KR20230035026A - 엡스타인-바 바이러스를 표적하는 tcr-t 세포 요법 - Google Patents

엡스타인-바 바이러스를 표적하는 tcr-t 세포 요법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 엡스타인-바 바이러스(EBV) 항원을 인식하거나 이에 결합하는 T 세포 수용체, 유전적으로 조작된 세포 및 세포 기반 요법에 관한 것이다.

Description

엡스타인-바 바이러스를 표적하는 TCR-T 세포 요법
기술 분야
본 발명은 일반적으로 조작된 세포 및 이의 조성물, 특히, 유전적으로 조작된 T 세포 수용체(TCR)를 포함하는 T 세포에 관한 것이다. 이러한 조성물을 암 치료에 사용하는 방법도 본원에 개시되어 있다.
배경
엡스타인-바 바이러스(EBV)는 인간을 감염시킬 수 있는 헤르페스바이러스 계열의 구성원이다. EBV는 가장 일반적으로 체액, 주로 타액을 통해 전염된다. EBV는 모노라고도 불리는 전염성 단핵구증과 암을 비롯한 다른 질병을 일으킬 수 있다. EBV는 항원 활성화 B 세포의 자연 분화 경로를 모방하는 수명 주기를 진화시켜, 바이러스가 잠복 감염 부위에 접근할 수 있도록 한다. 증식 중인 감염된 B 세포에서, 엡스타인-바 바이러스(EBV)는 “성장” 또는 “잠복기 III” 프로그램인 유전자 발현 프로그램을 실행시킨다. 이러한 유형의 잠복기는 시험관내 EBV-유도된 림프모세포양 세포주(LCL), 이식 후 림프구증식성 질병(Brink AA, 1997, J Clin Pathol 50: 911-918.) 및 원발성 및 지속성 EBV 감염 동안 림프 기관들 내 EBV에 감염된 B 세포에서도 발견되는데, 여기서 이 프로그램은 감염된 세포의 증식을 통해 EBV 부하를 증폭시키는 것으로 생각된다(Young LS, 2004, Nat Rev Cancer 4: 757-768; Hochberg D, 2004, Proc Natl Acad Sci USA 101: 239-244). 잠복성 막 단백질(LMP1, LMP2A, LMP2B) 및 엡스타인-바 핵 항원(EBNA1, -2, -3A, -3B, -3C, -LP)으로 불리는 여러 면역원성 EBV 항원은 잠복기 III의 EBV-감염된 B 세포에서 발현된다.
EBV 감염은 특정 유형의 암과 관련이 있다. EBV DNA는 비인두암(Mutirangura et al., Clin Cancer Res. 4: 665-9 (1998); Lo et al., Cancer Res. 59: 1188-91 (1999)), 림프종(Lei et al., Br J Haematol. 111:239-46 (2000); Gallagher et al., Int J Cancer. 84: 442-8 (1999); Dronet et al., J Med Viral. 57: 383-9 (1999)), 유방암(Bonnet, M. et al., J. Natl. Cancer Inst., 91: 1376-1381 (1999)) 및 간세포 암종(Sugawara, Y. et al., Virology, 256: 196-202 (1999)) 환자에서 발견되어 왔다.
암에 대한 면역 요법의 한 방식인 입양 세포 전달(ACT)은 혈액 악성 종양 및 악성 흑색종 치료에 놀라운 성공을 거두었다. CD19 또는 GD2와 같은 종양 관련 항원(TAA)을 특이적으로 표적화하기 위해 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 유전적으로 변형된 T 세포를 사용하는 ACT의 한 형태는 B 세포 악성종양과 같은 질병을 치료하기 위한 임상 시험에서 고무적인 결과를 보여주었다. 혈액 악성 종양 환자에서 CAR-T 세포 요법의 이러한 문서화된 성공에도 불구하고, 고형 종양에 대해서는 완만한 반응만 관찰되었다. 따라서, EBV-유도된 암을 표적으로 하는 효능있는 TCR-T 세포 치료법이 필요하다.
요약
본 발명은 항-LMP2 TCR을 인코딩하는 핵산을 포함하는 조작된 T 세포를 제공하며, 여기서 항-LMP2 TCR은 종양 내 LMP2에 특이적으로 결합하는 유전적으로 조작된 T 세포 수용체(TCR)이다.
한 양상에서, 본원은 가변 알파(Va) 영역을 포함하는 알파 사슬 및 가변 베타(Vb) 영역을 포함하는 베타 사슬을 포함하는 T 세포 수용체(TCR) 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다. 일부 실시형태들에서, Va 영역은 상보성 결정 영역 1(CDR1), 상보성 결정 영역 2(CDR2), 및 상보성 결정 영역 3(CDR3)을 포함한다. 일부 실시형태에서, Va 영역의 CDR3은 아미노산 서열 X1GX2SGYSTL을 포함하고, 여기서 X1은 E, T, Q, V 또는 N이고; X2는 D, G, N 또는 E이다. 일부 실시형태에서, Vb 영역은 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다. 일부 실시형태에서, Vb 영역의 CDR3은 아미노산 서열 X3X4QGGX5X6X7X8을 포함하고, 여기서 X3은 S, T, N 또는 R이고; X4는 T, R, Y, G, V, Q, F, S 또는 P이고; X5는 N, G, H, T, S, A, I 또는 W이고; X6은 Y, N, D, E, R 또는 I이고; X7은 G, Q, N, Y이고, X8은 Y, F 또는 G이다.
일부 실시형태들에서, Va 영역은 인간 TRAV 유전자 분절 및 인간 TRAJ 유전자 분절을 재배열한 서열에 의해 인코딩되고, Vb 영역은 인간 TRBV 유전자 분절, 선택적으로 인간 TRBD 유전자 분절, 및 인간 TRBJ 유전자 분절을 재배열한 서열에 의해 인코딩된다. 일부 실시형태에서, TRAV 유전자 분절은 TRAV17이고; TRAJ 유전자 분절은 TRAJ11이고; TRBV 유전자 분절은 TRBV6-5이고; TRBD 유전자 분절은 TRBD1 또는 TRBD2이고; TRBJ 유전자 분절은 TRBJ2-1 또는 TRBJ1-2이다.
일부 실시형태에서, Va CDR1 영역은 TSINN(서열번호 1)에 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, Va CDR2 영역은 IRSNEY(서열번호 2)에 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, Vb CDR1 영역은 MNHEY(서열번호 4)에 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 그리고 Vb CDR2 영역은 SVGAGI(서열번호 5)에 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, Va CDR1 영역은 선택된 Va CDR1 아미노산 서열에 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, Va CDR2 영역은 선택된 Va CDR2 아미노산 서열에 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, Va CDR3 영역은 선택된 Va CDR3 아미노산 서열에 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, Vb CDR1 영역은 선택된 Vb CDR1 아미노산 서열에 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, Vb CDR2 영역은 선택된 Vb CDR2 아미노산 서열에 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, Vb CDR3 영역은 선택된 Vb CDR3 아미노산 서열에 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 선택된 Va CDR 1, 2 및 3 및 Vb CDR 1, 2 및 3 아미노산 서열은 다음 중 하나이다:
(1) 선택된 Va CDR 1, 2, 3 아미노산 서열은 각각 서열번호 1 내지 3에 제시되고, 선택된 Vb CDR 1, 2, 3 아미노산 서열은 각각 서열번호 4 내지 6에 제시되거나;
(2) 선택된 Va CDR 1, 2, 3 아미노산 서열은 각각 서열번호 7 내지 9에 제시되고, 선택된 Vb CDR 1, 2, 3 아미노산 서열은 각각 서열번호 10 내지 12에 제시되거나;
(2) 선택된 Va CDR 1, 2, 3 아미노산 서열은 각각 서열번호 13 내지 15에 제시되고, 선택된 Vb CDR 1, 2, 3 아미노산 서열은 각각 서열번호 16 내지 18에 제시되거나;
(4) 선택된 Va CDR 1, 2, 3 아미노산 서열은 각각 서열번호 19 내지 21에 제시되고, 선택된 Vb CDR 1, 2, 3 아미노산 서열은 각각 서열번호 22 내지 24에 제시되거나;
(5) 선택된 Va CDR 1, 2, 3 아미노산 서열은 각각 서열번호 25 내지 27에 제시되고, 선택된 Vb CDR 1, 2, 3 아미노산 서열은 각각 서열번호 28 내지 30에 제시되거나;
(6) 선택된 Va CDR 1, 2, 3 아미노산 서열은 각각 서열번호 31 내지 33에 제시되고, 선택된 Vb CDR 1, 2, 3 아미노산 서열은 각각 서열번호 34 내지 36에 제시되거나;
(7) 선택된 Va CDR 1, 2, 3 아미노산 서열은 각각 서열번호 37 내지 39에 제시되고, 선택된 Vb CDR 1, 2, 3 아미노산 서열은 각각 서열번호 40 내지 42에 제시되거나;
(8) 선택된 Va CDR 1, 2, 3 아미노산 서열은 각각 서열번호 43 내지 45에 제시되고, 선택된 Vb CDR 1, 2, 3 아미노산 서열은 각각 서열번호 46 내지 48에 제시되거나;
(9) 선택된 Va CDR 1, 2, 3 아미노산 서열은 각각 서열번호 49 내지 51에 제시되고, 선택된 Vb CDR 1, 2, 3 아미노산 서열은 각각 서열번호 52 내지 54에 제시되거나;
(10) 선택된 Va CDR 1, 2, 3 아미노산 서열은 각각 서열번호 61 내지 63에 제시되고, 선택된 Vb CDR 1, 2, 3 아미노산 서열은 각각 서열번호 64 내지 66에 제시되거나;
(11) 선택된 Va CDR 1, 2, 3 아미노산 서열은 각각 서열번호 67 내지 69에 제시되고, 선택된 Vb CDR 1, 2, 3 아미노산 서열은 각각 서열번호 70 내지 72에 제시되거나;
(12) 선택된 Va CDR 1, 2, 3 아미노산 서열은 각각 서열번호 73 내지 75에 제시되고, 선택된 Vb CDR 1, 2, 3 아미노산 서열은 각각 서열번호 76 내지 78에 제시되거나;
(13) 선택된 Va CDR 1, 2, 3 아미노산 서열은 각각 서열번호 79 내지 81에 제시되고, 선택된 Vb CDR 1, 2, 3 아미노산 서열은 각각 서열번호 82 내지 84에 제시되거나; 또는
(14) 선택된 Va CDR 1, 2, 3 아미노산 서열은 각각 서열번호 85 내지 87에 제시되고, 선택된 Vb CDR 1, 2, 3 아미노산 서열은 각각 서열번호 88 내지 90에 제시된다.
한 양상에서, 본원은 가변 알파(Va) 영역을 포함하는 알파 사슬을 포함하는 T 세포 수용체(TCR) 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다. 일부 실시형태들에서, Va 영역은 상보성 결정 영역 1(CDR-1), 상보성 결정 영역 2(CDR-2), 및 상보성 결정 영역 3(CDR-3)을 포함한다. 일부 실시형태들에서, Va CDR1 영역은 서열번호 55에 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, Va CDR2 영역은 서열번호 56에 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, Va CDR3 영역은 서열번호 57에 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태들에서, 가변 베타(Vb) 영역을 포함하는 베타 사슬을 추가로 포함하는 T 세포 수용체(TCR) 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에서 제공된다. 일부 실시형태들에서, Vb 영역은 상보성 결정 영역 1(CDR-1), 상보성 결정 영역 2(CDR-2), 및 상보성 결정 영역 3(CDR-3)을 포함한다. 일부 실시형태들에서, Vb CDR1 영역은 서열번호 58에 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, Vb CDR2 영역은 서열번호 59에 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, Vb CDR3 영역은 서열번호 60에 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, TCR 또는 이의 항원 결합 단편은 주조직 적합성 복합체(MHC) 분자에 의해 제시되는 LMP2의 펩티드 에피토프(FLYALALLL)(서열번호 139)에 결합하거나 이를 인식한다.
일부 실시형태에서, MHC 분자는 HLA-A2 분자이다.
일부 실시형태들에서, Va 영역은 인간 TRAV 유전자 분절 및 인간 TRAJ 유전자 분절을 재배열한 서열에 의해 인코딩되고, Vb 영역은 인간 TRBV 유전자 분절, 선택적으로 인간 TRBD 유전자 분절, 및 인간 TRBJ 유전자 분절을 재배열한 서열에 의해 인코딩된다. 일부 실시형태에서, TRAV 유전자 분절은 TRAV21이고; TRAJ 유전자 분절은 TRAJ33이고; TRBV 유전자 분절은 TRBV10-2이고; TRBD 유전자 분절은 TRBD1 또는 TRBD2이고; TRBJ 유전자 분절은 TRBJ2-7이다.
일부 실시형태에서, Va CDR1 영역은 서열번호 143에 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, Va CDR2 영역은 서열번호 144에 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, Va CDR3 영역은 서열번호 145에 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 그리고 일부 실시형태들에서, Vb CDR1 영역은 서열번호 146에 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, Vb CDR2 영역은 서열번호 147에 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, Vb CDR3 영역은 서열번호 148에 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, TCR 또는 이의 항원 결합 단편은 주조직 적합성 복합체(MHC) 분자에 의해 제시되는 LMP2의 펩티드 에피토프 CLGGLLTMV(서열번호 167) 및/또는 SLGGLLTMV(서열번호 168)에 결합하거나 이를 인식한다.
일부 실시형태에서, MHC 분자는 HLA-A2 분자이다.
한 양상에서, 본원은 가변 알파(Va) 영역을 포함하는 알파 사슬을 포함하는 T 세포 수용체(TCR) 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다. 일부 실시형태들에서, Va 영역은 상보성 결정 영역 1(CDR-1), 상보성 결정 영역 2(CDR-2), 및 상보성 결정 영역 3(CDR-3)을 포함한다. 일부 실시형태에서, Va CDR1 영역은 선택된 Va CDR1 아미노산 서열에 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, Va CDR2 영역은 선택된 Va CDR2 아미노산 서열에 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, Va CDR3 영역은 선택된 Va CDR3 아미노산 서열에 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 가변 베타(Vb) 영역을 포함하는 베타 사슬을 추가로 포함하는 TCR 또는 이의 항원-결합 단편이 본원에 제공된다. 일부 실시형태들에서, Vb 영역은 상보성 결정 영역 1(CDR-1), 상보성 결정 영역 2(CDR-2), 및 상보성 결정 영역 3(CDR-3)을 포함한다. 일부 실시형태에서, Vb CDR1 영역은 선택된 Vb CDR1 아미노산 서열에 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, Vb CDR2 영역은 선택된 Vb CDR2 아미노산 서열에 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, Vb CDR3 영역은 선택된 Vb CDR3 아미노산 서열에 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 선택된 Va CDR 1, 2 및 3 및 Vb CDR 1, 2 및 3 아미노산 서열은 다음 중 하나이다:
(1) 선택된 Va CDR 1, 2, 3 아미노산 서열은 각각 서열번호 91, 92, 93에 제시되고, 선택된 Vb CDR 1, 2, 3 아미노산 서열은 각각 서열번호 94, 95, 96에 제시되고;
(1) 선택된 Va CDR 2, 2, 3 아미노산 서열은 각각 서열번호 97, 98, 99에 제시되고, 선택된 Vb CDR 1, 2, 3 아미노산 서열은 각각 서열번호 100, 101, 102에 제시되고;
(3) 선택된 Va CDR 1, 2, 3 아미노산 서열은 각각 서열번호 103, 104, 105에 제시되고, 선택된 Vb CDR 1, 2, 3 아미노산 서열은 각각 서열번호 106, 107, 108에 제시되고; 그리고
(4) 선택된 Va CDR 1, 2, 3 아미노산 서열은 각각 서열번호 149, 150 및 151에 제시되고, 선택된 Vb CDR 1, 2, 3 아미노산 서열은 각각 서열번호 152, 153 및 154에 제시되고; 그리고
(5) 선택된 Va CDR 1, 2, 3 아미노산 서열은 각각 서열번호 155, 156 및 157에 제시되고, 선택된 Vb CDR 1, 2, 3 아미노산 서열은 각각 서열번호 158, 159 및 160에 제시된다.
일부 실시형태들에서, Va 영역은 인간 TRAV 유전자 분절 및 인간 TRAJ 유전자 분절을 재배열한 서열에 의해 인코딩되고, Vb 영역은 인간 TRBV 유전자 분절, 선택적으로 인간 TRBD 유전자 분절, 및 인간 TRBJ 유전자 분절을 재배열한 서열에 의해 인코딩된다. 일부 실시형태에서, TRAV 유전자 분절은 TRAV4, TRAV25, TRAV22 또는 TRAV6이고; TRAJ 유전자 분절은 TRAJ23, TRAJ47, TRAJ29, TRAJ43 또는 TRAJ11이고; TRBV 유전자 분절은 TRBV12-4, TRBV12-3, TRBV11-2, TRBV4-1 또는 TRBV11-2이고; TRBD 유전자 분절은 TRBD2이고; TRBJ 유전자 분절은 TRBJ1-1, TRBJ2-1, TRBJ2-5 또는 TRBJ2-7이다.
일부 실시형태에서, TCR 또는 이의 항원 결합 단편은 주조직 적합성 복합체(MHC) 분자에 의해 제시되는 LMP2의 펩티드 에피토프(SSCSSCPLSK)(서열번호 140)에 결합하거나 이를 인식한다.
일부 실시형태에서, MHC 분자는 HLA-A11 분자이다.
한 양상에서, 본원은 가변 알파(Va) 영역을 포함하는 알파 사슬을 포함하는 T 세포 수용체(TCR) 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다. 일부 실시형태들에서, Va 영역은 상보성 결정 영역 1(CDR-1), 상보성 결정 영역 2(CDR-2), 및 상보성 결정 영역 3(CDR-3)을 포함한다. 일부 실시형태에서, Va CDR1 영역은 선택된 Va CDR1 아미노산 서열에 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, Va CDR2 영역은 선택된 Va CDR2 아미노산 서열에 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, Va CDR3 영역은 선택된 Va CDR3 아미노산 서열에 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 가변 베타(Vb) 영역을 포함하는 베타 사슬을 추가로 포함하는 TCR 또는 이의 항원-결합 단편이 본원에 제공된다. 일부 실시형태들에서, Vb 영역은 상보성 결정 영역 1(CDR-1), 상보성 결정 영역 2(CDR-2), 및 상보성 결정 영역 3(CDR-3)을 포함한다. 일부 실시형태에서, Vb CDR1 영역은 선택된 Vb CDR1 아미노산 서열에 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, Vb CDR2 영역은 선택된 Vb CDR2 아미노산 서열에 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, Vb CDR3 영역은 선택된 Vb CDR3 아미노산 서열에 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 선택된 Va CDR 1, 2 및 3 및 Vb CDR 1, 2 및 3 아미노산 서열은 다음 중 하나이다:
(1) 선택된 Va CDR 1, 2, 3 아미노산 서열은 각각 서열번호 109, 110, 111에 제시되고, 선택된 Vb CDR 1, 2, 3 아미노산 서열은 각각 서열번호 112, 113, 114에 제시되거나; 또는
(2) 선택된 Va CDR 1, 2, 3 아미노산 서열은 각각 서열번호 115, 116, 117에 제시되고, 선택된 Vb CDR 1, 2, 3 아미노산 서열은 각각 서열번호 118, 119, 120에 제시된다.
일부 실시형태들에서, Va 영역은 인간 TRAV 유전자 분절 및 인간 TRAJ 유전자 분절을 재배열한 서열에 의해 인코딩되고, Vb 영역은 인간 TRBV 유전자 분절, 선택적으로 인간 TRBD 유전자 분절, 및 인간 TRBJ 유전자 분절을 재배열한 서열에 의해 인코딩된다. 일부 실시형태에서, TRAV 유전자 분절은 TRAV12-1이고; TRAJ 유전자 분절은 TRAJ21이고; TRBV 유전자 분절은 TRBV20-1이고; TRBD 유전자 분절은 TRBD1이고; TRBJ 유전자 분절은 TRBJ2-5 또는 TRBJ2-3이다.
일부 실시형태에서, TCR 또는 이의 항원 결합 단편은 주조직 적합성 복합체(MHC) 분자에 의해 제시되는 LMP2의 펩티드 에피토프(IYVLVMLVL)(서열번호 141)에 결합하거나 이를 인식한다.
한 양상에서, 본원은 가변 알파(Va) 영역을 포함하는 알파 사슬을 포함하는 T 세포 수용체(TCR) 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다. 일부 실시형태들에서, Va 영역은 상보성 결정 영역 1(CDR-1), 상보성 결정 영역 2(CDR-2), 및 상보성 결정 영역 3(CDR-3)을 포함한다. 일부 실시형태에서, Va CDR1 영역은 선택된 Va CDR1 아미노산 서열에 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, Va CDR2 영역은 선택된 Va CDR2 아미노산 서열에 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, Va CDR3 영역은 선택된 Va CDR3 아미노산 서열에 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 가변 베타(Vb) 영역을 포함하는 베타 사슬을 추가로 포함하는 TCR 또는 이의 항원-결합 단편이 본원에 제공된다. 일부 실시형태들에서, Vb 영역은 상보성 결정 영역 1(CDR-1), 상보성 결정 영역 2(CDR-2), 및 상보성 결정 영역 3(CDR-3)을 포함한다. 일부 실시형태에서, Vb CDR1 영역은 선택된 Vb CDR1 아미노산 서열에 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, Vb CDR2 영역은 선택된 Vb CDR2 아미노산 서열에 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, Vb CDR3 영역은 선택된 Vb CDR3 아미노산 서열에 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 선택된 Va CDR 1, 2 및 3 및 Vb CDR 1, 2 및 3 아미노산 서열은 다음 중 하나이다:
(1) 선택된 Va CDR 1, 2, 3 아미노산 서열은 각각 서열번호 121, 122, 123에 제시되고, 선택된 Vb CDR 1, 2, 3 아미노산 서열은 각각 서열번호 124, 125, 126에 제시되거나;
(2) 선택된 Va CDR 1, 2, 3 아미노산 서열은 각각 서열번호 127, 128, 129에 제시되고, 선택된 Vb CDR 1, 2, 3 아미노산 서열은 각각 서열번호 130, 131, 132에 제시되거나;
(3) 선택된 Va CDR 1, 2, 3 아미노산 서열은 각각 서열번호 133, 134, 135에 제시되고, 선택된 Vb CDR 1, 2, 3 아미노산 서열은 각각 서열번호 136, 137, 138에 제시되거나; 또는
(4) 선택된 Va CDR 1, 2, 3 아미노산 서열은 각각 서열번호 161, 162 및 163에 제시되고, 선택된 Vb CDR 1, 2, 3 아미노산 서열은 각각 서열번호 164, 165 및 166에 제시된다.
일부 실시형태들에서, Va 영역은 TCR 알파 가변(TRAV) 유전자 분절 및 TCR 알파 결합(TRAJ) 유전자 분절을 재배열한 서열에 의해 인코딩되고, Vb 영역은 TCR 베타 가변(TRBV) 유전자 분절, 선택적으로 TCR 베타 다양성(TRBD) 유전자 분절, 및 TCR 베타 결합(TRBJ) 유전자 분절을 재배열한 서열에 의해 인코딩된다. 일부 실시형태에서, TRAV 유전자 분절은 TRAV25, TRAV12-3, 또는 TRAV21이고; TRAJ 유전자 분절은 TRAJ16, TRAJ3, TRAJ35이고; TRBV 유전자 분절은 TRBV6-6, TRBV24-1 또는 TRBV30이고; TRBD 유전자 분절은 TRBD1 또는 TRBD2이고; TRBJ 유전자 분절은 TRBJ1-1, TRBJ2-5, TRBJ2-3 또는 TRBJ2-7이다.
일부 실시형태에서, TCR 또는 이의 항원 결합 단편은 주조직 적합성 복합체(MHC) 분자에 의해 제시되는 LMP2의 펩티드 에피토프(TYGPVFMCL)(서열번호 142)에 결합하거나 이를 인식한다.
일부 실시형태에서, MHC 분자는 HLA-A24 분자이다.
일부 실시형태들에서, 알파 사슬은 마우스 알파 사슬 불변 영역을 포함하고, 베타 사슬은 마우스 베타 사슬 불변 영역을 포함한다.
일부 실시형태들에서, 알파 사슬은 인간 알파 사슬 불변 영역을 포함하고, 베타 사슬은 인간 베타 사슬 불변 영역을 포함한다.
일부 실시형태에서, TCR 또는 이의 항원 결합 단편은 T 세포의 표면에서 발현될 때 표적 암 세포에 대한 세포독성 활성을 자극한다. 일부 실시형태에서, 표적 암 세포는 LMP2를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하거나 LMP2를 발현한다.
한 양상에서, 본원에 기재된 TCR 또는 이의 항원-결합 단편을 인코딩하는 핵산을 포함하는 벡터가 본원에 제공된다.
한 양상에서, 다음을 포함하는 벡터가 본원에 제공된다: a) 인간 항-LMP2 TCR의 알파 사슬 가변 영역 및 알파 사슬 불변 영역을 포함하는 TCR 알파 사슬을 인코딩하는 제1 핵산 서열; 그리고 b) 인간 항-LMP2 TCR의 베타 사슬 가변 영역 및 베타 사슬 불변 영역을 포함하는 TCR 베타 사슬을 인코딩하는 제2 핵산 서열. 일부 실시형태에서, TCR 알파 사슬 및 TCR 베타 사슬은 본원에 기재된 TCR 또는 이의 항원 결합 단편을 형성한다.
일부 실시형태에서, 제1 핵산 서열 및 제2 핵산 서열은 링커 서열에 의해 연결된다. 일부 실시형태에서, 링커 서열은 P2A 서열이다.
일부 실시형태들에서, 벡터는 발현 벡터, 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 벡터이다. 일부 실시형태들에서, 레트로바이러스 벡터는 pMP71이다.
한 양상에서, 본원에 기재된 벡터를 포함하는 조작된 세포가 본원에 제공된다.
한 양상에서, 본원에 기재된 TCR 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 조작된 세포가 본원에 제공된다.
일부 실시형태들에서, TCR 또는 이의 항원 결합 단편은 상기 세포에 대해 이종이다.
일부 실시형태들에서, 조작된 세포는 세포주이다.
일부 실시형태들에서, 조작된 세포는 대상체(예를 들어, 인간 대상체)로부터 수득된 일차 세포이다.
일부 실시형태에서, 조작된 세포는 T 세포이다. 일부 실시형태에서, T-세포는 인간 대상체로부터 단리된다. 일부 실시형태에서, T 세포는 CD8+이다. 일부 실시형태에서, T 세포는 CD4+이다.
일부 실시형태에서, 조작된 세포는 이중기능성 트랩 단백질을 발현한다. 일부 실시형태들에서, 이중기능성 트랩 단백질은 체크포인트 억제제(예를 들어, PD-1) 및 형질전환 성장 인자 베타 계열의 구성원(예를 들어, TGF-β)을 표적으로 한다.
일부 실시형태들에서, 조작된 세포는 체크포인트 억제제(예를 들어, PD-1)를 표적으로 하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 발현한다.
일부 실시형태들에서, 형질전환 성장 인자 베타 계열의 구성원(예를 들어, TGF-β)에 결합하는 단백질을 발현한다.
한 양상에서, 본원에 기재된 벡터를 시험관내 또는 생체외에서 세포에 도입하는 것을 포함하는, 조작된 세포의 생산 방법이 제공된다. 일부 실시형태들에서, 도입 단계는 형질도입에 의해 수행된다.
한 양상에서, 본원에 기재된 조작된 세포를 EBV와 연관된 질병 또는 장애를 갖는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 질병 또는 장애의 치료 방법이 제공된다. 일부 실시형태들에서, EBV와 연관된 질병 또는 장애는 암이다.
한 양상에서, 대상체의 종양 치료 방법이 본원에 제공되며, 상기 방법은 종양 내 항원에 특이적으로 결합하는 본원에 기재된 TCR 또는 이의 항원-결합 단편을 인코딩하는 핵산을 포함하는 조작된 T 세포를, 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
한 양상에서, 대상체의 종양 치료 방법이 본원에 제공되며, 상기 방법은 (a) 종양 내 항원에 특이적으로 결합하는 본원에 기재된 TCR 또는 이의 항원-결합 단편을 인코딩하는 핵산을 포함하는 조작된 T 세포; 및 (b) 전환 성장 인자 베타 계열의 구성원(예를 들어, TGF-β)에 결합하는 단백질 및 체크포인트 억제제 중 하나 또는 둘 모두를, 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
한 양상에서, 대상체의 종양 치료 방법이 본원에 제공되며, 상기 방법은 (a) 종양 내 항원에 특이적으로 결합하는 본원에 기재된 TCR 또는 이의 항원-결합 단편을 인코딩하는 핵산을 포함하는 조작된 T 세포; 및 (b) 전환 성장 인자 베타 계열의 구성원(예를 들어, TGF-β) 및 체크포인트 억제제를 표적하는 이중기능성 트랩 단백질을, 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
일부 실시형태에서, 종양은 EBV-관련 종양이다.
일부 실시형태들에서, 본원에 기재된 암 또는 EBV-관련 종양은 버킷 림프종, 면역억제성 림프종, 미만성 거대 B 세포 림프종, 만성 염증과 관련된 미만성 거대 B 세포 림프종, 림프종양 육아종증, 형질모세포성 림프종, 원발성 삼출 림프종, 이식 후 림프증식성 장애, 비인두 암종, 위 선암종, 림프상피종 관련 암종, 면역결핍 관련 평활근육종 또는 호지킨 림프종이다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 발명에서 사용하기 위한 방법 및 물질들이 본원에 기재되어 있으며; 당업계에 공지된 다른 적합한 방법 및 물질 또한 사용될 수 있다. 재료, 방법 및 실시예들은 단지 설명을 위한 것이며 제한을 하고자 하는 것이 아니다. 본원에서 언급된 모든 공보, 특허 출원, 특허, 서열, 데이터베이스 항목, 및 기타 참조문헌은 그 전체가 원용된다. 상충되는 경우, 정의를 비롯하여 본원의 내용이 우선한다.
본 발명의 그 외 다른 특징 및 이점들은 하기 상세한 설명 및 도면, 그리고 청구범위로부터 명확해 질 것이다.
도면의 설명
예시적인 실시예는 참조 도면에 도시되어 있다. 본 명세서에 개시된 실시예 및 도면은 제한적이라기보다는 예시적인 것으로 간주되어야 한다.
도 1은 pMP71 레트로바이러스 벡터 구조체를 보여주는 개략도이다. P2A는 2A 자가 절단 펩티드를 인코딩한다: Va는 인간 항-LMP2 TCR의 알파 사슬의 가변 영역을 인코딩하고; Vb는 동일한 인간 항-LMP2 TCR의 베타 사슬의 가변 영역을 인코딩하고; Ca는 마우스 TCR 알파 사슬의 불변 영역을 인코딩하고; Cb는 마우스 TCR 베타 사슬의 불변 영역을 인코딩한다. ψ는 바이러스의 패키징 순서를 나타낸다. 5'LTR 및 3'LTR은 긴 말단 반복서열이다.
도 2는 HLA-A2 유형 항-LMP2 TCR의 서열을 보여주는 표이다. CDR1α, CDR2α 및 CDR3α는 각각 TCR 알파 사슬의 CDR1, CDR2 및 CDR3이다. CDR1β, CDR2β 및 CDR3β는 각각 TCR 베타 사슬의 CDR1, CDR2 및 CDR3이다. TRA_VJ는 항-LMP2 TCR의 알파 사슬을 인코딩하는 재배열된 V 및 J 분절이다. TRB_VDJ는 항-LMP2 TCR의 베타 사슬을 인코딩하는 재배열된 V, D 및 J 분절이다. 표적 에피토프는 LMP2 단백질의 TCR 표적화 에피토프의 아미노산 위치를 보여준다.
도 3은 HLA-A11 유형의 항-LMP2 TCR의 서열들을 보여주는 표이다.
도 4는 HLA-A24 유형의 항-LMP2 TCR의 서열들을 보여주는 표이다.
도 5A-5C는 재조합 TCR을 인코딩하는 구조체가 형질도입된 Jurkat 세포에서 HLA-A2 유형의 항-LMP2 TCR의 시험관내 발현을 나타내는 일련의 그래프이다. CD3를 염색하고 생존가능한 CD3+ 림프구 게이팅 전략을 사용했다. 형질도입되지 않은(UT) 세포를 음성 대조군으로 사용했다.
도 5D는 재조합 TCR을 인코딩하는 구조체가 형질도입된 일차 인간 T 세포에서 HLA-A2 유형의 항-LMP2 TCR의 시험관내 발현을 나타내는 일련의 그래프이다. CD3 및 CD8을 동시에 염색하고 생존가능한 CD3+ 림프구 게이팅 전략을 사용했다. 형질도입되지 않은(UT) 세포를 음성 대조군으로 사용했다.
도 5E는 재조합 TCR을 인코딩하는 구조체가 형질도입된 일차 인간 T 세포에서 HLA-A2 유형의 항-LMP2 TCR L208의 시험관내 발현을 나타내는 그래프이다. CD3 및 CD8을 동시에 염색하고 생존가능한 CD3+ 림프구 게이팅 전략을 사용했다. 형질도입되지 않은(UT) 세포를 음성 대조군으로 사용했다.
도 6A-6C는 항원-특이적 자극된 TCR-Jurkat 세포의 표면 CD69 발현을 나타내는 그래프이다. CD3+ TCR+ 세포를 분석하였다. 형질도입되지 않은(UT) 세포를 음성 대조군으로 사용했다(Ctrl).
도 6D는 항원-특이적 자극된 TCR-T 세포에서 세포내 IFN-γ 발현을 나타내는 일련의 그래프이다. CD3+ CD8+ 세포들을 분석하였다. 형질도입되지 않은(UT) 세포를 음성 대조군으로 사용했다.
도 6E는 항원-특이적 자극된 TCR-T 세포에서 세포내 IFN-γ 발현을 나타내는 그래프이다. CD3+ CD8+ 세포들을 분석하였다. 형질도입되지 않은(UT) 세포를 음성 대조군으로 사용했다. 항원은 LMP2 단백질의 돌연변이 펩티드(서열번호 168)이다.
도 6F-6G는 HLA-A2 유형의 항-LMP2 TCR L208을 발현하는 TCR-T 세포의 활성화 곡선을 보여준다. 증가하는 농도의 동족 야생형 또는 돌연변이체 LMP2 펩티드를 사용하여 L208 재조합 TCR을 발현하는 TCR-T 세포에 대한 EC50을 결정하였다.
도 7A-7B는 재조합 TCR을 인코딩하는 구조체가 형질도입된 일차 T 세포에서 HLA-A11 유형의 항-LMP2 TCR의 시험관내 발현을 나타내는 그래프이다. CD3 및 CD8을 동시에 염색하고 생존가능한 CD3+ 림프구 게이팅 전략을 사용했다. 형질도입되지 않은(UT) 세포를 음성 대조군으로 사용했다.
도 8A-8B는 항원-특이적 자극된 TCR-T 세포에서 세포내 IFN-γ 발현을 나타내는 그래프이다. CD3+ CD8+ 세포들을 분석하였다. 형질도입되지 않은(UT) 세포를 음성 대조군으로 사용했다.
도 8C-8D는 항원-특이적 자극된 TCR-T 세포에서 표면 CD69 발현을 나타내는 그래프이다. CD3+ CD8+ 세포들을 분석하였다. 형질도입되지 않은(UT) 세포를 음성 대조군으로 사용했다.
도 9는 HLA-A11 유형의 항-LMP2 TCR을 발현하는 TCR-T 세포의 활성화 곡선을 보여준다. 증가하는 농도의 동족 LMP2 펩티드를 사용하여 L11-3 또는 L11-6 재조합 TCR을 발현하는 TCR-T 세포에 대한 EC50을 결정하였다.
도 10A는 재조합 TCR을 인코딩하는 구조체가 형질도입된 일차 인간 T 세포에서 HLA-A24 유형의 항-LMP2 TCR의 시험관내 발현을 나타내는 일련의 그래프이다. CD3 및 CD8을 동시에 염색하고 생존가능한 CD3+ 림프구 게이팅 전략을 사용했다. 형질도입되지 않은(UT) 세포를 음성 대조군으로 사용했다.
도 10B는 재조합 TCR을 인코딩하는 구조체가 형질도입된 Jurkat 세포에서 HLA-A24 유형의 항-LMP2 TCR의 시험관내 발현을 나타내는 일련의 그래프이다. CD3를 염색하고 생존가능한 CD3+ 림프구 게이팅 전략을 사용했다. 음성 대조군(Ctrl)을 사용했다.
도 10C는 재조합 TCR을 인코딩하는 구조체가 형질도입된 일차 인간 T 세포에서 HLA-A24 유형의 항-LMP2 TCR의 시험관내 발현을 나타내는 일련의 그래프이다. CD3 및 CD8을 동시에 염색하고 생존가능한 CD3+ 림프구 게이팅 전략을 사용했다. 형질도입되지 않은(UT) 세포를 음성 대조군으로 사용했다.
도 11A-11C는 항원-특이적 자극된 TCR-T 세포에서 세포내 IFN-γ 발현을 나타내는 일련의 그래프이다. CD3+ CD8+ 세포들을 분석하였다. 형질도입되지 않은(UT) 세포를 음성 대조군으로 사용했다.
도 11D는 항원-특이적 자극된 TCR-Jurkat 세포의 표면 CD69 발현을 나타내는 일련의 그래프이다. CD3+ TCR+ 세포를 분석하였다. 음성 대조군(Ctrl)을 사용했다.
도 12A는 HLA-A24 유형의 항-LMP2 TCR을 발현하는 TCR-T 세포의 활성화 곡선을 보여준다. 증가하는 농도의 동족 LMP2 펩티드를 사용하여 L24-49 또는 L24-2 재조합 TCR을 발현하는 TCR-T 세포에 대한 EC50을 결정하였다.
도 12B는 HLA-A24 유형의 항-LMP2 TCR을 발현하는 TCR-T 세포의 활성화 곡선을 보여준다. 증가하는 농도의 동족 LMP2 펩티드를 사용하여 L24-3 또는 L24-13 재조합 TCR을 발현하는 TCR-T 세포에 대한 EC50을 결정하였다.
도 13은 TCRdist 방법을 이용한 모티프 분석을 보여준다. 30개의 TCR 클론으로 구성된 클론 클러스터가 식별되었다(직사각형으로 표시됨). 클러스터의 14개의 테스트 클론을 사용하여 서열 정렬을 수행했다. TRA의 CDR3 및 TRB의 CDR3 내의 모티프를 강조 표시한다.
도 14는 머신 러닝법(서포트 벡터 머신)에 기반한 모티프 분석을 보여준다. 왼쪽 상단 표는 제작된 모티프의 예와 모티프 길이가 3 또는 4인 개수를 보여준다. 오른쪽 상단에서. 오른쪽 상단 표에는 입력 파일의 예를 보여준다. 각각의 양성 또는 음성 TCR 클론에 대해, 해당 모티프가 포함된 경우 불리언 값 1이 할당되고 해당 모티프가 포함되지 않은 경우 0이 할당되었다. 아래 표에서, ROC 곡선 아래 면적(AUC) 값과 서포트 벡터 머신(SVM) 중요도 점수가 상위 순위 모티프에 대해 계산되었다.
도 15는 피셔 정확 및 크래머의 V 검정(Fisher exact and Cramer's V test) 결과를 보여준다. P 값, 피셔 정확 검정에 의해 보정된 P 값 및 크래머의 V 검정에 의한 크래머 중요도 점수가 상위 순위 모티프에 대해 계산되었다.
도 16A는 TCR 베타 사슬의 CDR3 내부에 많이 농축된 모티프를 보여준다.
도 16B는 TCR 알파 사슬의 CDR3 내부에 많이 풍부해진 모티프를 보여준다.
도 17A는 TCR 베타 사슬 모티프 “QGG”의 수신자 조작 특성(ROC) 곡선을 나타낸다. 민감도는 모티프 QGG가 있음에 의해 정확하게 식별되는 실제 양성의 비율을 나타낸다. 특이도는 모티프 QGG가 없음에 의해 정확하게 식별되는 실제 음성의 비율을 나타낸다.
도 17B는 TCR 알파 사슬 모티프 “YST”의 ROC 곡선을 보여준다.
도 17C는 TCR 알파 사슬 모티프 “SGY”의 ROC 곡선을 보여준다.
도 18은 본 발명에 기재된 서열을 제공한다.
상세한 설명
하기 실시예 및 이의 양상들을, 그 범위를 제한하는 것이 아니라 예시 및 설명하고자 제공되는 시스템, 조성물 및 방법과 함께 설명하고 예시한다.
정의
본원에서 사용되는 용어 “포함하는” 또는 “포함하다”는 실시형태예에 유용한 조성물, 방법 및 이들의 각각의 구성요소(들)와 관련하여 사용되지만, 유용하든 그렇지 않든 간에 불특정 요소를 포함할 수 있다. 일반적으로 본 명세서에서 사용되는 용어는 일반적으로 “개방형” 용어로 사용하고자 한다는 것을 당업자는 이해할 것이다(예를 들어, 용어 “포함하는”은 “포함하지만 이에 제한되지 않는”으로 해석되어야 하며, 용어 “갖는”은 “적어도 갖는”으로 해석되어야 하며, 용어 “포함하다”는 “포함하지만 이에 제한되지 않는” 등으로 해석되어야 한다.).
달리 명시되지 않는 한, 본원(특히 청구항에서)의 특정 실시형태를 설명함에 사용되는 용어 “하나” 및 “그것” 그리고 유사한 용어들은 단수 및 복수형 모두를 포함하는 것으로 해석될 수 있다. 본 출원에서 수치 범위의 언급은 해당 범위에 속하는 각각의 별도 수치를 개별적으로 언급하는 간단한 기재 방법으로 제공하고자 하는 것에 불과하다. 본 출원에 달리 언급이 없는 한, 각각의 개개의 값은 마치 본 출원에서 개별적으로 언급된 것처럼 명세서에 포함된다. 본 출원에 달리 언급이 없는 한 또는 내용상 달리 명확하게 반대의 언급이 없는 한, 본 출원에 기재된 모든 방법들은 임의의 적합한 순서로 실시될 수 있다. 본 문서의 특정 실시형태와 관련하여 제공되는 모든 실시예 또는 예시적인 언어(예를 들어, “~와 같은”)의 사용은 단지 본 발명을 더 잘 설명하기 위한 것이며 달리 청구범위에 기재된 본 발명의 범위를 제한하지 않는다. 약어 “예를 들어,”는 라틴어 exempli gratia에서 유래하였으며, 비제한적 예를 나타내기 위해 본원에서 사용된다. 따라서 약어 “예를 들어,”는 “예를 들어”라는 용어와 동의어이다. 명세서의 어떠한 언어도 본 발명의 실시에 필수적인 비-청구범위 기재 요소를 나타내는 것으로 해석되어서는 안된다.
본 명세서에서 용어 “약”은 양, 지속시간 등 측정 가능한 값을 의미하며, 지정된 값에서 ±20%, ±10%, ±5%, ±1%, ±0.5% 또는 ±0.1% 등의 변동을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 “항체”는 적어도 하나(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개)의 면역글로불린 상보성 결정 영역(CDR)(예를 들어, 면역글로불린 경쇄의 3개의 CDR 또는 면역글로불린 중쇄의 3개의 CDR 중 어느 하나)을 함유하며 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 항원 결합 분자를 지칭한다. 항체의 비제한적 예는 단일클론 항체, 다클론 항체, 다중특이성 항체(예를 들어, 이중특이성 항체), 단일 사슬 항체, 키메라 항체, 인간 항체 및 인간화 항체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체는 인간 항체의 Fc 영역을 함유할 수 있다. 용어 항체는 또한 유도체, 예를 들어, 이중특이성 항체, 단일 사슬 항체, 디아바디, 선형 항체 및 항체 단편들로부터 형성된 다중특이성 항체를 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 “항원-결합 단편”은 항체의 일부가 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 전장 항체의 일부를 지칭한다. 일부 실시형태들에서, 항원-결합 단편은 적어도 하나의 가변 도메인(예를 들어, 중쇄의 가변 도메인 또는 경쇄의 가변 도메인)을 함유한다. 항체 단편의 비제한적 예는 예를 들어, Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편을 포함한다.
본원에 사용된 “단일 사슬 가변 단편”, “단일 사슬 항체 가변 단편” 또는 “scFv” 항체는 링커 펩티드에 의해 연결된, 중쇄(VH) 및 경쇄(VL)의 가변 영역들만을 포함하는 항체들의 형태를 지칭한다. scFv는 단일 사슬 폴리펩티드로서 발현될 수 있다. scFv는 유래된 온전한 항체의 특이성을 유지한다. 경쇄 및 중쇄 가변 영역은 표적 항원에 대한 scFv의 특이성이 유지되는 한 임의의 순서, 예를 들어, VH-링커-VL 또는 VL-링커-VH 일 수 있다.
용어 “결합 단백질”은 단백질 결합 도메인(예를 들어, 사이토카인, 사이토카인 수용체), 항체 단편(예를 들어, Fab, scFv, 디아바디, 가변 도메인 유래 결합제, VHH 나노바디), 대체 스캐폴드 유래 단백질 결합 도메인(예를 들어, Fn3 변이체, 안키린 반복 변이체, 센티린 변이체, 아비머, 아피바디) 또는 특정 항원을 인식하는 모든 단백질을 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 “항원”은 MHC 분자에 의해 제시되는 경우 항체 또는 T 세포 수용체(TCR)에 의해 결합될 수 있는 분자를 지칭한다. 본원에서 사용되는 용어 “항원”은 또한 T-세포 수용체에 의해 인식되는 T-세포 에피토프를 포함한다. 이러한 인식은 T 세포의 활성화와 후속 효과기 메커니즘, 예를 들어, T 세포의 증식, 사이토카인 분비 등을 유발할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 “EBV 항원”은 엡스타인-바 바이러스(EBV)로부터 유래된 폴리펩티드 분자를 지칭한다. EBV 항원에는, 잠복성 막 단백질(LMP1, LMP2A 및 LMP2B) 및 엡스타인-바 핵 항원(EBNA1, -2, -3A, -3B, -3C, -LP)이 포함되지만 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 용어 “말초 혈액 세포 아형”은 호산구, 호중구, T 세포, 단핵구, K 세포, 과립구 및 B 세포를 포함하는(그러나 이에 제한되지 않음) 말초 혈액에서 일반적으로 발견되는 세포 유형을 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 “T 세포”는 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포를 포함한다. 용어 T 세포는 또한 T 헬퍼 1형 T 세포와 T 헬퍼 2형 T 세포를 모두 포함한다. T 세포는 표적 세포 표면의 특정 항원 부분을 인식하는 세포 표면 수용체를 발현한다. 세포 표면 수용체는 야생형 또는 재조합 T 세포 수용체(TCR), 키메라 항원 수용체(CAR), 또는 표적 세포와 관련된 항원 모이어티를 인식할 수 있는 임의의 다른 표면 수용체일 수 있다. 일반적으로 TCR에는 두 개의 단백질 사슬(알파 사슬과 베타 사슬)이 있으며, 이는 특정 세포 표면의 MHC 단백질에 의해 제시된 특이적 펩티드에 결합한다. TCR은 표적 세포의 표면에 발현된 MHC 분자와 관련하여 펩티드를 인식한다. 일부 실시형태들에서, TCR은 또한 암 세포의 표면에 직접 제시된 암 항원을 인식할 수 있다.
본원에서 사용된 “유전자 변형 세포”, “조작된 세포”, “유전적으로 조작된 세포” 또는 “변형 세포”는 유전적으로 변형된 세포를 지칭한다. 일부 실시형태들에서, 유전적으로 조작된 세포는 유전적으로 조작된 항원 수용체 및/또는 체크포인트 억제제를 발현할 수 있다. 일부 실시형태에서, 유전적으로 변형된 세포는 유전적으로 조작된 TCR을 인코딩하는 벡터 및/또는 하나 이상의 체크포인트 억제제를 인코딩하는 벡터를 포함한다. 일부 실시형태들에서, 유전적으로 변형된 세포는 유전적으로 조작된 TCR 및 하나 이상의 체크포인트 억제제를 인코딩하는 벡터를 포함한다. 한 실시형태에서, 유전적으로 변형된 세포는 T 림프구(T 세포)이다. 일부 실시형태에서, 유전적으로 변형된 세포는 자연 살해(NK) 세포이다.
본원에서 사용되는 용어 “벡터”, “클로닝 벡터” 또는 “발현 벡터”는 폴리뉴클레오티드 서열(예를 들어, 외래 유전자)을 숙주 세포에 도입할 수 있는 비히클을 지칭한다. 벡터에는 플라스미드, 파지, 바이러스 등이 포함된다. 가장 널리 사용되는 벡터 유형은 관심 유전자를 포함하는 추가 DNA 분절들이 결찰될 수 있는 폐쇄형 원형 이중 가닥 DNA 루프를 지칭하는 “플라스미드”이다. 또 다른 유형의 벡터는 바이러스 벡터로서, 여기서 수송될 핵산 구조체는 바이러스 게놈에 결찰되어 있다. 바이러스 벡터는 이들이 도입된 숙주 세포에서 자가 복제가 가능하거나 숙주 세포의 게놈에 통합되어 숙주 게놈과 함께 복제될 수 있다. 또한, 특정 벡터는 작동 가능하게 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터를 본 명세서에서 “재조합 발현 벡터” 또는 간단히 “발현 벡터”라고 지칭한다. 바이러스 벡터(예를 들어, 복제 결함 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노 관련 바이러스)와 같은 일부 다른 형태의 발현 벡터가 사용될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 “레트로바이러스 벡터” 또는 “재조합 레트로바이러스 벡터”는 특정 실시형태 내에서 관심 핵산 분자의 발현을 지시할 수 있는 핵산 구조체를 지칭한다. 레트로바이러스는 바이러스 캡슐에 RNA 형태로 존재하며 숙주 세포에서 복제할 때 이중 가닥 DNA 중간체를 형성한다. 마찬가지로, 레트로바이러스 벡터는 RNA 및 이중 가닥 DNA 형태로 존재하며, 두 형태 모두 “레트로바이러스 벡터” 및 “재조합 레트로바이러스 벡터”라는 용어에 포함된다. 용어 “레트로바이러스 벡터” 및 “재조합 레트로바이러스 벡터”는 또한 재조합 DNA 단편을 함유하는 DNA 형태 및 재조합 RNA 단편을 함유하는 RNA 형태를 포함한다. 벡터는 적어도 하나의 전사 프로모터/인핸서, 또는 유전자 발현을 제어하는 다른 요소를 포함할 수 있다. 이러한 벡터는 또한 패키징 신호, 긴 말단 반복서열(LTR) 또는 그 일부, 사용된 레트로바이러스에 적절한 양성 및 음성 가닥 프라이머 결합 부위(레트로바이러스 벡터에 이미 존재하지 않는 경우)를 포함할 수 있다. 선택적으로, 벡터는 또한 폴리아데닐화를 지시하는 신호, 암피실린 내성, 네오마이신 내성, TK, 히그로마이신 내성, 플레오마이신 내성 히스티디놀 내성 또는 DHFR과 같은 선별가능한 마커, 뿐만 아니라 하나 이상의 제한 부위 및 번역 종결 서열을 포함할 수 있다. 예로서, 이러한 벡터는 5' LTR, 리딩 서열, tRNA 결합 부위, 패키징 신호, 제2 가닥 DNA 합성의 기점 및 3' LTR 또는 이의 일부를 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 “링커”(L) 또는 “링커 도메인” 또는 “링커 영역”은 길이가 약 1 내지 100개 아미노산인 올리고- 또는 폴리펩티드 영역을 지칭하며, 이는 TCR의 도메인/영역을 본원에 기재된 바와 같이 함께 연결한다. 링커는 인접한 단백질 도메인들이 서로에 대해 자유롭게 이동할 수 있도록 글리신 및 세린과 같은 유연한 잔기로 구성될 수 있다. 두 개의 인접한 도메인들이 서로 입체적으로 간섭하지 않도록 하는 것이 바람직할 때 더 긴 링커를 사용할 수 있다. 링커는 절단가능하거나 절단 불가능할 수 있다. 절단가능한 링커의 예는 2A 링커(예를 들어, T2A), 2A-유사 링커 또는 이의 기능적 균등물 및 이의 조합을 포함한다. 일부 실시형태에서, 링커는 피코나바이러스 2A-유사 링커, 돼지 테스코바이러스(P2A)의 CHYSEL 서열, 테세아 아시그나 바이러스(T2A) 또는 이들의 조합, 변이체 및 기능적 균등물을 포함한다. 다른 실시형태에서, 링커 서열은 Asp-Val/Ile-Glu-X-Asn-Pro-Gly(2A)-Pro(2B) 모티프를 포함할 수 있으며, 이는 2A 글리신과 2B 프롤린 사이를 절단시킨다.
“약학적으로 허용가능한 담체”는 활성 성분 이외에 약학 제형 내 성분을 지칭하며, 이는 대상체에게 비독성이다. 약학적으로 허용되는 담체는 완충액, 부형제, 안정화제, 또는 보존제를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다.
본원에서 사용되는 “대상체”는 인간 또는 다른 동물과 같은 포유동물이고, 전형적으로 인간이다. 일부 실시형태에서, 세포, 세포 집단, 또는 조성물이 투여되는 대상체, 예를 들어, 환자는 포유동물, 전형적으로 인간과 같은 영장류이다. 일부 실시형태들에서, 영장류는 원숭이 또는 유인원이다. 대상체는 남성 또는 여성일 수 있고 유아, 청소년, 청소년, 성인 및 노인 대상을 포함하는 임의의 적합한 연령일 수 있다. 일부 실시형태들에서, 대상체는 설치류 또는 마우스와 같은 비영장류 포유동물이다.
“대조군”이라는 용어는 테스트 샘플과의 비교를 제공하기에 적합한 모든 참조 표준을 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 “억제하다”는, 예를 들어, 특정 작용, 기능 또는 상호작용의 임의의 감소를 지칭한다. 예를 들어, 단백질의 기능 및/또는 한 단백질과 다른 단백질의 결합과 같은 생물학적 기능이 야생형 상태 또는 적용된 제제가 없는 상태와 같은 참조 상태, 예를 들어, 대조군과 비교하여 감소하는 경우 이는 억제된다. 예를 들어, PD-L1 및/또는 PD-L2와 같은 하나 이상의 리간드에 대한 PD-1 단백질의 결합 및/또는 생성된 PD-1 신호전달 및 면역 효과는, PD-1 단백질이 해당 제제와 접촉하지 않을 때와 비교하여 항-PD-1 항체와 같은 제제와의 접촉으로 인한 결합, 신호전달 및 기타 면역 효과가 감소되는 경우, 억제되거나 결핍된다. 이러한 억제 또는 결핍은, 예를 들어, 특정 시간 및/또는 장소에 제제를 적용함으로써 유도될 수 있거나, 또는 연속 투여에 의한 경우와 같이 항시적일 수 있다. 이러한 억제 또는 결핍은 또한 부분적이거나 완전할 수 있다(예를 들어, 참조 상태, 예를 들어, 야생형 상태와 같은 대조군과 비교하여 본질적으로 측정가능한 활성이 없음). 본질적으로 완전한 억제 또는 결핍은 차단이라 지칭된다.
본원에서 사용되는 “병태” 및 “질병 상태”는 암, 종양 또는 감염성 질병을 포함할 수 있다. 예시적 실시형태에서, 병태는 임의의 형태의 악성 신생물 세포 증식성 장애 또는 질병을 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니다. 예시적인 실시형태에서, 병태는 신장암, 흑색종, 전립선암, 유방암, 교모세포종, 폐암, 결장암 또는 방광암 중 하나 이상을 포함한다.
“암” 및 “암성”이라는 용어는 전형적으로 조절되지 않은 세포 성장을 특징으로 하는 포유동물의 생리학적 병태를 지칭하거나 설명한다. 용어 “암”은 조직병리학적 유형 또는 침윤 단계에 관계없이 모든 유형의 암 성장 또는 발암성 과정, 전이성 조직 또는 악성으로 형질전환된 세포, 조직 또는 기관을 포함하는 것을 의미한다. 고형 종양의 예는, 간, 폐, 유방, 림프계, 위장관(예를 들어, 결장), 비뇨생식관(예를 들어, 신장, 요로상피 세포), 전립선 및 인두에 영향을 미치는 것과 같은 다양한 기관계의 악성 종양, 예를 들어, 육종, 선암종 및 암종을 포함한다. 선암종은 대부분의 결장암, 직장암, 신세포 암종, 간암, 폐의 비소세포 암종, 소장암 및 식도암과 같은 악성 종양을 포함한다. 한 실시형태에서, 암은 흑색종, 예를 들어, 진행 단계 흑색종이다. 전술한 암의 전이성 병변은 또한 본원에 기재된 방법 및 조성물을 사용하여 치료 또는 예방될 수 있다. 치료할 수 있는 다른 암의 예로는, 골암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부 또는 안내 악성 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문암, 위암, 고환암, 자궁암, 나팔관 암종, 자궁내막 암종, 자궁경부 암종, 질 암종, 외음부 암종, 호지킨병, 비호지킨 림프종, 식도암, 소장암, 내분비계암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 급성 골수성 백혈병을 포함한 만성 또는 급성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 소아 고형 종양, 림프구성 림프종, 방광암, 신장 또는 요관암, 신우암종, 중추신경계(CNS)의 신생물, 원발성 CNS 림프종, 종양 혈관신생, 척추축 종양, 뇌간 신경아교종, 뇌하수체 선종, 카포시 육종, 표피암, 편평 세포암, T-세포 림프종, 석면 유발 암을 비롯한 환경적으로 유발된 암, 및 이러한 암들의 조합을 포함한다. 전이성 암, 예를 들어, PD-L1을 발현하는 전이성 암의 치료(Iwai et al. (2005) Int. Immunol. 17:133-144)는 본원에 기재된 항체 분자를 사용하여 이루어질 수 있다.
본원에서 사용되는, 용어 “치료하다”, “치료”, “치료하는 것” 또는 “개선”은 치료적 치료를 지칭하며, 여기서 목적은 질병 또는 장애와 관련된 병태의 진행 또는 중증도를 역전시키거나, 경감시키거나, 개선시키거나, 억제하거나, 늦추거나, 정지시키는 것이다. “치료하는 것”이라는 용어는 암과 같은 병태, 질병 또는 장애의 적어도 하나의 역효과 또는 증상을 감소시키거나 경감시키는 것을 포함한다. 치료는 일반적으로 하나 이상의 증상이나 임상 지표가 감소하는 경우 “효과적”이다. 또는 질병의 진행이 감소하거나 중단되면 치료가 “효과적”이다. 즉, “치료”는 증상이나 지표의 개선, 뿐만 아니라 치료가 없을 때 예상되는 증상의 진행을 적어도 늦추거나 증상을 악화시키는 것의 중단도 포함한다. 유익한 또는 원하는 임상적 결과들에는 하나 이상의 증상(들)의 완화, 질병 정도의 감소, 질병의 안정화 (즉, 악화되지 않는) 상태, 질병 진행의 지연 또는 저하, 질병 상태의 경감 또는 일시적 완화, 및 차도 (부분적이든 또는 전체적이든), 탐지가능한지 또는 탐지불가능한지 여부가 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 질병의 “치료”라는 용어는 또한 질병의 증상 또는 부작용을 완화시키는 것(완화 치료 포함)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 암의 치료는 종양 부피 감소, 암 세포 수 감소, 암 전이 억제, 기대 수명 증가, 암 세포 증식 감소, 암 세포 생존 감소, 또는 암성 병태와 관련된 다양한 생리학적 증상의 완화를 포함한다.
본원에 사용된 “질병의 발달 지연”은 질병(예를 들어, 암)의 발달을 지연, 방해, 둔화, 지체, 안정화, 억제 및/또는 연기하는 것을 의미한다. 이러한 지연은 병력 및/또는 치료받는 개체에 따라 시간의 길이가 다양할 수 있다. 당업자에게 명백한 바와 같이, 충분한 또는 유의미한 지연은, 사실상, 개체에서 질병이 발병하지 않는다는 점에서, 예방을 포함할 수 있다. 예를 들어, 말기 암, 예컨대 전이의 발병이 지연될 수 있다.
본원에서 사용되는 “예방하는 것”은 질병에 걸리기 쉬울 수 있지만 아직 질병으로 진단되지 않은 대상체에서 질병의 발생 또는 재발에 대한 예방을 제공하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제공된 세포 및 조성물은 질병의 발달을 지연시키거나 질병의 진행을 늦추기 위해 사용된다.
본원에서 사용되는, 기능 또는 활성을 “억제”하는 것은 관심 있는 조건 또는 매개변수를 제외한 다른 동일한 조건과 비교할 때, 또는 대안적으로 또 다른 조건과 비교할 때 기능 또는 활성을 감소시키는 것이다. 예를 들어, 종양 성장을 억제하는 세포는 세포가 없을 때의 종양 성장 속도에 비해 종양 성장 속도를 감소시킨다.
투여와 관련하여 제제, 예를 들어, 약학적 제형, 세포 또는 조성물의 “유효량”은 원하는 결과, 예를 들어, 치료 또는 예방적 결과를 달성하기 위해 필요한 소정의 기간 동안 그리고 소정의 투여량/양에서 효과적인 양을 지칭한다.
한 제제, 예를 들어, 약학 제형 또는 세포의 “치료적 유효량”은, 원하는 치료 결과, 예를 들어, 질병, 병태, 또는 장애의 치료 및/또는 치료의 약동학적 또는 약력학적 효과를 달성하는데 필요한 소정의 기간 동안 그리고 소정의 투여량에서 효과적인 양을 지칭한다. 치료적 유효량은 대상체의 질병 상태, 연령, 성별, 체중 및 투여되는 세포 집단과 같은 인자에 따라 달라질 수 있다. 일부 실시형태에서, 제공된 방법은 유효량, 예를 들어, 치료적 유효량으로 세포 및/또는 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
“예방적 유효량”은 원하는 예방적 결과를 달성하기 위해 필요한 기간 동안 그리고 투여량에서 효과적인 양을 지칭한다. 반드시 그런 것은 아니지만 전형적으로, 질병 이전 또는 질병의 초기 단계에서 예방적 용량이 대상체에게 사용되기 때문에 예방적 유효량은 치료적 유효량보다 적을 것이다. 더 낮은 종양 부하와 관련하여, 일부 양상에서 예방적 유효량은 치료적 유효량보다 높을 것이다.
본원에 기재된 다양한 실시형태에 따르면, 본 발명은 조작된 세포 및 조작된 세포를 함유하는 조성물/제제를 제공한다. 본 발명은 또한 병리학적 질병 또는 병태를 갖는 환자를 치료하는데 유용할 수 있는 조작된 세포를 제조하는 방법 또는 공정을 제공한다.
또한, 본원에 기재된 다양한 실시형태에 따라, 본 발명은 세포를 유전적으로 변형시키기에 적합한 핵산 구조체를 포함하는 재조합 벡터를 제공하며, 이는 병리학적 질병 또는 병태의 치료에 사용될 수 있다.
또한, 본원에 기재된 다양한 실시형태에 따라, 본 발명은 병리학적 질병 또는 병태의 치료에 사용될 수 있는, 세포를 유전적으로 변형시키는데 적합한 핵산 구조체를 포함하는 조작된 세포를 제공하며, 여기서 핵산은 (a) 항원에 특이적으로 결합하는 유전적으로 조작된 항원 수용체; 및 (b) 종양 표적의 발현을 감소시키거나 감소시킬 수 있는 억제 단백질을 인코딩한다. 다양한 실시형태에서, 세포는 유전적으로 조작된 항원 수용체 및 억제 단백질을 발현한다. 다양한 실시형태에서, 억제 단백질은 항시적으로 발현된다.
제공된 세포, 조성물, 방법으로 치료하기 위한 질병, 병태 및 장애 중에서, 용도는 고형 종양, 혈액학적 악성종양 및 흑색종을 포함하는 종양, 및 감염성 질병, 예를 들어, 바이러스 또는 다른 병원체, 예를 들어, HPV, HIV, HCV, HBV, EBV, HTLV-1, CMV, 아데노바이러스, BK 폴리오마바이러스, HHV-8, MCV 또는 기타 병원체에 의한 감염 및 기생충 질병이다. 일부 실시형태에서, 질병 또는 병태는 종양, 암, 악성종양, 신생물 또는 기타 증식성 질병 또는 장애이다. 이러한 질병에는 백혈병, 림프종, 예를 들어, 만성 림프구성 백혈병(CLL), 급성 림프구성 백혈병(ALL), 비호지킨 림프종, 급성 골수성 백혈병, 다발성 골수종, 불응성 여포성 림프종, 맨틀 세포 림프종, 무통성 B 세포 림프종, B 세포 악성종양, 자궁경부암, 결장암, 폐암, 간암, 유방암, 전립선암, 난소암, 피부암, 흑색종, 뼈암, 및 뇌암, 난소암, 상피암, 신세포암, 췌장 선암종, 호지킨 림프종, 자궁경부 암종, 대장암, 교모세포종, 신경모세포종, 유잉 육종, 수모세포종, 골육종, 윤활막 육종 및/또는 중피종이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다.
T 세포 수용체 및 결합 분자
T 세포는 일반적으로 흉선에서 발생하고 면역 반응에서 중심적인 역할을 하는 일종의 림프구이다. 이는 “적응 면역 반응”에서 중요한 역할을 한다. T 세포는 세포 표면에 있는 T 세포 수용체의 존재에 의해 다른 림프구와 구별될 수 있다. 분화된 T 세포는 면역 반응을 조절하는 데 중요한 역할을 한다. “킬러 세포”라고도 알려진 CD8+ T 세포는 세포독성이 있다. 표적 세포를 인식하면, 표적 세포(예를 들어, 바이러스 감염 세포 또는 암세포)를 직접 사멸시킬 수 있다. CD8+ T 세포는 또한 사이토카인을 생산하고 다른 세포(예를 들어, 대식세포 및 자연 살해(NK) 세포)를 동원하여 면역 반응을 일으킬 수 있다. “헬퍼 세포”로도 알려진 CD4+ T 세포는, 예를 들어, B 세포의 형질 세포 및 기억 B 세포로의 성숙 및 세포독성 T 세포 및 대식세포의 활성화를 촉진함으로써 표적 세포를 간접적으로 사멸시킬 수 있다. 헬퍼 T 세포는 항원 제시 세포(APC)의 표면에서 발현되는 MHC 클래스 II 분자에 의해 펩티드 항원이 제시될 때 활성화된다. 일단 활성화되면, 빠르게 분열하여 면역 반응을 조절하거나 돕는 사이토카인을 분비한다. 조절 T 세포는 관용에 중요하므로, 자가 면역 반응을 예방하거나 억제한다. 조절 T 세포의 주요 역할은 면역 반응이 끝날 무렵 T 세포 매개 면역을 차단하고 흉선에서 음성 선택 과정을 벗어난 자가 반응 T 세포를 억제하는 것이다.
T 세포는 암 면역에서 중요한 역할을 하는데, 여기서 암세포의 항원이 흡수되어 항원 제시 세포(APC)라고 하는 특수 면역 세포의 세포 표면에 제시되어 그 결과 다른 면역 세포가 관심 항원을 인식할 수 있다. 림프절에서 APC는 T 세포가 종양 세포를 인식하도록 활성화시킨다. 활성화된 T 세포는 혈관을 통해 이동하여 종양에 도달하고 침투하여 암세포를 인식하고 사멸시킬 수 있다.
T 세포의 활성화에는 T 세포 수용체가 필요하다. “T 세포 수용체” 또는 “TCR”은 변수 a(또는 알파) 및 b(또는 베타) 사슬(각각 TCRα 및 TCRβ로도 알려짐) 또는 변수 g(또는 감마) 및 d(또는 델타) 사슬(각각 TCRγ 및 TCRδ로도 알려짐) 또는 이의 항원 결합 부분을 함유하는 분자이며, 항원, 예를 들어, 주조직 적합성 복합체(MHC)에 결합된 펩티드 항원 또는 펩티드 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 분자이다.
본 발명은 T 세포 수용체(TCR) 또는 이의 항원 결합 단편, 및 TCR로부터 유도된 결합 분자를 제공한다. 일부 실시형태에서, TCR은 αβ 형태이다. αβ 및 γδ 형태로 존재하는 TCR은 일반적으로 구조적으로 유사하지만 이를 발현하는 T 세포는 별개의 해부학적 위치나 기능을 가질 수 있다. 일반적으로 TCR은 T 세포(또는 T 림프구)의 표면에서 발견되며 일반적으로 주조직 적합성 복합체(MHC) 분자에 결합된 펩티드와 같은 항원을 인식하는 역할을 한다.
일부 실시형태에서, TCR은 a 사슬 및 b 사슬을 함유하는 TCR과 같은 온전한 또는 전장 TCR이다. 일부 실시형태에서, TCR은 전장 TCR보다 작지만 MHC 분자에 결합된 특정 펩티드에 결합하는, 예를 들어, MHC-펩티드 복합체에 결합하는 항원-결합 부분이다. 경우에 따라, TCR의 항원 결합 부분 또는 단편은 전체 길이 또는 온전한 TCR의 구조적 도메인의 일부만 포함할 수 있지만 전장 TCR이 결합하는 MHC-펩티드 복합체와 같은 펩티드 에피토프에 결합할 수 있다. 일부 경우에, 항원-결합 부분은 TCR의 가변 도메인, 예를 들어, TCR의 가변 a(Va 또는 Vα) 사슬 및 가변 b(Vb 또는 Vβ) 사슬, 또는 특정 MHC-펩티드 복합체에 결합하기 위한 결합 부위를 형성하기에 충분한 이들의 항원 결합 단편을 함유한다.
TCR의 가변 도메인은 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하며, 이는 일반적으로 펩티드, MHC 및/또는 MHC-펩티드 복합체의 항원 인식 및 결합 능력 및 특이성에 주된 원인을 제공한다. 일부 실시형태에서, TCR의 CDR 또는 이들의 조합은 주어진 TCR 분자의 항원-결합 부위의 전부 또는 실질적으로 전부를 형성한다. TCR 사슬의 가변 영역 내의 다양한 CDR들은 일반적으로 CDR과 비교하여 TCR 분자 간의 변동성이 적은 프레임워크 영역(FR)에 의해 일반적으로 분리된다. 일부 실시형태에서, CDR3은 항원 결합 또는 특이성을 담당하는 주요 CDR이거나, 또는 항원 인식 및/또는 펩티드-MHC의 복합체의 가공된 펩티드 부분과의 상호작용에 있어서 주어진 TCR 가변 영역 상의 3개의 CDR 중에서 가장 중요하다. 경우에 따라, 알파 사슬의 CDR1은 특정 항원성 펩티드의 N-말단 부분과 상호작용할 수 있다. 경우에 따라, 베타 사슬의 CDR1이 펩티드의 C 말단 부분과 상호 작용할 수 있다. 경우에 따라, CDR2는 MHC-펩티드 복합체의 MHC 부분과의 상호작용 또는 MHC 부분 인식에 가장 강력하게 기여하거나 이를 담당하는 1차 CDR이다.
TCR의 a-사슬 및/또는 b-사슬은 또한 불변 도메인, 막횡단 도메인 및/또는 짧은 세포질 꼬리를 포함할 수 있다. 일부 양상에서, TCR의 각각의 사슬(예를 들어, 알파 또는 베타)은 하나의 N-말단 면역글로불린 가변 도메인, 하나의 면역글로불린 불변 도메인, 막횡단 영역, 및 C-말단 단부의 짧은 세포질 꼬리를 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, TCR은, 예를 들어, 세포질 꼬리를 통해, 신호 전달 매개에 관여하는 CD3 복합체의 불변 단백질과 회합된다. 경우에 따라, 이러한 구조는 TCR이 CD3 및 그 서브유닛과 같은 다른 분자와 회합할 수 있도록 한다. 예를 들어, 막횡단 영역과 함께 불변 도메인을 포함하는 TCR은 단백질을 세포막에 고정하고 CD3 신호전달 장치 또는 복합체의 불변 서브유닛과 회합할 수 있다. CD3 신호전달 서브유닛(예를 들어, CD3γ, CD3δ, CD3e 및 CD3z 사슬)의 세포내 꼬리는 하나 이상의 면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프 또는 ITAM을 포함하며 일반적으로 TCR 복합체의 신호 전달 능력에 관여한다.
한 도메인 또는 영역의 정확한 위치는 특정 구조 또는 상동성 모델링 또는 특정 도메인을 설명하는 데 사용되는 기타 특징들에 따라 달라질 수 있다. 경우에 따라, 특정 도메인(예를 들어, 가변 또는 불변)은 더 길거나 더 짧은 여러개의 아미노산(예를 들어, 1, 2, 3 또는 4개)일 수 있다. 일부 양상에서, TCR의 잔기는 공지이거나 국제 면역유전학 정보 시스템(IMGT) 넘버링 체계에 따라 식별될 수 있다(예를 들어, www.imgt.org; Lefranc et al. “IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains.” Developmental & Comparative Immunology 27.1 (2003): 55-77 참조). TCR의 구조 및 변형은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어, WO 2019/195486에 기재되어 있으며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
일부 실시형태에서, TCR의 a 사슬 및 b 사슬은 각각 불변 도메인을 추가로 함유한다. 일부 실시형태에서, a쇄 불변 도메인(Ca) 및 b쇄 불변 도메인(Cb)은 개별적으로 인간 또는 비인간 불변 도메인(예를 들어, 마우스 불변 도메인)과 같은 포유동물이다. 일부 실시형태에서, 불변 도메인은 세포막에 인접해 있다. 예를 들어, 경우에 따라, 두 사슬들에 의해 형성된 TCR의 세포외 부분은 두 개의 막-근위 불변 도메인과 두 개의 막-원위 가변 도메인을 포함하며, 가변 도메인은 각각 CDR을 포함한다.
일부 양상에서, 본원에 기재된 TCR은 인간 Ca 영역을 함유하는 알파 사슬 및 인간 Cb 영역을 함유하는 베타 사슬과 같은 인간 불변 영역을 함유할 수 있다. 일부 실시형태에서, TCR은 전적으로 인간이다. 일부 실시형태에서, TCR의 발현 및/또는 활성은, 예를 들어, 인간 세포, 가령, 1차 인간 T 세포에서 발현될 때, 내인성 인간 TCR의 존재에 의해 영향을 받지 않거나 실질적으로 영향을 받지 않는다.
일부 실시형태에서, 조작된 TCR은, 인간 T 세포와 같은 내인성 인간 TCR을 함유하거나 발현하는 인간 세포에 의해 발현될 때, 유사한 인간 세포들에서 동일한, 그러나 내인성 TCR의 발현이 감소 또는 제거된 TCR의 발현, 기능 활성 및/또는 항종양 활성의 수준과 비교하여, 세포 표면에서 유사하거나 개선된 수준으로 발현되고, 유사하거나 더 큰 기능적 활성(예를 들어, 세포용해 활성)을 나타내고/나타내거나 유사하거나 더 큰 항종양 활성을 나타낸다. 일부 예에서 본원에 기재된 조작된 TCR은, 인간 T 세포에서 발현될 때, 유사하지만 내인성 TCR의 발현이 감소되거나 제거된 인간 T 세포에서 발현되는 동일한 TCR 발현 수준의 적어도 또는 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 105%, 110%, 115% 또는 120% 수준으로 세포 표면에서 발현된다.
일부 실시형태에서, 각각의 Ca 및 Cb 도메인은 인간이다. 일부 실시형태에서, Ca는 TRAC 유전자(IMGT 명명법) 또는 이의 변이체에 의해 인코딩된다. 일부 실시형태에서, Ca의 변이체는 적어도 하나의 비-천연 시스테인의 대체를 포함한다.
일부 실시형태에서, TCR은, 예를 들어, 이황화 결합 또는 이황화 결합들에 의해 연결된 2개의 사슬 a 및 b의 이종이량체일 수 있다. 일부 실시형태에서, TCR의 불변 도메인은 시스테인 잔기가 이황화 결합을 형성함으로써 TCR의 2개 사슬을 연결하는 짧은 연결 서열을 함유할 수 있다. 일부 실시형태에서, TCR은 각각의 a 및 b 사슬에 추가적인 시스테인 잔기를 가질 수 있고, 그리하여 TCR은 불변 도메인들에 2개의 이황화 결합을 함유할 수 있다. 일부 실시형태에서, 각각의 불변 및 가변 도메인은 시스테인 잔기에 의해 형성된 이황화 결합을 함유한다.
일부 실시형태에서, 천연 이황화물 결합은 존재하지 않는다. 일부 실시형태에서, 천연 사슬간 이황화 결합을 형성하는 하나 이상의 천연 시스테인(예를 들어, a 사슬 및 b 사슬의 불변 도메인에서)은 또 다른 잔기, 예를 들어, 세린 또는 알라닌으로 치환된다. 일부 실시형태에서, 도입된 이황화 결합은 a 사슬 및 b 사슬의 불변 도메인과 같은 알파 및 베타 사슬 상의 비 시스테인 잔기를 시스테인으로 돌연변이시킴으로써 형성될 수 있다. TCR a 및 b 사슬의 대면 시스테인들은 치환된 TCR의 TCR a 및 b 사슬의 불변 영역을 서로 연결하는 이황화 결합을 제공하며, 이는 천연 이황화 결합이 존재하는 치환되지 않은 불변 영역, 예를 들어, 치환되지 않은 천연 인간 불변 영역 또는 치환되지 않은 천연 마우스 불변 영역을 포함하는 TCR에는 존재하지 않는다. 일부 실시형태에서, 재조합 TCR에서 비-천연 시스테인 잔기들의 존재(예를 들어, 하나 이상의 비-천연 이황화 결합을 생성함)는 천연 TCR 사슬을 함유하는 미스매치된 TCR 쌍의 발현에 비해 이것이 도입되는 세포에서 원하는 재조합 TCR의 생성을 유리하게 할 수 있다.
일부 실시형태에서, TCR은 본원에 기재된 CDR, Va 및/또는 Vb 및 불변 영역 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, TCR은 이량체 TCR(dTCR)이다. 일부 실시형태에서 dTCR은 제공된 TCR a 사슬 가변 영역 서열에 상응하는 서열이 TCR a 사슬 불변 영역 세포외 서열에 상응하는 서열의 N 말단에 융합된 제1 폴리펩티드, 및 제공된 TCR b 사슬 가변 영역 서열에 상응하는 서열이 TCR b 사슬 불변 영역 세포외 서열에 상응하는 서열의 N 말단에 융합된 제2 폴리펩티드를 포함하며, 상기 제1 및 제2 폴리펩티드는 이황화 결합에 의해 연결된다.
일부 실시형태들에서, TCR은 세포 결합 또는 가용성 형태일 수 있다. 일부 실시형태에서, TCR은 세포 표면에서 발현되는 세포 결합 형태이다.
일부 실시형태에서, TCR은 단일 사슬 TCR(scTCR)이다. scTCR은 MHC-펩티드 복합체에 결합할 수 있는 a 사슬과 b 사슬을 포함하는 단일 아미노산 가닥이다. 전형적으로, scTCR은 당업자에게 공지된 방법을 사용하여 생성될 수 있다. 이들 방법은, 예를 들어, WO 96/13593, WO 96/18105, W099/18129, WO 04/033685, WO2006/037960, WO2011/044186; WO 2019/195486; 미국 특허 번호 7,569,664에 기재되어 있으며; 이들 각각은 그 전문이 참조로 본원에 포함된다.
TCR, 이의 항원 결합 단편 및 TCR 유래 결합 분자는 관심 항원(예를 들어, 암 항원)과 관련된 펩티드 에피토프에 결합하거나 이를 인식할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원은 암 세포 및/또는 바이러스, 예를 들어, EBV로 감염된 세포의 표면에서 발현되는 펩티드 에피토프일 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원은 MHC 분자와 관련하여 제시된다. 이러한 결합 분자는, 예를 들어, T 세포 수용체(TCR) 및 이의 항원 결합 단편, 항체 및 이의 항원 결합 단편, 및 TCR-유사 CAR을 포함한다. 이들은 이러한 펩티드 에피토프를 결합하거나 인식하는 항원 특이성을 나타낸다. 일부 양상에서, 제공되는 결합 분자, 예를 들어, TCR 또는 항원-결합 단편을 발현하는 조작된 세포는 펩티드 에피토프를 발현하는 표적 세포, 예를 들어, 암 세포 또는 EBV로 감염된 세포에 대해 세포독성 활성을 나타낸다.
일부 양상에서, TCR, 이의 항원 결합 단편, 및 TCR 유래 결합 분자는 MHC 클래스 I 분자 또는 MHC 클래스 II 분자와 같은 MHC 분자와 관련된 에피토프를 인식하거나 이에 결합한다. MHC 클래스 I 분자 또는 MHC 클래스 II 분자는 모두 인간 백혈구 항원(HLA)이다. 이들은 적응 면역 체계의 중요한 구성 요소를 담당한다. HLA 발현은 6번 염색체에 위치한 유전자에 의해 제어된다. 이것은 항원성 펩티드를 T 세포의 T 세포 수용체에 제시하도록 특성화된 세포 표면 분자를 인코딩한다.
일부 실시형태들에서, TCR, 이의 항원 결합 단편, 및 TCR 유래 결합 분자는 MHC 클래스 I 분자와 관련된 에피토프를 인식하거나 이에 결합한다. MHC 클래스 I 분자는 하나 이상의 하위형, 예를 들어, HLA-A*0201, *0202, *0203, *0206, 또는 *0207을 비롯한 인간 백혈구 항원(HLA)-A2 분자이다. 인간 백혈구 항원 A2(HLA-A2)는 가장 흔한 인간 혈청형 중 하나이다. 경우에 따라 서로 다른 집단들 간에 하위 유형의 빈도에 차이가 있을 수 있다. 예를 들어, HLA-A2 양성 백인 집단의 95% 이상이 HLA-A*020l인 반면, 중국 집단에서의 빈도는 HLA-A*020l의 경우 약 23%, HLA-A*0207의 경우 45%, HLA-A*0206의 경우 8%, HLA-A*0203의 경우 23%인 것으로 보고되었다. 일부 실시형태들에서, MHC 분자는 HLA-A*020l이다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 EBV LMP2/HLA-A2 복합체, EBV LMP2/HLA-A11 복합체, 또는 EBV LMP2/HLA-A24 복합체에 결합하는 TCR 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다. 일부 실시형태들에서, 본 발명은 EBV LMP2 펩티드 FLYALALLL(서열번호 139)/HLA-A2 복합체, EBV LMP2 펩티드 CLGGLLTMV(서열번호 167)/HLA-A2 복합체, EBV LMP2 펩티드 SLGGLLTMV(서열번호 168)/HLA-A2 복합체, EBV LMP2 펩티드 SSCSSCPLSK(서열번호 140)/HLA-A11 복합체, EBV LMP2 펩티드 IYVLVMLVL(서열번호 141)/HLA-A24 복합체, 또는 EBV LMP2 펩티드 TYGPVFMCL(서열번호 142)/HLA-A24 복합체에 결합하는 TCR 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
일부 실시형태에서, 결합 분자, 예를 들어, TCR 또는 이의 항원 결합 단편 또는 TCR 유래 결합 분자는 단리 또는 정제되거나 재조합이다. 일부 양상에서, 결합 분자, 예를 들어, TCR 또는 이의 항원 결합 단편 또는 TCR 유래 결합 분자는 완전한 인간이다. 일부 실시형태에서, 결합 분자는 단클론이다. 일부 양상에서, 결합 분자는 단일 사슬이다. 다른 실시형태에서, 결합 분자는 2개의 사슬을 함유한다. 일부 실시형태에서, 결합 분자, 예를 들어, TCR, 이의 항원 결합 단편 또는 TCR 유래 결합 분자는 세포의 표면에서 발현된다.
TRA 유전자좌는 V 및 J 유전자 분절(TRAV 및 TRAJ 유전자 분절)을 포함하고 TRB 유전자좌는 V, D 및 J 유전자 분절(TRBV, TRBD 및 TRBJ 유전자 분절)을 포함한다. 14q11.2의 인간 TRA 유전자좌는 약 1000kb에 걸쳐 있다. 이것은 41개의 하위그룹에 속하는 54개의 TRAV 유전자, 71kb에 국한된 61개의 TRAJ 분절 및 고유한 TRAC 유전자로 구성된다. 대부분의 5' TRAV 유전자는 가장 센트로머 위치를 차지하는 반면, 유전자좌의 3'인 TRAC 유전자는 TRA 유전자좌에서 가장 텔로미어 유전자이다. 넓은 영역에서의 TRAJ 분절들의 조직화는 매우 이례적이며 다른 면역글로불린 또는 T 세포 수용체 유전자좌에서는 관찰되지 않았다. 또한 TRD 유전자좌는 TRAV와 TRAJ 분절들 사이의 TRA 유전자좌에 자리 잡고 있다. 따라서 TRA 유전자좌의 V-J 재배열은 TRD 유전자들을 동일한 염색체에 국한시켜 결실시킨다. 이러한 결실은 두 단계로 발생하고 TRDC의 상류에 위치한 특정 서열(서열 슈도 J 알파)을 포함한 TRD 유전자의 결실이며, TRAV-J 재배열 전에 발생할 것이다. 게놈 TRA 레퍼토리는 33-35개의 하위그룹에 속하는 45-47개의 기능적 TRAV 유전자, 50개의 기능적 TRAJ 분절 및 고유한 TRAC 유전자를 포함한다. 가변 유전자들 중에는, 5개의 서로 다른 하위그룹에 속하고 TRAJ 또는 TRDD 분절로 재배열되어 알파 또는 델타 사슬의 합성에 사용될 수 있는 것으로 밝혀진 TRAV/DV로 지정된 5개의 유전자가 포함된다. 반수체 게놈당 인간 TRA 유전자의 총 수는 116개이며 그 중 96 내지 98개 유전자가 기능적이다. 인핸서 서열은 TRAC로부터 4.5kb 3'에서 특성화되었다. TRAV 유전자들의 목록은 표 1에, TRVJ 유전자들의 목록은 표 2에 나와 있다.
표 1. 인간 염색체 14의 TRAV 유전자들의 목록
Figure pct00001
표 2. 인간 염색체 14의 TRAJ 유전자들의 목록
Figure pct00002
7q35의 인간 TRB 유전자좌는 620kb에 이른다. 이는 32개의 하위 그룹에 속하는 64 내지 67개의 TRBV 유전자로 구성된다. 역전사 방향에서 TRBC2 유전자의 하류에 국한된 TRBV30을 제외하고, 다른 모든 TRBV 유전자는 복제된 D-J-C-클러스터의 상류에 위치하며, 이는 첫 번째 부분의 경우 TRBD 1개, TRBJ 6개 및 TRBC1 유전자를 포함하고, 두 번째 부분의 경우 TRBD 1개, TRBJ 8개, 및 TRBC2 유전자를 포함한다. 대부분의 5' TRBV 유전자는 가장 센트로머 위치를 차지하는 반면, 유전자좌의 3'인 TRBV30 유전자는 TRB 유전자좌에서 가장 텔로미어 유전자이다. 레퍼토리는 21 내지 23개의 하위 그룹에 속하는 39 내지 46개의 기능성 TRBV 유전자, 2개의 TRBD, 13개의 TRBJ(첫 번째 클러스터에서 6개 및 두 번째 클러스터에서 7개) 및 2개의 TRBC 유전자로 구성된다. 6개의 TRBV 오르폰들은 9p21의 염색체 9에 국한되었다. 인핸서 서열은 TRBC2로부터 5.5kb 3'에서 특성화되었다. TRBV, TRBD 및 TRBJ 유전자들의 목록은 각각 표 3, 표 4 및 표 5에 나와 있다.
표 3. 인간 염색체 7번의 TRBV 유전자들의 목록
Figure pct00003
표 4. 인간 염색체 7번의 TRBD 유전자들의 목록
Figure pct00004
표 5. 인간 염색체 7번의 TRBJ 유전자들의 목록
Figure pct00005
일부 실시형태들에서, 가변 알파(Va) 영역을 포함하는 알파 사슬 및 가변 베타(Vb) 영역을 포함하는 베타 사슬을 포함하는 TCR, TCR 유래 결합 분자, 또는 이의 항원 결합 단편이 제공되고, 여기서 Va 영역은 상보성 결정 영역(CDR) 1, 2, 3을 가질 수 있고, 여기서 CDR1 영역은 선택된 Va CDR1 아미노산 서열에 적어도 80%, 85%, 90%, 또는 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나 이것으로 구성되고, CDR2 영역은 선택된 Va CDR2 아미노산 서열에 적어도 80%, 85%, 90%, 또는 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나 이것으로 구성되고, CDR3 영역은 선택된 Va CDR3 아미노산 서열에 적어도 80%, 85%, 90%, 또는 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나 이것으로 구성되고, 그리고 상기 가변 베타(Vb) 영역은 CDR 1, 2, 3을 포함하고, 여기서 CDR1 영역은 선택된 Vb CDR1 아미노산 서열에 적어도 80%, 85%, 90%, 또는 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나 이것으로 구성되고, CDR2 영역은 선택된 Vb CDR2 아미노산 서열에 적어도 80%, 85%, 90%, 또는 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나 이것으로 구성되고, 그리고 CDR3 영역은 선택된 Vb CDR3 아미노산 서열에 적어도 80%, 85%, 90%, 또는 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나 이것으로 구성된다. 선택된 Va CDR 1, 2, 3 아미노산 서열 및 선택된 Vb CDR, 1, 2, 3 아미노산 서열은 도 2-4에 도시되어 있다.
일부 실시형태에서, Va 영역은 서열번호 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 또는 222 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열, 또는 이에 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, Vb 영역은 서열번호 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 또는 223 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열, 또는 이에 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태들에서, Va 영역은 본원에 기재된 하나 이상의 Va CDR 서열을 포함한다. 일부 실시형태들에서, Vb 영역은 본원에 기재된 하나 이상의 Vb CDR 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 서열번호 170에 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일한 Va 영역 및 서열번호 171에 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일한 Vb 영역을 가지는 TCR이 제공된다.
일부 실시형태에서, 서열번호 172에 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일한 Va 영역 및 서열번호 173에 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일한 Vb 영역을 가지는 TCR이 제공된다.
일부 실시형태에서, 서열번호 174에 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일한 Va 영역 및 서열번호 175에 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일한 Vb 영역을 가지는 TCR이 제공된다.
일부 실시형태에서, 서열번호 176에 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일한 Va 영역 및 서열번호 177에 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일한 Vb 영역을 가지는 TCR이 제공된다.
일부 실시형태에서, 서열번호 178에 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일한 Va 영역 및 서열번호 179에 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일한 Vb 영역을 가지는 TCR이 제공된다.
일부 실시형태에서, 서열번호 180에 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일한 Va 영역 및 서열번호 181에 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일한 Vb 영역을 가지는 TCR이 제공된다.
일부 실시형태에서, 서열번호 182에 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일한 Va 영역 및 서열번호 183에 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일한 Vb 영역을 가지는 TCR이 제공된다.
일부 실시형태에서, 서열번호 184에 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일한 Va 영역 및 서열번호 185에 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일한 Vb 영역을 가지는 TCR이 제공된다.
일부 실시형태에서, 서열번호 186에 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일한 Va 영역 및 서열번호 187에 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일한 Vb 영역을 가지는 TCR이 제공된다.
일부 실시형태에서, 서열번호 188에 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일한 Va 영역 및 서열번호 189에 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일한 Vb 영역을 가지는 TCR이 제공된다.
일부 실시형태에서, 서열번호 190에 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일한 Va 영역 및 서열번호 191에 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일한 Vb 영역을 가지는 TCR이 제공된다.
일부 실시형태에서, 서열번호 192에 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일한 Va 영역 및 서열번호 193에 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일한 Vb 영역을 가지는 TCR이 제공된다.
일부 실시형태에서, 서열번호 194에 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일한 Va 영역 및 서열번호 195에 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일한 Vb 영역을 가지는 TCR이 제공된다.
일부 실시형태에서, 서열번호 196에 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일한 Va 영역 및 서열번호 197에 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일한 Vb 영역을 가지는 TCR이 제공된다.
일부 실시형태에서, 서열번호 198에 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일한 Va 영역 및 서열번호 199에 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일한 Vb 영역을 가지는 TCR이 제공된다.
일부 실시형태에서, 서열번호 200에 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일한 Va 영역 및 서열번호 201에 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일한 Vb 영역을 가지는 TCR이 제공된다.
일부 실시형태에서, 서열번호 202에 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일한 Va 영역 및 서열번호 203에 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일한 Vb 영역을 가지는 TCR이 제공된다.
일부 실시형태에서, 서열번호 204에 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일한 Va 영역 및 서열번호 205에 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일한 Vb 영역을 가지는 TCR이 제공된다.
일부 실시형태에서, 서열번호 206에 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일한 Va 영역 및 서열번호 207에 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일한 Vb 영역을 가지는 TCR이 제공된다.
일부 실시형태에서, 서열번호 208에 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일한 Va 영역 및 서열번호 209에 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일한 Vb 영역을 가지는 TCR이 제공된다.
일부 실시형태에서, 서열번호 210에 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일한 Va 영역 및 서열번호 211에 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일한 Vb 영역을 가지는 TCR이 제공된다.
일부 실시형태에서, 서열번호 212에 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일한 Va 영역 및 서열번호 213에 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일한 Vb 영역을 가지는 TCR이 제공된다.
일부 실시형태에서, 서열번호 214에 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일한 Va 영역 및 서열번호 215에 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일한 Vb 영역을 가지는 TCR이 제공된다.
일부 실시형태에서, 서열번호 216에 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일한 Va 영역 및 서열번호 217에 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일한 Vb 영역을 가지는 TCR이 제공된다.
일부 실시형태에서, 서열번호 218에 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일한 Va 영역 및 서열번호 219에 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일한 Vb 영역을 가지는 TCR이 제공된다.
일부 실시형태에서, 서열번호 220에 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일한 Va 영역 및 서열번호 221에 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일한 Vb 영역을 가지는 TCR이 제공된다.
일부 실시형태에서, 서열번호 222에 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일한 Va 영역 및 서열번호 223에 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일한 Vb 영역을 가지는 TCR이 제공된다.
일부 실시형태들에서, 본원에 기재된 TCR, 이의 항원 결합 단편, 또는 TCR-유래 결합 분자는 0, 1, 또는 2개의 아미노산 삽입, 결실, 또는 치환이 있는 본원에 기재된 1, 2, 또는 3개의 CDR들을 함유하는 가변 영역(예를 들어, Va)를 함유할 수 있다. 일부 실시형태들에서, a 사슬은 본원에 기재된 하나 이상의 Va CDR 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, b 사슬은 본원에 기재된 하나 이상의 Vb CDR 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 TCR, 이의 항원 결합 단편, 또는 TCR-유래 결합 분자는 가변 알파(Va) 영역을 포함하는 알파 사슬 및 가변 베타(Vb) 영역을 포함하는 베타 사슬을 포함한다. 일부 실시형태들에서, Va 영역은 상보성 결정 영역 1(CDR1), 상보성 결정 영역 2(CDR2), 및 상보성 결정 영역 3(CDR3)을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, Va 영역의 CDR3은 SGY(세린-글리신-티로신)를 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, Va 영역의 CDR3은 YST(티로신-세린-트레오닌)를 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, Va 영역의 CDR3은 아미노산 서열 X1GX2SGYSTL을 포함하고, 여기서 X1은 E(글루탐산), T(트레오닌), Q(글루타민), V(발린) 또는 N(아스파라긴)이고; X2는 D(아스파르트산), G(글리신), N(아스파라긴) 또는 E(글루탐산)이다. 일부 실시형태에서, Vb 영역은 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다. 일부 실시형태에서, Vb 영역의 CDR3은 QGG(글루타민-글리신-글리신)를 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, Vb 영역의 CDR3은 TQGG(트레오닌-글루타민-글리신-글리신)를 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, Vb 영역의 CDR3은 아미노산 서열 X3X4QGGX5X6X7X8을 포함하고, 여기서 X3은 S(세린), T(트레오닌), N(아스파라긴) 또는 R(아르기닌)이고; X4는 T(트레오닌), R(아르기닌), Y(티로신), G(글리신), V(발린), Q(글루타민), F(페닐알라닌), S(세린) 또는 P(프롤린)이고; X5는 N(아스파라긴), G(글리신), H(히스티딘), T(트레오닌), S(세린), A(알라닌), I(이소류신) 또는 W(트립토판)이고; X6은 Y(티로신), N(아스파라긴), D(아스파르트산), E(글루탐산), R(아르기닌) 또는 I(이소류신)이고; X7은 G(글리신), Q(글루타민), N(아스파라긴), Y(티로신)이고; X8은 Y(티로신), F(페닐알라닌) 또는 G(글리신)이다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 TCR, 이의 항원 결합 단편, 또는 TCR-유래 결합 분자는 가변 알파(Va) 영역을 포함하는 알파 사슬 및 가변 베타(Vb) 영역을 포함하는 베타 사슬을 포함한다. 일부 실시형태들에서, Va 영역은 인간 TRAV 유전자 분절 및 인간 TRAJ 유전자 분절을 재배열한 서열에 의해 인코딩되고, Vb 영역은 인간 TRBV 유전자 분절, 인간 TRBD 유전자 분절, 및 인간 TRBJ 유전자 분절을 재배열한 서열에 의해 인코딩된다. 일부 실시형태에서, TRAV 유전자 분절은 TRAV17이고; TRAJ 유전자 분절은 TRAJ11이고; TRBV 유전자 분절은 TRBV6-5이고; TRBD 유전자 분절은 TRBD1 또는 TRBD2이고; TRBJ 유전자 분절은 TRBJ2-1 또는 TRBJ1-2이다. 일부 실시형태에서, TRAV 유전자 분절은 TRAV21이고; TRAJ 유전자 분절은 TRAJ33이고; TRBV 유전자 분절은 TRBV10-2이고; TRBD 유전자 분절은 TRBD1이고; TRBJ 유전자 분절은 TRBJ2-7이다. 일부 실시형태에서, TRAV 유전자 분절은 TRAV4, TRAV25, TRAV22 또는 TRAV6이고; TRAJ 유전자 분절은 TRAJ23, TRAJ47, TRAJ29, TRAJ43 또는 TRAJ11이고; TRBV 유전자 분절은 TRBV12-4, TRBV12-3, TRBV11-2, TRBV4-1 또는 TRBV11-2이고; TRBD 유전자 분절은 TRBD2이고; TRBJ 유전자 분절은 TRBJ1-1, TRBJ2-1, TRBJ2-5 또는 TRBJ2-7이다. 일부 실시형태에서, TRAV 유전자 분절은 TRAV12-1이고; TRAJ 유전자 분절은 TRAJ21이고; TRBV 유전자 분절은 TRBV20-1이고; TRBD 유전자 분절은 TRBD1이고; TRBJ 유전자 분절은 TRBJ2-5 또는 TRBJ2-3이다. 일부 실시형태에서, TRAV 유전자 분절은 TRAV25, TRAV12-3, 또는 TRAV21이고; TRAJ 유전자 분절은 TRAJ16, TRAJ3, 또는 TRAJ35이고; TRBV 유전자 분절은 TRBV6-6, TRBV24-1 또는 TRBV30이고; TRBD 유전자 분절은 TRBD1 또는 TRBD2이고; TRBJ 유전자 분절은 TRBJ1-1, TRBJ2-5, TRBJ2-3 또는 TRBJ2-7이다.
일부 실시형태에서, Va 영역의 CDR은 인간 TRAV 유전자 분절 및 인간 TRAJ 유전자 분절으로부터의 서열에 의해 인코딩되며, 여기서 TRAV 유전자 분절은 TRAV17이고 TRAJ 유전자 분절은 TRAJ11이다. 일부 실시형태에서, Vb 영역의 CDR은 인간 TRBV 유전자 분절, 인간 TRBD 유전자 분절, 및 인간 TRBJ 유전자 분절로부터의 서열들에 의해 인코딩되며, 여기서 TRBV 유전자 분절은 TRBV6-5이고; TRBD 유전자 분절은 TRBD1 또는 TRBD2이고; TRBJ 유전자 분절은 TRBJ2-1 또는 TRBJ1-2이다.
일부 실시형태에서, Va 영역의 CDR은 인간 TRAV 유전자 분절 및 인간 TRAJ 유전자 분절으로부터의 서열에 의해 인코딩되며, 여기서 TRAV 유전자 분절은 TRAV21이고 TRAJ 유전자 분절은 TRAJ33이다. 일부 실시형태에서, Vb 영역의 CDR은 인간 TRBV 유전자 분절, 인간 TRBD 유전자 분절, 및 인간 TRBJ 유전자 분절으로부터의 서열에 의해 인코딩되며, 여기서 TRBV 유전자 분절은 TRBV10-2이고; TRBD 유전자 분절은 TRBD1이고; TRBJ 유전자 분절은 TRBJ2-7이다.
본 발명은 또한 TCR에 대해 상기 기재된 하나 이상의 CDR을 함유하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다. 일부 실시형태들에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 알파 사슬에 함유된 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 및 베타 사슬에 함유된 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3을 함유하는 가변 중쇄 및 경쇄를 함유한다.
본 발명은 또한 TCR a 사슬 가변 영역, TCR b 사슬 가변 영역, 면역글로불린 중쇄 가변 영역 또는 면역글로불린 경쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산을 제공한다. 가변 영역은 도 2 내지 4에 도시된 바와 같은 CDR을 포함한다. 폴리펩티드가 상응하는 폴리펩티드(예를 들어, 상응하는 a 사슬 가변 영역 또는 상응하는 b 사슬 가변 영역)와 쌍을 이룰 때, 쌍을 이룬 폴리펩티드는 관심 항원(예를 들어, EBV LMP2)에 결합한다.
일부 실시형태에서, 관심 항원에 결합함으로써, TCR 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 TCR 유래 결합 분자는 (예를 들어, TCR 신호전달 경로를 활성화함으로써) T 세포를 활성화할 수 있다. 일부 실시형태들에서, 이러한 활성화는 면역 반응을 상향 조절하고, 사이토카인(예를 들어, IFNγ) 및/또는 CD107a의 발현을 증가시키고, T 세포 증식 및 T 세포 매개 사멸을 촉진할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 TCR 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 TCR 유래 결합 분자는 T 세포의 면역 반응, 활성 또는 수를 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 2배, 3배, 5배, 10배, 20배 만큼 증가시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, TCR 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 TCR 유래 결합 분자는 관심 항원이 존재할 때 IFN-γ의 혈청 농도를 증가시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 이러한 활성화는 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 1배, 2배, 5배, 10배, 100배, 또는 1000배의 IFN-γ 혈청 농도 증가를 유도할 수 있다. 일부 실시형태에서, 이러한 활성화는 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 1배, 2배, 3배, 4배, 또는 5배의 표적 세포의 특이적 사멸 증가를 유도할 수 있다.
일부 양상에서, 상기 제공된 재조합 TCR은 적어도 부분적으로 CD8-독립적인 TCR을 포함한다. 일부 양상에서, 제공된 재조합 TCR은 적어도 부분적으로 CD8-의존성인 TCR을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 TCR 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 TCR 유래 결합 분자는 EBV LMP2 에피토프에 특이적으로 결합한다. 일부 실시형태에서, 에피토프는 서열번호 139 내지 142, 167 및 168로부터 선택된 서열을 갖는다. 결합 친화도는 동역학 속도 상수의 비율(KD=koff/kon)로부터 추론할 수 있다. 일부 실시형태들에서, KD는 1 x 10-6M 미만, 1 x 10-7M 미만, 1 x 10-8 M 미만, 1 x 10-9 M 미만, 또는 1 x 10-10 M 미만이다. 일부 실시형태들에서, KD는 50nM, 30 nM, 20 nM, 15 nM, 10 nM, 9 nM, 8 nM, 7 nM, 6 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM, 또는 1 nM 미만이다. 일부 실시형태에서, KD는 1 x 10-7 M 초과, 1 x 10-8 M 초과, 1 x 10-9 M 초과, 1 x 10-10 M 초과, 1 x 10-11 M 초과, 또는 1 x 10-12 M 초과이다. 항원에 대한 결합 분자의 친화도를 측정하기 위한 일반적인 기술에는, 예를 들어, ELISA, RIA 및 표면 플라즈몬 공명(SPR)이 포함된다.
일부 실시형태에서, TCR 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 TCR 유래 결합 분자는 상대적으로 높은 발현 효율을 갖는다. 예를 들어, 본원에 기재된 TCR 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 TCR 유래 결합 분자에 대한 발현 효율은 동일한 조건하의 참조 분자 보다 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50% 또는 100% 더 높을 수 있다.
일부 실시형태에서, 결합 분자, 예를 들어, TCR은 교차 반응성 또는 오프 타겟 결합, 예를 들어, 바람직하지 않은 오프 타겟 결합, 예를 들어, 건강한 또는 정상 조직 또는 세포에 존재하는 항원에 대한 오프 타겟 결합을 나타내지 않는다.
EBV 감염 및 암
엡스타인 바 바이러스(EBV)는 발암성으로 확인된 최초의 바이러스 중 하나였다. EBV는 CD21 및 MHC 클래스 II와의 상호 작용을 통해 B 세포 감염에 매우 효과적이다. EBV는 또한 상피 세포에 감염되어 유지될 수 있다. 사실상 전 세계의 모든 성인이 EBV에 노출된 적이 있다. 면역 저하가 없는 경우, 어린 시절의 초기 노출은 세포 면역 반응에 의해 제어되는 자기 제한적 질병을 가져온다. 엡스타인 바 바이러스(EBV) 및 EBV 관련 질병에 대한 면역 방어의 존재는 잘 알려져 있다. 바이러스 단백질에 대한 숙주의 항원 특이적 T 세포 생성은 바이러스에 대해 매우 효과적이다. 그러나 EBV는 완전히 제거되지 않고 상피 세포 또는 B 세포에서 지속될 수 있다. 숙주의 면역 상태의 변화는 재활성화를 초래할 수 있으며 면역 손상 정도에 따라 이러한 재활성화는 악성 종양을 초래할 수 있다.
EBV는 고형 기관 및 조혈 세포 이식(HSCT)에 관여하며 T 세포의 수가 감소하거나 부재하면 EBV를 보유하고 있는 B 세포의 무제한 증식을 유발할 수 있다. 이러한 제어되지 않은 증식은 가장 흔한 이식 후 악성 종양인 이식 후 림프증식성 질병(PTLD)을 유발할 수 있다. 이 증후군의 빈도와 강도는 환자마다 다르며 면역 억제가 T 세포 집단에 미치는 영향도 다르다. EBV는 또한 다른 악성종양에도 관여한다. 여러 연구 분야에서 EBV가 다양한 상피 및 림프성 악성 종양의 병인에 연루되어 있다. 예를 들어, 호지킨(Glaser, et al. “Epstein-Barr virus-associated Hodgkin's disease: epidemiologic characteristics in international data.” International journal of cancer 70.4 (1997): 375-382) 및 비호지킨 림프종은 EBV에 관련되는 것으로 널리 공지되어 있다. 또한 EBV와 비인두 암종 사이에는 분명한 인과 관계가 있다(NPC; Raab-Traub “Nasopharyngeal carcinoma: an evolving role for the Epstein-Barr virus.” Epstein Barr Virus Volume 1. Springer, Cham, 2015. 339-363). 호지킨 림프종 및 NPC 환자의 종양 샘플들은 잠복기 막 단백질 2(LMP2)를 포함한 EBV 유래 단백질을 발현시킨다. 이러한 바이러스 단백질은 비-자기이고 EBV에 대한 세포 면역 반응의 주요 표적이기 때문에 항암 면역요법의 이상적인 표적이 된다.
EBV와 관련된 LMP2(+) 인간 악성종양 목록에는 버킷 림프종, 면역억제성 림프종, 미만성 거대 B 세포 림프종, 만성 염증과 관련된 미만성 거대 B 세포 림프종, 림프종양 육아종증, 형질모구 림프종, 원발성 삼출 림프종, 이식 후 림프증식성 장애, 비인두 암종, 위 선암종, 림프상피종 관련 암종 및 면역결핍 관련 평활근육종이 포함된다. 이러한 장애는, 예를 들어, WO/2019/213416 A1; Thompson et al., “Epstein-Barr virus and cancer.” Clinical Cancer Research 10.3 (2004): 803-821에 기재되어 있으며, 이들 모두 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
휴지기 B 세포의 EBV 감염/변형은 잠복기 림프모세포종 계열(LCL)을 생성한다. LCL은 잠복기 복제에 존재하며 바이러스 게놈의 여러 사본들을 에피솜으로 운반한다. 이들은 잠복기 단계에 따라 달라지는 잠복성 단백질들로 명명된 많은 바이러스 유전자 생성물을 발현한다. 다음과 같은 총 10개의 잠복기 단백질이 설명된 바 있다: 6개의 엡스타인 바이러스 핵 항원(EBNA 1, 2, 3A, 3B, 3C 및 LP), 3개의 잠복성 막 단백질(LMP 1, 2A 및 2B) 및 BARF1. 초기 EBV 감염은 B 세포를 활성화하고 EBNA1, EBNA2, EBNA3, LMP1, LMP2 및 BARF1이 발현될 때 잠복기 III을 유도한다. 이들 단백질은, 예를 들어, Bollard, et al., “T-cell therapy in the treatment of post-transplant lymphoproliferative disease.” Nature reviews Clinical oncology 9.9 (2012): 510에 기재되어 있으며, 이는 본원에 그 전문이 참고로 포함된다.
본 발명은 EBV 감염 및/또는 EBV 유발 질병 및 장애를 치료하는 방법을 제공한다.
조작된 세포
본 발명은 TCR 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 본원에 기재된 다른 유사한 항원-결합 분자를 포함하는 조작된 세포(예를 들어, T 세포)를 제공한다. 이들 조작된 세포는 본원에 기재된 다양한 장애 또는 질병(예를 들어, 바이러스 감염, 암, 바이러스 유발된 장애)을 치료하는 데 사용될 수 있다.
다양한 실시형태에서, 조작된 세포는, 예를 들어, 인간 및 인간이 아닌 동물로부터 얻을 수 있다. 다양한 실시형태에서, 조작된 세포는 박테리아, 진균, 인간, 래트, 마우스, 토끼, 원숭이, 돼지 또는 임의의 다른 종으로부터 얻을 수 있다. 바람직하게는, 세포는 인간, 래트 또는 마우스로부터 유래한다. 보다 바람직하게는, 세포는 인간으로부터 얻은 세포이다. 다양한 실시형태에서, 조작되는 세포는 혈액 세포이다. 바람직하게는, 이러한 세포는 백혈구(예를 들어, T 세포), 림프구 또는 임의의 다른 적합한 혈액 세포 유형이다. 일부 실시형태에서, 이러한 세포는 말초 혈액 세포이다. 일부 실시형태에서, 이러한 세포는 T 세포, B 세포 또는 NK 세포이다.
일부 실시형태에서, 이러한 세포는 T 세포이다. 일부 실시형태에서, T 세포는 표적 세포의 표면 상의 특정 항원 모이어티를 인식하는 세포 표면 수용체를 발현할 수 있다. 세포 표면 수용체는 야생형 또는 재조합 T 세포 수용체(TCR), 키메라 항원 수용체(CAR), 또는 표적 세포와 관련된 항원 모이어티를 인식할 수 있는 임의의 다른 표면 수용체일 수 있다. T 세포는 당업계에 공지된 다양한 방법, 예를 들어, 환자로부터 단리된 T 세포(예를 들어, 종양 침윤 림프구)의 시험관내 배양에 의해 수득될 수 있다. TCR 유전자 변형된 T 세포는 T 세포(예를 들어, 환자의 말초 혈액에서 단리됨)에 바이러스 벡터를 형질도입하여 얻을 수 있다. 일부 실시형태에서, T 세포는 TCR 유전자 변형된 T 세포이다. 일부 실시형태에서, T 세포는 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포 또는 조절 T 세포이다. 일부 실시형태에서, T 세포는 T 헬퍼 1형 T 세포 및 T 헬퍼 2형 T 세포이다. 일부 실시형태에서, 이러한 수용체를 발현하는 T 세포는 αβ-T 세포이다. 다른 실시형태에서, 이러한 수용체를 발현하는 T 세포는 γδ-T 세포이다.
일부 실시형태에서, 세포는 NK 세포이다. 일부 실시형태에서, 조작된 세포의 제조는 하나 이상의 배양 및/또는 제조 단계를 포함한다. 결합 분자, 예를 들어, TCR을 도입하기 위한 세포는 샘플, 예를 들어, 생물학적 샘플, 예를 들어, 대상체로부터 얻거나 이로부터 유래된 샘플로부터 단리될 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포가 단리되는 대상체는 질병 또는 병태에 걸렸거나 세포 요법이 필요하거나 세포 요법이 투여될 대상체이다. 일부 실시형태에서 대상체는 세포가 단리, 가공 및/또는 조작되는 입양 세포 요법과 같은 특정 치료 개입이 필요한 인간이다.
일부 실시형태에서, 세포는 유도 만능 줄기 세포(iPSC)를 비롯한 다능성 및 만능 줄기 세포와 같은 줄기 세포이다. 세포는 일차 세포, 예를 들어, 대상체로부터 직접 단리된 세포이고/이거나 대상체로부터 단리되어 동결될 수 있다. 일부 실시형태에서, 줄기 세포는 추가의 분화 인자와 함께 배양되어 원하는 세포 유형(예를 들어, T 세포)을 얻는다.
적절한 단리 방법을 통해 다양한 세포 유형을 얻을 수 있다. 단리 방법은 하나 이상의 특정 분자, 예를 들어, 표면 마커, 예를 들어, 표면 단백질, 세포내 마커 또는 핵산의 세포에서의 발현 또는 존재에 기초하여 상이한 세포 유형을 분리하는 것을 포함한다. 일부 실시형태들에서, 이러한 마커들에 기초한 공지된 분리 방법이 사용될 수 있다. 일부 실시형태들에서, 분리는 친화성 또는 면역친화성 기반 분리이다. 예를 들어, 일부 양상에서 단리는 세포의 발현 또는 하나 이상의 마커, 전형적으로 세포 표면 마커의 발현 수준에 기초한 세포 및 세포 집단의 분리를 포함하는데, 이는, 예를 들어, 이러한 마커에 특이적으로 결합하는 항체 또는 결합 짝과 인큐베이션하고, 후속하여 일반적으로 세척 단계 및 항체 또는 결합 짝에 결합하지 않은 세포들로부터 항체 또는 결합 짝에 결합한 세포들을 분리함에 의한다.
이러한 분리 단계는 시약들이 결합된 세포가 추후 사용을 위해 유지되는 양성 선택 및/또는 항체 또는 결합 짝에 결합되지 않은 세포가 유지되는 음성 선택을 기반으로 할 수 있다. 일부 예에서, 두 분획들 모두가 추후 사용을 위해 유지된다. 일부 양상에서, 음성 선별은 이종 집단에서 세포 유형을 특이적으로 식별하는 이용가능한 항체가 없는 경우에 특히 유용할 수 있으며, 따라서 분리는 원하는 집단 이외의 세포에 의해 발현되는 마커들에 기초하여 가장 잘 수행된다.
또한 결합 분자를 발현하기 위한, 그리고 이러한 결합 분자를 발현하는 유전적으로 조작된 세포를 생산하기 위한 방법, 핵산, 조성물 및 키트가 제공된다. 유전자 조작은 일반적으로 치료 분자, 예를 들어, TCR, CAR, 예를 들어, TCR-유사 CAR, 폴리펩티드, 융합 단백질을 인코딩하는 핵산을, 예를 들어, 레트로바이러스 형질도입, 형질감염 또는 형질전환에 의해 세포 내로 도입하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 유전자 전달은 먼저 세포를 자극함으로써, 예를 들어, 세포를 사이토카인 또는 활성화 마커의 발현에 의해 측정되는 증식, 생존 및/또는 활성화와 같은 반응을 유도하는 자극과 조합하고, 이어서 활성화된 세포를 형질도입하고, 그리고 배양에서 임상 적용에 충분한 수까지 증식시킴으로써 이루어진다.
일부 실시형태에서, 재조합 핵산은 재조합 감염성 바이러스 입자, 예를 들어, 유인원 바이러스 40(SV40), 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스(AAV)로부터 유래된 벡터를 사용하여 세포 내로 전달된다. 일부 실시형태에서, 재조합 핵산은 재조합 렌티바이러스 벡터 또는 레트로바이러스 벡터, 예를 들어, 감마-레트로바이러스 벡터를 사용하여 T 세포로 전달된다. 일부 실시형태에서, 레트로바이러스 벡터는 긴 말단 반복 서열(LTR)을 가지는데, 예를 들어, 레트로바이러스 벡터는 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스(MoMLV), 골수증식성 육종 바이러스(MPSV), 뮤린 배아 줄기 세포 바이러스(MESV), 뮤린 줄기 세포 바이러스(MSCV) 또는 비장 초점 형성 바이러스(SFFV)로부터 유래된다. 대부분의 레트로바이러스 벡터는 뮤린 레트로바이러스에서 유래된다. 일부 실시형태에서, 레트로바이러스는 임의의 조류 또는 포유동물 세포 출처로부터 유래된 것을 포함한다. 레트로바이러스는 일반적으로 암포트로픽(amphotropic)인데, 이는 인간을 포함한 여러 종의 숙주 세포를 감염시킬 수 있음을 의미한다. 일부 실시형태에서, 벡터는 렌티바이러스 벡터이다. 일부 실시형태에서, 재조합 핵산은 전기천공을 통해 T 세포로 전달된다. 일부 실시형태에서, 재조합 핵산은 전위(transposition)를 통해 T 세포로 전달된다. 면역 세포에 유전 물질을 도입하고 발현시키는 다른 방법에는 인산칼슘 형질감염, 원형질체 융합, 양이온성 리포좀-매개 형질감염; 텅스텐 입자 촉진 미립자 충격 및 인산스트론튬 DNA 공침이 포함된다. 이들 방법 중 다수는, 예를 들어, WO2019195486에 설명되어 있으며, 이 문헌은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
일부 양상에서, 인간화 및/또는 완전 인간 재조합 TCR의 개발은 기술적 과제를 제시한다. 예를 들어, 일부 양상에서, 인간화 및/또는 완전 인간 재조합 TCR 수용체는 인간 T 세포로 조작될 때 내인성 TCR 복합체와 경쟁할 수 있고/있거나 내인성 TCRa 및/또는 TCRb 사슬과 미스페어링을 형성할 수 있으며, 이는 특정 양상에서 재조합 TCR 신호전달, 활성 및/또는 발현을 감소시킬 수 있고, 궁극적으로 조작된 세포의 활성을 감소시킬 수 있다.
조작된 세포는 유전적으로 변형될 수 있다. 일부 실시형태에서, 조작된 세포는 T 세포 수용체 알파 불변(TRAC) 유전자 및/또는 T 세포 수용체 베타 불변(TRBC) 유전자의 유전적 파괴를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, TRBC 유전자는 T 세포 수용체 베타 불변 1(TRBCJ) 또는 T 세포 수용체 베타 불변 2(TRBC2) 유전자 중 하나 또는 둘 모두이다. 일부 실시형태에서, 조작된 세포는 내인성 TCR a 사슬 및/또는 TRC b 사슬을 발현하지 않는다. 일부 다른 양상에서, 비-인간 불변 도메인, 예를 들어, 설치류(예를 들어, 마우스) 불변 도메인이 사용된다. 비-인간 불변 도메인을 사용하면 미스페어링 오류의 가능성을 효과적으로 줄일 수 있다.
또한 조작된 세포, 이러한 세포들을 포함하고/하거나 이러한 세포들이 풍부한 조성물의 집단이 제공되는데, 예를 들어, 이러한 집단에서 결합 분자를 발현하는 세포는 특정 유형, 예를 들어, T 세포, CD8+ 또는 CD4+ 세포의 조성물 또는 세포 내 전체 세포의 적어도 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상을 구성한다.
재조합 벡터
본 발명은 또한 본원에 개시된 단리된 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 본원에 개시된 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드)를 포함하는 재조합 벡터(예를 들어, 발현 벡터), 재조합 벡터가 도입되는 숙주 세포(즉, 그리하여 숙주 세포는 폴리뉴클레오티드 및/또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함함), 및 재조합 기술에 의한 재조합 폴리펩티드 또는 이의 단편의 생산을 제공한다.
본원에서 사용되는 “벡터”는 벡터가 숙주 세포에 도입될 때 하나 이상의 관심 폴리뉴클레오티드(들)를 숙주 세포에 전달할 수 있는 임의의 구조체이다. “발현 벡터”는 발현 벡터가 도입된 숙주 세포에서 인코딩된 폴리펩티드로서 하나 이상의 관심 폴리뉴클레오티드(들)를 전달 및 발현할 수 있다. 따라서, 발현 벡터에서, 관심 폴리뉴클레오티드는 벡터 내 발현을 위해 프로모터, 인핸서 및/또는 폴리-A 꼬리와 같은 조절 요소와 작동가능하게 연결됨으로써 벡터 내에 또는 관심 폴리뉴클레오티드의 통합 부위에 또는 근처에 또는 양상에 있는 숙주 세포의 게놈 내에 위치되고, 그 결과 관심 폴리뉴클레오티드는 발현 벡터에 의해 도입된 숙주 세포에서 번역될 수 있게 된다.
벡터는 당업계에 공지된 방법, 예를 들어, 전기천공법, 화학적 형질감염(예를 들어, DEAE-덱스트란), 형질전환, 형질감염 및 감염 및/또는 형질도입(예를 들어, 재조합 바이러스 사용)에 의해 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 따라서, 벡터의 비제한적 예는, 바이러스 벡터(재조합 바이러스 생성에 사용될 수 있음), 네이키드 DNA 또는 RNA, 플라스미드, 코스미드, 파지 벡터, 및 양이온성 축합제와 결합된 DNA 또는 RNA 발현 벡터를 포함한다.
본 발명은 세포를 유전적으로 변형시키는데 적합한 핵산 구조체를 포함하는 재조합 벡터를 제공하며, 이는 병리학적 질병 또는 병태의 치료에 사용될 수 있다.
모든 벡터 또는 벡터 유형을 사용하여 유전 물질을 세포에 전달할 수 있다. 이러한 벡터에는 플라스미드 벡터, 바이러스 벡터, 박테리아 인공 염색체(BAC), 효모 인공 염색체(YAC) 및 인간 인공 염색체(HAC)가 포함되지만 이에 제한되지 않는다. 바이러스 벡터는 재조합 레트로바이러스 벡터, 재조합 렌티바이러스 벡터, 재조합 아데노바이러스 벡터, 발포형 바이러스 벡터, 재조합 아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터, 하이브리드 벡터 및 플라스미드 트랜스포존(예를 들어, 잠자는 숲속의 미녀 트랜스포존 시스템, 및 PiggyBac 트랜스포존 시스템) 또는 통합효소 기반 벡터 시스템을 포함할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 당업계에 공지된 다른 벡터도 본원에 기재된 방법과 관련하여 사용될 수 있다.
일부 실시형태들에서, 벡터는 바이러스 벡터이다. 바이러스 벡터는 바이러스 벡터 제조에 특이적인 배양 배지에서 성장시킬 수 있다. 본원에 기재된 실시예에 따라 성장하는 바이러스 벡터를 위한 임의의 적합한 성장 배지 및/또는 보충제가 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 사용되는 벡터는 재조합 레트로바이러스 벡터이다. 레트로바이러스 벡터는 관심 핵산 분자의 발현을 지시할 수 있다. 레트로바이러스는 바이러스 캡슐에 RNA 형태로 존재하며 숙주 세포에서 복제할 때 이중 가닥 DNA 중간체를 형성한다. 유사하게, 레트로바이러스 벡터는 RNA 및 이중 가닥 DNA 형태 모두에 존재한다. 레트로바이러스 벡터는 또한 재조합 DNA 단편을 포함하는 DNA 형태와 재조합 RNA 단편을 포함하는 RNA 형태를 포함한다. 벡터는 적어도 하나의 전사 프로모터/인핸서, 또는 유전자 발현을 제어하는 다른 요소를 포함할 수 있다. 이러한 벡터는 또한 패키징 신호, 긴 말단 반복서열(LTR) 또는 그 일부, 사용된 레트로바이러스에 적절한 양성 및 음성 가닥 프라이머 결합 부위를 포함할 수 있다. 긴 말단 반복서열(LTR)은 레트로바이러스 RNA의 역전사에 의해 형성된 레트로트랜스포존 또는 프로바이러스 DNA의 양쪽 단부에서 발견되는 여러 번(예를 들어, 수백 또는 수천 번) 반복되는 동일한 DNA 시퀀스이다. 이들은 바이러스가 유전 물질을 숙주 게놈에 삽입하는 데 사용된다. 선택적으로, 벡터는 또한 폴리아데닐화를 지시하는 신호, 암피실린 내성, 네오마이신 내성, TK, 히그로마이신 내성, 플레오마이신 내성 히스티디놀 내성 또는 DHFR과 같은 선별가능한 마커, 뿐만 아니라 하나 이상의 제한 부위 및 번역 종결 서열을 포함할 수 있다. 예로서, 이러한 벡터는 5' LTR, 리딩 서열, tRNA 결합 부위, 패키징 신호, 제2 가닥 DNA 합성의 기점 및 3' LTR 또는 이의 일부를 포함할 수 있다. 또한, 본원에서 사용되는 레트로바이러스 벡터는 레트로바이러스 gag, pol 및 env 유전자를 제거하고 관심 유전자로 대체하여 생성된 재조합 벡터를 의미할 수도 있다.
일부 실시형태에서, MP71(또는 pMP71) 벡터가 사용된다. MP71 레트로바이러스 벡터 구조체는 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 생성된다. 일부 실시형태에서, MP71 레트로바이러스 벡터는 P2A 서열에 의해 연결된 다음과 같은 2개의 유전자를 함유한다: (1) 마우스 TCR 알파 사슬의 불변 영역에 융합된 인간 항-LMP2 TCR의 알파 사슬의 가변 영역; (2) 마우스 TCR 베타 사슬의 불변 영역에 융합된 동일한 인간 항-LMP2 TCR의 베타 사슬 가변 영역. (도 1)
일부 실시형태에서, 벡터는 억제 단백질(예를 들어, 체크포인트 억제제)을 인코딩하는 추가적인 핵산을 포함할 수 있다. 다양한 실시형태에서, 세포는 유전적으로 조작된 항원 수용체 및 억제 단백질을 발현한다. 다양한 실시형태에서, 억제 단백질은 항시적으로 발현된다.
일부 실시형태에서, 벡터 또는 구조체는 하나 이상의 핵산 분자의 발현을 유도하는 단일 프로모터를 함유할 수 있다. 일부 실시형태에서, 이러한 프로모터는 멀티시스트론(바이시스트론 또는 트리시스트론)일 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 전사 단위는 IRES(내부 리보솜 진입 부위)를 함유하는 바이시스트론 단위로 조작될 수 있는데, 이는 (예를 들어, TCR의 알파 사슬 및/또는 베타 사슬을 인코딩하는) 유전자 생성물들이 단일 프로모터로부터의 메시지에 의해 공동 발현될 수 있게 한다. 대안적으로, 일부 경우에, 단일 프로모터는, 자가 절단 펩티드(예를 들어, P2A 또는 T2A) 또는 프로테아제 인식 부위(예를 들어, 퓨린)를 인코딩하는 서열들에 의해 서로 간 분리된 (예를 들어, TCR의 알파 사슬 및/또는 베타 사슬을 인코딩하는) 2개 또는 3개의 유전자를 단일 오픈 리딩 프레임(ORF)에 포함하는 RNA의 발현을 지시할 수 있다. 따라서 ORF는 단일 다중단백질을 인코딩하며, 이는 번역 중에 (2A의 경우, 예를 들어, T2A) 또는 번역 후에 개별 단백질로 절단된다. 경우에 따라, T2A와 같은 펩티드는 리보솜이 2A 요소의 C-말단에서 펩티드 결합의 합성을 스킵하게 하여(리보솜 스키핑, ribosome skipping) 2A 서열의 단부와 다음 펩티드 하류 사이를 분리시킬 수 있다.
본원에 기재된 벡터와 관련하여 다양한 세포주가 사용될 수 있다. 폴리펩티드를 발현하는데 사용될 수 있는 예시적인 진핵 세포는 COS 7 세포를 비롯한 COS 세포; 293-6E 세포를 비롯한 293 세포; CHO-S, DG44, Lec13 CHO 세포 및 FUT8 CHO 세포를 비롯한 CHO 세포; PER.C6® 세포; 및 NSO 세포를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 일부 실시형태에서, 특정 진핵 숙주 세포는 결합 분자에 원하는 번역후 변형을 만드는 능력에 기초하여 선택된다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, CHO 세포는 293 세포에서 생산된 동일한 폴리펩티드보다 더 높은 수준의 시알화를 갖는 폴리펩티드를 생산한다.
한 양상에서, 본 발명은 또한 다음을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산에 관한 것이다:
(1) 각각 도 2 내지 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역(CDR) 1, 2 및 3을 포함하는 a 사슬 가변 영역(Va)을 포함하는 TCR a 사슬 또는 이의 단편, 여기서 Va는 상응하는 b 사슬 가변 영역(Vb)과 페어링 될 때 LMP2에 결합하고; 및/또는
(2) 각각 도 2 내지 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역(CDR) 1, 2 및 3을 포함하는 b 사슬 가변 영역(Vb)을 포함하는 TCR b 사슬 또는 이의 단편, 여기서 Vb는 상응하는 a 사슬 가변 영역(Va)과 페어링 될 때 LMP2에 결합한다.
일부 실시형태에서, Va는 Vb와 페어링 될 때 EBV LMP2에 특이적으로 결합하거나, Vb는 Va와 페어링 될 때 EBV LMP2에 특이적으로 결합한다. 일부 실시형태에서, 핵산은 cDNA이다.
한 양상에서, 본 발명은 본원에 기재된 하나 이상의 핵산을 포함하는 벡터에 관한 것이다. 한 양상에서, 본 발명은 또한 본원에 기재된 2개의 핵산을 포함하는 벡터에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 벡터는 EBV 항원에 함께 결합하는 Va 영역 및 Vb 영역을 인코딩한다.
한 양상에서, 본 발명은 한 쌍의 벡터에 관한 것이며, 여기서 각각의 벡터는 본원에 기재된 핵산 중 하나를 포함하고, 이 때 벡터 쌍은 함께 EBV 항원에 함께 결합하는 Va 영역 및 Vb 영역을 인코딩한다.
한 양상에서, 본 발명은 본원에 기재된 벡터 또는 벡터 쌍을 포함하는 세포에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 이러한 세포는 T 세포이다.
경우에 따라 특정 TCR은 내인성 TCR 사슬 및/또는 기타 요인들과의 미스페어링 및/또는 경쟁으로 인해 부분적으로 불량한 발현 또는 활성을 나타낼 수 있다. 이러한 문제를 해결하는 한 가지 방법은 내인성 인간 TCR a 또는 b 사슬과의 미스페어링을 방지하기 위해 마우스 불변 도메인을 가진 재조합 TCR을 설계하는 것이었다. 그러나 마우스 서열들이 있는 재조합 TCR을 사용하면 면역 반응에 대한 위험이 나타날 수 있다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 TCR 사슬을 인코딩하는 내인성 유전자에 예를 들어, 유전자 편집에 의해 유전자 파괴가 도입된다.
도 1에 도시된 바와 같이, 핵산 구조체는 P2A 서열로 연결된 다음과 같은 두 개의 유전자를 포함하는 레트로바이러스 벡터 pMP71에 클로닝된다: (1) 마우스 TCR 알파 사슬의 불변 영역에 융합된 인간 항-LMP2 TCR의 알파 사슬의 가변 영역; (2) 마우스 TCR 베타 사슬의 불변 영역에 융합된 동일한 인간 항-LMP2 TCR의 베타 사슬 가변 영역. 일부 실시형태에서, 핵산 구조체는 신호 펩티드를 인코딩하는 서열을 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 억제 단백질은 항-PD-1 항체(예를 들어, 항-PD-1 scFV)이다.
본원에서 사용된 용어 “링커”(L) 또는 “링커 도메인” 또는 “링커 영역”은 길이가 약 1 내지 100개 아미노산인 올리고- 또는 폴리펩티드 영역을 지칭하며, 이는 상기 도메인/영역을 함께 연결한다. 링커는 인접한 단백질 도메인들이 서로에 대해 자유롭게 이동할 수 있도록 글리신 및 세린과 같은 유연한 잔기로 구성될 수 있다. 두 개의 인접한 도메인들이 서로 입체적으로 간섭하지 않도록 하는 것이 바람직할 때 더 긴 링커를 사용할 수 있다. 링커는 절단 가능하거나 절단 불능할 수 있다. 절단가능한 링커의 예는 2A 링커(예를 들어, P2A, T2A), 2A-유사 링커 또는 이의 기능적 균등물 및 이의 조합을 포함한다. 일부 실시형태에서, 링커는 피코나바이러스 2A-유사 링커, 돼지 테스코바이러스(P2A)의 CHYSEL 서열, 테세아 아시그나 바이러스(T2A) 또는 이들의 조합, 변이체 및 기능적 균등물을 포함한다. 다른 링커는 당업자에게 명백할 것이고 본원에 기재된 방법에서 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 TCR, 이의 항원 결합 단편, 및/또는 TCR-유래 결합 분자(예를 들어, 본원에 기재된 이의 기능적 부분 및 기능적 변이체, 폴리펩티드 또는 단백질 포함)를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 서열을 제공한다. 본원에서 사용되는 “핵산”은 “폴리뉴클레오티드”, “올리고뉴클레오티드” 및 “핵산 분자”를 포함할 수 있으며, 일반적으로 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있는 DNA 또는 RNA의 중합체를 의미하며, 합성되거나 천연 출처로부터 얻을 수 있고, 천연, 비천연 또는 변경된 뉴클레오티드를 포함할 수 있는 있다. 또한, 핵산은 상보적 DNA(cDNA)를 포함한다. 핵산은 임의의 삽입, 결실, 역위 및/또는 치환을 포함하지 않는 것이 일반적으로 바람직하다. 그러나, 본원에서 논의된 바와 같이, 경우에 따라 핵산이 하나 이상의 삽입, 결실, 역위 및/또는 치환을 포함하는 것이 적합할 수 있다.
본원에 기재된 핵산은 당업계에 공지된 절차를 사용하여 화학적 합성 및/또는 효소 결찰 반응에 기초하여 제작될 수 있다. 예를 들어, 핵산은 천연 발생 뉴클레오티드 또는 다양하게 변형된 뉴클레오티드를 사용하여 화학적으로 합성될 수 있다. 이러한 일부 실시형태에서, 뉴클레오티드 서열은 코돈-최적화된다.
본 발명은 또한 본원에 기재된 임의의 핵산의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열 또는 엄격한 조건 하에 본원에 기재된 임의의 핵산의 뉴클레오티드 서열에 혼성화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 제공한다.
일부 실시형태에서, 알파 사슬을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 베타 사슬을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 리보솜 스키핑(ribosome skipping)를 유발하는 펩티드 서열에 의해 분리된다. 일부 실시형태에서, 리보솜 스키핑을 유발하는 펩티드는 P2A 또는 T2A 펩티드이다. 일부 실시형태들에서, 핵산은 합성이다. 일부 실시형태에서, 핵산은 cDNA이다.
일부 실시형태에서, 벡터는 체크포인트 억제제(CPI)(예를 들어, 억제 단백질)를 인코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 체크포인트 억제제는, 예를 들어, 본원에 기재된 임의의 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 일부 실시형태들에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 PD-1, PD-L1, PD-L2, 2B4 (CD244), 4-1BB, A2aR, B7.1, B7.2, B7-H2, B7-H3, B7-H4, B7-H6, BTLA, 부티로필린, CD160, CD48, CTLA4, GITR, gp49B, HHLA2, HVEM, ICOS, ILT-2, ILT-4, KIR 계열 수용체, LAG-3, OX-40, PIR-B, SIRP알파 (CD47), TFM-4, TIGIT, TIM-1, TIM-3, TIM-4, 또는 VISTA에 특이적으로 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 억제 단백질은 scFv(예를 들어, 항-PD-1 scFv)이다.
일부 실시형태에서, 벡터는 이중기능성 트랩 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 이중기능성 트랩 단백질은 PD-1 및 TGF-β 모두를 표적으로 한다. 일부 실시형태에서, 이중기능성 트랩 단백질은 PD-L1 및 TGF-β 모두를 표적으로 한다. 일부 실시형태에서, 이중기능성 융합 단백질은 PD-L1을 차단하고 TGF-β를 격리하도록 설계된다. M7824(MSB0011395C)는 인간 IgG1 단클론 항체(mAb) 아벨루맙을 기반으로 인간 항-PD-L1 scFv의 C-말단에 연결된 인간 TGF-β 수용체 II(TGFβRII)의 세포외 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 이중기능성 융합 단백질은 인간 항-PD-1 scFv의 C-말단에 연결된 인간 TGF-β 수용체 II(TGFβRII)의 세포외 도메인을 포함한다.
이러한 임의의 일부 실시형태에서, TCR 또는 이의 항원 결합 단편은 코돈 최적화된 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된다. 특정 실시형태에서, 알파 및/또는 베타 사슬은 신호 펩티드를 추가로 포함한다. 특정 실시형태에서, TCR 또는 이의 항원-결합 단편은 단리 또는 정제되거나 재조합이다. 이러한 임의의 일부 실시형태에서, TCR 또는 항원-결합 단편은 재조합이다. 이러한 임의의 일부 실시형태에서, TCR 또는 이의 항원 결합 단편은 인간이다.
본 발명은 또한 본원에 기재된 임의의 뉴클레오티드 서열에 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일한 핵산 서열, 및 본원에 기재된 임의의 아미노산 서열에 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일한 아미노산 서열을 제공한다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 본원에 기재된 임의의 펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열, 또는 본원에 기재된 임의의 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 임의의 아미노산 서열에 관한 것이다.
일부 실시형태에서, 핵산 서열은 뉴클레오티드가 적어도 또는 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 500 또는 600개이다. 일부 실시형태들에서, 아미노산 서열은 아미노산 잔기가 적어도 또는 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 또는 200개이다. 일부 실시형태에서, 핵산 서열은 뉴클레오티드가 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 500 또는 600개 미만이다. 일부 실시형태들에서, 아미노산 서열은 아미노산 잔기가 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 또는 200개 미만이다.
2개의 아미노산 서열 또는 2개의 핵산 서열의 퍼센트 동일성을 결정하기 위해, 서열들을 최적으로 비교하기 위해 정렬시킨다(예를 들어, 최적의 정렬을 위해 제1 및 제2 아미노산 또는 핵산 서열 중 하나 또는 둘 모두에 갭을 도입할 수 있으며 비상동 서열은 비교시 무시할 수 있다). 이어서 상응하는 아미노산 위치 또는 뉴클레오티드 위치에서 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드를 비교한다. 제 1 서열에서의 위치가 제 2 서열의 상응하는 위치에서와 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드에 의해 점유되면, 이 때 이 분자들은 해당 위치에서 동일하다. 2개 서열들 간 퍼센트 동일성은, 갭의 수, 그리고 2개 서열들의 최적 정렬을 위해 도입될 필요가 있는 각 갭의 길이를 고려한, 해당 서열들이 공유하는 동일한 위치들의 수의 함수이다.
T 세포 수용체 및 TCR 유사 분자를 생성하는 방법
본 발명은 또한 표적 항원을 인식할 수 있는 T 세포 수용체를 식별하고 생성하는 방법을 제공한다. 일부 양상에서, 상기 방법은 정상 공여자 또는 관심 질병 또는 병태에 걸린 환자로부터 유래된 T 세포를 비롯한 T 세포, 예를 들어, 1차 T 세포를 함유하는 생물학적 샘플을 항원에 다회 라운드 노출시키고 평가하는 단계를 수반한다. 일부 양상에서, 라운드는 클래스 I 또는 II MHC와 같은 MHC에 대한 제시를 촉진하기 위해 원하는 펩티드 항원으로 펄싱된 다른 APC 또는 자가 수지상 세포와 같은 인공적인 또는 조작된 항원 제시 세포의 사용을 포함한다.
일부 양상에서, 다회의 항원 노출 라운드가 수행되고 일부 양상에서 T 세포는 1회 이상의 라운드 후에, 예를 들어, 원하는 항원(예를 들어, 펩티드-MHC 사량체)에 결합하는 능력에 기초하여 분류된다.
분류는 해당 분야에 공지된 방법, 예를 들어, 유세포 측정법에 의해 수행될 수 있다. 원하는 항원에 결합할 수 있는 세포(양성 분획) 및 원하는 항원에 효과적으로 결합할 수 없는 세포(음성 분획)를, 예를 들어, 단일 세포 시퀀싱 방법으로 분석한다. 일부 실시형태에서, 각 샘플에 존재하는 TCR 쌍들을 단일 세포 수준에서 식별하기 위해 시퀀싱을 수행한다. 일부 양상에서, 상기 방법은 샘플에 존재하는 주어진 TCR 쌍의 사본 수를 정량화할 수 있고, 그리하여 주어진 샘플에서 주어진 TCR의 풍부도 및/또는 이의 농축을 또 다른 샘플과 비교하여, 예를 들어, 1회 이상의 라운드에 걸쳐 양성(항원-결합) 분획의 농축 또는 풍부도를 음성 분획과 비교하여 평가할 수 있다. 이러한 분석은 항원 특이적 T 세포 수용체(TCR)를 생성하기 위해 수행될 수 있다. 일부 양상에서, 클론 T 세포주가 생성되고, 페어링된 개별 TCR 알파 및 베타 사슬의 서열 및 다양한 집단에서의 이들의 풍부도를 고처리량 페어링된 TCR 시퀀싱을 사용하여 단일 세포 기준으로 결정한다.
TCR 또는 이의 항원 결합 단편은 추가로 변형될 수 있다. 일부 실시형태에서, 결합 분자, 예를 들어, TCR 또는 이의 항원-결합 단편은, 예를 들어, 결합 분자, 예를 들어, 본원에 기재된 TCR의 서열과 비교하여 하나 이상의 아미노산 변이, 예를 들어, 치환, 결실, 삽입 및/또는 돌연변이를 포함한다. 예시적인 변이체는 결합 분자의 결합 친화도 및/또는 다른 생물학적 특성을 개선하도록 설계된 것들을 포함한다. 결합 분자의 아미노산 서열 변이체는 결합 분자를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에 적절한 변형을 도입하거나 펩티드 합성을 통해 제조할 수 있다. 이러한 변형은 예를 들면, 상기 결합 분자의 아미노산 서열로부터의 잔기 결실, 및/또는 이들 아미노산 서열 내부로의 잔기 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 최종 구조체가 원하는 특성, 예를 들어, 항원에 특이적으로 결합하는 한, 최종 구조체에 도달하기 위한 어떠한 결실, 삽입 및 치환의 조합이라도 이루어질 수 있다.
TCR로부터 다양한 결합 분자를 만들 수 있다. 결합 분자, 예를 들어, TCR 또는 이의 항원 결합 단편은, 예를 들어, 결합 분자, 예를 들어, 본원에 기재된 결합 분자, 예를 들어, TCR과 비교하여 및/또는 천연 레퍼토리, 예를 들어, 인간 레퍼토리의 서열과 비교하여 하나 이상의 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 치환 돌연변이유발에 대한 관심 부위는 CDR, FR 및/또는 불변 영역을 포함한다. 아미노산 치환은 관심 결합 분자에 도입될 수 있고 생성물은 원하는 활성, 예를 들어, 유지/개선된 항원 친화도 또는 결합력, 감소된 면역원성, 개선된 반감기, CD8-독립적 결합 또는 활성, 표면 발현, TCR 사슬 페어링의 촉진 및/또는 기타 개선된 속성 또는 기능에 대해 스크리닝될 수 있다.
일부 실시형태에서, 모 결합 분자, 예를 들어, TCR의 CDR 내의 하나 이상의 잔기가 치환된다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 인간 대상체에 투여시 면역원성의 가능성을 감소시키기 위해, 서열 또는 해당 서열 내 위치를 생식계열(예를 들어, 인간 생식계열)에서 발견되는 결합 분자 서열과 같은 생식계열 서열로 되돌리기 위한 치환이 이루어진다.
일부 실시형태에서, 기능적 변이체는 TCR 또는 TCR 유래 결합 분자로부터 만들어진다. 본원에서 사용되는 용어 “기능적 변이체”는 모 분자에 대해 적절한 또는 유의한 서열 동일성을 갖는 결합 분자를 지칭한다. 또한 기능적 변이체는 모 단백질과 동일한 생물학적 활성을 유지한다. 기능적 변이체는 모체 TCR이 항원 특이성을 갖거나 모체 폴리펩티드 또는 단백질이 특이적으로 결합하는 EBV 에피토프에 특이적으로 결합하는 능력을 유지하는 본원에 기재된 TCR 단백질(모체 TCR, 폴리펩티드 또는 단백질)의 변이체를 포함한다. 또한 기능적 변이체의 결합 영역(예를 들어, 가변 도메인)은 모체 TCR 단백질과 유사한 정도, 동일한 정도 또는 더 높은 정도 일 수 있다. 모체 TCR, 폴리펩티드 또는 단백질과 관련하여 기능적 변이체는 아미노산 서열이 TCR, 폴리펩티드 또는 단백질과, 예를 들어, 적어도 약 30%, 50%, 75%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 동일할 수 있다.
치환, 삽입 또는 결실은 이러한 변경이 항원에 결합하는 결합 분자, 예를 들어, TCR 또는 이의 항원 결합 단편의 능력을 실질적으로 감소시키지 않는 한 하나 이상의 CDR에 이루어질 수 있다. 예를 들면, 결합 친화도를 실질적으로 감소시키지 않는 보존적 변경 (예를 들어, 본 명세서에서 제공된 보존적 치환)이 CDR들에 이루어질 수 있다. 이러한 변경은, 예를 들어, CDR들의 항원 접촉 잔기의 외부에 있을 수 있다. 본원에 제공된 가변 서열의 특정 실시형태에서, 각각의 CDR은 변경되지 않거나 1개, 2개 또는 3개 이하의 아미노산 치환을 포함한다.
TCR 유래 항체
본 발명은 또한 상기 기재된 하나 이상의 CDR을 함유하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다. 일부 실시형태들에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 알파 사슬에 함유된 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 및 베타 사슬에 함유된 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3을 함유하는 가변 중쇄 및 경쇄를 함유한다. 일부 실시형태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 도 2 내지 4의 CDR 서열과 적어도 약 80%, 85%, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99% 동일한 하나 이상의 CDR을 함유한다.
일부 실시형태에서, 항체 및 이의 항원 결합 단편, 예를 들어, TCR-유사 항체는 MHC 클래스 I과 같은 MHC 분자와 관련하여 펩티드 에피토프(예를 들어, EBV 항원)를 특이적으로 인식한다. 경우에 따라, 클래스 I 분자는 HLA-A2 분자, 예를 들어, HLA-A2*01이다.
일부 실시형태에서, 항체 및 이의 항원 결합 단편은 MHC 분자 독립적인 방식으로 펩티드 에피토프(예를 들어, EBV 항원)를 특이적으로 인식할 수 있다.
일반적으로 항체(면역글로불린이라고도 함)는 경쇄와 중쇄라는 두 종류의 폴리펩티드 사슬로 구성된다. 본 발명의 비제한적 항체는 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함하는 온전한 4개의 면역글로불린 사슬 항체일 수 있다. 항체의 중쇄는 IgM, IgG, IgE, IgA 또는 IgD를 비롯한 이소형 또는 IgG1, IgG2, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgG4, IgE1, IgE2 등을 비롯한 하위 이소형일 수 있다. 경쇄는 카파 경쇄 또는 람다 경쇄일 수 있다. 항체는 2개의 동일한 경쇄 사본과 2개의 동일한 중쇄 사본을 포함할 수 있다. 각각 하나의 가변 도메인(또는 가변 영역, VH) 및 다수의 불변 도메인(또는 불변 영역)을 포함하는 중쇄는 불변 도메인 내에서 이황화 결합을 통해 서로 결합하여 항체의 “줄기”를 형성한다. 각각 하나의 가변 도메인(또는 가변 영역, VL) 및 하나의 불변 도메인(또는 불변 영역)을 포함하는 경쇄는 각각 이황화 결합을 통해 하나의 중쇄에 결합한다. 각 경쇄의 가변 영역은 이것이 결합되는 중쇄의 가변 영역과 나란해진다. 경쇄 및 중쇄 둘 모두의 가변 영역은 보다 보존적인 프레임워크 영역(FR)들 사이에 끼인 3개의 초가변 영역을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항체는 온전한 면역글로불린 분자(예를 들어, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgM, IgD, IgE, IgA)이다. IgG 서브클래스(IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4)는 상당히 보존되어 있으며, 불변 영역, 특히, 힌지와 상부 CH2 도메인이 상이하다. IgG 서브클래스의 서열 및 차이점은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, Vidarsson, et al, “IgG subclasses and allotypes: from structure to effector functions.” Frontiers in immunology 5 (2014); Irani,et al. “Molecular properties of human IgG subclasses and their implications for designing therapeutic monoclonal antibodies against infectious diseases.” Molecular immunology 67.2 (2015): 171-182; Shakib, Farouk, ed. The human IgG subclasses: molecular analysis of structure, function and regulation. Elsevier, 2016에 기재되어 있고; 이들 문헌 각각은 본원에 그 전문이 참고로 포함된다.
항체는 또한 임의의 종(예를 들어, 인간, 설치류, 마우스, 낙타류)으로부터 유래된 면역글로불린 분자일 수 있다. 본원에 개시된 항체는 또한 다클론, 단클론, 단일특이성, 다중특이성 항체, 및 또 다른 폴리펩티드에 융합된 면역글로불린 결합 도메인을 포함하는 키메라 항체를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. “항원 결합 도메인” 또는 “항원 결합 단편”이라는 용어는 온전한 항체의 특이적 결합 활성을 보유하는 항체의 일부, 즉, 온전한 항체의 표적 분자 상의 에피토프에 특이적 결합을 할 수 있는 항체의 부분이다. 이는, 예를 들어, Fab, Fab', F(ab')2 및 이들 단편의 변이체를 포함한다. 따라서, 일부 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, 예를 들어, scFv, Fv, Fd, dAb, 이중특이성 항체, 이중특이성 scFv, 디아바디, 선형 항체, 단일사슬 항체 분자, 항체 단편으로부터 형성된 다중특이성 항체, 및 항체 결합 도메인이거나 이와 상동성인 결합 도메인을 포함하는 임의의 폴리펩티드일 수 있다. 항원 결합 도메인의 비제한적 예는, 예를 들어, 온전한 항체의 중쇄 및/또는 경쇄 CDR, 온전한 항체의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역, 온전한 항체의 전장 중쇄 또는 경쇄, 또는 온전한 항체의 중쇄 또는 경쇄로부터의 개별 CDR을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 단편은 키메라 항원 수용체(CAR)의 일부를 형성할 수 있다. 일부 실시형태에서, 키메라 항원 수용체는 CD3-제타 막횡단- 및 엔도도메인에 융합된, 본원에 기재된 단일 사슬 가변 단편(scFv)들의 융합체이다. 일부 실시형태에서, 키메라 항원 수용체는 또한 다양한 동시자극 단백질 수용체(예를 들어, CD28, 41BB, ICOS)로부터의 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 키메라 항원 수용체는 효능을 증가시키기 위해 다중 신호전달 도메인, 예를 들어, CD3z-CD28-41BB 또는 CD3z-CD28-OX40을 포함한다. 따라서, 한 양상에서, 본 발명은 본원에 기재된 키메라 항원 수용체를 발현하는 세포(예를 들어, T 세포)를 추가로 제공한다.
일부 실시형태에서, scFV는 하나의 중쇄 가변 도메인 및 하나의 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, scFV는 2개의 중쇄 가변 도메인 및 2개의 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
TCR 유래 CAR
항체 또는 이의 항원 결합 부분은 항원 수용체와 같은 재조합 수용체의 일부로서 세포에서 발현될 수 있다. 항원 수용체 중에는 키메라 항원 수용체(CAR)와 같은 기능적 비-TCR 항원 수용체가 있다. 일반적으로, MHC 분자와 관련하여 펩티드에 대해 지시된 TCR-유사 특이성을 나타내는 항체 또는 항원-결합 단편을 함유하는 CAR은 또한 TCR-유사 CAR로 지칭될 수 있다. 따라서, 제공된 결합 분자, 예를 들어, EBV 결합 분자 중에는 항원 수용체, 예를 들어, 제공된 항체 중 하나, 예를 들어, TCR-유사 항체를 포함하는 것들이 있다. 일부 실시형태에서, 항원 수용체 및 다른 키메라 수용체는, 예를 들어, TCR-유사 항체와 같은 LMP2의 영역 또는 에피토프에 특이적으로 결합한다. 항원 수용체 중에는 키메라 항원 수용체(CAR)와 같은 기능적 비-TCR 항원 수용체가 있다. 또한 EBV 항원 발현과 관련된 질병 및 장애의 치료와 같은 입양 세포 요법에서 CAR을 발현하는 세포 및 그의 용도가 제공된다.
비-TCR 분자를 포함하는 TCR 유사 CAR은, MHC 분자와 관련하여 표시되거나 제시될 때, 예를 들어, T 세포 에피토프 또는 펩티드 에피토프에 대한 T 세포 수용체 특이성을 나타낸다. 일부 실시형태에서, TCR-유사 CAR은 항체 또는 이의 항원-결합 부분, 예를 들어, 본원에 기재된 TCR-유사 항체를 함유할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항체 또는 이의 항체 결합 부분은 MHC 분자와 관련하여 특정 펩티드 에피토프에 대해 반응성이며, 여기서 항체 또는 항체 단편은 MHC 분자와 관련하여 특이적인 펩티드를 MHC 분자 단독과, 특정 펩티드 단독과, 그리고 경우에 따라 MHC 분자와 관련 없는 펩티드와 구분할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 T 세포 수용체보다 더 높은 결합 친화도를 나타낼 수 있다.
CAR을 포함하는 예시적인 항원 수용체, 및 이러한 수용체를 조작하여 세포 내로 도입하는 방법은, 예를 들어, US2002/131960, US2013/287748, US2013/0149337, US 6,451,995, US 7,446,190, US 8,252,592에 기재되어 있으며; 이들 각각은 그 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다.
일부 실시형태들에서, CAR은 일반적으로, 예를 들어, 일부 양상에 따라 링커 및/또는 막횡단 도메인(들)을 통해 하나 이상의 세포내 신호전달 성분들에 연결된, 펩티드에 특이적인 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는, 세포외 항원(또는 리간드) 결합 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 이러한 분자는 전형적으로 천연 항원 수용체, 예를 들어, TCR을 통한 신호, 및 선택적으로 보조자극 수용체를 함께 사용하여 이러한 수용체를 통한 신호를 모방하거나 근사화할 수 있다.
일부 실시형태에서, CAR은 전형적으로 이의 세포외 부분에 하나 이상의 항원 결합 분자, 예를 들어, 하나 이상의 항원 결합 단편, 도메인, 또는 일부, 또는 하나 이상의 항체 가변 도메인 및/또는 항체 분자를 포함한다. 일부 실시형태에서, CAR은 단클론 항체(mAh)의 가변 중쇄(VH) 및 가변 경쇄(VL)로부터 유래한 단일사슬 항체 단편(scFv)과 같은 항체 분자의 항원 결합 부분 또는 부분들을 포함한다. 일부 실시형태에서, CAR은 TCR-유사 항체, 예를 들어, MHC 분자와 관련하여 세포 표면에 제시된 펩티드 에피토프를 특이적으로 인식하는 항체 또는 항원-결합 단편(예를 들어, scFv)을 함유한다.
특정 실시형태에서, 세포내 신호전달 도메인은 CD3(예를 들어, CD3-제타) 세포내 도메인에 연결된 CD28 막횡단 및 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포내 신호전달 도메인은 CD3 제타 세포내 도메인에 연결된 키메라 CD28 및 CD137(4-1BB, TNFRSF9) 공동자극 도메인을 포함한다.
일부 실시형태에서, 결합 분자는 또한 유전적으로 조작된 T 세포 수용체(TCR), 유전적으로 조작된 NK 세포 수용체, 킬러 세포 면역글로불린 유사 수용체(KIR), C형 렉틴 수용체, 백혈구 면역글로불린 유사 수용체(LILR), 1형 사이토카인 수용체, 2형 사이토카인 수용체, 종양 괴사 인자 패밀리, TGFβ 수용체, 케모카인 수용체 또는 면역글로불린 수퍼패밀리(IgSF)의 구성원일 수 있다.
일부 실시형태에서, 조작된 세포는 이의 치료 또는 예방 효능이 증가되도록 수많은 방식으로 추가로 변형된다. 예를 들어, 조작된 TCR 또는 해당 집단에 의해 발현되는 다른 결합 분자는 직접적으로 또는 링커를 통해 간접적으로 표적으로 하는 모이어티에 접합될 수 있다. 결합 분자, 예를 들어, CAR 또는 TCR을 표적화 모이어티에 접합시키는 것의 실시는 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, Wadhwa et al. “Receptor mediated glycotargeting.” Journal of drug targeting 3.2 (1995): 111-127., 및 미국 특허 제 5,087,616에 기재되어 있는데; 이들 문헌은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
조작된 세포의 제조 방법
본 발명은 병리학적 질병 또는 병태를 치료하기 위해 상기 조작된 세포를 제조하고 사용하는 방법 또는 공정을 제공한다.
결합 분자, 예를 들어, TCR을 도입하기 위한 세포는 샘플, 예를 들어, 생물학적 샘플, 예를 들어, 대상체로부터 얻거나 이로부터 유래된 샘플로부터 단리될 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포가 단리되는 대상체는 질병 또는 병태에 걸렸거나 세포 요법이 필요하거나 세포 요법이 투여될 대상체이다. 일부 실시형태에서 대상체는 세포가 단리, 가공 및/또는 조작되는 입양 세포 요법과 같은 특정 치료 개입이 필요한 인간이다.
따라서, 일부 실시형태에서 세포는 일차 세포, 예를 들어, 일차 인간 세포이다. 샘플에는 대상체로부터 직접 채취한 조직, 체액 및 기타 샘플, 뿐만 아니라 하나 이상의 가공 단계, 예를 들어, 분리, 원심분리, 유전자 조작(예를 들어, 바이러스 벡터를 형질도입), 세척 및/또는 인큐베이션에서 생성된 샘플이 포함된다. 생물학적 샘플은 생물학적 출처에서 직접적으로 얻은 샘플이거나 가공된 샘플일 수 있다. 생물학적 샘플에는 예컨대 혈액, 혈장, 혈청, 뇌척수액, 활액, 소변 및 땀, 조직 및 기관 샘플 (이로부터 유래된 가공된 샘플 포함)이 포함되나, 이에 제한되지는 않는다.
일부 양상들에서, 상기 세포가 유래되거나 또는 세포가 단리된 샘플은 혈액 또는 혈액-유래된 샘플이거나, 성분 채집 또는 백혈구형성 생성물이거나 또는 이로부터 유래된다. 예시적인 샘플에는 전혈, 말초 혈액 단핵 세포 (PBMCs), 백혈구, 골수, 흉선, 조직 생검, 종양, 백혈병, 림프종, 림프절, 장-관련 림프 조직, 점막-관련 림프 조직, 비장, 기타 림프구 조직, 간, 폐, 위, 내장, 결장, 신장, 췌장, 유방, 뼈, 전립선, 자궁 경부, 고환, 난소, 편도선 또는 기타 장기 및/또는 이들로부터 유래된 세포들이 포함된다. 샘플에는 세포 요법, 예를 들어, 입양 세포 요법과 관련하여, 자가조직의 샘플과 동종이계 출처의 샘플이 포함된다.
일부 실시형태들에서, 상기 세포는 세포주, 예를 들어, T 세포주로부터 유래된다. 일부 실시형태들에서, 이들 세포는 이종 출처, 예를 들면, 마우스, 래트, 또는 비-인간 영장류로부터 얻는다.
일부 실시형태에서, 대상체로부터 수집된 혈액 세포를, 예를 들어, 혈장 분획을 제거하기 위해 세척하고 세포를 후속 처리 단계를 위해 적절한 완충액 또는 배지에 넣는다. 일부 실시형태들에서, 상기 세포들은 인산염 완충 식염수(PBS)로 세척된다. 일부 실시형태들에서, 세척액에는 칼슘 및/또는 마그네슘 및/또는 많은 또는 모든 2가 양이온이 없다. 일부 양상에서, 세척 단계는 반자동 “유동식” 원심분리기로 수행된다. 일부 양상에서, 접선 유동 여과(TFF)에 의해 세척 단계가 이루어진다. 일부 실시형태에서, 세포는 세척 후 다양한 생체적합성 완충액, 예를 들어, Ca 2+/Mg 2+이 없는 PBS에 재현탁된다. 특정 실시형태들에서, 혈액 세포 샘플의 성분을 제거하고, 세포를 배양 배지에 곧바로 재현탁시킨다. 일부 실시형태들에서, 상기 방법은 밀도-기반 세포 분리 방법, 예를 들어, 적혈구를 용해시켜 말초 혈액으로부터 백혈구를 준비하고, Percoll 또는 Ficoll 구배(gradient)를 통해 원심 분리하는 것을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 방법은, 예를 들어, 환자의 혈액으로부터 T 세포를 단리하는 단계; 유전적으로 조작된 항원 수용체를 인코딩하는 핵산 구조체를 포함하는 바이러스 벡터를 집단 T 세포에 형질도입하는 단계; 형질도입된 세포를 시험관내에서 증식시키는 단계; 및/또는 증식된 세포들을 환자에게 주입하여, 조작된 T 세포가 항원 양성 종양 세포를 찾아 파괴하게 하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 핵산 구조체는 억제 단백질을 인코딩하는 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 이들 조작된 T 세포는 PD-1/PD-L1 면역억제를 차단하고 항종양 면역 반응을 강화할 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 핵산 구조체를 함유하는 바이러스 벡터로 T 세포를 형질감염시키는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 방법은 본원에 기재된 벡터를 시험관내 또는 생체외에서 세포에 도입하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 벡터는 바이러스 벡터이고 도입은 형질도입에 의해 수행된다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 세포에 하나 이상의 제제를 도입하는 단계를 추가로 수반하며, 여기서 하나 이상의 제제 각각은 독립적으로 T 세포 수용체 알파 불변(TRAC) 유전자 및/또는 T 세포 수용체 베타 불변(TRBC) 유전자의 유전적 파괴를 유도할 수 있다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 제제는 억제성 핵산(예를 들어, siRNA)이다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 제제는 DNA-표적화 단백질 및 뉴클레아제 또는 RNA-가이드 뉴클레아제(예를 들어, 클러스터된 규칙적 간격의 짧은 회문식 핵산(CRISPR)-관련 뉴클레아제)를 포함하는 융합 단백질이다.
T 세포의 형질감염은 당업자가 임의의 표준 방법, 예를 들어, 인산칼슘법, 전기천공법, 리포좀 매개 전달법, 미세주입법, 생물학적 입자 전달 시스템 또는 임의의 다른 공지된 방법을 사용하여 이루어질 수 있다. 일부 실시형태에서, T 세포의 형질감염은 인산칼슘법을 사용하여 수행된다.
본원에 기재된 다양한 실시형태에 따르면, 본 발명은 종양, 특히 EBV 관련 암에 대한 면역요법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 조작된 T 세포는 종양 관련 EBV 항원을 인식하고 동시에 세포예정사 단백질-1(PD-1) 및 TGFβ를 차단하는 단일 사슬 항체(scFv) 융합 단백질을 분비한다. 이러한 조작된 T 세포는 더 강력한 항종양 반응과 감소된 T 세포 고갈을 보여준다. 항-PD-1 제제 전달이 종양 부위에 국한되어 종양 부위에서 농도가 더 높아지기 때문에 PD-1 체크포인트 차단이 본원에 기재된 방법에서 더 효과적이라는 것이 실험적으로 밝혀졌다. 또한 항 PD-1 약물 전달이 종양 부위에 국한되기 때문에 비특이적 염증으로 인한 독성이 감소한다. 본 발명은 항-EBV TCR 및 항-PD-1 항체의 병용이 기존의 다른 방법들과 비교하여 T 세포 활성화를 개선하고/하거나 T 세포 고갈을 방지함을 제공한다.
본 발명은 맞춤형 항종양 면역요법을 생성하는 방법을 제공한다. 유전적으로 조작된 항-LMP2 T 세포는 환자의 혈액 세포에서 생성될 수 있다. 이렇게 조작된 T 세포는 세포 치료제로 환자에게 재주입된다. 이 치료제는 비인두 암종, 호지킨 림프종, 버킷 림프종 및 위암을 비롯한 (그러나 이에 제한되지 않음) EBV 관련 종양이 있는 모든 환자에게 적용할 수 있다.
조작된 세포를 제조하고 이들 조작된 세포를 대상체에게 투여하는 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, 미국 특허 10,174,098 및 Draper et al. “Targeting Of HPV-16+ Epithelial Cancer Cells By Tcr Gene Engineered t Cells Directed Against e6.” Clinical Cancer Research 21.19 (2015): 4431-4439에 기재되어 있고, 이들 문헌 둘 모두 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
치료 방법
본원에 개시된 방법은 다양한 치료 목적을 위해 사용될 수 있다. 한 양상에서, 본 발명은 대상체에서 암을 치료하는 방법, 대상체의 종양 부피의 증가 속도를 시간 경과에 따라 감소시키는 방법, 전이 발생 위험을 감소시키는 방법, 또는 대상체에서 추가적인 전이가 발생할 위험을 감소시키는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 치료는 암의 진행을 정지, 둔화, 지체 또는 억제할 수 있다. 일부 실시형태에서, 치료는 대상체에서 하나 이상의 암 증상의 수, 중증도 및/또는 지속 기간을 감소시킬 수 있다.
한 양상에서, 본 발명은 TCR을 발현하는 조작된 세포, 이의 항원 결합 단편, 및 TCR-유래 결합 분자의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 대상체(예를 들어, 암, 예를 들어, EBV-관련 암에 걸린 것으로 식별되거나 진단된 대상체)에게 투여하는 것을 포함하는 방법을 특징으로 한다. 일부 실시형태에서, EBV-관련 암은 비인두 암종, 호지킨 림프종, 버킷 림프종 및 위암이다.
일부 실시형태에서, 대상체는 고형 종양을 갖는다. 일부 실시형태에서, 대상체는 유방암(예를 들어, 삼중 음성 유방암), 유암종, 자궁경부암, 자궁내막암, 신경교종, 두경부암, 간암, 폐암, 소세포폐암, 림프종, 흑색종, 난소암, 췌장암, 전립선암, 신장암, 결장직장암, 위암, 고환암, 갑상선암, 방광암, 요도암 또는 혈액 악성종양을 가진다. 일부 실시형태에서, 암은 절제불가능한 흑색종 또는 전이성 흑색종, 비소세포 폐암종(NSCLC), 소세포 폐암(SCLC), 방광암 또는 전이성 호르몬 불응성 전립선암이다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 조성물 및 방법은 암에 걸릴 위험이 있는 환자의 치료에 사용될 수 있다. 암 환자는 당업계에 공지된 다양한 방법으로 식별될 수 있다.
또한, 본 발명은 대상체에서 감염 또는 감염 관련 병태를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 치료는 질병의 진행을 정지, 둔화, 지체 또는 억제할 수 있다. 이들 방법은 일반적으로 본원에 개시된 유전적으로 조작된 세포의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 치료되는 질병 또는 병태는 감염성 질병 또는 병태, 예를 들어, 바이러스, 레트로바이러스, 박테리아 및 원생동물 감염, 면역결핍증, 인간 유두종 바이러스(HPV), 거대세포바이러스(CMV), 엡스타인 바 바이러스(EBV), 아데노바이러스, BK 폴리오마바이러스이다. 일부 실시형태에서, 질병은 EBV 감염이다.
본원에서 사용되는 “유효량”은 질병, 예를 들어, 암의 진행 정지, 둔화, 지연 또는 억제를 비롯한 유익한 또는 원하는 결과를 달성하기에 충분한 양 또는 투여량을 의미한다. 유효량은, 예를 들어, 치료제 및/또는 치료 조성물이 투여될 대상체의 연령 및 체중, 증상의 중증도 및 투여 경로에 따라 달라질 것이며, 따라서 투여는 개별적으로 결정될 수 있다.
유효량은 1회 이상의 투여로 투여될 수 있다. 한 예로서, 조성물의 유효량은 환자의 암 진행을 개선, 중단, 안정화, 역전, 억제, 둔화 및/또는 지연시키기에 충분한 양이거나, 또는 시험관 내에서 세포(예를 들어, 생검된 세포, 본원에 기재된 임의의 암 세포, 또는 세포주(예를 들어, 암 세포주))의 증식을 개선, 중단, 안정화, 역전, 둔화 및/또는 지연시키기에 충분한 양이다. 당업계에서 이해되는 바와 같이, 유효량은, 특히, 환자 병력, 뿐만 아니라 사용된 조성물의 유형(및/또는 투여량)과 같은 다른 요인들에 따라 달라질 수 있다.
유효량 및 투여 일정은 경험적으로 결정될 수 있으며, 이러한 결정을 내리는 것은 당업자의 통상의 기술 범위에 속한다. 당업자는 투여되어야 하는 투여량이, 예를 들어, 치료를 받을 포유동물, 투여 경로, 치료제의 특정 유형 및 포유동물에게 투여되는 다른 약물에 따라 달라질 것임을 이해할 것이다. 적절한 용량을 선택하는 지침은 문헌에서 찾을 수 있다. 또한, 치료가 반드시 질병 또는 병태의 100% 또는 완전한 치료 또는 예방으로 이어지는 것은 아니다. 당업자가 잠재적으로 유리한 치료 수단으로 인식하는, 치료 효과가 다양한 여러 치료/예방 방법들을 이용할 수 있다.
일부 양상에서, 본 발명은 또한 포유동물에서 질병/병태를 진단하는 방법을 제공하며, 여기서 TCR, 항원 결합 단편, TCR-유래 결합 분자는 대상체로부터 얻은 샘플(들)과 상호작용하여 복합체를 형성하고, 여기서 샘플은 하나 이상의 세포, 폴리펩티드, 단백질, 핵산, 항체 또는 항원 결합 부분, 혈액, 전 세포, 이들의 용해물, 또는 전체 세포 용해물의 분획, 예를 들어, 핵 또는 세포질 분획, 전 단백질 분획, 또는 이의 핵산 분획을 포함할 수 있으며, 여기서 복합체의 검출은 포유동물에서 병태의 존재를 나타내는 것이며, 이러한 병태는 암, EBV 감염 또는 EBV-양성 전암(premalignancy)이다. 또한, 복합체는 ELISA, 유세포 측정법, 형광 인시튜 혼성화(FISH), 중합효소 연쇄 반응(PCR), 마이크로어레이, 서던 블롯팅, 전기영동, 파지 분석, 크로마토그래피 등과 같은(그러나 이에 제한되는 것은 아님) 해당 분야에 공지된 수많은 방법으로 검출될 수 있다. 따라서, 치료 방법은, 예를 들어, 대상체가 EBV 감염 또는 EBV-관련 암을 갖는지 여부를 결정함으로써 대상체가 본원에 개시된 치료로부터 이익을 얻을 수 있는지 여부를 결정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본원에 기재된 임의의 방법에서, 조작된 세포 및/또는 적어도 하나의 추가 치료제는 적어도 주 1회(예를 들어, 주 1회, 주 2회, 주 3회, 주 4회, 일일 1회, 일일 2회, 또는 일일 3회) 대상체에 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 적어도 2개의 상이한 조작된 세포(예를 들어, 세포들이 상이한 결합 분자를 발현함)가 동일한 조성물(예를 들어, 액체 조성물)로 투여된다. 일부 실시형태에서, 조작된 세포 및 적어도 하나의 추가 치료제는 동일한 조성물(예를 들어, 액체 조성물)로 투여된다. 일부 실시형태에서, 조작된 세포 및 적어도 하나의 추가 치료제는 2개의 상이한 조성물로 투여된다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 추가적인 치료제는 알약, 정제 또는 캡슐로서 투여된다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 추가 치료제는 서방형 경구 제형으로 투여된다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 추가 치료제는 대상체에게 조작된 세포를 투여하기 전에, 그와 동시에, 또는 그 후에 대상체에게 투여될 수 있다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 추가 치료제가 대상체에게 투여될 수 있다. 추가적인 치료제는 체크포인트 억제제(CPI)일 수 있다. 일부 실시형태에서, 체크포인트 억제제는 억제 단백질, 예를 들어, 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 체크포인트 억제제는, 예를 들어, PD-1, PD-L1, PD-L2, 2B4(CD244), 4-1BB, A2aR, B7.1, B7.2, B7-H2, B7-H3, B7-H4, B7-H6, BTLA, 부티로필린, CD160, CD48, CTLA4, GITR, gp49B, HHLA2, HVEM, ICOS, ILT-2, ILT-4, KIR 계열 수용체, LAG-3, OX -40, PIR-B, SIRPalpha(CD47), TFM-4, TIGIT, TIM-1, TIM-3, TIM-4, VISTA 및 이들의 조합을 포함하는 하나 이상의 면역 체크포인트를 억제하거나 차단할 수 있다. 일부 실시형태에서, 억제 단백질은 PD-1 또는 PD-L1을 차단한다. 다양한 실시형태에서, 억제 단백질은 항-PD-1 scFv를 포함한다. 억제 단백질은 PD-1 또는 PD-L1의 발현 감소 및/또는 집단 내 T 세포에서 PD-1 또는 PD-L1의 상향조절 억제 및/또는 PD-1/PD-L1 복합체의 형성 및 후속 신호 전달을 물리적으로 방해할 수 있다. 일부 실시형태에서, 억제 단백질은 PD-1을 차단한다. 일부 실시형태에서, 추가 치료제는 항-OX40 항체, 항-PD-L1 항체, 항-PD-L2 항체, 항-LAG-3 항체, 항-TIGIT 항체, 항-BTLA 항체, 항-CTLA-4 항체, 또는 항-GITR 항체이다. 일부 실시형태에서, 추가 치료제는 항-CTLA4 항체(예를 들어, 이필리무맙), 항-CD20 항체(예를 들어, 리툭시맙), 항-EGFR 항체(예를 들어, 세툭시맙), 항-CD319 항체(예를 들어, 엘로투주맙), 또는 항-PD1 항체(예를 들어, 니볼루맙)이다.
일부 실시형태에서, 추가 치료제는 이중기능성 트랩 융합 단백질이다. 이중기능성 트랩 단백질은 면역 체크포인트와 TGF-β 음성 조절 경로를 모두 표적할 수 있다. 면역 체크포인트의 발현 외에도 종양 미세 환경은 다른 면역 억제 분자들을 포함한다. 특히 흥미로운 것은 암에서 여러 기능을 하는 사이토카인 TGF-β(TGFB)이다. TGF-β는 종양 발생 초기에 종양 세포의 증식을 방지하고 분화 및 세포자멸을 촉진시킨다. 그러나 종양이 진행되는 동안 TGF-β 수용체 발현의 소실 또는 하류 신호전달 요소들에 대한 돌연변이로 인해 종양 TGF-β 불감성이 발생한다. 그런 다음 TGF-β는 혈관신생, 상피에서 중간엽으로의 전이(EMT) 유도 및 면역 억제에 영향을 미쳐 종양 진행을 촉진시킨다. 종양에서 높은 TGF-β 혈청 수준과 TGF-β 수용체(TGFβR) 발현의 손실은 불량한 예후와 관련이 있다. TGFβ-표적화 요법은 제한된 임상 활성을 보였다. 일부 실시형태에서, 이중기능성 트랩 단백질은 PD-1 및 TGF-β 모두를 표적으로 한다. 일부 실시형태에서, 이중기능성 트랩 단백질은 PD-L1 및 TGF-β 모두를 표적으로 한다. 일부 실시형태에서, 이중기능성 융합 단백질은 PD-L1을 차단하고 TGF-β를 격리하도록 설계된다. M7824(MSB0011395C)는 인간 IgG1 단클론 항체(mAb) 아벨루맙을 기반으로 인간 항-PD-L1 scFv의 C-말단에 연결된 인간 TGF-β 수용체 II(TGFβRII)의 세포외 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 이중기능성 융합 단백질은 인간 항-PD-1 scFv의 C-말단에 연결된 인간 TGF-β 수용체 II(TGFβRII)의 세포외 도메인을 포함한다. 이러한 이중기능성 트랩 융합 단백질은, 예를 들어, Knudson, et al. “M7824, a novel bifunctional anti-PD-L1/TGFβ Trap fusion protein, promotes anti-tumor efficacy as monotherapy and in combination with vaccine.” Oncoimmunology 7.5 (2018): e1426519에 기재되어 있으며, 이 문헌은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다. 일부 실시형태에서, 대상체는 본원에 기재된 TCR 또는 항원-결합 분자 및 하나 이상의 이중기능성 트랩 융합 단백질을 발현하는 세포에 의해 치료된다.
한 일부 실시형태에서, 추가 치료제는 B-Raf의 억제제, EGFR 억제제, MEK의 억제제, ERK의 억제제, K-Ras의 억제제, c-Met의 억제제, 역형성 림프종 키나제(ALK)의 억제제, 포스파티딜이노시톨 3-키나제(PI3K)의 억제제, Akt의 억제제, mTOR의 억제제, 이중 PI3K/mTOR 억제제, 브루톤의 티로신 키나제(BTK), 및 이소시트레이트 디하이드로게나제 1(IDH1) 및/또는 이소시트레이트 디하이드로게나제 2(IDH2)의 억제제로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 억제제를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 추가 치료제는 인돌아민 2,3-디옥시게나제-1)(IDO1)의 억제제(예를 들어, 에파카도스타트)이다. 일부 실시형태에서, 추가적인 치료제는 HER3의 억제제, LSD1의 억제제, MDM2의 억제제, BCL2의 억제제, CHK1의 억제제, 활성화된 헤지호그 신호전달 경로의 억제제, 및 에스트로겐 수용체를 선택적으로 분해하는 제제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 억제제를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 추가 치료제는 트라벡테딘, nab-파클리탁셀, 트레바나닙, 파조파닙, 세디라닙, 팔보시클립, 에베롤리무스, 플루오로피리미딘, IFL, 레고라페닙, 레오리신, 알림타, 자이카디아, 수텐트, 템시롤리무스, 악시티닙, 에베롤리무스, 소라페닙, 보트리엔트, 파조파닙, IMA-901, AGS-003, 카보잔티닙, 빈플루닌, Hsp90 억제제, Ad-GM-CSF, 테마졸로마이드, IL-2, IFNa, 빈블라스틴, 탈로미드, 다카르바진, 사이클로포스파미드, 레날리도마이드, 아자시티딘, 레날리도마이드, 보르테조미드, 암루비신, 카르필조밉, 프랄라트렉세이트 및 엔자스타우린으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치료제를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 추가적인 치료제는 보조제, TLR 작용제, 종양 괴사 인자(TNF) 알파, IL-1, HMGB1, IL-10 길항제, IL-4 길항제, IL-13 길항제, IL-17 길항제, HVEM 길항제, ICOS 작용제, CX3CL1을 표적으로 하는 치료제, CXCL9를 표적으로 하는 치료제, CXCL10을 표적으로 하는 치료제, CCL5를 표적으로 하는 치료제, LFA-1 작용제, ICAM1 작용제 및 셀렉틴 작용제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치료제를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 카보플라틴, nab-파클리탁셀, 파클리탁셀, 시스플라틴, 페메트렉세드, 겜시타빈, FOLFOX 또는 FOLFIRI가 대상체에게 투여된다. 일부 실시형태에서, 추가 치료제는 아스파라기나제, 부술판, 카르보플라틴, 시스플라틴, 다우노루비신, 독소루비신, 플루오로우라실, 겜시타빈, 하이드록시우레아, 메토트렉세이트, 파클리탁셀, 리툭시맙, 빈블라스틴, 빈크리스틴 및/또는 이들의 조합으로부터 선택된다.
조성물 및 제형
본 발명은 본원에 개시된 방법에 의해 생성된 조작된 세포 및 이의 집단을 함유하는 조성물(약제 및 치료 조성물 포함)을 제공한다. 또한 방법, 예를 들어, 조작된 T 세포 및 이의 조성물을 대상체, 예를 들어, 환자에게 투여하기 위한 치료 방법이 제공된다.
투여를 위한 조작된 T 세포를 포함하는 조성물, 예를 들어, 주어진 용량 또는 이의 분획으로 투여하기 위한 수의 세포를 포함하는 단위 용량 형태 조성물과 같은 약학 조성물 및 제형을 비롯한 조성물이 제공된다. 약학 조성물 및 제제는 하나 이상의 선택적인 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 조성물은 적어도 하나의 추가적인 치료제를 포함한다.
약학적으로 허용되는 담체는 약학 조성물에 존재하는, 활성 성분 이외의 성분을 의미한다. 약학적으로 허용되는 담체는 활성 성분을 방해하지 않으며 대상체에게 독성이 없다. 약학적으로 허용되는 담체는 완충액, 부형제, 안정화제, 또는 보존제를 포함할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 약학 제형은 서로 다른 물질 및/또는 제제를 조합하여 최종 의약품을 생산하는 과정을 의미한다. 제형 연구는 환자에게 허용되는 약물의 제재 개발을 포함한다. 추가적으로, 제재는 내부에 포함된 활성 성분의 생물학적 활성이 효과가 있도록 하기 위한 형태로 존재하며, 해당 제형이 투여되는 대상체에게 허용불가능한 독성을 주는 추가 성분들은 포함하지 않는다.
일부 실시형태에서, 담체의 선택은 부분적으로는 특정 세포(예를 들어, T 세포 또는 NK 세포) 및/또는 투여 방법에 의해 결정된다. 다양한 적합한 제형을 사용할 수 있다. 예를 들어, 약학 조성물은 보존제를 함유할 수 있다. 적합한 보존제는, 예를 들어, 메틸파라벤, 프로필파라벤, 벤조산나트륨 및 염화벤잘코늄을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 둘 이상의 보존제의 혼합물이 사용된다. 보존제 또는 이의 혼합물은 전형적으로 총 조성물 중량의 약 0.0001% 내지 약 2%의 양으로 존재한다. 담체는 예를 들어, Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)에 기재되어 있다. 약학적으로 허용되는 담체는 이용되는 투여량 및 농도에서 수용자에 비독성이며, 다음을 포함하나, 이에 제한되지 않는다: 완충액, 예를 들어, 포스페이트, 시트레이트 및 다른 유기산; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 보존제 (예를 들어, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토니움 클로라이드; 벤잘코니움 클로라이드; 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부탈 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤 예를 들어, 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르치놀; 시클로헥사놀; 3-펜타놀; 그리고 m-크레졸); 낮은 분자량의 (약 10개 잔기 미만) 폴리펩티드; 단백질, 예를 들어, 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로블린; 친수성 중합체 예를 들어, 폴리비닐피롤리돈; 아미노산 예를 들어, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 리신; 모노사카라이드, 디사카라이드, 그리고 글루코스, 만노스, 또는 덱스트린을 포함하는 기타 탄수화물; 킬레이트 물질 예를 들어, EDTA; 당, 예를 들어, 슈크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 카운터-이온, 예를 들어, 나트륨; 금속 복합체 (예컨대 Zn-단백질 복합체); 및/또는 비-이온성 계면활성제 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG).
적합한 완충제는, 예를 들어, 시트르산, 시트르산나트륨, 인산, 인산칼륨 및 다양한 기타 산 및 염을 포함한다. 일부 실시형태에서, 둘 이상의 완충제의 혼합물이 사용된다. 완충제 또는 이들의 혼합물은 전형적으로 총 조성물 중량의 약 0.001% 내지 약 4%의 양으로 존재한다. 투여 가능한 약학 조성물을 제조하는 방법은 공지되어 있다. 예시적인 방법은 예를 들어, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams & Wilkins; 21st ed. (May 1, 2005)에 보다 상세히 기재되어 있다.
제형은 수용액을 포함할 수 있다. 제형 또는 조성물은 또한 조작된 세포, 바람직하게는 각각의 활성이 서로 역으로 영향을 미치지 않는 세포들에 대해 상보적인 활성을 갖는 세포들로 치료되는 특정 적응증, 질병 또는 병태에 유용한 하나 이상의 활성 성분을 함유할 수 있다. 이러한 활성 성분은 의도한 목적에 유효한 양으로 조합되어 적절하게 존재한다. 따라서, 일부 실시형태에서, 약학 조성물은 기타 약학적 활성 성분 또는 약물, 예를 들어, 체크포인트 억제제, 융합 단백질, 화학요법제, 예를 들어, 아스파라기나제, 부설판, 카르보플라틴, 시스플라틴, 다우노루비신, 독소루비신, 플루오로우라실, 겜시타빈, 하이드록시우레아, 메토트렉세이트, 파클리탁셀, 리툭시맙, 빈블라스틴 및/또는 빈크리스틴을 추가로 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서 약학 조성물은 질병 또는 병태를 치료하거나 예방하는데 효과적인 양, 예를 들어, 치료적 유효량 또는 예방적 유효량의 세포를 함유한다. 일부 실시형태에서 치료적 또는 예방적 효능은 치료 대상체의 주기적인 평가에 의해 모니터링된다. 원하는 용량은 세포의 단회 일시 투여, 세포의 다중 일시 투여 또는 세포의 연속 주입 투여에 의해 전달될 수 있다.
세포 및 조성물은 표준 투여 기술, 제형 및/또는 장치를 사용하여 투여될 수 있다. 세포의 투여는 자가 또는 이종일 수 있다. 예를 들어, 면역반응성 T 세포 또는 전구체는 하나의 대상체로부터 얻을 수 있고, 본원에 기재된 다양한 실시예에 따라 이들을 유전적으로 변형한 후 동일한 대상체 또는 다른 적합한 대상체에게 투여될 수 있다. 말초 혈액 유래 면역반응성 T 세포 또는 이의 자손(예를 들어, 생체내, 생체외 또는 시험관내 유래)은 카테터 투여, 전신 주사, 국소 주사, 정맥내 주사 또는 비경구 투여를 비롯한 국소 주사를 통해 투여될 수 있다. 일반적으로, 치료용 조성물(예를 들어, 유전적으로 변형된 면역반응 세포를 함유하는 약학 조성물)을 투여할 때, 이는 일반적으로 단위 투여 주사 가능한 형태(용액, 현탁액, 에멀젼)로 제형화된다.
본원에 개시된 제형은 경구, 정맥내, 복강내, 피하, 폐, 경피, 근육내, 비강내, 협측, 설하 또는 좌약 투여용 제형을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포 집단은 비경구적으로 투여된다. 본원에서 사용되는 용어 “비경구”는 정맥내, 근육내, 피하, 직장, 질 및 복강내 투여를 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포는 정맥내, 복강내 또는 피하 주사에 의한 말초 전신 전달을 사용하여 대상체에게 투여된다.
일부 실시형태에서 조성물은 멸균 액체 제재, 예를 들어, 등장성 수용액, 현탁액, 에멀젼, 분산액 또는 점성 조성물로서 제공되며, 이는 일부 양상에서 선택된 pH로 완충될 수 있다. 액체 제재는 일반적으로 겔, 기타 점성 조성물 및 고체 조성물보다 제조하기가 더 쉽다. 추가로, 액체 조성물은 특히 주사에 의해 투여하기에 다소 더 편리하다. 한편, 점성 조성물은 특정 조직과 더 긴 접촉 시간을 제공하기에 적절한 점도 범위 내에서 제형화될 수 있다. 액체 또는 점성 조성물은 담체를 포함할 수 있는데, 담체는 예를 들어, 물, 식염수, 인산염 완충 식염수, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜) 및 이들의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다.
멸균 주사액은 멸균수, 생리식염수, 글루코스, 덱스트로스 등과 같은 적합한 담체, 희석제 또는 부형제와의 혼합물과 같은 용매에 세포를 혼입하여 제조할 수 있다. 조성물은 원하는 투여 경로 및 제재에 따라 보조 물질, 예를 들어, 습윤제, 분산제 또는 유화제(예를 들어, 메틸셀룰로오스), pH 완충제, 겔화제 또는 점도 향상 첨가제, 보존제, 향미제 및/또는 착색제를 함유할 수 있다. 적절한 제재를 준비하기 위해 일부 양상에서 표준 문헌들을 참조할 수 있다.
항미생물 보존제, 항산화제, 킬레이트제 및 완충제를 비롯하여 조성물의 안정성 및 멸균성을 향상시키는 다양한 첨가제를 첨가할 수 있다. 미생물 작용은 파라벤, 클로로부탄올, 페놀 및 소르브산과 같은 다양한 항균 및 항진균제로 확실히 예방될 수 있다. 주사용 제약 형태의 장기간 흡수는 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 사용함으로써 이루어질 수 있다.
생체내 투여에 사용되는 제형은 일반적으로 멸균이다. 멸균은 예를 들어, 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 용이하게 구현될 수 있다.
본원에 기재된 조성물 또는 약학 조성물은 투여 지침서와 함께 용기, 팩 또는 디스펜서에 포함될 수 있다.
투여 방법
또한 암을 비롯한 질병, 병태 및 장애를 치료하거나 예방하기 위한 세포, 집단 및 조성물의 투여 방법 및 이러한 세포, 집단 및 조성물의 용도가 제공된다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법은 본원에 기재된 질병, 병태 및 장애의 발병 위험을 감소시킬 수 있다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 세포, 집단 및 조성물은, 예를 들어, 입양 T 세포 요법과 같은 입양 세포 요법을 통해 치료될 특정 질병 또는 병태를 갖는 대상체 또는 환자에게 투여된다. 일부 실시형태에서, 상기 제공된 방법에 의해 제조된 세포 및 조성물, 예를 들어, 인큐베이션 및/또는 다른 가공 단계 후 조작된 조성물 및 생산 종료 조성물은 대상체, 예를 들어, 질병 또는 병태에 걸렸거나 이에 걸릴 위험이 있는 대상체에게 투여된다. 일부 양상에서, 상기 방법은 조작된 T 세포에 의해 인식되는 항원을 발현하는 암에서 종양 부담을 줄이는 것과 같이 질병 또는 병태의 하나 이상의 증상을 치료, 예를 들어, 완화시킨다.
입양 세포 요법을 위한 세포 투여 방법은 공지되어 있으며 상기 제공된 방법 및 조성물과 관련하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 입양 T 세포 요법 방법은 예를 들어, U.S. 2003/0170238; 미국 특허 제 4,690,915; Rosenberg, “Cell transfer immunotherapy for metastatic solid cancer―what clinicians need to know.” Nature reviews Clinical oncology 8.10 (2011): 577; Themeli et al. “Generation of tumor-targeted human T lymphocytes from induced pluripotent stem cells for cancer therapy.” Nature biotechnology 31.10 (2013): 928; Tsukahara et al. “CD19 target-engineered T-cells accumulate at tumor lesions in human B-cell lymphoma xenograft mouse models.” Biochemical and biophysical research communications 438.1 (2013): 84-89; Davila et al. “CD19 CAR-targeted T cells induce long-term remission and B Cell Aplasia in an immunocompetent mouse model of B cell acute lymphoblastic leukemia.” PloS one 8.4 (2013)에 기재되어 있으며; 이들 문헌 각각은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
일부 실시형태에서, 세포 요법, 예를 들어, 입양 T 세포 요법은 자가 전달에 의해 수행되며, 여기서 T 세포는 세포 요법을 받을 대상체로부터, 또는 이러한 대상체로부터 유래된 샘플로부터 단리 및/또는 제조된다. 따라서, 일부 양상에서, 세포는 대상체, 예를 들어, 치료를 필요로 하는 환자로부터 유래되고, 단리 및 가공 후 동일한 대상체에게 투여된다.
일부 실시형태에서, 세포 요법, 예를 들어, 입양 T 세포 요법은 동종이계 전달에 의해 수행되며, 여기서 T 세포는 세포 요법을 받게 될 또는 궁극적으로 받게 될 대상체 이외의 대상체, 예를 들어, 제1 대상체로부터 단리 및/또는 다른 방식으로 제조된다. 그러한 실시형태에서, 세포는 그 후 상이한 대상체, 예를 들어, 동일한 종의 제2 대상체에게 투여된다. 일부 실시형태에서, 제1 및 제2 대상체는 유전적으로 동일하다. 일부 실시형태에서, 제1 및 제2 대상체는 유전적으로 유사하다. 일부 실시형태에서, 제2 대상체는 제1 대상체와 동일한 HLA 클래스 또는 슈퍼타입을 발현한다.
일부 실시형태에서, 대상체의 HLA 클래스 또는 HLA 슈퍼타입이 식별된다. 일부 실시형태에서, 대상체는 HLA 클래스 또는 HLA 수퍼타입과 관련하여 항원을 인식할 수 있는 세포 요법으로 치료된다.
일부 실시형태에서, 대상체는 세포 또는 이러한 세포를 함유하는 조성물의 투여 이전에, 질병 또는 병태, 예를 들어, 종양을 표적으로 하는 치료제로 치료를 받았다. 일부 양상에서, 대상체는 다른 치료제에 불응성이거나 무반응이다. 일부 실시형태에서, 대상체는, 예를 들어, 화학요법, 방사선 및/또는 조혈 줄기 세포 이식(HSCT), 예를 들어, 동종이계 HSCT를 포함하는 또 다른 치료 시술로 치료한 후 질병이 지속되거나 재발되었다. 일부 실시형태에서, 투여는 대상체가 또 다른 요법에 내성이 생겼음에도 불구하고 대상체를 효과적으로 치료한다.
일부 실시형태에서, 대상체는 다른 치료제에 반응성이고, 치료제를 사용한 치료는 질병 부담을 감소시킨다. 일부 양상에서, 대상체는 이러한 치료제에 초기에는 반응하지만, 시간 경과에 따라 질병 또는 병태의 재발을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 대상체는 재발하지 않았다. 이러한 일부 실시형태에서, 대상체는 재발 위험이 있는, 예를 들어, 재발 위험이 높은 것으로 결정되고, 따라서 세포는 예방적으로, 예를 들어, 재발 가능성을 감소시키거나 재발을 예방하기 위해 투여된다. 일부 실시형태에서, 대상체는 다른 치료제로 사전 치료를 받지 않았다.
일부 실시형태에서, 세포는 원하는 투여량으로 투여되며, 이는 일부 양상에서 원하는 용량 또는 수의 세포 또는 세포 유형(들) 및/또는 원하는 비율의 세포 유형을 포함한다. 따라서, 일부 실시형태에서 세포의 투여량은 세포의 총 수(또는 체중 kg당 수) 및 CD4+ 대 CD8+ 비율과 같은 원하는 개별 집단 또는 하위 유형들의 비율을 기반으로 한다. 일부 실시형태에서, 세포의 투여량은 개별 집단 또는 개별 세포 유형의 세포의 원하는 총 수(또는 체중 kg당 수)를 기반으로 한다. 일부 실시형태에서, 투여량은 이러한 특징들의 조합, 예를 들어, 원하는 총 세포 수, 원하는 비율 및 개별 집단 내 원하는 총 세포 수에 기반한다.
일부 실시형태에서, CD8+ 및 CD4+ T 세포와 같은 세포의 집단 또는 하위형은 원하는 전체 세포 용량의 허용된 차이로 또는 그 범위 내에서 투여된다. 일부 실시형태에서, 원하는 용량은 원하는 세포 수 또는 세포가 투여되는 대상체의 체중 단위당 원하는 세포 수, 예를 들어, 세포/kg이다. 일부 실시형태에서, 원하는 용량은 최소 세포 수 또는 체중 단위당 최소 세포 수 이상이다. 일부 실시형태에서, 원하는 용량으로 투여된 전체 세포 중에서, 개별 집단 또는 하위형은 원하는 산출 비율(예를 들어, CD4+ 대 CD8+ 비율)로 또는 그 근처 범위로, 예를 들어, 이러한 비율의 특정한 허용 차이 또는 오차 내에서 존재한다.
일부 실시형태에서, 세포는 원하는 용량의 CD4+ 세포 및/또는 원하는 용량의 CD8+ 세포와 같은 세포의 개별 집단 또는 하위형 중 하나 이상의 원하는 용량의 허용된 차이로 또는 그 이내로 투여된다. 일부 실시형태에서, 원하는 용량은 원하는 하위 유형 또는 집단의 세포 수, 또는 세포가 투여되는 대상체의 체중 단위당 원하는 이러한 세포 수, 예를 들어, 세포/kg이다. 일부 실시형태에서, 원하는 용량은 해당 집단 또는 하위형 세포의 최소 수 또는 체중 단위당 해당 집단 또는 하위형 세포의 최소 수 이상이다.
따라서, 일부 실시형태에서, 투여량은 총 세포의 원하는 고정 용량 및 원하는 비율에 기초하고/하거나 하나 이상의, 예를 들어, 각각의 개별 하위형 또는 하위 집단의 원하는 고정 용량에 기초한다. 따라서, 일부 실시형태에서, 투여량은 원하는 T 세포 고정 또는 최소 용량 및 원하는 CD4+ 대 CD8+ 세포 비율을 기반으로 하고/하거나 원하는 CD4+ 및/또는 CD8+ 세포 고정 또는 최소 용량을 기반으로 한다.
특정 실시형태에서, 세포 또는 하위형 세포의 개별 집단은 약 100만 내지 약 1000억개 세포, 예를 들어, 100만 내지 약 500억개 세포(예를 들어, 약 500만개 세포, 약 2500만개 세포, 약 5억개 세포, 약 10억개 세포, 약 50억개 세포, 약 200억개 세포, 약 300억개 세포, 약 400억개 세포 또는 전술한 값들 중 임의의 두 값으로 정의된 범위), 예를 들어, 약 1000만 내지 약 1000억개 세포(예를 들어, 약 2000만개 세포, 약 3000만개 세포, 약 4000만개 세포, 약 6000만개 세포, 약 7000만개 세포, 약 8000만개 세포, 약 9000만개 세포, 약 100억개 세포, 약 250억개 세포, 약 500억개 세포, 약 750억개 세포, 약 900억개 세포 또는 전술한 값 중 임의의 두 값으로 정의된 범위), 경우에 따라, 약 1억개 내지 약 500억개의 세포(예를 들어, 약 1억 2천만개 세포, 약 2억 5천만개 세포, 약 3억 5천만개 세포, 약 4억 5천만개 세포, 약 6억 5천만개 세포, 약 8억개 세포, 약 9억개 세포, 약 30억개 세포, 약 300억개 세포, 약 450억개 세포) 범위로 또는 이들 범위 사이의 값 범위로 대상체에게 투여된다.
일부 실시형태들에서, 총 세포의 용량 및/또는 세포의 개별 하위집단의 용량은 약 104 내지 약 109 개 세포/킬로그램(kg) 체중의 범위, 예를 들어, 105 내지 106 개 세포/kg 체중, 예를 들어, 적어도 또는 적어도 약 1×105 개 세포/kg, 1.5×105 개 세포/kg, 2×105 개 세포/kg, or 1×106 개 세포/kg 체중이다. 예를 들어, 일부 실시형태들에서, 세포들은 약 104 내지 약 109 개 T 세포/킬로그램(kg) 체중으로 또는 이의 특정 오차 범위 이내로, 예를 들어, 105 내지 106 개 T 세포/kg 체중, 예를 들어, 적어도 또는 적어도 약 또는 약 1×105 개 T 세포/kg, 1.5×105 개 T 세포/kg, 2×105 개 T 세포/kg, or 1×106 개 T 세포/kg 체중으로 투여된다.
일부 실시형태들에서, 세포는 약 104 내지 약 109 개 CD4+ 및/또는 CD8+ 개 세포/킬로그램(kg) 체중으로 또는 이의 특정 오차 범위 이내로, 예를 들어, 105 내지 106 개 CD4+ 및/또는 CD8+ 개 세포/kg 체중, 예를 들어, 적어도 또는 적어도 약 또는 약 1×105 개 CD4+ 및/또는 CD8+ 세포/kg, 1.5×105 개 CD4+ 및/또는 CD8+ 세포/kg, 2×105 개 CD4+ 및/또는 CD8+ 세포/kg, 또는 1×106 개 CD4+ 및/또는 CD8+ 세포/kg 체중으로 투여된다.
일부 실시형태들에서, 세포는 적어도 약 1×106, 약 2.5×106, 약 5×106, 약 7.5×106, 또는 약 9×106 개 CD4+ 세포, 및/또는 적어도 약 1×106, 약 2.5×106, 약 5×106, 약 7.5×106, 또는 약 9×106 CD8+ 세포, 및/또는 적어도 약 1×106, 약 2.5×106, 약 5×106, 약 7.5×106, 또는 약 9×106 개 T 세포로 또는 이의 특정 오차 범위 이내로 투여된다. 일부 실시형태들에서, 세포는 약 108 내지 1012 개 또는 약 1010 내지 1011 개 T 세포, 약 108 내지 1012 개 또는 약 1010 내지 1011 개 CD4+ 세포, 및/또는 약 108 내지 1012 개 또는 약 1010 내지 1011 개 CD8+ 세포로 또는 이의 특정 오차 범위 이내로 투여된다.
일부 실시형태에서, 세포는 다수의 세포 집단 또는 하위 유형, 예를 들어, CD4+ 및 CD8+ 세포 또는 하위 유형의 원하는 산출 비율로 또는 이의 허용 범위 이내로 투여된다. 일부 양상에서, 원하는 비율은 특정 비율일 수 있거나 비율의 범위일 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태들에서, 원하는 비율(예를 들어, CD4+ 대 CD8+ 세포의 비율)은 약 1:5 내지 약 5:1(또는 약 1:5 초과 약 5:1 미만), 또는 약 1:3 내지 약 3:1(또는 약 1:3 초과 내지 약 3:1 미만), 예컨대 약 2:1 내지 약 1:5 (또는 약 1:5 초과 및 약 2:1 미만, 예컨대 약 5:1, 4.5:1, 4:1, 3.5:1, 3:1, 2.5:1, 2:1, 1.9:1, 1.8:1, 1.7:1, 1.6:1, 1.5:1, 1.4:1, 1.3:1, 1.2:1, 1.1:1, 1:1, 1:1.1, 1:1.2, 1:1.3, 1:1.4, 1:1.5, 1:1.6, 1:1.7, 1:1.8, 1:1.9: 1:2, 1:2.5, 1:3, 1:3.5, 1:4, 1:4.5, 또는 1:5이다. 일부 양상에서, 허용되는 차이는 원하는 비율의 약 1%, 약 2%, 약 3%, 약 4% 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35 %, 약 40%, 약 45%, 약 50% 이내이며, 이들 범위 사이의 임의의 값을 포함한다. 일부 양상에서, 본원에 기재된 TCR은 개선된 발현 및 활성을 제공함으로써, 낮은 효과기 대 표적(E:T) 비율에서도 치료 효과를 제공한다.
치료에 대한 최적의 반응은 TCR과 같은 조작된 재조합 수용체가 세포 표면에서 일관되고 안정적으로 발현되고/되거나 표적 항원에 결합하는 능력에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 경우에 따라, 특정 재조합 수용체, 예를 들어, TCR의 특성은 경우에 따라 세포 치료에 사용되는 인간 T 세포와 같은 세포에서 발현될 때 재조합 수용체의 발현 및/또는 활성에 영향을 미칠 수 있다. 일부 내용에서, 특정 재조합 수용체, 예를 들어, TCR의 발현 수준은 낮을 수 있고, 이러한 재조합 수용체를 발현하는 인간 T 세포와 같은 조작된 세포의 활성은 불량한 발현 또는 불량한 신호전달 활성으로 인해 제한될 수 있다. 경우에 따라, 재조합 수용체 발현의 일관성 및/또는 효율 및 수용체 활성은 이용가능한 치료적 접근법의 특정 세포 또는 특정 세포 집단에서 제한된다. 어떤 경우에는 기능적 활성을 나타내기 위해 많은 수의 조작된 T 세포(높은 효과기 대 표적(E:T) 비율)가 필요하다. 일부 실시형태에서, 원하는 비율(E:T 비율)은 약 1:10 내지 약 10:1(또는 약 1:10 초과 내지 약 10:1 미만), 또는 약 1:1 및 약 10:1(또는 약 1:1 초과 약 5:1 미만), 예를 들어, 약 2:1 내지 약 10:1이다. 일부 실시형태에서, E:T 비율은 약 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 또는 10:1 이상이다.
질병의 예방 또는 치료를 위해 적절한 용량은 치료할 질병의 유형, 세포 또는 재조합 수용체의 유형, 질병의 중증도 및 경과, 세포가 예방 또는 치료 목적으로 투여되는지 여부, 이전 치료, 대상체의 임상 병력 및 세포에 대한 반응, 주치의의 재량에 따라 달라질 수 있다. 조성물 및 세포는 일부 실시형태에서 한 번에 또는 일련의 치료에 걸쳐 대상체에게 적합하게 투여된다.
본원에 기재된 세포는 임의의 적합한 수단, 예를 들어, 일시(bolus) 주입, 주사, 예를 들어, 정맥내 또는 피하 주사, 안구내 주사, 눈주위 주사, 망막하 주사, 유리체내 주사, 경중격 주사, 공막하 주사, 맥락막내 주사, 전안방내 주사, 결막하 주사(subconjectval injection), 결막하 주사(subconjuntival injection), 테논하 주사, 안구뒤 주사, 안구주위 주사, 또는 후방 공막근접 전달에 의해 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 이들은 비경구, 폐내 및 비강내로 투여되고, 국소 치료를 위해 필요한 경우 병변내 투여로 투여된다. 비경구 주입에는 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내 또는 피하 투여가 포함된다. 일부 실시형태에서, 주어진 용량은 세포의 단일 일시(bolus) 투여에 의해 투여된다. 일부 실시형태에서, 이는, 세포의 다회 일시 투여에 의해, 예를 들어, 3일 이하의 기간에 걸쳐 또는 세포의 연속 주입 투여에 의해 투여된다.
일부 실시형태에서, 세포는 병용 치료의 일부로서, 예를 들어, 또 다른 치료적 개입, 예를 들어, 항체 또는 조작된 세포 또는 수용체 또는 제제, 예를 들어, 세포독성 제제 또는 치료제와 동시에 또는 임의의 순서로 순차적으로 투여된다. 일부 실시형태에서 세포는 동시에 또는 임의의 순서로 순차적으로 하나 이상의 추가 치료제와 함께 또는 또 다른 치료적 개입과 관련하여 동시 투여된다. 일부 경우에서, 세포는 또 다른 요법과 시간상 충분히 근접하게 공동-투여되어, 세포 집단이 하나 이상의 추가 치료제의 효과를 향상시키거나 그 반대가 되도록 한다. 일부 실시형태에서, 세포는 하나 이상의 추가 치료제 이전에 투여된다. 일부 실시형태에서, 세포는 하나 이상의 추가 치료제 이후에 투여된다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 추가 제제는, 예를 들어, 지속성을 향상시키기 위해 IL-2와 같은 사이토카인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 화학요법제의 투여를 포함한다.
세포 투여 후, 일부 실시형태에서 조작된 세포 집단의 생물학적 활성은, 예를 들어, 임의의 다수의 공지된 방법에 의해 측정된다. 평가하기 위한 매개변수는, 생체내에서 예를 들어, 이미징에 의한 또는 생체외에서 예를 들어, ELISA 또는 유세포 측정법에 의해 측정된, 조작된 T 세포의 항원에 대한 특이적 결합을 포함한다. 특정 실시형태에서, 표적 세포를 파괴하는 조작된 세포의 능력은 해당 분야에 공지된 임의의 적합한 방법, 예를 들어, Kochenderfer et al. “Construction and pre-clinical evaluation of an anti-CD19 chimeric antigen receptor.” Journal of immunotherapy (Hagerstown, Md.: 1997) 32.7 (2009): 689 및 Hermans et al. “The VITAL assay: a versatile fluorometric technique for assessing CTL-and NKT-mediated cytotoxicity against multiple targets in vitro and in vivo.” Journal of immunological methods 285.1 (2004): 25-40에 기재된 세포독성 분석법을 사용하여 측정될 수 있다. 특정 실시형태에서, 세포의 생물학적 활성은 CD107a, IFNγ, IL-2 및 TNF와 같은 하나 이상의 사이토카인의 발현 및/또는 분비를 분석함으로써 측정된다. 일부 양상에서 생물학적 활성은 종양 부하 또는 부하의 감소와 같은 임상 결과를 평가함으로써 측정된다.
투약 일정 및 치료 요법
일차 세포 투여를 제공한 후 한 회 이상의 2차 연속 투여를 제공하는 반복 투약 방법이 제공된다. 세포의 다회 투여 시기 및 크기는 일반적으로 입양 요법 방법으로 대상체에게 투여될 때 본원에 기재된 조작된 세포의 효능 및/또는 활성 및/또는 기능을 증가시키도록 설계된다. 일부 실시형태에서, 반복 투여는 PD-1 및/또는 PD-L1과 같은 억제성 면역 분자가 조작된 T 세포에서 상향 조절될 때 발생할 수 있는 하향 조절 또는 억제 활성을 감소시킨다. 이 방법은 1차 투여를 투여한 후 일반적으로 한 회 이상의 연속 투여를 서로 다른 투여 사이에 특정 시간 프레임으로 투여하는 것을 포함한다.
입양 세포 요법과 관련하여, 주어진 “투여”의 투여는 주어진 양 또는 수의 세포를 단일 조성물로서 및/또는 단일 연속 투여로서, 예를 들어, 단일 주사 또는 연속 주입으로서 투여하는 것을 포함하고, 또한 주어진 양 또는 수의 세포를 특정 기간(예를 들어, 3일 이하)에 걸쳐 여러 개별 조성물 또는 주입으로 제공되는 분할 투여로서 투여하는 것을 포함한다. 따라서, 일부 경우, 1차 또는 연속적인 투여는 단일 시점에 제공되거나 개시되는 특정 수의 세포의 단회 또는 연속되는 투여이다. 그러나 일부 경우에서 1차 또는 연속 투여는 제한된 기간(예를 들어, 3일 이하)에 걸쳐 다회 주사 또는 주입으로, 예를 들어, 3일 동안 또는 2일 동안 1일 1회 또는 단 하루의 기간에 걸쳐 다회 주입하여 투여된다.
1차 투여의 세포는 단일 약학 조성물로 투여된다. 일부 실시형태에서, 연속 투여의 세포는 단일 약학 조성물로 투여된다.
일부 실시형태에서, 1차 투여의 세포는 1차 투여의 세포들을 집합적으로 함유하는 다수의 조성물로 투여된다. 일부 실시형태에서, 연속 투여의 세포는 연속 투여의 세포들을 집합적으로 함유하는 다수의 조성물로 투여된다. 일부 양상에서, 추가의 연속 투여는 3일 이하의 기간에 걸쳐 복수의 조성물로 투여될 수 있다.
용어 “분할 투여”는 분할된 투여를 의미하여 하루 이상에 걸쳐 투여된다. 이러한 유형의 투약은 본 방법에 포함되며 단회 투여로 간주된다. 따라서, 일부 실시형태에서, 1차 투여 및/또는 연속 투여(들)은 분할 투여로 투여될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 이러한 투여는 2일에 걸쳐 또는 3일에 걸쳐 대상체에게 투여될 수 있다. 예시적인 분할 투여 방법은 첫날에 용량의 25%를 투여하고 둘째 날에 용량의 나머지 75%를 투여하는 것을 포함한다. 다른 실시형태에서, 1차 투여의 33%는 1일차에 투여될 수 있고 나머지 67%는 2일차에 투여될 수 있다. 일부 양상에서, 용량의 10%가 1일차에 투여되고, 용량의 30%가 2일차에 투여되며, 용량의 60%가 3일차에 투여된다. 일부 실시형태에서, 분할 투여는 3일 이상에 걸쳐 분산되지 않는다.
이전 투여, 예를 들어, 1차 투여와 관련하여, 용어 “연속 투여”는 이전, 예를 들어, 1차 투여 이후에 동일한 대상체에게 투여되는 투여를 지칭하며, 그 사이에 대상체에게 임의의 중간 투여는 투여하지 않는다. 그럼에도 불구하고, 이 용어는 단일 분할 투여에 포함된 일련의 주입 또는 주사에서의 2차, 3차 및/또는 그 이후의 주사 또는 주입을 포함하지 않는다. 따라서, 달리 명시되지 않는 한, 1일, 2일 또는 3일 기간 이내의 2차 주입은 본원에서 사용되는 “연속” 투여로 간주되지 않는다. 마찬가지로, 분할 투여에 속하는 일련의 다회 투여에서 2차, 3차 등은 “연속” 투여의 의미와 관련하여 “중간” 투여로 간주되지 않는다. 따라서 달리 명시되지 않는 한, 1차 또는 이전 투여의 개시 후 3일을 초과하는 특정 기간에 투여된 투여는, 1차 또는 이전 투여 개시 후 3일 기간 이내에 2차 또는 후속 주사 또는 투여가 발생한 한, 대상체가 1차 투여 개시 후 2차 또는 후속된 세포 주사 또는 주입을 받더라도 “연속적인” 투여로 간주된다.
따라서 달리 명시하지 않는 한, 동일한 세포를 3일 이내의 기간에 걸쳐 반복 투여하는 것은 단회 투여로 간주하며, 최초 투여 후 3일 이내에 세포를 투여하는 것은 연속 투여로 간주하지 않으며 2차 투여가 1차 투여에 대해 “연속적”인지 여부를 결정함에 있어서 중간 투여로 간주되지 않는다.
일부 실시형태들에서, 다회의 연속 투여는, 일부 양상에서, 1차 투여와 1차 연속 투여 사이의 시기에 관한 것과 동일한 시기 지침을 사용하여, 예를 들어, 1차와 다회 연속 투여를 투여함으로써 제공되며, 각각의 연속 투여는 억제성 면역 분자, 예를 들어, PD-1 및/또는 PD-L1이 1차 투여 투여시로부터 대상체의 세포에서 상향조절되었던 기간의 시간 이내에 제공된다. 예를 들어, 말초 혈액 또는 기타 체액으로부터, 항원 발현, 예를 들어, TCR-발현 세포 내 PD-1 및/또는 PD-L1의 수준을 평가함으로써 연속 투여를 제공해야 하는 시기를 경험적으로 결정하는 것은 당업자의 능력 수준에 속한다.
일부 실시형태들에서, 1차 투여와 1차 연속 투여, 또는 1차와 다회 연속 투여 사이의 시기는 약 5 일, 6 일, 7 일, 8 일, 9 일, 10 일, 11 일, 12 일, 13 일, 14 일, 15 일, 16 일, 17 일, 18 일, 19 일, 20 일, 21 일, 22 일, 23 일, 24 일, 25 일, 26 일, 27 일, 28 일 또는 그 이상 보다 초과되는 시간 기간 이내에 제공되게 한다. 일부 실시형태에서, 연속 투여는 1차 투여 또는 직전 투여의 투여 후 약 28일 미만인 기간 내에 제공된다. 추가적인 다회 추가 연속 투여는 또한 후속 투여 또는 후속 연속 투여로도 지칭된다.
1차 및/또는 하나 이상의 연속 세포 투여의 크기는 일반적으로 개선된 효능 및/또는 감소된 독성 위험을 제공하도록 설계된다. 일부 양상에서, 1차 투여 또는 임의의 연속 투여의 투여량 또는 크기는 상기 기재된 임의의 용량 또는 양이다. 일부 실시형태들에서, 1차 투여 또는 임의의 연속 투여에서 세포의 수는 약 0.5×106 개 세포/대상체의 kg 체중 내지 5×106 개 세포/kg, 약 0.75×106 개 세포/kg 내지 3×106 개 세포/kg, 또는 약 1×106 개 세포/kg 내지 2×106개 세포/kg이다.
본원에서 사용되는 “1차 투여”는 연속 또는 후속 투여의 투여 이전인 주어진 투여 시기를 설명하기 위해 사용된다. 이 용어는 대상체가 이전에 세포 요법을 받은 적이 없거나 심지어 대상체가 이전에 동일한 재조합 수용체를 발현하거나 동일한 항원을 표적으로 하는 동일한 세포 또는 세포 투여를 제공 받은 적이 없다는 것을 반드시 의미하지는 않는다.
일부 실시형태에서, 장기적인 기간에 걸쳐(예를 들어, 적어도 1주, 2주, 3주, 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 12개월, 1년, 2년, 3년, 4년 또는 5년의 기간에 걸쳐) 대상체에게 다회 투여가 투여될 수 있다. 숙련된 의료 전문가는 진단을 위해 또는 치료의 유효성을 추적하기 위해(예를 들어, 적어도 하나의 암 증상을 관찰) 본원에 기재된 임의의 방법을 사용하여 치료 기간의 길이를 결정할 수 있다.
일부 실시형태에서, 연속 투여 내 세포들에 의해 발현되는 조작된 수용체, 예를 들어, TCR은 1차 투여 세포에 의해 발현되는 수용체, 예를 들어, TCR로서 적어도 하나의 면역반응성 에피토프를 함유한다. 일부 실시형태에서, 연속 투여로 투여된 세포에 의해 발현되는 수용체, 예를 들어, TCR은 1차 투여에 의해 발현되는 수용체, 예를 들어, TCR과 동일하거나, 또는 1차 투여로 투여된 세포에 의해 발현된 수용체, 예를 들어, TCR과 실질적으로 동일하다.
다양한 투여로 대상체에게 투여된 세포에 의해 발현되는 수용체, 예를 들어, TCR은 일반적으로 치료되는 질병 또는 병태에서 발현되는, 이와 관련되는, 및/또는 이에 특이적인 분자 또는 이의 세포들을 인식하거나 특이적으로 결합한다. 분자, 예를 들어, 항원에 특이적으로 결합 시, 수용체는 일반적으로 ITAM-변환된 신호와 같은 면역자극 신호를 세포 내로 전달함으로써 질병 또는 병태를 표적으로 하는 면역 반응을 촉진시킨다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 1차 투여의 세포는 발현된 항원에 특이적으로 결합하는 TCR을 발현한다.
실시예
본 발명은 실시예에서 보다 상세히 설명될 것이며, 이러한 실시예는 청구범위에 기재된 본 발명의 범위를 제한하지 않는다.
실시예 1. 재료 및 방법
구조체 설계
LMP2 TCR-T 세포의 경우, 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 2개의 코딩 영역을 포함하는 pMP71 레트로바이러스 벡터 구조체를 생성했다. 도 1에서 보는 바와 같이, 레트로바이러스 벡터 구조체는 P2A 서열에 의해 연결된 다음과 같은 두 개의 코딩 영역을 포함한다: (1) 마우스 TCR 알파 사슬의 불변 영역에 융합된 인간 항-LMP2 TCR의 알파 사슬의 가변 영역; (2) 마우스 TCR 베타 사슬의 불변 영역에 융합된 동일한 인간 항-LMP2 TCR의 베타 사슬 가변 영역. 구조체를 pMP71 레트로바이러스 벡터에 클로닝하여 TCR-T 세포를 생산하였다.
세포주 및 배지
HEK-293T, HMy2.CIR 및 K562 세포는 ATCC에서 구입했다. 익명 기증자의 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 Hemacare사로부터 얻었다. HMy2.CIR-A2 세포는 인간 HLA-A2를 과발현하는 벡터를 HMy2.CIR 세포의 레트로바이러스 형질도입하여 생산되었다.
K562-A11 및 K562-A24 세포는 각각 인간 HLA-A11 및 HLA-A24를 과발현하는 벡터를 K562 세포에 레트로바이러스 형질도입하여 생산되었다. 세포를 DMEM + 10% FBS, RPMI + 10% FBS 또는 X-Vivo + 5% 인간 혈청 A/B에서 배양하였다.
레트로바이러스 벡터 생산
표준 인산칼슘 침전 프로토콜을 사용하여 HEK-293T 세포를 일시적 형질감염시켜 레트로바이러스 벡터를 제조하였다. 바이러스 상층액을 48시간시에 채취하여 T 세포를 형질도입하는 데 사용했다.
Jurkat/T 세포 형질도입 및 증식
레트로바이러스 형질도입 전에, PBMC를 T 세포 활성화제 비드 및 인간 IL-2와 함께 배양하여 2일 동안 활성화시켰다. 형질도입을 위해, 새로 채취한 레트로바이러스 상층액을 32°C의 2,000g에서 2시간 동안 원심분리하여 웰당 15μg RetroNectin(Clontech Laboratories)으로 코팅된 비조직 배양-처리된 24웰 플레이트에 스핀 로딩했다. Jurkat 또는 활성화된 PBMC를 플레이트에 로딩하고 32°C에서 30분 동안 600g에서 원심분리하였다. Jurkat 또는 T 세포는 37°C 및 5% CO2에서 인큐베이션되었다. 배양 배지는 2일마다 보충하였다.
TCR 염색
모든 항체는 BioLegend, Inc.에서 구입했다. 재조합 TCR의 발현은 형질도입 48시간 후에 마우스 TCR 베타 사슬에 대하여 항체 염색하고 그 후 유세포 측정법에 의해 검출되었다. CD3 및/또는 CD8 염색을 수행하였다.
TCR-Jurkat 세포에서의 CD69 발현
TCR-Jurkat 세포를 표시된 펩티드 펄싱된 APC와 밤새 공동 배양한 후, 세포 표면 CD69를 유세포 측정법으로 측정했다. 분류된 CD3+ TCR+ 세포를 분석하였다.
시험관내 TCR-T IFN-γ 생산
TCR-T 세포를 지시된 펩티드 항원-펄싱된 APC(K562-A2, K562-A11 또는 K562-A24)와 함께 밤새 공동 배양한 후 세포내 IFN-γ 발현을 유세포 측정법으로 측정했다. 분류된 CD3+ CD8+ 세포를 분석하였다.
EC50 결정
TCR-T 세포를 HLA-A11 또는 HLA-A24를 과발현하는 K562 세포와 밤새 공동 배양하고 증가하는 농도의 LMP2 펩티드로 펄싱시켰다. TCR-T 세포와 APC를 1:1 효과기 대 표적 비율로 공동 배양한 후, T 세포를 수집하고 세포내 IFN-γ 발현을 측정하여 EC50을 결정했다.
실시예 2. 항-LMP2 TCR의 서열
다양한 HLA-A2 유형 항-LMP2 TCR의 알파 사슬 가변 도메인 및 베타 사슬 가변 도메인의 CDR1, CDR2 및 CDR3의 서열들이 도 2에 도시되어 있다. HLA-A2 유형의 항-LMP2 TCR은 LMP2 단백질의 아미노산 356-364를 표적으로 하는 L2-1, L2-2, L2-3, L2-4, L2-5, L2-6, L2-9, L2-10, L2-11, L2-12, L2-13, L2-16, L2-19, L2-23, L2-24 및 L2-25를 포함한다. HLA-A2 유형의 항-LMP2 TCR은 또한 LMP2 단백질의 아미노산 426-434를 표적으로 하는 L208을 포함한다.
3개의 HLA-A11 유형의 항-LMP2 TCR의 알파 사슬 가변 도메인 및 베타 사슬 가변 도메인의 CDR1, CDR2 및 CDR3의 서열들이 도 3에 도시되어 있다. HLA-A11 유형의 항-LMP2 TCR은 LMP2 단백질의 아미노산 340-349를 표적으로 하는 L11-3, L11-6 및 L11-15를 포함한다. HLA-A11 유형의 항-LMP2 TCR은 또한 LMP2 단백질의 아미노산 340-349를 표적으로 하는 L11-20 및 L11-22를 포함한다.
3개의 HLA-A24 유형의 항-LMP2 TCR의 알파 사슬 가변 도메인 및 베타 사슬 가변 도메인의 CDR1, CDR2 및 CDR3의 서열들이 도 4에 도시되어 있다. HLA-A24 유형의 항-LMP2 TCR은 LMP2 단백질의 아미노산 222-230를 표적으로 하는 L24-49 및 L24-2를 포함한다. HLA-A24 유형의 항-LMP2 TCR은 또한 LMP2 단백질의 아미노산 419-427를 표적으로 하는 L24-3, L24-5, L24-13, 및 L24-21을 포함한다.
실시예 3. HLA-A2 유형의 항-LMP2 TCR의 시험관내 발현
HLA-A2 유형의 항-LMP2 TCR의 시험관내 발현을 유세포 측정법으로 측정하였다. 도 5A-5C에 도시된 바와 같이, Jurkat 세포는 형질도입되지 않았거나(UT), 형질도입되어 L2-3, L2-9, L2-10, L2-19, L2-5, L2-6, L2-11, L2-12, L2-16, L2-23, L2-24 또는 L2-25 재조합 TCR을 발현하였다. 도 5D에 도시된 바와 같은 별도의 실험에서, 일차 인간 T 세포는 형질도입되지 않았거나(UT), 형질도입되어 L2-1, L2-2 또는 L2-13 재조합 TCR을 발현하였다. 형질도입 2일 후 마우스 TCR 베타 사슬을 염색하여 TCR 발현을 측정하였다. 도 5A-5D의 결과는 HLA-A2 유형의 항-LMP2 TCR이 인간 T 세포에서 강력하게 발현되었음을 나타낸다.
도 5E에 도시된 바와 같은 별도의 실험에서, 일차 인간 T 세포는 형질도입되지 않았거나(UT), 형질도입되어 L208 재조합 TCR을 발현하였다. 형질도입 11일 후 마우스 TCR 베타 사슬을 염색하여 TCR 발현을 측정하였다. 도 5E의 결과는 HLA-A2 유형의 항-LMP2 TCR L208이 인간 T 세포에서 강하게 발현되었음을 나타낸다.
실시예 4. 항원 특이적 자극 시 HLA-A2 유형의 항-LMP2 TCR-T 세포 활성화
항원 특이적 자극 시 HLA-A2 유형의 항-LMP2 TCR-T 세포 활성화를 유세포 측정법으로 결정했다. 도 6A-6C에 도시된 바와 같이, 형질도입되지 않은(UT) Jurkat 세포, 또는 형질도입되어 L2-3, L2-9, L2-10, L2-19, L2-5, L2-6, L2-11, L2-12, L2-16, L2-23, L2-24 또는 L2-25 재조합 TCR을 발현하는 Jurkat 세포들을 펩티드 FLYALALLL(또는 LMP2 단백질의 아미노산 356-364; 서열번호 139) 펄싱된 항원 제시 세포(APC)와 함께 밤새 공동 배양한 후, 표면 CD69 발현을 유세포 측정법으로 측정하였다. 도 6A-6C의 결과는 HLA-A2 유형의 TCR-T 세포가 시험관 내에서 항원 특이적 자극 시 활성화될 수 있음을 나타낸다.
도 6D에 도시된 바와 같이, 항원-특이적 자극 시 HLA-A2 유형의 항-LMP2 TCR-T 세포 활성화 또한 활성화된 TCR-T 세포에서 세포내 IFN-γ 발현을 측정함으로써 결정하였다. 보다 구체적으로, 형질도입되지 않은(UT) T 세포 또는 L2-1, L2-2 또는 L2-13 재조합 TCR을 발현하는 TCR-T 세포(PBMC T 세포)를 펩티드 FLYALALLL(서열번호 139) 펄싱된 APC와 함께 밤새 공동 배양하였다. 그런 다음 T 세포를 수집하고 세포내 IFN-γ 발현을 유세포 측정법으로 측정했다. 도 6D의 결과는 HLA-A2 유형의 항-LMP2 TCR을 발현하는 TCR-T 세포가 세포내 IFN-γ 발현에 의해 측정된 바와 같이 동족 항원에 의해 특이적으로 활성화되었음을 나타낸다.
또 다른 실험에서, 형질도입되지 않은(UT) T 세포 또는 L208 재조합 TCR을 발현하는 TCR-T 세포(PBMC T 세포)를 돌연변이체 펩티드 SLGGLLTMV(서열번호 168) 펄싱된 APC와 함께 밤새 공동 배양하였다. 그런 다음 T 세포를 수집하고 세포내 IFN-γ 발현을 유세포 측정법으로 측정했다. 도 6E의 결과는 HLA-A2 유형의 항-LMP2 TCR L208을 발현하는 TCR-T 세포가 세포내 IFN-γ 발현에 의해 측정된 바와 같이 LMP2 단백질로부터 돌연변이체 펩티드에 의해 특이적으로 활성화되었음을 나타낸다.
동족 야생형 및 돌연변이체 LMP2 펩티드의 절반 최대 유효 농도(EC50)를 결정하였다. 구체적으로, L208 재조합 TCR을 발현하는 TCR-T 세포는 증가하는 농도의 야생형 LMP2 펩티드 CLGGLLTMV(서열번호 167) 또는 돌연변이체 LMP 펩티드 SLGGLLTMV(서열번호 168)로 1:1의 효과기 대 표적 세포 비율로 펄싱된 APC와 함께 밤새 공동 배양되었다. 그런 다음 T 세포를 수집하고 세포내 IFN-γ 발현을 측정하여 EC50을 결정했다. 도 6F-6G에 도시된 바와 같이, 결과는 HLA-A2 유형의 항-LMP2 TCR L208을 발현하는 TCR-T 세포가 1㎍/ml 미만의 EC50에서 야생형 또는 돌연변이체 LMP2 펩티드로 펄싱된 APC를 인식함을 보여주었다. 예를 들어, 한 실험(도 6F)에서 야생형 펩티드의 EC50은 0.03923μg/ml이고 돌연변이체 펩티드의 EC50은 0.01826μg/ml이었다. 다른 실험(도 6G)에서 야생형 펩티드의 EC50은 0.2605μg/ml이고 돌연변이체 펩티드의 EC50은 0.1252μg/ml이었다.
실시예 5. HLA-A11 유형의 항-LMP2 TCR의 시험관내 발현
HLA-A11 유형의 항-LMP2 TCR의 시험관내 발현을 유세포 측정법으로 측정하였다. 도 7A-7B에 도시된 바와 같이, 일차 T 세포는 형질도입되지 않았거나(UT), 형질도입되어 L11-3, L11-6, L11-15, L11-20, 또는 L11-22 재조합 TCR을 발현하였다. 형질도입 2일 후 마우스 TCR 베타 사슬을 염색하여 TCR 발현을 측정하였다. 도 7A-7B의 결과는 HLA-A11 유형의 항-LMP2 TCR이 인간 T 세포에서 강력하게 발현되었음을 나타낸다.
실시예 6. 항원 특이적 자극 시 HLA-A11 유형의 항-LMP2 TCR-T 세포 활성화
항원 특이적 자극 시 HLA-A11 유형의 항-LMP2 TCR-T 세포 활성화를 유세포 측정법으로 결정했다. 도 8A-8B에 도시된 바와 같이 실험이 수행되었으며, 여기서 항원-특이적 자극 시 HLA-A11 유형의 항-LMP2 TCR-T 세포 활성화를 활성화된 TCR-T 세포에서 세포내 IFN-γ 발현을 측정함으로써 결정하였다. 보다 구체적으로, 형질도입되지 않은(UT) T 세포 또는 L11-3, L11-15 또는 L11-6 재조합 TCR을 발현하는 TCR-T 세포(PBMC T 세포)를 펩티드 SSCSSCPLSK(또는 LMP2 단백질의 아미노산 340-349, 서열번호 140) 펄싱된 APC와 함께 밤새 공동 배양하였다. 그런 다음 T 세포를 수집하고 세포내 IFN-γ 발현을 유세포 측정법으로 측정했다.
도 8C-8D에서, 형질도입되지 않은(UT) T 세포 또는 L11-20 또는 L11-22 재조합 TCR을 발현하는 TCR-T 세포(PBMC T 세포)를 펩티드 SSCSSCPLSK(또는 LMP2 단백질의 아미노산 340-349, 서열번호 140) 펄싱된 APC와 함께 밤새 공동 배양한 후, 표면 CD69 발현을 유세포 측정법으로 측정하였다.
도 8A-8D의 결과는 HLA-A11 유형의 항-LMP2 TCR을 발현하는 TCR-T 세포가 세포내 IFN-γ 발현 및 CD69에 의해 측정된 바와 같이 동족 항원에 의해 특이적으로 활성화되었음을 나타낸다.
실시예 7. HLA-A11 유형의 항-LMP2 TCR의 EC50
동족 LMP2 펩티드의 절반 최대 유효 농도(EC50)를 결정하였다. 구체적으로, L11-3 또는 L11-6 재조합 TCR을 발현하는 TCR-T 세포는 증가하는 농도의 LMP2 펩티드 SSCSSCPLSK(서열번호 140)로 1:1의 효과기 대 표적 세포 비율로 펄싱된 APC와 함께 밤새 공동 배양되었다. 그런 다음 T 세포를 수집하고 세포내 IFN-γ 발현을 측정하여 EC50을 결정했다. 도 9에 도시된 바와 같이, 결과는 HLA-A11 유형의 항-LMP2 TCR을 발현하는 TCR-T 세포가 LMP2 펩티드로 펄싱된 APC를 nM-내-μM 범위의 EC50으로 인식함을 보여주었다. 예를 들어, L11-3의 EC50은 0.3nM이고 L11-6의 EC50은 2nM이다.
실시예 8. HLA-A24 유형의 항-LMP2 TCR의 시험관내 발현
HLA-A24 유형의 항-LMP2 TCR의 시험관내 발현을 유세포 측정법으로 측정하였다. 도 10A 및 도 10C에 도시된 바와 같이, 일차 T 세포는 형질도입되지 않았거나(UT), 형질도입되어 L24-49, L24-2, L24-3, L24-13, L24-21 재조합 TCR을 발현하였다. 도 10B에 도시된 바와 같은 별도의 실험에서, Jurkat 세포는 빈 벡터 또는 L24-5 재조합 TCR을 인코딩하는 벡터로 형질도입되었다. 형질도입 2일 후 마우스 TCR 베타 사슬을 염색하여 TCR 발현을 측정하였다.
도 10A-10C의 결과는 HLA-A24 유형의 항-LMP2 TCR이 인간 T 세포에서 강력하게 발현되었음을 나타낸다.
실시예 9. 항원 특이적 자극 시 HLA-A24 유형의 항-LMP2 TCR-T 세포 활성화
항원 특이적 자극 시 HLA-A24 유형의 항-LMP2 TCR-T 세포 활성화를 유세포 측정법으로 결정했다. 도 11A-11B에 도시된 바와 같이, 항원-특이적 자극 시 HLA-A24 유형의 항-LMP2 TCR-T 세포 활성화 또한 활성화된 TCR-T 세포에서 세포내 IFN-γ 발현을 측정함으로써 결정하였다. 보다 구체적으로, 형질도입되지 않은(UT) T 세포 또는 L24-49 또는 L24-2 재조합 TCR을 발현하는 TCR-T 세포(PBMC T 세포)를 펩티드 IYVLVMLVL(또는 LMP2 단백질의 아미노산 222-230, 서열번호 141)로 펄싱된 APC와 함께 밤새 공동 배양하였다(도 11A). 별도의 실험에서, 형질도입되지 않은(UT) T 세포 또는 L24-3 또는 L24-13 재조합 TCR을 발현하는 TCR-T 세포(PBMC T 세포)를 펩티드 TYGPVFMCL(또는 LMP2 단백질의 아미노산 419-427, 서열번호 142)로 펄싱된 APC와 함께 밤새 공동 배양하였다(도 11B). 별도의 실험에서, 형질도입되지 않은(UT) T 세포 또는 L24-21 재조합 TCR을 발현하는 TCR-T 세포(PBMC T 세포)를 펩티드 TYGPVFMCL(또는 LMP2 단백질의 아미노산 419-427, 서열번호 142)로 펄싱된 APC와 함께 밤새 공동 배양하였다(도 11C). 그런 다음 T 세포를 수집하고 세포내 IFN-γ 발현을 유세포 측정법으로 측정했다. 도 11A-11C의 결과는 HLA-A24 유형의 항-LMP2 TCR을 발현하는 TCR-T 세포가 세포내 IFN-γ 발현에 의해 측정된 바와 같이 동족 항원에 의해 특이적으로 활성화되었음을 나타낸다.
도 11D에 도시된 바와 같이, 대조군(ctrl) Jurkat 세포, 또는 형질도입되어 L24-5 재조합 TCR을 발현하는 Jurkat 세포들을 펩티드 TYGPVFMCL(서열번호 142) 펄싱된 항원 제시 세포(APC)와 함께 밤새 공동 배양한 후, 표면 CD69 발현을 유세포 측정법으로 측정하였다. 도 11D의 결과는 HLA-A24 유형의 TCR-T 세포가 시험관 내에서 항원 특이적 자극 시 활성화될 수 있음을 나타낸다.
실시예 10. HLA-A24 유형의 항-LMP2 TCR의 EC50
동족 LMP2 펩티드의 절반 최대 유효 농도(EC50)를 결정하였다. 구체적으로, L24-49 또는 L24-2 재조합 TCR을 발현하는 TCR-T 세포는 증가하는 농도의 LMP2 펩티드 IYVLVMLVL(서열번호 141)로 1:1의 효과기 대 표적 세포 비율로 펄싱된 APC와 함께 밤새 공동 배양되었다. 별도의 실험에서, L24-3 또는 L24-13 재조합 TCR을 발현하는 TCR-T 세포는 증가하는 농도의 LMP2 펩티드 TYGPVFMCL(서열번호 142)로 1:1의 효과기 대 표적 세포 비율로 펄싱된 APC와 함께 밤새 공동 배양되었다. 그런 다음 T 세포를 수집하고 세포내 IFN-γ 발현을 측정하여 EC50을 결정했다. 도 12A-12B에 도시된 바와 같이, 결과는 HLA-A24 유형의 항-LMP2 TCR을 발현하는 TCR-T 세포가 LMP2 펩티드로 펄싱된 APC를 nM-내-μM 범위의 EC50으로 인식함을 보여주었다.
실시예 11. EBV 양성 TCR에 대한 모티프 분석
EBV 양성 TCR에 매우 풍부한 모티프들을 분석했다. 가장 중요한 모티프를 찾는 데 사용되는 방법에는 TCRdist, 서포트 벡터 머신(SVM), 피셔 정확 검정이 있다. 모티프가 결정되면 크래머의 V 검정을 적용하여 모티프와 결과 간의 연관성 강도를 측정했다.
먼저 TCRdist 알고리즘을 활용하여 가장 많이 농축된 모티프를 찾았다. 구체적으로, 두 아미노산 사이의 거리를 편집하여 최소 단위의 거리를 측정하였다. 도메인 기반 분석을 사용하여 서로 다른 도메인들의 거리를 측정하여, CDR2.5(α/β) 도메인이 점수화 시스템에서 정의되게 하였다. TCR 알파 사슬(TRA)과 TCR 베타 사슬(TRB)은 TCR 복합체의 서로 다른 도메인들에서 가중치 합산을 통해 클론들 간의 거리를 측정하기 위해 통합되었다. TCRdist 알고리즘의 세부 사항은, 예를 들어, Dash et al., “Quantifiable predictive features define epitope-specific T cell receptor repertoires.” Nature 547.7661 (2017): 89-93에서 찾을 수 있으며, 이 문헌은 본원에 그 전문이 참고로 포함된다. TCRdist 분석 결과는 도 13에 도시되어 있다. 표시된 클러스터의 클론들은 다른 모든 클러스터들의 클론들과 비교하여 서로 상당히 더 가깝다(유사함).
총 30개의 TCR 클론이 클러스터에서 식별되었고 14개가 실험에 의해 양성 클론으로 테스트되었다. 이러한 양성 클론들은 표적 에피토프를 인식하고 T 세포를 활성화할 수 있다. 양성 클론 중에서, 2개의 보존된 모티프, 즉, TRA의 CDR3 내부 “SGYSTL” 및 TRB의 CDR3 내부 “QGG”가 식별되었다.
두 번째로, 서포트 벡터 머신(SVM)을 활용하여 가장 중요한 모티프를 찾았다. 구체적으로, SVM을 실행하기 전에 R 패키지 tcR을 사용하여 3량체 내지 5량체의 모티프를 생성했다. “양성” EBV TCR 모티프와 “음성” HPV 단일 세포 TCR에 대해 교차 검증이 포함된 SVM 모델을 실행했다. 이 모델은 클래스 가중치/비용 민감 학습으로 실행되었다. 비용 민감 학습은 머신 러닝 모델을 교육할 때 예측 오류 비용을 고려했다. SVM은 결과 예측에 중요한 변수를 제공하기 위해 활용되었다. 그런 다음 이러한 고정밀 변수를 사용하여 곡선 아래 면적(AUC) 값과 ROC 곡선을 얻었다. 도 14에 도시된 바와 같이, SVM 분석 결과 최상위 모티프는 “QGG”와 “TQGG”로 나타났다.
셋째로, 피셔의 정확 검정(또는 Fisher's exact test)과 크래머의 V 검정을 수행하였다. 피셔의 정확 검정은 작은 셀 크기(예상값이 5 미만)에 대한 두 범주형 변수 간의 연관성을 검정하는 방법이다. 피셔 정확 검정의 P 값은 FDR 방법을 사용하여 조정되었다. 0.05 미만의 조정된 P 값은 유의한 것으로 간주되었다. 크래머의 V 통계량은 두 범주형 변수 간 연관성의 상대성(강도)을 측정하는 또 다른 검정이다. 아래 표는 크래머 V의 값과 그 연관성을 설명한다.
표 6
Figure pct00006
피셔 정확 검정 및 크래머의 V 검정 결과를 도 15에 도시한다. “QGG” 및 “TQGG”를 포함하여 최상위 모티프에 대해 P 값, 피셔 정확 검정으로 조정된 P 값 및 크래머의 V 검정에 의한 크래머 중요도 점수를 나열한다.
정리하면, 도 16A-16B에 도시된 바와 같이, 위의 모든 방법을 통과한 모티프가 양성 TCR에서 가장 중요한 마커로 간주된다. EBV-A02 데이터세트의 TCR 베타 사슬의 CDR3 내에서 모티프 “QGG”가 매우 풍부해졌다. EBV-A02 데이터 세트의 TCR 알파 사슬의 CDR3 내에서 “YST” 및 “SGY” 모티프가 매우 풍부해졌다. 모티프 “QGG”, “YST” 및 “SGY”의 AUC 값은 도 17A-17C에 도시된 바와 같이 계산되었다.
기타 실시형태
본 발명을 이의 상세한 설명과 관련하여 설명하였으나, 전술한 설명은 예시하기 위한 것이지, 첨부된 청구범위에 의해 정의되는 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것은 아님을 이해하여야 한다. 다른 양상들, 이점 및 변형들은 하기 청구범위에 속한다.
SEQUENCE LISTING <110> GUANGDONG TCRCURE BIOPHARMA TECHNOLOGY CO., LTD. TCRCURE BIOPHARMA CORP. <120> TCR-T CELL THERAPY TARGETING EPSTEIN-BARR VIRUS <130> 49159-0007US1 <150> PCT/CN2021/098487 <151> 2021-06-04 <150> PCT/CN2020/094628 <151> 2020-06-05 <160> 225 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1 Thr Ser Ile Asn Asn 1 5 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 2 Ile Arg Ser Asn Glu Arg Glu 1 5 <210> 3 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 3 Cys Ala Thr Thr Gly Asp Ser Gly Tyr Ser Thr Leu Thr Phe 1 5 10 <210> 4 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 4 Met Asn His Glu Tyr 1 5 <210> 5 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 5 Ser Val 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Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 161 Asp Ser Ala Ile Tyr Asn 1 5 <210> 162 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 162 Ile Gln Ser Ser Gln Arg Glu 1 5 <210> 163 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 163 Cys Gly Gly Leu Gly Phe Gly Asn Val Leu His Cys 1 5 10 <210> 164 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 164 Gly Thr Ser Asn Pro Asn 1 5 <210> 165 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 165 Ser Val Gly Ile Gly 1 5 <210> 166 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 166 Cys Ala Trp Ser Ser Leu Ala Ser Ser Tyr Glu Gln Tyr Phe 1 5 10 <210> 167 <211> 9 <212> PRT <213> Human gammaherpesvirus 4 <400> 167 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Synthetic polypeptide <400> 173 Met Ser Ile Gly Leu Leu Cys Cys Ala Ala Leu Ser Leu Leu Trp Ala 1 5 10 15 Gly Pro Val Asn Ala Gly Val Thr Gln Thr Pro Lys Phe Gln Val Leu 20 25 30 Lys Thr Gly Gln Ser Met Thr Leu Gln Cys Ala Gln Asp Met Asn His 35 40 45 Glu Tyr Met Ser Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Met Gly Leu Arg Leu 50 55 60 Ile His Tyr Ser Val Gly Ala Gly Ile Thr Asp Gln Gly Glu Val Pro 65 70 75 80 Asn Gly Tyr Asn Val Ser Arg Ser Thr Thr Glu Asp Phe Pro Leu Arg 85 90 95 Leu Leu Ser Ala Ala Pro Ser Gln Thr Ser Val Tyr Phe Cys Ala Ser 100 105 110 Ser Tyr Gln Gly Gly Asn Tyr Gly Tyr Thr Phe Gly Ser Gly Thr Arg 115 120 125 Leu Thr Val Val 130 <210> 174 <211> 132 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 174 Met Glu Thr Leu Leu Gly Val Ser Leu Val Ile Leu Trp Leu Gln Leu 1 5 10 15 Ala Arg Val Asn Ser Gln Gln Gly Glu Glu Asp Pro Gln Ala Leu Ser 20 25 30 Ile Gln Glu Gly Glu Asn Ala Thr Met Asn Cys Ser Tyr Lys Thr Ser 35 40 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Sequence: Synthetic polypeptide <400> 177 Met Ser Ile Gly Leu Leu Cys Cys Ala Ala Leu Ser Leu Leu Trp Ala 1 5 10 15 Gly Pro Val Asn Ala Gly Val Thr Gln Thr Pro Lys Phe Gln Val Leu 20 25 30 Lys Thr Gly Gln Ser Met Thr Leu Gln Cys Ala Gln Asp Met Asn His 35 40 45 Glu Tyr Met Ser Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Met Gly Leu Arg Leu 50 55 60 Ile His Tyr Ser Val Gly Ala Gly Ile Thr Asp Gln Gly Glu Val Pro 65 70 75 80 Asn Gly Tyr Asn Val Ser Arg Ser Thr Thr Glu Asp Phe Pro Leu Arg 85 90 95 Leu Leu Ser Ala Ala Pro Ser Gln Thr Ser Val Tyr Phe Cys Ala Ser 100 105 110 Ser Tyr Gln Gly Gly Thr Arg Asn Gly Tyr Thr Phe Gly Ser Gly Thr 115 120 125 Arg Leu Thr Val Val 130 <210> 178 <211> 132 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 178 Met Glu Thr Leu Leu Gly Val Ser Leu Val Ile Leu Trp Leu Gln Leu 1 5 10 15 Ala Arg Val Asn Ser Gln Gln Gly Glu Glu Asp Pro Gln Ala Leu Ser 20 25 30 Ile Gln Glu Gly Glu Asn Ala Thr Met Asn Cys Ser Tyr Lys 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Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 181 Met Ser Ile Gly Leu Leu Cys Cys Ala Ala Leu Ser Leu Leu Trp Ala 1 5 10 15 Gly Pro Val Asn Ala Gly Val Thr Gln Thr Pro Lys Phe Gln Val Leu 20 25 30 Lys Thr Gly Gln Ser Met Thr Leu Gln Cys Ala Gln Asp Met Asn His 35 40 45 Glu Tyr Met Ser Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Met Gly Leu Arg Leu 50 55 60 Ile His Tyr Ser Val Gly Ala Gly Ile Thr Asp Gln Gly Glu Val Pro 65 70 75 80 Asn Gly Tyr Asn Val Ser Arg Ser Thr Thr Glu Asp Phe Pro Leu Arg 85 90 95 Leu Leu Ser Ala Ala Pro Ser Gln Thr Ser Val Tyr Phe Cys Ala Ser 100 105 110 Ser Thr Gln Gly Gly Gly Asp Gly Tyr Thr Phe Gly Ser Gly Thr Arg 115 120 125 Leu Thr Val Val 130 <210> 182 <211> 132 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 182 Met Glu Thr Leu Leu Gly Val Ser Leu Val Ile Leu Trp Leu Gln Leu 1 5 10 15 Ala Arg Val Asn Ser Gln Gln Gly Glu Glu Asp Pro Gln Ala Leu Ser 20 25 30 Ile Gln Glu Gly Glu Asn Ala Thr Met Asn Cys Ser 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Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 189 Met Ser Ile Gly Leu Leu Cys Cys Ala Ala Leu Ser Leu Leu Trp Ala 1 5 10 15 Gly Pro Val Asn Ala Gly Val Thr Gln Thr Pro Lys Phe Gln Val Leu 20 25 30 Lys Thr Gly Gln Ser Met Thr Leu Gln Cys Ala Gln Asp Met Asn His 35 40 45 Glu Tyr Met Ser Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Met Gly Leu Arg Leu 50 55 60 Ile His Tyr Ser Val Gly Ala Gly Ile Thr Asp Gln Gly Glu Val Pro 65 70 75 80 Asn Gly Tyr Asn Val Ser Arg Ser Thr Thr Glu Asp Phe Pro Leu Arg 85 90 95 Leu Leu Ser Ala Ala Pro Ser Gln Thr Ser Val Tyr Phe Cys Ala Ser 100 105 110 Arg Val Gln Gly Gly Ile Glu Gly Tyr Thr Phe Gly Ser Gly Thr Arg 115 120 125 Leu Thr Val Val 130 <210> 190 <211> 132 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 190 Met Glu Thr Leu Leu Gly Val Ser Leu Val Ile Leu Trp Leu Gln Leu 1 5 10 15 Ala Arg Val Asn Ser Gln Gln Gly Glu Glu Asp Pro Gln Ala Leu Ser 20 25 30 Ile Gln Glu Gly Glu Asn Ala Thr Met Asn Cys Ser 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Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 193 Met Ser Ile Gly Leu Leu Cys Cys Ala Ala Leu Ser Leu Leu Trp Ala 1 5 10 15 Gly Pro Val Asn Ala Gly Val Thr Gln Thr Pro Lys Phe Gln Val Leu 20 25 30 Lys Thr Gly Gln Ser Met Thr Leu Gln Cys Ala Gln Asp Met Asn His 35 40 45 Glu Tyr Met Ser Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Met Gly Leu Arg Leu 50 55 60 Ile His Tyr Ser Val Gly Ala Gly Ile Thr Asp Gln Gly Glu Val Pro 65 70 75 80 Asn Gly Tyr Asn Val Ser Arg Ser Thr Thr Glu Asp Phe Pro Leu Arg 85 90 95 Leu Leu Ser Ala Ala Pro Ser Gln Thr Ser Val Tyr Phe Cys Ala Ser 100 105 110 Ser Ser Gln Gly Gly Trp Asn Tyr Gly Tyr Thr Phe Gly Ser Gly Thr 115 120 125 Arg Leu Thr Val Val 130 <210> 194 <211> 132 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 194 Met Glu Thr Leu Leu Gly Val Ser Leu Val Ile Leu Trp Leu Gln Leu 1 5 10 15 Ala Arg Val Asn Ser Gln Gln Gly Glu Glu Asp Pro Gln Ala Leu Ser 20 25 30 Ile Gln Glu Gly Glu Asn Ala Thr 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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 197 Met Ser Ile Gly Leu Leu Cys Cys Ala Ala Leu Ser Leu Leu Trp Ala 1 5 10 15 Gly Pro Val Asn Ala Gly Val Thr Gln Thr Pro Lys Phe Gln Val Leu 20 25 30 Lys Thr Gly Gln Ser Met Thr Leu Gln Cys Ala Gln Asp Met Asn His 35 40 45 Glu Tyr Met Ser Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Met Gly Leu Arg Leu 50 55 60 Ile His Tyr Ser Val Gly Ala Gly Ile Thr Asp Gln Gly Glu Val Pro 65 70 75 80 Asn Gly Tyr Asn Val Ser Arg Ser Thr Thr Glu Asp Phe Pro Leu Arg 85 90 95 Leu Leu Ser Ala Ala Pro Ser Gln Thr Ser Val Tyr Phe Cys Ala Ser 100 105 110 Asn Pro Gln Gly Gly Ser Ile Gly Tyr Thr Phe Gly Ser Gly Thr Arg 115 120 125 Leu Thr Val Val 130 <210> 198 <211> 132 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 198 Met Glu Thr Leu Leu Gly Val Ser Leu Val Ile Leu Trp Leu Gln Leu 1 5 10 15 Ala Arg Val Asn Ser Gln Gln Gly Glu Glu Asp Pro Gln Ala Leu Ser 20 25 30 Ile Gln Glu Gly Glu Asn Ala 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Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 201 Met Gly Thr Arg Leu Phe Phe Tyr Val Ala Leu Cys Leu Leu Trp Ala 1 5 10 15 Gly His Arg Asp Ala Gly Ile Thr Gln Ser Pro Arg Tyr Lys Ile Thr 20 25 30 Glu Thr Gly Arg Gln Val Thr Leu Met Cys His Gln Thr Trp Ser His 35 40 45 Ser Tyr Met Phe Trp Tyr Arg Gln Asp Leu Gly His Gly Leu Arg Leu 50 55 60 Ile Tyr Tyr Ser Ala Ala Ala Asp Ile Thr Asp Lys Gly Glu Val Pro 65 70 75 80 Asp Gly Tyr Val Val Ser Arg Ser Lys Thr Glu Asn Phe Pro Leu Thr 85 90 95 Leu Glu Ser Ala Thr Arg Ser Gln Thr Ser Val Tyr Phe Cys Ala Ser 100 105 110 Ser Glu Asp Gly Met Asn Thr Glu Ala Phe Phe Gly Gln Gly Thr Arg 115 120 125 Leu Thr Val Val 130 <210> 202 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 202 Met Leu Leu Ile Thr Ser Met Leu Val Leu Trp Met Gln Leu Ser Gln 1 5 10 15 Val Asn Gly Gln Gln Val Met Gln Ile Pro Gln Tyr Gln His Val Gln 20 25 30 Glu Gly Glu Asp Phe Thr Thr Tyr Cys 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polypeptide <400> 205 Met Asp Ser Trp Thr Phe Cys Cys Val Ser Leu Cys Ile Leu Val Ala 1 5 10 15 Lys His Thr Asp Ala Gly Val Ile Gln Ser Pro Arg His Glu Val Thr 20 25 30 Glu Met Gly Gln Glu Val Thr Leu Arg Cys Lys Pro Ile Ser Gly His 35 40 45 Asn Ser Leu Phe Trp Tyr Arg Gln Thr Met Met Arg Gly Leu Glu Leu 50 55 60 Leu Ile Tyr Phe Asn Asn Asn Val Pro Ile Asp Asp Ser Gly Met Pro 65 70 75 80 Glu Asp Arg Phe Ser Ala Lys Met Pro Asn Ala Ser Phe Ser Thr Leu 85 90 95 Lys Ile Gln Pro Ser Glu Pro Arg Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala 100 105 110 Ser Ser Leu Gly Ala Gly Ser Gly Trp Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly 115 120 125 Thr Arg Leu Thr Val Thr 130 <210> 206 <211> 147 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 206 Met Ala Phe Trp Leu Arg Arg Leu Gly Leu His Phe Arg Pro His Leu 1 5 10 15 Gly Arg Arg Met Glu Ser Phe Leu Gly Gly Val Leu Leu Ile Leu Trp 20 25 30 Leu Gln Val Asp Trp Val Lys Ser Gln Lys Ile Glu Gln Asn Ser Glu 35 40 45 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<220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 209 Met Gly Cys Arg Leu Leu Cys Cys Ala Val Leu Cys Leu Leu Gly Ala 1 5 10 15 Val Pro Ile Asp Thr Glu Val Thr Gln Thr Pro Lys His Leu Val Met 20 25 30 Gly Met Thr Asn Lys Lys Ser Leu Lys Cys Glu Gln His Met Gly His 35 40 45 Arg Ala Met Tyr Trp Tyr Lys Gln Lys Ala Lys Lys Pro Pro Glu Leu 50 55 60 Met Phe Val Tyr Ser Tyr Glu Lys Leu Ser Ile Asn Glu Ser Val Pro 65 70 75 80 Ser Arg Phe Ser Pro Glu Cys Pro Asn Ser Ser Leu Leu Asn Leu His 85 90 95 Leu His Ala Leu Gln Pro Glu Asp Ser Ala Leu Tyr Leu Cys Ala Ser 100 105 110 Ser Gln Gly Arg Trp Tyr Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu 115 120 125 Thr Val Thr 130 <210> 210 <211> 127 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 210 Met Arg Gln Val Ala Arg Val Ile Val Phe Leu Thr Leu Ser Thr Leu 1 5 10 15 Ser Leu Ala Lys Thr Thr Gln Pro Ile Ser Met Asp Ser Tyr Glu Gly 20 25 30 Gln Glu Val Asn Ile Thr Cys 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Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 213 Met Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Pro Gly Ser Gly Leu Gly Ala 1 5 10 15 Val Val Ser Gln His Pro Ser Arg Val Ile Cys Lys Ser Gly Thr Ser 20 25 30 Val Lys Ile Glu Cys Arg Ser Leu Asp Phe Gln Ala Thr Thr Met Phe 35 40 45 Trp Tyr Arg Gln Phe Pro Lys Gln Ser Leu Met Leu Met Ala Thr Ser 50 55 60 Asn Glu Gly Ser Lys Ala Thr Tyr Glu Gln Gly Val Glu Lys Asp Lys 65 70 75 80 Phe Leu Ile Asn His Ala Ser Leu Thr Leu Ser Thr Leu Thr Val Thr 85 90 95 Ser Ala His Pro Glu Asp Ser Ser Phe Tyr Ile Cys Ser Ala Arg Gly 100 105 110 Pro Gly Glu Arg Glu Ala Asn Thr Asp Thr Gln Tyr Phe Gly Pro Gly 115 120 125 Thr Arg Leu Thr Val Leu 130 <210> 214 <211> 136 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 214 Met Ala Thr Gly Ser Arg Thr Ser Leu Leu Leu Ala Phe Gly Leu Leu 1 5 10 15 Cys Leu Pro Trp Leu Gln Glu Ala Ser Ala Arg Lys Glu Val Glu Gln 20 25 30 Asp Pro Gly Pro Phe Asn Val Pro Glu Gly 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Leu Val Ile Leu Trp Leu Gln Leu 1 5 10 15 Ser Trp Val Trp Ser Gln Gln Lys Glu Val Glu Gln Asp Pro Gly Pro 20 25 30 Leu Ser Val Pro Glu Gly Ala Ile Val Ser Leu Asn Cys Thr Tyr Ser 35 40 45 Asn Ser Ala Phe Gln Tyr Phe Met Trp Tyr Arg Gln Tyr Ser Arg Lys 50 55 60 Gly Pro Glu Leu Leu Met Tyr Thr Tyr Ser Ser Gly Asn Lys Glu Asp 65 70 75 80 Gly Arg Phe Thr Ala Gln Val Asp Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ser Leu 85 90 95 Phe Ile Arg Asp Ser Gln Pro Ser Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala 100 105 110 Met Ser Ala Trp Ala Ser Lys Ile Ile Phe Gly Ser Gly Thr Arg Leu 115 120 125 Ser Ile Arg Pro 130 <210> 219 <211> 134 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 219 Met Ala Ser Leu Leu Phe Phe Cys Gly Ala Phe Tyr Leu Leu Gly Thr 1 5 10 15 Gly Ser Met Asp Ala Asp Val Thr Gln Thr Pro Arg Asn Arg Ile Thr 20 25 30 Lys Thr Gly Lys Arg Ile Met Leu Glu Cys Ser Gln Thr Lys Gly His 35 40 45 Asp Arg Met Tyr Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Leu Gly Leu Arg 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Phe Cys Ala Arg Phe Ser Asp Gly Gln Lys Leu Leu Phe Ala Arg 115 120 125 Gly Thr Met Leu Lys Val Asp Leu 130 135 <210> 221 <211> 140 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 221 Met Ala Thr Gly Ser Arg Thr Ser Leu Leu Leu Ala Phe Gly Leu Leu 1 5 10 15 Cys Leu Pro Cys Leu Gln Glu Gly Ser Ala Asn Ala Gly Val Thr Gln 20 25 30 Thr Pro Lys Phe Arg Ile Leu Lys Ile Gly Gln Ser Met Thr Leu Gln 35 40 45 Cys Thr Gln Asp Met Asn His Asn Tyr Met Tyr Trp Tyr Arg Gln Asp 50 55 60 Pro Gly Met Gly Leu Lys Leu Ile Tyr Tyr Ser Val Gly Ala Gly Ile 65 70 75 80 Thr Asp Lys Gly Glu Val Pro Asn Gly Tyr Asn Val Ser Arg Ser Thr 85 90 95 Thr Glu Asp Phe Pro Leu Arg Leu Glu Leu Ala Ala Pro Ser Gln Thr 100 105 110 Ser Val Tyr Phe Cys Ala Ser Ser Asn Arg Gly Gly Val Pro Asp Thr 115 120 125 Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr Val Leu 130 135 140 <210> 222 <211> 130 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 222 Met Glu Thr Leu Leu Gly Leu Leu Ile Leu Trp Leu Gln Leu Gln Trp 1 5 10 15 Val Ser Ser Lys Gln Glu Val Thr Gln Ile Pro Ala Ala Leu Ser Val 20 25 30 Pro Glu Gly Glu Asn Leu Val Leu Asn Cys Ser Phe Thr Asp Ser Ala 35 40 45 Ile Tyr Asn Leu Gln Trp Phe Arg Gln Asp Pro Gly Lys Gly Leu Thr 50 55 60 Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Ser Gln Arg Glu Gln Thr Ser Gly Arg 65 70 75 80 Leu Asn Ala Ser Leu Asp Lys Ser Ser Gly Arg Ser Thr Leu Tyr Ile 85 90 95 Ala Ala Ser Gln Pro Gly Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Gly Gly Leu 100 105 110 Gly Phe Gly Asn Val Leu His Cys Gly Ser Gly Thr Gln Val Ile Val 115 120 125 Leu Pro 130 <210> 223 <211> 130 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 223 Met Leu Cys Ser Leu Leu Ala Leu Leu Leu Gly Thr Phe Phe Gly Val 1 5 10 15 Arg Ser Gln Thr Ile His Gln Trp Pro Ala Thr Leu Val Gln Pro Val 20 25 30 Gly Ser Pro Leu Ser Leu Glu Cys Thr Val Glu Gly Thr Ser Asn Pro 35 40 45 Asn Leu Tyr Trp Tyr Arg Gln Ala Ala Gly Arg Gly Leu Gln Leu Leu 50 55 60 Phe Tyr Ser Val Gly Ile Gly Gln Ile Ser Ser Glu Val Pro Gln Asn 65 70 75 80 Leu Ser Ala Ser Arg Pro Gln Asp Arg Gln Phe Ile Leu Ser Ser Lys 85 90 95 Lys Leu Leu Leu Ser Asp Ser Gly Phe Tyr Leu Cys Ala Trp Ser Ser 100 105 110 Leu Ala Ser Ser Tyr Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr 115 120 125 Val Thr 130 <210> 224 <211> 141 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 224 Asp Ile Gln Asn Pro Glu Pro Ala Val Tyr Gln Leu Lys Asp Pro Arg 1 5 10 15 Ser Gln Asp Ser Thr Leu Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Ile 20 25 30 Asn Val Pro Lys Thr Met Glu Ser Gly Thr Phe Ile Thr Asp Lys Thr 35 40 45 Val Leu Asp Met Lys Ala Met Asp Ser Lys Ser Asn Gly Ala Ile Ala 50 55 60 Trp Ser Asn Gln Thr Ser Phe Thr Cys Gln Asp Ile Phe Lys Glu Thr 65 70 75 80 Asn Ala Cys Tyr Pro Ser Ser Asp Val Pro Cys Asp Ala Thr Leu Thr 85 90 95 Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Met Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser 100 105 110 Val Met Gly Leu Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu 115 120 125 Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser Arg Ala Lys Arg 130 135 140 <210> 225 <211> 173 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 225 Glu Asp Leu Arg Asn Val Thr Pro Pro Lys Val Ser Leu Phe Glu Pro 1 5 10 15 Ser Lys Ala Glu Ile Ala Asn Lys Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu 20 25 30 Ala Arg Gly Phe Phe Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn 35 40 45 Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln Ala Tyr Lys 50 55 60 Glu Ser Asn Tyr Ser Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Cys Ala 65 70 75 80 Thr Phe Trp His Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe 85 90 95 His Gly Leu Ser Glu Glu Asp Lys Trp Pro Glu Gly Ser Pro Lys Pro 100 105 110 Val Thr Gln Asn Ile Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly 115 120 125 Ile Thr Ser Ala Ser Tyr Gln Gln Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu 130 135 140 Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser 145 150 155 160 Thr Leu Val Val Met Ala Met Val Lys Arg Lys Asn Ser 165 170

Claims (55)

  1. 가변 알파(Va) 영역을 포함하는 알파 사슬 및 가변 베타(Vb) 영역을 포함하는 베타 사슬을 포함하는 T 세포 수용체(TCR) 또는 이의 항원-결합 단편으로서, 여기서
    (a) Va 영역은 상보성 결정 영역 1(CDR1), 상보성 결정 영역 2(CDR2) 및 상보성 결정 영역 3(CDR3)을 포함하고, 여기서 Va 영역의 CDR3은 아미노산 서열 X1GX2SGYSTL을 포함하고, 여기서
    X1은 E, T, Q, V 또는 N이고,
    X2 는 D, G, N 또는 E이고; 그리고
    (b) Vb 영역은 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하고, 여기서 Vb 영역의 CDR3은 아미노산 서열 X3X4QGGX5X6X7X8을 포함하고, 여기서
    X3은 S, T, N 또는 R이고,
    X4는 T, R, Y, G, V, Q, F, S 또는 P이고,
    X5는 N, G, H, T, S, A, I 또는 W이고,
    X6은 Y, N, D, E, R 또는 I이고,
    X7은 G, Q, N, Y이고,
    X8은 Y, F 또는 G인, T 세포 수용체(TCR) 또는 이의 항원-결합 단편.
  2. 제1항에 있어서, Va 영역은 인간 TRAV 유전자 분절 및 인간 TRAJ 유전자 분절을 재배열한 서열에 의해 인코딩되고, Vb 영역은 인간 TRBV 유전자 분절, 선택적으로 인간 TRBD 유전자 분절, 및 인간 TRBJ 유전자 분절을 재배열한 서열에 의해 인코딩되는, T 세포 수용체(TCR) 또는 이의 항원-결합 단편으로서, 여기서
    TRAV 유전자 분절은 TRAV17이고;
    TRAJ 유전자 분절은 TRAJ11이고;
    TRBV 유전자 분절은 TRBV6-5이고;
    TRBD 유전자 분절은 TRBD1 또는 TRBD2이고; 그리고
    TRBJ 유전자 분절은 TRBJ2-1 또는 TRBJ1-2인, T 세포 수용체(TCR) 또는 이의 항원-결합 단편.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, Va CDR1 영역은 TSINN(서열번호 1)에 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, Va CDR2 영역은 IRSNEY(서열번호 2)에 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, Vb CDR1 영역은 MNHEY(서열번호 4)에 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 그리고 Vb CDR2 영역은 SVGAGI(서열번호 5)에 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, T 세포 수용체(TCR) 또는 이의 항원-결합 단편.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    여기서 Va CDR1 영역은 선택된 Va CDR1 아미노산 서열에 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, Va CDR2 영역은 선택된 Va CDR2 아미노산 서열에 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, Va CDR3 영역은 선택된 Va CDR3 아미노산 서열에 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 그리고
    여기서 Vb CDR1 영역은 선택된 Vb CDR1 아미노산 서열에 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, Vb CDR2 영역은 선택된 Vb CDR2 아미노산 서열에 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, Vb CDR3 영역은 선택된 Vb CDR3 아미노산 서열에 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하고;
    여기서 선택된 Va CDR 1, 2 및 3 및 Vb CDR 1, 2 및 3 아미노산 서열은 다음 중 하나인, T 세포 수용체(TCR) 또는 이의 항원-결합 단편:
    (1) 선택된 Va CDR 1, 2, 3 아미노산 서열은 각각 서열번호 1 내지 3에 제시되고, 선택된 Vb CDR 1, 2, 3 아미노산 서열은 각각 서열번호 4 내지 6에 제시되거나;
    (2) 선택된 Va CDR 1, 2, 3 아미노산 서열은 각각 서열번호 7 내지 9에 제시되고, 선택된 Vb CDR 1, 2, 3 아미노산 서열은 각각 서열번호 10 내지 12에 제시되거나;
    (3) 선택된 Va CDR 1, 2, 3 아미노산 서열은 각각 서열번호 13 내지 15에 제시되고, 선택된 Vb CDR 1, 2, 3 아미노산 서열은 각각 서열번호 16 내지 18에 제시되거나;
    (4) 선택된 Va CDR 1, 2, 3 아미노산 서열은 각각 서열번호 19 내지 21에 제시되고, 선택된 Vb CDR 1, 2, 3 아미노산 서열은 각각 서열번호 22 내지 24에 제시되거나;
    (5) 선택된 Va CDR 1, 2, 3 아미노산 서열은 각각 서열번호 25 내지 27에 제시되고, 선택된 Vb CDR 1, 2, 3 아미노산 서열은 각각 서열번호 28 내지 30에 제시되거나;
    (6) 선택된 Va CDR 1, 2, 3 아미노산 서열은 각각 서열번호 31 내지 33에 제시되고, 선택된 Vb CDR 1, 2, 3 아미노산 서열은 각각 서열번호 34 내지 36에 제시되거나;
    (7) 선택된 Va CDR 1, 2, 3 아미노산 서열은 각각 서열번호 37 내지 39에 제시되고, 선택된 Vb CDR 1, 2, 3 아미노산 서열은 각각 서열번호 40 내지 42에 제시되거나;
    (8) 선택된 Va CDR 1, 2, 3 아미노산 서열은 각각 서열번호 43 내지 45에 제시되고, 선택된 Vb CDR 1, 2, 3 아미노산 서열은 각각 서열번호 46 내지 48에 제시되거나;
    (9) 선택된 Va CDR 1, 2, 3 아미노산 서열은 각각 서열번호 49 내지 51에 제시되고, 선택된 Vb CDR 1, 2, 3 아미노산 서열은 각각 서열번호 52 내지 54에 제시되거나;
    (10) 선택된 Va CDR 1, 2, 3 아미노산 서열은 각각 서열번호 61 내지 63에 제시되고, 선택된 Vb CDR 1, 2, 3 아미노산 서열은 각각 서열번호 64 내지 66에 제시되거나;
    (11) 선택된 Va CDR 1, 2, 3 아미노산 서열은 각각 서열번호 67 내지 69에 제시되고, 선택된 Vb CDR 1, 2, 3 아미노산 서열은 각각 서열번호 70 내지 72에 제시되거나;
    (12) 선택된 Va CDR 1, 2, 3 아미노산 서열은 각각 서열번호 73 내지 75에 제시되고, 선택된 Vb CDR 1, 2, 3 아미노산 서열은 각각 서열번호 76 내지 78에 제시되거나;
    (13) 선택된 Va CDR 1, 2, 3 아미노산 서열은 각각 서열번호 79 내지 81에 제시되고, 선택된 Vb CDR 1, 2, 3 아미노산 서열은 각각 서열번호 82 내지 84에 제시되거나; 또는
    (14) 선택된 Va CDR 1, 2, 3 아미노산 서열은 각각 서열번호 85 내지 87에 제시되고, 선택된 Vb CDR 1, 2, 3 아미노산 서열은 각각 서열번호 88 내지 90에 제시됨.
  5. 다음을 포함하는 T 세포 수용체(TCR) 또는 이의 항원 결합 단편:
    가변 알파(Va) 영역을 포함하는 알파 사슬, 여기서 Va 영역은 상보성 결정 영역 1(CDR-1), 상보성 결정 영역 2(CDR-2), 및 상보성 결정 영역 3(CDR-3)을 포함하고, 여기서 Va CDR1 영역은 서열번호 55에 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, Va CDR2 영역은 서열번호 56에 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, Va CDR3 영역은 서열번호 57에 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 그리고
    가변 베타(Vb) 영역을 포함하는 베타 사슬, 여기서 Vb 영역은 상보성 결정 영역 1(CDR-1), 상보성 결정 영역 2(CDR-2), 및 상보성 결정 영역 3(CDR-3)을 포함하고, 여기서 Vb CDR1 영역은 서열번호 58에 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, Vb CDR2 영역은 서열번호 59에 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, Vb CDR3 영역은 서열번호 60에 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함함.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, TCR 또는 이의 항원 결합 단편은 주조직 적합성 복합체(MHC) 분자에 의해 제시되는 LMP2의 펩티드 에피토프(FLYALALLL)(서열번호 139)에 결합하거나 이를 인식하는, TCR 또는 이의 항원 결합 단편.
  7. 제6항에 있어서, MHC 분자는 HLA-A2 분자인, TCR 또는 이의 항원 결합 단편.
  8. 제1항에 있어서, Va 영역은 인간 TRAV 유전자 분절 및 인간 TRAJ 유전자 분절을 재배열한 서열에 의해 인코딩되고, Vb 영역은 인간 TRBV 유전자 분절, 선택적으로 인간 TRBD 유전자 분절, 및 인간 TRBJ 유전자 분절을 재배열한 서열에 의해 인코딩되며, 여기서
    TRAV 유전자 분절은 TRAV21이고;
    TRAJ 유전자 분절은 TRAJ33이고;
    TRBV 유전자 분절은 TRBV10-2이고;
    TRBD 유전자 분절은 TRBD1 또는 TRBD2이고; 그리고
    TRBJ 유전자 분절은 TRBJ2-7인, T 세포 수용체(TCR) 또는 이의 항원-결합 단편.
  9. 제1항 또는 제8항에 있어서,
    Va CDR1 영역은 서열번호 143에 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, Va CDR2 영역은 서열번호 144에 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, Va CDR3 영역은 서열번호 145에 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 그리고
    Vb CDR1 영역은 서열번호 146에 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, Vb CDR2 영역은 서열번호 147에 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, Vb CDR3 영역은 서열번호 148에 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, T 세포 수용체(TCR) 또는 이의 항원-결합 단편.
  10. 다음을 포함하는 T 세포 수용체(TCR) 또는 이의 항원 결합 단편:
    가변 알파(Va) 영역을 포함하는 알파 사슬, 여기서 Va 영역은 상보성 결정 영역 1(CDR-1), 상보성 결정 영역 2(CDR-2), 및 상보성 결정 영역 3(CDR-3)을 포함하고, 여기서 Va CDR1 영역은 서열번호 143에 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, Va CDR2 영역은 서열번호 144에 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, Va CDR3 영역은 서열번호 145에 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 그리고
    가변 베타(Vb) 영역을 포함하는 베타 사슬, 여기서 Vb 영역은 상보성 결정 영역 1(CDR-1), 상보성 결정 영역 2(CDR-2), 및 상보성 결정 영역 3(CDR-3)을 포함하고, 여기서 Vb CDR1 영역은 서열번호 146에 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, Vb CDR2 영역은 서열번호 147에 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, Vb CDR3 영역은 서열번호 148에 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, T 세포 수용체(TCR) 또는 이의 항원 결합 단편.
  11. 제1항 및 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TCR 또는 이의 항원 결합 단편은 주조직 적합성 복합체(MHC) 분자에 의해 제시되는 LMP2의 펩티드 에피토프 CLGGLLTMV(서열번호 167) 및/또는 SLGGLLTMV(서열번호 168)에 결합하거나 이를 인식하는, T 세포 수용체(TCR) 또는 이의 항원 결합 단편.
  12. 제11항에 있어서, MHC 분자는 HLA-A2 분자인, TCR 또는 이의 항원 결합 단편.
  13. T 세포 수용체(TCR) 또는 이의 항원 결합 단편으로서, 다음을 포함하며:
    가변 알파(Va) 영역을 포함하는 알파 사슬, 여기서 Va 영역은 상보성 결정 영역 1(CDR-1), 상보성 결정 영역 2(CDR-2), 및 상보성 결정 영역 3(CDR-3)을 포함하고, 여기서 Va CDR1 영역은 선택된 Va CDR1 아미노산 서열에 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, Va CDR2 영역은 선택된 Va CDR2 아미노산 서열에 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, Va CDR3 영역은 선택된 Va CDR3 아미노산 서열에 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 그리고
    가변 베타(Vb) 영역을 포함하는 베타 사슬, 여기서 Vb 영역은 상보성 결정 영역 1(CDR-1), 상보성 결정 영역 2(CDR-2), 및 상보성 결정 영역 3(CDR-3)을 포함하고, 여기서 Vb CDR1 영역은 선택된 Vb CDR1 아미노산 서열에 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, Vb CDR2 영역은 선택된 Vb CDR2 아미노산 서열에 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, Vb CDR3 영역은 선택된 Vb CDR3 아미노산 서열에 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하고;
    여기서 선택된 Va CDR 1, 2 및 3 및 Vb CDR 1, 2 및 3 아미노산 서열은 다음 중 하나인, T 세포 수용체(TCR) 또는 이의 항원-결합 단편:
    (1) 선택된 Va CDR 1, 2, 3 아미노산 서열은 각각 서열번호 91, 92 및 93에 제시되고, 선택된 Vb CDR 1, 2, 3 아미노산 서열은 각각 서열번호 94, 95 및 96에 제시되고;
    (2) 선택된 Va CDR 1, 2, 3 아미노산 서열은 각각 서열번호 97, 98 및 99에 제시되고, 선택된 Vb CDR 1, 2, 3 아미노산 서열은 각각 서열번호 100, 101 및 102에 제시되고;
    (3) 선택된 Va CDR 1, 2, 3 아미노산 서열은 각각 서열번호 103, 104 및 105에 제시되고, 선택된 Vb CDR 1, 2, 3 아미노산 서열은 각각 서열번호 106, 107 및 108에 제시되고;
    (4) 선택된 Va CDR 1, 2, 3 아미노산 서열은 각각 서열번호 149, 150 및 151에 제시되고, 선택된 Vb CDR 1, 2, 3 아미노산 서열은 각각 서열번호 152, 153 및 154에 제시되고; 그리고
    (5) 선택된 Va CDR 1, 2, 3 아미노산 서열은 각각 서열번호 155, 156 및 157에 제시되고, 선택된 Vb CDR 1, 2, 3 아미노산 서열은 각각 서열번호 158, 159 및 160에 제시됨.
  14. 제13항에 있어서, Va 영역은 인간 TRAV 유전자 분절 및 인간 TRAJ 유전자 분절을 재배열한 서열에 의해 인코딩되고, Vb 영역은 인간 TRBV 유전자 분절, 선택적으로 인간 TRBD 유전자 분절, 및 인간 TRBJ 유전자 분절을 재배열한 서열에 의해 인코딩되며, 여기서
    TRAV 유전자 분절은 TRAV4, TRAV25, TRAV22 또는 TRAV6이고;
    TRAJ 유전자 분절은 TRAJ23, TRAJ47, TRAJ29, TRAJ43 또는 TRAJ11이고;
    TRBV 유전자 분절은 TRBV12-4, TRBV12-3, TRBV11-2, TRBV4-1 또는 TRBV11-2이고;
    TRBD 유전자 분절은 TRBD2이고; 그리고
    TRBJ 유전자 분절은 TRBJ1-1, TRBJ2-1, TRBJ2-5 또는 TRBJ2-7인, T 세포 수용체(TCR) 또는 이의 항원-결합 단편.
  15. 제13항 또는 제14항에 있어서, TCR 또는 이의 항원 결합 단편은 주조직 적합성 복합체(MHC) 분자에 의해 제시되는 LMP2의 펩티드 에피토프(SSCSSCPLSK)(서열번호 140)에 결합하거나 이를 인식하는, TCR 또는 이의 항원 결합 단편.
  16. 제15항에 있어서, MHC 분자는 HLA-A11 분자인, TCR 또는 이의 항원 결합 단편.
  17. T 세포 수용체(TCR) 또는 이의 항원 결합 단편으로서, 다음을 포함하며:
    가변 알파(Va) 영역을 포함하는 알파 사슬, 여기서 Va 영역은 상보성 결정 영역 1(CDR-1), 상보성 결정 영역 2(CDR-2), 및 상보성 결정 영역 3(CDR-3)을 포함하고, 여기서 Va CDR1 영역은 선택된 Va CDR1 아미노산 서열에 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, Va CDR2 영역은 선택된 Va CDR2 아미노산 서열에 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, Va CDR3 영역은 선택된 Va CDR3 아미노산 서열에 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 그리고
    가변 베타(Vb) 영역을 포함하는 베타 사슬, 여기서 Vb 영역은 상보성 결정 영역 1(CDR-1), 상보성 결정 영역 2(CDR-2), 및 상보성 결정 영역 3(CDR-3)을 포함하고, 여기서 Vb CDR1 영역은 선택된 Vb CDR1 아미노산 서열에 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, Vb CDR2 영역은 선택된 Vb CDR2 아미노산 서열에 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, Vb CDR3 영역은 선택된 Vb CDR3 아미노산 서열에 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하고;
    여기서 선택된 Va CDR 1, 2 및 3 및 Vb CDR 1, 2 및 3 아미노산 서열은 다음 중 하나인, T 세포 수용체(TCR) 또는 이의 항원-결합 단편:
    (1) 선택된 Va CDR 1, 2, 3 아미노산 서열은 각각 서열번호 109, 110 및 111에 제시되고, 선택된 Vb CDR 1, 2, 3 아미노산 서열은 각각 서열번호 112, 113 및 114에 제시되거나; 또는
    (2) 선택된 Va CDR 1, 2, 3 아미노산 서열은 각각 서열번호 115, 116 및 117에 제시되고, 선택된 Vb CDR 1, 2, 3 아미노산 서열은 각각 서열번호 118, 119 및 120에 제시됨.
  18. 제17항에 있어서, Va 영역은 인간 TRAV 유전자 분절 및 인간 TRAJ 유전자 분절을 재배열한 서열에 의해 인코딩되고, Vb 영역은 인간 TRBV 유전자 분절, 선택적으로 인간 TRBD 유전자 분절, 및 인간 TRBJ 유전자 분절을 재배열한 서열에 의해 인코딩되며, 여기서
    TRAV 유전자 분절은 TRAV12-1이고;
    TRAJ 유전자 분절은 TRAJ21이고;
    TRBV 유전자 분절은 TRBV20-1이고;
    TRBD 유전자 분절은 TRBD1이고; 그리고
    TRBJ 유전자 분절은 TRBJ2-5 또는 TRBJ2-3인, T 세포 수용체(TCR) 또는 이의 항원-결합 단편.
  19. 제17항 또는 제18항에 있어서, TCR 또는 이의 항원 결합 단편은 주조직 적합성 복합체(MHC) 분자에 의해 제시되는 LMP2의 펩티드 에피토프(IYVLVMLVL)(서열번호 141)에 결합하거나 이를 인식하는, TCR 또는 이의 항원 결합 단편.
  20. T 세포 수용체(TCR) 또는 이의 항원 결합 단편으로서, 다음을 포함하며:
    가변 알파(Va) 영역을 포함하는 알파 사슬, 여기서 Va 영역은 상보성 결정 영역 1(CDR-1), 상보성 결정 영역 2(CDR-2), 및 상보성 결정 영역 3(CDR-3)을 포함하고, 여기서 Va CDR1 영역은 선택된 Va CDR1 아미노산 서열에 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, Va CDR2 영역은 선택된 Va CDR2 아미노산 서열에 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, Va CDR3 영역은 선택된 Va CDR3 아미노산 서열에 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 그리고
    가변 베타(Vb) 영역을 포함하는 베타 사슬, 여기서 Vb 영역은 상보성 결정 영역 1(CDR-1), 상보성 결정 영역 2(CDR-2), 및 상보성 결정 영역 3(CDR-3)을 포함하고, 여기서 Vb CDR1 영역은 선택된 Vb CDR1 아미노산 서열에 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, Vb CDR2 영역은 선택된 Vb CDR2 아미노산 서열에 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, Vb CDR3 영역은 선택된 Vb CDR3 아미노산 서열에 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하고;
    여기서 선택된 Va CDR 1, 2 및 3 및 Vb CDR 1, 2 및 3 아미노산 서열은 다음 중 하나인, T 세포 수용체(TCR) 또는 이의 항원-결합 단편:
    (1) 선택된 Va CDR 1, 2, 3 아미노산 서열은 각각 서열번호 121, 122 및 123에 제시되고, 선택된 Vb CDR 1, 2, 3 아미노산 서열은 각각 서열번호 124, 125 및 126에 제시되거나;
    (2) 선택된 Va CDR 2, 1, 3 아미노산 서열은 각각 서열번호 127, 128 및 129에 제시되고, 선택된 Vb CDR 1, 2, 3 아미노산 서열은 각각 서열번호 130, 131 및 132에 제시되거나;
    (3) 선택된 Va CDR 1, 2, 3 아미노산 서열은 각각 서열번호 133, 134 및 135에 제시되고, 선택된 Vb CDR 1, 2, 3 아미노산 서열은 각각 서열번호 136, 137 및 138에 제시되거나; 또는
    (4) 선택된 Va CDR 1, 2, 3 아미노산 서열은 각각 서열번호 161, 162 및 163에 제시되고, 선택된 Vb CDR 1, 2, 3 아미노산 서열은 각각 서열번호 164, 165 및 166에 제시됨.
  21. 제15항에 있어서, Va 영역은 TCR 알파 가변(TRAV) 유전자 분절 및 TCR 알파 결합(TRAJ) 유전자 분절을 재배열한 서열에 의해 인코딩되고, Vb 영역은 TCR 베타 가변(TRBV) 유전자 분절, 선택적으로 TCR 베타 다양성(TRBD) 유전자 분절, 및 TCR 베타 결합(TRBJ) 유전자 분절을 재배열한 서열에 의해 인코딩되고, 여기서
    TRAV 유전자 분절은 TRAV25, TRAV12-3 또는 TRAV21이고;
    TRAJ 유전자 분절은 TRAJ16, TRAJ3 또는 TRAJ35이고;
    TRBV 유전자 분절은 TRBV6-6, TRBV24-1, 또는 TRBV30이고;
    TRBD 유전자 분절은 TRBD1 또는 TRBD2이고; 그리고
    TRBJ 유전자 분절은 TRBJ1-1, TRBJ2-5, TRBJ2-3 또는 TRBJ2-7인, T 세포 수용체(TCR) 또는 이의 항원-결합 단편.
  22. 제20항 또는 제21항에 있어서, TCR 또는 이의 항원 결합 단편은 주조직 적합성 복합체(MHC) 분자에 의해 제시되는 LMP2의 펩티드 에피토프(TYGPVFMCL)(서열번호 142)에 결합하거나 이를 인식하는, TCR 또는 이의 항원 결합 단편.
  23. 제19항 또는 제22항에 있어서, MHC 분자는 HLA-A24 분자인, TCR 또는 이의 항원 결합 단편.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 알파 사슬은 마우스 알파 사슬 불변 영역을 포함하고, 베타 사슬은 마우스 베타 사슬 불변 영역을 포함하는, TCR 또는 이의 항원-결합 단편.
  25. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 알파 사슬은 인간 알파 사슬 불변 영역을 포함하고, 베타 사슬은 인간 베타 사슬 불변 영역을 포함하는, TCR 또는 이의 항원-결합 단편.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, TCR 또는 이의 항원 결합 단편은 T 세포의 표면 상에 발현될 때 표적 암 세포에 대한 세포독성 활성을 자극하는, TCR 또는 이의 항원 결합 단편.
  27. 제26항에 있어서, 표적 암 세포는 LMP2를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하거나 LMP2를 발현하는, TCR 또는 이의 항원 결합 단편.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항의 TCR 또는 이의 항원 결합 단편을 인코딩하는 핵산을 포함하는 벡터.
  29. 벡터로서, 다음을 포함하고:
    a) 인간 항-LMP2 TCR의 알파 사슬 가변 영역 및 알파 사슬 불변 영역을 포함하는 TCR 알파 사슬을 인코딩하는 제1 핵산 서열; 그리고
    b) 인간 항-LMP2 TCR의 베타 사슬 가변 영역 및 베타 사슬 불변 영역을 포함하는 TCR 베타 사슬을 인코딩하는 제2 핵산 서열,
    여기서 TCR 알파 사슬 및 TCR 베타 사슬은 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항의 TCR 또는 이의 항원-결합 단편을 형성하는, 벡터.
  30. 제29항에 있어서, 상기 제1 핵산 서열과 상기 제2 핵산 서열은 링커 서열로 연결되어 있는, 벡터.
  31. 제30항에 있어서, 링커 서열은 P2A 서열인, 벡터.
  32. 제28항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 벡터는 발현 벡터, 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 벡터인, 벡터.
  33. 제32항에 있어서, 레트로바이러스 벡터는 pMP71인, 벡터.
  34. 제28항 내지 제33항 중 어느 한 항의 벡터를 포함하는 조작된 세포.
  35. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항의 TCR 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 조작된 세포.
  36. 제34항 또는 제35항에 있어서, TCR 또는 이의 항원 결합 단편은 조작된 세포에 대해 이종인, 조작된 세포.
  37. 제34항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 조작된 세포는 세포주인, 조작된 세포.
  38. 제34항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 조작된 세포는 대상체(예를 들어, 인간 대상체)로부터 수득된 일차 세포인, 조작된 세포.
  39. 제34항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 조작된 세포는 T 세포인, 조작된 세포.
  40. 제39항에 있어서, T-세포는 인간 대상체로부터 단리된 것인, 조작된 세포.
  41. 제39항에 있어서, T 세포는 CD8+인, 조작된 세포.
  42. 제39항에 있어서, T 세포는 CD4+인, 조작된 세포.
  43. 제34항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 조작된 세포는 이중기능성 트랩 단백질을 발현하는, 조작된 세포.
  44. 제43항에 있어서, 이중기능성 트랩 단백질은 체크포인트 억제제(예를 들어, PD-1) 및 형질전환 성장 인자 베타 계열의 구성원(예를 들어, TGF-β)을 표적으로 하는, 조작된 세포.
  45. 제34항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 체크포인트 억제제(예를 들어, PD-1)를 표적으로 하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 발현하는, 조작된 세포.
  46. 제34항 내지 제42항 및 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 형질전환 성장 인자 베타 계열의 구성원(예를 들어, TGF-β)에 결합하는 단백질을 발현하는, 조작된 세포.
  47. 제28항 내지 제33항 중 어느 한 항의 벡터를 시험관내 또는 생체외에서 세포에 도입하는 것을 포함하는, 조작된 세포의 생산 방법.
  48. 제47항에 있어서, 도입 단계는 형질도입에 의해 수행되는, 방법.
  49. 제34항 내지 제46항 중 어느 한 항의 조작된 세포를 EBV와 관련된 질병 또는 장애를 갖는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 질병 또는 장애의 치료 방법.
  50. 제49항에 있어서, EBV와 관련된 질병 또는 장애는 암인, 방법.
  51. 대상체의 종양 치료 방법으로서, 이 방법은 다음을 포함하는, 방법:
    종양 내 항원에 특이적으로 결합하는 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항의 TCR 또는 이의 항원 결합 단편을 인코딩하는 핵산을 포함하는 조작된 T 세포를 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것.
  52. 대상체의 종양 치료 방법으로서, 치료를 필요로 하는 대상체에게 다음을 투여하는 것을 포함하는, 방법:
    (a)종양 내 항원에 특이적으로 결합하는 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항의 TCR 또는 이의 항원 결합 단편을 인코딩하는 핵산을 포함하는 조작된 T 세포; 및
    (b) 전환 성장 인자 베타 계열의 구성원(예를 들어, TGF-β)에 결합하는 단백질 및 체크포인트 억제제 중 하나 또는 둘 모두.
  53. 대상체의 종양 치료 방법으로서, 치료를 필요로 하는 대상체에게 다음을 투여하는 것을 포함하는, 방법:
    다음을 인코딩하는 핵산을 포함하는 조작된 T 세포:
    (a) 종양에서 항원에 특이적으로 결합하는 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항의 TCR 또는 이의 항원 결합 단편; 그리고
    (b) 전환 성장 인자 베타 계열의 구성원(예를 들어, TGF-β) 및 체크포인트 억제제를 표적으로 하는 이중기능성 트랩 단백질.
  54. 제51항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 종양은 EBV-관련 종양인, 방법.
  55. 제50항 또는 제54항에 있어서, 암 또는 EBV-관련 종양은 버킷 림프종, 면역억제성 림프종, 미만성 거대 B 세포 림프종, 만성 염증과 관련된 미만성 거대 B 세포 림프종, 림프종양 육아종증, 형질모세포성 림프종, 원발성 삼출 림프종, 이식 후 림프증식성 장애, 비인두 암종, 위 선암종, 림프상피종 관련 암종, 면역결핍 관련 평활근육종 또는 호지킨 림프종인, 방법.
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