CN112266416A - 一种抗hiv的广谱中和抗体及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种抗HIV的广谱中和抗体及其制备方法和应用。具体的，本发明涉及如SEQ ID NO.1、2、3所示氨基酸序列的重链可变区CDR‑H1、CDR‑H2、CDR‑H3；以及如SEQ ID NO.5、6、7所示氨基酸序列的轻链可变区CDR‑L1、CDR‑L2、CDR‑L3。本发明同时涉及编码抗体的核酸、包含所述核酸的载体以及包含所述载体的细胞和药物组合物。本发明还涉及所述抗体用于检测和治疗HIV感染和HIV相关疾病的用途。

Description

一种抗HIV的广谱中和抗体及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于细胞免疫学、基因工程领域，涉及一种抗HIV的广谱中和抗体及其制备方法和应用。
背景技术
获得性免疫缺陷综合症即艾滋病(Acquired Immunodeficiency Syndrome，AIDS)，该病是由人类免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus Type，HIV)感染而引起的。HIV-1主要有三条传播途径，分别是血液传播、母婴传播和性传播。HIV主要侵犯人体的免疫系统，被感染者的免疫功能会逐渐减弱甚至丧失，这就会使各种继发感染趁虚而入进一步侵害人体，最终导致死亡。艾滋病已经严重危害到国民的健康安全，全世界众多医学研究人员都在投入大量的人力物力竭尽全力去克服这一重大问题。
HIV属于逆转录病毒科慢病毒属，分为两个亚型:1型和2型。其中HIV-2主要流行在西欧，北美和非洲西部地区，该病毒株毒性较弱。而HIV-1则在世界各地广泛存在，是世界上艾滋病流行的主要病毒株，该病毒株毒性强，严重威胁到人体健康。HIV成为迄今为止在疫苗研发和药物开发过程中所经历的最为可怕的病原微生物。虽然在对抗HIV的过程中，进行了大量生物学的基础研究，但相对于其他病原体，HIV的高突变性、免疫逃逸、窗口期短等特点，为对抗HIV的治疗和疫苗的研发工作带来重重困难。
HIV广谱中和抗体，因为识别HIV病毒膜蛋白相对保守的位点，受到HIV病毒变异的影响较小，可对抗绝大多数HIV病毒株，因而在艾滋病治疗中具有极高的应用价值。但感染者体内这类HIV广谱中和抗体很难产生，除了HIV病毒变异频率高，另据报道75％的HIV抗体具有多反应性，已知的几种HIV广谱中和抗体(如4E10、B12、2G12、2F5)，均是自身反应性和多反应性抗体。但是由于自身反应性和多反应性抗体可以与人体自身抗原等多种抗原反应，所以在发育过程中，免疫系统会将分泌这类抗体的B细胞克隆清除，以免引起自身免疫反应。研究发现，在正常人体B细胞的发育过程中，大部分早期B细胞具有自身反应性，能和人体自身抗原反应；随着B细胞的逐渐发育，自身反应性B细胞的比例显著降低，到成熟B细胞阶段，这一比例已降至20％左右。这可能是HIV广谱中和抗体难以产生的原因。
探究新的途径来筛选自身反应性和多反应性抗体，进而筛选抗HIV广谱中和抗体，对检测和治疗HIV感染以及与HIV感染相关的疾病具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种抗HIV的广谱中和抗体。
本发明的目的之二在于提供了一种筛选抗HIV的广谱中和抗体的方法。
本发明的目的之三在于提供了检测或治疗HIV感染和HIV相关疾病的药物和途径。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面提供了一种抗HIV广谱中和抗体，所述抗体包含重链互补决定区和/或轻链互补决定区；
所述重链互补决定区包含：SEQ ID NO.1的氨基酸序列的CDR-H1、SEQ ID NO.2的氨基酸序列的CDR-H2以及SEQ ID NO.3的氨基酸序列的CDR-H3；
所述轻链互补决定区包含：包含SEQ ID NO.5的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ IDNO.6的氨基酸序列的CDR-L2以及包含SEQ ID NO.7的氨基酸序列的CDR-L3。
进一步，所述抗体包含：
(a)与SEQ ID NO.4的氨基酸序列具有至少90％，优选95％序列同一性的VH序列；
(b)与SEQ ID NO.8的氨基酸序列具有至少90％，优选95％序列同一性的VL序列；或者
(c)如(a)中的VH序列和如(b)中的VL序列。
进一步，所述抗体包括Fab、Fab’、F(ab)’2、ScFv、Fv片段或线性抗体。
本发明的第二方面提供了一种核酸分子，所述核酸分子编码本发明第一方面所述的抗体。
进一步，编码CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3的核酸序列具有与SEQ ID NO.9-11至少90％，优选95％序列的同一性的序列。
进一步，编码CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3的核酸序列具有与SEQ ID NO.13-15至少90％，优选95％序列的同一性的序列。
进一步，编码VH的核酸序列具有与SEQ ID NO.12至少90％，优选95％序列同一性的序列。
进一步，编码VL的核酸序列具有与SEQ ID NO.16至少90％，优选95％序列同一性的核酸序列。
在本发明中，核酸分子可以例如通过标准化学合成方法和/或重组方法合成，或半合成地产生，例如通过组合化学合成和重组方法。编码序列与转录调控元件和/或与其他氨基酸编码序列的连接可以使用已确立的方法进行，例如限制酶切消化、连接和分子克隆。
本发明的第三方面提供了一种载体，所述载体包含本发明第二方面所述的核酸分子。
本发明的第四方面提供了一种细胞，所述细胞包含本发明第三方面所述的载体。
本发明的第五方面提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含本发明第一方面所述的抗体、本发明第二方面所述的核酸分子、本发明第三方面所述的载体、或本发明第四方面所述的细胞；和药用载体。
进一步，所述药物组合物还包括第二治疗剂。
进一步，所述第二治疗剂是抗病毒剂。
进一步，所述抗病毒剂包括：非核苷逆转录酶抑制剂，蛋白酶抑制剂，进入或融合抑制剂、整合酶抑制剂。
本发明的第六方面提供了一种疫苗，所述疫苗包含特异性结合本发明第一方面所述的抗体的表位。
本发明的第七方面提供了一种用于生成抗HIV广谱中和抗体的方法，所述方法包括：
获得本发明第四方面所述的细胞；
在如下条件下在培养基中培养所述细胞，所述条件容许由所述载体编码的多肽的表达并且装配抗体或其片段，并自所述细胞或所述细胞的培养基纯化所述抗体。
本发明的第八方面提供了一种筛选抗HIV广谱中和抗体的方法，包括：
(a)收集人源化GTL小鼠外周血，流式细胞分选成熟B细胞；
(b)单细胞PCR克隆抗体基因；
(c)抗体表达及纯化；
(d)筛选具有自身反应性、多反应性的抗体；
(e)筛选具有HIV抗原结合活性的抗体。
本发明的第九方面提供了如下任一项所述的应用：
(a)本发明第一方面所述的抗体、本发明第二方面所述的核酸分子、本发明第三方面所述的载体、本发明第四方面所述的细胞、本发明第五方面所述的药物组合物、本发明第六方面所述的疫苗在制备治疗HIV感染或HIV相关疾病的药物中的应用；
(b)本发明第一方面所述的抗体、本发明第二方面所述的核酸分子、本发明第三方面所述的载体、本发明第四方面所述的细胞在制备检测HIV感染或HIV相关疾病诊断、预后或治疗监测的产品中的应用；
(c)本发明第一方面所述的抗体在制备免疫偶联物或嵌合受体中的应用；
(d)本发明第一方面所述的抗体在HIV免疫组织化学测定中的应用。
进一步，(c)中所述嵌合受体为嵌合抗原受体。
进一步，所述嵌合抗原受体进一步包含细胞内信号传导结构域。
本发明的优点和有益效果：
本发明提供了一种抗HIV广谱中和抗体，该抗体受到HIV病毒变异的影响较小，可对抗绝大多数HIV病毒株，因此具有较好的应用前景。
本发明提供了一种筛选抗HIV广谱中和抗体的方法，该方法相对于传统的筛选手段，高效、方便，具有较高的成功率。
附图说明
图1是pcDNA3.1(+)-Fc表达载体图；
图2是BN2抗体自身反应性检测结果图；
图3是BN2抗体结合Insulin的多反应性检测结果图；
图4是BN2抗体与HIV表面抗原gp140-trimer结合活性检测结果图。
具体实施方式
本发明基于人源化GTL小鼠的研究。人源化GTL小鼠，是将人胎儿脐带血中CD34+的造血干细胞、胎儿肝和胸腺组织移植到NOD/Scid/IL2Rγnull小鼠体内，使人的造血细胞、淋巴细胞在GTL小鼠体内发育。由于人B细胞处在小鼠体内的发育环境中，对于人体来讲的这类自身反应性/多反应性B细胞克隆可能被清除的比例降低，从而可以更多地保留下来。在人源化GTL小鼠模型研究过程中，发现78.4％的成熟B细胞具有自身反应性/多反应性，比例相当高。在对这些自身反应性/多反应性抗体进行研究过程中，发现了具备HIV广谱中和抗体特征的抗体，这相当于从含高比例自身反应性/多反应性抗体库中进行HIV抗体的筛选，获得HIV广谱中和抗体的几率大大提高。
基于上述发现，本发明公开了一种获得HIV广谱中和抗体的方法：在人源化GTL小鼠外周血中获得成熟B细胞，筛选具有自身反应性/多反应性的抗体，进一步发现具有抗HIV活性的广谱中和抗体。
在本发明中，术语“抗体”意图包括但不限于任何特定的结合成员，免疫球蛋白类和/或同种型(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA、IgD、IgE和IgM)；及其生物学相关片段或特异性结合成员，包括但不限于Fab、F(ab’)2、Fv、和scFv(单链或相关实体)。除非另有说明，术语“抗体”应理解为包括其功能性抗体片段。
术语“抗体片段”包含完整抗体的一部分，诸如完整抗体的抗原结合或可变区。抗体片段的例子包括但不限于Fab、Fab’、F(ab’)2、和Fv片段；双抗体；线性抗体。
术语“Fv”是含有完整抗原识别和抗原结合位点的最小限度抗体片段。此片段含有紧密非共价联合的一个重链可变区域和一个轻链可变区域的二聚体。从这两个域的折叠得出6个高变环(各自来自H链和L链的3个环)，其为抗原结合贡献氨基酸残基，并且对抗体赋予抗原结合特异性。然而，甚至单一可变区(或仅包含对抗原特异性的3个CDR的Fv的一半)具有识别和结合抗原的能力，尽管以比完整结合位点更低的亲和力。
术语“单链Fv”(“sFv”或“scFv”)是包含连接成单一多肽链的VH和VL抗体域的抗体片段。sFv多肽可以进一步包含VH和VL域之间使sFv能够形成抗原结合的期望结构的多肽接头。
术语“双抗体”指通过构建sFv制备的小抗体片段，所述sFv在VH和VL域之间具有短接头(约5-10个残基)，从而实现V域的链间而非链内配对，生成二价片段(即具有两个抗原结合位点的片段)。双特异性双抗体是两个“交叉”sFv片段的异二聚体，其中两个抗体的VH和VL域存在于不同多肽链上。
如本文中使用的，“抗体”的定义中还包括嵌合抗体、人源化抗体、和重组抗体、自转基因非人动物生成的人抗体、及使用技术人员可用的富集技术自文库选择的抗体。
术语“嵌合抗体”通常是指其中重链和/或轻链的一部分来自特定的来源或物种，而该重链和/或轻链的其余部分来自不同来源或物种的抗体。在一个实例中，嵌合抗体包含非人可变区(例如，来自小鼠、大鼠、仓鼠、兔或非人灵长类动物如猴的可变区)和人恒定区。在进一步的实例中，嵌合抗体是“类别转换的”抗体，其中类别或亚类已经从亲本抗体的类别或亚类改变。嵌合抗体包括其抗原结合片段。
术语“人源化抗体”是其中全部或基本上全部CDR氨基酸残基都来源于非人类CDR且全部或基本上全部FR氨基酸残基都来源于人类FR的抗体。人源化抗体可任选地包括来源于人类抗体的抗体恒定区的至少一部分。非人类抗体的“人源化形式”是指已经历人源化的非人类抗体的变体，该人源化通常用于降低对人的免疫原性，同时保留亲代非人类抗体的特异性和亲和力。在一些实施方案中，将人源化抗体中的一些FR残基用来自非人类抗体(例如，衍生出CDR残基的抗体)的相应残基置换，例如用以恢复或提高抗体特异性或亲和力。
术语“可变”指可变(V)域的某些区段在抗体间在序列上广泛不同。V域介导抗原结合，并且限定特定抗体对其特定抗原的特异性。天然重链和轻链的可变区(分别为VH和VL)各自包含由3个高变区连接的4个FR。每条链中的高变区通过FR极端紧密保持在一起，并且与来自另一条链的高变区一起促成抗体的抗原结合位点的形成。如本文中使用的，术语“高变区”指抗体中负责抗原结合的氨基酸残基。高变区一般包含来自“互补决定区”(“CDR”)的氨基酸残基。
给定CDR或FR的边界可根据用于鉴别的方案而变化。例如，Kabat方案是基于结构比对，而Chothia方案是基于结构信息。除非另有规定，否则给定抗体或其区域(如其可变区)的“CDR”或“互补决定区”或单个指定的CDR(例如，“CDR-H1、CDR-H2”)应理解为包括如由目前常用的方案所定义的互补决定区(或特定互补决定区)。例如，在阐明特定CDR(例如，CDR-H3)含有给定VH或VL氨基酸序列中相应CDR的氨基酸序列的情况下，应当理解，此类CDR具有如由任何本领域常用的方案所定义的可变区内的相应CDR(例如，CDR-H3)的序列。
作为可选择的实施方式，本发明提供了抗HIV抗体(包括但不限于抗体的抗原结合片段和偶联物，和/或抗体的融合蛋白，例如片段，诸如嵌合蛋白或嵌合受体，例如，含有一种或多种该抗体的嵌合抗原受体(CAR))。在一些实施方案中，这样的抗体、融合蛋白和/或偶联物可用于HIV的治疗、诊断和/或预后。
作为可选择的实施方式，抗HIV抗体包含与SEQ ID NO.4的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变区(VH)序列。在一些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VH序列含有相对于参考序列的置换(例如，保守置换)、插入或缺失，但包含该序列的抗HIV抗体保留与HIV结合的能力。在一些实施方案中，置换、插入或缺失发生在CDR外的区域中(例如，在FR中)。在特定的实施方案中，所述VH包含具有SEQ ID NO.1、2、3所示氨基酸序列的重链可变区CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3。
作为可选择的实施方式，抗HIV抗体包含与SEQ ID NO.8的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变区(VL)序列。在一些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VH序列含有相对于参考序列的置换(例如，保守置换)、插入或缺失，但包含该序列的抗HIV抗体保留与HIV结合的能力。在一些实施方案中，置换、插入或缺失发生在CDR外的区域中(例如，在FR中)。在特定的实施方案中，所述VH包含具有SEQ ID NO.1、2、3所示氨基酸序列的重链可变区CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3。
在本发明中，可以使用重组方法和组合物产生抗体。在一些实施方案中，提供了本文所述的编码抗HIV抗体的分离的核酸或其片段。这样的核酸可编码包含抗体的VL的氨基酸序列和/或包含抗体的VH的氨基酸序列。在进一步的实施方案中，提供了包含这样的核酸的一种或多种载体。载体是能够使与其连接的另一核酸增殖的核酸分子。该术语包括作为自我复制的核酸结构的载体以及整合到其被引入的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够指导与其可操作地连接的核酸的表达。在一些实施方案中，提供了编码CAR的核酸和/或载体，该CAR包含源自本文公开的抗HIV抗体的结合域。
在进一步的实施方案中，提供了包含这样的核酸的细胞。所述细胞是已被引入外源核酸的细胞，包括此类细胞的子代。所述细胞包括“转化体”和“转化的细胞”，其包括初级转化的细胞和由其衍生的子代，而不考虑传代次数。子代在核酸内含物方面不能与亲本细胞完全相同，但可含有突变。本文包括如在最初转化的细胞中筛选或选择的具有相同功能或生物学活性的突变子代。在一个这样的实施方案中，所述细胞包含(例如已被转化具有)含有编码包含抗体的VL的氨基酸序列和包含抗体的VH的氨基酸序列的核酸的载体，或含有编码包含抗体的VL的氨基酸序列的核酸的第一载体和含有编码包含抗体的VH的氨基酸序列的核酸的第二载体。在一些实施方案中，该细胞包含含有编码CAR的核酸的载体。在一些实施方案中，该细胞是真核细胞，例如，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴样细胞(例如YO、NSO、Sp20细胞)。在一些实施方案中，提供了制备抗HIV抗体的方法，其中该方法包括在适用于表达所述抗体的条件下培养如上文提供的包含编码所述抗体的核酸的细胞，并且任选地从所述细胞或细胞培养基回收所述抗体。
用于克隆或表达编码抗体的载体的合适细胞包括原核或真核细胞。例如，可以例如在不需要糖基化和Fc效应子功能时，在细菌中产生抗体。除原核生物之外，真核微生物如丝状真菌或酵母是编码抗体的载体的合适克隆或表达宿主。所述的细胞还来源于多细胞生物体，包括无脊椎动物和脊椎动物。无脊椎动物的实例包括植物和昆虫细胞。脊椎动物细胞的实例包括哺乳动物细胞系、经SV40转化的猴肾CV1系(C0S-7)、人胚胎肾系、幼仓鼠肾细胞(BHK)、小鼠支持
细胞(TM4细胞)、猴肾细胞(CV1)、非洲绿猴肾细胞(Vero)、人宫颈癌细胞(HELA)、犬肾细胞(MDCK)、水牛大鼠肝细胞(BRL 3A)、人肺细胞(W138)、人肝细胞(Hep G2)、小鼠乳房肿瘤(MMT 060562)、TR1细胞、MRC 5细胞、FS4细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、骨髓瘤细胞系。
在本发明中，术语“免疫偶联物”是与一种或多种异源分子偶联的抗体。例如，免疫偶联物可以包含与一种或多种细胞毒性剂如化疗剂或化疗药物、生长抑制剂、蛋白质结构域、毒素(例如，蛋白毒素、细菌、真菌、植物或动物来源的酶促活性毒素，或其片段)或放射性同位素偶联的抗HIV抗体。在一些实施方案中，免疫偶联物可以包含抗HIV抗体或其片段(例如，scFv)。
在本发明中，任何本文提供的抗HIV抗体均可用于检测生物样品中HIV的存在。检测包括定量或定性检测。
本文公开的抗体和组合物可用于多种目的，如用于在受试者中检测HIV感染或诊断AIDS。这些方法可包括使来自诊断患有HIV或AIDS的受试者的样品与本文所述的抗体接触，以及检测抗体与样品的结合。相对于抗体与对照样品的结合，抗体与样品结合的增加确认受试者患有HIV感染和/或AIDS。在一些实施方案中，该方法进一步包括使结合HIV的第二抗体与该样品接触，以及检测该第二抗体的结合。在一些非限制性实例中，相对于与对照样品的结合，抗体与样品结合的增加检测出受试者中的HIV。在一些非限制性实例中，该抗体特异性结合该样品中的可溶性gp140。在一些实施方案中，该方法进一步包括使特异性识别HIV抗体的第二抗体与样品接触，以及检测第二抗体的结合。
根据另一个实施方案，本发明提供了诊断HIV感染的方法。诊断方法通常涉及使从患者获得的生物样品(诸如例如，血液、血清、唾液、尿、痰、细胞拭子样品或组织活检物)与HIV抗体接触，以及确定与对照样品或预定截止值相比，抗体是否优先与样品结合，从而表明HIV病毒的存在。
根据另一个实施方案，本发明提供了在来自患者的生物样品中检测本发明HIV抗体的存在的方法。检测方法通常涉及从患者获得生物样品(诸如例如，血液、血清、唾液、尿、痰、细胞拭子样品或组织活检)，以及分离HIV抗体或其片段或编码HIV抗体的核酸，以及测定生物样品中HIV抗体的存在。而且，本发明提供了检测细胞中HIV抗体的核苷酸序列的方法。该HIV抗体的核苷酸序列也可以使用本文公开的引物来检测。可以利用已知的重组技术和/或使用质谱仪来确定该HIV抗体在来自患者的生物样品中的存在。
术语“治疗”或“处理”或“减轻”可互换使用，并且指治疗性处理和防范性或预防性措施两者；其中目的是预防或减缓(减轻)靶向的病理状况或病症。需要治疗的对象包括那些已经具有病症的对象以及那些易于具有病症的对象或那些要预防病症的对象。若在接受治疗量的依照本发明方法的抗体后，患者显示下列一项或多项的可观察到的和/或可测量的降低或缺乏，则受试者或哺乳动物是成功“治疗”感染的：受感染细胞的数目减少或受感染细胞的缺乏；被感染的总细胞的百分比降低；和/或以一定程度减轻一种或多种与特定感染有关的症状；降低的发病率和死亡率，和生活质量问题的改善。
在本发明中，术语“载体”包括药学可接受载体、赋形剂或稳定剂，其在采用的剂量和浓度时对暴露于其的细胞或哺乳动物无毒。经常，生理学可接受载体是水性PH缓冲溶液。生理学可接受载体的例子包括但不限于缓冲剂诸如磷酸盐、柠檬酸盐、和其它有机酸；抗氧化剂，包括但不限于抗坏血酸；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如但不限于血清清蛋白、明胶、或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如但不限于聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸诸如但不限于甘氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，精氨酸或赖氨酸；单糖，二糖，和其它碳水化合物，包括但不限于葡萄糖，甘露糖，或糊精；螯合剂，诸如但不限于EDTA；糖醇，诸如但不限于甘露醇或山梨糖醇；盐形成反荷离子，诸如但不限于钠；和/或非离子型表面活性剂，诸如但不限于TWEEN.；聚乙二醇(PEG)和PLUR0NICS。
在一些实施方案中，药物组合物被提供为无菌液体制剂，例如，等渗水溶液、悬浮液、乳液、分散液或粘性组合物，其在一些方面可以被缓冲至选定的
Figure BDA0002743439680000101
液体制剂通常比凝胶、其他粘性组合物和固体组合物更容易制备。另外，液体组合物更便于施用，特别是通过注射。另一方面，粘性组合物可以在合适的粘度范围内配制，以提供与特定组织更长的接触时间。液体或粘性组合物可以包含载体，该载体可以是溶剂或含有例如水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液体聚乙二醇)及其合适混合物的分散介质。
可通过将抗体或其片段掺入溶剂中，如与合适的载体、稀释剂或赋形剂如无菌水、生理盐水、葡萄糖、右旋糖等混合来制备无菌注射溶液。还可以将该组合物冻干。根据期望的给药途径和制剂，该组合物可以含有辅助物质如润湿剂、分散剂或乳化剂(例如，甲基纤维素)、pH缓冲剂、胶凝添加剂或粘度增强添加剂、防腐剂、调味剂、着色剂等。在一些方面，可以参考标准文本来制备合适的制剂。
可以添加各种增强组合物稳定性和无菌性的添加剂，包含抗微生物防腐剂、抗氧化剂、螯合剂和缓冲剂。可以通过各种抗菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、酚、山梨酸等来确保防止微生物的作用。可以通过使用延迟吸收的药剂例如单硬脂酸铝和明胶来实现可注射药物形式的延长吸收。
本发明的抗体或药物组合物(和任何额外的治疗剂)可以通过任何合适的手段施用，该手段包括肠胃外施用、肺内施用和鼻内施用，以及局部治疗需要时的病灶内施用。肠胃外输注包括肌内施用、静脉内施用、动脉内施用、腹膜内施用或皮下施用。可以通过任何合适的途径来给药。例如，可以通过注射(例如，静脉内或皮下注射)来剂量。
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。
以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1抗HIV抗体的制备
1、成熟B细胞的分选
Buffer1：500ml 1×PBS+2ml 0.5M EDTA+25ml 10％BSA(含2mM EDTA,0.5％BSA)
(1)收集人源化GTL小鼠外周血200μl，加入200μl Buffer1；
(2)加入10倍体积的ACK lysing buffer(Fisher/BioWhittaker)，室温孵育10min，1500rpm离心10min；
(3)弃上清，加入10ml Buffer 1洗细胞，1500rpm离心10min；
(4)弃上清，加入10μl Buffer 1重悬细胞；加入如下流式抗体，标记成熟B细胞：
anti-CD5/FITC(UCHT2，eBioscience)
anti-CD19/PE(SJ25-C1，BD Pharmingen)
anti-CD10/APC(BC96，eBioscience)
anti-CD27/PE-Cy7(O323，eBioscience)
anti-IgM/PE-Cy5(G20-127，BD Pharmingen)
(5)流式细胞仪(FACS Sorter)分选成熟B细胞(CD5-CD19+CD10-CD27-IgM+)，将单个细胞收集到96孔PCR板中，内置4μl细胞裂解液；
(6)将分选到的细胞至于干冰上，并尽快保存于-70℃冰箱。
(7)结果：分选获得成熟B细胞。
2、抗体的鉴定
(1)反转录合成cDNA，用Invitrogen公司的
Figure BDA0002743439680000121
III First-StrandSynthesis System合成体系；
(2)第一轮PCR，扩增抗体重链VH基因、轻链VL基因，用Qiagen公司的Hotstar试剂盒；
(3)第二轮巢式PCR，扩增抗体VH基因、VL基因，用Qiagen公司的Hotstar试剂盒；
(4)将第二轮PCR产物VH片段、VL片段分别连入T载体，转化JM109感受态细菌；
(5)用PCR法鉴定含VH片段、VL片段的阳性克隆；
(6)选择来自同一细胞的，经PCR鉴定为阳性的VH和VL产物，将其组装成单链抗体scFv。
(7)通过SfiI、Not I酶切位点，将scFv连入含IgG1-Fc的pcDNA3.1(+)-Fc表达载体(含IgG1-Fc标签，图1)，转化JM109感受态细菌。
(8)用PCR法鉴定含scFv片段的阳性克隆并测序，获得序列正确的scFv/pcDNA3.1(+)-Fc克隆。
(9)抗体的序列如表1所示。
表1抗体序列
Figure BDA0002743439680000131
Figure BDA0002743439680000141
3、抗体的真核表达和亲和纯化
将测序正确的scFv/pcDNA3.1(+)-Fc质粒，用lipofectamine 2000(Invitrogen)瞬时转染HEK 293T细胞。293T细胞接种于15cm的培养板中，含20ml培养基，细胞铺板至90％时，用40μg质粒DNA，100μl lipofectamine2000，按操作指南进行转染。转染8-10h后换液，换液后48h收集细胞上清，用Protein A亲和层析法(Protein A sepharose CL-4B，GEHealthcare)纯化抗体(表达的抗体含Fc标签)，经超滤浓缩后获得scFv-Fc抗体蛋白。
实施例2抗体特性的检测
1、自身反应性检测
抗体的自身反应性采用临床上标准的抗核抗体检测试剂盒(QUANTA LiteTMANAELISA，INOVA Diagnostics,Inc.)进行检测，检测试剂盒中提供了阴性反应样品、低阳性反应样品、高阳性反应样品。4E10是一个HIV广谱中和抗体，也是一个自身反应性/多反应性抗体，实验中我们制备了4E10 scFv-Fc，用作阳性对照抗体。检测步骤如下：
(1)包被：ANA试剂盒中的Elisa板已经进行了抗原包被；
(2)一抗：加入50μg/ml scFv-Fc蛋白50μl，室温反应2h；
(3)二抗：弃去孔中液体，PBST洗涤3次，加入HRP标记的羊抗人IgG-Fc抗体，室温反应1h；
(4)显色：弃去孔中液体，PBST洗涤3次，加入TMB底物溶液，每孔100μl，室温避光显色3min；
(5)检测：加入2N H2SO4 100μl终止反应，酶标仪450nm处进行检测。
(6)结果：如图2所示，scFv-Fc抗体(命名为BN2)抗核反应显示出强阳性，几乎与4E10 scFv-Fc相当。表明BN2与人类核抗原反应，是一种自身反应性抗体。
2、多反应性检测
抗体的多反应性是检测抗体和自然界多种公认常见抗原的反应，包括人单链DNA(ssDNA)、人双链DNA(dsDNA)、重组人胰岛素(insulin)、人心磷脂(cardiolipin)、牛血清白蛋白(BSA)、细菌脂多糖(LPS)等。源于人源化GTL小鼠的抗体多反应性通过基于电化学发光法的MSD(Gaithersburg,MD,USA)平台进行评价。实验中，4E10 scFv-Fc用作阳性对照抗体。
(1)包被：用ssDNA、dsDNA、insulin、cardiolipin、BSA、LPS各10μg/ml为多反应性抗原，包被384孔MSD板，4℃孵育过夜；
(2)封闭：弃去孔中液体，PBST洗涤3次，加入10％FBS 100μl封闭Elisa板，室温孵育1h；
(3)一抗：弃去孔中液体，PBST洗涤3次，加入5μg/ml scFv-Fc蛋白15μl，室温孵育反应2h；
(4)二抗：弃去孔中液体，PBST洗涤3次，加入1μg/ml带SULFO标签的羊抗人IgG-Fc抗体15μl，室温反应2h；
(5)弃去孔中液体，PBST洗涤3次，根据操作指南，反应板在MSD Sector Imager2400进行读取。
(6)结果：BN2与ssDNA、dsDNA、insulin、cardiolipin、BSA、LPS抗原反应均显示出强阳性(图3显示BN2与insulin的反应性)，几乎与4E10 scFv-Fc相当，表明BN2与这些抗原都反应，是一种多反应性抗体。
3、HIV抗原结合反应检测
基于MSD平台技术，设置了BN2与HIV表面抗原gp140-trimer结合实验，用5μg/mlgp140-trimer(来自HIV-YU2病毒株)包被384孔MSD板，方法同上。实验中，仍以4E10 scFv-Fc为阳性对照抗体，在自身反应性检测(Hep-2 Elisa)结果中显示阴性和低阳性反应的抗体，这个实验中被用作阴性对照和低阳性反应对照。
结果如图4所示，BN2与gp140-trimer显示出较强的结合活性，表明BN2具有HIV抗原结合活性，具备进一步开发的价值。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
序列表
<110> 苏州卫生职业技术学院
<120> 一种抗HIV的广谱中和抗体及其制备方法和应用
<141> 2020-10-26
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr Tyr
1 5
<210> 2
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr
1 5
<210> 3
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Ala Arg Ala Arg Pro Tyr Cys Thr Asn Gly Val Cys Tyr Ala Phe Asp
1 5 10 15
Ile
<210> 4
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Glu Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Arg Pro Tyr Cys Thr Asn Gly Val Cys Tyr Ala Phe Asp
100 105 110
Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 5
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Gln Ser Val Leu Tyr Ser Ser Asn Asn Lys Ile Tyr
1 5 10
<210> 6
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Trp Ala Ser
1
<210> 7
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro Leu Thr
1 5
<210> 8
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Asn Lys Ile Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Ser Thr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ggatacacct tcaccggcta ctat 24
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
atcaacccta acagtggtgg caca 24
<210> 11
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gcgagagccc gcccatattg tactaatggt gtatgctatg cttttgatat c 51
<210> 12
<211> 372
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gagttgcagc tggtggagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60
tcctgcaagg cttctggata caccttcacc ggctactata tgcactgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atcaacccta acagtggtgg cacaaactat 180
gcacagaagt ttcagggcag ggtcaccatg accagggaca cgtccatcag cacagcctac 240
atggagctga gcaggctgag atctgacgac acggccgtgt attactgtgc gagagcccgc 300
ccatattgta ctaatggtgt atgctatgct tttgatatct ggggccaagg gacaatggtc 360
accgtctctt ca 372
<210> 13
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
cagagtgttt tatacagctc caacaataag atctac 36
<210> 14
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
tgggcatct 9
<210> 15
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
cagcaatatt atagtactcc gctcact 27
<210> 16
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gacatcgtga tgacccagtc tccagactcc ctggctgtgt ctctgggcga gagggccacc 60
atcaactgta agtccagcca gagtgtttta tacagctcca acaataagat ctacttagct 120
tggtaccagc agaaaccagg acagcctcct aagctgctca tttactgggc atctacccgg 180
gaatccgggg tccctgaccg attcagtggc agcgggtctg ggacagattt cactctcacc 240
atcagcagcc tgcaggctga agatgtggca gtttattact gtcagcaata ttatagtact 300
ccgctcactt tcggcggagg gaccaaggtg gagatcaaa 339

Claims (10)

1.一种抗HIV广谱中和抗体，其特征在于，所述抗体包含重链互补决定区和/或轻链互补决定区；所述重链互补决定区包含：SEQ ID NO.1的氨基酸序列的CDR-H1、SEQ ID NO.2的氨基酸序列的CDR-H2以及SEQ ID NO.3的氨基酸序列的CDR-H3；所述轻链互补决定区包含：包含SEQ ID NO.5的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO.6的氨基酸序列的CDR-L2以及包含SEQ ID NO.7的氨基酸序列的CDR-L3；
优选的，所述抗体包含：
(a)与SEQ ID NO.4的氨基酸序列具有至少90％，优选95％序列同一性的VH序列；
(b)与SEQ ID NO.8的氨基酸序列具有至少90％，优选95％序列同一性的VL序列；或者
(c)如(a)中的VH序列和如(b)中的VL序列。
2.根据权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述抗体包括Fab、Fab’、F(ab)’2、ScFv、Fv片段或线性抗体。
3.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1或2所述的抗体；
优选的，编码CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3的核酸序列具有与SEQ ID NO.9-11至少90％，优选95％序列的同一性的序列；编码CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3的核酸序列具有与SEQ IDNO.13-15至少90％，优选95％序列的同一性的序列；
优选的，编码VH的核酸序列具有与SEQ ID NO.12至少90％，优选95％序列同一性的序列；
优选的，编码VL的核酸序列具有与SEQ ID NO.16至少90％，优选95％序列同一性的核酸序列。
4.一种载体，其特征在于，所述载体包含权利要求3所述的核酸分子。
5.一种细胞，其特征在于，所述细胞包含权利要求4所述的载体。
6.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含权利要求1或2所述的抗体、权利要求3所述的核酸分子、权利要求4所述的载体、或权利要求5所述的细胞；和药用载体。
优选的，所述药物组合物还包括第二治疗剂；
优选的，所述第二治疗剂是抗病毒剂；
优选的，所述抗病毒剂包括：非核苷逆转录酶抑制剂，蛋白酶抑制剂，进入或融合抑制剂、整合酶抑制剂。
7.一种疫苗，其特征在于，所述疫苗包含特异性结合权利要求1或2所述的抗体的表位。
8.一种用于生成抗HIV广谱中和抗体的方法，其特征在于，所述方法包括：
获得权利要求5所述的细胞；
在如下条件下在培养基中培养所述细胞，所述条件容许由所述载体编码的多肽的表达并且装配抗体或其片段，并自所述细胞或所述细胞的培养基纯化所述抗体。
9.一种筛选抗HIV广谱中和抗体的方法，其特征在于，包括：
(a)收集人源化GTL小鼠外周血，流式细胞分选成熟B细胞；
(b)单细胞PCR克隆抗体基因；
(c)抗体表达及纯化；
(d)筛选具有自身反应性、多反应性的抗体；
(e)筛选具有HIV抗原结合活性的抗体。
10.如下任一项所述的应用：
(a)权利要求1或2所述的抗体、权利要求3所述的核酸分子、权利要求4所述的载体、权利要求5所述的细胞、权利要求6所述的药物组合物、权利要求7所述的疫苗在制备治疗HIV感染或HIV相关疾病的药物中的应用；
(b)权利要求1或2所述的抗体、权利要求3所述的核酸分子、权利要求4所述的载体、权利要求5所述的细胞在制备检测HIV感染或HIV相关疾病诊断、预后或治疗监测的产品中的应用；
(c)权利要求1或2所述的抗体在制备免疫偶联物或嵌合受体中的应用；
(d)权利要求1或2所述的抗体在HIV免疫组织化学测定中的应用；
优选的，(c)中所述嵌合受体为嵌合抗原受体。
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