CN116669751A - 靶向爱泼斯坦-巴尔病毒的tcr-t细胞疗法 - Google Patents

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Abstract

提供识别或结合爱泼斯坦‑巴尔病毒(EBV)抗原的T细胞受体、基因工程化细胞和基于细胞的疗法。

Description

靶向爱泼斯坦-巴尔病毒的TCR-T细胞疗法
技术领域
本公开大体上涉及工程化细胞和其组合物，特别是包含基因工程化T细胞受体(TCR)的T细胞。本文还公开了使用所述组合物治疗癌症的方法。
背景技术
爱泼斯坦巴尔病毒(Epstein-Barr virus；EBV)是可感染人类的疱疹病毒家族的成员。EBV最常通过体液、主要是唾液传播。EBV可引起传染性单核细胞增多症(mononucleosis)，也称为mono，以及包括癌症的其它疾病。EBV已进化出模仿抗原激活的B细胞的天然分化途径的生命周期，使病毒能够进入其潜伏感染的部位。在增殖感染的B细胞中，爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)执行基因表达程序，即“生长”或“潜伏期III”程序。这种类型的潜伏期发现于体外EBV诱导的类淋巴母细胞细胞系(LCL)、移植后淋巴增殖性疾病(BrinkAA,1997,J Clin Pathol 50:911–918.)以及原发性和持续性EBV感染期间淋巴器官中的EBV感染的B细胞中，其中这个程序被认为通过受感染的细胞的增殖导致EBV载量的扩增(Young LS,2004,Nat Rev Cancer 4:757–768；Hochberg D,2004,Proc Natl Acad Sci US A101:239–244)。称为潜伏膜蛋白(LMP1、LMP2A、LMP2B)和爱泼斯坦-巴尔核抗原(EBNA1、-2、-3A、-3B、-3C、-LP)的几种免疫原性EBV抗原在潜伏期III EBV感染的B细胞中表达。
EBV感染与某些类型的癌症相关。已在患有鼻咽癌(Mutirangura等人,ClinCancer Res.4:665-9(1998)；Lo等人,Cancer Res.59:1188-91(1999))、淋巴瘤(Lei等人,Br J Haematol.111:239-46(2000)；Gallagher等人,Int J Cancer.84:442-8(1999)；Dronet等人,J Med Viral.57:383-9(1999))、乳腺癌(Bonnet,M.等人,J.Natl.CancerInst.,91:1376-1381(1999))和肝细胞癌(Sugawara,Y.等人,Virology,256:196-202(1999))的患者中发现EBV DNA。
作为针对癌症的免疫疗法的模式的过继细胞转移(ACT)已在治疗血液系统恶性肿瘤和恶性黑色素瘤方面显示出显著的成功。使用表达嵌合抗原受体(CAR)的基因修饰的T细胞以特异性靶向肿瘤相关抗原(TAA)如CD19或GD2的一种ACT形式已在用于治疗例如B细胞恶性肿瘤等疾病的临床试验中显示出令人鼓舞的结果。尽管CAR T细胞疗法在患有血液系统恶性肿瘤的患者中的这种已记录的成功，但针对实体瘤仅观察到适度的反应。因此，需要靶向EBV诱导的癌症的有效TCR-T细胞疗法。
发明内容
本公开提供一种工程化T细胞，其包含编码抗LMP2 TCR的核酸，其中所述抗LMP2TCR是与肿瘤中LMP2特异性结合的基因工程化T细胞受体(TCR)。
在一方面，本文提供一种T细胞受体(TCR)或其抗原结合片段，其包含含有可变α(Va)区和的α链和含有可变β(Vb)区的β链。在一些实施方案中，Va区包含互补决定区1(CDR1)、互补决定区2(CDR2)和互补决定区3(CDR3)。在一些实施方案中，Va区的CDR3包含氨基酸序列X1GX2SGYSTL，其中X1是E、T、Q、V或N；X2是D、G、N或E。在一些实施方案中，Vb区包含CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，Vb区的CDR3包含氨基酸序列X3X4QGGX5X6X7X8，其中X3是S、T、N或R；X4是T、R、Y、G、V、Q、F、S或P；X5是N、G、H、T、S、A、I或W；X6是Y、N、D、E、R或I，；X7是G、Q、N、Y；X8是Y、F、或G。
在一些实施方案中，Va区由来自人TRAV基因区段和人TRAJ基因区段的重排的序列编码，和Vb区由来自人TRBV基因区段、任选地人TRBD基因区段和人TRBJ基因区段的重排的序列编码。在一些实施方案中，TRAV基因区段是TRAV17；TRAJ基因区段是TRAJ11；TRBV基因区段是TRBV6-5；TRBD基因区段是TRBD1或TRBD2；和TRBJ基因区段是TRBJ2-1或TRBJ1-2。
在一些实施方案中，Va CDR1区包含与TSINN(SEQ ID NO:1)为至少80％同一性的氨基酸序列，Va CDR2区包含与IRSNERE(SEQ ID NO:2)为至少80％同一性的氨基酸序列，VbCDR1区包含与MNHEY(SEQ ID NO:4)为至少80％同一性的氨基酸序列，和Vb CDR2区包含与SVGAGI(SEQ ID NO:5)为至少80％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，Va CDR1区包含与选择的Va CDR1氨基酸序列为至少80％同一性的氨基酸序列，Va CDR2区包含与选择的Va CDR2氨基酸序列为至少80％同一性的氨基酸序列，Va CDR3区包含与选择的Va CDR3氨基酸序列为至少80％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，Vb CDR1区包含与选择的Vb CDR1氨基酸序列为至少80％同一性的氨基酸序列，Vb CDR2区包含与选择的Vb CDR2氨基酸序列为至少80％同一性的氨基酸序列，Vb CDR3区包含与选择的Vb CDR3氨基酸序列为至少80％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，选择的Va CDR 1、2和3以及Vb CDR 1、2和3氨基酸序列是以下中的一种：
(1)选择的Va CDR 1、2和3氨基酸序列分别记载于SEQ ID NOs:1-3，和选择的VbCDR 1、2和3氨基酸序列分别记载于SEQ ID NOs:4-6；
(2)选择的Va CDR 1、2和3氨基酸序列分别记载于SEQ ID NOs:7-9，和选择的VbCDR 1、2和3氨基酸序列分别记载于SEQ ID NOs:10-12；
(3)选择的Va CDR 1、2和3氨基酸序列分别记载于SEQ ID NOs:13-15，和选择的VbCDR 1、2和3氨基酸序列分别记载于SEQ ID NOs:16-18；
(4)选择的Va CDR 1、2和3氨基酸序列分别记载于SEQ ID NOs:19-21，和选择的VbCDR 1、2和3氨基酸序列分别记载于SEQ ID NOs:22-24；
(5)选择的Va CDR 1、2和3氨基酸序列分别记载于SEQ ID NOs:25-27，和选择的VbCDR 1、2和3氨基酸序列分别记载于SEQ ID NOs:28-30；
(6)选择的Va CDR 1、2和3氨基酸序列分别记载于SEQ ID NOs:31-33，和选择的VbCDR 1、2和3氨基酸序列分别记载于SEQ ID NOs:34-36；
(7)选择的Va CDR 1、2和3氨基酸序列分别记载于SEQ ID NOs:37-39，和选择的VbCDR 1、2和3氨基酸序列分别记载于SEQ ID NOs:40-42；
(8)选择的Va CDR 1、2和3氨基酸序列分别记载于SEQ ID NOs:43-45，和选择的VbCDR 1、2和3氨基酸序列分别记载于SEQ ID NOs:46-48；
(9)选择的Va CDR 1、2和3氨基酸序列分别记载于SEQ ID NOs:49-51，和选择的VbCDR 1、2和3氨基酸序列分别记载于SEQ ID NOs:52-54；
(10)选择的Va CDR 1、2和3氨基酸序列分别记载于SEQ ID NOs:61-63，和选择的Vb CDR 1、2和3氨基酸序列分别记载于SEQ ID NOs:64-66；
(11)选择的Va CDR 1、2和3氨基酸序列分别记载于SEQ ID NOs:67-69，和选择的Vb CDR 1、2和3氨基酸序列分别记载于SEQ ID NOs:70-72；
(12)选择的Va CDR 1、2和3氨基酸序列分别记载于SEQ ID NOs:73-75，和选择的Vb CDR 1、2和3氨基酸序列分别记载于SEQ ID NOs:76-78；
(13)选择的Va CDR 1、2和3氨基酸序列分别记载于SEQ ID NOs:79-81，和选择的Vb CDR 1、2和3氨基酸序列分别记载于SEQ ID NOs:82-84；或
(14)选择的Va CDR 1、2和3氨基酸序列分别记载于SEQ ID NOs:85-87，和选择的Vb CDR 1、2和3氨基酸序列分别记载于SEQ ID NOs:88-90。
在一方面，本文提供一种T细胞受体(TCR)或其抗原结合片段，其包含含有可变α(Va)区的α链。在一些实施方案中，Va区包含互补决定区1(CDR-1)、互补决定区2(CDR-2)和互补决定区3(CDR-3)。在一些实施方案中，Va CDR1区包含与SEQ ID NO:55为至少80％同一性的氨基酸序列，Va CDR2区包含与SEQ ID NO:56为至少80％同一性的氨基酸序列，VaCDR3区包含与SEQ ID NO:57为至少80％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文提供T细胞受体(TCR)或其抗原结合片段，其还包含含有可变β(Vb)区的β链。在一些实施方案中，Vb区包含互补决定区1(CDR-1)、互补决定区2(CDR-2)和互补决定区3(CDR-3)。在一些实施方案中，Vb CDR1区包含与SEQ ID NO:58为至少80％同一性的氨基酸序列，Vb CDR2区包含与SEQ ID NO:59为至少80％同一性的氨基酸序列，Vb CDR3区包含与SEQ ID NO:60为至少80％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，TCR或其抗原结合片段结合或识别由主要组织相容性复合体(MHC)分子呈递的LMP2(FLYALALLL)(SEQ ID NO:139)的肽表位。
在一些实施方案中，MHC分子是HLA-A2分子。
在一些实施方案中，Va区由来自人TRAV基因区段和人TRAJ基因区段的重排的序列编码，和Vb区由来自人TRBV基因区段、任选地人TRBD基因区段和人TRBJ基因区段的重排的序列编码。在一些实施方案中，TRAV基因区段是TRAV21；TRAJ基因区段是TRAJ33；TRBV基因区段是TRBV10-2；TRBD基因区段是TRBD1或TRBD2；和TRBJ基因区段是TRBJ2-7。
在一些实施方案中，Va CDR1区包含与SEQ ID NO:143为至少80％同一性的氨基酸序列，Va CDR2区包含与SEQ ID NO:144为至少80％同一性的氨基酸序列，Va CDR3区包含与SEQ ID NO:145为至少80％同一性的氨基酸序列；和在一些实施方案中，Vb CDR1区包含与SEQ ID NO:146为至少80％同一性的氨基酸序列，Vb CDR2区包含与SEQ ID NO:147为至少80％同一性的氨基酸序列，Vb CDR3区包含与SEQ ID NO:148为至少80％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，TCR或其抗原结合片段结合或识别由主要组织相容性复合体(MHC)分子呈递的LMP2 CLGGLLTMV(SEQ ID NO:167)和/或SLGGLLTMV(SEQ ID NO:168)的肽表位。
在一些实施方案中，MHC分子是HLA-A2分子。
在一方面，本文提供一种T细胞受体(TCR)或其抗原结合片段，其包含含有可变α(Va)区的α链。在一些实施方案中，Va区包含互补决定区1(CDR-1)、互补决定区2(CDR-2)和互补决定区3(CDR-3)。在一些实施方案中，Va CDR1区包含与选择的Va CDR1氨基酸序列为至少80％同一性的氨基酸序列，Va CDR2区包含与选择的Va CDR2氨基酸序列为至少80％同一性的氨基酸序列，Va CDR3区包含与选择的Va CDR3氨基酸序列为至少80％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文提供TCR或其抗原结合片段，其还包含含有可变β(Vb)区的β链。在一些实施方案中，Vb区包含互补决定区1(CDR-1)、互补决定区2(CDR-2)和互补决定区3(CDR-3)。在一些实施方案中，Vb CDR1区包含与选择的Vb CDR1氨基酸序列为至少80％同一性的氨基酸序列，Vb CDR2区包含与选择的Vb CDR2氨基酸序列为至少80％同一性的氨基酸序列，Vb CDR3区包含与选择的Vb CDR3氨基酸序列为至少80％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，选择的Va CDR 1、2和3以及Vb CDR 1、2和3氨基酸序列是以下中的一种：
(1)选择的Va CDR 1、2和3氨基酸序列分别记载于SEQ ID NOs:91、92和93，和选择的Vb CDR 1、2和3氨基酸序列分别记载于SEQ ID NOs:94、95和96；
(2)选择的Va CDR 1、2和3氨基酸序列分别记载于SEQ ID NOs:97、98和99，和选择的Vb CDR 1、2和3氨基酸序列分别记载于SEQ ID NOs:100、101和102；
(3)选择的Va CDR 1、2和3氨基酸序列分别记载于SEQ ID NOs:103、104和105，和选择的Vb CDR 1、2和3氨基酸序列分别记载于SEQ ID NOs:106、107和108；和
(4)选择的Va CDR 1、2和3氨基酸序列分别记载于SEQ ID NOs:149、150和151，和选择的Vb CDR 1、2和3氨基酸序列分别记载于SEQ ID NOs:152、153和154；和
(5)选择的Va CDR 1、2和3氨基酸序列分别记载于SEQ ID NOs:155、156和157，和选择的Vb CDR 1、2和3氨基酸序列分别记载于SEQ ID NOs:158、159和160。
在一些实施方案中，Va区由来自人TRAV基因区段和人TRAJ基因区段的重排的序列编码，和Vb区由来自人TRBV基因区段、任选地人TRBD基因区段和人TRBJ基因区段的重排的序列编码。在一些实施方案中，TRAV基因区段是TRAV4、TRAV25、TRAV22或TRAV6；TRAJ基因区段是TRAJ23、TRAJ47、TRAJ29、TRAJ43或TRAJ11；TRBV基因区段是TRBV12-4、TRBV12-3、TRBV11-2、TRBV4-1或TRBV11-2；TRBD基因区段是TRBD2；和TRBJ基因区段是TRBJ1-1、TRBJ2-1、TRBJ2-5或TRBJ2-7。
在一些实施方案中，TCR或其抗原结合片段结合或识别由主要组织相容性复合体(MHC)分子呈递的LMP2(SSCSSCPLSK)(SEQ ID NO:140)的肽表位。
在一些实施方案中，MHC分子是HLA-A11分子。
在一方面，本文提供一种T细胞受体(TCR)或其抗原结合片段，其包含含有可变α(Va)区的α链。在一些实施方案中，Va区包含互补决定区1(CDR-1)、互补决定区2(CDR-2)和互补决定区3(CDR-3)。在一些实施方案中，Va CDR1区包含与选择的Va CDR1氨基酸序列为至少80％同一性的氨基酸序列，Va CDR2区包含与选择的Va CDR2氨基酸序列为至少80％同一性的氨基酸序列，Va CDR3区包含与选择的Va CDR3氨基酸序列为至少80％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文提供TCR或其抗原结合片段，其还包含含有可变β(Vb)区的β链。在一些实施方案中，Vb区包含互补决定区1(CDR-1)、互补决定区2(CDR-2)和互补决定区3(CDR-3)。在一些实施方案中，Vb CDR1区包含与选择的Vb CDR1氨基酸序列为至少80％同一性的氨基酸序列，Vb CDR2区包含与选择的Vb CDR2氨基酸序列为至少80％同一性的氨基酸序列，Vb CDR3区包含与选择的Vb CDR3氨基酸序列为至少80％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，选择的Va CDR 1、2和3以及Vb CDR 1、2和3氨基酸序列是以下中的一种：
(1)选择的Va CDR 1、2和3氨基酸序列分别记载于SEQ ID NOs:109、110和111，和选择的Vb CDR 1、2和3氨基酸序列分别记载于SEQ ID NOs:112、113和114；或
(2)选择的Va CDR 1、2和3氨基酸序列分别记载于SEQ ID NOs:115、116和117，和选择的Vb CDR 1、2和3氨基酸序列分别记载于SEQ ID NOs:118、119和120。
在一些实施方案中，Va区由来自人TRAV基因区段和人TRAJ基因区段的重排的序列编码，和Vb区由来自人TRBV基因区段、任选地人TRBD基因区段和人TRBJ基因区段的重排的序列编码。在一些实施方案中，TRAV基因区段是TRAV12-1；TRAJ基因区段是TRAJ21；TRBV基因区段是TRBV20-1；TRBD基因区段是TRBD1；和TRBJ基因区段是TRBJ2-5或TRBJ2-3。
在一些实施方案中，TCR或其抗原结合片段结合或识别由主要组织相容性复合体(MHC)分子呈递的LMP2(IYVLVMLVL)(SEQ ID NO:141)的肽表位。
在一方面，本文提供一种T细胞受体(TCR)或其抗原结合片段，其包含含有可变α(Va)区的α链。在一些实施方案中，Va区包含互补决定区1(CDR-1)、互补决定区2(CDR-2)和互补决定区3(CDR-3)。在一些实施方案中，Va CDR1区包含与选择的Va CDR1氨基酸序列为至少80％同一性的氨基酸序列，Va CDR2区包含与选择的Va CDR2氨基酸序列为至少80％同一性的氨基酸序列，Va CDR3区包含与选择的Va CDR3氨基酸序列为至少80％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文提供TCR或其抗原结合片段，其还包含含有可变β(Vb)区的β链。在一些实施方案中，Vb区包含互补决定区1(CDR-1)、互补决定区2(CDR-2)和互补决定区3(CDR-3)。在一些实施方案中，Vb CDR1区包含与选择的Vb CDR1氨基酸序列为至少80％同一性的氨基酸序列，Vb CDR2区包含与选择的Vb CDR2氨基酸序列为至少80％同一性的氨基酸序列，Vb CDR3区包含与选择的Vb CDR3氨基酸序列为至少80％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，选择的Va CDR 1、2和3以及Vb CDR 1、2和3氨基酸序列是以下中的一种：
(1)选择的Va CDR 1、2和3氨基酸序列分别记载于SEQ ID NOs:121、122和123，和选择的Vb CDR 1、2和3氨基酸序列分别记载于SEQ ID NOs:124、125和126；
(2)选择的Va CDR 1、2和3氨基酸序列分别记载于SEQ ID NOs:127、128和129，和选择的Vb CDR 1、2和3氨基酸序列分别记载于SEQ ID NOs:130、131和132；
(3)选择的Va CDR 1、2和3氨基酸序列分别记载于SEQ ID NOs:133、134和135，和选择的Vb CDR 1、2和3氨基酸序列分别记载于SEQ ID NOs:136、137和138；或
(4)选择的Va CDR 1、2和3氨基酸序列分别记载于SEQ ID NOs:161、162和163，和选择的Vb CDR 1、2和3氨基酸序列分别记载于SEQ ID NOs:164、165和166。
在一些实施方案中，Va区由来自TCRα可变(TRAV)基因区段和TCRα接合(TRAJ)基因区段的重排的序列编码，和Vb区由来自TCRβ可变(TRBV)基因区段、任选地TCRβ多样性(TRBD)基因区段和TCRβ接合(TRBJ)基因区段的重排的序列编码。在一些实施方案中，TRAV基因区段是TRAV25、TRAV12-3或TRAV21；TRAJ基因区段是TRAJ16、TRAJ3或TRAJ35；TRBV基因区段是TRBV6-6、TRBV24-1或TRBV30；TRBD基因区段是TRBD1或TRBD2；和TRBJ基因区段是TRBJ1-1、TRBJ2-5、TRBJ2-3或TRBJ2-7。
在一些实施方案中，TCR或其抗原结合片段结合或识别由主要组织相容性复合体(MHC)分子呈递的LMP2(TYGPVFMCL)(SEQ ID NO:142)的肽表位。
在一些实施方案中，MHC分子是HLA-A24分子。
在一些实施方案中，α链包含小鼠α链恒定区，和β链包含小鼠β链恒定区。
在一些实施方案中，α链包含人α链恒定区，和β链包含人β链恒定区。
在一些实施方案中，TCR或其抗原结合片段当在T细胞表面上表达时刺激针对靶癌细胞的细胞毒活性。在一些实施方案中，靶癌细胞包含编码LMP2的核酸序列或表达LMP2。
在一方面，本文提供一种载体，其包含编码如本文所描述的TCR或其抗原结合片段的核酸。
在一方面，本文提供一种载体，其包含：a)编码TCRα链的第一核酸序列，所述TCRα链包含人抗LMP2 TCR的α链可变区和α链恒定区；和b)编码TCRβ链的第二核酸序列，所述TCRβ链包含人抗LMP2 TCR的β链可变区和β链恒定区。在一些实施方案中，TCRα链和所述TCRβ链形成如本文所描述的TCR或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，第一核酸序列和所述第二核酸序列通过接头序列连接。在一些实施方案中，接头序列是P2A序列。
在一些实施方案中，载体是表达载体、病毒载体、逆转录病毒载体或慢病毒载体。在一些实施方案中，逆转录病毒载体是pMP71。
在一方面，本文提供一种工程化细胞，其包含如本文所描述的载体。
在一方面，本文提供一种工程化细胞，其包含如本文所描述的TCR或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，TCR或其抗原结合片段与所述细胞是异源的。
在一些实施方案中，工程化细胞是细胞系。
在一些实施方案中，工程化细胞是从受试者(例如，人受试者)获得的原代细胞。
在一些实施方案中，工程化细胞是T细胞。在一些实施方案中，T细胞是从人受试者分离的。在一些实施方案中，T细胞是CD8+。在一些实施方案中，T细胞是CD4+。
在一些实施方案中，工程化细胞表达双功能陷阱蛋白。在一些实施方案中，双功能陷阱蛋白靶向检查点抑制剂(例如，PD-1)和转化生长因子β家族(例如，TGF-β)的成员。
在一些实施方案中，工程化细胞表达靶向检查点抑制剂(例如，PD-1)的抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，工程化细胞表达结合转化生长因子β家族(例如，TGF-β)的成员的蛋白质。
在一方面，本文提供一种用于生产工程化细胞的方法，其包括将如本文所描述的载体体外或离体引入细胞中。在一些实施方案中，引入步骤通过转导进行。
在一方面，本文提供一种治疗疾病或病症的方法，其包括向患有与EBV相关的疾病或病症的受试者施用如本文所描述的工程化细胞。在一些实施方案中，与EBV相关的疾病或病症是癌症。
在一方面，本文提供一种治疗受试者中肿瘤的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用工程化T细胞，所述工程化T细胞包含编码与肿瘤中的抗原特异性结合的如本文所描述的TCR或其抗原结合片段的核酸。
在一方面，本文提供一种治疗受试者中肿瘤的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用(a)工程化T细胞，其包含：编码与肿瘤中的抗原特异性结合的如本文所描述的TCR或其抗原结合片段的核酸；和(b)检查点抑制剂和结合转化生长因子β家族(例如，TGF-β)的成员的蛋白质中的一者或两者。
在一方面，本文提供一种治疗受试者中肿瘤的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用工程化T细胞，所述工程化T细胞包含：编码以下的核酸：(a)与肿瘤中的抗原特异性结合的如本文所描述的TCR或其抗原结合片段；和(b)靶向检查点抑制剂和转化生长因子β家族(例如，TGF-β)的成员的双功能陷阱蛋白。
在一些实施方案中，肿瘤是EBV相关肿瘤。
在一些实施方案中，如本文所描述的癌症和EBV相关肿瘤是伯基特氏淋巴瘤、免疫抑制性淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、与慢性炎症相关的弥漫性大B细胞淋巴瘤、淋巴瘤样肉芽肿、浆母细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、移植后淋巴增殖性疾病、鼻咽癌、胃腺癌、淋巴上皮瘤相关癌、免疫缺陷相关平滑肌肉瘤或霍奇金氏淋巴瘤。
除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。本文描述了用于在本发明中使用的方法和材料，也可以使用本领域已知的其它合适的方法和材料。材料、方法和实例仅仅是说明性的，而不旨在进行限制。本文提及的全部出版物、专利申请、专利、序列、资料库条目和其它参考文献通过引用以其整体并入。在发生冲突的情况下，以本说明书(包括定义)为准。
本发明的其它特征和优点将从以下详细描述和附图以及权利要求显而易见。
附图说明
在附图中展示了示例性实施方案。旨在将本文公开的实施方案和附图视为说明性的而非限制性的。
图1是显示pMP71逆转录病毒载体构建体的示意图。P2A编码2A自切割肽；Va编码人抗LMP2 TCR的α链的可变区；Vb编码同一人抗LMP2 TCR的β链的可变区；Ca编码小鼠TCRα链的恒定区；Cb编码小鼠TCRβ链的恒定区。Ψ指示病毒的包装序列。5’LTR和3’LTR是长末端重复序列。
图2是示出HLA-A2型抗LMP2 TCR的序列的表格。CDR1α、CDR2α和CDR3α分别是TCRα链的CDR1、CDR2和CDR3。CDR1β、CDR2β和CDR3β分别是TCRβ链的CDR1、CDR2和CDR3。TRA_VJ是编码抗LMP2 TCR的α链的重排的V和J区段。TRB_VDJ是编码抗LMP2 TCR的β链的重排的V、D和J区段。靶表位示出了来自LMP2蛋白的TCR靶向表位的氨基酸位置。
图3是示出HLA-A11型抗LMP2 TCR的序列的表格。
图4是示出HLA-A24型抗LMP2 TCR的序列的表格。
图5A-5C是示出用编码重组TCR的构建体转导的Jurkat细胞中HLA-A2型抗LMP2TCR的体外表达的一组图。将CD3染色，并且使用活的CD3+淋巴细胞设门策略。将未转导的(UT)细胞用作阴性对照。
图5D是示出用编码重组TCR的构建体转导的原代人T细胞中HLA-A2型抗LMP2 TCR的体外表达的一组图。将CD3和CD8同时染色，并且使用活的CD3+淋巴细胞设门策略。将未转导的(UT)细胞用作阴性对照。
图5E是示出用编码重组TCR的构建体转导的原代人T细胞中HLA-A2型抗LMP2 TCRL208的体外表达的一组图。将CD3和CD8同时染色，并且使用活的CD3+淋巴细胞设门策略。将未转导的(UT)细胞用作阴性对照。
图6A-6C是示出抗原特异性刺激的TCR-Jurkat细胞的表面CD69表达的图。分析CD3+TCR+细胞。将未转导的(UT)细胞用作阴性对照(Ctrl)。
图6D是示出在抗原特异性刺激的TCR-T细胞中细胞内IFN-γ表达的一组图。分析CD3+CD8+细胞。将未转导的(UT)细胞用作阴性对照。
图6E是示出在抗原特异性刺激的TCR-T细胞中细胞内IFN-γ表达的图。分析CD3+CD8+细胞。将未转导的(UT)细胞用作阴性对照。抗原是来自LMP2蛋白的突变型肽(SEQ IDNO:168)。
图6F-6G示出了表达HLA-A2型抗LMP2 TCR L208的TCR-T细胞的激活曲线。使用增加浓度的同源野生型或突变型LMP2肽，测定表达L208重组TCR的TCR-T细胞的EC50。
图7A-7B是示出用编码重组TCR的构建体转导的原代T细胞中HLA-A11型抗LMP2TCR的体外表达的图。将CD3和CD8同时染色，并且使用活的CD3+淋巴细胞设门策略。将未转导的(UT)细胞用作阴性对照。
图8A-8B是示出在抗原特异性刺激的TCR-T细胞中细胞内IFN-γ表达的图。分析CD3+CD8+细胞。将未转导的(UT)细胞用作阴性对照。
图8C-8D是示出抗原特异性刺激的TCR-T细胞的表面CD69表达的图。分析CD3+CD8+细胞。将未转导的(UT)细胞用作阴性对照。
图9示出了表达HLA-A11型抗LMP2 TCR的TCR-T细胞的激活曲线。使用增加浓度的同源LMP2肽，确定表达L11-3或L11-6重组TCR的TCR-T细胞的EC50。
图10A是示出用编码重组TCR的构建体转导的原代人T细胞中HLA-A24型抗LMP2TCR的体外表达的一组图。将CD3和CD8同时染色，并且使用活的CD3+淋巴细胞设门策略。将未转导的(UT)细胞用作阴性对照。
图10B是示出用编码重组TCR的构建体转导的Jurkat细胞中HLA-A24型抗LMP2 TCR的体外表达的一组图。将CD3染色，并且使用活的CD3+淋巴细胞设门策略。使用阴性对照(Ctrl)。
图10C是示出用编码重组TCR的构建体转导的原代人T细胞中HLA-A24型抗LMP2TCR的体外表达的一组图。将CD3和CD8同时染色，并且使用活的CD3+淋巴细胞设门策略。将未转导的(UT)细胞用作阴性对照。
图11A-11C是示出在抗原特异性刺激的TCR-T细胞中细胞内IFN-γ表达的一组图。分析CD3+CD8+细胞。将未转导的(UT)细胞用作阴性对照。
图11D是显示在抗原特异性刺激的TCR-Jurkat细胞中表面CD69表达的一组图。分析CD3+TCR+细胞。使用阴性对照(Ctrl)。
图12A示出了表达HLA-A24型抗LMP2 TCR的TCR-T细胞的激活曲线。使用增加浓度的同源LMP2肽，测定表达L24-49或L24-2重组TCR的TCR-T细胞的EC50。
图12B示出了表达HLA-A24型抗LMP2 TCR的TCR-T细胞的激活曲线。使用增加浓度的同源LMP2肽，测定表达L24-3或L24-13重组TCR的TCR-T细胞的EC50。
图13示出了使用TCRdist方法的基序分析。鉴定包含30个TCR克隆的克隆簇(用矩形指示)。使用来自簇的14个测试克隆进行序列比对。突出显示TRA的CDR3和TRB的CDR3内的基序。
图14示出基于机器学习方法(支持向量机(Support Vector Machine))的基序分析。左上方表格示出了基序长度为3或4的所产生的基序及其计数的实例。在右上方。在右上方表格中，示出了输入文件的实例。对于每种阳性或阴性TCR克隆，如果其含有所述基序，则指定1的布尔值(Boolean value)，或如果其不含有所述基序，则指定0。在底部表格中，计算排名最高的基序的ROC曲线下面积(AUC)值和支持向量机(SVM)重要性得分。
图15示出了费希尔精确检验(Fisher exact test)和克拉默氏V检验(Cramer’s Vtest)结果。计算排名最高的基序的P值、通过费希尔精确检验调整的P值和通过克拉默氏V检验的克拉默重要性得分。
图16A示出了TCRβ链的CDR3内的高富集基序。
图16B示出了TCRα链的CDR3内的高富集基序。
图17A示出了TCRβ链基序“QGG”的接收者操作特征(Receiver OperatingCharacteristic；ROC)曲线。灵敏度指示通过具有基序QGG正确鉴定的实际阳性的比例。特异性指示通过不具有基序QGG正确鉴定的实际阴性的比例。
图17B示出了TCRα链基序“YST”的ROC曲线。
图17C示出了TCRα链基序“SGY”的ROC曲线。
图18提供了如本公开中所描述的序列。
具体实施方式
以下实施方案及其方面结合系统、组合物和方法进行描述和说明，所述系统、组合物和方法旨在为示例性和说明性的，而不限制范围。
定义
如本文所用，术语“包括”或“包含”参考对实施方案有用的组合物、方法和其相应(一个或多个)组分使用，但对包括非特定元素是开放的，无论是否有用。本领域的技术人员将理解，通常，本文使用的术语通常旨在为“开放”术语(例如，术语“含有”应解释为“含有但不限于”，术语“具有”应解释为“具有至少”，术语“包含”应解释为“包含但不限于”等)。
除非另有说明，否则术语“一(a/an)”和“所述”以及在描述本申请的特定实施方案的上下文中使用的类似参考(特别是在权利要求书的上下文中)可以被解释为涵盖单数和复数。本文中对值的范围的叙述仅旨在用作单独提及落入所述范围内的每个单独值的速记法。除非本文另外指示，否则每个单个值都被并入本说明书中，如同在本文中单独叙述一样。除非本文另外指示或以其它方式与上下文明显矛盾，否则本文所描述的所有方法都可以以任何合适的顺序执行。关于本文中的某些实施方案提供的任何和所有实例或示例性语言(例如，“诸如(such as)”)的使用仅旨在更好地阐明本申请，并且不对以其它方式要求保护的本申请的范围构成限制。缩写“例如(e.g.)”源自拉丁语例如(exempli gratia)，并且在本文中用于指示非限制性实例。因此，缩写“例如(e.g.)”与术语“例如(for example)”同义。说明书中的任何语言都不应被解释为指示对本申请的实践至关重要的任何未要求保护的元素。
如本文所用，术语“约”是指可测量的值，诸如量、持续时间等，并且涵盖自指定值±20％、±10％、±5％、±1％、±0.5％或±0.1％的变化。
如本文所用，术语“抗体”是指包含至少一个(例如，一个、两个、三个、四个、五个或六个)免疫球蛋白互补决定区(CDR)(例如，来自免疫球蛋白轻链的三个CDR中的任何一个或来自免疫球蛋白重链的三个CDR中的任何一个)并且能够特异性地结合表位的任何抗原结合分子。抗体的非限制性实例包括：单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、单链抗体、嵌合抗体、人抗体和人源化抗体。在一些实施方案中，抗体可以包含人抗体的Fc区。术语抗体还包括衍生物，例如双特异性抗体、单链抗体、双抗体、线性抗体和由抗体片段形成的多特异性抗体。
如本文所用，术语“抗原结合片段”是指全长抗体的一部分，其中所述抗体的所述部分能够特异性地结合抗原。在一些实施方案中，抗原结合片段包含至少一个可变结构域(例如，重链的可变结构域或轻链的可变结构域)。抗体片段的非限制性实例包括例如Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段。
如本文所用，“单链可变片段”、“单链抗体可变片段”或“scFv”抗体是指包含由接头肽连接的仅重(VH)链和轻(VH)链的可变区的抗体形式。scFv能够表达为单链多肽。scFv保留从其衍生的完整抗体的特异性。轻链和重链可变区可为任何顺序，例如VH-接头-VL或VL-接头-VH，只要保留scFv对靶抗原的特异性即可。
术语“结合蛋白”是指蛋白质结合结构域(诸如细胞因子、细胞因子受体)、抗体片段(诸如Fab、scFv、双抗体(diabody)、可变结构域衍生的结合物、VHH纳米抗体(nanobody))、替代的支架衍生的蛋白质结合结构域(诸如Fn3变体、锚蛋白重复变体、中心体蛋白(centyrin)变体、高亲和性多聚体(avimers)、亲合体(affibody))或识别特定抗原的任何蛋白质。
如本文所用，术语“抗原”是指如果由MHC分子呈递，则能够由抗体或T细胞受体(TCR)结合的分子。如本文所用，术语“抗原”还涵盖由T细胞受体识别的T细胞表位。这种识别可以引起T细胞的激活和随后的效应机制，诸如T细胞的增殖、细胞因子分泌等。
如本文所用，术语“EBV抗原”是指源自爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)的多肽分子。EBV抗原包括但不限于潜伏膜蛋白(LMP1、LMP2A和LMP2B)和爱泼斯坦-巴尔核抗原(EBNA1、-2、-3A、-3B、-3C、-LP)。
如本文所用，术语“外周血细胞亚型”是指通常在外周血中发现的细胞类型，包括但不限于嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞、T细胞、单核细胞、K细胞、粒细胞和B细胞。
如本文所用，术语“T细胞”包括CD4+T细胞和CD8+T细胞。术语T细胞还包括T辅助1型T细胞和T辅2型T细胞两者。T细胞表达识别靶细胞的表面上的特异性抗原部分的细胞表面受体。细胞表面受体可以是野生型或重组T细胞受体(TCR)、嵌合抗原受体(CAR)，或能够识别与靶细胞相关的抗原部分的任何其它表面受体。通常，TCR具有两条蛋白质链(α链和β链)，其结合某些细胞表面上由MHC蛋白呈递的特异性肽。TCR在靶细胞表面上表达的MHC分子的背景下识别肽。在一些实施方案中，TCR还可以识别在癌细胞表面上直接呈递的癌症抗原。
如本文所用，“基因修饰的细胞”、“工程化的细胞”、“基因工程化的细胞”或“修饰的细胞”是指经基因修饰的细胞。在一些实施方案中，基因工程化的细胞可以表达基因工程化的抗原受体和/或检查点抑制剂。在一些实施方案中，基因修饰的细胞包含编码基因工程化的TCR的载体和/或编码一种或更多种检查点抑制剂的载体。在一些实施方案中，基因修饰的细胞包含编码基因工程化的TCR和一种或更多种检查点抑制剂的载体。在一个实施方案中，基因修饰的细胞是T淋巴细胞(T细胞)。在一些实施方案中，基因修饰的细胞是自然杀伤(NK)细胞。
如本文所用，术语“载体”、“克隆载体”或“表达载体”是指可以通过其将多核苷酸序列(例如，外源基因)引入宿主细胞中的运载体(vehicle)。载体包括质粒、噬菌体、病毒等。最流行类型的载体是“质粒”，其是指可以将包含感兴趣的基因的额外DNA区段连接至其中的闭合环状双链DNA环。载体的另一种类型是将要运输的核酸构建体连接至病毒基因组中的病毒载体。病毒载体能够在其被引入的宿主细胞中自主复制，或者可以将其自身整合至宿主细胞的基因组中，从而与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导与其可操作地连接的基因的表达。此类载体在本文中被称为“重组表达载体”或简称为“表达载体”。可以使用一些其它形式的表达载体，诸如病毒载体(例如，复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。
如本文所用，术语“逆转录病毒载体”或“重组逆转录病毒载体”是指核酸构建体，所述核酸构建体携带并且在某些实施方案中能够指导感兴趣的核酸分子的表达。逆转录病毒以RNA形式存在于其病毒荚膜(viral capsule)中，并且当在宿主细胞中复制时形成双链DNA中间体。类似地，逆转录病毒载体以RNA和双链DNA形式两者存在，这两种形式都包括在术语“逆转录病毒载体”和“重组逆转录病毒载体”中。术语“逆转录病毒载体”和“重组逆转录病毒载体”还包括含有重组DNA片段的DNA形式和含有重组RNA片段的RNA形式。载体可以包括至少一种转录启动子/增强子、或控制基因表达的其它元件。这类载体还可以包括包装信号、长末端重复序列(LTR)或其部分，以及适合于所使用的逆转录病毒的正链和负链引物结合位点(如果这些尚未存在于逆转录病毒载体中)。任选地，载体还可以包括指导多腺苷酸化的信号、可选择标记如氨苄青霉素抗性、新霉素抗性、TK、匀霉素抗性、腐草霉素抗性组氨醇抗性、或DHFR，以及一个或更多个限制位点和翻译终止序列。举例来说，此类载体可以包括5’LTR、前导序列、tRNA结合位点、包装信号、第二链DNA合成的起点和3’LTR或其一部分。
如本文所用，“接头”(L)或“接头结构域”或“接头区域”是指长度为约1至100个氨基酸的低聚-或多肽区域，其将如本文所描述的TCR的结构域/区域中的任何连接在一起。接头可以由柔性残基如甘氨酸和丝氨酸构成，使得相邻的蛋白质结构域可以相对于彼此自由移动。当期望确保两个相邻结构域彼此不空间干扰时，可以使用较长的接头。接头可以是可切割的或不可切割的。可切割接头的实例包括2A接头(例如，T2A)、2A样接头或其功能等同物以及其的组合。在一些实施方案中，接头包括小核糖核酸病毒2A样接头；猪捷申病毒(P2A)、明脉扁刺蛾病毒(Thosea asigna virus)(T2A)的CHYSEL序列或其的组合、变体和功能等同物。在其它实施方案中，接头序列可以包含Asp-Val/Ile-Glu-X-Asn-Pro-Gly(2A)–Pro(2B)基序，其引起2A甘氨酸与2B脯氨酸之间的切割。
“药学上可接受的载体”是指药物制剂中除活性成分以外的对受试者无毒的成分。药学上可接受的载体包括但不限于缓冲液、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
如本文所用，“受试者”是哺乳动物，诸如人或其它动物，并且通常为人。在一些实施方案中，向其施用细胞、细胞群体或组合物的受试者如患者是哺乳动物，通常是灵长类动物，诸如人。在一些实施方案中，灵长类动物是猴或猿。受试者可以是男性或女性，并且可以是任何合适的年龄，包括婴儿、少年、青少年、成年和老年受试者。在一些实施方案中，受试者是非灵长类哺乳动物，诸如啮齿动物或小鼠。
术语“对照”是指适于提供与测试样品的比较的任何参照标准品。
如本文所用，术语“抑制”是指例如特定动作、功能或相互作用的任何减少。例如，如果生物功能，诸如蛋白质的功能和/或一种蛋白质与另一种蛋白质的结合，与参照状态，诸如对照如野生型状态或没有施用药剂的状态，相比降低，那么所述生物功能被抑制。例如，与PD-1蛋白未与药剂接触时相比，如果结合、信号传导和其它免疫效应由于与药剂如抗PD-1抗体接触而降低，那么PD-1蛋白与其一种或更多种配体如PD-L1和/或PD-L2的结合和/或由此产生的PD-1信号传导和免疫效应被抑制或缺乏。这类抑制或缺乏可以诸如通过在特定时间和/或位置处施加药剂来诱导，或者可以是组成性的，诸如通过连续施用。此类抑制或缺乏也可以是部分或完全的(例如，与参照状态、诸如对照如野生型状态相比，基本上没有可测量的活性)。基本上完全的抑制或缺乏被称为阻断。
如本文所用，“病况”和“疾病病况”可以包括癌症、肿瘤或传染性疾病。在示例性实施方案中，病况包括但不限于任何形式的恶性肿瘤细胞增殖性病症或疾病。在示例性实施方案中，病况包括肾癌、黑色素瘤、前列腺癌、乳腺癌、成胶质细胞瘤、肺癌、结肠癌或膀胱癌中的任何一种或更多种。
“癌症”和“癌性”是指或描述通常表征为未调节的细胞生长的哺乳动物中的生理病况。术语“癌症”旨在包括所有类型的癌性生长或致癌过程、转移性组织或恶性转化的细胞、组织或器官，无论组织病理类型或浸润阶段。实体瘤的实例包括各种器官系统的恶性肿瘤、例如肉瘤、腺癌和癌，诸如影响肝、肺、乳腺、淋巴、胃肠道(例如，结肠)、泌尿生殖道(例如，肾、尿道上皮细胞)、前列腺和咽的那些。腺癌包括恶性肿瘤，诸如大多数结肠癌、直肠癌、肾细胞癌、肝癌、肺的非小细胞癌、小肠癌和食管癌。在一个实施方案中，癌症是黑色素瘤，例如晚期黑色素瘤。也可使用如本文所描述的方法和组合物治疗或预防上述癌症的转移病灶(metastatic lesion)。可以被治疗的其它癌症的实例包括骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈癌、皮肤或眼内恶性黑色素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛区癌、胃癌、睾丸癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病(Hodgkin Disease)、非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma)、食管癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、慢性或急性白血病包括急性髓性白血病、慢性髓性白血病、急性淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、儿童实体瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)的赘生物、原发性CNS淋巴瘤、肿瘤血管生成、脊柱轴肿瘤(spinal axis tumor)、脑干神经胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西氏肉瘤(Kaposi’s sarcoma)、表皮样癌、鳞状细胞癌、T细胞淋巴瘤、环境诱导的癌症包括由石棉诱导的那些，以及所述癌症的组合。例如表达PD-L1的转移性癌症等转移性癌症的治疗(Iwai等人(2005)Int.Immunol.17:133-144)可以使用本文所描述的抗体分子来实现。
如本文所用，术语“治疗(treat/treatment/treating)”或“改善”是指治疗性治疗，其中目的是逆转、减轻、改善、抑制、减慢或停止与疾病或病症相关的病况的进展或严重程度。术语“治疗”包括减少或减轻病况、疾病或病症、诸如癌症的至少一个不良作用或症状。如果一种或更多种症状或临床标志物减少，那么治疗通常是“有效的”。可选地，如果疾病的进展减少或停止，那么治疗是“有效的”。即，“治疗”不仅包括症状或标志物的改善，而且还包括停止至少在没有治疗的情况下预期的进展减慢或症状恶化。有益或期望的临床结果包括但不限于一种或更多种症状的减轻、疾病程度的减小、疾病的稳定(即，不恶化)状态、疾病进展的延迟或减慢、疾病状态的改善或缓和，以及缓解(无论是部分或全部的)，无论是可检测的还是不可检测的。术语疾病的“治疗”还包括提供对疾病的症状或副作用的缓解(包括姑息治疗)。在一些实施方案中，癌症的治疗包括减小肿瘤体积、减少癌细胞数、抑制癌症转移、增加预期寿命、减少癌症细胞增殖、降低癌细胞存活或改善与癌症病况相关的各种生理症状。
如本文所用，“延迟疾病的发展”是指推迟、阻碍、减慢、延缓、稳定、抑制和/或延期疾病(诸如癌症)的发展。取决于病史和/或所治疗的个体，所述延迟可以具有不同的时间长度。对于本领域技术人员显而易见的是，足够或显著的延迟实际上可以涵盖预防，因为个体不会发展疾病。例如，晚期癌症，诸如转移的发展，可被延迟。
如本文所用，“预防”包括针对受试者中疾病的发生或复发提供预防，所述受试者可能易患疾病但尚未被诊断患有疾病。在一些实施方案中，所提供的细胞和组合物用于延迟疾病的发展或减慢疾病的进展。
如本文所用，“抑制”功能或活性是指与感兴趣的病况或参数以外的其它相同病况相比时，或替代地与另一病况相比时，减少功能或活性。例如，与在不存在细胞的情况下的肿瘤的生长速率相比，抑制肿瘤生长的细胞降低了肿瘤的生长速率。
在施用的背景下，药剂如药物制剂、细胞或组合物的“有效量”是指在必要的剂量/量和时间段内有效实现所需结果如治疗或预防结果的量。
药剂如药物制剂或细胞的“治疗有效量”是指在必要的剂量和时间段内有效实现所需治疗结果，诸如用于治疗疾病、病况或和病症、和/或治疗的药代动力学或药效学效应的量。治疗有效量可以根据诸如受试者的疾病状态、年龄、性别和体重以及施用的细胞群体等因素而变化。在一些实施方案中，所提供的方法涉及以有效量，例如治疗有效量施用细胞和/或组合物。
“预防有效量”是指在必要的剂量和时间段内有效实现所需预防结果的量。通常但不一定，由于预防剂量在疾病之前或疾病早期阶段在受试者中使用，预防有效量将小于治疗有效量。在较低肿瘤负荷的背景下，在某些方面，预防有效量将高于治疗有效量。
根据本文所描述的各种实施方案，本公开提供了工程化细胞和含有工程化细胞的组合物/制剂。本公开还提供了用于制造工程化细胞的方法或过程，所述工程化细胞可用于治疗患有病理性疾病或病况的受试者。
此外，根据本文所描述的各种实施方案，本公开提供了一种包含适合于对细胞进行基因修饰的核酸构建体的重组载体，其可以用于治疗病理性疾病或病况。
此外，根据本文所描述的各种实施方案，本公开提供了一种包含适合于对细胞进行基因修饰的核酸构建体的工程化细胞，其可用于治疗病理疾病或病况，其中所述核酸编码：(a)与抗原特异性结合的基因工程化的抗原受体；和(b)降低或能够实现降低肿瘤靶的表达的抑制蛋白。在各种实施方案中，细胞表达基因工程化的抗原受体和抑制蛋白。在各种实施方案中，抑制蛋白是组成型表达的。
用于用所提供的细胞、组合物、方法和用途治疗的疾病、病况和病症是肿瘤，包括实体瘤、血液系统恶性肿瘤和黑色素瘤，以及传染性疾病，诸如病毒感染或其它病原体感染，例如HPV、HIV、HCV、HBV、EBV、HTLV-1、CMV、腺病毒、BK多瘤病毒、HHV-8、MCV或其它病原体，以及寄生虫病。在一些实施方案中，疾病或病况是肿瘤、癌症、恶性肿瘤、赘生物或其它增殖性疾病或病症。这类疾病包括但不限于白血病、淋巴瘤，例如慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin’s lymphoma)、急性髓性白血病、多发性骨髓瘤、难治性滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、惰性B细胞淋巴瘤、B细胞恶性肿瘤、子宫颈癌、结肠癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、皮肤癌、黑色素瘤、骨癌、和脑癌、卵巢癌、上皮癌、肾细胞癌、胰腺腺癌、霍奇金淋巴瘤(Hodgkin lymphoma)、宫颈癌、结直肠癌、成胶质细胞瘤、神经母细胞瘤、尤文肉瘤(Ewing sarcoma)、成神经管细胞瘤、骨肉瘤、滑膜肉瘤和/或间皮瘤。
T细胞受体和结合分子
T细胞是通常在胸腺中发育并在免疫反应中发挥核心作用的一种类型的淋巴细胞。其在“适应性免疫应答”中起重要作用。通过在细胞表面上T细胞受体的存在，可以将T细胞与其它淋巴细胞区分开。分化的T细胞在控制免疫应答中具有重要作用。CD8+T细胞，也称为“杀伤细胞”，为细胞毒素的。一旦它们识别出靶细胞，它们能够直接杀死靶细胞(例如，病毒感染的细胞或癌细胞)。CD8+T细胞还可以产生细胞因子并募集其它细胞(例如，巨噬细胞和自然杀伤(NK)细胞)以活化(mount)免疫应答。CD4+T细胞，也称为“辅助细胞”，可以例如通过促进B细胞成熟为浆细胞和记忆B细胞、以及激活细胞毒性T细胞和巨噬细胞而间接地杀死靶细胞。当辅助性T细胞被MHC II类分子与肽抗原一起呈递时，其变成激活的，所述MHCII类分子在抗原呈递细胞(APC)的表面上表达。一旦激活，它们便迅速分裂并分泌调节或协助免疫应答的细胞因子。调节性T细胞对于耐受性很重要，从而阻止或抑制自身免疫应答。调节性T细胞的主要作用是在免疫应答结束时关闭T细胞介导的免疫，并抑制逃逸胸腺中的负选择过程的自身反应性T细胞。
T细胞在癌症免疫方面起重要作用，其中来自癌细胞的抗原被吸收并在被称为抗原呈递细胞(APC)的特殊免疫细胞的细胞表面上呈递，从而使其它免疫细胞可以识别感兴趣的抗原。在淋巴结中，APC激活T细胞并激活其以识别肿瘤细胞。然后，激活的T细胞可以经由血管移动以到达肿瘤，浸润，识别癌细胞并将其杀死。
T细胞的激活需要T细胞受体。“T细胞受体”或“TCR”是一种分子，其含有可变a(或α)链和b(或β)链(也分别称为TCRα和TCRβ)或可变g(或γ)链和d(或δ)链(也分别称为TCRγ和TCRδ)、或其抗原结合部分，并且能够特异性地结合抗原，例如，与主要组织相容性复合体(MHC)分子结合的肽抗原或肽表位。
本公开提供了T细胞受体(TCR)或其抗原结合片段、以及衍生自TCR的结合分子。在一些实施方案中，TCR呈αβ形式。以αβ和γδ形式存在的TCR通常为结构上相似的，但是表达其的T细胞可能具有独特的解剖定位(anatomical location)或功能。通常，TCR发现于T细胞(或T淋巴细胞)的表面，在那里其通常负责识别抗原，诸如与主要组织相容性复合体(MHC)分子结合的肽。
在一些实施方案中，TCR是完整或全长TCR，诸如含有a链和b链的TCR。在一些实施方案中，TCR是小于全长TCR但与结合在MHC分子中的特定肽结合、诸如与MHC-肽复合体结合的抗原结合部分。在一些情况下，TCR的抗原结合部分或片段可以仅含有全长或完整TCR的结构性结构域的一部分，但仍能够结合完整TCR所结合的肽表位，诸如MHC-肽复合体。在一些情况下，抗原结合部分含有TCR的可变结构域，诸如TCR的可变a(Va或Vα)链和可变b(Vb或Vβ)链、或其足以形成用于与特定MHC-肽复合体结合的结合位点的抗原结合片段。
TCR的可变结构域包含互补决定区(CDR)，其通常是抗原识别以及肽、MHC和/或MHC-肽复合体的结合能力和特异性的主要贡献者。在一些实施方案中，TCR的CDR或其组合形成给定TCR分子的全部或基本上全部抗原结合位点。在TCR链的可变区内的各种CDR通常被框架区(FR)隔开，所述框架区与CDR相比在TCR分子之间通常显示出较小的变异性。在一些实施方案中，CDR3是负责抗原结合或特异性的主要CDR，或者是给定TCR可变区上的三个CDR中对于抗原识别和/或对于与肽-MHC复合体的加工过的肽部分相互作用而言最重要的。在一些情境下，α链的CDR1可以与某些抗原肽的N末端部分相互作用。在一些情况下，β链的CDR1可以与肽的C末端部分相互作用。在一些情境下，CDR2最有力地促进了与MHC-肽复合体的MHC部分的相互作用或对MHC-肽复合体的MHC部分的识别，或者是负责与MHC-肽复合体的MHC部分相互作用或识别MHC-肽复合体的MHC部分的主要CDR。
TCR的a链和/或b链还可以包含恒定结构域、跨膜结构域和/或短胞质尾区。在一些方面，TCR的每条链(例如α或β)可以拥有一个N末端免疫球蛋白可变结构域、一个免疫球蛋白恒定结构域、跨膜区和在C末端的短胞质尾区。在一些实施方案中，TCR例如经由胞质尾区与参与介导信号转导的CD3复合体的不变蛋白质(invariant protein)相关。在一些情况下，所述结构允许TCR与其它分子如CD3及其亚基结合。例如，包含具有跨膜区的恒定结构域的TCR可以将蛋白质锚定在细胞膜中，并与CD3信号传导装置或复合体的不变亚基结合。CD3信号传导亚基(例如CD3γ、CD3δ、CD3e和CD3z链)的细胞内尾区包含一个或更多个基于免疫受体酪氨酸的激活基序或ITAM，并且通常参与TCR复合体的信号传导能力。
结构域或区域的确切位点可以根据用于描述特定结构域的特定结构或同源性建模或其它特征而有所不同。在一些情况下，特定结构域(例如可变或恒定)可以是更长或更短的几个氨基酸(诸如一个、两个、三个或四个)。在一些方面，TCR的残基是已知的或可以根据国际免疫遗传学信息系统(International Immunogenetics Information System，IMGT)编号系统来鉴定(参见例如www.imgt.org；Lefranc等人"IMGT unique numberingfor immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains."Developmental&Comparative Immunology 27.1(2003):55-77.)。TCR的结构和变化是本领域已知的，并且描述于例如WO 2019/195486中，其通过引用以其整体并入本文。
在一些实施方案中，TCR的a链和b链各自还包含恒定结构域。在一些实施方案中，a链恒定结构域(Ca)和b链恒定结构域(Cb)单独地是哺乳动物恒定结构域，诸如是人恒定结构域或非人恒定结构域(例如，小鼠恒定结构域)。在一些实施方案中，恒定结构域与细胞膜相邻。例如，在一些情况下，由两条链形成的TCR的细胞外部分包含两个膜近端恒定结构域和两个膜远端可变结构域，所述可变结构域各自包含CDR。
在一些方面，如本文所描述的TCR可以包含人恒定区，诸如含有人Ca区的α链和含有人Cb区的β链。在一些实施方案中，TCR是完全人的。在一些实施方案中，TCR的表达和/或激活，诸如当在人细胞、例如人T细胞、诸如原代人T细胞中表达时，不受或基本上不受内源性人TCR的存在的影响。
在一些实施方案中，与在相似的人细胞但其中内源性TCR的表达已经被降低或被消除中的相同TCR的表达水平、功能活性和/或抗肿瘤活性相比，当工程化TCR被含有或表达内源性人TCR、诸如人T细胞的人细胞表达时，所述工程化TCR在细胞表面上以相似或改善的水平表达，表现出相似或更高的功能活性(例如，细胞溶解活性)和/或表现出相似或更高的抗肿瘤活性。在一些实例中，当在人T细胞中表达时，如本文所描述的工程化TCR以如下水平在细胞表面上表达：所述水平为当在相似的人T细胞但其中内源性TCR的表达已经被降低或被消除中表达时的相同TCR的表达水平的至少或至少约80％、85％、90％、95％、100％、105％、110％、115％或120％。
在一些实施方案中，Ca结构域和Cb结构域中的每一者都是人的。在一些实施方案中，Ca由TRAC基因(IMGT命名法)编码或为其变体。在一些实施方案中，Ca的变体包含至少一个非天然半胱氨酸的替代。
在一些实施方案中，TCR可以是诸如通过一个或更多个二硫键连接的两条链a和b的异二聚体。在一些实施方案中，TCR的恒定结构域可以包含短连接序列，其中半胱氨酸残基形成二硫键，从而连接TCR的两条链。在一些实施方案中，TCR可以在a链和b链的每一者中具有额外的半胱氨酸残基，使得TCR在恒定结构域中含有两个二硫键。在一些实施方案中，恒定结构域和可变结构域中的每一者都含有由半胱氨酸残基形成的二硫键。
在一些实施方案中，天然二硫键不存在。在一些实施方案中，形成天然链间二硫键的一个或多个天然半胱氨酸(例如在a链和b链的恒定结构域中)被取代为另一种残基，诸如取代为丝氨酸或丙氨酸。在一些实施方案中，可以通过将在α链和β链上、诸如在a链和b链的恒定结构域中的非半胱氨酸残基突变为半胱氨酸来形成引入的二硫键。TCR a链和b链中相对的半胱氨酸提供了一个二硫键，所述二硫键将经取代的TCR的TCR a链和b链的恒定区彼此连接并且在包含其中存在天然二硫键的未经取代的恒定区、诸如未经取代的天然人恒定区或未经取代的天然小鼠恒定区的TCR中不存在。在一些实施方案中，在重组TCR中非天然半胱氨酸残基的存在(例如导致一个或多个非天然二硫键)可能有利于在引入其的细胞中产生所需的重组TCR，而不是含有天然TCR链的错配的TCR对的表达。
在一些实施方案中，TCR包含如本文所描述的CDR、Va和/或Vb以及恒定区序列。
在一些实施方案中，TCR是二聚体TCR(dTCR)。在一些实施方案中，dTCR包含其中与所提供的TCR a链可变区序列对应的序列融合至与TCR a链恒定区细胞外序列对应的序列的N末端的第一多肽、以及其中与所提供的TCR b链可变区序列对应的序列融合至与TCR b链恒定区细胞外序列对应的序列的N末端的第二多肽，所述第一多肽和所述第二多肽通过二硫键连接。
在一些实施方案中，TCR可以是细胞结合的或呈可溶的形式。在一些实施方案中，TCR呈在细胞表面上表达的细胞结合形式。
在一些实施方案中，TCR是单链TCR(scTCR)。scTCR是含有能够与MHC-肽复合体结合的a链和b链的一条单氨基酸链。通常，可以使用本领域技术人员已知的方法来产生scTCR。这些方法描述于例如WO 96/13593、WO96/18105、W099/18129、WO 04/033685、W02006/037960、WO2011/044186；WO 2019/195486；美国专利号7,569,664；其中每一者通过引用以其整体并入本文。
TCR、其抗原结合片段和TCR衍生的结合分子可以结合或识别与感兴趣的抗原(例如，癌症抗原)相关的肽表位。在一些实施方案中，抗原可以是在癌细胞和/或感染病毒如EBV的细胞的表面上表达的肽表位。在一些实施方案中，在MHC分子的背景下呈递抗原。此类结合分子包括例如T细胞受体(TCR)及其抗原结合片段、抗体及其抗原结合片段、和TCR样CAR。它们表现出结合或识别此类肽表位的抗原特异性。在一些方面，表达所提供的结合分子如TCR或抗原结合片段的工程化细胞对表达肽表位的靶细胞如癌细胞或感染EBV的细胞表现出细胞毒活性。
在一些方面，TCR、其抗原结合片段和TCR衍生的结合分子识别或结合在MHC分子如MHC I类分子或MHC II类分子的背景下的表位。MHC I类分子或MHC II类分子两者都是人白细胞抗原(HLA)。它们扮演着适应性免疫系统的重要组分。HLA表达受位于染色体6上的基因的控制。其编码专门向T细胞上的T细胞受体呈递抗原肽的细胞表面分子。
在一些实施方案中，TCR、其抗原结合片段和TCR衍生的结合分子识别或结合在MHCI类分子的背景下的表位。MHC I类分子是人白细胞抗原(HLA)-A2分子，包括其任何一种或更多种亚型，例如HLA-A*020l、*0202、*0203、*0206或*0207。人白细胞抗原A2(HLA-A2)是最常见的人血清型之一。在一些情况下，不同群体之间亚型的频率可能不同。例如，HLA-A2阳性的白种人群体中超过95％是HLA-A*020l，然而已报道在中国人群体中，HLA-A*020l的频率为大约23％、HLA-A*0207的频率为45％，HLA-A*0206的频率为8％，并且HLA-A*0203的频率为23％。在一些实施方案中，MHC分子是HLA-A*020l。在一些实施方案中，本公开提供了结合EBV LMP2/HLA-A2复合体、EBV LMP2/HLA-A11复合体或EBV LMP2/HLA-A24复合体的TCR或其抗原结合片段。在一些实施方案中，本公开提供了与以下结合的TCR或其抗原结合片段：EBV LMP2肽FLYALALLL(SEQ ID NO:139)/HLA-A2复合体、EBV LMP2肽CLGGLLTMV(SEQ IDNO:167)/HLA-A2复合体、EBV LMP2肽SLGGLLTMV(SEQ ID NO:168)/HLA-A2复合体、EBV LMP2肽SSCSSCPLSK(SEQ ID NO:140)/HLA-A11复合体、EBV LMP2肽IYVLVMLVL(SEQ ID NO:141)/HLA-A24复合体、或EBV LMP2肽TYGPVFMCL(SEQ ID NO:142)/HLA-A24复合体。
在一些实施方案中，结合分子如TCR或其抗原结合片段或TCR衍生的结合分子是分离的或纯化的、或者是重组的。在一些方面，结合分子如TCR或其抗原结合片段或TCR衍生的结合分子是完全人的。在一些实施方案中，结合分子是单克隆的。在一些方面，结合分子是单链。在其它实施方案中，结合分子包含两条链。在一些实施方案中，结合分子如TCR、其抗原结合片段或TCR衍生的结合分子在细胞表面上表达。
TRA基因座包含V和J基因区段(TRAV和TRAJ基因区段)，并且TRB基因座包含V、D和J基因区段(TRBV、TRBD和TRBJ基因区段)。14q11.2处的人TRA基因座跨越约1000kb。其由属于41个亚组的54个TRAV基因、在71kb上定位的61个TRAJ区段和独特的TRAC基因组成。最5’TRAV基因占据最多的着丝粒位置，而基因座的3’的TRAC基因是TRA基因座中最多端粒的基因。大面积上的TRAJ区段的组织非常罕见，并且在其它免疫球蛋白或T细胞受体基因座中尚未观察到。此外，TRD基因座位于TRAV和TRAJ区段之间的TRA基因座中。因此，TRA基因座中的V-J重排导致位于同一染色体上的TRD基因的缺失。所述缺失以作为TRD基因的缺失的两个步骤发生，涉及位于TRDC上游的特定序列(序列假Jα)将在TRAV-J重排之前发生。基因组TRA库(TRA repertoire)包含属于33-35个亚组的45-47个功能性TRAV基因、50个功能性TRAJ区段和独特的TRAC基因。可变基因中包括指定为TRAV/DV的五个基因，其属于五个不同的亚组，并且已发现其重排为TRAJ或TRDD区段且因此可用于α或δ链的合成。每个单倍体基因组的人TRA基因的总数为116，其中96至98个基因是功能性的。增强子序列已表征为来自TRAC的4.5kb 3’。TRAV基因的列表示于表1中，并且TRVJ基因的列表示于表2中。
表1.人染色体14上的TRAV基因的列表
表2.人染色体14上的TRAJ基因的列表
基因名称 顺序 基因名称 顺序 基因名称 顺序 基因名称 顺序
TRAJ1 1 TRAJ21 21 TRAJ41 41 TRAJ61 61
TRAJ2 2 TRAJ22 22 TRAJ42 42
TRAJ3 3 TRAJ23 23 TRAJ43 43
TRAJ4 4 TRAJ24 24 TRAJ44 44
TRAJ5 5 TRAJ25 25 TRAJ45 45
TRAJ6 6 TRAJ26 26 TRAJ46 46
TRAJ7 7 TRAJ27 27 TRAJ47 47
TRAJ8 8 TRAJ28 28 TRAJ48 48
TRAJ9 9 TRAJ29 29 TRAJ49 49
TRAJ10 10 TRAJ30 30 TRAJ50 50
TRAJ11 11 TRAJ31 31 TRAJ51 51
TRAJ12 12 TRAJ32 32 TRAJ52 52
TRAJ13 13 TRAJ33 33 TRAJ53 53
TRAJ14 14 TRAJ34 34 TRAJ54 54
TRAJ15 15 TRAJ35 35 TRAJ55 55
TRAJ16 16 TRAJ36 36 TRAJ56 56
TRAJ17 17 TRAJ37 37 TRAJ57 57
TRAJ18 18 TRAJ38 38 TRAJ58 58
TRAJ19 19 TRAJ39 39 TRAJ59 59
TRAJ20 20 TRAJ40 40 TRAJ60 60
7q35处的人TRB基因座跨越约620kb。其由属于32个亚组的64-67个TRBV基因组成。除了位于TRBC2基因下游的TRBV30以外，在转录的相反方向中，所有其它TRBV基因都位于复制的D-J-C簇的上游，所述簇的第一部分包括一个TRBD、六个TRBJ、和TRBC1基因，第二部分包括一个TRBD、八个TRBJ基因、和TRBC2基因。最5’TRBV基因占据最多的着丝粒位置，而基因座的3’的TRBV30基因是TRB基因座中最多端粒的基因。库由属于21-23个亚组的39-46个功能性TRBV基因、两个TRBD、十三个TRBJ(6个来自第一簇且7个来自第二簇)、和两个TRBC基因组成。六个TRBV孤独基因(orphons)已经定位于染色体9上9p21处。增强子序列已表征为来自TRBC2的5.5kb 3’。TRBV、TRBD和TRBJ基因的列表分别示于表3、表4和表5中。
表3.人染色体7上TRBV基因的列表
表4.人染色体7上TRBD基因的列表
基因名称 顺序
TRBD1 1
TRBD2 2
表5.人染色体7上TRBJ基因的列表
在一些实施方案中，TCR、TCR衍生的结合分子或其抗原结合片段，包含含有可变α(Va)区的α链和含有可变β(Vb)区的β链，其中所述Va区可以具有互补决定区(CDR)1、2、3，其中所述CDR1区包含与选择的Va CDR1氨基酸序列为至少80％、85％、90％或95％同一性的氨基酸序列或由其组成，所述CDR2区包含与选择的Va CDR2氨基酸序列为至少80％、85％、90％或95％同一性的氨基酸序列或由其组成，并且所述CDR3区包含与选择的Va CDR3氨基酸序列为至少80％、85％、90％或95％同一性的氨基酸序列或由其组成，并且可变β(Vb)区包含CDR 1、2、3，其中所述CDR1区包含与选择的Vb CDR1氨基酸序列为至少80％、85％、90％或95％同一性的氨基酸序列或由其组成，所述CDR2区包含与选择的Vb CDR2氨基酸序列为至少80％、85％、90％或95％同一性的氨基酸序列或由其组成，并且所述CDR3区包含与选择的Vb CDR3氨基酸序列为至少80％、85％、90％或95％同一性的氨基酸序列或由其组成。选择的Va CDR 1、2、3氨基酸序列以及选择的Vb CDR 1、2、3氨基酸序列示于图2-4中。
在一些实施方案中，Va区包含SEQ ID NO:170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220或222中的任一个中所记载的氨基酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，Vb区包含SEQ ID NO:171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221或223中的任一个中所记载的氨基酸序列；或与其具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，Va区包含一个或更多个如本文所描述的VaCDR序列。在一些实施方案中，Vb区包含一个或更多个如本文所描述的Vb CDR序列。
在一些实施方案中，本文提供了具有与SEQ ID NO:170为至少80％、85％、90％或95％同一性的Va区和与SEQ ID NO:171为至少80％、85％、90％或95％同一性的Vb区的TCR。
在一些实施方案中，本文提供了具有与SEQ ID NO:172为至少80％、85％、90％或95％同一性的Va区；和与SEQ ID NO:173为至少80％、85％、90％或95％同一性的Vb区的TCR。
在一些实施方案中，本文提供了具有与SEQ ID NO:174为至少80％、85％、90％或95％同一性的Va区；和与SEQ ID NO:175为至少80％、85％、90％或95％同一性的Vb区的TCR。
在一些实施方案中，本文提供了具有与SEQ ID NO:176为至少80％、85％、90％或95％同一性的Va区；和与SEQ ID NO:177为至少80％、85％、90％或95％同一性的Vb区的TCR。
在一些实施方案中，本文提供了具有与SEQ ID NO:178为至少80％、85％、90％或95％同一性的Va区；和与SEQ ID NO:179为至少80％、85％、90％或95％同一性的Vb区的TCR。
在一些实施方案中，本文提供了具有与SEQ ID NO:180为至少80％、85％、90％或95％同一性的Va区；和与SEQ ID NO:181为至少80％、85％、90％或95％同一性的Vb区的TCR。
在一些实施方案中，本文提供了具有与SEQ ID NO:182为至少80％、85％、90％或95％同一性的Va区；和与SEQ ID NO:183为至少80％、85％、90％或95％同一性的Vb区的TCR。
在一些实施方案中，本文提供了具有与SEQ ID NO:184为至少80％、85％、90％或95％同一性的Va区；和与SEQ ID NO:185为至少80％、85％、90％或95％同一性的Vb区的TCR。
在一些实施方案中，本文提供了具有与SEQ ID NO:186为至少80％、85％、90％或95％同一性的Va区；和与SEQ ID NO:187为至少80％、85％、90％或95％同一性的Vb区的TCR。
在一些实施方案中，本文提供了具有与SEQ ID NO:188为至少80％、85％、90％或95％同一性的Va区；和与SEQ ID NO:189为至少80％、85％、90％或95％同一性的Vb区的TCR。
在一些实施方案中，本文提供了具有与SEQ ID NO:190为至少80％、85％、90％或95％同一性的Va区；和与SEQ ID NO:191为至少80％、85％、90％或95％同一性的Vb区的TCR。
在一些实施方案中，本文提供了具有与SEQ ID NO:192为至少80％、85％、90％或95％同一性的Va区；和与SEQ ID NO:193为至少80％、85％、90％或95％同一性的Vb区的TCR。
在一些实施方案中，本文提供了具有与SEQ ID NO:194为至少80％、85％、90％或95％同一性的Va区；和与SEQ ID NO:195为至少80％、85％、90％或95％同一性的Vb区的TCR。
在一些实施方案中，本文提供了具有与SEQ ID NO:196为至少80％、85％、90％或95％同一性的Va区；和与SEQ ID NO:197为至少80％、85％、90％或95％同一性的Vb区的TCR。
在一些实施方案中，本文提供了具有与SEQ ID NO:198为至少80％、85％、90％或95％同一性的Va区；和与SEQ ID NO:199为至少80％、85％、90％或95％同一性的Vb区的TCR。
在一些实施方案中，本文提供了具有与SEQ ID NO:200为至少80％、85％、90％或95％同一性的Va区；和与SEQ ID NO:201为至少80％、85％、90％或95％同一性的Vb区的TCR。
在一些实施方案中，本文提供了具有与SEQ ID NO:202为至少80％、85％、90％或95％同一性的Va区；和与SEQ ID NO:203为至少80％、85％、90％或95％同一性的Vb区的TCR。
在一些实施方案中，本文提供了具有与SEQ ID NO:204为至少80％、85％、90％或95％同一性的Va区；和与SEQ ID NO:205为至少80％、85％、90％或95％同一性的Vb区的TCR。
在一些实施方案中，本文提供了具有与SEQ ID NO:206为至少80％、85％、90％或95％同一性的Va区；和与SEQ ID NO:207为至少80％、85％、90％或95％同一性的Vb区的TCR。
在一些实施方案中，本文提供了具有与SEQ ID NO:208为至少80％、85％、90％或95％同一性的Va区；和与SEQ ID NO:209为至少80％、85％、90％或95％同一性的Vb区的TCR。
在一些实施方案中，本文提供了具有与SEQ ID NO:210为至少80％、85％、90％或95％同一性的Va区；和与SEQ ID NO:211为至少80％、85％、90％或95％同一性的Vb区的TCR。
在一些实施方案中，本文提供了具有与SEQ ID NO:212为至少80％、85％、90％或95％同一性的Va区；和与SEQ ID NO:213为至少80％、85％、90％或95％同一性的Vb区的TCR。
在一些实施方案中，本文提供了具有与SEQ ID NO:214为至少80％、85％、90％或95％同一性的Va区；和与SEQ ID NO:215为至少80％、85％、90％或95％同一性的Vb区的TCR。
在一些实施方案中，本文提供了具有与SEQ ID NO:216为至少80％、85％、90％或95％同一性的Va区；和与SEQ ID NO:217为至少80％、85％、90％或95％同一性的Vb区的TCR。
在一些实施方案中，本文提供了具有与SEQ ID NO:218为至少80％、85％、90％或95％同一性的Va区；和与SEQ ID NO:219为至少80％、85％、90％或95％同一性的Vb区的TCR。
在一些实施方案中，本文提供了具有与SEQ ID NO:220为至少80％、85％、90％或95％同一性的Va区；和与SEQ ID NO:221为至少80％、85％、90％或95％同一性的Vb区的TCR。
在一些实施方案中，本文提供了具有与SEQ ID NO:222为至少80％、85％、90％或95％同一性的Va区；和与SEQ ID NO:223为至少80％、85％、90％或95％同一性的Vb区的TCR。
在一些实施方案中，本文所描述的TCR、其抗原结合片段或TCR衍生的结合分子可以包含可变区(例如，Va)，所述可变区含有一个、两个或三个本文所描述的CDR，所述CDR具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失或取代。在一些实施方案中，所述a链包含一个或更多个如本文所描述的Va CDR序列。在一些实施方案中，所述b链包含一个或更多个如本文所描述的Vb CDR序列。
在一些实施方案中，本文所描述的TCR、其抗原结合片段或TCR衍生的结合分子包括包含可变α(Va)区的α链和包含可变β(Vb)区的β链。在一些实施方案中，Va区可包括互补决定区1(CDR1)、互补决定区2(CDR2)和互补决定区3(CDR3)。在一些实施方案中，Va区的CDR3包含包括SGY(丝氨酸-甘氨酸-酪氨酸)的氨基酸序列。在一些实施方案中，Va区的CDR3包含包括YST(酪氨酸-丝氨酸-苏氨酸)的氨基酸序列。在一些实施方案中，Va区的CDR3包含氨基酸序列X1GX2SGYSTL，其中X1是E(谷氨酸)、T(苏氨酸)、Q(谷氨酰胺)、V(缬氨酸)或N(天冬酰胺)；并且X2是D(天冬氨酸)、G(甘氨酸)、N(天冬酰胺)或E(谷氨酸)。在一些实施方案中，Vb区包含CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，Vb区的CDR3包含包括QGG(谷氨酰胺-甘氨酸-甘氨酸)的氨基酸序列。在一些实施方案中，Vb区的CDR3包含包括TQGG(苏氨酸-谷氨酰胺-甘氨酸-甘氨酸)的氨基酸序列。在一些实施方案中，Vb区的CDR3包含氨基酸序列X3X4QGGX5X6X7X8，其中X3是S(丝氨酸)、T(苏氨酸)、N(天冬酰胺)或R(精氨酸)；X4是T(苏氨酸)、R(精氨酸)、Y(酪氨酸)、G(甘氨酸)、V(缬氨酸)、Q(谷氨酰胺)、F(苯丙氨酸)、S(丝氨酸)或P(脯氨酸)；X5是N(天冬酰胺)、G(甘氨酸)、H(组氨酸)、T(苏氨酸)、S(丝氨酸)、A(丙氨酸)、I(异亮氨酸)或W(色氨酸)；X6是Y(酪氨酸)、N(天冬酰胺)、D(天冬氨酸)、E(谷氨酸)、R(精氨酸)或I(异亮氨酸)；X7是G(甘氨酸)、Q(谷氨酰胺)、N(天冬酰胺)、Y(酪氨酸)；并且X8是Y(酪氨酸)、F(苯丙氨酸)或G(甘氨酸)。
在一些实施方案中，本文所描述的TCR、其抗原结合片段或TCR衍生的结合分子包括包含可变α(Va)区的α链和包含可变β(Vb)区的β链。在一些实施方案中，Va区由来自人TRAV基因区段和人TRAJ基因区段的重排的序列编码，并且Vb区由来自人TRBV基因区段、人TRBD基因区段和人TRBJ基因区段的重排的序列编码。在一些实施方案中，TRAV基因区段是TRAV17；TRAJ基因区段是TRAJ11；TRBV基因区段是TRBV6-5；TRBD基因区段是TRBD1或TRBD2；并且TRBJ基因区段是TRBJ2-1或TRBJ1-2。在一些实施方案中，TRAV基因区段是TRAV21；TRAJ基因区段是TRAJ33；TRBV基因区段是TRBV10-2；TRBD基因区段是TRBD1；并且TRBJ基因区段是TRBJ2-7。在一些实施方案中，TRAV基因区段是TRAV4、TRAV25、TRAV22或TRAV6；TRAJ基因区段是TRAJ23、TRAJ47、TRAJ29、TRAJ43或TRAJ11；TRBV基因区段是TRBV12-4、TRBV12-3、TRBV11-2、TRBV4-1或TRBV11-2；TRBD基因区段是TRBD2；并且TRBJ基因区段是TRBJ1-1、TRBJ2-1、TRBJ2-5或TRBJ2-7。在一些实施方案中，TRAV基因区段是TRAV12-1；TRAJ基因区段是TRAJ21；TRBV基因区段是TRBV20-1；TRBD基因区段是TRBD1；并且TRBJ基因区段是TRBJ2-5或TRBJ2-3。在一些实施方案，TRAV基因区段是TRAV25、TRAV12-3或TRAV21；TRAJ基因区段是TRAJ16、TRAJ3或TRAJ35；TRBV基因区段是TRBV6-6、TRBV24-1或TRBV30；TRBD基因区段是TRBD1或TRBD2；并且TRBJ基因区段是TRBJ1-1、TRBJ2-5、TRBJ2-3或TRBJ2-7。
在一些实施方案中，Va区的CDR由来自人TRAV基因区段和人TRAJ基因区段的序列编码，其中TRAV基因区段是TRAV17并且TRAJ基因区段是TRAJ11。在一些实施方案中，Vb区的CDR由来自人TRBV基因区段、人TRBD基因区段和人TRBJ基因区段的序列编码，其中TRBV基因区段是TRBV6-5；TRBD基因区段是TRBD1或TRBD2；并且TRBJ基因区段是TRBJ2-1或TRBJ1-2。
在一些实施方案中，Va区的CDR由来自人TRAV基因区段和人TRAJ基因区段的序列编码，其中TRAV基因区段是TRAV21并且TRAJ基因区段是TRAJ33。在一些实施方案中，Vb区的CDR由来自人TRBV基因区段、人TRBD基因区段和人TRBJ基因区段的序列编码，其中TRBV基因区段是TRBV10-2；TRBD基因区段是TRBD1；并且TRBJ基因区段是TRBJ2-7。
本公开还提供了一种抗体或其抗原结合片段，其包含任何一种或更多种如上文关于TCR所描述的CDR。在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段包含可变的重链和轻链，所述可变的重链和轻链包含在α链中含有的CDR1、CDR2和/或CDR3以及在β链中含有的CDR1、CDR2和/或CDR3。
本公开还提供了包含编码多肽的多核苷酸的核酸，所述多肽包含TCR a链可变区、TCR b链可变区、免疫球蛋白重链可变区或免疫球蛋白轻链可变区。可变区包含如图2-4中所示的CDR。当多肽与对应的多肽(例如，对应的a链可变区或对应的b链可变区)配对时，所述配对的多肽与感兴趣的抗原(例如，EBV LMP2)结合。
在一些实施方案中，通过与感兴趣的抗原结合，TCR或其抗原结合片段或TCR衍生的结合分子可以激活T细胞(例如，通过激活TCR信号传导途径)。在一些实施方案中，激活可以上调免疫反应、增加细胞因子(例如IFNγ)和/或CD107a的表达、促进T细胞增殖和T细胞介导的杀伤。
在一些实施方案中，如本文所描述的TCR或其抗原结合片段或TCR衍生的结合分子可以使T细胞的免疫应答、活性或数量增加至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、2倍、3倍、5倍、10倍或20倍。在一些实施方案中，当存在感兴趣的抗原时，TCR或其抗原结合片段或TCR衍生的结合分子可以增加IFN-γ的血清浓度。在一些实施方案中，激活可以诱导IFN-γ的血清浓度增加至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、1倍、2倍、5倍、10倍、100倍或1000倍。在一些实施方案中，激活可以诱导对靶细胞的特异性杀伤增加至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、1倍、2倍、3倍、4倍或5倍。
在一些方面，提供的重组TCR包括至少部分地独立于CD8的TCR。在一些方面，提供的重组TCR包括至少部分地依赖于CD8的TCR。
在一些实施方案中，如本文所描述的TCR或其抗原结合片段或TCR衍生的结合分子特异性地结合EBV LMP2表位。在一些实施方案中，表位具有选自SEQ ID NO:139-142、167和168的序列。可以从动力学速率常数的商(KD＝koff/kon)推导结合亲和力。在一些实施方案中，KD为小于1x 10-6M、小于1x 10-7M、小于1x 10-8M、小于1x 10-9M、或小于1x 10-10M。在一些实施方案中，KD为小于50nM、30nM、20nM、15nM、10nM、9nM、8nM、7nM、6nM、5nM、4nM、3nM、2nM、或1nM。在一些实施方案中，KD为大于1x10-7M、大于1x 10-8M、大于1x 10-9M、大于1x 10-10M、大于1x 10-11M、或大于1x 10-12M。用于测定结合分子对抗原的亲和力的一般技术包括例如ELISA、RIA和表面等离子共振(SPR)。
在一些实施方案中，TCR或其抗原结合片段或TCR衍生的结合分子具有相对高的表达效率。例如，在相同条件下，本文所描述的TCR或其抗原结合片段或TCR衍生的结合分子的表达效率可以比参照分子(例如，内源性TCR)高至少10％、20％、30％、40％、50％或100％。
在一些实施方案中，结合分子如TCR不表现出交叉反应性或脱靶结合，诸如不期望的脱靶结合，例如与健康或正常组织或细胞中存在的抗原的脱靶结合。
EBV感染和癌症
爱泼斯坦巴尔病毒(EBV)是最早被鉴定为致癌的病毒之一。EBV通过其与CD21和MHC II类的相互作用在感染B细胞方面极为有效。EBV也可以感染并保留在上皮细胞中。世界上几乎所有的成年人都已经暴露于EBV。在不存在免疫妥协(immune compromise)的情况下，儿童期的初始暴露导致由细胞免疫应答控制的自限制疾病。针对爱泼斯坦巴尔病毒(EBV)和EBV相关疾病的免疫防御的存在是众所周知的。宿主产生的针对病毒蛋白的抗原特异性T细胞对病毒非常有效。然而，EBV可以在上皮或B细胞中持续存在而不被完全消除。宿主的免疫状态的任何变化都可导致再激活，并且取决于免疫妥协的程度，这种再激活可能导致恶性肿瘤。
EBV涉及实体器官和造血细胞移植(HSCT)，其中T细胞数量减少或缺失可能导致携带EBV的B细胞不受限制的增殖。这类不受控制的扩增可导致移植后淋巴增生性疾病(PTLD)，这是最常见的移植后恶性肿瘤。这种综合症的频率和强度在每位患者内不同，并且其免疫抑制对其T细胞群体的影响也不同。EBV还涉及其它恶性肿瘤。若干条研究线已使EBV牵涉各种上皮和淋巴恶性肿瘤的发病机制。例如，众所周知，霍奇金(Glaser,等人"Epstein-Barr virus-associated Hodgkin's disease:epidemiologic characteristicsin international data."International journal of cancer 70.4(1997):375-382)和非霍奇金淋巴瘤与EBV相关。EBV和鼻咽癌之间也有明确的因果关系(NPC；Raab-Traub"Nasopharyngeal carcinoma:an evolving role for the Epstein–Barr virus."EpsteinBarr Virus第1卷.Springer,Cham,2015.339-363.)。患有霍奇金淋巴瘤和NPC的患者的肿瘤样品表达EBV衍生的蛋白质，包括潜伏膜蛋白2(LMP2)。因为这些病毒蛋白是非自身的，并且也是针对EBV的细胞免疫应答的主要靶标，所以其代表了抗癌免疫疗法的理想靶标。
与EBV相关的LMP2(+)人恶性肿瘤的列表包括伯基特氏淋巴瘤、免疫抑制性淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、与慢性炎症相关的弥漫性大B细胞淋巴瘤、淋巴瘤样肉芽肿、浆母细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、移植后淋巴增殖性疾病、鼻咽癌、胃腺癌、淋巴上皮瘤相关癌、和免疫缺陷相关平滑肌肉瘤。这些病症描述于例如WO/2019/213416A1；Thompson等人,"Epstein-Barr virus and cancer."Clinical Cancer Research 10.3(2004):803-821，二者通过引用以其整体并入本文。
静息B细胞的EBV感染/转化产生潜伏性淋巴母细胞瘤系(LCL)。LCL以潜伏复制的形式存在，并且携带病毒基因组的多个拷贝作为附加体。其表达许多称为潜伏蛋白的病毒基因产物，所述潜伏蛋白根据潜伏期而不同。已经描述了总共十种潜伏蛋白：六种爱泼斯坦病毒核抗原(EBNA1、2、3A、3B、3C和LP)、三种潜伏膜蛋白(LMP 1、2A和2B)和BARF1。当表达EBNA1、EBNA2、EBNA3、LMP1、LMP2和BARF1时，初始EBV感染激活B细胞并诱导潜伏期III。这些蛋白质描述于例如Bollard等人,"T-cell therapy in the treatment of post-transplant lymphoproliferative disease."Nature reviews Clinical oncology 9.9(2012):510中，其通过引用以其整体并入本文。
本公开提供了治疗EBV感染和/或EBV诱导的疾病和病症的方法。
工程化细胞
本公开提供了工程化细胞(例如，T细胞)，其包含如本文所描述的TCR或其抗原结合片段、或其它类似的抗原结合分子。这些工程化细胞可以用于治疗如本文所描述的各种病症或疾病(例如，病毒感染、癌症、病毒诱导的病症)。
在各种实施方案中，被工程化的细胞可以获得自例如人和非人动物。在各种实施方案中，被工程化的细胞可以获得自细菌、真菌、人、大鼠、小鼠、兔、猴、猪或任何其它物种。优选地，所述细胞来自人、大鼠或小鼠。更优选地，所述细胞获得自人。在各种实施方案中，被工程化的细胞是血细胞。优选地，所述细胞是白细胞(例如T细胞)、淋巴细胞或任何其它合适的血细胞类型。在一些实施方案中，所述细胞是外周血细胞。在一些实施方案中，所述细胞是T细胞、B细胞或NK细胞。
在一些实施方案中，所述细胞是T细胞。在一些实施方案中，T细胞可以表达识别靶细胞表面上的特异性抗原部分的细胞表面受体。细胞表面受体可以是野生型或重组T细胞受体(TCR)、嵌合抗原受体(CAR)或能够识别与靶细胞相关的抗原部分的任何其它表面受体。T细胞可以通过本领域已知的各种方法获得，例如，从患者中分离的T细胞(例如，肿瘤浸润性淋巴细胞)的体外培养。可以通过用病毒载体转导T细胞(例如，从患者外周血中分离的)来获得TCR基因修饰的T细胞。在一些实施方案中，T细胞是TCR基因修饰的T细胞。在一些实施方案中，T细胞是CD4+T细胞、CD8+T细胞或调节性T细胞。在一些实施方案中，T细胞是T辅助1型T细胞和T辅助2型T细胞。在一些实施方案中，表达该受体的T细胞是αβ-T细胞。在替代性实施方案中，表达该受体的T细胞是γδ-T细胞。
在一些实施方案中，所述细胞是NK细胞。在一些实施方案中，工程化细胞的制备包括一个或更多个培养和/或制备步骤。可以从样品(诸如生物样品，例如从受试者获得或来源的生物样品)中分离用于引入结合分子(例如TCR)的细胞。在一些实施方案中，从其分离细胞的受试者是患有疾病或病况或需要细胞疗法、或将向其施用细胞疗法的受试者。在一些实施方案中，受试者是需要特定治疗干预(诸如为其对细胞进行分离、加工和/或工程化的过继细胞疗法)的人。
在一些实施方案中，所述细胞是干细胞，诸如多潜能和多能干细胞，包括诱导性多能干细胞(iPSC)。所述细胞可以是原代细胞，诸如直接从受试者中分离和/或从受试者中分离并冷冻的那些细胞。在一些实施方案中，将干细胞与另外的分化因子一起培养以获得所需的细胞类型(例如T细胞)。
可以从适当的分离方法中获得不同的细胞类型。所述分离方法包括基于一种或更多种特定分子(诸如表面标志物，例如表面蛋白、细胞内标志物、或核酸)在细胞中的表达或存在来分离不同的细胞类型。在一些实施方案中，可以使用基于此类标志物的任何已知的分离方法。在一些实施方案中，所述分离是基于亲和力或免疫亲和力的分离。例如，在一些方面，所述分离包括基于一种或更多种标志物(通常是细胞表面标志物)的细胞表达或表达水平而分离细胞和细胞群体，例如，通过与特异性地结合此类标志物的抗体或结合配偶体(binding partner)一起孵育，随后通常是洗涤步骤和将已经结合抗体或结合配偶体的细胞从未结合抗体或结合配偶体的细胞分开。
此类分离步骤可以是基于阳性选择，其中已经结合试剂的细胞被保留以供进一步使用，和/或基于阴性选择，其中未结合抗体或结合配偶体的细胞被保留。在一些实例中，两个级分均被保留供进一步使用。在一些方面，在没有可用的抗体特异性地鉴定异源群体中的细胞类型，使得最好基于由除所需群体以外的细胞表达的标志物来进行分离的情况下，阴性选择可能特别有用。
还提供了用于表达结合分子和用于生产表达此类结合分子的基因工程化细胞的方法、核酸、组合物和试剂盒。基因工程化通常涉及诸如通过逆转录病毒转导、转染或转化将编码治疗分子(例如TCR、CAR、例如TCR样CA多肽、融合蛋白)的核酸引入细胞中。在一些实施方案中，通过如下来实现基因转移：首先刺激细胞，诸如通过将其与诱导反应(诸如增殖、存活和/或激活，例如通过细胞因子或激活标志物的表达所测定的)的刺激物组合，随后转导激活的细胞并在培养物中扩增至足以用于临床应用的数量。
在一些实施方案中，使用重组传染性病毒颗粒，诸如，例如源自猿猴病毒40(SV40)、腺病毒、腺相关病毒(AAV)的载体，将重组核酸转移到细胞中。在一些实施方案中，使用重组慢病毒载体或逆转录病毒载体，诸如γ-逆转录病毒载体，将重组核酸转移到T细胞中。在一些实施方案中，逆转录病毒载体具有长末端重复序列(LTR)，例如衍生自莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV)、骨髓增生性肉瘤病毒(MPSV)、鼠胚胎干细胞病毒(MESV)、鼠干细胞病毒(MSCV)、或脾病灶形成病毒(SFFV)的逆转录病毒载体。大多数逆转录病毒载体衍生自鼠逆转录病毒。在一些实施方案中，所述逆转录病毒包括衍生自任何鸟类(avian)或哺乳动物细胞来源的那些。所述逆转录病毒通常是双嗜性的，这意味着其能够感染包括人在内的若干个物种的宿主细胞。在一些实施方案中，载体是慢病毒载体。在一些实施方案中，重组核酸通过电穿孔转移到T细胞中。在一些实施方案中，重组核酸通过转座(transposition)转移到T细胞中。在免疫细胞中引入和表达遗传物质的其它方法包括磷酸钙转染、原生质体融合、阳离子脂质体介导的转染；钨粒子促进的微粒轰击和磷酸锶DNA共沉淀。这些方法中的许多描述于例如WO2019195486中，其以其整体通过引用并入本文。
在一些方面，人源化和/或完全人重组TCR的开发提出了技术挑战。例如，在一些方面，当人源化和/或完全人重组TCR受体被工程化为人T细胞时，可以与内源性TCR复合体竞争和/或可以与内源性TCRa链和/或TCRb链形成错误配对，这在某些方面可能降低重组TCR信号传导、活性和/或表达，并最终导致工程化细胞的活性降低。可以对工程化细胞进行基因修饰。在一些实施方案中，工程化细胞可以包含T细胞受体α恒定(TRAC)基因和/或T细胞受体β恒定(TRBC)基因的遗传破坏。在一些实施方案中，TRBC基因是T细胞受体β恒定1(TRBCJ)或T细胞受体β恒定2(TRBC2)基因中的一者或两者。在一些实施方案中，工程化细胞不表达内源性TCR a链和/或TRC b链。在一些其它方面，使用非人恒定结构域，例如啮齿动物(例如小鼠)恒定结构域。使用非人恒定结构域可以有效地降低配对错误的可能性。
还提供了工程化细胞群体、含有此类细胞和/或富集此类细胞(诸如其中表达结合分子的细胞组成组合物中的总细胞或某种类型的细胞(诸如T细胞、CD8+或CD4+细胞)的至少15％、20％、25％、30％、35％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高百分比)的组合物。
重组载体
本公开还提供了包括本文公开的分离的多核苷酸(例如编码本文公开的多肽的多核苷酸)的重组载体(例如表达载体)、向其中引入重组载体(即，使得宿主细胞包含多核苷酸和/或含有多核苷酸的载体)的宿主细胞、以及通过重组技术生产重组多肽或其片段。
如本文所用，“载体”是当将载体引入宿主细胞时能够将一种或更多种感兴趣的多核苷酸递送至宿主细胞的任何构建体。“表达载体”能够在已经引入表达载体的宿主细胞中递送一种或更多种感兴趣多核苷酸和将其表达为编码的多肽。因此，通过在感兴趣多核苷酸的整合位点处或附近或侧翼与载体内或宿主细胞基因组中的调控元件如启动子、增强子和/或poly-A尾可操作地连接，使得感兴趣的多核苷酸将在与表达载体一起引入的宿主细胞中翻译，将感兴趣多核苷酸定位在表达载体中用于表达。
可以通过本领域已知的方法将载体引入宿主细胞中，例如电穿孔、化学转染(例如DEAE-葡聚糖)、转化、转染、以及感染和/或转导(例如用重组病毒)。因此，载体的非限制性实例包括病毒载体(其可以用于产生重组病毒)、裸DNA或RNA、质粒、粘粒(cosmids)、噬菌体载体、以及与阳离子缩合剂(cationic condensing agent)相关的DNA或RNA表达载体。
本公开提供了包含适合于对细胞进行基因修饰的核酸构建体的重组载体，其可以用于治疗病理性疾病或病况。
任何载体或载体类型均可以用于将遗传物质递送至细胞。这些载体包括但不限于质粒载体、病毒载体、细菌人工染色体(BAC)、酵母人工染色体(YAC)和人类人工染色体(HAC)。病毒载体可以包括但不限于重组逆转录病毒载体、重组慢病毒载体、重组腺病毒载体、泡沫病毒载体、重组腺相关病毒(AAV)载体、杂交载体、和质粒转座子(例如，睡美人(sleeping beauty)转座子系统和PiggyBac转座子系统)或基于整合酶的载体系统。也可以结合本文所描述的方法使用本领域已知的其它载体。
在一些实施方案中，载体是病毒载体。可以将病毒载体在对病毒载体制造具有特异性的培养基中生长。根据本文所描述的实施方案，可以使用任何合适的生长培养基和/或用于使病毒载体生长的补充剂。
在一些实施方案中，所使用的载体是重组逆转录病毒载体。逆转录病毒载体能够指导感兴趣的核酸分子的表达。逆转录病毒以RNA形式存在于其病毒荚膜中，并且当在宿主细胞中复制时形成双链DNA中间体。类似地，逆转录病毒载体以RNA和双链DNA两种形式存在。逆转录病毒载体还包括含有重组DNA片段的DNA形式和含有重组RNA片段的RNA形式。载体可以包括至少一种转录启动子/增强子、或控制基因表达的其它元件。此类载体还可以包括包装信号、长末端重复序列(LTR)或其部分、以及适合于所使用的逆转录病毒的正链和负链引物结合位点。长末端重复序列(LTR)是在逆转录转座子或通过逆转录病毒RNA的逆转录形成的前病毒DNA的末端发现的重复许多次(例如数百或数千次)的相同的DNA序列。其由病毒使用以将其遗传物质插入宿主基因组中。任选地，载体还可以包括指导多腺苷酸化的信号、可选择标记如氨苄青霉素抗性、新霉素抗性、TK、匀霉素抗性、腐草霉素抗性组氨醇抗性、或DHFR，以及一个或更多个限制位点和翻译终止序列。举例来说，此类载体可以包括5’LTR、前导序列、tRNA结合位点、包装信号、第二链DNA合成的起点和3’LTR或其一部分。另外，本文所用的逆转录病毒载体还可以指代通过去除逆转录病毒gag、pol和env基因并用感兴趣基因替代而产生的重组载体。
在一些实施方案中，使用MP71(或pMP71)载体。使用标准分子生物学技术产生MP71逆转录病毒载体构建体。在一些实施方案中，MP71逆转录病毒载体包含两个通过P2A序列连接的基因：(1)与小鼠TCRα链的恒定区融合的人抗LMP2 TCR的α链的可变区；(2)与小鼠TCRβ链的恒定区融合的同一人抗LMP2 TCR的β链的可变区。(图1)
在一些实施方案中，载体可以包括编码抑制蛋白(例如，检查点抑制剂)的另外的核酸。在各种实施方案中，细胞表达基因工程化抗原受体和抑制蛋白。在各种实施方案中，抑制蛋白是组成型表达的。
在一些实施方案中，载体或构建体可以含有驱动一个或更多个核酸分子的表达的单个启动子。在一些实施方案中，此类启动子可以是多顺反子(双顺反子或三顺反子)。例如，在一些实施方案中，转录单元可以是工程化为含有IRES(内部核糖体进入位点)的双顺反子单元，其允许通过来自单一启动子的消息共表达基因产物(例如编码TCR的α链和/或β链)。可选地，在一些情况下，单一启动子可指导RNA的表达，所述RNA在单一开放阅读框(ORF)中含有两个或三个基因(例如，编码TCR的α链和/或β链)，所述两个或三个基因通过编码自切割肽(例如P2A或T2A)的序列或蛋白酶识别位点(例如弗林蛋白酶(furin))彼此分开。因此，ORF编码单个多蛋白，所述多蛋白在翻译期间(在2A如T2A的情况下)或之后被切割成单个蛋白质。在一些情况下，肽如T2A可以引起核糖体跳过2A元件C末端处肽键的合成(核糖体跳跃)，从而导致在2A序列末端与下游相邻肽之间分开。
可以结合如本文所述的载体使用各种细胞系。可以用于表达多肽的示例性真核细胞包括但不限于COS细胞，包括COS 7细胞；293细胞，包括293-6E细胞；CHO细胞，包括CHO-S、DG44。Lec13 CHO细胞和FUT8 CHO细胞；细胞；和NSO细胞。在一些实施方案中，特定的真核宿主细胞是基于其对结合分子进行所需的翻译后修饰的能力来选择的。例如，在一些实施方案中，CHO细胞产生的多肽的唾液酸化水平高于在293细胞中产生的相同多肽。
在一个方面，本公开还涉及包含编码多肽的多核苷酸的核酸，所述多肽包含：
(1)包含a链可变区(Va)的TCR a链或其片段，所述Va包含分别包含图2-4中示出的氨基酸序列的互补决定区(CDR)1、2和3，并且其中所述Va当与对应的b链可变区(Vb)配对时，与LMP2结合；和/或
(2)包含b链可变区(Va)的TCR b链或其片段，所述Vb包含分别包含图2-4中示出的氨基酸序列的互补决定区(CDR)1、2和3，并且其中所述Vb当与对应的a链可变区(Va)配对时，与LMP2结合
在一些实施方案中，所述Va当与Vb配对时，与EBV LMP2特异性结合，或者所述Vb当与Va配对时，与EBV LMP2特异性结合。在一些实施方案中，核酸是cDNA。
在一个方面，本公开涉及包含一种或更多种如本文所描述的核酸的载体。在一个方面，本公开还涉及包含两种如本文所描述的核酸的载体。在一些实施方案中，所述载体编码一起结合EBV抗原的Va区和Vb区。
在一个方面，本公开涉及一对载体，其中每个载体包含一种如本文所描述的核酸，其中所述载体对一起编码一起结合EBV抗原的Va区和Vb区。
在一个方面，本公开涉及包含如本文所描述的载体或载体对的细胞。在一些实施方案中，所述细胞是T细胞。
在一些情况下，某些TCR可能表现出不良的表达或活性，部分地因为与内源性TCR链的错误配对和/或竞争和/或其它因素。解决这些挑战的一种方法是设计具有小鼠恒定结构域的重组TCR，以防止与内源性人TCR a链或b链错误配对。然而，使用具有小鼠序列的重组TCR可能带来免疫应答的风险。在一些实施方案中，例如通过基因编辑在编码一个或更多个TCR链的内源基因上引入遗传破坏。
如图1中所示，将核酸构建体克隆到逆转录病毒载体pMP71中，所述逆转录病毒载体pMP71含有两个通过P2A序列连接的基因：(1)与小鼠TCRα链的恒定区融合的人抗LMP2TCR的α链的可变区；(2)与小鼠TCRβ链的恒定区融合的同一人抗LMP2 TCR的β链的可变区。在一些实施方案中，核酸构建体还包含编码信号肽的序列。
在一些实施方案中，抑制蛋白是抗PD-1抗体(例如，抗PD-1scFV)。
如本文所用，“接头”(L)或“接头结构域”或“接头区域”是指长度为约1至100个氨基酸的低聚-或多肽区域，其将任何结构域/区域连接在一起。接头可以由柔性残基如甘氨酸和丝氨酸构成，使得相邻的蛋白质结构域可以相对于彼此自由移动。当期望确保两个相邻结构域彼此不空间干扰时，可以使用较长的接头。接头可以是可切割的或不可切割的。可切割接头的实例包括2A接头(例如P2A、T2A)、2A样接头或其功能等同物以及其的组合。在一些实施方案中，接头包括小核糖核酸病毒2A样接头；猪捷申病毒(P2A)、明脉扁刺蛾病毒(Thosea asigna virus)(T2A)的CHYSEL序列或其的组合、变体和其功能等同物。其它接头对本领域技术人员将是显而易见的，并且可以在本文所述的方法中使用。
本公开还提供了一种核酸序列，其包含编码TCR、其抗原结合片段和/或TCR衍生的结合分子(包括例如本文所描述的其功能部分和功能变体、多肽或蛋白质)中的任一种的核苷酸序列。如本文所用，“核酸”可以包括“多核苷酸”、“寡核苷酸”和“核酸分子”，并且通常意指DNA或RNA的聚合物，其可以是单链或双链的、合成的或获得自天然来源，其可以含有天然、非天然或改变的核苷酸。此外，核酸包含互补DNA(cDNA)。通常优选的是，核酸不包含任何插入、缺失、倒位和/或取代。然而，如本文所讨论的，在一些情形下，核酸包含一个或更多个插入、缺失、倒位和/或取代可能是合适的。
可以使用本领域已知的程序基于化学合成和/或酶促连接反应来构建如本文所描述的核酸。例如，可以使用天然存在的核苷酸或各种经修饰的核苷酸来化学地合成核酸。在一些任何此类实施方案中，核苷酸序列是密码子优化的。
本公开还提供了核酸，所述核酸包含与本文所描述的任何核酸的核苷酸序列互补的核苷酸序列或者在严格条件下与本文所描述的任何核酸的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。
在一些实施方案中，编码α链的核苷酸序列和编码β链的核苷酸序列被引起核糖体跳跃的肽序列分开。在一些实施方案中，引起核糖体跳跃的肽是P2A或T2A肽。在一些实施方案中，核酸是合成的。在一些实施方案中，核酸是cDNA。
在一些实施方案中，载体可以另外包括编码检查点抑制剂(CPI)(例如抑制蛋白)的核酸序列。在一些实施方案中，检查点抑制剂是例如本文所描述的任何抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段可以特异性地结合PD-1、PD-L1、PD-L2、2B4(CD244)、4-1BB、A2aR、B7.1、B7.2、B7-H2、B7-H3、B7-H4、B7-H6、BTLA、嗜乳脂蛋白、CD160、CD48、CTLA4、GITR、gp49B、HHLA2、HVEM、ICOS、ILT-2、ILT-4、KIR家族受体、LAG-3、OX-40、PIR-B、SIRPα(CD47)、TFM-4、TIGIT、TIM-1、TIM-3、TIM-4或VISTA。在一些实施方案中，抑制蛋白是scFv(例如抗PD-1scFv)。
在一些实施方案中，载体可以另外包括编码双功能陷阱融合蛋白的核酸序列。在一些实施方案中，双功能陷阱蛋白靶向PD-1和TGF-β二者。在一些实施方案中，双功能陷阱蛋白靶向PD-L1和TGF-β二者。在一些实施方案中，双功能融合蛋白设计成阻断PD-L1和隔绝(sequester)TGF-β。基于人IgG1单克隆抗体(mAb)阿维鲁单抗(avelumab)，M7824(MSB0011395C)包含与人抗PD-L1 scFv的C末端连接的人TGF-β受体II(TGFβRII)的细胞外结构域。在一些实施方案中，双功能融合蛋白包含与人抗PD-1scFv的C末端连接的人TGF-β受体II(TGFβRII)的细胞外结构域。
在一些任何此类实施方案中，TCR或其抗原结合片段由已经进行密码子优化的核苷酸序列编码。在某些实施方案中，α链和/或β链还包含信号肽。在特定实施方案中，TCR或其抗原结合片段是分离的或纯化的或者是重组的。在一些任何此类实施方案中，TCR或抗原结合片段是重组的。在一些任何此类实施方案中，TCR或其抗原结合片段是人的。
本公开还提供了与本文所述的任何核苷酸序列为至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的核酸序列、以及与本文所描述的任何氨基酸序列为至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开涉及编码本文所描述的任何肽的核苷酸序列、或由本文所述的任何核苷酸序列编码的任何氨基酸序列。
在一些实施方案中，核酸序列为至少或约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、150、200、250、300、350、400、500、或600个核苷酸。在一些实施方案中，氨基酸序列为至少或约5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200个氨基酸残基。在一些实施方案中，核酸序列为小于10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、150、200、250、300、350、400、500、或600个核苷酸。在一些实施方案中，氨基酸序列为小于5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、或200个氨基酸残基。
为确定两条氨基酸序列或两条核酸序列的同一性百分比，出于最佳比较目的，对序列进行比对(例如，可以在第一和第二氨基酸或核酸序列中的一者或两者中引入缺口以进行最佳比对，并且出于比较目的可以忽略非同源序列)。然后比较在相应的氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的位置被与第二序列中的相应位置相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，则分子在所述位置是相同的。考虑了缺口数量和每个缺口的长度(需要将其引入以实现两个序列的最佳比对)，两条序列之间的同一性百分比是由序列所共享的相同位置的数量的函数。
产生T细胞受体和TCR样分子的方法
本公开还提供了鉴定和产生可以识别靶抗原的T细胞受体的方法。在一些方面，所述方法涉及使含有T细胞如原代T细胞的生物样品，包括来自正常供体或患有感兴趣的疾病或病况的患者的那些生物样品，经受多轮抗原暴露和评价。在一些方面，所述多轮涉及使用人工或工程化抗原呈递细胞，诸如自体树突状细胞或用所需肽抗原脉冲的其它APC来促进在MHC如I类或II类MHC上的呈递。
在一些方面，进行多轮抗原暴露，并且在一些方面，例如基于结合所需抗原(诸如肽-MHC四聚体)的能力，在一轮或多轮之后分选T细胞。
可以通过本领域已知的方法例如流式细胞术进行分选。例如，通过单细胞测序方法分析了可以与所需抗原结合的细胞(阳性级分)和不能与所需抗原有效地结合的细胞(阴性级分)。在一些实施方案中，进行测序以在单细胞水平上鉴定每个样品中存在的TCR对。在一些方面，所述方法可以定量在样品中存在的给定TCR对的拷贝数，并且因此可以评价在给定样品中的给定TCR的丰度、和/或其在另一样品中的富集，诸如例如经过一轮或多轮，例如与阴性级分相比，在阳性(抗原结合)级分中的富集或丰度。可以进行此类测定以产生抗原特异性T细胞受体(TCR)。在一些方面，产生克隆T细胞系，并且使用高通量配对TCR测序在单细胞的基础上确定各个群体中单个配对TCRα链和β链的序列及其丰度。
可以进一步修饰TCR或其抗原结合片段。在一些实施方案中，与结合分子(例如本文所描述的任何TCR)的序列相比，结合分子(例如TCR或其抗原结合片段)包括一个或更多个氨基酸变异，例如取代、缺失、插入和/或突变。示例性变体包括设计以改善结合分子的结合亲和力和/或其它生物学特性的那些变体。可以通过将适当的修饰引入编码结合分子的核苷酸序列中、或通过肽合成来制备结合分子的氨基酸序列变体。此类修饰包括例如结合分子的氨基酸序列内的残基的缺失和/或插入和/或取代。可以进行缺失、插入和取代的任何组合以得到最终的构建体，条件是最终的构建体拥有所需的特征，例如与抗原特异性结合。
各种结合分子可以由TCR制成。与本文所述的结合分子(例如TCR)序列相比和/或与天然库(例如人类库)的序列相比，结合分子(例如TCR或其抗原结合片段)可以包括一个或更多个氨基酸取代。取代诱变的感兴趣的位点包括CDR、FR和/或恒定区。可以将氨基酸取代引入感兴趣的结合分子中，并且针对所需活性(例如，保留/改善的抗原亲和力或亲合力、降低的免疫原性、改善的半衰期、独立于CD8的结合或活性、表面表达、促进TCR链配对和/或其它改善的特性或功能)筛选产物。
在一些实施方案中，亲本结合分子(例如TCR)的CDR内的一个或更多个残基被取代。在一些实施方案中，进行取代以将序列或序列中的位置还原为种系序列，诸如在种系(例如人种系)中发现的结合分子序列，例如，以便例如在向人受试者施用后降低免疫原性的可能性。
在一些实施方案中，功能变体由TCR或TCR衍生的结合分子制成。如本文所用，术语“功能变体”是指与亲本分子具有足够或显著的序列同一性的结合分子。此外，功能变体保留了与亲本蛋白质相同的生物活性。功能变体涵盖本文所描述的TCR蛋白(亲本TCR、多肽或蛋白质)的那些变体，其保留了与亲本TCR具有抗原特异性或母体多肽或蛋白质特异性结合的EBV表位特异性结合的能力。此外，功能变体的结合区域(例如，可变结构域)可以是与亲本TCR蛋白相似的程度、相同的程度或更高的程度。关于亲本TCR、多肽或蛋白质，功能变体可以例如与亲本TCR、多肽或蛋白质在氨基酸序列上为至少约30％、50％、75％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同一性。
可以对一个或更多个CDR进行取代、插入或缺失，只要此类改变基本上不降低结合分子(例如TCR或其抗原结合片段)结合抗原的能力即可。例如，可以在CDR中进行基本上不降低结合亲和力的保守改变(例如，如本文提供的保守取代)。此类改变可以例如在CDR中的抗原接触残基之外。在本文提供的可变序列的某些实施方案中，每个CDR要么不改变，要么含有不超过一个、两个或三个氨基酸取代。
TCR衍生的抗体
本公开还提供了含有如上所述的任何一个或更多个CDR的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段含有可变的重链和轻链，所述可变的重链和轻链包含在α链中含有的CDR1、CDR2和/或CDR3以及在β链中含有的CDR1、CDR2和/或CDR3。在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段含有一个或更多个与图2-4中的CDR序列为至少或约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的CDR。
在一些实施方案中，所述抗体和其抗原结合片段(例如TCR样抗体)特异性识别在MHC分子(诸如MHC I类)的背景下的肽表位(例如，EBV抗原)。在一些情况下，MHC I类分子是HLA-A2分子，例如HLA-A2*01。
在一些实施方案中，所述抗体及其抗原结合片段可以以独立于MHC分子的方式特异性地识别肽表位(例如，EBV抗原)。
通常，抗体(也称为免疫球蛋白)由两类多肽链组成：轻链和重链。本公开的非限制性抗体可以是包含两条重链和两条轻链的完整的四条免疫球蛋白链抗体。抗体的重链可以是包括IgM、IgG、IgE、IgA或IgD的任何同型或包括IgG1、IgG2、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgG4、IgE1、IgE2等的亚同型。轻链可以是κ轻链或λ轻链。抗体可以包含两个相同拷贝的轻链和两个相同拷贝的重链。每一条链含有一个可变结构域(或可变区，VH)和多个恒定结构域(或恒定区)的重链在其恒定结构域内通过二硫键彼此结合以形成抗体的“茎”。每一条链含有一个可变结构域(或可变区，VL)和一个恒定结构域(或恒定区)的轻链各自通过二硫键结合至一条重链。每条轻链的可变区与其所结合的重链的可变区对齐。轻链和重链二者的可变区均含有夹在更保守的框架区(FR)之间的三个高变区。
在一些实施方案中，抗体是完整的免疫球蛋白分子(例如，IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM、IgD、IgE、IgA)。IgG亚类(IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)是高度保守的，区别在于其恒定区，尤其是其铰链和上部CH2结构域。IgG亚类的序列和差异是本领域已知的，并且描述于例如Vidarsson,等人,"IgG subclasses and allotypes:from structure to effectorfunctions."Frontiers in immunology 5(2014)；Irani,等人"Molecular properties ofhuman IgG subclasses and their implications for designing therapeuticmonoclonal antibodies against infectious diseases."Molecular immunology 67.2(2015):171-182；Shakib,Farouk,编辑.The human IgG subclasses:molecular analysisof structure,function and regulation.Elsevier,2016；前述每一者通过引用以其整体并入本文。
抗体也可以是源自任何物种(例如人、啮齿动物、小鼠、骆驼科动物)的免疫球蛋白分子。本文公开的抗体还包括但不限于多克隆、单克隆、单特异性、多特异性抗体、和包括与另一多肽融合的免疫球蛋白结合结构域的嵌合抗体。术语“抗原结合结构域”或“抗原结合片段”是保留了完整抗体的特异性结合活性的抗体的一部分，即能够与完整抗体的靶分子上的表位特异性结合的任何抗体部分。其包括例如Fab、Fab’、F(ab’)2以及这些片段的变体。因此，在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段可以是例如scFv、Fv、Fd、dAb、双特异性抗体、双特异性scFv、双抗体、线性抗体、单链抗体分子、由抗体片段形成的多特异性抗体、以及包含是抗体结合结构域或与抗体结合结构域同源的结合结构域的任何多肽。抗原结合结构域的非限制性实例包括例如完整抗体的重链和/或轻链CDR、完整抗体的重链和/或轻链可变区、完整抗体的全长重链或轻链、或来自完整抗体重链或轻链的单个CDR。
在一些实施方案中，抗原结合片段可以形成嵌合抗原受体(CAR)的一部分。在一些实施方案中，嵌合抗原受体是与CD3-δ跨膜结构域和胞内域融合的、如本文所描述的单链可变片段(scFv)的融合物。在一些实施方案中，嵌合抗原受体还包含来自多种共刺激蛋白受体(例如，CD28、41BB、ICOS)的细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，嵌合抗原受体包含多个信号传导结构域，例如CD3z-CD28-41BB或CD3z-CD28-OX40，以增加效力。因此，在一个方面，本公开还提供了表达如本文所描述的嵌合抗原受体的细胞(例如T细胞)。
在一些实施方案中，scFV包含一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域。在一些实施方案中，scFV包含两个重链可变结构域和两个轻链可变结构域。
TCR衍生的CAR
所述抗体或其抗原结合部分可以作为重组受体如抗原受体的一部分在细胞上表达。抗原受体包括功能性非TCR抗原受体，诸如嵌合抗原受体(CAR)。通常，含有表现出针对在MHC分子的背景下的肽的TCR样特异性的抗体或抗原结合片段的CAR也可以被称为TCR样CAR。因此，所提供的结合分子(例如EBV结合分子)为抗原受体，诸如包括所提供的抗体之一(例如TCR样抗体)的那些。在一些实施方案中，抗原受体和其它嵌合受体与LMP2(例如TCR样抗体)的区域或表位特异性地结合。抗原受体包括功能性非TCR抗原受体，诸如嵌合抗原受体(CAR)。还提供了表达CAR的细胞及其在过继细胞疗法中的用途，所述过继细胞疗法诸如与EBV抗原表达相关的疾病和病症的治疗。
含有非TCR分子的TCR样CAR当在MHC分子的背景下显示或呈递时表现出T细胞受体特异性，诸如对T细胞表位或肽表位。在一些实施方案中，TCR样CAR可以含有抗体或其抗原结合部分，例如TCR样抗体，诸如本文所描述的。在一些实施方案中，抗体或其抗体结合部分针对在MHC分子的背景下的特定肽表位具有反应性，其中所述抗体或抗体片段可以将在MHC分子的背景下的特异性肽与单独的MHC分子、单独的特异性肽、以及在一些情况下在MHC分子的背景下的不相关肽区分开。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合部分可以表现出比T细胞受体更高的结合亲和力。
示例性抗原受体(包括CAR)以及将此类受体工程化并引入细胞中的方法，包括描述于例如US2002/131960、US2013/287748、US2013/0149337、U.S.6,451,995、U.S.7,446,190、U.S.8,252,592中的那些；前述每一者通过引用以其整体并入本文。
在一些实施方案中，CAR通常包括在一些方面经由接头和/或一个或更多个跨膜结构域与一种或更多种细胞内信号传导组分连接的、对肽具有特异性的细胞外抗原(或配体)结合结构域，包括例如抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，此类分子通常可以模拟或接近通过天然抗原受体(诸如TCR)的讯息，以及任选地通过与共刺激受体组合的这样的受体的信号。
在一些实施方案中，CAR通常在其细胞外部分中包括一个或更多个抗原结合分子，诸如一个或更多个抗原结合片段、结构域或部分、或一个或更多个抗体可变结构域、和/或抗体分子。在一些实施方案中，CAR包括抗体分子的一个或更多个抗原结合部分，诸如从单克隆抗体(mAh)的可变重链(VH)和可变轻链(VL)衍生的单链抗体片段(scFv)。在一些实施方案中，CAR含有TCR样抗体，诸如特异性地识别存在于细胞表面上的在MHC分子的背景下的肽表位的抗体或抗原结合片段(例如，scFv)。
在某些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含与CD3(例如，CD3-δ)细胞内结构域连接的CD28跨膜和信号传导结构域。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含与CD3δ细胞内结构域连接的嵌合CD28和CD 137(4-lBB、TNFRSF9)共刺激结构域。
在一些实施方案中，结合分子还可以是基因工程化的T细胞受体(TCR)、基因工程化的NK细胞受体、杀手细胞免疫球蛋白样受体(KIR)、C型凝集素受体、白细胞免疫球蛋白样受体(LILR)、1型细胞因子受体、2型细胞因子受体、肿瘤坏死因子家族、TGFβ受体、趋化因子受体或免疫球蛋白超家族(IgSF)的成员。
在一些实施方案中，以多种方式进一步修饰工程化细胞，使得其治疗或预防功效增加。例如，被群体表达的工程化TCR或其它结合分子可以通过接头直接或间接地缀合至靶向部分。将结合分子(例如CAR或TCR)缀合至靶向部分的实践是本领域已知的，并且描述于例如Wadhwa等人"Receptor mediated glycotargeting."Journal of drug targeting3.2(1995):111-127.和美国专利号5,087,616，前述通过引用以其整体并入本文。
工程化细胞的制备方法
本公开提供了一种用于制造和/或使用工程化细胞来治疗病理性疾病或病况的方法或过程。
可以从样品(诸如生物样品，例如从受试者获得或来源的生物样品)中分离用于引入结合分子(例如TCR)的细胞。在一些实施方案中，从其分离细胞的受试者是患有疾病或病况或需要细胞疗法、或将向其施用细胞疗法的受试者。在一些实施方案中，受试者是需要特定治疗干预(诸如为其对细胞进行分离、加工和/或工程化的过继细胞疗法)的人。
因此，在一些实施方案中，所述细胞是原代细胞，例如原代人细胞。样品包括直接取自受试者的组织、流体和其它样品，以及来自一个或更多个加工步骤(诸如分离、离心、基因工程化(例如用病毒载体转导)、洗涤和/或孵育)的样品。生物样品可以是直接从生物来源获得的样品或经过加工的样品。生物样品包括但不限于体液(诸如血液、血浆、血清、脑脊液、滑液、尿液和汗液)、组织和器官样品，包括由其衍生的经加工的样品。
在一些方面，细胞从其中衍生或分离的样品是血液或血液衍生的样品，或者源自单采术或白细胞分离术产物。示例性样品包括全血、外周血单核细胞(PBMC)、白细胞、骨髓、胸腺、组织活检、肿瘤、白血病、淋巴瘤、淋巴结、肠相关淋巴组织、粘膜相关淋巴组织、脾、其它淋巴组织、肝、肺、胃、肠、结肠、肾、胰腺、乳房、骨、前列腺、子宫颈、睾丸、卵巢、扁桃体或其它器官和/或由其衍生的细胞。在细胞疗法(例如过继细胞疗法)的背景下，样品包括来自自体和同种异体来源的样品。
在一些实施方案中，所述细胞衍生自细胞系，例如T细胞系。在一些实施方案中，所述细胞获得自异种来源，例如自小鼠、大鼠、或非人灵长类动物。
在一些实施方案中，洗涤从受试者收集的血细胞，例如以去除血浆级分并将细胞置于适当的缓冲液或介质中以用于随后的加工步骤。在一些实施方案中，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤所述细胞。在一些实施方案中，洗涤溶液缺乏钙和/或镁和/或许多或所有二价阳离子。在一些方面，通过半自动化“流通式”离心完成洗涤步骤。在一些方面，通过切向流过滤(TFF)完成洗涤步骤。在一些实施方案中，洗涤后将细胞重悬于多种生物相容性缓冲液，诸如，例如不含Ca2+/Mg2+的PBS。在某些实施方案中，去除血细胞样品的组分并将所述细胞直接重悬于培养基中。在一些实施方案中，所述方法包括基于密度的细胞分离方法，如通过裂解红细胞并通过Percoll或Ficoll梯度进行离心来从外周血制备白细胞。
在一些实施方案中，所述方法包括以下的一个或更多个步骤：例如，从患者血液中分离T细胞；用病毒载体转导群体T细胞，所述病毒载体包括编码基因工程化的抗原受体的核酸构建体；体外扩增经转导的细胞；和/或将扩增的细胞输注至患者，在那里工程化的T细胞将寻找并破坏抗原阳性的肿瘤细胞。在一些实施方案中，核酸构建体还包括编码抑制蛋白的序列。在一些实施方案中，这些工程化的T细胞可以阻断PD-1/PD-L1免疫抑制并增强抗肿瘤免疫应答。在一些实施方案中，所述方法还包括：用含有核酸构建体的病毒载体转染T细胞。
在一些实施方案中，所述方法涉及将本文所描述的任何载体体外或离体引入细胞中。在一些实施方案中，载体是病毒载体，并且所述引入通过转导来进行。在一些实施方案中，所述方法还涉及将一种或更多种药剂引入细胞中，其中所述一种或多种药剂中的每一种独立地能够诱导T细胞受体α链恒定区(TRAC)基因和/或T细胞受体β链恒定区(TRBC)基因的遗传破坏。在一些实施方案中，所述一种或更多种药剂是抑制核酸(例如siRNA)。在一些实施方案中，所述一种或更多种药剂是包含DNA靶向蛋白和核酸酶或RNA指导的核酸酶的融合蛋白(例如，成簇的规律间隔短回文核酸(CRISPR)相关的核酸酶)。
本领域技术人员可以通过使用任何标准方法，诸如磷酸钙、电穿孔、脂质体介导的转移、显微注射、生物弹道颗粒递送系统或任何其它已知方法来实现T细胞的转染。在一些实施方案中，使用磷酸钙方法进行T细胞的转染。根据本文所描述的各种实施方案，本公开提供了针对肿瘤、特别是EBV相关癌症的免疫疗法。在一些实施方案中，工程化的T细胞识别肿瘤相关的EBV抗原，并且同时分泌阻断程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)和TGFβ的单链抗体(scFv)融合蛋白。这些工程化T细胞表现出更强的抗肿瘤反应和减少的T细胞耗竭。实验上已经发现，PD-1检查点阻断在本文所描述的方法中更有效，因为抗PD-1药剂递送定位于肿瘤部位，因此在肿瘤部位具有更高的浓度。而且，由于抗PD-1药物递送定位于肿瘤部位，因此降低了由于非特异性炎症引起的毒性。本公开提供了与现有替代方案相比，抗-EBV TCR和抗PD-1抗体的组合改善了T细胞激活和/或防止了T细胞耗竭。
本公开提供了创建个性化抗肿瘤免疫疗法的方法。基因工程化的抗LMP2 T细胞可以从患者的血细胞中产生。然后，将这些工程化的T细胞作为细胞疗法产品重新输注至患者。这种产品可以施加至患有EBV相关肿瘤的任何患者，包括但不限于鼻咽癌、霍奇金氏淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤和胃癌。
制备工程化的细胞并将这些工程化的细胞施用至受试者的方法是本领域已知的，并且描述于例如美国专利号10,174,098和Draper等人"Targeting Of HPV-16+EpithelialCancer Cells By Tcr Gene Engineered t Cells Directed Against e6."ClinicalCancer Research 21.19(2015):4431-4439，前述的每一者通过引用以其整体并入。
治疗方法
本文公开的方法可以用于各种治疗目的。在一个方面，本公开提供了用于治疗受试者中的癌症的方法、降低受试者中肿瘤体积随时间增加的速率的方法、降低发展转移的风险的方法、或降低受试者中发展额外的转移的风险的方法。在一些实施方案中，治疗可以停止、减慢、延缓或抑制癌症的进展。在一些实施方案中，治疗可以导致受试者中癌症的一种或更多种症状的数量、严重程度和/或持续时间的减少。
在一个方面，本公开的特征在于方法，其包括将治疗有效量的表达TCR、其抗原结合片段和TCR衍生的结合分子的工程化细胞施用至有需要的受试者(例如，患有或鉴定为或诊断为患有癌症的受试者)，例如EBV相关的癌症。在一些实施方案中，EBV相关的癌症是鼻咽癌、霍奇金氏淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤和胃癌。
在一些实施方案中，所述受试者患有实体瘤。在一些实施方案中，所述受试者患有乳腺癌(例如三阴性乳腺癌)、类癌、宫颈癌、子宫内膜癌、神经胶质瘤、头颈癌、肝癌、肺癌、小细胞肺癌、淋巴瘤、黑色素瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、结直肠癌、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌、膀胱癌、尿道癌或血液系统恶性肿瘤。在一些实施方案中，所述癌症是不可切除的黑色素瘤或转移性黑色素瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、小细胞肺癌(SCLC)、膀胱癌或转移性激素难治性前列腺癌。
在一些实施方案中，本文公开的组合物和方法可以用于治疗处于癌症的风险的患者。患有癌症的患者可以通过本领域已知的各种方法来鉴定。
此外，本公开提供了用于治疗受试者中的感染或感染相关病况的方法。在一些实施方案中，治疗可以停止、减慢、延缓或抑制疾病的进展。这些方法通常涉及将治疗有效量的本文公开的基因工程化细胞施用至有需要的受试者。在一些实施方案中，治疗的疾病或病况是传染性疾病或病况，诸如但不限于病毒、逆转录病毒、细菌和原生动物感染、免疫缺陷、人乳头瘤病毒(HPV)、巨细胞病毒(CMV)、爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)、腺病毒、BK多瘤病毒。在一些实施方案中，所述疾病是EBV感染。
如本文所用，“有效量”意指足以实现有益或期望结果(包括停止、减慢、延缓或抑制疾病(例如癌症)的进展)的量或剂量。有效量将根据例如将要向其施用治疗剂和/或治疗组合物的受试者的年龄和体重、症状的严重程度和施用途径而变化，并且因此可以在个体基础上确定施用。
有效量可以在一次或更多次给药中进行施用。举例来说，组合物的有效量是足以改善、停止、稳定、逆转、抑制、减慢和/或延迟患者中的癌症的进展的量，或者是足以在体外改善、停止、稳定、逆转、减慢和/或延迟细胞(例如，活检的细胞、本文所描述的任何癌细胞、或细胞系(例如癌细胞系))的增殖的量。如本领域中所理解的，有效量可以根据尤其是患者病史以及其它因素如所使用的组合物的类型(和/或剂量)而变化。
可以根据经验地确定施用的有效量和时间表，并且进行这种确定在本领域技术范围内。本领域技术人员将理解，必须施用的剂量将根据例如将接受治疗的哺乳动物、施用途径、向哺乳动物施用的治疗剂和其它药物的特定类型而变化。选择适当剂量的指南可以在文献中找到。此外，治疗不一定导致对疾病或病况的100％或完全治疗或预防。有多种具有不同程度的治疗效果的治疗/预防方法可用，本领域普通技术人员将其视为潜在有利的治疗手段。
在一些方面，本公开还提供了诊断哺乳动物中的疾病/病况的方法，其中使所述TCR、抗原结合片段、TCR衍生的结合分子与从受试者获得的一个或更多个样品相互作用以形成复合体，其中所述样品可以包含一种或更多种细胞、多肽、蛋白质、核酸、抗体或抗原结合部分、血液、全细胞、其裂解物或全细胞裂解物的一部分，例如细胞核或细胞质部分、全蛋白部分或其核酸部分，其中复合体的检测指示哺乳动物中病况的存在，其中所述病况是癌症、EBV感染或EBV阳性初癌。此外，对复合体的检测可为许多本领域已知的方式，但不限于ELISA、流式细胞术、萤光原位杂交(FISH)、聚合酶链反应(PCR)、微阵列、Southern印迹、电泳、噬菌体分析、色谱等。因此，治疗方法可以还包括例如通过确定受试者是否患有EBV感染或EBV相关的癌症来确定受试者是否可以从本文公开的治疗中受益。
在本文所述的任何方法中，工程化细胞和、和/或至少一种另外的治疗剂可以每周至少一次(例如，每周一次、每周两次、每周三次、每周四次、每天一次、每天两次或每天三次)施用至受试者。在一些实施方案中，将至少两种不同的工程化细胞(例如表达不同结合分子的细胞)在同一组合物(例如液体组合物)中施用。在一些实施方案中，将工程化细胞和至少一种另外的治疗剂在同一组合物(例如液体组合物)中施用。在一些实施方案中，将工程化细胞和至少一种另外的治疗剂在两种不同的组合物中施用。在一些实施方案中，将所述至少一种另外的治疗剂以丸剂、片剂或胶囊剂施用。在一些实施方案中，将所述至少一种另外的治疗剂以缓释口服制剂施用。
在一些实施方案中，可以在将工程化细胞施用至受试者之前、同时或之后，将一种或更多种另外的治疗剂施用至受试者。
在一些实施方案中，可以将一种或更多种另外的治疗剂施用至受试者。所述另外的治疗剂可以是检查点抑制剂(CPI)。在一些实施方案中，检查点抑制剂是抑制蛋白，例如抗体或其抗原结合片段。检查点抑制剂可以抑制或阻断一种或更多种免疫检查点，包括例如，PD-1、PD-L1、PD-L2、2B4(CD244)、4-1BB、A2aR、B7.1、B7.2、B7-H2、B7-H3、B7-H4、B7-H6、BTLA、嗜乳脂蛋白、CD160、CD48、CTLA4、GITR、gp49B、HHLA2、HVEM、ICOS、ILT-2、ILT-4、KIR家族受体、LAG-3、OX-40、PIR-B、SIRPα(CD47)、TFM-4、TIGIT、TIM-1、TIM-3、TIM-4、VISTA及其组合。在一些实施方案中，抑制蛋白阻断PD-1或PD-Ll。在各种实施方案中，抑制蛋白包含抗PD-1scFv。抑制蛋白能够导致群体中T细胞中PD-1或PD-L1的表达降低和/或抑制PD-1或PD-L1的上调、和/或在物理上阻碍PD-1/PD-L1复合体的形成和随后的信号转导。在一些实施方案中，抑制蛋白阻断PD-1。在一些实施方案中，另外的治疗剂是抗OX40抗体、抗PD-L1抗体、抗PD-L2抗体、抗LAG-3抗体、抗TIGIT抗体、抗BTLA抗体、抗CTLA-4抗体、或抗GITR抗体。在一些实施方案中，另外的治疗剂是抗CTLA4抗体(例如伊匹单抗(ipilimumab))、抗CD20抗体(例如利妥昔单抗(rituximab))、抗EGFR抗体(例如西妥昔单抗(cetuximab))、抗CD319抗体(例如埃罗妥珠单抗(elotuzumab))或抗PD1抗体(例如纳武单抗(nivolumab))。
在一些实施方案中，另外的治疗剂是双功能陷阱融合蛋白。双功能陷阱蛋白可以靶向免疫检查点和TGF-β负调控途径二者。除了免疫检查点的表达以外，肿瘤微环境还含有其它免疫抑制分子。特别令人感兴趣的是在癌症中具有多种功能的细胞因子TGF-β(TGFB)。TGF-β在肿瘤发展的早期阻止肿瘤细胞的增殖并促进分化和细胞凋亡。然而，在肿瘤进展期间，由于TGF-β受体表达的丧失或下游信号传导元件的突变而引起肿瘤TGF-β不敏感性。然后，TGF-β通过其对血管生成、上皮-间充质转化(EMT)的诱导和免疫抑制的作用来促进肿瘤进展。高的TGF-β血清水平和在肿瘤上TGF-β受体(TGFβR)表达的丧失与不良预后相关。TGFβ靶向疗法已展示出有限的临床活性。在一些实施方案中，双功能陷阱蛋白靶向PD-1和TGF-β二者。在一些实施方案中，双功能陷阱蛋白靶向PD-L1和TGF-β二者。在一些实施方案中，双功能融合蛋白设计成阻断PD-L1和隔绝TGF-β。基于人IgG1单克隆抗体(mAb)阿维鲁单抗，M7824(MSB0011395C)包含与人抗PD-L1 scFv的C末端连接的人TGF-β受体II(TGFβRII)的细胞外结构域。在一些实施方案中，双功能融合蛋白包含与人抗PD-1scFv的C末端连接的人TGF-β受体II(TGFβRII)的细胞外结构域。这些双功能陷阱融合蛋白描述于例如Knudson,等人"M7824,a novel bifunctional anti-PD-L1/TGFβTrap fusion protein,promotesanti-tumor efficacy as monotherapy and in combination with vaccine."Oncoimmunology 7.5(2018):e1426519；其通过引用以其整体并入本文。在一些实施方案中，用表达本文所描述的TCR或抗原结合分子的细胞和一种或更多种双功能陷阱融合蛋白治疗受试者。
在一个一些实施方案中，所述另外的治疗剂可以包含选自由以下组成的组的一种或更多种抑制剂：B-Raf抑制剂、EGFR抑制剂、MEK抑制剂、ERK抑制剂、K-Ras抑制剂、c-Met抑制剂、间变性淋巴瘤激酶(ALK)抑制剂、磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)抑制剂、Akt抑制剂、mTOR抑制剂、PI3K/mTOR双重抑制剂、布鲁顿酪氨酸激酶(BTK)抑制剂、以及异柠檬酸脱氢酶1(IDH1)和/或异柠檬酸脱氢酶2(IDH2)的抑制剂。在一些实施方案中，所述另外的治疗剂是吲哚胺2,3-双加氧酶-1)(IDO1)的抑制剂(例如艾卡哚司他(epacadostat))。在一些实施方案中，所述另外的治疗剂可以包含选自由以下组成的组的一种或更多种抑制剂：HER3抑制剂、LSD1抑制剂、MDM2抑制剂、BCL2抑制剂、CHK1抑制剂、激活的hedgehog信号传导途径的抑制剂，以及选择性地降解雌激素受体的药剂。
在一些实施方案中，所述另外的治疗剂可以包含选自由以下组成的组的一种或更多种治疗剂：曲贝替定(Trabectedin)、白蛋白结合型紫杉醇(nab-paclitaxel)、Trebananib、帕唑帕尼(Pazopanib)、西地尼布(Cediranib)、帕布昔利布(Palbociclib)、依维莫司(everolimus)、氟嘧啶、IFL、瑞格非尼(regorafenib)、Reolysin、力比泰(Alimta)、色瑞替尼(Zykadia)、索坦(Sutent)、坦西莫司(temsirolimus)、阿昔替尼(axitinib)、依维莫司、索拉非尼(sorafenib)、维全特(Votrient)、帕唑帕尼(Pazopanib)、IMA-901、AGS-003、卡博替尼(cabozantinib)、长春氟宁(Vinflunine)、Hsp90抑制剂、Ad-GM-CSF、替莫唑胺(Temazolomide)、IL-2、IFNa、长春碱(vinblastine)、沙利度胺(Thalomid)、达卡巴嗪(dacarbazine)、环磷酰胺、来那度胺(lenalidomide)、氮杂胞苷、来那度胺、硼替佐米(bortezomid)、氨柔比星(amrubicine)、卡非佐米(carfilzomib)、普拉曲沙(pralatrexate)和恩扎妥林(enzastaurin)。
在一些实施方案中，所述另外的治疗剂可以包含选自由以下组成的组的一种或更多种治疗剂：佐剂、TLR激动剂、肿瘤坏死因子(TNF)α、IL-1、HMGB1、IL-10拮抗剂、IL-4拮抗剂、IL-13拮抗剂、IL-17拮抗剂、HVEM拮抗剂、ICOS激动剂、靶向CX3CL1的治疗、靶向CXCL9的治疗、靶向CXCL10的治疗、靶向CCL5的治疗、LFA-1激动剂、ICAM1激动剂和选择素(Selectin)激动剂。
在一些实施方案中，将卡铂(carboplatin)、白蛋白结合型紫杉醇、紫杉醇、顺铂(cisplatin)、培美曲塞(pemetrexed)、吉西他滨(gemcitabine)、FOLFOX或FOLFIRI施用至受试者。在一些实施方案中，所述另外的治疗剂选自天冬酰胺酶、白消安(busulfan)、卡铂、顺铂、柔红霉素(daunorubicin)、阿霉素(doxorubicin)、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、甲氨蝶呤、紫杉醇、利妥昔单抗、长春碱、长春新碱(vincristine)和/或其组合。
组合物和制剂
本公开提供了含有通过本文公开的方法生产的工程化细胞及其群体的组合物(包括药物组合物和治疗组合物)。还提供了用于向受试者(例如患者)施用工程化细胞及其组合物的方法(例如治疗方法)。
提供了包括用于施用的工程化T细胞的组合物，包括药物组合物和制剂，诸如包括用于以给定剂量或其部分施用的细胞数量的单位剂型组合物。药物组合物和制剂可以包括一种或更多种任选的药学上可接受的载体或赋形剂。在一些实施方案中，所述组合物包括至少一种另外的治疗剂。
药学上可接受的载体是指药物组合物中除活性成分以外的成分。药学上可接受的载体不干扰活性成分并且对受试者无毒。药学上可接受的载体可以包括但不限于缓冲液、赋形剂、稳定剂或防腐剂。药物配制是指将不同的物质和/或药剂组合以产生最终药物产品的过程。制剂研究涉及开发患者可接受的药物制剂。另外，是这样的制剂，其处于使得其中所含活性成分的生物活性有效的形式，并且不含对要给予制剂的受试者具有不可接受的毒性的另外的组分。
在一些实施方案中，载体的选择部分地由特定细胞(例如T细胞或NK细胞)和/或由施用方法来确定。多种合适的制剂是可用的。例如，药物组合物可以含有防腐剂。合适的防腐剂可以包括例如对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯甲酸钠和苯扎氯铵。在一些实施方案中，使用两种或更多种防腐剂的混合物。所述防腐剂或其混合物通常以总组合物的约0.0001重量％至约2重量％的量存在。载体描述于例如Remington’s PharmaceuticalSciences第16版,Osol,A.编辑(1980)中。药学上可接受的载体在所用的剂量和浓度下通常对接受者无毒，并且包括但不限于：缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如十八烷基二甲基苄基氯化铵；六甲氯铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖类，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐抗衡离子，诸如钠；金属络合物(例如锌-蛋白质络合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如聚乙二醇(PEG)。
合适的缓冲剂包括例如柠檬酸、柠檬酸钠、磷酸、磷酸钾和各种其它酸和盐。在一些实施方案中，使用两种或更多种缓冲剂的混合物。所述缓冲剂或其混合物通常以总组合物的约0.001重量％至约4重量％的量存在。用于制备可施用的药物组合物的方法是已知的。示例性方法更详细地描述于例如Remington:The Science and Practice ofPharmacy,Lippincott Williams&Wilkins；第21版(2005年5月1日)。
制剂可以包括水性溶液。所述制剂或组合物还可以含有多于一种可用于正在用工程化细胞治疗的特定适应症、疾病或病况的活性成分，优选地具有与所述细胞互补的活性的那些成分，其中各自的活性不会彼此不利地影响。此类活性成分以有效用于预期目的的量适当地组合存在。因此，在一些实施方案中，药物组合物还可以包括其它药物活性药剂或药物，诸如检查点抑制剂、融合蛋白、化学治疗剂，例如天冬酰胺酶、白消安、卡铂、顺铂、柔红霉素、阿霉素、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、甲氨蝶呤、紫杉醇、利妥昔单抗、长春碱和/或长春新碱。
在一些实施方案中，药物组合物含有有效治疗或预防疾病或病况的量(诸如治疗有效量或预防有效量)的细胞。在一些实施方案中，通过定期评价所治疗的受试者来监测治疗或预防功效。所需剂量可以通过细胞的单次推注(bolus)施用、通过细胞的多次推注施用或通过细胞的连续输注施用来递送。
细胞和组合物可以使用标准给药技术、制剂和/或装置来施用。所述细胞的施用可以是自体的或异源的。例如，免疫应答T细胞或祖细胞可以获得自一名受试者，并且在根据本文所描述的各种实施方案对其进行基因修饰后，将其施用至同一受试者或不同的相容受试者。外周血衍生的免疫应答T细胞或其后代(例如，体内、离体或体外衍生的)可以通过局部注射施用，包括导管施用、全身注射、局部注射、静脉内注射或肠胃外施用。通常，当施用治疗性组合物(例如，含有基因修饰的免疫应答细胞的药物组合物)时，通常将其配制成单位剂量可注射形式(溶液、悬浮液、乳液)。
本文公开的制剂包括用于口服、静脉内、腹膜内、皮下、肺、经皮、肌内、鼻内、经颊、舌下或栓剂施用的那些。在一些实施方案中，肠胃外施用所述细胞群体。如本文所用，术语“肠胃外”包括静脉内、肌内、皮下、直肠、阴道和腹膜内施用。在一些实施方案中，通过静脉内、腹膜内或皮下注射使用外周全身递送将细胞施用至受试者。
在一些实施方案中，组合物作为无菌液体制剂提供，例如等渗水性溶液、悬浮液、乳液、分散体或粘性组合物，其在一些方面中可以被缓冲至选择的pH。液体制剂通常比凝胶、其它粘性组合物和固体组合物更容易制备。另外地，液体组合物稍微更方便施用，特别是通过注射。另一方面，粘性组合物可以配制在适当的粘度范围内，以提供与特定组织的更长的接触时间。液体或粘性组合物可以包含载体，所述载体可以是溶剂或分散介质，例如水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液体聚乙二醇)及其合适的混合物。
无菌可注射溶液可以通过将细胞掺入溶剂中来制备，例如与合适的载体、稀释剂或赋形剂(如无菌水、生理盐水、葡萄糖、右旋糖等)混合。所述组合物可以含有辅助物质，诸如润湿剂、分散剂或乳化剂(例如甲基纤维素)、pH缓冲剂、胶凝或粘度增强添加剂、防腐剂、调味剂和/或颜料，这取决于施用途径和所需的制剂。在一些方面，可以参考标准文本来制备合适的制剂。
可以添加增强所述组合物的稳定性和无菌性的各种添加剂，包括抗微生物防腐剂、抗氧化剂、螯合剂和缓冲剂。可以通过各种抗细菌剂和抗真菌剂如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚和山梨酸来确保防止微生物作用。可以通过使用延迟吸收剂如单硬脂酸铝和明胶来实现可注射药物形式的延长吸收。
用于进行体内施用的制剂通常是无菌的。可以例如通过经无菌滤膜过滤而容易地实现无菌。
本文所述的组合物或药物组合物可以与施用说明书一起包含在容器、包装或分配器中。
施用方法
还提供了施用细胞、群体和组合物的方法，以及此类细胞、群体和组合物治疗或预防疾病、病况和病症(包括癌症)的用途。在一些实施方案中，本文所描述的方法可以降低发生如本文所描述的疾病、病况和病症的风险。
在一些实施方案中，将本文所描述的细胞、群体和组合物施用至受试者或患者，所述受试者或患者患有要例如通过过继细胞疗法(诸如过继T细胞疗法)治疗的特定疾病或病况。在一些实施方案中，将通过所提供的方法制备的细胞和组合物(诸如孵育和/或其它加工步骤后的工程化组合物和最终生产组合物)施用至受试者，诸如患有疾病或病况或处于疾病或病况的风险的受试者。在一些方面，所述方法由此治疗疾病或病况，例如，改善疾病或病况的一种或更多种症状，诸如通过减轻表达由工程化T细胞识别的抗原的癌症中的肿瘤负荷来治疗。
用于施用过继细胞疗法的细胞的方法是已知的，并且可以与所提供的方法和组合物结合使用。例如，过继T细胞疗法的方法描述于例如U.S.2003/0170238；美国专利号4,690,915；Rosenberg,"Cell transfer immunotherapy for metastatic solid cancer—what clinicians need to know."Nature reviews Clinical oncology 8.10(2011):577；Themeli等人"Generation of tumor-targeted human T lymphocytes from inducedpluripotent stem cells for cancer therapy."Nature biotechnology 31.10(2013):928；Tsukahara等人"CD19 target-engineered T-cells accumulate at tumor lesionsin human B-cell lymphoma xenograft mouse models."Biochemical and biophysicalresearch communications 438.1(2013):84-89；Davila等人"CD19 CAR-targeted Tcells induce long-term remission and B Cell Aplasia in an immunocompetentmouse model of B cell acute lymphoblastic leukemia."PloS one 8.4(2013)；前述中的每一者通过引用以其整体并入本文。
在一些实施方案中，通过自体转移进行细胞疗法，例如过继T细胞疗法，其中从要接受细胞疗法的受试者中或从衍生自这样的受试者的样品中分离和/或以其它方式制备T细胞。因此，在一些方面，所述细胞源自于需要治疗的受试者(例如患者)，并且在分离和加工后将所述细胞施用至同一受试者。
在一些实施方案中，通过同种异体转移进行细胞疗法，例如过继T细胞疗法，其中从除要接受或最终接受细胞疗法的受试者以外的受试者(例如第一受试者)分离和/或以其它方式制备T细胞。在此类实施方案中，细胞随后被施用至同一物种的不同受试者(例如第二受试者)。在一些实施方案中，所述第一受试者和第二受试者在遗传上是相同的。在一些实施方案中，所述第一受试者和第二受试者在遗传上是相似的。在一些实施方案中，所述第二受试者与所述第一受试者表达相同的HLA类别或超类型。
在一些实施方案中，鉴定受试者的HLA类别或HLA超类型。在一些实施方案中，用细胞疗法治疗受试者，所述细胞疗法可以在HLA类别或HLA超类型的背景下识别抗原。
在一些实施方案中，在施用细胞或含有细胞的组合物之前，已经用靶向疾病或病况(例如肿瘤)的治疗剂对受试者进行过治疗。在一些方面，受试者对其它治疗剂是难治的或无反应。在一些实施方案中，受试者例如在用另一种治疗性干预进行治疗后具有持续性或复发性疾病，所述治疗性干预包括化学疗法、放射线和/或造血干细胞移植(HSCT)如同种异体HSCT。在一些实施方案中，尽管受试者已经对另一种疗法产生抗性，但施用仍有效地治疗受试者。
在一些实施方案中，受试者对其它治疗剂有反应，并且用所述治疗剂进行治疗降低了疾病负荷。在一些方面，受试者最初对所述治疗剂有反应，但是随着时间的推移展现出疾病或病况的复发。在一些实施方案中，受试者尚未复发。在一些此类实施方案中，确定受试者处于复发的风险中，诸如处于高复发风险中，因此预防性地施用细胞，例如以降低复发的可能性或防止复发。在一些实施方案中，受试者尚未接受用另一种治疗剂的先前治疗。
在一些实施方案中，细胞以所需剂量施用，所述所需剂量在一些方面包括所需剂量或数量的细胞或一种或更多种细胞类型和/或所需比的细胞类型。因此，在一些实施方案中，细胞剂量是基于细胞总数(或每kg体重的数量)和所需的单个群体或亚型的比，诸如CD4+与CD8+的比。在一些实施方案中，细胞剂量是基于所需的单个群体中的细胞或单个细胞类型的总数(或每kg体重的数量)。在一些实施方案中，剂量是基于此类特征的组合，诸如所需的总细胞数、所需比、和所需的单个群体中的细胞总数。
在一些实施方案中，以所需剂量的总细胞(诸如所需剂量的T细胞)的耐受差或在所述耐受差之内施用细胞的群体或亚型(诸如CD8+和CD4+T细胞)。在一些实施方案中，所需剂量是所需细胞数或被施用所述细胞的受试者的每单位体重的所需细胞数，例如细胞/kg。在一些实施方案中，所需剂量等于或高于最小细胞数或每单位体重的最小细胞数。在一些实施方案中，在以所需剂量施用的总细胞中，单个群体或亚型以等于或接近所需输出比(诸如CD4+与CD8+的比)、例如在这种比的一定耐受差或误差内存在。
在一些实施方案中，以所需剂量的一种或更多种单个细胞群体或亚型(诸如所需剂量的CD4+细胞和/或所需剂量的CD8+细胞)的耐受差或在所述耐受差之内施用细胞。在一些实施方案中，所需剂量是所需的所述亚型或群体的细胞数或所需的被施用所述细胞的受试者的每单位体重的此类细胞数，例如细胞/kg。在一些实施方案中，所需剂量等于或高于最小的所述群体或亚型的细胞数或每单位体重的最小的所述群体或亚型的细胞数。
因此，在一些实施方案中，剂量是基于所需的总细胞固定剂量和所需比，和/或基于所需固定剂量的一种或更多种(例如每一种)单个亚型或亚群。因此，在一些实施方案中，剂量是基于所需固定剂量或最小剂量的T细胞和所需的CD4+与CD8+细胞的比，和/或是基于所需固定剂量或最小剂量的CD4+和/或CD8+细胞。
在某些实施方案中，将细胞或细胞的单个群体或亚型以约100万至约1000亿个细胞施用至受试者，诸如，例如100万至约500亿个细胞(例如，约500万个细胞、约2500万个细胞、约5亿个细胞、约10亿个细胞、约50亿个细胞、约200亿个细胞、约300亿个细胞、约400亿个细胞或由前述值中的任两个值所限定的范围)，诸如约1000万至约1000亿个细胞(例如，约2000万个细胞、约3000万个细胞、约4000万个细胞、约6000万个细胞、约7000万个细胞、约8000万个细胞、约9000万个细胞、约100亿个细胞、约250亿个细胞、约500亿个细胞、约750亿个细胞、约900亿个细胞或由前述值中的任两个值所限定的范围)，并且在一些情况下约1亿个细胞至约500亿个细胞(例如，约1.2亿个细胞、约2.5亿个细胞、约3.5亿个细胞、约4.5亿个细胞、约6.5亿个细胞、约8亿个细胞、约9亿个细胞、约30亿个细胞、约300亿个细胞、约450亿个细胞)或在这些范围之间的任何值。
在一些实施方案中，总细胞的剂量和/或单个细胞亚群的剂量在为或约104与为或约109个细胞/千克(kg)体重之间的范围内，诸如在105与106个细胞/kg体重之间，例如至少或至少约或为或约1×105个细胞/kg体重、1.5×105个细胞/kg体重、2×105个细胞/kg体重或1×106个细胞/kg体重。例如，在一些实施方案中，以在为或约104与为或约109个T细胞/千克(kg)体重之间，诸如在105与106个T细胞/kg体重之间，例如，至少或至少约或者为或约1×105个T细胞/kg体重、1.5×105个T细胞/kg体重、2×105个T细胞/kg体重、或1×106个T细胞/kg体重，或在其一定误差范围内施用细胞。
在一些实施方案中，以在为或约104与为或约109个CD4+和/或CD8+细胞/千克(kg)体重之间，诸如在105与106个CD4+和/或CD8+细胞/kg体重之间，例如，至少或至少约或者为或约1×105个CD4+和/或CD8+细胞/kg体重、1.5×105个CD4+和/或CD8+细胞/kg体重、2×105个CD4+和/或CD8+细胞/kg体重、或1×106个CD4+和/或CD8+细胞/kg体重，或在其一定误差范围内施用细胞。
在一些实施方案中，以大于、和/或至少约1×106、约2.5×106、约5×106、约7.5×106、或约9×106个CD4+细胞、和/或至少约1×106、约2.5×106、约5×106、约7.5×106、或约9×106个CD8+细胞、和/或至少约1×106、约2.5×106、约5×106、约7.5×106、或约9×106个T细胞，或在其一定误差范围内施用细胞。在一些实施方案中，以在约108与1012个之间或在约1010与1011个之间的T细胞、在约108与1012个之间或在约1010与1011个之间的CD4+细胞，和/或在约108与1012个之间或在约1010与1011个之间的CD8+细胞，或在其一定误差范围内施用细胞。
在一些实施方案中，以多种细胞群或亚型(诸如CD4+和CD8+细胞或亚型)的所需输出比的耐受范围或在其耐受范围内施用细胞。在一些方面，所需比可以是具体比，或可以是比的范围。例如，在一些实施方案中，所需比(例如，CD4+与CD8+细胞的比)在为或约1:5与为或约5:1之间(或大于约1:5且小于约5:1)，或在为或约1:3与为或约3:1之间(或大于约1:3且小于约3:1)，诸如在为或约2:1与为或约1:5之间(或大于约1:5且小于约2:1)，诸如为或约5:1、4.5:1、4:1、3.5:1、3:1、2.5:1、2:1、1.9:1、1.8:1、1.7:1、1.6:1、1.5:1、1.4:1、1.3:1、1.2:1、1.1:1、1:1、1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5、1:1.6、1:1.7、1:1.8、1:1.9:1:2、1:2.5、1:3、1:3.5、1:4、1:4.5或1:5。在一些方面，耐受差在所需比的约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％内，包括这些范围之间的任何值。在一些方面，本文所描述的TCR提供了改善的表达和活性，从而甚至以低效应物与靶标(E:T)比提供治疗效果。
对疗法的最佳反应可能取决于工程化重组受体如TCR在细胞表面上一致且可靠地表达和/或结合靶抗原的能力。例如，在一些情况下，当在一些情况下在细胞如人T细胞中表达，用于细胞疗法时，某些重组受体如TCR的特性可能影响重组受体的表达和/或活性。在一些情境下，特定重组受体如TCR的表达水平可能很低，并且表达此类重组受体的工程化细胞如人T细胞的活性可能由于表达不良或信号传导活性不佳而受到限制。在一些情况下，重组受体的表达的一致性和/或效率以及受体的活性在可用的治疗方法的某些细胞或某些细胞群中受到限制。在一些情况下，需要大量的工程化T细胞(高的效应物与靶标(E:T)比)来展现出功能活性。在一些实施方案中，所需比(E:T比)在为或约1:10与为或约10:1之间(或大于约1:10且小于约10:1)、或在为或约1:1与为或约10:1之间(或大于约1:1且小于约5:1)，诸如在为或约2:1与为或约10:1之间。在一些实施方案中，E:T比为大于或约1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、或10:1。
为了预防或治疗疾病，适当的剂量可能取决于要治疗的疾病类型、细胞或重组受体的类型、疾病的严重程度和病程、细胞是否针对预防或治疗目的而被施用、先前疗法、受试者的临床病史和对细胞的反应以及主治医师的决断。在一些实施方案中，适合将组合物和细胞一次或在一系列治疗中施用至受试者。
本文所描述的细胞可以通过任何合适的手段施用，例如通过推注输注，通过注射，例如静脉内或皮下注射、眼内注射、眼周注射、视网膜下注射、玻璃体内注射、经中隔注射、巩膜下注射、脉络膜内注射、前房注射、结膜下(subconjectval)注射、结膜下(subconjuntival)注射、眼球筋膜囊下(sub-Tenon)注射、球后注射、球周注射或后近巩膜(posterior juxtascleral)递送。在一些实施方案中，其通过肠胃外、肺内和鼻内来施用，以及如果需要用于局部治疗的话病灶内施用。肠胃外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。在一些实施方案中，将给定剂量通过细胞的单次推注给药来施用。在一些实施方案中，给定剂量通过细胞的多次推注给药例如在不超过3天的时间段内来施用，或通过细胞的连续输注给药。
在一些实施方案中，所述细胞作为组合治疗的一部分施用，如与另一种治疗性干预如抗体或工程化细胞或受体或药剂如细胞毒性剂或治疗剂同时施用或以任何顺序依次施用。在一些实施方案中，所述细胞与一种或更多种另外的治疗剂共同施用或与另一种治疗性干预结合施用，同时或以任何顺序依次施用。在一些背景下，将所述细胞与另一种疗法在时间上足够接近地共同施用，使得所述细胞群增强一种或更多种另外的治疗剂的效果，或反之亦然。在一些实施方案中，在一种或更多种另外的治疗剂之前施用细胞。在一些实施方案中，在一种或更多种另外的治疗剂之后施用细胞。在一些实施方案中，一种或更多种另外的药剂包括细胞因子如IL-2，例如以增强持久性。在一些实施方案中，所述方法包括施用化学治疗剂。
在一些实施方案中，在施用细胞后，例如通过许多已知方法中的任一种测量工程化的细胞群体的生物学活性。评价的参数包括工程化T细胞与抗原体内(例如通过成像)或体外(例如通过ELISA或流式细胞术)的特异性结合。在某些实施方案中，可以使用本领域已知的任何合适的方法测定工程化细胞破坏靶细胞的能力，所述方法诸如描述于例如Kochenderfer等人"Construction and pre-clinical evaluation of an anti-CD19chimeric antigen receptor."Journal of immunotherapy(Hagerstown,Md.:1997)32.7(2009):689和Hermans等人"The VITAL assay:a versatile fluorometric techniquefor assessing CTL-and NKT-mediated cytotoxicity against multiple targets invitro and in vivo."Journal of immunological methods 285.1(2004):25-40。在某些实施方案中，通过测量一种或更多种细胞因子如CD107a、IFNγ、IL-2和TNF的表达和/或分泌来测量细胞的生物活性。在一些方面，通过评价临床结果(诸如肿瘤负荷或负担的减少)来测量生物活性。
给药时间表和治疗方案
提供了重复给药方法，其中给予第一剂量的细胞，随后给予一个或更多个第二连续剂量。当以过继疗法方法施用至受试者时，通常设计细胞的多个剂量的时间安排和大小以增加如本文所描述的工程化细胞的功效和/或活性和/或功能。在一些实施方案中，重复给药减少了当抑制性免疫分子(诸如PD-1和/或PD-L1)在工程化T细胞上被上调时可能发生的下调或抑制活性。所述方法涉及施用第一剂量，通常随后是一个或更多个连续剂量，在不同剂量之间具有特定的时间范围。
在过继细胞疗法的情境下，给定“剂量”的施用包括作为单一组合物和/或单次不间断给药的方式(例如作为单次注射或连续输注)施用给定量或数量的细胞，并且还涵盖在指定时间段(例如不超过3天)内以在多种单独组合物或多次单独输注中提供的分割剂量的方式施用给定量或数量的细胞。因此，在一些情境下，第一或连续剂量是在单个时间点给予或开始的指定数量的细胞的单次或连续施用。然而，在一些情境下，将第一或连续剂量在受限的时间段(例如不超过三天)内以多次注射或输注的方式施用，诸如每天一次施用持续三天或两天或者通过在一天的时间段内多次输注的方式施用。
第一剂量的细胞以单一药物组合物施用。在一些实施方案中，连续剂量的细胞以单一药物组合物施用。
在一些实施方案中，第一剂量的细胞以共同含有第一剂量的细胞的多种组合物施用。在一些实施方案中，连续剂量的细胞以共同含有连续剂量的细胞的多种组合物施用。在一些方面，可以在不超过3天的时间段内以多种组合物施用另外的连续剂量。
术语“分割剂量”是指被分割使得其可以在超过一天的时间内施用的剂量。这种类型的给药涵盖在本发明的方法中，并且被认为是单剂量。因此，在一些实施方案中，第一剂量和/或一个或更多个连续剂量可以作为分割剂量施用。例如，在一些实施方案中，可以在2天或3天内将剂量施用至受试者。用于分割给药的示例性方法包括在第一天施用25％的剂量并在第二天施用剩余75％的剂量。在其它实施方案中，可以在第一天施用第一剂量的33％并且在第二天施用剩余的67％。在一些方面，在第一天施用10％的剂量，在第二天施用30％的剂量，并且在第三天施用60％的剂量。在一些实施方案中，分割剂量分布不超过3天内。
关于先前剂量，诸如第一剂量，术语“连续剂量”是指在先前(例如第一)剂量之后暂时没有向受试者施用任何介入剂量的情况下向同一受试者施用的剂量。但是，所述术语不涵盖在单个分割剂量内包含的一系列输注或注射中的第二次、第三次和/或等等注射或输注。因此，除非另有说明，否则在一天、两天或三天时间段内的第二次输注不被视为如本文所用的“连续”剂量。同样，在“连续”剂量的意义的情境下，在分割剂量内的一系列多次剂量中的第二次、第三次等等也不被视为“介入”剂量。因此，除非另有说明，否则只要在第一或先前剂量开始后的三天时间段内发生了第二次或随后的注射或输注，即使受试者在第一剂量开始后接受了细胞的第二次或随后的注射或输注，在开始第一或先前剂量之后大于三天的一定时间段内施用的剂量都被视为“连续”剂量。
因此，除非另有说明，否则在长达3天的时间段内多次施用相同细胞被视为单一剂量，并且在初次施用的3天内施用细胞不被视为连续剂量，并且也不被视为出于确定第二剂量是否与第一剂量“连续”的目的使用的介入剂量。
在一些实施方案中，在一些方面使用与关于第一剂量和第一连续剂量之间的时间安排的相同的时间安排指南，例如通过施用第一剂量和多个连续剂量来给予多个连续剂量，其中在抑制性免疫分子如PD-1和/或PD-L1已在受试者的细胞中从所施用的第一剂量开始被上调的一个时间段内给予每个连续剂量。诸如通过评价在来自外周血或其它体液的抗原表达细胞诸如TCR表达细胞中PD-1和/或PD-L1的水平来凭经验确定何时提供连续剂量是在本领域技术人员的水平之内。
在一些实施方案中，在第一剂量与第一连续剂量、或者第一与多个连续剂量之间的时间安排为使得在大于约5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天或更长时间的时间段内给予每个连续剂量。在一些实施方案中，在施用第一剂量或紧接先前剂量之后少于约28天的时间段内给予连续剂量。另外的多个另外一个或更多个连续剂量也被称为后续剂量或后续连续剂量。
将细胞的第一剂量和/或一个或多个连续剂量的大小通常设计为提供改善的功效和/或降低的毒性风险。在一些方面，第一剂量或任何连续剂量的剂量量或大小是如上所述的任何剂量或量。在一些实施方案中，在第一剂量或任何连续剂量中的细胞数在约0.5×106个细胞/kg受试者体重与5×106个细胞/kg之间、在约0.75×106个细胞/kg与3×106个细胞/kg之间、或在约1×106个细胞/kg与2×106个细胞/kg之间。
如本文所用，“第一剂量”用于描述在施用连续或后续剂量之前的给定剂量的时间安排。所述术语不一定暗示受试者先前从未接受过一定剂量的细胞疗法或，或者甚至受试者先前没有接受过一定剂量的相同细胞或表达相同重组受体或靶向相同抗原的细胞。
在一些实施方案中，可以在延长的时间段内(例如，在至少1周、2周、3周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、1年、2年、3年、4年或5年的时间段内)向受试者施用多个剂量。熟练的医疗专业人员可以使用本文所描述的用于诊断或跟踪治疗的有效性(例如观察癌症的至少一种症状)的任何方法来确定治疗期的长度。
在一些实施方案中，由连续剂量中的细胞表达的工程化受体(例如TCR)含有至少一个免疫反应性表位作为由第一剂量的细胞表达的受体(例如TCR)。在一些实施方案中，由在连续剂量中施用的细胞表达的受体(例如TCR)与由第一剂量表达的受体(例如TCR)相同，或者与由在第一剂量中施用的细胞表达的受体(例如TCR)基本上相同。
由以各种剂量施用至受试者的细胞表达的受体(例如TCR)通常识别或特异性结合在所治疗的疾病或病况或其细胞中表达、与所治疗的疾病或病况或其细胞相关和/或对所治疗的疾病或病况或其细胞具有特异性的分子。在与分子(例如抗原)特异性结合后，受体通常将免疫刺激信号(诸如ITAM转导的信号)递送到细胞中，从而促进针对疾病或病况的免疫应答。例如，在一些实施方案中，第一剂量中的细胞表达特异性结合所表达的抗原的TCR。
实施例
在以下实施例中进一步描述本发明，所述实施例并不限制权利要求书中所描述的本发明的范围。
实施例1：材料和方法
构建体设计
对于LMP2 TCR-T细胞，使用标准分子生物学技术产生含有2个编码区的pMP71逆转录病毒载体构建体。如图1中所示，逆转录病毒载体构建体含有两个通过P2A序列连接的基因：(1)与小鼠TCRα链的恒定区融合的人抗LMP2TCR的α链的可变区；(2)与小鼠TCRβ链的恒定区融合的同一人抗LMP2 TCR的β链的可变区。将构建体克隆到pMP71逆转录病毒载体中以产生TCR-T细胞。
细胞系和培养基
从ATCC获得HEK-293T、HMy2.CIR和K562细胞。从Hemacare获得来自匿名供体的外周血单核细胞(PBMC)。HMy2.CIR-A2细胞是通过用过度表达人HLA-A2的载体逆转录病毒转导HMy2.CIR细胞而产生的。
K562-A11和K562-A24细胞是通过用分别过度表达人HLA-A11和HLA-A24的载体逆转录病毒转导K562细胞而产生的。将细胞在DMEM+10％FBS、RPMI+10％ FBS或X-Vivo+5％人血清A/B中培养。
逆转录病毒载体生产
通过使用标准磷酸钙沉淀方案瞬时转染HEK-293T细胞来制备逆转录病毒载体。在48小时时收获病毒上清液并将其用于转导T细胞。
Jurkat/T细胞转导和扩增
在逆转录病毒转导之前，通过与T细胞激活珠和人IL-2一起培养将PBMC激活2天。为进行转导，通过在32℃下以2,000g离心2小时，将新鲜收获的逆转录病毒上清液旋转加载到用每孔15μg RetroNectin(Clontech Laboratories)包被的非组织培养物处理的24孔板上。将激活的PBMC加载到板上并在32℃下以600g旋转30分钟。将Jurkat或T细胞在37℃和5％ CO2下孵育。每2天补充一次培养基。
TCR染色
从BioLegend,Inc.获得所有抗体。在转导后48小时，通过对小鼠TCRβ链进行抗体染色，然后进行流式细胞术来检测重组TCR的表达。进行CD3和/或CD8染色。
TCR-Jurkat细胞中CD69表达
将TCR-Jurkat细胞与指定的肽脉冲的APC共培养过夜，其后通过流式细胞术测量细胞表面CD69。分析分选的CD3+TCR+细胞。
体外TCR-T IFN-γ生产
将TCR-T细胞与指定的肽抗原脉冲的APC(K562-A2、K562-A11或K562-A24)共培养过夜，其后通过流式细胞术测量细胞内IFN-γ表达。分析分选的CD3+CD8+细胞。
EC50确定
将TCR-T细胞与过度表达HLA-A11或HLA-A24的K562细胞共培养过夜，并且用增加的浓度的LMP2肽脉冲。将TCR-T细胞和APC以1:1效应物与靶比共培养，其后收集T细胞并测量细胞内IFN-γ表达以确定EC50。
实施例2.抗LMP2 TCR的序列
图2中示出各种HLA-A2型抗LMP2 TCR的α链可变结构域和β链可变结构域的CDR1、CDR2和CDR3的序列。HLA-A2型抗LMP2 TCR包括靶向LMP2蛋白的氨基酸356-364的L2-1、L2-2、L2-3、L2-4、L2-5、L2-6、L2-9、L2-10、L2-11、L2-12、L2-13、L2-16、L2-19、L2-23、L2-24和L2-25。HLA-A2型抗LMP2 TCR还包括靶向LMP2蛋白的氨基酸426-434的L208。
图3中示出三种HLA-A11型抗LMP2 TCR的α链可变结构域和β链可变结构域的CDR1、CDR2和CDR3的序列。HLA-A11型抗LMP2 TCR包括靶向LMP2蛋白的氨基酸340-349的L11-3、L11-6和L11-15。HLA-A11型抗LMP2TCR还包括靶向LMP2蛋白的氨基酸340-349的L11-20和L11-22。
图4中示出三种HLA-A24型抗LMP2 TCR的α链可变结构域和β链可变结构域的CDR1、CDR2和CDR3的序列。HLA-A24型抗LMP2 TCR包括靶向LMP2蛋白的氨基酸222-230的L24-49和L24-2。HLA-A24型抗LMP2 TCR还包括靶向LMP2蛋白的氨基酸419-427的L24-3、L24-5、L24-13和L24-21。
实施例3.HLA-A2型抗LMP2 TCR的体外表达
通过流式细胞术测量HLA-A2型抗LMP2 TCR的体外表达。如图5A-5C中所示，Jurkat细胞为未转导(UT)的，或被转导以表达L2-3、L2-9、L2-10、L2-19、L2-5、L2-6、L2-11、L2-12、L2-16、L2-23、L2-24或L2-25重组TCR。在如图5D中所示的单独的实验中，原代人T细胞为未转导(UT)的，或被转导以表达L2-1、L2-2或L2-13重组TCR。通过在转导后2天对小鼠TCRβ链进行染色来测量TCR表达。图5A-5D中的结果指示，HLA-A2型抗LMP2 TCR在人T细胞中强烈表达。
在如图5E中所示的单独的实验中，原代人T细胞为未转导(UT)的，或被转导以表达L208重组TCR。通过在转导后11天对小鼠TCRβ链进行染色来测量TCR表达。图5E中的结果指示，HLA-A2型抗LMP2 TCR L208在人T细胞中强烈表达。
实施例4.抗原特异性刺激后的HLA-A2型抗LMP2 TCR-T细胞激活
通过流式细胞术确定抗原特异性刺激后的HLA-A2型抗LMP2 TCR-T细胞激活。如图6A-6C中所示，将未转导(UT)的Jurkat细胞或被转导以表达L2-3、L2-9、L2-10、L2-19、L2-5、L2-6、L2-11、L2-12、L2-16、L2-23、L2-24或L2-25重组TCR的Jurkat细胞与肽FLYALALLL(或LMP2蛋白的氨基酸356-364；SEQ ID NO:139)脉冲的抗原呈递细胞(APC)共培养过夜，其后通过流式细胞术测量表面CD69表达。图6A-6C中的结果指示，HLA-A2型TCR-T细胞可在体外抗原特异性刺激后激活。
如图6D中所示，还通过测量激活的TCR-T细胞中的细胞内IFN-γ表达来确定抗原特异性刺激后的HLA-A2型抗LMP2 TCR-T细胞激活。更具体地，将未转导(UT)的T细胞或表达L2-1、L2-2或L2-13重组TCR的TCR-T细胞(PBMC T细胞)与肽FLYALALLL(SEQ ID NO:139)脉冲的APC共培养过夜。然后收集T细胞，并且通过流式细胞术测量细胞内IFN-γ表达。图6D中的结果指示，如通过细胞内IFN-γ表达所测量的，表达HLA-A2型抗LMP2 TCR的TCR-T细胞由同源抗原特异性激活。
更具体地，将未转导(UT)的T细胞或表达L208重组TCR的TCR-T细胞(PBMC T细胞)与突变型肽SLGGLLTMV(SEQ ID NO:168)脉冲的APC共培养过夜。然后收集T细胞，并且通过流式细胞术测量细胞内IFN-γ表达。图6E中的结果指示，如通过细胞内IFN-γ表达所测量的，表达HLA-A2型抗LMP2TCR L208的TCR-T细胞由来自LMP2蛋白的突变型肽特异性激活。
测定同源野生型和突变型LMP2肽的半最大有效浓度(EC50)。具体地，将表达L208重组TCR的TCR-T细胞与增加的浓度的野生型LMP2肽CLGGLLTMV(SEQ ID NO:167)或突变型LMP肽SLGGLLTMV(SEQ ID NO:168)脉冲的APC以1:1效应物与靶细胞比共培养过夜。然后收集T细胞，并且测量细胞内IFN-γ表达以确定EC50。如图6F-6G中所示，结果显示表达HLA-A2型抗LMP2 TCR L208的TCR-T细胞识别用野生型或突变型LMP2肽以低于1μg/ml的EC50脉冲的APC。例如，在一个实验中(图6F)，野生型肽的EC50为0.03923μg/ml，并且突变型肽的EC50为0.01826μg/ml。在不同的实验中(图6G)，野生型肽的EC50为0.2605μg/ml，并且突变型肽的EC50为0.1252μg/ml。
实施例5.HLA-A11型抗LMP2 TCR的体外表达
通过流式细胞术测量HLA-A11型抗LMP2 TCR的体外表达。如图7A-7B中所示，原代人T细胞为未转导(UT)的，或被转导以表达L11-3、L11-6、L11-15、L11-20或L11-22重组TCR。通过在转导后2天对小鼠TCRβ链进行染色来测量TCR表达。图7A-7B中的结果指示，HLA-A11型抗LMP2 TCR在人T细胞中强烈表达。
实施例6.抗原特异性刺激后的HLA-A11型抗LMP2 TCR-T细胞激活
通过流式细胞术确定抗原特异性刺激后的HLA-A11型抗LMP2 TCR-T细胞激活。如图8A-8B所示进行实验，其中通过测量激活的TCR-T细胞中的细胞内IFN-γ表达来确定抗原特异性刺激后的HLA-A11型抗LMP2 TCR-T细胞激活。更具体地，将未转导(UT)的T细胞或表达L11-3、L11-15或L11-6重组TCR的TCR-T细胞(PBMC T细胞)与肽SSCSSCPLSK(或LMP2蛋白的氨基酸340-349；SEQ ID NO:140)脉冲的APC共培养过夜。然后收集T细胞，并且通过流式细胞术测量细胞内IFN-γ表达。
在图8C-8D中，将未转导(UT)的T细胞或表达L11-20或L11-22重组TCR的TCR-T细胞(PBMC T细胞)与肽SSCSSCPLSK(或LMP2蛋白的氨基酸340-349；SEQ ID NO:140)脉冲的APC共培养过夜，其后通过流式细胞术测量表面CD69表达。
图8A-8D中的结果指示，如通过细胞内IFN-γ表达和CD69所测量的，表达HLA-A11型抗LMP2 TCR的TCR-T细胞通过同源抗原特异性激活。
实施例7.HLA-A11型抗LMP2 TCR的EC50
测定同源LMP2肽的半最大有效浓度(EC50)。具体地，将表达L11-3或L11-6重组TCR的TCR-T细胞与增加的浓度的LMP2肽SSCSSCPLSK(SEQ ID NO:140)脉冲的APC以1:1效应物与靶细胞比共培养过夜。然后收集T细胞，并且测量细胞内IFN-γ表达以确定EC50。如图9中所示，结果显示表达HLA-A11型抗LMP2 TCR的TCR-T细胞识别用LMP2肽以nM至μM范围内的EC50脉冲的APC。例如，L11-3的EC50为0.3nM，和L11-6的EC50为2nM。
实施例8.HLA-A24型抗LMP2 TCR的体外表达
通过流式细胞术测量HLA-A24型抗LMP2 TCR的体外表达。如图10A和图10C中所示，原代人T细胞为未转导(UT)的，或被转导以表达L24-49、L24-2、L24-3、L24-13或、24-21重组TCR。在如图10B中所示的单独的实验中，用空载体或编码L24-5重组TCR的载体转导Jurkat细胞。通过在转导后2天对小鼠TCRβ链进行染色来测量TCR表达。
图10A-10C中的结果指示，HLA-A24型抗LMP2 TCR在人T细胞中强烈表达。
实施例9.抗原特异性刺激后的HLA-A24型抗LMP2 TCR-T细胞激活
通过流式细胞术确定抗原特异性刺激后的HLA-A24型抗LMP2 TCR-T细胞激活。如图11A-11B中所示，通过测量激活的TCR-T细胞中的细胞内IFN-γ表达来确定抗原特异性刺激后的HLA-A24型抗LMP2 TCR-T细胞激活。更具体地，将未转导(UT)的T细胞或表达L24-49或L24-2重组TCR的TCR-T细胞(PBMC T细胞)与肽IYVLVMLVL(或LMP2蛋白的氨基酸222-230；SEQ ID NO:141)脉冲的APC共培养过夜(图11A)。在单独的实验中，将未转导(UT)的T细胞或表达L24-3或L24-13重组TCR的TCR-T细胞与肽TYGPVFMCL(或LMP2蛋白的氨基酸419-427；SEQ ID NO:142)脉冲的APC共培养过夜(图11B)。在单独的实验中，将未转导(UT)的T细胞或表达L24-21重组TCR的TCR-T细胞与肽TYGPVFMCL(或LMP2蛋白的氨基酸419-427；SEQ IDNO:142)脉冲的APC共培养过夜(图11C)。然后收集T细胞，并且通过流式细胞术测量细胞内IFN-γ表达。图11A-11C中的结果指示，如通过细胞内IFN-γ表达所测量的，表达HLA-A24型抗LMP2 TCR的TCR-T细胞通过同源抗原特异性激活。
如图11D中所示，将对照(ctrl)Jurkat细胞或被转导以表达L24-5重组TCR的Jurkat细胞与肽TYGPVFMCL(SEQ ID NO:142)脉冲的抗原呈递细胞(APC)共培养过夜，其后通过流式细胞术测量表面CD69表达。图11D中的结构指示，HLA-A24型的TCR-T细胞可在体外抗原特异性刺激后被激活。
实施例10.HLA-A24型抗LMP2 TCR的EC50
测定同源LMP2肽的半最大有效浓度(EC50)。具体地，将表达L24-49或L24-2重组TCR的TCR-T细胞与增加的浓度的LMP2肽IYVLVMLVL(SEQ ID NO:141)脉冲的APC以1:1效应物与靶细胞比共培养过夜。在单独的实验中，将表达L24-3或L24-13重组TCR的TCR-T细胞与增加的浓度的LMP2肽TYGPVFMCL(SEQ ID NO:142)脉冲的APC以1:1效应物与靶细胞比共培养过夜。然后收集T细胞，并且测量细胞内IFN-γ表达以确定EC50。如图12A-12B中所示，结果显示表达HLA-A24型抗LMP2 TCR的TCR-T细胞识别用LMP2肽以nM至μM范围内的EC50脉冲的APC。
实施例11.关于EBV阳性TCR的基序分析
分析在EBV阳性TCR中高度富集的基序。用于查找最重要基序的方法包括TCRdist、支持向量机(SVM)、费希尔精确检验。一旦确定基序，就应用克拉默氏V检验来测量基序与结果之间的关联强度。
首先，利用TCRdist法来寻找最显著富集的基序。具体地，通过编辑两个氨基酸之间的距离来测量最小单位的距离。基于结构域的分析用于测量不同结构域的距离，使得在评分系统中定义CDR2.5(α/β)结构域。整合TCRα链(TRA)和TCRβ链(TRB)用于通过对TCR复合体的不同结构域中的加权得分求和来测量克隆之间的距离。TCRdist算法的详细信息可例如在Dash等人,"Quantifiable predictive features define epitope-specific T cellreceptor repertoires."Nature 547.7661(2017):89-93中找到；其通过引用以其整体并入本文。图13中示出TCRdist分析结果。与所有其它簇中的克隆相比，指定簇中的克隆彼此明显更接近(相似)。
在簇中鉴定了总共30个TCR克隆，并且通过实验将14个测试为阳性克隆。这些阳性克隆可以识别靶表位并激活T细胞。在阳性克隆中鉴定了两个保守的基序，其在TRA的CDR3内为“SGYSTL”，并且在TRB的CDR3内为“QGG”。
其次，利用支持向量机(SVM)来寻找最显著的基序。具体地，在运行SVM之前，使用R包装tcR产生3聚体至5聚体的基序。在“阳性”EBV TCR基序和“阴性”HPV单细胞TCR上运行具有交叉验证的SVM模型。这种模型使用类别权重(class weight)/代价敏感学习(costsensitive learning)来运行。代价敏感学习在训练机器学习模型时考虑了预测误差的代价。利用SVM来提供预测结果的重要变量。然后使用这些高准确度变量来获得曲线下面积(AUC)值和ROC曲线。如图14中所示，SVM分析结果示出排名最高的基序为“QGG”和“TQGG”。
第三，进行费希尔精确检验(或费希尔氏精确检验)和克拉默氏V检验。费希尔氏精确检验是一种检验小细胞大小(预期值小于5)的两个分类变量之间的关联的方法。使用FDR方法调整来自费希尔氏精确检验的P值。小于0.05的调整P值被认为是显著的。克拉默氏V统计是测量两个分类变量之间的关联的相对(强度)的另一种检验。下表描述了克拉默V的值及其关联。
表6
图15中示出费希尔精确和克拉默氏V试验结果。列出排名最高的基序(包括“QGG”和“TQGG”)的P值、通过费希尔精确检验调整的P值和通过克拉默氏V检验的克拉默重要性得分。
总之，在所有上述方法中通过的基序被认为是阳性TCR中的最重要标志物，如图16A-16B中所示。在来自EBV-A02资料集的TCRβ链的CDR3内，基序“QGG”高度富集。在来自EBV-A02资料集的TCRα链的CDR3内，基序“YST”和“SGY”高度富集。如图17A-17C中所示，计算基序“QGG”、“YST”和“SGY”的AUC值。
其它实施方案
应当理解，尽管已经结合本发明的具体实施方式描述了本发明，但是前述描述旨在说明而不限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求书的范围限定。其它方面、优点和修改在所附权利要求书的范围内。

Claims (55)

1.一种T细胞受体(TCR)或其抗原结合片段，其包含含有可变α(Va)区和的α链和含有可变β(Vb)区的β链，其中
(a)所述Va区包含互补决定区1(CDR1)、互补决定区2(CDR2)和互补决定区3(CDR3)，其中所述Va区的所述CDR3包含氨基酸序列X1GX2SGYSTL，其中
所述X1是E、T、Q、V或N，
所述X2是D、G、N或E；和
(b)所述Vb区包含CDR1、CDR2和CDR3，其中所述Vb区的所述CDR3包含氨基酸序列X3X4QGGX5X6X7X8，其中
所述X3是S、T、N或R，
所述X4是T、R、Y、G、V、Q、F、S或P，
所述X5是N、G、H、T、S、A、I或W，
所述X6是Y、N、D、E、R或I，
所述X7是G、Q、N、Y，
所述X8是Y、F、或G。
2.根据权利要求1所述的T细胞受体(TCR)或其抗原结合片段，其中所述Va区由来自人TRAV基因区段和人TRAJ基因区段的重排的序列编码，和所述Vb区由来自人TRBV基因区段、任选地人TRBD基因区段和人TRBJ基因区段的重排的序列编码，其中
所述TRAV基因区段是TRAV17；
所述TRAJ基因区段是TRAJ11；
所述TRBV基因区段是TRBV6-5；
所述TRBD基因区段是TRBD1或TRBD2；和
所述TRBJ基因区段是TRBJ2-1或TRBJ1-2。
3.根据权利要求1或2所述的T细胞受体(TCR)或其抗原结合片段，其中所述Va CDR1区包含与TSINN(SEQ ID NO:1)为至少80％同一性的氨基酸序列，所述Va CDR2区包含与IRSNERE(SEQ ID NO:2)为至少80％同一性的氨基酸序列，所述Vb CDR1区包含与MNHEY(SEQID NO:4)为至少80％同一性的氨基酸序列，和所述Vb CDR2区包含与SVGAGI(SEQ ID NO:5)为至少80％同一性的氨基酸序列。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的T细胞受体(TCR)或其抗原结合片段，
其中所述Va CDR1区包含与选择的Va CDR1氨基酸序列为至少80％同一性的氨基酸序列，所述Va CDR2区包含与选择的Va CDR2氨基酸序列为至少80％同一性的氨基酸序列，所述Va CDR3区包含与选择的Va CDR3氨基酸序列为至少80％同一性的氨基酸序列；和
其中所述Vb CDR1区包含与选择的Vb CDR1氨基酸序列为至少80％同一性的氨基酸序列，所述Vb CDR2区包含与选择的Vb CDR2氨基酸序列为至少80％同一性的氨基酸序列，所述Vb CDR3区包含与选择的Vb CDR3氨基酸序列为至少80％同一性的氨基酸序列；
其中所述选择的Va CDR 1、2和3以及Vb CDR 1、2和3氨基酸序列是以下中的一种：
(1)所述选择的Va CDR 1、2和3氨基酸序列分别记载于SEQ ID NOs:1-3，和所述选择的Vb CDR 1、2和3氨基酸序列分别记载于SEQ ID NOs:4-6；
(2)所述选择的Va CDR 1、2和3氨基酸序列分别记载于SEQ ID NOs:7-9，和所述选择的Vb CDR 1、2和3氨基酸序列分别记载于SEQ ID NOs:10-12；
(3)所述选择的Va CDR 1、2和3氨基酸序列分别记载于SEQ ID NOs:13-15，和所述选择的Vb CDR 1、2和3氨基酸序列分别记载于SEQ ID NOs:16-18；
(4)所述选择的Va CDR 1、2和3氨基酸序列分别记载于SEQ ID NOs:19-21，和所述选择的Vb CDR 1、2和3氨基酸序列分别记载于SEQ ID NOs:22-24；
(5)所述选择的Va CDR 1、2和3氨基酸序列分别记载于SEQ ID NOs:25-27，和所述选择的Vb CDR 1、2和3氨基酸序列分别记载于SEQ ID NOs:28-30；
(6)所述选择的Va CDR 1、2和3氨基酸序列分别记载于SEQ ID NOs:31-33，和所述选择的Vb CDR 1、2和3氨基酸序列分别记载于SEQ ID NOs:34-36；
(7)所述选择的Va CDR 1、2和3氨基酸序列分别记载于SEQ ID NOs:37-39，和所述选择的Vb CDR 1、2和3氨基酸序列分别记载于SEQ ID NOs:40-42；
(8)所述选择的Va CDR 1、2和3氨基酸序列分别记载于SEQ ID NOs:43-45，和所述选择的Vb CDR 1、2和3氨基酸序列分别记载于SEQ ID NOs:46-48；
(9)所述选择的Va CDR 1、2和3氨基酸序列分别记载于SEQ ID NOs:49-51，和所述选择的Vb CDR 1、2和3氨基酸序列分别记载于SEQ ID NOs:52-54；
(10)所述选择的Va CDR 1、2和3氨基酸序列分别记载于SEQ ID NOs:61-63，和所述选择的Vb CDR 1、2和3氨基酸序列分别记载于SEQ ID NOs:64-66；
(11)所述选择的Va CDR 1、2和3氨基酸序列分别记载于SEQ ID NOs:67-69，和所述选择的Vb CDR 1、2和3氨基酸序列分别记载于SEQ ID NOs:70-72；
(12)所述选择的Va CDR 1、2和3氨基酸序列分别记载于SEQ ID NOs:73-75，和所述选择的Vb CDR 1、2和3氨基酸序列分别记载于SEQ ID NOs:76-78；
(13)所述选择的Va CDR 1、2和3氨基酸序列分别记载于SEQ ID NOs:79-81，和所述选择的Vb CDR 1、2和3氨基酸序列分别记载于SEQ ID NOs:82-84；或
(14)所述选择的Va CDR 1、2和3氨基酸序列分别记载于SEQ ID NOs:85-87，和所述选择的Vb CDR 1、2和3氨基酸序列分别记载于SEQ ID NOs:88-90。
5.一种T细胞受体(TCR)或其抗原结合片段，其包含
含有可变α(Va)区的α链，其中所述Va区包含互补决定区1(CDR-1)、互补决定区2(CDR-2)和互补决定区3(CDR-3)，其中所述Va CDR1区包含与SEQ ID NO:55为至少80％同一性的氨基酸序列，所述Va CDR2区包含与SEQ ID NO:56为至少80％同一性的氨基酸序列，所述VaCDR3区包含与SEQ IDNO:57为至少80％同一性的氨基酸序列；和
含有可变β(Vb)区的β链，其中所述Vb区包含互补决定区1(CDR-1)、互补决定区2(CDR-2)和互补决定区3(CDR-3)，其中所述Vb CDR1区包含与SEQ ID NO:58为至少80％同一性的氨基酸序列，所述Vb CDR2区包含与SEQ ID NO:59为至少80％同一性的氨基酸序列，所述VbCDR3区包含与SEQ IDNO:60为至少80％同一性的氨基酸序列。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的TCR或其抗原结合片段，其中所述TCR或其抗原结合片段结合或识别由主要组织相容性复合体(MHC)分子呈递的LMP2(FLYALALLL)(SEQ IDNO:139)的肽表位。
7.根据权利要求6所述的TCR或其抗原结合片段，其中所述MHC分子是HLA-A2分子。
8.根据权利要求1所述的T细胞受体(TCR)或其抗原结合片段，其中所述Va区由来自人TRAV基因区段和人TRAJ基因区段的重排的序列编码，和所述Vb区由来自人TRBV基因区段、任选地人TRBD基因区段和人TRBJ基因区段的重排的序列编码，其中
所述TRAV基因区段是TRAV21；
所述TRAJ基因区段是TRAJ33；
所述TRBV基因区段是TRBV10-2；
所述TRBD基因区段是TRBD1或TRBD2；和
所述TRBJ基因区段是TRBJ2-7。
9.根据权利要求1或8所述的T细胞受体(TCR)或其抗原结合片段，
其中所述Va CDR1区包含与SEQ ID NO:143为至少80％同一性的氨基酸序列，所述VaCDR2区包含与SEQ ID NO:144为至少80％同一性的氨基酸序列，所述Va CDR3区包含与SEQID NO:145为至少80％同一性的氨基酸序列；和
其中所述Vb CDR1区包含与SEQ ID NO:146为至少80％同一性的氨基酸序列，所述VbCDR2区包含与SEQ ID NO:147为至少80％同一性的氨基酸序列，所述Vb CDR3区包含与SEQID NO:148为至少80％同一性的氨基酸序列。
10.一种T细胞受体(TCR)或其抗原结合片段，其包含
含有可变α(Va)区的α链，其中所述Va区包含互补决定区1(CDR-1)、互补决定区2(CDR-2)和互补决定区3(CDR-3)，其中所述Va CDR1区包含与SEQ ID NO:143为至少80％同一性的氨基酸序列，所述Va CDR2区包含与SEQ ID NO:144为至少80％同一性的氨基酸序列，所述Va CDR3区包含与SEQ ID NO:145为至少80％同一性的氨基酸序列；和
含有可变β(Vb)区的β链，其中所述Vb区包含互补决定区1(CDR-1)、互补决定区2(CDR-2)和互补决定区3(CDR-3)，其中所述Vb CDR1区包含与SEQ ID NO:146为至少80％同一性的氨基酸序列，所述Vb CDR2区包含与SEQ ID NO:147为至少80％同一性的氨基酸序列，所述Vb CDR3区包含与SEQ ID NO:148为至少80％同一性的氨基酸序列。
11.根据权利要求1和8-10中任一项所述的TCR或其抗原结合片段，其中所述TCR或其抗原结合片段结合或识别由主要组织相容性复合体(MHC)分子呈递的LMP2 CLGGLLTMV(SEQID NO:167)和/或SLGGLLTMV(SEQ IDNO:168)的肽表位。
12.根据权利要求11所述的TCR或其抗原结合片段，其中所述MHC分子是HLA-A2分子。
13.一种T细胞受体(TCR)或其抗原结合片段，其包含
含有可变α(Va)区的α链，其中所述Va区包含互补决定区1(CDR-1)、互补决定区2(CDR-2)和互补决定区3(CDR-3)，其中所述Va CDR1区包含与选择的Va CDR1氨基酸序列为至少80％同一性的氨基酸序列，所述Va CDR2区包含与选择的Va CDR2氨基酸序列为至少80％同一性的氨基酸序列，所述Va CDR3区包含与选择的Va CDR3氨基酸序列为至少80％同一性的氨基酸序列；和
含有可变β(Vb)区的β链，其中所述Vb区包含互补决定区1(CDR-1)、互补决定区2(CDR-2)和互补决定区3(CDR-3)，其中所述Vb CDR1区包含与选择的Vb CDR1氨基酸序列为至少80％同一性的氨基酸序列，所述Vb CDR2区包含与选择的Vb CDR2氨基酸序列为至少80％同一性的氨基酸序列，所述Vb CDR3区包含与选择的Vb CDR3氨基酸序列为至少80％同一性的氨基酸序列；
其中所述选择的Va CDR 1、2和3以及Vb CDR 1、2和3氨基酸序列是以下中的一种：
(1)所述选择的Va CDR 1、2和3氨基酸序列分别记载于SEQ ID NOs:91、92和93，和所述选择的Vb CDR 1、2和3氨基酸序列分别记载于SEQ ID NOs:94、95和96；
(2)所述选择的Va CDR 1、2和3氨基酸序列分别记载于SEQ ID NOs:97、98和99，和所述选择的Vb CDR 1、2和3氨基酸序列分别记载于SEQ ID NOs:100、101和102；
(3)所述选择的Va CDR 1、2和3氨基酸序列分别记载于SEQ ID NOs:103、104和105，和所述选择的Vb CDR 1、2和3氨基酸序列分别记载于SEQ ID NOs:106、107和108；
(4)所述选择的Va CDR 1、2和3氨基酸序列分别记载于SEQ ID NOs:149、150和151，和所述选择的Vb CDR 1、2和3氨基酸序列分别记载于SEQ ID NOs:152、153和154；和
(5)所述选择的Va CDR 1、2和3氨基酸序列分别记载于SEQ ID NOs:155、156和157，和所述选择的Vb CDR 1、2和3氨基酸序列分别记载于SEQ ID NOs:158、159和160。
14.根据权利要求13所述的T细胞受体(TCR)或其抗原结合片段，其中所述Va区由来自人TRAV基因区段和人TRAJ基因区段的重排的序列编码，和所述Vb区由来自人TRBV基因区段、任选地人TRBD基因区段和人TRBJ基因区段的重排的序列编码，其中
所述TRAV基因区段是TRAV4、TRAV25、TRAV22或TRAV6；
所述TRAJ基因区段是TRAJ23、TRAJ47、TRAJ29、TRAJ43或TRAJ11；
所述TRBV基因区段是TRBV12-4、TRBV12-3、TRBV11-2、TRBV4-1或TRBV11-2；
所述TRBD基因区段是TRBD2；和
所述TRBJ基因区段是TRBJ1-1、TRBJ2-1、TRBJ2-5或TRBJ2-7。
15.根据权利要求13或14所述的TCR或其抗原结合片段，其中所述TCR或其抗原结合片段结合或识别由主要组织相容性复合体(MHC)分子呈递的LMP2(SSCSSCPLSK)(SEQ ID NO:140)的肽表位。
16.根据权利要求15所述的TCR或其抗原结合片段，其中所述MHC分子是HLA-A11分子。
17.一种T细胞受体(TCR)或其抗原结合片段，其包含
含有可变α(Va)区的α链，其中所述Va区包含互补决定区1(CDR-1)、互补决定区2(CDR-2)和互补决定区3(CDR-3)，其中所述Va CDR1区包含与选择的Va CDR1氨基酸序列为至少80％同一性的氨基酸序列，所述Va CDR2区包含与选择的Va CDR2氨基酸序列为至少80％同一性的氨基酸序列，所述Va CDR3区包含与选择的Va CDR3氨基酸序列为至少80％同一性的氨基酸序列；和
含有可变β(Vb)区的β链，其中所述Vb区包含互补决定区1(CDR-1)、互补决定区2(CDR-2)和互补决定区3(CDR-3)，其中所述Vb CDR1区包含与选择的Vb CDR1氨基酸序列为至少80％同一性的氨基酸序列，所述Vb CDR2区包含与选择的Vb CDR2氨基酸序列为至少80％同一性的氨基酸序列，所述Vb CDR3区包含与选择的Vb CDR3氨基酸序列为至少80％同一性的氨基酸序列；
其中所述选择的Va CDR 1、2和3以及Vb CDR 1、2和3氨基酸序列是以下中的一种：
(1)所述选择的Va CDR 1、2和3氨基酸序列分别记载于SEQ ID NOs:109、110和111，和所述选择的Vb CDR 1、2和3氨基酸序列分别记载于SEQ ID NOs:112、113和114；或
(2)所述选择的Va CDR 1、2和3氨基酸序列分别记载于SEQ ID NOs:115、116和117，和所述选择的Vb CDR 1、2和3氨基酸序列分别记载于SEQ ID NOs:118、119和120。
18.根据权利要求17所述的T细胞受体(TCR)或其抗原结合片段，其中所述Va区由来自人TRAV基因区段和人TRAJ基因区段的重排的序列编码，和所述Vb区由来自人TRBV基因区段、任选地人TRBD基因区段和人TRBJ基因区段的重排的序列编码，其中
所述TRAV基因区段是TRAV12-1；
所述TRAJ基因区段是TRAJ21；
所述TRBV基因区段是TRBV20-1；
所述TRBD基因区段是TRBD1；和
所述TRBJ基因区段是TRBJ2-5或TRBJ2-3。
19.根据权利要求17或18所述的TCR或其抗原结合片段，其中所述TCR或其抗原结合片段结合或识别由主要组织相容性复合体(MHC)分子呈递的LMP2(IYVLVMLVL)(SEQ ID NO:141)的肽表位。
20.一种T细胞受体(TCR)或其抗原结合片段，其包含
含有可变α(Va)区的α链，其中所述Va区包含互补决定区1(CDR-1)、互补决定区2(CDR-2)和互补决定区3(CDR-3)，其中所述Va CDR1区包含与选择的Va CDR1氨基酸序列为至少80％同一性的氨基酸序列，所述Va CDR2区包含与选择的Va CDR2氨基酸序列为至少80％同一性的氨基酸序列，所述Va CDR3区包含与选择的Va CDR3氨基酸序列为至少80％同一性的氨基酸序列；和
含有可变β(Vb)区的β链，其中所述Vb区包含互补决定区1(CDR-1)、互补决定区2(CDR-2)和互补决定区3(CDR-3)，其中所述Vb CDR1区包含与选择的Vb CDR1氨基酸序列为至少80％同一性的氨基酸序列，所述Vb CDR2区包含与选择的Vb CDR2氨基酸序列为至少80％同一性的氨基酸序列，所述Vb CDR3区包含与选择的Vb CDR3氨基酸序列为至少80％同一性的氨基酸序列；
其中所述选择的Va CDR 1、2和3以及Vb CDR 1、2和3氨基酸序列是以下中的一种：
(1)所述选择的Va CDR 1、2和3氨基酸序列分别记载于SEQ ID NOs:121、122和123，和所述选择的Vb CDR 1、2和3氨基酸序列分别记载于SEQ ID NOs:124、125和126；
(2)所述选择的Va CDR 1、2和3氨基酸序列分别记载于SEQ ID NOs:127、128和129，和所述选择的Vb CDR 1、2和3氨基酸序列分别记载于SEQ ID NOs:130、131和132；
(3)所述选择的Va CDR 1、2和3氨基酸序列分别记载于SEQ ID NOs:133、134和135，和所述选择的Vb CDR 1、2和3氨基酸序列分别记载于SEQ ID NOs:136、137和138；或
(4)所述选择的Va CDR 1、2和3氨基酸序列分别记载于SEQ ID NOs:161、162和163，和所述选择的Vb CDR 1、2和3氨基酸序列分别记载于SEQ ID NOs:164、165和166。
21.根据权利要求15所述的T细胞受体(TCR)或其抗原结合片段，其中所述Va区由来自TCRα可变(TRAV)基因区段和TCRα接合(TRAJ)基因区段的重排的序列编码，其中所述Vb区由来自TCRβ可变(TRBV)基因区段、任选地TCRβ多样性(TRBD)基因区段和TCRβ接合(TRBJ)基因区段的重排的序列编码，其中
所述TRAV基因区段是TRAV25、TRAV12-3或TRAV21；
所述TRAJ基因区段是TRAJ16、TRAJ3或TRAJ35；
所述TRBV基因区段是TRBV6-6、TRBV24-1或TRBV30；
所述TRBD基因区段是TRBD1或TRBD2；和
所述TRBJ基因区段是TRBJ1-1、TRBJ2-5、TRBJ2-3或TRBJ2-7。
22.根据权利要求20或21所述的TCR或其抗原结合片段，其中所述TCR或其抗原结合片段结合或识别由主要组织相容性复合体(MHC)分子呈递的LMP2(TYGPVFMCL)(SEQ ID NO:142)的肽表位。
23.根据权利要求19或22所述的TCR或其抗原结合片段，其中所述MHC分子是HLA-A24分子。
24.根据权利要求1-23中任一项所述的TCR或其抗原结合片段，其中所述α链包含小鼠α链恒定区，和所述β链包含小鼠β链恒定区。
25.根据权利要求1-23中任一项所述的TCR或其抗原结合片段，其中所述α链包含人α链恒定区，和所述β链包含人β链恒定区。
26.根据权利要求1-25中任一项所述的TCR或其抗原结合片段，其中所述TCR或其抗原结合片段当在T细胞表面上表达时刺激针对靶癌细胞的细胞毒活性。
27.根据权利要求26所述的TCR或其抗原结合片段，其中所述靶癌细胞包含编码LMP2的核酸序列或表达LMP2。
28.一种载体，其包含编码根据权利要求1-27中任一项所述的TCR或其抗原结合片段的核酸。
29.一种载体，其包含：
a)编码TCRα链的第一核酸序列，所述TCRα链包含人抗LMP2 TCR的α链可变区和α链恒定区；和
b)编码TCRβ链的第二核酸序列，所述TCRβ链包含人抗LMP2 TCR的β链可变区和β链恒定区，
其中所述TCRα链和所述TCRβ链形成根据权利要求1-27中任一项所述的TCR或其抗原结合片段。
30.根据权利要求29所述的载体，其中所述第一核酸序列和所述第二核酸序列通过接头序列连接。
31.根据权利要求30所述的载体，其中所述接头序列是P2A序列。
32.根据权利要求28-31中任一项所述的载体，其中所述载体是表达载体、病毒载体、逆转录病毒载体或慢病毒载体。
33.根据权利要求32所述的载体，其中所述逆转录病毒载体是pMP71。
34.一种工程化细胞，其包含根据权利要求28-33中任一项所述的载体。
35.一种工程化细胞，其包含根据权利要求1-27中任一项所述的TCR或其抗原结合片段。
36.根据权利要求34或35所述的工程化细胞，其中所述TCR或其抗原结合片段与所述细胞是异源的。
37.根据权利要求34-36中任一项所述的工程化细胞，其中所述工程化细胞是细胞系。
38.根据权利要求34-36中任一项所述的工程化细胞，其中所述工程化细胞是从受试者(例如，人受试者)获得的原代细胞。
39.根据权利要求34-38中任一项所述的工程化细胞，其中所述工程化细胞是T细胞。
40.根据权利要求39所述的工程化细胞，其中所述T细胞是从人受试者分离的。
41.根据权利要求39所述的工程化细胞，其中所述T细胞是CD8+。
42.根据权利要求39所述的工程化细胞，其中所述T细胞是CD4+。
43.根据权利要求34-42中任一项所述的工程化细胞，其中所述工程化细胞表达双功能陷阱蛋白。
44.根据权利要求43所述的工程化细胞，其中所述双功能陷阱蛋白靶向检查点抑制剂(例如，PD-1)和转化生长因子β家族(例如，TGF-β)的成员。
45.根据权利要求34-42中任一项所述的工程化细胞，其中所述工程化细胞表达靶向检查点抑制剂(例如，PD-1)的抗体或其抗原结合片段。
46.根据权利要求34-42和45中任一项所述的工程化细胞，其中所述工程化细胞表达结合转化生长因子β家族(例如，TGF-β)的成员的蛋白质。
47.一种用于生产工程化细胞的方法，其包括将根据权利要求28-33中任一项所述的载体体外或离体引入所述细胞中。
48.根据权利要求47所述的方法，其中所述引入步骤通过转导进行。
49.一种治疗疾病或病症的方法，其包括向患有与EBV相关的疾病或病症的受试者施用根据权利要求34-46中任一项所述的工程化细胞。
50.根据权利要求49所述的方法，其中所述与EBV相关的疾病或病症是癌症。
51.一种治疗受试者中肿瘤的方法，所述方法包括
向有需要的受试者施用工程化T细胞，所述工程化T细胞包含编码与肿瘤中的抗原特异性结合的根据权利要求1-27所述的TCR或其抗原结合片段的核酸。
52.一种治疗受试者中肿瘤的方法，所述方法包括
向有需要的受试者施用
(a)工程化T细胞，其包含：编码与肿瘤中的抗原特异性结合的根据权利要求1-27所述的TCR或其抗原结合片段的核酸；和
(b)检查点抑制剂和结合转化生长因子β家族(例如，TGF-β)的成员的蛋白质中的一者或两者。
53.一种治疗受试者中肿瘤的方法，所述方法包括
向有需要的受试者施用
工程化T细胞，其包含：编码以下的核酸：
(a)与肿瘤中的抗原特异性结合的根据权利要求1-27所述的TCR或其抗原结合片段；和
(b)靶向检查点抑制剂和转化生长因子β家族(例如，TGF-β)的成员的双功能陷阱蛋白。
54.根据权利要求51-53中任一项所述的方法，其中所述肿瘤是EBV相关肿瘤。
55.根据权利要求50或54所述的方法，其中所述癌症或所述EBV相关肿瘤是伯基特氏淋巴瘤、免疫抑制性淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、与慢性炎症相关的弥漫性大B细胞淋巴瘤、淋巴瘤样肉芽肿、浆母细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、移植后淋巴增殖性疾病、鼻咽癌、胃腺癌、淋巴上皮瘤相关癌、免疫缺陷相关平滑肌肉瘤或霍奇金氏淋巴瘤。
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