CN118176016A

CN118176016A - 抗体的新型组合及其用途

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Publication number: CN118176016A
Application number: CN202280063701.2A
Authority: CN
Inventors: B·弗伦德修斯; M·雷恩; M·塞姆里奇; L·玛藤松; J-B·马尔尚
Original assignee: Transgene SA; Bioinvent International AB
Current assignee: Transgene SA; Bioinvent International AB
Priority date: 2021-09-22
Filing date: 2022-09-21
Publication date: 2024-06-11

Abstract

本发明整体涉及一种组合，其包含：能够表达与CTLA‑4特异性结合的第一抗体分子的溶瘤病毒；以及与PD‑1和/或PD‑L1特异性结合的第二抗体分子，以及其在治疗癌症中的用途。

Description

抗体的新型组合及其用途

技术领域

本发明涉及一种组合，其包含：(i)能够表达与CTLA-4特异性结合的第一抗体分子的溶瘤病毒；以及(ii)与PD-1和/或PD-L1特异性结合的第二抗体分子，其中该组合用于治疗患者的癌症，其中癌症包括冷肿瘤或由冷肿瘤组成。本发明还涉及所述组合在制造用于治疗患者的癌症的药物中的用途，其中癌症包括冷肿瘤或由冷肿瘤组成，以及一种用于治疗患者的癌症的方法，其中癌症包括冷肿瘤或由冷肿瘤组成，该方法包括施用所述组合。

背景技术

用免疫检查点阻断抗体治疗已经改变了患有晚期实体癌(包括转移性黑素瘤、非小细胞肺癌和错配修复缺陷型癌症)的患者的生存率(Hodi等人，2010；Larkin等人，2015；Topalian等人，2012)。

然而，由于许多患者未能响应免疫检查点阻断(ICB)或获得对ICB的抗性，因此仍存在大量尚未满足的需求(Sharma等人，2017)。据信，缺乏疗效的原因包括肿瘤浸润性免疫细胞(TIL)缺乏或不足，在TIL中最显著的是CD8+ T细胞(Chen和Mellman，2013；Gajewski等人，2013)。实体癌肿瘤微环境(TME)中缺乏趋化信号和炎症信号同样被认为是CAR-T细胞疗法耐药性的基础(Wagner等人，2020)。

因此，非常需要鉴定诱导炎性免疫细胞募集到“免疫遗弃”或“免疫排斥”肿瘤中，从而转化为稳健的全身适应性抗肿瘤免疫和CD8+ T细胞浸润，同时使原发性肿瘤和转移性肿瘤消退的治疗剂。

瘤内(i.t.)溶瘤病毒疗法诱导T细胞浸润并改善抗PD-1免疫疗法(Ribas等人，2017)。与单一药剂ICB相比，使用抗CTLA-4抗体和抗PD-1抗体的组合疗法增强了疗效，这可能是通过互补机制即系统性CD4⁺和CD8⁺ T细胞分化以及T效应细胞和调节性T细胞的肿瘤局部调节实现的(Arce Vargas等人，2018；Wei等人，2019)。然而，全身性施用抗CTLA-4(包括已批准的伊匹木单抗)的耐受性问题限制了临床应用(Postow等人，2015)。

全身性抗CTLA-4抗体疗法的疗效和耐受性似乎有关联。增加伊匹木单抗剂量既提高了疗效，也增强了副作用(Bertrand等人，2015)。与CTLA-4的中枢免疫检查点功能一致，副作用可能很严重，而且具有全身性自体免疫性质(Tivol等人，1995)。

有趣的是，最近报道，相对于CD8⁺和CD4⁺效应T细胞耗竭过度表达CTLA-4的瘤内(“i.t.”)Treg细胞，有助于伊匹木单抗的治疗活性，并且Treg耗竭增强的抗CTLA-4抗体变体在携带肿瘤的FcγR-人源化小鼠中显示出改善的治疗活性(Arce Vargas等人，2018)。这些发现表明，与目前可用的抗CTLA-4疗法相比，使用耗竭Treg的抗CTLA-4抗体的肿瘤局部疗法可以提供强大的治疗活性，同时副作用减少(Marabelle等人，2013a；Marabelle等人，2013b)-特别是在与经验证的安全免疫调节剂如PD-1/PD-L1轴阻断剂或溶瘤病毒联合使用时。

发明内容

在此背景下，发明人在本文中描述并表征了掺入全长人重组抗CTLA-4抗体的基于痘苗病毒(VV)的溶瘤载体。发明人还描述了编码最近发现的全长人重组抗CTLA-4抗体的溶瘤病毒。这种病毒编码的新型人IgG1CTLA-4抗体(命名为“4-E03”)是使用功能优先筛选单克隆抗体(“mAb”)和与优异的Treg耗竭活性相关联的靶标来鉴定的。在以人瘤内相关CTLA-4表达为特征的人源化小鼠模型中，4-E03 IgG1证明与经临床验证的伊匹木单抗相比，增强了Treg耗竭。相比之下，与伊匹木单抗相比，4-E03在阻断CTLA-4:B7相互作用与克服CTLA-4介导的效应T细胞增殖抑制方面显示出类似的效力。在本发明中，肿瘤选择性溶瘤痘苗载体经工程改造以编码这种新型的强烈耗竭Treg且阻断检查点的抗CTLA-4抗体4-E03和GM-CSF(VV_GM-ahCTLA4，BT-001)。另外生成了编码匹配的Treg耗竭小鼠替代抗体的病毒，使得能够在代表发炎或免疫排斥肿瘤微环境、对ICB敏感或耐药的同基因免疫感受态小鼠肿瘤模型中进行概念验证研究。

这导致了意外的发现，即，表达抗CTLA-4抗体的溶瘤病毒与抗PD-1/PD-L1抗体协同排斥“冷肿瘤”(在本文中也称为“冷免疫肿瘤”)。这是令人惊奇的，因为已知冷肿瘤对全身性静脉内单一药物或者ICB与目前可用的抗CTLA-4和/或抗PD-1的组合具有耐药性，本文所公开的“冷肿瘤”小鼠模型中的动物也是如此。

如在“实施例”和本文中所讨论的，“冷”肿瘤是T细胞浸润不良的肿瘤。令人惊奇的是，发明人已发现，使用表达抗CTLA-4抗体和抗PD-1/PD-L1抗体的溶瘤病毒进行的联合治疗诱导T细胞大量涌入“冷”肿瘤中，这些肿瘤变得与“热”肿瘤一样密集地富含T细胞。

发明人的惊人发现为治疗包括“冷”肿瘤或由“冷”肿瘤组成的癌症提供了进一步的有益治疗方法。如本文所述，本发明整体涉及一种组合，其包含：(i)能够表达与CTLA-4特异性结合的第一抗体分子的溶瘤病毒；以及(ii)与PD-1和/或PD-L1特异性结合的第二抗体分子，其中该组合用于治疗患者的癌症，其中癌症包括冷肿瘤或由冷肿瘤组成。

在第一方面，本发明提供了一种组合，其包含：

-能够表达与CTLA-4特异性结合的第一抗体分子的溶瘤病毒；以及

-与PD-1和/或PD-L1特异性结合的第二抗体分子；

该组合用于治疗患者的癌症，其中癌症包括冷肿瘤或由冷肿瘤组成。

在第二方面，本发明提供了以下物质即：

-能够表达编码与CTLA-4特异性结合的第一抗体分子的核苷酸序列的溶瘤病毒；以及

-与PD-1和/或PD-L1特异性结合的第二抗体分子；

在制造用于治疗患者的癌症的药物中的用途，其中癌症包括冷肿瘤或由冷肿瘤组成。

在第三方面，本发明提供了一种用于治疗患者的癌症的方法，其中癌症包括冷肿瘤或由冷肿瘤组成，该方法包括向患者施用：

-与PD-1和/或PD-L1特异性结合的第二抗体分子。

在第四方面，本发明提供了一种能够表达与CTLA-4特异性结合的第一抗体分子的溶瘤病毒，其与特异性地结合到PD-1和/或PD-L1的第二抗体分子结合使用；用于治疗患者的癌症，其中癌症包括冷肿瘤或由冷肿瘤组成。

如上文所讨论和在所附实施例中所证实的，在本发明的上述方面中，用能够表达与CTLA-4特异性结合的第一抗体分子和与PD-1和/或PD-L1特异性结合的第二抗体的溶瘤病毒治疗使得T细胞涌入患者的癌症的冷肿瘤中。这导致患者的癌症的冷肿瘤中T细胞的数量和/或密度增加，使得冷肿瘤变得与热肿瘤类似地密集富含T细胞。在本发明的一个实施方案中，患者的癌症的冷肿瘤中T细胞的数量和/或密度增加约5倍至25倍或更多倍，例如增加约5倍、或6倍、或7倍、或8倍、或9倍、或10倍、或11倍、或12倍、或13倍、或14倍、或15倍、或16倍、或17倍、或18倍、或19倍、或20倍、或21倍、或22倍、或23倍、或24倍、或25倍，或更多倍。

因此，在另一方面，本发明提供了一种组合，其包含：

-与PD-1和/或PD-L1特异性结合的第二抗体分子；

该组合用于增加患者的癌症的冷肿瘤中T细胞的数量和/或密度，并且/或者介导T细胞涌入患者的癌症的冷肿瘤中。应当理解，通过这样做，本发明治疗患者的癌症。在本发明的一个实施方案中，患者的癌症的冷肿瘤中T细胞的数量和/或密度增加约5倍至25倍或更多倍，例如增加约5倍、或6倍、或7倍、或8倍、或9倍、或10倍、或11倍、或12倍、或13倍、或14倍、或15倍、或16倍、或17倍、或18倍、或19倍、或20倍、或21倍、或22倍、或23倍、或24倍、或25倍，或更多倍。

如本文所讨论的，本发明的溶瘤病毒能够表达与CTLA-4特异性结合的第一抗体分子。细胞毒性T淋巴细胞相关抗原(CTLA-4或CTLA4)，也称为CD152，是阻断T细胞激活的B7/CD28家族成员。CTLA-4在激活的T细胞上表达，并向T细胞传递抑制信号。它与T细胞共刺激蛋白CD28同源，并且CTLA-4和CD28都与CD80(也称为B7-1)和CD86(也称为B7-2)结合。CTLA4还存在于调节性T细胞(regulatory T cell，Treg)中，并有助于其抑制功能。CTLA-4蛋白含有胞外V结构域、跨膜结构域和胞质尾区。

已经提出，结合CTLA-4的抗体通过双重机制发挥其治疗活性，既作用于免疫效应CD4⁺和CD8⁺ T细胞，又作用于免疫抑制性T调节(Treg)细胞。在效应T细胞上，阻断CTLA-4与其配体B7.1和B7.2的相互作用的CTLA-4抗体可以增强免疫应答，并且已被证明能够刺激强效的抗肿瘤免疫(Korman等人，2006,Checkpoint blockade in cancer immunotherapy,Adv Immunol.90:297-339)。

最近，证实Fc效应子功能和Treg耗竭有助于抗CTLA-4抗体(包括临床相关抗体伊匹木单抗和曲美木单抗)的治疗活性并与之相关联(Arce Vargas、Furness等人，2018)。疗效和毒性(后者可能很严重，并且具有自体免疫性质)被认为与目前可用的全身抗CTLA-4方案相关。因此，一直缺乏递送高效而安全的基于抗CTLA-4的ICB的方法。发明人最近证明，瘤内递送的编码Treg耗竭抗CTLA-4抗体的溶瘤病毒(i.t.载体化抗CTLA-4)具有广泛的抗肿瘤活性。在本文中，发明人出乎意料地证明，在PD-1/PD-L1 ICB的情况下，i.t.载体化抗CTLA-4对免疫浸润不良的“冷”肿瘤具有疗效，这种“冷”肿瘤对全身性抗体介导的ICB有耐药性。另外，由于与该方法相关联的肿瘤限制性抗CTLA-4暴露，表明与批准的抗CTLA-4方案相比，i.t.载体化抗CTLA-4既安全又耐受良好。

如本文所讨论的，本发明还涉及与PD-1特异性结合并且/或者与PD-L1特异性结合的第二抗体分子。在一些实施方案中，第二抗体分子与PD-1特异性结合；在一些实施方案中，第二抗体分子与PD-L1特异性结合；并且在一些实施方案中，第二抗体分子与PD-1和PD-L1两者特异性结合。

程序性细胞死亡蛋白1(PD-1或PD1)，也称为CD279，存在于T细胞和B细胞的表面上并且抑制T细胞活性。PD-1结合两个配体：PD-L1和PD-L2。程序性死亡配体1(PD-L1)，也称为CD274，与其受体PD-1结合产生抑制信号，该抑制信号减少T细胞增殖。

抗体是免疫学和分子生物学领域的技术人员众所周知的。通常，抗体包含两条重(H)链和两条轻(L)链。在本文中，我们有时将这种完整抗体分子称为全尺寸或全长抗体。抗体的重链包含一个可变结构域(VH)和三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3)，抗体分子的轻链包含一个可变结构域(VL)和一个恒定结构域(CL)。可变结构域(有时统称为F_V区)与抗体的靶标或抗原结合。每个可变结构域包含三个环，这些环被称为互补决定区(CDR)，负责靶标结合。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合，而是表现出各种效应子功能。根据抗体或免疫球蛋白的重链恒定区的氨基酸序列，抗体或免疫球蛋白可以被分配到不同类别。有五种主要免疫球蛋白类别：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且在人体中，这些类别中的几个类别被进一步划分为亚类(同种型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3和IgG4；IgA1和IgA2。抗体的另一部分为Fc结构域(也称为片段可结晶结构域)，其包括每个抗体重链的恒定结构域中的两个恒定结构域。Fc结构域负责抗体与Fc受体之间的相互作用。

Fc受体是膜蛋白，其通常发现于免疫系统细胞的细胞表面上(即，Fc受体发现于靶细胞膜–也被称为质膜或细胞质膜上)。Fc受体的作用是通过Fc结构域结合抗体，并将抗体内化到细胞中。在免疫系统中，这可能导致抗体介导的吞噬作用和抗体依赖性细胞介导的细胞毒性。

Fc受体的亚组是对IgG抗体具有特异性的Fcγ受体(Fcγ受体，FcγR)。存在两种类型的Fcγ受体：活化Fcγ受体(也表示为活化性Fcγ受体)和抑制性Fcγ受体。活化受体和抑制性受体分别经由基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)或基于免疫受体酪氨酸的抑制性基序(ITIM)传输其信号。在人类中，FcγRIIb(CD32b)是抑制性Fcγ受体，而FcγRI(CD64)、FcγRIIa(CD32a)、FcγRIIc(CD32c)、FcγRIIIa(CD16a)和FcγRIV是活化Fcγ受体。FcγRIIIb是在中性粒细胞上表达的GPI连接的受体，该GPI连接的受体缺乏ITAM基序，但通过其交联脂质筏并与其他受体接合的能力，而也被视为活化性受体。在小鼠中，活化受体是FcγRI、FcγRIII和FcγRIV。

众所周知，抗体通过与Fcγ受体的相互作用来调节免疫细胞活性。具体地，抗体免疫复合物如何调节免疫细胞活化是通过其活化Fcγ受体和抑制性Fcγ受体的相对接合来确定的。不同抗体同种型以不同亲和力与活化Fcγ受体和抑制性Fcγ受体结合，从而产生不同的A:I比率(活化:抑制比率)(Nimmerjahn等人，Science.2005年12月2日；310(5753):1510-2)。

通过与抑制性Fcγ受体结合，抗体可以抑制、阻断和/或下调效应细胞功能。

通过与活化性Fcγ受体结合，抗体可以活化效应细胞功能并且由此触发以下机制，诸如抗体依赖性细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞吞噬(ADCP)、细胞因子释放和/或抗体依赖性内吞，以及在中性粒细胞的情况下的NETosis(即NET(中性粒细胞胞外陷阱)的活化和释放)。抗体与活化Fcγ受体的结合还可能导致某些活化标志物(诸如CD40、MHCII、CD38、CD80和/或CD86)增加。

在一些实施方案中，与CTLA-4特异性结合的抗体分子是Fcγ受体接合抗体。所谓“Fcγ受体接合抗体”，意指该抗体分子可以经由其Fc区与至少一种Fcγ受体结合。

如本文所用，术语“抗体分子”涵盖全长或全尺寸抗体，以及全长抗体的功能性片段和这类抗体分子的衍生物。

全尺寸抗体的功能性片段具有与对应的全尺寸抗体相同的抗原结合特征，并且包括与对应的全尺寸抗体相同的可变结构域(即，VH序列和VL序列)和/或相同的CDR序列。功能性片段具有与对应的全尺寸抗体相同的抗原结合特征，意味着该功能性片段与全尺寸抗体结合到靶标上的相同表位。这样的功能性片段可以对应于全尺寸抗体的Fv部分。替代性地，这种片段可以是Fab，也表示为单价抗原结合片段Fab'或二价抗原结合片段(Fab')₂，其中该单价抗原结合片段不含有Fc部分，该二价抗原结合片段含有通过二硫键或Fab'(即(Fab')₂的单价变体)连接在一起的两个抗原结合Fab部分。这种片段也可以是单链可变片段(scFv)。

在一些实施方案中，本文所述的第一抗体分子和/或第二抗体分子选自由全尺寸抗体、嵌合抗体、单链抗体及其抗原结合片段(例如，Fab、Fv、scFv、Fab'和(Fab')₂)组成的组。

功能性片段并不总是含有对应全尺寸抗体的所有六个CDR。应当理解，含有三个或更少CDR区(在一些情况下，甚至仅单个CDR或其一部分)的分子能够保留该CDR的来源抗体的抗原结合活性。例如，在Gao等人，1994,J.Biol.Chem.,269:32389-93中，描述了整条VL链(包含所有三个CDR)对其底物具有高亲和力。

含有两个CDR区的分子描述于例如以下文献中：Vaughan和Sollazzo，2001,Combinatorial Chemistry&High Throughput Screening,4:417-430.第418页(右栏–3OurStrategy for Design)，描述了仅包含散布在框架区内的H1和H2 CDR高变区的微抗体。所述微抗体被描述为能够与靶标结合。Pessi等人，1993,Nature,362:367-9和Bianchi等人，1994,J.Mol.Biol.,236:649-59被Vaughan和Sollazzo引用，其中更详细地描述了H1和H2微抗体及其性质。在Qiu等人,2007,《自然生物技术(Nature Biotechnology)》,25:921-9中，表明由两个连接的CDR组成的分子能够结合抗原。Quiocho1993,《自然》,362:293-4提供了“微抗体”技术的总结。Ladner 2007,《自然生物技术》,25:875-7指出，含有两个CDR的分子能够保留抗原结合活性。

含有单个CDR区的抗体分子描述于例如以下文献中：Laune等人，1997,JBC,272:30937-44，其中证明源自CDR的一系列六肽显示出抗原结合活性，并且注意到完整的单个CDR的合成肽显示出强结合活性。在Monnet等人,1999,《生物化学杂志》,274:3789-96中，示出了一系列12聚体肽和相关框架区具有抗原结合活性，并且指出仅CDR3样肽能够结合抗原。在Heap等人，2005,J.Gen.Virol.,86:1791-1800中，报道了“微抗体”(含有单个CDR的分子)能够结合抗原，并且示出来自抗HIV抗体的环状肽具有抗原结合活性和功能。在Nicaise等人,2004,《蛋白质科学(Protein Science)》,13:1882-91中，示出了单个CDR可以赋予抗原结合活性和对其溶菌酶抗原的亲和力。

因此，具有五个、四个、三个或更少的CDR的抗体分子能够保留其来源全长抗体的抗原结合性质。

抗体分子也可以是全长抗体的衍生物或这种抗体的片段。衍生物具有与对应的全尺寸抗体相同的抗原结合特性，因为该衍生物与全尺寸抗体结合到靶标上的相同表位。

因此，如本文所用，所谓术语“抗体分子”，包括所有类型的抗体分子及其功性能片段及其衍生物，包括：单克隆抗体、多克隆抗体、合成抗体、重组产生的抗体、多特异性抗体、双特异性抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单链抗体、可变片段(Fv)、包括二价单链可变片段(di-scFv)和二硫键连接的可变片段的单链可变片段(scFv片段)、Fab片段、F(ab')₂片段、Fab'片段、抗体重链、抗体轻链、抗体重链的同二聚体、抗体轻链的同二聚体、抗体重链的异二聚体、抗体轻链的异二聚体、这类同二聚体和异二聚体的抗原结合功能性片段。

另外，如本文所用，术语“抗体分子”包括所有类别的抗体分子和功能性片段，包括：IgG、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgD和IgE。

在一些实施方案中，抗体是人IgG1。技术人员了解，小鼠IgG2a和人IgG1与激活性Fcγ受体有效地结合并且能够通过用例如ADCP和ADCC激活带有免疫细胞(例如巨噬细胞和NK细胞)的激活性Fcγ受体来激活靶细胞的缺失。因此，尽管小鼠IgG2a是针对小鼠中的缺失的优选同种型，但是人IgG1是针对人中的缺失的优选同种型。相反地，对已知TNFR超家族激动剂受体(例如4-1BB、OX40、TNFRII、CD40)的最佳共刺激取决于抗体接合抑制性FcγRIIB。在小鼠中，已知优先结合抑制性Fcγ受体(FcγRIIB)且仅与激活性Fcγ受体弱结合的IgG1同种型是针对TNFR超家族靶向性mAb的共刺激活性的最佳选择。虽然未描述过小鼠IgG1同种型在人体内的直接等效物，但是抗体可以经工程改造以示出类似增强的与抑制性人Fcγ受体的结合，该结合优于与活化性人Fcγ受体的结合。在被工程改造为表达人激活性Fcγ受体和人抑制性Fcγ受体的转基因小鼠中，这类经过工程改造的TNFR超家族靶向性抗体在体内的共刺激活性也得到了改善(1}Dahan等人,2016,《激动性人抗CD40单克隆抗体的治疗活性需要选择性的FcγR参与(Therapeutic Activity of Agonistic,Human Anti-CD40Monoclonal Antibodies Requires Selective FcγR Engagement.)》CancerCell.29(6):820-31)。

如上所概述的，抗体分子的不同类型和形式包含在本发明中，而且是免疫学领域技术人员已知的。众所周知的是，用于治疗目的的抗体通常用改进抗体分子性质的附加组分来修饰。

因此，我们提出：本发明的抗体分子或根据本发明使用的抗体分子(例如，单克隆抗体分子和/或多克隆抗体分子和/或双特异性抗体分子)包含可检测部分和/或细胞毒性部分。

所谓“可检测部分”，包括一种或多种来自包括以下项的组的组成部分：酶、放射性原子、荧光部分、化学发光部分、生物发光部分。可检测部分允许抗体分子在体外和/或体内和/或离体可见。

所谓“细胞毒性部分”，包括放射性部分和/或酶，例如，其中酶是半胱天冬酶和/或毒素，例如，其中毒素是细菌毒素或毒液；其中细胞毒性部分能够诱导细胞裂解。

我们还提出，抗体分子可以呈分离形式和/或经纯化形式，并且/或者可以是聚乙二醇化抗体分子。

如上文所讨论的，抗体的CDR与抗体靶标结合。将氨基酸分配给本文所述每个CDR是根据以下文献中提出的定义进行的：Kabat EA等人，1991,“Sequences of Proteins ofImmunological Interest”，第5版，NIH出版号91-3242，第xv至第xvii页。

如技术人员将了解的，还存在用于向每个CDR分配氨基酸的其他方法。例如，国际免疫遗传学信息系统(IMGT(R))(http://www.imgt.org/and Lefranc and Lefranc“TheImmunoglobulin FactsBook”，由Academic Press出版，2001)。

在另一个实施方案中，本发明或根据本发明使用的CTLA-4特异性抗体分子是能够与本文所述特异性抗体竞争的抗体分子，诸如具有SEQID.NO:15、16、17、10、18和19或SEQID.NO:22、23、24、10、25和26的抗体分子。

所谓“能够竞争”，意指竞争性抗体能够至少部分地抑制或以其他方式干扰如本文所定义的抗体分子与特异性靶标的结合。

例如，这种竞争性抗体分子可以能够将本文所述抗体分子的结合至少抑制约10％；例如，至少抑制约20％，或至少抑制约30％，至少抑制约40％、至少抑制约50％、至少抑制约60％、至少抑制约70％、至少抑制约80％、至少抑制约90％、至少抑制约95％、至少抑制约100％，并且/或者将本文所述抗体防止或减少与特异性靶标结合的能力至少抑制约10％；例如，至少抑制约20％、至少抑制约30％、至少抑制约40％、至少抑制约50％、至少抑制约60％、至少抑制约70％、至少抑制约80％、至少抑制约90％、至少抑制约95％，或至少抑制约100％。

可以通过本领域技术人员众所周知的方法来确定竞争性结合，诸如酶联免疫吸附测定(ELISA)。

可以使用ELISA测定来评价表位修饰或阻断抗体。适用于鉴定竞争性抗体的附加方法公开于Antibodies:A Laboratory Manual,Harlow和Lane中，该文献以引用方式并入本文(例如，参见第567页到第569页、第574页到第576页、第583页以及第590到第612页，1988，CSHL,NY,ISBN 0-87969-314-2)。

众所周知，抗体特异性结合限定的靶分子或抗原，并且这意味着抗体优先且选择性地结合其靶标而不是非靶标的分子。

根据本发明的第一抗体和第二抗体(CTLA-4、PD1、PD-L1)的靶标或根据本发明使用的第一抗体和第二抗体的靶标在细胞表面上表达，即，这些靶标是细胞表面抗原，其将包括抗体的表位(在该语境中又称为细胞表面表位)。细胞表面抗原和表位是免疫学或细胞生物学领域技术人员容易理解的术语。

所谓“细胞表面抗原”，包括：本文所述抗体分子在细胞膜的细胞外侧上向其暴露的细胞表面抗原或至少其表位。

评估蛋白质结合的方法是生物化学和免疫学领域技术人员已知的。技术人员将理解，这些方法可以用于评估抗体与靶标的结合和/或抗体的Fc结构域与Fc受体的结合；以及相对强度或特异性，或者这些相互作用的抑制、预防或减小。可以用于评估蛋白质结合的方法的实例为，例如，免疫测定、BIAcore、蛋白质印迹、放射性免疫测定(RIA)和酶联免疫吸附测定(ELISA)(关于抗体特异性的讨论，参见Fundamental Immunology第二版，RavenPress,New York，第332至332页(1989))。

因此，本文中的“与CTLA-4特异性结合的抗体分子”和“抗CTLA-4抗体分子”均指与靶标CTLA-4特异性结合但不与非靶标结合，或者相比靶标以弱得多的强度(诸如以较低的亲和力)与非靶标结合的抗体分子。

类似地，本文中的“与PD-1特异性结合的抗体分子”和“抗PD-1抗体分子”均指与靶标PD-1特异性结合但不与非靶标结合，或者相比靶标以弱得多的强度(诸如以较低的亲和力)与非靶标结合的抗体分子。

本文中的“与PD-L1特异性结合的抗体分子”和“抗PD-L1抗体分子”均指与靶标PD-L1特异性结合但不与非靶标结合，或者相比靶标以弱得多的强度(诸如以较低的亲和力)与非靶标结合的抗体分子。

在一些实施方案中，特异性结合CTLA-4的抗体分子(或抗CTLA-4抗体分子)是指与CTLA-4的细胞外结构域特异性结合的抗体分子。在一些实施方案中，特异性结合PD-1的抗体分子(或抗PD-1抗体分子)是指与PD-1的细胞外结构域特异性结合的抗体分子。在一些实施方案中，特异性结合PD-L1的抗体分子(或抗PD-L1抗体分子)是指与PD-L1的细胞外结构域特异性结合的抗体分子。

我们还提出以下含义：抗体与靶标CTLA-4或PD-1或PD-L1特异性结合的强度是抗体与非靶标特异性结合的强度的至少两倍、或至少五倍、或至少10倍、或至少20倍、或至少50倍、或至少100倍、或至少200倍、或至少500倍、或至少约1000倍。

此外，我们提出以下含义：如果抗体以至少约10^-1M、或至少约10^-2M、或至少约10^- ³M、或至少约10^-4M、或至少约10^-5M、或至少约10^-6M、或至少约10^-7M、或至少约10^-8M、或至少约10^-9M、或至少约10^-10M、或至少约10^-11M、或至少约10^-12M、或至少约10^-13M、或至少约10^-14M、或至少约10^-15M的解离常数(K_D)与靶标CTLA-4或PD-1或PD-L1结合，则抗体与该靶标特异性结合。

如上文所讨论的，本发明的溶瘤病毒表达特异性结合CTLA-4的抗体。

在一些实施方案中，与CTLA-4特异性结合的抗体分子是Fcγ受体接合抗体。

在一些实施方案中，第一抗体分子选自由伊匹木单抗和曲美木单抗组成的组。

在一些实施方案中，特异性结合CTLA-4的抗体分子(或抗CTLA-4抗体分子)不与CD28交叉反应。在一些实施方案中，特异性结合CTLA-4的抗体分子(或抗CTLA-4抗体分子)阻断CTLA-4与CD80和/或CD86的结合，从而抑制CTLA-4信号传导。

在一些实施方案中，与伊匹木单抗相比，本文所述与CTLA-4特异性结合的抗体分子(或抗CTLA-4抗体分子)对CTLA-4阳性细胞具有改善的耗竭作用。

抗体分子对CTLA-4阳性细胞具有消耗作用意指在施用于受试者如人后，这样的抗体与在CTLA-4阳性细胞表面上表达的CTLA-4特异性结合，并且这种结合导致这类细胞的消耗。

在一些实施方案中，CTLA-4阳性细胞是CD4阳性(CD4⁺)细胞，即表达CD4的细胞。

在一些实施方案中，CTLA-4阳性细胞为CD4阳性和FOXP3阳性两者，即表达CD4和FOXP3。这些细胞是Treg。CD8阳性T细胞也表达CTLA-4，但Tregs表达的CDLA-4水平明显高于CD8阳性T细胞。与较低表达CD8⁺细胞相比，这使Treg更易于耗竭。

在一些情况下，CTLA-4优先在肿瘤微环境中的免疫细胞(肿瘤浸润细胞，TIL)上表达。

因此，在肿瘤微环境中，Treg将是具有最高CTLA-4表达的细胞，从而使得与CTLA-4特异性结合的抗体分子(或抗CTLA-4抗体分子)具有Treg耗竭作用。

因此，在一些实施方案中，与CTLA-4特异性结合的抗体分子是Treg耗竭抗体。

如上文所提及，本文所述的抗CTLA-4抗体分子可以是Treg耗竭抗体分子，这意味着在施用于受试者(诸如人类)后，这样的抗体分子与在Treg表面上表达的CTLA-4特异性结合，并且这种结合引起Treg耗竭。

为了确定抗体分子是否为具有本文所提及的Treg耗竭作用的抗体分子(例如，与伊匹木单抗相比，这可能是改善的耗竭作用)，可以使用体外抗体依赖性细胞毒性(ADCC)测定或PBMC-NOG/SCID模型中的体内测试。

体外ADCC测试，其使用经稳定转染以表达CD16-158V等位基因与GFP的NK-92细胞系执行，其中ADCC测试包括以下连续的七个步骤：

1)从健康供体的外周血中分离出CTLA-4阳性细胞、CD4阳性细胞或Treg作为靶细胞。该分离可以使用CD4⁺ T细胞分离试剂盒(诸如来自Miltenyi Biotec的商业试剂盒)来进行。

2)然后用CD3/CD28，例如使用CD3/CD28和rhIL-2，如50ng/ml rhIL-2，刺激靶细胞例如持续48小时。刺激可以在37℃下进行。

3)然后将靶细胞与待测试的抗体分子例如以10μg/ml在4℃下预温育30分钟，并且然后与NK细胞混合。

4)然后将靶细胞在含有HEPES缓冲液、丙酮酸钠和FBS低IgG的RPMI 1640+GlutaMAX培养基中温育持续适当的时间，如4小时。RPMI 1640+GlutaMAX培养基可以含有10mM HEPES缓冲液、1mM丙酮酸钠和10％ FBS低IgG，并且效应子与靶细胞的比率可以为2:1。

5)通过流式细胞术测定裂解。

6)重复或并行执行步骤1至5，其中使用伊匹木单抗(作为对照)代替步骤3中的测试抗体分子。

7)将测试的抗体分子的裂解结果与伊匹木单抗的裂解结果进行比较。测试的抗体分子与伊匹木单抗相比改善的裂解表明测试的抗体分子对CTLA-4阳性细胞、CD4阳性细胞或Treg具有改善的消耗作用，这分别取决于使用哪种靶细胞。

在一些实施方案中，以上步骤7)中的改善的消耗作用是显著改善的消耗作用。

体内测试是基于PBMC小鼠和NOG/SCID小鼠的组合使用，这在本文中称为PBMC-NOG/SCID模型。PBMC小鼠和NOG/SCID小鼠都是众所周知的模型。PBMC-NOG/SCID模型中的体内测试包括以下连续的九个步骤：

1)将人PBMC(外周血单核细胞)分离、洗涤并重悬于无菌PBS中。在一些实施方案中，以75×10⁶个细胞/ml将PBMC重悬于PBS中。

2)向NOG小鼠i.v.(静脉内)注射适当量(如200μl)的来自步骤1)的细胞悬浮液。如果注射200μl，则这对应于15×10⁶个细胞/小鼠。

3)在注射之后的合适时间，诸如2周，从NOG小鼠分离脾脏，使其成为单细胞悬浮液。任选地，从单细胞悬浮液中取出少量样品，以通过FACS确定CTLA-4在人T细胞上的表达，以便确认CTLA-4表达。

4)将来自步骤3)的细胞悬浮液重悬于无菌PBS中。在一些实施方案中，以50×10⁶个细胞/ml将细胞悬浮液重悬于无菌PBS中。如果步骤3中包含了任选的CTLA-4表达确定，则其余的细胞悬浮液将在步骤4中重新悬浮。

5)向SCID小鼠i.p.(腹膜内)注射适量(诸如200μl)来自步骤4的悬浮液。如果注射200μl，则这对应于10×10⁶个细胞/小鼠。

6)在步骤5)中的注射之后合适的时间，如1小时，用适当量(如10mg/kg)的待测抗体分子、伊匹木单抗或同种型对照单克隆抗体处理SCID小鼠。

7)在步骤6)中的处理之后的合适时间，诸如24小时，收集经处理的SCID小鼠的腹膜内液。

8)使用以下标志物由FACS鉴定人T细胞亚群并对其进行定量：CD45、CD4、CD8、CD25和/或CD127。

9)将来自用测试的抗体分子处理的小鼠的T细胞亚群的鉴定和定量结果与来自用伊匹木单抗处理的小鼠的T细胞亚群的鉴定和定量结果以及来自用同种型对照单克隆抗体处理的小鼠的T细胞亚群的鉴定和定量结果进行比较。与用伊匹木单抗处理的小鼠的腹膜液中的CTLA-4阳性细胞的数量相比，用待测试的抗体分子处理的小鼠的腹膜液中的CTLA-4阳性细胞数量较少，表明与伊匹木单抗相比，抗体分子对CTLA-4阳性细胞具有改善的消耗作用。与用伊匹木单抗处理的小鼠的腹膜内液中的CD4阳性细胞数量相比，用待测试抗体分子处理的小鼠的腹膜内液中的CD4阳性细胞数量较少，表明与伊匹木单抗相比，该抗体分子对CD4阳性细胞具有改善的耗竭作用。与用伊匹木单抗处理的小鼠的腹膜液中的Treg数量相比，用待测试的抗体分子处理的小鼠的腹膜液中的Treg数量较少，表明与伊匹木单抗相比，抗体分子对Treg具有改善的消耗作用。

在该体内测试中，在一些实施方案中，最感兴趣的是观察步骤7中的Treg消耗。

如技术人员已知的，也可以在抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)测定中评估Treg消耗。

在一些实施方案中，与Yervoy(伊匹木单抗)相比，抗体分子对CTLA-4与B7.1配体和B7.2配体的相互作用具有相似的阻断作用。这可以通过ELISA或在更具功能性的测定中进行评估，在该更具功能性的测定中，抗CTLA-4抗体响应于用葡萄球菌肠毒素B(SEB)刺激PBMC，增强T细胞产生IL-2。

在一些实施方案中，抗CTLA-4抗体分子是人抗体分子。在一些实施方案中，抗CTLA-4抗体分子是人源化抗体分子。在一些实施方案中，抗CTLA-4抗体分子是人源的抗体分子，这意味着它源自随后被修饰的人抗体分子。在一些实施方案中，抗CTLA-4抗体分子是人IgG1抗体。

在一些实施方案中，与CTLA-4特异性结合的第一抗体分子选自由以下项组成的组：人IgG抗体、人源化IgG抗体和人源IgG抗体。

在一些实施方案中，与CTLA-4特异性结合的第一抗体分子选自由全尺寸抗体、嵌合抗体、单链抗体及其抗原结合片段(例如，Fab、Fv、scFv、Fab'和(Fab')₂)组成的组。

在一些实施方案中，抗CTLA-4抗体是以下人IgG1抗体形式的抗体：其表现出与一个或几个活化性Fc受体的结合改善并且/或者经工程改造以改善与一个或几个活化性Fc受体的结合；因此，在一些实施方案中，抗CTLA-4抗体是经Fc工程改造的人IgG1抗体。

在一些实施方案中，抗CTLA-4抗体是鼠或人源化鼠IgG2a抗体。

在一些实施方案中，抗CTLA-4抗体是与人CTLA-4交叉反应的鼠抗体。

在一些实施方案中，抗CTLA-4抗体是单克隆抗体或单克隆来源的抗体分子。在一些实施方案中，抗CTLA-4抗体是多克隆抗体。

在一些实施方案中，抗CTLA-4抗体分子是包括下表1中呈现的三个替代VH-CDR1序列之一、三个替代VH-CDR2序列之一、两个替代VH-CDR3序列之一、两个VL-CDR1序列之一、两个VL-CDR2序列之一和/或两个替代VL-CDR3序列之一的抗体分子。

在一些实施方案中，抗CTLA-4抗体分子选自由包括CDR中的1至6个的抗体分子组成的组，所述CDR选自由SEQ ID.No:3、6、8、10、12和14组成的组。

在一些实施方案中，抗CTLA-4抗体分子选自由包含具有SEQ ID.No:3、6、8、10、12和14的CDR的抗体分子组成的组。

在一些实施方案中，抗CTLA-4抗体分子选自由包括CDR VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL-CDR1和VL-CDR3中的1至6个的抗体分子组成的组，

其中VH-CDR1，如果存在的话，选自由SEQ ID.No:15、22、29和35组成的组；

其中VH-CDR2，如果存在的话，选自由SEQ ID.No:16、23、30和36组成的组；

其中VH-CDR3，如果存在的话，选自由SEQ ID.No:17、24、31和37组成的组；

其中VL-CDR1，如果存在的话，选自由SEQ ID.No:10和38组成的组；

其中VL-CDR2，如果存在的话，选自由SEQ ID.No:18、25、32和39组成的组；

其中VL-CDR3，如果存在的话，选自由SEQ ID.No:19、26和40组成的组。

在一些实施方案中，抗CTLA-4抗体分子是选自由包括6个CDR的抗体分子组成的组的抗体分子，所述6个CDR选自由以下组成的组：

SEQ ID.NO:15、16、17、10、18和19；

SEQ ID.NO:22、23、24、10、25和26；

SEQ ID.NO:29、30、31、10、32和26；以及

SEQ ID.NO:35、36、37、38、39和40。

在一些实施方案中，抗CTLA-4抗体分子是包含具有SEQ ID.NO:15、16、17、10、18和19的6个CDR的抗体分子。

在一些实施方案中，抗CTLA-4抗体分子是包含具有SEQ ID.NO:22、23、24、10、25和26的6个CDR的抗体分子。

在一些实施方案中，抗CTLA-4抗体分子是选自由包括VH的抗体分子组成的组的抗体分子，所述VH选自由以下组成的组：SEQ ID.NO:20、27、33和41。

在一些实施方案中，抗CTLA-4抗体分子是选自由包括VL的抗体分子组成的组的抗体分子，所述VL选自由以下组成的组：SEQ ID.NO:21、28、34和42。

在一些实施方案中，抗CTLA-4抗体分子是选自由包括VH和VL的抗体分子组成的组的抗体分子，所述VH和VL选自由以下组成的组：SEQID.NO:20-21、27-28、33-34和41-42。

在一些实施方案中，抗CTLA-4抗体分子包括具有序列SEQ ID.No:20的VH和具有序列SEQ ID.NO:21的VL。

在一些实施方案中，抗CTLA-4抗体分子包括具有序列SEQ ID.No:27的VH和具有序列SEQ ID.No:28的VL。

在一些实施方案中，第一抗体分子包含选自由SEQ.ID.NO:20和27组成的组的可变重链。在一些附加或替代性实施方案中，第一抗体分子包含选自由SEQ ID NO:21和28组成的组的可变轻链。

在一些实施方案中，抗CTLA-4抗体分子包含具有序列SEQ ID NO:43的重链恒定区(CH)。在一些附加或替代性实施方案中，抗CTLA-4抗体分子包含具有序列SEQ ID NO:44的轻链恒定区(CL)。在一些实施方案中，抗CTLA-4抗体分子包含具有SEQ ID NO:43和44的恒定区。

表1：本文公开的抗体的一般CDR序列

表2：特异性抗CTLA-4抗体分子；CDR序列在完整的VH序列和VL序列中以粗体标记。

在一些实施方案中，本文所述的抗CTLA-4抗体分子还可包括下表3中所呈现的恒定区中的一个或两个。

表3：本文公开的抗体的恒定区的序列

在一些实施方案中，抗CTLA-4抗体分子是由下表4中所呈现的核苷酸序列之一编码的分子。

表4：编码抗CTLA-4抗体分子的特定核苷酸序列

在一些实施方案中，有利的是抗体分子既与人CTLA-4(hCTLA-4)又与恒河猴CTLA-4(cmCTLA-4或cyno CTLA-4)结合。与恒河猴(也称为食蟹猕猴或短尾猕猴)中的细胞上表达的CTLA-4的交叉反应可能是有利的，因为这使得能够在猴中测试抗体分子而不必使用替代抗体，这特别关注耐受性。

在一些实施方案中，抗体分子既与人CTLA-4(hCTLA-4)又与鼠CTLA-4(mCTLA-4)结合是有利的。这可能是有利的，因为这使得能够在小鼠中测试抗体分子，特别关注效果和药效学，而不必使用替代抗体。

在一些实施方案中，抗体分子与所有三个hCTLA-4、cmCTLA-4和mCTLA-4结合。

在一些实施方案中，有必要使用替代抗体在小鼠体内相关模型中测试抗体分子的功能活性。为了确保抗体分子在人体内的作用与替代抗体在小鼠体内的体内结果之间的可比性，有必要选择具有与人抗体分子相同的体外特性的功能等同替代抗体。

在一些实施方案中，与CTLA-4特异性结合的第一抗体分子不结合人CD28。

如本文所讨论的，第二抗体可以与PD-1特异性结合。在一些实施方案中，与PD-1特异性结合的抗体分子选自抗PD-1抗体的以下非限制性实例中的一者或多者：

·派姆单抗(目前批准使用)；

·纳武单抗(目前批准使用)；

·西米普利单抗(目前批准使用)；

·卡瑞利珠单抗(目前批准使用)；

·斯巴达珠单抗(目前处于临床开发阶段)；

·多塔利单抗(目前处于临床开发阶段)；

·替雷利珠单抗(目前处于临床开发阶段)；

·JTX-4014(目前处于临床开发阶段)；

·信迪利单抗(IBI308)(目前处于临床开发阶段)；

·特瑞普利单抗(JS 001)(目前处于临床开发阶段)；

·AMP-224(目前处于临床开发阶段)；

·AMP-514(MEDI0680)(目前处于临床开发阶段)。

在一个优选的实施方案中，与PD-1特异性结合的抗体是派姆单抗、纳武单抗、西米普利单抗或卡瑞利珠单抗。在一些实施方案中，与PD-1特异性结合的抗体是这些抗体中的两者或更多者的组合。在一个优选的实施方案中，与PD-1特异性结合的抗体是派姆单抗。

在一些实施方案中，抗PD-1抗体分子是人抗体分子。在一些实施方案中，抗PD-1抗体分子是人源化抗体分子。

在一些实施方案中，抗PD-1抗体分子是人源抗体分子，这意味着它源自随后经过修饰的人抗体分子。

在一些实施方案中，抗PD-1抗体分子是人IgG1抗体。

在一些实施方案中，抗PD-1抗体是以下人IgG1抗体形式的抗体：其表现出与一个或几个活化性Fc受体的结合改善并且/或者经工程改造以改善与一个或几个活化性Fc受体的结合；因此，在一些实施方案中，抗PD-1抗体是经Fc工程改造的人IgG1抗体。

在一些实施方案中，抗PD-1抗体是鼠或人源化鼠IgG2a抗体。

在一些实施方案中，与PD-1特异性结合的第二抗体分子选自由以下项组成的组：人抗体分子、人源化抗体分子和人源抗体分子。

在一些实施方案中，与PD-1特异性结合的第二抗体分子选自由全尺寸抗体、嵌合抗体、单链抗体及其抗原结合片段(例如，Fab、Fv、scFv、Fab'和(Fab')₂)组成的组。

在一些实施方案中，与PD-1特异性结合的第二抗体分子选自由以下项组成的组：人IgG抗体、人源化IgG抗体和人源IgG抗体。

在一些实施方案中，抗PD-1抗体是与人PD-1交叉反应的鼠抗体。

在一些实施方案中，抗PD-1抗体是单克隆抗体或单克隆来源的抗体分子。在一些实施方案中，抗PD-1抗体是多克隆抗体。

在一些实施方案中，第二抗体分子可以与PD-L1特异性结合。在一些实施方案中，与PD-L1特异性结合的抗体分子选自抗PD-L1抗体的以下非限制性实例中的一者或多者：

·阿特珠单抗(目前批准使用)；

·德瓦鲁单抗(目前批准使用)；

·阿维鲁单抗(目前批准使用)；

·CS1001(目前处于临床开发阶段)；

·KN035(恩沃利单抗)-目前在美国、中国和日本进行临床评估的PD-L1抗体皮下制剂；

·CK-301(目前正由Checkpoint Therapeutics进行临床开发)

在一个优选的实施方案中，与PD-L1特异性结合的抗体是阿特珠单抗、德瓦鲁单抗或阿维鲁单抗。在一些实施方案中，与PD-L1特异性结合的抗体是这些抗体中的两者或更多者的组合。

在一些实施方案中，抗PD-L1抗体分子是人抗体分子。

在一些实施方案中，抗PD-L1抗体分子是人源化抗体分子。

在一些实施方案中，抗PD-L1抗体分子是人源抗体分子，这意味着它源自随后经过修饰的人抗体分子。

在一些实施方案中，抗PD-L1抗体分子是人IgG1抗体。

在一些实施方案中，抗PD-L1抗体是以下人IgG1抗体形式的抗体：其表现出与一个或几个活化性Fc受体的结合改善并且/或者经工程改造以改善与一个或几个活化性Fc受体的结合；因此，在一些实施方案中，抗PD-L1抗体是经Fc工程改造的人IgG1抗体。

在一些实施方案中，抗PD-L1抗体是鼠或人源化鼠IgG2a抗体。

在一些实施方案中，与PD-L1特异性结合的第二抗体分子选自由以下项组成的组：人抗体分子、人源化抗体分子和人源抗体分子。

在一些实施方案中，与PD-L1特异性结合的第二抗体分子选自由全尺寸抗体、嵌合抗体、单链抗体及其抗原结合片段(例如，Fab、Fv、scFv、Fab'和(Fab')₂)组成的组。

在一些实施方案中，与PD-L1特异性结合的第二抗体分子选自由人IgG抗体、人源化IgG抗体和人源IgG抗体组成的组。

在一些实施方案中，抗PD-L1抗体是与人PD-L1交叉反应的鼠抗体。

在一些实施方案中，抗PD-L1抗体是单克隆抗体或单克隆来源的抗体分子。在一些实施方案中，抗PD-L1抗体是多克隆抗体。

如本文所述，本发明涉及能够表达与CTLA-4特异性结合的第一抗体分子的溶瘤病毒。

如本文所用，术语“溶瘤”是指病毒在分裂细胞(例如增殖性细胞，诸如癌细胞)中选择性复制的能力，其目的是在体外或在体内减慢所述分裂细胞的生长和/或裂解，而在非分裂(例如正常或健康)细胞中不表现出或只表现出极少的复制。

“复制(Replication)”(或任何形式的复制，如“复制(replicate)”和“复制(replicating)”等)意指病毒的复制，这可以在核酸水平或优选在传染性病毒颗粒水平发生。可以从目前鉴定的病毒的任何成员获得这样的溶瘤病毒。它可以是天然溶瘤的天然病毒，也可以通过修饰一个或多个病毒基因进行工程改造，从而提高肿瘤选择性并且/或者在分裂细胞中优先复制，诸如参与DNA复制、核酸代谢、宿主向性、表面附着、毒力、裂解和扩散的那些(参见例如，Wong等人，2010,Viruses 2:78-106)。还可以设想将一种或多种病毒基因置于事件或组织特异性调控元件(例如启动子)的控制之下。

示例性溶瘤病毒无限制地包括：呼肠孤病毒、塞内卡山谷病毒(SVV)、水疱性口炎病毒(VSV)、新城鸡瘟病毒(NDV)、单纯疱疹病毒(HSV)、麻疹病毒、腺病毒、痘病毒、逆转录病毒、麻疹病毒、泡沫病毒、α病毒、慢病毒、流感病毒、辛德毕斯病毒、粘液瘤病毒、棒状病毒、小核糖核酸病毒、柯萨基病毒、细小病毒，诸如此类。此类病毒是医学领域和病毒学领域的技术人员已知的。

在一些实施方案中，这样的溶瘤病毒获自疱疹病毒。疱疹病毒科是一个大家族的DNA病毒，它们都具有相同的结构，并且由相对大的双链线性DNA基因组构成，所述基因组编码被包裹二十面体衣壳内的100-200个基因，所述二十面体衣壳被包膜在脂质双层膜中。尽管溶瘤疱疹病毒可以衍生自不同类型的HSV，但是特别优选的是HSV1和HSV2。可以对疱疹病毒进行基因修饰，以便限制在肿瘤中的病毒复制或降低其在非分裂细胞中的细胞毒性。例如，可以使参与核酸代谢的任何病毒基因失活，诸如胸苷激酶(Martuza等人，1991,Science252:854-6)、核糖核苷酸还原酶(RR)(Mineta等人，1994,Cancer Res.54:3363-66)，或尿嘧啶-N-糖基化酶(Pyles等人，1994,J.Virol.68:4963-72)。另一方面涉及病毒突变体，其在编码毒力因子的基因(诸如ICP34.5基因)的功能上有缺陷(Chambers等人，1995,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:1411-5)。溶瘤疱疹病毒的代表性实例包括NV1020(例如，Geevarghese等人，2010,Hum.Gene Ther.21(9):1119-28)和T-VEC(Harrington等人，2015,Expert Rev.Anticancer Ther.15(12):1389-1403)。

在一些实施方案中，这样的溶瘤病毒获自腺病毒。方法是本领域可用于工程改造溶瘤腺病毒的。一种有利的策略包含用肿瘤选择性启动子替换病毒启动子或修饰E1腺病毒基因产物，以使其在肿瘤细胞中改变的与p53或视网膜母细胞瘤(Rb)蛋白的结合功能失活。在自然环境中，腺病毒E1B55kDa基因与另一种腺病毒产物协同作用使p53失活(p53在癌细胞中经常失调)，从而防止了细胞凋亡。溶瘤腺病毒的代表性实例包含ONYX-015(例如，Khuri等人,2000,《自然医学(Nat.Med)》6(8):879-85)和也称为Oncorine的H101(Xia等人,2004,《癌症(Ai Zheng)》23(12):1666-70)。

在一些实施方案中，这样的溶瘤病毒是溶瘤痘病毒。如本文所用，术语“痘病毒”是指属于痘病毒科的病毒，特别优选属于脊索痘病毒亚科(the Chordopoxviridaesubfamily)的痘病毒，并且更优选属于正痘病毒属(the Orthopoxvirus genus)的痘病毒。痘苗病毒、牛痘病毒、金丝雀痘病毒、鼠痘病毒和粘液瘤病毒特别适合于本发明的上下文中。这类痘病毒的基因组序列可在本领域和专门的数据库中获得(例如Genbank，登录号分别为NC_006998、NC_003663或AF482758.2、NC_005309、NC_004105、NC_001132)。

在具体和优选的实施方案中，这样的溶瘤痘病毒是溶瘤痘苗病毒。痘苗病毒是特征在于200kb双链DNA基因组的痘病毒家族的成员，所述基因组编码多种病毒酶和使病毒能够独立于宿主细胞机制进行复制的因子。大部分痘苗病毒颗粒借助单个脂质包膜在细胞内(对于细胞内成熟病毒体，IMV)，并保留在感染细胞的胞液质中直至裂解。另一种传染性形式是双被包膜的颗粒(对于细胞外被包膜的病毒体，EEV)，它从被感染的细胞中发芽而不会使其裂解。尽管它可以来源于任何痘苗病毒株，但特别优选埃尔斯特里(Elstree)、怀斯(Wyeth)、哥本哈根(Copenhagen)、利斯特(Lister)和西储(Western Reserve)株。除非另有说明，否则本文所用的基因命名法是哥本哈根痘苗株的命名法。但是，哥本哈根和其他痘苗株之间的对应关系通常可在文献中获得。

优选地，通过改变一种或多种病毒基因来修饰这样的溶瘤痘苗病毒。所述(一种或多种)修饰优选导致缺乏合成或缺陷性病毒蛋白的合成，所述缺陷性病毒蛋白不能确保未修饰基因在正常条件下产生的蛋白的活性。在文献中公开了示例性修饰，其目的是改变参与DNA代谢、宿主毒力、IFN通路的病毒基因(例如，Guse等人，2011,Expert OpinionBiol.Ther.11(5):595-608)等等。用于改变病毒基因座的修饰涵盖病毒基因或其调控元件内一个或多个核苷酸(连续或不连续)的缺失、突变和/或取代。可以通过本领域技术人员已知的多种方式使用常规重组技术进行(一种或多种)修饰。

更优选地，通过改变胸苷激酶编码基因(基因座J2R)来修饰这样的溶瘤痘苗病毒。胸苷激酶(TK)酶参与脱氧核糖核苷酸的合成。正常细胞中的病毒复制需要TK，因为这些细胞通常具有低浓度的核苷酸，而在含有高核苷酸浓度的分裂细胞中它是可有可无的。

替代性地，或与之结合，通过改变编码核糖核苷酸还原酶(RR)的至少一个或两个基因来修饰这样的溶瘤痘苗病毒。在自然环境中，该酶催化核糖核苷酸还原为脱氧核糖核苷酸，这是DNA生物合成中的关键步骤。病毒酶的亚基结构与哺乳动物酶相似，由两个异源亚基构成，设计分别由I4L和F4L基因座编码的R1和R2。在本发明的上下文中，可以使I4L基因(编码R1大亚基)或F4L基因(编码R2小亚基)或两者失活(例如，如WO2009/065546和Foloppe等人,2008,《基因疗法Gene Ther.)》,15:1361-71中所述)。J2R、I4L和F4L基因的序列及其在各种痘病毒基因组中的位置可在公共数据库中获得。

因此，在一些实施方案中，溶瘤病毒的胸苷激酶(TK)和/或核糖核苷酸还原酶(RR)活性有缺陷。在一些实施方案中，溶瘤病毒是胸苷激酶(TK)和/或核糖核苷酸还原酶(RR)活性有缺陷的痘苗病毒。

在一些实施方案中，溶瘤病毒包含编码如本文所定义的第一抗体分子的核苷酸序列。

在一些实施方案中，这样的溶瘤病毒包含编码与上表2中列出的序列具有至少80％同一性的氨基酸序列的核苷酸序列。在一些实施方案中，这样的溶瘤病毒包含与上表2中列出的序列具有至少85％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，这样的溶瘤病毒包含与上表2中列出的序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，这样的溶瘤病毒包含与上表2中列出的序列具有至少95％同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，这样的溶瘤病毒包含编码SEQ.ID.NO:20和ID.NO:21的核苷酸序列。在一些实施方案中，这样的溶瘤病毒包含编码SEQ.ID.NO:27和ID.NO:28的核苷酸序列。在一些实施方案中，这样的溶瘤病毒包含编码SEQ.ID.NO:33和ID.NO:34的核苷酸序列。在一些实施方案中，这样的溶瘤病毒包含编码SEQ.ID.NO:41和ID.NO:42的核苷酸序列。

在一些实施方案中，这样的溶瘤病毒包含与上表4中列出的序列具有至少80％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，这样的溶瘤病毒包含与上表4中列出的序列具有至少85％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，这样的溶瘤病毒包含与上表4中列出的序列具有至少90％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，这样的溶瘤病毒包含与上表4中列出的序列具有至少95％同一性的核苷酸序列。

在一些实施方案中，该核苷酸序列包括选自由SEQ ID NO:45-52组成的组的序列，或者由选自由SEQ ID NO:45-52组成的组的序列组成。在一些实施方案中，这样的溶瘤病毒包含SEQ.ID.NO:45和46。在一些实施方案中，这样的溶瘤病毒包含SEQ.ID.NO:47和48。在一些实施方案中，这样的溶瘤病毒包含SEQ.ID.NO:49和50。在一些实施方案中，这样的溶瘤病毒包含SEQ.ID.NO:51和52。

一些溶瘤病毒具有容纳足够大的DNA插入以适应全长人抗体序列整合的能力。减弱型痘苗病毒和单纯疱疹病毒是其基因组大到足以允许整合全长IgG抗体序列的治疗性溶瘤病毒的实例(Chan和McFadden，2014；Bommareddy、Shettigar等人，2018)。全长IgG抗体已成功整合到溶瘤痘苗病毒中，其结果是，在感染病毒易感宿主细胞(例如癌细胞)后，全长IgG抗体表达并向细胞外释放(产生)(Kleinpeter等人，2016)。腺病毒也可以经工程改造以编码在细胞感染时功能性地产生并分泌的全长IgG抗体(Marino等人，2017)。

在一个优选的实施方案中，这样的溶瘤病毒是痘病毒(例如，痘苗病毒)，该痘病毒的TK活性有缺陷(由于J2R基因座改变而引起)或者TK和RR这两种活性有缺陷(由于J2R基因座以及编码RR的I4L和/或F4L基因座中的至少一个基因座这两者改变而引起)并且包含(a)编码SEQ.ID.NO:20和ID.NO:21的核苷酸序列或(b)编码SEQ.ID.NO:27和ID.NO:28的核苷酸序列或(c)编码SEQ.ID.NO:33和ID.NO:34的核苷酸序列或(d)编码SEQ.ID.NO:41和ID.NO:42的核苷酸序列。

在一些实施方案中，可以通过在相关基因座(即，J2R、I4L和/或F4L基因座)内引入编码第一抗体分子的核苷酸序列来破坏TK活性和RR活性。在一些优选的实施方案中，病毒包含插入病毒J2R基因座处的编码第一抗体分子的重链的核苷酸序列并且/或者包含插入病毒I4L基因座处的编码第一抗体分子的轻链的核苷酸序列。

在适当的时候，可能有利的是插入本文所述的溶瘤病毒中的(一个或多个)核苷酸序列包含促进表达、运输和生物学活性的附加调控元件。例如，可以包含信号肽，以促进在生产者细胞(例如，受感染细胞)外的分泌。通常将信号肽紧接在Met引发剂之后插入编码的多肽的N端。信号肽的选择是广泛的，并且是本领域技术人员可及的。例如，源自另一种免疫球蛋白的信号肽(例如重链IgG)可用于本发明的上下文中，以允许本文所述的抗CTLA4抗体在生产者细胞外分泌。出于说明的目的，可以参考SEQ ID NO:53和SEQ ID NO:54，其包含本文所述4-E03抗体的轻链和重链，其中轻链和重链均配备有源自IgG的肽信号。

特别优选的溶瘤病毒是痘苗病毒(例如，哥本哈根株)，该痘苗病毒的TK和RR这两种活性有缺陷(例如，由于J2R基因座和I4L基因座这两者改变而引起)并且包含编码SEQ.ID.NO:20和SEQ ID.NO:21或SEQ.ID.NO:53和SEQ ID.NO:54的核苷酸序列。

在一些实施方案中，这样的溶瘤病毒可以还包含具有治疗意义的附加核苷酸序列，诸如编码免疫调节多肽(即，直接或间接参与刺激免疫应答的多肽)的核苷酸序列。合适的免疫调节多肽的代表性实例包括但不限于细胞因子和趋化因子，且特别优选的是粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，特别是人、非人灵长类或鼠GM-CSF。

因此，在一些实施方案中，能够表达与CTLA-4特异性结合的第一抗体分子的溶瘤病毒(例如，痘苗病毒)还包含编码GM-CSF，优选人GM-CSF(例如具有SEQ ID NO:55或SEQ IDNO:56)或鼠GM-CSF(例如具有SEQ ID NO:57或SEQ ID NO:58)的核苷酸序列。

可以通过标准分子生物学技术(例如PCR扩增、cDNA克隆、化学合成)使用本领域可获得的序列数据和本文提供的信息来容易地获得附加核苷酸序列。特别优选的溶瘤病毒是痘苗病毒(例如，哥本哈根株)，该痘苗病毒的TK和RR这两种活性有缺陷(由于J2R基因座和I4L基因座这两者改变而引起)并且包含编码SEQ.ID.NO:20和ID.NO:21或SEQ.ID.NO:53和SEQ ID.NO:54的核苷酸序列和编码GM-CSF的核苷酸序列，其中特别优选的是人GM-CSF(例如，具有SEQ ID NO:55或SEQ ID NO:56)或鼠GM-CSF(例如，具有SEQ ID NO:57或SEQ IDNO:58)。

下表提供了本文所提及的GM-CSF的序列：

另外，可以通过修饰一个或多个密码子来优化要插入这样的溶瘤病毒中的核苷酸序列，以在特定宿主细胞或受试者中提供高水平表达。此外，为了优化密码子使用，还可以设想各种修饰，以防止在集中区域中存在稀有、非最佳密码子的聚类和/或抑制或修饰预期对表达水平有负面影响的“负”序列元件。此类负序列元件无限制地包括具有非常高(>80％)或非常低(<30％)的GC含量的区域；富含AT或富含GC的序列延伸；不稳定的正向或反向重复序列；R A二级结构；和/或内部隐性调控元件，诸如内部TATA盒、chi位点、核糖体进入位点，和/或剪接供体/受体位点。

在一些实施方案中，将(一个或多个)核苷酸序列置于合适的调控元件的控制下，以使其在宿主细胞或受试者中正确表达。如本文所用，术语“调控元件”是指允许、贡献或调节编码(一个或多个)核苷酸序列在给定宿主细胞或受试者中的表达的任何元件，包含其复制、复制、转录、剪接、翻译、稳定性和/或在表达细胞内或外的运输。本领域技术人员将理解，调控元件的选择可以取决于如核苷酸序列本身、其被插入其中的病毒、宿主细胞或受试者、所需表达水平等因素。启动子特别重要。在本发明的上下文中，它可以是它在许多类型的宿主细胞中控制的或特定于某些宿主细胞或响应于特定事件或外源因素(例如，通过温度、营养添加剂、激素等)或根据病毒周期的阶段(例如晚期或早期)调节的核苷酸序列的组成型指导表达。适于病毒介导的表达的启动子是本领域已知的。

由溶瘤痘病毒表达的代表性实例无限制地包括痘苗p7.5K、pH5.R、p11K7.5、TK、p28、p11、pB2R、pA35R、K1L和pSE/L启动子(Erbs等人，2008,Cancer Gene Ther.15(1):18-28；Orubu等人，2012,PloS One 7:e40167)，早期/晚期嵌合启动子与合成启动子(Chakrabarti等人，1997,Biotechniques 23:1094-7；Hammond等人，1997,J.VirolMethods 66:135-8；以及Kumar和Boyle，1990,Virology 179:151-8)。在优选的实施方案中，将本文所述抗体的轻链和重链的核苷酸序列分别置于具有相同转录强度的启动子的控制下，并且优选地置于相同启动子(例如p7.5K，诸如以SEQ ID NO:59描述的启动子，或pH5.R，诸如以SEQ ID NO:60描述的启动子)的控制下，以对于两条链获得相似表达水平，因此抗体作为异四聚体蛋白进行最佳组装(即，避免过多的非缔合链)。可以将附加核苷酸序列(例如编码GM-CSF)置于不同启动子(例如pSE/L，诸如以SEQ ID NO:61描述的启动子)的控制下。

下表提供了上文所提及的启动子的序列：

通过常规手段，使用适当的限制酶或优选地通过同源重组，在这样的溶瘤病毒的基因组中插入核苷酸序列(可能装备有适当的调控元件)。(一个或多个)核苷酸序列可以独立地插入病毒基因组的任何位置。可以考虑各种插入位点，例如在这样的溶瘤病毒的基因组的非必需病毒基因、基因间区域或非编码部分中。J2R基因座和/或I4L基因座特别适合于作为痘病毒的溶瘤病毒(例如溶瘤痘苗病毒)。在将核苷酸序列插入病毒基因组中后，插入位点处的病毒基因座可能至少部分缺失。在一个实施方案中，这种缺失或部分缺失可导致由全部或部分缺失的基因座编码的病毒基因产物的表达受到抑制，从而导致对于所述病毒功能的有缺陷病毒。特别优选的溶瘤病毒是包括编码插入J2R基因座处的重链的盒与编码插入I4L基因座处的轻链的盒的TK和/或RR缺陷性痘苗病毒。可以将编码附加GM-CSF编码的核苷酸序列的盒插入病毒基因组的另一个位置或者J2R或I4L基因座中，且优选插入I4L基因座处。

本发明还提供了一种在合适的宿主细胞(生产者细胞)中生成本文所述的这种溶瘤病毒，特别是溶瘤痘病毒的方法。在一些实施方案中，这样的方法包括病毒基因组和转移质粒之间同源重组的一个或多个步骤，所述转移质粒包括要插入的(一个或多个)核苷酸序列(可能带有调控元件)，所述核苷酸序列侧接5'和3'，且病毒序列分别存在于插入位点的上游和下游。所述转移质粒可以通过常规技术(例如，通过转染)生成并引入宿主细胞中。可以通过感染将病毒基因组引入宿主细胞中。每个侧翼病毒序列的大小可以在核苷酸序列的每一侧上至少100bp到至多1500bp之间变化(优选200至550bp并且更优选250至500bp)。允许产生这样的溶瘤病毒的同源重组优选在培养的细胞系(例如赫拉(HeLa)、韦罗(Vero))或从胚卵获得的鸡胚成纤维细胞(CEF)细胞中进行。

在一些实施方案中，可以通过使用选择和/或可检测基因来促进对掺入了抗CTLA4编码核苷酸序列以及可能的附加核苷酸序列(例如GM-CSF)的溶瘤病毒的鉴定。

在优选的实施方案中，转移质粒进一步包括对GPT基因(编码鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶)具有特定偏好的选择标志物，其允许在选择性培养基(例如在麦考酚酸、黄嘌呤和次黄嘌呤的存在下)或编码可检测的基因产物如GFP、e-GFP或mCherry的可检测基因中生长。另外，还可以考虑使用能够在所述选择或可检测基因中能够提供双链断裂的核酸内切酶。所述核酸内切酶可以是蛋白质形式或由表达载体表达。

一旦生成，可以使用常规技术将这样的溶瘤病毒扩增到合适的宿主细胞中，所述常规技术包含在合适的条件下培养转染或感染的宿主细胞，以允许产生和回收感染性颗粒。

本发明还涉及用于产生本文所述的溶瘤病毒的方法。优选地，所述方法包括以下步骤：a)制备生产者细胞系，b)用溶瘤病毒转染或感染制备的生产者细胞系，c)在合适的条件下培养转染或感染的生产者细胞系，以便产生病毒，d)从所述生产者细胞系的培养物中回收产生的病毒，以及任选地e)纯化所述回收的病毒。

在一些实施方案中，生产者细胞选自由以下项组成的组：哺乳动物(例如人或非人)细胞，诸如HeLa细胞(例如ATCC-CRM-CCL-2^TM或ATCC-CCL-2.2^TM)、HER96、PER-C6(Fallaux等人，1998,Human Gene Ther.9:1909-17)、仓鼠细胞系诸如BHK-21(ATCC CCL-10)等，以及禽细胞诸如在WO2005/042728、WO2006/108846、WO2008/129058、WO2010/130756、WO2012/001075中描述的那些，以及由获自受精卵的鸡胚制备的原代鸡胚成纤维细胞(CEF)。生产者细胞优选在适当的培养基中培养，如果需要，所述培养基可以补充血清和/或(一种或多种)合适的生长因子或不补充(例如化学成分确定的培养基，优选不含动物或人类来源的产物)。取决于生产者细胞，本领域技术人员可以容易地选择适当的培养基。这类培养基是可商购的。在感染前，优选在包括在+30℃和+38℃之间的温度下(更优选在约+37℃下)培养生产者细胞持续1和8天之间。如果需要，可以进行1至8天的几次传代，以增加细胞总数。

在步骤b)中，在适当的条件下，使用适当的感染复数(MOI)，通过溶瘤病毒感染生产者细胞，以允许生产者细胞的生产性感染。为了说明的目的，适当的MOI范围为10^-3至20，且特别优选MOI包括0.01至5，并且更优选0.03至1。感染步骤在可以与用于生产者细胞培养的培养基相同或不同的培养基中进行。

在步骤c)中，然后在本领域技术人员熟知的适当条件下培养感染的生产者细胞，直到产生子代病毒颗粒。感染的生产者细胞的培养还优选在+32℃和+37℃之间的温度下在可以与用于生产者细胞的培养和/或感染步骤的培养基/培养基相同或不同的培养基中执行，持续1至5天。

在步骤d)中，从培养上清液和/或生产者细胞中收集在步骤c)中产生的病毒颗粒。从生产者细胞中回收可能需要允许破坏生产者细胞膜以允许释放病毒的步骤。可以通过本领域技术人员熟知的各种技术来诱导生产者细胞膜的破坏，包含但不限于冷冻/融化、低渗裂解、超声处理、微流化、高剪切(也称为高速)均质化或高压均质化。

回收的溶瘤病毒可以在按剂量分布并如本文所述使用前至少部分地纯化。本领域可获得大量的纯化步骤和方法，包含例如澄清、酶处理(例如核酸内切酶、蛋白酶等)、色谱和过滤步骤。适当的方法描述于本领域中(参见例如WO2007/147528、WO2008/138533、WO2009/100521、WO2010/130753、WO2013/022764)。

在一个实施方案中，本发明还提供了一种被能够表达本文所述第一抗体分子的溶瘤病毒感染的细胞。

能够表达与CTLA-4特异性结合的第一抗体分子的溶瘤病毒和与PD-1和/或PD-1特异性结合的第二抗体分子的组合用于治疗患者的癌症，其中癌症包括冷肿瘤或由冷肿瘤组成。

我们指出，受试者可以是哺乳动物或非哺乳动物。优选地，哺乳动物受试者是人类，或是非哺乳动物，诸如马、牛、羊、猪、骆驼、狗或猫。最优选地，哺乳动物受试者是人类。

患者可能表现出表明他们患有癌症的体征或症状。所谓“表现出”，包括：受试者显现癌症症状和/或癌症诊断标志物，并且/或者该癌症症状和/或癌症诊断标志物可以被测量和/或评估和/或量化。

医学领域技术人员很容易理解，癌症症状和癌症诊断标志物将是什么，以及如何测量和/或评估和/或量化癌症症状的严重性是降低还是增加，或者癌症诊断标志物是减少还是增加；以及能够如何使用这些癌症症状和/或癌症诊断标志物来形成癌症的预后。

癌症治疗通常作为疗程来施用，也就是说，在一段时间内施用治疗剂。疗程的时间长短取决于许多因素，这些因素可以包含所施用的治疗剂的类型、所治疗的癌症的类型、所治疗的癌症的严重程度以及受试者的年龄和健康状况，以及其它原因。

“在治疗期间”包含：受试者当前正在接受疗程、和/或正在接受治疗剂、和/或正在接受治疗剂疗程。

如上文所讨论的，能够表达与CTLA-4特异性结合的第一抗体分子的溶瘤病毒和与PD-1和/或PD-L1特异性结合的第二抗体分子的组合特别可用于治疗患者的癌症，其中癌症包括冷肿瘤或由冷肿瘤组成。

因此，在一些实施方案中，通过第一抗体分子和第二抗体分子来治疗冷肿瘤。

技术人员应当理解，确定冷肿瘤是否已被“治疗”涉及用于任何其他类型肿瘤的相同类型的确定法。例如，技术人员将寻找多种体征，诸如可以使用CT扫描测量的肿瘤缩小(在经注射和未经注射这两类肿瘤中)，和/或无进展生存期，和/或总生存期。在其他情况下，这可能是更主观的效果，诸如由受试者报告的症状严重性降低。测量受试者对施用治疗性抗体的应答的治疗效果是本领域众所周知的。

“冷肿瘤”是指被炎性免疫细胞(最突出的是T细胞，特别是CD8⁺ T细胞)浸润不良的肿瘤。冷肿瘤具有高度临床相关性，因为肿瘤免疫浸润，尤其是CD8+ T细胞浸润已被广泛证明与具有不同组织学特征和解剖学定位的癌症的较长无病生存期(DFS)和/或总生存期(OS)相关联。这已经在原发和转移这两种背景中得到证实(Bruni等人，2020)，其中这些背景包括黑素瘤、大多数鳞状细胞癌(SCC)、大细胞肺癌和几种类型的腺癌(Galon等人，2006；Fridman等人，2012；Fridman等人，2017；Hu等人，2018)，与对ICB的应答相关联并且用于预测对ICB的应答(Galon和Bruni，2019)。

例如，最近证实，CD8⁺ T细胞密度与在人类实体癌患者的以下疾病中使用抗CTLA-4和PD-1/PD-L1抗体时对ICB的应答/进展相关：黑素瘤(Tumeh等人，2014)、肾细胞癌(McDermott、Huseni等人，2018)和NSCLC(Thommen、Koelzer等人，2018)。类似地，很好理解的是，临床前小鼠肿瘤模型在免疫浸润方面存在定量和定性差异，B16/C57BL6模型在免疫细胞浸润(包括CD8⁺ T细胞)方面尤其不足(Mosely等人，2017)。另外，与人“冷肿瘤”类似，B16/C57BL6模型在使用抗CTLA-4和/或抗PD-1/L1时对全身性ICB特别有耐药性，使得其可用于帮助鉴定有助于克服“冷肿瘤”对全身性ICB的耐药性的疗法。

已经设计了量化肿瘤细胞、免疫细胞或复合细胞的PD-L1水平的临床相关测定，并且在临床上用于帮助鉴定使用抗PD-1/L1 ICB试剂(例如派姆单抗)来治疗的患者(参见章节2.1的处方信息，其描述如何选择患者进行治疗-可在https://www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2021/125514s096lbl.pdf处获得)。

最近的数据，基于多色免疫荧光，鉴定了侵袭边缘CD8⁺ T细胞密度作为最佳全预测参数，并且鉴定了肿瘤CD8⁺ T细胞密度作为黑素瘤中对PD-1阻断疗法的应答/进展的第二最佳预测因子(Tumeh等人，2014)。另外，主成分分析证明，CD8浸润、PD-1和PD-L1与治疗结果显著相关。这些数据支持CD8⁺ T细胞密度可能是用于鉴定冷肿瘤患者的有用方法。最近，开发了一种基于免疫的测定法，称为“免疫评分”，用于原位量化癌症患者肿瘤中的CD3⁺CD8⁺ T细胞浸润(Bruni等人，2020；Galon等人，2006；Lanzi等人，2020)。

免疫评分是一种基于免疫组织化学和数字病理学的评分系统，用于评估肿瘤及其侵袭边缘中CD3⁺和CD8⁺ T细胞的密度。简言之，将承载福尔马林固定石蜡包埋肿瘤块的两个相邻载玻片置于自动染色仪中用抗CD3抗体和抗CD8抗体染色。然后扫描载玻片，使用数字病理学软件，将数字图像用于量化感兴趣细胞的密度。这些密度最终转化为免疫评分，范围从低免疫评分(I0)到高免疫评分(I4)。

Galon和Bruni已经提出了将免疫评分与“热肿瘤和冷肿瘤”的概念进行比对的方法(Galon等人，2019；Angell等人，2020)。使用这种方法，基于T细胞浸润将肿瘤分为四类：热免疫肿瘤；变异型免疫抑制性免疫肿瘤；变异型排斥免疫肿瘤；和冷肿瘤。

这四种肿瘤类型的特征详细描述于Galon等人，2019的方框1中，其根据以下特征来描述肿瘤类型：

1.热免疫肿瘤(在本文中也称为热肿瘤)

-高度的T细胞和细胞毒性T细胞浸润(高免疫评分)

-检查点活化(程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)、细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)、T细胞免疫球蛋白粘蛋白受体3(TIM-3)和淋巴细胞活化基因3(LAG-3))或以其他方式受损的T细胞功能(例如，细胞外钾驱动的T细胞抑制)

2.变异型免疫抑制性免疫肿瘤

-T细胞和细胞毒性T细胞浸润不良，但不是没有(中等免疫评分)

-存在可溶性抑制介质(转化生长因子-β(TGFβ)、白介素10(IL-10)和血管内皮生长因子(VEGF))

-存在免疫抑制细胞(骨髓源性抑制细胞和调节性T细胞)

-存在T细胞检查点(PD-1、CTLA-4、TIM-3和LAG-3)

3.变异型排斥免疫肿瘤

-肿瘤床内无T细胞浸润；T细胞在肿瘤边界(侵袭边缘)处聚积(中等免疫评分)

-致癌通路活化

-肿瘤微环境的表观遗传调控和重编程

-肿瘤脉管系统和/或基质异常

-缺氧

4.冷免疫肿瘤(在本文中也称为冷肿瘤)

-肿瘤内和肿瘤边缘处不存在T细胞(低免疫评分)

-T细胞启动失败(肿瘤突变负荷低、抗原呈递不良，以及对T细胞杀伤固有的不敏感性)。

因此，在一些实施方案中，如果患者具有符合如上文所定义的变异型免疫抑制性免疫肿瘤、变异型排斥免疫肿瘤或冷免疫肿瘤的定义的肿瘤，则认为该患者具有冷肿瘤。

应当理解，上述类型肿瘤中的每一种将对T细胞检查点抑制具有不同水平的应答，其中冷免疫肿瘤具有最低水平的应答(无应答)，随后分别是变异型排斥免疫肿瘤和变异型免疫抑制性免疫肿瘤(具有次优的应答水平)。

本文所用的“冷肿瘤”定义，即免疫细胞(例如，CD3+和CD8+ T细胞)浸润不良的肿瘤，既涵盖经典的冷免疫肿瘤、变异型排斥肿瘤，也涵盖变异型免疫抑制性肿瘤，因为所有这些类别都是通过T细胞浸润不良(免疫变异型)或不存在(免疫排斥型和冷肿瘤)来定义的。这相当于癌症患者的免疫评分为I、II或III，而不是IV(后者是T细胞发炎肿瘤)。因此，本发明适用于具有免疫评分I、II和III而不是IV的患者。

因此，在一些实施方案中，如果肿瘤具有免疫评分I、II或III，则认为患者具有冷肿瘤。

本领域技术人员应当理解，除免疫评分或T细胞密度之外的其他测定法和技术也可以帮助鉴定特别具有耐药性的“冷型”癌症。

在一些实施方案中，冷肿瘤具有无反应性(或无能性)淋巴细胞。这意味着淋巴细胞对抗原没有应答。确定无能性淋巴细胞的方法是本领域熟知的。

在另一些实施方案中，冷肿瘤具有低水平的CD3阳性细胞。例如，冷肿瘤可以具有少于10％的CD3阳性细胞(占肿瘤中总细胞的百分比)，即，少于5％、少于4％、少于3％、少于2％、少于1％、少于0.5％、少于0.1％的CD3阳性细胞，或不具有CD3阳性细胞。测量CD3阳性细胞的百分比的方法在本领域中是已知的。

如上文所讨论的，如本文所述的冷肿瘤是通常不被免疫系统良好靶向的肿瘤。在一些替代性或附加实施方案中，此类冷肿瘤还可以被分类为以下类型：

-免疫遗弃肿瘤，即，由于缺乏肿瘤浸润T细胞而在肿瘤中完全缺乏免疫应答。

-免疫排斥肿瘤，即，生成应答性T细胞，但不能渗入肿瘤以发动针对肿瘤的应答，T细胞可能存在于肿瘤周边。

-免疫浸润不良肿瘤，即，免疫细胞(T细胞)渗入肿瘤微环境的水平降低。

如本文中所用的所谓“冷肿瘤”，还包括所有免疫遗弃肿瘤、免疫排斥肿瘤，以及免疫浸润不良肿瘤。这些定义可以替代性地或附加地用于上文所讨论的冷肿瘤定义(变异型免疫抑制性免疫肿瘤、变异型排斥免疫肿瘤或冷免疫肿瘤)。在一些实施方案中，变异型免疫抑制性免疫肿瘤对应于免疫浸润不良的肿瘤。在一些实施方案中，变异型排斥免疫肿瘤对应于免疫排斥肿瘤。在一些实施方案中，冷免疫肿瘤对应于免疫遗弃肿瘤。

所谓“包括冷肿瘤或由冷肿瘤组成”，是指可以由冷肿瘤和非冷肿瘤构成的癌症。例如，如果原发癌症(可能是冷肿瘤)已经转移并且形成非冷肿瘤的继发性肿瘤，则可能出现这种情况。本文的患者可能患有多种肿瘤，其中只有一种肿瘤需要满足冷肿瘤的要求，本发明就会有益处。在其他实施方案中，患者可以具有被认为是冷肿瘤的单个肿瘤。

可能属于这些“冷肿瘤”亚型的癌症包括但不限于以下癌症：黑素瘤、胰腺癌、前列腺癌、结直肠癌、肝细胞癌、肺癌、膀胱癌、肾癌、胃癌、宫颈癌、梅克尔细胞癌、卵巢癌、头颈癌、间皮瘤或乳腺癌。

上述癌症中的每一种都是众所周知的，并且如用于治疗那些癌症的治疗剂一样对症状和癌症诊断标志物进行了很好的描述。因此，症状、癌症诊断标志物和用于治疗上文提及的癌症类型的治疗剂将为医学技术人员所知。

对大量癌症的诊断、预后和进展的临床定义依赖于被称为分期的某些分类。那些分期系统用于核对许多不同的癌症诊断标志物和癌症症状，以提供对癌症的诊断和/或预后和/或进展的概述。肿瘤学的技术人员将知道如何使用分期系统来评估癌症的诊断和/或预后和/或进展，以及应当使用哪些癌症诊断标志物和癌症症状来进行这种评估。

所谓“癌症分期”，包括：Rai分期，其包括0期、I期、II期、III期和IV期；和/或Binet分期，其包括A期、B期和C期；和/或安娜堡分期，其包括I期、II期、III期和IV期。

已知的是，癌症可以引起细胞形态的异常。这些异常通常可再现地发生在某些癌症中，这意味着在癌症的诊断或预后中可以检查形态的这些变化(又称为组织学检查)。用于使样品可视化以检查细胞形态以及制备用于可视化的样品的技术是本领域众所周知的；例如，光学显微镜或共聚焦显微镜。

所谓“组织学检查”，包括：存在小型成熟淋巴细胞，和/或存在具有狭窄细胞质边界的小型成熟淋巴细胞，存在具有缺乏可辨别的核仁的致密核的小型成熟淋巴细胞，和/或存在具有狭窄细胞质边界并且具有缺乏可辨别的核仁的致密核的小型成熟淋巴细胞，和/或存在非典型细胞和/或裂解细胞和/或幼淋巴细胞。

众所周知，癌症是细胞DNA突变的结果，所述突变可能导致细胞避免细胞死亡或不可控制地增殖。因此，检查这些突变(也称为细胞遗传学检查)可能是用于评估癌症诊断和/或预后的有用工具。这一点的实例是染色体位置13q14.1缺失，这是慢性淋巴细胞性白血病的特征。用于检查细胞中突变的技术是本领域熟知的；例如，原位荧光杂交技术(FISH)。

所谓“细胞遗传学检查”，包括检查细胞以及具体地染色体中的DNA。细胞遗传学检查可以用于鉴定DNA的变化，这些变化可能与难治性癌症和/或复发性癌症的存在相关联。此类变化可以包括：染色体13的长臂中的缺失；和/或染色体位置13q14.1的缺失；和/或染色体12的三体性；和/或染色体12的长臂中的缺失；和/或染色体11的长臂中的缺失；和/或11q的缺失；和/或染色体6的长臂中的缺失；和/或6q的缺失；和/或染色体17的短臂中的缺失；和/或17p缺失；和/或t(11:14)易位；和/或(q13:q32)易位；和/或抗原基因受体重排；和/或BCL2重排；和/或BCL6重排；和/或t(14:18)易位；和/或t(11:14)易位；和/或(q13:q32)易位；和/或(3:v)易位；和/或(8:14)易位；和/或(8:v)易位；和/或t(11:14)和(q13:q32)易位。

已知的是，患有癌症的受试者表现出某些身体症状，这通常是由于癌症对身体的负担所致。这些症状通常在同一癌症中再次发生，因此可以作为该疾病的诊断和/或预后和/或进展的特征。医学领域的技术人员将理解哪些身体症状与哪些癌症相关联，以及如何评估这些身体系统可以怎样与该疾病的诊断和/或预后和/或进展相关。所谓“身体症状”，包括肝肿大和/或脾肿大。

患有“冷”肿瘤的患者不太可能对传统的免疫检查点阻断疗法(例如，施用抗CTLA-4抗体或抗PD-1抗体)作出应答。因此，在一些实施方案中，具有冷肿瘤的患者对免疫检查点阻断疗法有耐药性。

根据这些观察结果，对ICB的抗性构成了未得到满足的重大医疗需求，而可以帮助克服抗性的药物具有巨大的治疗前景。因此，本发明的优点是，能够表达与CTLA-4特异性结合的第一抗体的溶瘤病毒与对PD-1和/或PD-L1具有特异性的抗体组合产生了能够克服所述抗性的协同效应，并且靶向以前无法使用免疫检查点抑制剂治疗的冷肿瘤。

本发明还涵盖药物组合物，其包含能够表达与CTLA-4特异性结合的第一抗体分子的溶瘤病毒和与PD-1和/或PD-L1特异性结合的第二抗体分子的组合，以及与之组合的药学上可接受的载剂和/或稀释剂和/或助剂。此类药学上可接受的载剂、稀释剂和助剂在本领域中是已知的。

本文所述的抗体分子、核苷酸序列、质粒、病毒、细胞和/或药物组合物可以适合于肠胃外施用，其包括水性和/或非水性无菌注射溶液剂，该水性和/或非水性无菌注射溶液剂可以含有抗氧化剂和/或缓冲剂和/或抑菌剂，和/或使制剂与预期接受者的血液等渗的溶质；和/或水性和/或非水性无菌悬浮液，该水性和/或非水性无菌悬浮液可以包含悬浮剂和/或增稠剂。本文所述的抗体分子、核苷酸序列、质粒、细胞和/或药物组合物可以存在于单位剂量或多剂量容器(例如，密封的安瓿瓶和小瓶)中，并且可以在冷冻干燥(即，冻干)条件下储存，仅需要在临使用前添加无菌液体载剂(例如，注射用水)。

可以由前述种类的无菌粉末和/或颗粒和/或片剂制备临时的注射溶液剂和悬浮液。

对于人类患者的肠胃外施用而言，以单剂量或分剂量施用的抗PD-1和/或抗PD-L1抗体分子的日剂量水平通常将是1mg/kg患者体重至20mg/kg，或者在一些情况下甚至高达100mg/kg。在一些优选的实施方案中，剂量为10mg/kg。在特殊情况下，例如在结合长期施用的情况下，可以使用较低剂量。在任何情况下，医生都将确定最适合于任何个体患者的实际剂量，并且该实际剂量将随着特定患者的年龄、体重和应答而变化。上述剂量是一般情况的示例。当然，也可能存在个别情况，其中更高或更低的剂量范围是理所应当的，而且此剂量范围处于本发明的范围内。

通常，本文所述包含抗体分子的药物组合物(或药物)将含有浓度介于约2mg/ml与150mg/ml之间或介于约2mg/ml与200mg/ml之间的抗PD-1和/或抗PD-L1抗体分子。在一些实施方案中，药物组合物将含有浓度为10mg/ml或25mg/ml的抗PD-1抗体分子和/或抗PD-L1抗体分子。

在一些实施方案中，当抗PD-1抗体是派姆单抗时，该抗体以约25mg/ml的剂量使用。在另一些实施方案中，派姆单抗以每3周200mg(iv)的剂量或每6周400mg(iv)的剂量使用。

在一些实施方案中，当抗PD-1抗体是纳武单抗时，该抗体以约10mg/ml的剂量使用。在一些实施方案中，纳武单抗以每2周240mg(iv)的剂量或每4周480mg(iv)的剂量使用。在一些实施方案中，纳武单抗可以与抗CTLA-4抗体伊匹木单抗结合使用，在这种情况下，纳武单抗以每3周1mg/kg的剂量最多使用4剂，或者以每2周或每3周3mg/kg的剂量使用。

在一些实施方案中，当抗PD-L1抗体是阿特珠单抗时，该抗体以约60mg/ml的剂量使用。在另一些实施方案中，阿特珠单抗以每2周840mg(iv)的剂量或每3周1200mg(iv)的剂量或每4周1680mg(iv)的剂量使用。

技术人员应当理解，本文所述的任何抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体均能够以其处方信息中所述的任何剂量或给药方案使用。

通常，药物组合物(或药物)将含有浓度介于约10³至10¹²vp(病毒颗粒)、iu(感染单位)或pfu(噬菌斑形成单位)之间的本文所述溶瘤病毒，具体浓度取决于病毒和定量技术。样品中存在的pfu的量可以通过计数感染允许细胞(例如CEF或Vero细胞)以获得噬菌斑形成单位(pfu)滴度后的噬菌斑数量来确定，vp的量可以通过测量260nm吸光度来确定，并且iu的量可以通过定量免疫荧光(例如使用抗病毒抗体)来确定。作为一般指导，适用于包含溶瘤痘病毒的药物组合物的单独剂量在以下范围内：约10³pfu至约10¹⁰pfu，有利地为约10³pfu至约10⁹pfu，优选地为约10⁴pfu至约10⁷pfu；并且更优选地为约10⁶pfu至约10⁷pfu。

在一些实施方案中，当受试者是小鼠时，溶瘤病毒的最佳剂量为约10⁶pfu至10⁷pfu。在一些实施方案中，当受试者是人时，溶瘤病毒的最佳剂量为约10⁶pfu至10⁹pfu。

通常，在人类中，口服或肠胃外施用本文所述的抗体分子、核苷酸序列、质粒、病毒、细胞和/或药物组合物是最方便的优选途径。对于兽医用途，本文所述的抗体分子、核苷酸序列、质粒、病毒、细胞和/或药物组合物根据正常兽医实践，以适当可接受的制剂施用，并且兽医将确定最适合于特定动物的给药方案和施用途径。因此，本发明提供了包含一定量的对于治疗各种病况(如上文和下文进一步描述的)有效的本发明的抗体分子、核苷酸序列、质粒、病毒和/或细胞的药物制剂。

优选地，本文所述的抗体分子、核苷酸序列、质粒、病毒、细胞和/或药物组合物适于通过选自包括以下项的组的途径来递送：静脉内、瘤内、肌内、皮下。施用可以是单次注射或几次重复注射的形式(例如，在相同或不同的施用部位处，以相同或不同的剂量，用相同或不同的途径)。出于说明的目的，包括约10⁴、5×10⁴、10⁵、5×10⁵、10⁶、5×10⁶、10⁷、5×10⁷、10⁸、5×10⁸、10⁹、5×10⁹或10¹⁰pfu的溶瘤痘病毒(例如，本文所述的TK和RR缺陷性痘苗病毒)的单独剂量特别适合于瘤内施用。

本发明还包括本文所述的抗体分子、核苷酸序列、质粒、病毒、细胞和/或药物组合物，该药物组合物包含本发明的多肽结合部分的药学上可接受的酸或碱加成盐。用于制备可用于本发明的前述碱化合物的药学上可接受的酸加成盐的酸是形成无毒酸加成盐的那些酸，这些无毒酸加成盐即含有药理学上可接受的阴离子的盐，诸如盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硝酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、酸性磷酸盐、乙酸盐、乳酸盐、柠檬酸盐、酸性柠檬酸盐、酒石酸盐、酒石酸氢盐、琥珀酸盐、马来酸盐、富马酸盐、葡萄糖酸盐、蔗糖酸盐、苯甲酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐和双羟萘酸盐[即，1,1'-亚甲基-双-(2-羟基-3萘甲酸酯)]盐，等等。也可以使用药学上可接受的碱加成盐来产生药学上可接受的盐形式的根据本发明的药剂。可以用作试剂以制备在性质上为酸性的本发明药剂的药学上可接受的碱盐的化学碱是与此类化合物形成无毒碱盐的那些。此类无毒碱盐包括但不限于：衍生自此类药学上可接受的阳离子的碱盐，诸如碱金属阳离子(例如，钾和钠)和碱土金属阳离子(例如，钙和镁)的碱盐；铵或水溶性胺加成盐，诸如N-甲基葡糖胺-(葡甲胺)；以及低级链烷醇铵和药学上可接受的有机胺的其他碱盐，等等。本文所述的抗体分子、核苷酸序列、质粒、病毒和/或细胞在使用前，可以冻干以储存并在合适的载剂中重构。可以采用任何合适的冻干方法(例如，喷雾干燥、滤饼干燥)和/或复溶技术。本领域的技术人员应当理解，冻干和复溶可能导致不同程度的抗体活性损失(例如，对于常规免疫球蛋白，IgM抗体往往比IgG抗体具有更大的活性损失)，并且可能必须向上调整使用水平以进行补偿。在一个实施方案中，冻干的(冷冻干燥的)多肽结合部分在重新水合时，其(冻干之前的)活性损失不超过约20％、或不超过约25％、或不超过约30％、或不超过约35％、或不超过约40％、或不超过约45％、或不超过约50％。

在一些实施方案中，将病毒组合物适当地在生理pH或略微碱性的pH处缓冲(例如，从约pH 7至约pH 9，且特别优选的是，pH介于7与8.5之间，更具体地接近8)。在病毒组合物中还包含单价盐以确保适当的渗透压可能是有益的。所述单价盐尤其可以选自NaCl和KCl，优选地，所述单价盐是NaCl，优选地浓度为10至500mM(例如50mM)。合适的病毒组合物包括50g/L的蔗糖、50mM的NaCl、10mM的Tris-HCl和10mM的pH8的谷氨酸钠。还可以配制组合物以便包含用于在低储存温度下保护溶瘤病毒的冷冻保护剂。合适的冷冻保护剂包含但不限于蔗糖(或蔗精)、海藻糖、麦芽糖、乳糖、甘露醇、山梨糖醇和甘油，优选浓度为0.5％至20％(以g计重量/以L计体积，称为w/v)，以及高分子量聚合物，如右旋糖酐或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。

应当理解，如本文所述的包含能够表达第一抗体分子的溶瘤病毒的组合物和包含第二抗体分子的组合物可以作为单一组合物在同一时间(即，同时)施用。

替代性地，这些组合物可以在相似的时间或在不同的时间点(例如，间隔一天或一周)分别施用。例如，溶瘤病毒可以在第二抗体分子之前施用。在其他实例中，第二抗体分子可以在溶瘤病毒之前施用。这种依次施用可以通过暂时分离溶瘤病毒和第二抗体分子来实现。替代性地，或与第一选项组合，依次施用也可以通过以下方式来实现：在空间上分离溶瘤病毒和第二抗体分子；以某种方式(诸如瘤内)施用能够表达抗CTLA-4抗体的溶瘤病毒，使得其在第二抗体分子之前到达癌症，然后以某种方式(诸如全身性)施用该第二抗体分子，以便其在溶瘤病毒之后到达癌症。

如上所述，本发明的溶瘤病毒和第二抗体分子可以根据每种组分的已建立治疗方案来施用。这意味着每种组分的施用可以在同一时间进行，或者在相对于彼此不同的时间进行。

在一些实施方案中，可以重复施用如本文所述的能够表达第一抗体分子的溶瘤病毒，以及第二抗体分子。例如，施用可以重复两次、三次、四次、五次，或达到治疗效果所必需的多次。

现在将参考以下附图和实施例来描述体现本发明的某些方面的优选的非限制性实例：

附图说明

图1：新型Treg耗竭αCTLA-4mAb的生物化学和功能表征。(A)携带CT26肿瘤的BALB/c小鼠中的抗体介导的生存期和(B)TIL调节。已建立肿瘤的动物接受四次注射(10mg/kg)，注射物为具有所指示Treg相关特异性的抗体或对照mIgG2a抗体(n＝5-15)。(C)CTLA-4特异性mAb诱导体外活化的CD4⁺ T细胞的ADCC。通过FACS鉴定裂解的目标T细胞。附图示出平均值±SD(n＝4-8)，学生t检验的**p<0.01。(D)抗CTLA-4(IgG1)mAb介导huPBMC小鼠体内的Treg耗竭。克隆4-E03示出与伊匹木单抗相比，人Treg细胞的耗竭增强(上图)，而CD8⁺ T细胞的耗竭未增强(下图)。每个点代表一只小鼠。坐标图示出来自2次实验的平均数据。利用单因素ANOVA，*p<0.05。(E)通过ELISA测量4-E03 hIgG1和伊匹木单抗与人、小鼠和食蟹猴CTLA-4和CD28的结合。(F)用rhCTLA-4-Fc蛋白预阻断4-E03 IgG1与体外活化的表达CTLA-4的人T细胞的结合(黑线)(G)通过ELISA测量4-E03和2-C06阻断CD80和CD86与CTLA-4结合。(H)体外的功能性配体阻断。坐标图示出用αCTLA-4处理体外活化的人PBMC后上清液中的IL-2。示出了代表性供体(n＝6)。(I)通过流式细胞术测量小鼠αCTLA-4mAb与mCTLA-4转染的细胞的剂量依赖性结合。(J)通过ELISA测量抗CTLA-4mAb阻断B7配体(CD80和CD86)与重组CTLA-4的结合。在携带CT26肿瘤的BALB/c小鼠中，(K)Treg耗竭活性和CD8⁺ T细胞/Treg比率(n＝4至8)和(L)由α小鼠CTLA-4抗体诱导的生存期。

图2：表达Treg耗竭αCTLA-4和GM-CSF的溶瘤痘苗病毒的生成和表征。(A)用于编码αCTLA4抗体和GM-CSF的重链(在J2R基因座处)和轻链(在I4L基因座处)的痘苗病毒载体的示意图。(B)LoVo细胞中的复制动力学，以及(C)VV_GM-αhCTLA4(BT-001)对MIA PaCa-2细胞的溶瘤活性。添加TG6002(重组的J2R和I4L缺失痘苗病毒)作为对照。(D)从MIA PaCa-2 BT-001感染的细胞培养物中纯化的4-E03经考马斯亮蓝染色后的电泳图谱。泳道2和5：重组4-E03；泳道1和4：从MIA PaCa-2 BT-001感染细胞的培养基中纯化的4-E03。泳道1和2：非还原条件；泳道3和4：还原条件。(E)指示的人肿瘤细胞在由VV_GM-αhCTLA4(BT-001)感染后48小时的4-E03和人GM-CSF的表达水平。(F)通过TF-1增殖测定法确定的E)中所产生的GM-CSF的生物活性。包括重组人GM-CSF(从欧洲药典参考标准获得的莫拉司亭)作为阳性对照。(G和H)由BT-001感染的MIA PaCa-2细胞产生的4-E03的功能评估(G)体外：如图1E所示，通过与固定化重组hCTLA蛋白结合，以及(H)体内：如图1D所示，(Treg耗竭)。

图3：瘤内VV_GM-αCTLA4具有与肿瘤限制性CTLA-4受体饱和与Treg耗竭相关联的体内抗肿瘤活性。(A)用VV_GM-αCTLA4(7.5×10⁶pfu、7.5×10⁵pfu，或7.5×10⁴pfu)、VV-αCTLA4(7.5×10⁶pfu)或空白对照VV(7.5×10⁶pfu)处理携带CT26肿瘤的小鼠(n＝20只小鼠/组)。(B)在三次(第0天、第2天和第4天)以10⁷pfu i.t.注射VV_GM-αCTLA4或单次i.p.注射3mg/kgαCTLA-4mAb 5-B07(n＝3只小鼠/时间点)之后，携带CT26肿瘤的小鼠的肿瘤和血清中αCTLA-4的药代动力学。灰色区域表示CTLA-4受体饱和的EC₁₀至EC₉₀范围(参见图1J)。(C)在注射VV_GM-αCTLA4后第10天，通过FACS分析肿瘤和脾脏中FoxP3⁺细胞的数目。坐标图示出来自3个独立实验(n＝13只小鼠/组)的合并数据。

图4：瘤内VV_GM-αCTLA4在涵盖发炎肿瘤和冷肿瘤微环境的同基因肿瘤模型中具有广泛的抗肿瘤活性。(A)携带CT26、A20或EMT6肿瘤的BALB/c小鼠，或者携带MC38或B16肿瘤的C57BL/6小鼠接受三次VV_GM-αCTLA4或缺乏抗CTLA-4mAb的对照病毒(VV空白或VV_GM)的i.t.注射。当肿瘤体积为约50至100mm³时，或者在肿瘤细胞注射后4天，开始治疗(仅限B16)。坐标图示出各个小鼠的肿瘤生长和对应的生存期(n＝10)。(B)将CT26肿瘤细胞植入BALB/c小鼠的右胁腹和左胁腹中。当肿瘤体积达到约100mm³时，开始在右胁腹肿瘤中用VV_GM-αCTLA4进行i.t.注射(垂直虚线，与A中相同)(n＝9至10)。

图5：瘤内VV_GM-αCTLA4引发稳健的全身性CD8⁺ T细胞依赖性抗肿瘤免疫。(A)在用CT26肿瘤细胞皮下(s.c.)攻击前后，用CD8耗竭抗体(短虚线)或CD4耗竭抗体(长虚线)处理BALB/c小鼠。当肿瘤达到约20至50mm³的体积时，开始如图4A中所示的治疗。一个代表性实验(2个中的一个)由每组10只小鼠示出。(B-D)将携带CT26肿瘤的小鼠用VV i.t.处理，或者用αCTLA-4mAb(克隆5-B07，以3mg/kg)i.p.处理。用VV或CT26(AH-1)特异性肽离体再刺激肿瘤细胞悬浮液和脾细胞，然后通过FACS量化IFN-γ⁺和TNF-α⁺CD8⁺ T细胞或MHC I类标记的多聚体阳性CD8⁺ T细胞的百分比。(B)示出了以下脾细胞的流式细胞术点图：AH-1肽阳性脾细胞(上图)，或细胞因子阳性脾细胞(下图)。指定器官中以下T细胞的定量：(C)抗原特异性T细胞和(D)IFN-γ⁺/TNF-α⁺CD8⁺ T细胞。每个点代表一只小鼠。(n＝3至6个实验)利用单因素ANOVA，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.005，****p<0.001。

图6：瘤内诱导的CD8⁺ T细胞抗肿瘤免疫具有FcγR依赖性和cDC1依赖性。(A)如图4A所示，携带CT26肿瘤的WT和Fcer1g^-/-BALB/c小鼠接受i.t.注射VV_GM-αCTLA4或PBS。坐标图示出肿瘤体积(左图和中图)与小鼠生存期(右图)。垂直线指示处理结束。(n＝10只小鼠/组)(B)在用VV_GM-αCTLA4对比VV空白处理的CT26肿瘤中，富含一组352个差异表达基因(上调或下调)的GO项。示出了具有最低的经调节p值的20个富集项。(C)图6b中与5个最丰富的GO项相关联的差异表达基因的网络视图。发现只有上调的基因才与这5个富集的GO项相关联。(D)如图4A和图6A所示，携带MC38肿瘤的WT和Batf3^-/-BALB/c小鼠接受i.t.注射VV_GM-αCTLA4或PBS。坐标图示出肿瘤体积(左图和中图)与小鼠生存期(右图)。垂直线指示处理结束。(n＝8至10只小鼠/组)。

图7：瘤内VV_GM-αCTLA4扩增外周效应CD8⁺ T细胞并减少Treg和耗竭的CD8⁺ T细胞。携带CT26“双生”肿瘤的BALB/c小鼠用VV_GM-αCTLA4或PBS进行i.t.处理(仅右胁腹肿瘤)。在处理后第10天收集脾脏、经注射肿瘤和对侧肿瘤，用被设计用于鉴定T细胞群的高维面板染色。(A)i.t.VV_GM-αCTLA4在经注射和未经注射的肿瘤中减少了活化的CD4⁺Treg细胞(FoxP3⁺Klrg1⁺，“T1”)、减少了耗竭的CD8⁺ T细胞(PD1⁺TIM3⁺，“T2”)并扩增了活化的效应CD8⁺ T细胞(Klrg1⁺，“T3”)(上图)，并且在脾脏中扩增了活化的CD8⁺ T细胞(S1，下图)(B)示出了A中所展示数据的量化。一个代表性实验(3个中的一个)由每组5只小鼠示出。(C)流式细胞术图示出了所选择i.t.T细胞簇的特征性标志物。

图8：瘤内VV_GM-αCTLA4与αPD-1协同排斥“冷”ICB耐药性肿瘤。(A和B)携带两个B16肿瘤的C57BL/6小鼠，包括一个大肿瘤(5×10⁵个细胞，经处理肿瘤)和一个小肿瘤(1×10⁵个细胞，对侧)，接受三次以下注射：i.t.注射VV_GM-αCTLA4(垂直虚线)，以及i.p.注射αPD-1(29F.1A12，10mg/kg；每周两次，持续三周，灰色区域)。(A)生存期(n＝10-20)，对数秩检验的*p<0.05。(B)瘤内注射肿瘤和对侧肿瘤的肿瘤生长曲线。(C)当肿瘤体积达到约135mm³时，用以下物质以不同的方式处理携带A20肿瘤的BALB/c小鼠三次：用VV_GM-αCTLA4 i.t.处理(以1×10⁵pfu的次优剂量)，用αPD-1i.p.处理(RMP1-14，全剂量10mg/kg)，或这两者的组合。坐标图示出动物生存期(n＝10)。

图9：CTLA4特异性mAb的表征。(A)将新鲜切除的卵巢肿瘤、腹水和血液的样品与健康PBMC进行比较。通过流式细胞术评估CD4⁺CD25⁺CD127^-Treg细胞、CD4⁺非Treg细胞和CD8⁺效应T细胞上的CTLA-4表达，并且与PBMC转移后两周从NOG脾脏分离的人T细胞上的表达进行比较。数据表示个体患者/供体，其中对于健康PBMC，n＝11，对于腹水，n＝20，对于肿瘤，n＝9，并且对于患者血液，n＝5。(B)将人PBMC i.v.注射到NOG小鼠中。移植后2至3周，解剖出脾脏，将细胞悬浮液i.p.注射到SCID受体中，随后用10mg/kg 4-E03 hIgG1、4-E03 hIgG1N297Q或同种型对照处理。通过i.p.灌洗收集细胞，在处理后24h定量。％细胞耗竭相对于同种型对照标准化。每个点代表一只小鼠。(C)通过Biacore分析评价4-E03和伊匹木单抗与可溶性人CTLA-4的结合动力学。通过固定化抗人Fc将mAb捕获在芯片上，然后在每个循环中注射不同浓度的CTLA-4蛋白。4-E03和伊匹木单抗的K_D值分别为0.6nM和2.7nM。(D)通过流式细胞术测量抗CTLA-4mAb与内源性表达CTLA-4的人T细胞的剂量依赖性结合。(E)通过ELISA针对小鼠CTLA-4和CD28测试滴定剂量的小鼠替代抗体5-B07 mIgG2a(从10μg/ml开始，采用3倍稀释步骤)的结合。(F)将1×10⁶个CT26细胞s.c.注射到BALB/c小鼠(n＝7)中。当肿瘤达到约100mm³的大小时，小鼠在第0天、第4天和第7天接受200μg(10mg/kg)5-B07 mIgG2a、5-B07 mIgG1 N297A或同种型对照抗体。第8天，取出肿瘤，通过FACS分析TIL。显示的数据是每组n＝7只小鼠的一个代表性实验的平均值(+SD)。

图10：病毒和转基因在肿瘤和血液中的药代动力学。(A和B)图3B中描述的肿瘤样品也用于测量以下项：(A)鼠GM-CSF的瘤内浓度，(B)病毒载量，以及(C至E)LoVo异种移植肿瘤中的药代动力学。将LoVo细胞植入瑞士裸鼠的右胁腹中。当肿瘤体积达到约120mm³(定义为D0)时，通过单次i.t.注射10⁵pfu的VV_GM-hCTLA4(BT-001)或VV，或者i.p.注射3mg/kg的4-E03单克隆抗体来处理小鼠。在每个指定时间点处收集三只小鼠的血液和肿瘤。(C)4-E03、(D)GM-CSF和(E)病毒的浓度通过对Vero细胞分别进行ELISA和滴定来确定。这些线连接每个时间点值的中位数。

图11：用i.t.VV_GM-αCTLA4处理在经处理和未经处理的肿瘤中诱导持久的抗肿瘤应答。(A)将CT26肿瘤细胞植入BALB/c小鼠的右胁腹和左胁腹中。当肿瘤体积达到约100mm³时，开始用VV_GM-αCTLA4在右胁腹肿瘤中进行I.t.注射(3次，间隔两天)。处理后一天评估经处理的对侧肿瘤中的病毒浓度。(n＝3只小鼠/组；小鼠1-3(M1-3)；N.D.＝未检出)B-C)用指定剂量的VV_GM-αCTLA4处理携带CT26肿瘤的小鼠，如A)中所述。替代性地，i.v.给予10⁷或10⁵pfu的VV_GM-αCTLA4。示出了单独的肿瘤生长曲线(B)和生存期曲线(C)。(D)受再次攻击的肿瘤生长受到抑制。将CT26肿瘤细胞皮下注射植入BALB/c小鼠中。用VV_GM-αCTLA4或空白对照VV进行i.t.处理如A)中所述安排。如图4B的图注所指出的那样，在最后一次注射VV后100天，用CT26或Renca细胞s.c.再次攻击存活小鼠。

图12：瘤内诱导的CD8 T细胞免疫是FcγR依赖性的。用1×10⁶个CT26细胞皮下注射攻击WT小鼠和Fcer1g-/-BALB/c小鼠。当肿瘤达到约100mm³时，小鼠在第0天、第2天和第5天接受三次i.t.注射，注射物为VV_GM-αCTLA4或PBS对照(最终剂量为10⁷pfu)。第8天，分离肿瘤和脾，通过FACS分析FoxP3⁺CD4⁺细胞。

图13：用i.t.VV_GM-αCTLA4进行处理依赖于CD8⁺ T细胞。(A)在用1×10⁶个CT26细胞s.c.攻击小鼠前3天，用1mg CD8或CD4耗竭抗体(或对应的同种型对照抗体)处理各自包括10只BALB/c小鼠的多个组，或者不处理。又过了4天(相对于开始处理日的第3天)，i.p.施用200μg耗竭抗体。然后在第0天、第2天和第4天用VV_GM-αCTLA4以1×10⁷pfu对小鼠进行i.t.处理。示出了到人道终点的生存百分比。数据代表两个独立实验。(B)将携带CT26肿瘤的小鼠用VV i.t.处理，或者用抗CTLA-4mAb(克隆5-B07，以3mg/kg)i.p.处理。用VV或CT26(AH-1)特异性肽离体再刺激肿瘤细胞悬浮液，培养4h，然后通过流式细胞术量化IFN-γ⁺和TNF-α⁺CD8⁺ T细胞的数量。每个点代表一只小鼠。代表性实验(n＝3至6)利用单因素ANOVA，**p<0.01，***p<0.005，****p<0.001。(C)和(D)热图显示通过无监督聚类鉴定的(C)12个瘤内和(D)10个脾脏CD3+亚群的中值标志物表达。

图14：B16肿瘤使用抗CTLA-4加抗PD-1的全身治疗效果不佳。在第4天、第7天、第11天用抗PD-1以10mg/kg或用抗PD-1和抗CTLA-4的组合(10mg/kg)i.p.处理携带B16肿瘤的C57BL/6小鼠(A)数据表示为细胞接种后如所指示的天数时的肿瘤体积(mm³)；每条线代表单只小鼠。(B)下图示出在指定处理后至携带B16肿瘤的小鼠的人道终点的生存百分比。(C)携带B16肿瘤的C57BL/6小鼠接受三次注射，i.t.注射VV_GM-αCTLA4，和/或i.p.注射抗PD-1，如图8中所述。最后一次治疗后六天，收集肿瘤，通过流式细胞术分析肿瘤浸润T细胞的数量。每个点代表一只小鼠。(n＝3个实验)。。利用单因素ANOVA，*p<0.05。显示高度T细胞发炎CT26肿瘤微环境中的T细胞浸润水平作为参考(在细胞接种后约第20天，在CT26肿瘤中测定)。

具体实施方式

实施例

材料和方法

细胞系

人胚肾细胞系293T、鼠黑素瘤B16-F10、鼠结肠癌CT26、鼠B细胞淋巴瘤A20、鼠乳腺EMT6和鼠Lewis肺癌细胞系(LL/2)购自美国典型培养物保藏中心(ATCC)，用来自Crown Bio的人CTLA-4(293T-CTLA4)对细胞进行稳定转染。在补充有10％ FCS、10mM HEPES和1mM丙酮酸钠的RPMI+GlutaMax(CT26)或DMEM+GlutaMax(MC38，B16-F10)中培养细胞。将EMT6细胞维持在补充有15％ FCS、10mM HEPES和1mM丙酮酸钠的Waymouth培养基中。将表达hFcγRIIIA-158V连同GFP的NK-92细胞系(购自ATCC)培养在补给性α-MEM培养基中(Binyamin等人，2008)。在R10培养基(含有2mM谷氨酰胺、1mM丙酮酸盐、100IU/ml青霉素和链霉素以及10％ FBS的RPMI 1640；购自Life Technologies的GIBCO)中培养原代细胞。使人结直肠腺癌细胞系LoVo(ATCC)、胰腺肿瘤细胞系MIA PaCa-2(ATCC)和人胃癌细胞系Hs-746 T(ATCC)在补充有10％ FBS并含有40mg/L庆大霉素的DMEM(Gibco)中生长。使人卵巢肿瘤细胞系SK-OV-3(ATCC)和人结直肠癌细胞系HCT 116(ATCC)在补充有10％ FBS并含有40mg/L庆大霉素的McCoy 5A培养基(ATCC)中生长。使人成红血细胞细胞系TF-1(ATCC)在补充有10％ FBS并含有40mg/L庆大霉素+2ng/mL GM-CSF的RPMI 1640(Sigma)中生长。

小鼠

将小鼠饲养在局部无病原体的设施中。对于所有实验，将年轻成年小鼠进行性别和年龄匹配，并随机分配到实验组中。所有程序均经当地实验动物伦理委员会()批准；在BioInvent以许可证号17196/2018或2934/2020，或在Transgene以APAFIS Nr21622项目2019072414343465，并且根据当地伦理准则进行。从Taconic、Janvier或Charles River获得C57BL/6和BALB/c小鼠。所使用的基因改变病毒株是：购自Taconic的C.129P2(B6)-Fcer1gtm1Rav(Fcer1g-KO，以BALB/c为背景，并且以BALB/cAnNTac WT为对照)；以及购自Jackson Laboratories的B6.129S(C)-Batf3tm1Kmm/J(Hildner等人，2008)；Batf3-KO，以C57BL/6J为背景，并且以C57BL/6J WT为对照)。

人体(临床)样品和伦理

由大学医院的伦理委员会获得伦理批准。根据赫尔辛基宣言提供知情同意书。通过瑞典隆德市大学医院的妇产科与肿瘤科获得患者样品。将腹水作为已分离的单细胞悬浮液评估。

人体组织加工

将从接受手术的患者获得的卵巢肿瘤样品切成小块，与DNase I(Sigma)和Liberase TM(Roche Diagnostics)一起置于R10中，在37℃处孵育20分钟。机械解离剩余组织，连同细胞悬浮液一起通过70μm细胞过滤网。获得匹配的外周血样品，使用Ficoll-PaquePLUS(Cytiva)通过在Leucosep管(Greiner)中以800x g离心20分钟来分离外周血单核细胞。从哈尔姆斯塔德医院(瑞典)的血液中心获得人血沉棕黄层，根据标准方案进行处理。

抗体依赖性细胞毒性

使用经稳定转染以表达CD16-158V等位基因与GFP的NK-92细胞系执行进行ADCC测定。使用CD4⁺ T细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec)从健康供体的外周血中分离出靶标CD4⁺T细胞。在37℃处，用CD3/CD28Dynabead磁珠(Life Technologies,Thermo Fisher)和50ng/ml重组hIL-2(R&D Systems)持续72小时刺激细胞，以上调CTLA-4。将靶细胞与10μg/ml mAb一起在4℃处预孵育30min，之后与NK细胞混合。将细胞以2:1的效应物:靶细胞比例孵育4小时。通过流式细胞术测定裂解。简言之，在孵育结束时，将细胞悬浮液用VioGreen偶联的抗CD4(M-T466，Miltenyi Biotec)连同可固定活性染料eFluor780(eBioscience)一起在黑暗中于4℃处染色30min，然后通过FACS对细胞进行分析。

体外功能性阻断

对于SEB PBMC测定，将来自健康供体的全部PBMC接种在96孔板(1×10⁵个细胞/孔)中，在滴定剂量的抗CTLA-4IgG(在20μg/ml至0.625μg/ml范围内)存在下用1μg/ml葡萄球菌肠毒素B(SEB，Sigma Aldrich)刺激。3天后，收获上清液，根据制造商的说明通过MSD(Meso Scale Discovery,Rockville,USA)量化IL-2。

体外结合测定

将表达CTLA-4的转染细胞在4℃处与所指示浓度的抗CTLA-4mAb一起孵育20min，之后洗涤，再用APC标记的山羊抗人二抗(Jackson ImmunoResearch)染色。没有观察到与用空白载体(未示出)转染的细胞结合。

在分离的体外活化CD4⁺ T细胞上分析IgG与原代细胞的结合。简言之，使用MACSCD4 T细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec)，通过阴性选择来从总PBMC中纯化人外周CD4⁺ T细胞。在R10培养基中用CD3/CD28Dynabead磁珠(Life Technologies)加50ng/ml重组hIL-2(R&D Systems)体外活化CD4+ T细胞3天，以上调CTLA-4表达。将体外活化的人CD4⁺T细胞与所指示浓度的抗CTLA-4mAb连同抗CD4一起孵育。用APC标记的山羊抗人IgG检测结合的抗CTLA-4mAb。在竞争性结合测定中，将2μg/ml Alexa 647标记的抗CTLA-4mAb与重组人或食蟹猴CTLA-4-Fc蛋白(50μg/ml；R&D Systems)混合，之后与表达CTLA-4的细胞一起孵育。通过FACS检测结合的IgG。

VV生成和纯化

使用在J2R和I4L基因座处编码GFP或mCherry的起始亲本哥本哈根痘苗病毒和两个转移质粒，在鸡胚成纤维细胞(CEF)中通过两次连续同源重组来生成重组病毒。转移质粒编码在p7.5启动子下方并侧接J2R重组臂的mAb重链，或者在p7.5启动子下方的mAb轻链，除此之外，还编码在pSE/L启动子下方并侧接I4L重组臂的鼠或人GM-CSF，或者不编码该鼠或人GM-CSF(参见图2A)。通过扩增/分离非荧光噬菌斑的几个循环来分离重组病毒。然后在CEF上产生重组病毒，在细胞裂解后通过5μm过滤纯化，之后使用0.2μm切向流过滤来纯化/浓缩。最后，通过渗滤将病毒配制在蔗糖50g/L、NaCl 50mM、Tris 10mM、谷氨酸钠10mM(pH8)中，等分后储存在-80℃处，直到使用。

所有用于该公开的病毒均来自TK-RR-哥本哈根株：

VV：未武装的痘苗病毒或TG6002(编码FCU1嵌合酶的痘苗病毒，基准重组VV)

VV_GM：编码鼠GM-CSF的痘苗病毒

VV_GM-αCTLA4：编码鼠GM-CSF和5-B07(抗小鼠CTLA-4，小鼠IgG2a)的痘苗病毒

VV-αCTLA4：编码5-B07的痘苗病毒

VV_GM-αhCTLA4(BT-001)：编码人GM-CSF和4-E03(抗人CTLA-4，人IgG1)的痘苗病毒。

体外病毒复制、溶瘤活性和转基因表达

通过测量用BT-001以感染复数(MOI)10^-3(即，1个病毒感染1000个细胞)感染LoVo细胞后24小时、48小时和72小时处的总病毒滴度来评估BT-001的复制。病毒滴度通过在Vero细胞上的噬斑测定来确定。

在MIA PaCa-2细胞与BT-001以图注所指示的MOI孵育5天后，通过使用细胞计数器(Vi-Cell)量化细胞活力来评估BT-001的溶瘤活性。BT-001的复制和溶瘤活性均以目前正在临床评价阶段的哥本哈根TK-RR-痘苗病毒TG6002的复制和溶瘤活性为基准(Foloppe等人，2019)。

在用BT-001以MOI 0.05感染以下几种人肿瘤细胞系之后评估转基因表达：LoVo、HCT 116(结肠癌)、MIA PaCa-2(胰腺癌)、SK-OV3(卵巢癌)和Hs176T(胃癌)。感染后48小时收集培养物上清液，离心，在0.2μm滤膜上过滤，然后通过ELISA测量4-E03和hGM-CSF的浓度。

抗体纯化

将每烧瓶装有约4.7×10⁷个MIA PaCa-2细胞的15个F175烧瓶用不含牛血清的DMEM中的BT-001以MOI 0.01感染。感染后72小时，收获细胞上清液，合并，离心，在0.2μm滤膜上过滤，然后添加EDTA(最终浓度2mM)和Tris pH 7.5(最终浓度20mM)。在4℃处，将合并的上清液装载到预先在PBS中平衡的1mL protA Hitrap柱(GE healthcare，参考号17-5079-01)上。用100mM甘氨酸HCl(pH 2.8)洗脱结合的抗体，用PBS透析。在还原或非还原条件下将经纯化的4-E03装载到SDS-PAGE(NuPage Bis-Tris凝胶4％至12％，Thermo NP0323)上，该凝胶用InstantBlue(Expedeon，ISB1L)考马斯亮蓝染色。进一步评估该经纯化的抗体(即，4-E03 MIA PaCa-2)的CTLA-4结合以及体内Treg耗竭活性。

酶联免疫吸附测定

GMCSF。使用ELISA GM-CSF免疫测定法(R&D Systems)确定人和鼠GM-CSF浓度。

使用TF-1增殖测定法评估人GM-CSF功能性。在已知浓度的hGM-CSF(标准品或来自BT-001感染的细胞)存在下，通过比色法，使用活细胞脱氢酶将MTS酶促转化为甲臜，来测量TF-1细胞的细胞增殖(通过490nm处的吸光度测量)。将490nm处的吸光度相对GM-CSF浓度作图，将曲线与用重组GM-CSF(即，莫拉司亭)获得的曲线进行比较。

与CTLA4/CD28蛋白结合。对于抗体结合ELISA，将经纯化的人CTLA4-Fc、人CD28-Fc(R&D Systems)和小鼠CTLA4-Fc(Sino Biologicals)以1pmol/孔包被到测定板上，同时以5pmol/孔包被小鼠CD28-His(R&D Systems)。以10μg/ml添加不同的抗体，使其在室温处结合1小时。使用抗小鼠/抗人H+L-HRP(Jackson Immunoresearch)或抗小鼠/人λ轻链抗体HRP(Bethyl)检测结合的mIgG2A或hIgG1抗体。使用显色底物(TMB T0440)或发光底物(Pierce 37070)，用Tecan Ultra进行平板读数。

阻断CD80/CD86相互作用。对于配体阻断ELISA，将经纯化的人CTLA4-Fc(R&DSystems)以2pmol/孔(对于CD80)或1pmol/孔(对于CD86)包被到测定板上。以0.4pM至67nM范围内的浓度添加抗体，使其结合1小时。分别以200nM和100nM添加带His标签的配体(rhCD80和rhCD86；R&D Systems)，该浓度是在试验性实验中通过ELISA来优化的(数据未示出)。将板进一步孵育15分钟。洗涤后，用HRP标记的抗His抗体(安迪系统)检测结合的配体。将Super Signal ELISA Pico(Thermo Scientific)用作底物，使用Tecan Ultra微孔板读取器对板进行分析。替代性地，将小鼠CTLA4-Fc(Sino Biological)以1pmol/孔包被到测定板上。以10μg/ml(67nM)的起始浓度添加抗体，采用2倍稀释步骤，使其结合1小时。以50nM添加带His标签的配体CD80和CD86(Sino Biological)，将板进一步孵育30分钟。如上所述进行检测和读取。

小鼠实验

体内肿瘤实验。将培养的肿瘤细胞皮下注射到仅左胁腹或双侧胁腹中(CT26 1×10⁶个细胞；MC38 5×10⁵个细胞；A20 5×10⁶个细胞；EMT61×10⁶个细胞；B16-F10 0.5至5×10⁵个细胞)。除非另外指明，否则用10⁷pfu的VV_GM-αCTLA4或对照VV i.t.处理小鼠三次，隔天一次。对于肿瘤生长实验，每周用卡尺测量经处理肿瘤和远侧肿瘤的肿瘤大小两次，根据下式计算肿瘤体积(mm³)：(宽度²×长度×0.52)。当总肿瘤负荷(经处理肿瘤和对侧肿瘤结合)达到2000mm³的体积时(实验终点)，对动物实施安乐死。对于功能实验，在图注中所指示的时间点处收集组织并加以处理。在R10中用DNase I(Sigma)和Liberase TM(RocheDiagnostics)在37℃处消化小鼠肿瘤15min。然后使细胞通过70μm细胞过滤网，直接用于测定。对于DC表型分析，在密度梯度离心(Cedarline目录号CL5035)后富集活白细胞。

原代人异种移植模型。通过用200μl PBS中使用Ficoll-Paque PLUS分离的1至2×10⁷个PBMC对NOG小鼠进行静脉内注射(NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Sug/JicTac(Taconic))，生成PBMC-NOG/SCID小鼠。注射后约两周，随后用来自重建NOG小鼠的10×10⁶个脾细胞对SCID小鼠(C.B-Igh-1b/IcrTac-Prkdcscid(Taconic))进行腹膜内注射。1小时后，用10mg/kg mAb处理小鼠。24h之后收集小鼠的腹膜内液。使用以下标志物通过FACS鉴定和量化人T细胞亚群：CD45、CD4、CD8、CD25、CD127(均来自BD Biosciences)。

肿瘤和血液中转基因和病毒的药物动力学。在前述CT26肿瘤模型中，VV_GM-αCTLA4或VV-αCTLA4在与上文所提及相同的条件下施用(即，在第0天、第2天和第4天，3次i.t.注射10⁷pfu)。在第1天、第4天(第三次注射之前)、第8天和第10天，在每个时间点收集三只小鼠的肿瘤和血液。通过对Vero细胞进行病毒滴定，测量全血中以及在PBS中匀浆化的肿瘤中的病毒浓度。通过ELISA测量血清和肿瘤匀浆中的5-B07和mGM-CSF两者的浓度。在异种移植的人肿瘤模型中，将LoVo细胞皮下注射到瑞士裸鼠的左胁腹中。约两周后，当肿瘤体积达到约120mm³时，将小鼠随机分为2组(15只小鼠/组)。第一组用10⁵pfu的VV_GM-αhCTLA4(BT-001)i.t.注射一次，第二组用3mg/kg的4-E03腹腔内注射。在病毒注射后第1、3、6、10和20天，在每个时间点收集三只小鼠的肿瘤和血液/血清。4-E03和hGM-CSF两者的病毒滴度和浓度如前一段中所述进行测量。

抗原特异性T细胞应答

分析脾脏、经处理肿瘤和对侧肿瘤中的抗原特异性T细胞应答。简言之，用2μg/ml肿瘤特异性肽(AH-1，SPSYVYHQF)或病毒特异性肽(S9L8，SPGAAGYDL)(BioNordika)对1×10⁶个分离细胞进行再刺激(Huang等人，1996；Russell和Tscharke，2014)。在布雷菲德菌素A(Sigma)的存在下，将肿瘤细胞脉冲4h。将分离的脾细胞再刺激48小时，最后4小时在布雷菲德菌素A的存在下再刺激。然后通过FACS染色鉴定产生细胞因子的CD8⁺ T细胞的CD45、TCR-β、CD8、TNF-α、IFN-γ和CD25。与此同时，使用MHC I类多聚体(五聚体H-2Ld–SPGAAGYDL-R-PE(S9L8)ProImmune、五聚体H-2Ld–TPHPARIGL-R-PE(对照)ProImmune、Dextramer H-2Ld–SPSYVYHQF-APC(AH-1)Immudex、Dextramer H-2Ld–TPHPARIGL-APC(对照)Immudex)来鉴定肿瘤和病毒特异性CD8⁺ T细胞。

流式细胞术

使用可固定活性染料eFluor^TM780、可固定活性染色剂440UV或碘化丙啶常规地鉴定死细胞，将其连同双联体一起从分析中排除。使用FoxP3染色缓冲液套件(Thermo FisherScientific)进行细胞内染色。在BD FACS Verse或Fortessa II上进行样品采集，使用FlowJo 10.7.2对数据进行分析。为了生成瘤内和脾脏CD3⁺ T细胞的UMAP，使用FlowAI工具(v.2.2)对数据进行清理，然后为样品加上处理组和器官的条形码，再连结起来。使用默认设置(距离函数：欧几里德函数，最近邻：15，最小距离：0.5)并包括所有补偿参数与前向散射(FSC)和侧向散射(SSC)测量结果，在所得的流式细胞术标准(FCS)文件上运行FlowJo插件UMAP(v3.1)。对于集群识别，使用默认设置(最近邻K＝82)并包括以下参数，在所得UMAP上运行FlowJo插件x-shift(v1.3)，这些参数为：CD4、CD62L、CD25、ICOS、FoxP3、Klrg1、CD44、CTLA-4、PD-1、TIM-3、T-bet、GzmB、Ki-67。使用从FlowJo获得的缩放通道值计算前面所提及参数的每簇平均表达。用每簇的参数平均值生成平均表达热图，在0与1之间缩放。

抗体

用于流式细胞术的单克隆抗体：抗人CD4-VioGreen(M-T466)Miltenyi Biotec目录号130-113-259、抗人CD25-BV421(克隆M-A251)BD Biosciences目录号562442、抗人CD127-FITC(克隆HIL-7R-M21)BD Biosciences目录号561697、抗人CD8-APC(克隆RPA-T8)BD Biosciences目录号555369、抗人CTLA-4-PE(克隆BNI3)BD Biosciences目录号555853；小鼠IgG2a，k同种型对照-PE BD Biosciences目录号555574；抗小鼠CD45.2-PerCP-Cy5.5(克隆104)BD Biosciences目录号552950、抗小鼠CD45.2-BUV737(克隆104)BDBiosciences目录号612779、抗小鼠CD25-BV421(克隆7D4)BD Biosciences目录号564571、抗小鼠CD8-BV786(克隆53-6.7)BD Biosciences目录号563332、抗小鼠CD4-BV510(克隆RM4-5)BD Biosciences目录号563106、抗小鼠TCRb-Alexa Fluor488(克隆H57-597)BioLegend目录号109215、抗小鼠PD-1-BB700(克隆RMP1-30)BD Biosciences目录号748242、抗小鼠CTLA-4-PECF594(克隆UC10-4F10-11)BD Biosciences目录号564332、抗小鼠CTLA-4-APC(克隆UC10-4B9)BioLegend目录号106310、抗小鼠Klrg1-APC(克隆2F1)BDBiosciences目录号561620、抗小鼠CD62L-BUV395(克隆MEL-14)BD Biosciences目录号740218、抗小鼠TIM3-PE(克隆5D12)BD Biosciences目录号566346、抗小鼠ICOS-BV605(克隆7E.17G9)BD Biosciences目录号745254、抗小鼠CD44-APC-Cy7(克隆IM7)BDBiosciences目录号560568、抗小鼠Ki67-Alexa Fluor 700(克隆B56)BD Biosciences目录号561277、抗人Granzyme B-R718(克隆GB11)BD Biosciences目录号566964、抗小鼠Tbet-BV711(克隆O4-46)BD Biosciences目录号563320、抗小鼠FoxP3-PeCy7(克隆FJK-16s)Thermo Fisher Scientific目录号17-5773-82、抗小鼠IFNg-PeCy7(克隆XMG1.2)BioLegend目录号505826、抗小鼠TNFa-Alexa Fluor 700(克隆MP6-XT22)BD Biosciences目录号558000、Pentamer H-2Ld–SPGAAGYDL-R-PE(S9L8)ProImmune、Pentamer H-2Ld–TPHPARIGL-R-PE(对照)ProImmune、Dextramer H-2Ld–SPSYVYHQF-APC(AH-1)Immudex、Dextramer H-2Ld–TPHPARIGL-APC(对照)Immudex。

二抗：山羊抗小鼠IgG(H+L)过氧化物酶Jackson ImmunoResearch目录号115-035-003；山羊抗人IgG(H+L)过氧化物酶Jackson ImmunoResearch目录号109-035-003；山羊抗人IgG，Fc片段特异性APC Jackson ImmunoResearch目录号109-136-098；山羊抗人IgG-APCJackson ImmunoResearch目录号109-136-088；山羊抗人κ轻链HRP Bethyl目录号A80-115P；山羊抗小鼠λ轻链HRP Bethyl目录号A90-121P；山羊抗小鼠IgG-APC JacksonImmunoResearch目录号115-136-146；抗His MAb，(克隆AD1.1.10)R&D Systems目录号MAB050；抗His-HRP(克隆AD1.1.10)R&D Systems目录号MAB050H。

用于体内实验的市售抗体：抗小鼠CD8(克隆53.6.72)BioXCell目录号BP0004-1、抗小鼠CD4(克隆GK1.5)BioXCell目录号BE0003-1、抗小鼠PD1(克隆29F.1A12)BioXCell目录号BE0273、抗三硝基苯酚rIgG2a同种型对照(克隆2A3)BioXCell目录号BE0089、抗小鼠CTLA-4(克隆9H10)BioXCell目录号BE0131、抗小鼠PD1(克隆RMP1-14)BioXCell目录号BE0146。

从n-CoDeR噬菌体展示文库中分离出的内部生成的抗小鼠抗体和抗人类抗体。本文描述了抗小鼠CTLA-4(克隆5-B07)和抗人CTLA-4(克隆4-E03)。

RNA测序

实验程序将CT26肿瘤细胞植入每组10只BALB/c小鼠中。在植入后约1周，当肿瘤体积达到20至50mm³时(定义为第0天)，在D0和D2处，不对小鼠进行处理，或者用未武装的痘苗病毒(VV空白)或VV_GM-αCTLA4以50μL中的10⁷pfu i.t.处理小鼠两次。在D4处，收获肿瘤，使用Qiagen RNeasy Plus Mini试剂盒提取RNA。将样品保存在-80℃处，直到随后评估其质量的那天。使用Agilent RNA 6000Nano试剂盒、Agilent 2100生物分析仪系统、2100专家软件来评价经纯化RNA的质量，以确保至少25％的RNA片段长于200nt(DV200>25％)，这是后续的3’mRNA测序所需的。制备链特异性文库，通过IntegraGen(法国)对两个末端进行测序(配对末端测序)，产生多对100nt长读段。

数据分析。配对读段通过定制生物信息学管道来处理。简言之，从读段1中提取独特分子标识符(UMI)序列，而从读段2中提取经捕获RNA片段的3’末端序列。在基于质量的修剪和质量控制之后，利用STAR(Dobin等人，2013)针对包含小家鼠(Mus musculus)全基因组(mm10组装体)加上作为人工额外染色体的VV_GM-αCTLA4基因组的定制基因组，对读段2作图。然后使用来自UMI工具套件(Smith等人，2017)的去重程序，以“唯一”方法对读数进行重复数据消除。最后，使用HTSeq-count对经过重复数据消除的读数进行量化(Anders等人，2015)。然后使用DESeq2(Love等人，2014)对每个样品的readcount数据进行归一化处理，如果两个条件之间的倍数变化大于2，并且调整后的p值小于0.1(Benjamini-Hochberg多次测试校正)，则认为基因差异表达。使用如上文所定义的差异表达(上调或下调)基因集进行基因本体(GO)富集分析，其中函数enrichGO来自R包clusterProfiler(Yu等人，2012)。

分离对肿瘤Treg相关受体具有特异性的Treg耗竭抗体

基本上如前所述，通过对体外CDR改组抗体文库进行肿瘤相关Treg细胞(分离自携带CT26、4T1、B16和Lewis肺肿瘤的小鼠)对比CD4⁺ T细胞耗竭幼稚细胞和来自携带肿瘤小鼠的CD11b⁺细胞的差异性生物淘选，来分离肿瘤Treg细胞相关受体的特异性抗体(Veitonmaki等人，2013)。

生成CTLA-4mAb

从scFv噬菌体展示文库中分离出抗人/小鼠CTLA-4的抗体片段。通过使用装载于链霉亲和素Dynabead磁珠或聚苯乙烯球上的生物素化h/mCTLA-4-His蛋白(Sino Biological)进行三次连续淘选，来实现特异性CTLA-4抗体的富集。第三轮选择还包括悬浮适应的HEK293-EBNA细胞，其用编码h/mCTLA-4的细胞外区域和跨膜区域或不相关的非靶标蛋白的cDNA(Sino Biological)瞬时转染。在每次用生物素化非靶标蛋白进行选择之前进行预选择。在每轮选择后通过胰蛋白酶消化来洗脱结合噬菌体，然后使用标准程序在平板上扩增。将来自第三轮选择的噬菌粒转化为产生scFv的形式并用于后续的筛选测定，其中评估了与可溶性抗原(重组蛋白)和细胞结合抗原(瞬时转染细胞)的特异性结合。商品抗体用于通过流式细胞术、荧光微阵列技术(FMAT)和ELISA评价重组和细胞表面结合的人抗体(Yervoy，Bristol Myers Squibb；抗人APC，Jackson)和抗小鼠CTLA-4(BioLegend)。在所有实验中包括相应的同种型对照作为阴性对照。为了初步筛选scFv，将h/mCTLA-4转染的细胞接种到FMAT平板中。添加大肠杆菌表达的scFv，之后添加去糖基化小鼠抗His抗体(R&DSystems)和抗小鼠APC(Jackson)。使用8200检测系统(AppliedBiosystems)检测染色的细胞。重新表达来自初次筛选的阳性克隆，在ELISA中重新测试其与转染细胞和重组蛋白的结合。对于ELISA，将大肠杆菌表达的scFv添加到包被h/mCTLA-4或非靶标蛋白的板中。使用抗FLAG-AP(Sigma Aldrich)检测结合的scFv，之后添加底物(CDP-star，Life Technologies)，读取发光(Tecan Ultra)。

总共分别有42个和31个独特的克隆转化为hIgG1变体和mIgG2a变体。对VH和VL进行PCR扩增，分别插入含有该抗体的重链恒定区和轻链恒定区的表达载体中，然后转染到悬浮适应的HEK 293EBNA细胞(ATCC)中。转染后6天收获培养基，根据标准程序使用连接至纯化系统的填充有MabSelect的柱(GE Healthcare)将抗体纯化。用低pH缓冲液洗脱抗体，然后在最终无菌过滤之前，使用Spectra/Por透析膜4(Spectrum LaboratoriesInc)透析到适当的配制缓冲液中。

通过CE-SDS(LabChip XII；Perkin Elmer,Massachusetts,USA)和SE-HPLC(Ultimate 3000,Thermo Fisher Scientific)来评估抗体纯度。使用符合《欧洲药典》2.6.14，当前版本：细菌内毒素，“Method D.Chromogenic Kinetic method”的显色LAL-Endochrome-K试剂盒(Charles River)，经测定，所有配制物的内毒素含量都很低(<0.1EU/mg蛋白质)。

然后在ELISA和Biacore两者中评估经纯化的IgG与转染的HEK细胞以及原代细胞的结合，以及与重组蛋白的结合。

表面等离振子共振

还使用Biacore 3000，通过表面等离振子共振(SPR)技术测试了与重组蛋白的结合。将抗人Fc(GE Healthcare)作为捕获抗体以330nM浓度固定在CM5传感器芯片(GEHealthcare)上。在预测试中评估4-E03和伊匹木单抗连同重组蛋白的最佳浓度，以获得良好的曲线拟合并限制质量传递。以10μl/min添加抗体(在该特定实验中为5nM)持续1min，之后以30μl/min滴定人CTLA-4蛋白(Sino Biological)的浓度(4-E03为1.6nM至50nM，伊匹木单抗为1.6nM至200nM)，持续3min。在每个循环之间，用10mM甘氨酸(pH 1.5)使表面再生。

细胞转染

使用Lipofectamine 2000(Life Technologies)将编码人和小鼠CTLA-4的cDNA(Sino Biological)转染到悬浮适应的293FT细胞(Life Technologies)中。将转染的细胞置于FreeStyleTM 293表达培养基(Life Technologies)中，在37℃处和5％ CO2中，以120rpm培养48h。使用流式细胞术分析靶标表达。

数据可用性

该论文中报道的RNAseq数据的指定登录号为GEO：GSE176052。

定量和统计分析

所有统计分析均使用GraphPad Prism 9.0(GraphPad Software Inc,La Jolla,CA)进行。使用学生t检验或单因素ANOVA来计算p值。使用Kaplan-Meier方法绘制到人道终点的生存期，并通过对数秩检验分析显著性。当p<0.05时，接受显著性。

结果

Treg耗竭抗CTLA-4抗体的鉴定和表征

免疫检查点阻断和抗CTLA-4抗体疗法是经临床验证的方法，但抗CTLA-4抗体疗效的基础机制尚未完全表征。CTLA-4在维持对自身抗原的耐受性、同时允许在T细胞介导下有效识别和去除表达外来抗原的细胞和肿瘤细胞方面的核心作用已得到广泛认可(Leach等人，1996；Tivol等人，1995；Waterhouse等人，1995)。积累数据表明，抗CTLA-4抗体除用于降低T细胞识别肿瘤抗原和排斥肿瘤的阈值外，还可以通过抗体与表达FcγR的效应细胞相互作用后耗竭瘤内Treg细胞来发挥治疗活性(Peggs等人，2009；Simpson等人，2013)(Ingram等人，2018)。与此一致的是，最近的数据表明，FcγR和Treg耗竭在抗CTLA-4抗体(包括伊匹木单抗)的疗效中发挥作用(Arce Vargas等人，2018)。

使用靶标不可知的F.I.R.S.T^TM发现平台(Veitonmaki等人，2013)，发明人鉴定了一系列抗体及其相关联靶标，这些抗体和靶标能够在T细胞发炎CT26小鼠肿瘤模型中耗竭Treg细胞并改善生存期(数据未示出，图1A和图1B)。在这些抗体中鉴定出CTLA-4和抗CTLA-4抗体，抗CTLA-4mIgG2a mAb耗竭了瘤内Treg细胞，并在治疗携带同基因CT26肿瘤的动物时赋予生存期(图1A)。对人CTLA-4特异性IgG1抗体的集中筛选鉴定了具有相似的体外耗竭表达CTLA-4的人T细胞活性的几种克隆(图1C)。当跨多个供体筛选时，一个克隆(4-E03)基于与其他克隆相比始终更强的CTLA-4⁺ T细胞耗竭功效而引人注目(图1C)。为了研究该克隆明显更强的耗竭活性的体内相关性，发明人转向将人PBMC移植到NOD SCID IL-2Rγ-/-(NSG)小鼠中的模型。由于移植物抗宿主类型的相互作用，人Treg和CD8+ T细胞被强烈活化，并示出与在人肿瘤中观察到的表达相比，类似的共刺激和共抑制分子表达(Buchan等人，2018)(图9A)。对NOG-hPBMC CD4⁺CD25⁺CD127^低的Treg和CD8⁺ T细胞的分析确实揭示了与在从9个卵巢癌患者获得的T细胞上观察到的CTLA-4表达水平相似的CTLA-4表达水平(图9A)。此外，用10mg/kg伊匹木单抗或附加的抗CTLA-4抗体克隆(2-C06和2-F09)对NOG-hPBMC小鼠给药证实人CD4⁺CD25⁺CD127^低Treg细胞具有相似的体内耗竭活性(图1D)。然而，4-E03诱发了人类Treg细胞明显更大的耗竭。重要的是，与CTLA-4在瘤内NOG-hPBMC CD8⁺ T细胞上的表达低于Treg细胞上的表达一致(图9A)，4-E03显示人活化的CD8⁺ T细胞没有耗竭(图1D)。4-E03抗体配制物的生物化学表征，特别是HPLC-SEC分析，显示单体IgG>95％(数据未示出)，排除了4-E03增强的Treg耗竭是由抗体聚集引起的。与发明人和其他人的观察结果一致，抗CTLA-4mAb Treg耗竭被证实依赖于抗体Fc:FcγR相互作用。与WT FcγR结合高效的IgG1相比，FcγR结合受损的4-E03变体(IgG1N297Q)显示Treg耗竭严重受损(图9B)。

这些发现表明，4-E03与CTLA-4上的功能不同的表位结合。因此，发明人表征了4-E03相对于伊匹木单抗和其他抗CTLA-4抗体的结合与配体阻断活性。所有抗体都显示出对人CTLA-4的细胞外结构域的高特异性，并且通过ELISA没有观察到与其密切相关的人同系物CD28的结合(图1E)。尽管4-E03和伊匹木单抗以类似的效力和功效与hCTLA-4结合(图1E和图9C)，但是仅4-E03显示出与小鼠CTLA-4具有微弱但明显的交叉反应性(图1E)。这些发现与两种抗体结合到不同的表位一致。

进一步比较分析4-E03和伊匹木单抗，评价其与体外活化的人CD4⁺ T细胞上内源性表达的CTLA-4的结合(图9D和图1F)、对B7:CTLA-4相互作用的阻断(图1G)，或者对B7:CTLA-4介导的T细胞阻抑的抑制(图1H)，揭示在其他方面几乎相同的功效和效力。总而言之，结果表明4-E03与功能不同的CTLA-4表位结合，这与更强的Treg耗竭相关联，但是对B7:CTLA-4的等效阻断诱导T效应细胞抑制由伊匹木单抗所靶向的表位。

由于4-E03与小鼠CTLA-4仅微弱地交叉反应(图1E)，所以发明人接下来集中筛选鉴定用于在免疫感受态小鼠肿瘤模型中进行体内概念验证研究的适当替代物。鉴定了一个克隆(5-B07)，其显示与小鼠CTLA-4转染的CHO细胞(图1I)和小鼠CTLA-4蛋白(图9E)的高特异性结合、对B7:CTLA-4相互作用的阻断(图1J)，以及与人体环境中的4-E03相比，瘤内小鼠Treg的类似强耗竭(图1K)。另外，抗mCTLA-4(5-B07)赋予抗肿瘤活性，并改善了携带CT26肿瘤的BALB/c小鼠的生存期(图1L)。就像用抗hCTLA-4(4-E03)对人细胞进行处理所观察到的，发现小鼠Treg的抗mCTLA-4(5-B07)耗竭依赖于Fc:FcγR相互作用。5-B07的Fc:FcγR结合高效变体而不是Fc:FcγR结合受损变体耗竭了瘤内Treg(图9F)。

类似的明显Treg耗竭活性，连同它们对CTLA-4的类似高特异性和对CTLA-4:B7家族相互作用的阻断活性，表明抗hCTLA-4(4-E03)和抗mCTLA-4(5-B07)作为合适的MoA匹配替代物的治疗潜力。

对用于肿瘤选择性CTLA-4阻断和Treg耗竭的抗体编码溶瘤病毒进行工程改造

抗CTLA-4抗体疗法的常见副作用与CTLA-4充当维持T细胞内稳态和自身耐受性的中心检查点的公认作用一致(Tivol等人，1995；Waterhouse等人，1995)。然而，Quezada及其同事最近的工作已经证实，瘤内Treg耗竭可以显著促进伊匹木单抗的临床活性(ArceVargas等人，2018)，并且瘤内递送的Treg耗竭抗体可以在小鼠肿瘤模型中提供显著的抗肿瘤活性(Fransen等人，2013；Marabelle等人，2013b)。抗CTLA-4的这种双重活性，分别在中央室和周边室起作用，提示将抗CTLA-4疗法定位于肿瘤可能是一种使抗CTLA-4的功效与毒性脱钩的有吸引力的策略。

发明人假设，经工程改造以表达Treg耗竭抗CTLA-4的瘤内递送的溶瘤病毒(OV)将代表一种用于实现有效但安全的肿瘤定位抗CTLA-4疗法的特别有吸引力的手段。除能够在肿瘤细胞感染时，在TME中局部产生抗体和阻断CTLA-4受体以及耗竭Treg外，OV还被认为发挥直接和间接的抗肿瘤活性，并且已被批准用于癌症免疫疗法(Bommareddy等人，2018)。

因此，发明人工程改造出一种痘苗病毒载体，其源自减毒的哥本哈根株(Foloppe等人，2019)，在全球天花疫苗接种计划中观察到经临床证实的安全性和强大的免疫调节作用，并且在免疫遗弃和免疫排斥癌症的小鼠实验模型中具有细胞溶解特性和诱导炎性细胞浸润特性(Fend等人，2017；Kleinpeter等人，2016；Liu等人，2017；Marchand等人，2018)，具有全长抗hCTLA-4或抗mCTLA-4IgG抗体序列。还生成了另外编码GM-CSF的变体载体(VV_GM-αCTLA4)(图2A)，这是一种骨髓细胞生成和先天免疫细胞趋化性的生长因子诱导剂和增强剂，并且评价了其治疗功效。

遗传重建后，确认重组的抗CTLA-4编码病毒在肿瘤细胞系中感染、复制(图2B)和裂解(图2C)。用经工程改造的溶瘤病毒感染的肿瘤细胞系进一步证实产生全长IgG抗体和GM-CSF转基因(图2D和图2E)，与重组产生的蛋白质相比，该全长IgG抗体和GM-CSF转基因与CTLA-4受体的结合力相等(图2G)，并且支持GM-CSF依赖性TF-1细胞增殖(图2F)。由BT-001感染的MIA-PaCa-2肿瘤细胞产生的4-E03也证实在体内耗竭人Treg细胞(图2H)。

瘤内VV_GM-αCTLA4具有与肿瘤选择性CTLA-4受体饱和与Treg耗竭相关联的抗肿瘤活性

首先在CT26 BALB/c模型中对VV_GM-αCTLA4抗肿瘤活性进行评估，该模型已知被T细胞高度浸润并且对全身性抗CTLA-4抗体治疗敏感(Grosso和Jure-Kunkel，2013)。用7.5×10⁴、7.5×10⁵或7.5×10⁶pfu的VV_GM-αCTLA4对携带CT26肿瘤的动物进行三次瘤内注射，证明存在剂量依赖性抗肿瘤作用，峰值在10⁶至10⁷pfu下出现，10只动物中有6至7只治愈(图3A)。用缺乏抗CTLA-4抗体和/或GM-CSF转基因的对照病毒进行的处理证明对抗CTLA-4抗体具有绝对依赖性(10只小鼠中没有一只存活)，以及GM-CSF对治疗功效具有边际抗CTLA-4增强作用(10只小鼠中有7只存活对比10只小鼠中有5只存活)。基于已建立的剂量依赖性、抗CTLA-4抗体依赖性和GM-CSF增强作用，发明人因此使用1×10⁷pfu的瘤内递送剂量评价了编码双转基因的OV(VV_GM-αCTLA4)的疗效与作用机制，并对其进行表征。

发明人接下来评估了瘤内施用编码转基因的痘苗OV后的肿瘤，以及下列物质的全身浓度：抗CTLA-4(图3B)、GM-CSF(图10A)和病毒颗粒(图10B)。瘤内注射10⁷VV_GM-αCTLA4感染性颗粒进入携带同基因小鼠肿瘤的免疫感受态小鼠中，生成了与肿瘤而不是血液中的CTLA-4表达细胞的持续饱和相关联的瘤内抗体暴露(图3B和图1I)。类似地，i.t.施用VV_GM-αhCTLA4至携带人肿瘤异种移植物的免疫缺陷小鼠在肿瘤中相比在血液中生成数量级更高的抗体浓度(图10C至图10E)。与瘤内施用在肿瘤中而非全身区室中实现受体饱和浓度一致(图3B)，i.t.VV_GM-αCTLA4使得瘤内Treg细胞几乎完全耗竭，但不影响携带CT26肿瘤的BALB/c小鼠脾脏中的Treg数量(图3C)。

总体而言，这些结果证明，瘤内施用编码抗CTLA-4的痘苗病毒在体内成功实现了肿瘤限制性CTLA-4受体饱和与Treg耗竭，从而支持其肿瘤选择性抗CTLA-4治疗性质，并且促进在各种不同癌症实验模型中测试体内疗效和耐受性。

VV_GM-αCTLA4具有广泛的抗肿瘤活性

发明人继续在一系列免疫感受态小鼠癌症模型中评估i.t.VV_GM-αCTLA4的抗肿瘤活性，这些小鼠癌症模型涵盖不同遗传小鼠背景下不同来源的血液癌症(A20)和实体癌症(CT26 BALB/c结肠；MT6 BALB/c乳腺，MC38 C57BL/6结肠和B16 C57BL/6黑素瘤，图4A)，代表对免疫排斥(B16)肿瘤微环境的高度T细胞发炎(CT26)。这些模型包括在使用CTLA-4或抗PD-1时对ICB敏感或有耐药性的那些。

惊人的是，将VV_GM-αCTLA4 i.t.施用于携带建立的同基因肿瘤(其特征在于不同的免疫发炎类型肿瘤微环境)的C57BL/6或BALB/c小鼠治愈了大多数(A20＝10/10，EMT6＝8/10，MC38＝8/10和CT26＝10/10只存活小鼠)动物(图4A)。同样令人印象深刻的是，在以免疫遗弃型TME以及对抗PD-1和抗CTLA-4均具有耐药性为特征的B16 C57BL/6模型中，i.t.VV_GM-αCTLA4显著延迟了肿瘤生长并治愈了3/10只动物。这些结果表明VV_GM-αCTLA4在各种不同的癌症类型中(包括在患有各种不同的炎性和免疫排斥类型TME的患者中)具有广泛的治疗潜力。

用VV_GM-αCTLA4进行瘤内处理诱导持久的全身抗肿瘤免疫

临床前研究和临床研究已经证明了肿瘤局部癌症免疫疗法的治疗潜力。瘤内溶瘤病毒疗法，单独使用(Andtbacka等人，2015)或与ICB组合使用(Chesney等人，2018；Ribas等人，2017)在黑素瘤癌症患者中诱导持久的应答。从机理上讲，已提出i.t.溶瘤病毒疗法可诱导或增强炎性细胞浸润到经注射肿瘤中，引起肿瘤抗原呈递、向引流淋巴结的迁移以及启动后CD8⁺ T细胞向远侧(未经注射)肿瘤病变的运输增加，从而发挥全身抗肿瘤“远端”效应(Ngwa等人，2018)。在临床中，这种对全身适应性抗肿瘤记忆应答的诱导将是至关重要的，因为癌症患者可能呈现以转移、不可检测或不可注射的肿瘤为特征的广泛扩散性疾病。

发明人使用多管齐下方法来评估i.t.VV_GM-αCTLA4是否诱导远端效应和全身抗肿瘤免疫。首先，使用“双生肿瘤模型”，其中将肿瘤细胞皮下移植到每只动物的右胁腹和左胁腹中，但只有一个肿瘤注射OV，另一个肿瘤保持未处理，可以评价远端效应，其表现为在未经注射的肿瘤中肿瘤生长减少。

在携带CT26肿瘤的小鼠中瘤内注射最大有效VV_GM-αCTLA4剂量引起对经注射肿瘤的完全排斥(9/9)，以及对未经注射肿瘤的几乎完全排斥(7/9)，这表明存在强烈的远端效应(图4B)。i.t.施用OV真正的远端性质得到双重证实。首先，为了排除病毒颗粒从经注射肿瘤扩散到未经注射肿瘤的潜在治疗作用，对未经注射肿瘤进行分析，确认病毒颗粒为阴性(图11A)。

第二，使用该双生肿瘤模型，发明人比较了治疗最大有效剂量(10⁷pfu)和次最优剂量(10⁵pfu)的局部(i.t.)或全身(i.v.)施用的VV_GM-αCTLA4的抗肿瘤活性。与真正的远端效应一致，在两个测试剂量下，与i.v.施用相比，i.t.施用赋予提高的生存率(图11C)。事实上，在排斥未经注射肿瘤方面，i.t.给药10⁵pfu相比i.v.注射100倍剂量至少同样有效(图11B和图11C)。最后，与i.t.施用OV诱导适应性抗原特异性免疫应答的免疫记忆特征一致，保护治愈的动物免受用相同(CT26)而并非无关的肿瘤(Renca)发起的再次攻击(图11D)。

VV_GM-αCTLA4引发稳健的全身性CD8⁺ T细胞依赖性抗肿瘤免疫

发明人通过与CD4⁺ T细胞耗竭或CD8⁺ T细胞耗竭的携带CT26肿瘤的小鼠相比，评估免疫完整小鼠中的VV_GM-αCTLA4治疗活性，研究了全身抗肿瘤免疫应答的性质。惊人的是，CD8⁺ T细胞耗竭完全消除了VV_GM-αCTLA4抗肿瘤活性。CD4⁺ T细胞耗竭减小了VV_GM-αCTLA4的作用，但并没有将其消除。这些数据证明，VV_GM-αCTLA4抗肿瘤活性关键取决于CD8⁺ T细胞。在证明存在远端效应和对抗再次攻击的肿瘤特异性保护的同时，结果强烈提示，瘤内递送的VV_GM-αCTLA4诱导稳健的全身CD8⁺ T细胞抗肿瘤免疫。

因此，发明人接下来评估i.t.VV_GM-αCTLA4是否诱导或扩增肿瘤和周边中的肿瘤特异性和病毒特异性CD8⁺ T细胞。用VV_GM-αCTLA4对携带CT26肿瘤的BALB/c小鼠进行瘤内处理，或者为了模拟临床上可用的抗CTLA-4方案，用抗mCTLA-4mAb 5-B07(3mg/kg)进行全身(i.p.)处理。通过两种方法量化肿瘤和中央室(脾脏)中的CT26肿瘤特异性和痘苗特异性CD8⁺ T细胞；使用CT26肿瘤抗原(AH-1)特异性和痘苗病毒特异性多聚体来直接量化所收获脾脏中的肿瘤特异性CD8+ T细胞，然后评估在离体刺激脾细胞后的IFN-γ⁺ TNF-α⁺CD8⁺ T细胞(图5B)，或者分别用CT26衍生的肿瘤肽AH-1和痘苗衍生的肽S9L8刺激的TIL。包括用PBS或仅编码GM-CSF的VV来处理，以此作为对照。正如预期的那样，与瘤内VV_GM-αCTLA4诱导稳健的全身CD8⁺ T细胞依赖性抗肿瘤免疫一致，i.t.VV_GM-αCTLA4在经注射肿瘤和周边室(未经注射肿瘤和脾脏)中均诱导肿瘤特异性CD8⁺ T细胞(图5B至图5D和图13B)，如通过脾细胞的离体刺激或Dextramer染色所评估的。令人印象深刻的是，i.t.VV_GM-αCTLA4与全身抗CTLA-4相比，更有效地扩增了肿瘤特异性CD8⁺ T细胞。用PBS或缺乏αCTLA-4的病毒进行对照处理，由任一读出结果看出，没有诱导肿瘤特异性CD8⁺ T细胞。有趣的是，用VV_GM-αCTLA4进行i.t.处理，也诱导了痘苗特异性CD8⁺ T细胞，尽管数量少。

总体而言，这些数据证明，瘤内VV_GM-αCTLA4诱导稳健的全身CD8⁺T细胞依赖性抗肿瘤免疫。

瘤内诱导的CD8+ T细胞抗肿瘤免疫是FcγR依赖性的，并且与Treg耗竭相关联

广泛的抗肿瘤活性、肿瘤特异性CD8⁺ T细胞在肿瘤和周边中的强扩增，以及Treg细胞的肿瘤限制性耗竭，均支持用i.t.VV_GM-αCTLA4实现了高效且安全的处理。

为了进一步评估和确认抗体介导的Treg耗竭潜在抗肿瘤免疫的作用，发明人比较了i.t.VV_GM-αCTLA4在携带CT26肿瘤的WT小鼠和普通γ链缺陷(Fcer1g^-/-)BALB/c小鼠中的抗肿瘤作用。Fcer1g^-/-小鼠缺乏功能性活化Fcγ受体和抗CTLA-4抗体体内Treg耗竭，并且相关联抗肿瘤活性先前证实具有活化FcγR依赖性(Arce Vargas等人，2018；Simpson等人，2013)。与抗CTLA-4诱导的Treg耗竭的关键性基础i.t.VV_GM-αCTLA4抗肿瘤免疫一致，WT(10/10)而不是FcγR缺陷动物(3/10)完全受到保护，并且癌症痊愈(图6A)。在FcγR缺陷动物中观察到的有限却显著的抗肿瘤活性与发明人和其他人的观察结果一致，即，病毒载体(图4A)和CTLA-4:B7阻断本身-在缺乏Treg耗竭的情况下(图9F和图12A)-延迟了肿瘤生长，但仅贡献有限的生存优势。

除了为抗体包被的靶细胞提供免疫效应细胞介导的ADCC和ADCP之外，FcγR还被证实可以促进肿瘤抗原的交叉呈递(DiLillo和Ravetch，2015)、拓宽和增强CD8⁺ T细胞抗肿瘤应答，使其涵盖通常被排除在外的MHCII限制性细胞外肿瘤抗原。发明人发现，i.t.VV_GM-αCTLA4抗肿瘤免疫是FcγR依赖性的，诱导肿瘤特异性CD8⁺ T细胞更稳健地扩增，此外还诱导病毒特异性CD8⁺ T细胞，表明该抗肿瘤免疫也可能促进肿瘤抗原交叉呈递。与注射病毒骨架(VV)的小鼠和未经处理的携带CT26肿瘤的小鼠相比，对从注射VV_GM-αCTLA4的小鼠收获的肿瘤的差异基因表达分析强化了这一观点(图6B和图6C)。除了上调Batf本身之外，差异基因分析还证明，与抗原交叉呈递cDC1树突状细胞相关联的I型IFN应答和CD8α标志物上调。另外的标记支持上文表征的CD8⁺ T细胞依赖性(和潜在的NK细胞介导的颗粒酶依赖性)肿瘤细胞溶解，这是触发和启动VV_GM-αCTLA4抗肿瘤免疫的基础。

为了评估抗原交叉呈递在VV_GM-αCTLA4诱导的抗肿瘤免疫中的作用，发明人使用缺乏转录因子Batf3的小鼠(Batf3^-/-小鼠)。Batf3^-/-小鼠缺乏CD8α⁺树突状细胞，因此显示有缺陷的抗原交叉呈递，以及CD8⁺ T细胞对感染期间的病毒和小鼠癌症实验模型中的肿瘤抗原的应答严重受损(Hildner等人，2008)。另外，已知cDC1和抗原交叉呈递可以介导包括αCTLA-4在内的免疫检查点阻断剂的治疗活性(Gubin等人，2014)。因此，发明人比较了移植MC38肿瘤的Batf3^+/+和Batf3^-/-C57BL/6小鼠中的i.t.VV_GM-αCTLA4的抗肿瘤活性。惊人的是，Batf3缺陷消除了i.t.VV_GM-αCTLA4抗肿瘤免疫，正如0/8Batf3^-/-与9/9WT小鼠存活相比较所证明的那样(图6D)。

总体而言，这些结果证明，VV_GM-αCTLA4具有FcγR依赖性和cDC1依赖性这两种抗肿瘤活性，从而确认瘤内诱导的Treg耗竭和肿瘤抗原交叉呈递为主要机制，并且瘤内CTLA-4:B7阻断和溶瘤为支持机制，这些机制是i.t.VV_GM-αCTLA4诱导的CD8⁺ T细胞抗肿瘤免疫的基础。

瘤内抗CTLA-4-VV扩增外周效应CD8⁺ T细胞并减少Treg和耗竭的CD8⁺ T细胞

发明人继续定性表征i.t.VV_GM-αCTLA4如何调节经注射侧翼肿瘤和周边中的TIL应答。使用多色流式细胞仪和被设计成鉴定功能不同的抗肿瘤和促肿瘤TIL亚群的高维抗体组，跨处理组鉴定了12个T细胞簇(图7和图13C)。惊人的是，i.t.VV_GM-αCTLA4在经注射肿瘤中，与经模拟物处理的动物相比，消除了耗竭的(PD-1⁺ TIM-3⁺)CD8⁺ T细胞并稳健地扩增了未耗竭的Klrg1⁺效应CD8⁺ T细胞(图7)。与此同时，并且与上述发现一致，i.t.VV_GM-αCTLA4有效地耗竭CTLA-4⁺瘤内Treg，包括Klrg1⁺ Treg，已知其表达高水平的CTLA-4并且具有非常高的抑制性(Nakagawa等人，2016)(图7)。

对未注射抗体编码病毒的侧翼远侧肿瘤的评估揭示，i.t.VV_GM-αCTLA4实现了对TIL的相似但较不明显的调节。另外，与发明人的观察结果保持一致，即，瘤内施用编码αCTLA4的溶瘤病毒在周边中扩增肿瘤特异性CD8⁺ T细胞(图5B至图5D)，i.t.VV_GM-αCTLA4诱导脾脏中的活化颗粒酶B⁺(Klrg1⁺)CD8⁺ T细胞亚群(图7A)。最后，与实现肿瘤限制性Treg耗竭的抗体编码病毒一致，在肿瘤床中耗竭的Treg群体在脾脏中，在i.t.VV_GM-αCTLA4的作用下基本上没有改变(图7A)。

瘤内抗CTLA-4-VV与抗PD-1组合，以排斥“冷”远侧肿瘤

发明人的观察结果证明，VV_GM-αCTLA4在经注射肿瘤中局部起作用，主要通过涉及抗CTLA-4mAb依赖性肿瘤抗原交叉呈递和Treg耗竭的机制，以“点燃”全身适应性抗肿瘤免疫和稳健的外周肿瘤特异性CD8⁺ T细胞扩增。这些发现表明，VV_GM-αCTLA4可能与帮助将CD8⁺ T细胞动员至肿瘤的治疗剂协同作用。认为抗PD-1主要通过逆转T细胞耗竭而起作用(Hui等，2017；Wei等人，2018)，并且可能通过动员干细胞样记忆CD8⁺ T细胞至肿瘤而起作用(Galletti等人，2020；Simon等人，2020)。尽管抗PD-1被记载能够改善不同来源的多种实体癌的生存率，但是抗PD-1并没有改善免疫浸润不良“冷肿瘤”患者的结果(Galon和Bruni，2019)，这可能代表当今癌症疗法中未得到满足的最大医疗需求。

基于它们明显不同且潜在互补的作用机制，因此，发明人接下来检查了抗PD-1与VV_GM-αCTLA4的协同作用，使用B16 C57BL/6作为模型系统，重点研究对ICB有耐药性、免疫浸润不良和免疫原性差的“冷”癌。先前的数据已证明，B16肿瘤是ICB疗法难治的，该ICB疗法包括临床相关地全身施用抗PD-1(10mg/kg)、抗CTLA-4(10mg/kg)或它们的组合(图14)。

为了模拟其中可触知的大肿瘤将注射抗体编码病毒，但较小或不可检测的转移病灶不能被注射的临床情况，发明人建立了双生肿瘤B16/C57BL6模型，其中动物携带一个“大”肿瘤和一个“小”肿瘤，并且其中仅大肿瘤i.t.注射VV_GM-αCTLA4。用10mg/kg最大有效剂量全身治疗后，缺乏肿瘤生长抑制或生存益处证实对抗PD-1存在耐药性(图8A)。

如先前所观察到的，用VV_GM-αCTLA4进行单一药剂处理显著降低了经初次注射肿瘤的肿瘤生长(图4和图8B)。然而，i.t.VV_GM-αCTLA4仅诱导未经注射肿瘤生长的轻微延迟(图8B)，这没有转化为动物生存(图8A)。然而惊人的是，与单一药剂或组合的抗PD-1和抗CTLA-4疗法相比，用i.t.VV_GM-αCTLA4和全身抗PD-1联合治疗显著抑制经注射肿瘤和未经注射肿瘤的生长，结果是，约20％的动物在这种对ICB治疗有耐药性的“冷”癌模型中得到治愈(图8A)。

进一步与VV_GM-αCTLA4能够将对ICB有耐药性的冷肿瘤转化为ICB反应性发炎表型一致，与VV_GM-αCTLA4联合治疗(而不是用单独的抗PD-1治疗)诱导T细胞大量涌入B16肿瘤中，与发炎CT26肿瘤相比，B16肿瘤变得类似地密集富含T细胞(图14C)。

这些观察结果表明，组合的i.t.VV_GM-αCTLA4和全身抗PD-1在移植同基因A20肿瘤的BALB/c小鼠中证实具有协同作用。该模型证实对抗PD-1具有半响应性，其中约20％的动物由完全治疗性i.p.给药(10mg/kg)治愈(图8C)。尽管用i.t.VV_GM-αCTLA4进行最佳治疗性给药提供完全保护(10/10的动物得到治愈，图4)，但是用1/100最佳剂量进行次优治疗仅显示微小的肿瘤生长抑制，并且没有生存优势。将治疗性i.p.抗PD-1与亚治疗性i.t.VV_GM-αCTLA4组合时，大部分动物(7/10)得到治愈(图8C)。

论述

发明人提供了体内概念验证，即瘤内施用肿瘤病毒编码的Treg耗竭αCTLA-4与经批准的全身αCTLA-4方案相比具有更强更宽的抗肿瘤活性，然而通过其暴露的肿瘤限制性质表明，前者既安全又耐受良好。i.t.VV_GM-αCTLA4与全身重组αCTLA-4相比诱导肿瘤特异性CD8⁺ T细胞的更强扩增，并且在对用全身αCTLA-4和αPD-1进行临床相关给药具有耐药性的免疫浸润不良同基因小鼠“冷”肿瘤模型中具有抗肿瘤活性。引人注意的是，我们的观察结果提示，由肿瘤病毒αCTLA-4诱导的强效全身抗肿瘤免疫严格地源自经注射肿瘤中的“免疫点燃”效应；i.t.VV_GM-αCTLA4与病毒扩散或抗体暴露于远侧未经注射肿瘤无关，而是实现了肿瘤限制性CTLA-4受体饱和与Treg耗竭。

这些观察结果对于i.t.VV_GM-αCTLA4的预期临床疗效和耐受性都有重要意义。从疗效角度来看，这些观察结果证明，局部施用肿瘤病毒编码的αCTLA-4与可获得的抗体方案(伊匹木单抗)、Treg耗竭优化(Arce Vargas、Furness等人，2018)或“经掩蔽的”抗体方案(Gutierrez、Long等人，2020)、全身αCTLA-4抗体方案相比，以及与先前描述的编码非Treg耗竭优化αCTLA-4的溶瘤病毒方法(Aroldi、Sacco等人，2020)相比，可以提供更大的治疗益处。在机理水平上，VV_GM-αCTLA4诱导的FcγR依赖性Treg耗竭和cDC1⁺抗原交叉呈递可能是观察到的CD8⁺ T细胞稳健扩增以及与αPD-1协同排斥冷肿瘤两者的基础。除了介导诱导内源性抗肿瘤免疫应答(Hildner等人，2008)和全身检查点阻断疗法的疗效(Gubin、Zhang等人，2014；Salmon、Idoyaga等人，2016；Garris、Arlauckas等人，2018)之外，cDC1还促进瘤内CD8⁺ TIL的增殖应答、扩大TCF1⁺干细胞样前体的库，并且诱导TIM3⁺末端效应物在αPD-1疗法期间生成(Mao等人，2021)。

类似地，用针对共刺激或共抑制受体(例如IL-2R和CTLA-4)的mAb实现的Treg耗竭可以促进CD8⁺效应子功能并且与αPD-1协同作用(Wei等人，2019；Solomon等人，2020)。关于对减少Treg并扩增抗肿瘤CD8⁺ T细胞的“双重活性”免疫调节抗体的开发，不断积累的数据证明了靶向生物学、微调效应CD8⁺ T细胞增强与Treg耗竭特性，以及递送方案的重要性。例如，最近证明，与配体阻断αIL-2R抗体相比，耗竭Treg但没有使CD8⁺效应T细胞缺乏关键(IL-2介导的)生长存活信号传导的针对IL-2R的FcγR感受态非配体阻断抗体在癌症疗法中具有优越的治疗潜力(Solomon等人，2020)。

类似地，但不同的是，发明人最近报道了可以通过抗体同种型转换(改变FcγR接合)产生针对4-1BB的抗体以耗竭Treg或促进效应T细胞扩增，但是利用这两种机制需要顺序施用或铰链工程改造(Buchan等人，2018)。如本文在溶瘤病毒感染的背景下所述，Treg耗竭增强的功能阻断抗CTLA-4对经注射肿瘤的空间限制在单独使用或与协同检查点阻断疗法(例如抗PD-1/L1)组合使用时，似乎是利用免疫调节抗CTLA-4抗体的最大治疗活性的特别有前景的方法。

一些观察结果支持优化肿瘤局部疗法中抗CTLA-4对Treg的耗竭。首先，独立研究已经确立，抗CTLA-4的治疗功效依赖于Treg耗竭并与之相关联(Arce Vargas等人，2018；Simpson等人，2013)。本文呈现的关于Treg耗竭抗CTLA-4克隆的治疗活性的数据支持该观点，这些克隆在FcγR结合高效(Treg耗竭)抗体Fc形式和宿主中与其FcγR缺陷(非耗竭)对应物相比显示出强疗效。其次，虽然最近报道用伊匹木单抗治疗黑素瘤患者的临床结果与FcγR接合和Treg耗竭相关联，但是来自发明人T细胞人源化小鼠模型的数据提示，与本文针对表达瘤内相关水平CTLA-4的人Treg细胞的载体化抗CTLA-4抗体4-E03相比，伊匹木单抗的耗竭活性有限。此外，尽管伊匹木单抗的临床耐受剂量(1mg/kg至3mg/kg，取决于适应症和用药方案)仅与亚饱和CTLA-4受体的占用率和次最大效应相关联(Ribas等人，2005)(Bertrand等人，2015)，但是发明人的数据证明，溶瘤载体化和i.t.施用能够以明显安全的方式生成治疗上最佳的暴露(持续的CTLA-4受体饱和)-即便使用Treg耗竭增强的抗CTLA-4也是如此。最后，抗体介导的CTLA-4阻断最近证实在改善肿瘤特异性CD8⁺ T细胞应答中与FcγR依赖性耗竭协同作用，这支持我们对具有Treg耗竭增强与检查点阻断“双重活性”的αCTLA-4抗体进行载体化这一做法。抗体阻断CTLA-4在功能上破坏了瘤内Treg的平衡，并且通过改变糖酵解和竞争B7配体的过程促进B7:CD28共刺激和抗肿瘤CD8⁺ T效应细胞功能(Zappasodi等人，2021)。

完全治疗性给药实现肿瘤限制性抗CTLA-4暴露的事实表明，与持续性全身Treg耗竭相关联的严重毒性(例如，在FoxP3-DTR小鼠模型中观察到的那些(Kim等人，2007))不太可能出现。类似地，由于抗CTLA-4检查点阻断作用将仅限于具有肿瘤抗原特异性的TIL，所以与全身抗CTLA-4相关联的意外自行反应性应当最小化。相比之下，但与充分记载的CTLA-4的中枢免疫检查点性质(Chambers等人，1996；Leach等人，1996)一致，与全身施用(即，全身性抗体暴露)相关联的抗CTLA-4副作用可能具有严重的自体免疫性质，因而可能导致致命后果(Tivol等人，1995；Waterhouse等人，1995)。

因此，综合考虑，虽然迄今为止抗CTLA-4的疗效和耐受性一直被认为是相关的，而且具有剂量依赖性，因此无法使用基于抗CTLA-4的用药方案的完全治疗剂量，但是研究发现强烈提示，载体化Treg耗竭αCTLA-4的空间限制能够克服目前的这些局限性，从而使疗效与耐受性脱钩。

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Claims

1.一种组合，包含：

-与PD-1和/或PD-L1特异性结合的第二抗体分子；

所述组合用于治疗患者的癌症，其中所述癌症包括冷肿瘤或由冷肿瘤组成。

2.以下物质即：

-与PD-1和/或PD-L1特异性结合的第二抗体分子；

在制造用于治疗患者的癌症的药物中的用途，其中所述癌症包括冷肿瘤或由冷肿瘤组成。

3.一种用于治疗患者的癌症的方法，其中所述癌症包括冷肿瘤或由冷肿瘤组成，所述方法包括向所述患者施用：

-与PD-1和/或PD-L1特异性结合的第二抗体分子。

4.一种能够表达与CTLA-4特异性结合的第一抗体分子的溶瘤病毒，

其与特异性地结合到PD-1和/或PD-L1的第二抗体分子结合使用；

用于治疗患者的癌症，其中所述癌症包括冷肿瘤或由冷肿瘤组成。

5.根据任一项前述权利要求所述的用于使用的组合、或用途、或方法、或者用于使用的溶瘤病毒，其中所述冷肿瘤由所述第一抗体分子和所述第二抗体分子治疗。

6.根据任一项前述权利要求所述的用于使用的组合、或用途、或方法、或者用于使用的溶瘤病毒，其中所述与CTLA-4特异性结合的抗体分子是Fcγ受体接合抗体。

7.根据任一项前述权利要求所述的用于使用的组合、或用途、或方法、或者用于使用的溶瘤病毒，其中所述与CTLA-4特异性结合的抗体分子是Treg耗竭抗体。

8.根据任一项前述权利要求所述的用于使用的组合、或用途、或方法、或者用于使用的溶瘤病毒，其中所述溶瘤病毒是溶瘤痘病毒。

9.根据权利要求8所述的用于使用的组合、或用途、或方法、或者用于使用的溶瘤病毒，其中所述痘病毒属于脊椎动物痘病毒亚科，更优选地属于正痘病毒属，优选地选自由痘苗病毒、牛痘病毒、金丝雀痘病毒、鼠痘病毒和粘液瘤病毒组成的组。

10.根据权利要求9所述的用于使用的组合、或用途、或方法、或者溶瘤病毒，其中所述溶瘤病毒是胸苷激酶(TK)和/或核糖核苷酸还原酶(RR)这两种活性有缺陷的痘苗病毒，并且所述痘苗病毒包含编码SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:53和SEQ ID NO:54的核苷酸序列。

11.根据权利要求9或10所述的用于使用的组合、或用途、或方法、或者用于使用的溶瘤病毒，其中所述痘苗病毒还包含编码GM-CSF的核苷酸序列，并且特别偏好人GM-CSF(例如具有SEQ ID NO:55或SEQ ID NO:56)或鼠GM-CSF(例如具有SEQ ID NO:57或SEQ ID NO:58)。

12.根据任一项前述权利要求所述的用于使用的组合、或用途、或方法、或者用于使用的溶瘤病毒，其中所述病毒包含插入病毒J2R基因座处的编码所述第一抗体分子的所述重链的核苷酸序列并且/或者包含插入病毒I4L基因座处的编码所述第一抗体分子的所述轻链的核苷酸序列。

13.根据任一项前述权利要求所述的用于使用的组合、或用途、或方法、或者用于使用的溶瘤病毒，其中所述第一抗体分子选自由包含1至6个CDR的抗体分子组成的组，所述CDR选自由SEQ ID NO:3、6、8、10、12和14组成的组。

14.根据任一项前述权利要求所述的用于使用的组合、或用途、或方法、或者用于使用的溶瘤病毒，其中所述第一抗体分子选自由包含1至6个CDR的抗体分子组成的组，所述CDR包括VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL-CDR1和VL-CDR3，

-其中VH-CDR1，如果存在的话，选自由SEQ ID NO:15、22、29和35组成的组；

-其中VH-CDR2，如果存在的话，选自由SEQ ID NO:16、23、30和36组成的组；

-其中VH-CDR3，如果存在的话，选自由SEQ ID NO:17、24、31和37组成的组；

-其中VL-CDR1，如果存在的话，选自由SEQ ID NO:10和38组成的组；

-其中VL-CDR2，如果存在的话，选自由SEQ ID NO:18、25、32和39组成的组；

-其中VL-CDR3，如果存在的话，选自由SEQ ID NO:19、26和40组成的组。

15.根据任一项前述权利要求所述的用于使用的组合、或用途、或方法、或者用于使用的溶瘤病毒，其中所述第一抗体分子包含具有

SEQ ID.NO:15、16、17、10、18和19的六个CDR，或者具有SEQ ID NO:22、23、24、10、25和26的六个CDR。

16.根据任一项前述权利要求所述的用于使用的组合、或用途、或方法、或者用于使用的溶瘤病毒，其中所述第一抗体分子包含选自由

SEQ.ID.NO:20和27组成的组的可变重链和/或选自由SEQ ID NO:21和28组成的组的可变轻链。

17.根据任一项前述权利要求所述的用于使用的组合、或用途、或方法、或者用于使用的溶瘤病毒，其中所述第一抗体分子包含重链恒定区SEQ ID NO:43和/或轻链恒定区SEQID NO:44。

18.根据权利要求1至12中任一项所述的用于使用的组合、或用途、或方法、或者用于使用的溶瘤病毒，其中所述第一抗体分子选自由伊匹木单抗和曲美木单抗组成的组。

19.根据任一项前述权利要求所述的用于使用的组合、或用途、或方法、或者用于使用的溶瘤病毒，其中所述第一抗体分子是能够与如权利要求13至18中任一项所定义的抗体分子竞争结合到CTLA-4的抗体分子。

20.根据任一项前述权利要求所述的用于使用的组合、或用途、或方法、或者用于使用的溶瘤病毒，其中所述第一抗体分子选自由全尺寸抗体、嵌合抗体、单链抗体、Fab、Fv、scFv、Fab'和(Fab')₂组成的组。

21.根据任一项前述权利要求所述的用于使用的组合、或用途、或方法、或者用于使用的溶瘤病毒，其中所述第一抗体分子选自由人IgG抗体、人源化IgG抗体和人源IgG抗体组成的组。

22.根据任一项前述权利要求所述的用于使用的组合、或用途、或方法、或者用于使用的溶瘤病毒，其中所述病毒包含编码如权利要求13至21中任一项所定义的第一抗体分子的核苷酸序列。

23.根据权利要求22所述的用于使用的组合、或用途、或方法、或者用于使用的溶瘤病毒，其中所述核苷酸序列包含选自由SEQ ID NO:45至52组成的组的序列，或者由选自由SEQID NO:45至52组成的组的序列组成。

24.根据任一项前述权利要求所述的用于使用的组合、或用途、或方法、或者用于使用的溶瘤病毒，其中所述第二抗体分子选自由人抗体分子、人源化抗体分子和人源抗体分子组成的组。

25.根据任一项前述权利要求所述的用于使用的组合、或用途、或方法、或者用于使用的溶瘤病毒，其中所述第二抗体分子是单克隆抗体分子或单克隆来源的抗体分子。

26.根据任一项前述权利要求所述的用于使用的组合、或用途、或方法、或者用于使用的溶瘤病毒，其中所述第二抗体分子选自由全尺寸抗体、嵌合抗体、单链抗体及其抗原结合片段组成的组。

27.根据任一项前述权利要求所述的用于使用的组合、或用途、或方法、或者用于使用的溶瘤病毒，其中所述第二抗体分子是人IgG抗体、人源化IgG抗体分子或人源IgG抗体分子。

28.根据任一项前述权利要求所述的用于使用的组合、或用途、或方法、或者用于使用的溶瘤病毒，其中所述第二抗体分子与PD1特异性结合，并且选自由以下项组成的组：派姆单抗、纳武单抗、西米普利单抗、卡瑞利珠单抗、斯巴达珠单抗、多塔利单抗、替雷利珠单抗、JTX-4014、信迪利单抗(IBI308)、特瑞普利单抗(JS 001)、AMP-224和AMP-514(MEDI0680)。

29.根据任一项前述权利要求所述的用于使用的组合、或用途、或方法、或者用于使用的第一抗体分子，其中所述第二抗体分子与PD-L1特异性结合，并且选自由以下项组成的组：阿特珠单抗、德瓦鲁单抗、阿维鲁单抗、CS1001、KN035(恩沃利单抗)和CK-301。

30.根据任一项前述权利要求所述的用于使用的组合、或用途、或方法、或者用于使用的溶瘤病毒，其中所述冷肿瘤是免疫遗弃肿瘤；

和/或免疫排斥肿瘤；和/或免疫浸润不良的肿瘤。

31.根据任一项前述权利要求所述的用于使用的组合、或用途、或方法、或者用于使用的溶瘤病毒，其中所述冷肿瘤选自由以下项组成的组：黑素瘤、胰腺癌、前列腺癌、结直肠癌、肝细胞癌、肺癌、膀胱癌、肾癌、胃癌、宫颈癌、梅克尔细胞癌、卵巢癌、头颈癌、间皮瘤和乳腺癌。

32.根据任一项前述权利要求所述的用于使用的组合、或用途、或方法、或者用于使用的溶瘤病毒，其中所述癌症：对使用与CTLA-4特异性结合的抗体分子的治疗有耐药性；对使用与PD1特异性结合的抗体分子的治疗有耐药性；或者对使用与PD-L1特异性结合的抗体分子的治疗有耐药性。

33.根据任一项前述权利要求所述的用于使用的组合、或用途、或方法、或者用于使用的溶瘤病毒，其中所述癌症：对使用与CTLA-4特异性结合的抗体分子和与PD1特异性结合的抗体分子的治疗有耐药性；或者对使用与CTLA-4特异性结合的抗体分子和与PD-L1特异性结合的抗体分子的治疗有耐药性；或者对使用与PD-1特异性结合的抗体分子和与PD-L1特异性结合的抗体分子的治疗有耐药性；或者对使用与CTLA-4特异性结合的抗体分子、与PD1特异性结合的抗体分子和与PD-L1特异性结合的抗体分子的治疗有耐药性。

34.根据任一项前述权利要求所述的用于使用的组合、或用途、或方法、或者用于使用的溶瘤病毒，其中所述患者先前已用与CTLA-4特异性结合的抗体分子、和/或与PD-1特异性结合的抗体分子、和/或与PD-L1特异性结合的抗体分子治疗，并且其中已发现所述患者对所述治疗有耐药性，或在所述治疗之后或期间已变得对所述治疗有耐药性。

35.基本上如本文参考所附编号段落、权利要求书、具体实施方式、实施例和附图所要求保护的用于使用的组合、或用途、或方法、或者用于使用的溶瘤病毒。