトIgG4変異体キメラ抗体もHCV感染阻害活性を有していると考えられる。
　Ｃ型肝炎治療薬として利用することができる。
　配列番号１１,１２,１３,１４：プライマー
　配列番号１５：プローブ

Claims (15)

  1. 　ヒトクラウディン１の第二細胞外ループ中のエピトープを認識してヒトクラウディン１に結合する抗クラウディン１モノクローナル抗体。
  2. 　ヒトクラウディン１の第一細胞外ループ中のエピトープ及び第二細胞外ループ中のエピトープに結合する請求項１記載の抗クラウディン１モノクローナル抗体。
  3. 　前記第一細胞外ループ中のエピトープが、配列番号１に記載のアミノ酸配列により定義される請求項２に記載の抗クラウディン１モノクローナル抗体。
  4. 　前記第二細胞外ループ中のエピトープが、配列番号２に記載のアミノ酸配列により定義される請求項１又は２に記載の抗クラウディン１モノクローナル抗体。
  5. 　ＶＨの配列が配列番号３、ＶＬの配列が配列番号４である請求項１又は２に記載の抗クラウディン１モノクローナル抗体。
  6. 　ＶＨの配列が配列番号５、ＶＬの配列が配列番号６である請求項１又は２に記載の抗クラウディン１モノクローナル抗体。
  7. 　ＶＨの配列が配列番号７、ＶＬの配列が配列番号８である請求項１又は２に記載の抗クラウディン１モノクローナル抗体。
  8. 　ＶＨの配列が配列番号９、ＶＬの配列が配列番号１０である請求項１又は２に記載の抗クラウディン１モノクローナル抗体。
  9. 　マウス抗クラウディン１モノクローナル抗体。
  10. 　請求項１乃至８の何れか1項に記載の抗体の可変領域を有するヒトIgG1キメラ抗体、ヒトIgG4キメラ抗体又はヒトIgG4変異体キメラ抗体若しくはこれらの改変型キメラ抗体。
  11. 　請求項１乃至８の何れか1項に記載の抗体の相補性決定領域を有するヒト化抗体又は改変型ヒト化抗体。
  12. 請求項１乃至１１の何れか1項に記載の抗体のFabフラグメント、F(ab’)2フラグメント又はFvフラグメント。
  13. 　請求項１乃至１２の何れか１項に記載の抗クラウディン１モノクローナル抗体又はそのフラグメントを有効成分とする、抗HCV治療剤。 
  14. 　請求項１乃至８の何れか１項に記載の抗クラウディン１モノクローナル抗体のエピトープに結合する分子。
  15. 　請求項１４に記載の抗クラウディン１モノクローナル抗体のエピトープに結合する分子を有効成分とする、抗HCV治療剤。
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